USP 40-NF 35 Contenido iii

Contenido
VOLUMEN 1 Artículos Nuevos que Aparecen en USP 40 Ausentes
en USP 39 y sus Suplementos ........... xxxvi

Artículos Incluidos en USP 39 Ausentes

en USP 40 ......................... xxxvii
Declaración de la Misión y Prefacio vii
Lista Detallada ....................... xxxviii

Integrantes del Ciclo de Revisión

2015-2020 ....................... xiii Advertencias
Funcionarios . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xiii Advertencias y Requisitos Generales . . . . . . . . . . 1

junta Directiva . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xiii

Capítulos Generales
Consejo de Expertos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xiii
Ver página 69 para detalles del contenido
Comités de Expertos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xiv
Pruebas y Valoraciones Generales . . . . . . . . . . . 75
In Memóriam ........................... xx
Requisitos Generales para Pruebas y
Miembros y Delegados de la Conven- Valoraciones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75
ción de la Farmacopea de los
Estados Unidos de América, a partir Aparatos para Pruebas y Valoraciones . . . . . . . 11 8
del 31 de mayo de 2016 ........... xxi Pruebas Microbiológicas . . . . . . . . . . . . . . . . . 124
Reconocimiento para los Donantes de Pruebas y Valoraciones Biológicas . . . . . . . . . . 158
Materiales de Referencia y de
Monografías en 2015 ............ xxviii Pruebas y Valoraciones Químicas . . . . . . . . . . . 266

Pruebas y Determinaciones Físicas . . . . . . . . . . 509

Acta Constitutiva ................... xxx Información General . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 893
Gobierno de la USP . . . . . . . . . . . . . . . . xxxi Suplementos Dietéticos . . . . . . . . . . . . . . . . . 2464
Estatutos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xxxi

Normas y Procedimientos . . . . . . . . . . . . . . . . xxxi Reactivos, Indicadores y

Políticas de la USP ...................... xxxi Soluciones ..... ................... 2547

Especificaciones de Reactivos. . . . . . . . . . . . . 2552

Indicadores y Papeles Indicadores . . . . . . . . . 2635

Incorporaciones ................... xxxv
Soluciones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2638
Artículos Incorporados a USP 40 mediante
Suplementos .......................... xxxv Soluciones Amortiguadoras . . . . . . . . . . . . 2638
iv Contenido USP 40-NF 35

Soluciones Colorimétricas 2639

Soluciones Reactivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2640 VOLUMEN 3
Soluciones Volumétricas . . . . . . . . . . . . . . . 2652

Columnas Cromatográficas . . . . . . . . . . . . . . 2666

Guía para los Capítulos Generales. . . . vii

Tablas de Referencia
Envases para Dispensar Cápsulas y Tabletas . . 2673
Advertencias
Advertencias y Requisitos Generales . . . . . . . . . xiii
Descripción y Solubilidad Relativa de Artículos
de la USP y del NF. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2684

Solubilidades Aproximadas de Artículos de la

USP y del NF . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2748
USP 40
Pesos Atómicos ....................... 2757

Vidas Medias de Radionucleidos Seleccionados ...

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2758 Monografías
Tabla Alcoholimétrica . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2759
Monografías Oficiales de USP 40, 1-Z . . . . . . 5025
Tabla de Viscosidad Intrínseca . . . . . . . . . . . . 2761

Índice
Índice Índice Combinado de USP 40 y NF 35 . . . . . . . 1-1
Índice Combinado de USP 40 y NF 35 . . . . . . . 1-1

VOLUMEN 4
VOLUMEN 2 Guía para los Capítulos Generales . . . . vii

Guía para los Capítulos Generales. . . . vii Advertencias

Advertencias y Requisitos Generales . . . . . . . . . xiii

Advertencias
Advertencias y Requisitos Generales . . . . . . . . . xiii

Salud Global
Monografías Oficiales . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7289
USP 40

Monografías Suplementos Dietéticos

Monografías Oficiales de USP 40, A-H. . . . . . 2763 Monografías Oficiales . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7291

Índice
Índice Combinado de USP 40 y NF 35 . . . . . . . 1-1
USP 40-NF 35 Contenido v

Excipientes
NF 35
Excipientes USP y NF, Agrupados por
Categoría . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8045

Incorporaciones
Monografías
Artículos Incorporados a NF 35 mediante
Suplementos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8043 Monografías Oficiales de NF 35. . . . . . . . . . . 8055

Artículos Nuevos que Aparecen en NF 35

Ausentes en NF 34 y sus Suplementos .... 8043 Índice
Artículos Nuevos que Aparecen en NF 35 . . . 8043 Índice Combinado de USP 40 y NF 35 . . . . . . . 1-1
Lista Detallada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8044
USP 40
Misión y Prefacio
USP 40-NF 35 y sus
Este apartado brinda información sobre la Convención de
la Farmacopea de los Estados Unidos de América (USP), así
como también información general sobre la 40.• revisión de
la Farmacopea de los Estados Unidos de América (USP 40) y la
35.ª edición del Formulario Nacional (NF 35) y sus Suplemen-
tos. Los textos de USP 40-NF 35 serán oficiales a partir del
1º de mayo de 201 7, los textos del Primer Suplemento de
USP 40-NF 35 serán oficiales a partir del 1º de agosto de
2017 y los textos del Segundo Suplemento de USP 40-NF 35
serán oficiales a partir del 1º de diciembre de 2017, a me-
nos que se indique algo diferente.
DECLARACIÓN DE LA MISIÓN
Los compendios USP-NF se publican en cumplimiento con
la misión de la USP: Mejorar la salud en todo el mundo a
través de normas públicas y programas relacionados que ayu-
den a garantizar la calidad, seguridad y beneficio de los medi-
camentos y alimentos.
HISTORIA
La USP tiene una historia rica, que remonta a 1820
cuando once médicos se reunieron en la Cámara de Sena-
dores del Capitolio de los EE.UU. para establecer una farma-
copea para los EE.UU. Puede aprender más sobre la historia
de la USP y los acontecimientos más importantes, dirigién-
dose al sitio Web de la USP (http://www.usp.org/about-usp/
our-history).
CONTENIDO DE LOS COMPENDIOS USP-NF
Los compendios USP-NF contienen monografías de sus-
tancias (ingredientes) y productos para artículos oficiales re-
conocidos en los compendios USP-NF (ver Advertencias y Re-
quisitos Generales 2.20 Artículos Oficiales). Los compendios
USP-NF también incluye monografías para preparaciones
magistrales. Salvo escasas excepciones, tales como artículos
en las monografías de Salud Global, todos los artículos sobre
los que existen monografías en los compendios USP-NF se
comercializan legalmente en los EE.UU. o están contenidos
en artículos que se comercializan legalmente. Las monogra-
fías de Salud Global son para aquellos artículos que no han
sido aprobados o que no se comercializan legalmente en los
EE.UU., pero que han sido aprobados por una autoridad re-
glamentaria estricta [según la definición de la Organización
Mundial de la Salud (OMS)] y son utilizados para propósitos
esenciales en otras partes del mundo.
Una monografía de los compendios USP-NF de una sus-
tancia, producto o preparación oficial puede constar de va-
rios componentes, incluido el nombre del artículo, la defini-
ción, las condiciones de envasado, almacenamiento y otros
requisitos, y una especificación. Los capítulos generales pro-
porcionan los procedimientos gue se citan con frecuencia, a
veces con criterios de aceptacion, con el fin de compilar en
un solo lugar información repetitiva que se aplica a muchas
Misión y Prefacio vii
Suplementos
monografías. Para mayor información sobre normas en las
monografías y capítulos generales de los compendios
USP-NF ver Advertencias y Requisitos Generales, 3. 7O Aplicabi-
lidad de las Normas.
Las monografías y capítulos generales, nuevos, eliminados
y revisados en esta edición se indican en el apartado
Incorporaciones.
Organización de los Compendios USP-NF-Los com-
pendios USP-NF se publican en línea bajo el nombre
USP-NF Online. Los compendios USP-NF tambien se en-
cuentran impresos en cuatro volúmenes. El Volumen 7 in-
cluye secciones de preliminares (Misión y Prefacio, Integran-
tes, sitios Web y páginas del Gobierno de la USP e
Incorporaciones/Lista Detallada). Asimismo, incluye Adverten-
cias y Requisitos Generales, Capítulos Generales, capítulos ge-
nerales de Suplementos Dietéticos, Reactivos y Tablas de Refe-
rencia. El Volumen 2 incluye monografías de la USP
correspondientes a las letras A-H y el Volumen 3 incluye mo-
nografías de la USP correspondientes a las letras 1-Z. El Volu-
men 4 incluye monografías de Salud Global, Suplementos
Dietéticos, Incorporaciones del NF/Lista Detallada, Excipientes y
monografías del NF. Para facilitar el uso y referencias conve-
nientes, todos los cuatro volúmenes incluyen el índice com-
binado, así como las Advertencias y Requisitos Generales y la
Guía para los Capítulos Generales. Los capítulos generales es-
pecíficos para los suplementos dietéticos se incluyen por
orden numérico con los demás capítulos generales en la
USP. Las monografías de excipientes se presentan por lo ge-
neral en el NF, pero pueden también aparecer en la USP,
con la referencia cruzada correspondiente cuando también
son fármacos. El apartado Excipientes (Volumen 4) presenta
una tabla de los excipientes organizados por categoría fun-
cional.
Suplementos-Los Suplementos de USP-NF se rigen por
un programa de publicación estándar anual: el Primer Suple-
mento se publica en febrero y se oficializa el 1 º de agosto. El
Segundo Suplemento se publica en junio y se oficializa el 1 º
de diciembre. Los usuarios de los productos impresos de la
USP deben conservar los Suplementos y verificar la sección
de "Official Text" (Texto Oficial) del sitio Web de la USP
para contar con el texto oficial actualizado. La USP-NF On-
line se actualiza con cada Suplemento o con la revisión
anual. Cada vez que se publica una nueva edición o Suple-
mento durante la suscrlpción vigente, se publica una nueva
versión electrónica. El Indice de cada Suplemento es acumu-
lativo e incluye citas de la revisión anual y, en el caso del
Segundo Suplemento, citas del Primer Suplemento. Los dos Su-
plementos se incluyen en la siguiente edición anual, junto
con las nuevas revisiones oficiales que hayan sido adoptadas
con posterioridad al Segundo Suplemento de la edición pre-
via de los compendios.
Revisiones de USP-NF-Los compendios USP-NF se revi-
san en forma continua mediante un proceso excepcional de
participación pública e interacción sustancial entre la USP y
sus partes interesadas, tanto a nivel nacional como interna-
cional. Las revisiones se presentan anualmente en USP-NF y
en los Suplementos semestrales, y como Revisiones Aceleradas
en el sitio Web de la USP [Fe de Erratas, Anuncios de Revisión
viii Misión y Prefacio USP 40

Intermedia (Jnterim Revision Announcement (IRA) y Boletines así como entre la versión impresa y Online de los compen-
de Revisión (Revision Bulletins)]. dios USP-NF.
Revisiones de Normas-El proceso de revisión de normas Texto Sombreado y Símbolos-El texto sombreado se
de la USP requiere la publicación de las propuestas de la usa para identificar el texto que ha sido modificado, agre-
revisión en el Pharmacopeial Forum (PF) durante un período gado o eliminado desde su última publicación. Los símbolos
de notificación y comentarios de 90 días y, después de la identifican el inicio y el final de cada revisión o de texto no
aprobación del Comité de Expertos pertinente de la USP, se armonizado. La siguiente tabla resume los tipos de símbolos
publica la revisión en los próximos compendios USP-NF o y los subíndices relacionados que se usan en las publicacio-
Suplemento, según corresponda. Aprenda más sobre el pro- nes de la USP:
ceso de desarrollo y revisión en el sitio Web de la USP
(http://www.usp.org/usp-nf/development-process). Tipo de Revisión Símbolo Subíndice
Revisiones Aceleradas-Se usa el proceso de Revisión Ace- Anuncio de •texto nuevoe (1RA01.¡,1- (IRA Ol-jul-2017) *
lerada para oficializar revisiones de USP-NF en forma más Revisión Inter- 2011)
rápida que a través del proceso de Revisión de Normas de la media
USP. Aprenda más sobre los Boletines de Revisión, Anuncios Boletín de •texto nuevoe CBR01-ece- (BR Ol-ene-2017)*
de Revisión Intermedia (IRA) y Fe de Erratas, y el criterio para
Revisión 201n
cada uno y la implementación de cada uno en el sitio Web
de la USP (http://www.usp.org/usp-nf/official-text). Texto eliminado •e (IRA 01-jul-201 7) 0 (IRA Ol-jul-2017) *
• •1 S (USP40) 0 1 S (USP40)*
Modificación de Referencias Farmacopeicas-En oca-
siones, la USP y sus Comités de Expertos consideran necesa- .&.JJ..(USP40) USP4o**
rio modificar los títulos de los capítulos generales o de tex- Texto adoptado •texto nuevo •1s1usP40J 1 S o 25 (edición
tos similares que pudieran estar referidos en otras normas en en los anual de la USP) *
los compendios USP-NF. Cuando esto sucede, el personal de Suplementos
la USP lleva a cabo un riguroso proceso para identificar y Texto adoptado ..texto nuevo ..1usP40J Edición anual de la
actualizar tales referencias. Dichas actualizaciones pueden re- en USP-NF usp**
alizarse mediante una revisión de rutina, o para casos en los Armonización +texto nacional remanen-
que una actualización no representa un cambio significativo te o texto no armoniza-
en el estándar en cuestión, mediante una actualización di- do+
recta de la referencia en dicha norma sin necesidad de aviso Erratas •texto nuevoe CERR01.¡01- (ERR Ol -jul-2017)
ni periodo de comentarios. En todos los casos, la USP publi- 2011)
cará en su sitio Web un aviso en el que se indique el cambio
Referencias a ca- •texto nuevoe CAFDl-moy- (AF Ol -may-2017)
de la fuente, cualquier referencia resultante y si dichas refe-
pítulos
rencias se actualizarán a través de una revisión de rutina o 2011)

una actualización directa. •texto nuevoe (Oficia101-dic- (Oficial Ol-dic-2017)

2017
Actualización de la Información Química-Las actuali-
zaciones de la sección de Información Química al principio *Un número o fecha en subíndice indica el IRA, el Boletín de Revisión o
de las monografías se realizan continuamente y no se identi- el Suplemento donde la revisión apareció por primera vez.
fican con símbolos de revisión. Los nombres químicos y los **Un ejemplo de una revisión que se oficializó en los compendios
pesos moleculares se actualizan cuando la monografía se so- USP-NF sería .. usp40.
mete a revisión para que correspondan con la fuente oficial,
Nombres Adoptados en los Estados Unidos (USAN, por sus si- La siguiente tabla presenta los símbolos y fechas oficiales
glas en ing~és). Las estructuras químicas se actualizan de para los IRA y los Suplementos de los compendios USP 40-NF
forma continua. 35.
Los nombres químicos por lo general reflejan las conven-
ciones al momento del desarrollo o revisión de la monogra- Fechas Oficiales y Símbolos
fía. Si las reglas de nomenclatura de CAS o IUPAC han su- Para los Anuncios de Revisión Intermedia y los Suplementos de los
frido cambios importantes, los nombres químicos pueden Compendios USP 40--NF 35
revisarse o agregarse para reflejar dichas reglas. Los pesos
Anuncio de
moleculares se derivan de la fórmula química y se basan en
Revisión
la tabla de pesos atómicos. Los pesos atómicos son los reco-
Suple- Intermedia
mendados por IUPAC y reflejan la composición isotópica de
mento Propuesto Fecha Oficial Símbolos
material terrestre normal. Cuando se presenten cambios en
los valores recomendados por IUPAC, se entiende que los 43(1) 1 º de julio de 2017 •ye(IRA 01-jul-2017)
cambios en los pesos moleculares se realizarán dentro del 1º de agosto de 2017 •y.1 S (USP40)
tiempo esperado. 43(2) 1 º de septiembre de 201 7 •Ye (IRA Ol-sep-201 7)
La representación gráfica de las estructuras de compues- 43(3) 1 º de noviembre de 2017 •Ye (IRA 01-nov-2017)
tos químicos tiene como propósito ayudar visualmente a es- 2 1 º de diciembre de 2017 •y.25 (USP40)
tablecer la identidad química y se entiende que representa
43(4) 1 º de enero de 2018 •ye(IRA Ol-ene-2018)
una de muchas formas posibles de representar la molécula.
La introducción de una representación gráfica así como 43(5) 1º de marzo de 2018 •ye(IRA 01-mar-2018)
cambios que resulten en la misma información química, p. USP 43(6) 1º de mayo de 2018 •ye(IRA Ol-may-2018)

ej., una molécula quiral invertida o la inclusión de una es- 41-NF

tructura molecular, se puede agregar fuera del proceso de
revisión. Asimismo, se entiende que para el tautomerismo, la
molécula representada puede ser uno de los tautómeros,
pero se entiende que la intención es representar todos los
isómeros en equilibrio. Los centros estereogénicos represen-
tados con enlaces sin realce implican mezclas de estereóme-
ros-enantiómeros, diastereómeros, epímeros (anómeros)
pertinentes, entre otros.
Dependiendo del momento de estas actualizaciones, los
usuarios podrían notar diferencias en una estructura química
entre las publicaciones del PF y de los compendios USP-NF,
36
Asimismo, en USP-NF Online, las monografías y capítulos
generales que han sido revisados, pero que aún no se han
publicado en los compendios USP-NF ni sus Suplementos (p.
ej., como Revisiones Aceleradas) incluirán íconos vinculados a
la página en el sitio Web de la USP donde se puede revisar
el nuevo texto oficial. Estos íconos también estarán vincula-
dos a las Revisiones Aceleradas [p.ej., Boletines de Revisión
(Revision Bulletins), Anuncios de Revisión Intermedia (IRAs) y Fe
USP 40
de Erratas] y Armonización en Etapa 6 (ver a continuación la
sección Actividades de Armonización).
Comentarios-Para las revisiones que se publican para su
revisión y comentarios públicos en el PF, la propuesta puede
oficializarse o, en su defecto, republicarse en el PF para noti-
ficación y comentarios adicionales. Si se reciben comentarios
adicionales, estos son considerados e incorporados por el
Comité de Expertos según corresponda. Para los casos en
los que las propuestas se oficialicen sin necesidad de repu-
blicación en el PF, se publica un resumen de los comentarios
recibidos junto con las respuestas pertinentes del Comité de
Expertos en el apartado Comentarios del sitio Web de la USP
al momento de la publicación de la revisión.
Los Comentarios no forman parte del texto oficial y no
están destinados para su aplicación por parte de autoridades
reglamentarias, sino gue explican los fundamentos de las
respuestas del Comite de Expertos a los comentarios públi-
cos. En caso de discrepancia entre el contenido de los Co-
mentarios y el texto oficial, el texto oficial prevalecerá. En
caso de controversia o cuestionamiento sobre la interpreta-
ción, prevalecerá el lenguaje del texto oficial, de manera
única e independiente de los Comentarios.
Presentaciones Impresas y Electrónicas-Para más in-
formación sobre los formatos disponibles de los compendios
USP-NF ver Advertencias y Requisitos Generales, 2. 7O Texto
Oficial.
Traducciones de USP-NF-Los compendios USP-NF se en-
cuentran disponibles en ediciones en español, ruso y chino.
El mantenimiento de la edición en español sigue el mismo
enfoque de revisión que la edición en inglés; las demás tra-
ducciones están basadas en revisiones anteriores de los com-
pendios USP-NF.
Estándares de Referencia USP-EI uso de los Estándares
de Referencia USP promueve la calidad uniforme de los me-
dicamentos y sustenta la fiabilidad y uniformidad para aqué-
llos que llevan a cabo los análisis para el cumplimiento de
las normas y demás usuarios de los compendios USP-NF,
incluidos fabricantes, compradores y autoridades reglamen-
tarias. Los Estándares de Referencia USP se citan en procedi-
mientos específicos tanto en monografías como en capítulos
generales. La USP oficializa este material a través de estudios
meticulosos de caracterización y de análisis colaborativos,
seguidos por la revisión y aprobación del uso farmacopeico
del material de referencia por parte de los'Comités de Ex-
pertos del Consejo de Expertos. El Catálogo USP, que lista la
colección de Estandares de Referencia USP, y más informa-
ción sobre uso y almacenamiento, se encuentra disponible
en el sitio Web de la USP (http://www.usp.org/reference-
standards). Este programa se beneficia de una amplia contri-
bución voluntaria de materiales adecuados y de datos de
prueba ye_rtinentes por parte de fabricantes de productos
farmaceut1cos.
ÓRGANOS DE GOBIERNO, DE ESTABLECIMIENTO DE
NORMAS Y DE ASESORAMIENTO DE LA USP
Los órganos de gobierno, de establecimiento de normas y
de asesoramiento de la USP incluyen la Convención de la
USP, la Junta Directiva, el Consejo de Expertos y sus Comi-
tés de Expertos, Paneles de Expertos, Subcomités, Subcomi-
tés Conjuntos para el Establecimiento de Normas y personal.
Otros cuerpos de voluntarios incluyen Foros de Partes Inter-
esadas y Equipos de Proyecto, que ofrecen a partes interesa-
das la oportunidad de contribuir, mediante consejos y reco-
mendaciones, hacia el avance de las normas y procesos de
la USP. Aprenda más sobre la composición y trabajo de la
Convencion de la USP, la Junta Directiva, los Comités de
Expertos y los Paneles de Expertos en el sitio Web de la USP
(http://www.usp.org/about-usp/leadership/governance).
Aprenda más sobre los Foros de Partes Interesadas y Equipos
de Proyecto en el sitio Web de la USP (http://www.usp.org/
meetings-courses/stakeholder-forums). La sección Integrantes
incluye un listado actualizado de los Delegados de la Con-
Misión y Prefacio ix
vención de la USP con Derecho a Voto y de los miembros y
Enlaces Gubernamentales ante el Consejo de Expertos y sus
Comités de Expertos y Paneles de Expertos.
Trabajo Conjunto con la Administración de Alimentos
y Medicamentos de los Estados Unidos (Food and Drug
Administration o FDA)-La USP trabaja con el Secretario
del Department of Health and Human Services (Secretaría
de Salud y Asuntos Sociales), principalmente a través de la
FDA. La USP trabaja de distintas formas con dicha agencia,
pero la interacción principal se da mediante el Programa de
Enlaces Gubernamentales. El Programa de Enlaces Guberna-
mentales permite que representantes de la FDA y otras
agencias gubernamentales participen en las reuniones de los
Comités de Expertos y de los Paneles de Expertos, con lo
que se facilita la interacción entre el personal gubernamen-
tal y los Comités de Expertos. El personal de los Centros de
la FDA responsable de revisar las actividades farmacopeicas
proporciona oportunidades y vínculos específicos para el
intercambio de comentarios. La Office of Policy for Pharma-
ceutical Quality (Oficina de Política para la Calidad Farma-
céutica) en el Center for Drug Evaluation and Research
(Centro de Evaluación e Investigación de Medicamentos) es
el contacto principal para los temas farmacopeicos entre la
FDA y la USP.
NORMAS Y PROCEDIMIENTOS
Documentos Rectores-Las normas de los compendios
USP-NF gozan de un gran reconocimiento porque son nor-
mas autorizadas, tienen fundamento científico y se estable-
cen a través de un proceso transparente y fiable. Ver la sec-
ción Acta Constitutiva en este libro; los Estatutos (http://
www.usp.org/about-usp/leadership/bylaws) y las Normas y
Procedimientos del Consejo de Expertos (http://www.usp.org/
about-usp/leadership/policies-rules). Colectivamente, estos
documentos sirven como principios rectores de las activida-
des referentes al establecimiento de normas para el personal
y los colaboradores voluntarios de la USP.
RECONOCIMIENTO LEGAL
Reconocimiento de los Compendios USP-NF-Los com-
pendios USP-NF están reconocidos por la legislación y cos-
tumbre en muchos países del mundo. En los EE.UU., la Ley
FD&C (Ley sobre Alimentos, Medicamentos y Cosméticos)
define el término "compendio oficial" para referirse a la USP
oficial, al NF oficial, a la Farmacopea Homeopática de los Esta-
dos Unidos de América oficial o a cualquiera de sus suple-
mentos. Las normas de USP-NF desempeñan un papel en las
disposiciones sobre adulteración y rotulación incorrecta
(misbranding) de la Ley FD&C, las cuales se aplican también
a productos biológicos, que constituyen un subconjunto de
medicamentos baJO la Public Health Service Act (Ley de Ser-
vicios de Salud Publica) (ver Advertencias y Requisitos Genera-
les, 2.30 Reconocimiento Lega0.
La FDA requiere que los nombres de los artículos que no
son oficiales se distingan y diferencien claramente de cual-
quier otro nombre reconocido en un compendio oficial. Los
medicamentos con un nombre reconocido en USP-NF tam-
bién se considerarán rotulados incorrectamente a menos
que cumplan con las normas farmacopeicas de envasado y
etiquetado (para mayor información ver Advertencias y Re-
quisitos Generales, 3. 7O. 7O Aplicabilidad de las Normas a Pro-
ductos Farmacéuticos, Fármacos y Excipientes).
Medicamentos-El objetivo de la USP es contar con mo-
nografías de fármacos y medicamentos en los compendios
USP-NF para todos los medicamentos aprobados por la FDA
en los EE.UU., incluyendo medicamentos químicos y bioló_gi-
cos, y sus ingredientes. La USP también provee monograf1as
en USP-NF para productos terapéuticos legalmente comer-
cializados no aprobados por la FDA; p.ej., medicamentos an-
teriores a 1938, medicamentos de venta libre comercializa-
x Misión y Prefacio
dos bajo el sistema de Monografías de Medicamentos de
Venta Libre de la FDA (FDA OTC Monograph System), su-
plementos dietéticos y preparaciones magistrales. La sección
de Salud Global en USP-NF contiene monografías para artí-
culos que no han sido aprobados o que no se comercializan
legalmente en los EE.UU., pero que han sido aprobados por
una autoridad reglamentaria estricta [según la definición de
la Organización Mundial de la Salud (OMS)] y son utilizados
para propósitos esenciales en otras partes del mundo.
Cuando corresponda, el cumplimiento de lo estipulado en
una monograf1a de USP-NF, será obligatorio en todo mo-
mento durante la vida de un artículo, desde su producción
hasta su caducidad.
Productos Biológicos-En los EE.UU., los productos bio-
lógicos se consideran un subconjunto de medicamentos, in-
dependientemente de que estén aprobados por la FDA de
conformidad con la Ley FD&C [y se les conceda una solici-
tud de medicamento nuevo (NDA, por sus siglas en inglés)]
o de conformidad con la Public Health Service Act [la Ley
PHS, por la que reciben una licencia de productos biológi-
cos (BLA, por sus siglas en inglés)]. Como resultado, tocfos
los productos biológicos considerados por la Ley PHS están
sujetos a los requisitos reglamentarios para medicamentos
aplicables ba¡·o fa Ley FD&C, lo que significa que tienen que
cumplir con as disposiciones sobre adulteracion y rotulación
incorrecta (misbranding) de la Ley FD&C, incluyendo los re-
quisitos farmacopeicos de USP-NF, en la medida en que
tales requisitos aplican a un producto biológico particular.
Lo anterior se aplica de la misma manera a los productos
biológicos aprobados por la vía "351 (a)" de larga data de la
Ley PHS, así como por la nueva vía "351 (k)" para productos
biosimilares agregada por la reforma de la legislación de sa-
lud de 201 O [Biologics Price Competition and lnnovation
Act, Title VII, Subtitle A of the Patient Protection and Afford-
able Care Act, Public Law 111-148 (Ley sobre Innovación y
Precios Competitivos para Productos Biológicos, Título VII,
Subtítulo A de la Ley de Protección y Cuidados de la Salud
Accesibles para el Paciente, Ley Pública 111-148)].
Suplementos Dietéticos-Las enmiendas a la Ley FD&C
de la Ley de Salud y Educación sobre Suplementos Dietéti-
cos de 1994 establecen que se puede considerar a un suple-
mento dietético un alimento rotulado incorrectamente (mis-
branded) si dicho suplemento está cubierto por las
especificaciones de un compendio oficial (es decir, los com-
pendios USP-NF), declara cumplir con dichas especificacio-
nes y no cumple con las mismas. En esto difiere de un pro-
ducto farmaceutico, para el cual la conformidad con la
norma farmacopeica aplicable es obligatoria sin necesidad
de aseverarlo.
Preparaciones Magistrales-La preparación magistral
implica la preparación, mezclado, ensamblaje, alteración,
envasado y etiquetado de un medicamento, dispositivo u
otro artículo, derivado de una orden de un profesional de la
salud o como iniciativa a dicha orden, basándose en los
patrones rutinarios de prescripción regularmente observa-
dos. La USP proporciona capitulas generales y monografías
para preparaciones magistrales. Aprenda más sobre prepara-
ciones magistrales en el sitio Web de la USP (http://www.
usp.org/usp-healthcare-professionals/compounding).
Dispositivos Médicos-La Sección 201 (h) de la Ley
FD&C define como dispositivo a un instrumento, aparato,
artículo similar, o componente de los mismos, reconocido
en USP-NF. La Sección 502(e) de la Ley FD&C, en ausencia
de una designación de la FDA, define el nombre establecido
de un dispositivo como el título oficial en un compendio
oficial. A pesar de estas disposiciones reglamentarias, no se
cuenta con un reconocimiento del papel de la USP para
establecer normas farmacopeicas para dispositivos médicos
comparable al que existe para medicamentos y productos
biologicos. De acuerdo con la Food and Drug Administra-
tion Modernization Act of 1997 (Ley de Modernización de
la Administración de Alimentos y Medicamentos de 1997),
el Center for Devices and Radiological Health (Centro para
Dispositivos y Salud Radiológica) reconoce normas naciona-
USP 40
les e internacionales, entre las que se incluyen al~unas prue-
bas y valoraciones de la USP para dispositivos medicas.
Nomenclatura-Para información sobre el proceso de
desarrollo de nomenclaturas, el Comité de Expertos en No-
menclatura y Etiquetado, y el trabajo de la USP con el Con-
sejo de Nombres Adoptados en los Estados Unidos (USAN,
por sus siglas en ingles), ver el sitio Web de la USP (http://
www.usp.org/usp-nf/development-process/compendial-no-
menclature).
Nombres Químicos y Números de Registro CAS-Los
subtítulos químicos que aparecen en las monografías son los
nombres empleados en los índices del Chemical Abstracts
Service (Servicio de Resúmenes Químicos; CAS, por sus si-
glas en inglés) de la American Chemical Society (Sociedad
Química de los Estados Unidos). Sólo se incluyen en las mo-
nografías cuyos títulos especifican sustancias que constituyen
entidades químicas definibles. El primer subtítulo es la forma
invertida del nombre químic9 sistemático desarrollado por el
CAS para los propósitos del Indice Colectivo (Collective ln-
dex o CI). El segundo subtítulo, que se presenta en forma
no invertida, es un nombre IUPAC preferido (PIN) sancio-
nado y empleado por la lnternational Union of Pure and
Applied Chemistiy (Unión Internacional de Química Pura y
Aplicada o IUPAC). Los nombres IUPAC preferidos también
son usados por la OMS. En ocasiones, se proporciona un
tercer subtítulo por razones históricas o cuando el sinónimo
emplea una convención nominal alternativa pero equiva-
lente. Las monografías con subtítulos químicos general-
mente incluyen también los números de registro CAS. Estos
números entre corchetes funcionan de manera indepen-
diente de la nomenclatura como indicadores numéricos in-
variables de sustancias químicas singulares, no ambiguas, en
el registro CAS y, por consiguiente, son convenientes y go-
zan de un uso difundido.
ACTIVIDADES DE ARMONIZACIÓN
Grupo de Debate Farmacopeico-La USP armoniza las
monografías de excipientes y los capítulos generales farma-
copeicos en el Grupo de Debate Farmacopeico (PDG, por
sus siglas en inglés). Este grupo incluye representantes de la
Farmacopea Europea, de la Farmacopea Japonesa y de la
Farmacopea de los Estados Unidos de America, as1 como de
la OMS (como observador). De acuerdo con la definición
del PDG, "un capítulo general farmacopeico u otro docu-
mento farmacopeico está armonizado cuando una sustancia
o un producto farmacéutico, que se analiza según el proce-
dimiento armonizado del documento, produce los mismos
resultados y se lle~a a la misma decisión respecto de acep-
tarlo o rechazarlo' . El sitio Web de la USP contiene informa-
ción sobre el PDG, incluyendo la historia, el procedimiento
de trabajo del PDG, un glosario y una lista de las monogra-
fías y capítulos generales que han completado las etapas de
1-6 del proceso de armonización farmacopeica que resulta
en texto aprobado de Armonización en Etapa 6 de USP
(http://www.usp.org/usp-nf/harmonization).
Otras Actividades de Armonización-La USP participa
en diversas actividades de armonización que incluyen a to-
das las farmacopeas. Estas actividades, actualmente en desa-
rrollo, se enfocan en Buenas Prácticas Farmacopeicas y nor-
mas públicas óptimas para todos los medicamentos.
OTROS COMPENDIOS DE LA USP
USP Compounding Compendium-EI USP Compounding
Compendium es un compendio electrónico que incluye todos
los capítulos generales que se encuentran en los compen-
dios USP-NF relacionados con la preparación magistral, ade-
más de capítulos generales de sustento a los que se hace
referencia en los capítulos de preparación magistral y en las
Advertencias y Reqwsitos Generales USP-NF. El propósito del
USP Compounding Compendium es proporcionar acceso con-
USP 40
veniente a los capítulos generales a los profesionales encar-
gados de la preparación magistral.
USP Herbal Medicines Compendium-EI USP Herbal Medi-
cines Compendium (HMC) es un compendio en línea que
ayudará a garantizar la calidad de los ingredientes botánicos
usados en los medicamentos botánicos. Las monografías del
HMC proporcionan especificaciones de calidad-pruebas,
procedimientos y criterios de aceptación-con procedimien-
tos analíticos validados y materiales de referencia relaciona-
dos que facilitan la evaluación del cumplimiento. El HMC
puede ayudar a fabricantes de ingredientes, fabricantes de
productos botánicos, ag~~cias reglam~nt?rias y otras partes
interesadas en la evaluac1on del cumplimiento de los ingre-
dientes botánicos medicinales con normas públicas indepen-
dientes y pa_ra contr.olar la calidad de artícu!os. que ~e co-
mercializan internacionalmente. El HMC esta disponible en
https://hmc.usp.org.
USP Dietary Supplements Compendium-EI Dietary Suppfe-
ments Compendium combina, en dos volúmenes, las normas
USP-NF para suplementos dietéticos, normas e información
del Food Chemicals Codex, documentos reglamentarios y de
la industria, así como otras herramientas y recursos. Se pu-
blica cada dos años en una edición impresa de tapa dura.
Food Chemica/s Codex-EI Food Chemicals Codex (FCC) es
un compendio reconocido internacionalmente de normas de
monografías y pruebas de pureza y calidad para ingredien-
tes alimenticios, p.ej. conservantes, saborizantes, colorantes
y nutrientes. El FCC se publica, ca~a d~s años, con sup~e­
mentos cada seis meses, y esta disponible en formato im-
preso Y. electrónico. La~ ~~visiones prop~est~s ~I FCC est~n
disponibles para su rev1s1on y comentario publico a traves.
del FCC Forum, al cual se puede acceder de manera gratuita
en forum.foodchemicalscodex.org.
Misión y Prefacio xi
OTROS RECURSOS DE LA USP
Chromatographic Columns-Esta exhaustiva publicación
de referencia, previamente titulada Chromatographic Rea-
gents (Reactivos Cromatográficos), ofrece información deta-
llada necesaria para llevar a cabo los procedimientos croma-
tográficos incluidos en los compendios USP-NF. La
publicación Chromatographic Columns lista los nombres co-
merciales de los reactivos para columna citados en todas las
propuestas de procedimientos analíticos nuevos o revisados
para cromatografía de gases o de líquidos publicados en el
PF desde 1980. La publicación Chromatographic Columns
también ayuda a mantener un registro de los reactivos que
se usaron para validar los procedimientos analíticos que se
han oficializado. El listado de reactivos para columna con
sus marcas se actualiza bimestralmente y se publica en el
sitio Web de la USP.
USP Dictionary-EI USP Díctíonary of USAN and lnterna-
tíonal Drug Names ofrece, en un solo volumen, los Nombres
Adoptados en los Estados Unidos (USAN, por sus siglas en
inglés) más actualizados para los fármacos; los nombres
USP-NF oficiales; las denominaciones comunes, los nombres
comerciales y químicos; las fórmulas gráficas; las fórmulas y
los pesos moleculares; los números de registro CAS y las
designaciones por código; los fabricantes de fármacos; y las
categorías farmacológicas y terapéuticas. El USP Díctíonary
ayuda a asegurar la exactitud de los siguientes puntos: eti-
quetado del producto; informes, artículos y corresponden-
cia; solicitudes reglamentarias de la FDA y prospectos de
productos farmacéuticos. Se publica anualmente. Para ma-
yor información sobre el USP Díctíonary ver el sitio Web de
la USP (http://www.usp.org/usp-nf/development-process/
compendial-nomenclature).
USP 40 Integrantes / Comités xiii

Integrantes

Ciclo de Revisión
2015-2020
Funcionarios de la Convención de la USP, junta
Directiva, y del Consejo de Expertos, Comités de
Expertos y Paneles de Expertos

Alexandria, VA
Ron T. Piervincenzi, Ph.D.
Funcionarios (2015-2020) Director Ejecutivo, Febrero 20 74-presente
Jesse L. Goodman, M.D., M.P.H. (ex-officio)
Presidente Rockville, MD
Washington, DC
Timothy R. Franson, B.S. Pharm., M.D.
Presidente Saliente
Consejo de Expertos (2015-2020)
lndianapolis, IN Jaap Venema, Ph.D.
John E. Courtney, Ph.D. Presidente, Consejo de Expertos
Tesorero Rockville, MD
Bethesda, MD Richard A. Blessin9, M.S.
Susan S. de Mars, J.D. Presidente, Monograf1as 7 de Medicamentos Químicos
Secretaria North Chicago, IL
Rockville, MD Edward K. Chess, Ph.D.
Presidente, Monografías 3 de Productos Biológicos-
Productos Biológicos Complejos
Junta Directiva (2015-2020) McHenry, IL
Thomas R. Temple, B.S. Pharm., M.S., F.A.Ph.A. Stephanie Y. Crawford, Ph.D., M.P.H.
Presidente Presidente, Nomenclatura y Etiquetado
Representante At-Large Chicago, IL
Des Moines, IA Gigi S. Davidson, B.S.Pharm., DICVP
Gregory E. Amidon, Ph.D. Presidente, Preparación Magistral
Representante del Sector Farmacia Raleigh, NC
Ann Arbor, MI Michael R. De Felippis, Ph.D.
Laura Herman, M.B.A., M.A. Presidente, Monografías 7 de Productos Biológicos-Péptidos
Representante del Interés Público lndianapolis, IN
New Canaan, CT James E. De Muth, Ph.D., R.Ph.
Robert J. Meyer, M.D. Presidente, Capítulos Generales-Formas Farmacéuticas
Representante del Sector Medicina Madison, WI
Charlottesville, VA Jonathan W. DeVries, Ph.D.
Marilyn K. Speedie, Ph.D. Presidente, Ingredientes Alimenticios
Representante del Sector Farmacia Golden Valley, MN
Minneapolis, MN Dennis E. Doherty, M.D., FCCP
Stephen P. Spielberg, M.D., Ph.D. Presidente, Calidad de Cuidado de la Salud
Representante del Sector Medicina Lexington, KY
Upr.er Gwynedd, PA David A. Fay, Ph.D.
Gail R. Wilensky, Ph.D. Presidente, Monografías 6 de Medicamentos Químicos
Representante At-Large St. Louis, MO
Bethesda, MD Mary G. Foster, Pharm.D., BFA
Susan C. Winckler, R.Ph., J.D. Presidente, Capítulos Generales-Envasado y Distribución
Representante At-Large Blue Bell, PA
xiv Comités /Integrantes
Dennis K. J. Gorecki, B.S.P., Ph.D.
Presidente, Suplementos Dietéticos No-Botánicos
Saskatoon, Saskatchewan, Canada
Xiaorong He, Ph.D.
Presidente, Capítulos Generales-Análisis Físico
Ridgefield, CT
Mary C. Houck, Ph.D.
Presidente, Monografías 2 de Excipientes
Norman, OK
David Husson_9, Ph.D.
Presidente, Cap1tulos Generales-Microbiología
Kensington, MD
Kim C. Huynh-Ba, M.S.
Presidente, Monografías 4 de Medicamentos Químicos
Newark, DE
Amy J. Karren, B.Sc.
Presidente, Monografías 5 de Medicamentos Químicos
Flagstaff, AZ
Robin J. Marles, B.Sc., M.Sc., Ph.D.
Presidente, Suplementos Dietéticos Botánicos y Mary B. Baker, Pharm.D.; Stephanie Y. Crawford, Ph.D.;
Medicamentos Herbolarios
Ottawa, Ontario, Canada
Michael G. Mulkerrin, Ph.D.
Presidente, Monografías 2 de Productos Biológicos-
Proteínas
Hillsborough, CA
Eric Jon Munson, Ph.D.
Presidente, Monografías 1 de Excipientes
Lexington, KY
Bernard A. Olsen, Ph.D.
Presidente, Monografías 3 de Medicamentos Químicos
Wake Forest, NC
Ernest Parente, Ph.D.
Presidente, Monografías 2 de Medicamentos Químicos
Saint Louis, MO
Robert R. Sin,er, M.S.
Presidente, Cap1tulos Genera/es-Estadísticas
Union City, CA
Wesley E. Workman, Ph.D.
Presidente, Capítulos Generales-Análisis Biológico
Saint Charles, MO
Nancy Lewen, B.Sc.
Presidente, Capítulos Generales-Análisis Químico
lndianapolis, IN
Comités de Expertos (2015-2020)
[Nota-El siguiente listado de Comités de Expertos
incluye los Paneles de Expertos que asesoran a Comités
de Expertos específicos. El listado de Paneles de
Expertos y sus miembros representa a aquellos Paneles
formados y aprobados en su totalidad a partir de julio
de 2015. Los Paneles de Expertos se forman y
desintegran continuamente durante todo el ciclo de
revisión de la USP, por lo que en un futuro se publicarán
otras listas de miembros.]
Paneles de Expertos para el Comité
Ejecutivo del Consejo de Expertos
Panel de Expertos para la Traducción al Español
ENRIQUE FEFER, PH.D., Presidente
Peggy Casanova, M.Sc.; Ofelia Espejo, Ph.D.; Lidiette
Fonseca González, M.Sc.; José juarez Eyzaguirre, Ph.D.;
Monica l. Hirschhorn, M.Sc.; José Mana Parisi, M.Sc.;
Luisa Fernanda Ponce D'León Quiroga, Ph.D.; Osear
Quattrocchi, M.Sc.; Mauricio A. Seigelchifer, Ph.D.;
Caroline R. Weinstein-Oppenheimer, Ph.D.
USP 40
Comité de Expertos de la Farmacopea de
los Estados Unidos de América
Nomenclatura y Etiquetado
STEPHANIE Y. CRAWFORD, PH.D., M.P.H., Presidente
Mary B. Baker, Pharm.D.; Dawn M. Boothe, D.V.M.,
Ph.D.; Mike Cohen, M.S.; Elizabeth lgne Ferreira, Ph.D.;
Karen Hauda, J.D., M.S.; Kent johnson, M.Pharm.;
Armen Melikian, Ph.D.; Ajay Parashar, M.S.; Ginette A.
Pepper, R.N., Ph.D., FAAN; Thomas Reinders, Pharm.D.;
Joanne G. Schwartzberg, M.D.; Maged Sharaf, Ph.D.;
Eric Sheinin, Ph.D.; Thomas Tice, Ph.D.; Claudia
Vincenzi, Ph.D., Pharm.D.; Gillian Woollett, Ph.D.
Panel de Expertos en Pronunciación
WILLIAM M. HELLER, PH.D., Presidente
Kent Johnson, M.Pharm.; David F. Long, Ph.D.; Joan C.
May, Ph.D.; Anthony Palmieri, Ph.D.; Ginette Pepper,
Ph.D.; Thomas P. Reinders, Pharm.D.
Calidad de Cuidado de la Salud
DENNIS DOHERTY, M.D., FCCP, Presidente
Timothy Albertson, Ph.D.; Phil Ayers, Pharm.D.; Danial
Edwin Baker, Pharm.D.; Mark Decerbo, Pharm.D.; Peter
Glassman, M.B.B.S.; Roy Guharoy, Pharm.D., M.B.A.;
Raymond Hohl, M.D.; Duane Kirking, Ph.D.; Raymond
Love, Pharm.D.; Oneka Bynoe Marriott, D.0., M.P.H.;
Marcus Reidenberg, M.D.; Melody Ryan, Pharm.D.;
Joanne Schwartzberg, M.D.; Patricia Sokol, J.D.; J. Russell
Teagarden, D.M.H.; jeanne Tuttle, B.S. Pharm.; Terri
Warholak, Ph.D.
Panel de Expertos en Clasificación de Alergias e
Intolerancias a los Medicamentos
RAYMOND LOVE, PHARM.D., Presidente
Gay Dolin, M.S.N.; Roy Guharoy, Pharm.D., M.B.A.;
Robert Hausam, M.D.; Russell Leftwich, M.D.; Robert
McClure, M.D.; Gerald McEvoy, Pharm.D.; Tejal Patel,
Pharm.D.; Seth Powsner, Ph.D.; George Allen Robinson,
B.S. Pharm; Shelly Spiro, B.S. Pharm
Panel de Expertos en Educación para la Salud
JOANNE G. SCHWARTZBERG, M.D., Presidente
Cindy Brach, MPP; joseph Chebli, Pharm.D.; Nicole
Cook, Ph.D.; Terry Davis, Ph.D.; Radhika Devraj, Ph.D.;
Oneka Bynoe Marriott, D.0., M.P.H.; Gerald McEvoy,
Pharm.D.; juliet Nguyen, Pharm.D.; Ruth Parker, M.D.;
Seth Powsner, Ph.D.; N. Lee Rucker; Patricia Sokol, j.D.;
Charity Strothers, Pharm.D.; J. Russell Teagarden,
D.M.H.; Keith Trettin, B.S. Pharm
Panel de Expertos en Guías Modelo para Todos los
Productos Comercializados
DUANE M. KIRKING, PH.D., Presidente
Daniel E. Baker, Pharm.D.; Lauren Hoffman, Pharm.D.;
Gerald McEvoy, Pharm.D.; Seth Powsner, Ph.D.; N. Lee
Rucker; Brian Solow, M.D.; J. Russell Teagarden, D.M.H.;
Jeanne Tuttle, B.S. Pharm
Panel de Expertos en Seguridad de Nutrición
Parenteral
PHIL AYERS, PHARM.D., Presidente
Mary B. Baker, Pharm.D.; Elizabeth Bobo, M.S.; Denise
Bohrer, Ph.D.; joseph Boullata, Pharm.D.; Mark Decerbo,
Pharm.D.; Kathleen M. Gura, Pharm.D.; Deborah
Houston, Pharm.D.; Matthew T. jenkins, M.S.; Gordon
Scott Sacks, Pharm.D.; Maureen Schanck, Pharm.D.;
David Seres, M.D.; Connie Rae Sullivan, B.S. Pharm
USP 40
Monografías 1 de Medicamentos Químicos
RICHARD A BLESSING, M.S., Presidente
Gennady Ananchenko, Ph.D.; Elizabeth (Betsy) Cariello;
Alain Duguet, Ph.D.; Leslie Furr, M.S.; Rupa lyer, M.S.;
Monika Jain, Ph.D.; Greg Kaster, M.S.; Jasmina
Novakovic, Ph.D.; Naidu Petla, Ph.D.; Jeff Rohrer, Ph.D.;
David Schuck, Ph.D.; Nilesh Shinde, M.S.; Jan Srbek,
Ph.D.; Giordano Trazzi, Ph.D.
Monografías 2 de Medicamentos Químicos
ERNEST PARENTE, PH.D., Presidente
Mahmoud Al Omari, Ph.D.; Allan Bokser, Ph.D.; Matthew
Borer, Ph.D.; Jama Elmi, Ph.D.; Michael Koberda, Ph.D.;
Joan C. May, Ph.D.; Beth Minter; Maria lnes Santoro,
Ph.D.; Jeff Schwartzenhauer, M.S.; Dennis Stephens,
Ph.D.; Sumathi V. Rao, Ph.D.; Luciano Virgili, Ph.D.;
Zhenyu Wang, Ph.D.; Joseph Yakupkovic, Ph.D.; Patrick
Yat, Ph.D.
Monografías 3 de Medicamentos Químicos
BERNARD A ÜLSEN, PH.D., Presidente
Samuel Akapo, Ph.D.; Bianca Avramovitch, Ph.D.; Amy
Barker, Ph.D.; Lynn Blessing, M.S.; Thomas Broadbent,
Ph.D.; lan Chung, Ph.D.; Debashis Das, Ph.D.; Jeffrey
Fleitman, Ph.D.; Yuri Goldberg, Ph.D.; Qamrul Islam,
M.S.; Eric Kesslen, Ph.D.; Pauline Lacroix, M.S.; Donald
Parsons, Ph.D.; David Reed, M.B.A.; Murugan Saravanan,
M.S.; Joseph Stowell, Ph.D.
Monografías 4 de Medicamentos Químicos
KIM c. HUYNH-BA, M.S., Presidente
Malleswara Reddy Annarapu, Ph.D.; Mukul Dalvi, Ph.D.;
Josep Maria de Ciurana Gay, M.S.; Simona Dragan,
Ph.D.; Natalia Borisovna Epshtein, Pharm.D., M.S.N.;
Quanyin Gao, Ph.D.; Jerome M. Lewis, Ph.D.; Osear Liu,
Ph.D.; Mariann Neverovitch, M.S.; Patrick Noland, M.S.;
James A. Ponto, M.S.; Hemant Kumar Sharma, Ph.D.;
William Taraszewski, Ph.D.; Martin Williamson, Ph.D.;
Min Xia, Ph.D.; Steve S. Zigler, Ph.D.
(821) Identificación y Valoración de Radionucleidos,
y (1821) Teoría y Practica de la Radioactividad y
(1823) Panel de Expertos en Medicamentos para
Tomografía de Emisión de Positrones
SALLY w. SCHWARZ, M.S., Presidente
Cathy Sue Cutler, Ph.D.; Jonathan M. Fitzsimmons,
Ph.D.; Paula M. Jacobs, Ph.D.; Thijs Kroon, Pharm.D.;
Jerome M. Lewis, Ph.D.; Roger Moroney, M.S.; James A.
Ponto, M.S.; Duann V. Thistlethwaite, B.S.; Steven S.
Zigler, Ph.D.
Panel de Expertos en Agentes No-Radioactivos para
Diagnóstico por Imágenes
JEROME M. LEWIS, PH.D., Presidente
Francisco Aguilar-Parrilla, Ph.D.; James Walter Brodack,
Ph.D.: Dilip R. Choudhury, Ph.D.; Francette Delaloge,
Ph.D.; Joseph Louis Glajch, Ph.D.; Ernest Víctor Groman,
Ph.D.; Gordon Craig Hill, Ph.D.; Aurelie Mieze-Richard,
Pharm.D.; Patrick Noland, M.S.; Scott Roberts
Panel de Expertos en Medicamentos Radioactivos
JAMES A. PONTO, M.S., Presidente
Corinne Bensimon, Ph.D.; Jonathan M. Fitzsimmons,
Ph.D.; Umesh Gangadharmath, Ph.D.; Thijs Kroon,
Pharm.D.; Adrian Nunn, Ph.D.; David Pipes, Ph.D.; Kara
Weatherman, Pharm.D.; Martín Williamson, Ph.D.; Steve
Zigler, Ph.D.
Monografías 5 de Medicamentos Químicos
AMY J. KARREN, Presidente
D.J. Doan, M.S; Sushil Gangwal, Ph.D.; Assad Kazeminy,
Ph.D.; Min Li, Ph.D.; Judy Lin, M.S.; Pauline McGregor,
Integrantes / Comités xv
Ph.D.; Marian Meyer, Ph.D., M.B.A.; Jonathan Parks;
Justin Pennington, Ph.D.; Vijaya Ramesh, B.Pharm.;
Gurvinder Singh Rekhi, Ph.D.; lffaaz Salahudeen, Ph.D.;
Mary W. Seibel; Hameraj Singh, Ph.D.; Michael Skibic,
M.S.
Monografías 6 de Medicamentos Químicos
DAVID A FAY, PH.D., Presidente
Seamus Boland; Robert Graham Buice, Ph.D., M.B.A.;
Tina Engel, Ph.D.; Timothy Gilmor, Ph.D.; Carmen
Gonzalez, Ph.D.; John Herries, Ph.D.; Todd Lewis, M.S.;
William Long, Ph.D.; Phil Nethercote, Ph.D.; Raphael
Ornaf, Ph.D.; David Hitchcock Rogers, Ph.D.; Thomas
Rosanske, Ph.D.; Christina Szabo, Ph.D.; Reinhard Walter,
Ph.D.; Xiaoping Wang, Ph.D.; Kylen Whitaker, Ph.D.;
Zeena Williams, Ph.D.
Panel de Expertos en Acetaminofeno de Venta Libre
KYLEN WHITAKER, PH.D., Presidente
Tina M. Engel, Ph.D.; David A. Fay, Ph.D.; Saulius A.
Gylys; Michael T. Rankin, M.S.; David H. Rogers, Ph.D.;
Gregory K. Webster, Ph.D.; Jonathan Zeszotarski, Ph.D.
Monografías 1 de Productos Biológicos-Péptidos
MIKE DE FELIPPIS, PH.D., Presidente
Wilfried ArL, Ph.D.; Chaim Eidelman, Ph.D.; Gerhard
Haas, Ph.D.; Morten Hach, M.S.; Marion King, Ph.D.;
Jean-Marc Poudrel, Ph.D.; Harold Rode, Ph.D.; Raimon
Rubires, Ph.D.; Zachary Shriver, Ph.D.; Ved Srivastava,
Ph.D.; Aleksander Swietlow, Ph.D.; Michael Verlander,
Ph.D.
Panel de Expertos en Glatiramer
ZACHARY SHRIVER, PH.D., Presidente
Joseph Louis Glajch, Ph.D.; Gyongyi Gratzl, Ph.D.;
Satyanarayana Kota, Ph.D.; Todd A Osiek, Ph.D.; Marcia
Cecilia Rusjan; Rakesh Singh Shekhawat, Ph.D.; Zachary
Shriver, Ph.D.; Rene Thuermer, Ph.D.; Michael
Verlander, Ph.D.; Vera Weinstein, Ph.D.
Panel de Expertos en Glucagón
HAROLD RODE, PH.D., Presidente
Jan Amstrup, Ph.D.; Matthew W. Borer, Ph.D.; Adrian F.
Bristow, Ph.D.; Gerhard Manfred Haas, Ph.D.; Anne
Munk Jespersen, Ph.D.; Elizabeth Clark Kramer, Ph.D.
Monografías 2 de Productos Biológicos-Proteínas
MICHAEL MULKERRIN, PH.D., Presidente
Gregory Beck, Ph.D.; Heather Boux, Ph.D.; Chris Burns,
Ph.D.; Frédéric Carriere, Ph.D.; Stefan Christians, Ph.D.;
Michel Girard, Ph.D.; Anne Munk Jespersen; Sridevi
Khambhampaty, Ph.D.; Robert Mayer, Ph.D.; Ned
Mozier, Ph.D.; Dhananjay Patankar, Ph.D.; Mauricio
Seigelchifer, Ph.D.; Jill Crouse-Zeineddini, Ph.D.
Panel de Expertos en Ensayos de la Función del Fe
JILL CROUSE-ZEINEDDINI, PH.D., Presidente
Shan Chung, Ph.D.; Marina Feschenko, Ph.D.; Scott
Kuhns, Ph.D.; LeeAnn Machiesky, M.S.; Ned Mozier,
Ph.D.; Veena Pai Raiker, Ph.D.; Bhavin Parekh, Ph.D.;
Max Tejada, Ph.D.
Monografías 3 de Productos Biológicos-Productos
Biológicos Complejos
EDWARD K. CHESS, PH.D., Presidente
Mehrshid Alai, Ph.D.; Pascal Anger, Ph.D.; Parastoo
Azadi, Ph.D.; Svetlana Bergelson, Ph.D.; Barbara Blum,
Ph.D., M.P.H.; Mirella Ezban, Ph.D.; Elaine Gray, Ph.D.;
Donald Maclean, Ph.D.; Nicole Provost, Ph.D.; Elizabeth
l. Read, M.D.; Peter Vandeberg, Ph.D.; Christian Viskov,
Ph.D.; Darin Weber, Ph.D.
xvi Comités / Integrantes
Panel de Expertos en Heparina Bovina No
Fraccionada
WESLEY E. WORKMAN, PH.D., Presidente
Tania Andrade, B.S. Pharm.; Irene Bartoli, B.Sc.; Maria
Leticia Bertot, Pharm.D.; Elaine Gray, Ph.D.; Marco
Guerrini, Pharm.D.; Kristian johansen, Ph.D.; Robert
Linhardt, Ph.D.; Barbara Mulloy, Ph.D.; Marilene Nuss
Rangel; Zachary Shriver, Ph.D.; Pearle Torralba, Ph.D.;
Christian Viskov, Ph.D.
Panel de Expertos en Células CD-34 Positivas-
CONCLUIDO
NICOLE M. PROVOST, PH.D., Presidente
Ruud Hulspas, Ph.D.; Elizabeth l. Read, M.O.; Michael D.
Rosu-Myles, Ph.D.; Luisa Saraiva, Ph.D.; Richard j.
Stebbings, Ph.D.; D. Robert Sutherland, M.Sc.; Lili Wang,
Ph.D.; Albertus W. Wognum, Ph.D.
Panel de Expertos en Heparinas de Bajo Peso
Molecular
ELAINE GRAY, PH.D. y EDWARD K. CHESS, PH.D., Ca-Presidentes
Nicolas C.R. Amiot, Ph.D.; Malleswarareddy Annarapu,
Ph.D.; Christopher P. Bryant, Ph.D.; lshan Capila, Ph.D.;
Venkatesan S. Chidambaram, Ph.D.; Gyongyi S. Gratzl,
Ph.D.; Kristian johansen, Ph.D.; Edwin Rudolf Kellenbach,
Ph.D.; Barbara Mulloy, Ph.D.; Anna K.Y. Nordin; Bruna
Parma, M.Sc.; Zachary Shriver, Ph.D.; Christian Viskov,
Ph.D.
Capítulos Generales-Análisis Biológico
WESLEY E. WORKMAN, PH.D., Presidente
Robert Bel!, Ph.D.; Mahesh Bhalgat, Ph.D.; Adrian
Bristow, Ph.D.; Christopher jones, Ph.D.; jeremy Kunkel,
Ph.D.; Huijuan Li, Ph.D.; Kenneth Miller, Ph.D.; Anthony
Mire-Sluis, Ph.D.; Anthony A.G. Ridgway, Ph.D.; Wendy
Saffell-Clemmer, M.S.; Martin Vanderlaan, Ph.D.;
Teruhide Yamaguchi, Ph.D.; Earl Zablackis, Ph.D.
Panel de Expertos en Creación de Bancos de Células
ROBERT BELL, PH.D., Presidente
Anne Gondran, Ph.D.; Luhong He, Ph.D.; Ruud Hulspas,
Ph.D.; jette Dina Kreiberg, Ph.D.; Michael Laird, Ph.D.;
Lye Theng Lock, Ph.D.; Archie Lovatt, Ph.D.; Sam
Yaghmour, M.S.; Earl Zablackis, Ph.D.
Panel de Expertos en ADN Residual en Productos
Obtenidos por Biotecnología
WESLEY E. WORKMAN, PH.D., Presidente
Pascal R. Anger, Ph.D.; jan R. Barman; Audrey Chang,
Ph.D.; Scott Kuhns, Ph.D.; Weihong Wang, Ph.D.; judith
Zhu-Shimoni, Ph.D.
Panel de Expertos en Pruebas para la Identificación
por Resonancia Magnética Nuclear (NMR) de
Vacunas Polisacáriáos
CHRISTOPHER jONES, PH.D., Presidente
Yves Aubin, Ph.D.; Francesco Berti, Ph.D.; Cristiana
Campa, Ph.D.; Thomas P. jacques, Ph.D.; Michael T.
Janes, Ph.D.; jeremy P. Kunkel, Ph.D.; Neil Ravenscroft,
Ph.D.; Philippe Talaga, Ph.D.; Earl Zablackis, Ph.D.
Panel de Expertos en Vacunas Virales
EARL ZABLACKIS, PH.D., Presidente
Lapa Adhikary, Ph.D.; Luca Benetti, Ph.D.; Sunil Gairola,
Ph.D.; Lucy Gisonni-Lex, M.S.; Keith Howard, Ph.D.;
Christopher jones, Ph.D.; Archie Lovatt, Ph.D.; Brij Patel,
Ph.D.; Silke Schepelmann, Ph.D.; Vaneet Sharma, Ph.D.;
Mark Van Ooij, Ph.D.
Capítulos Generales-Análisis Químico
NANCY LEWEN, B.Sc., Presidente
Anthony Bevilacqua, Ph.D.; Christopher Burgess, Ph.D.;
Robert Cambron, Ph.D.; Thomas DiFeo, Ph.D.; john
Dolan, Ph.D.; joseph Louis Glajch, Ph.D.; john
USP 40
Hammond; john Hinshaw, Ph.D.; Brent Kleintop, Ph.D.;
Steven Leinbach, M.S.; Gregory Martin, M.S.; Nuno
Matos, B.Sc.; Osear Quattrocchi, M.Sc.; Helmut
Rockstroh, Ph.D.; Mark Schweitzer, Ph.D.; Timothy
Shelbourn, M.S.; Rostyslaw O. Slabicky, B.Sc.; Teri Soli,
Ph.D.; Kevin A. Swiss, Ph.D., Timothy j. Wozniak, Ph.D.
Panel de Expertos en Quimiometría
PEI CHEN, PH.D. y NUNO MATOS, Ca-Presidentes
Chunsheng Cai, Ph.D.; Robert Tom Cambron, Ph.D.;
Peter de B. Harrington, Ph.D.; Mark j. Henson, Ph.D.;
Yang (Angela) Liu, Ph.D.; Zhenqi (Pete) Shi, Ph.D.; Yvan
C.D. Vander Heyden, Ph.D.; Stanislav O. Zakharkin,
Ph.D.; Lin Zhang, Ph.D.
Panel de Expertos en Impurezas Elementales
NANCY LEWEN, B.Sc., Presidente
Charles Barton, Ph.D., DABT; Courtney M. Callis, MPH,
DABT; Steven J. Dentali, Ph.D.; Anna M. Fan, Ph.D.,
DABT; Edward james Fletcher; Bruce A. Fowler, Ph.D., A.
T.S.; Roland Frotschl; Assad j. Kazeminy, Ph.D.; Richard
Ko, Pharm.D., Ph.D.; Melissa M. Phillips, Ph.D.; Timothy
L. Shelbourn, M.B.A., M.S.
Panel de Expertos en Buenas Prácticas de
Documentación-CONCLUIDO
KIM c. HUYNH-BA, M.S., Presidente
Kathleen V. Brady, B.S.; Frank J. Diana, Ph.D.; Lisa Ann
Fink, .MBA; Craig Hamilt<:>n, Ph.D:; judy Lin, M.S.; Anjan
K. M1ttal, M.Pharm.; Kevm A. Sw1ss, Ph.D.
Panel de Expertos en Modernización de Pruebas de
ldentificacion
NANCY LEWEN, B.SC., Presidente
Michelle R. Adamson; Anthony C. Bevilacqua, Ph.D.;
Geoffrey P.R. Carr, Ph.D.; Pei Chen, Ph.D.; jonathan W.
DeVries, Ph.D.; Maryna Dmitriieva, Ph.D.; Michael
Hornig, Ph.D.; Bernard A. Olsen, Ph.D.; jeffrey S. Rohrer,
Ph.D.; Anne M. Warner, Ph.D.
(467) Panel de Expertos en Disolventes Residuales
ÜSCAR A. QUATTROCCHI, M.Sc., Presidente
Coleman C. Chasteen, M.S.; john Connelly, Ph.D.; jeffrey
Fleitman, Ph.D.; john V. Hinshaw, Ph.D.; Bruce P.
johnson, Ph.D.; Eric C. Kesslen, Ph.D.; Brent Kleintop,
Ph.D.; Elizabeth Kovacs; Paul W. Lockwood, M.S.;
Gregory P. Martin, M.S.; Kevin A. Swiss, Ph.D.; Yuwen
Wang, Ph.D.
Panel de Expertos en Validación y Verificación
GREGORY P. MARTIN, M.S., Presidente
Kimber L. Barnett, Ph.D.; Christopher Burgess, Ph.D.;
Paul D. Curry, Ph.D.; joachim Ermer, Ph.D.; Gyongyi S.
Gratzl, Ph.D.; john P. Hammond, FRSC; Elizabeth Kovacs;
David j. LeBlond, Ph.D.; Rosario LoBrutto, Ph.D.; Anne K.
McCasland-Keller, Ph.D.; Pauline L. McGregor, Ph.D.;
Phil Nethercote, Ph.D.; Allen C. Templeton, Ph.D.; David
P. Thomas, Ph.D.; M.L. Jane Weitzel
Panel de Expertos en Agua para Uso Analítico y
Farmacéutico
TERI c. Süll, PH.D., Presidente
Anthony C. Bevilacqua, Ph.D.; Lucia Clontz, D.H.Sc.,
M.Sc.; Max S. Lazar; Nancy Lewen, B.Sc.; Bruno Rossi,
M.S.; Rostyslaw O. Slabicky, B.Sc.
Capítulos Generales-Análisis Físico
XIAORONG HE, PH.D., Presidente
Shaukat Ali, Ph.D.; Lawrence H. Block, Ph.D.; Geoff Carr,
Ph.D.; Martin Coffey, Ph.D.; Tim Freeman; David j.
Goldfarb, Ph.D.; Bruno Hancock, Ph.D.; Stephen Hoag,
Ph.D.; Mario Hubert, Ph.D.; Richard Meury; Matthew
Mullarney, M.S.; Prabu Nambiar, Ph.D.; Myke Scoggins,
Ph.D.; Changquan Sun, Ph.D.; Allen Templeton, Ph.D.;
USP 40
Eloise Welfare, Ph.D.; Dale Wurster, Ph.D.; Bing-Shiou
Yang, Ph.D.; Geoff Zhang, Ph.D.
Panel de Expertos en Impurezas en Fármacos y
Productos Farmacéuticos
PRABU NAMBIAR, PH.D., M.B.A., Presidente
Abdullah M. Al-Mohizea, Ph.D.; Shaukat Ali, Ph.D.;
Steven W. Baertschi, Ph.D.; ]udy P. Boehlert, Ph.D.;
Robert G. Buice, Ph.D.; Greg ]. Davies; Xiaorong He,
Ph.D., M.B.A.; Kim C. Huynh-Ba, M.S.; Michael Koberda,
Ph.D.; Robert E. Osterberg, R.Ph., Ph.D., Fellow-ATS;
Ernest Parente, Ph.D.; Osear Quattrocchi, M.Sc.; David
H. Rogers, Ph.D.; Mark Schweitzer, Ph.D.; Mary W.
Seibel; Rostyslaw O. Slabicky, B.Sc.; Teri C. Soli, Ph.D.;
Kevin A. Swiss, Ph.D.
Capítulos Generales-Formas Farmacéuticas
]AMES E. DE MUTH, PH.D., Presidente
Emmanuel Akala, Ph.D.; llgaz Akseli, Ph.D.; Scott Aldrich;
Susan Cady, M.S.; Paul Curry, Ph.D.; Mario González,
Ph.D.; Vivian A. Gray, B.S.; Ralph Heasley, Ph.D.;
Anthony Hickey, Ph.D.; Michael Houghton; Munir A.
Hussain, Ph.D.; Johannes Kramer, Ph.D.; Stefan Leiner,
Ph.D.; David Long, Ph.D.; John Mauger, Ph.D.; Colin
Minchom, Ph.D.; ]olyon Mitchell, Ph.D.; Muller Pierre-
Alain, Ph.D.; Guirag ~oochikian, Ph.D.; Chetar:i Pujara,
Ph.D.; Shobhan Sabrns, Ph.D.; ]ohn Shabushn1g, Ph.D.;
]ason Suggett, Ph.D., M.B.A.; Raymond D. Skwierczynski,
Ph.D.; Monica Tejwani, Ph.D.; Thomas Tice, Ph.D.; Kevin
Warner, Ph.D.; Mehran Yazdanian, Ph.D.
(771) Panel de Expertos en Preparaciones Oftálmicas
ASHIM K. MITRA, PH.D., Presidente
Dale S. Aldrich, Ph.D.; Cynthia M. Bach, M.S.; Martin
Coffey, Ph.D.; Paul Curry, Ph.D.; ]effrey S. Fleitman,
Ph.D.; John Mauger, Ph.D.; Seshadri Neervannan, Ph.D.;
Stacey M. Platzer; Chetan Pujara, Ph.D.; Satish K. Singh,
Ph.D.; Monica Tejwani, Ph.D.; Thomas R. Tice, Ph.D.
(788) Panel de Expertos en Partículas en Inyectables
DALE S. ALDRICH, PH.D., Presidente
Dan Berdovich; Kevin Dahl, Ph.D.; Robert Gavin, M.S.;
Kent A. Peterson; Dean Ripple, Ph.D.
Panel de Expertos en Cápsulas Rellenas con Líquido
VIVIAN A. GRAY, B.S., Presidente
Ewart Cole, Ph.D.; ]ean-Luc Colin, Ph.D.; ]oe Fotso,
Ph.D.; Munir A. Hussain, Ph.D.; Vi N. Schmidt, M.S.;
Stephen C. Tindal; Madhusudan Vudathala, M.Pharm.,
M.B.A.
Panel de Expertos en Pruebas de Desempeño de
Formas Farmacéuticas Semisólidas
KAILAS THAKKER, PH.D., Presidente
Eric Beyssac, Ph.D.; Bryan Crist; james E. De Muth,
Ph.D.; Geoffrey N. Grove, Ph.D.; L. Thomas Hall, Ph.D.;
]ohn S. Heaney; Matthew Kersey, Ph.D.; Hans-]uergen
Knitter; Patricia L. Lee, M.S.; Patrick C. Mahn; William M.
Rosenthal; Steve W. Shaw
Panel de Expertos en los Criterios de Solubilidad
para Fármacos de Uso Veterinario
MARIO A GONZALEZ, PH.D., Presidente
Susan Cady, M.S.; ~ryan Crist; Robert P. Hunter, M.S.,
Ph.D.; Mark G. Pap1ch, M.S., D.V.M.; Alan F. Parr,
Pharm.D., Ph.D.; Monica Tejwani, Ph.D.
Panel de Expertos en el Uso de Enzimas en la Prueba
de Disolucion de Cápsulas de Gelatina
VIVIAN A GRAY, B.S., Presidente
Ewart Cole, Ph.D.; ]oan M. Dalla Riva Toma, Ph.D.; Luigi
Ghidorsi; ]ian-Hwa Guo, Ph.D.; Feixue Han, Ph.D.; Jian-
Hwa Han, Ph.D.; Christopher T. Hosty; ]ianmei D.
Kochling, Ph.D.; ]ohannes Kramer, Ph.D.; Thomas
Integrantes /Comités xvii
Langdon; Steven R. Leinbach; Stefan Leiner, Ph.D.;
Gregory P. Martin, M.S.; Steven M. Meyerhoffer, Ph.D.;
Richard C. Moreton, Ph.D.; Krishnaswamy S. Raghavan,
Ph.D.; Edward Shneyvas, Ph.D.; ]ason A. Suggett, Ph.D.;
Stephen C. Tindal; Madhusudan Vudathala, M.Pharm.,
M.B.A.; Hu Wang, M.S.
Panel de Expertos en Inspección Visual de
Parenterales
RUSSELL E. MADSEN, M.S., Presidente
Dale S. Aldrich, Ph.D.; ]ohn D. Ayres, M.O., J.D.; Roy
Cherris; ]ohn G. Shabushnig, Ph.D.; Deborah Shnek,
Ph.D.
Capítulos Generales-Microbiología
DAVID HUSSONG, PH.D., Presidente
James Agalloco, M.S.; james Akers, Ph.D.; Dilip Ashtekar,
Ph.D.; Anthony Cundell, Ph.D.; Dennis Guilfoyle, Ph.D.;
Rajesh Gupta, Ph.D.; Russell Madsen, M.S.; Karen
McCullough, M.S.; Robert Mello, Ph.D.; David Roesti,
Ph.D.; Donald Singer, M.S.; Paul Stinavage, Ph.D.;
Edward Tidswell, Ph.D.
Panel de Expertos en Métodos Modernos
Microbiológicos
ANTHONY CUNDELL, PH.D. Y EDWARD TIDSWELL, PH.D., Co-
Presidentes
Thierry Bonnevay, Ph.D.; Ralph Breton, B.S. Pharm.;
Claudio Denoya, Ph.D.; Gary du Moulin, Ph.D.; ]ohn
Duguid, B.Sc.; Rajesh Gupta, Ph.D.; David Hussong,
Ph.D.; Matthew Jenkins, M.S.; Amy Lynn McDaniel,
Ph.D.; Michael Miller, Ph.D.; Felix Montero ]ulian, Ph.D.;
David Newon, Ph.D.; Kuldip Patel; Steven Richter, Ph.D.;
David Roesti, Ph.D.; Yongqiang Zhang, Ph.D.; Steve S.
Zigler, Ph.D.
Capítulos Generales-Envasado y Distribución
MARY G. FOSTER, PHARM.D., BFA, Presidente
Bettine Boltres, Ph.D.; Glaucia Braga, Ph.D.; Jeffrey
Carrico, Pharm.D.; Chris Chandler, Pharm.D.; Michael N.
Eakins, Ph.D.; Dana Guazzo, Ph.D.; Renaud Janssen,
Ph.D.; Dennis ]enke, Ph.D.; Wendy Mach, B.Sc.; Dan
Malinowski; Daniel Norwood, Ph.D.; Devinder Pal, M.
Pharm.; Robert Seevers, Ph.D.; Cheryl Stults, Ph.D.; Li
Xiong, Ph.D.; Gao Yonghua, B.S.Pharm.
(381) Panel de Expertos en Tapones Elastoméricos
para Inyectables
DIANE M. PASKIET, M.S. y RENAUD ]ANSSEN, PH.D., Ca-Presidentes
Douglas J. Ball, M.S., DABT; Michael N. Eakins, Ph.D.;
Dana Guazzo, Ph.D.; Dennis R. ]enke, Ph.D.; Heinz
Kirchmeyer, Ph.D.; Philippe LeGall, M.S.; Daniel L.
Norwood, Ph.D.; Michael A. Ruberto, Ph.D.; Wai (John)
Wong, Ph.D.; Lisa M. Yoest, M.S.
(659) Panel de Expertos en Requisitos de Envasado y
Almacenamiento
CHRIS CHANDLER, PHARM.D., Presidente
Glaucia Braga, B.Sc.; Jeffrey Carrico, Pharm.D.; Mary G.
Foster, Pharm.D. BFA; Eleanor Freeman, B.S.; Wendy
Mach, B.Sc.; Devinder Pal, M.Pharm.; Robert H. Seevers,
Ph.D.; Gao Yonghua, B.S. Pharm; Li Xiong, Ph.D.
Panel de Expertos en Biocompatibilidad de los
Materiales Usados en Sistemas de Envasado,
Dispositivos Médicos e Implantes
DANIEL L. NORWOOD, PH.D., Presidente
Douglas J. Ball, M.S.; Stephen A. Barat, Ph.D.; William P.
Beierschmitt, Ph.D.; Denise Bohrer, Ph.D.; Tage C.G.
Carlson, Ph.D.; Michael N. Eakins, Ph.D.; Jill A. Glosson,
B.A.; John lannone, B.Sc.; Renaud ]anssen, Ph.D.;
Douglas E. Kiehl, M.Sc.; Wendy Mach, B.Sc.; Anita Y.
Sawyer, M.S.; Cheryl Stults, Ph.D.
xviii Comités / Integrantes
Panel de Expertos en Materiales para Ensayos
Clínicos (Buenas Prácticas de Distribución)
MARY G. FOSTER, PHARM.D., BFA, Presidente
Rafik H. Bishara, Ph.D.; Glaucia K. Braga, Ph.D.; Jeffrey
Carrico, Pharm.D.; Steven A. Jacobs, M.B.A.; Martin
Jeiven, M.S.; Claude Jolicoeur, B.S.
(661.3) Panel de Expertos en Sistemas Plásticos
Usados en la Fabricación de Medicamentos
DENNIS R. JENKE, PH.D., Presidente
Denise G. Bestwick, B.S.; Weibing Ding, Ph.D.; Michael
N. Eakins, Ph.D.; Mary G. Foster, Pharm.D., BFA; James
Hathcock, Ph.D.; Jerold (Jerry) M. Martin, M.Sc.; Diane
M. Paskiet, M.S.; Robert Steininger; Cheryl L.M. Stults,
Ph.D.; Ken M. Wong, M.Sc.
Capítulos Generales-Estadísticas
ROBERT R. SINGER, M.S., Presidente
Bruno Boulanger, Ph.D.; Richard Burdick, Ph.D.; David
Christopher, M.S.; David Lansky, Ph.D.; Dave LeBlond,
Ph.D.; Juris Meija, Ph.D.; Anthony Okinczyc, M.P.H.;
Peter Rigsby, M.S.; Dennis Sandell, Ph.D.; Timothy
Schofield, M.A.; Charles Tan, Ph.D.; Edwin van den
Heuvel, Ph.D.; Jane Weitzel; Harry Yang, Ph.D.
Panel de Expertos en Uniformidad de Contenido con
Muestras de Gran Tamaño
DENNIS SANDELL, PH.D., Presidente
James S. Bergum, Ph.D.; Walter Hauck, Ph.D.; Jeffrey
Hofer, M.S.; Gregory L. Lamer, M.S.
Comités de Expertos del Formulario
Nacional
Monografías 1 de Excipientes
ERIC MUNSON, PH.D., Presidente
Thiago Carvalho, Ph.D.; Brian Carlin, Ph.D.; Richard
Cawthorne, Ph.D.; Richard Creekmore, Ph.D.; Vivek
Dave, Ph.D.; Felicitas Guth; Otilia Koo, Ph.D.; Devalina
Law, Ph.D.; Phil Merrell, Ph.D.; Dominic Moore; Chris
Moreton, Ph.D.; Jasmine Musakhanian, M.S.; Charles
Vesey, M.S.; Richard Wendt, Ph.D.
(1059) Panel de Expertos en Desempeño de
Excipientes
ERIC A. SCHMITI, PH.D., Presidente
Abdullah M. Al-Mohizea, Ph.D.; Shaukat Ali, Ph.D.;
Lawrence H. Block, Ph.D.; Patrick Deluca, Ph.D.; Carl
Frey, M.S.; Xiao_rong He, Ph.D., M.B.A.; _Stephen W.
Hoag, Ph.D.; M1chelle A. Long, Ph.D.; Richard C.
Moreton, Ph.D.; Prabu Nambiar, Ph.D., M.B.A.; James
A. Ponto, M.S.; Kent Sternitzke, Ph.D.; Kevin A. Swiss,
Ph.D.; Sean V. Taylor, Ph.D.
(1197) Panel de Expertos en Buenas Prácticas de
Distribución para Excipientes Farmacéuticos a
Granel
RICHARD c. MORETON, PH.D., Presidente
Lawrence H. Block, Ph.D.; William Dale Carter, M.S.;
Zak T. Chowhan, Ph.D.; Marc Fages; Elizabeth
Ferguson-Brown; Mary G. Foster, Pharm.D., BFA;
Linda A. Herzog, M.B.A.; Ashok V. Katdare, Ph.D.;
Zakiya Kurdi, Ph.D.; Edward G. Malawer, Ph.D., CQA;
Frank Milek, Ph.D.; Becc~ Mitchell; Dwight Mutchler;
Garnet E. Peck, Ph.D.; M1ke Schultz, R.Ph.; Alexa
Smith, M.S.; Glenn Sokoloski; Kelly Taylor; Jiasheng
Tu, Ph.D.
USP 40
Monografías 2 de Excipientes
MARY c. HOUCK, PH.D., Presidente
Lawrence H. Block, Ph.D.; Andrew Bluj; Tim Cabelka,
Ph.D.; Arya Jayatilaka, Ph.D.; Russell Maus, Ph.D.; Robert
E. Osterberg, R.Ph., Ph.D., Fellow-ATS; Julie Warner Pier,
M.S.; Anisuf Quadir, Ph.D.; Gwen Rucker; Barbara Serr,
Ph.D.; Huimin Sun, Ph.D.; Jiasheng Tu, Ph.D.; Fan Wu,
Ph.D.; Timothy Yasika
Panel de Expertos en Glicerina
TIM B. CABELKA, PH.D., Presidente
Carlos E. Bortolotto, B.~.; Franc~s K. Byrne, M.S.; lan
A. Duncan, Ph.D.; Balaj! V. Kadn, M.Pharm., M.Sc.,
MBA; Tanja Natterer; Marian J. Rinken, Ph.D.; Gwen
E. Rucker, B.S.; David A. Sharknas, B.S.; Hong Zhou,
Ph.D.
Panel de Expertos en Povidonas-CONCLUIDO
BERNHARD D. FUSSNEGGER, PH.D. Y CARL PERINI, M.S., Co-
Presidentes
Feng Chen, Ph.D.; David J. Filiar, MBA; Edward G.
Malawer, Ph.D.; Syed A.A. Rizvi, Ph.D.; John W. Spink,
Ph.D.; Fan Wu, Ph.D.
Panel de Expertos en Métodos Relacionados con
Talco
JULIE WARNER PIER, M.S. Y MARTIN RUTSTEIN, PH.D., Co-
Presidentes
Daniel Crane; Sean M. Fitzgerald, B.Sc.; Mickey E.
Gunter, Ph.D.; Don Halterman, M.S.; Mary C. Houck,
Ph.D.; Lee Poye, B.Sc.; Matthew S. Sanchez, Ph.D.;
Alan M. Segrave, B.Sc.; Gary P. Tomanino, B.Sc.;
Drew R. Van Ordern, M.A.; James Webber, Ph.D.
Comités de Expertos de la USP y del
Dietary Supplements Compendium
Suplementos Dietéticos Botánicos y Medicamentos
Herbolarios
ROBIN J. MARLES, PH.D., Presidente
Thomas Brendler, B.A.; Josef A. Brinckmann; Paula
Naomi Brown, Ph.D.; Angela Calderon, Ph.D.; Steven
Dentali, Ph.D.; Edward Fletcher, B.A.; Stefan Gafner,
Ph.D.; Joerg Gruenwald, Ph.D.; De-an Guo, Ph.D.;
Sukhdev Swami Handa, M.Pharm., Ph.D.; James Harnly,
Ph.D.; Craig Hopp, Ph.D.; Scott A. Jordan, Ph.D.; lkhlas
Khan, Ph.D.; Richard Ko, Pharm.D., Ph.D.; Tieraona Low
Dog, M.D.; Mirtha Navarro, Ph.D.; Pilar Pais, Ph.D.;
Guido Pauli, Pharm.D., Ph.D.; Eike Reich, Ph.D.; Paul
Schiff, Ph.D.; Shangmei Shi, B.Sc.
Panel de Expertos en Herbal Medicines
Compendium-Asia Oriental
DE-AN Gua, PH.D., Presidente
Yuan-shiun Chang, Ph.D.; Shilin Chen, Ph.D.; Takashi
Hakamatsuka, Ph.D.; Shen Ji, Ph.D.; Yeong Shik Kim,
Ph.D.; Hwee-Ling Koh, Ph.D.; Clara Bik San Lau, Ph.D;
Ping Li, Ph.D.; Qing Li, Ph.D.; Shuangcheng Ma,
Ph.D.; Shangmei Sni; Viet Hung Tran, Ph.D.; Pengfei
Tu, Ph.D.; Wanying Wu, Ph.D.; Zhongzhen Zhao,
Ph.D.
Panel de Expertos en Herbal Medicines
Compendium-Sur de Asia
SUKHDEV S. HANDA, PH.D., FNAIM, FNA.SC, Presidente
Amit Agarwal, Ph.D.; Rasadah Mat Ali, Ph.D.;
Mohamed Zahir Mohammed Farhad; C.K. Katiyar,
Ph.D.; Ami Fazlin Syed Mohamed, Ph.D.; A.
Nagarajan, Ph.D.; D.G. Naik, Ph.D.; Sankaran
Natarajan, Ph.D.; M.K. Raina, Ph.D.; J.L.N. Sastry,
Ph.D.; Rajeev Kr. Sharma, Ph.D.; R. Sundaram, Ph.D.;
Neeraj Tandon, Ph.D.; Surapote Wongyai, Ph.D.
USP 40
Modelado de la Seguridad de Suplementos Dietéticos
MARY L. HARDY, M.D., Presidente
V.A. Shiva Ayyadurai, Ph.D.; Mary A. Fox! Ph.D., MPH;
Scott A. ]ordan, Ph.D.; Mkaya Mwambun, M.D., Ph.D.,
MA (Econ); Diane R. Mould, Ph.D.; Robert E. Osterberg,
R.Ph., Ph.D., Fellow-ATS; Charlie Yoe, Ph.D.
Suplementos Dietéticos No-Botánicos
DENNIS K. J. GORECKI, B.S.P., PH.D., Presidente
]oseph Betz, Ph.D.; Michael Bradley, M.S.; james Brooks,
Ph.D.; Bi_ll Gurl~y, Ph.D.; Chung ~yun, M.S.; Joy ]oseph,
M.S.; Ra1mar Lobenberg, Ph.D.; Richard Myers, Ph.D.;
james Neal-Kababick, B.Sc.; Peter Rice, Pharm.D., Ph.D.;
Amy Roe, Ph.D.; Fabio Soldati, Ph.D.; Aniko Solyom,
Ph.D.; Karunakar Sukuru, Ph.D.; Darryl Sullivan, Ph.D.;
Edward Waysek, Ph.D.
(2251) Panel de Expertos en Adulteración de
Suplementos Dietéticos con Fármacos y Análogos
de Fármacos
DENNIS K. J. GORECKI, B.S.P., PH.D., Presidente
]oseph M. Betz, Ph.D.; Pei Chen, Ph.D.; Hans Geyer,
Ph.D.; Jana B. Hildreth, B.A.; Hwee-Ling Koh, Ph.D.;
lkhlas A. Khan, Ph.D.; Cynthia L. Morris-Kukoski,
Pharm.D., DABAT, FAACT; James Neal-Kababick, B.Sc.;
Olivier Rabin, Ph.D.; ]ohn Spink, Ph.D.; Darryl
Sullivan, Ph.D.; Nicole Vu, Ph.D.; Kate Yu, Ph.D.
Panel de Expertos en Suplementos Dietéticos de
Liberación Prolongada
]OY A ]OSEPH, M.S., Presidente
Charles Barton, Ph.D., DABT; ]oseph F. Borzelleca,
Ph.D.; Michael S. Bradley, M.S.; James R. Brooks,
Ph.D.; Marion Ehrich, Ph.D.; Vivian A. Gray, B.S.;
Carol ]ohnston, Ph.D., RD; Raimar Li:ibenberg, Ph.D.;
Alexander G. Schauss, Ph.D., FACN; Elizabeth A.
Yetley, Ph.D.
Comités de Expertos del food Chemicals
Codex
Ingredientes Alimenticios
]ONATHAN w. DEVRIES, PH.D., Presidente
]anet Balson, M.S.; Richard C. Cantrill, Ph.D.; ]unshi
Chen, M.D.; Hwei-Fang Cheng, Ph.D.; Henry Chin,
Ph.D.; Grady Chism, Ph.D.; Robin Churchill, Ph.D.; Roger
Clemens, DrPH; ]ohn Clos, Ph.D.; Helen Darling, Ph.D.;
Andrew Ebert, Ph.D.; ]aap Evers, Ph.D.; Carl Frey, M.S.;
Einat Haleva, Ph.D.; Lori Klopf, Ph.D.; Hemant G. Koshia,
Ph.D.; Dana Krueger, B.Sc.; Diane McColl, ].D.; Bert
Popping, Ph.D.; Yoko Uematsu, Ph.D.; Yongning Wu,
Ph.D.; Liangli Yu, Ph.D.
Panel de Expertos en Adulteración de Alimentos
HENRY CHIN, PH.D., Presidente
Grant Abernethy, Ph.D.; David Bolliet; Richard C.
Cantrill, Ph.D.; Christophe Cavin, Ph.D.; Robín
Churchill, Ph.D.; Helen Darling, Ph.D.; Jonathan W.
DeVries, Ph.D.; Andrew Ebert, Ph.D.; Kim Huynh-Ba,
M.S.; Shaun Kennedy; Dana Krueger, B.Sc.; Michele
Lees, Ph.D.; Bert Popping, Ph.D.; Lars Reimann, M.S.;
Roman Romero, Ph.D.; Thomas Tarantelli, B.Sc.; Yoko
Uematsu, Ph.D.; Saskia van Ruth, Ph.D.; Carl Winter,
Ph.D.; Yongning Wu, Ph.D.
Panel de Expertos en la Identificación de Riesgos
de la Adulteración de Alimentos
HENRY CHIN, PH.D., Presidente
Andrew Ebert, Ph.D.; Richard Lane, Ph.D.; Diane
McColl, ].D.; Bert Popping, Ph.D.; Joseph Scimeca;
Carl Winter, Ph.D.
Integrantes / Comités xix
Panel de Expertos en Métodos no Dirigidos para
Ingredientes Lácteos
ROBERT MAGALETTA, PH.D., Presidente
Sned Bhandari, Ph.D.; ]onathan W. DeVries, Ph.D.;
Gerard Downey, Ph.D.; Stephen Ellison, Ph.D.; james
M. Harnly, Ph.D.; Steven Holroyd, Ph.D.; Gregory A.
lsraelson, B.Sc.; ]oseph Katzenmeyer, Ph.D.; Moon S.
Kim, Ph.D.; Andrew Mackey, Ph.D.; Benjamin B.
Perston, Ph.D.; Jianwei Qin, Ph.D.; Roman Romero,
Ph.D.; Paul Wehling; Steven Zbylut, Ph.D.
Panel de Expertos en Calidad y Autenticidad de
Aceite de Oliva
RICHARD c. CANTRILL, PH.D., Presidente
Diego Luis Garcia-Gonzalez, Ph.D.; Claudia Guillaume,
M.Sc.; Zohar Kerem, Ph.D.; Paul H. Miller, B.A.;
Agusti ]ordi Romero, Ph.D.; Selina Wang, Ph.D.
Comités de Expertos de la USP y de la
USP on Compounding
Preparación Magistral
GIGI S. DAVIDSON, B.S.PHARM., DICVP, Presidente
Lisa Ashworth, B.S.Pharm., R.Ph.; Gus Bassani, Pharm.D.;
Ruth Ebiasah, Pharm.D., M.S.; Edmund J. Elder, ]r.,
Ph.D.; Ryan Forrey, Pharm.D., M.S.; Deborah Houston,
Pharm.D.; Brenda ]ensen, M.A.; Patricia C. Kienle,
M.P.A.; William A. Mixon, M.S.; ]ohn Musil, Pharm.D.;
David Newton, Ph.D.; Alan Parr, Pharm.D., Ph.D.; Abby
Roth; Robert Shrewsbury, Ph.D.; Connie Rae Sullivan, B.
S. Pharm.; james T. Wagner; Brenda Yuzdepski, B.S.
Pharm.
Panel de Expertos en Preparación Magistral con
Fármacos Peligrosos
PATRICIAc. KIENLE, M.P.A., Presidente
Thomas H. Connor, Ph.D.; Eric Kastango, M.B.A., B.S.
Pharm.; Melissa A. McDiarmid, M.D., MPH; Kenneth
R. Mead, Ph.D.; Martha Polovich, Ph.D.; Lucille A.
Power; james T. Wagner
Enlaces Gubernamentales ante los
Comités de Expertos y los Paneles de
Expertos
Enlaces de la Administración de Alimentos y
Medicamentos de los EE.UU.
Eileen Abt, Ph.D.; Rajiv Agarwal, Ph.D.; Mohammed Ahmed,
M.S.; Ali Al-Hakim, Ph.D.; Om Anand, Ph.D.; jane Axelrad, J.
D.; Matthew Barlow, RN, BSN; Eden Bermingham, DVM,
MS, DACVCP; ]onathan Bray, B.S.; Michael Brent; Michael
Brewer, Ph.D.; Daniel Brown, Lucinda Buhse, Ph.D.; Teresa
Cain, Ph.D.; Steven Casper, Ph.D.; Wiley Chambers, M.D.;
Jane Chang, Ph.D.; Richard Chang, Ph.D.; Anissa Cheung,
Ph.D.; Donna Christner, Ph.D.; ]ohn Cipollo, Ph.D.; David
Claffey, Ph.D.; Mike Darj, Ph.D.; Swapan De, Ph.D.; lan
DeVeau, Ph.D.; Michelle Dillahunt, Ph.D.; Shulin Ding,
Ph.D.; Zedong Dong, Ph.D.; Jinhui Dou, Ph.D.; Jason
Dreabit, M.A.; Okponanabofa Eradiri, Ph.D.; Cory Evans,
Ph.D.; Raafat Fahmy, Ph.D.; Daniel Folmer, Ph.D.; Rick
Friedman, M.S.; Michael Furness, M.S.; Zongming Gao,
Ph.D.; Mohamed Ghorab, Ph.D.; Tapash Ghosh, Ph.D.;
Devinder Gill, Ph.D.; Gurpreet Gill-Sangha, Ph.D.; Lillie
Golson, Pharm.D.; Edisa Gozun, Pharm.D.; Damon Green,
M.D.; Yin Guo, Ph.D.; Linan Ha, Ph.D.; William Hallett,
Ph.D.; Blake Hamann, Ph.D.; Bruce Harris, Ph.D.; Danielle
Marie Harris, Pharm.D.; William Hess, B.S. Pharm; Hank
Hoang, Ph.D.; Gloria Huang, Ph.D.; Laura Huffman, M.S.;
Gregory Hunter, Ph.D.; Latiff Hussain, Ph.D.; Mai Huynh,
Ph.D.; Robert lser, M.S.; ]oseph E. Jablonski, Ph.D.; Young
xx Comités / Integrantes
jhon; Ravindra Kasliwal, Ph.D.; john Kauffman, Ph.D.; David
Keire, Ph.D.¡ Michael Kennedy, Ph.D.; james ~en~ey, Ph.D.;
Andrea Kerngan, M.S.; Saeed Khan, Ph.D.; Erm K1m, Ph.D.;
Kathryn E. King, Ph.D.; Donald Klein, Ph.D.; Bogdan
Kurtyka, Ph.D.; Stephen Langille, Ph.D.; David Lau, M.A.;
Hyoung S Lee, Ph.D.; Sau Lee, Ph.D.; Xihao Li; jennifer
Liang, Ph.D.; Tsai-Lien Lin, Ph.D.; Heather Lombardi, Ph.D.;
Ewa Marszal, Ph.D.; Marilyn Ma~tinez, Ph.D.; Timothy
McGovern, Ph.D.; Jeffrey Medw1d, Ph.D.; Randa Melhem,
Ph.D.; john Metcalfe, Ph.D.; Yana Mille, B.S. Pharm; Amit
Mitra, Ph.D.; Magdi Mossoba, Ph.D.; Laura Moussa, Ph.D.;
Karunakar Neelam, Ph.D.; Pallavi Nithyanandan, Ph.D.;
Rache! Novak, Ph.D.; Steven Oh, Ph.D.; Frank Perrella,
Ph.D.; Erika Pfeiler, Ph.D.; Laura Pague, Ph.D.; Zhihao Peter
Qiu, Ph.D.; Ziyaur Rahman, Ph.D.; Radhika Rajagopalan,
Ph.D.; Muthukumar Ramaswamy, Ph.D.; Sam G. Raney,
Ph.D.; Ashutosh Rao, Ph.D.; Andre Raw, Ph.D.; Shahnaz
Read! Ph.D.; Bhagwant Rege, Ph.D.; james Rice, Ph.D.; jasan
Rodnguez, Ph.D.; Sara Rothman; Allen Rudman, Ph.D.; R.O.
Satzger, Ph.D.; Zuben Erach Sauna, Ph.D.; Peter Scholl;
Suzanne Sechen, Ph.D.; Hamid Shafiei, Ph.D.; Rakhi Shah,
Ph.D.; Balajee Shanmugam, Ph.D.; Xiaobin Shen, Ph.D.;
Akhtar Siddiqui, Ph.D.; Mark Skasko, Ph.D.; Fenhong Song,
Ph.D.; jannavi Srinivasan, Ph.D.; Benjamin Stevens, M.P.H.;
Maria Stevens-Riley, Ph.D.; Yichun Sun, Ph.D.; Zhigang Sun,
Ph.D.; jennifer Swisher, Ph.D.; Frank Switzer, Ph.D.; Neeru
Takiar, M.S.; jennifer Thomas, Ph.D.; Yiying Tsai, Pharm.D.;
Saleh Turujman, Ph.D.; Katherine Tyner, Pn.D.; Alex
USP 40
Viehmann, Ph.D.; john Whyte, Ph.D.; Steve Wolfgang,
Ph.D.; Bingyuan Wu, Ph.D.; Geoffrey Wu, Ph.D.; Larisa Wu,
Ph.D.; jo Wyeth, Pharm.D.; Xiaoming Xu, Ph.D.; Betsy jean
Yakes, Ph.D.; jingyue Yang, Ph.D.; Sri Rama Krishnaiah
Yellela, Ph.D.; Xavier Ysern, Ph.D.; Jin Zhang, Ph.D.; Yuda
long, Ph.D.
Otros Enlaces Gubernamentales
Agency for Healthcare Research and Quality
Diane D. Cousins, RPh
U.S. Centers for Disease Control and Prevention
Nadine Shehab, Pharm.D., M.P.H.; Melissa Schaefer,
M.O.
Health Canada
Victoria Kyeyune, Ph.D.; jessica Priem, M.S.
In Memóriam
La USP extiende su reconocimiento a los siguientes
Voluntarios Expertos y Enlaces Gubernamentales quienes
fallecieron durante el ciclo 2015-2020:
Scott V.W. Sutton, Ph.D. (Comité de Expertos en
Capítulos Generales-Microbiología)
USP 40 Integrantes / Miembros xxi

Miembros y Delevados de
la Convención de la
Farmacopea de los Estados
Unidos de América a partir
del 31 de mayo de 2016
Indiana University School of Medicine, David R. Jones, Ph.D.
Instituciones Académicas y joan C. Edwards School of Medicine Marshall University, Gary
Asociaciones Vinculadas- O. Rankin, Ph.D.
johns Hopkins University School of Medicine, Daniel M. Ashby,
Asociaciones Académicas M.S., FASHP
Keck School of Medicine of University of Southern California,
American Association of Colleges of Nursing, Ginette A. Paul D. Holtom, M.D.
Pepper, Ph.D. Loma Linda University Schoo/ of Medicine, ]ohn N. Buchholz,
American Association of Colleges of Osteopathic Medicine, An- Ph.D.
thony J. Silvagni, D.0., Pharm.D., M.Sc., FACOFP, FAFPE Louisiana State University School of Medicine, Kurt ]. Varner,
American Association of Colleges of Pharmacy, Lucinda L. Ph.D.
Maine, Ph.D., R.Ph. Louisiana State University School of Medicine at Shreveport,
Association of American Medica/ Colleges, David W. Henry R. McKnight, B.S., M.S., Pharm.D.
Nierenberg, M.D. Layo/a University Chicago Stritch School of Medicine, ]awed
Association of American Veterinary Medica/ Colleges, Dawn M. Fareed, Ph.D.
Boothe, D.V.M., Ph.D., M.S. Mayo Medica/ School, Peter ]. Post, Pharm.D., R.Ph.
Association of Faculties of Pharmacy of Canada, Raimar Loe- Medica/ University of South Carolina College of Medicine,
benberg, Ph.D. Kenneth D. Tew, Ph.D.
Meharry Medica/ College School of Medicine, Clivel G.
Instituciones Académicas y Charlton, Ph.D.
Mercer University School of Medicine, Wayne Glasgow, Ph.D.
Asociaciones Vinculadas- Michigan State University College of Human Medicine, Rami B.
lbrahim, M.Sc., Pharm.D., BCPS, BCOP
Universidades y Facultades de Morehouse School of Medicine, Ward Kirlin, Ph.D.
Medicina Mount Sinai School of Medicine, ]oel S. Mindel, M.D., Ph.D.
New York Medica/ College, Mario A. lnchiosa, Ph.D.
Baylor Co/lege of Medicine, Lynn C. Yeoman, Ph.D. New York University School of Medicine, Lewis S. Nelson,
Bastan University School of Medicine, Carol T. Walsh, Ph.D.
M.D.
Northeast Ohio Medica/ University College of Medicine, Werner
Brody School of Medicine at East Carolina University, Abdel A.
Abdel-Rahman, Ph.D., FAHA Geldenhuys, Ph.D.
Northwestern University Feinberg School of Medicine, Steven
Case Western Reserve University School of Medicine, Walter B.
Geho, M.D., Ph.D. M. Belknap, M.D.
Ohio State University College of Medicine, Robert ]. Weber,
Chicago Medica/ School at Rosalind Franklin University of Medi-
cine and Science, Ann K. Snyder, Ph.D.
Pharm.D., M.S.
Pennsylvania State University Co/lege of Medicine, Kelly D.
Columbia University Co/lege of Physicians and Surgeons, Ru-
dina Odeh-Ramadan, Pharm.D. Karpa, Ph.D., R.Ph.
Rutgers, the State University of New jersey, New jersey Medica/
Creighton University School of Medicine, Peter W. Abel, Ph.D.
School, Deborah Lazzarino, Ph.D.
Duke University School of Medicine, Sharon L. Ellison,
Rutgers, the State University of New jersey, Robert Wood
Pharm.D.
johnson Medica/ School, Susan Goodin, Pharm.D., FCCP,
East Tennessee State University james H. Quillen College of
Medicine, Kenneth E. Ferslew, Ph.D.
BCOP
Eastern Virginia Medica/ School, Senthil Kumar Rajasekaran, Saint Louis University School of Medicine, Heather Macarthur,
M.D. Ph.D., B.Sc.
San juan Bautista School of Medicine, Marielis E. Rivera Ruiz,
Florida State University College of Medicine, Graham A.
Patrick, Ph.D. Ph.D.
Geisel School of Medicine at Dartmouth, Lionel D. Lewis, M.D. Sidney Kimmel Medica/ College at Thomas jefferson University,
Georgetown University School of Medicine, Thomas G.
Walter Kraft, M.D., M.S., FACP
Southern 11/inois University School of Medicine, Carl Faingold,
Sherman, Ph.D.
Howard University College of Medicine, Robert E. Taylor, M.D., Ph.D.
SUNY at Buffalo School of Medicine and Biomedical Sciences,
Ph.D., FACP
Paul J. Kostyniak, Ph.D., DABT
xxii Miembros / Integrantes
SUNY Downstate Medica/ Center College of Medicine, jacob V.
Aranda, M.D., Ph.D., FRCPC
SUNY Upstate Medica/ University, David F. Lehmann, M.D.,
Pharm.D.
Temple University School of Medicine, Alan Cowan, Ph.D.
Texas A&M Hea/th Science Center College of Medicine, D.
Samba Reddy, Ph.D., R.Ph.
The Warren Alpert Medica/ School of Brown University, Wayne
D. Bowen, Ph.D.
Tufts University School of Medicine, Ross W. Thompson, M.S.,
R.Ph.
Tulane University School of Medicine, David W. Busija, Ph.D.,
M.D. (Hon.)
Uniformed Services University of the Health Sciences, Louis R.
Cantilena, M.D., Ph.D.
Universidad Central del Caribe School of Medicine, Harry
Mercado, M.D.
University of Alabama at Birmingham School of Medicine,
Richard J. Whitley, M.D.
University of Arizona College of Medicine, Hillary A. Franke,
M.D., M.S.
University of Arkansas far Medica/ Sciences College of Medicine,
Paul L. Prather, Ph.D., B.S.
University of California Davis School of Medicine, Timothy E.
Albertson, M.D., M.P.H., Ph.D.
University of California San Francisco School of Medicine, Linda
L. Liu, M.D.
University of Chicago Pritzker School of Medicine, Michael L.
Maitland, M.D., Ph.D.
University of Cincinnati College of Medicine, Marianne F. lvey,
Pharm.D., M.P.H., FASHP
University of Connecticut Health Center School of Medicine,
Kimberly j. Metcalf, Pharm.D.
University of Hawaii john A. Burns School of Medicine, Robert
A. Nichols, Ph.D.
University of Jllinois College of Medicine at Chicago, Randal A.
Skidgel, Ph.D.
University of Jowa Carver College of Medicine, Donald E. Le-
tendre, Pharm.D.
University of Kansas School of Medicine, Sam j. Enna, Ph.D.
University of Kentucky College of Medicine, Lisa A. Cassis,
Ph.D.
University of Louisville School of Medicine, Demetra
Antimisiaris, Pharm.D., CGP, FASCP
University of Maryland School of Medicine, Margaret M.
McCarthy, Ph.D.
University of Massachusetts Medica/ School, Roy Guharoy,
Pharm.D., M.B.A., FCP, FCC, FASHP
University of Miami Miller School of Medicine, joshua D. Len-
chus, D.O., R.Ph., FACP
University of Michigan Medica/ School, Paul F. Hollenberg,
Ph.D.
University of Mississippi School of Medicine, Deborah S. Minor,
Pharm.D., FAHA
University of Missouri-Kansas City School of Medicine, james
M. Wooten, Pharm.D.
University of Nebraska College of Medicine, L. Charles Murrin,
Ph.D.
University of Nevada Schoo/ of Medicine, lain L. Buxton,
Pharm.D.
University of New Mexico Health Sciences Center School of
Medicine, Arti Prasad, M.D.
University of North Dakota School of Medicine and Health
Sciences, james E. Porter, Ph.D.
University of Oklahoma College of Medicine, Pramod K.
Chetty, M.D.
University of Pennsylvania School of Medicine, Patrick j.
Brennan, M.D.
University of Pittsburgh Schoo/ of Medicine, Dennis P.
Swanson, M.S.
University of Puerto Rico School of Medicine, Miguel A.
Marrero, M.D.
University of South Alabama College of Medicine, jack A. Di-
Palma, B.S., M.D.
USP 40
University of South Carolina School of Medicine, Kenneth B.
Walsh, Ph.D.
University of South Florida Morsani College of Medicine, Shu-
feng Zhou, M.D., Ph.D.
University of Tennessee, Memphis College of Medicine, Trevor
W. Sweatman, Ph.D.
University of Texas Medica/ School at Houston, Gary C.
Rosenfeld, Ph.D.
University of Utah School of Medicine, Richard J. Sperry, M.D.,
Ph.D.
University of Virginia School of Medicine, Robert J. Meyer,
M.D.
University of Washington School of Medicine, Suzanne M.
Allen, M.D., M.P.H.
University of Wisconsin School of Medicine and Public Health,
F. Michael Hoffmann, Ph.D.
Vanderbilt University School of Medicine, C. Michael Stein,
M.D.
Virginia Commonwealth University School of Medicine,
Dominic A. Sica, M.D.
Wake Forest University School of Medicine, Kathy P. Bricker,
Pharm.D., BCPS
Washington University School of Medicine in St. Louis, Evan D.
Kharasch, M.D., Ph.D.
Wayne State University School of Medicine, Stephen A. Lerner,
M.D.
Wright State University Boonshoft School of Medicine, Khalid
M. Elased, Ph.D., R.Ph.
Ya/e University School of Medicine, Seth Powsner, M.D.
Instituciones Académicas y
Asociaciones Vinculadas-
Universidades y Facultades de
Farmacia
Auburn University Harrison School of Pharmacy, William R. Ra-
vis, Ph.D.
Butler University College of Pharmacy and Health Sciences, Su-
dip K. Das, Ph.D.
Campbel/ University Schoo/ of Pharmacy, Antoine Al-Achi,
M.S.Pharm., Ph.D., M.S.
Chicago State University College of Pharmacy, Duc P. Do,
Ph.D.
Creighton University School of Pharmacy and Health
Professions, J. Christopher Bradberry, Pharm.D.
Drake University College of Pharmacy and Hea/th Sciences,
Abebe E. Mengesha, Ph.D.
Duquesne University Mylan School of Pharmacy, Ira S.
Buckner, Ph.D.
Ernest Mario School of Pharmacy at Rutgers University, Long-
qin Hu, Ph.D.
Ferris State University College of Pharmacy, Kim E. Hancock,
Ph.D.
Florida A & M University College of Pharmacy and
Pharmaceutical Sciences, Mandip Sachdeva, Ph.D.
Hampton University School of Pharmacy, Chengan Du, Ph.D.,
M.P.H.
Howard University College of Pharmacy, Nursing and Allied
Health Sciences, Emmanuel O. Akala, Ph.D.
ldaho State University College of Pharmacy, Kevin W.
Cleveland, Pharm.D.
Lake frie College of Osteopathic Medicine Schoo/ of Pharmacy,
Sachin S. Devi, B.Pharm., Ph.D.
Loma Linda University School of Pharmacy, W. William
Hughes, Ph.D.
Long Jsland University Arnold and Marie Schwartz College of
Pharmacy and Health Sciences, David R. Taft, B.S.Pharm.,
Ph.D.
Massachusetts College of Pharmacy and Hea/th Sciences-
Boston, David A. Williams, Ph.D.
Massachusetts College of Pharmacy and Health Sciences Schoo/
of Pharmacy-Worcester, Robert Campbell, Ph.D., M.S.
USP 40
Mercer University College of Pharmacy and Health Sciences,
J. Grady Strom, Ph.D.
Midwestern University Chicago College of Pharmacy, Anna Ka-
bakov, Pharm.D.
Midwestern University College of Pharmacy-Glendale, Bill J.
Bowman, Ph.D., R.Ph.
North Dakota State University College of Pharmacy, Nursing
and Allied Sciences, Jagdish Singh, Ph.D.
Northeastern University Bouve College of Health Sciences
School of Pharmacy, Mansoor M. Amiji, Ph.D.
NOVA Southeastern University College of Pharmacy, Hamid H.
Omidian, Ph.D., M.Sc., B.Sc.
Ohio Northern University Raabe College of Pharmacy, Jenelle
L. Sobotka, Pharm.D.
Oregon State University College of Pharmacy, J. Mark
Christensen, Ph.D.
Pacific University College of Health Professions School of
Pharmacy, Susan M. Stein, R.Ph., M.S.
Palm Beach Atlantic University Gregory School of Pharmacy,
Adwoa O. Nornoo, B.Pharm., M.S., Ph.D.
Purdue University School of Pharmacy and Pharmaceutical
Sciences, Stephen R. Byrn, Ph.D.
Roseman University of Health Sciences College of Pharmacy,
Mark C. Decerbo, Pharm.D., BCPS, BCNSP
Samford University McWhorter School of Pharmacy, John J.
Arnold, Ph.D., B.S.
Shenandoah University Bernard f. Dunn School of Pharmacy,
Nina Hengen, M.O., Ph.D.
South Carolina College of Pharmacy, James J. Sterrett,
Pharm.D., BCPS
South Dakota State University College of Pharmacy, David L.
Helgeland, B.S.Pharm., M.B.A., Ed.D.
South University School of Pharmacy, S. Craig Dyar, Ph.D.
Southern 11/inois University Edwardsville School of Pharmacy,
William M. Kolling, Ph.D.
Southwestern Oklahoma State University School of Pharmacy,
Shelly Stockton, Ph.D.
St. john's University College of Pharmacy and Allied Health
Professions, Abu Serajuddin, Ph.D.
St. Louis College of Pharmacy, John Pieper, Pharm.D.
SUNY at Buffalo School of Pharmacy and Pharmaceutical
Sciences, Alfred T. Reiman, R.Ph.
Temple University School of Pharmacy, Michael Borenstein,
Ph.D.
Texas Southern University College of Pharmacy and Health
Sciences, Dong Liang, Ph.D.
Texas Tech University Health Sciences Center School of
Pharmacy, Arthur A. Nelson, Ph.D., R.Ph.
The Ohio State University College of Pharmacy, Robert W.
Brueggemeier, Ph.D.
The University of Arizona College of Pharmacy, Michael Ma-
yersohn, Ph.D.
The University of lowa College of Pharmacy, Mickey L. Wells,
Ph.D.
The University of Louisiana at Monroe College of Pharmacy,
Sami M. Nazzal, Ph.D.
The University of North Carolina at Chapel Hill Eshe/man
School of Pharmacy, Dennis M. Williams, Pharm.D.
The University of Texas at Austin College of Pharmacy, Janet C.
Walkow, Ph.D.
The University of Toledo College of Pharmacy, Kenneth S.
Alexander, R.Ph., Ph.D.
Tauro University California College of Pharmacy, Alison
McCormick, Ph.D.
University of Arkansas far Medica/ Sciences College of
Pharmacy, Melanie Reinhardt, Pharm.D.
University of California San Diego Skaggs School of Pharmacy
and Pharmaceutical Sciences, Grace M. Kuo, Pharm.D.,
Ph.D., M.P.H.
University of California San Francisco School of Pharmacy,
Leslie Z. Benet, Ph.D.
Integrantes / Miembros xxiii
University of Cincinnati james L. Winkle College of Pharmacy,
Pankaj B. Desai, Ph.D.
University of Colorado Skaggs School of Pharmacy, Peter J.
Rice, Pharm.D., Ph.D.
University of Connecticut School of Pharmacy, Peter ). Tycz-
kowski, R.Ph., M.B.A.
University of Florida College of Pharmacy, Rhonda
Cooper-DeHoff, Pharm.D., M.S., FAHA
University of Georgia College of Pharmacy, Gurvinder Singh
Rekhi, Ph.D., M.S.
University of Houston College of Pharmacy, F. Lamar Pritchard,
Ph.D.
University of 11/inois at Chicago College of Pharmacy,
Stephanie Y. Crawford, Ph.D., M.P.H.
University of Kansas School of Pharmacy, Christian Schoneich,
Ph.D.
University of Kentucky College of Pharmacy, Eric J. Munson,
Ph.D.
University of Maryland School of Pharmacy, Natalie D.
Eddington, Ph.D.
University of Michigan College of Pharmacy, Gregory E. Ami-
don, B.S., Ph.D.
University of Minnesota College of Pharmacy, Marilyn K. Spee-
die, Ph.D.
University of Mississippi School of Pharmacy, Michael A.
Repka, D.D.S., Ph.D.
University of Missouri-Kansas City School of Pharmacy, Cydney
E. McQueen, Pharm.D.
University of Nebraska Medica/ Center College of Pharmacy,
Michael F. Powell, B.S. Pharm., M.S.
University of New Mexico College of Pharmacy, Lynda S.
Welage, B.S., Pharm.D.
University of Oklahoma College of Pharmacy, Vibhudutta
Awasthi, Ph.D., M.Pharm.
University of Pittsburgh School of Pharmacy, Michael A. Ze-
maitis, Ph.D.
University of Rhode /sland College of Pharmacy, David R.
Worthen, Ph.D., J.D.
University of Sao Paulo College of Pharmacy, Prof. Terezinha
de Jesus Andreoli Pinto
University of Southern California School of Pharmacy, Stan G.
Louie, Pharm.D.
University of Tennessee Health Science Center College of
Pharmacy, Laura A. Thoma, Pharm.D., B.S.
University of the Pacific Thomas f. Long School of Pharmacy
and Health Sciences, Xiaoling Li, Ph.D.
University of the Sciences in Philadelphia, Philadelphia College
of Pharmacy, Daniel A. Hussar, Ph.D.
University of Utah College of Pharmacy, John W. Mauger,
Ph.D.
University of Washington School of Pharmacy, Thomas K. Haz-
let, Pharm.D., Dr.P.H.
University of Wisconsin-Madison School of Pharmacy, James E.
DeMuth, Ph.D., R.Ph.
University of Wyoming School of Pharmacy, Kurt Dolence,
Ph.D.
Virginia Commonwealth University/Medical College of Virginia
School of Pharmacy, Phillip M. Gerk, Pharm.D., Ph.D.
Washington State University College of Pharmacy, Danial E.
Baker, Pharm.D., FASHP, FASCP
Wayne State University Eugene Applebaum College of
Pharmacy and Hea/th Sciences, Sheila M. Wilhelm,
Pharm.D.
West Virginia University School of Pharmacy, Arthur l. Jackno-
witz, Pharm.D.
Western University of Health Sciences College of Pharmacy, Su-
nil Prabhu, Pharm.D., R.Ph.
Wilkes University Nesbitt School of Pharmacy, Harvey A.
Jacobs, Ph.D.
Xavier University of Louisiana College of Pharmacy, Tarun K.
Mandal, Ph.D.
xxiv Miembros / Integrantes
Instituciones Académicas y
Asociaciones Vinculadas-
Universidades y Facultades de
Medicina Osteopática
NOVA Southeastern University College of Osteopathic Medicine
Nicole Cook, Ph.D., M.P.H. '
Organizaciones de Consumidores
y Otras Organizaciones que
Representan el Interés Público
AARP, Leigh Purvis
Alzheimer's Association, William Thies, Ph.D.
American Autoimmune Related Diseases Association, Virginia T.
Ladd, R.T.
American Cancer Society, Mark Clanton, M.O., M.P.H.
Amer(can Diabetes Asspciation,.Ja.ne L. Chiang, M.O.
Amencan Health Qualtty Assoc1att0n, Kenneth Mishler, R.Ph.,
Pharm.D.
American Heart Association, Robert Lee Page 11, Pharm.D.,
M.S.P.H., FCCP, FAHA, FASHP, FASCP, BCPS CGP
Arthritis Foundation, John H. Klippel, M.O. ' Min1stry of Health of the Republtc of Belarus, Liudmila
Center far Science in the Public lnterest, David G. Schardt,
M.S.
Consumers Union, Lisa L. Gill, B.A.
ECRI lnstitute, Jeffrey C. Lerner, Ph.D.
lnstitute far Safe Medication Practices, Michael R. Cohen,
R.Ph., M.S., Se.O., FASHP
National Consumers League, Karin Bolte, J.D.
National Council on Patient lnfarmation and Education
William R. Bullman, M.A.M. ' National Association of Boards of Pharmacy, Elizabeth Scott
Nf:!t!onal Os~eoporosis Foundation, Amy Porter
W1//1am J. Clinton Foundation, Rodger W. Stringham, Ph.D.
Organismos, Divisiones y
Asociaciones Gubernamentales
Vinculados
Agency far Healthcare Research and Quality, Scott R. Smith,
Ph.D.
Argentine Pharmacopoeia, Héctor A. Giuliani, Pharm.D.
Asso~(ation of Food and Drug Officials, Cynthia T. Culmo
Braz1/wn Pharmacopoeia Commission, Mónica da Luz Car-
valho Soares
Brazil's National Jnstitute of Quality Control in Health Filipe
Soares Quirino Silva, Ph.D. ' National Jnstitutes far Food and Drug Control, Bo Li, Ph.D.
British Pharmacopoeia Commission, James Pound
Centers far Disease Control and Prevention, Cindy P.
Dougherty, Pharm.D.
Centers far Medicare & Medicaid Services, Jeffrey A. Kelman,
M.O.
China National Center far Food Safety Risk Assessment, Junshi
Chen, M.O.
Chinese Pharmacopoeia Commission, Zhang Wei
Department of Veterans Affairs Veterans Health Administration
Timothy J. Stroup, R.Ph.
European Directorate far the Quality of Medicines and
HealthCare, Susanne Keitel
FDA Center far Biologics Evaluation and Research, John G.
Bishop 111, Ph.D.
FDA Center far Devices and Radiological Health, Marilyn M.
Lightfoote, M.O., Ph.D.
FDA Center far Drug Evaluation and Research Pallavi
Nithyanandan, Ph.D. ' UK), MPSSL, FPCPharm
FDA Center far Food Safety and Applied Nutrition, Daniel E.
Folmer, Ph.D.
USP 40
FDA Center far Veterinary Medicine, Janis R. Messenheimer,
D.V.M.
Federal Commission far Protection Against Sanitary Risks, Rocio
del Carmen Alatorre Eden-Wynter, M.C.
Federal Service on Surveillance in Healthcare of Russian
Federation, Valentina F. Kosenko, Ph.D., Pharm.
Food and f!~ugs Authority, Ghana, Eri.c .Karikari-Boateng, M.S.
Food, Medicine and Hea/th Care Admin1stration and Control
Authority of Ethiopia, Yehulu Denekew Alamneh, B.Sc.,
M.A.
Genera! Directorate of Medicines, Supplies and Drugs, Laura
Ceron, Pharm.D.
Health Canada, Karen Reynolds
Health Canada, Food Directorate, Barbara Lee
Health Canada, Natural and Non-prescription Health Products
Directorate, Jeannine R. Ritchot
lndian Pharmacopoeia Commission, G.N. Singh, Ph.D.,
M.Pharm.
lndonesian Pharmacopoeia Commission, Augustine Zaini, M.S.
lnternational Trade Administration-U.S. Department of
Commerce, James D. Rice, B.A., M.A.
japan's Ministry of Health Labour and Welfare,
Pharmaceuticals and Medica/ Devices Agency, Nobuo
Uemura
fardan Food and Drug Administration, Dr. Lubna R. Qusous
M(n(stry of Food and Drug Safety, Dr. Jin-Ho Wang
Reutskaya, Pharm.D.
Ministrr of Health of the Republic of Uzbekistan, Mirzohidjon
Kodirov, Ph.D.
Ministry of Health of Turkey, Filiz Bütev Ko~, Ph.D.
Morocco's Directorate of Medicines and Pharmacy, Laila
Hakkou
National Agency far Food and Drug Administration and
Control, Dr. Monica H. Eimunjeze
Russell, B.S.Pharm.
National Center far Quality Control, Ofelia del Rosario Villalva
Rojas, Q.F.
National Centre far Expertise of Drugs, Medica/ Products and
Medica/ Equipment, Ardak U. Tuíegenova, Ph.D.
National Drug Authority of Uganda, Gordon Katende
Sematiko
National Health Surveillance Agency, Lais Santana Dantas B.S.
National lnstitute far Biological Standards and Control Aci'rian
F. Bristow, Ph.D. '
National lnstitute of Drug and Food Surveillance, Eduardo Ver-
gel Bayona
National Jnstitute of Metrology, Quality and Technology, Valnei
Smar~aro da Cunha, Ph.D.
National Jnstitute of Standards and Technology, Michael J. Tar-
lov, Ph.D.
National lnstitutes of Health, Robert DeChristoforo, R.Ph.,
M.S., FASHP
Permanent Commission of the Pharmacopoeia of the United
Mexican States, Maria del Carmen Becerril-Martinez
Pharmacopoeia of Chinese Taipei, Jaw-Jou Kang, Ph.D.
Pharmacy Council of India, Bhojraj Suresh, M.Pharm., Ph.D.,
O.Se.
Philippine Pharmacopeia, Maria Lourdes C. Santiago,
B.S.Pharm., M.S.Pharm.
' Saudí Food and Drug Authority, Abdullah S. Alhomoud, M.S.
State Administration of Ukraine on Medicinal Products Andrii
V. Shovkovyi '
Tanzania Food and Drugs Authority, Yonah Hebron Mwalwisi,
M.Sc., B.Pharm.
Thai Pharmacopoeia Committee, Kornvika Charupant, Ph.D.
The Pharmacy Board of Sierra Leone, Wiltshire C.N. Johnson,
B.Pharm. (Hons.) University of Sierra Leone, M.Sc (Brad
Therapeutic Goods Administration of Australia, Vivienne Christ,
B.App.Sc., MASM
Ukrainian Scientific Pharmacopoeial Center far Quality of Medi-
cines, Oleksandr l. Gryzodub, Ph.D.
USP 40
United States Agency far lnternational Development, Anthony
F. Boni
United States Air Force-Office of the Surgeon General, Deborah
Myers, R.Ph., M.B.A.
United States Army-Office of the Surgeon General, john Spain,
Pharm.D., BCPS
United States Department of Health and Human Services,
Donald Wright, M.D., M.P.H.
United States Navy Bureau of Medicine and Surgery-Office of
the Surgeon General, Thinh V. Ha, Pharm.D., M.B.A., M.S.
United States Public Health Service-Office of the Surgeon
General, Christina H. Lee, Pharm.D.
Vietnamese Pharmacopoeia Commission, Luc Thi Thu Hang,
Ph.D.
Otras Asociaciones Profesionales
y Científicas de Profesionales de
la Salud
AACC lnternational, Amy Hope
Academy of Nutrition and Dietetics, Ann Erickson, M.A., R.D.
American Academy of Allergy, Asthma and lmmunology,
Michael R. Nelson, M.D., Ph.D.
American Academy of Neurology, jack J. Chen, Pharm.D.,
FASCP, FCCP
American Academy of Nurse Practitioners, jan Towers, Ph.D.,
NP-C
American Academy of Ophthalmology, Wiley A. Chambers,
M.D.
American Academy of Pediatrics, Hank Farrar, M.D.
American Academy of Physician Assistants, Marie-Michele
Leger, M.P.H., PA-C
American Academy of Veterinary Pharmacology and
Therapeutics, Carol A. Davis, Ph.D.
American Association of Pharmaceutical Scientists, Christopher
McCurdy, Ph.D., R.Ph.
American Botanical Council, Mark Blumenthal
American Chemical Society, Denise L. Creech
American College of Clínica/ Pharmacology, Peter Wiernik,
M.D.
American College of Clínica/ Pharmacy, C. Edwin Webb,
Pharm.D., M.P.H.
American College of Physicians, Brian L. Strom, M.D.
American Dental Association, Eugenio D. Beltrán-Aguilar,
D.M.D., M.P.H., M.S., Dr.P.H.
American Dental Education Association, Vahn A. Lewis,
Pharm.D., Ph.D.
American Geriatrics Society, Todd P. Semla, M.S., Pharm.D.,
BCPS, FCCP, AGSF
American Medica/ Association, Barry D. Dickinson, Ph.D.
American Nurses Association, Rita Munley Gallagher, Ph.D.,
R.N.
American Optometric Association, Jimmy D. Bartlett, O.D.
American Pharmacists Association, Thomas E. Menighan,
R.Ph., M.B.A., FAPhA
American Public Health Association, Deborah K. Walker, Ed.D.
American Society far Clínica/ Pharmacology and Therapeutics,
Patricia W. Slattum, Pharm.D., Ph.D.
American Society far Microbiology, Amy L. Leber, Ph.D.
American Society far Nutrition, Robert M. Russell, M.D.
American Society far Parenteral and Entera/ Nutrition, Gordon
S. Sacks, Pharm.D., BCNSP, FCCP
American Society far Pharmacology and Experimental
Therapeutics, Mary Paine, Ph.D.
American Society far Quality, Donald C. Singer, M.S.
American Society of Anesthesiologists, H.A. Tillmann Hein,
M.D., Ph.D.
American Society of Consultant Pharmacists, Arnold E. Clay-
man, Ph.D., FASHP
American Society of Health-System Pharmacists, Paul W. Abra-
mowitz, Pharm.D., FASHP
American Veterinary Medica/ Association, Donald C. Sawyer,
D.V.M., Ph.D.
Integrantes / Miembros xxv
Argentine Association of Industrial Pharmacy and Biochemistry,
Federico Montes de Oca, M.B.A.
Brazilian National Association of Compounding Pharmacists,
Maria do Carmo Garcez
Calibration and Validation Group, Herman Lam, Ph.D.
Canadian Pharmacists Association, Perry Eisenschmid, M.B.A.
Canadian Society far Pharmaceutical Sciences, Neal M. Davies,
B.Sc. Pharm., Ph.D., R.Ph.
European Federation far Pharmaceutical Sciences, Hendrik j. de
jong, Ph.D.
lnfusion Nurses Society, Mary C. Alexander, C.R.N.I., M.A.,
R.N., CAE, FAAN
lnstitute of Food Technologists, William Fisher, M.S.
lnternational Academy of Compounding Pharmacists, john Vo-
liva, R.Ph.
lnternational Council of Nurses, David C. Benton, RGN, RMN,
BSC, MPhil, FFNF, FRCN
lnternational Society far Ce/fular Therapy, joseph C. Laning,
Ph.D.
lnternational Society far Pharmaceutica/ Engineering, Stephen
M. Tyler, M.S.
National Alfiance of State Pharmacy Associations, Rebecca P.
Snead, R.Ph., B.S.Pharm.
National Community Pharmacists Association, Ronna B. Hau-
ser, Pharm.D.
National Pharmaceuticaf Association, Barry A. Bleidt, Ph.D.,
Pharm.D.
National Pharmacy Technician Association, Michael J.
johnston, CPhT
New jersey Pharmaceutical Quality Control Association,
Barbara J. Ferguson, B.A.
Pan American Pharmaceutical Federation, Maria Elena
Girard-Cuesy
Parenteral Drug Association, /ne., Richard M. johnson, M.Sc.
Regulatory Affairs Professionals Society, Sherry L. Keramidas,
Ph.D., CAE
Society of Critica/ Care Medicine, Timothy S. Yeh, M.D.,
FCCM
Society of Nuclear Medicine and Molecular lmaging, Jeffrey P.
Norenberg, Pharm.D.
Western Compendia/ Discussion Group, Assad j. Kazeminy,
Ph.D.
Asociaciones Profesionales y
Científicas de Profesionales de la
Salud-Sociedades Médicas
Estatales de los Estados Unidos de
América
California Medica/ Association, Charles W. Maas, M.D.,
M.P.H.
Connecticut State Medica/ Society, Eric B. Einstein, M.D.
Hawaii Medica/ Association, jone Geimer-Flanders, D.O.
11/inois State Medica/ Society, Maitreyi janarthanan, M.D.
Indiana State Medica/ Association, Daria Schooler, M.D., R.Ph.
/owa Medica/ Society, Harold W. Miller, M.D.
Kansas Medica/ Society, Tracie Collins, M.D., M.P.H.
Maine Medica/ Association, Stevan Gressitt, M.D.
Massachusetts Medica/ Society, Bruce G. Karlin, M.D.
MedChi-Maryland State Medica/ Society, Peter H. Rheinstein,
M.D., j.D., M.S.
Medica/ Association of the State of Alabama, Allan R.
Goldstein, M.D.
Medica/ Society of New jersey, joseph N. Micale, M.D.
Medica/ Society of the District of Columbia, Kim A. Bullock,
M.D.
Medica/ Society of the State of New York, Richard S. Blum,
M.D.
Minnesota Medica/ Association, Robert K. Meiches, M.D.,
M.B.A.
Missouri State Medica/ Association, Thomas L. Holloway
Montana Medica/ Association, jean Branscum
xxvi Miembros / Integrantes
New Mexico Medica/ Society, jerry D. Mclaughlin, M.D.
North Oakota Medica/ Association, Robert (Rob) W. Beattie,
M.D.
Pennsylvania Medica/ Society, Ralph Schmeltz, M.D., FACP,
FACE
Puerto Rico Medica/ Association, Rolance G. Chavier-Roper,
M.D.
Rhode lsland Medica/ Societ(, Peter A. Hollmann, M.D.
South Oakota State Medica Association, E. Paul
Amundson, M.D.
Tennessee Medica/ Association, john J. lngram 111, M.D.
Texas Medica/ Association, Kevin H. McKinney, M.D., FACE,
FACP
Utah Medica/ Association, Michelle S. McOmber, B.S., M.B.A.
West Virginia State Medica/ Association, Kevin W. Yingling,
M.D., R.Ph., FACP
Wisconsin Medica/ Society, Thomas M. Derrig, M.D.
Asociaciones Profesionales y
Científicas de Profesionales de la
Salud-Asociaciones
Farmacéuticas Estatales de los
Estados Unidos de América
Alabama Pharmacy Association, Valerie A. Oakley, Pharm.D.
Alaska Pharmacists Association, Amber L. Briggs, Pharm.D.,
CGP, BCPS
Arizona Pharmacy Association, Kelly Ridgeway
Arkansas Pharmacists Association, Kristen G. Riddle, Pharm.D.
California Pharmacists Associatíon, jon R. Roth, CAE
Colegio de Farmaceuticos de Puerto Rico, Milagros Morales,
R.Ph.
Colorado Pharmacists Society, Val Kalnins, R.Ph.
Connectícut Pharmacists Association, Peter J. Sposato, R.Ph.,
B.C.N.P.
Oelaware Pharmacists Society, Kenneth (Kevin) Musto, R.Ph.
Florida Pharmacy Association, Michael A. Moné, j.D., R.Ph.,
FAPhA
Georgia Pharmacy Association, Larry L. Braden, B.S., R.Ph.,
D.Sc.
Hawaíi Pharmacists Association, Ronald T. Taniguchi,
Pharm.D.
/daho State Pharmacy Association, Pam Eaton
11/inoís Pharmacists Association, Norman A. Hoback,
B.S.Pharm.
Indiana Pharmacists Alliance, Daniel D. Degnan 111, Pharm.D.,
M.S.
lowa Pharmacy Association, Thomas R. Temple, R.Ph., M.S.
Kansas Pharmacists Association, Michael Larkin
Kentucky Pharmacists Association, Patricia R. Freeman, Ph.D.
Louisiana Pharmacists Associatíon, Randall Brooks, B.S.
Maine Pharmacy Association, Laurier A. Lamie, R.Ph.
Maryland Pharmacists Association, Matthew G. Shimoda,
Pharm.D.
Massachusetts Pharmacists Association, Steven D. Geoffroy,
R.Ph.
Michigan Pharmacists Association, Eric D. Roath, Pharm.D.
Minnesota Pharmacists Association, Lowell J. Anderson, D.Sc.,
FAPhA, FFIP
Mississippi Pharmacists Association, Kimsey O'Neal, Pharm.D.
Míssourí Pharmacy Association, Ron L. Fitzwater, CAE, M.B.A.
Montana Pharmacy Association, Lori Morin, M.B.A., Pharm.D.
Nebraska Pharmacists Association, Samuel C. Augustine,
Pharm.D., FAPhA
New Hampshire Pharmacists Association, Elizabeth A.
Robertson, R.Ph.
New jersey Pharmacists Association, Steve H. Zlotnick,
Pharm.D.
New Mexico Pharmacists Associatíon, William G. Troutman,
Pharm.D.
North Carolina Association of Pharmacists, Stephen F. Eckel,
Pharm.D., M.H.A.
USP 40
North Dakota Pharmacists Association, Michael D. Schwab
Ohío Pharmacists Association, Amelia S. Bennett, R.Ph.
Oklahoma Pharmacists Association, Wiley L. Williams, ].D.
Oregon State Pharmacy Association, ]oshua Free, Pharm.D.,
M.B.A.
Pennsylvania Pharmacists Association, George R. Haynes,
Pharm.D., Ph.D.
Pharmacists Society of the State of New York, Tracy R. Russell,
CAE
Pharmacy Society of Wisconsin, Susan M. Kleppin, R.Ph.,
FASHP
Rhode /sland Pharmacists Association, ]ohn Grossomanides,
Pharm.D.
South Carolina Pharmacy Association, Craig Burridge, M.S.,
CAE
South Dakota Pharmacists Association, Leonard J. Petrik,
Pharm.D.
Tennessee Pharmacists Association, Micah Cost, Pharm.D.,
M.S.
Texas Pharmacy Association, Eric H. Frankel, MSE, Pharm.D.
Utah Pharmacists Association, Adam W. jones
Virginia Pharmacists Association, Marianne R. Rollings, R.Ph.
Washington O.C. Pharmacy Associatíon, Michael J. Kim,
Pharm.D.
Washington State Pharmacy Associatíon, Jeff Rochon,
Pharm.D.
West Virginia Pharmacists Association, Patty ]ohnston, B.S.
Wyoming Pharmacy Association, William H. Rathburn, R.Ph.
Asociaciones de Fabricantes,
Comerciales y Afiliadas
· American Chemistry Council, Michael P. Walls, Esq.
American Herbal Products Associatíon, Maged H. Sharaf, Ph.D.
American Hospital Association, ]ohn R. Combes, M.D.
Animal Health lnstitute, Richard A. Carnevale, V.M.D.
Association of the European Self-Medícatíon lndustry, Christelle
Anquez-Traxler
Biotechnology lndustry Organizatíon, Earl S. Dye, Ph.D.
Bulk Drug Manufacturers Association, Airra Krishna Reddy,
B.Sc.
Compressed Gas Assocíatíon, Michael B. Tiller, B.S., B.A.
Consumer Health Products Canada, Adam C. Kingsley, B.Sc.,
NP, CAE
Consumer Healthcare Products Association, ]ohn Punzi, Ph.D.
Council for Responsible Nutrition, James C. Griffiths, Ph.D.
Egyptian Chamber of Pharmaceutical lndustry, Abdulla Molok-
hia, Ph.D.
European Generíc Medicines Associatíon, julie Marechal-jamal,
M.S.
Flavor and Extract Manufacturers Association, ]ohn H. Cox,
J.D.
Food Marketing lnstitute, Catherine M. Polley, R.Ph.
Generic Animal Drug Alliance, Stephanie Batliner
Generic Pharmaceutical Association, David R. Gaugh, R.Ph.
Grocery Manufacturers Association, Shannon M. Cooksey,
M.S., PMP
Healthcare Dístributíon Management Association, Karen J.
Ribler
lndian Orug Manufacturers' Association, Daara B. Patel,
B.Com., D.l.M.M.
lnternational Dairy Foods Association, John T. Allan 111, B.S.,
M.S.
lnternational Federatíon of Pharmaceutícal Manufacturers and
Associations, Caroline Mendy
lnternational Food Additives Council, Robert Rankin
lnternatíonal Generic and Biosimilar Medicines, Nicholas
Cappuccino, Ph.D.
lnternational Pharmaceutícal Excipients Council of the
Amerícas, Priscilla Zawislak
Mexico's National Chamber of the Pharmaceutícal lndustry,
J. Rivelino Flores, M.Sc.
USP 40 Integrantes / Miembros xxvii

National Association of Chain Drug Stores, Alex J. Adams, Organismos No Gubernamentales

Pharm.D.
Personal Care Products Council, Beth Anne Lange, Ph.D., B.S. para el Establecimiento de
Pharmaceutical Care Management Association, Greg S.
johnson, B.A. . Normas y Determinación de
Pharmaceutical Research and Manufacturers of Amenca,
J. Mark Wiggins, B.S., M.S. . .
Conformidad
Sao Paulo State Pharmaceutical Manufacturers Assoc1at1on,
Accreditation Council far Pharmacy Educatíon, Dimitra V. Trav-
Nelson dos Santos, jr.
The joint Commission, jeannell M. Mansur, B.S. Pharm., los, Pharm.D., BCPS . . .
American Type Culture Collect1on1 El1zabeth J. Kerngan, B.A.
Pharm.D. . AOAC lnternational, E. james Bradford, Ph.D.
The jordanian Association of Manufacturers of Pharmaceut1cals
Association far the Advancement of Medica/ Jnstrumentation,
& Medica/ Appliances, Hanan J. Sboul, M.B.A., CAE
joseph Carl Lewelling, B.A.,, M.A. .
Chilean Pharmacopeia Foundat1on, Carohne R.
Weinstein-Oppenheimer, Ph.D. . .
Clínica/ and Laboratory Standards Jnst1tute, Glen Fine, M.S.,
M.B.A., CAE
URAC, Kylanne Green, R.N., N.P.
xxviii Donantes / Integrantes USP 40

Reconocimiento para los

Donantes de Materiales de
Referencia y de
Monografías en 2015
La USP reconoce y agradece el apoyo de las empresas que Dow Chemical Company
han participado en el establecimiento de las normas USP Dow Corning
mediante el aporte de información para el desarrollo de Dr. Reddy's Laboratories
nuevas monografías o la donación de candidatos a materia- DSM Nutritional Products
les de referencia. La siguiente lista incluye a las empresas Dupont
que aportaron monografías propuestas en 2015 o que do- Dupont Nutrition and Health
naron candidatos a materiales de referencia establecidos DUSA Pharmaceuticals
como Estándares de Referencia USP durante 2015. Egis Pharmaceuticals
3V Eisai Food and Chemical
Abbott Laboratories Eli Lilly and Company
Abbvie Endo Pharmaceuticals
ACS Dobfar Erregierre
Agan Aroma & Fine Chemicals Evolva
Ajinomoto Aminoscience Evonik
Alcon Laboratories Excella
Alembic Fine Chemicals
Allergan Fine Organics
AMAG Pharmaceuticals Fresenius Kabi Oncology
American Chemical Service GE Healthcare Bio-Sciences
Amgen Genentech
Apotex GlaxoSmithKline
Astrazeneca Glenmark Generics
Aurobindo Pharma Grifo Is
Bachem Americas Hayashibara
BASF Health Protection Agency
Baxter Healthcare Helsinn
Bayer Hetero Drugs
Bayer Schering Hoffman-Laroche
Ben Venue Laboratories Hovione Farmaciencia
Bidachem ICL Performance Products
Bioberica lndena
Bioenergy Life Science lnd-Swift Laboratories
Biogen lnstitute of Shortening and Edible Oils
Boehringer lngelheim lnternational Specialty Products
Bristol-Myers Squibb lnternational Vitamin
Calyx Chemicals & Pharma lnterquim
Cambrex Karlskoga janssen Pharmaceutical
Charmson Trading Japan Food Research Laboratories
Chattem Chemicals jost Chemical
Chemo jubilant Life Sciences
Chevron Phillips Chemical Ka Malle Pharmaceuticals
China Pharmaceutical University Kongo Chemical
CHP Carbohydrate Pirna Koster Keunen
Cilag Kythera Biopharmaceuticals
Clariant Laboratori Alchemia
Colorcon Linnea
Cosma Longyan City Run Bao Bio-Technology
Covidien Lundbeck Pharmaceutical
Cremer Oleo Lupin Pharma
Croda Lusochimica
CU Chemie Uetikon Mateo
Cydex Pharmaceutical Mallinckrodt
Daiichi Sankyo Mantrose-Haeuser
Dipharma Meda Pharmaceuticals
Dottikon Exclusive Synthesis Medichem
USP 40 Integrantes / Donantes xxix

Medpointe Healthcare Sichuan Xieli Pharmaceutical

Megafine Pharma Si cor
Menadiona Sifavitor
Merck Smilax Laboratories
Moehs lberica Sourcetech Quimica
Morepen Laboratories Stearinerie Dubois
Mutchler Stepan Company
Mylan Laboratories Sterling S.N.l.F.F. Italia
Mylan Pharmaceuticals Strides Arcolab
Natac Suzhou Sanjian Nutrient and Health Products
Nature-Standard Symbiotec Pharmalab
Naturex Symed Labs
Noramco Synkem
Novartis Takeda Pharmaceuticals North America
Novo Nordisk Taro Pharmaceuticals
Novozymes Delta Tekni-Plex
Nutrasweet Teva API
Opocrin Teva Pharmaceuticals Industries, Israel
Orchid Chemicals & Pharmaceuticals Teva Pharmaceuticals
Otsuka Chemical The Medicines Company
Pfizer Topharman Shanghai
Pharmavite Torrent Pharmaceuticals
Pliva Croatia UCB Pharma
Polypeptide Laboratories University of Macau
Precise Chemipharma Upsher-Smith Laboratories
Provepharm Vertellus Specialties
Proviron Functional Chemicals Virupaksha Organics
Recordati Wacker Chemicals
Reliance Lite Sciences Wakunaga of America
Roche Yunnan Hande Bio-Tech
Roquette America Zambon Chemicals
Sandoz Zeon Chemicals
Sanofi Zhejiang Apeloa ]iayuan Pharmaceutical
Schwabe Zhejiang Hangzhou Xinfu Pharmaceutical
Scino Pharm Taiwan Zhejiang Huahai Pharmaceutical
Seppic Zhejiang Medicineco
Septodont Zhejiang Supor Pharmaceuticals
Shanghai lnstitute of Materia Medica Zydus Pharmaceuticals
xxx Acta Constitutiva USP 40

Acta Constitutiva
En mayo de 1900 la Convención le ordenó a la Junta
Directiva que constituyera la asociación de la USP conforme
a la legislación del Distrito de Columbia (Estados Unidos de
América). La creación de la asociación se vio retrasada de-
bido a que la legislación del Distrito de Columbia exigía que
la mayoría de los funcionarios firmantes del Certificado de
Constitución fueran residentes del Distrito, por lo que fue
necesario designar representantes que cumplieran con tal
requisito. No obstante, se procedió a elaborar el Acta Cons-
titutiva, que se firmó e inscribió definitivamente el 11 de
julio de ese mismo año. A continuación figura el texto del
certificado original:

Certificado de Constitución

Por el presente, los suscriptos, ciudadanos de los Estados Unidos, mayores de edad y en su mayoría ciudadanos del
Distrito de Columbia, constituyen una asociación que se denominará Convención de la Farmacopea de los Estados Unidos de
América (The United States Pharmacopeial Convention), según lo dispuesto en los artículos 545 a 552 inclusive, de las Leyes
Revisadas de los Estados Unidos para el Distrito de Columbia y su enmienda aprobada por Ley del Congreso, aprobada el día
23 de abril de 1884.
Esta Asociación se constituye por un plazo de novecientos noventa y nueve años. Su objeto es promover y fomentar la
ciencia y el arte de la medicina y la farmacia mediante la realización de investigaciones, experimentos y otros procedimientos
adecuados destinados a seleccionar y denominar materiales que puedan utilizarse apropiadamente como medicamentos y
fármacos, incluyendo fórmulas para su preparación; establecer normas y directivas uniformes para quienes practican la
medicina y la farmacia en los Estados Unidos, que les permitan determinar con exactitud la identidad, el contenido y la
pureza de tales medicamentos y fármacos, y otros propósitos afines y similares; e imprimir y distribuir en general, a intervalos
adecuados, las mencionadas fórmulas y los resultados de dichas selecciones, denominaciones y determinaciones de índole
similar, entre los miembros de esta Asociación, farmacéuticos y médicos generalmente de los Estados Unidos, así como entre
quienes tengan interés en la farmacia y en la medicina.
La administración y control de los asuntos, fondos y bienes de la Asociación durante su primer año de existencia estarán
a cargo de una Junta Directiva, integrada por los siete miembros siguientes:

ALBERT E. EBERT GEORGE W. SLOAN

SAMUEL A.D. SHEPPARD HORATIO C. WOOD
WILLIAM S. THOMPSON CHARLES RICE
CHARLES E. DOHME

En fe de lo cual firmamos y sellamos el presente documento este séptimo día del mes de julio del año 1900.
WILLIAM S. THOMPSON [SELLO] WILLIAM M. MEW [SELLO]
G. LLOYD MAGRUDER [SELLO] FRANK M. CRISWELL [SELLO]
JüHN T. WINTER [SELLO] MURRAY G. MOTIER [SELLO]
THOMAS C. SMITH [SELLO]
USP 40 Gobierno de la USP xxxi

Gobierno de la USP

Estatutos

Los Estatutos de USP para el período 2015-2020 están disponibles en el sitio electrónico http://www.usp.org/about-usp/
leadership/bylaws.

Normas y Procedimientos

Las Normas y Procedimientos del Consejo de Expertos para el período 2015-2020 están disponibles en el sitio electró-
nico http://www.usp.org/about-usp/leadership/policies-rules/rules-procedures-council-experts.

Políticas de la USP

Las políticas de la USP están disponibles en el sitio electrónico http://www.usp.org/about-usp/leadership/policies-rules.

 FARMACOPEA DE LOS
USP 40 ESTADOS
, UNIDOS DE
AMERICA
Oficial desde el 1º de mayo de 201 7

CUADRAGÉSIMA REVISIÓN
© 201 7 The United States Pharmacopeial Convention
12601 Twinbrook Parkway, Rockville, MD 20852
Todos los derechos reservados.
USP 40 Incorporaciones xxxv

Incorporaciones
Artículos Incorporados a USP 40 mediante
Suplementos

Primer Suplemento (1 º de agosto de 2016)

CAPÍTULOS GENERALES

(507) Procedimientos para la Determinación de Proteínas
(800) Fármacos Peligrosos-Manipulación en Instalaciones
de Cuidados de la Salud
(1050.1) Diseño, Evaluación y Caracterización de
Procedimientos de Depuración Viral
(1207.1) Pruebas de Integridad de Envases en el Ciclo de
Vida del Producto-Selección y Validación de Métodos
de Prueba
(1207.2) Tecnologías para Pruebas de Fuga en la Integridad
de Envases
(1207.3) Tecnologías para Pruebas de Calidad de Sellado
de Envases
(1228) Despirogenización
(1228.1) Despirogenización por Calor Seco
(1229.5) Indicadores Biológicos para Esterilización
(1229.9) Integradores e Indicadores Fisicoquímicos
para Esterilización
(1229 .12) Nuevos Métodos de Esterilización
(2251) Sondeo de Fármacos y Análogos de Fármacos no De-
clarados

MONOGRAFÍAS DE USP

Abacavir y Lamivudina, Tabletas Clorhidrato de Palonosetrón

Adapaleno, Gel Perindopril Erbumina
Clorhidrato de Amiodarona, Inyección Perindopril Erbumina, Tabletas
Argatrobán Rabeprazol Sódico
Succinato de Calcio Sildenafil, Tabletas
Candesartán Cilexetilo, Tabletas Tenipósido
Clorhidrato de Difenhidramina e lbuprofeno, Cápsulas Tenipósido, Inyección
Clorhidrato de Dronedarona Acetónido de Triamcinolona, Atomizador Nasal
Dronedarona, Tabletas Clorhidrato de Vardenafil
Exemestano Zolmitriptán
Lufenurón Zolmitriptán, Tabletas

SUPLEMENTOS DIETÉTICOS

Rhodiola rosea, Cápsulas Ubiquinol

Rhodiola rosea, Tabletas Ubiquinol, Cápsulas
Ribosa
xxxví Incorporaciones USP 40

Segundo Suplemento (1º de diciembre de 2016)

CAPÍTULOS GENERALES

(782) Espectroscopía de Dicroísmo Circular Vibracional (1228.3) Despirogenización por Filtración

(1004) Medicamentos para Mucosas-Pruebas
de Desempeño
(1029) Guías de Buenas Prácticas de Documentación
(1063) Metodología de Celda de Corte para Pruebas
de Fluidez de Polvos
(1228.5) Indicadores de Endotoxinas para Despirogenización
(1229 .1 3) Esterilización en el Sitio
(1782) Espectroscopía de Dicroísmo Circular Vibracional-
Teoría y Práctica

MONOGRAFÍAS DE USP

Clorhidrato de Cetirizina, Tabletas de Desintegración Oral Acetato de Octreotida

Desloratadi na Clorhidrato de Oximorfona, Tabletas
Desloratadina, Tabletas Clorhidrato de Oximorfona, Tabletas de Liberación
Desloratadina, Tabletas de Desintegración Oral Prolongada
Pamoato de lmipramina, Cápsulas Polietilenglicol 3350
Metronidazol, Tabletas de Liberación Prolongada Ropinirol, Tabletas de Liberación Prolongada
Zolmitriptán, Tabletas de Desintegración Oral

SUPLEMENTOS DIETÉTICOS

Metilcobalamina, Tabletas Extracto Seco de Fruto de Esquisandra del Norte de China

Artículos Nuevos que Aparecen en USP 40 Ausentes en USP 39 y sus

Suplementos

[NOTA-Los artículos que se incluyen en esta lista se marcan en el libro con los siguientes símbolos • •usr40. Esto se aplica
tanto a los artículos nuevos como a secciones de artículos existentes que han tenido revisiones.]

CAPÍTULOS GENERALES

(89 .1 ) Colagenasa 1 (1602) Espaciadores y Cámaras Espaciadoras con Válvulas

(89.2) Colagenasa 11 que se Usan con Aerosoles para Inhalación-Pruebas de
(127) Recuento de Células CD34+ por Citometría de Flujo Caracterización
(165) Activador de Precalicreína (1821) Radioactividad-Teoría y Práctica
(1039) Quimiometría (1823) Fármacos para Tomografía por Emisión
de Positrones-Información

MONOGRAFÍAS DE USP

Cidofovir Pemetrexed para Inyección

Cidofovir, Inyección Quetiapina, Tabletas de Liberación Prolongada
Doxercalciferol Selamectina
lxabepilona Tejido Deshidratado de Membrana Amniótica
Pemetrexed Disódico Coriónica Humana
USP 40
MONOGRAFÍAS DE SALUD GLOBAL
Gluconato de Clorhexidina, Gel Tópico
SUPLEMENTOS DIETÉTICOS
Citrato Ferroso Sódico
Citrulina
Hesperidina
Flor de Madreselva
Flor de Madreselva en Polvo
Extracto Seco de Flor de Madreselva
Artículos Incluidos en USP 39 Ausentes en USP 40
CAPÍTULOS GENERALES
(21) Termómetros
(751) Partículas Metálicas en Ungüentos Oftálmicos
(851) Espectrofotometría y Dispersión de Luz
MONOGRAFÍAS DE USP
Clorhidrato de Clordiazepóxido para Inyección
Mesilato de Dolasetrón, Inyección
Mesilato de Dolasetrón, Tabletas
Electrólitos Múltiples y Dextrosa, Inyección Tipo 4
Electrólitos Múltiples y Azúcar Invertido, Inyección Tipo 1
Electrólitos Múltiples y Azúcar Invertido, Inyección Tipo 2
Electrólitos Múltiples y Azúcar Invertido, Inyección Tipo 3
Indicador Biológico para Esterilización por Calor Seco,
Portador de Papel
Indicador Biológico para Esterilización con Óxido de Etileno
Portador de Papel
Indicador Biológico para Esterilización por Vapor,
Autocontenido
Indicador Biológico para Esterilización por Vapor,
Portador de Papel
Indicadores Biológicos para Esterilización por Calor Húmedo,
Calor Seco y Gases, Portadores Diferentes al Papel
Indicadores Biológicos para Esterilización por Calor Húmedo,
Calor Seco y Gases, Suspensiones Líquidas de Esporas
lofendilato
Incorporaciones xxxvii
Extracto Seco de Raíz y Rizoma de Notoginseng, Cápsulas
Extracto Seco de Raíz y Rizoma de Notoginseng, Tabletas
Raíz y Rizoma de Notoginseng en Polvo, Cápsulas
Raíz y Rizoma de Notoginseng en Polvo, Tabletas
Extracto Seco de Sumidad Florida de Hierba de San Juan,
Cápsulas
Extracto Seco de Sumidad Florida de Hierba de San Juan,
Tabletas
(1035) Indicadores Biológicos para Esterilización
(1045) Artículos Obtenidos por Biotecnología
(1209) Esterilización-Indicadores e Integradores Químicos
y Fisicoquímicos
lofendilato, Inyección
Ácido lopanoico
Ácido lopanoico, Tabletas
lpodato Sódico
lpodato Sódico, Cápsulas
Mangafodipir Trisódico
Mangafodipir Trisódico, Inyección
Clorhidrato de Oximorfona, Supositorios
Oxtrifilina, Tabletas de Liberación Retardada
Clorhidrato de Propoxifeno
Clorhidrato de Propoxifeno, Cápsulas
Clorhidrato de Propoxifeno y Acetaminofeno, Tabletas
Clorhidrato de Propoxifeno, Aspirina y Cafeína, Cápsulas
Napsilato de Propoxifeno
Napsilato de Propoxifeno, Suspensión Oral
Napsilato de Propoxifeno, Tabletas
Napsilato de Propoxifeno y Acetaminofeno, Tabletas
Napsilato de Propoxifeno y Aspirina, Tabletas
Cloruro de Sodio y Dextrosa, Tabletas
Cloruro de Succinilcolina para Inyección
xxxviii Lista Detallada USP 40

LISTA DETALLADA

Advertencias Generales, Monografías, Capítulos Generales, Reactivos y

Tablas Afectadas por Cambios que Aparecen en USP 40

Los números de página se refieren a USP 40. Nota-Las siguientes listas indican, entre paréntesis, seguido del título de la sección
o subsección, si la sección es nueva o si la subsección se a;¡regó o eliminó de una sección ya existente. Las entradas que aparecen
sin ninguna designación de la forma "nueva", "agregada' o "eliminada", tienen cambios en la redacción que se incluyeron en el
texto oficial existente.

Advertencias y Requisitos Reactivos, Indicadores y

Generales Soluciones
Advertencias Generales, 1 Especificaciones de Reactivos
3. Cumplimiento de las Normas; 5. Componen- Reactivos, Introducción, 2547
tes de las Monografías; 6. Prácticas y Procedi- 4. Definición
mientos de Prueba; y 8. Términos y Definiciones ~cido 1, 1-Ciclobutanodicarboxílico (nuevo), 2556
~cido lsonicotínico, 2558
Capítulos Generales ~cido Malónico (nuevo), 2558
Acido Propiónico (nuevo), 2559
Agua (nuevo), 2561
Agua Desgasificada, 2561
Pruebas y Valoraciones Generales Agua, Exenta de Dióxido de Carbono, 2561
Agua, Exenta de Partículas (nuevo), 2562
Agua, Exenta de Sustancias Orgánicas (nuevo),
Requisitos Generales para Pruebas y Valoraciones 2562
(1) Medicamentos Inyectables y en Implantes (Pa- Butil Hidroxitolueno (nuevo), 2574
renterales)-Pruebas de Calidad del Producto, 75 1-Dodecanosulfonato de Sodio (nuevo), 2589
Pruebas y Valoraciones Biológicas (R)-(-)-a-Felandreno (nuevo), 2593
(89.1) Colagenasa 1 (nuevo), 197 Hidróxido de Tetrabutilamonio 30-Hidrato, 2600
(89.2) Colagenasa 11 (nuevo), 202 Hidroxipropil Celulosa (nuevo), 2601
(127) Recuento de Células CD34+ por Citometría (R)-(+)-Limoneno (nuevo), 2602
de Flujo (nuevo), 235 Litio (nuevo), 2603
(151) Prueba de Pirógenos, 255 D-Manitol (nuevo), 2603
Introducción Nitrato Cúprico, 2606
(165) Activador de Precalicreína (nuevo), 262 Nitrato de Níquel Hexahidrato (nuevo), 2607
Pruebas y Valoraciones Químicas (+)-a-Pineno (nuevo), 2613
(481) Valoració,n de Riboflavina, 417 /3-Pineno (nuevo), 2613
VALORACION Polisorbato 80 (nuevo), 2615
(531) Valoracióp de Tiamina, 438 Sabineno (nuevo), 2620
VALORACION Sulfato de Cobre Pentahidrato (nuevo), 2624
Pruebas y Determinaciones Físicas Tetrahidrofurano, 2627
(659) Requisitos de Envasado y Almacenamiento, Soluciones Reactivo
568 ~cido Acético 1 M SR (nuevo), 2640
(670) Envases-Componentes Auxiliares, 599 ~cido Acético 2 M SR (nuevo), 2640
(821) Radioactividad, 81 O ~cido Clorhídrico 0,025 N SR (nuevo), 2641
~cido Clorhídrico 0,01 N SR (nuevo), 2641
~cido Clorhídrico 0,05 N SR (nuevo), 2641
Información General ~cido Fosfórico 0,05 M SR (nuevo), 2641
~cido Fosfórico 0,06 M SR (nuevo), 2641
(1015) Aparatos Automatizados de Síntesis Radio- ~cido Fosfórico 1 N SR (nuevo), 2641
química (eliminado), 917 ~cido Fosfórico al 20% SR (nuevo), 2641
(1039) Quimiometría (nuevo), 1040 ~cido Sulfúrico 0,2 N SR (nuevo), 2642
(1602) Espaciadores y Cámaras Espaciadoras con ~cido Sulfúrico 0,5 N SR (nuevo), 2642
Válvulas que se Usan con Aerosoles para Inhala- ~cido Sulfúrico 2 N SR (nuevo), 2642
ción-Pruebas de Caracterización (nuevo), 2184 Acido Sulfúrico 1 M SR (nuevo), 2642
(1821) Radioactividad-Teoría y Práctica (nuevo), Edetato Disódico 0,01 M SR (nuevo), 2645
2390 Fosfato Dibásico de Potasio 0,2 M SR (nuevo),
(1823) Fármacos para Tomografía por Emisión de 2645
Positrones-Información (nuevo), 2405 Fosfato Monobásico de Potasio 0,02 M SR
(nuevo), 2646
Suplementos Dietéticos Hidróxido de Amonio 1 M SR (nuevo), 2646
Hidróxido de Amonio 2 M SR (nuevo), 2646
Hidróxido de Potasio 1,8 N SR (nuevo), 2646
(2251) Sondeo de Fármacos y Análogos de Fár- Hidróxido de Potasio al 45% SR (nuevo), 2646
macos No Declarados, 2507 Hidróxido de Sodio 0,0025 N SR (nuevo), 2647
Hidróxido de Sodio 0,02 N SR (nuevo), 2647
USP 40 Lista Detallada xxxix

Hidróxido de Sodio 2 N SR (nuevo), 2647 Tricloruro de Titanio O, 1 N SV, 2665

Hidróxido de Sodio 2,5 N SR (nuevo), 2647 Yodato de Potasio 0,05 M SV, 2665
Hidróxiqo de Sodio 1O N SR (nuevo), 2647 Yodo 0,01 N SV, 2665
Sulfato Acido de Tetrabutilamonio 0,02 M SR Yodo 0,05 N SV, 2666
(nuevo), 2650 Yodo O, 1 N SV, 2666
Soh"ciones Volumétricas Columnas Cromatográficas
~cid o Acético 2 N SV, 265 3 L19, 2667
~cido Clorhídrico 0,02 N SV (nuevo), 2653 L22, 2667
~cido Clorhídrico 0, 1 N SV (nuevo), 2653 L40, 2667
~cido Clorhídrico 0,5 N SV, 2653 L45, 2667
~cido Clorhídrico 0,5 N en Metanol SV, 2653 L51, 2668
~cido Clorhídrico 1 N SV, 2653 L54, 2668
~cido Clorhídrico Alcohólico O, 1 M SV, 2654 L56, 2668
~cido Oxálico O, 1 N SV, 2q54 L80, 2669
Acido Perclórico O, 1 N en Acido Acético Glacial L90 (nueva), 2669
~V, 2654 L91 (nueva), 2669
~cido Perclórico O, 1 N en Dioxano SV, 2654
~cido Sulfúrico 1 N SV, 2654
Acido Sulfúrico 0,5 N en Alcohol SV, 2655
Tablas de Referencia
Arsenito de Potasio 0, 1 N SV, 2655
Arsenito de Sodio 0,05 M SV, 2655 Especificaciones del Envase para Cápsulas y
Bromato de Potasio O, 1 N SV, 2655 Tabletas
Bromo O, 1 N SV, 2655 Clorhidrato de Biperideno, Tabletas (eliminado),
Bromuro-Bromato de Potasio O, 1 N SV, 2655 2675
Bromuro de Tetrametilamonio 0, 1 M SV, 2655 Extracto Seco de Raíz y Rizoma de Notoginseng,
Cloruro de Magnesio 0,01 M SV, 2656 Cápsulas (nueva), 2678
Cloruro de Tetrametilamonio O, 1 M SV, 2656 Extracto Seco de Raíz y Rizoma de Notoginseng,
Dicromato de Potasio O, 1 N SV, 2656 Tabletas (nueva), 2678
Edetato Disódico O, 1 M SV, 2656 Extracto Seco de Sumidad Florida de Hierba de
Edetato Disódico 0,05 M SV, 2657 San Juan, Cápsulas (nueva), 2678
Ferricianuro de Potasio 0,05 M SV, 2657 Extracto Seco de Sumidad Florida de Hierba de
Hidróxido de Potasio Alcohólico 0, 1 M SV, 2657 San Juan, Tabletas (nueva), 2678
Hidróxido de Potasio Alcohólico 0,5 N SV, 2657 Quetiapina, Tabletas de Liberación Prolongada
Hidróxido de Potasio 1 N SV, 2657 (nueva), 2681
Hidróxido de Potasio Metanólico O, 1 N SV, 2657 Raíz y Rizoma de Notoginseng en Polvo, Cápsulas
Hidróxido de Sodio Alcohólico O, 1 N SV, 2658 (nueva), 2681
Hidróxido de Sodio 0, 1 N SV (nuevo), 2658 Raíz y Rizoma de Notoginseng en Polvo, Tabletas
Hidróxido de Sodio 1 N SV, 2658 (nueva), 2681
Hidróxido de Tetrabutilamonio 0, 1 N SV, 2658 Descripción y Solubilidad Relativa de Artículos de
Hidróxido de Tetrabutilamonio en Metanol/Al- la USP y del NF
cohol lsopropílico O, 1 N SV, 2659 Aceite de Eucalipto (nueva), 2684
Metóxido de Litio O, 1 N en Clorobenceno SV, Azul de Metilen9, 2693
2659 Copolímero de Acido Metacrílico y Acrilato de
Metóxido de Litio O, 1 N en Metanol SV, 2659 Etilo, Dispersión, 2709
Metóxido de Litio 0,02 N en Metanol SV, 2659 Doxercalciferol (nueva), 271 3
Metóxido de Litio O, 1 N en Tolueno SV, 2660 lxabepilona (nueva), 2724
Metóxido de Sodio 0,5 N en Metanol SV, 2660 Pemetrexed Disódico (nueva), 2734
Metóxido de Sodio O, 1 N en Tolueno SV, 2660 Perindopril Erbumina (nueva), 2734
Nitrato Cérico Amónico 0,05 N SV, 2660 Succinato de Sodio (nueva), 2739
Nitrato Cúprico 0, 1 N SV, 2661
Nitrato de Bismuto 0,01 M SV, 2661
Nitrato de Plata 0,002 N en Alcohol lsopropílico Monografías (USP 40)
SV (nuevo), 2661
Nitrato de Plata 0,05 N SV (nuevo), 2661 Clorhidrato de Act;butolol, Cápsulas, 2775
Nitrato de Plata 0, 1 N SV, 2661 IDENTIFIO\CION
Nitrato de Plomo 0,01 M SV, 2661 VALORACION
Nitrato Mercúrico O, 1 M SV, 2661 PRUEBAS DE DESEMPEÑO
Nitrito de Sodio 0, 1 M SV, 2662 Disolución
Perclorato de Plomo 0,01 M SV, 2662 IMPUREZAS
Perclorato de Plomo O, 1 M SV, 2662 Acetaminofeno y Fosfato de Codeína, Solución
Permanganato de Potasio O, 1 N SV, 2662 Oral, 2790 ,
Solución Estándar de Diclorofenol-lndofenol, VALORACION
2663 Acetaminofeno y Fosfato de Codeína
Sulfato Cérico O, 1 N SV, 2663 IMPUREZAS
Sulfato de Cinc 0,05 M SV, 2663 4-Aminofenol en Medicamentos que Contie-
Sulfato de Cinc O, 1 M SV (nuevo), 2663 nen Acetaminofeno (agregada)
Sulfato Férrico Amónico O, 1 N SV, 2663 Acetaminofeno y Fosfato de Codeína, Suspensión
Sulfato Ferroso Amónico O, 1 N SV, 2663 Oral, 2791 ,
Tartrato Cúprico Alcalino, Solución (Solución de VALORACION
Fehling), 2664 Acetaminofeno y Fosfato de Codeína
Tetrafenilboro Sódico 0,02 M SV, 2664 IMPUREZAS
Tiocianato de Amonio O, 1 N SV, 2664 4-Aminofenol en Medicamentos que Contie-
Tiocianato de Potasio O, 1 N SV, 2664 nen Acetaminofeno (agregada)
Tiosulfato de Sodio O, 1 N SV, 2665
xi Lista Detallada USP 40

Acetaminofeno y Citrato de Difenhidramina, Ta- PRUEBAS ESPECÍFICAS

bletas, 2793 , Acidez
VALORACION Aminobenzoato potásic9, 2974
Acetaminofeno y Citrato de Difenhidramina INFORMf\CION QUIMICA
IMPUREZAS DEFINICION
4-Aminofenol en Medicamentos que Contie- IDENTIFICACIÓN
nen Acetaminofeno (agregada) Prueba A,y Prueba B
Acetaminofeno y Clorhidrato de Pseudoefedrina, VALORACION
Tabletas, 2794, IMPUREZAS
VALORACION Cloruros y Sulfatos, Cloruros; Cloruros y Sul-
IMPUREZAS fatos, Sulfatos; Sustancias Diazotizables Volá-
4-Aminofenol en Medicamentos que Contie- tiles; Límite de Analina y p-Toluidina; e Impu-
nen Acetaminofeno (agregada) rezas Orgánicas
Acetaminofeno y Clorhidrato de Tramado!, Table- REQUISITOS ADICIONALES
tas, 2J96 Estándares de Referencia USP
TITULO , Aminobenzoato Pqtásico, Cápsulas, 2976
VALORACION IDENTIFICACION
OTROS COMPONENTES Prueba B,(agregada)
Límite de p-Aminofenol (eliminada) VALORACION
IMPUREZAS IMPUREZAS
REQUISITOS ADICIONALES REQUISITOS ADICIONALES
Estándares de Referencia USP Estándares de Referencia USP
Acetaminofeno, Maleato de Clorfeniramina y Aminofilina, 2984 ,
Bromhidrato d~ Dextrometorfano, Tabletas, 2800 IDENTIFICACION
VALORACION Absorción en el Infrarrojo, Prueba A y Prueba
Acetaminofeno, Maleato de Clorfeniramina y B ,
Bromhidrato de Dextrometorfano VALORACION
IMPUREZAS OTROS COMPONENTES
4-Aminofenol en Medicamentos que Contie- IMPUREZAS
nen Acetaminofeno (agregado) REQUISITOS ADICIONALES
REQUISITOS ADICIONALES Envasado y Almacenamiento y Estándares de
Estándares de Referencia USP Referencia USP
Acetaminofeno, Clorhidrato de Difenhidramina y Aminofilina, lnyecc;ión, 2986
Clorhidrato de ,Pseudoefedrina, Tabletas, 2801 IDENTIFICACION
VALORACION Absorción en el Infrarrojo, Prueba By Prueba
Acetaminofeno y Clorhidrato de c ,
Difenhidramina VALORACION
IMPUREZAS IMPUREZAS
4-Aminofenol en Medicamentos que Contie- REQUISITOS ADICIONALES
nen Acetaminofeno (agregada) Envasado y Almacenamiento y Estándares de
Acetaminofeno, Bromhidrato de Dextrometor- Referencia USP
fano, Succinato de Doxilamina y Clorhidrato de Aminofilina, Solucipn Oral, 2988
Pseudoefedrina, Solución Oral, 2812 IDENTIFICACION
VALORACION Absorción, en el Infrarrojo, Prueba A
Acetaminofeno y Bromhidrato de VALORACION
Dextrometorfano IMPUREZAS
IMPUREZAS REQUISITOS ADICIONALES
4-Aminofenol en Medicamentos que Contie- Estándares de Referencia USP
nen Acetaminofeno (agregada) Aminofilina, Tablet,as, 2991
Clorhidrato de Alfuzosina, Tabletas de Liberación IDENTIFICACION
Prolongada, 2870 _ Absorción en el Infrarrojo, Prueba A y Prueba
PRUEBAS DE DESEMPENO B ,
Disolución VALORACION
IMPUREZAS IMPUREZAS
Alprazolam, Tabletas de Desintegración Oral, REQUISITOS ADICIONALES
2889 Envasado y Almacenamiento y Estándares de
IDENTIFICACIÓN Referencia USP
Prueba A,y Prueba B (agregada) Amlodipino y,Valsartán, Tabletas, 3020
VALORACION DEFINICIOt-J
PRUEBAS DE DESEMPEÑO VALORACION
Disolución PRUEBAS DE DESEMPEÑO
Alprazolam, Tabletas de Liberación Prolongada, Disolución
2891 , IMPUREZAS
IDENTIFICACION REQUISITOS ADICIONALES
Prueba B,(agregada) Etiquetado (agregada)
VALORACION Amlodipino, Valsartán e Hidroclorotiazida, Table-
PRUEBAS DE DESEMPEÑO tas, 3024 ,
Disolución DEFINICION
REQUISITOS ADICIONALES VALORACIÓN
Estándares de Referencia USP PRUEBAS DE DESEMPEÑO
Amiloxato, 2973 , Disolución
IDENTIFICACION IMPUREZAS
Absorción en el Ultravioleta, Prueba B y REQUISITOS ADICIONALES
Prueba C, (agregada) Etiquetado (agregada)
VALORACION Aripiprazol, Tabletas, 3133
USP 40 Lista Detallada xli

VALORACIÓN pH (eliminado) y Determinación de Agua

PRUEBAS DE DESEMPEÑO REQUISITOS ADICIONALES
Disolución Estándares de Referencia USP
, IMPUREZAS Cisplatino, 3727 ,
Acido Ascórbico, ll)yección, 3142 IDENTIFICACION
IDENTIFICACION Absorción en el Infrarrojo, Prueba B y Croma-
Prueba C tografía en Capa Delgada, Prueba C
Azatioprina Sódica, para Inyección, 3197 (eliminacja)
IDENTIFICACION VALORACION
Prueba B,(agregada) IMPUREZAS
VALORACION , Límite de Tric/oroaminoplatinato y Límite de
PRUEBAS ESPECIFICAS Transplatino ,
Totalidad de la Disolución (eliminada) PRUEBAS ESPECIFICAS
REQUISITOS ADICIONALES Contenido de Platino
Envasado y Almacenamiento REQUISITOS ADICIONALES
Valerato de Betam~tasona, Crema, 3299 Envasado y Almacenamiento
IDENTIFICACION Cisplatino para lny,ección, 3730
Prueba A,y Prueba B IDENTIFICACION
VALORACION Prueba B,(agregada)
IMPUREZAS VALORACION
REQUISITOS ADICIONALES IMPUREZAS
Estándares de Referencia USP Límite de Tricloroaminoplatinato y Límite de
Valerato de Betam~tasona, Ungüento, 3301 Transplatino
IDENTIFICACION Clorhidrato de Cistejna, 3732
Prueba A,y Prueba B PRUEBAS ESPECIFICAS
VALORACION Pérdida por Secado
IMPUREZAS Corticotropina,, Inyección, 3935
REQUISITOS ADICIONALES VALORACION
Estándares de Referencia USP Corticotropina para Inyección, 3937
Biperideno (eliminada), 3316 VALORACION
Clorhidrato de Biperideno (eliminada), 3317 Corticotropina ,de Depósito, Inyección, 3940
Clorhidrato de Biperideno, Tabletas (eliminada), VALORACION
3317 Clorhidrato de De~eclociclina, Tabletas, 3983
Lactato de Biperideno, Inyección (eliminada), IDENTIFIO\CION
3319 VALORACION
Carboplatino,,3503 PRUEBAS DE DESEMPEÑO
DEFINICION , Disolución ,
IDENTIFICACION PRUEBAS ESPECIFICAS
Absorción en el Infrarrojo, Prueba A y Prueba Pérdida por Secado (eliminada)
B (agregsida) Clorhidrato de De~ipramina, Tabletas, 3988
VALORACION IDENTIFICACION
OTROS COMPONENTES Prueba A,y Prueba B (agregada)
IMPUREZAS, VALORACION
Límite de Acido 7, 7-Ciclobutanodicarboxílico e IMPUREZAS
Impurezas Orgánicas Dextrometorfano, ,4044
PRUEBAS ESPECIFICAS IDENTIFICACION
Determinación de Agua, Método I (elimi- Prueba B ,
nada) y Pérdida por Secado (agregada) PRUEBAS ESPECIFICAS
REQUISITOS ADICIONALES Intervalo o Temper9tura de Fusión (elimi-
Envasado y Almacenamiento nada) y Rotacion Optica (eliminada)
Carboplatino para ,Inyección, 3505 REQUISITOS ADICIONALES
IDENTIFICACION Estándares de Referencia USP
Prueba B,(agregada) Bromhidrato de D~xtrometorfano, 4046
VALORACION IDENTIFICACION
IMPUREZAS Prueba A, PruE;ba By Prueba C (eliminada)
REQUISITOS ADICIONALES PRUEBAS ESPECIFICAS
Envasado y Almacenamiento Rotación Optica (eliminada)
Ceftriaxona pa~a Inyección, 3625 REQUISITOS ADICIONALES
VALORACION Estándares de Referencia USP
IMPUREZAS Clorhidrato de Difenhidramina, Cápsulas, 411 O
REQUISITOS ADICIONALES IMPUREZAS
Envasado y Almacenamiento Clorhidrato de Difenhidramina, Solución Oral,
Ceftriaxona Sóc;lica, 3627 4113
VALORACION IMPUREZAS
IMPUREZAS REQUISITOS ADICIONALES
REQUISITOS ADICIONALES Estándares de Referencia USP
Envasado y Almacenamiento Clorhidrato de Difenhidramina y Clorhidrato de
Cianocobalamir;ia, 3652 Fenilefrina, Tabletas, 4115
VALORACION IMPUREZAS
Cidofovir (nueva), 3680 REQUISITOS ADICIONALES
Cidofovir, Inyección (new), 3681 Estándares de Referencia USP
Besilato de Cisatracurio, 3723 Doxercalciferol (nueva), 4239
IMPUREZAS Hiclato de Doxicic[ina, Cápsulas, 4251
Impurezas Orgánicas IDENTIFIO\CION
PRUEBAS ESPECIFICAS VALORACION
xlii Lista Detallada USP 40

PRUEBAS DE DESEMPEÑO Absorción, en el Infrarrojo, Prueba A

Disolución VALORACION
IMPUREZAS IMPUREZAS
Impurezas Orgánicas (agregada) Impurezas Orgánicas
PRUEBAS ESPECIFICAS REQUISITOS ADICIONALES
Determinación de Agua, Método I Estándares de Referencia USP
(eliminada) Clorhidrato de Hid,roxizina, Tabletas, 4997
REQUISITOS ADICIONALES IDENTIFICACION
Envasado y Almacenamiento y Estándares de Prueba A,y Prueba B (agregada)
Referencia USP VALORACION
Hiclato de Doxicic[ina, Tabletas, 4254 IMPUREZAS
IDENTIFICACION Impurezas Orgánicas (agregada)
Procedimiento (eliminada) y Prueba A REQUISITOS ADICIONALES
(agregad,a) Envasado y Almacenamiento y Estándares de
VALORACION Referencia USP
PRUEBAS DE DESEMPEÑO lbuprofeno, Susperisión Oral, 5026
Disolución IDENTIFICACION
IMPUREZAS Prueba A,y Prueba B
Impurezas Orgánicas (agregada) VALORACION
PRUEBAS ESPECIFICAS IMPUREZAS
Determinación de Agua, Método I Límite de Compuesto Relacionado C de lbu-
(eliminada) profeno (eliminada) e Impurezas Orgánicas
REQUISITOS ADICIONALES (agregada)
Envasado y Almacenamiento y Estándares de REQUISITOS ADICIONALES
Referencia USP Estándares de Referencia USP
Dutasterida, 4284 lotalamato Sódico, Inyección (eliminada), 5127
IMPUREZAS lsoflurano, 5151
Impurezas Or9ánicas, Procedimiento 2 IMPUREZAS
Esomeprazol Magne,sico, 4422 Cloruros ,
PRUEBAS ESPECIFICAS PRUEBAS ESPECIFICAS
Determinación de Agua y Cristalinidad Acidez o Alcalinidad (agregada)
(agregada) lxabepilona (nueva), 5207
REQUISITOS ADICIONALES Ketorolaco Tromet9mina, 5222
Envasado y Almacenamiento y Etiquetado IDENTIFICACION
Fenbendazol, 454Q Prueba B
IDENTIFICACION IMPUREZAS
IMPUREZAS Impurezas Orgánicas
Impurezas Orgánicas Levetiracetam, Tabletas de Liberación Prolongada,
REQUISITOS ADICIONALES 5284
Envasado y Almacenamiento PRUEBAS DE DESEMPEÑO
Clorhidrato de Fenilefrina, Tabletas, 4555 Disolución
IMPUREZAS Diclorhidrato de Levocetirizina, 5297
REQUISITOS ADICIONALES IMPUREZAS
Estándares de Referencia USP Residuo de Incineración, Impurezas Orgánicas
Fenitoína Sódica de Acción Inmediata, Cápsulas y Pureza EnanJiomérica
(eliminada), 4565 PRUEBAS ESPECIFICAS
Clorhidrato de Feri.oxibenzamina, Cápsulas, 4590 Pérdida por Secado
IDENTIFICACION Losartán Potásico e Hidroclorotiazida, Tabletas,
Prueba A,y Prueba B (agregada) 5391
VALORACION PRUEBAS DE DESEMPEÑO
PRUEBAS DE DESEMPEÑO Disolución
Disolución y Uniformidad de Unidades de REQUISITOS ADICIONALES
Dosificación Etiquetado (agregada)
Clorhidrato de Fexofenadina y Clorhidrato de Clorhidrato de Memantina, Tabletas, 5486
Pseudoefedrina, Tabletas de Liberación Prolon- IMPUREZAS
gada, 4626 _ Límite de Aducto de Memantina-Lactosa
PRUEBAS DE DESEMPENO Azul de Metileno, 5576
Disolución Metocarbamol, Tabletas, 5607
Galantamina, Cápsulas de Liberación Prolongada, IMPUREZAS
4822 , Fumarato de tyletoprolol, 5618
VALORACION DEFINICION ,
PRUEBAS DE DESEMPEÑO IDENTIFICACION
Disolución Prueba B,
IMPUREZAS VALORACION
Heparina Sódica, 4935 IMPUREZAS
IDENTIFICACION Impurezas Orgánicas
Determinaciones de Pesos Moleculares, PRUEBAS ESPECIFICAS
Prueba D y Prueba E Intervalo o Temperatura de Fusión
IMPUREZAS (eliminada)
Impurezas Nucleotídicas REQUISITOS ADICIONALES
Succinato Sódico ge Hidrocortisona, 4975 Envasado y Almacenamiento y Estándares de
IDENTIFICACION Referencia USP
Prueba C Clorhidrato de Moexipril, 5698
Clorhidrato de Hid,roxizina, 4994 IMPUREZAS
IDENTIFICACION Impurezas Orgánicas
USP 40 Lista Detallada xliii

Clorhidrato de Moexipril, Tabletas, 5700 Maleato de P~oclorperazina, 6354

IMPUREZAS DEFINICION ,
Impurezas Orgánicas IDENTIFICACION
Clorhidrato de ,Moxifloxacino, 5749 Prueba A,y Prueba B (agregada)
VALORACION VALORACION
IMPUREZAS IMPUREZAS
Impurezas Orgánicas y Pureza Enantiomérica Impurezas Orgánicas
(agregada) , Clorhidrato de Propafenona, Cápsulas de Libera-
PRUEBAS ESPECIFICAS ción Prolongada, 6383 _
Rotación Optica (eliminada) PRUEBAS DE DESEMPENO
REQUISITOS ADICIONALES Disolución
Estándares de Referencia USP IMPUREZAS
Nicotina Pola<;rilex, 5851 Impurezas Orgánicas y Contenido de Com-
DEFINICION , puesto Relacionado A de Propafenona
IDENTIFICACION REQUISITOS ADICIONALES
Absorción en el Infrarrojo para Nicotina, Etiquetado (agregada)
Prueba A y Absorción en el Infrarrojo para Sulfato de Prot9mina, 641 O
Polacrilex, Prueba B VALORACION
VALORACION , IMPUREZAS
PRUEBAS ESPECIFICAS Impurezas Elementales (eliminada)
Determinación de Agua (eliminada), Pérdida REQUISITOS ADICIONALES
por Secado (agregada) y Liberación de Estándares de Referencia USP
Nicotina Sulfato de Prot9mina, Inyección, 6411
REQUISITOS ADICIONALES VALORACION
Envasado y Almacenamiento Quetiapina, Tabletas de Liberación Prolongada
Clorhidrato de Olqpatadina, 5934 (nueva), 6431
IDENTIFICACION Ribavirina, Cápsulas, 6494 _
Absorción, en el Infrarrojo, Prueba A PRUEBAS DE DESEMPENO
VALORACION Disolución
IMPUREZAS Riboflavina, Tal;?letas, 6497
Impurezas Orgánicas VALORACION
Clorhidrato de Olopatadina, Solución Oftálmica, Solución de Ringe~ Inyectable, 6522
5936 , IDENTIFICACION
IDENTIFICACION Identificación-Pruebas Generales, Prueba A;
Prueba B,(agregada) Sodio, Prueba B (agregada); y Potasio,
VALORACION Prueba C (agregada)
IMPUREZAS Secobarbital Sódico, Inyección (eliminada), 6623
Límite de Impurezas de Elución Temprana y Secobarbital Sódico para Inyección (eliminada),
Límite de Impurezas de Elución Tardía 6623
Pemetrexed Disódico (nueva), 611 O Secobarbital Sódico y Amobarbital Sódico, Cápsu-
Pemetrexed para Inyección (nueva), 6112 las (eliminada), 6624
Penicilina G Proq1ínica, ,61 31 Selamectina (nueva), 6624
INFORMA~ION QUIMICA Citrato de Sodio y Acido Cítrico, Solución Oral,
VALORACION , 6675 ,
PRUEBAS ESPECIFICAS IDENTIFICACION
Contenido de Penicilina G y Procaína, Prue- Prueba A e Identificación-Pruebas Genera-
bas de Esterilidad y pH les, Prueqa D
REQUISITOS ADICIONALES VALORACION ,
Envasado y Almacenamiento y Estándares de Sodio, Citrato de Sodio y Acido Cítrico
Referencia USP Hipoclorito de Soqio, Solución, 6692
Pentazocina y ~cetaminofeno, Tabletas, 6150 IDENTIFICACION
VALORACION Prueba B,y Prueba C (eliminada)
Pentazocina y Acetaminofeno VALORACION
IMPUREZAS Sulfadoxina y Pirill)etamina, Tabletas, 6743
4-Aminofenol en Medicamentos que Contie- IDENTIFICACION
nen Acetaminofeno (agregada) Prueba A,
Pioglitazona y Clorhidrato de Metformina, Table- VALORACION
tas, 6198 , Clorhidrato de ,Tamsulosina, Cápsulas, 6805
IDENTIFICACION VALORACION
Absorción, en el Ultravioleta, Prueba A Procedimiento 8 y Procedimiento 1O
VALORACION (agregada) _
Sulfato de Polimixina B, 6247 PRUEBAS DE DESEMPENO
IMPUREZAS Disolución
Impurezas Orgánicas Tejido Deshidratado de Membrana Amniótica Co-
PRUEBAS ESPECIFICAS rionica Humana (nueva), 6840
Composición de Polimixinas Clorhidrato d5! Tetrahidrozolina, 6916
Gluconato de Pota,.sio, 6279 DEFINICION ,
IDENTIFICACION IDENTIFICACION
Prueba B Absorción en el Infrarrojo, Prueba A y Prueba
Gluconato de Pota,sio, Solución Oral, 6280 B ,
IDENTIFICACION VALORACION
Prueba A IMPUREZAS
Gluconato de Pota,sio, Tabletas, 6281 Impurezas Comunes (eliminada) e Impurezas
IDENTIFICACION Orgánicas (agregada)
Prueba B REQUISITOS ADICIONALES
xliv Lista Detallada USP 40

Envasado y Almacenamiento Flor de Madreselva (nueva), 7604

Clorhidrato de Jiamina, Tabletas, 6926 Flor de Madreselva en Polvo (nueva), 7607
VALORACION Extracto Seco de Flor de Madreselva (nueva),
Tinidazol, 69q5 7610
DEFINICION , Raíz y Rizoma de Notoginseng en Polvo, Cápsulas
IDENTIFICACION (nueva), 7658
Prueba B,y Prueba C (eliminada) Raíz y Rizoma de Notoginseng en Polvo, Tabletas
VALORACION (nueva), 7660
IMPUREZAS Extracto Seco de Raíz y Rizoma de Notoginseng,
Impurezas Orgánicas Cápsulas (nueva), 7664
PRUEBAS ESPECIFICAS Extracto Seco de Raíz y Rizoma de Notoginseng,
Intervalo o Temperatura de Fusión Tabletas (nueva), 7666
(eliminada) Raíz de Orovale, 7f>73
Clorhidrato de Tramado!, Tabletas de Liberación IDENTIFICACION
Prolongada, 7036 _ HPTLC para Artículos de Origen Botánico,
PRUEBAS DE DESEMPENO Prueba A y,HPLC, Prueba B
Disolución COMPOSICION
IMPUREZAS REQUISITOS ADICIONALES
Valina, 7148 Estándares de Referencia USP
IMPUREZAS Raíz de Orovale er¡ Polvo, 7675
Compuestos Relacionados IDENTIFICACION
REQUISITOS ADICIONALES HPTLC para Artículos de Origen Botánico,
Estándares de Referencia USP Prueba A y,HPLC, Prueba B
Yodo, Solución Tópica, 7238 COMPOSICION
IDENTIFICACION REQUISITOS ADICIONALES
Identificación-Pruebas Generales, Yoduros, Estándares de Referencia USP
Prueba B y Sodio, Prueba C (agregada) Extracto en P9lvo de Raíz de Orovale, 7677
Yodo, Tintura, 723,9 DEFINICION ,
IDENTIFICACION IDENTIFICACION
Identificación-Pruebas Generales, Yoduros, HPTLC para Artículos de Origen Botánico,
Prueba By Sodio, Prueba C (agregada) Prueba A y,HPLC, Prueba B
Yodo Fuerte, Tintura, 7240 COMPOSICION
IDENTIFICACION REQUISITOS ADICIONALES
Identificación-Pruebas Generales, Yoduros, Estándares de Referencia USP
Prueba By Potasio, Prueba C (agregada) Rutina, 771 9
IMPUREZAS
Quercetina y Otros Compuestos Relacionados
Monografías (Salud Global) Sumigad Florida de Hierba de San juan, 7726
TITULO ,
Gluconato de Clorhexidina, Gel Tópico (nueva), DEFINICION ,
7289 IDENTIFICACION
HPTLC para Artículos de Origen Botánico,
Monografías (Suplementos Prueba B ,
COMPOSICION
Dietéticos) Contenido de Hipericina y Pseudohipericina y
Contenido de l;liperforina
Citrato Ferroso Sódico (nueva), 7420 PRUEBAS ESPECIFICAS
Citrulina (nueva), 7421 Pérdida por Secado
Aceite de Crypthecpdinium cohnii, 7439 Sumidad Florida de Hierba de San juan en Polvo,
IDENTIFICACION 7728,
Cúrcuma, 7444 TITULO
DEFINICION DEFINICIÓN ,
IDENTIFICACIÓN IDENTIFICACION
Prueba A y ,Prueba B HPTLC para Artículos de Origen Botánico,
COMPOSICION Prueba B ,
Cúrcuma en ~olvo, 7446 COMPOSICION
DEFINICION Contenido de Hipericina y Pseudohipericina y
IDENTIFICACIÓN Contenido de l;liperforina
Prueba A y,Prueba B PRUEBAS ESPECIFICAS
COMPOSICION Pérdida por Secado
PRUEBAS ESPECÍFICAS Extracto Seco de Sumidad Florida de Hierba de
Artículos de Origen Botánico, Materia Orgá- San jyan, 7730
nica Extraña (eliminada) TITULO ,
Extracto en Polvo 9e Cúrcuma, 7448 DEFINICION ,
IDENTIFICACION IDENTIFICACION
Prueba A y ,Prueba B HPTLC para Artículos de Origen Botánico,
COMPOSICION Prueba A y Cromatografía en Capa Delgada,
Curcuminoides, 7450 Prueba B
IDENTIFICACION COMPOSICIÓN
HPTLC para Artículos de Origen Botánico, Contenido de Hipericina y Pseudohipericina y
Prueba A y ,HPLC, Prueba B Contenido de Hiperforina
COMPOSICION Extracto Seco de Sumidad Florida de Hierba de
CONTAMINANTES San juan, Cápsulas (nueva), 7732
Extractos Botánicos (agregada) Extracto Seco de Sumidad Florida de Hierba de
Hesperidina (nueva), 7567 San juan, Tabletas (nueva), 7734
USP 40-NF 35
Advertencias y Requisitos
Aplicables a las Normas, Pruebas,
Valoraciones y Otras Especificaciones
de la Farmacopea de los Estados Unidos
1. Título y Revisión ....................... 3
2. Estado Oficial y Reconocimiento
Legal ................................... 3
2. lli. Texto Oficial . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
2.20. Artículos Oficiales ....................... 3
2.30. Reconocimiento Legal .................... 3
3. Cumplimiento de las Normas ........... 4
3.10. Aplicabilidad de las Normas ................ 4
3.20. Indicación de Cumplimiento ................ 5
4. Monografías y Capítulos Generales ..... 5
4.1 O. Monografías . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
4.20. Capítulos Generales ...................... 5
5. Componentes de las Monografías ...... 6
5.1 O. Fórmulas Moleculares ..................... 6
5.20. Sustancias Agregadas ..................... 6
5.30. Descripción y Solubilidad .................. 6
5.40. Identidad . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
5.50. Valoración . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
5.60. Impurezas y Sustancias Extrañas ............. 7
5.70. Pruebas de Desempeño ................... 7
5.80. Estándares de Referencia USP ............... 8
6. Prácticas y Procedimientos de
Prueba ................................. 8
6.1 O. Prácticas Seguras de Laboratorio ............. 8
6.20. Procedimientos Automatizados .............. 8
6.30. Métodos y Procedimientos Alternativos y
Armonizados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
6.40. Con Respecto a la Sustancia Seca, Anhidra,
Incinerada o Exenta de Disolventes .............. 8
6.50. Preparación de Soluciones ................. 8
6.60. Unidades Necesarias para Completar una
Prueba . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
Advertencias Generales 1
Generales
6.70. Reactivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
6.80. Equipo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
7. Resultados de Pruebas ................. 9
7.1 O. Interpretación de los Requisitos .............. 9
7.20. Reglas para Redondeo ................... 1O
8. Términos y Definiciones ............... 1 o
8.1 O. Abreviaturas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 O
8.20. Aproximadamente ..................... 1O
8.30. Contenido de Alcohol ................... 1 O
8.40. Pesos Atómicos ....................... 1O
8.50. Determinaciones con Blancos ............. 1O
8.60. Concomitantemente .................... 1 O
8.70. Desecador . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 O
8.80. Logaritmos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 O
8.90. Cepas Microbianas ..................... 1O
8.1 OO. Inapreciable . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 O
8.11 O. No menos de (NLT) y No más de (NMT) ..... 11
8.120. Olor . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
8.1 30. Por ciento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
8.140. Concentraciones Porcentuales ............. 11
8.150. Presión . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
8.160. Tiempo de Reacción .................... 11
8.1 70. Peso Específico ....................... 11
8.180. Temperaturas ........................ 11
8.190. Tiempo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
8.200. Transferir . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
8.21 O. Vacío . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
8.220. Desecador al Vacío ..................... 11
8.230. Agua . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
8.240. Pesos y Medidas ...................... 11
9. Prescripción y Dispensación ........... 13
9.10. Uso de Unidades Métricas ................ 13
9.20. Cambios en Volumen .................... 13
2 Advertencias Generales USP 40-NF 35

1O. Conservación, Envasado, Almacena- 10.1 O. Envasado y Almacenamiento .............. 13

10.20. Etiquetado .......................... 13
miento y Etiquetado ................... 13
USP 40
ADVERTENCIAS Y
REQUISITOS GENERALES
La sección de Advertencias y Requisitos Generales (en lo
sucesivo, Advertencias Generales) presenta las suposiciones
básicas, definiciones y condiciones que se usan por defecto
para la interpretación y aplicación de la Farmacopea de los
Estados Unidos de America (USP, por sus siglas en inglés) y
del Formulario Nacional (NF, por sus siglas en inglés).
Los requisitos establecidos en estas Advertencias Generales
se aplican a todos los artículos reconocidos en la USP y en el
NF (en lo sucesivo, los "compendios") y a todos los capítu-
los generales, a menos que se especifique algo diferente.
1. TÍTULO Y REVISIÓN
El título completo de esta publicación (que consiste en
cuatro volúmenes e incluye sus Suplementos) es Farmacopea
de los Estados Unidos de América, Cuadragésima Revisión y
Formulario Nacional, Trigésima Quinta Edición. Estos títulos
pueden abreviarse a USP 40, a NF 35 y a USP 40-NF 35. La
Farmacopea de los Estados Unidos, Cuadragésima Revisión y
el Formulario Nacional, Trigésima Quinta Edición reemplazan
a todas las revisiones anteriores. Cuando se emplean fas si-
glas "USP", "NF" o "USP-NP' sin ningún otro calificativo, las
mismas se refieren únicamente a USP 40, NF 35, y a sus
Suplementos,durante el tiempo que estos compendios estén
vigentes. Los mismos títulos, sin ninguna distinción, se apli-
can tanto a la presentación impresa como a la electrónica
de este contenido. Aunque la USP y el NF se publican en
forma conjunta y comparten estas Advertencias Generales,
cada uno de ellos constituye por sí mismo un compendio
separado.
Esta revisión es oficial a partir del 1 º de mayo de 2017, a
menos que se indique algo diferente mediante un texto
específico.
Los Suplementos de la USP y el NF se publican
periódicamente.
Las Accelerated Revisions (Revisiones Aceleradas) se publi-
can periódicamente en el sitio Web de la USP bajo la sec-
ción Official Text (Texto Oficial) (http://www.usp.org/usp-nf/
texto-oficial), con el fin de oficializar revisiones en forma
más rápida que a través del proceso ordinario de publica-
ción de normas de los compendios USP-NF. Los lnterim Revi-
sion Announcements (Anuncios de Revisión Intermedia) son
Revisiones Aceleradas a la USP y el NF que contienen revisio-
nes oficiales y sus fechas de entrada en vigencia.
Los Revision Bulletins (Boletines de Revisión) son Revisiones
Aceleradas del texto oficial o aplazamientos que requieren
una publicación urgente. Por lo general, se oficializan inme-
diatamente, a menos que se indique algo distinto en el Bole-
tín de Revisión.
Las Erratas son Revisiones Aceleradas que comprenden las
correcciones a ítems publicados erróneamente. Asimismo, el
sitio Web de la USP, en el apartado "Official Text" (Texto
Oficial) incluye anuncios sobre la disponibilidad de nuevos
Estándares de Referencia USP y anuncios sobre pruebas o
procedimientos que se mantienen en suspenso hasta que se
encuentren disponibles los Estándares de Referencia USP
requeridos.
2. ESTADO OFICIAL Y RECONOCIMIENTO LEGAL
2.10. Texto Oficial
El Official text (Texto oficial) de los compendios USP y NF
se publican en el sitio USP-NF Online (www.uspnf.com) en
la edición identificada como "CURRENTLY OFFICIAL" (Ac-
tualmente Oficial) y en las Revisiones Aceleradas que reem-
Advertencias Generales 3
plazan el texto en el sitio USP-NF Online, tal como se des-
cribe más adelante.
Las revisiones de rutina se publican en el sitio USP-NF
Online y se oficializan en la fecha indicada, por lo general
seis meses después de su publicación. Las Revisiones Acele-
radas reemplazan el texto en el sitio USP-NF On/ine y se
oficializan en la fecha indicada. En el sitio Web de la USP se
pueden encontrar enlaces a las Revisiones Aceleradas de las
monografías o capítulos generales reemplazados en la
USP-NF Online.
La USP y el NF también se encuentran disponibles en ver-
sión impresa y en memoria flash USB. Las revisiones de ru-
tina se suministran al mismo tiempo que la versión USP-NF
Online. El texto oficial publicado en los Suplementos reem-
plaza a aquél previamente publicado en la versión impresa o
en memoria flash USB. Estas versiones también son reempla-
zadas por las Revisiones Aceleradas, según se describió
anteriormente.
En el caso de encontrarse cualquier diferencia entre las
versiones impresa o memoria flash USB y el sitio USP-NF
Online, el sitio USP-NF Online será preponderante.
2.20. Artículos Oficiales
Un artículo oficial es un artículo reconocido en la USP o el
NF. Se considera que un artículo está reconocido e incluido
en un compendio cuando se publica su monografía en el
compendio y se le asigna una fecha oficial a la misma en
forma específica o general.
El título especificado en una monografía es el título oficial
para ese artículo. Los nombres que se consideren sinónimos
de títulos oficiales no pueden ser utilizados para sustituir a
los nombres oficiales.
Los artículos oficiales incluyen tanto sustancias oficiales
como productos oficiales. Una sustancia oficial es un fármaco,
excipiente, ingrediente dietético u otro ingrediente, o un
componente de un dispositivo terminado para el cual el tí-
tulo de la monografía no incluye indicación alguna sobre la
naturaleza de la forma terminada.
Un producto oficial es un producto farmacéutico, suple-
mento dietético, preparación magistral o dispositivo termi-
nado para el cual se provee una monografía.
2.30. Reconocimiento Legal
Los compendios USP y NF están reconocidos por las legis-
laciones y reglamentaciones de muchos países del mundo.
Las autoridades reglamentarias pueden hacer cumplir las
normas presentadas en la USP y el NF; no obstante, debido
a que el reconocimiento de los compendios USP y NF puede
variar de país a país, se recomienda que los usuarios conoz-
can las legislaciones y reglamentaciones aplicables. En los
Estados Unidos, de acuerdo con la Federal Food, Drug, and
Cosmetic Act (Ley Federal de Alimentos, Medicamentos y
Cosméticos o FDCA), tanto la USP como el NF están recono-
cidos como compendios oficiales. Un medicamento con un
nombre reconocido en USP-NF debe cumplir con las normas
farmacopeicas de identidad o se le considerará adulterado,
rotulado incorrectamente (misbranded) o ambos. Ver, p.ej.,
la FDCA § 501 (b) y 502(e)(3)(b); ver también las reglamen-
taciones de la FDA, el Título 21 del CFR § 299.5(a&b). Para
evitar que se les considere adulterados, los medicamentos
deben cumplir además con las normas farmacopeicas de
contenido, calidad y pureza, a menos que se declaren en el
etiquetado todos los aspectos en los que el medicamento
difiere. Ver, p.ej., FDCA § 501 (b) y Título 21 del CFR §
4 Advertencias Generales
299.S(c). Asimismo, para evitar que se les considere rotula-
dos incorrectamente, los medicamentos reconocidos en los
compendios USP-NF deben también envasarse y etiquetarse
de conformidad con las normas farmacopeicas. Ver la FOCA
§ 502(g).
Un suplemento dietético que declara cumplir con las es-
pecificaciones de USP se considerará como un alimento in-
correctamente rotulado (misbranded food) si incumpliera las
mismas. Ver la FOCA § 403(s)(2)(D).
La ejecución de las normas USP es responsabilidad de la
FDA y demás autoridades gubernamentales en los EE.UU. y
demás países. La USP no desempeña ningún papel en la
ejecucion de las normas.
Cam6io en la redacd6n:
3. CUMPLIMIENTO DE LAS NORMAS
3.10. Aplicabilidad de las Normas
Las normas para un artículo reconocido en los compen-
dios (USP-NF) se expresan en la monografía del artículo, en
los capítulos generales aplicables y en las Advertencias Gene-
rales. La identidad, el contenido, la calidad y la pureza de
un artículo se determinan mediante pruebas, procedimien-
tos y criterios de aceptación oficiales, y demás requisitos in-
cluidos en la monografía, en los capítulos generales aplica-
bles o en las Advertencias Generales. Los "capítulos generales
aplicables" son aquellos con numeración menor de 1000 o
superior a 2000 que se hacen aplicables a un artículo me-
diante referencia en las Advertencias Generales, en una mo-
nografía o en otro capítulo general aplicable con numera-
ción menor de 1000. Cuando los requisitos de una
monografía sean diferentes a los de las Advertencias Genera-
les o de un capítulo general aplicable, los requisitos de la
monografía se aplicarán y reemplazarán a los requisitos de
las Advertencias Generales o cap1tulos generales aplicables,
aunque la monografía no haga mención expresa de las dife-
rencias.
Los capítulos generales con numeración entre 1000 y
1999 tienen únicamente fines informativos. No contienen
pruebas, valoraciones ni otros requisitos obligatorios aplica-
bles a artículos oficiales, aunque se citen en un capítulo ge-
neral con numeración inferior a 1000, una monografía o
estas Advertencias Generales. Los capítulos generales con nu-
meración superior a 2000 se aplican únicamente a artículos
destinados para su uso como ingredientes dietéticos y suple-
mentos dietéticos. Las citas a capítulos generales en las mo-
nografías del NF se refieren a los capítulos generales del
compendio USP.
La USP permite la adopción temprana de las normas revi-
sadas con antelación a la fecha oficial, a menos que se espe-
cifique algo distinto al momento de la publicación. Cuando
las normas revisadas para un artículo existente hayan sido
publicadas como "texto oficial" aprobado (conforme a lo
aprobado en la sección 2.1 O) pero aún no han alcanzado su
fecha de oficialización (seis meses después de su publica-
ción, a menos que se es¡ecifique algo distinto; ver "fecha
oficial", sección 2.20), e cumplimiento con la norma revi-
sada no excluirá una determinación o indicación de cumpli-
miento con las normas farmacopeicas, a menos que la USP
especifique algo distin~o prohibiendo la adopción temprana
en una norma en particular.
Las normas en monografías, capítulos generales pertinen-
tes y Advertencias Generales son aplicables durante toda la
vida del artículo, desde su producción hasta su caducidad.
Las especificaciones del fabricante y las prácticas de fabrica-
ción (incluyendo, p.ej., iniciativas de Calidad por Diseño,
Tecnología de Procesamiento Analítico y Análisis de Libera-
ción en Tiempo Real), por lo general se siguen para asegu-
rar que el artículo cumpla con las normas farmacopeicas
hasta su fecha de caducidad, siempre que se almacene con-
forme a las instrucciones provistas. Todos los artículos farma-
copeicos comercializados deberán fabricarse de modo que,
al ser examinados usando estas valoraciones y procedimien-
tos de prueba, cumplan con todos los requisitos farmacopei-
USP 40
cos aplicables (Advertencias Generales, monografías y capítu-
los generales). Por consiguiente, se espera que todo artículo
oficial cumpla con las normas farmacopeicas en caso de ser
analizado, y todo artículo oficial analizado según se indica
en la monografía pertinente debe cumplir con tales normas
para demostrar el cumplimiento.
Algunas pruebas, tales como las pruebas de Disolución y
Uniformidad de Unidades de Dosificación, requieren el análi-
sis individual de múltiples unidades de dosificación con un
esquema de decisiones. Sin embargo, aunque estas pruebas
utilicen el análisis de varias unidades de dosificación, son, de
hecho, una única determinación. Estos procedimientos no
deben confundirse con los planes de muestreo estadístico.
La similitud con los procedimientos estadísticos parecería su-
gerir una intención de hacer inferencias a grupos más gran-
des de unidades, pero, en todos los casos, las declaraciónes
sobre el cumplimiento de la norma farmacopeica son aplica-
bles únicamente a las unidades analizadas. Los compendios
no indican ni prohíben las repeticiones, las mediciones múl-
tiples, el rechazo estadístico de valores aberrantes o las ex-
trapolaciones de los resultados a poblaciones más grandes,
ni tampoco la necesidad y frecuencia adecuada del análisis
de las partidas; dichas decisiones se basan en los objetivos
del análisis. La frecuencia del análisis y el muestreo se dejan
libres a las preferencias o instrucciones de aquéllos que lle-
van a cabo los análisis para determinar el cumplimiento con
las normas y a los demás usuarios de USP-NF, incluidos fa-
bricantes, compradores o autoridades reglamentarias.
Los productos oficiales se preparan de acuerdo con los
principios reconocidos de buenas prácticas de fabricación y
a partir de ingredientes que cumplen con las normas de USP
o NF, siempre que existan normas para dichos ingredientes
(para suplementos dietéticos, ver la sección 3.1 0.20).
Las sustancias oficiales se elaboran según principios reco-
nocidos de buenas prácticas de fabricación con ingredientes
que cumplen con las especificaciones establecidas para ase-
gurar que las sustancias resultantes cumplan con los requisi-
tos de las monografías oficiales.
3.10.1 O. Aplicabilidad de las Normas a Productos
Farmacéuticos, Fármacos y Excipientes
Las normas correspondientes de los compendios USP o NF
se aplican a cualquier artículo comercializado en los Estados
Unidos que (1) se reconozca en el compendio y (2) que se
destine o etiquete para su uso como medicamento o como
ingrediente de un medicamento. Dichos artículos (productos
farmacéuticos, fármacos y excipientes) incluyen medicamen-
tos para humanos (ya sea dispensados con receta, "de venta
libre" o de otro tipo), así como medicamentos para anima-
les. Las normas correspondientes se aplican a dichos artícu-
los, independientemente de que se agregue o no la deno-
minación "USP" o "NF". Las normas se aplican por igual a
los artículos con títulos oficiales o nombres derivados por
transposiciones de las palabras que componen los títulos ofi-
ciales, o por transposición en el orden de los nombres de
dos o mas ingredientes activos en los títulos oficiales, o
cuando se usan sinónimos con la intención o efecto de su-
gerir un grado significativo de identidad con el título o
nombre oficial.
3.10.20. Aplicabilidad de las Normas a Dispositivos
Médicos, Suplementos Dietéticos y a Sus Componentes e
Ingredientes
Un artículo reconocido en la USP o el NF debe cumplir
con las normas farmacopeicas si el artículo es un dispositivo
médico, componente destinado para un dispositivo médico,
suplemento dietético, ingrediente dietético u otro ingre-
diente destinado para su incorporación en un suplemento
dietético, y si declara en su etiquetado que cumple con los
compendios USP o NF.
En general, los suplementos dietéticos se elaboran con in-
gredientes que cumplen con las normas de los compendios
USP, NF, o Food Chemicals Codex. Cuando no existen tales
normas, las sustancias pueden usarse en suplementos dieté-
ticos siempre que hayan demostrado una calidad de grado
USP 40
alimenticio aceptable utilizando otros procedimientos
adecuados.
•3.10.30. Aplicabilidad de tas Normas a la Pr.ád:ica·~éla
Preparación Magistral (Nµevo)
las normas sobre preparación magistr<'llc:Je la.(JSP, P(epcl"
ración l\4agistrol~Preparadones N_a. Estériles \795't y Prepara·
ción Magísttal-Preparacianes Estenles ('197)., segun corres·
ponda, son aplical:)les a la pnktica () (lctivídad ~e)~ . .
preparación magistral indep~~diente!Tienie d~ si e><1ste una.
monografía para la preparac1on magistral o si estos . los
son referidos en dicha monografía. En los
América, los capítulos (795:) y(797} no son apli
dicamentos preparados ma91stralm~nte por .~n~i .. , . .· •
tracias con la FDA como instalaciones de. terceniaciert (()uk
sourcing) conforme alo defini~o:ec,n.la ley Federal d~ ·· .....
Alimentos, Med1camentos·x Co.smet1cos.(FD~ ppr·s~~ st·.
$Jlas en _inglés) §S.03B, debido a que; s~ requ•e 91crqs
mstalac1on~~ cui:nplan con lcis r~uis1t~s de. bu., . . . ·act''?s
de fabricac1on vigentes de la FDA. las preparact()~~s mi!lgis-
trales ·incluidos los medicamentos p1"eparados.rna91straJ· ...
menté .pot instalaciori~s terc~íi2:adas; también j\l~eijen estqr
sujetas a las monograf.ias aplicables; ver la secc1on 2.20. ~rtl­
culos Oficiales y la sección 4, 10 Mc:mografías.,.usuo
3.20. Indicación de Cumplimiento
Un producto farmacéutico, fármaco o excipiente puede
usar la denominación "USP" o "NF" junto a su título ofici.al
o en otra parte de la etiqueta únicamente cuando: (1) existe
una monografía en el compendio especificado y (2) el a.rtí-
culo cumple con la identidad estipulada en el compendio
correspondiente. , . , producidos por diferentes fabricantes, tales como distintas
Cuando se determina que un producto farmaceut1co, far-
maco, preparación magistral o excip~ente di~iere de las nor-
mas USP o NF pertinentes ~e. contenido! c~l1dad o purez~ ,al
aplicar las pruebas, proced1ryi1entos y cnt~nos de acept.acion
establecidos en el compendio correspondiente,. estas dife-
rencias deben indicarse de forma clara en la etiqueta.
Cuando un producto farmacéutico, fári:naco! prepar.ación
magistral o excipiente no cumple con la 1dent1dad estipu-
lada en los compendios USP o NF o se le ha agre.ga.do una
sustancia que interfiere co~ las pruebas y pro~ed1m1entos
establecidos, se le debe asignar un nombre d1fere~te y total-
mente distinto de cualquier otro nombre reconocido en los
compendios USP o NF.
Un dispositivo médico, suplemento dietético o ingredi~nte
o componente de un dispositivo médico o suplemento die-
tético puede usar la denominación ''.USP" o ,"t:JF" junto a su
título oficial o en otra parte de I~ etiqueta, unican:iente ..
cuando (1) existe una monograf1a en el compendio espec1f1-
cado y (2) el artículo cumple con las normas de la mon~­
grafía y demás normas aplicables en •ese•ysP4a compendio.,
La denominación "USP" o "NF" en la etiqueta de un arti-
culo no debe ni puede interpretarse como un aval por p~rte
de la USP ni tampoco debe interpretarse como una confir-
mación por parte de la USP de que tal artículo c~r:iple con
las n,ormas p~rtinentes de la USP. La USP puede 1nic1ar una
accion legal s1 se declara o presenta un articulo como ~n
artículo oficial en uno de los compendios de la USP y esta
determina que tal aseveración no fue hecha de bue~a fe.
La denominación "USP-NF" puede usarse en la etiqueta
de un artículo siemr,re que dicha etiqueta también lleve
una frase tal c'omo 'Cumple con las normas NF publicadas
por la USP", indicando el compendio particular que corres-
ponde aplicar.
Cuando se usan las siglas "USP/' "NF," o "USP-NF" en la
etiqueta de un artículo para indicar que el artículo cumple
con las normas farmacopeicas, las siglas deben aparecer
junto al título oficial del artículo. las siglas no deberán apa-
recer dentro de símbolos, como por ejemplo círculos, cua-
drados etc., y deberán estar en letras mayúsculas.
Si un suplemento dietético no cumple con todos los re-
quisitos farmacopeicos aplicables, pero contiene un<;> o más
ingredientes dietéticos u otros ingre~ien.tes reconocid<;>s en
los compendios USP o NF, se puede indicar que tales ingre-
dientes individuales cumplen con las normas USP o NF o
Advertencias Generales 5
que son de calidad USP o NF siempre y cuando la denomi-
nación se limite a los ingredientes individuales y no se insi-
núe que el suplemento dietético cumple con las normas en
USP.
4. MONOGRAFÍAS Y CAPÍTULOS GENERALES
4.1 O. Monografías
Las monografías establecen el nombre, definición, especi-
ficaciones y demás requisitos relacion,ados con el en':'~sad?,
almacenamiento y etiquetado del articulo. Las espec1f1cac10-
nes consisten en pruebas, procedimieritos y criterios de.
aceptación que ayudan,ª asegurar la 1dent!~ad, contenido,
calidad y pureza del articulo. Para los requ1s1tos generales
relacionados con secciones específicas de la monografía, ver
la sección 5. Componentes de las Monografías.
Debido a que, en ocasiones, las mo:i~grafías no propor-
cionan normas para todas las caractenst1cas relevantes, algu-
nas sustancias oficiales pueden ajustarse a las normas USP o
NF, pero diferir en lo que respecta a propiedades ~o norma-
lizadas que son relevantes para su uso en preparaciones es-
pecíficas. Para asegurar. la reemplazabilidad ~n esos. casos,. se
recomienda a los usuarios comprobar la equ1valenc1a funcio-
nal o determinar tales caractensticas antes de su uso.
4.10.1 O. Aplicabilidad de los Procedimientos de Prueba
Una monografía individual puede incluir más de una
prueba, procedimiento y/o criterio de ~~eptación para el
mismo atributo. A menos que se especifique de otro modo
en la monografía, se debe cumplir con todas las pruebas. En
algunos casos, las instrucciones de la monografía permiten
la selección de pruebas que reflejen atributos de artículos
formas polimórficas, impurezas, hidratos y disolución. las
instrucciones de las monografías indican las pruebas, proce-
dimientos y/o criterios de aceptación que se deben usar, y
el requisito de etiquetado.
El orden en el que se presentan estas pruebas en la mo-
nograffa se basa en el or~en en el que ~on ap~obadas por el
Comite de Expertos pertinente para su inclus1on en la mo-
nografía. La Prueba 1 no es necesariamente la pruebayara
el producto innov~dor o l?ara el producto de r~ferencia. De-
pendiendo de las instrucciones de la monograf1a, por lo re-
gular no se requiere una declaración en el etiquetado si se
usa la Prueba 1 .
4.10.20. Criterios de Aceptación ,.
Los criterios de aceptación consideran errores anal1t1cos y
variaciones inevitables durante la fabricación y preparación
magistral, así como el deterioro hasta un grado considerado
aceptable e~ condicionesyrácticas. La.existenci,a de criterios
de aceptacion farmacope1cos no constituye razon para ase-
verar que una sustancia oficial .cuya pureza se .aproxin:ia al
100 por ciento "excede" la calidad farmacope1ca. De igual
manera, el hecho de que un artículo se haya preparado
usando criterios más estrictos que los especificados en la
monografía no constituye una razón válida para aseverar
que el artículo "excede" los requisitos farmac~peico~~
Un producto oficial debe formularse ~on la intenc1~n de
suministrar el 100 por ciento de la cantidad ~e cada ing~e­
diente declarado en la etiqueta. Cuando debido a requ1s1tos
legales aplicables, se requiera que la cantid~d i;i.ínima de
una sustancia presente en un suplemento d1etetico sea ma-
yor que el criterio de aceptación inferior permitido por la
monografía, el criterio de aceptación superior de la mono-
grafía puede incrementarse en una cantidad
correspondiente.
los criterios de aceptación especificados en las monogra-
fías individuales y en los capítulos generales pa~a preparacio-
nes magistrales se basan en los atributos de calidad que se
espera podrían caracterizar un artículo preparado magistral-
mente a partir de fármacos e ingredientes a granel de
acuerdo con los procedimientos establecidos o con los prin-
cipios reconocidos de buenas prácticas de preparación ma-
gistral descritos en estos compendios.
4.20. Capítulos Generales
A cada capítulo general se le asigna un número que apa-
rece entre paréntesis angulares junto al título (p.ej., Croma-
 6 Advertencias Generales
tografía (621 )). Los capítulos generales pueden contener lo
siguiente:
• Descripciones de pruebas y procedimientos para su apli-
cación en monografías individuales,
• Descripciones y especificaciones de condiciones y prác-
ticas de preparacion magistral,
• Información general para la interpretación de requisitos
farmacopeicos,
• Descripciones de prácticas generales de almacena-
miento farmacéutico, dispensación y envasado, o
• Guías generales para fabricantes de sustancias oficiales o
productos oficiales.
Cuando una monografía hace referencia a un capítulo ge-
neral, los criterios de aceptación pueden presentarse des-
pués de dos puntos.
Algunos capítulos pueden servir como descripciones gene-
rales introductorias de una prueba o técnicas analíticas. Ade-
más, pueden hacer referencia a otros capítulos generales
que contengan técnicas, detalles de los procedimientos y,
en ocasiones, criterios de aceptación.
5. COMPONENTES DE LAS MONOGRAFÍAS
5.1 O. Fórmulas Moleculares
Las fórmulas moleculares de los ingredientes activos que
se usan en la definición del contenido requerido de un artí-
culo farmacopeico tienen por objeto designar las entidades
químicas, tal como aparecen en el nombre químico com-
pleto del artículo, con una pureza absoluta (100 por ciento).
5.20. Sustancias Agregadas
Las sustancias agregadas se presumen inadecuadas para
su inclusión en un artículo oficial y por lo tanto quedan
prohibidas, si su presencia afecta negativamente la biodispo-
nibilidad, la eficacia terapéutica o la seguridad del artículo
oficial; o interfieren con las pruebas y valoraciones prescritas
para determinar el cumplimiento de las normas farmacopei-
cas (ver 3.20 Indicación de Cumplimiento).
El aire contenido en el envase de un artículo oficial puede
extraerse o reemplazarse por dióxido de carbono, helio, ar-
gón o nitrógeno, o una mezcla de estos gases, siempre que
sea apropiado. No es necesario declarar en el etiquetado el
uso de alguno de dichos gases.
5.20.10. Sustancias Agregadas en Sustancias Oficiales
Las sustancias oficiales pueden contener únicamente las
sustancias agregadas específicas permitidas por la monogra-
fía individual. Tales sustancias agregadas no deberán exce-
der la cantidad requerida para lograr el efecto deseado. Si
se permite tal adición, la etiqueta debe indicar los nombres
y las cantidades de las sustancias agregadas.
5.20.20. Sustancias Agregadas (Excipientes e
Ingredientes) en Productos Oficiales
A menos que se especifique algo diferente en la monogra-
fía individual, pueden agregarse sustancias y excipientes
adecuados tales como agentes antimicrobianos, bases far-
macéuticas, transportadores, recubrimientos, saborizantes,
conservantes, estabilizantes y vehículos a un producto oficial
para mejorar su estabilidad, utilidad o apariencia, o para fa-
cilitar su preparación.
Se pueden emplear excipientes y sustancias agregadas ex-
clusivamente para impartir color a los productos oficiales,
excepto para aquéllos destinados a la administración paren-
teral u oftálmica, siempre que cumplan con las reglamenta-
ciones de la FDA para el uso de colorantes y que sean ade-
cuadas en todos los otros as ectos. er también
¡,
En la preparación de ungüentos y supositorios, se pueden
variar las proporciones de fas sustancias que constituyen la
base para mantener la consistencia adecuada en diferentes
condiciones climáticas, siempre que no se varíe la concen-
USP 40
tración de los ingredientes activos y que no se afecte la
biodisponibilidad, la eficacia terapeutica o la seguridad de la
preparación.
5.20.20.1. En Preparaciones Magistrales
Las preparaciones magistrales para las que se proporciona
una composición completa deben contener únicamente los
ingredientes indicados en las fórmulas, a menos que se ex-
ceptúe específicamente en este documento o en la mono-
grafía individual. Se pueden presentar desviaciones en los
procesos especificados o en los métodos de preparación ma-
gistral, pero no en sus ingredientes o proporciones, siempre
que la preparación final cumpla con las normas pertinentes
y se prepare siguiendo el proceso especificado.
Cuando la monografía de una preparación magistral exige
una cantidad de un ingrediente expresada con respecto a la
sustancia seca, no es necesario secar el ingrediente antes de
utilizarlo, siempre que se tome debida cuenta del agua u
otras sustancias volátiles presentes en la cantidad utilizada.
Existen formulaciones de alcohol especialmente desnatura-
lizado que se usan de acuerdo con los estatutos y reglamen-
taciones federales de la Interna! Revenue Service (Oficina de
Recaudación de Impuestos de los EE.UU. o IRS). Puede
usarse una formulación apropiada de alcohol especialmente
desnaturalizado en lugar de Alcohol en la fabricación de
preparaciones farmacopeicas destinadas para uso interno o
para uso tópico, siempre que el desnaturalizante sea volátil
y no se quede en el producto terminado. Un producto ter-
minado destinado a aplicación tópica sobre la piel puede
contener alcohol especialmente desnaturalizado, siempre
que el desnaturalizante sea un ingrediente normal en la pre-
paración o una sustancia agregada permitida; en ambos ca-
sos, el desnaturalizante se debe identificar en la etiqueta de
la preparación tópica. Cuando se indigue un proceso en la
monografía individual, toda preparacion elaborada magis-
tralmente con alcohol desnaturalizado debe ser idéntica a la
que se obtiene mediante el proceso indicado en la
monografía.
5.20.20.2. En Suplementos Dietéticos
Pueden agregarse ingredientes adicionales a los productos
de suplementos dietéticos siempre que tales ingredientes:
(1) cumplan con los requisitos reglamentarios aplicables y
(2) no interfieran con las valoraciones y las pruebas prescri-
tas para determinar el cumplimiento de las normas
farmacopeicas.
5.30. Descripción y Solubilidad
Una prueba cuantitativa de solubilidad se considera una
prueba de pureza, únicamente cuando se describe y designa
como tal en una monografía.
Una monografía puede incluir información relacionada
con la descripción del artículo. La información de "descrip-
ción y solubilidad" correspondiente a un artículo también
aparece en la tabla de referencia Descripción y Solubilidad
Relativa de Artículos de la USP y del NF. La tabla de referencia
indica sólo las propiedades de los artículos que cumplen con
las normas de la monografía. La tabla de referencia está
destinada principalmente para aquéllos que usan, elaboran y
dispensan fármacos y/o artículos relacionados. Aunque la in-
formación proporcionada en las monografías y la informa-
ción en la tabla de referencia puede ayudar indirectamente
a la evaluación preliminar de un artículo, dicha información
no constituye en sí misma una norma o prueba de pureza.
La solubilidad aproximada de una sustancia farmacopeica
se indica mediante uno de los siguientes términos
descriptivos:
Partes de Disolvente
Requeridas para
Término Descriptivo 1 Parte de Soluto
Muv soluble Menos de 1
Fácilmente soluble De 1 a 1O
Soluble De 1O a 30
Moderadamente soluble De 30 a 100
Poco soluble De 100 a 1000
USP 40
Partes de Disolvente
Requeridas para
Término Descriotivo 1 Parte de Soluto
Muv ooco soluble De 1 000 a 1O 000
Prácticamente insoluble o Mayor que o igual a
Insoluble 10000
5.40. Identidad
La prueba farmacopeica bajo el título Identidad o Identifi-
cación se proporciona como una ayuda para verificar la
identidad de los artículos según se indica, p.ej., en la eti-
queta de sus envases, y para establecer si se trata del artí-
culo nombrado en USP-NF. La prueba de Identidad o Identi-
ficación para un artículo en particular puede comprender
uno o más procedimientos. Cuando se lleva a cabo una
prueba farmacopeica de Identidad o Identificación, se deben
cumplir todos los requisitos de todos los procedimientos es-
pecificados para satisfacer los requisitos de la prueba. El in-
cumplimiento de un artículo con los requisitos de una
prueba de Identidad o Identificación prescrita (es decir, que
no cumpla con los requisitos de todos los procedimientos
especificados que componen dicha prueba) indica que el
artículo está rotulado incorrectamente y/o adulterado.
5.50. Valoración
Las pruebas de valoración para preparaciones ma9istrales
no han sido concebidas para evaluar una preparacion ma-
gistral antes de su dispensación, sino como pruebas oficiales
para casos en los que exista duda o controversia acerca de
la conformidad de la preparación con las normas oficiales.
5.50.1 O. Unidades de Potencia (Biológica)
Para las sustancias que no pueden ser caracterizadas com-
pletamente por medios químicos o físicos, o que requieren
la confirmación de la funcionalidad o de una estructura ter-
ciaria, puede ser necesario expresar las cantidades de activi-
dad biológica en unidades de potencia biológica, definidas
por un estándar de referencia designado como patrón ofi-
cial. Para casos en los que los materiales de referencia se
han discontinuado, las unidades internacionales de potencia
pueden definirse en términos de masa molecular, como en
el caso de las vitaminas A, D y E.
Cuando se encuentran disponibles, los Estándares Biológi-
cos Internacionales de la Organización Mundial de la Salud
(OMS) definen las Unidades Internacionales (UI). Las mono-
grafías de la USP hacen referencia a las unidades asignadas
por los Estándares de Referencia USP directamente como
Unidades Internacionales (UI) o como "Unidades USP". Para
algunos productos biológicos, las unidades de potencia se
asignan en comparación con el correspondiente Estándar de
los Estados Unidos de América (U.S. Standard) establecido
por la FDA (ver Productos Biológicos (1041 )), existan o no
Unidades Internacionales o Unidades USP definidas. Se debe
tener en cuenta que para el etiquetado relacionado con el
producto, r,.ej., en envases, no se requiere utilizar la frase
completa 'Unidades USP de [nombre del producto]" que
aparece en muchas monografías de la USP en la seccion de
etiquetado. El término "Unidades USP" se puede utilizar en
el etiquetado del producto de conformidad con los requisi-
tos farm~copeicos de la USP, siempre y cuando quede claro
que, basandose en el contexto, el volumen se declara en
términos de Unidades USP de [nombre del producto]. En
dichos casos, debe quedar claro que "Unidades USP" y
"Unidades USP de [nombre del producto]" comparten el
mismo significado.
5.60. Impurezas y Sustancias Extrañas
Las pruebas para determinar la presencia de sustancias ex-
trañas e impurezas se establecen para limitarlas a cantidades
que no sean objetables en las condiciones normales de em-
pleo del artículo (ver también Impurezas en Fármacos y Pro-
ductos Farmacéuticos (1086)).
Además de las pruebas prescritas en la monografía indivi-
dual, se deben aplicar otras pruebas y criterios de acepta-
ción adecuados para detectar y controlar impurezas que pu-
dieran resultar de cambios en los métodos de
procesamiento o que provengan de fuentes externas,
Advertencias Generales 7
cuando su presencia no concuerde con las buenas prácticas
de fabricación o las buenas prácticas farmacéuticas
aplicables.
5.60.1 O. Otras Impurezas en los Artículos de la USP y el
NF
Cuando una monografía de los compendios USP o NF in-
cluye una valoración o prueba de impurezas orgánicas cro-
matográfica, diferente de una prueba de disolventes resi-
duales, y el procedimiento de la monografía no detecta una
impureza presente en la sustancia, se deben expresar la can-
tidad e identidad de la impureza, si se conocieran ambas,
bajo el encabezado Otra(s) lmpureza(s) en el etiquetado
(certificado de análisis) de la sustancia oficial.
La presencia en una sustancia oficial de cualquier impu-
reza no declarada en el etiquetado constituye una desvia-
ción de la norma si el contenido es de O, l % o mayor. La
suma de las Otras Impurezas combinada con las impurezas
detectadas por los métodos de la monografía no puede ex-
ceder del 2,0% (ver Impurezas Comunes (466)), a menos
que en la monografía se indique algo diferente.
Las siguientes categorías de fármacos quedan excluidos de
los requisitos de Otras Impurezas:
• Productos de fermentación y derivados semisintéticos
obtenidos a partir de ellos,
• Radiofármacos,
• Productos biológicos,
• Productos obtenidos por biotecnología,
• Péptidos,
• Productos botánicos y
• Productos crudos de origen animal o vegetal.
No debe incluirse ninguna sustancia conocida como tó-
xica en Otras Impurezas.
5.60.20. Disolventes Residuales en los Artículos de la USP
y el NF
Todos los artículos de los compendios USP y NF están su-
jetos al control pertinente de disolventes residuales, incluso
cuando la prueba no esté indicada en la monografía indivi-
dual. Los disolventes que se empleen durante los procesos
de fabricación deben ser de calidad adecuada. Asimismo, se
debe tomar en consideración la toxicidad y el nivel residual
de cada disolvente y limitar los disolventes conforme a los
principios definidos y los requisitos especificados en Disol-
ventes Residuales (467), según los métodos generales indica-
dos en dicho capítulo u otros métodos adecuados.
5.60.30 Impurezas Elementales en Medicamentos y
Suplementos Dietéticos USP
Con vigencia a partir del 1º de enero de 2018, se contro-
larán las impurezas elementales en los medicamentos oficia-
les de acuerdo con los principios definidos y los requisitos
e~pecif.icados e.n Impurezas Elementales-Límites (232). Con
v1genoa a partir del 1 º de enero de 2018, los contaminan-
tes elementales en suplementos dietéticos oficiales se con-
trolarán de acuerdo con los principios definidos y los requisi-
tos especificados en Contaminantes Elementales en
Suplementos Dietéticos (2232). También, con vigencia a par-
tir del 1 º de enero de 2018, se eliminará el capítulo Metales
Pesados (231 ), así como todas las referencias a dicho capí-
tulo que se encuentren en los capítulos generales y las mo-
nografías. La USP permitirá la adopción temprana de los re-
quisitos de los capítulos (232) y (2232). Además, si el
capítulo (232) o el (2232), según corresponda, se imple-
mentan por completo en lo que respecta a un medicamento
o suplemento dietético particular antes del 1 º de enero de
2018, dicho producto y sus ingredientes ya no necesitarán
cumplir con los requisitos aplicables del capítulo (231) para
que la USP considere que cumplen con los requisitos de
USP-NF.
5.70. Pruebas de Desempeño
Cuando las determinaciones de uniformidad de contenido
se hayan efectuado usando la misma metodología analítica
especificada en la Valoración, tomando debida cuenta de las
diferencias en la preparación de la muestra, el promedio de
todas las determinaciones individuales de uniformidad de
contenido puede usarse como el resultado de la Valoración.
8 Advertencias Generales
5.80. Estándares de Referencia USP
Los Estándares de Referencia USP son materiales auténti-
cos que han sido aprobados como adecuados para su uso
como estándares de comparación en las pruebas y valora-
ciones de la USP o el NF. (Ver Estándares de Referencia USP
(11 ).) Cuando una Frueba o valoración de los compendios
USP o NF indique e uso de un Estándar de Referencia USP,
sólo se considerarán concluyentes los resultados obtenidos
usando el Estándar de Referencia USP especificado. Cuando
un procedimiento exija el uso de un artículo farmacopeico y
no de un Estándar de Referencia USP como material de refe-
rencia, se debe utilizar una sustancia que satisfaga todos los
requisitos indicados para dicho artículo en la monografía ofi-
cial. Si alguna norma nueva de la USP o del NF requiere el
uso de un Estándar de Referencia USP nuevo que aún no
esté disponible, dicha parte de la norma que contiene el
requisito no será oficial hasta que el material de referencia
USP especificado esté disponible.
Salvo que la etiqueta del estándar de referencia indique
una potencia o contenido específicos, se asume que el es-
tándar de referencia tiene una pureza del 100,0% para la
ªFlicación oficial. A menos que se indique algo diferente en
e procedimiento de la monografía individuar o en un capí-
tulo general, los Estándares de Referencia USP deben usarse
de acuerdo con las instrucciones de sus etiquetas.
6. PRÁCTICAS Y PROCEDIMIENTOS DE PRUEBA
6.10. Prácticas Seguras de Laboratorio
Al realizar procedimientos farmacopeicos, se deben seguir
prácticas seguras de laboratorio, las cuales incluyen medidas
precautorias, equipo de protección y prácticas de trabajo
acordes a las sustancias químicas y procedimientos usados.
Antes de realizar cualquier procedimiento descrito en los
compendios, el analista debería conocer los peligros asocia-
dos con las sustancias químicas y las técnicas y medios de
protección contra dichos riesgos. Estos compendios no tie-
nen como objetivo describir tales peligros o medidas de
protección.
6.20. Procedimientos Automatizados
Los procedimientos automatizados y manuales que em-
plean los mismos fundamentos químicos se consideran
equivalentes.
6.30. Métodos y Procedimientos Alternativos y
Armonizados
Se pueden usar métodos y/o procedimientos alternativos
que proporcionen alguna ventaja en cuanto a exactitud,
sensibilidad, precisión, selectividad o adaptabilidad a la au-
tomatización o a la reducción de datos computarizados o en
otras circunstancias especiales. Dichos métodos y procedi-
mientos alternativos se deben validar según se describe en
el capítulo general Validación de Procedimientos Farmacopei-
cos (1225) y se debe demostrar que proporcionan resultados
equivalentes o mejores. Solamente aquellos resultados obte-
nidos por losrnét9dos y procedimientos suministrados en
los ~tomper:¡(ji<>S•vsúa serán concluyentes.
Se recomienda remitir a la USP los procedimientos alter-
nativos para su evaluación como reemplazos potenciales o
para agre~arlos a las normas (ver la sección 4. 7O.
Monografws).
En ciertos capítulos generales se indica que el texto en
cuestión está armonizado con el texto correspondiente de la
Farmacopea Europea y/o la Farmacopea japonesa y que estos
textos son intercambiables. Por ello, si el cumplimiento de
un requisito de una sustancia o preparación fuera determi-
nado usando un método intercambiable de una de estas
farmacopeas, también debería cumplir los requisitos de la
USP-NF. Sin embargo, si apareciera una diferencia, o en el
caso de controversia, sólo el resultado obtenido mediante el
procedimiento y/o método dado en la USP será
concluyente.
USP 40
6.40. Con Respecto a la Sustancia Seca, Anhidra,
Incinerada o Exenta de Disolventes
A menos que se especifique algo diferente, todos los cál-
culos se efectúan con respecto a la sustancia "tal como se
encuentra".
Se pueden realizar los procedimientos de las pruebas so-
bre la sustancia sin secar o sin incinerar y calcular los resul-
tados con respecto a la sustancia seca, anhidra o incinerada,
siempre que la monografía indique una prueba para Pérdida
por Secado, Determinación de Agua o Pérdida por Incineración,
respectivamente. Cuando la presencia de humedad u otro
material volátil puede interferir con el procedimiento, la mo-
nografía individual especifica que es necesario secar la sus-
tancia con anterioridad, paso que es obligatorio.
La expresión "exenta de disolventes" significa que se de-
ben corregir los cálculos por la presencia de disolventes co-
nocidos, según se determinan usando los métodos descritos
en el capítulo (467), a menos que la monografía propor-
cione una prueba de límite de disolventes orgánicos.
La expresión "previamente secada(o)" sin otro calificativo
sic;¡nifica que la sustancia se debe secar según se indica en
Perdida por Secado (731) o Determinación de Agua (921) (de-
terminación gravimétrica).
Cuando se indique secar al vacío sobre un desecante, se
debe utilizar un desecador al vacío, una pistola para secado
al vacío u otro instrumento apropiado para secado al vacío.
6.40.1 O. Incinerar hasta Peso Constante
"Incinerar hasta peso constante" significa que deberá con-
tinuarse la incineración a 800 ± 25º, a menos que se indique
algo diferente, hasta que dos pesadas consecutivas, la se-
gunda de las cuales se realiza después de un periodo adicio-
nal acorde con la naturaleza y cantidad del residuo, no difie-
ran en más de 0,50 mg por g de sustancia tomada.
6.40.20. Secado hasta Peso Constante
"Secado hasta peso constante" significa que deberá conti-
nuarse el secado hasta que dos pesadas consecutivas, la se-
gunda de las cuales se realiza después de un periodo adicio-
nal de secado acorde con la naturaleza y cantidad del
residuo, no difieran en más de 0,50 mg por g de sustancia
tomada.
6.50. Preparación de Soluciones
6.50.1 O. Filtración
Cuando en un procedimiento se indica "filtrar" sin otro
calificativo, el líquido se debe pasar a través de un papel de
filtro adecuado o dispositivo equivalente hasta que el fil-
trado sea transparente. Dados fas posibles efectos del filtro,
se pueden desechar los volúmenes iniciales del filtrado.
6.50.20. Soluciones
A menos que se especifique de otro modo, todas las solu-
ciones deben prepararse con Agua Purificada. Las soluciones
para mediciones cuantitativas deben prepararse usando ana-
litos medidos o pesados con exactitud (ver la sección 8.20.
Aproximadamente).
Una expresión tal como "(l en 1O)" significa que 1 parte
en volumen de un líquido debe diluirse con, o que 1 parte
en peso de un sólido debe disolverse en, una cantidad sufi-
ciente de diluyente o disolvente para que el volumen de la
solución final sea de 1O partes medidas en volumen. Expre-
siones similares a "(20:5:2)" significan que los números res-
pectivos de partes, medidas en volumen, de los líquidos se-
ñalados deben mezclarse, a menos que se indique algo
diferente.
6.50.20.1. Ajuste de Soluciones
Cuando un procedimiento exige una concentración espe-
cífica, se puede usar una solución con otra normalidad o
molaridad, siempre que se tenga en cuenta la diferencia en
la concentración y no se aumente el error de la medición.
En las pruebas y valoraciones se pueden tomar cantidades
proporcionalmente mayores o menores que las especificadas
de fas sustancias a analizar y los correspondientes Estándares
de Referencia, siempre y cuando las mediciones produzcan
una exactitud equivalente o mejor.
USP 40
A menos que se indique algo diferente, las concentracio-
nes de analitos deben prepararse de modo que queden den-
tro del diez por ciento (10%) del valor indicado. En el caso
de que un procedimiento se adapte al intervalo de trabajo
de un instrumento, las concentraciones de las soluciones
pueden diferir del valor indicado en más de diez por ciento
(10%), realizando los cambios apropiados en los cálculos
asociados. Todo cambio realizado debe quedar dentro del
intervalo validado del instrumento.
Cuando se indica el ajuste del pH mediante un ácido o
base y no se indica la concentración, se pueden usar con-
centraciones apropiadas de dicho ácido o base.
6.50.20.2. Soluciones Reactivo
La información acerca de las Soluciones Reactivo (SR) se
encuentra en el apartado Soluciones Reactivo en la sección
Reactivos, Indicadores y Soluciones de los compendios
USP-NF. El uso de una Solución Reactivo alternativa o cam-
bios en la Solución Reactivo utilizada puede requerir de
validación.
6.50.20.3. Soluciones Indicadoras
Cuando se especifica el uso de una SR indicadora en un
procedimiento, se deben agregar aproximadamente 0,2 mL
ó 3 gotas de dicha solución, a menos que se indique algo
diferente.
6.60. Unidades Necesarias para Completar una Prueba
A menos que se especifique algo diferente, se debe tomar
un número suficiente de unidades para asegurar un resul-
tado analítico adecuado.
6.60.10. Tabletas
Cuando en el procedimiento de una monografía de Table-
tas se indica pesar y reducir a polvo fino no menos de un
cierto número de Tabletas, se entiende que se debe pesar y
reducir a polvo un número contado de Tabletas. La porción
tomada de Tabletas reducidas a polvo debe ser representa-
tiva del total de Tabletas y pesada con exactitud.
6.60.20. Cápsulas
Cuando en el procedimiento de una monografía de Cáp-
sulas se indique vaciar, tanto como sea posible, el contenido
de no menos de cierto número de Cápsulas, se entiende
que se debe abrir cuidadosamente un número contado de
Cápsulas y se debe retirar cuantitativamente, combinar,
mezclar y pesar con exactitud el contenido de las mismas.
La porción tomada del contenido mezclado de las Cápsulas
debe ser representativo del contenido total de las Cápsulas y
pesado con exactitud.
6.70. Reactivos
La ejecución adecuada de las pruebas y valoraciones far-
macopeicas y la confiabilidad de los resultados dependen,
en parte, de la calidad de los reactivos utilizados en estos
procedimientos. A menos que se especifique algo diferente,
se deben usar reactivos que cumplan con lo establecido en
las especificaciones de la edición vigente de Reagent Chemi-
cals publicada por la American Chemical Society (ACS).
Cuando tales especificaciones no existan o cuando por dis-
tintas razones la pureza requerida de un reactivo fuera dife-
rente, se suministran especificaciones farmacopeicas de reac-
tivos de calidad aceptable (ver la sección Reactivos,
Indicadores y Soluciones en USP-NF). Los reactivos no trata-
dos por ninguna de estas especificaciones deben ser de
grado adecuado para la realización del método de valora-
ción o prueba en cuestión.
La inclusión en los compendios de estos reactivos, indica-
dores y soluciones empleadas como reactivos, no implica
que tales sustancias tengan utilidad terapéutica. Cualquier
referencia a la USP o el NF en sus etiquetados debe incluir
también el término "reactivo" o "grado reactivo". La USP
puede proveer reactivos en caso de que no se encuentren
comercialmente disponibles.
6.80. Equipo
A menos que se indique algo diferente, la especificación
de un tamaño o tipo definido de recipiente o de aparato es
sólo una recomendación. Es posible usar otras dimensiones
o tipos siempre que sean adecuados para el uso pretendido.
Advertencias Generales 9
6.80.1 O. Aparatos de Medición
Cuando se indique el uso de matraces volumétricos u
otros dispositivos para medir, pesar o clasificar en forma
exacta, se deben emplear estos equipos u otros que posean,
al menos, una exactitud equivalente.
6.80.10.1. Pipeta
Cuando se especifica el uso de una pipeta, ésta se puede
sustituir por una bureta adecuada. Cuando se indica el uso
de una pipeta calibrada "para contener", ésta se puede sus-
tituir por un matraz volumétrico adecuado.
6.80.10.2. Protección contra la Luz
Cuando se indique el uso de recipientes con protección
actínica o resistentes a la luz, se pueden utilizar recipientes
especialmente tratados para proteger el contenido contra la
luz, o recipientes transparentes que se hayan recubierto o
envuelto adecuadamente para volverlos opacos.
6.80.20. Instrumentos
Es posible sustituir el instrumento especificado por otro
instrumento siempre que el instrumento sustituto se base en
los mismos principios fundamentales de operación y tenga
una sensibilidad y exactitud equivalente o mayor; tales ca-
racterísticas se deben calificar como apropiadas. Si se men-
cionara una marca o un proveedor de un material, un ins-
trumento o una pieza de equipo, o el nombre y la dirección
de un fabricante o distribuidor (por lo general pueden apa-
recer como notas al pie de página), esta información se
brinda sólo por conveniencia y no implica aprobación, aval
o certificacion.
6.80.20.1. Columnas y Tubos Cromatográficos
El término "diámetro" se refiere al diámetro interno (DI).
6.80.20.2. Otros Tipos de Tubos y Tuberías
El término "diámetro" se refiere al diámetro externo (DE).
6.80.20.3. Baño de Vapor
Cuando se indique el uso de un baño de vapor, se usa
vapor vivo fluente u otra fuente de calor regulado a una
temperatura equivalente.
6.80.20.4. Baño de Agua
A menos que se especifique algo diferente, un baño de
agua requiere agua en ebullición vigorosa.
6.80.30. Dispositivos de Medición de Temperatura
Los dispositivos de medición de temperatura adecuados
para las pruebas farmacopeicas cumplen con especificacio-
nes que son rastreables a un estándar del National lnstitute
of Standards and Technology (Instituto Nacional de Normas
y Tecnología de los EE.UU. o NIST) o equivalente. Los dispo-
sitivos de medición de temperatura pueden ser del tipo li-
quido en vidrio o un tipo de indicador de temperatura aná-
logo o digital, tal como un dispositivo de temperatura con
resistencia, termistor o termopar. La estandarización de ter-
mómetros se lleva a cabo con una frecuencia de análisis
establecida con una temperatura estándar rastreable al NIST.
Por ejemplo, se puede consultar la edición vigente de las
normas El de la American Society of Testing of Materials
(Sociedad Estadounidense para el Análisis de Materiales o
ASTM) para termómetros de líquido en vidrio.
7. RESULTADOS DE PRUEBAS
7.1 O. Interpretación de los Requisitos
Los resultados analíticos observados en el laboratorio (o
los calculados a través de determinaciones experimentales)
se comparan con los criterios de aceptación especificados
para deter~inar si el artículo cumple con los requisitos
farmacope1cos.
El valor de informe, que por lo general se obtiene combi-
nando valores de varias determinaciones individuales, se
compara con los criterios de aceptación. El valor de informe
es el resultado final de un procedimiento completo de medi-
ción, según se ha documentado.
Cuando los criterios de aceptación se expresan de forma
numérica en estas Advertencias Generales mediante la espe-
cificación de un límite superior y/o inferior, los valores per-
mitidos incluyen los valores especificados, pero no los valo-
1O Advertencias Generales USP 40

res fuera del límite o límites. Los criterios de aceptación se
consideran significativos hasta el último dígito señalado.
7.10.5. Concentraciones Nominales en Ecuaciones
Cuando se especifica una "concentración nominal", calcu-
lar la concentración basándose en la cantidad declarada en
la etiqueta. En los procedimientos de valoración, la correc-
ción por contenido de agua típicamente se indica en la De-
finición y en la etiqueta del Estándar de Referencia USP. Para
otros procedimientos, la corrección por contenido y/o po-
tencia valorados se realiza antes de usar la concentracion en
la ecuación provista en la monografía.
7.10.10. Equivalencia en Procedimientos Volumétricos
Las instrucciones de los procedimientos volumétricos con-
cluyen con una declaración de equivalencia entre el peso
del analito y cada mL de solución volumétrica normalizada.
En tales equivalencias, se entenderá que el número de cifras
significativas en la concentración de la solución volumétrica
corresponde al del número de cifras significativas en el peso
del analito. Siempre que corresponda, se deben hacer co-
rrecciones en todas las valoraciones volumétricas basándose
en la determinación con un blanco (ver Volumetría (541) ).
7.20. Reglas para Redondeo
Los valores observados o calculados deben redondearse al
mismo número de decimales que el expresado para el lí-
mite. No deberá efectuarse el redondeo antes de concluir
los cálculos correspondientes para obtener el valor de in-
forme. Los cálculos intermedios (p.ej., la pendiente de la
curva de linealidad) pueden redondearse para propósitos de
informe, pero si se requiere realizar cálculos adicionales se
deben utilizar los valores originales sin redondear. Los crite-
rios de aceptación son números fijos y no se redondean.
Cuando se requiere redondear una cifra, se considera so-
lamente el dígito que se encuentra a la derecha del último
lugar decimaf en la expresión del límite. Si este dígito es
menor de 5, se elimina sin cambiar el dígito que lo precede.
Si este dígito es igual o mayor a 5, se elimina y el d1gito
que lo precede se aumenta en 1.
Ca111bio en la ~d«c<ló~:.
8. TÉRMINOS Y DEFINICIONES
8.1 O. Abreviaturas
• ER corresponde a un Estándar de Referencia USP.
• SC corresponde a una Solución Calorimétrica.
• SR corresponde a una Solución Reactivo.
• SV corresponde a una Solución Volumétrica estandari-
zada de conformidad con las instrucciones provistas en
la monografía individual o en la sección Reactivos, Indi-
cadores y Soluciones de USP-NF.
8.20. Aproximadamente
El término "aproximadamente" indica una cantidad que
puede variar dentro del 10%.
Si se especifica una medición como "medida con exacti-
tud" o "pesada con exactitud" se deben seguir las especifi-
caciones de los capítulos generales Aparatos Volumétricos
(31) y Balanzas (41 ), respectivamente.
8.30. Contenido de Alcohol
Los porcentajes de alcohol, como los indicados en Conte-
nido de Alcohol, son porcentajes en volumen de C2HsOH a
15,56º. Cuando se exige el uso de alcohol, alcohol etílico o
etanol en una fórmula, prueba o valoración, se debe usar el
artículo de la monograf1a Alcohol de la USP. Cuando se hace
referencia a "C2H 50H", significa etanol absoluto (100 por
ciento). Cuando un procedimiento exige alcohol deshidra-
tado, alcohol absoluto o alcohol anhidro, se debe usar el
artículo de la monografía Alcohol Deshidratado de la USP.
8.40. Pesos Atómicos
Los pesos atómicos usados para calcular pesos molecu-
lares y los factores en las valoraciones y en otras partes
donde éstos aparezcgn, son.los estgblecidos por la IUP,ó.C:
Commi.ssion on .t.:)s .t;iµ("ldl:\ll~es ~ndA:tc:f.. ·
(CC!misíón qi:¡ ·AptJ:h :f5(ft6pt~s y;.f>~oscf\
de la Unión Internacional de Química Pura y Aplicada).
8.50. Determinaciones con Blancos
Cuando se indique realizar "cualguier corrección necesa-
ria" por medio de una determinacion con un blanco, tal
determinación debe efectuarse usando las mismas cantida-
des de los mismos reactivos tratados de la misma manera
que la solución o mezcla que contiene la porción de sustan-
cia que se va a analizar o valorar, pero omitiendo dicha
sustancia.
8.60. Concomitantemente
El término "concomitantemente" indica que las determi-
naciones o mediciones deben efectuarse en sucesión
inmediata.
8.70. Desecador
La instrucción "en un desecador" indica el uso de un reci-
piente cerrado herméticamente, de tamaño y diseño ade-
cuados, que mantiene una atmósfera de bajo contenido de
humedad mediante un desecante adecuado, por ejemplo,
cloruro de calcio anhidro, perclorato de magnesio, pentó-
xido de fósforo o gel de sílice. Ver también la seccion 8.220
Desecador al Vacío.
8.80. Logaritmos
Los logaritmos empleados son logaritmos en base 1 O.
8.90. Cepas Microbianas
Cuando se cita e identifica una cepa microbiana por el
número de catálogo de la American Type Culture Collection
(Colección Estadounidense de Cultivos de Referencia o
ATCC), la cepa específica debe emplearse directamente o, si
se hacen cultivos sucesivos, no deben usarse más de cinco
pasajes a partir de la cepa original.
8.100. Inapreciable
El término "inapreciable" indica una cantidad que no ex-
cede de 0,50 mg.

Ejemplos de Redondeo de Valores Numéricos

para Comparación con los Reauisltos
Reaulslto Farmacopelco Valor Sin Redondear Resultado Redondeado Cumple
Límite de valoración :2'.98,0% 97,96% 98,0% Sí
97,92% 97,9% No
97 95% 98 0% Sí
Límite de valoración :o;l 01,5% 101,55% 101,6% No
101,46% 101,5% Sí
10145% 1015% Sí
Prueba de límite :o;0,02% 0,025% 0,03% No
0,015% 0,02% Sí
0027% o 03% No
Prueba de límite :o;3 ppm 3,5 ppm 4 ppm No
3,4 ppm 3 ppm Sí
2,5 ppm 3 ppm Sí
USP 40
8.110. No menos de (NLT} y No más de (NMT)
Las siglas en inglés "NLT" (not less than) significan y se
traducen como "no menos de". Las siglas en in~lés "NMT"
(not more than) significan y se traducen como no más
de".
8.120. Olor
Los términos "inodoro," "prácticamente inodoro," "un
débil olor característico" y expresiones semejantes, indican
la evaluación de una cantidad adecuada de material recien-
temente abierto después de la exposición al aire durante 15
minutos. La asignación de un olor es sólo descriptiva y no
deberá considerarse como una norma de pureza para un
lote particular de un artículo.
8.130. Por ciento
La expresión "por ciento" usada sin otros calificativos
significa:
• Porcentaje de peso en peso, para mezclas de sólidos y
semisólidos;
• Porcentaje de peso en volumen, para soluciones o sus-
pensiones de sólidos en líquidos;
• Porcentaje de volumen en volumen, para soluciones de
líquidos en líquidos; y
• Porcentaje de peso en volumen, para soluciones de
gases en líquidos.
Por ejemplo, una solución al 1 por ciento se prepara disol-
viendo 1 g de un sólido o semisólido, o 1 mL de un líquido,
en disolvente suficiente para obtener 100 mL de solución.
8.140. Concentraciones Porcentuales
Las concentraciones porcentuales se expresan según se in-
dica a continuación:
• Porcentaje de Peso en Peso (p/p) se define como el nú-
mero de g de un soluto en 100 g de solución.
• Porcentaje de Peso en Volumen (p/v) se define como el
número de g de un soluto en 100 mL de solución.
• Porcentaje de Volumen en Volumen (v/v) se define como
el número de mL de un soluto en 100 mL de solución.
8.150. Presión
La presión se determina usando un manómetro o baró-
metro adecuado, calibrado en términos de la presión ejer-
cida por una columna de mercurio de la altura indicada.
8.160. Tiempo de Reacción
El tiempo de reacción es de 5 minutos a menos que se
especifique algo diferente.
8.170. Peso Específico
El Peso específico es el peso de una sustancia en aire a
25º dividido por el peso de un volumen igual de agua a la
misma temperatura.
8.180. Temperaturas
A menos que se indique algo diferente, las temperaturas
se expresan en grados centígrados (Celsius) y todas las me-
diciones se hacen a 25º. Cuando se especifica calor mode-
rado, se indica toda temperatura no mayor de 45º (113º F).
8.190. Tiempo
A menos que se especifique algo diferente, las reglas para
redondeo, según se describen en la sección 7.20 Reglas para
Redondeo, se aplican a todos los tiempos especificados.
8.200. Transferir
El término "transferir" indica una manipulación
cuantitativa.
8.210. Vacío
El término "al vacío" especifica la exposición a una pre-
sión menor de 20 mm de mercurio (2,67 kPas), a menos
que se indique algo diferente.
8.220. Desecador al Vacío
Un "desecador al vacío" es un desecador gue mantiene
una atmósfera de baja humedad a una presion reducida de
Advertencias Generales 11
no más de 20 mm de mercurio (2,67 kPas) o a la presión
indicada en la monografía individual.
8.230. Agua
8.230.1 O. Agua como Ingrediente de un Producto Oficial
Cuando aparece como un ingrediente en un producto ofi-
cial, el agua cumple con los requisitos de la monografía de
agua adecuada en la USP o el NF.
8.230.20. Agua en la Fabricación de Sustancias Oficiales
En la fabricación de sustancias oficiales, el agua usada
debe cumplir con los requisitos para agua potable estableci-
dos en las National Primary Drinking Water Regulations (Re-
glamentaciones Primarias Nacionales para Agua Potable) de
fa U.S. Environmental Protection Agency (Agencia de Protec-
ción Ambiental de los Estados Unidos de América) o en las
reglamentaciones para agua potable de la Unión Europea o
de Japón, o en las Guías para la Calidad del Agua Potable
de la Organización Mundial de la Salud. Las monografías
pueden requerir especificaciones adicionales.
8.230.30. Agua en un Procedimiento Farmacopeico
Cuando se exige agua en un procedimiento farmaco- .
peico, se entiende que debe emplearse .~1 artículo Agua Puri-
ficada de la USP, a menos que se espec1f1que algo diferente.
Se proveen definiciones para otros tipos de agua en la sec-
ción Reactivos, Indicadores y Soluciones y en el capítulo Agua
para Uso Farmacéutico (1231 ).
8.240. Pesos y Medidas
En general, se emplea el Sistema Internacional de Unida-
des (SI, por sus siglas en inglés) para pesos y medidas, de
acuerdo con lo establecido y revisado por la Conférence gé-
nérale des poids et mesures (Conferencia General de Pesos y
Medidas, por sus siglas en inglés). A los fines de los com-
pendios, el término "peso" se considera sinónimo de
"masa".
La molalidad se representa por medio del símbolo m pre-
cedido por un número que es el número de moles de soluto
contenidos en 1 kilogramo del disolvente desi~nado.
La molaridad se representa por medio del s1mbolo M pre-
cedido por un número que es el número de moles del so-
luto designado contenidos en una cantidad del disolvente
designado suficiente para preparar 1 litro de solución.
La normalidad se representa por medio del símbolo N
precedido por un número que es el número de equivalentes
de soluto contenidos en una cantidad de disolvente sufi-
ciente para preparar 1 litro de solución
El símbolo para grados (º) sin una unidad de medición
calificadora representa los grados centígrados (Celsius).
Listado de Símbolos y Prefijos comúnmente usados para
unidades métricas del SI y otras unidades:
Unidades Símbolo Comentarios
Lonnitud
metro m
centímetro cm
milímetro mm
Anteriormente referido
micrómetro um como micrón
Anteriormente se usaba
el símbolo mµ (para
nanómetro nm milimicrón1
Ánastri.im Á loual a O 1 nm
Masa
kiloaramo ka
a ramo a
miliaramo ma
12 Advertencias Generales USP 40

Unidades Símbolo Comentarios Unidades Símbolo Comentarios

El símbolo µg se usa en Presión osmótica de
la USP y el NF para re- una solución, relacio-
presentar microgra- nada con la caneen-
mos, pero los tración de una
microgramos se pue- osmol Os mol sustancia
den representar como miliosmol mOsmol
"mcg" para propósi- Presión
tos de etiquetado y
oascal Pa
prescripción. El térmi-
no "gamma", simboli- kilooascal kPa
zado por la letra libras por
griega y, se usa con pulgada
frecuencia para desig- cuadrada osi
nar el microgramo en milímetro
microgra- la literatura de bioquí- de mer-
mo ua mica. curio mm Ha laual a 133 322 Pa
nanoaramo na Unidades
oicoaramo eléctricas
ºª También referido como amoerio A
la unidad de masa voltio V
atómica unificada y es milivoltio mV
igual a 1 /12 veces la hercio Hz Unidad de frecuencia
masa de un átomo no
kilohercio kHz
enlazado de carbono
dalton Da 12. meaahercio MHz
kilodalton kDa electronvol-
tio eV
Tiemoo
kiloelec-
seaundo s
tronvoltio keV
minuto min
megaelec-
hora h tronvoltio Me V
Volumen Radiación
1 L es igual a 1000 Unidad del SI para la
cm 3 (centímetros cú- actividad de radionu-
litro L bicos) becauerelio Ba cleidos
decilitro dl kilobecque-
1 ml es igual a 1 cm 3, relio kBa
en ocasiones se deno- megabec-
mililitro ml mina ce. auerelio MBa
microlitro ul gigabec-
Tempera- auerelio GBa
tura Unidad para la activi-
Celsius ºC dad de radionucleidos
Cantidad que no forma parte
de Sus- curio Ci del SI
tanda milicurio mCi
Históricamente referido microcurio uCi
como peso molecular nanocurio nCi
en gramos o peso
Otros
mol mol atómico en aramos
aceleración
mili mol mmol
debida a Usada para expresar la
micromol u mol la grave- velocidad de centrifu-
femtomol fmol dad a aación
También referido como revolucio- Usada para expresar la
peso equivalente en nes por velocidad de centrifu-
gramos. Se usa en el minuto rom aación
cálculo de concentra-
ción de sustancia en
unidades de normali- Prefijos Seleccionados del SI
dad. Esta unidad ac-
tualmente ya no Nombre Símbolo Factor
representa la de uso aiaa G J09
preferido en química mea a M 106
equivalente Ea analítica o metrolonía. kilo k 10 3
mili- deci d 10-1
equivalen- 10-2
centi c
te mEa
mili m 10-3
micro u 10-6
nano n 10-9
USP 40
Prefijos Seleccionados del SI (Continuación)
Nombre Símbolo Factor
nico n 1 Q-12
femto f lQ-15
9. PRESCRIPCIÓN Y DISPENSACIÓN
9.10 Uso de Unidades Métricas
Las pres~ripciones, d~ artículo~ fa~macopeicos se escribirán
usa.ndo unidades metncas para indicar la cantidad y/o con-
tenido desea,dC!s, ? .menos que se i~,dique algo diferente en
la monograf1a md1v1dual (ver tamb1en fa anterior sección
5.50. 7O. Un!dades de Potencia [Biológica]). Si la prescripción
de una cantidad se hace en otro sistema de medición se
debe dispe~sar sólo ~n? cantidad equivalente a la pre'scrita
usando el sistema metnco. No se deben usar las abreviatu-
ras para los términos "Unidades" o "Unidades Internaciona-
les" par.a fines de e~iquetado o prescripción. No se deben
usar unidades del sistema apotecario en el etiquetado.
Advertencias Generales 1 3
9.20 Cambios en Volumen
. En la dispensa~ión de n:iedicaciones prescritas, pueden ob-
v1ar~e los pegu~nos cambios de volumen que se producen
debido a vanac1on~s en la temperatura ambiente.
10. CONSERVACION, ENVASADO ALMACENAMIENTO Y
ETIQUETADO I
10.1 O. Envasado y Almacenamiento
:rodos los artíc~l?s en los compendios USP o NF están
s~i.etos a los requlSJtos de envasado y almacenamiento espe-
cificados ~n el capitulo general Requisitos de Envasado y Al-
nyacenam1ento (659), a menos que se provean requisitos dis-
tintos en una monografía individual.
10.20. Etiquetado
To~?S los artí.culos en la USP o el NF están sujetos a los
requ1s1tos de etiquetado especificados en el capítulo (7) a
menos que se provean requisitos diferentes en una mo~o­
grafía individual.
 USP 40 Guía de los Capítulos Generales / Diagrama de Capítulos 15

Diagrama de Capítulos
Guía de Diagramas-Capítulos Generales USP 1
Artículos Oficiales
• Fármacos de Medicamentos Químicos-Pruebas Universales: Ver Diagrama 1a
• Fármacos de Medicamentos Químicos-Pruebas Específicas: Ver Diagrama 1b
• Fármacos Biológicos: Ver Diagrama 2
• Excipientes-Pruebas Universales: Ver Diagrama 3a
• Excipientes-Pruebas Específicas: Ver Diagrama 3b
• Productos Farmacéuticos para Medicamentos Químicos-Pruebas Universales: Ver Diagrama 4a
• Productos Farmacéuticos para Medicamentos Químicos-Pruebas Específicas: Ver Diagrama 4b
• Medicamentos Biológicos: Ver Diagrama 5
• Vacunas: Ver Diagrama 6
• Sangre y Hemoderivados: Ver Diagrama 7
• Productos Derivados de Células, Genes y Tejidos: Ver Diagrama 8
• Ingredientes de Suplementos Dietéticos: Ver Diagrama 11
• Productos de Suplementos Dietéticos: Ver Diagrama 12
• Preparación Magistral-Sustancia/Preparación/Dispensación: Ver Diagrama 73
• Dispositivos Médicos
• (691) Algodón
• (861) Suturas-Diámetro
• (871) Suturas-Sujeción de Agujas
Generalmente Aplicables
• Elementos Básicos
• (1029) Guías de Buenas Prácticas de Documentación
• (1039) Quimiometría
• (1058) Calificación de Instrumentos Analíticos
• (1097) Procedimientos para el Muestreo de Polvos a Granel
• (1151) Formas Farmacéuticas
• (1224) Transferencia de Procedimientos Analíticos
• (1225) Validación de Procedimientos Farmacopeicos
• (1226) Verificación de Procedimientos Farmacopeicos
• Distribución de Medicamentos: Ver Diagrama 9
• Microbiología-Productos No Estériles: Ver Diagrama 1Oa
• Microbiología-Productos Estériles: Ver Diagrama 1Ob

1 Esta tabla y los Diagramas 7-7 3 que se presentan a continuación tienen la finalidad de ser una guía de los capítulos en esta publicación. Es probable que no
incluyan la información completa y no pretenden cumplir con las expectativas de los artículos o limitar la aplicación de las pruebas a cualquier artículo en los
compendios USP-NF.
16 Diagrama de Capítulos / Guía de los Capítulos Generales USP 40

Diagrama la. Fármacos de Medicamentos Químicos-Pruebas Universales

Impurezas
Valora- Disolventes
Capítulo Descripción Identificación ción Orgánicas Inorgánicas Residuales
(7) Etiquetado +
(11) Estándares de Referencia USP +
(81) Antibióticos-Valoraciones Microbiológi-
cas
+
(181) Identificación-Bases Orgánicas Nitro-
genadas +
(191) Identificación-Pruebas Generales +
(193) ldentificación-Tetracic/inas +
(197) Pruebas de Identificación Espectrofoto-
métrica +
(201) Prueba de Identificación por Cromato-
grafía en Capa Delgada +
(202) Identificación de Aceites Fijos por Cro-
matografía en Capa Delgada +
(203) Procedimiento de Cromatografía en Ca-
pa Delgada de Alta Resolución para /dentifi- +
cación de Artículos de Origen Botánico
(206) Aluminio +
(211) Arsénico +
(221) Cloruros y Sulfatos +
(223) Dimetilanilina +
(231) Metales Pesados +
(232) Impurezas Elementales-Límites +
(233) Impurezas Elementales-Procedimien-
tos
+
(241) Hierro +
(251) Plomo +
(261) Mercurio +
(281) Residuo de Incineración +
(291) Selenio +
(351) Valoración de Esteroides +
(391) Valoración de Epinefrina +
(401) Grasas y Aceites Fijos +
(425) Antibióticos-Va/oración Yodométrica +
(451) Volumetría con Nitrito +
(461) Determinación de Nitrógeno +
(466) Impurezas Comunes +
(467) Disolventes Residuales +
(471) Combustión en Matraz con Oxígeno +
(511) Valoración de un Esteroide Aislado +
(541) Volumetría + +
(621) Cromatografía + + + +
(659) Requisitos de Envasado y Almacena-
miento +
(730) Espectroquímica de Plasma +
(731) Pérdida por Secado + +
(733) Pérdida por Incineración +
(735) Espectrometría de Fluorescencia de Ra-
yos X + + +
(736) Espectrometría de Masas + +
USP 40 Guía de los Capítulos Generales / Diagrama de Capítulos 1 7

Diagrama la. Fármacos de Medicamentos Químicos-Pruebas Universales (Continuación)

Impurezas
Valora- Disolventes
Capítulo Descripción Identificación ción Orgánicas Inorgánicas Residuales
(761) Espectroscopía de Resonancia Magnéti-
ca Nuclear •
(781) Rotación Óptica
• •
(801) Po/orografía
• •
(852) Espectroscopía de Absorción Atómica
• • •
(85 3) Espectroscopía de Fluorescencia
• • •
(854) Espectroscopía en el Infrarrojo Medio
(855) Nefelometría, Turbidimetría y Campa-
• • •
ración Visual • •
(857) Espectroscopia Ultravioleta-Visible
• • •
(941 ) Caracterización de Sólidos Cristalinos y
Parcialmente Cristalinos por Difracción de
Rayos X sobre Polvo (DRXP)
•
(1064) Identificación de Artículos de Origen
Botánico por Cromatografía en Capa Delga-
da de Alta Resolución
•
(1086) Impurezas en Fármacos y Productos
Farmacéuticos •
(1119) Espectroscopia en el Infrarrojo Cerca-
no •
(1120) Espectroscopia Raman
(1223.1) Validación de Métodos Alternativos
• •
para Va/oraciones Microbiológicas de Anti-
bióticos
•
(1730) Espectroquímica de Plasma-Teoría y
Práctica • •
(1 735) Espectrometría de Fluorescencia de
Rayos X-Teoría y Práctica • •
(1736) Aplicaciones de la Espectrometría de
Masas • •
( 1 761 ) Aplicaciones de la Espectroscopia de
Resonancia Magnética Nuclear •
(1852) Espectroscopía de Absorción Atómi-
ca-Teoría y Práctica • • •
( 185 3) Espectroscopia de Fluorescencia-Tea-
ría y Práctica • • •
(1854) Espectroscopia en el Infrarrojo Me-
dio-Teoría y Práctica • • •
(1857) Espectroscopia Ultravioleta-Visible-
Teoría y Práctica • • •
Diagrama 1 b. Fármacos de Medicamentos Químicos-Pruebas Específicas
Caracterización
Capítulo Fisicoquímica Equipamiento Contenido de Agua
(31) Aparatos Volumétricos
•
(41) Balanzas
•
(268) Porosidad Mediante Adsorción-Desorción de Nitrógeno
•
(301) Capacidad Neutralizante de Ácido
•
(429) Medición del Tamaño de Partícula por Difracción de
Luz •
(541) Volumetría
(616) Densidad Aparente y Densidad por Asentamiento de los
•
Polvos •
( 6 31 ) Color y Acromatismo
•
18 Diagrama de Capítulos / Guía de los Capítulos Generales USP 40

,, )
Ulm 1COS-Prue b as Espec1'fl cas (Cont1nuac1on
DI agrama lb f'armacos d e Me di camentos Q,
Caracterización
Capítulo Fislcoquímlca Equipamiento Contenido de Aqua
( 641 ) Totalidad de la Disolución
•
(651) Temperatura de Solidificación
•
(695) Cristalinidad
•
(699) Densidad de Sólidos
•
(721) Intervalo de Destilación
•
(731) Pérdida por Secado
• •
(735) Espectrometría de Fluorescencia de Rayos X
•
(741) Intervalo o Temperatura de Fusión
•
(761) Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear
•
(776) Microscopía Óptica
•
(781) Rotación Óptica
•
(782) Espectroscopía de Dicroísmo Circular Vibracional
•
(785) Osmolalidad y Osmolaridad
•
(786) Estimación de la Distribución del Tamaño de Partícula
por Tamizado Analítico •
(791) pH
•
(811 ) Finura de Polvos
•
(831) Índice de Refracción
•
(841) Peso Específico
•
(846) Área Superficial Específica
•
(881) Resistencia a la Tensión
•
(891) Análisis Térmico
•
(911) Viscosidad-Métodos Capilares
•
(912) Viscosidad-Métodos Rotatorios
•
(913) Viscosidad-Método de Bola Rodante
•
(921) Determinación de Agua
(941 ) Caracterización de Sólidos Cristalinos y Parcialmente
•
Cristalinos por Difracción de Rayos X sobre Polvo (DRXP) •
(1051) Limpieza de Material de Vidrio
•
(1119) Espectroscopía en el Infrarrojo Cercano
•
(1120) Espectroscopía Raman
•
(11 71) Análisis por Solubilidad de Fases
•
(1251) Pesada en una Balanza Analítica
•
(1730) Espectroquímica de Plasma-Teoría y Práctica
•
(1735) Espectrometría de Fluorescencia de Rayos X-Teoría y
Práctica •
(1761) Aplicaciones de la Espectroscopía de Resonancia Mag-
nética Nuclear •
(1 782) Espectroscopía de Dicroísmo Circular Vibracional-
Teoría y Práctica •
(1911) Reometría
•
Diagrama 2. Fármacos Biológicos
Impurezas
Relaclo-
Equi- Relacio- nadas
pa- nadas con Carac-
Descrip- Identifica- Seg u- Valo- Fislco- mien- con el el Pro- terlza-
Capítulo ción ción rldad ración química to Proceso dueto ción
(7) Etiquetado
•
(11) Estándares de Referencia USP
• • • • • •
(31) Aparatos Volumétricos
•
USP 40 Guía de Jos Capítulos Generales/ Diagrama de Capítulos 19

o·1agrama 2 F'armacos e·10 I'og1cos

. ., )
(Contmuaoon
Impurezas
Re lacio-
Equi- Relacio- nadas
pa- nadas con Carac-
Descrlp- Identifica- Seg u- Valo- Físico- mlen- con el el Pro- te riza-
Capítulo ción clón rldad ración química to Proceso dueto ción
(41) Balanzas
•
(61) Examen Microbiológico de Produc-
tos No Estériles: Pruebas de Recuento
Microbiano
•
(63) Pruebas para Micoplasmas
• •
(71) Pruebas de Esterilidad
(81) Antibióticos-Valoraciones Micro-
•
biológicas •
(85) Prueba de Endotoxinas Bacteria-
nas •
(87) Pruebas de Reactividad Biológica,
In Vitro •
(88) Pruebas de Reactividad Biológica,
In Vivo •
(111) Diseño y Análisis de Valoraciones
Biológicas • • • •
(121) Valoración de Insulina
(121.1) Procedimientos Analíticos Fisi-
• •
coquímicos para Insulinas • • • • •
(126) Pruebas de Identidad Biológica
de Somatropina •
(129) Procedimientos Analíticos para
Anticuerpos Monoclonales Recombi-
nantes de Uso Terapéutico
• • •
(191) Identificación-Pruebas Genera-
les •
(197) Pruebas de Identificación Espec-
trofotométricas •
(208) Valoración de Actividad Anti-Fac-
tor Xa y Anti-Factor /la para Hepari-
nas No Fraccionadas y de Bajo Peso •
Molecular
(209) Determinaciones de Peso Mole-
cu/ar de Heparinas de Bajo Peso Mole-
cu/ar
•
(212) Análisis de Oligosacáridos
• • •
(2 31 ) Metales Pesados
•
(232) Impurezas Elementales-Límites
(233) Impurezas Elementales-Procedi-
•
mientas •
(467) Disolventes Residuales
•
(503) Ácido Acético en Péptidos
(503.1) Ácido Trifluoroacético en Pépti-
•
dos •
(507) Procedimientos para la Determi-
nación de Proteínas • •
(541) Volumetría
• •
(621) Cromatografía
• • • • • •
(6 31 ) Color y Acromatismo
•
(695) Cristalinidad
•
(730) Espectroquímica de Plasma
•
(731) Pérdida por Secado
•
(736) Espectrometría de Masas
• • • • • •
20 Diagrama de Capítulos / Guía de los Capítulos Generales USP 40

. I'oq1cos
D'1agrama 2 . Farmacos 810 . ' )
Continuacion
Impurezas
Relacio-
Equi- Relacio- nadas
pa- nadas con Carac-
Descrip- Identifica- Seg u- Valo- Fisico- mien- con el el Pro- teriza-
Capítulo ción ción ridad ración química to Proceso dueto ción
(761) Espectroscopía de Resonancia
Magnética Nuclear • • • • • •
(781) Rotación Óptica
•
( 782) Espectroscopía de Dicroísmo Cir-
cu/ar Vibracional •
(786) Estimación de la Distribución del
Tamaño de Partícula por Tamizado
Analítico
•
(831) Índice de Refracción
(852) Espectroscopía de Absorción Ató-
•
mica • • • • •
(853) Espectroscopía de Fluorescencia
(854) Espectroscopía en el Infrarrojo
• • • • •
Medio • • • • •
(855) Nefelometría, Turbidimetría y
Comparación Visual • • • •
(857) Espectroscopía Ultravio/eta-Visi-
ble • • • • •
(921) Determinación de Agua
•
(1025) Pancreatina
(1030) Capítulos de Va/oraciones Bioló-
• • • • • • • •
gicas-lnformación General y Glosa-
río
• • •
(1032) Diseño y Desarrollo de Valora-
ciones Biológicas • • •
(1033) Validación de Va/oraciones Bio-
lógicas • • •
(1034) Análisis de Valoraciones Biológi-
cas • • •
(1 041) Productos Biológicos
•
(1044) Crioconservación de Células
• •
(1048) Calidad de Productos Biotecno-
lógicos: Análisis de la Construcción Ex-
presable en Células Usadas para la
Producción de Productos Proteínicos
•
Obtenidos con ADN Recombinante
(1050.1) Diseño, Evaluación y Caracte-
rización de Procedimientos de Depu-
ración Viral
•
(1 052) Artículos Obtenidos por Biotec-
nología-Análisis de Aminoácidos • • • • •
(1053) Electroforesis Capilar
(1054) Artículos Obtenidos por Biotec-
• • • • •
nología-lsoelectroenfoque • • • • •
(1 055) Artículos Obtenidos por Biotec-
nología-Mapeo de Péptidos • • • • •
(1056) Artículos Obtenidos por Biotec-
nología-E/ectroforesis en Gel de Po-
liacrilamida
• • • • •
(1057) Artículos Obtenidos por Biotec-
nología-Valoración de Proteínas To-
tales
• • • • •
(1065) Cromatografía Jónica
(1084) Análisis de Glicoproteínas y Gli-
•
canos-Consideraciones Generales • •
USP 40 Guía de los Capítulos Generales/ Diagrama de Capítulos 21

Diaqrama 2. Farmacos Bioloqlcos (Continuacion)

Impurezas
Relacio-
Equi- Relacio- nadas
pa- nadas con Carac-
Descrip- Identifica- Seg u- Valo- Flsico- mi en- con el el Pro- te riza-
Capítulo clón clón ridad ración química to Proceso dueto ción
(1102) Métodos de Pruebas lnmunoló-
gicas-Consideraciones Generales • • • • •
(1103) Métodos de Pruebas lnmunoló-
gicas-Ensayo por lnmunoadsorción
Ligado a Enzimas (ELISA)
• • • • •
(1104) Métodos de Pruebas lnmunoló-
gicas-Análisis por lnmunotransferen-
cía
• • • •
(1105) Métodos de Pruebas lnmunoló-
gicas-Resonancia de Plasmón Super-
ficial
• •
(1113) Caracterización, Identificación
y Tipificación de Cepas Microbianas •
(1121) Nomenclatura
•
(1125) Técnicas Basadas en Ácidos
Nucleicos-Generalidades • •
(1126) Técnicas Basadas en Ácidos
Nucleicos-Extracción, Detección y
Secuenciación
• •
(1127) Técnicas Basadas en Ácidos
Nucleicos-Amplificación • •
(1128) Técnicas Basadas en Ácidos
Nucleicos-Micromatrices •
(1129) Técnicas Basadas en Ácidos
Nucleicos-Genotipificación •
(1130) Técnicas Basadas en Ácidos
Nucleicos-Enfoques para Detectar
Trazas de Ácidos Nucleicos (Análisis • • •
de ADN Residual)
(11 32) Medición de Proteína Residual
de Células Huésped en Productos Bio-
farmacéuticos
• •
(1180) Plasma Humano
•
(1181) Microscopía Electrónica de Ba-
rrido •
(1211) Esterilización y Garantía de Es-
terilidad de Artículos Farmacopeicos •
(1228) Despirogenización
(1228.1) Despirogenización por Calor
•
Seco •
(1228.3) Despirogenización por Filtra-
ción •
(1228.5) Indicadores de Endotoxinas
para Despirogenización •
(1229) Esterilización de Artículos Far-
macopeicos •
(1229.4) Esterilización de Líquidos por
Filtración •
(1251) Pesada en una Balanza Analíti-
ca •
(1 736) Aplicaciones de la Espectrome-
tría de Masas • •
( 1 761 ) Aplicaciones de la Espectrosco-
pía de Resonancia Magnética Nuclear • • • • • •
22 Diagrama de Capítulos / Guía de los Capítulos Generales USP 40

Diagrama 2. Fármacos Biológicos (Continuación)

Impurezas
Relaclo-
Equl- Relaclo- nadas
pa- nadas con Carac-
Descrip- Identifica- Segu- Valo- Flslco- mlen- con el el Pro- terlza-
Capítulo clón clón rldad ración química to Proceso dueto clón
(1 782) Espectroscopía de Dicroísmo
Circular Vibracional-Teoría
ca
y Prácti- •
(1852) Espectroscopía de Absorción
Atómica-Teoría y Práctica • • • • •
(1853) Espectroscopía de Fluorescen-
da-Teoría y Práctica • • • • •
(1854) Espectroscopía en el Infrarrojo
Medio-Teoría y Práctica • • • • •
(1857) Espectroscopía Ultravioleta-Visi-
ble-Teoría y Práctica • • • • •

Diagrama 3a. Excipientes-Pruebas Universales

Impurezas
Disolventes
Capítulo Descripción Identificación Valoración Orgánicas Inorgánicas Residuales
(7) Etiquetado
•
(1 81 ) Identificación-Bases
Orgánicas Nitrogenadas •
(191) Identificación-Pruebas
Generales •
(197) Pruebas de Identifica-
ción Espectrofotométricas •
(201) Prueba de Identifica-
ción por Cromatografía en
Capa Delgada
•
(202) Identificación de Acei-
tes Fijos por Cromatografía
en Capa Delgada
•
(203) Procedimiento de Cro-
matografía en Capa Delga-
da de Alta Resolución para
Identificación de Artículos de
•
Origen Botánico
(206) Aluminio
•
(211) Arsénico
•
(221) Cloruros y Sulfatos
(226) 4-Epianhidrotetracicli-
•
na •
(228) Óxido de Etileno y Dio-
xano •
(231 ) Metales Pesados
•
(232) Impurezas Elemento-
les-Límites •
(233) Impurezas Elemento-
/es-Procedimientos •
(241) Hierro
•
(251) Plomo
•
(261) Mercurio
•
(281) Residuo de Incineración
•
(291) Selenio
•
(311) Valoración de Alginatos
•
USP 40 Guía de los Capítulos Generales/ Diagrama de Capítulos 23

D1aqrama 3a. Excip1entes-Prue bas Universales (Continuacion)

Impurezas
Disolventes
Capítulo Descripción Identificación Valoración Orgánicas Inorgánicas Residuales
(345) Valoración de Ácido Cí-
trico/Citrato y Fosfato •
(401) Grasas y Aceites Fijos
•
(425) Antibióticos-Valora-
ción Yodométrica •
(431) Determinación de Gru-
pos Metoxilo •
(461) Determinación de Ni-
trógeno •
(466) Impurezas Comunes
•
(467) Disolventes Residuales
•
(469) Etilenglicol, Dietilengli-
col y Trietilenglicol en Sus-
tancias Etoxiladas
•
(471) Combustión en Matraz
con Oxígeno •
(541) Volumetría
•
(621) Cromatografía
• • • •
(730) Espectroquímica de
Plasma •
( 7 31 ) Pérdida por Secado
• •
(733) Pérdida por Incinera-
ción •
(735) Espectrometría de Fluo-
rescencia de Rayos X • •
(736) Espectrometría de Ma-
sas •
(781) Rotación Óptica
• •
(801) Polarografía
• •
(852) Espectroscopía de Ab-
sorción Atómica • • •
(853) Espectroscopía de Fluo-
rescencia • • •
(854) Espectroscopía en el In-
frarrojo Medio • • •
(855) Nefelometría, Turbidi-
metría y Comparación Vi-
sua/
• •
(85 7) Espectroscopía Ultra-
violeta-Visible • • •
(941) Caracterización de Sóli-
dos Cristalinos y Parcialmen-
te Cristalinos por Difracción
de Rayos X sobre Polvo
•
(DRXP)
(1064) Identificación de Artí-
culos de Origen Botánico por
Cromatografía en Capa Del- •
gada de Alta Resolución
(1086) Impurezas en Fárma-
cos y Productos Farmacéuti-
cos
•
(1091) Etiquetado de lngre-
dientes Inactivos •
( 111 9) Espectroscopía en el
Infrarrojo Cercano •
24 Diagrama de Capítulos / Guía de los Capítulos Generales USP 40

Diagrama 3a. Excipientes-Pruebas Universales (Continuación)

Impurezas
Disolventes
Capítulo Descripción Identificación Valoración Orgánicas Inorgánicas Residuales
(1730) Espectroquímica de
Plasma-Teoría y Práctica • •
(1735) Espectrometría de
Fluorescencia de Rayos X-
Teoría y Práctica
• •
(1 736) Aplicaciones de la Es-
pectrometría de Masas •
(1852) Espectroscopía de Ab-
sorción Atómica-Teoría y
Práctica
• • •
(1853) Espectroscopía de
Fluorescencia-Teoría y
Práctica
• • •
(1854) Espectroscopía en el
Infrarrojo Medio-Teoría y
Práctica
• • •
(1857) Espectroscopía Ultra-
vio/eta-Visible-Teoría y
Práctica
• • •

Diagrama 3b. Excipientes-Pruebas Específicas

Caracterización Agua para Uso Farma- Funcionalidad/Segur!-
Capítulo Flslcoquímlca Equipamiento céutico 1 dad/BPF
(31) Aparatos Volumétricos •
(41 ) Balanzas •
(268) Porosidad Mediante
Adsorción-Desorción de Ni-
trógeno
•
(301) Capacidad Neutrali-
zante de Ácido •
(429) Medición del Tamaño
de Partícula por Difracción
de Luz
•
(541) Volumetría
(616) Densidad Aparente y
•
Densidad por Asentamiento
de Jos Polvos
•
(631) Color y Acromatismo
•
(641 ) Totalidad de la Disolu-
ción •
(643) Carbono Orgánico To-
tal •
(645) Conductividad del
Agua •
(651 ) Temperatura de Solidi-
ficación •
(69 5) Cristalinidad
•
(699) Densidad de Sólidos
•
(721) Intervalo de Destilación
•
(731) Pérdida por Secado
(735) Espectrometría de Fluo-
•
rescencia de Rayos X •
(741) Intervalo o Temperatu-
ra de Fusión •
1 Ver Microbiología (Diagrama 1O).
USP 40 Guía de los Capítulos Generales/ Diagrama de Capítulos 25

Diaqrama 3b. Exciplentes-Pruebas Espec1f1cas (Continuacion)

Caracterización Agua para Uso Farma- Funcionalidad/Segur!-
Capítulo Fislcoquímlca Equipamiento céutico 1 dad/BPF
( 761 ) Espectroscopía de Res o-
nancia Magnética Nuclear •
(776) Microscopía Óptica
•
(781) Rotación Óptica
(782) Espectroscopía de Di-
•
croísmo Circular Vibracional •
(785) Osmolalidad y Osmola-
ridad •
(786) Estimación de la Distri-
bución del Tamaño de Partí-
cu/a por Tamizado Analítico
•
(791) pH
• •
(811) Finura de Polvos
•
(831) Índice de Refracción
•
(841) Peso Específico
•
(846) Área Superficial Especí-
fica •
(881) Resistencia a la Tensión
•
(891) Análisis Térmico
•
(911) Viscosidad-Métodos
Capilares •
(912) Viscosidad-Métodos
Rotatorios •
(91 3) Viscosidad-Método de
Bola Rodante •
(921) Determinación de Agua
•
(941) Caracterización de Sóli-
dos Cristalinos y Parcialmen-
te Cristalinos por Difracción
de Rayos X sobre Polvo
•
(DRXP)
(1 051) Limpieza de Material
de Vidrio •
(1059) Desempeño de Exci-
pientes •
(1074) Guías para la Eva/ua-
ción de la Seguridad Bio/ógi-
ca de los Excipientes
•
(1078) Buenas Prácticas de
Fabricación para Excipientes
Farmacéuticos a Granel
•
(1080) Excipientes Farmacéu-
ticos a Granel-Certificado
de Análisis
•
(1097) Procedimientos para
el Muestreo de Polvos a Gro-
ne/
•
(1119) Espectroscopía en el
Infrarrojo Cercano •
(1174) Fluidez de Polvos
• •
(1195) Guía sobre Cambios
Significativos en Excipientes
Farmacéuticos a Granel
•
(1197) Buenas Prácticas de
Distribución para Excipientes
Farmacéuticos a Granel
•
1 Ver Microbiología (Diagrama 1O).
26 Diagrama de Capítulos / Guía de los Capítulos Generales USP 40

., )
• 1entes-Prue bas Espec1'flcas (Contmuaoon
Dº1agrama 3b Exc1p1
Caracterización Agua para Uso Farma- Funclonalldad/Segurl-
Capítulo Flslcoquímlca Equipamiento céutlco 1 dad/BPF
(1230) Agua para Uso en He-
modiálisis •
(1231) Agua para Uso Far-
macéutico •
(1251) Pesada en una Balan-
za Analítica •
(1644) Teoría y Práctica de
Mediciones de Conductivi-
dad Eléctrica de Soluciones
•
(l 730) Espectroquímica de
Plasma-Teoría y Práctica •
(1735) Espectrometría de
Fluorescencia de Rayos X-
Teoría y Práctica
•
(1761) Aplicaciones de la Es-
pectroscopía de Resonancia
Magnética Nuclear
•
(1 782) Espectroscopía de Di-
croísmo Circular Vibracio-
nal-Teoría y Práctica
•
(1911) Reometría
•
1 Ver Microbiología (Diagrama 1O).

Diagrama 4a. Productos Farmacéuticos para Medicamentos Químicos-Pruebas Universales

Impurezas
Disolventes
Capítulo Descripción Identificación Valoración Orgánicas Inorgánicas Residuales
(1) Medicamentos Inyectables y
en Implantes (Parenterales)-
Pruebas de Calidad del Produc- • • • • • •
to
(2) Medicamentos Orales-Prue-
bas de Calidad del Producto • • • • • •
(3) Medicamentos Tópicos y
Transdérmicos-Pruebas de Ca-
lidad del Producto
• • • • • •
(4) Medicamentos para Muco-
sos-Pruebas de Calidad del
Producto
• • • • • •
(5) Medicamentos Nasales y pa-
ra Inhalación-Información Ge-
neral y Pruebas de Calidad del • • • • • •
Producto
(7) Etiquetado
(81) Antibióticos-Valoraciones
•
Microbiológicas •
(191) Identificación-Pruebas
Generales •
(197) Pruebas de Identificación
Espectrofotométricas •
(201) Prueba de Identificación
por Cromatografía en Capa
Delgada
•
(202) Identificación de Aceites Fi-
jos por Cromatografía en Capa
Delgada
•
USP 40 Guía de los Capítulos Generales/ Diagrama de Capítulos 27

D1aqrama 4a. Prod uctos Farmaceut1cos para Me di camentos Q, .

u1m1cos- p rue bas umversa
. ,, )
es (Continuaoon
Impurezas
Disolventes
Capítulo Descripción Identificación Valoración Orgánicas Inorgánicas Residuales
(203) Procedimiento de Croma-
tografía en Capa Delgada de
Alta Resolución para Identifica-
ción de Artículos de Origen Bo-
•
tónico
(227) 4-Aminofenol en Medica-
mentas que Contienen Acetami-
nofeno
•
(232) Impurezas Elementales-
Límites •
(233) Impurezas Elementales-
Procedimientos •
(281) Residuo de Incineración
(341) Agentes Antimicrobia-
•
nos-Contenido •
(351) Valoración de Esteroides
•
(391) Valoración de Epinefrina
(413) Análisis de Impurezas en
•
Gases Medicinales •
(415) Valoración de Gases Medi-
cinales •
(451) Volumetría con Nitrito
•
(461) Determinación de Nitróge-
no •
(466) Impurezas Comunes
•
(467) Disolventes Residuales
(501) Sales de Bases Orgánicas
•
Nitrogenadas • •
(541) Volumetría
•
(611 ) Determinación de Alcohol
•
(621) Cromatografía
• • • •
(730) Espectroquímica de Plas-
ma •
(733) Pérdida por Incineración
•
(735) Espectrometría de F/uores-
cencia de Rayos X • •
(736) Espectrometría de Masas
•
(781) Rotación Óptica
•
(801) Po/orografía
• •
(821) Radioactividad
(823) Fármacos para Tomogra-
• • • • •
fía de Emisión de Positrones pa-
ro Uso en Preparaciones Magis-
troles, Investigación Clínica y
• • • • •
Estudios Científicos
(852) Espectroscopía de Absor-
ción Atómica • • •
(853) Espectroscopía de Fluores-
cencia • • •
(854) Espectroscopía en el lnfra-
rrojo Medio • • •
(855) Nefelometría, Turbidime-
tría y Comparación Visual • •
(857) Espectroscopía Ultraviole-
ta-Visible • • •
28 Diagrama de Capítulos / Guía de los Capítulos Generales USP 40

Diagrama 4a. Productos Farmacéuticos para Medicamentos Químicos-Pruebas Universales (Continuación)

Impurezas
Disolventes
Capítulo Descripción Identificación Valoración Orgánicas Inorgánicas Residuales
(1064) Identificación de Artículos
de Origen Botánico por Croma-
tografía en Capa Delgada de •
Alta Resolución
(1065) Cromatografía fónica
•
(1086) Impurezas en Fármacos y
Productos Farmacéuticos •
(1121) Nomenclatura
•
(1223.1) Validación de Métodos
Alternativos para Valoraciones
Microbiológicas de Antibióticos
•
(1 730) Espectroquímica de Plas-
ma-Teoría y Práctica • •
(1735) Espectrometría de Fluo-
rescencia de Rayos X-Teoría y
Práctica
• •
(1736) Aplicaciones de la Espec-
trometría de Masas •
(1821) Radioactividad-Teoría y
Práctica •
(1823) Fármacos para Tomogra-
fía por Emisión de Positrones-
Información
•
(1852) Espectroscopía de Absor-
ción Atómica-Teoría y Práctica • • •
(1853) Espectroscopía de Fluo-
rescencia-Teoría y Práctica • • •
(1854) Espectroscopía en el In-
frarrojo Medio-Teoría y Prácti-
ca
• • •
(185 7) Espectroscopía Ultraviole-
ta-Visible-Teoría y Práctica • • •
Diagrama 4b. Productos Farmacéuticos para Medicamentos Químicos-Pruebas Específicas
Pruebas de Desempeño
Mucosa Mucosa
(7 super-
Conteni- fieles
Equipa- do de Parente- lnhalato- de mem-
Capítulo miento Agua Oftálmlca 1 Nasal ral Oral Tópica ria brana)
(31) Aparatos Volumétricos
•
(41) Balanzas
•
(71) Pruebas de Esterilidad
•
(85) Prueba de Endotoxinas
Bacterianas •
(87) Pruebas de Reactividad
Biológica, In Vitro •
(88) Pruebas de Reactividad
Biológica, In Vivo •
(151) Prueba de Pirógenos •
( 301 ) Capacidad Neutrali-
zante de Ácido •
(381) Tapones Elastoméri-
cos para Inyectables •
(541) Volumetría
1 Ver
•
Microbiología (Diagrama 1O).
USP 40 Guía de los Capítulos Generales/ Diagrama de Capítulos 29

D1aqrama 4 b . Prod uctos Farmaceuticos para Medicamentos Qu1micos-Pruebas Especificas (Continuación)

Pruebas de Desempeño
Mucosa Mucosa
(7 super-
Contenl- ficies
Equipa- do de Parente- lnhalato- de mem-
Capítulo miento Agua Oftálmlca 1 Nasal ral Oral Tópica ria brana)
(601) Medicamentos Nasa-
les y para Inhalación:
Pruebas de Calidad de De-
sempeño de Aerosoles,
• •
Atomizadores y Polvos
(602) Propelentes
•
( 60 3) Aerosoles Tópicos
•
(604) Velocidad de Fuga
• • •
(69 7) Contenido en Envases
para Inyectables •
(701) Desintegración
•
(705) Atributos de Calidad
para Tabletas Cuyo Etique-
todo Indica Ranurado Fun- •
cional
(711) Disolución
(724) Liberación de Fárma-
•
cos • •
(729) Distribución del Ta-
maño de Glóbulos en
Emulsiones Inyectables de •
Lípidos
(731) Pérdida por Secado
•
(771) Productos Oftálmi-
cos-Pruebas de Calidad •
(785) Osmolalidad y Osmo-
laridad •
(787) Partículas Subvisibles
en Inyectables de Proteínas
Terapéuticas
•
(788) Partículas en Inyecta-
bles •
(789) Partículas en Solucio-
nes Oftálmicas •
(790) Partículas Visibles en
Inyectables •
(791) pH
• • • • •
(891) Análisis Térmico
•
(905) Uniformidad de Uni-
dades de Dosificación • • • • • •
(921) Determinación de
Agua •
(1004) Medicamentos para
Mucosas-Pruebas de De-
sempeño
•
(1 005) Emisión Acústica
(1051) Limpieza de Mate-
•
ria/ de Vidrio •
(1087) Disolución Intrínseca
Aparente-Procedimientos
de Pruebas de Disolución
para Disco Rotatorio y Dis-
•
co Estacionario
1 Ver Microbiología (Diagrama 1O).
30 Diagrama de Capítulos / Guía de los Capítulos Generales USP 40

D'1agrama 4b p rod uctos Farmaceuticos para M e d'1camentos Q' . ., )

u1m1cos-Prue b as Espec1'fl cas (Contmuaoon
Pruebas de Desempeño
Mucosa Mucosa
(7 super-
Conteni- fieles
Equipa- do de Parente- lnhalato- de mem-
Capítulo miento Aqua Oftálmlca 1 Nasal ral Oral Tópica ria brana)
(1 088) Evaluación In Vivo e
In Vitro de Formas Forma-
céuticas
•
(1090) Evaluación de De-
sempeño del Producto Far-
macéutico-Biodisponibili-
dad, Bioequiva/encia y Di-
•
solución
(1092) Procedimiento de
Disolución: Desarrollo y
Validación
•
(1094) Cápsulas-Pruebas
de Disolución y Atributos
de Calidad Relacionados
•
(111 3) Caracterización,
Identificación y Tipificación
de Cepas Microbianas
•
(1216) Friabilidad de las
Tabletas •
(1217) Fuerza de Ruptura
de las Tabletas •
(1228) Despirogenización
•
(1228.1) Despirogenización
por Calor Seco •
(1228.3) Despirogenización
por Filtración •
(1228.5) Indicadores de En-
dotoxinas para Despiroge-
nización
•
(1229) Esterilización de Ar-
tículos Farmacopeicos •
(1229 .2) Esterilización con
Calor Húmedo de Líquidos
Acuosos
•
(1229.3) Monitoreo de la
Biocarga •
(1229.4) Esterilización de
Líquidos por Filtración •
(1229 .1 3) Esterilización en
el Sitio •
(1251) Pesada en una Ba-
lanza Analítica •
(1601) Productos para Ne-
bulización-Pruebas de
Caracterización
•
(1602) Espaciadores y Cá-
moras Espaciadoras con
Válvulas que se Usan con
Aerosoles para Inhala- •
ción-Pruebas de Caracte-
rización
(1724) Medicamentos Se-
misó/idos-Pruebas de De-
sempeño
•
1 Ver Microbiología (Diagrama 1O).
USP 40 Guía de los Capítulos Generales/ Diagrama de Capítulos 31

Diagrama 4b. Productos Farmacéuticos para Medicamentos Químicos-Pruebas Específicas (Continuación)

Pruebas de Desempeño
Mucosa Mucosa
(7 super-
Conteni- ficies
Equipa- do de Parente- lnhalato- demem-
Capítulo miento Agua Oftálmica 1 Nasal ral Oral Tópica ria brana)
(1 771) Productos Oftálmi-
cos-Pruebas de Desempe-
ño
•
(1788) Métodos para la De-
terminación de Partículas
en Inyectables y Soluciones •
Oftálmicas
( 1 78 7) Medición de Partícu-
las Subvisibles en Inyecta-
bles de Proteínas Terapéu- •
ticas
1 Ver Microbiología (Diagrama 1O).

Diagrama 5. Medicamentos Biológicos

Impurezas
Rela-
clona- Re lacio-
das nadas
Mise. con el con el
Identifica- Caracteri- Equipa- Prue Descrip- Seguri- Valo- Fislco- Proce- Produc-
Capítulo clón zación miento bas ción dad ración química so to
(1) Medicamentos lnyec-
tables y en Implantes
(Parenterales)-Pruebas •
de Calidad del Producto
(7) Etiquetado
(11) Estándares de Rete-
•
renda USP • • • • • •
(31) Aparatos Volumétri-
cos •
(41 ) Balanzas
(61) Examen Microbiológi-
•
co de Productos No Esté-
riles: Pruebas de Recuen- • •
to Microbiano
(62) Examen Microbiológi-
co de Productos No Esté-
riles: Pruebas de Microor- • •
ganismos Específicos
(63) Pruebas para Mico-
plasmas • •
(71) Pruebas de Esterilidad
•
(85) Prueba de Endotoxi-
nas Bacterianas •
(87) Pruebas de Reactivi-
dad Biológica, In Vitro •
(88) Pruebas de Reactivi-
dad Biológica, In Vivo •
(89) Enzimas Usadas co-
mo Materiales Auxiliares
en la Fabricación de Pro- • • • • • •
duetos Farmacéuticos
(89.1) Colagenasa I
• • • • • •
(89.2) Colagenasa 11
• • • • • •
32 Diagrama de Capítulos / Guía de los Capítulos Generales USP 40

o·1aqrama 5. . I'og1cos
. ., )
Me dº1camentos 810 (C ontmuaoon
Impurezas
Rela-
ciona- Relacio-
das nadas
Mise. con el con el
Identifica- Caracteri- Equipa- Prue Descrip- Seguri- Valo- Fisico- Proce- Produc-
Capítulo ción zación miento has ción dad ración química so to
(90) Suero Fetal Bovino-
Atributos de Calidad y
Pruebas de Funcionalidad
•
(111) Diseño y Análisis de
Va/oraciones Biológicas • • • •
(121) Valoración de lnsuli-
na • •
(121 .1) Procedimientos
Analíticos Fisicoquímicos
para Insulinas
• • • • •
(123) Pruebas de ldenti-
dad Biológica de G/uca-
gón
•
(124) Valoraciones Bioló-
gicas de Eritropoyetina • •
(126) Pruebas de /denti-
dad Biológica de Soma-
tropina
•
(129) Procedimientos
Analíticos para Anticuer-
pos Monoclonales Re-
combinantes de Uso Te-
• • •
rapéutico
(1 30) Atributos de Calidad
de la Proteína A •
(151) Prueba de Pirógenos
•
(191) Identificación-
Pruebas Generales •
(19 7) Pruebas de ldentifi-
cación Espectrofotométri-
cas
•
(208) Valoración de Activi-
dad Anti-Factor Xa y An-
ti-Factor /la para Hepari-
nas No Fraccionadas y
• •
de Bajo Peso Molecular
(209) Determinaciones de
Peso Molecular de Hepa-
rinas de Bajo Peso Mole- •
cu/ar
(212) Análisis de Oligosa-
cáridos • • •
(231) Metales Pesados
(232) Impurezas Elemen-
•
tales-Límites •
(233) Impurezas Elemen-
tales-Procedimientos •
(341) Agentes Antimicro-
bianos-Contenido •
(467) Disolventes Residua-
les •
(503) Ácido Acético en
Péptidos •
(507) Procedimientos para
Ja Determinación de Pro-
teínas
• •
USP 40 Guía de los Capítulos Generales/ Diagrama de Capítulos 33

Dlaqrama 5. Medicamentos Biologlcos (Continuación)

Impurezas
Rela-
dona- Relacio-
das nadas
Mise. con el con el
Identifica- Caracterl- Equipa- Prue Descrlp- Seguri- Valo- Físico- Proce- Produc-
Capítulo ción zación miento has ción dad ración química so to
(541) Volumetría
• •
(621 ) Cromatografía
(631) Color y Acromatis-
• • • • • •
mo •
(660) Envases-Vidrio
•
( 661 ) Sistemas de Envases
Plásticos y sus Materiales
de Construcción
•
( 661 .1 ) Materiales Plásti-
cos de Construcción •
(661.2) Sistemas de Enva-
ses Plásticos para Uso
Farmacéutico
•
(671) Envases-Pruebas
de Desempeño •
(695) Cristalinidad
•
(697) Contenido en Enva-
ses para Inyectables •
(730) Espectroquímica de
Plasma •
(731) Pérdida por Secado
•
(736) Espectrometría de
Masas • • • • • •
( 761 ) Espectroscopía de
Resonancia Magnética
Nuclear
• • • • • •
( 781 ) Rotación Óptica
•
(782) Espectroscopía de
Dicroísmo Circular Vibra-
cional
•
(785) Osmolalidad y Os-
molaridad •
(786) Estimación de la
Distribución del Tamaño
de Partícula por Tamiza- •
do Analítico
(787) Partículas Subvisi-
bles en Inyectables de
Proteínas Terapéuticas
•
(788) Partículas en lnyec-
tables •
(791) pH
• •
(821) Radioactividad
• • • • • • •
(831) Índice de Refracción
•
(852) Espectroscopía de
Absorción Atómica • • • • •
(853) Espectroscopía de
Fluorescencia • • • • •
(854) Espectroscopía en el
Infrarrojo Medio • • • • •
(855) Nefelometría, Turbi-
dimetría y Comparación
Visual
• • • •
34 Diagrama de Capítulos / Guía de los Capítulos Generales USP 40

D'1agrama 5 M e d'1camentos B'10I'og1cos

' ., )
(Contmuaoon
Impurezas
Rela-
dona- Relacio-
das nadas
Mise. con el con el
Identifica- Caracteri- Equipa- Prue Descrip- Seguri- Valo- Fisico- Proce- Produc-
Capítulo ción zación miento bas ción dad ración química so to
(857) Espectroscopía U/-
travio/eta-Visible • • • • •
(921) Determinación de
Agua •
(1024) Suero Bovino
•
(1025) Pancreatina
(1030) Capítulos de Va/o-
• • • • • • • •
raciones Biológicas-In-
formación General y G/o- • • •
sario
(1032) Diseño y Desarro-
!lo de Va/oraciones Bioló-
gicas
• • •
(1033) Validación de Va-
/oraciones Biológicas • • •
(1034) Análisis de Valora-
ciones Biológicas • • •
(1041) Productos Biológi-
cos •
<1044) Crioconservación
de Células • •
(1050) Evaluación de la
Seguridad Viral en Pro-
duetos Biotecnológicos
Obtenidos de Líneas Ce- •
fulares de Origen Huma-
no o Animal
<1 050.1) Diseño, Eva/ua-
ción y Caracterización de
Procedimientos de Depu- •
ración Viral
(1052) Artículos Obteni-
dos por Biotecnología-
Análisis de Aminoácidos
• • • • •
(1053) Electroforesis Capi-
lar • • • • •
(1054) Artículos Obteni-
dos por Biotecnología-
lsoe/ectroenfoque
• • • • •
(1055) Artículos Obteni-
dos por Biotecnología-
Mapeo de Péptidos
• • • • •
(1056) Artículos Obteni-
dos por Biotecnología-
Electroforesis en Gel de • • • • •
Poliacrilamida
(105 7) Artículos Obteni-
dos por Biotecnología-
Valoración de Proteínas • • • • •
Totales
(1065) Cromatografía ló-
nica •
(1084) Análisis de Glico-
proteínas y Glicanos-
Consideraciones Genera- • • •
les
USP 40 Guía de los Capítulos Generales / Diagrama de Capítulos 35

D1aqrama 5. Medicamentos Bioloqicos (Continuacion)

Impurezas
Rela-
dona- Relacio-
das nadas
Mise. con el con el
Identifica- Caracterl- Equipa- Prue Descrip- Segurl- Valo- Fisico- Proce- Produc-
Capítulo ción zación miento has clón dad ración química so to
(1102) Métodos de Prue-
bas Inmunológicas-
Consideraciones Genera- • • • • •
les
(1103) Métodos de Prue-
bas Inmunológicas-En-
sayo por lnmunoadsor-
ción Ligado a Enzimas
• • • • •
(ELISA)
(1104) Métodos de Prue-
bas Inmunológicas-
Análisis por lnmuno- • • • •
transferencia
(1105) Métodos de Prue-
bas Inmunológicas-Re-
sonancia de Plasmón Su- • •
perficial
(1106) Ensayos de lnmu-
nogenicidad-Diseño y
Validación de lnmunoen-
sayos para Detectar Anti-
•
cuerpos Antifármacos
(1106.1) Ensayos de In-
munogenicidad-Diseño
y Validación de Ensayos
para Detectar Anticuer- •
pos Neutralizantes Anti-
fármacos
(1111) Examen Microbio-
lógico de Productos No
Estériles: Criterios de
Aceptación para Prepara-
ciones Farmacéuticas y
•
Sustancias de Uso Far-
macéutico
(1113) Caracterización,
Identificación y Tipifica-
ción de Cepas Microbio- • •
nas
(1121) Nomenclatura
(1125) Técnicas Basadas
•
en Ácidos Nucleicos-Ge-
neralidades
• •
(1126) Técnicas Basadas
en Ácidos Nucleicos-Ex-
tracción, Detección y Se- • •
cuenciación
(1127) Técnicas Basadas
en Ácidos Nucleicos-
Amplificación
• •
(1128) Técnicas Basadas
en Ácidos Nucleicos-Mi-
cromatrices
•
(1129) Técnicas Basadas
en Ácidos Nucleicos-Ge-
notipificación
• •
36 Diagrama de Capítulos / Guía de Jos Capítulos Generales USP 40

o·1agrama 5 M e d"1camen t os B"10I'og1cos

. " )
(C ontmuaoon
Impurezas
Rela-
dona- Relacio-
das nadas
Mise. con el con el
Identifica- Caracteri- Equipa- Prue Descrlp- Segurl- Valo- Fislco- Proce- Produc-
Capítulo ción zación miento bas ción dad ración química so to
(1130) Técnicas Basadas
en Ácidos Nucleicos-En-
foques para_ Detectar
Trazas de Acidos Nuc/ei- • •
cos (Análisis de ADN Re-
sidual)
(11 32) Medición de Pro-
teína Residual de Células
Huésped en Productos • •
Biofarmacéuticos
(1181) Microscopía Elec-
trónica de Barrido •
(1211) Esterilización y Ca-
rantía de Esterilidad de
Artículos Farmacopeicos
•
(1228) Despirogenización
•
(1228.1) Despirogeniza-
ción por Calor Seco •
(1228.3) Despirogeniza-
ción por Filtración •
(1228.5) Indicadores de
Endotoxinas para Despi-
rogenización
•
(1229) Esterilización de
Artículos Farmacopeicos •
(1229.4) Esterilización de
Líquidos por Filtración •
(1229.13) Esterilización
en el Sitio •
(1251) Pesada en una Ba-
lanza Analítica •
(1660) Envases de Vi-
drio-Eva/uación de la
Durabilidad de Ja Superfi- •
cie Interna
(1661) Evaluación de Sis-
temas de Envases Plásti-
cos y sus Materiales de
Construcción con Respec- •
to a su Impacto sobre la
Seguridad del Usuario
(1663) Evaluación de Sus-
tancias Extraíbles Re/a-
cionadas con Envases
Farmacéuticos y Sistemas
•
de Administración
(1664) Evaluación de Sus-
tancias Lixiviables en Me-
dicamentos Relacionadas
con Envases Farmacéuti- •
cos y Sistemas de Admi-
nistración
(1736) Aplicaciones de Ja
Espectrometría de Masas • • • • • •
USP 40 Guía de los Capítulos Generales/ Diagrama de Capítulos 37

Diagrama 5. Medicamentos Biológicos (Continuación)

Impurezas
Rela-
ciona- Re lacio-
das nadas
Mise. con el con el
Identifica- Caracteri- Equipa- Prue Descrip- Seguri- Valo- Fisico- Proce- Produc-
Capítulo ción zación miento bas ción dad ración química so to
(1761) Aplicaciones de la
Espectroscopía de Reso-
nancia Magnética Nu- • • • • • •
c/ear
(1 782) Espectroscopía de
Dicroísmo Circular Vibra-
cional-Teoría y Práctica
•
(1787) Medición de Partí-
cu/as Subvisib/es en In-
yectables de Proteínas •
Terapéuticas
(1 788) Métodos para la
Determinación de Partí-
culos en Inyectables y So- •
luciones Oftálmicas
(1821) Radioactividad-
Teoría y Práctica •
(1852) Espectroscopía de
Absorción Atómica-Tea-
ría y Práctica
• • • • •
(1853) Espectroscopía de
Fluorescencia-Teoría y
Práctica
• • • • •
(1854) Espectroscopía en
el Infrarrojo Medio-Tea-
ría y Práctica
• • • • •
(1857) Espectroscopía Uf-
travioleta-Visible-Teoría
y Práctica
• • • • •

Diagrama 6. Vacunas
Impurezas
Rela-
ciona- Re lacio-
das nadas
Mise. con el con el
Identifica- Caracteri- Equipa- Prue Descrip- Seguri- Valo- Fisico- Proce- Produc-
Capítulo ción zación miento bas ción dad ración química so to
(1) Medicamentos lnyec-
tables y en Implantes
(Parentera/es)-Pruebas •
de Calidad del Producto
( 11 ) Estándares de Rete-
rencia USP •
(31) Aparatos Volumétri-
CDS •
(41 ) Balanzas
•
(63) Pruebas para Mico-
plasmas •
(71) Pruebas de Esterilidad
•
(81) Antibióticos-Valora-
ciones Microbiológicas •
(85) Prueba de Endotoxi-
nas Bacterianas •
38 Diagrama de Capítulos / Guía de los Capítulos Generales USP 40

D1aqrama 6. Vacunas (Continuacion)

Impurezas
Rela-
dona- Relacio-
das nadas
Mise. con el con el
Identifica- Caracterl- Equipa- Prue Descrlp- Segurl- Valo- Flslco- Proce- Produc-
Capítulo ción zaclón miento bas clón dad ración química so to
(88) Pruebas de Reactivi-
dad Biológica, In Vivo •
(90) Suero Fetal Bovino-
Atributos de Calidad y
Pruebas de Funcionalidad
• •
(111) Diseño y Análisis de
Valoraciones Biológicas • • • •
(151 ) Prueba de Pirógenos
(341) Agentes Antimicro-
•
bianos-Contenido •
(507) Procedimientos para
la Determinación de Pro-
teínas
• •
(621) Cromatografía
• • • • • •
(660) Envases-Vidrio
•
(661 ) Sistemas de Envases
Plásticos y sus Materiales
de Construcción
•
(661 .1 ) Materiales Plásti-
cos de Construcción •
(661.2) Sistemas de Enva-
ses Plásticos para Uso
Farmacéutico
•
(671) Envases-Pruebas
de Desempeño •
(695) Cristalinidad
(697) Contenido en Enva-
ses para Inyectables •
(731) Pérdida por Secado
•
(736) Espectrometría de
Masas • • • • • •
(761) Espectroscopía de
Resonancia Magnética
Nuclear
• • • • • •
(786) Estimación de la
Distribución del Tamaño
de Partícula por Tamiza- •
do Analítico
(787) Partículas Subvisi-
bles en Inyectables de
Proteínas Terapéuticas
•
(788) Partículas en lnyec-
tables •
(790) Partículas Visibles
en Inyectables •
(791) pH
(852) Espectroscopía de
• •
Absorción Atómica • •
(85 3) Espectroscopía de
Fluorescencia • •
(854) Espectroscopía en el
Infrarrojo Medio • •
USP 40 Guía de los Capítulos Generales/ Diagrama de Capítulos 39

Diagrama 6. Vacunas (Continuación)

Impurezas
Rela-
dona- Relacio-
das nadas
Mise. con el con el
Identifica- Caracterl- Equipa- Prue Descrip- Seguri- Valo- Fisico- Proce- Produc-
Capítulo ción zación miento bas ción dad ración química so to
(855) Nefelometría, Turbi-
dimetría y Comparación
Visual
• •
(85 7) Espectroscopía Uf-
travioleta-Visible • •
(921) Determinación de
Agua •
(1 024) Suero Bovino
• •
(1030) Capítulos de Va/o-
raciones Biológicas-In-
formación General y Glo- • • •
sario
(1032) Diseño y Desarro-
/lo de Valoraciones Bioló-
gicas
• • •
(1033) Validación de Va-
/oraciones Biológicas • • •
(1034) Análisis de Valora-
dones Biológicas • • •
(1041) Productos Biológi-
cos •
(1044) Crioconservación
de Células • •
(1052) Artículos Obteni-
dos por Biotecnología-
Análisis de Aminoácidos
• • • • •
(1053) Electroforesis Capi-
lar • • • • •
(1054) Artículos Obteni-
dos por Biotecnología-
lsoe/ectroenfoque
• • • • •
(1055) Artículos Obteni-
dos por Biotecnología-
Mapeo de Péptidos
• • • • •
(1056) Artículos Obteni-
dos por Biotecnología-
Electroforesis en Gel de • • • • •
Poliacrilamida
(l 05 7) Artículos Obteni-
dos por Biotecnología-
Valoración de Proteínas • • • • •
Totales
(1065) Cromatografía ló-
nica •
(1084) Análisis de Glico-
proteínas y Glicanos-
Consideraciones Genera- • • •
les
(11 02) Métodos de Prue-
bas Inmunológicas-
Consideraciones Genera- • • • •
les
(1103) Métodos de Prue-
bas Inmunológicas-En-
sayo por lnmunoadsor-
ción Ligado a Enzimas
• • • •
(ELISA)
40 Diagrama de Capítulos / Guía de los Capítulos Generales USP 40

o·1agrama 6 ,, )
V acunas (C ontmuac1on
Impurezas
Rela-
dona- Re lacio-
das nadas
Mise. con el con el
Identifica- Caracteri- Equipa- Prue Descrip- Seguri- Valo- Fisico- Proce- Produc-
Capítulo ción zación miento has ción dad ración química so to
(11 04) Métodos de Prue-
bas Inmunológicas-
Análisis por lnmuno- • • • •
transferencia
(1105) Métodos de Prue-
bas Inmunológicas-Re-
sonancia de Plasmón Su- • •
perficial
(111 3) Caracterización,
Identificación y Tipifica-
ción de Cepas Microbio- •
nas
(1121) Nomenclatura
•
(1126) Técnicas Basadas
en Ácidos Nucleicos-Ex-
tracción, Detección y Se- • • •
cuenciación
(1127) Técnicas Basadas
en Ácidos Nucleicos-
Amplificación
• • •
(1128) Técnicas Basadas
en Ácidos Nucleicos-Mi-
cromatrices
•
( 1129) Técnicas Basadas
en Ácidos Nucleicos-Ge-
notipificación
•
(1130) Técnicas Basadas
en Ácidos Nucleicos-En-
foques para Detectar
Trazas de Ácidos Nuclei- •
cos (Análisis de ADN Re-
sidual)
(1211) Esterilización y Ga-
rantía de Esterilidad de
Artículos Farmacopeicos
•
(1228) Despirogenización
(1228.1) Despirogeniza-
•
ción por Calor Seco •
(1228.3) Despirogeniza-
ción por Filtración •
(1228.5) Indicadores de
Endotoxinas para Despi-
rogenización
•
(1229) Esterilización de
Artículos Farmacopeicos •
(1229.4) Esterilización de
Líquidos por Filtración •
(1229.13) Esterilización
en el Sitio •
(1234) Vacunas para Uso
Humano-Vacunas de
Polisacáridos y Glicocon- • • • • • • •
jugados
(1235) Vacunas para Uso
Humano-Consideracio-
nes Generales
• • • •
USP 40 Guía de los Capítulos Generales/ Diagrama de Capítulos 41

Diagrama 6. Vacunas (Continuación)

Impurezas
Rela-
clona- Relacio-
das nadas
Mise. con el con el
Identifica- Caracteri- Equipa- Prue Descrip- Seguri- Valo- Fisico- Proce- Produc-
Capítulo clón zación miento bas ción dad ración química so to
(1237) Métodos de Prue-
bas Virológicas • • • •
(1238) Vacunas para Uso
Humano-Vacunas Bac-
terianas
• • • • • •
(1251) Pesada en una Ba-
lanza Analítica •
(1660) Envases de Vi-
drio-Evaluación de la
Durabilidad de la Superfi- •
cie Interna
(1661) Evaluación de Sis-
temas de Envases Plásti-
cos y sus Materiales de
Construcción con Respec- •
to a su Impacto sobre la
Seguridad del Usuario
(1663) Evaluación de Sus-
tandas Extraíbles Re/a-
donadas con Envases
Farmacéuticos y Sistemas
•
de Administración
(1664) Evaluación de Sus-
tandas Lixiviables en Me-
dicamentos Relacionadas
con Envases Farmacéuti- •
cos y Sistemas de Admi-
nistración
(1736) Aplicaciones de la
Espectrometría de Masas • • • • • •
(1761) Aplicaciones de la
Espectroscopía de Reso-
nancia Magnética Nu- • • • • •
clear
(1 787) Medición de Partí-
cu/as Subvisibles en In-
yectables de Proteínas •
Terapéuticas
(1 788) Métodos para la
Determinación de Partí-
cu/as en Inyectables y So- •
luciones Oftálmicas
(1852) Espectroscopía de
Absorción Atómica-Tea-
ría y Práctica
• •
(185 3) Espectroscopía de
Fluorescencia-Teoría y
Práctica
• •
(1854) Espectroscopía en
el Infrarrojo Medio-Tea-
ría y Práctica
• •
(185 7) Espectroscopía Uf-
travioleta-Visible-Teoría
y Práctica
• •
42 Diagrama de Capítulos / Guía de los Capítulos Generales USP 40

Diagrama 7. Sangre y Hemoderlvados

Impurezas
Rela-
dona- Relaclo-
das nadas
Mise. con el con el
Identifica- Caracterl- Equipa- Prue Descrip- Segurl- Valo- Flslco- Proce- Produc-
Capítulo clón zación miento bas clón dad ración química so to
(1) Medicamentos lnyec-
tables y en Implantes
(Parenterales)-Pruebas •
de Calidad del Producto
(11) Estándares de Rete-
rencia USP • • • • • •
(31) Aparatos Volumétri-
cos •
(41) Balanzas
(51) Pruebas de Eficacia
•
Antimicrobiana •
(61) Examen Microbiológi-
co de Productos No Esté-
riles: Pruebas de Recuen- •
to Microbiano
(62) Examen Microbiológi-
co de Productos No Esté-
riles: Pruebas de Microor- •
ganismos Específicos
(71) Pruebas de Esterilidad
(85) Prueba de Endotoxi-
•
nas Bacterianas •
(87) Pruebas de Reactivi-
dad Biológica, In Vitro •
(88) Pruebas de Reactivi-
dad Biológica, In Vivo •
(111) Diseño y Análisis de
Valoraciones Biológicas • • • •
(151) Prueba de Pirógenos
(191) Identificación-
•
Pruebas Generales •
(197) Pruebas de ldentifi-
cación Espectrofotométri-
cas
•
(208) Valoración de Activi-
dad Anti-Factor Xa y An-
ti-Factor /la para Hepari-
nas No Fraccionadas y
•
de Bajo Peso Molecular
(209) Determinaciones de
Peso Molecular de Hepa-
rinas de Bajo Peso Mole- •
cu/ar
( 341 ) Agentes Antimicro-
bianos-Contenido •
(507) Procedimientos para
la Determinación de Pro-
teínas
• •
(621) Cromatografía
(631) Color y Acromatis-
• • • • • •
mo •
(660) Envases-Vidrio
(661) Sistemas de Envases
•
Plásticos y sus Materiales
de Construcción
•
USP 40 Guía de los Capítulos Generales/ Diagrama de Capítulos 43

D1aqrama 7. Sanqre y Hemoderiva d os (Continuacion)

Impurezas
Rela-
clona- Relaclo-
das nadas
Mise. con el con el
Identifica- Caracterl- Equipa- Prue Descrip- Segurl- Valo- Fisico- Proce- Produc-
Capítulo ción zaclón miento has ción dad ración química so to
(661.1) Materiales Plásti-
cos de Construcción •
( 661 .2) Sistemas de En va-
ses Plásticos para Uso
Farmacéutico
•
(671) Envases-Pruebas
de Desempeño •
(695) Cristalinidad
•
(697) Contenido en Enva-
ses para Inyectables •
(731) Pérdida por Secado
(736) Espectrometría de
•
Masas • • • • • •
( 761 ) Espectroscopía de
Resonancia Magnética
Nuclear
• • • • • •
(785) Osmo/alidad y Os-
molaridad •
(787) Partículas Subvisi-
bles en Inyectables de
Proteínas Terapéuticas
•
(788) Partículas en lnyec-
tables •
(790) Partículas Visibles
en Inyectables •
(791) pH
(852) Espectroscopía de
• •
Absorción Atómica • • • • •
(853) Espectroscopía de
Fluorescencia • • • • •
(854) Espectroscopía en el
Infrarrojo Medio • • • • •
(855) Nefelometría, Turbi-
dimetría y Comparación
Visual
• • • •
(85 7) Espectroscopía Uf-
travioleta-Visib/e • • • • •
(921) Determinación de
Agua •
(1030) Capítulos de Va/o-
raciones Biológicas-In-
formación General y Glo- • • •
sario
(1032) Diseño y Desarro-
!lo de Valoraciones Bioló-
gicas
• • •
(1033) Validación de Va-
/oraciones Biológicas • • •
(1034) Análisis de Valora-
ciones Biológicas • • •
(1041) Productos Biológi-
cos •
(1 044) Crioconservación
de Células •
44 Diagrama de Capítulos / Guía de los Capítulos Generales USP 40

p·1agrama 7 sangre y Hemod erva

1 d os (Contmuaoan
Impurezas
Rela-
dona- Relacio-
das nadas
Mise. con el con el
Identifica- Caracteri- Equipa- Prue Descrip- Seguri- Valo- Fisico- Proce- Produc-
Capítulo ción zación miento bas ción dad ración química so to
(1052) Artículos Obteni-
dos por Biotecnología-
Análisis de Aminoácidos
• • • • •
(1053) Electroforesis Capi-
lar • • • • •
(1054) Artículos Obteni-
dos por Biotecnología-
lsoelectroenfoque
• • • • •
(1055) Artículos Obteni-
dos por Biotecnología-
Mapeo de Péptidos
• • • • •
(1 056) Artículos Obteni-
dos por Biotecnología-
Electroforesis en Gel de • • • • •
Poliacrilamida
(1057) Artículos Obteni-
dos por Biotecnología-
Valoración de Proteínas • • • • •
Totales
(1065) Cromatografía ló-
nica •
(1102) Métodos de Prue-
bas Inmunológicas-
Consideraciones Genera- • • • •
les
(1103) Métodos de Prue-
bas Inmunológicas-En-
sayo por lnmunoadsor-
ción Ligado a Enzimas
• • • •
(ELISA)
(1104) Métodos de Prue-
bas Inmunológicas-
Análisis por lnmuno- • • • •
transferencia
(1105) Métodos de Prue-
bas Inmunológicas-Re-
sonancia de Plasmón Su- • •
perficial
(11 06) Ensayos de lnmu-
nogenicidad-Diseño y
Validación de lnmunoen-
sayos para Detectar Anti-
•
cuerpos Antifármacos
(1106. l) Ensayos de In-
munogenicidad-Diseño
y Validación de Ensayos
para Detectar Anticuer- •
pos Neutralizantes Anti-
fármacos
(1111) Examen Microbio-
lógico de Productos No
Estériles: Criterios de
Aceptación para Prepara-
ciones Farmacéuticas y
•
Sustancias de Uso Far-
macéutico
USP 40 Guía de los Capítulos Generales/ Diagrama de Capítulos 45

Diaqrama 7. Sanare y Hemoderiva dos (Continuacion)

Impurezas
Rela-
clona- Relacio-
das nadas
Mise. con el con el
Identifica- Caracteri- Equipa- Prue Descrip- Seguri- Valo- Fisico- Proce- Produc-
Capítulo ción zación miento bas ción dad ración química so to
( 111 3) Caracterización,
Identificación y Tipifica-
ción de Cepas Microbio- •
nas
(1116) Control Microbio-
lógico y Monitoreo de
Ambientes de Procesa- •
miento Aséptico
(11 21 ) Nomenclatura •
(1125) Técnicas Basadas
en Ácidos Nucleicos-Ge-
neralidades
•
(1130) Técnicas Basadas
en Ácidos Nucleicos-En-
foques para Detectar
Trazas de Ácidos Nuclei- •
cos (Análisis de ADN Re-
sidual)
(1180) Plasma Humano •
(1211) Esterilización y Ga-
rantía de Esterilidad de
Artículos Farmacopeicos
•
(1228) Despirogenización •
(1228.1) Despirogeniza-
ción por Calor Seco •
(1228.3) Despirogeniza-
ción por Filtración •
(1228.5) Indicadores de
Endotoxinas para Despi-
rogenización
•
(1229) Esterilización de
Artículos Farmacopeicos •
(1229.4) Esterilización de
Líquidos por Filtración •
(1229.5) Indicadores Bio-
lógicos para Esterilización •
(1229.13) Esterilización
en el Sitio •
(1237) Métodos de Prue-
bas Virológicas •
(1240) Análisis de Virus
en Plasma Humano para
Fabricación Posterior
•
(1251 ) Pesada en una Ba-
lanza Analítica •
(1660) Envases de Vi-
drio-Evaluación de la
Durabilidad de la Superfi- •
cie Interna
(1661) Evaluación de Sis-
temas de Envases Plásti-
cos y sus Materiales de
Construcción con Respec- •
to a su Impacto sobre la
Seguridad del Usuario
46 Diagrama de Capítulos / Guía de los Capítulos Generales USP 40

Diagrama 7. Sangre y Hemoderivados (Continuación)

Impurezas
Rela-
dona- Relacio-
das nadas
Mise. con el con el
Identifica- Caracteri- Equipa- Prue Descrip- Seguri- Valo- Fisico- Proce- Produc-
Capítulo ción zación miento bas ción dad ración química so to
(1663) Evaluación de Sus-
tancias Extraíbles Re/a-
donadas con Envases
Farmacéuticos y Sistemas
•
de Administración
(1664) Evaluación de Sus-
tancias Lixiviab/es en Me-
dicamentos Relacionadas
con Envases Farmacéuti- •
cos y Sistemas de Admi-
nistración
(1736) Aplicaciones de la
Espectrometría de Masas • • • • • •
(1761) Aplicaciones de la
Espectroscopía de Reso-
nancia Magnética Nu- • • • • • •
c/ear
(1787) Medición de Partí-
cu/as Subvisibles en In-
yectables de Proteínas •
Terapéuticas
(1 788) Métodos para la
Determinación de Partí-
cu/as en Inyectables y So- •
luciones Oftálmicas
(1852) Espectroscopía de
Absorción Atómica-Tea-
ría y Práctica
• • • • •
(1853) Espectroscopía de
Fluorescencia-Teoría y
Práctica
• • • • •
(1854) Espectroscopía en
el Infrarrojo Medio-Tea-
ría y Práctica
• • • • •
(185 7) Espectroscopía Uf-
travioleta-Visible-Teoría
y Práctica
• • • • •

Diagrama 8 Productos Derivados de Células Genes y Tejidos

'
Pruebas Universales Pruebas Específicas 1,2
Cuestiones
Microbioló- Cuestio- Cuestio- Equi-
gicas nes de nes del pa-
Identifica- Valora- Biocompati- y de Esterili- Produc- Produc- mien- Caracteriza-
Capítulo ción ción bilidad dad ción to to ción
(1) Medicamentos Inyectables
y en Implantes (Parentera-
/es)-Pruebas de Calidad del •
Producto
(11) Estándares de Referencia
USP •
(31) Aparatos Volumétricos
•
(41) Balanzas
•
1 Para la prueba de Funcionalidad, ver (881) Resistencia a la Tensión.
2 Para la prueba de Agua, ver (1231) Agua para Uso Farmacéutico
USP 40 Guía de los Capítulos Generales/ Diagrama de Capítulos 47

Diagrama 8. Productos Derivados de Células, Genes y Teiidos (Continuación)

Pruebas Universales Pruebas Específicas 1,2
Cuestiones
Mlcrobloló- Cuestio- Cuestio- Equi-
glcas nes de nes del pa-
Identifica- Valora- Biocompati- y de Esterili- Produc- Produc- mi en- Caracteriza-
Capítulo ción ción bilidad dad ción to to ción
(61) Examen Microbiológico
de Productos No Estériles:
Pruebas de Recuento Micro- •
biano
(62) Examen Microbiológico
de Productos No Estériles:
Pruebas de Microorganismos •
Específicos
(63) Pruebas para Micoplas-
mas •
(71) Pruebas de Esterilidad
(85) Prueba de Endotoxinas
•
Bacterianas •
(87) Pruebas de Reactividad
Biológica, In Vitro •
(88) Pruebas de Reactividad
Biológica, In Vivo •
(90) Suero Fetal Bovino-Atri-
butos de Calidad y Pruebas
de Funcionalidad
•
(92) Factores de Crecimiento
y Citokinas Usados en la Fa-
bricación de Productos de •
Terapia Celular
(111) Diseño y Análisis de
Valoraciones Biológicas •
(151) Prueba de Pirógenos
•
(161) Dispositivos Médicos-
Pruebas de Endotoxinas Bac-
terianas y Pirógenos
•
(381) Tapones Elastoméricos
para Inyectables •
(507) Procedimientos para la
Determinación de Proteínas •
(621) Cromatografía
• •
(785) Osmolalidad y Osmola-
ridad •
(787) Partículas Subvisibles
en Inyectables de Proteínas
Terapéuticas
•
(788) Partículas en Inyecta-
bles •
(79l)pH
•
(797) Preparación Magis-
trol-Preparaciones Estériles •
(905) Uniformidad de Unida-
des de Dosificación •
(911) Viscosidad-Métodos
Capilares •
(912) Viscosidad-Métodos
Rotatorios •
(913) Viscosidad-Método de
Bola Rodante •
1 Para la prueba de Funcionalidad, ver (881) Resistencia a la Tensión.
2 Para la prueba de Agua, ver (1231) Agua para Uso Farmacéutico
48 Diagrama de Capítulos / Guía de los Capítulos Generales USP 40

Diaqrama 8. Productos Derivados de Células, Genes y Telldos (Continuación)

Pruebas Universales Pruebas Específicas i ,2
Cuestiones
Microbioló- Cuestio- Cuestio- Equi-
glcas nes de nes del pa-
Identifica- Valora- Biocompati- y de Esterili- Produc- Produc- mi en- Caracteriza-
Capítulo ción ción bllidad dad ción to to ción
(1024) Suero Bovino
•
(1027) Citometría de Flujo
•
(1030) Capítulos de Valora-
ciones Biológicas-Informa-
ción General y Glosario
• • •
(1031) Biocompatibilidad de
los Materiales Usados en En-
vases de Medicamentos,
Dispositivos Médicos e lm-
•
plantes
(1032) Diseño y Desarrollo
de Valoraciones Biológicas • • •
(1033) Validación de Valora-
ciones Biológicas • • •
(1034) Análisis de Valoracio-
nes Biológicas • • •
(1041) Productos Biológicos
•
(1043) Materiales Auxiliares
para Productos Celulares,
Génicos y de Ingeniería Tisu- •
lar
( 1044) Crioconservación de
Células • • • •
(1046) Productos Derivados
de Células y Tejidos • • •
(1047) Productos de Terapia
Génica •
(1048) Calidad de Productos
Biotecnológicos: Análisis de
la Construcción Expresable
en Células Usadas para la
Producción de Productos
•
Proteínicos Obtenidos con
ADN Recombinante
(1049) Calidad de Productos
Biotecnológicos: Pruebas de
Estabilidad de Productos Bio- •
tecnológicos o Biológicos
(1050) Evaluación de la Se-
guridad Viral en Productos
Biotecnológicos Obtenidos
de Líneas Celulares de Orí-
•
gen Humano o Animal
(1051) Limpieza de Material
de Vidrio •
(1052) Artículos Obtenidos
por Biotecnología-Análisis
de Aminoácidos
•
(1053) Electroforesis Capilar
•
(1054) Artículos Obtenidos
por Biotecnología-lsoelec-
troenfoque
•
(1055) Artículos Obtenidos
por Biotecnología-Mapeo
de Péptidos
•
1 Para la prueba de Funcionalidad, ver (881) Resistencia a la Tensión.
2 Para la prueba de Agua, ver (1231) Agua para Uso Farmacéutico
USP 40 Guía de Jos Capítulos Generales / Diagrama de Capítulos 49

Diaqrama 8. Productos Derivados de Células, Genes y Teiidos (Continuación)

Pruebas Universales Pruebas Específlcas 1,2
Cuestiones
Microbioló- Cuestio- Cuestio- Equi-
gicas nes de nes del pa-
Identifica- Valora- Blocompati- y de Esterill- Produc- Produc- mien- Caracteriza-
Capítulo ción ción bllldad dad clón to to ción
(1056) Artículos Obtenidos
por Biotecnología-Electro-
foresis en Gel de Poliacrila- •
mida
(1057) Artículos Obtenidos
por Biotecnología-Valora-
ción de Proteínas Totales
•
(1074) Guías para la Evalua-
ción de la Seguridad Biológi-
ca de los Excipientes
•
(1084) Análisis de G/icopro-
teínas y Glicanos-Conside-
raciones Generales
•
(1086) Impurezas en Fárma-
cos y Productos Farmacéuti-
CDS
•
(11 02) Métodos de Pruebas
Inmunológicas-Considera-
ciones Generales
• • •
(1103) Métodos de Pruebas
Inmunológicas-Ensayo por
lnmunoadsorción Ligado a • • •
Enzimas (EL/SA)
(1104) Métodos de Pruebas
Inmunológicas-Análisis por
lnmunotransferencia
• •
(1113) Caracterización, /den-
tificación y Tipificación de
Cepas Microbianas
•
(1116) Control Microbiológi-
co y Monitoreo de Ambien-
tes de Procesamiento Asépti- •
co
(1121) Nomenclatura
( 1126) Técnicas Basadas en
•
Ácidos Nucleicos-Extrae-
ción, Detección y Secuencia- • •
ción
(1127) Técnicas Basadas en
Ácidos Nucleicos-Amplifica-
ción
• •
(1128) Técnicas Basadas en
Ácidos Nucleicos-Microma-
trices
•
(1129) Técnicas Basadas en
Ácidos Nucleicos-Genotipi-
ficación
•
(1130) Técnicas Basadas en
Ácidos Nucleicos-Enfoques
para Detectar Trazas de Áci-
dos Nucleicos (Análisis de
•
ADN Residual)
( 11 51 ) Formas Farmacéuticas
(1184) Pruebas de Sensibili-
•
zación •
1 Para la prueba de Funcionalidad, ver (881) Resistencia a la Tensión.
2 Para la prueba de Agua, ver (1231) Agua para Uso Farmacéutico
50 Diagrama de Capítulos / Guía de los Capítulos Generales USP 40

Diagrama 8. Productos Derivados de Células, Genes y Tejidos (Continuación)

Pruebas Universales Pruebas Específicas i ,2
Cuestiones
Mlcrobloló- Cuestlo- Cuestlo- Equi-
glcas nes de nes del pa-
Identifica- Valora- Blocompati- y de Esterlli- Produc- Produc- mien- Caracteriza-
Capítulo ción clón bllldad dad ción to to clón
(1208) Pruebas de Esterili-
dad-Validación de Siste-
mas Aisladores
•
(1211) Esterilización y Ga-
rantía de Esterilidad de Artí-
culos Farmacopeicos
•
(1227) Validación de Recupe-
ración Microbiana en Artícu-
los Farmacopeicos
•
(1228) Despirogenización
•
(1228.1) Despirogenización
por Calor Seco •
(1228.3) Despirogenización
por Filtración •
(1228.5) Indicadores de En-
dotoxinas para Despirogeni-
zación
•
(1229) Esterilización de Artí-
culos Farmacopeicos •
(1229.3) Monitoreo de la
Biocarga •
(1229 .4) Esterilización de Lí-
quidos por Filtración •
(1229.13) Esterilización en el
Sitio •
(1237) Métodos de Pruebas
Virológicas • •
(1251) Pesada en una Balan-
za Analítica •
(1285) Preparación de Mues-
tras Biológicas para Análisis
Histológico e lnmunohisto- • • •
químico
(1285.1) Tinción con Hema-
toxilina y Eosina de Cortes
de Tejidos para Examen Mi- • • •
croscópico
(1 787) Medición de Partícu-
las Subvisibles en Inyecta-
bles de Proteínas Terapéuti- •
cas
(1 788) Métodos para la De-
terminación de Partículas en
Inyectables y Soluciones Of- •
tálmicas
1 Para la prueba de Funcionalidad, ver (881) Resistencia a la Tensión.
2 Para la prueba de Agua, ver (1231) Agua para Uso Farmacéutico

Diagrama 9. Distribución de Medicamentos

Transportis- Distribución Far-
Capítulo Fabricante ta Mayorista de Muestras Reenvasador macia Médico
(7) Etiquetado
•
(17) Etiquetado de Envases de
Medicamentos de Venta Bajo
Receta
•
USP 40 Guía de los Capítulos Generales/ Diagrama de Capítulos 51

., )
Dº1a~ rama 9 DI str1ºb uc I'on d e Me di camentos (Contmuac1on
Transportls- Distribución Far-
Capítulo Fabricante ta Mayorista de Muestras Reenvasador macia Médico
(87) Pruebas de Reactividad
Biológica, In Vitro • • •
(88) Pruebas de Reactividad
Biológica, In Vivo • • •
(381) Tapones Elastoméricos
para Inyectables • •
(659) Requisitos de Envasado y
Almacenamiento • • •
(660) Envases-Vidrio
( 661 ) Sistemas de Envases
• • •
Plásticos y sus Materiales de
Construcción
• • •
( 661 .1 ) Materiales Plásticos de
Construcción • • •
(661.2) Sistemas de Envases
Plásticos para Uso Farmacéu-
tico
• • •
(670) Envases-Componentes
Auxiliares •
(671) Envases-Pruebas de
Desempeño • • •
(698) Volumen de Entrega
(735) Espectrometría de Fluo-
• •
rescencia de Rayos X • •
(755) Llenado Mínimo
(1066) Ambientes Físicos que
• •
Favorecen el Uso Seguro de
los Medicamentos
• • •
(1079) Buenas Prácticas de Al-
macenamiento y Distribución
para Medicamentos
• • • • • •
(1118) Dispositivos de Manito-
reo-Tiempo, Temperatura y
Humedad
• • • • • •
(11 36) Envasado y Reenvasa-
do-Envases Unitarios • • •
(1151) Formas Farmacéuticas
(1152) Medicamentos Veteri-
•
narios Usados en Alimentos
para Animales
• •
(11 77) Buenas Prácticas de En-
vasado • • • • • •
(11 78) Buenas Prácticas de
Reenvasado •
(1191) Consideraciones sobre
Estabilidad en la Práctica de
Dispensación
• • •
(1265) Información Escrita de
los Medicamentos Receta-
dos-Guías
•
(1660) Envases de Vidrio-Eva-
luación de la Durabilidad de
la Superficie Interna
• • •
(1661) Evaluación de Sistemas
de Envases Plásticos y sus Ma-
teriales de Construcción con
Respecto a su Impacto sobre
• • •
la Seguridad del Usuario
52 Diagrama de Capítulos / Guía de los Capítulos Generales USP 40

Diagrama 9. Distribución de Medicamentos (Continuación)

Transportis- Distribución Far-
Capítulo Fabricante ta Mayorista de Muestras Reenvasador macia Médico
(1663) Evaluación de Sustan-
cías Extraíbles Relacionadas
con Envases Farmacéuticos y •
Sistemas de Administración
(1664) Evaluación de Sustan-
cías Lixiviables en Medica-
mentas Relacionadas con En-
vases Farmacéuticos y Siste-
•
mas de Administración

Diagrama 10a. Microbiología-Productos No Estériles

Ausencia de
Capítulo Recuento Microbiano Microorganismos Objetables
(61) Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Recuento
Microbiano •
(62) Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Microorga-
nismos Específicos •
(63) Pruebas para Micoplasmas
•
(61 O) Métodos de Muestreo Microbiológico Alternativos para Productos Nasa-
les e Inhaladores No Estériles • •
(1111) Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Criterios de Acepta-
ción para Preparaciones Farmacéuticas y Sustancias de Uso Farmacéutico • •
(1113) Caracterización, Identificación y Tipificación de Cepas Microbianas
•
(1115) Control de Biocarga de Fármacos y Medicamentos No Estériles
•
(2021) Pruebas de Recuento Microbiano-Suplementos Nutricionales y Dieté-
ticos •
(2022) Procedimientos Microbiológicos para Comprobar la Ausencia de Mi-
croorganismos Específicos-Suplementos Nutricionales y Dietéticos •
(2023) Atributos Microbiológicos de los Suplementos Nutricionales y Dietéti-
cos No Estériles •
Diagrama 10b. Microbiología-Productos Estériles 1
Montaje2 Esterilización Final
Óxi
Proce- do
Prue- samlen- Esteri- de
bas de to liza- Calor Ca- Ra- Eti- Fase Fase
Esterili- Mico- Asépti- Filtra- Mon- ción Húme- lor dia- le- Líqul- de Va-
Capítulo dad plasma co clón taje Otro Final do Seco clón no da por
(55) Indica-
dores Bioló-
gicos-Prue-
bas de Resis-
• • • •
tencia
(63) Pruebas
para Mico-
plasmas
•
(71) Pruebas
de Esterili-
dad
•
(151) Prueba
de Pirógenos •
(1072) De-
sinfectantes
y Antisépti- •
cos
1 Para los límites de endotoxinas, ver (85) Prueba de Endotoxinas Bacterianas.
2 Para BFS, FFS y SFS, ver (1116) Control Microbiológico y Monitoreo de Ambientes de Procesamiento Aséptico.
USP 40 Guía de los Capítulos Generales/ Diagrama de Capítulos 53

Diaarama 10b. Microbiología-Productos Estériles (Continuación)

Montaje2 Esterilización Final
Óxi
Proce- do
Prue- samien- Esteri- de
bas de to liza- Calor Ca- Ra- Etl- Fase Fase
Esterlli- Mico- Asépti- Filtra- Mon- clón Húme- lor dia- le- Líqui- de Va-
Capítulo dad olasma co clón taje Otro Final do Seco clón no da por
(1112) Oeter-
minación de
Actividad de
Agua en
Productos •
Farmacéuti-
cos No Esté-
riles
(1113) Ca-
racteriza-
ción, ldenti-
ficación y Ti-
pificación de
• • •
Cepas Mi-
crobianas
(1116) Con-
trol Micro-
biológico y
Monitoreo
deAmbien- • • •
tes de Proce-
samiento
Aséptico
(111 7) Ópti-
mas Prácti-
cas de Labo-
ratorio Mi-
•
crobiológico
(1207) Eva-
luación de la
Integridad
del Enva- •
se-Produc-
tos Estériles
(1207.1)
Pruebas de
Integridad
de Envases
en el Ciclo
de Vida del
Producto-
•
Selección y
Validación
de Métodos
de Prueba
(1207.2) Tec-
nologias pa-
ra Pruebas
de Fuga en
la lntegri-
•
dad de En-
vas es
(1207.3) Tec-
nologías pa-
ra Pruebas
de Calidad •
de Sellado
de Envases
1 Para los límites de endotoxinas, ver (85) Prueba de Endotoxinas Bacterianas.
2 Para BFS, FFS y SFS, ver (1116) Control Microbiológico y Monitoreo de Ambientes de Procesamiento Aséptico.
54 Diagrama de Capítulos / Guía de los Capítulos Generales USP 40

D aqrama 1Ob. Micro bi ooq1a-Pro

1 , 11 es 1 (Continuacion)
d uctos Ester
Montaje2 Esterilización Final
Óxi
Proce- do
Prue- samien- Esteri- de
bas de to liza- Calor Ca- Ra- Etl- Fase Fase
Esterill- Mico- Aséptl- Fiitra- Mon- clón Húme- lor dia- le- Líqui- de Va-
Capítulo dad plasma co clón taje Otro Final do Seco clón no da por
(1208) Prue-
bas de Este-
rilidad-Va-
lidación de • •
Sistemas
Aisladores
(1211) Esteri-
lización y
Garantía de
Esterilidad
de Artículos
• • • • • •
Farmacopei-
cos
(1222) Pro-
duetos Far-
macéuticos
con Esterili-
zación Ter- •
minal-U-
beración Pa-
ramétrica
(1223) Valí-
dación de
Métodos Mi-
crobiológi- •
cos Alterna-
tivos
(1228) Despi-
rogeniza-
ción
• • • • • • • •
(1228.1)
Despirogeni-
zación por • • • •
Calor Seco
(1228.3)
Despirogeni-
zación por • • •
Filtración
(1228.5) In-
dicadores de
Endotoxinas
para Despi- • • • • •
rogeniza-
ción
(1229) Esteri-
lización de
Artículos
Farmacopei-
• • • • • • • •
cos
(1229.l) Es-
terilización
con Vapor
de Agua por •
Contacto Di-
recto
1 Para los límites de endotoxinas, ver (85) Prueba de Endotoxinas Bacterianas.
2 Para BFS, FFS y SFS, ver (1116) Control Microbiológico y Monitoreo de Ambientes de Procesamiento Aséptico.
USP 40 Guía de los Capítulos Generales/ Diagrama de Capítulos 55

Diagrama 10b. Microbiología-Productos Estériles 1 (Continuación)

Montaje 2 Esterilización Final
Óxi
Proce- do
Prue- samien- Esteri- de
bas de to liza- Calor Ca- Ra- Eti- Fase Fase
Esterili- Mico- Asépti- Filtra- Mon- ción Húme- lor dia- le- Líqui- de Va-
Capítulo dad plasma co ción taje Otro Final do Seco ción no da por
(1229 .2) Es-
terilización
con Calor
Húmedo de •
Líquidos
Acuosos
(1229.3) Mo-
nitoreo de la
Biocarga
• • • •
(1229.4) Es-
terilización
de Líquidos
por Filtra-
• •
ción
(1229.5) In-
dicadores
Biológicos
para Esterili-
• • • •
zación
(1229.6) Es-
terilización
en Fase U- • •
quida
(1229 .7) Es-
terilización
por Gases
•
(1229.8) Es-
terilización
por Calor •
Seco
(1229.9) In-
tegradores e
Indicadores
Fisicoquími- • •
cos para Es-
terilización
(1229 .1 O) Es-
terilización
por Radia- •
ción
(1229.11) Es-
terilización
en Fase de • •
Vapor
(1229.12)
Nuevos Mé-
todos de Es- • •
terilización
(1229.13) Es-
terilización
en el Sitio
• • • • • •
1 Para los límites de endotoxinas, ver (85) Prueba de Endotoxinas Bacterianas.
2 Para BFS, FFS y SFS, ver (1116) Control Microbiológico y Monitoreo de Ambientes de Procesamiento Aséptico.
56 Diagrama de Capítulos / Guía de los Capítulos Generales USP 40

Diagrama 11. Ingredientes de Suplementos Dietéticos

No Botá-
Botánicos nicos 1, 2
Valora-
Con- Seguri- clón
Identifica- teni- dad/ Caracterización de Vitami-
Capítulo Descripción clón do Pureza Flslcoquímlca Otro nas 3
(7) Etiquetado
(91) Valoración de Pantotenato de Cal-
•
cio •
(115) Valoración de Dexpantenol
•
(1 71) Valoración de Actividad de Vitami-
na B12 •
(197) Pruebas de Identificación Espectro-
fotométricas •
(201) Prueba de Identificación por Cro-
matografía en Capa Delgada •
(202) Identificación de Aceites Fijos por
Cromatografía en Capa Delgada •
(203) Procedimiento de Cromatografía
en Capa Delgada de Alta Resolución
para Identificación de Artículos de Orí- •
gen Botánico
(211) Arsénico
•
(231) Metales Pesados
•
(233) Impurezas Elementales-Procedí-
mientas •
(251) Plomo
•
(261) Mercurio
•
(281) Residuo de Incineración
•
(401) Grasas y Aceites Fijos
•
(411) Valoración de Ácido Fálico
(441) Valoración de Niacina o Niacina-
•
mida •
(451) Volumetría con Nitrito
•
(461) Determinación de Nitrógeno
•
(467) Disolventes Residuales
•
(481) Valoración de Ribof/avina
•
(531) Valoración de Tiamina
•
(541) Volumetría
•
(551) Valoración de Vitamina E
•
(561) Artículos de Origen Botánico
(563) Identificación de Artículos de Ori-
• • • • •
gen Botánico • •
(565) Extractos Botánicos
• •
(571) Valoración de Vitamina A
•
(581) Valoración de Vitamina D
•
(591) Determinación de Cinc
•
( 611 ) Determinación de Alcohol
•
(621) Cromatografía
• • •
(730) Espectroquímica de Plasma
•
( 731 ) Pérdida por Secado
•
(733) Pérdida por Incineración
(735) Espectrometría de Fluorescencia de
•
Rayos X • • • •
1 Para complejos, ver Sustancias Obtenidas por Biotecnología (Diagrama 2).
2 Para Minerales, Aminoácidos y Metabolitos no complejos, ver Fármacos Activos No Complejos (Diagrama 1).
3 Ver también Fármacos Activos No Complejos (Diagrama 1).
USP 40 Guía de Jos Capítulos Generales/ Diagrama de Capítulos 57

, 1cos (Continuacion)
D aqrama 11. lnqredº1entes de Suplementos D1etet
No Botá-
Botánicos nicos 1, 2
Valora-
Con- Seguri- ción
Identifica- tenl- dad/ Caracterización de Vitaml-
Capítulo Descripción ción do Pureza Fislcoquímica Otro nas 3
(736) Espectrometría de Masas
•
(761) Espectroscopía de Resonancia
Magnética Nuclear •
(776) Microscopía Óptica
• •
(791) pH
(852) Espectroscopía de Absorción Ató-
•
mica • •
(85 3) Espectroscopía de Fluorescencia
• •
(854) Espectroscopía en el Infrarrojo Me-
dio • •
(855) Nefelometría, Turbidimetría y
Comparación Visual •
(857) Espectroscopía Ultravioleta-Visible
(1064) Identificación de Artículos de Ori-
• •
gen Botánico por Cromatografía en Ca-
pa Delgada de Alta Resolución
•
(1065) Cromatografía fónica
•
(1113) Caracterización, Identificación y
Tipificación de Cepas Microbianas •
(1181) Microscopía Electrónica de Barri-
do • •
(1225) Validación de Procedimientos
Farmacopeicos •
(1226) Verificación de Procedimientos
Farmacopeicos •
(1736) Aplicaciones de la Espectrometría
de Masas •
(1761) Aplicaciones de la Espectroscopía
de Resonancia Magnética Nuclear •
(1852) Espectroscopía de Absorción Ató-
mica-Teoría y Práctica • •
(1853) Espectroscopía de Fluorescen-
cía-Teoría y Práctica • •
(1854) Espectroscopía en el Infrarrojo
Medio-Teoría y Práctica • •
(185 7) Espectroscopía Ultravioleta-Visi-
ble-Teoría y Práctica • •
(2021) Pruebas de Recuento Microbio-
no-Suplementos Nutricionales y Dieté-
ticos
•
(2022) Procedimientos Microbiológicos
para Comprobar la Ausencia de Micro-
organismos Específicos-Suplementos •
Nutricionales y Dietéticos
(2023) Atributos Microbiológicos de los
Suplementos Nutricionales y Dietéticos
No Estériles
•
(2030) Información Complementaria pa-
ra Artículos de Origen Botánico •
(2232) Contaminantes Elementales en
Suplementos Dietéticos •
1 Para complejos, ver Sustancias Obtenidas por Biotecnología (Diagrama 2).
2 Para Minerales, Aminoácidos y Metabolitos no complejos, ver Fármacos Activos No Complejos (Diagrama 7).
3 Ver también Fármacos Activos No Complejos (Diagrama 7).
58 Diagrama de Capítulos / Guía de los Capítulos Generales USP 40

Diagrama 11. Ingredientes de Suplementos Dietéticos (Continuación)

No Botá-
Botánicos nlcos 1•2
Valora-
Con- Seguri- ción
Identifica- tenl- dad/ Caracterización de Vltami-
Capítulo Descripción ción do Pureza Flslcoquímlca Otro nas 3
(2250) Detección de Suplementos Dieté-
ticos Irradiados •
1 Para complejos, ver Sustancias Obtenidas por Biotecnología (Diagrama 2).
2 Para Minerales, Aminoácidos y Metabolitos no complejos, ver Fármacos Activos No Complejos (Diagrama 7).
3 Ver también Fármacos Activos No Complejos (Diagrama 1).

Diagrama 12. Productos de Suplementos Dietéticos

Pruebas Universales Pruebas Específicas
Valora- Impurezas Equi-
Des- ción/ Dlsolven- pa- Pruebas Seguri-
crip- Identifica- Contenl- Orgánl- lnorgá- tes Resl- mlen- de Desem- dad/
Capítulo ción ción do cas nicas duales to peño Pureza
(7) Etiquetado
•
(31) Aparatos Volumétricos
•
(41) Balanzas
•
(91) Valoración de Pantote-
nato de Calcio •
(1 71) Valoración de Actividad
de Vitamina BJJ •
(191) Identificación-Pruebas
Generales •
(197) Pruebas de Identifica-
ción Espectrofotométricas •
(201) Prueba de Identifica-
ción por Cromatografía en
Capa Delgada
•
(202) Identificación de Acei-
tes Fijos por Cromatografía
en Capa Delgada
•
(203) Procedimiento de Cro-
matografía en Capa Delga-
da de Alta Resolución para
Identificación de Artículos de
•
Origen Botánico
(211) Arsénico
•
(231) Metales Pesados
•
(251) Plomo •
(261) Mercurio
•
(281) Residuo de Incineración
•
(411) Valoración de Ácido Fó-
lico •
(441) Valoración de Niacina
o Niacinamida •
(451) Volumetría con Nitrito
•
(466) Impurezas Comunes
•
(467) Disolventes Residuales
•
(531) Valoración de Tiamina
•
(541) Volumetría
•
(551) Valoración de Vitamina
E •
(561) Artículos de Origen Bo-
tónico • •
USP 40 Guía de los Capítulos Generales/ Diagrama de Capítulos 59

., )
D.1agrama 12 p ro d uctos de sup1ementos Di etet1cos (Contmuac1on
Pruebas Universales Pruebas Específicas

Valora- Impurezas Equi-

Des- ción/ Disolven- pa- Pruebas Seguri-
crip- Identifica- Conteni- Orgáni- lnorgá- tes Resi- mien- de Desem- dad/
Capítulo ción ción do cas nicas duales to peño Pureza
(563) Identificación de Artícu-
los de Origen Botánico •
(565) Extractos Botánicos
•
(571) Valoración de Vitamina
A •
(581) Valoración de Vitamina
D •
( 621 ) Cromatografía
• • • •
(730) Espectroquímico de
Plasma • • •
(733) Pérdida por Incinera-
ción •
(735) Espectrometría de Fluo-
rescencia de Rayos X • • • •
(736) Espectrometría de Ma-
sas •
(776) Microscopía Óptico
•
(781) Rotación Óptico
•
(782) Espectroscopía de Di-
croísmo Circular Vibracional •
(801) Po/orografía
(852) Espectroscopía de Ab-
•
sordón Atómico • • •
(853) Espectroscopía de Fluo-
rescencia • • •
(854) Espectroscopía en el In-
frarrojo Medio • • •
(855) Nefelometría, Turbidi-
metría y Comparación Vi-
sual
• •
(857) Espectroscopía Ultra-
violeta-Visible • • •
(1051) Limpieza de Material
de Vidrio •
(1 064) Identificación de Artí-
culos de Origen Botánico por
Cromatografía en Capa Del- •
gada de Alta Resolución
(1065) Cromatografía lónico
•
(1086) Impurezas en Fárma-
cos y Productos Farmacéuti-
cos
•
(1094) Cápsulas-Pruebas de
Disolución y Atributos de
Calidad Relacionados
•
(1113) Caracterización, /den-
tificoción y Tipificación de
Cepas Microbianas
•
(1151) Formas Farmacéuticos
•
(1216) Friabilidad de las Ta-
bletas •
(1251) Pesada en una Balan-
za Analítica •
(1 736) Aplicaciones de la Es-
pectrometría de Masas •
60 Diagrama de Capítulos / Guía de Jos Capítulos Generales USP 40

Diagrama 12. Productos de Suplementos Dietéticos (Continuación)

Pruebas Universales Pruebas Específicas
Valora- Impurezas Equi-
Des- ción/ Disolven- pa- Pruebas Segurl-
crip- Identifica- Conteni- Orgáni- lnorgá- tes Resi- mien- de Desem- dad/
Capítulo ción ción do cas nicas duales to peño Pureza
(1 782) Espectroscopía de Di-
croísmo Circular Vibrado-
nal-Teoría y Práctica
•
(1852) Espectroscopía de Ab-
sordón Atómica-Teoría y
Práctica
• • •
(1853) Espectroscopía de
Fluorescencia-Teoría y
Práctica
• • •
(1854) Espectroscopía en el
Infrarrojo Medio-Teoría y
Práctica
• • •
(1857) Espectroscopía Ultra-
violeta-Visible-Teoría y
Práctica
• • •
(2021) Pruebas de Recuento
Microbiano-Suplementos
Nutricionales y Dietéticos
•
(2022) Procedimientos Micro-
biológicos para Comprobar
la Ausencia de Microorga-
nismos Específicos-Suple- •
mentas Nutricionales y Die-
téticos
(2023) Atributos Microbioló-
gicos de los Suplementos
Nutricionales y Dietéticos •
No Estériles
(2030) Información Comple-
mentaría para Artículos de
Origen Botánico
•
(2040) Desintegración y Di-
solución de Suplementos
Dietéticos
•
(2091) Variación de Peso de
Suplementos Dietéticos •
(2232) Contaminantes Ele-
mentales en Suplementos
Dietéticos
• •
(2250) Detección de Suple-
mentas Dietéticos Irradiados •
(2750) Prácticas de Fabrica-
ción para Suplementos Die-
téticos
• • •

Diagrama 13. Preparación Magistral-Sustancia/Preparación/Dispensación

Impurezas
Re lacio-
Caracteri- Re lacio- nadas
zación Fi- nadas con el
Descrip- ldentifi- Valora- Envasa- sicoquími- Seguri- Equipa- con el Produc-
Capítulo Global ción cación ción do ca dad miento Proceso to
( 7) Etiqueta-
do •
(11) Estánda-
res de Refe-
renda USP
• • • • • •
USP 40 Guía de los Capítulos Generales/ Diagrama de Capítulos 61

Diagrama 13. Preparación Magistral-Sustancia/Preparacion/Dispensación (Continuación)

Impurezas
Relacio-
Caracteri- Re lacio- nadas
zación Fi- nadas con el
Descrip- ldentifi- Valora- Envasa- sicoquími- Seguri- Equipa- con el Produc-
Capítulo Global ción cación ción do ca dad miento Proceso to
(31) Aparatos
Volumétricos •
(41) Balanzas
•
(61) Examen
Microbioló-
gico de Pro-
duetos No
Estériles: •
Pruebas de
Recuento
Microbiano
(62) Examen
Microbioló-
gico de Pro-
duetos No
Estériles:
Pruebas de
•
Microorga-
nismos Espe-
cíficos
(71) Pruebas
de Esterili-
dad
•
(81) Antibió-
ticos-Valo-
raciones Mi-
crobiológi-
•
cas
(85) Prueba
de Endotoxi-
nas Bacte- •
rianas
(87) Pruebas
de Reactivi-
dad Biológi- •
ca, In Vitro
(88) Pruebas
de Reactivi-
dad Biológi- •
ca, In Vivo
(111) Diseño
y Análisis de
Valoraciones • •
Biológicas
(191) ldenti-
ficación-
Pruebas Ge- •
nerales
(197) Prue-
bas de /den-
tificación Es-
pectrofoto-
• •
métricas
(201) Prueba
de ldentifi-
cación por
Cromato-
grafía en
•
Capa Delga-
da
62 Diagrama de Capítulos / Guía de los Capítulos Generales USP 40

Diaarama 13. Preoaración Maaistral-Sustancia/Preparación/Dispensación (Continuación)

Impurezas
Relacio-
Caracteri- Relacio- nadas
zación FI- nadas con el
Descrip- ldentifi- Valora- Envasa- sicoquími- Seguri- Equipa- con el Produc-
Capítulo Global clón cación clón do ca dad miento Proceso to
(202) Jdenti-
ficación de
Aceites Fijos
por Croma-
tografía en
•
Capa Delga-
da
(203) Proce-
dimiento de
Cromato-
grafía en
Capa Delga-
da de Alta
Resolución •
para ldenti-
ficación de
Artículos de
Origen Bo-
tónico
(231) Meta-
les Pesados •
(541) Va/u-
me tría • •
(621) Croma-
tografía • • • • • •
(659) Requi-
sitos de En-
vasado y Al-
macen a-
•
miento
(660) Enva-
ses-Vidrio •
(661 ) Siste-
mas de En-
vases Plásti-
cos y sus
Materiales
•
de Construc-
ción
(661.l)Ma-
teria/es Plás-
ticos de
Construc-
•
ción
(661.2) Siste-
mas de En-
vases Plásti-
cos para •
Uso Farma-
céutico
(671) Enva-
ses-Prue-
bas de De- •
sempeño
(730) Espec-
troquímica
de Plasma
• •
(731) Pérdida
por Secado •
USP 40 Guía de Jos Capítulos Generales/ Diagrama de Capítulos 63

Dlaqrama 13. Preparación Maqlstra -Sustancla/Preparacion/Dlspensación (Continuacion)

Impurezas
Relacio-
Caracterl- Relacio- nadas
zaclón Fi- nadas con el
Descrip- ldentifl- Valora- Envasa- sicoquíml- Seguri- Equipa- con el Produc-
Capítulo Global ción caclón ción do ca dad miento Proceso to
(736) Espec-
trometría de
Masas
• • • • • •
(761) Espec-
troscopía de
Resonancia
Magnética
• • • • • •
Nuclear
(781) Rota-
ción Óptica •
(786) Estima-
ción de Ja
Distribución
del Tamaño
de Partícula
•
por Tamiza-
do Analítico
(795) Prepa-
ración Ma-
gistra/-Pre-
paraciones
• • • • •
No Estériles
(797) Prepa-
ración Ma-
gistral-Pre-
paraciones
• • • • •
Estériles
(800) Fárma-
cos Peligro-
sos-Maní-
pu/ación en
lnstalacio- • • • •
nes de Cui-
dados de la
Salud
(823) Fárma-
cos para To-
mografía de
Emisión de
Positrones
para Uso en
Preparado-
nes Magis-
•
trales, lnves-
tigación Clí-
nica y Estu-
dios Científi-
cos
(831) Índice
de Retrae-
ción
•
(852) Espec-
troscopía de
Absorción • • • • •
Atómica
(853) Espec-
troscopía de
Fluorescen- • • • • •
cia
64 Diagrama de Capítulos / Guía de los Capítulos Generales USP 40

Diaqrama 13. Preparación Maqistral-Sustancia/Preparación/Dlsoensación (Continuación)

Impurezas
Relacio-
Caracteri- Relacio- nadas
zación Fl- nadas con el
Descrip- ldentifi- Valora- Envasa- sicoquími- Seguri- Equipa- con el Produc-
Capítulo Global ción cación ción do ca dad miento Proceso to
(854) Espec-
troscopía en
el Infrarrojo • • • • •
Medio
(855) Nefelo-
metría, Tur-
bidimetría y
Compara-
• • • •
ción Visual
(857) Espec-
troscopía Uf-
travioleta- • • • • •
Visible
(9 21 ) De ter-
minación de
Agua
•
(1031) Bio-
compatibili-
dad de los
Materiales
Usados en
Envases de
Medicamen-
•
tos, Disposi-
tivos Médi-
cose lm-
plantes
(1052) Artí-
culos Obte-
nidos por
Biotecno/o-
gía-Análi-
• •
sis de Ami-
noácidos
(1053) Elec-
troforesis
Capilar
• •
(1 054) Artí-
culos Obte-
nidos por
Biotecnolo-
gía-lsoe-
• •
lectroenfo-
que
(1 055) Artí-
culos Obte-
nidos por
Biotecno/o- • •
gía-Mapeo
de Péptidos
(1 056) Artí-
culos Obte-
nidos por
Biotecnolo-
gía-Elec- • •
troforesis en
Gel de Palia-
crilamida
USP 40 Guía de los Capítulos Generales / Diagrama de Capítulos 65

.
Dlaqrama 13. Preparacion Maq1stra -Sustancia / Preparac1on .
., / D1spensac1on
., ( Contmuaoon
., )

Impurezas
Relacio-
Caracteri- Relacio- nadas
zación Fi- nadas con el
Descrip- ldentifi- Valora- Envasa- sicoquími- Seguri- Equipa- con el Produc-
Capítulo Global ción cación ción do ca dad miento Proceso to
(1057) Artí-
culos Obte-
nidos por
Biotecnolo-
gía-Valora- • •
ción de Pro-
teínas Tata-
les
(1064) /den-
tificación de
Artículos de
Origen Bo-
tónico por
Cromato- •
grafía en
Capa Delga-
da de Alta
Resolución
(1065) Cro-
matografía
lónica
•
(1066)Am-
bientes Físi-
cosque Fa-
vorecen el
Uso Seguro
•
de los Medí-
comentos
(1113) Ca-
racteriza-
ción, ldenti-
ficación y Ti-
pificación de
•
Cepas Mi-
crobianas
(1121) No-
mene/atura •
(11 36) Enva-
sado y Reen-
vasado--En-
vases Unita-
•
ríos
(1151) For-
mas Forma-
céuticas
•
(1152) Medí-
comentos
Veterinarios
Usados en
Alimentos
•
para Anima-
les
(1160) Cál-
culos en Ja
Práctica Far- • •
macéutica
66 Diagrama de Capítulos / Guía de los Capítulos Generales USP 40

Diaqrama 13. Preparacion Maq1stral-Sustanc1a/Preparacion/Dispensacion (Continuacion)

Impurezas
Relacio-
Caracteri- Re lacio- nadas
zación Fi- nadas con el
Descrip- ldentifi- Valora- Envasa- sicoquími- Seguri- Equipa- con el Produc-
Capítulo Global ción cación ción do ca dad miento Proceso to
(1163) Ga-
rantía de
Calidad en
la Prepara- • • • • • •
ción Magis-
trol
(1176) Ba-
lanzas para
Prescripcio-
nes y Apara-
tos Volumé-
tricos Usa-
• • • •
dos en Pre-
paraciones
Magistrales
(1191) Cansí-
deraciones
sobre Estabi-
lidad en la
Práctica de
•
Dispensa-
ción
(1228) Despi-
rogeniza-
ción
•
(1228.1)
Despirogeni-
zación por •
Calor Seco
(1228.3)
Despirogeni-
zación por •
Filtración
(1228.5) In-
dicadores de
Endotoxinas
para Despi- •
rogeniza-
ción
(1229) Esteri-
lización de
Artículos
Farmacopei-
•
CDS

(1229.2) Es-
terilización
con Calor
Húmedo de •
Líquidos
Acuosos
(1229.3) Mo-
nitoreo de la
Biocarga
•
(1229.4) Es-
terilización
de Líquidos
por Filtra-
•
ción
USP 40 Guía de los Capítulos Generales/ Diagrama de Capítulos 67

Diagrama 13. Preoaración Magistral-Sustancia/Preparación/Dispensación (Continuación)

Impurezas
Relaclo-
Caracterl- Re lacio- nadas
zación FI- nadas con el
Descrlp- ldentifi- Valora- Envasa- sicoquíml- Segurl- Equipa- con el Produc-
Caoítulo Global ción caclón ción do ca dad miento Proceso to
(1229 .6) Es-
terilización
+
en Fase Lí-
quida
(1229.7) Es-
terilización +
por Gases
(1229 .8) Es-
terilización
+
por Calor
Seco
(1229.1 O) Es-
terilización
+
por Radia-
ción
( 1229 .11) Es-
terilización
+
en Fase de
Vapor
(1229.12)
Nuevos Mé-
+
todos de Es-
terilización
(1229.13) Es-
terilización +
en el Sitio
(1231) Agua
para Uso
Farmacéuti-
+
ca
(1251) Pesa-
da en una
+
Balanza
Analítica
( 1265) lnfor-
moción Es-
crita de los
Medicamen-
+
tos Receta-
dos-Guías
(1660) Enva-
ses de Vi-
drio-Eva-
luación de la +
Durabilidad
de la Super-
ficie Interna
(1661) Eva-
luación de
Sistemas de
Envases
Plásticos y
sus Materia-
les de Cons- +
trucción con
Respecto a
su Impacto
sobre la Se-
guridad del
Usuario
68 Diagrama de Capítulos / Guía de los Capítulos Generales USP 40

Diagrama 13. Preparación Magistral-Sustancia/Preparación/Dispensación (Continuación)

Impurezas
Relacio-
Caracteri- Relacio- nadas
zaclón FI- nadas con el
Descrip- ldentifi- Valora- Envasa- sicoquíml- Seguri- Equipa- con el Produc-
Capítulo Global ción cación ción do ca dad miento Proceso to
(1663) Eva-
luación de
Sustancias
Extraíbles
Relaciona-
dos con En-
vases Far-
•
macéuticos
y Sistemas
deAdminis-
tración
(1664) Eva-
luación de
Sustancias
Lixiviab/es
en Medica-
mentas Re-
/acionadas •
con Envases
Farmacéuti-
cos y Siste-
mas de Ad-
ministración
(1 736) Apli-
caciones de
la Espectro-
metría de
• • • • • •
Masas
(176l)Ap/i-
caciones de
la Espectros-
copía de Re-
sonancia
• • • • • •
Magnética
Nuclear
(1852) Espec-
troscopía de
Absorción
Atómica- • • • • •
Teoría y
Práctica
(1853) Espec-
troscopía de
Fluorescen-
cia-Teoría
• • • • •
y Práctica
(1854) Espec-
troscopía en
el Infrarrojo
Medio- • • • • •
Teoría y
Práctica
(1857) Espec-
troscopía Uf-
travioleta-
Visible- • • • • •
Teoría y
Práctica
USP 40
Guía para los Capítulos
Generales
(Para obtener la lista alfabética completa de los capítulos generales de esta Farmacopea, consulte "Capítulos Generales" en el
PRUEBAS Y VALORACIONES GENERALES
Requisitos Generales para
Pruebas y Valoraciones
(1) Medicamentos Inyectables y en Implantes
(Parenterales)-Pruebas de Calidad
del Producto .......................... 75
(2) Medicamentos Orales-Pruebas de Calidad del
Producto ............................. 82
(3) Medicamentos Tópicos y Transdérmicos-Pruebas
de Calidad del Producto .................. 87
(4) Medicamentos para Mucosas-Pruebas de
Calidad del Producto .................... 96
(5) Medicamentos Nasales y para Inhalación-
Información General y Pruebas de Calidad
del Producto ......................... 101
(7) Etiquetado ............................ 109
(11) Estándares de Referencia USP .............. 115
Aparatos para Pruebas y Valoraciones
(1 7) Etiquetado de Envases de Medicamentos
de Venta Bajo Receta ................... 11 8
(31) Aparatos Volumétricos ................... 122
(41) Balanzas ............................. 123
Pruebas Microbiológicas
(51) Pruebas de Eficacia Anti microbiana .......... 124
(55) Indicadores Biológicos-Pruebas de
Resistencia ........................... 127
(61) Examen Microbiológico de Productos No Estériles:
Pruebas de Recuento Microbiano .......... 1 30
(62) Examen Microbiológico de Productos No Estériles:
Pruebas de Microorganismos Específicos ..... 1 36
(63) Pruebas para Micoplasmas ................ 144
(71) Pruebas de Esterilidad ................... 150
Pruebas y Valoraciones Biológicas
(81) Antibióticos-Valoraciones Microbiológicas ....
(85) Prueba de Endotoxinas Bacterianas ..........
(87) Pruebas de Reactividad Biológica, In Vitro .....
(88) Pruebas de Reactividad Biológica, In Vivo .....
(89) Enzimas Usadas como Materiales Auxiliares en
la Fabricación de Productos Farmacéuticos ....
(89 .1 ) Colagenasa 1 • • . • . • • . . . . • . • . • . • . • . • • •
(89.2) Colagenasa 11 ........................
(90) Suero Fetal Bovino-Atributos de Calidad y
Pruebas de Funcionalidad ................
Guía para los Capítulos Generales 69
índice.)
(91) Valoración de Pantotenato de Calcio ......... 21 O
(92) Factores de Crecimiento y Citokinas Usados en la
Fabricación de Productos de Terapia Celular .. 212
(111) Diseño y Análisis de Valoraciones Biológicas ... 217
(115) Valoración de Dexpantenol ............... 221
(121) Valoración de Insulina .................. 223
(121.1) Procedimientos Analíticos Fisicoquímicos
para Insulinas ........................ 225
(123) Pruebas de Identidad Biológica de Glucagón .. 228
(124) Valoraciones Biológicas de Eritropoyetina ..... 231
(126) Pruebas de Identidad Biológica de
Somatropina ......................... 233
(127) Recuento de Células CD34+ por
Citometría de Flujo .................... 235
(129) Procedimientos Analíticos para Anticuerpos Mono-
clonales Recombinantes de Uso Terapéutico ... 240
(130) Atributos de Calidad de la Proteína A ....... 247
(151) Prueba de Piró9enos ................... 255
(161) Dispositivos Medicas-Pruebas de Endotoxinas
Bacterianas y Pirógenos ................. 257
(162) Prueba de Potencia Antitoxina Diftérica en
lnmunoglobulinas Humanas .............. 260
(165) Activador de Precalicreína ............... 262
(171) Valoración de Actividad de Vitamina Bi2 ..... 263
Pruebas y Valoraciones Químicas
Pruebas de Identificación
(181) Identificación-Bases Orgánicas
Nitrogenadas ......................... 266
(191) Identificación-Pruebas Generales .......... 267
(193) ldentificación-Tetraciclinas .............. 276
(197) Pruebas de Identificación Espectrofoto-
métrica ............................. 277
(201) Prueba de Identificación por Cromatografía
en Capa Delgada ...................... 278
(202) Identificación de Aceites Fijos por Cromato-
grafía en Capa Delgada ................. 279
(203) Procedimiento de Cromatografía en Capa
Delgada de Alta Resolución para Identifi-
cación de Artículos de Origen Botánico ...... 281
158 Pruebas de Límite
178
185 (206) Aluminio ............................ 283
187 (207) Prueba para el Derivado 1,6-Anhidro de
Enoxaparina Sódica .................... 284
193 (208) Valoración de Actividad Anti-Factor Xa y
19 7 Anti-Factor lla para Heparinas No Fraccionadas y
202 de Bajo Peso Molecular ................. 290
206
70 Guía para los Capítulos Generales
(209) Determinaciones de Peso Molecular de
Heparinas de Bajo Peso Molecular .......... 294
(211) Arsénico ............................ 295
(212) Análisis de Oligosacáridos ............... 297
(221) Cloruros y Sulfatos .................... 312
(223) Dimetilanilina ........................ 312
(226) 4-Epianhidrotetraciclina ................. 313
(227) 4-Aminofenol en Medicamentos que
Contienen Acetaminofeno ............... 31 3
(228) Óxido de Etileno y Dioxano .............. 315
(231) Metales Pesados ...................... 318
(232) Impurezas Elementales-Límites ........... 320
(233) Impurezas Elementales-Procedimientos ..... 323
(241) Hierro .............................. 327
(251) Plomo ............................. 328
(261) Mercurio ............................ 329
(267) Porosimetría por Intrusión de Mercurio ...... 333
(268) Porosidad Mediante Adsorción-Desorción
de Nitrógeno ........................ 336
(271) Prueba para Sustancias Fácilmente
Carbonizables ........................ 340
(281) Residuo de Incineración ................. 340
(291) Selenio ............................. 341
Otras Pruebas y Valoraciones
(301) Capacidad Neutralizante de Ácido ......... 342
(311) Valoración de Alginatos ................. 343
(341) Agentes Antim[crobianos-Contenido ....... 344
(345) Valoración de Acido Cítrico/Citrato y Fosfato .. 349
(351) Valoración de Esteroides ................. 350
(371) Valoración de Cobalamina con Marcador
Radioactivo .......................... 351
(381) Tapones Elastoméricos para Inyectables ...... 352
(391) Valoración de Epinefrina ................. 358
(401) Grasas y Aceite,s Fijos ................... 359
(411) Valoración de Acido Fólico ................. 373
(413) Análisis de Impurezas en Gases Med1c1nales ... 377
(415) Valoración de Gases Medicinales ........... 378
(425) Antibióticos-Valoración Yodométrica ....... 381
(429) Medición del Tamaño de Partícula por
Difracción de Luz ...................... 383
(431) Determinación de Grupos Metoxilo ........ 388
(441) Valoración de Niacina o Niacinamida ....... 390
(451) Volumetría con Nitrito .................. 395
(461) Determinación de Nitrógeno ............. 396
(466) Impurezas Comunes ................... 397
(467) Disolventes Residuales .................. 399
(469) Etilenglicol, Dietilenglicol y Trietilenglicol
en Sustancias Etoxiladas ................. 414
(471) Combustión en Matraz con Oxígeno ....... 416
(481) Valoración de Riboflavina ................ 417
(501) ~ales de Bases Orgánicas Nitrogenadas ...... 423
(503) Acido Acético en Péptidos ............... 424
(503.1) Ácido Trifluoroacético en Péptidos ........ 425
(507) Procedimientos para la Determinación de
Proteínas ............................ 426
(511) Valoración de un Esteroide Aislado ......... 432
(525) Dióxido de Azufre ..................... 433
(531) Valoración de Tiamina .................. 438
(541) Volumetría .......................... 447
(551) Valoración de Vitamina E ................ 451
(561) Artículos de Origen Botánico ............. 458
(563) Identificación de Artículos de Origen
Botánico ............................ 473
(565) Extractos Botánicos .................... 487
(571) Valoración de Vitamina A ................ 489
(580) Valoración de Vitamina C ................ 495
(581) Valoración de Vitamina D ................ 498
(591) Determinación de Cinc ................. 508
USP 40
Pruebas y Determinaciones Físicas
(601) Medicamentos Nasales y para Inhalación:
Pruebas de Calidad de Desempeño
de Aerosoles, Atomizadores y Polvos ....... 509
(602) Propelentes .......................... 535
(603) Aerosoles Tópicos ..................... 537
(604) Velocidad de Fuga ..................... 538
(61 O) Métodos de Muestreo Microbiológico
Alternativos para Productos Nasales
e Inhaladores No Estériles ................ 538
(611) Determinación de Alcohol ............... 540
(616) Densidad Aparente y Densidad por Asenta-
miento de los Polvos ................... 542
(621) Cromatografía ........................ 546
(631) Color y Acromatismo ................... 559
(641) Totalidad de la Disolución ............... 560
(643) Carbono Orgánico Total ................. 560
(645) Conductividad del Agua ................. 562
(651) Temperatura de Solidificación .............. 566
(659) Requisitos de Envasado y Almacenamiento ... 568
(660) Envases-Vidrio ..... ; ............. : .... 574
(661) Sistemas de Envases Plast1cos y sus Materiales
de Construcción ...................... 581
(661.1) Materiales Plásticos de Construcción ...... 582
(661.2) Sistemas de Envases Plásticos para Uso
Farmacéutico ......................... 595
(670) Envases-Componentes Auxiliares .......... 599
(671) Envases-Pruebas de Desempeño .......... 607
(691) Algodón ............................ 615
(695) Cristalinidad ......................... 617
(696) Caracterización de Sólidos Cristalinos por Micro-
calorimetría y Calorimetría de Disolución ..... 618
(697) Contenido en Envases para Inyectables ...... 621
(698) Volumen de Entrega ................... 622
(699) Densidad de Sólidos ................... 625
(701) Desintegración ....................... 627
(705) Atributos de Calidad para Tabletas Cuyo
Etiquetado Indica Ranurado Funcional ....... 630
(711) Disolución .......................... 632
(721) Intervalo de Destilación ................. 643
(724) Liberación de Fármacos ................. 644
(729) Distribución del Tamaño de Glóbulos en
Emulsiones Inyectables de Lípidos .......... 652
(730) Espectroquímica de Plasma .............. 655
(731) Perdida por Secado .................... 659
(733) Pérdida por Incineración ................ 660
(735) Espectrometría de Fluorescencia de Rayos X .. 660
(736) Espectrometría de Masas ................ 665
(741) Intervalo o Temperatura de Fusión ......... 672
(755) Llenado Mínimo ...................... 674
(761) Espectroscopía de Resonancia Magnética
Nuclear ............................. 676
(771) Productos Oftálmicos-Pruebas de Calidad ... 686
(776) Microscopfa Optica .................... 692
(781) Rotación Optica ...................... 695
(782) Espectroscopía de Dicroísmo Circular
Vibracional .......................... 697
(785) Osmolalidad y Osmolaridad .............. 704
(786) Estimación de la Distribución del Tamaño de
Partícula por Tamizado Analítico ........... 707
(787) Partículas Subvisibles en Inyectables de
Proteínas Terapéuticas .................. 712
(788) Partículas en Inyectables ................ 715
(789) Partículas en Soluciones Oftálmicas ......... 719
(790) Partículas Visibles en Inyectables ........... 720
(791) pH ................................ 721
(795) Preparación Magistral-Preparaciones No
Esteriles ............................. 725
(797) Preparación Magistral-Preparaciones
Esteriles ............................. 734
(800) Fármacos Peligrosos-Manipulación
en Instalaciones de Cuidados de la Salud ..... 784
(801) Polarografía ......................... 804
(811) Finura de Polvos ...................... 809
(821) Radioactividad ........................ 81 O
USP 40
(823) Fármacos para Tomografía de Emisión de Posi-
trones para Uso en Preparaciones Ma5)istrales,
Investigación Clínica y Estudios Cient1ficos .... 817
(831) Índice de Refracción ................... 828
(841) Peso Específico ....................... 829
(846) Área Superficial Específica ................ 830
(852) Espectroscopía de Absorción Atómica ....... 834
(853) Espectroscopía de Fluorescencia ........... 839
(854) Espectroscopía en el Infrarrojo Medio ....... 845
(855) Nefelometna, Turbidimetría y Comparación
Visual .............................. 850
(857) Espectroscopía Ultravioleta-Visible .......... 851
(861) Suturas-Diámetro .................... 858
(871) Suturas-Sujeción de Agujas .............. 859
(881) Resistencia a la Tensión ................. 860
(891) Análisis Térmico .................. : : ..... 861
(905) Uniformidad de Unidades de Dos1f1cac1on .... 866
(911) Viscosidad-Métodos Capilares ............ 870
(912) Viscosidad-Métodos Rotatorios ........... 872
(913) Viscosidad-M~todo de Bola R?dante .... ~ ... 877
(914) Viscosidad-Metodos por Medida de Pres1on .. 878
(921) Determinación de Agua ................. 880
(941) Caracterización d~ S~lidos Crist~linos.,
y Parcialmente Cristalinos por D1fracc1on
de Rayos X sobre Polvo (DRXP) ............ 885
INFORMACIÓN GENERAL
(1004) Medicamentos para Mucosas-Pruebas de
Desempeño .......................... 893
(1 005) Emisión Acústica ..................... 896
(101 O) Datos Analíticos-Interpretación y
Tratamiento .......................... 900
(1Ol5~:J¡~~~f~i¿~~~~~t.i~a~~~ .d~. ~í~~e~i~ ........ 917
(1024) Suero Bovino ........................ 919
(1025) Pancreatina ......................... 933
(1027) Citometría de Flujo ................... 943
(1029) Guías de Buenas Prácticas de
Documentación ....................... 962
(1030) Capítulos de Valoraciones Biológicas-Infor-
mación General y Glosario ............... 966
(1031) Biocompatibilidad de los Materiales Usados en
Envases de Medicamentos, Dispositivos
Médicos e Implantes ................... 978
(1032) Diseño y Desarrollo de Valoraciones
Biológicas ........................... 988
(1033) Validación de Valoraciones Biológicas ..... 101 O
(1034) Análisis de Valoraciones Biológicas ........ 1027
(1039) Quimiometría ...................... 1040
(1 041) Productos Biológicos ................. 1061
(1043) Materiales Auxiliares para Productos Celulares,
Génicos y de Ingeniería Tisular ........... 1062
(1044) Crioconservación de Células ............ 1071
(1046) Productos Derivados de Células y Tejidos ... 1086
(1047) Productos de Terapia G~nica . ~ . : ..... : ... 1119
(1048) Calidad de Productos B1otecnolog1cos: Anal1s1s de
la Construcción Expresable en Células Usadas
para la Producción de Productos Proteínicos
Obtenidos con ADN Recombinante ........ 1151
(1 049) Calidad de Productos Biotecnológicos: Pruebas
de Estabilidad de Productos Biotecnológicos
o Biológicos ........................ 1154
(1050) Evaluación de la Seguridad Viral en Productos
Biotecnológicos Obtenidos de Líneas
Celulares de Origen Humano o Animal ..... 1159
(1050.1) Diseño, Evaluación y Caracterización
de Procedimientos de Depuración Viral ..... 1175
(1051) Limpieza de Material de Vidrio .......... 1187
(1052) Artículos Obtenidos por Biotecnología-
Análisis de Aminoácidos ................ 1188
(1053) Electroforesis Capilar ................. 1202
(1054) Artículos Obtenidos por Biotecnología-
lsoelectroenfoque .................... 121 O
Guía para los Capítulos Generales 71
(1055) Artículos Obtenidos por Biotecnología-
Mapeo de Péptidos ................... 1213
(1056) Artículos Obtenidos por Biotecnología-
Electroforesis en Gel de Poliacrilamida ...... 1220
(1057) Artículos Obtenidos por Biotecnología-
Valoración de Proteínas Totales ........... 1228
(1058) Calificación de Instrumentos Analíticos .... 1235
(1059) Desempeño de Excipientes ............. 1242
(1061) Color-Medición Instrumental .......... 1273
(1063) Metodología de Celda de Corte para
Pruebas de Fluidez de Polvos ............ 1276
(1064) Identificación de Artículos de Origen
Botánico por Cromatografía en Capa
Delgada de Alta Resolución ............. 1289
(1065) Cromatografía lónica ................. 1299
(1 066) Ambientes Físicos que Favorecen el Uso
Seguro de los Medicamentos ............ 1302
(1072) Desinfectantes y Antisépticos ........... 1317
(1074) Guías para la Evaluación de la Seguridad
Biológica de los Excipientes ............. 1322
(1078) Buenas Prácticas de Fabricación para
Excipientes Farmacéuticos a Granel ........ 1327
(1079) Buenas Prácticas de Almacenamiento y
Distribución para Medicamentos .......... 1 349
(1080) Excipientes Farmacéuticos a Granel-
Certificado de Análisis ................. 1359
(1084) Análisis de Glicoproteínas y Glicanos-
Consideraciones Generales .............. 1 368
(1086) Impurezas en Fármacos y Productos
Farmacéuticos ....................... 1 379
(1087) Disolución Intrínseca Aparente-Procedi-
mientos de Pruebas de Disolución para
Disco Rotatorio y Disco Estacionario ....... 1 382
(1088) Evaluación In Vivo e In Vitro de Formas
Farmacéuticas ....................... 1 387
(1090) Evaluación de Desempeño del Producto
Farmacéutico-Biodisponibilidad, Bioequi-
valencia y Disolución .......... : ........ 1399
(1091) Etiquetado de Ingredientes Inactivos ...... 1408
(1092) Procedimiento de Disolución: Desarrollo
y Validación ......................... 1408
(1094) Cápsulas-Pruebas de Disolución y
Atributos de Calidad Relacionados ......... 1430
(1097) Procedimientos para el Muestreo de Polvos
a Granel ........................... 1439
(1102) Métodos de Pruebas Inmunológicas-
Consideraciones Generales .............. 1453
(1103) Métodos de Pruebas Inmunológicas-
Ensayo por lnmunoadsorción Ligado a
Enzimas (ELISA) ...................... 1462
(1104) Métodos de Pruebas Inmunológicas-
Análisis por lnmunotransferencia .......... 1474
(1105) Métodos de Pruebas Inmunológicas-
Resonancia de Plasmón Superficial ........ 1487
(1106) Ensayos de lnmunogenic1dad-Diseño y
Validación de lnmunoensayos para Detectar
Anticuerpos Antifármacos ............... 1504
(1106.1) Ensayos de lnmunogenicidad-Diseño y
Validacion de Ensayos para Detectar
Anticuerpos Neutralizantes Antifármacos .... 1522
(1111) Examen Microbiológico de Productos No
Estériles: Criterios de Aceptación para
Preparaciones Farmacéuticas y Sustancias
de Uso Farmacéutico .................. 1544
(1112) Determinación de Actividad de Agua en
Productos Farmacéuticos No Estériles ...... 1546
(1113) Caracterización, Identificación y
Tipificación de Cepas Microbianas ......... 1548
(1115) Control de Biocarga de Fármacos y Medi-
camentos No Estérifes ................. 1553
(1116) Control Microbiológico y Monitoreo de
Ambientes de Procesamiento Aséptico ...... 1561
(1117) Óptimas Prácticas de Laboratorio
Microbiológico ...................... 1575
72 Guía para los Capítulos Generales
(1118) Dispositivos de Monitoreo-Tiempo,
Temperatura y Humedad ............... 1582
(1119) Espectroscopía en el Infrarrojo Cercano .... 1588
n 120) Espectroscopía Raman ................ 1595
(1121) Nomenclatura ..... , ................. 1604
(1125) Técnicas Basadas en Acidos Nucleicos-
Generalidades ...... , ................. 1607
(1126) Técnicas Basadas en Acidos Nucleicos-
Extracción, Detección y, Secuenciación ...... 1612
(1127) Técnicas Basadas en Acidos Nucleicos-
Amplificación ....... ,· ................ 1624
(1128) Tecnicas Basadas en Acidos Nucleicos-
Micromatrices ...... ,· ................ 1635
(1129) Técnicas Basadas en Acidos Nucleicos-
Genotipificación ..... ,· ................ 1642
(1130) Técnicas Basadas en Acidos Nucl~icos-
Enfoques para Detectar Trazas de Acidos
Nucleicos (Análisis de ADN Residual) ..... 1647
(11 32) Medición de Proteína Residual
de Células Huésped en Productos
Biofarmacéuticos ..................... 1651
(11 36) Envasado y Reenvasado-Envases
Unitarios ........................... 1677
(1151) Formas Farmacéuticas ................ 1689
(1152) Medicamentos Veterinarios Usados en
Alimentos para Animales ............... 1 71 7
(1160) Cálculos en la Práctica Farmacéutica ...... 1 71 9
(1163) Garantía de Calidad en la Preparación
Magistral ........................... 1743
(1171) Análisis por Solubilidad de Fases ......... 1751
(1174) Fluidez de Polvos .................... 1754
(1176) Balanzas para Prescripciones y Aparatos
Volumétricos Usados en Preparaciones
Magistrales ......................... 1759
(1177) Buenas Prácticas de Envasado ........... 1765
(11 78) Buenas Prácticas de Reenvasado ......... 1769
(1180) Plasma Humano .................... 1771
(1181) Microscopía Electrónica de Barrido ....... 1797
(1184) Pruebas de Sensibilización ............. 1807
(1191) Consideraciones sobre Estabilidad en la
Práctica de Dispensación ............... 1819
(1195) Guía sobre Cambios Significativos en
Excipientes Farmacéuticos a Granel ........ 1824
(1197) Buenas Prácticas de Distribución para
Excipientes Farmacéuticos a Granel ........ 1837
(1207) Evaluación de la lnte9r_idad del
Envase-Productos Estenles .............. 1862
(1207.1) Pruebas de Integridad de Envases
en el Ciclo de Vida del Producto-
Selección y Validación
de Métodos de Prueba ................. 1870
(1207.2) Tecnologías para Pruebas de Fuga
en la Integridad de Envases ............. 1885
(1207.3) Tecnologías para Pruebas de Calidad
de Sellado de Envases . . . . . . . . . . . . . . . . . 1904
(1208) Pruebas de Esterilidad-Validación de Sistemas
Aisladores .......................... 1907
(1211) Esterilización y Garantía de Esterilidad de
Artículos Farmacopeicos ................ 1913
(1216) Friabilidad de las Tabletas .............. 1918
(1217) Fuerza de Ruptura de las Tabletas ........ 1919
(1222) Productos Farmacéuticos con Esterilización
Terminal-Liberación Paramétrica ......... 1923
(1223) Validación de Métodos Microbiológicos
Alternativos ......................... 1927
(1223.1) Validación de Métodos Alternativos para
Valoraciones Microbiológicas de
Antibióticos ......................... 1942
(1224) Transferencia de Procedimientos Analíticos .. 1950
(1225) Validación de Procedimientos Farma-
copeicos ........................... 1952
(1226) Verificación de Procedimientos Farma-
copeicos ........................... 1958
(1227) Validación de Recuperación Microbiana en
Artículos Farmacopeicos ................ 1960
USP 40
(1228) Despirogenización ................... 1964
(1228.1) Despirogenización por Calor Seco ...... 1969
(1228.3) Despirogenización por Filtración ....... 1974
(1228.5) Indicadores de Endotoxinas para
Despirogenización .................... 1978
(1229) Esterilización de Artículos Farmacopeicos ... 1983
(1229 .1) Esterilización con Vapor de Agua por
Contacto Directo ..................... 1988
(1229.2) Esterilización con Calor Húmedo de
Líquidos Acuosos ..................... 1992
(1229.3) Monitoreo de la Biocarga ............ 1997
(1229.4) Esterilización de Líquidos por Filtración ... 2001
(1229 .5) Indicadores Biológicos para
Esterilización ........................ 2009
(1229.6) Esterilización en Fase Líquida .......... 2012
(1229 .7) Esterilización por Gases .............. 201 5
(1229.8) Esterilización por Calor Seco .......... 2018
(1229.9) Integradores e Indicadores Fisicoquímicos
para Esterilización .................... 2020
(1229.1 O) Esterilización por Radiación .......... 2021
(1229 .11) Esterilización en Fase de Vapor ........ 2025
(1229.12) Nuevos Métodos de Esterilización ...... 2027
(1229 .1 3) Esterilización en el Sitio ............. 2028
(1230) Agua para Uso en Hemodiálisis .......... 2030
(1231) Agua para Uso Farmacéutico ........... 2032
(1234) Vacunas para Uso Humano-Vacunas
de Polisacaridos y Glicoconjugados ........ 2073
(1235) Vacunas para Uso Humano-
Consideraciones Generales .............. 2091
(1237) Métodos de Pruebas Virológicas ......... 211 O
(1238) Vacunas para Uso Humano-Vacunas
Bacterianas ......................... 2133
(1240) Análisis de Virus en Plasma Humano para
Fabricación Posterior .................. 2148
(1241) Interacciones Agua-Sólido en Sistemas
Farmacéuticos ....................... 2159
(1251) Pesada en una Balanza Analítica ......... 2164
(1265) Información Escrita de los Medicamentos
Recetados-Guías .................... 21 70
(1285) Preparación de Muestras Biológicas para
Análisis Histológico e lnmunohisto-
químico ........................... 2172
(1285.1) Tinción con Hematoxilina y Eosina de Cortes
de Tejidos para Examen Microscópico ...... 2177
(1 601) Productos para Nebulización-Pruebas de
Caracterización ...................... 2180
(1602) Espaciadores y Cámaras Espaciadoras
con Válvulas Que Se Usan con Aerosoles
para Inhalación-Pruebas
de Caracterización .................... 2184
(1644) Teoría y Práctica de Mediciones de
Conductividad Eléctrica de Soluciones ...... 2198
(1660) Envases de Vidrio-Evaluación de la
Durabilidad de la Superficie Interna ........ 2205
(1661) Evaluación de Sistemas de Envases Plásticos
y sus Materiales de Construcción
con Respecto a su Impacto sobre la
Seguridad del Usuario ................. 2211
(1663) Evaluación de Sustancias Extraíbles
Relacionadas con Envases Farmacéuticos y
Sistemas de Administración ............. 2219
(1664) Evaluación de Sustancias Lixiviables en
Medicamentos Relacionadas con Envases
Farmacéuticos y Sistemas de
Administración ...................... 2236
(1664.1) Medicamentos Nasales y para Inhalación
Oral .............................. 2250
(1 724) Medicamentos Semisólidos-Pruebas de
Desempeño ......................... 2258
(1730) Espectroquímica de Plasma-Teoría y
Práctica ............................ 2272
(1 735) Espectrometría de Fluorescencia de
Rayos X-Teoría y Práctica .............. 2279
(1 736) Aplicaciones de la Espectrometría de
Masas ............................. 2299
USP 40
(1761) Aplicaciones de la Espectroscopía de
Resonancia Magnética Nuclear ........... 2322
(1771) Productos Oftálmicos-Pruebas de
Desempeño . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2344
(1 782) Espectroscopía de Dicroísmo Circular
Vibracional-Teoría y Práctica ............ 2345
(1 787) Medición de Partículas Subvisibles en
Inyectables de Proteínas Terapéuticas ...... 2360
(1 788) Métodos para la Determinación de Partículas
en Inyectables y Soluciones Oftálmicas ..... 2375
(1821) Radioactividad-Teoría y Práctica ........ 2390
(1823) Fármacos para Tomografía por Emisión
de Positrones-Información ............. 2405
(1852) Espectroscopía de Absorción Atómica-Teoría
(1853) :;~~~i~s~~pí~ ·d·e· Fl~~r·e~~e·n~Ía~.¡-~;ria· ... 241 7
(1854) :;~~~ii~s~~pí~ ·e~· ~l ·l~fr~r~~j~. M~di~~T~o.rÍa 2427
(1857) :;~~~ii~s~~pí~ Últr~~i~l-et~-Vi~i·b·I~~T~~rfa· .. 2437
y Práctica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2447
(1911) Reometría . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2457
Guía para los Capítulos Generales 73
SUPLEMENTOS DIETÉTICOS
(2021) Pruebas de Recuento Microbiano-
Suplementos Nutricionales y Dietéticos ..... 2464
(2022) Procedimientos Microbiológicos para
Comprobar la Ausencia de Microorganismos
Específicos-Suplementos Nutricionales
(2023) fti~~~t~~~sMi~~~bi~IÓgÍc~~ ·d~-1~~ ......... 2469
Suplementos Nutricionales y Dietéticos
No Estériles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2476
(2030) Información Complementaria para
Artículos de Origen Botánico ............ 2480
(2040) Desintegración y Disolución de
Suplementos Dietéticos ................ 2491
(2091) Variación de Peso de Suplementos
Dietéticos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2499
(2232) Contaminantes Elementales en
Suplementos Dietéticos ................ 2500
(2250) Detección de Suplementos Dietéticos
Irradiados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2504
(2251) Sondeo de Fármacos y Análogos de
Fármacos No Declarados ............... 2507
(2750) Prácticas de Fabricación para
Suplementos Dietéticos ................ 2525
USP 40 Requisitos Generales/ (1) Medicamentos Inyectables 75

Capítulos Generales
Pruebas y Valoraciones Generales

Requisitos Generales para Pruebas y Valoraciones

(1) MEDICAMENTOS INYECTABLES Y EN IMPLANTES

(PARENTERALES)-PRUEBAS DE CALIDAD DEL PRODUCTO

Cambio en la redacción:
• 1NTRODUCCIÓN
PRUEBAS COMUNES DE CALIDAD DEL PRODUCTQ PARA FORMAS FARMAC~UTICASP.AflENTERALES ..
Pruebas Universales
Pruebas Específicas . .· . .. . . . . .. . ··
PRUEBAS DE CALIDAD DEL PRODUCTO PARA FORMAS FARMACÉUTICAS PARENTEIW.ES ESJ>ECÍHCAS
Soluciones
Polvos Estériles para Soluciones
Suspensiones
Liposomas
Polvos Estériles para Suspensiones
Emulsiones
Implantes
Estents Liberadores de Fármacos. (BR ol-may-zo16)

Cambio en la redacción:

INTRODUCCIÓN
Los medicamentos parenterales incluyen inyectables e implantes que se inyectan a través de la piel u otro tejido de barrera
externo, o que se implantan dentro del cuerpo para permitir la administración directa de fármacos activos en los vasos sanguí-
neos, órganos, tejidos o lesiones. Los inyectables se pueden presentar como formas farmacéuticas de liberación inmediata o
prolongada. Los medicamentos parenterales en implantes son formas farmacéuticas de acción prolongada que proveen una
liberación continua de fármacos activos durante periodos que van de meses a años. Para la liberación sistémica, se pueden
implantar por vía subcutánea, mientras que para la administración local, se pueden implantar en una parte específica del cuer-
po. Los medicamentos parenterales se pueden administrar por vía intravenosa, intraventricular, intraarterial, intraarticular, sub-
cutánea, intramuscular, intratecal, intracisternal e intraocular.
Las formas farmacéuticas parenterales se pueden presentar como soluciones, suspensiones, emulsiones, polvos estériles para
soluciones y suspensiones (incluyendo liposomas), implantes (incluyendo micropartículas) y productos que consten de un fár-
maco y un dispositivo, tales como los estents liberadores de fármacos. •Las definiciones y descripciones de estas formas farma-
céuticas, así como información resumida sobre su composición y procesos de fabricación, se eneúentran en Formas Farmacéuti-
cas (1151 ). [NoTA-Tódas las referencias a capítulos superiores a 1000 son únicamente para propósitos informativos y para uso
como recursos útiles. Estos capítulos nos son obligatorios .a menos que su aplicacion· se. exija explícitamente.]• (BROl·m•y-2016)
• • (B« oi-may-zo 16J Este capítulo se divide en •tres• (BROJ'.may:2016) secciones principales: (1) pruebas universales de calidad del pro-
ducto que son aplicables a formas farmacéuticas parenterales; (2) pruebas específicas de calidad del producto que deben te-
nerse en cuenta además de las Pruebas Universales; •y• (BROl-may, 2016i (3) pruebas de calidad del producto para formas farma-
céuticas específicas donde se citan•. lBROl-may-2016¡ las pruebas aplicables (universales y específicas) para la forma farmacéutica
específica.
76 (1 > Medicamentos Inyectables/ Requisitos Generales USP 40

•Este capítulo es aplicable, en su totalidad() en parte, cuando se haga referencia al mismo en una monografía de un medi-
camento (ver Advertencias Generales, 3. ro
A,plícabilidad de /qs Norm¡:¡s),. (BR Ol·ll1<W·20}6)
Las definiciones farmacopeicas de preparaciones estériles para uso parenteral pueden no ser aplicables a algunos productos
biológicos debido a su naturaleza especial y a requisitos de patente o licencia (ver Productos Biológicos (1041 )). No obstante,
algunos medicamentos biológicos terminados cuyas monografías contienen el término "Inyección" en el título deben cumplir
con los requisitos del capítulo (1) o las secciones del mismo que se especifiquen en la monografía .
• • (BR 01 -may-2016)

Cambio en la redacción:

PRUEBAS COMUNES DE CALIDAD DEL PRODUCTO PARA FORMAS FARMACÉUTICAS

PARENTERALES

Pruebas Universales

A continuación se citan las pruebas universales que son aplicables a las formas farmacéuticas parenterales.
• • (BR 01-may-2016)

IDENTIFICACIÓN

Las pruebas de identificación se tratan en Advertencias y Requisitos Generales 5.40.

• • (BR 01-may-2016)

VALORACIÓN

Se debe usar una prueba específica e indicadora de estabilidad para determinar la concentración (contenido) del medica-
mento. Para los casos en los que se justifique el uso de una valoración no específica, se deben usar otros procedimientos analí-
ticos complementarios para lograr la especificidad. Se debe usar un procedimiento específico cuando exista evidencia de la
interferencia de los excipientes con la valoración no específica.

IMPUREZAS

Las pruebas para Impurezas se tratan en Advertencias y Requisitos Generales 5.60.

•e (BR 01-rnay-2016)

MATERIA EXTRAÑA Y PARTÍCULAS

Los artículos destinados para administración parenteral deben prepararse de una manera diseñada para excluir partículas
conforme a lo definido en Partículas Subvisibles en Inyectables de Proteínas Terapéuticas (787), Partículas en Inyectables (788) •o
• caaoi-may- 2016) Partículas en Soluciones Oftálmicas (789), así como para excluir otras partículas según resulte apropiado para la
forma farmacéutica. Se debe inspeccionar cada uno de los envases finales de todas las preparaciones parenterales en la medida
de lo posible para detectar la presencia de materia extraña y partículas observables (en lo sucesivo denominadas partículas visi-
bles) en su contenido. El proceso de inspección debe estar diseñado y calificado para asegurar que todos los lotes de todas las
preparaciones parenterales estén esencialmente exentos de partículas visibles, conforme a lo definido en Partículas Visibles en
Inyectables (790). La calificación del proceso de inspección debe realizarse en referencia a las partículas en el rango visible y a
aquellas partículas que puedan surgir del proceso de fabricación o llenado. Debe desecharse todo envase cuyo contenido pre-
sente indicios de partículas visibles. La inspección para detectar partículas visibles puede realizarse al momento de examinar
otros defectos•• {BRoi-may-2016}, tales como envases o sellos rotos o defectuosos, o bien cuando se caracteriza el aspecto de un
producto liofilizado.
Cuando la naturaleza del contenido o el sistema envase-cierre del envase permita solamente una inspección limitada del
contenido total, la inspección del 100% de un lote debe complementarse con la inspección de contenidos reconstituidos (p.
ej., liofilizados) o contenidos extraídos (p. ej., de un envase ámbar oscuro) de una muestra de envases del lote.
Las inyecciones de gran volumen para infusiones monodosis, las inyecciones de pequeño volumen y los envases a granel
para farmacias (EGF) están sujetos a los procedimientos microscópicos o de obstrucción de luz y a los límites de partículas sub-
visibles especificados en el capítulo (788), a menos que se especifique algo diferente en el capítulo o la monografía individual.
Un artículo envasado como inyección, ya sea de gran volumen o de pequeño volumen, cumple con los requisitos establecidos
para inyecciones de pequeño volumen cuando la etiqueta del envase indica que contiene 100 mL o menos. Cumple con los
requisitos establecidos para inyecciones de gran volumen para infusiones monodosis cuando la etiqueta del envase indica que
contiene más de 100 ml.
USP 40 Requisitos Generales / (1) Medicamentos Inyectables 77

ESTERILIDAD

La esterilidad de todos los medicamentos destinados para administración parenteral debe confirmarse usando los métodos
descritos en Pruebas de Esterilidad (71) o por un método alternativo aprobado.

ENDOTOXINAS BACTERIANAS

Todos los artículos destinados para administración parenteral deben prepararse de forma tal que se limiten las endotoxinas
bacterianas conforme a lo definido en Prueba de Endotoxinas Bacterianas (85) o Prueba de Pirógenos (151 ).

CONTENIDO DEL ENVASE

Se debe determinar el contenido del envase cuando resulte apropiado (ver Contenido en Envases para Inyectables (697)).

•SISTEMAS DLENVASESe <s!\01-may-2016)

El sistema de envase no debe interactuar física o químicamente con la preparación de forma que se altere su contenido,
calidad o pureza más allá de los requisitos oficiales o establecidos. El sistema de envase debe cumplir con los requisitos de
Tapones Elastoméricos para Inyectables (381 ), Requisitos de Envasado y Almacenamiento (659), Envases-Vidrio (660), Sistemas de
Envases Plásticos y sus Materiales de Construcción (661 ), Materiales Plásticos de Construcción (661 .1 ) y Sistemas de Envases Plásti-
cos para Uso Farmacéutico (661.2). Se puede encontrar información adicional con respecto al análisis de sistemas de envases en
Evaluación de Sustancias Extraíbles Relacionadas con Envases Farmacéuticos y Sistemas de Administración (1663) y Evaluación de
Sustancias Lixiviables en Medicamentos Relacionadas con Envases Farmacéuticos y Sistemas de Administración (1664).

INTEGRIDAD DEL ENVASE-CIERRE

El sistema de envase debe cerrarse o sellarse de modo tal que prevenga la contaminación o la pérdida de contenido. La vali-
dación de la integridad del envase debe demostrar que no existe contaminación por penetración de microorganismos o la ad-
quisición o pérdida de cualquier parámetro físico o químico que se considere necesario para proteger el producto (ver •Eva-
luación de la Integridad del Envase'C'-"Productos Estériles (1207), Pruf?./}as de Integridad de Envases en f?./ Ciclo de Vida del Producto--
Selección y Valídacíónde Métodos de Prueba (1207.1 ), Tecnologías para Pruebas de Fuga en fa Integridad de Envases (1207.2) y
Tecnologíaspara Pruebas de Calidad de Sellado de Envase.t{l 207.3)) .• (sRol-may-w161

ETIQUETADO

Todos los artículos destinados para administración parenteral deben cumplir con los requisitos de etiquetado definidos en el
capítulo Etiquetado (7).

Pruebas Específicas

Además de las Pruebas Universales citadas anteriormente, las siguientes pruebas específicas pueden ser •necesarias depen-
diendo de la forma farmacéutica.• (BR oi-may-2016)
• • (BR 01-may-2016)

UNIFORMIDAD DE UNIDADES DE DOSIFICACIÓN

Esta prueba es aplicable a medicamentos parenterales y formas farmacéuticas envasadas en envases unitarios. Incluye tanto
la masa de la forma farmacéutica como el contenido de la sustancia activa en la misma (ver Uniformidad de Unidades de Dosifi-
cación (905)).

VEHÍCULOS Y SUSTANCIAS AGREGADAS

Existen otros vehículos, acuosos y no acuosos, aparte de los tratados a continuación. Todos los vehículos deben ser adecua-
dos para el uso que se les pretende dar y no deben impactar la calidad del medicamento.
Vehículos acuosos: Los vehículos acuosos deben cumplir con los requisitos del capítulo (151) o del capítulo (85), según se
especifique en la monografía. El vehículo de uso más general es el agua para inyección. Se puede agregar cloruro de sodio o
dextrosa para isotonizar la solución resultante; y la inyección de cloruro de sodio, o la solución de Ringer inyectable pueden
reemplazar parcial o totalmente al agua para inyección.
78 (1) Medicamentos Inyectables / Requisitos Generales USP 40

Vehículos no acuosos: Los aceites fijos son una clase de Vehículos no acuosos. Los aceites fijos empleados como vehículos son
de origen vegetal e inodoros. Cumplen con los requisitos de la prueba de Parafina Sólida en la monografía de Aceite Mineral
con el baño de enfriamiento mantenido a 1Oº.
•Los vehículos no acuosos deben• {BROl-m•y-2016) también cumplir con los requisitos de las siguientes pruebas:
• Grasas y Aceites Fijos (401 ), Índice de Saponificación: Entre 185 y 200
• Grasas y Aceites Fijos (401 ), Índice de Yodo: Entre 79 y 141
• Grasas y Aceites Fijos (401 ), Materia lnsaponificable: No más de 1,5%
• Grasas y Aceites Fijos (401 ), Índice de Acidez: No más de 0,2
• Grasas y Aceites Fijos (401 ), Índice de Peróxido: No más de 5,0
• Determinación de Agua (921 ), Método le: No más de O, 1%
• Límite de Cobre, Hierro, Plomo y Níquel: [NOTA-La prueba para níquel no se requiere si el aceite no ha sido sometido a
hidrogenación, o si no se ha usado un catalizador de níquel durante el procesamiento.] Proceder según se indica en el
capítulo Grasas y Aceites Fijos (401 ), Trazas de Metales o Impurezas Elementales-Procedimientos (233). Cumplen con los
requisitos en Impurezas Elementales-Límites (232).
Los monoglicéridos o diglicéridos sintéticos de ácidos grasos se pueden emplear como vehículos, siempre que sean líquidos, se
mantengan transparentes cuando se enfrían a 1Oº y presenten un Índice de Yodo no mayor de 140.
Sustancias agregadas: Se pueden agregar sustancias adecuadas a preparaciones para incrementar la estabilidad o la utilidad,
a menos que se prohíban en la monografía. No se pueden agregar colorantes a una preparación con el único propósito de
conferir color a la preparación terminada (ver Advertencias y Requisitos Generales 5.20 y Pruebas de Eficacia Antimicrobiana (51 )).
Debe tenerse especial cuidado en la elección y uso de sustancias agregadas en preparaciones con volúmenes superiores a 5
mL. Los siguientes límites prevalecen a menos que se indique de otro modo:
• Mercurio y agentes catiónicos tensoactivos: No más de 0,01 %
• Clorobutanol, creso!, fenol y sustancias similares: No más de 0,5%
• Dióxido de azufre o una cantidad equivalente de sulfito, bisulfito o metabisulfito de potasio o sodio: No más de 0,2%

CONSERVANTES ANTIMICROBIANOS

Se deben agregar agentes antimicrobianos a las preparaciones destinadas para inyección en envases multidosis, a menos
que prevalezca una de las siguientes condiciones: (1) existen instrucciones diferentes en la monografía individual; (2) la sustan-
cia contiene un radio isótopo con una vida media física menor que 24 horas; o (3) los ingredientes activos son antimicrobia-
nos. Tales sustancias deben cumplir con los requisitos del capítulo (51) y de Agentes Antimicrobianos-Contenido (341 ).

CONTENIDO DE AGUA

El contenido de agua en productos liofilizados debe determinarse siempre que sea apropiado (ver el capítulo (921 )).
e e (BR 01-m•y-2016)

CONTENIDO DE ALUMINIO

•ver Etiquetado (7), Aluminio en Inyectables de Gran Volumen (IGV), Inyectables de Pequeño Volumen (f PV) y Envases a Granel
para Farmacias (EGF) Usados en Terapia de Nutrici6n Pdrenteral Total (NPT) para información relacionada con los requisitos espe-
cíficos de etiquetado relacionados con el contenído de alllminio; • (B« 01 .may-2016¡

TOTALIDAD Y TRANSPARENCIA DE SOLUCIONES

Las siguientes pruebas se llevan a cabo para demostrar la aptitud de las soluciones reconstituidas que se preparan antes de
su administración. Reconstituir la solución según se indica en el etiquetado suministrado por el fabricante:
• El sólido se disuelve completamente, sin dejar ninguna materia sin disolver.
• La solución reconstituida no es significativamente menos transparente que un volumen igual de diluyente o de agua puri-
ficada contenida en un recipiente similar y examinada de modo similar. Las soluciones de proteína pueden presentar una
opalescencia inherente.
La solución reconstituida está exenta de partículas que se puedan observar durante la inspección visual (ver el capítulo
(790)).
USP 40 Requisitos Generales/ (1) Medicamentos Inyectables 79

PRUEBAS DE CALIDAD DEL PRODUCTO PARA FORMAS FARMACÉUTICAS PARENTERALES

ESPECÍFICAS

A continuación se citan las pruebas de calidad del producto para las formas farmacéuticas específicas. Los capítulos específi-
cos referidos para la prueba pueden encontrarse en las secciones Pruebas Universales y Pruebas Específicas. •• (Bíl~t·m~y-ldi~)

Soluciones

Una solución es una forma farmacéutica líquida transparente y homogénea que contiene una o más sustancias químicas (p.
ej., fármacos o excipientes) disueltas en un disolvente (acuoso o no acuoso) o una mezcla de disolventes miscibles entre sí. Las
soluciones destinadas para administración parenteral (p. ej., mediante inyección o para irrigación) deben ser estériles y bio-
compatibles con el sitio de administración al que están destinadas. Esto incluye considerar factores tales como tonicidad, pH,
pirogenicidad, partículas extrañas y compatibilidad fisicoquímica, entre otros.
A menos que se justifique de otro modo, se requieren las siguientes pruebas para soluciones para inyección:
• Pruebas Universales
• Pruebas Específicas
•4 'c~~ii1~h¡~;l~ó1!li
- Conservantes Antimicrobianos

Polvos Estériles para Soluciones

Los polvos estériles para solución (también referidos como polvos estériles para inyección) están formados por fármacos y
otros componentes tales como ingredientes para formulaciones secas para asegurar la estabilidad química y física de la presen-
tación dentro de un envase para uso final. Se puede proveer un diluyente estéril acompañante o compartimentos de diluyente
para facilitar la reconstitución al volumen final deseado.
El artículo estéril para inyección se presenta en diversas formas: polvo liofilizado destinado para solución final, sólidos pulveri-
zados destinados para solución final o sólidos secos que al reconstituirlos forman líquidos viscosos.
La descripción debe incluir una sección que describa la facilidad de dispersión y la reconstitución. La forma farmacéutica es
un sólido homogéneo que se reconstituye fácilmente en la forma final con el diluyente especificado, y la dispersión se comple-
ta agitando suavemente.
A menos que se justifique de otro modo, las siguientes pruebas se aplican a polvos estériles para inyección:
• Pruebas Universales
••• (~R Olfm~y"¡Q!!i)
Lo siguiente se aplica a soluciones reconstituidas:
• Capítulo (905): Para asegurar la uniformidad de las unidades de dosificación, cada unidad en una partida debe contener
una cantidad de fármaco cercana a la cantidad declarada dentro de un intervalo estrecho. Las unidades de dosificación se
definen como formas farmacéuticas que contienen una sola dosis o una parte de una dosis de fármaco en cada unidad.
Para formas farmacéuticas líquidas, los analistas deben realizar la valoración usando una cantidad de material reconstitui-
do bien mezclado, retirado de un envase individual en condiciones normales de uso, expresar los resultados como dosis
entregada y calcular el valor de aceptación.
••t..(l. sig(Jfen.ie.s.e• aplii:;a •·a ul'l ~g!ornetªº·º ~eco:. <s~ ot-m~y-2016)
• Pérdida por Secado (731 ): El procedimiento establecido en este capítulo determina la cantidad de materia volátil de cual-
quier tipo expelida en las condiciones especificadas.
• Capítulo (921 ): El contenido de agua o de disolvente puede tener efectos importantes sobre la reconstitución y la estabili-
dad. Para los artículos que requieren un control del contenido de agua o de disolvente, los analistas deben llevar a cabo
uno de los '• (l\RaHnay'zii16l métodos 'descritOs en.el capftul()~9~1)• (sRai·may,2016i o reemplazarlo por uno que resulte ade-
cuado.
• Aspecto: Los analistas deben evaluar el nivel y la variación de la unidad para los siguientes parámetros:
- Color del Aglomerado Seco: Varía dentro de los parámetros esperados.
- Textura y Homogeneidad del Aglomerado Seco: Varía dentro de los parámetros esperados.
- Presencia de Material Extraño: Se deben rechazar todas las unidades con material extraño.
• . (BRCl1·mllycÍ016)

Suspensiones

Las suspensiones parenterales son formas farmacéuticas líquidas que contienen partículas sólidas en un estado de dispersión
uniforme. Las suspensiones para administración parenteral deben ser estériles y compatibles con el sitio de administración. Se
debe tomar en cuenta el pH y la pirogenicidad, además de que se deben identificar límites apropiados. Las evaluaciones de
80 (1) Medicamentos Inyectables / Requisitos Generales USP 40

estabilidad física de las suspensiones parenterales deben incluir evaluaciones para confirmar que el intervalo del tamaño de
partícula de la materia suspendida no cambie con el tiempo y para confirmar que los sólidos en la preparación se pueden re-
suspender con facilidad para obtener una preparación uniforme.
• • <BR oi-may.2016iSe requieren las siguientes pruebas para suspensiones inyectables, a menos que se justifique algo diferente:
• Pruebas Universales
• Pruebas Específicas
e e (BR Ol -may-2016)
- Uniformidad de Unidades de Dosificación
- Conservantes Antimicrobianos

Liposomas

Los liposomas son medicamentos singulares con propiedades únicas que pueden estar en forma de solución o suspensión.
Los liposomas son dispersiones acuosas de lípidos anfifílicos y tienen baja solubilidad en agua. Se organizan como una lámina
de dos capas que encierra un compartimiento acuoso interno y se conocen como vesículas de bicapa lipídica. Los liposomas
pueden tener una sola bicapa lipídica (vesícula unilaminar) o pueden tener una estructura multicapa parecida a una cebolla
(vesícula multilaminar). Los lípidos anfifílicos comprenden una cabeza compuesta por un grupo hidratado en la interfase de
agua de la bicapa unido a un grupo hidrófobo que forma el interior de la bicapa mediante la asociación con el grupo hidrófo-
bo de lípidos de la lámina opuesta de la bicapa. Las propiedades físicas del liposoma y su bicapa pueden variar ampliamente
dependiendo de la composición lipídica, la composición acuosa y la temperatura con respecto a los puntos de transición de
fase de los componentes acilo. Debido al compartimiento acuoso central, una prueba simple para determinar la presencia de
liposomas en una dispersión de lípidos sirve para determinar la presencia de una fase acuosa atrapada.
Un medicamento liposomal consta del fármaco, los componentes del liposoma y otros ingredientes inactivos pero críticos
tales como una dispersión acuosa, a menos que el contenido sea un producto liofilizado.
A menos que se justifique de otro modo, se requieren las siguientes pruebas para liposomas:
• Pruebas Universales
• Pruebas Específicas
- •Distribución del Tamaño de Glóbulos en Emulsiones Inyectables de Lípidos (729)• ceRo1-may-2016¡

Polvos Estériles para Suspensiones

Los polvos estériles para suspensiones están formados por fármacos y otros componentes tales como ingredientes para for-
mulaciones secas para asegurar la estabilidad química y física de la presentación dentro de un envase para uso final. Se puede
proveer un diluyente estéril acompañante o compartimentos de diluyente para facilitar la reconstitución al volumen final de-
seado.
El artículo estéril inyectable se puede presentar de diversas formas: polvo liofilizado destinado a suspensión final, sólidos pul-
verizados destinados a suspensión final o micropartículas que mantienen su integridad y que se administran en forma de sus-
pensión estéril. La descripción debe incluir una sección que describa la facilidad de dispersión y la reconstitución. La forma
farmacéutica es un sólido homogéneo que se reconstituye fácilmente en la forma final con el diluyente especificado, y la dis-
persión se completa agitando suavemente.
A menos que se justifique de otro modo, las siguientes pruebas se aplican a polvos estériles para inyección:
• Pruebas Universa/es
•e (BR 01-may-2016)
Micropartículas: Algunas micropartículas se proveen como polvos estériles que deben reconstituirse en forma de suspensión
antes de la inyección. La mayoría de las preparaciones de micropartículas deben reconstituirse en forma de suspensión inyecta-
ble. Para los requisitos de las pruebas de calidad, consultar la sección Implantes.

Emulsiones

Las emulsiones para formas farmacéuticas parenterales son preparaciones líquidas de fármacos disueltos o dispersados en un
medio de emulsión adecuado. Las emulsiones de aceite en agua o de agua en aceite por lo regular atrapan al fármaco.
Las emulsiones por lo general son formas farmacéuticas líquidas homogéneas, turbias y de color blanco que contienen una o
más sustancias químicas (p. ej., fármacos y excipientes) disueltas en un disolvente (acuoso o no acuoso) o una mezcla de disol-
ventes miscibles entre sí. Las emulsiones destinadas para administración intravenosa deben ser estériles y compatibles con el
sitio de administración al que está destinado.
A menos que se justifique de otro modo, se requieren las siguientes pruebas para emulsiones inyectables:
• Pruebas Universa/es
• Pruebas Específicas
- •Capítulo (729)e (BR01-may-2010)
USP 40 Requisitos Generales/ (1) Medicamentos Inyectables 81

Implantes

Los implantes para liberación prolongada están compuestos por una matriz de fármaco y un excipiente polimérico que pue-
de o no tener una membrana externa de control de velocidad. El excipiente polimérico debe ser biocompatible pero puede o
no ser biorreabsorbible. Algunos implantes se fabrican con metal de grado médico con una bomba osmótica en su interior que
produce la liberación prolongada del fármaco. Los implantes deben ser estériles y, por lo general, en forma de cilindro, aunque
también se usan otras formas. Los disolventes usados para disolver la formulación pueden conducir a la esterilización, por lo
que el método de prueba de esterilidad interno debe demostrar que la preparación de la muestra no provoca la esterilización
de la muestra de prueba.
Los implantes en forma de cilindro para administración sistémica por lo general se proveen en un dispositivo de inserción
para administración subcutánea o local, tal como administración ocular local. Asimismo, los implantes se pueden implantar
quirúrgicamente para administración local, p. ej., administración ocular.
A menos que se justifique de otro modo, se requieren las siguientes pruebas para implantes:
• Pruebas Universales
• Pruebas Específicas
- Uniformidad de Unidades de Dosificación
•c. {BR 01.may-2016)

Geles in situ

Los geles estériles in situ son preparaciones líquidas que están destinadas para inyectarse en sitios terapéuticos específicos.
Por lo regular, están compuestos por polímeros en disolventes orgánicos y, al momento de su inyección, los disolventes emi-
gran del sitio, dejando una masa gelificada. Las preparaciones se pueden inyectar tal como se encuentran, al momento de su
reconstitución, a partir de la formación in situ, o a partir de catálisis iniciada químicamente que resulta en la forma final.
A menos que se justifique de otro modo, se requieren las siguientes pruebas para geles in situ:
• Pruebas Universales
• Pruebas Específicas
• • (BR Ol-may-2016)
- Conservantes Antimicrobianos
• • (BR Ol-may-2016)

Micropartículas

Micropartículas reabsorbibles inyectables para liberación prolongada con un diámetro generalmente de 20 a 100 µm. Están
compuestas por fármacos incluidos dentro de un excipiente polimérico biocompatible y biorreabsorbible, p. ej., excipientes de
poliéster. Las micropartículas se proveen como polvos estériles en un vial o jeringa.
justo antes de su administración intramuscular o subcutánea, el polvo de micropartículas debe suspenderse en un vehículo
acuoso para inyección (diluyente). El vehículo para inyección por lo regular está formado por agua para inyección, agente ten-
soactivo y mejorador de viscosidad, y puede contener un compuesto que ajuste la osmolalidad, p. ej., un azúcar con o sin un
compuesto que controle el pH, p. ej., un ácido. El vehículo para inyección debe ser estéril y debe analizarse de acuerdo a los
requisitos para soluciones destinadas para administración parenteral.
A menos que se justifique de otro modo, se requieren las siguientes pruebas para micropartículas para inyección:
• Pruebas Universales
• Pruebas Específicas
- Uniformidad de Unidades de Dosificación
- Contenido de Agua
• • (BR 01-may-2016)

Estents Liberadores de Fármacos

Los estents liberadores de fármacos son metales diminutos o estructuras de polímeros que se usan para mantener las arterias
abiertas después de una intervención médica; el fármaco se incorpora en el interior o sobre la plataforma del estent. Los es-
tents liberadores de fármacos por lo regular tienen dos componentes de análisis: (1) pruebas funcionales que por lo general
son métodos de la American Society for Testing and Materials (Sociedad Estadounidense para Ensayos y Materiales o ASTM)
que están fuera del alcance de este capítulo y (2) pruebas analíticas.
A menos que se justifique de otro modo, se requieren las siguientes pruebas para estents liberadores de fármacos:
• Pruebas Universales
• Pruebas Específicas
- Uniformidad de Unidades de Dosificación. El contenido de la sustancia activa en la forma farmacéutica es aplicable para
estents liberadores de fármacos envasados en envases unitarios. La prueba se puede realizar mediante uniformidad
82 (1) Medicamentos Inyectables J Requisitos Generales USP 40

de contenido o variación de peso (ver el capítulo (905)). Siempre que se justifique adecuadamente, el número de
estents requerido para esta prueba puede ser menor que el recomendado en el capítulo (905).
- •Pruebas de Reactividad Biológica, Jn Ví\lo {881 • (SR 01 .máy-zoi6i
Eliminar lo siguiente:

•PRUEBAS DE DESEMPEAO DlL PRODUCTO

Una prueba de desempeño para inyectables y productos implafltados debe tefler la capacidad de medir la liberación de fár-
macos a partir de las formas farmacéuticas fabricadas: Asimismo; debe ser reproducible y confiable, y, aunque no se trata de
una medición de biodisponibilidad, ·la prueba de desempeño debe ser capaz de detectar cambios en· 1as características de libe-
ración del fármaco del producto terminado. Estos cambios tienen el potencial de alterar el desempeñó biológico del fármaco
en la forma farmacéutica, y pueden estar reladcmados con ingredientes activos o iflactivos/inertes en la formulación, con atri-
butos físicos o químicos de la formulación terminada, con vari.ables de fabricación, con los efectos de transporte y almacenac
miento1 con efectos de envejecimiento y con otros factores de formulación críticos para las características de calidad del medi-
camento terminado.
Favor de consultar el capítulo Procedimiento de Disolución: Desarrollo y Valídadón (1092} al desarrollar la prueba de liberación
de fármacos, al seleccionar el medio de liberación de fármacos, el aparato o el procedimiento y el método analítico. Las prue-
bas de desempeño del producto pueden servir para una gran .variedad de propósitos en el desarrollo del producto y en el mo-
nitoreo del medicam.ento posterior a la. aprobación. Asimismo, proveen garantía sobre el desempeño equivalente para produc-
tos que han .sufrido cambios en las materias primas, reublca.C::ión o cambios en el sitio de fabricación y demás cambios posterio-
res a la aprobación conforme a lo detallado en las Pautas para la Industria SUPAC de la FDA (SUPAC-IR, SUPAC-MRy.SUPAC-
SS; disponibles en www.fda.gov/cder/guidancé)~ En este capítuló, se debe considerar una prueba de desempeño de la USP
para productos inyectables e.implantados a fin de sustentar la liberación.de partidas •• (BROl-may.2016>

(2) MEDICAMENTOS ORALES-PRUEBAS DE CALIDAD DEL

PRODUCTO

INTRODUCCIÓN
La administración oral es la vía de administración más común para medicamentos. Todos los medicamentos orales conllevan
a la acción sistémica y/o local en la cavidad oral y/o en el tracto gastrointestinal. Los medicamentos orales se dividen principal-
mente en dos categorías: sólidos y líquidos. Los medicamentos orales sólidos incluyen, entre otros, cápsulas, tabletas, gránulos
y polvos. De manera similar, los medicamentos orales líquidos incluyen, entre otros, soluciones, suspensiones y emulsiones. Las
definiciones y descripciones de estas formas farmacéuticas, así como información resumida sobre su composición y proceso de
fabricación se encuentran en Formas Farmacéuticas (1151). [NOTA-Todas las referencias a los capítulos superiores a (1000) son
únicamente para propósitos informativos y para su uso como recursos útiles. Estos capítulos no son obligatorios a menos que
su aplicación se exija explícitamente.]
Este capítulo general se centra en las pruebas de calidad de productos que generalmente son necesarias para medicamentos
orales para una molécula individual o una combinación de moléculas pequeñas de ingredientes activos. Este capítulo no con-
templa los productos biológicos en formas farmacéuticas sólidas. En este capítulo, los términos "fármaco" e "ingrediente acti-
vo" se usan de manera intercambiable. El contenido de este capítulo no necesariamente se aplica a medicamentos destinados
para uso distinto a la administración oral. Por ejemplo, el capítulo no trata las formas farmacéuticas oromucosas. Algunas de
las pruebas indicadas en este capítulo se pueden llevar a cabo durante el proceso u omitirse como pruebas de rutina basándo-
se en la validación del proceso. Sin embargo, una vez que el producto esté en el mercado, este debe cumplir con los requisitos
farmacopeicos de la USP al momento del muestreo y análisis.
Este capítulo provee listas de los requisitos de pruebas de calidad de productos comunes consolidados en un formato cohe-
rente y conciso. Este capítulo es aplicable, en su totalidad o en parte, cuando se haga referencia al mismo en una monografía
de un medicamento (ver Advertencias Generales, 3. 1O Aplicabilidad de las Normas). Este capítulo incluye las pruebas de calidad
para la vía de administración específica. Las pruebas de calidad listadas pueden ser usadas por los fabricantes, según corres-
ponda, en el desarrollo de nuevas monografías para medicamentos que se van a presentar ante la USP. Cuando esté disponible
un procedimiento de prueba validado para el medicamento específico, este se identifica en un capítulo general con un número
inferior a (1000). Para aquéllos casos en los que no sea posible recomendar un procedimiento validado pero se cuente con
información para una prueba de calidad y/o de desempeño del producto, dicha información se describe en un capítulo infor-
mativo con un número superior a (1000).
USP 40 Requisitos Generales/ (2) Medicamentos Orales-Pruebas de Calidad 83

Pruebas de Calidad y de Desempeño de Medicamentos

Las pruebas, los procedimientos analíticos y los criterios de aceptación de una monografía para analizar medicamentos ora-
les se dividen en dos categorías: 1) aquéllas que evalúan los atributos generales de calidad del producto y 2) aquéllas que eva-
lúan el desempeño del producto, el cual es un atributo específico de calidad generalmente vinculado a los estudios de biodis-
ponibilidad y bioequivalencia (ver Evaluación de Desempeño del Producto Farmacéutico-Biodisponibilidad, Bioequivalencia y Diso-
lución (1090)). Las pruebas de calidad del medicamento pretenden evaluar atributos tales como identificación, contenido (va-
loración), impurezas (pruebas universales), uniformidad del contenido de la dosis, pH, llenado mínimo, contenido de alcohol,
contenido volátil y contenido microbiano (pruebas específicas). Las pruebas de desempeño de medicamentos están diseñadas
para evaluar la liberación de fármacos in vitro a partir de las formas farmacéuticas (p.ej., Disolución (711) y Liberación de Fárma-
cos (724)). Para medicamentos orales líquidos en solución, el desempeño se considera óptimo, por lo que no se incluye una
prueba de desempeño en la monografía.
Cada uno de estos atributos es importante para adquirir un entendimiento primario de la calidad y desempeño de un medi-
camento. Por ende, constituyen los cimientos para la monografía. Un producto oficial debe cumplir con todas las pruebas de
calidad de medicamentos y las pruebas de desempeño de medicamentos incluidas en la monografía correspondiente.
[NOTA-Las pruebas de disolución, específicamente la similitud del perfil de disolución entre contenidos mayores y conteni-
dos menores de un producto de un fabricante dado y la similitud del perfil de disolución entre el producto genérico y el pro-
ducto de referencia, se emplean para otorgar bioexenciones. Ver el capítulo (1090).)

PRUEBAS DE CALIDAD DE PRODUCTOS PARA MEDICAMENTOS ORALES

Las pruebas de calidad para medicamentos orales se dividen en dos categorías: 1) pruebas universales que son aplicables a
todos los medicamentos orales y que deben estar incluidas en la monografía, y 2) pruebas específicas cuya inclusión debe con-
siderarse para tipos específicos de productos orales.

Pruebas Universales para Medicamentos Orales

Los atributos de calidad del producto para formas farmacéuticas orales son importantes para asegurar que los productos co-
mercializados cumplan con los requisitos mínimos de calidad. Las pruebas universales deben aplicarse a todas las formas far-
macéuticas orales y deben incluir Descripción, Identificación, Contenido (prueba de Valoración) e Impurezas (orgánicas, inorgáni-
cas y disolventes residuales).

DESCRIPCIÓN

La descripción tiene un carácter general y no constituye una norma por sí misma. Esta comunica la aparición de un artículo
que cumple con los estándares de la monografía.

IDENTIFICACIÓN

La prueba de identificación se define en Advertencias Generales, 5.40 Identidad. Se incluye en una monografía para ayudar a
confirmar que el artículo contiene el fármaco declarado mediante una identificación positiva del fármaco o fármacos en un
medicamento.
Un método para confirmar la identidad consiste en comparar el tiempo de retención de la muestra con el obtenido en in-
yecciones estándar en un procedimiento cromatográfico de valoración. Otros métodos que a menudo se usan para confirmar
ortogonalmente la identidad del ingrediente activo son: Prueba de Identificación por Cromatografía en Capa Delgada (201 ), Prue-
bas de Identificación Espectrofotométrica (197), Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear (761 ), Espectroscopía en el Infra-
rrojo Cercano (1119) y Espectroscopía Raman (1120), entre otros. El procedimiento analítico debe ser capaz de distinguir entre
el ingrediente activo y todos los excipientes que están presentes o de los productos de degradación potenciales que pudieran
estar presentes. Se debe tener cuidado de asegurar que el sistema cromatográfico separa el artículo de otros fármacos, impure-
zas y aditivos estrechamente relacionados. La absorción en el infrarrojo y en el ultravioleta también pueden usarse para la iden-
tificación (ver el capítulo (197)), cuando se haya demostrado que el procedimiento es selectivo para el fármaco mediante un
estudio de validación o verificación apropiado. Los resultados de la prueba de identificación deben compararse con los resulta-
dos obtenidos de un Estándar de Referencia adecuado preparado de manera similar.

VALORACIÓN

La valoración es una prueba específica e indicadora de la estabilidad para determinar la potencia (contenido) del medica-
mento. Cuando se justifica una valoración no específica (p.ej., volumetría), se debe asegurar mediante otros procedimientos
analíticos de sustento la capacidad de detectar cualquier especie interferente. En general, la aceptación a priori de una varia-
ción de±10% en los límites de un atributo de calidad (p.ej., valoración) a partir de la cantidad declarada esperada (100%) en
84 (2) Medicamentos Orales-Pruebas de Calidad / Requisitos Generales USP 40

la mayoría de los casos pretende tomar en cuenta la variabilidad de la fabricación y la estabilidad durante la vida útil, y se basa
principalmente en la noción de que tal variación en un atributo de calidad tiene poca probabilidad de ocasionar un impacto
adverso perceptible en el resultado clínico deseado. Los criterios de aceptación de 95,0%-105,0% se usan con justificación
(p.ej., para medicamentos con un índice terapéutico estrecho). También se aceptan las valoraciones de actividad y las valora-
ciones de contenido absoluto siempre que se justifique.

IMPUREZAS

El fármaco y los excipientes usados en la fabricación del medicamento pueden presentar impurezas del proceso, subproduc-
tos sintéticos y otras impurezas inorgánicas y orgánicas. Los límites de dichas impurezas están indicados en las monografías del
fármaco y de los excipientes. Existe la posibilidad de que ocurra degradación durante la fabricación del producto y durante su
vida útil, la cual, entre otros factores, puede resultar de la degradación del fármaco o de interacciones entre el fármaco y los
excipientes. Los procedimientos y criterios de aceptación deben limitar específicamente los materiales tóxicos. Ver los requisi-
tos específicos en las Advertencias Generales, 5.60 Impurezas y Sustancias Extrañas. [NOTA-Para información adicional, ver Im-
purezas en Fármacos y Productos Farmacéuticos (l 086).]

Pruebas Específicas para Tabletas

Además de las Pruebas Universa/es para Medicamentos Orales descritas anteriormente, se deben considerar las siguientes
pruebas específicas para tabletas, dependiendo de la naturaleza del fármaco y de la formulación.

CONTENIDO VOLÁTIL

La prueba y el método específico dependen de la naturaleza del artículo. Se debe tener consideración especial a las formas
farmacéuticas cuyo contenido de agua puede ser un atributo potencial de calidad y a los productos en los que se emplean
disolventes para la fabricación del medicamento.
Cuando la presencia de humedad u otro material volátil pueda tornarse crítica, los analistas deben determinar la cantidad de
disolventes volátiles no unidos o de materia volátil de cualquier tipo separado mediante Pérdida por Secado (731) u otra técnica
adecuada (p.ej., actividad del agua). Para sustancias que parecen contener agua como el único componente volátil, el procedi-
miento provisto en Determinación de Agua (921) puede ser apropiado. Para los medicamentos, los analistas también deben
consultar Disolventes Residuales (467).

DESINTEGRACIÓN

La desintegración es un atributo esencial de los sólidos orales, excepto para aquéllos destinados a ser masticados antes de
tragarlos y para los productos de liberación retardada o prolongada. Esta prueba mide el tiempo que tarda en desintegrarse la
unidad de dosificación en un medio acuoso y se describe en detalle en Desintegración (701 ). Para algunas formas farmacéuticas
(p.ej., tabletas efervescentes, tabletas de desintegración, entre otras) la Farmacopea Europea describe en gran detalle la prueba
de desintegración. La prueba de desintegración para algunas de las formas farmacéuticas en este capítulo se incluye para pro-
veer información completa. Para información sobre procedimientos detallados, consultar el capítulo (701) o la Farmacopea Eu-
ropea. Siempre que se incluye, la prueba de desintegración se usa únicamente como una prueba de control de calidad y no
como una prueba de desempeño del producto, y debe cumplir con las especificaciones de la monografía. Una prueba de de-
sintegración podrá usarse como una prueba de desempeño del producto únicamente cuando la desintegración se haya corre-
lacionado con la disolución de una forma farmacéutica (Pauta Q6A de la ICH, disponible en www.ich.org). Para todos los de-
más casos, se deberá considerar una prueba de disolución como una prueba de desempeño del producto.

FRIABILIDAD DE LAS TABLETAS

El procedimiento de prueba se aplica a la mayoría de las tabletas comprimidas sin cubierta. La friabilidad determina la capa-
cidad de las tabletas para soportar las tensiones mecánicas y su resistencia a la formación de desportilladuras y a la abrasión en
la superficie. [NOTA-Para información adicional, ver Friabilidad de las Tabletas (1216).]

FUERZA DE RUPTURA DE LAS TABLETAS

La fuerza de ruptura de las tabletas mide la integridad mecánica de las tabletas, que es la fuerza requerida para provocar que
fallen (es decir, que se rompan) en un plano específico. [NOTA-Para información adicional, ver Fuerza de Ruptura de las Table-
tas (1217).]
USP 40 Requisitos Generales/ (2) Medicamentos Orales-Pruebas de Calidad 85

UNIFORMIDAD DE UNIDADES DE DOSIFICACIÓN

La uniformidad de unidades de dosificación debe demostrarse mediante uniformidad de contenido o variación de peso. La
uniformidad de contenido se basa en la valoración del contenido individual de fármacos en un número de unidades de dosifi-
cación para determinar si los contenidos individuales son lo suficientemente cercanos a la cantidad declarada. La variación de
peso se puede usar como una alternativa para estimar la uniformidad del contenido ante ciertas condiciones (ver Uniformidad
de Unidades de Dosificación (905)).

Pruebas Específicas para Tabletas Sin Cubierta

Las tabletas sin cubierta incluyen tabletas de una sola capa que resultan de una sola compresión de partículas y tabletas de
capas múltiples que constan de capas concéntricas o paralelas obtenidas mediante compresión sucesiva de partículas de com-
posición diferente. Los excipientes usados generalmente no tienen el propósito específico de modificar la liberación del fárma-
co en los fluidos digestivos. Las tabletas sin cubierta incluyen, entre otras: tabletas efervescentes, tabletas bucales, tabletas su-
blinguales, tabletas masticables, tabletas de desintegración, tabletas de desintegración oral, tabletas para solución oral y table-
tas para suspensión oral. Para tabletas sin cubierta, la desintegración debe analizarse según se indica en el capítulo (701 ).

TABLETAS BUCALES, SUBLINGUALES Y DE DESINTEGRACIÓN ORAL

Estas formas farmacéuticas se tratan en Medicamentos para Mucosas-Pruebas de Calidad del Producto (4). Se citan en este
capítulo solo para propósitos informativos y para proveer información completa.

TABLETAS MASTICABLES

Las tabletas masticables no requieren cumplir con la prueba de desintegración. Las tabletas masticables (intactas) deben so-
meterse a la prueba de disolución, como una prueba de desempeño del producto (cuando se cite en la monografía), debido a
que podrían ser tragadas por un paciente sin haberlas masticado apropiadamente. En general, las condiciones de la prueba de
disolución para tabletas masticables deben ser las mismas que para las tabletas no masticables del mismo ingrediente o grupo
activo.

TABLETAS PARA SOLUCIÓN ORAL Y TABLETAS PARA SUSPENSIÓN ORAL

Estas tabletas están destinadas a disolverse o dispersarse en agua antes de su administración para obtener una solución o
dispersión homogénea. Se citan en este capítulo solo para propósitos informativos y para proveer información completa.

Pruebas Específicas para Tabletas Recubiertas

Las tabletas recubiertas son tabletas cubiertas con una o más capas de mezclas de varias sustancias tales como resinas sintéti-
cas o naturales, gomas, gelatinas, excipientes inactivos e insolubles, azúcares, plastificantes, polioles, ceras, materia colorante
autorizada por la autoridad competente y, en ocasiones, sustancias saborizantes y sustancias activas. Las tabletas recubiertas
con azúcar o película incluyen, entre otras: tabletas con cubierta simple, tabletas de liberación prolongada y tabletas de libera-
ción retardada. Cuando sea aplicable, se debe realizar una prueba de desintegración según se indica en el capítulo (701 ).
No existen pruebas de calidad adicionales específicas para tabletas de liberación prolongada ni para tabletas de liberación
retardada. Se deben aplicar las pruebas universales de calidad a estos productos.

Pruebas Específicas para Cápsulas

Además de las Pruebas Universales para Medicamentos Orales descritas anteriormente, se deben considerar las siguientes
pruebas específicas, dependiendo de la naturaleza del fármaco y de la formulación.
Las pruebas de calidad del producto que se consideran específicas al tipo de cápsula incluyen aquéllas para contenido volátil
(capítulos (731) y (921 )). Las cápsulas de una pieza a menudo se usan para administrar un fármaco como solución o suspen-
sión. Las cápsulas de dos piezas constan de dos piezas telescópicas de tapa y cuerpo que se usan para administrar material
sólido como polvo, gránulos o tabletas pequeñas. Las cápsulas de liberación modificada incluyen, entre otras: cápsulas de libe-
ración retardada y cápsulas de liberación prolongada.
Desintegración: Proceder según se indica en Desintegración (701 ), Cápsulas de Gelatina Blanda para cápsulas de una pieza y
Desintegración (701 ), Cápsulas de Gelatina Dura para cápsulas de dos piezas. La desintegración para cápsulas de liberación mo-
dificada se describe en sumo detalle en la Farmacopea Europea.
No existen pruebas de calidad adicionales específicas para cápsulas de liberación prolongada ni para cápsulas de liberación
retardada. Se deben aplicar las pruebas universales de calidad a estos productos.
86 (2) Medicamentos Orales-Pruebas de Calidad / Requisitos Generales USP 40

Pruebas Específicas para Gránulos

Además de las Pruebas Universales para Medicamentos Orales descritas anteriormente, se deben considerar las siguientes
pruebas específicas, dependiendo de la naturaleza del fármaco y de la formulación.
Los gránulos son formas farmacéuticas sólidas que están compuestas de aglomeraciones de partículas más pequeñas. Los
gránulos incluyen, entre otros: gránulos efervescentes, gránulos recubiertos, gránulos de liberación prolongada y gránulos de
liberación retardada.
Las pruebas que se consideran específicas para el tipo de gránulos incluyen contenido volátil (capítulos (731) y (921 )). La
desintegración para gránulos efervescentes se describe en sumo detalle en la Farmacopea Europea. Basándose en la naturaleza
del artículo y en criterios científicos, podrían ser aplicables pruebas adicionales, incluida la finura de polvos, entre otras.

Pruebas Específicas para Polvos

Los polvos orales deben indicar lo siguiente: "Sólo para Uso Oral". Las pruebas que se consideran específicas para el tipo de
polvo incluyen: Llenado Mínimo (755) y contenido volátil (capítulos (731) y (921 )). El capítulo (755) contiene especificaciones
aplicables a los polvos orales.
Basándose en la naturaleza del artículo y en criterios científicos, podrían ser aplicables pruebas adicionales, incluidos el pH en
soluciones acuosas, finura de polvos, límites microbianos, entre otros.

Pruebas Específicas para Líquidos

Las pruebas de calidad del producto recomendadas para un medicamento líquido incluyen las Pruebas Universales para Medi-
camentos Orales descritas anteriormente y las pruebas específicas que se incluyen a continuación. La mayoría de las pruebas de
calidad para líquidos requieren la evaluación de productos monodosis para estimar el atributo de calidad. Las instrucciones
específicas para realizar las pruebas de calidad para productos monodosis o multidosis se proveen en la monografía o en el
capítulo general. Por ejemplo, la variación de peso se puede usar cuando se controla adecuadamente el mezclado de las sus-
tancias activas y los excipientes en la mezcla para asegurar su distribución uniforme, como en el caso de las soluciones.

VOLUMEN DE ENTREGA

Cuando la formulación líquida se envasa en un envase multidosis, se debe cumplir con el capítulo Volumen de Entrega (698).

DETERMINACIÓN DE ALCOHOL

Si la formulación líquida contiene una cantidad de alcohol, se debe incluir Determinación de Alcohol (611 ). Los límites pueden
ser una concentración absoluta, en porcentaje o relativos a un contenido declarado.

PH
Los productos orales líquidos generalmente son formulaciones acuosas que son susceptibles a cambios en el pH derivados de
la exposición al C0 2 atmosférico. La incorporación de C0 2 atmosférico y los cambios de pH subsiguientes de los productos
orales líquidos es relevante únicamente para los productos acuosos. El pH de una formulación líquida oral puede afectar el sa-
bor y la estabilidad. El intervalo de pH conforme a lo descrito en pH (791) se indica en la monografía.

CONTENIDO MICROBIANO

La presencia de ciertos microorganismos en preparaciones no estériles pueden tener el potencial de reducir o incluso inacti-
var la actividad terapéutica del producto, y tiene el potencial de afectar adversamente la salud del paciente. Algunos productos
orales líquidos pueden estar sujetos a un control microbiológico extremo, mientras que otros no requieren control alguno. La
necesidad de especificaciones microbianas para un producto oral líquido dado depende de su formulación y uso y se indica en
la monografía.
[NOTA-Para información adicional, ver Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Criterios de Aceptación para Prepara-
ciones Farmacéuticas y Sustancias de Uso Farmacéutico (1111 ).]

ANTIOXIDANTE

Se debe realizar una prueba de liberación. La prueba para vida útil podría no ser necesaria cuando los datos de desarrollo y
estabilidad así lo justifiquen (Pauta Q6A de la ICH).
USP 40 Requisitos Generales/ (3) Medicamentos Tópicos y Transdérmicos 87

SUSTANCIAS EXTRAÍBLES

Cuando los datos de desarrollo y estabilidad no presentan evidencia significativa de productos extraíbles, se puede proponer
la eliminación de esta prueba. Cuando los datos demuestren la necesidad de criterios de aceptación- para tapones de goma,
recubrimiento interno de la tapa, frascos de plástico-en contacto con soluciones orales se deben recopilar datos tan pronto
como sea posible durante el proceso de desarrollo (Pauta Q6A de la ICH).

Tipos de Formas Farmacéuticas Líquidas

Las pruebas de calidad específicas para estas formas farmacéuticas se proveen en sus respectivas monografías.

SOLUCIONES, POLVOS Y GRÁNULOS PARA SOLUCIÓN

Las pruebas para formulaciones "para Solución" se llevan a cabo en una solución bien mezclada del medicamento reconsti-
tuido según se indica en el etiquetado.

EMULSIONES, SUSPENSIONES Y POLVOS Y GRÁNULOS PARA SUSPENSIÓN

Las pruebas para formulaciones "para Suspensión" se llevan a cabo en una suspensión bien mezclada del medicamento re-
constituido según se indica en el etiquetado. Las pruebas de calidad del producto para suspensiones deben incluir una prueba
de capacidad de suspensión.

POLVOS Y GRÁNULOS PARA SOLUCIONES

Después de su disolución o suspensión, cumplen con los requisitos de la monografía para la forma farmacéutica final. La
determinación del contenido volátil (capítulos (731) y (921 )) puede ser una prueba de calidad adicional para polvos y gránulos
para reconstituir.

Pruebas Específicas para Formas Farmacéuticas Orales Misceláneas

PRODUCTOS ORALES LIOFILIZADOS

Determinación de Agua (921 ), Método la: Los productos orales liofilizados cumplen con la prueba. Los límites se aprueban se-
gún se indica en la monografía específica.

(3) MEDICAMENTOS TÓPICOS Y TRANSDÉRMICOS-PRUEBAS DE

CALIDAD DEL PRODUCTO

INTRODUCCIÓN
Los medicamentos de aplicación tópica se dividen en dos categorías generales: medicamentos que se aplican para generar
una acción localizada y los que se aplican para conseguir efectos sistémicos después de su absorción a través de la piel en el
torrente sanguíneo. La acción localizada puede presentarse en la superficie del sitio de aplicación (p.ej., estrato córneo), en los
tejidos subyacentes (p.ej., epidermis y/o dermis) y en tejidos subcutáneos (p.ej., músculo o articulación). Los medicamentos de
aplicación tópica incluyen, entre otros, cremas, geles, ungüentos, pastas, suspensiones, lociones, espumas, atomizadores, aero-
soles, soluciones y sistemas transdérmicos de liberación de fármacos (TDS, por sus siglas en inglés). Las definiciones y descrip-
ciones de estas formas farmacéuticas, así como información abreviada sobre su composición y/o procesos de fabricación se
encuentran en Formas Farmacéuticas (1151 ).
Los procedimientos y criterios de aceptación aceptables para analizar los medicamentos de aplicación tópica se pueden divi-
dir en dos clases: aquéllos que evalúan los atributos generales de calidad del producto y aquéllos que evalúan el desempeño
del producto. Los atributos de calidad del producto incluyen: descripción, identificación, valoración (contenido), impurezas,
propiedades fisicoquímicas, uniformidad de unidades de dosificación, contenido de agua, pH, viscosidad aparente, límites mi-
crobianos, contenido de conservantes antimicrobianos, contenido de antioxidantes, esterilidad (cuando corresponda), así co-
mo otras pruebas específicas para cada producto. Las pruebas de desempeño del producto evalúan la liberación de fármacos y
demás atributos que afectan la liberación de los fármacos de la forma farmacéutica terminada.
88 (3) Medicamentos Tópicos y Transdérmicos / Requisitos Generales USP 40

Este capítulo provee listas de los requisitos de pruebas de calidad de productos comunes y consolidadas en un formato
coherente y conciso. Este capítulo es aplicable, en su totalidad o en parte, cuando se haga referencia al mismo en una mono-
grafía de un medicamento (ver Advertencias Generales, 3. 7O Aplicabilidad de las Normas) e incluye las pruebas de calidad para la
vía de administración específica. Las pruebas de calidad listadas pueden ser usadas por los fabricantes, según corresponda, en
el desarrollo de nuevas monografías para medicamentos que se van a presentar ante la USP-NF.
Los sistemas transdérmicos de liberación de fármacos liberan sus ingredientes activos mediante diversos mecanismos, los
cuales pueden ser pasivos o activos. Este capítulo abarca únicamente las pruebas relacionadas con sistemas transdérmicos de
liberación de fármacos pasivos.

Cambio en la redacción:

PRUEBAS DE CALIDAD DEL PRODUCTO PARA MEDICAMENTOS TÓPICOS V TRANSDÉRMICOS

Pruebas Universales

Las pruebas universales (ver la Guía Q6A de la ICH-Specifications: Test Procedures and Acceptance Criterio for New Drug Subs-
tances and New Drug Products: Chemical Substances [Especificaciones: Procedimientos de Prueba y Criterios de Aceptación para
Nuevos Fármacos y Nuevos Medicamentos: Sustancias Químicas], disponible en www.ich.org) se listan a continuación y se
aplican a todos los medicamentos de aplicación tópica.

DESCRIPCIÓN

Se debe proveer una descripción cualitativa del medicamento. Los criterios de aceptación deben incluir el aspecto final acep-
table de la forma farmacéutica terminada y del envase. El examen visual debe identificar los cambios de color, migración adhe-
siva (es decir, flujo frío; ver Prueba de Flujo Frío) para sistemas transdérmicos de liberación de fármacos, separaciones, cristaliza-
ción, entre otros, que sean específicos del medicamento. La descripción debe especificar el contenido o la cantidad declarada
en la etiqueta del artículo. Para los sistemas transdérmicos de liberación de fármacos, un examen visual debe también llevarse
a cabo para evaluar posibles problemas durante el uso del producto. El examen debe evaluar la dificultad al momento de reti-
rar el sistema transdérmico de liberación de fármacos de la bolsa (p.ej., debido a la migración de adhesivo que causa que el
sistema se adhiera a la bolsa); la incapacidad de retirar el sistema transdérmico de liberación de fármacos de la bolsa sin causar
daños al sistema y el residuo de adhesivo remanente en la bolsa después de retirar el sistema transdérmico de liberación de
fármacos. Esta última no es una prueba farmacopeica, pero forma parte de la especificación del fabricante para el medicamen-
to.

IDENTIFICACIÓN

Las pruebas de identificación se tratan en las Advertencias Generales, 5.40 Identidad. Las pruebas de identificación deben es-
tablecer la identidad del fármaco o fármacos presentes en el artículo y deben distinguir entre compuestos con estructuras es-
trechamente relacionadas que pudieran estar presentes. Las pruebas de identificación deben ser específicas para los fármacos
(p.ej., espectroscopía en el infrarrojo). Los métodos de espectrofotometría en el infrarrojo cercano (NIR, por sus siglas en in-
glés) o Raman también podrían ser aceptables para la identificación del producto farmacéutico (ver Espectroscopía en el Infra-
rrojo Cercano (1119) y Espectroscopía Raman (1120) para más información). La identificación mediante un tiempo de retención
cromatográfico único no es específica.

VALORACIÓN

Se debe usar una prueba específica e indicadora de la estabilidad para valorar el medicamento (determinar su contenido).
Este requisito de valoración puede cumplirse para productos tópicos que contienen antibióticos mediante un método micro-
biológico estándar (ver Antibióticos-Valoraciones Microbiológicas (81)). Para los casos en los que se justifica el uso de una valo-
ración no específica (p.ej., Volumetría (541 )), se deben usar otros procedimientos analíticos de respaldo para conseguir la espe-
cificidad general.

IMPUREZAS

El fármaco y los excipientes usados en la fabricación del medicamento pueden presentar impurezas del proceso, subproduc-
tos de síntesis, impurezas asociadas con el adhesivo (p.ej., monómeros residuales), disolventes residuales (ver Disolventes Resi-
duales (467)), •. (Oficialoi-ene-zo18) entre otras impurezas inorgánicas y orgánicas, las cuales deben ser evaluadas y controladas.
Asimismo, se deben evaluar y controlar las impurezas producidas por la degradación del fármaco, así como aquéllas produci-
das durante el proceso de fabricación del medicamento.
USP 40 Requisitos Generales/ (3) Medicamentos Tópicos y Transdérmicos 89

Pruebas Específicas

Además de las Pruebas Universales citadas anteriormente, se deben considerar las siguientes Pruebas Específicas para cada ca-
so en particular:

UNIFORMIDAD DE UNIDADES DE DOSIFICACIÓN

Esta prueba se aplica a los sistemas transdérmicos de liberación de fármacos y a las formas farmacéuticas tópicas diseñadas
para administración sistémica, o en casos en que sea necesario un control estricto de la dosis para limitar la irritación localizada
o la exposición sistémica no deseada, envasados en envases unitarios, como sobres (ver Uniformidad de Unidades de Dosificación
(905)). La especificación de uniformidad de unidades de dosificación no aplica a soluciones, suspensiones, emulsiones, un-
güentos o geles en envases unitarios diseñados para generar una acción localizada después de su administración externa por
vía cutánea.

CONTENIDO DE AGUA

Cuando resulte apropiado, se debe incluir una prueba de contenido de agua (ver Determinación de Agua (921 )). Esta prueba
por lo general depende de la formulación. Por lo tanto, no se incluye en la monografía oficial del medicamento, pero forma
parte de la especificación del fabricante para el medicamento.

LÍMITES MICROBIOLÓGICOS

El examen microbiológico para medicamentos no estériles se realiza en conformidad con los métodos provistos en Pruebas
de Recuento Microbiano (61) y Pruebas de Microorganismos Específicos (62), a menos que se haya demostrado que la formulación
posee por sí misma propiedades anti microbianas. Los criterios de aceptación para medicamentos no estériles basados en el
recuento total de microorganismos aerobios y en el recuento total combinado de hongos filamentosos y levaduras se propor-
cionan en Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Criterios de Aceptación para Preparaciones Farmacéuticas y Sustancias
de Uso Farmacéutico (1111 ).

CONTENIDO DE CONSERVANTES ANTIMICROBIANOS

Se deben establecer criterios de aceptación para el contenido de conservantes antimicrobianos en productos de unidades
múltiples. Dichos criterios deben basarse en los niveles de conservante antimicrobiano necesarios para mantener la calidad mi-
crobiológica del producto durante todas las etapas de su uso y vida útil propuestos (ver Pruebas de Eficacia Antimicrobiana
(51)).

CONTENIDO DE ANTIOXIDANTES

Si el medicamento contiene antioxidantes, se deben establecer pruebas para determinar su contenido, a menos que se pue-
da detectar su degradación por oxidación empleando otro método de prueba, como por ejemplo, una prueba de impurezas.
Se deben establecer criterios de aceptación para el contenido de antioxidantes. Dichos criterios deben basarse en los niveles de
antioxidante necesarios para mantener la estabilidad del producto durante todas las etapas de su uso y vida útil propuestos.

ESTERILIDAD

Dependiendo del uso de la forma farmacéutica (p.ej., productos que se aplicarán a heridas abiertas o áreas con quemadu-
ras), se deberá demostrar la esterilidad del producto según corresponda (ver Pruebas de Esterilidad (71 )).

PH
Cuando corresponda, el pH de los medicamentos de aplicación tópica deberá analizarse. Algunos medicamentos de aplica-
ción tópica contienen cantidades muy limitadas de agua o fase acuosa, por lo que no siempre se requiere la medición de su
pH. Esta prueba por lo general depende de la formulación. Por lo tanto, no se incluye en la monografía oficial del medicamen-
to, pero forma parte de la especificación del fabricante para el medicamento.

TAMAÑO DE PARTÍCULA

Se debe llevar a cabo un análisis del tamaño de partícula cuando el producto terminado contiene un fármaco sólido suspen-
dido. Por lo general, se establece y controla el tamaño de partícula de los fármacos activos en medicamentos de aplicación
90 (3) Medicamentos Tópicos y Transdérmicos / Requisitos Generales USP 40

tópica durante la etapa de desarrollo de la formulación. No obstante, los medicamentos de aplicación tópica deben ser exami-
nados para detectar cualquier alteración de la partícula (es decir, la forma polimórfica del fármaco, apariencia de las partículas,
tamaño, forma, morfología, aglomeración, o agregación) del fármaco que pudiera ocurrir durante el procesamiento y almace-
namiento del producto. Estos tipos de prueba por lo general dependen de la formulación, por lo que no se incluyen en las
monografías oficiales pero forman parte de la especificación del fabricante para el medicamento.

FORMACIÓN DE CRISTALES

Cuando el fármaco se disuelve en el producto terminado, el producto debe examinarse microscópicamente para detectar
evidencia de la formación de cristales del fármaco activo. Esta prueba por lo general depende de la formulación, por lo que no
se incluye en la monografía oficial del medicamento, pero forma parte de la especificación del fabricante para el medicamento.
Se recomienda examinar el potencial de formación de cristales del fármaco durante el desarrollo del producto en condiciones
de estrés.

PRUEBAS ESPECÍFICAS PARA MEDICAMENTOS OFTÁLMICOS

Ver Productos Oftálmicos-Pruebas de Calidad (771 ).

PRUEBAS ESPECÍFICAS PARA MEDICAMENTOS SEMISÓLIDOS DE APLICACIÓN TÓPICA

Llenado Mínimo

Los envases unitarios y de unidades múltiples deben cumplir con los requisitos de llenado mínimo según se establecen en las
pruebas descritas en Llenado Mínimo (755). Para envases unitarios cuando se lleva a cabo la prueba del capítulo (905), no se
requiere la prueba del capítulo (755).

Viscosidad Aparente

La viscosidad es una medida de la resistencia de la formulación a fluir, y además es una evaluación de una propiedad reoló-
gica de una forma farmacéutica semisólida. El término "viscosidad aparente" se aplica a fluidos no newtonianos, lo cuales re-
presentan la mayor parte de las formas farmacéuticas semisólidas.
Se deben desarrollar procedimientos de medición de acuerdo a lo indicado en Viscosidad- Métodos Capilares (911 ), Viscosi-
dad-Métodos Rotatorios (912) y Viscosidad-Método de Bola Rodante (913). Para semisólidos tixotrópicos y/o que presentan
cambios irreversibles en la viscosidad después del corte, se debe prestar especial atención a los procedimientos de preparación
de la muestra para minimizar la variabilidad en las mediciones de viscosidad aparente ocasionadas por el historial variable de
corte (p.ej., velocidad y temperatura de mezclado, operación de llenado y manipulación de las muestras). Además, en el caso
de algunos productos, puede ser necesario contar con especificaciones de viscosidad aparente para más de una etapa del pro-
ceso de fabricación o en más de un conjunto de condiciones de prueba (p.ej., etapa de proceso a granel, producto final enva-
sado, velocidades altas y bajas de corte y diferentes temperaturas).
Además de las mediciones de viscosidad de un solo punto, se pueden aplicar técnicas reológicas más avanzadas (pruebas de
flujo, oscilatorias, de deformación por fluencia lenta (creep) y relajación de tensión) para desarrollar un modelo mecanístico
que permita entender una formulación y su estructura. Estas técnicas pueden ser útiles para el desarrollo del producto em-
pleando los principios de calidad por diseño, o para la caracterización fisicoquímica comparativa de las formulaciones de prue-
ba y de referencia en el caso de una petición de bioexención en una solicitud de un medicamento genérico. Sin embargo,
estas técnicas por lo general no son adecuadas para análisis de calidad rutinarios. Los parámetros comunes derivados a partir
de análisis reológicos de formas farmacéuticas semisólidas que pueden ser útiles para la caracterización y la comparación inclu-
yen el módulo de almacenamiento, módulo de pérdida, módulo de relajación, cumplimiento, índice tixotrópico y tensión de
cedencia.
Los criterios de aceptación son específicos del producto y se definen con el fin de garantizar que la viscosidad aparente de
cada partida de un medicamento semisólido se encuentre dentro del intervalo definido por el diseño del producto y sea unifor-
me entre partidas, basándose en las especificaciones de desarrollo del producto o en la evaluación estadística de múltiples par-
tidas del producto durante la vida útil del mismo.

Uniformidad en los Envases

Los medicamentos semisólidos de aplicación tópica pueden presentar una separación física durante los procesos de fabrica-
ción y durante la vida útil. Para asegurar la integridad del medicamento, es fundamental evaluar la uniformidad del producto
terminado. Esta prueba se aplica solo a envases de unidades múltiples tales como tubos y frascos. Esta prueba no aplica a me-
dicamentos tópicos de consistencia más fluida en envases de unidades múltiples, tales como emulsiones, lociones, geles de dos
USP 40 Requisitos Generales/ (3) Medicamentos Tópicos y Transdérmicos 91

fases o suspensiones tópicas, en los que el etiquetado indica que el usuario debe mezclar el producto (p.ej., agitar bien) antes
de usar.

PRODUCTOS ENVASADOS EN TUBOS

Uniformidad visual: Retirar o cortar con cuidado el sello de la parte inferior del tubo y realizar un corte vertical desde la
parte inferior hasta la parte superior del tubo. Cortar cuidadosamente alrededor del borde superior del tubo, abrir las dos sola-
pas y sujetarlas de modo que el producto quede expuesto.
Inspeccionar el producto visualmente para determinar si hay separación de fases, cambios en la apariencia física y la textura
(p.ej., cambio en el color, cristalización, aglomeración), así como otras propiedades descritas en la especificación del producto
en Descripción. Si no hay una separación de fases significativa o cambios en la apariencia física y la textura, y si el producto
cumple con los criterios en Descripción, el producto cumple con la prueba. Si el producto presenta separación de fases signifi-
cativa o cambios en la apariencia física y la textura, no cumple con la prueba.
Uniformidad de los ingredientes activos: Los procedimientos descritos a continuación se pueden modificar dependiendo
de la sensibilidad del procedimiento cuantitativo usado para determinar la cantidad de fármacos presentes en la formulación.
Para productos en unidades múltiples que contienen 5 g de producto o más
ETAPA 1:
1. Usando un solo tubo, después de llevar a cabo la prueba de Uniformidad Visual, retirar una cantidad apropiada de produc-
to de las partes superior (es decir, tapa), media e inferior (es decir, extremo sellado) del tubo. El tamaño de las muestras
debe ser tal que permita realizar al menos una determinación cuantitativa de los ingredientes activos y no debe exceder la
dosis máxima recomendada en el etiquetado del producto para un sola aplicación.
2. Determinar la cantidad de los ingredientes activos en cada porción del producto usando cualquier procedimiento cuanti-
tativo apropiado validado y evaluar los resultados de la prueba realizada en el tubo usando los criterios de aceptación de
la Etapa 7 listados en el apartado número 3.
3. Los criterios de aceptación de la Etapa 7 se cumplen cuando:
• Ninguno de los tres resultados se encuentra fuera del intervalo de valoración del producto y
• La diferencia máxima entre la cantidad de ingredientes activos determinada en el tubo es no más de 10,0%. Por
ejemplo, si las tres mediciones en el tubo son 97,0%, 95,2% y 99,7%, la diferencia máxima sería 4,5% (es decir,
99,7% - 95,2% = 4,5%).
4. Proceder con las pruebas de la Etapa 2 si no se cumple con los criterios de aceptación de la Etapa 7 y ninguno de los
resultados de la prueba se encuentra fuera del intervalo de valoración del producto por más de 5,0% (p.ej., si el intervalo
de valoración del producto es 90,0%-120%, el intervalo será 85,0%-125,0%) y la diferencia máxima entre la cantidad de
ingredientes activos medida en el tubo es no más de 1 0,0%. Por ejemplo, si los valores de la valoración más altos y más
bajos son 106,0% y 94,7% de la cantidad declarada, entonces la diferencia sería 106,0 - 94,7 = 11,7%.
5. Proceder con las pruebas de la Etapa 3 si no se cumple con los criterios de aceptación de la Etapa 7 y si no se puede
cumplir los criterios de aceptación de la Etapa 2, no más de uno de los tres resultados de la prueba se encuentra fuera del
intervalo de valoración del producto por más de ±5,0%, ninguno de los resultados se encuentra fuera del intervalo de
valoración de producto por más de± 15,0% y la diferencia máxima entre la cantidad de ingredientes activos medida en el
tubo es no más de 15,0%.
ETAPA 2:
1. Llevar a cabo las pruebas de Uniformidad Visual y Uniformidad de los Ingredientes Activos en dos tubos adicionales para ob-
tener un total de tres muestras de cada uno de los tres tubos.
2. Determinar la cantidad de ingredientes activos en cada porción del producto usando cualquier procedimiento cuantitati-
vo apropiado validado y evaluar los resultados de la prueba de los tres tubos usado los criterios de aceptación de la Etapa
2.
3. Los criterios de aceptación de la Etapa 2 se cumplen cuando:
•Todos los tubos cumplen con la prueba de Uniformidad Visual;
• Ninguno de los nueve resultados (es decir, tres de cada uno de los tres tubos) se encuentra fuera del intervalo de
valoración de producto por no más de 5,0% y
• La diferencia máxima entre las cantidades de ingredientes activos medidas en cada tubo, para cada una de las mues-
tras analizadas, es no más de 10,0%.
4. Proceder con las pruebas de la Etapa 3 si no más de uno de los nueve resultados de prueba se encuentra fuera del interva-
lo de valoración por ±5,0%, ninguno se encuentra fuera del intervalo de valoración de producto por± 15,0% y la diferen-
cia máxima entre la cantidad de ingredientes activos medida en cada tubo es no más de 15,0%.
ETAPA 3:
1 . Si se completa la Etapa 2, llevar a cabo las pruebas de Uniformidad Visual y Uniformidad de Jos Ingredientes Activos en siete
tubos adicionales, para obtener un total de tres muestras de cada uno de los 1 O tubos. Si se omitió la Etapa 2, llevar a
cabo las pruebas de Uniformidad Visual y Uniformidad de Jos Ingredientes Activos en nueve tubos adicionales, para obtener
un total de tres muestras de cada uno de 1 O tubos.
92 (3) Medicamentos Tópicos y Transdérmicos / Requisitos Generales USP 40

2. Determinar la cantidad de los ingredientes activos en cada porción del producto, usando cualquier procedimiento cuanti-
tativo apropiado validado y evaluar los resultados de las pruebas realizadas en los 1 O tubos usando los criterios de acepta-
ción de la Etapa 3 listados en el apartado número 3.
3. Los criterios de aceptación de la Etapa 3 se cumplen cuando:
•Todos los tubos cumplen con la prueba de Uniformidad Visual; y
• 29 de los 30 resultados de la prueba se encuentran dentro del intervalo de valoración del producto ±5,0% y ninguno
se encuentra± 15,0% por fuera del intervalo de valoración del producto; y
• La diferencia máxima entre las cantidades de ingredientes activos medidas en cada tubo, para cada uno de los 1 O
tubos analizados, es no más de 15,0%.
Para tubos de unidades múltiples que contienen menos de 5 g de producto
ETAPA 1:
1. Usando un solo tubo, después de llevar a cabo la prueba de Uniformidad Visual, retirar una cantidad apropiada del pro-
ducto de las partes superior (es decir, tapa), e inferior (es decir, extremo sellado) del tubo. El tamaño de las muestras debe
ser tal que permita realizar al menos una determinación cuantitativa de los ingredientes activos y no debe exceder la dosis
máxima recomendada en el etiquetado del producto para un sola aplicación.
2. Determinar la cantidad de los ingredientes activos en cada porción del producto usando cualquier procedimiento cuanti-
tativo apropiado validado y evaluar los resultados de la prueba realizada en el tubo usando los criterios de aceptación de
la Etapa 7 listados en el apartado número 3.
3. Los criterios de aceptación de la Etapa 7 se cumplen cuando:
• Ninguno de los resultados se encuentra fuera del intervalo de valoración del producto; y
• La diferencia entre la cantidad de ingredientes activos determinada para las dos muestras del tubo analizado es no
más de 10,0%. Por ejemplo, si dos de las mediciones de un tubo son 95,2% y 89,7%, la diferencia sería 5,5%.
4. Proceder con las pruebas de la Etapa 2 si no se cumple con los criterios de aceptación de la Etapa 7 y ninguno de los
resultados de la prueba se encuentra fuera del intervalo de valoración del producto por más de ±5,0% (p.ej., si el intervalo
de valoración del producto es 90,0%-120,0%, el intervalo será 85,0%-125,0%) y la diferencia máxima entre las cantida-
des de ingredientes activos medida en el tubo es no más de 10,0%.
5. Proceder con las pruebas de la Etapa 3 si no se cumple con los criterios de aceptación de la Etapa 7 y si no se pueden
cumplir los criterios de aceptación de la Etapa 2, no más de uno de los resultados de la prueba se encuentra fuera del
intervalo de valoración del producto por más de ±5,0% y ninguno de los resultados se encuentran fuera del intervalo de
valoración de producto por más de± 15,0% y la diferencia entre las cantidades de ingredientes activos medida es no más
de 15,0%.
ETAPA 2:
1. Llevar a cabo las pruebas de Uniformidad Visual y Uniformidad de los Ingredientes Activos en dos tubos adicionales para ob-
tener un total de dos muestras de cada uno de los tres tubos.
2. Determinar la cantidad de ingredientes activos en cada porción del producto usando cualquier procedimiento cuantitati-
vo apropiado validado y evaluar los resultados de la prueba de los tres tubos usado los criterios de aceptación de la Etapa
2 listados en el apartado número 3.
3. Los criterios de aceptación de la Etapa 2 se cumplen cuando:
•Todos los tubos cumplen con la prueba de Uniformidad Visual; y
• Ninguno de los seis resultados (es decir, dos de cada uno de los tres tubos) se encuentra fuera del intervalo devalo-
ración de producto por ±5,0% y
• La diferencia entre la cantidad de ingredientes activos determinada para las dos muestras de cada tubo, para cada
uno de los tres tubos analizados, es no más de 10,0%.
4. Proceder con las pruebas de la Etapa 3 si no más de uno de los seis resultados de prueba se encuentra fuera del intervalo
de valoración por ±5,0%, ninguno se encuentra fuera del intervalo de valoración de producto por± 15,0% y la diferencia
entre las cantidades de ingredientes activos medidas en cada tubo es no más de 15,0%.
ETAPA 3:
1. Si se completa la Etapa 2, llevar a cabo las pruebas de Uniformidad Visual y Uniformidad de los Ingredientes Activos en siete
tubos adicionales, para obtener un total de dos muestras de cada uno de los 1 O tubos. Si se omitió la Etapa 2, llevar a
cabo las pruebas de Uniformidad Visual y Uniformidad de los Ingredientes Activos en nueve tubos adicionales, para obtener
un total de dos muestras de cada uno de los 1 O tubos.
2. Determinar la cantidad de los ingredientes activos en cada porción del producto, usando cualquier procedimiento cuanti-
tativo apropiado validado y evaluar los resultados de las pruebas realizadas en los 1 O tubos usando los criterios de acepta-
ción de la Etapa 3 listados en el apartado número 3.
3. Los criterios de aceptación de la Etapa 3 se cumplen cuando:
•Todos los tubos cumplen con la prueba de Uniformidad Visual; y
• 19 de los 20 resultados de la prueba se encuentran dentro del intervalo de valoración del producto ±5,0% y ninguno
se encuentra ±15,0% por fuera del intervalo de valoración del producto; y
• La diferencia entre la cantidad de ingredientes activos determinada para las dos muestras de cada tubo, para cada
uno de los 1 O tubos analizados, es no más de 15,0%.
USP 40 Requisitos Generales/ (3) Medicamentos Tópicos y Transdérmicos 93

PRODUCTOS ENVASADOS EN ENVASES DIFERENTES A LOS TUBOS

Para los productos semisólidos que se envasan en envases diferentes a los tubos, para los que no se pueda usar el método de
muestreo anteriormente presentado, se pueden aceptar otros métodos como este método descrito para un frasco:
1. Seleccionar una jeringa adecuada cuya longitud sea suficiente para alcanzar el fondo del recipiente.
2. Retirar y colocar aparte el émbolo de la jeringa, y cortar la parte inferior del cuerpo de la jeringa. El muestreo se debe
llevar a cabo desde un punto a la izquierda o derecha de una línea media en la superficie del tarro a fin de conservar una
región intacta en el otro lado para cualquier investigación adicional (Ver la Figura 1).

PARTE SUPERIOR

PARTE MEDIA

PARTE INFERIOR

Figura 1 . Muestreo de un frasco.

3. Presionar lentamente el cuerpo de la jeringa hacia el interior del envase hasta alcanzar el fondo. Luego, hacer girar el cuer-
po de la jeringa que contiene el núcleo de la muestra y retirar la jeringa del envase.
4. Insertar el émbolo de la jeringa en el cuerpo y extrudir cuidadosamente el núcleo de la muestra sobre una superficie lim-
pia en tres porciones iguales que representen a las partes superior, media e inferior del envase.
5. Retirar una muestra apropiada, que sea representativa de las partes superior, media e inferior de las muestras del envase, y
analizar de acuerdo con las instrucciones citadas en Productos Envasados en Tubos.

PRUEBAS ESPECÍFICAS PARA SISTEMAS TRANSDÉRMICOS DE LIBERACIÓN DE FÁRMACOS

Los sistemas transdérmicos de liberación de fármacos se formulan con una capa de adhesivo para asegurar el contacto ínti-
mo con la piel y para permitir la administración de la dosis deseada de fármaco. El adhesivo de los sistemas transdérmicos de
liberación de fármacos debe permitir el fácil desprendimiento de la capa protectora antes de su uso, se debe adherir adecuada-
mente a la piel humana durante la aplicación, debe mantener su adhesión a la piel durante el periodo de uso prescrito y debe
permitir el fácil retiro del sistemas transdérmicos de liberación de fármacos al final de su uso sin dejar residuo u ocasionar da-
ños a la piel u otros efectos no deseados. Asimismo, los adhesivos deben tener la capacidad de mantener el desempeño de los
sistemas transdérmicos de liberación de fármacos durante toda la vida útil del medicamento.
Por lo general, se analizan propiedades físicas de los sistemas transdérmicos de liberación de fármacos tales como desprendi-
miento, desprendimiento de la capa protectora, adherencia, flujo frío, corte y formación de cristales (ver Formación de Crista-
les). Las pruebas de desprendimiento, desprendimiento de la capa protectora y adherencia miden las propiedades de adheren-
cia de los sistemas transdérmicos de liberación de fármacos. Cada una de estas pruebas mide la fuerza requerida para separar
el sistema transdérmico de liberación de fármacos de otra superficie. Las pruebas de flujo frío y de corte miden las propiedades
de cohesión de los sistemas transdérmicos de liberación de fármacos. Estas últimas pruebas miden la resistencia a fluir de la
matriz adhesiva.
Los criterios de aceptación son específicos del producto y se definen con el fin de garantizar que la adhesividad de cada
partida de sistemas transdérmicos de liberación de fármacos se encuentre dentro del intervalo definido por el diseño del pro-
ducto y sea uniforme entre partidas, basándose en las especificaciones de desarrollo del producto y en la evaluación estadística
de múltiples partidas de producto durante la vida útil del mismo.
Además del análisis de las propiedades físicas, esta sección también trata la Prueba de Fugas que se aplica a los sistemas
transdérmicos de liberación de fármacos de tipo moldeado-llenado-sellado (en reservorios o bolsas).

Prueba de Desprendimiento

Esta prueba mide la fuerza requerida para retirar (desprender) un sistemas transdérmicos de liberación de fármacos adherido
a una superficie de un sustrato estándar (p.ej., acero inoxidable pulido). El sistema transdérmico de liberación de fármacos se
aplica al sustrato usando las técnicas especificadas para aplicación y se acondiciona a una temperatura y tiempo específicos.
Luego, el sistema transdérmico de liberación de fármacos se desprende del sustrato con un instrumento que permite controlar
el ángulo de desprendimiento (p.ej., 90º o 180º) y la velocidad de desprendimiento (p.ej., 300 mm/min), mientras se registra
la fuerza de desprendimiento. Este procedimiento se repite usando un mínimo de cinco muestras independientes. El producto
94 (3) Medicamentos Tópicos y Transdérmicos / Requisitos Generales USP 40

no cumple con la prueba si la fuerza promedio de desprendimiento se encuentra fuera del intervalo aceptable, determinado
durante el desarrollo del producto y basado en la evaluación estadística de múltiples partidas de producto durante la vida útil
del mismo.

Prueba de Desprendimiento de la Capa Protectora

Esta prueba mide la fuerza requerida para separar la capa protectora de la capa de adhesivo del sistema transdérmico de
liberación de fármacos. La prueba se lleva a cabo con una muestra de producto terminado. La muestra de prueba se acondi-
ciona usando procedimientos específicos (temperatura y tiempo). Luego, la capa protectora se desprende del sistema transdér-
mico de liberación de fármacos con un instrumento que permite controlar el ángulo de desprendimiento (p.ej., 90º o 180º) y
la velocidad de desprendimiento (p.ej., 300 mm/min), mientras se registra la fuerza de desprendimiento. Este procedimiento
se repite usando un mínimo de cinco muestras independientes. El producto no cumple con la prueba si la fuerza promedio de
desprendimiento se encuentra fuera del intervalo aceptable, determinado durante el desarrollo del producto y basado en la
evaluación estadística de múltiples partidas de producto durante la vida útil del mismo.

Prueba de Adherencia

Se han desarrollado diversos métodos para analizar la adherencia. Por ejemplo el Método de Adherencia a Sonda y el Método
de Bola Rodante. Queda a criterio del fabricante del sistema transdérmico de liberación de fármacos decidir qué prueba de ad-
herencia es la más adecuada para cada medicamento.

MÉTODO DE ADHERENCIA A SONDA

Esta prueba mide la fuerza requerida para separar la punta de la sonda de prueba de la capa de adhesivo del sistema trans-
dérmico de liberación de fármacos. Esta prueba emplea un instrumento diseñado para crear una unión entre la punta de una
sonda de prueba de acero inoxidable (con una geometría definida) y el sistema transdérmico de liberación de fármacos, usan-
do una fuerza controlada (presión ligera) y condiciones de prueba específicas (es decir, velocidad, tiempo de contacto, presión
de contacto y temperatura). Luego, mientras se controla la velocidad de desprendimiento de la sonda, la prueba mide el perfil
de la fuerza requerida para separar la punta de la sonda del sistema transdérmico de liberación de fármacos y la fuerza máxima
requerida para romper la unión (adherencia). Este procedimiento se repite usando un mínimo de cinco muestras independien-
tes. El producto no cumple con la prueba si el resultado de prueba promedio [perfiles de fuerza y/o adherencia] se encuentra
fuera del intervalo aceptable, determinado durante el desarrollo del producto y basado en la evaluación estadística de múlti-
ples partidas de producto durante la vida útil del mismo.

MÉTODO DE BOLA RODANTE

Esta prueba mide la distancia recorrida por una bola definida sobre la capa de adhesivo del sistema transdérmico de libera-
ción de fármacos usando condiciones definidas, como parámetro que depende de las propiedades adherentes de la capa de
adhesivo. Esta prueba emplea una configuración diseñada para rodar una bola (de material, peso, tamaño y superficie defini-
dos) desde una rampa (con un ángulo y longitud definidos) sobre la capa de adhesivo (con orientación definida) en condicio-
nes de prueba específicas (p.ej., temperatura; ver la ASTM 03 72 7 para más detalles). La distancia recorrida por la bola sobre la
capa de adhesivo se mide usando un dispositivo de medición adecuado. Este procedimiento se repite usando un mínimo de
cinco muestras independientes. El producto no cumple con la prueba si la distancia promedio recorrida se encuentra fuera del
intervalo aceptable, determinado durante el desarrollo del producto y basado en la evaluación estadística de múltiples partidas
de producto durante la vida útil del mismo.

Prueba de Flujo Frío

El flujo frío es la migración de la matriz adhesiva fuera del borde de la capa posterior del sistema transdérmico de liberación
de fármacos así como a través del corte en la capa protectora, que puede ocurrir durante el procesamiento y almacenamiento
del producto. El flujo frío es una propiedad inherente de los sistemas transdérmicos de liberación de fármacos debido al uso de
adhesivos sensibles a la presión que fluyen cuando se aplica fuerza (es decir, si la matriz adhesiva no fluyera, el sistema trans-
dérmico de liberación de fármacos no se adheriría). La magnitud del flujo frío depende por lo general de la formulación, condi-
ciones y tiempo de almacenamiento del producto. El flujo frío se debe medir cualitativa y cuantitativamente usando un méto-
do adecuado. Queda a criterio del fabricante del sistema transdérmico de liberación de fármacos decidir qué prueba de flujo
frío es la más adecuada para cada medicamento. Los criterios de aceptación son específicos del producto y se definen con el
fin de garantizar que el flujo frío de cada partida del sistema transdérmico de liberación de fármacos se encuentre dentro del
intervalo definido por el diseño del producto y sea uniforme entre partidas, basándose en las especificaciones de desarrollo del
producto y en la evaluación estadística de múltiples partidas durante la vida útil del mismo.
USP 40 Requisitos Generales/ (3) Medicamentos Tópicos y Transdérmicos 95

Prueba de Corte

La Prueba de Corte mide la fuerza de cohesión de un sistema transdérmico de liberación de fármacos. Puede medirse en con-
diciones estáticas (ver Prueba Estática de Corte) o dinámicas. La prueba de corte no puede ser aplicada a todos los sistemas
transdérmicos de liberación de fármacos debido a la presencia de múltiples capas de adhesivo en el sistema, la presencia de
una membrana o gasa, o el uso de un sistema de emulsión adhesiva que pueden causar problemas para obtener una falla en la
cohesión del producto. Los sistemas transdérmicos de liberación de fármacos construidos con un anillo adhesivo periférico o
de tipo moldeado-llenado-sellado pueden no ser aptos para esta prueba. Queda a criterio del fabricante de sistemas transdér-
micos de liberación de fármacos decidir qué prueba de corte es la más adecuada para cada medicamento. Los criterios de
aceptación son específicos del producto y se definen con el fin de garantizar que el corte de cada partida del sistema transdér-
mico de liberación de fármacos se encuentre dentro del intervalo definido por el diseño del producto y sea uniforme entre
partidas, basándose en las especificaciones de desarrollo del producto y en la evaluación estadística de múltiples partidas de
producto durante la vida útil del mismo.

Prueba Estática de Corte

En la Prueba Estática de Corte se mide el tiempo requerido para retirar un área estándar del sistema transdérmico de libera-
ción de fármacos del sustrato (p.ej., un panel de prueba de acero inoxidable) por debajo de una carga estándar (p.ej., 250 g).
El sistema transdérmico de liberación de fármacos se aplica a un panel de prueba y la muestra se somete a una fuerza de corte
mediante el uso de un peso dado suspendido del sistema transdérmico de liberación de fármacos. El aparato de prueba sostie-
ne el panel de prueba a Oº- 2º de la vertical para garantizar que el sistema transdérmico de liberación de fármacos no experi-
mentará una acción de desprendimiento una vez que se sujete el peso. Se deben registrar el tiempo de residencia, el peso
usado, el tipo de panel de prueba, el modo de falla y el tamaño de la muestra. De igual manera se debe informar el tiempo
que tomó la muestra del sistema transdérmico de liberación de fármacos para desprenderse del panel de prueba. Este procedi-
miento se repite usando un mínimo de cinco muestras independientes que produzcan resultados válidos (ver Determinación de
la Validez de Ja Prueba Estática de Corte). El producto no cumple con la prueba si la fuerza promedio de corte (es decir, el pro-
medio aritmético o el promedio geométrico según lo determine el fabricante) se encuentra fuera del intervalo aceptable deter-
minado durante el desarrollo del producto, basándose en la evaluación estadística de múltiples partidas de producto durante la
vida útil del mismo.

DETERMINACIÓN DE LA VALIDEZ DE LA PRUEBA ESTÁTICA DE CORTE

La cohesión es el modo de falla esperado durante la prueba estática de corte. La falla de cohesión se presenta cuando per-
manece adhesivo en el sistema transdérmico de liberación de fármacos y en el panel de prueba de acero inoxidable. En con-
traste, una falla de adhesión ocurre cuando: 1) el sistema transdérmico de liberación de fármacos se desprende sin problema
del panel de prueba de acero inoxidable, sin dejar trazas visibles de adhesivo en el mismo; 2) el adhesivo se transfiere al panel
de prueba de acero inoxidable, sin dejar adhesivo en el sistema transdérmico de liberación de fármacos o 3) el sistema trans-
dérmico de liberación de fármacos se rompe en láminas en una interfase (p.ej., entre una membrana y una capa de adhesivo,
o entre dos capas diferentes de adhesivo de un producto de dos capas). La prueba de la muestra es inválida si se presentan
fallas de adhesión. Adicionalmente, si el sistema transdérmico de liberación de fármacos se rompe o rasga antes de despren-
derse del panel de prueba de acero inoxidable o se desliza fuera de la abrazadera o si la pesa colgante no cuelga libremente, la
prueba de la muestra es invalida.

Prueba de Fugas

Esta prueba se aplica únicamente a los sistemas transdérmicos de liberación de fármacos de tipo moldeado-llenado-sellado
(en reservorios o bolsas). El sistema transdérmico de liberación de fármacos de tipo moldeado-llenado-sellado se debe fabricar
manteniendo un enfoque de cero tolerancia para fugas, debido al potencial de pérdida de dosis ante la presencia de las mis-
mas.
Es necesario implementar métodos de control durante el proceso para examinar la presencia de fugas o de elementos que
pudieran ocasionar fugas en los sistemas transdérmicos de liberación de fármacos. Dichos métodos requieren un desarrollo im-
portante por parte de los fabricantes de sistemas transdérmicos de liberación de fármacos.

ANÁLISIS DURANTE EL PROCESO

Durante el proceso de fabricación, se debe examinar el sistema transdérmico de liberación de fármacos para detectar la pre-
sencia de fugas (o el potencial de fugas) por perforación, cortadura o sello defectuoso generado por fallas tales como burbujas
de aire, salpicaduras del gel o mala alineación de la capa posterior y de la capa protectora. A menos que se implemente una
tecnología analítica automatizada de proceso, se debe llevar a cabo un análisis durante el proceso para identificar estos defec-
tos usando los siguientes procedimientos de prueba.
96 (3) Medicamentos Tópicos y Transdérmicos / Requisitos Generales USP 40

Inspección visual:
• Examinar aleatoriamente un número específico de sistemas transdérmicos de liberación de fármacos, el cual se define ba-
sándose en el tamaño de la partida.
• Inspeccionar cada sistema transdérmico de liberación de fármacos muestreado visualmente y de manera minuciosa para
detectar fugas.
• El producto no cumple con la prueba si alguno de los sistemas transdérmicos de liberación de fármacos examinados pre-
senta una fuga.
Integridad del sello: Los sellos de los sistemas transdérmicos de liberación de fármacos deben someterse a pruebas de estrés
para asegurar que la presión aplicada no fuerce la apertura del sello, lo cual generaría una fuga.
• Examinar aleatoriamente un número específico de sistemas transdérmicos de liberación de fármacos, el cual se define ba-
sándose en el tamaño de la partida.
• Inspeccionar cada sistema transdérmico de liberación de fármacos muestreado visualmente y de manera minuciosa para
detectar fugas.
• Colocar cada sistema transdérmico de liberación de fármacos muestreado sobre una superficie rígida y plana, y colocar
encima un peso de 13,6 kg. Dejar que el peso descanse encima del sistema transdérmico de liberación de fármacos du-
rante 2 minutos. Una vez retirado el peso, inspeccionar visualmente el sistema transdérmico de liberación de fármacos
para detectar fugas.
• El producto no cumple con la prueba si el número de sistema transdérmico de liberación de fármacos que presentan fu-
gas es mayor que el límite aceptable establecido por el fabricante.
Prueba del producto envasado: Los sistemas transdérmicos de liberación de fármacos pueden presentar fugas después de
haber sido envasados en sus envases primarios debido a la operación misma de envasado o debido a la apertura del envase
por parte del usuario. En consecuencia, los sistemas transdérmicos de liberación de fármacos deben ser analizados para detec-
tar fugas después de su fabricación y de su envasado en el material de envasado primario.
• Examinar aleatoriamente un número específico de sistemas transdérmicos de liberación de fármacos, el cual se define ba-
sándose en el tamaño de la partida, después de colocarlos en su material de envasado primario.
• Retirar los sistemas transdérmicos de liberación de fármacos muestreados de su envase e inspeccionarlos visualmente y de
manera minuciosa para detectar fugas.
a Luego, frotar uniformemente cada sistema transdérmico de liberación de fármacos muestreado con un hisopo humedeci-
do con un disolvente. Es necesario frotar tanto el lado posterior como el lado de la capa protectora del sistema transdér-
mico de liberación de fármacos. Asimismo, se debe frotar la superficie interna de la bolsa. Luego, se debe extraer el fárma-
co del hisopo y valorar su contenido.
• El producto no cumple con la prueba si la cantidad total de fármaco del sistema transdérmico de liberación de fármacos,
y su bolsa correspondiente, excede el límite aceptable establecido por el fabricante.

(4) MEDICAMENTOS PARA MUCOSAS-PRUEBAS DE CALIDAD DEL

PRODUCTO

INTRODUCCIÓN

Para los propósitos de distinción taxonómica de formas farmacéuticas por vía de administración, la vía mucosa de adminis-
tración de medicamentos se subdivide en siete superficies de membrana, las cuales se caracterizan como áticas, oftálmicas,
nasales, orofaríngeas, uretrales, vaginales y rectales. Dicha clasificación no incluye la vía mucosa pulmonar, tratada en el capí-
tulo Medicamentos Nasales y para Inhalación-Información General y Pruebas de Calidad del Producto (5). Un medicamento se
administra en cualquiera de estas siete superficies mucosas para producir una acción local o una absorción sistémica. La acción
local ocurre en el área próxima a la de aplicación. Cuando se pretende generar una acción local, por lo regular no se desea la
absorción sistémica la cual además es innecesaria para el efecto terapéutico. No obstante, en algunos casos, se usa la adminis-
tración de un medicamento por vía mucosa para absorción sistémica debido a que evita el metabolismo de primer paso, pro-
vee una administración sistémica más rápida, o representa una alternativa cuando la administración oral no es posible (en el
tracto gastrointestinal) debido a una enfermedad. Un gran número de formas farmacéuticas listadas en Formas Farmacéuticas
(1151) pueden administrarse a través de las diversas superficies de membrana en la categoría de mucosas. [NOTA-Todas las
referencias a los capítulos superiores a 1000 son únicamente para propósitos informativos y para su uso como recursos útiles.
Estos capítulos no son obligatorios a menos que su aplicación se exija explícitamente.]
Los procedimientos analíticos y criterios de aceptación para las pruebas de medicamentos se dividen en dos categorías:
aquéllas que evalúan los atributos generales de calidad del producto y aquéllas que evalúan el desempeño del producto. Las
pruebas de calidad de los medicamentos evalúan atributos tales como identificación, valoración (contenido), impurezas y uni-
formidad de contenido de la dosis, y, por lo general, forman parte de la monografía oficial. Las pruebas de desempeño del
producto incluyen la prueba de disolución para una forma farmacéutica oral sólida (ver Disolución (711 )) y la prueba de libera-
USP 40 Requisitos Generales/ (4) Medicamentos para Mucosas 97

ción de fármacos (ver Liberación de Fármacos (724)). En conjunto, las pruebas de calidad y de desempeño aseguran la identi-
dad, contenido, calidad y pureza de un medicamento para mucosas.
Este capítulo provee listas de los requisitos de pruebas de calidad de productos comunes consolidados en un formato cohe-
rente y conciso. Este capítulo es aplicable, en su totalidad o en parte, cuando se haga referencia al mismo en una monografía
de un medicamento (ver Advertencias Generales, 3.1 O Aplicabilidad de las Normas). Las pruebas de calidad listadas pueden ser
usadas por los fabricantes, según corresponda, en el desarrollo de nuevas monografías para medicamentos que se van a pre-
sentar ante la USP.

PRUEBAS DE CALIDAD DE MEDICAMENTOS PARA MUCOSAS

Este capítulo provee pruebas de calidad generalmente necesarias, pruebas aplicables a productos específicos y pruebas apli-
cables a una o más de las vías mucosas específicas. Se espera que cualquier forma farmacéutica que se administre por una vía
mucosa específica se analice mediante las pruebas de calidad que en este capítulo se citan bajo el encabezado correspondiente
a dicha vía específica.

Pruebas Generalmente Necesarias

Los atributos de calidad de las formas farmacéuticas para mucosas deben reflejar requisitos aceptables para los productos
que se hallan en el mercado. Las siguientes pruebas deben aplicarse de manera general a todas las formas farmacéuticas desti-
nadas para administración por mucosas. Las pruebas que son generalmente necesarias para todos los artículos incluyen: Defini-
ción, Identificación, Valoración e Impurezas (orgánicas, inorgánicas y disolventes residuales). Por lo regular, la monografía de un
producto USP incluye la referencia a la prueba del capítulo Uniformidad de Unidades de Dosificación (905).

DEFINICIÓN

La sección definición (ver Advertencias Generales, 4.1 O Monografías) de una monografía USP describe el medicamento y espe-
cifica el intervalo aceptable para el contenido valorado de los fármacos presentes en la forma farmacéutica. Para ciertos pro-
ductos, la definición incluye toda la información adicional pertinente, como por ejemplo, la presencia o ausencia de otros
componentes, excipientes o coadyuvantes y declaraciones precautorias sobre toxicidad y estabilidad. La información sobre la
apariencia se usa en registros reglamentarios para ayudar a la identificación del producto. Debido a que atributos tales como
tamaño, forma, color y otros son características individuales de cada producto individual en el mercado, por lo general no se
requiere una descripción cualitativa como parte de una monografía USP (ver el capítulo (1151 )).

IDENTIFICACIÓN

La identificación se incluye en una monografía como una ayuda para verificar la identidad del artículo (ver Advertencias Ge-
nerales, 5.40 Identidad).

VALORACIÓN

La valoración se usa para determinar la concentración del fármaco (o su contenido) en el medicamento. Por lo regular, la
valoración es específica e indicadora de estabilidad. Cuando se justifique una valoración inespecífica, otros procedimientos
analíticos complementarios deberían asegurar la detección y limitación de cualquier especie interferente. Los resultados de la
valoración a menudo se informan como porcentaje de la cantidad declarada, con criterios de aceptación que por lo general
están en el intervalo de 90,0% a 110,0%. Para algunos productos antibióticos, el intervalo puede ser más amplio. La amplitud
de estos límites tiene como propósito dejar margen a la variabilidad de la fabricación, incluyendo cambios en la estabilidad, así
como variación analítica. El intervalo de aceptación más estrecho de 95,0%-105,0% se usa con menos frecuencia y requiere
justificación.

IMPUREZAS

Las impurezas del proceso incluyen aquéllas que surgen de los materiales de partida, subproductos de síntesis, así como
otras impurezas orgánicas e inorgánicas que pueden estar presentes en el fármaco y en los excipientes usados en la fabricación
del medicamento. Se establecen límites para estas impurezas, según se especifica en las monografías del fármaco y de los exci-
pientes. Las impurezas en el medicamento también pueden resultar de la degradación del fármaco o de los excipientes, de las
interacciones entre el fármaco y un excipiente o de las interacciones entre el fármaco y los componentes del envase. Los proce-
dimientos y criterios de aceptación deben limitar específicamente los productos de degradación tóxicos así como los produc-
tos de degradación que comprometen la calidad del artículo si estos exceden ciertos niveles. El capítulo Impurezas en Fármacos
98 (4) Medicamentos para Mucosas/ Requisitos Generales USP 40

y Productos Farmacéuticos (1086) 1 y el documento ICH Q3B lmpurities in New Drug Products (Impurezas en Nuevos Medica-
mentos)1 proveen una discusión más completa sobre este tema.

UNIFORMIDAD DE UNIDADES DE DOSIFICACIÓN

El capítulo (905) se usa para asegurar que la uniformidad del contenido del fármaco en las unidades de dosificación se en-
cuentre dentro de un intervalo estrecho cercano a la cantidad declarada. La prueba se aplica sólo a formas farmacéuticas que
contienen una única dosis o parte de una dosis de un fármaco en cada unidad. La uniformidad de unidades de dosificación se
puede demostrar mediante uno de dos métodos: uniformidad de contenido o variación de peso. La uniformidad de contenido
se basa en las valoraciones de un número de unidades de dosificación individuales. La variación de peso se puede usar para
estimar la uniformidad de contenido en ciertas condiciones.

Formas Farmacéuticas por Vías Mucosas Específicas y Pruebas Específicas del Producto

Además de las pruebas de calidad generalmente necesarias previamente discutidas, la forma farmacéutica puede requerir
pruebas de calidad específicas que son comunes a diversas vías de administración. El capítulo Medicamentos Inyectables y en
Implantes (1) provee requisitos de análisis comunes para productos inyectables e implantes. El capítulo Medicamentos Orales-
Pruebas de Calidad del Producto (2) provee requisitos de análisis para tabletas y tabletas de disolución bucal. El capítulo Medica-
mentos Tópicos y Transdérmicos-Pruebas de Calidad del Producto (3) provee requisitos de análisis comunes para semisólidos
(cremas, ungüentos y geles). El capítulo (5) presenta requisitos de análisis para espráis y aerosoles. Para los casos en los que
este capítulo no presenta una prueba específica para una forma farmacéutica, no se requieren pruebas adicionales a menos
que se incluyan en la especificación de la monografía individual.

VÍA ÓTICA

La vía ótica se caracteriza por la administración de una preparación en o a través del oído. No siempre se requiere demostrar
la esterilidad (ver Pruebas de Esterilidad (71 )) para productos administrados en el oído. Por lo regular, la esterilidad se requiere
cuando el producto se administra en el oído interno o cuando el tímpano se encuentra dañado. Para casos en los que no se
requiere esterilidad, puede ser necesario el recuento cuantitativo de bacterias mesófilas y hongos que crecen en condiciones
anaeróbicas, ver Pruebas de Recuento Microbiano (61) o la determinación de la ausencia o presencia limitada de organismos
específicos, ver Pruebas de Microorganismos Específicos (62).
Si se usa un conservante antimicrobiano, puede ser necesario cumplir con los requisitos de los capítulos Pruebas de Eficacia
Antimicrobiana (51) y Agentes Antimicrobianos-Contenido (341 ).
Las formas farmacéuticas administradas por vía ótica incluyen líquidos, soluciones y suspensiones.

VÍA OFTÁLMICA

La vía oftálmica se refiere a la administración en el ojo. Además de las pruebas generalmente necesarias, se deben considerar
las siguientes pruebas específicas para medicamentos oftálmicos (ver la Tabla 1). Para productos que se inyectan o implantan
en el ojo, ver el capítulo (1 ). A continuación se citan algunas de las pruebas importantes de calidad del producto para produc-
tos administrados por la vía oftálmica. Ver Productos Oftálmicos-Pruebas de Calidad (771) para detalles y demás información
sobre calidad de productos.
• Partículas y Materia Extraña
• Esterilidad
•Tamaño de Partícula y Distribución del Tamaño de la Partícula
• Conservantes Antimicrobianos
Tabla 1. Medicamentos Administrados por la Vía Oftálmica, Pruebas Específicas
Vía Oftálmica
Forma Farmacéutica Pruebas Específicas del Producto
Llenado Mínimo (755)
Geles (3)

1 ICH Q3B (R2) lmpurities in New Drug Products, 2006, http://www.ich.org/products/guidelines/quality/article/quality-guidelines.html. Consultado el 28 de mayo
de 2015.
USP 40 Requisitos Generales/ (4) Medicamentos para Mucosas 99

Ta bl a 1. Medi camentos Ad mm
. 1stra d os por a V1a Of ta'I mica, Pruebas Especificas (Continuacion)
Vía Oftálmica
Forma Farmacéutica Pruebas Específicas del Producto
Osmolalidad y Osmolaridad (785)
pH(791)
Tensión superficial
Viscosidad-Métodos Capilares (911)
Viscosidad-Métodos Rotatorios (912)
Emulsiones Potencial zeta
Insertos Prueba de Endotoxinas Bacterianas (85)
(755)
Ungüentos (3)
Partículas en Soluciones Oftálmicas (789)
(791)
(911)
(912)
Viscosidad-Método de Bola Rodante (91 3)
Soluciones (785)
En la actualidad no existen pruebas específicas (pueden aplicarse requisi-
Tiras tos adicionales específicos de las monografías)
(791)
(785)
Tamaño de partícula y distribución del tamaño de la partícula
(911)
(912)
Suspensiones (913)

VÍA NASAL

La vía nasal se refiere a la administración en o a través de la nariz para efecto local o sistémico (ver la Tabla 2).
T a bl a 2 M e di camentos Ad m 1'
mstra dos por IV'N
a asa,IP rue bE
as spec1T 1cas
'ª
Vía Nasal
Forma Farmacéutica Pruebas Específicas del Producto
Aerosoles (5)
(755)
Geles (Jalea) (3)
(755)
Ungüentos (3)
Espráis (5)
Soluciones (5)

VÍA OROFARÍNGEA

La vía orofaríngea se refiere a la administración en la cavidad oral y/o la región faríngea. La vía orofaríngea se subclasifica por
superficies intra-orales específicas, tales como bucal o sublingual. Las administraciones bucal y sublingual por lo general están
destinadas a promover la absorción sistémica mediante la permeación a través de la mucosa respectiva. Sin embargo, en este
contexto, la administración oral puede referirse a la aplicación tópica para acción local (ver la Tabla 3). Las pruebas de calidad
para productos administrados en superficies orofaríngeas a menudo se ajustan a aquéllas para administración oral en el tracto
gastrointestinal (ver el capítulo (2)).
Tabla 3. Medicamentos Administrados por la Vía Orofaríngea, Pruebas Específicas
Vía Orofaríngea
Forma Farmacéutica Pruebas Específicas del Producto
Parches bucales Ver el capítulo (3) para requisitos de prueba comunes para parches.
En la actualidad no existen pruebas específicas (pueden aplicarse requisitos
Películas adicionales específicos de las monografías)
100 (4) Medicamentos para Mucosas/ Requisitos Generales USP 40

Tabla 3. Medicamentos Administrados por la Vía Orofaríngea, Pruebas Específicas (Continuación)

Vía Orofaríngea
Forma Farmacéutica Pruebas Específicas del Producto
(755)
Geles (3)
En la actualidad no existen pruebas específicas (pueden aplicarse requisitos
Gomas adicionales específicos de las monografías)
En la actualidad no existen pruebas específicas (pueden aplicarse requisitos
Tabletas de Disolución Bucal adicionales específicos de las monografías)
(3)
Ungüentos (755)
En la actualidad no existen pruebas específicas (pueden aplicarse requisitos
Soluciones (Enjuagues) adicionales específicos de las monografías)
Espráis (5)
Tabletas (2)

VÍA URETRAL

La vía uretral se refiere a la administración dentro de la uretra, por lo regular para acción local, aunque también es posible la
distribución sistémica. Los capítulos (61) y (62) pueden ser aplicables. Los medicamentos en esta categoría incluyen insertos
uretrales.

VÍA VAGINAL

La vía vaginal se refiere a la administración dentro de la vagina, por lo regular para acción local, aunque también es posible
la distribución sistémica. Los capítulos (61) y (62) pueden ser aplicables (ver la Tabla 4).
Densidad relativa de espumas: Determinar la densidad relativa de espumas pesando una masa de espuma (m) y una masa
del mismo volumen de agua (e) en un recipiente de fondo plano. Densidad relativa de espumas= m/e.
Volumen de expansión de espumas: Estimar el volumen de expansión de espumas a 25º usando una bureta graduada y un
envase generador de espuma equipado con un disparador de dosis integrado a la bu reta.
Tabla 4. Medicamentos Administrados por la Vía Vaginal, Pruebas Específicas
Vía Vaginal
Forma Farmacéutica Pruebas Específicas del Producto
(755)
Cremas (3)
(755)
Aspecto físico (de la espuma y de la espuma colapsada)
Densidad relativa de espumas
Espumas Volumen de expansión de espumas
(755)
Geles (3)
En la actualidad no existen pruebas específicas (pueden aplicarse requisi-
Insertos tos adicionales específicos de las monografías)

VÍA RECTAL

La vía rectal se refiere a la administración en el recto. Los productos que se administran en el recto pueden producir efectos
locales o liberación en la circulación sistémica.
Tiempo de ablandamiento de supositorios lipofílicos: La prueba pretende determinar, en condiciones definidas, el tiempo
que transcurre hasta que un supositorio mantenido en agua a 37 ± 0,5º se ablanda hasta el grado en que ya no ofrece resisten-
cia al aplicarle un peso definido (ver la Tabla 5).
USP 40 Requisitos Generales/ (5) Medicamentos Nasales y para Inhalación 101

Tabla 5. Medicamentos Administrados por la Vía Rectal, Pruebas Específicas

Vía Rectal
Forma Farmacéutica Pruebas Específicas del Producto
(755)
Aspecto físico (de la espuma y de la espuma colapsada)
Densidad relativa de espumas
Espumas Volumen de expansión de espumas
(755)
Ungüentos (3)
Supositorios Tiempo de ablandamiento de supositorios lipofílicos
En la actualidad no existen pruebas específicas (pueden aplicarse requisi-
Soluciones tos adicionales específicos de las monografías)
En la actualidad no existen pruebas específicas (pueden aplicarse requisi-
Suspensiones tos adicionales específicos de las monografías)

(5) MEDICAMENTOS NASALES Y PARA INHALACIÓN-INFORMACIÓN

GENERAL Y PRUEBAS DE CALIDAD DEL PRODUCTO

1. INTRODUCCIÓN
Los medicamentos para inhalación entregan un fármaco en los pulmones mediante inhalación oral e incluyen las siguientes
formas farmacéuticas: aerosoles para inhalación, polvos para inhalación, espráis para inhalación, soluciones para inhalación,
suspensiones para inhalación, concentrados para preparar soluciones inhalables y fármacos para preparar solución inhalable.
Los medicamentos nasales entregan fármacos en la cavidad nasal e incluyen las siguientes formas farmacéuticas: aerosoles na-
sales, espráis nasales, soluciones nasales y polvos nasales. En este capítulo no se discuten los medicamentos nasales en forma
de gel ni ungüentos. La Tabla 1 provee una lista de nombres establecidos y definiciones para estas formas farmacéuticas. Asi-
mismo, en el capítulo Formas Farmacéuticas (1151) se proveen definiciones, información resumida acerca de los métodos de
fabricación y un glosario de nombres de estas formas farmacéuticas. [NOTA-Todas las referencias a los capítulos superiores a
1000 son únicamente para propósitos informativos y para su uso como recursos útiles. Estos capítulos no son obligatorios a
menos que su aplicación se exija explícitamente.]
Tabla 1. Nombres Establecidos y Definiciones
Nombre Establecido Definición
Medicamento para inhalación oral que se envasa a presión y entrega una cantidad específica de ingredientes terapéuti-
camente activos al activar un sistema de válvula que entrega una dosis exactamente medida. Los aerosoles para inhala-
Aerosol para Inhalación ción se conocen comúnmente como inhaladores de dosis fija (MDI, por sus siglas en inglés).
Medicamento en polvo para inhalación oral que se usa con un dispositivo que lo transforma en aerosol y libera una
cantidad exactamente medida de los ingredientes terapéuticamente activos. Los Polvos para Inhalación se conocen co-
Polvo para Inhalación múnmente como inhaladores de polvo seco.
Forma farmacéutica líquida de un medicamento para inhalación oral, en un envase no presurizado, que libera una can-
Espray para Inhalación tidad exactamente medida de la formulación en forma de niebla o rocío.
Solución para Inhalación Medicamento en solución para inhalación oral que se emplea con un sistema de nebulización.
Suspensión para Inhalación Medicamento en suspensión para inhalación oral que se emplea con un sistema de nebulización.
Concentrado para Solución Solución de un fármaco para inhalación oral que se debe diluir antes de su administración con un sistema de nebuliza-
lnhalable ción.
[Fármaco] p~ra Solución Medicamento en polvo que, al agregarle un vehículo adecuado, produce una solución que cumple con todos los aspee-
lnhalable tos de una Solución para Inhalación.
Medicamento para aplicación local en las fosas nasales que se envasa a presión y libera una cantidad específica de in-
Aerosol Nasal gredientes terapéuticamente activos al activar un sistema de válvula de dosis exactamente medida.
Forma farmacéutica líquida de un medicamento para aplicación local en las fosas nasales en un envase no presurizado
Espray Nasal que, al activarlo, libera una cantidad exactamente medida de la formulación en forma de niebla o rocío.
Solución Nasal Forma farmacéutica líquida de un medicamento no presurizado para aplicación local en las fosas nasales.
Medicamento en polvo para aplicación local en las fosas nasales que se usa con un dispositivo que libera y transforma
Polvo Nasal en aerosol una cantidad exactamente medida de los ingredientes terapéuticamente activos.

Este capítulo provee listas de los requisitos de pruebas de calidad de productos comunes y consolidadas en un formato
coherente y conciso. Este capítulo general es aplicable, en su totalidad o en parte, cuando se haga referencia al mismo en una
102 (5) Medicamentos Nasales y para Inhalación / Requisitos Generales USP 40

monografía de un medicamento (ver Advertencias Generales, 3. 7O Aplicabilidad de las Normas) e incluye las pruebas de calidad
para la vía de administración específica. Las pruebas de calidad listadas pueden ser usadas por los fabricantes, según corres-
ponda, en el desarrollo de nuevas monografías para medicamentos que se van a presentar ante la USP-NF. Cuando esté dispo-
nible un procedimiento de prueba validado para el medicamento específico, este se identifica en un capítulo general con un
número inferior a 1000. Toda la información adicional o la información sobre tecnologías venideras que aún no han sido vali-
dadas en su totalidad, puede estar disponible en los capítulos informativos con números superiores a 1000.

Pruebas Generales de Calidad y Pruebas de Calidad de Desempeño para Medicamentos

Una monografía de medicamento de la USP contiene pruebas, procedimientos analíticos y criterios de aceptación. Las prue-
bas de medicamentos se dividen en dos categorías: 1) pruebas que evalúan los atributos generales de calidad y 2) pruebas de
calidad que evalúan el desempeño del producto, p.ej., uniformidad de dosis liberada y sus características físicas tales como
distribución del tamaño aerodinámico de partícula. Las pruebas generales de calidad evalúan la integridad de la forma farma-
céutica, mientras que las pruebas de calidad del desempeño evalúan la liberación del fármaco y otros atributos que pueden
relacionarse con el desempeño in vivo del medicamento.
En conjunto, las pruebas de calidad y de desempeño garantizan la identidad, contenido, calidad y pureza de los medica-
mentos para inhalación y nasales.
Las dos secciones siguientes de este capítulo listan atributos de calidad del producto para medicamentos para inhalación y
para medicamentos nasales, respectivamente. La sección final describe en mayor detalle las pruebas de calidad para medica-
mentos para inhalación y nasales. El capítulo Medicamentos Nasales y para Inhalación: Pruebas de Calidad de Desempeño de Ae-
rosoles, Atomízadores y Polvos (601) contiene pruebas de desempeño del producto para medicamentos nasales y para inhala-
ción, y se debe usar junto con este capítulo.

2. PRUEBAS GENERALES DE CALIDAD PARA MEDICAMENTOS PARA INHALACIÓN

Aerosol para Inhalación

DESCRIPCIÓN

El término aerosol en este contexto es una forma farmacéutica que consiste en una preparación sólida o líquida envasada a
presión y destinada para su administración en forma de niebla fina. El término descriptivo aerosol también se refiere a la niebla
fina de diminutas gotitas o partículas sólidas que se emiten desde el dispositivo que contiene al medicamento. Los aerosoles
para inhalación, también conocidos como inhaladores de dosis fija, son preparaciones que se caracterizan por dispersar el in-
grediente farmacéutico activo en las vías respiratorias durante la aspiración oral para lograr un efecto local o sistémico, mien-
tras que los aerosoles nasales, que también se conocen como inhaladores de dosis fija nasales, se caracterizan por depositar los
ingredientes farmacéuticos activos en la cavidad nasal para lograr un efecto local o sistémico.
Una formulación en aerosol por lo regular contiene fármacos disueltos o suspendidos en propelentes o en una mezcla de
propelentes y codisolventes, y posiblemente otros excipientes adecuados. Un medicamento en aerosol para inhalación, co-
múnmente conocido como inhalador de dosis fija, libera una cantidad específica de ingredientes terapéuticamente activos con
una calidad definida al activar un sistema de válvula que libera una dosis exactamente medida. Las pruebas generales de cali-
dad para medicamentos en aerosoles para inhalación deben incluir lo siguiente (ver 4. Descripción de las Pruebas de Calidad del
Producto para un análisis más detallado de cada prueba):
• Identificación
• Valoración
• Impurezas y Productos de Degradación
• Contenido de Agua
• Partículas Extrañas
• Sustancias Lixiviables
• Patrón de Rocío
• Límite Microbiano
• Contenido de Alcohol (si estuviera presente)
• Peso de Llenado Neto
• Velocidad de Fuga
• Para pruebas de calidad de desempeño, ver el capítulo (601)
USP 40 Requisitos Generales/ (5) Medicamentos Nasales y para Inhalación 103

Solución para Inhalación

DESCRIPCIÓN

Los medicamentos en solución para inhalación por lo general tienen una base acuosa y son preparaciones estériles. Están
diseñados para ser transportados a los pulmones mediante nebulización con un nebulizador externo específico. Dichas prepa-
raciones medicinales por lo general se envasan en envases monodosis semipermeables e incluyen además un empaque protec-
tor para minimizar el ingreso de contaminantes extraños volátiles, la pérdida de disolvente y la exposición al oxígeno y la luz.
La nebulización implica la generación mediante energía ultrasónica, efecto de Venturi u otros medios mecánicos/eléctricos
apropiados de una niebla fina de gotitas acuosas que contienen el fármaco en solución, y su continua administración al pacien-
te. Las pruebas generales de calidad para soluciones para inhalación deben incluir lo siguiente (ver 4. Descripción de las Pruebas
de Calidad del Producto para un análisis más detallado de cada prueba):
• Identificación
• Valoración
• Impurezas y Productos de Degradación
•Uniformidad de Contenido (dosis previamente medidas)
•Valoración de Conservante Anti microbiano y Excipientes Estabilizadores (si estuvieran presentes)
• Esterilidad
• Partículas Extrañas
• pH
• Osmolalidad
• Sustancias Lixiviables
• Peso de Llenado Neto
• Pérdida de Peso
• Para información sobre pruebas de calidad del desempeño, ver Productos para Nebulízación-Pruebas de Caracterización
(1601 >

Suspensión para Inhalación

DESCRIPCIÓN

Los medicamentos en suspensión para inhalación por lo general tienen una base acuosa y son preparaciones estériles. Están
diseñados para ser transportados a los pulmones mediante nebulización con un nebulizador externo específico. Dichas prepa-
raciones medicinales por lo general se envasan en envases monodosis semipermeables e incluyen además un empaque protec-
tor para minimizar el ingreso de contaminantes extraños volátiles, la pérdida de disolvente y la exposición al oxígeno y la luz.
La nebulización implica la generación mediante energía ultrasónica, efecto de Venturi u otros medios mecánicos apropiados de
una niebla fina de gotitas acuosas que contienen los componentes de la formulación y su continua administración al paciente.
Las pruebas generales de calidad para suspensiones para inhalación deben incluir lo siguiente (ver 4. Descripción de las Pruebas
de Calidad del Producto para un análisis más detallado de cada prueba):
• Distribución del tamaño de la partícula de la formulación en el envase inmediato
• Para todos los demás atributos generales de calidad, referirse a los atributos en Solución para Inhalación anteriormente in-
dicados.

Concentrado para Solución lnhalable

DESCRIPCIÓN

Los medicamentos concentrados para solución inhalable por lo general tienen una base acuosa y son preparaciones estériles.
Al diluirlos, de acuerdo con las instrucciones del etiquetado, incluyendo la identidad y la cantidad de vehículo para dilución,
están diseñados para ser transportados a los pulmones mediante nebulización usando un nebulizador externo. Dichas prepara-
ciones medicinales por lo general se envasan en envases monodosis semipermeables e incluyen además un empaque protector
para minimizar el ingreso de contaminantes extraños volátiles, la pérdida de disolvente y la exposición al oxígeno y la luz. La
nebulización implica la generación mediante energía ultrasónica, efecto de Venturi u otros medios mecánicos/eléctricos apro-
piados de una niebla fina de gotitas acuosas que contienen los componentes de la formulación y su continua administración al
paciente. Las pruebas generales de calidad para concentrados para soluciones inhalables deben incluir lo siguiente (ver 4. Des-
cripción de las Pruebas de Calidad del Producto para un análisis más detallado de cada prueba):
•Transparencia y color de la solución luego de la dilución de acuerdo con las instrucciones del etiquetado
• Para todos los demás atributos generales de calidad, referirse a los atributos en Solución para Inhalación anteriormente in-
dicados.
104 (5) Medicamentos Nasales y para Inhalación / Requisitos Generales USP 40

Fármacos para Solución lnhalable

DESCRIPCIÓN (POLVO)

Un fármaco para solución inhalable es un medicamento en polvo (con un colorante específico) que al agregarle un vehículo
adecuado, de acuerdo con las instrucciones del etiquetado, incluyendo la identidad y la cantidad de vehículo para dilución,
produce una solución que cumple con todos los aspectos de los requisitos en Solución para Inhalación. Las pruebas generales
de calidad para fármacos para soluciones inhalables deben incluir lo siguiente (ver 4. Descripción de las Pruebas de Calidad del
Producto para un análisis más detallado de cada prueba):
• Contenido de agua
• Transparencia, color y totalidad de la solución dentro del tiempo especificado, luego de la reconstitución
• Para todos los demás atributos generales de calidad, referirse a los atributos en Solución para Inhalación anteriormente in-
dicados luego de reconstituir el medicamento.

Espray para Inhalación

DESCRIPCIÓN

Los medicamentos en espray para inhalación por lo general son formulaciones líquidas con base acuosa envasadas en un
sistema de envase-cierre compacto que contiene una unidad de bomba atomizadora integrada que al activarla descarga una
cantidad exactamente medida de una niebla fina de gotitas de la formulación. La niebla puede generarse por diversos medios
tales como acción mecánica, electricidad, o energía derivada de la aspiración por parte del paciente. Los mecanismos a través
de los cuales se generan las gotitas difieren entre los varios tipos de espráis para inhalación. Estos medicamentos pueden pro-
veerse en presentaciones de dosis única o multidosis. Los medicamentos en espray para inhalación pueden formularse en pre-
sentaciones con dosis medidas por el dispositivo o dosis previamente medida. Una unidad para dosis previamente medidas
contiene una cantidad de formulación líquida previamente medida en un envase individual (p.ej., un blíster) que el paciente
inserta en el dispositivo antes de usar. Un producto con dosis medidas por el dispositivo contiene una cantidad de la formula-
ción líquida en un depósito que resulta suficiente para un número preestablecido de dosis, y el dispositivo libera cada dosis
como un rocío fijo exacto durante la vida útil de la unidad. Las pruebas generales de calidad para espráis para inhalación de-
ben incluir lo siguiente (ver 4. Descripción de las Pruebas de Calidad del Producto para un análisis más detallado de cada prueba):
• Geometría de la nube
• Para todos los demás atributos generales de calidad, referirse a los atributos anteriormente indicados en Solución para In-
halación.
•Para pruebas de calidad de desempeño, ver el capítulo (601)

Polvo para Inhalación

DESCRIPCIÓN

Los medicamentos en polvo para inhalación, comúnmente conocidos como inhaladores de polvo seco, dispensan polvos pa-
ra inhalación mediante un dispositivo que los transforma en aerosol liberando una dosis exacta del ingrediente activo solo o
con los excipientes adecuados con características físicas uniformes. Los diseños actuales incluyen inhaladores de polvo seco
con dosis previamente medidas y con dosis medidas por el dispositivo, los cuales dependen de diversas fuentes de energía
para crear y dispersar el aerosol durante la aspiración por parte del paciente.
Los inhaladores de polvo seco con dosis previamente medidas contienen cantidades previamente medidas de formulación
en envases individuales (p.ej., cápsulas o blísteres) que se insertan en el dispositivo antes de usar. Los inhaladores de polvo
seco con dosis previamente medidas también pueden contener las unidades de dosificación ordenadas en forma de cargado-
res multidosis en el sistema de liberación. Los inhaladores de polvo seco con dispositivos de dosis fija tienen un depósito inter-
no que contiene una cantidad de formulación suficiente para entregar múltiples dosis mediante el accionamiento del dispositi-
vo por parte del paciente. Las pruebas generales de calidad para polvos para inhalación deben incluir lo siguiente (ver 4. Des-
cripción de las Pruebas de Calidad del Producto para un análisis más detallado de cada prueba):
• Identificación
• Valoración
• Impurezas y Productos de Degradación
• Uniformidad de Contenido (dosis previamente medidas)
• Contenido de Agua
• Partículas Extrañas
• Límite Microbiano
•Contenido Neto (dosis medidas por el dispositivo)
• Disolventes Residuales
USP 40 Requisitos Generales/ (5) Medicamentos Nasales y para Inhalación 105

• Sustancias Lixiviables Volátiles y Semivolátiles

• Para pruebas de calidad de desempeño, ver el capítulo (601)

3. PRUEBAS GENERALES DE CALIDAD PARA MEDICAMENTOS NASALES

Aerosol Nasal

Referirse a los atributos en Aerosol para Inhalación anteriormente indicados.

Espray Nasal

DESCRIPCIÓN

Los medicamentos en espray nasal por lo general son formulaciones líquidas con base acuosa que se aplican a la cavidad
nasal para lograr efectos locales y/o sistémicos. Contienen ingredientes terapéuticamente activos disueltos o suspendidos en
una solución o en mezclas de excipientes en un sistema de envase-cierre compacto no presurizado. El sistema de envase-cierre
incluye una unidad de bomba atomizadora integrada que al activarla libera un rocío que contiene una cantidad exactamente
medida de niebla fina de gotitas de la formulación. La dispersión de la formulación en forma de rocío por lo general se logra
forzando el paso de la formulación a través del accionador del dispositivo nasal y su orificio. A menudo, dichos productos vie-
nen en presentaciones multidosis con dosis medidas por el dispositivo (ver Espray para Inhalación) en las que la bomba atomi-
zadora determina la dosis. Los medicamentos en espráis nasales también se pueden presentar en un diseño de dosis previa-
mente medidas. Las pruebas generales de calidad para espráis nasales deben incluir lo siguiente (ver 4. Descripción de las Prue-
bas de Calidad del Producto para un análisis más detallado de cada prueba):
• Identificación
• Valoración
• Impurezas y Productos de Degradación
•Valoración de Conservantes y Excipientes Estabilizadores (si estuvieran presentes)
•Uniformidad de Contenido (dosis previamente medidas)
• Distribución del Tamaño de Partícula (para suspensiones)
• Partículas Extrañas
• Patrón de Rocío
• Límite Microbiano
• Sustancias Lixiviables
• Peso de Llenado Neto
• pH
• Osmolalidad
• Viscosidad
• Esterilidad (dosis previamente medidas)
• Para pruebas de calidad de desempeño, ver el capítulo (601)

Polvo Nasal

Referirse a los atributos de calidad en Polvo para Inhalación anteriormente indicados.

Solución Nasal

DESCRIPCIÓN

Por lo general, las soluciones nasales medicinales son formulaciones líquidas con base acuosa que se aplican a la cavidad
nasal para lograr un efecto local. Pueden contener soluciones de fármacos solos o mezclados con excipientes en un sistema de
envase-cierre compacto no presurizado. El sistema de envase-cierre incluye un sistema de descarga que administra cantidades
no medidas de la formulación en forma de gotitas en una niebla fina. Por lo regular, dichos productos vienen en presentacio-
nes multidosis. Las pruebas generales de calidad para soluciones nasales medicinales deben incluir lo siguiente (ver 4. Descrip-
ción de las Pruebas de Calidad del Producto para un análisis más detallado de cada prueba):
• Identificación
• Valoración
• Impurezas y Productos de Degradación
• Valoración de Conservantes y Excipientes Estabilizadores (si estuvieran presentes)
• Partículas Extrañas
• Límite Microbiano
106 (5) Medicamentos Nasales y para Inhalación / Requisitos Generales USP 40

• Sustancias Lixiviables
• Peso de Llenado Neto
• pH
• Osmolalidad
• Viscosidad

4. DESCRIPCIÓN DE LAS PRUEBAS DE CALIDAD DEL PRODUCTO

A continuación se listan las pruebas de calidad del producto que deben aplicarse a los medicamentos nasales y para inhala-
ción y a los productos para nebulización. Las pruebas de calidad específicas del producto se tratan en las monografías de los
productos.

Descripción

Ver las formas farmacéuticas previas correspondientes y las etiquetas pertinentes para la monografía de un medicamento.

Contenido de Alcohol (si estuviera presente)

Si se usa alcohol en la formulación de un medicamento, se debe incluir una valoración específica con criterios de aceptación
apropiados.

Valoración (contenido y uniformidad de contenido)

La prueba de Valoración de la USP de un fármaco en el envase del medicamento se determina mediante un procedimiento
indicador de estabilidad validado siguiendo el capítulo Validación de Procedimientos Farmacopeicos (1225). La prueba de Valora-
ción de la USP debe medir el fármaco disponible y su estabilidad, incluyendo la adherencia del fármaco a los componentes del
envase y del cierre. Contar con criterios de aceptación apropiados puede proveer una mayor garantía sobre la reproducibilidad
de la fabricación y puede asegurar un mejor cumplimiento con otros atributos de desempeño (p.ej., uniformidad de dosis libe-
rada).
Si un medicamento declara contener un solo enantiómero de un fármaco quiral, los analistas pueden usar una valoración
quiral o una combinación de valoración no quiral y un procedimiento validado para controlar la presencia del enantiómero no
deseado como una impureza.

Valoración de Conservantes y Excipientes Estabilizadores (si estuvieran presentes)

Por lo general, se debe valorar cualquier conservante (p.ej., un antimicrobiano) o excipiente estabilizador (p.ej., un antioxi-
dante, un agente que se agrega específicamente para minimizar o prevenir la degradación) en envases multidosis siguiendo un
procedimiento indicador de la estabilidad validado de acuerdo con los lineamientos de la guía ICH Q2 vigente. Los criterios de
aceptación correspondientes normalmente se basan en la efectividad apropiada del conservante, la cual se demuestra median-
te una prueba de desafío microbiano.

Uniformidad de Contenido para Formas Farmacéuticas Previamente Medidas

Ver Uniformidad de Unidades de Dosificación (905).

Transparencia y Color de la Solución Luego de la Dilución

Las formas farmacéuticas de concentrados para solución inhalable y fármacos para solución inhalable deben diluirse y re-
constituirse de acuerdo con las instrucciones del etiquetado antes de su administración por nebulización. El tipo y la cantidad
de vehículo usado para la dilución y la reconstitución deben especificarse en el etiquetado. Se deben llevar a cabo estudios
apropiados para evaluar la transparencia, el color de la solución luego de la dilución o reconstitución. Los estudios también
deben incluir análisis de estabilidad física y química apropiados, y de las características de desempeño.

Partículas Extrañas

Las partículas extrañas en estos medicamentos se deben controlar de manera adecuada. Las partículas en medicamentos na-
sales y para inhalación pueden originarse durante la fabricación y a partir de los componentes de la formulación y del envase-
cierre. Para la evaluación toxicológica, se debe determinar el tipo, el origen, la cantidad y el tamaño de las partículas extrañas,
incluyendo partículas finas (p.ej., menores de 1O µm) a lo largo del periodo de almacenamiento durante el estudio de estabili-
dad.
USP 40 Requisitos Generales/ (5) Medicamentos Nasales y para Inhalación 107

Identificación

Se utiliza una o varias pruebas de identificación específicas para verificar la identidad del fármaco en el medicamento. Si se
emplea un método no específico para la identificación, este se debe combinar con un segundo método independiente y com-
plementario. Asimismo, se debe llevar a cabo una prueba de identificación específica para formas polimórficas. Además, si el
fármaco es una sal, se debe incluir una prueba de identificación apropiada para el contraión.

Impurezas y Productos de Degradación

Se deben usar procedimientos analíticos indicadores de estabilidad validados de acuerdo con el capítulo (1225) vigente para
determinar los niveles de impurezas y productos de degradación en un medicamento. Por lo regular, se establecen criterios de
aceptación para impurezas y productos de degradación individuales, totales no especificados, y totales, siguiendo la guía ICH
Q3B vigente. Para umbrales de informe, identificación y calificación y demás información pertinente, se deben seguir las pau-
tas vigentes de la ICH Q3B.

Sustancias Lixiviables

Los medicamentos nasales y para inhalación se deben evaluar para determinar la presencia de compuestos que podrían lixi-
viarse a partir de los componentes elastoméricos, plásticos o del recubrimiento del sistema de envase-cierre que están en con-
tacto directo con la formulación. Además, el medicamento puede inadvertidamente contener otros contaminantes residuales
derivados de la fabricación y el procesamiento. Las sustancias lixiviables pueden incluir sustancias aromáticas polinucleares, ni-
trosaminas, monómeros, plastificantes, aceleradores, antioxidantes y vulcanizadores. Los contaminantes del procesamiento
pueden incluir agentes de tratamiento de las superficies, o sustancias de procesamiento que se pueden disolver, asociar quími-
camente o suspenderse en la formulación.
Por ende, durante todo el periodo de vida útil hasta la fecha de caducidad, el medicamento debe someterse a una evalua-
ción de los compuestos que puedan migrar a la formulación desde diversas fuentes. El análisis a realizar depende del tipo de
formulación, por ejemplo si es un polvo o un líquido y de la composición del sistema de envase-cierre; p.ej., un medicamento
envasado en un envase semipermeable se debe evaluar para determinar el ingreso de sustancias lixiviables volátiles. Se deben
aplicar especificaciones apropiadas para identificar, monitorear y cuantificar los lixiviables en el medicamento usando procedi-
mientos analíticos validados con niveles de cuantificación mínimos apropiados. Se deben establecer y justificar los criterios de
aceptación correspondientes desde la perspectiva toxicológica y de seguridad.

Velocidad de Fuga

Los estudios de velocidad de fuga en aerosoles medicinales nasales y para inhalación se pueden realizar durante la caracteri-
zación y desarrollo del medicamento para justificar la selección de componentes apropiados del sistema de envase-cierre
(p.ej., válvula y envase) y de parámetros apropiados de fabricación del medicamento, incluyendo el proceso de precintado de
la válvula. Las especificaciones para los estudios de la prueba de Velocidad de Fuga de la USP se pueden basar en la determina-
ción de la diferencia en peso con el paso del tiempo a una temperatura especificada sobre múltiples unidades de cada partida.
Ver Velocidad de Fuga (604) para información adicional.

Límites Microbianos

La calidad microbiana de las formas farmacéuticas cuando se indique en 2. Pruebas Generales de Calidad en Medicamentos
para Inhalación y 3. Pruebas Generales de Calidad en Medicamentos Nasales por lo regular se controla mediante pruebas y crite-
rios de aceptación validados y apropiados para el recuento total de microorganismos aerobios, el recuento total de hongos
filamentosos y levaduras, y la demostración de la ausencia de patógenos indicadores especificados. Los criterios de aceptación
se pueden expresar en microorganismos por envase. Para información adicional, ver Pruebas de Recuento Microbiano (61) y
Métodos de Muestreo Microbiológico Alternativos para Productos Nasales e Inhaladores No Estériles (610).

Peso de Llenado Neto

Se deben establecer pruebas y criterios de aceptación para evaluar y controlar el peso neto total de la formulación dentro
del envase.

Osmolalidad

Para controlar la tonicidad de la formulación de las formas farmacéuticas cuando se indique en 2. Pruebas Generales de Cali-
dad en Medicamentos para Inhalación, se debe analizar la osmolalidad del producto con especificaciones apropiadas conforme
a lo descrito en Osmolalidad y Osmolaridad (785).
108 (5) Medicamentos Nasales y para Inhalación / Requisitos Generales USP 40

pH
Se debe establecer una especificación apropiada para el pH de la formulación de las formas farmacéuticas cuando se indique
en 2. Pruebas Generales de Calidad en Medicamentos para Inhalación y 3. Pruebas Generales de Calidad en Medicamentos Nasales,
según se describe en el capítulo pH (791 ).

Distribución del Tamaño de Partícula

Para medicamentos en suspensión para inhalación y en suspensión para espray nasal, se pueden usar métodos apropiados y
criterios de aceptación correspondientes para la determinación de la distribución del tamaño de partícula del fármaco en la
formulación dentro del envase.

Geometría de la Nube

Debido a que diversos factores pueden afectar las características de la nube de rocío en aerosoles para inhalación, espráis
para inhalación, aerosoles nasales, o en espráis nasales, su caracterización completa es importante para evaluar el desempeño
del sistema de liberación. La geometría de la nube se puede determinar mediante una variedad de procedimientos usando
métodos validados apropiadamente. La geometría de la nube también se puede controlar mediante criterios de aceptación
apropiados que midan las características del patrón de rocío, incluyendo la forma y el tamaño de la nube de rocío en condicio-
nes experimentales e instrumentales definidas de prueba.

Reconstitución y Tiempo de Reconstitución (polvos)

Las formas farmacéuticas de fármacos para solución inhalable deben reconstituirse antes de su administración mediante el
uso de un sistema de nebulización específico. Por consiguiente, se deben realizar estudios de compatibilidad apropiados para
evaluar el tipo y la cantidad de los disolventes, así como el tiempo de reconstitución necesario para la preparación de la solu-
ción final antes de su administración al paciente. Los estudios de compatibilidad también deben incluir análisis de estabilidad
física y química apropiados de la solución reconstituida, incluyendo la caracterización del desempeño.

Disolventes Residuales

Se deben usar pruebas adecuadas y validadas para determinar los niveles de cualquier disolvente en el medicamento. Ver
Disolventes Residuales (467) para información adicional.

Patrón de Rocío

Debido a que diversos factores pueden afectar el patrón de rocío de medicamentos en aerosol para inhalación, en aerosol
nasal o en atomizador nasal, la caracterización completa del patrón de rocío es importante para evaluar el desempeño de la
válvula específica y del accionador o la bomba. El patrón de rocío se puede determinar usando métodos validados apropiada-
mente y criterios de aceptación correspondientes que midan la forma, la densidad y el tamaño del mismo. El procedimiento de
prueba para patrones de rocío normalmente es específico para el medicamento y puede incluir, entre otros aspectos, la distan-
cia entre la boquilla y el plano de medición o la superficie de recolección, el número mínimo de accionamientos por patrón de
rocío para permitir la discriminación, la orientación de la superficie de recolección con respecto a la boquilla y los procedimien-
tos de visualización.

Esterilidad

Todas las formas farmacéuticas para inhalación con base acuosa son preparaciones estériles y deben cumplir con los requisi-
tos en Pruebas de Esterilidad (71 ).

Viscosidad

Se debe incluir una prueba de viscosidad con criterios de aceptación apropiados para formas farmacéuticas cuando así se
indique en 2. Pruebas Generales de Calidad en Medicamentos para Inhalación y 3. Pruebas Generales de Calidad en Medicamentos
Nasales, según sea apropiado (ver Viscosidad-Métodos Capilares (911 )).
 USP 40 Requisitos Generales/ (7) Etiquetado 109

Contenido de Agua

Se debe establecer una especificación apropiada para el contenido de agua de la formulación de las formas farmacéuticas
cuando se indique en 2. Pruebas Generales de Calidad en Medicamentos para Inhalación y 3. Pruebas Generales de Calidad en
Medicamentos Nasales para asegurar la estabilidad continua del medicamento y el desempeño del mismo. Se deben usar pro-
cedimientos analíticos validados conforme a lo descrito en Determinación de Agua (921 ). Proceder según se indica en el capítu-
lo (921 ), con las siguientes modificaciones: equipar el vaso de un sistema cerrado para volumetría con una abertura a través de
la cual pasa un tubo de dispersión de gases de porosidad gruesa conectado a un cilindro para muestras.

Pérdida de Peso

Los medicamentos deben evaluarse para determinar la pérdida de peso, p.ej., los medicamentos envasados en envases semi-
permeables se deben evaluar para determinar las propiedades de todo el sistema de envase-cierre que protegen contra la pér-
dida de humedad.

(7) ETIQUETADO

DEFINICIÓN

El término etiquetado se refiere a todas las etiquetas y demás materiales escritos, impresos o gráficos que aparezcan directa-
mente sobre el envase primario de un artículo, o sobre o dentro de cualquier empaque o envoltorio secundario, con excepción
de los embalajes externos destinados para el transporte. El término etiqueta designa la parte del etiquetado que se encuentra
sobre el envase primario.
Los embalajes para el transporte que contengan un solo artículo se etiquetan por lo menos con la identificación del produc-
to (excepto los artículos controlados), el número de lote, la fecha de caducidad y las condiciones de almacenamiento y distri-
bución, salvo que dicho envase sea también el envase primario o la parte exterior del empaque destinado al consumidor.

ETIQUETAS V ETIQUETADO PARA MEDICAMENTOS EXPRESADOS COMO LA PARTE ACTIVA

EN EL NOMBRE V EL CONTENIDO

Los nombres y contenidos de medicamentos y preparaciones magistrales deberán expresarse en términos de la parte activa
y su contenido correspondiente en la etiqueta (ver Nomenclatura (1121 ), Política para Ja Denominación de Monografías de Medi-
camentos y Preparaciones Magistrales que Contienen Sales de Fármacos).

Excepciones

Se puede considerar una excepción a esta Política, en aquellos casos raros en los que el uso de la forma salina específica de
la parte activa en el nombre suministra información vital desde una perspectiva clínica. En tales casos, cuando el título de la
monografía contiene la forma salina específica de la parte activa, el contenido del producto o preparación también se expresa
en términos de la forma salina específica.

Etiquetado

Las etiquetas y el etiquetado deben indicar claramente la forma salina específica de la parte activa que está presente en el
producto o preparación, debido a que esta información puede ser útil para profesionales de la salud y pacientes. Se proveen
en el etiquetado los nombres y los contenidos tanto de la parte activa como de la forma salina específica (cuando correspon-
de).

ETIQUETAS V ETIQUETADO PARA MEDICAMENTOS INYECTABLES

Las etiquetas 1 y el etiquetado indican la siguiente información:

• Nombre de la preparación
• En el caso de una preparación líquida, la cantidad o proporción de cada parte activa y/o fármaco en un volumen especifi-
cado

1 Para limitaciones de espacio, ver el CFR § 201.1 O(i) y el Título 21 del CFR § 610.60.
11 O (7) Etiquetado / Requisitos Generales USP 40

• En el caso de una preparación magistral estéril, los nombres y las cantidades o concentraciones de parte activa y/o fárma-
co en el envase inmediato (ver Preparación Magistral-Preparaciones Estériles (797), Responsabilidad del Personal de Prepara-
ción Magistra0
• En el caso de una preparación seca u otra preparación a la que se le deba agregar un diluyente antes de su uso, la canti-
dad o proporción de cada parte activa y/o fármaco, el volumen final de solución o suspensión, las instrucciones para el
almacenamiento adecuado de la solución reconstituida y una fecha de caducidad o fecha límite de uso (ver la sección
Fecha de Caducidad y Fecha Límite de Uso)
•Vías de administración
• Nombre y proporción de todos los ingredientes inactivos, excepto que los ingredientes agregados para ajustar el pH o
para hacer isotónico el medicamento, se pueden declarar por sus nombres con una indicación acerca de su efecto
• Indicación de las condiciones de almacenamiento
• Nombre y domicilio comercial del fabricante, envasador o distribuidor
• Número de lote identificativo y fecha de caducidad
• "Venta sólo con prescripción médica"
• La dosis recomendada o común.
El envase deberá etiquetarse de modo que una superficie suficiente de éste quede descubierta en toda su longitud o circun-
ferencia para permitir la inspección del contenido.
El número de lote debe proporcionar todo el historial de fabricación del envase específico, incluyendo todas las operaciones
de fabricación, llenado, esterilización y etiquetado. Cuando la monografía individual permita variar las concentraciones de la
parte activa y/o el fármaco en una inyección de gran volumen, se indica la concentración de cada parte activa y/o fármaco
nombrado en el título oficial como si fuera parte del título oficial (p.ej., Dextrosa 5%, Inyección o Dextrosa 5% y Cloruro de Sodio
0,2%, Inyección).
Las Inyecciones destinadas para uso veterinario sólo deben etiquetarse para ese fin.
El etiquetado de vacunas no se incluye en este capítulo general.

Contenido y Volumen Total para Medicamentos Inyectables Monodosis y Multidosis

Para medicamentos inyectables monodosis y multidosis, el contenido por volumen total debe ser la expresión principal y
prominente en el panel principal de la etiqueta, seguida en proximidad cercana por el contenido/mL entre paréntesis. Para
envases que contienen un volumen de menos de 1 mL, el contenido por fracción de mL debe ser la única expresión de con-
centración. El contenido en un mL debe expresarse como mg/mL, y no como mg/l mL. Los siguientes formatos son acepta-
bles para contenidos de más de 1 mL:
Contenido total/volumen total: 500 mg/1 O mL
Contenido/mL: 50 mg/mL
o
Contenido total/volumen total: 25 000 Unidades/5 mL
Contenido/mL: 5000 Unidades/ml.
El siguiente formato es aceptable para medicamentos que contienen menos de 1 mL:
12,5 mg/0,625 mL
Existen algunas excepciones para la expresión del contenido por volumen total. En algunos casos, la expresión principal y
prominente del contenido total de un fármaco por envase puede no ser efectiva en la prevención de errores en la administra-
ción y toma de medicamentos (p.ej., insulina). Otro ejemplo de ello es el uso de la lidocaína (u otros fármacos similares em-
pleados como anestésicos locales, casos en que el producto se ordena y administra por porcentaje, (p.ej., 1% o 2%). En tales
casos, se debería expresar el contenido total de la siguiente manera: por ejemplo, 1% se puede expresar como
(100 mg/l O mL) o
(1 O mg/mL).
Los sólidos secos que deben ser reconstituidos, deben también seguir este formato, con la excepción de que sólo se debe indi-
car el contenido total del fármaco y no la concentración en forma de contenido/volumen total o el contenido/ml.

Expresión de la Relación de Contenido

Los medicamentos que contienen un solo fármaco que también se expresan como una relación, tal como la epinefrina, de-
berán etiquetarse únicamente en términos de concentración, es decir contenido/ml. Un formato de expresión de una relación
tal como 1:1000 es inaceptable para medicamentos con un solo fármaco.
Ejemplos:
Epinefrina, Inyección, USP, 1:1000 deberá expresarse como 1 mg/mL
Epinefrina, Inyección, USP, 1 :1 O 000 deberá expresarse como O, l mg/mL
Clorhidrato de lsoproterenol, Inyección, USP, 1 :5000 deberá expresarse como 0,2 mg/mL
Metilsulfato de Neostigmina, Inyección, 1:1000 deberá expresarse como 1 mg/mL
Cuando se combina con un anestésico local, la concentración de epinefrina se expresará en forma de relación.
USP 40 Requisitos Generales / (7) Etiquetado 111

Ejemplos:
Clorhidrato de Lidocaína 1% y Epinefrina 1:100 000, Inyección, USP
Clorhidrato de Bupivacaína 0,25% y Epinefrina 1 :200 000, Inyección, USP

Envases a Granel para Farmacias

Cuando un envase se ofrece como un Envase a Granel para Farmacias, la etiqueta deberá: (a) indicar de manera prominente
"Envase a Granel para Farmacias-No para infusión directa"; (b) contener o referir a información sobre técnicas adecuadas pa-
ra garantizar el uso seguro del producto; y (c) portar una declaración que limite el intervalo de tiempo en el que el envase
puede usarse una vez que ha sido perforado, siempre que se mantenga en las condiciones de almacenamiento declaradas (ver
Requisitos de Envasado y Almacenamiento (659)).

Casquillos y Tapas de Sobresello

Los profesionales de la salud que utilizan productos inyectables deben ser capaces de ver fácilmente las indicaciones del eti-
quetado que comunican mensajes de seguridad importantes críticos para evitar situaciones en donde se ponga en riesgo la
vida de forma inminente y actuar de acuerdo con tales indicaciones. Estas indicaciones precautorias del etiquetado deben ser
simples, concisas y desprovistas de toda información no esencial. Los productos que no requieren indicaciones precautorias no
deben incluir ninguna información para que aquéllos que si las requieran se puedan reconocer inmediatamente. Para lograr
este propósito se requiere un enfoque sistemático para el etiquetado de los productos inyectables que asegure que los casqui-
llos y tapas de sobresello-un área de estos productos de alta visibilidad para los profesionales de la salud durante el uso de
estos medicamentos-sean reservados para comunicar mensajes críticos de seguridad. En consecuencia:
1. Sólo pueden aparecer indicaciones precautorias sobre la superficie superior (círculo) del casquillo y la tapa de sobresello
de un vial que contenga un producto inyectable. La indicación precautoria debe aparecer tanto en el casquillo como en la
tapa pero puede aparecer solamente en el casquillo, si la tapa de sobresello es transparente y la indicación precautoria
debajo de la misma es fácilmente legible. Una indicación precautoria es aquélla destinada a prevenir una situación que
ponga en riesgo la vida de forma inminente y puede incluir instrucciones relacionadas con la seguridad y la potencia, si
fuera necesario. Algunos ejemplos de tales indicaciones precautorias incluyen, entre otros: "Advertencia-Agente Parali-
zante" y "Diluir Antes de Usar." El texto de la indicación precautoria se debe imprimir en un color que contraste y sea
fácilmente visible en condiciones normales de uso.
2. Si no es necesaria una indicación precautoria, la superficie superior del vial, incluyendo el casquillo o la tapa de sobresello,
debe quedar en blanco.
3. Otras declaraciones o características que incluyen, entre otros, números o letras de identificación, como por ejemplo nú-
meros de códigos, números de lote, nombres de empresas, logotipos o nombres de productos, etc., pueden aparecer en
la superficie lateral (falda) del casquillo pero no en la superficie superior (círculo) de los casquillos o las tapas de sobresello
de los viales que contengan productos inyectables. La presencia de tales declaraciones o características en la falda del cas-
quillo no deben distraer o interferir con la indicación precautoria de la superficie superior.

Concentrado de Cloruro de Potasio para Inyección

El uso de un sistema de cierre negro en un vial (p.ej., una tapa de sobresello negra y un casquillo negro para sostener el
cierre elastomérico) o el uso de una banda o una serie de bandas negras sobre el estrechamiento del cuello de una ampolla se
reserva sólo para el Concentrado de Cloruro de Potasio para Inyección (ver el capítulo (659)).

Agentes de Bloqueo Neuromuscular y Paralizantes

Todas las preparaciones inyectables de agentes de bloqueo neuromuscular y agentes paralizantes se deben envasar en viales
con una declaración de advertencia impresa en los casquillos y en las tapas de sobresello. Tanto el casquillo del envase como la
tapa de sobresello deben llevar impresas en blanco o negro (lo que proporcione el mayor contraste con el color del casquillo o
la tapa) la declaración: "Advertencia: Agente Paralizante" o "Agente Paralizante" (dependiendo del tamaño del sistema de cie-
rre). Como alternativa, la tapa de sobresello puede ser transparente y sin inscripción, de manera que permita la visualización
de la indicación precautoria sobre el casquillo de cierre.

Aluminio en Inyectables de Gran Volumen (IGV), Inyectables de Pequeño Volumen (IPV) y

Envases a Granel para Farmacias (EGF) Usados en Terapia de Nutrición Parenteral Total (NPT)

1. El contenido de aluminio de los IGV usados en terapia de nutrición parenteral total (NPT) no debe exceder de 25 mcg/L.
2. El prospecto del envase de los IGV usados en terapia de NPT debe declarar que el medicamento no contiene más de 25
mcg de aluminio por L. Esta información debe incluirse en la sección Precauciones del etiquetado de todos los IGV usados
en terapia de NPT.
112 (7) Etiquetado / Requisitos Generales USP 40

3. Si la cantidad máxima de aluminio en los IPV y en los EGF es 25 mcg/L o menos, en lugar de declarar la cantidad exacta
de aluminio que contiene cada uno, tal como en el párrafo (4), la etiqueta del envase primario de los IPV y los EGF usados
en la preparación de mezclas o formulaciones para NPT (con las excepciones que se indican a continuación) pueden de-
clarar: "No contiene más de 25 mcg/L de aluminio." Si el IPV o el EGF es un polvo liofilizado, la etiqueta del envase pri-
mario puede declarar lo siguiente: "Cuando se reconstituye de acuerdo con las instrucciones del prospecto adjunto, la
concentración de aluminio no será más de 25 mcg/L."
4. El nivel máximo de aluminio a la fecha de caducidad debe declararse en la etiqueta del envase primario de todos los IPV y
los EGF usados en la preparación de formulaciones y mezclas para NPT. El contenido de aluminio debe declararse de la
siguiente manera: "No contiene más de_ mcg/L de aluminio." La etiqueta del envase primario de todos los IPV y los
EGF que son polvos liofilizados usados en la preparación de soluciones para NPT deben declarar lo siguiente: "Cuando se
reconstituye de acuerdo con las instrucciones del prospecto adjunto, la concentración de aluminio no será más de_
mcg/L." Este contenido máximo de aluminio debe declararse como el más alto entre los tres niveles siguientes:
• El nivel más alto de las partidas producidas durante los últimos tres años
• El nivel más alto de las últimas cinco partidas
• El nivel máximo con respecto a los niveles históricos, pero sólo hasta completar la producción de las primeras cinco
partidas.
El prospecto adjunto en los envases de todos los IGV, los IPV y los EGF usados en la preparación de mezclas y formulaciones
para NPT debe contener la siguiente declaración en la sección de Advertencias del etiquetado:
ADVERTENCIA: Este producto contiene aluminio que puede ser tóxico. El aluminio puede alcanzar niveles tóxicos con la
administración parenteral prolongada, si existe insuficiencia renal. Los neonatos prematuros en particular tienen mayor
riesgo debido a la inmadurez de sus riñones y a que requieren grandes cantidades de soluciones de calcio y fosfato que
contienen aluminio.
Los estudios indican que los pacientes con insuficiencia renal, incluidos los neonatos prematuros, que reciben niveles de
aluminio por vía parenteral mayores de 4-5 mcg/kg/día, acumulan aluminio a niveles asociados con la toxicidad ósea y
del sistema nervioso central. La acumulación en los tejidos puede ocurrir incluso con niveles más bajos de administración.

ETIQUETAS Y ETIQUETADO PARA MEDICAMENTOS Y OTRAS CATEGORÍAS

Las etiquetas y etiquetados deben incluir la siguiente información:
1. En el caso de una preparación líquida, el contenido porcentual de cada parte activa y/o fármaco o la cantidad de cada
parte activa y/o fármaco en un volumen especificado, excepto que los ingredientes agregados para ajustar a un pH dado
o para hacer isotónica la solución se puedan declarar por el nombre y una indicación acerca de su efecto.
2. En el caso de una preparación magistral, el etiquetado debe indicar: "Este medicamento es una preparación magistral"
(ver Preparación Magistral-Preparaciones No Estériles (795), Proceso de Preparación Magistral, Criterios para la Elaboración
de Una Preparación Magistral para Cada Fármaco).
3. En el caso de una preparación seca u otra preparación a la que se le deba agregar un diluyente antes de su uso, la canti-
dad de cada parte activa y/o fármaco, la composición de los diluyentes recomendados [sólo el o los nombres si la fórmula
se especifica en la monografía individual], la cantidad que se usará para lograr una concentración específica de la parte
activa o el fármaco, el volumen final de solución, las instrucciones para el almacenamiento adecuado de la solución re-
constituida y una fecha de caducidad o fecha límite de uso (ver la sección Fecha de Caducidad y Fecha Límite de Uso).

Cantidad de Parte Activa y/o Fármaco por Unidad de Dosificación

La concentración de un medicamento se expresa en la etiqueta del envase en términos de la parte terapéuticamente activa o
del fármaco en microgramos, miligramos, gramos o porcentaje, independientemente de la forma que se use en el título, a
menos que se indique de otro modo en una monografía individual. Los nombres de la parte activa y del fármaco, así como sus
cantidades equivalentes se proveen en la etiqueta del envase y en el etiquetado (ver el capítulo (1121 ), Política para la Denomi-
nación de Monografías de Medicamentos y Preparaciones Magistrales que Contienen Sales de Fármacos).
Los artículos oficiales en cápsulas, tabletas u otras formas farmacéuticas deberán etiquetarse indicando la cantidad de cada
parte activa y/o fármaco o el nutriente reconocido que está contenido en cada unidad. Las soluciones o suspensiones orales de
dosis única (independientemente de si se proveen como preparaciones líquidas o preparaciones líquidas que se reconstitutyen
a partir de sólidos con la adición de un volumen designado de un diluyente específico) deberán etiquetarse expresando la can-
tidad de cada parte activa y/o fármaco o nutriente reconocido administrado en las condiciones descritas en el capítulo Volu-
men de Entrega (698). Los medicamentos oficiales que no se envasan como dosis únicas deberán etiquetarse indicando la canti-
dad de cada parte activa y/o fármaco en cada mililitro o gramo, o expresando el porcentaje de cada uno de estos ingredientes
(ver Advertencias y Requisitos Generales 8. 740, Concentraciones Porcentuales). Una excepción son los líquidos o sólidos orales
destinados para su reconstitución para producir líquidos orales que, alternativamente, pueden etiquetarse en términos de cada
porción de 5 mL de líquido o del líquido resultante. A menos que se especifique de otro modo en una monografía o un capítu-
lo, las concentraciones o cantidades deberán declararse solamente en unidades métricas [ver también Advertencias y Requisitos
Generales 5.50. 7O, Unidades de Potencia (Biológica)].
USP 40 Requisitos Generales / (7) Etiquetado 11 3

Fecha de Caducidad y Fecha Límite de Uso

La etiqueta de un medicamento o suplemento nutricional o dietético oficial debe llevar una fecha de caducidad. Todos los
productos deben exhibir la fecha de caducidad de manera tal que pueda ser leída por una persona común en las condiciones
normales de compra y uso. La fecha de caducidad debe aparecer en forma prominente, contrastando claramente con el fon-
do, o grabada en relieve con nitidez, y debe ser fácilmente comprendida (p.ej., "CAD, VENC o EXP 6/13," "Cad, Venc o Exp
13 de junio " o "Caducidad, Vencimiento o Expiración 6/2013"). [NOTA-Para obtener información adicional, consultar los
Voluntary Codes and Guidelines of the Consumer Healthcare Products lndustry de la Consumer Healthcare Products Association.]
Las monografías para ciertas preparaciones especifican cómo se debe determinar la fecha de caducidad que aparece en la
etiqueta. En ausencia de un requisito específico en la monografía individual de un medicamento o un suplemento nutricional,
la etiqueta debe llevar una fecha de caducidad asignada para dicha formulación y empaque del artículo, con la siguiente ex-
cepción: no es necesario exhibir la fecha de caducidad en el caso de medicamentos o suplementos nutricionales envasados en
envases destinados a la venta sin receta médica, en cuyo etiquetado no se establezcan limitaciones de dosificación y que se
mantengan estables durante un período de no menos de 3 años, siempre que se almacenen en las condiciones prescritas.
En el caso de artículos oficiales que deban exhibir una fecha de caducidad, tales artículos deberán dispensarse únicamente
en un envase, o a partir de un envase, etiquetado con fecha de caducidad, y la fecha de dispensación del producto deberá ser
anterior a la fecha de caducidad declarada. La fecha de caducidad identifica el período durante el cual se estima que el artículo
cumple con los requisitos de la monografía oficial, siempre que se conserve en las condiciones de almacenamiento prescritas.
La fecha de caducidad limita el tiempo durante el cual un artículo puede ser dispensado o usado. En los casos en que se indica
sólo el mes y el año de caducidad, se entiende que la fecha se refiere al último día del mes indicado.
La fecha límite de uso es la fecha después de la cual no se debe utilizar un producto. Basándose en la información provista
por el fabricante o en esta subsección, el dispensador deberá colocar una fecha límite de uso adecuada en la etiqueta del enva-
se del artículo recetado para limitar el uso del mismo por parte del paciente. La fecha límite de uso colocada en la etiqueta no
debe ser posterior a la fecha de caducidad del envase del fabricante. Ver también la sección Preparaciones Magistrales más ade-
lante.
Para los artículos que requieran ser reconstituidos antes de su uso, se debe colocar en el etiquetado una fecha límite de uso
apropiada para el producto reconstituido.
Para todas las otras formas farmacéuticas, al determinar la fecha límite de uso, el dispensador debe tomar en cuenta, además
de cualquier otro factor relevante lo siguiente:
• La naturaleza del medicamento
• El envase en el que fue envasado por el fabricante y su fecha de caducidad
• Las características del envase para el paciente, si el artículo se reenvasa para su dispensación
• Las condiciones de almacenamiento esperadas a las que el artículo puede ser expuesto
• Las condiciones de almacenamiento inusuales a las que el artículo puede ser expuesto
• El período estimado para la duración del tratamiento.
Después de tomar en cuenta dichos factores, el dispensador deberá colocar una fecha límite de uso adecuada en la etiqueta
del envase del artículo para limitar el uso del mismo por parte del paciente. A menos que se especifique algo diferente en la
monografía individual, o en ausencia de datos de estabilidad, esa fecha límite de uso no podrá ser posterior a: (a) la fecha de
caducidad indicada en el envase del fabricante, o (b) 1 año a partir de la fecha en que se dispense el medicamento, lo que
represente un período menor. Para formas farmacéuticas líquidas y sólidas no estériles que están envasadas en envases unita-
rios y de dosis única, la fecha límite de uso debe ser de 1 año a partir de la fecha de envasado del medicamento en envases
unitarios o de dosis única, o la fecha de caducidad indicada en el envase del fabricante, lo que represente un período menor, a
menos que los datos de estabilidad o el etiquetado del fabricante indiquen algo diferente.

Preparaciones Magistrales

La etiqueta del envase o empaque que contiene una preparación magistral oficial debe llevar una fecha límite de uso. La
fecha límite de uso es la fecha después de la cual no debe usarse la preparación magistral. La fecha límite de uso se determina
basándose en criterios distintos a los utilizados para determinar las fechas de caducidad de los medicamentos fabricados en
forma industrial.
La etiqueta en el empaque del envase de una preparación magistral oficial debe incluir las palabras "preparación magistral"
después del nombre del medicamento (p.ej., Baclofeno, Solución Oral, Preparación Magistral). Además, las preparaciones ma-
gistrales oficiales USP para pacientes animales incluirán la palabra "veterinario(a)" después de la denominación oficial (p.ej.,
Atenolol, Suspensión, Preparación Magistral Veterinaria).

Irrigación, Hemofiltración y Diálisis

Los envases flexibles para inyecciones destinadas a diálisis, hemofiltración o soluciones de irrigación y que contienen un vo-
lumen de más de 1 L, deberán etiquetarse indicando que el contenido no está destinado para infusión intravenosa.
114 (7) Etiquetado / Requisitos Generales USP 40

Uso de Ceros al Comienzo y al Final de una Cantidad

Con el fin de minimizar la posibilidad de errores en la dispensación y administración de medicamentos, cuando la cantidad
de parte activa y/o fármaco se exprese en números enteros, se debe indicar sin coma decimal seguida de ceros (p. ej., indicar
4 mg, no 4,0 mg). Cuando la cantidad de parte activa y/o fármaco se exprese en un número decimal menor a 1, se debe
indicar con un cero antes de la coma decimal (p.ej., indicar 0,2 mg; no ,2 mg).

Alcohol

El contenido de alcohol en una preparación líquida debe especificarse en la etiqueta como un porcentaje (v/v) de C2 H5 0H.

Productos Botánicos

La etiqueta de una planta u otro producto botánico destinado para uso como suplemento dietético deberá incluir la leyenda
"Si está embarazada o en período de lactancia, consulte a un profesional de la salud antes de usar este producto."

Electrólitos

La concentración de electrólitos para terapias de reemplazo (p.ej., sodio, potasio, cloruro), deberá especificarse en la etique-
ta en miliequivalentes (mEq)/volumen. [NOTA-El contenido de fósforo en inyectables deberá expresarse en miliMoles (p.ej.,
mMol/volumen). Asimismo, la etiqueta del producto deberá indicar la cantidad del ingrediente o ingredientes, expresada en
términos de peso o concentración porcentual.]

Productos No Orales

Un producto destinado para inyección o uso tópico deberá indicar los nombres de todas las sustancias agregadas (ver Adver-
tencias y Requisitos Generales 5.20, Sustancias Agregadas).

Sales de Fármacos

Es un principio establecido que los artículos oficiales deben tener un único título oficial (ver Advertencias y Requisitos Genera-
les 2.20 y los requisitos farmacopeicos de nomenclatura en el capítulo (1121 )). Con el objeto de ahorrar espacio en las etique-
tas, y dado que los símbolos químicos de las sales inorgánicas más comunes son bien conocidos por los profesionales de la
salud, se permiten las siguientes alternativas para el etiquetado de artículos oficiales que son sales: HCI para clorhidrato; HBr
para bromhidrato; Na para sodio; y K para potasio. Los símbolos Na y K se usan para abreviar el nombre de las sales de ácidos
orgánicos; sin embargo, estos símbolos no deben usarse cuando se emplea la preposición de en el título oficial, es decir cuan-
do se denominan oficialmente de sodio o de potasio (con el metal al comienzo de la denominación oficial en inglés), (p.ej.,
Fenobarbital Sódico, que se denomina Phenobarbital Sodium en inglés, se puede abreviar a Fenobarbital Na, pero no se debe-
rá escribir Salicilato de Na para abreviar Salicilato de Sodio, el cual se denomina Sodium Salicylate en inglés).

Cápsulas y Tabletas Especiales

La etiqueta de cualquier Cápsula o Tableta destinada para una administración que no sea la ingestión oral de la unidad ente-
ra, deberá llevar una indicación bien visible sobre el modo de uso (ver Nomenclatura Farmacopeica, Pautas de Nomenclatura en
el sitio Web de la USP en www.usp.org).

Productos con Vitaminas

La etiqueta de los medicamentos oficiales debe indicar su contenido de vitaminas expresado en unidades métricas por uni-
dad de dosificación. Las cantidades de vitamina A, D y E también se pueden expresar en Unidades USP. Las cantidades de
vitamina A expresadas en unidades métricas hacen referencia a las cantidades equivalentes de retino! (alcohol de vitamina A).
La etiqueta de los suplementos nutricionales debe incluir un número identificatorio de lote, de control o de partida.

Temperatura Ambiente Controlada

Los artículos pueden etiquetarse indicando su almacenamiento a "temperatura ambiente controlada" o a una temperatura
de "hasta 25º", u otra indicación basada en la misma temperatura cinética media (ver el capítulo (659)).
USP 40 Requisitos Generales/ (11) Estándares de Referencia USP 115

Envase Resistente a la Luz

Cuando se use una cubierta opaca para proveer protección de la luz para un producto sensible a la luz envasado en un enva-
se transparente o incoloro o translúcido, la etiqueta del envase deberá indicar que la cubierta opaca es necesaria hasta el mo-
mento de uso o administración del contenido (ver Envases-Pruebas de Desempeño (671 ), Prueba de Transmisión de Luz y el
capítulo (659)).

Envase Unitario

Todos los envases unitarios deberán etiquetarse indicando la identidad, cantidad y/o concentración, el nombre del fabrican-
te, el número de lote y la fecha de caducidad del artículo (ver el capítulo (659)).

Envase Monodosis

Un envase monodosis deberá etiquetarse como tal y, cuando el espacio lo permita, la etiqueta deberá incluir instrucciones
apropiadas para su desecho (ver el capítulo (659)).

Envase de Unidad de Uso

Un envase de unidad de uso deberá etiquetarse como tal, sin ninguna modificación adicional excepto la adición del etique-
tado apropiado (ver el capítulo (659)).

Protección de la Congelación

El envase deberá incluir una indicación apropiada para proteger el artículo de la congelación si estuviera sujeto a la pérdida
de contenido o potencia, o a la alteración destructiva de sus características (ver el capítulo (659)).

Etiquetado de Envases de Venta bajo Receta Médica

Como mínimo, un envase de venta bajo receta médica deberá etiquetarse tomando en cuenta al paciente. La etiqueta debe-
rá contener información esencial que sea importante para el uso seguro y efectivo del medicamento por parte del paciente. Las
etiquetas deben tener un diseño y formato que optimice la legibilidad y el entendimiento (ver Etiquetado de Envases de Medica-
mentos de Venta Bajo Receta (17)).

ETIQUETADO GENERAL

Se recuerda a los usuarios referirse siempre a las Advertencias y Requisitos Generales para la evaluación o aplicación de cual-
quier norma farmacopeica. Las Advertencias y Requisitos Generales tratan diversos aspectos relacionados con el etiquetado, en-
tre los que se incluyen 3.20, Indicación de Cumplimiento (cuando un artículo puede etiquetarse con la denominación USP, NF o
USP-NF, y requisitos relacionados con las diferencias en identidad, denominación, contenido, calidad o pureza); 5.20. 7O, Sus-
tancias Agregadas, Excipientes e Ingredientes en Sustancias Oficiales; 6.70, Reactivos; y 8.240, Pesos y Medidas (p.ej., el microgra-
mo puede expresarse como µg o mcg. Para propósitos de etiquetado o prescripción, se prefiere "mcg").

(11) ESTÁNDARES DE REFERENCIA USP

Los Estándares de Referencia provistos por la Convención de la Farmacopea de los Estados Unidos de América (Estándares de
Referencia USP o ER) son muestras bien caracterizadas de fármacos y alimentos específicos (fármacos, productos biológicos,
excipientes, suplementos dietéticos, ingredientes alimenticios, impurezas, productos de degradación, reactivos y estándares de
verificación de desempeño). Cuando los ER USP se aprueban como aptos para su uso como estándares de comparación en las
pruebas o valoraciones documentales (es decir, como componentes de las monografías) en la Farmacopea de Jos Estados Unidos
(USP) o en el Formulario Nacional (NF), también adquieren estatus oficial y reconocimiento legal en los Estados Unidos de Amé-
rica. Es responsibilidad del usuario evaluar la aptitud de los ER para su uso en otras aplicaciones. Los ER USP oficiales son los
estándares primarios en jurisdicciones que los reconocen como tales y, cuando corresponda, se calibran con respecto a mate-
riales de referencia internacionales tales como los provistos por la Organización Mundial de la Salud. Los ER USP no están desti-
nados para uso terapéutico. Los ER USP se ofrecen para propósitos de metrología legal y pueden ayudar a asegurar la compa-
rabilidad de los resultados y la trazabilidad a las unidades del Sistema Internacional de Unidades (SI) independientemente del
116 (11) Estándares de Referencia USP / Requisitos Generales USP 40

estado de certificación. Los ER USP son Materiales de Referencia conforme a lo definido en el Vocabulario Internacional de Me-
trología-Conceptos Básicos y Generales y Términos Asociados (VIM): 3ra edición, 2007.

TIPOS DE ESTÁNDARES DE REFERENCIA

Estándares de Referencia para Artículos USP o NF

Los Estándares de Referencia para los artículos oficiales en USP o NF se ofrecen como materiales puros o como mezclas de
sustancias químicas que constituyen un reflejo de los fármacos o excipientes correspondientes. El uso de estos materiales se
especifica en la monografía del artículo. Por lo general, estos materiales son necesarios para la Valoración y/o las pruebas de
Identificación. La evaluación de la aptitud de un ER USP para usos distintos a los especificados en una monografía es responsa-
bilidad del usuario. El valor de propiedad o el valor de cálculo del Estándar de Referencia se declara en la etiqueta y se debe
incluir en los cálculos usados en la monografía y en los capítulos generales aplicables. Para los Estándares de Referencia que no
cuentan con un valor de propiedad o un valor de cálculo declarado en la etiqueta o en la documentación adjunta, se debe
asumir que el Estándar de Referencia es 100,0% puro para las aplicaciones cuantitativas farmacopeicas.

Estándares de Referencia de Impurezas

Los Estándares de Referencia de impurezas pueden incluir lo siguiente:

• Impurezas orgánicas que pueden surgir durante los procesos de fabricación o durante la vida útil de un artículo y pueden
incluir materiales iniciales, productos intermedios, subproductos, reactivos, catalizadores y/o productos de degradación.
• Impurezas inorgánicas que normalmente resultan de un proceso de síntesis y que pueden incluir reactivos, catalizadores,
metales pesados o sales inorgánicas
• Disolventes residuales que pueden ser líquidos orgánicos o inorgánicos que se usan para preparar soluciones o suspensio-
nes durante la síntesis de un artículo
Los Estándares de Referencia de Impurezas pueden presentarse como materiales purificados de un solo componente o como
mezclas de más de una impureza. Otras opciones para controlar impurezas pueden incluir la presentación del artículo oficial
con un contenido de impurezas declarado, el uso de tiempos de retención y factores de respuesta cromatográfica relativos, o
la provisión de valores teóricos tales como las absortividades UV a longitudes de onda seleccionadas.
En ediciones anteriores de la farmacopea, las impurezas se designaban por sus nombres químicos. Para facilitar la búsqueda
y el orden en el índice, los nombres químicos de las impurezas se han reemplazado gradualmente por la denominación "ER
Compuesto Relacionado Y de X," donde X es el nombre del artículo oficial e Y es una letra secuencial del alfabeto. La designa-
ción de esta letra no concuerda necesariamente con los esquemas de denominación usados por otras farmacopeas. Asimismo,
los Estándares de Referencia de mezclas de impurezas se pueden designar según el uso al que están destinados, como por
ejemplo "ER Aptitud del Sistema de X". Los nombres convencionales y los nombres químicos se reproducen en el catálogo y
en la etiqueta del ER.

Materiales de Referencia Certificados

Los Materiales de Referencia Certificados de USP (MRC) son Estándares de Referencia que proporcionan valores de propieda-
des certificados con incertidumbres asociadas y trazabilidad metrológica, de conformidad con las Guías 30-35 de la lnternatio-
nal Organization for Standardization (ISO). El uso correcto de estos MRC respalda la trazabilidad de los resultados a las unida-
des del SI y la capacidad de comparabilidad de los procedimientos.

Estándares de Referencia USP para Productos Biológicos

La USP ofrece ER para productos biológicos y materiales auxiliares. Por diversas razones, que incluyen razones históricas, y
conforme se indica en la Sección 5.50.1 O Unidades de Potencia (Biológica) en las Advertencias y Requisitos Generales, los ER USP
para productos biológicos pueden diferir en la cantidad de unidades de potencia, por definición, o en otros aspectos de los
demás estándares reconocidos internacionalmente. A menos que así se indique en la monografía, los estándares de referencia
internacionales generalmente no son intercambiables y se requieren ER USP para las pruebas y valoraciones de USP-NF.

Estándares de Referencia NF

Se pretende designar y etiquetar como "Estándares de Referencia USP" a los Estándares de Referencia actualmente etiqueta-
dos como "Estándares de Referencia NF", conforme a la consolidación de la USP y el NF dentro de la USP a partir del 2 de
Enero de 1975. Cuando sea necesario un Estándar de Referencia USP, se puede usar la sustancia correspondiente etiquetada
como un "Estándar de Referencia NF".
USP 40 Requisitos Generales / (11) Estándares de Referencia USP 11 7

Transición de Sustancias Auténticas a Estándares de Referencia USP

En el pasado, la USP desarrollaba a manera de servicio m<:teriales de referencia altamente caracterizados no requeridos para
su uso en monografías o capítulos generales de USP-NF, los cuales se distribuían como Sustancias Auténticas (SA). Las SA son
sustancias químicas altamente caracterizadas que se analizan mediante estudios en colaboración y se ponen a disposición co-
mo un servicio primariamente para los laboratorios analíticos, clínicos, farmacéuticos y de investigación. Estos materiales pue-
den usarse en la identificación, el desarrollo de métodos, la evaluación del desempeño de métodos, u otras aplicaciones que
sean adecuadas y estén validadas por el usuario. La USP dejará de lanzar materiales etiquetados como "Sustancias Auténticas".
Todos los materiales de referencia liberados al mercado, independientemente que se requiera o no su uso en una monografía
o capítulo general de USP-NF, serán "Estándares de Referencia USP".

Referencias Visuales Auténticas

Las Referencias Visuales Auténticas son Estándares de Referencia USP, pero a diferencia de los materiales de referencia quími-
cos, las Referencias Visuales Auténticas (RVA) no se usan en análisis químicos. Las RVA son imágenes visuales usadas por los
analistas para comparar ciertos artículos de prueba y asegurar que cumplen con los requisitos farmacopeicos. Las RVA se incor-
poran por referencia en la monografía.

Estándares de las Pruebas de Verificación de Desempeño USP

Estos materiales se proporcionan para analizar y, cuando fuese adecuado, facilitar el ajuste de la operación de un instrumen-
to para asegurar que los resultados obtenidos son exactos y/o precisos o que proporcionan resultados aceptables. El uso de
estos Estándares de Referencia se describe generalmente en los capítulos de pruebas generales asociados y en la información
relacionada.

APLICACIONES DE LOS ESTÁNDARES DE REFERENCIA USP

Las aplicaciones oficiales de los ER USP se especifican en las monografías y capítulos generales de USP-NF. Incluyen lo si-
guiente:
• usos cuantitativos en valoraciones de fármacos y formulaciones, pruebas de límite, o blancos y controles
• usos cualitativos, (p.ej., pruebas de identificación, pruebas de aptitud del sistema, o marcadores de picos cromatográfi-
cos)
•usos específicos del método, (p.ej., estándares de verificación de desempeño, RVA, estándares de punto de fusión y el set
de conteo de partículas)
Según se describió con anterioridad, la USP también ofrece Sustancias Auténticas que no se especifican para su uso en una
monografía o capítulo general de USP, las cuales se usan a criterio del usuario.

ENVASADO

La cantidad de material por envase individual de ER USP depende de la aplicación farmacopeica del estándar y es, por lo
general, suficiente para varias determinaciones. Algunos estándares (principalmente materiales con requisitos importantes de
manipulación o materiales que estén disponibles únicamente en pequeñas cantidades) se proporcionan en envases de un solo
uso. Dichos productos de un solo uso por lo general son liofilizados y su contenido se declara en unidades de masa o actividad
por envase. Cuando así se declara, el contenido del envase debe reconstituirse en su totalidad sin la necesidad de pesarlo nue-
vamente. Las instrucciones de reconstitución se proveen en la etiqueta o en las monografías en que se usa el estándar.

ETIQUETADO

El texto de la etiqueta proporciona toda la información requerida para el almacenamiento y uso correctos de los ER USP en
las aplicaciones de las monografías. La etiqueta incluye instrucciones de uso, advertencias de seguridad, información requerida
para las sustancias controladas y un valor de propiedad o un valor de cálculo para los estándares con aplicaciones cuantitativas.
Para los estándares de verificación de desempeño, se proveen intervalos de aceptación. Cuando resulta necesario, los ER USP
están acompañados de documentación adicional, como por ejemplo Hojas de Datos Técnicos o Cromatogramas Típicos.
A menos que se indique algo distinto en el procedimiento de la monografía individual o en un capítulo general, los ER USP
se deben usar de acuerdo con las instrucciones en la etiqueta del Estándar de Referencia. Las Hojas de Datos de Seguridad de
los Materiales para todos los materiales de referencia USP están disponibles en el sitio Web de la USP.
Aunque los ER USP se vuelven a analizar de acuerdo con un programa predefinido para determinar la aptitud continua de
uso, los ER USP no presentan una fecha de caducidad en la etiqueta. Un lote de ER USP puede usarse en sus aplicaciones oficia-
les siempre que se publique como "Current Lot" (Lote Vigente) en la versión vigente del USP Reference Standards Catalog
(Catálogo de Estándares de Referencia USP) o que no haya alcanzado su Fecha de Uso Válida. Al agotarse, se designa a este
118 (11) Estándares de Referencia USP / Requisitos Generales USP 40

lote en el catálogo como "Previous Lot" (Lote Anterior) y se le asigna una "Valid Use Date" (Fecha de Uso Válida). La USP
publica bimestralmente el Catálogo de Estándares de Referencia. Se puede encontrar la versión vigente del catálogo en el sitio
Web de la USP: www.usp.org. Es responsabilidad del usuario constatar antes de su uso que el lote del Estándar de Referencia
USP en cuestión tiene un estatus oficial como "Current Lot" (Lote Vigente) o como "Previous Lot" (Lote Anterior) dentro de la
Fecha de Uso Válida.

USO ADECUADO
Muchas pruebas y valoraciones farmacopeicas están basadas en la comparación de una muestra de prueba con un ER USP.
En estos casos, las mediciones se realizan en preparaciones de la muestra de prueba y del Estándar de Referencia. Cuando se
indica que se debe preparar en diluciones sucesivas, o de otro modo, una Solución estándar o una Preparación estándar para
realizar una determinación cuantitativa, está previsto que la sustancia del Estándar de Referencia se pese con exactitud (ver
Balanzas (41) y Aparatos Volumétricos (31 )). También se deben tomar en cuenta los errores potenciales asociados con el pesaje
de masas pequeñas (ver también la Sección 6.50.20. l Ajuste de Soluciones en las Advertencias y Requisitos Generales). Según se
indicó anteriormente, los Estándares de Referencia que se definen basándose en el contenido por envase son una excepción.
Las instrucciones de uso de los ER USP incluyen lo siguiente:
•Tal Como se Encuentra (As Is): Usar sin tratamiento previo ni corrección por sustancias volátiles. Ésta es la opción de
preferencia y se escoge siempre que los datos validados indiquen que el contenido de sustancias volátiles es constante
con el transcurrir del tiempo.
• Secar Antes de Usar (Dry Befare Use): Usar inmediatamente después de secar en las condiciones indicadas. El secado no
debe realizarse en el envase original. Se debe transferir una porción del material a un recipiente de secado distinto.
• Determinar Volumétricamente el Contenido de Agua al Momento de su Uso (Determine Water Content Titrimetri-
cally At Time of Use): Usar con una corrección por el contenido de agua o la pérdida por secado determinada en una
porción separada del material. Cuando se requiere de una determinación volumétrica de agua al momento de usar el Es-
tándar de Referencia, proceder según se indica en el Método I en Determinación de Agua (921 ). Para ello se aceptan méto-
dos instrumentales o microanalíticos. Cuando se usen cantidades habituales (aproximadamente 50 mg del Estándar de
Referencia), valorar volumétricamente con una solución del reactivo diluida de 2 a 5 veces. Cuando requiera la determina-
ción de la pérdida por secado de una porción separada del ER USP, proceder según se indica en la etiqueta. Se pueden
usar tamaños de muestra más pequeños que los requeridos en el capítulo de pruebas generales Pérdida por Secado (731)
para un ER USP, siempre que el usuario pueda obtener un resultado suficientemente exacto.
Siempre que las instrucciones de uso declaradas requieran de secado o de una corrección por sustancias volátiles, se lo debe
realizar al momento del uso. Se deben controlar los detalles experimentales adicionales mediante los Procedimientos Operati-
vos Estándares del usuario y las buenas prácticas de laboratorio.

ALMACENAMIENTO
Los ER USP deben almacenarse en la configuración de envasado provista por la USP (p.ej., viales que se envasan en bolsas
selladas herméticamente). Cuando se especifiquen condiciones de almacenamiento especiales, se deben seguir las instruccio-
nes de la etiqueta. Los viales sin abrir se deben almacenar según se indica en la etiqueta. Es responsabilidad del usuario asegu-
rar que el contenido de los viales abiertos continúe siendo adecuado para el uso provisto y que se mantenga tanto la asigna-
ción de valores como la información de incertidumbre.

Aparatos para Pruebas y Valoraciones

(17) ETIQUETADO DE ENVASES DE MEDICAMENTOS DE VENTA BAJO

RECETA

INTRODUCCIÓN
Este capítulo se aplica a las instrucciones de etiquetado y la información presente en aquellos envases de medicamentos de
venta bajo receta que se dispensan directamente a los pacientes, a fin de promover un mejor entendimiento por parte de los
pacientes. Estas normas no se aplican cuando la administración de un medicamento de venta bajo receta es realizada por per-
USP 40 Aparatos/ (1 7) Etiquetado de Envases de Medicamentos 119

sonal autorizado que actúa dentro del ámbito de su profesión. El uso indebido de medicamentos ocasiona más de 1 millón de
eventos adversos por año en los Estados Unidos. En lo que respecta a medicamentos recetados, la mejor (y generalmente la
única) fuente de información para los pacientes es la etiqueta del envase del medicamento de venta bajo receta y, aunque el
paciente dispone de otra información escrita y asesoramiento verbal, la etiqueta del envase del medicamento de venta bajo
receta debe satisfacer las obligaciones profesionales del médico que receta y del farmacéutico. Estas obligaciones incluyen pro-
veer a los pacientes la información esencial que necesitarán para entender la forma segura y apropiada de usar el medicamen-
to y cómo adherirse al régimen prescrito de medicación.
El entendimiento inadecuado de las instrucciones de uso del medicamento recetado y de la información auxiliar que se pro-
veen en los envases dispensados se ha generalizado. Diversos estudios han descubierto que el 46% de los pacientes no entien-
den una o más instrucciones de posología, mientras que el 56% malinterpreta una o más de las advertencias auxiliares. Este
problema se acentúa más comúnmente en pacientes con un bajo nivel de alfabetismo o semi analfabetos, así como en pacien-
tes que reciben varios medicamentos con esquemas de administración complejos, no estandarizados. Un estudio demostró
que los pacientes con bajo nivel de alfabetismo son 34 veces más propensos a malinterpretar las advertencias en las etiquetas
de los medicamentos recetados que los pacientes con niveles adecuados de alfabetismo. Sin embargo, incluso los pacientes
con un nivel adecuado de alfabetismo a menudo malinterpretan las instrucciones y advertencias comunes de los medicamen-
tos recetados. Asimismo, existen grandes discrepancias entre las advertencias auxiliares y las instrucciones adicionales que han
sido indicadas por cada médico para el mismo medicamento recetado. A menudo, la evidencia específica para sustentar una
declaración auxiliar determinada es poco clara y los pacientes en muchas ocasiones ignoran dicha información. Aún se requie-
ren mayores estudios que comparen la necesidad de información auxiliar con el uso exclusivo de lenguaje explícito y simplifi-
cado.
La falta de normas universales para el etiquetado de envases de medicamentos de venta bajo receta que se dispensan es una
causa importante por la cual el paciente malinterpreta las instrucciones, no las sigue de manera adecuada y comete errores de
medicación.
La USP desarrolló normas para etiquetas centradas en el paciente en lo referente a formato, apariencia, contenido y lenguaje
de las instrucciones en los medicamentos de venta bajo receta a fin de promover el entendimiento por parte de los pacientes.
Dichas recomendaciones conforman el fundamento de este capítulo general.

NORMAS PARA ETIQUETAS DE ENVASES DE MEDICAMENTOS RECETADOS QUE PROMUEVAN

EL ENTENDIMIENTO EN LOS PACIENTES

Organizar la Etiqueta del Medicamento de Venta Bajo Receta de una Manera Centrada en el
Paciente

La información debe organizarse de la manera que mejor refleje la forma en que la mayoría de los pacientes buscan y en-
tienden las instrucciones de uso de los medicamentos. El etiquetado del envase de los medicamentos de venta bajo receta de-
be presentar al paciente únicamente la información más importante requerida para entender el uso seguro y efectivo.

Se Deben Enfatizar las Instrucciones y Demás Información Importante para los Pacientes

Presentar de manera prominente la información crítica para los pacientes sobre el uso seguro y efectivo del medicamento.
En la parte superior de la etiqueta, se debe especificar el nombre del paciente, el nombre del medicamento (especificar el
nombre genérico y comercial completos) y la dosis del medicamento, además de instrucciones de uso explícitas y claras en
lenguaje sencillo.
Las instrucciones de los medicamentos de venta bajo receta deben seguir un formato estándar de manera que el paciente
pueda estar seguro de que cada elemento se presentará en un orden específico y predecible cada vez que reciba un medica-
mento recetado. El uso de una metodología que simplifique las instrucciones de administración del medicamento del paciente
debe mejorar la capacidad de la persona para entender las instrucciones del medicamento recetado, tomar la dosis correcta y
organizar regímenes de administración de múltiples medicamentos. La implementación de mejores prácticas de instrucciones
centradas en el paciente-que utilicen los principios de educación para la salud, de manejo de terapia de medicamentos y de
educación para describir explícitamente cómo tomar medicamentos de uso diario en formas farmacéuticas sólidas-ha mejora-
do el entendimiento por parte de los pacientes. Uno de estos métodos centrados en el paciente es el horario universal de me-
dicación (UMS, por sus siglas en inglés). El horario universal de medicación organiza la toma de medicamentos en cuatro pe-
riodos del día estandarizados (mañana, medio día, tarde y antes de acostarse) y usa un lenguaje y formato simplificados para
facilitar el entendimiento (p.ej., "tomar 1 píldora en la mañana y 1 píldora antes de acostarse" en lugar de "tome una tableta
dos veces al día"). Estos métodos pueden ser particularmente útiles para simplificar los regímenes de medicamentos diarios
que incluyen múltiples terapias de medicamentos orales. [NOTA-La palabra "píldora" se usa en el horario universal de medica-
ción para mejorar la educación para la salud y puede no ajustarse a la definición de la USP para una forma farmacéutica oral
específica (ver Compendia/ Nomenclature, USP Nomenclature Guidelines (Nomenclatura Farmacopeica, Guías de Nomenclatura
de la USP) en el sitio Web de la USP en www.usp.org/usp-nf/development-process).]
Cuando se recetan formas farmacéuticas orales líquidas, el elemento de dosificación apropiado (p.ej., jeringa para adminis-
tración oral, vaso dosificador) debe entregarse al paciente o al proveedor de cuidados con el fin de medir y administrar con
 120 (1 7) Etiquetado de Envases de Medicamentos / Aparatos USP 40

exactitud el medicamento oral. Las graduaciones en el elemento de dosificación deben ser legibles e indelebles y las marcas de
volumen deben usar unidades métricas y limitarse a una sola escala de medición que corresponda con las instrucciones de
dosificación en la etiqueta del envase del medicamento de venta bajo receta (ver Requisitos de Envasado y Almacenamiento
(659)).
Otra información menos crítica aunque importante (p.ej., nombre y número telefónico de la farmacia, nombre del médico
que receta, fecha de llenado, información de rellenado, fecha de caducidad, número de receta médica, cantidad de medica-
mento, descripción física e información complementaria basada en evidencia) no debe predominar sobre la información crítica
para el paciente. Esta información menos crítica se debe colocar lejos de las instrucciones de dosificación (p.ej., en la parte
inferior de la etiqueta o en otra ubicación menos prominente) puesto que puede distraer a los pacientes e interfiere con su
reconocimiento y entendimiento.

Lenguaje Simplificado

El lenguaje de la etiqueta debe ser claro, simplificado, conciso y familiar, y se debe usar de forma estandarizada. Se deben
usar únicamente términos y cláusulas comunes. No se deben usar palabras poco familiares (incluyendo términos en latín) ni
jerga médica.
No se recomienda el uso de fórmulas o software de legibilidad para simplificar breves fragmentos de texto tales como los
presentados en las etiquetas de los medicamentos de venta bajo receta. En su lugar, se deben usar cláusulas simplificadas y
estandarizadas que fueron desarrolladas mediante retroalimentación obtenida de muestras de diversos consumidores. Este tipo
de lenguaje facilitará el entendimiento correcto de las instrucciones.

Proveer Instrucciones Explícitas

Las instrucciones de uso (es decir, la SIG o signatura) deben separar claramente la dosis misma del esquema de administra-
ción de cada dosis a fin de transmitir explícitamente el número de unidades de dosificación y el momento en que se deben
administrar (p.ej., periodos (partes) específicos del día, tales como mañana, medio día, tarde y antes de acostarse). Las instruc-
ciones deben incluir detalles específicos sobre los periodos de administración. No se deben usar caracteres alfabéticos en lugar
de números. Por ejemplo, se debe escribir "Tomar 2 tabletas por la mañana y 2 tabletas por la tarde" en lugar de "Tomar dos
tabletas dos veces al día").
Siempre que sea posible, se deben usar instrucciones estandarizadas (p.ej., se debe escribir "Tomar 1 tableta por la mañana
y 1 tableta por la tarde" si la prescripción indica b.i.d.). Por lo general, se deben evitar instrucciones ambiguas basadas en
intervalos de dosificación tales como dos veces al día o 3 veces al día, o en intervalos por horas tales como cada 12 horas,
puesto que dichas instrucciones se consideran implícitas más que explícitas, pueden requerir destreza con los números y la
interpretación del paciente puede diferir de la intención del médico que expidió la receta. Aunque puede parecer que las ins-
trucciones expresadas en horas específicas (p.ej., 8 a.m. y 1O p.m.) se entienden con más facilidad que las instrucciones ambi-
guas e implícitas, en realidad son menos fáciles de entender y pueden presentar mayores problemas de seguimiento (debido a
los patrones de vida de cada individuo, tales como el horario de trabajo) que los intervalos de tiempo más generales como por
la mañana, por la tarde, después del desayuno, con el almuerzo, o antes de acostarse. El uso uniforme de la misma terminolo-
gía ayudará a evitar confusiones en los pacientes. El conjunto de instrucciones estandarizadas y explícitas (el horario universal
de medicación) fue desarrollado y probado en inglés y otros idiomas para mejorar el entendimiento por parte de los pacien-
tes.1
Se deben evitar instrucciones ambiguas tales como "tomar según lo indicado" a menos que se proporcionen instrucciones
complementarias claras y asesoramiento (p.ej., instrucciones de uso que no quepan en la etiqueta del envase del medicamento
de venta bajo receta). La etiqueta del envase debe incluir una indicación clara que refiera al paciente a dichos materiales com-
plementarios.

Incluir el Propósito de Uso

Si el propósito del medicamento se incluye en la receta médica, también debe incluirse en la etiqueta del envase del medica-
mento de venta bajo receta, a menos que el paciente prefiera la omisión del mismo. Los profesionales autorizados deben pre-
guntar a los pacientes cuáles son sus preferencias al momento de escribir las recetas médicas. Los factores de confidencialidad
y el uso aprobado por la FDA (p.ej. uso declarado en la etiqueta frente al uso alternativo) pueden restringir la inclusión del
propósito en las etiquetas. La evidencia actual respalda la inclusión del propósito de uso en un lenguaje claro y simple (p.ej.,
"para la presión sanguínea alta" en lugar de "para la hipertensión").

1 Explicit and Standardized Prescription Medicine lnstructions (Instrucciones Explícitas y Estandarizadas para Medicamentos de Venta Bajo Receta, disponible solo en
inglés). December 2014. Agency for Healthcare Research and Quality, Rockville, MD. http://www.ahrq.gov/professionals/quality-patient-safety/pharmhealthlit/
prescriptionmed-instr.html.
 USP 40 Aparatos/ (1 7) Etiquetado de Envases de Medicamentos 121

Limitar la Información Auxiliar

La información auxiliar que aparezca en la etiqueta del envase del medicamento de venta bajo receta debe basarse en evi-
dencia científica y presentarse en lenguaje explícito minimizado para evitar distraer a los pacientes con información innecesa-
ria. La mayoría de los pacientes, en particular aquellos con un nivel limitado de alfabetización, prestan poca atención a la infor-
mación auxiliar. La información debe presentarse de manera estandarizada y debe ser crítica para que el paciente entienda y
use el medicamento de forma segura (p.ej., advertencias y alertas críticas para la administración). Con frecuencia, los pacientes
malinterpretan los íconos. Asimismo, los íconos que ofrecen imágenes abstractas para transmitir mensajes que son difíciles de
representar visualmente pueden ser poco efectivos para promover el entendimiento en comparación con el uso exclusivo de
texto simplificado. Deben usarse únicamente aquellos íconos que, basándose en estudios con consumidores, mejoren el enten-
dimiento del paciente sobre uso correcto. La información complementaria basada en evidencia, tanto texto como íconos, debe
estandarizarse de modo que pueda aplicarse de manera uniforme y que no dependa de la preferencia individual del médico
que receta.

Tener en Cuenta el Dominio Limitado del Idioma Oficial del País

Cuando sea posible, las instrucciones de uso en la etiqueta del envase del medicamento de venta bajo receta deben proveer-
se en el idioma preferido del paciente. De otro modo, existiría el riesgo de que los pacientes con un dominio limitado del idio-
ma oficial del país malinterpretaran las instrucciones, lo cual podría llevar a errores de medicación y resultados adversos para la
salud. Además, siempre que sea posible, las instrucciones de uso deben proporcionarse también en el idioma oficial del país a
fin de facilitar el asesoramiento; los nombres de los medicamentos deben estar en el idioma oficial del país de manera que el
personal de emergencia y demás intermediarios tengan rápido acceso a la información. Se encuentran disponibles traduccio-
nes estandarizadas del horario universal de medicación. 2
Las etiquetas de los medicamentos de venta bajo receta deben traducirse usando procesos de traducción de alta calidad. A
continuación se proporciona un ejemplo de proceso de traducción de alta calidad:
• La traducción es realizada por un traductor capacitado cuya lengua materna es el idioma de destino.
• La revisión de la traducción es realizada por un segundo traductor capacitado quien resuelve cualquier diferencia con el
primer traductor.
• La revisión de la traducción es realizada por un farmacéutico cuya lengua materna es el idioma de destino quien resuelve
las diferencias con los traductores previos.
• Se prueba la comprensión con la audiencia a la que está destinada.
Cuando no sea posible contar con un proceso de traducción de alta calidad, las etiquetas deben imprimirse en el idioma oficial
del país y se deben usar los servicios de un intérprete capacitado siempre que sea posible para asegurar la comprensión del
paciente. El uso de traducciones generadas por computadora debe limitarse a programas de calidad demostrada debido a que
la traducción de las instrucciones de dosificación puede ser incorrecta o carecer de uniformidad, lo cual puede representar ries-
gos potenciales. La estandarización de las instrucciones traducidas y los avances tecnológicos son necesarios para asegurar la
exactitud y seguridad del etiquetado de los envases de medicamentos de venta bajo receta para pacientes con un dominio
limitado del idioma oficial del país.

Mejorar la Legibilidad

Las etiquetas deben contar con un diseño y formato que permita su fácil lectura. En la actualidad, no existe evidencia firme
que sustente la superioridad en cuanto a legibilidad de los tipos de letra serif frente a los tipos de letra sans serif, por lo tanto
se pueden usar tipos de letra no estrecha de cualquier tipo.
Se debe optimizar la tipografía usando las siguientes técnicas:
• Impresión en alto contraste (p.ej., impresión en negro sobre fondo blanco).
•Tipos de letra familiares, simples y no estrechas con suficiente espacio dentro y entre caracteres (p.ej., Times New Roman
o Arial).
• Uso de mayúsculas (es decir, siguiendo las reglas: Primera letra en mayúscula seguida de palabras en minúsculas, con ex-
cepción de nombres propios).
•Tipo de letra grande (p.ej, Times New Roman de mínimo 12 puntos o Arial de 11 puntos) para información crítica. Tomar
en cuenta que el tamaño de punto no representa el tamaño de letra real, por lo que dos tipos de letra con el mismo
tamaño nominal de punto pueden tener en realidad tamaños de letra distintos. La altura del tipo de letra, la altura x, se
ha usado como un indicador más exacto del tamaño aparente que el tamaño de punto. Por ejemplo, para un tamaño de
punto dado, la altura x y el tamaño aparente de Arial son en realidad mayores que los de Times New Roman. No usar
tipografía más pequeña que Times New Roman de 1O puntos o el tamaño de letra equivalente en otro tipo de fuente. Los
adultos de mayor edad, particularmente, tienen dificultades para leer impresiones pequeñas.
• Usar un espacio en blanco adecuado entre líneas de texto (25%-30% del tamaño de punto).

2 Disponibles en http://www.ahrq.gov/professionals/q uality-patient-safety /pharmhealthlit/prescriptionmed-instr. html.

 122 (1 7) Etiquetado de Envases de Medicamentos /Aparatos USP 40

• Usar espacios en blanco para separar secciones de la etiqueta, tales como instrucciones de uso para distinguirlas de la in-
formación de la farmacia.
• Usar sólo texto orientado horizontalmente.
Existen otras medidas que también pueden mejorar la legibilidad:
• Minimizar la necesidad de girar el envase para leer líneas de texto.
• Nunca truncar o abreviar la información crítica.
• Usar resaltado y negrilla, y otras marcas para mantener la legibilidad (p.ej., impresión en alto contraste y color claro para
el resaltado) y enfatizar la información centrada en el paciente o la información que facilite el seguimiento (p.ej., número
de dispensaciones adicionales).
•Limitar el número de colores usados para el resaltado (es decir, no más de dos).
• Usar renglones separados para distinguir los tiempos de dosificación.

Métodos de Acceso Alternativo para Pacientes con Discapacidades Visuales

Los pacientes con discapacidades visuales que no pueden leer las etiquetas impresas de los envases de medicamentos de
venta bajo receta, con frecuencia reportan haber tomado involuntariamente una cantidad o medicamento equivocado, o to-
marlo a la hora equivocada o siguiendo instrucciones erróneas, comprometiendo así su propia seguridad. De igual manera, el
paciente pueder correr riesgos de errores de medicación cuando el proveedor de cuidados padece alguna discapacidad visual.
La magnitud de este problema aumenta con el envejecimiento, debido a que tanto el riesgo de desarrollar una discapacidad
visual como el número de medicamentos de venta bajo receta aumentan con la edad.
• Seguir las normas para etiquetas de medicamentos de venta bajo receta medica centradas en el paciente.
• Ofrecer acceso alternativo para pacientes con impedimentos visuales (los métodos de acceso alternativo incluyen sistemas
táctiles, auditivos o visuales mejorados que puedan emplear tecnologías de asistencia avanzadas). 3
• Mejorar la comunicación entre el farmacéutico y los pacientes con discapacidades visuales (y sus representantes designa-
dos) de manera que el farmacéutico pueda explicar las opciones de acceso alternativo y juntos puedan identificar aquellas
que mejor se ajusten a las necesidades del paciente.
• Una vez identificado el método de acceso alternativo para el paciente individual, el farmacéutico deberá proveer el servi-
cio o dirigir al paciente a una farmacia que ofrezca ese tipo de acceso alternativo.
• Asegurar que las etiquetas duplicadas de fácil acceso mantengan la integridad de la etiqueta impresa del envase del medi-
camento de venta bajo receta médica y provean la misma secuencia de información que la etiqueta impresa.
• Seguir las mejores prácticas específicas para cada formato de acceso alternativo respectivo usado.

(31) APARATOS VOLUMÉTRICOS

La mayoría de los aparatos volumétricos disponibles en los Estados Unidos están calibrados a 20º, a pesar de que la tempera-
tura que predomina en general en los laboratorios se aproxima más a los 25º. Para minimizar el error volumétrico, la tempera-
tura debería ser la misma para los aparatos volumétricos, el material que se está preparando, los disolventes que se utilizan
para preparar las soluciones volumétricas, el área en la cual se preparan y el ajuste de volumen final.

uso
Para lograr el grado de precisión requerido en muchas valoraciones farmacopeicas que incluyen mediciones volumétricas e
indican que una cantidad sea "medida con exactitud", los aparatos deben elegirse y usarse con cuidado. El tamaño de una
bureta debe ser tal que el volumen de la solución volumétrica no represente menos del 30% del volumen nominal. Cuando se
deben medir menos de 1O mL de solución volumétrica, en general se requiere una bureta de 1O mL o una microbureta.

ESTÁNDARES DE EXACTITUD
Las tolerancias de capacidad para los matraces volumétricos, las pipetas de transferencia y las buretas son las mismas acepta-
das por el Instituto Nacional de Normas y Tecnología (National lnstitute of Standards and Technology) (Clase A), 1 según se
indica en la Tabla 7, la Tabla 2 y la Tabla 3, respectivamente. [NOTA-Las tablas de este capítulo listan las tolerancias para los
tamaños de uso más común. Para una lista completa de tolerancias y otros criterios aplicables, consultar las normas referidas
de la ASTM.] Usar aparatos volumétricos de Clase A a menos que se especifique algo diferente en la monografía individual.

3 Ver Working Group Recommendations from Access Board Working Group on Accessible Prescription Drug Container Labels (Recomendaciones del Grupo de Tra-
bajo derivado del Grupo de Trabajo para la junta de Acceso sobre Etiquetas Accesibles para Envases de Medicamentos de Venta Bajo Receta, disponible solo en inglés):
http://www.access-board.gov/guidelines-and-standards/health-care/about-prescription-drug-container-labels/working-group-recommendations.
1 Ver ASTM 288-06, ASTM E287-02, ASTM El 189-00 y ASTM E969-02.
USP 40 Aparatos/ (41) Balanzas 123

Cuando se especifica un aparato volumétrico de plástico, las tolerancias de capacidad aceptadas son iguales a las del vidrio
Clase B. 2
Las tolerancias de capacidad para las pipetas de medición (es decir, graduadas) de hasta 1 O mL inclusive, son algo mayores
que las tolerancias para las pipetas de transferencia de los mismos tamaños, es decir, 1O µL, 20 µL y 30 µL para las pipetas de 2
mL, 5 mL y 1O mL, respectivamente.
Las pipetas calibradas "para verter", graduadas y de transferencia, se deben escurrir en posición vertical y luego apoyar las
puntas contra la pared del recipiente receptor para escurrirlas por completo. Las lecturas de volumen en las bu retas deberían
estimarse con una exactitud de 0,01 mL para buretas de 25 mL y 50 mL, y con una exactitud de 0,005 mL para buretas de 5
mL y 1O ml. Las pipetas calibradas "para contener" se utilizan en casos especiales, generalmente para medir líquidos viscosos,
como jarabes; sin embargo, se puede usar un matraz volumétrico en lugar de una pipeta "para contener". En tales casos, la
pipeta o el matraz debería lavarse después del vaciado y los lavados agregarse a la porción medida.
Tabla 1. Matraces Volumétricos
Volumen nominal, mL 10 25 50 100 250 500 1000
Límite de error, m L 0,02 0,03 0,05 0,08 0,12 0,20 0,30
Límite de error, % 0,20 o, 12 o, 10 0,08 0,05 0,04 0,03

Tabla 2. Pipetas de Transferencia

Volumen nominal, mL 1 2 5 10 25 50 100
Límite de error, mL 0,006 0,006 0,01 0,02 0,03 0,05 0,08
Límite de error, % 0,60 0,30 0,20 0,20 0,12 o, 10 0,08

Tabla 3. Buretas
Volumen nominal, mL 1 O (tipo "micro") 25 50
Subdivisiones, mL 0,02 o, 1 o, 1
Límite de error, mL 0,02 0,03 0,05

(41) BALANZAS

Este capítulo establece los requisitos para balanzas que se usan para materiales que deben ser pesados con exactitud (ver
Advertencias y Requisitos Generales, 8.20). A menos que se especifique algo diferente, cuando las sustancias deban ser "pesadas
con exactitud", la pesada se debe realizar usando una balanza que esté calibrada dentro de su intervalo operativo y que cum-
pla con los requisitos de repetibilidad y exactitud definidos. Para balanzas que se usan en otras aplicaciones, su repetibilidad y
exactitud deben valorarse junto con los requisitos para su uso.
Con respecto a los principios teóricos de estos requisitos, ver Pesada en una Balanza Analítica (1251 ), ya que puede ser una
fuente útil, aunque no obligatoria.

REPETIBILIDAD

La repetibilidad se evalúa pesando una pesa de prueba no menos de 1O veces. [NOTA-La pesa de prueba debe estar dentro
del intervalo operativo de la balanza, pero no es necesario que la pesa esté calibrada. Debido a que, dentro de la capacidad de
la balanza la desviación estándar es prácticamente independiente de la masa de muestra, no se requiere usar un peso de prue-
ba pequeño, ya que éste podría resultar difícil de manejar.]
La repetibilidad es satisfactoria si el doble de la desviación estándar del valor pesado dividido por el peso neto más pequeño
deseado (es decir, el peso neto más pequeño que los usuarios planean usar en esa balanza) no excede de O, 10%. Si la desvia-
ción estándar obtenida es menos de 0,41 d, donde des el menor intervalo de la escala, reemplazar la desviación estándar con
0,41 d. En este caso, la repetibilidad es satisfactoria si 2 x 0,41 d, dividido por el peso neto más pequeño deseado, no excede de
0,10%.

EXACTITUD

La exactitud de una balanza es satisfactoria si su valor de pesada, cuando se prueba con pesas adecuadas, está dentro del
O, 10% del valor del peso de prueba.
Una pesa de prueba es adecuada cuando tiene una masa entre 5% y 100% de la capacidad de la balanza. El error máximo
permisible de la pesa de prueba (emp), o alternativamente, la incertidumbre en la calibración de la pesa no debe ser más de

2 Ver ASTM E 288 y Estándar ISO 384.

124 (41) Balanzas/ Aparatos USP 40

un tercio del límite de exactitud para la prueba. [NOTA-Las siguientes normas son aplicables: ASTM E617 (disponible en
http://www.astm.org) y OIML R 111 (disponible en http://www.oiml.org).]

Pruebas Microbiológicas

<51) PRUEBAS DE EFICACIA ANTI MICROBIANA

INTRODUCCIÓN
Los conservantes antimicrobianos son sustancias agregadas a productos farmacéuticos acuosos. Las formas farmacéuticas no
estériles pueden tener conservantes agregados para protegerlas del desarrollo de microorganismos introducidos inadvertida-
mente durante o después del proceso de fabricación. En el caso de artículos estériles envasados en envases multidosis, los con-
servantes anti microbianos se agregan para inhibir el desarrollo de microorganismos que puedan introducirse por la extracción
reiterada de dosis individuales. En todas las unidades multidosis estériles se espera encontrar uno o más conservantes antimi-
crobianos.
Los conservantes antimicrobianos no deben emplearse en lugar de las buenas prácticas de fabricación, solamente para redu-
cir la población microbiana viable de un producto no estéril, o para controlar la biocarga antes de la esterilización de formula-
ciones multidosis durante la fabricación. Los conservantes antimicrobianos de las formas farmacéuticas farmacopeicas cumplen
con los requisitos en 5.20 Sustancias Agregadas de las Advertencias y Requisitos Generales.
Todos los agentes antimicrobianos útiles son sustancias tóxicas. Para la máxima protección de los pacientes, la concentra-
ción del conservante que se indique como eficaz en el producto envasado final debe ser inferior al nivel que pueda resultar
tóxico para los seres humanos, basándose en la dosis recomendada del producto medicinal.
La concentración de un conservante antimicrobiano agregado puede mantenerse al mínimo si los ingredientes activos de la
formulación poseen actividad antimicrobiana intrínseca. La eficacia antimicrobiana, ya sea inherente al producto o producida
por la adición de un conservante antimicrobiano, debe ser demostrada para todas las inyecciones envasadas en envases multi-
dosis o para otros productos que contengan conservantes antimicrobianos. La eficacia antimicrobiana debe ser demostrada
para formas farmacéuticas de base acuosa, multidosis tópicas y orales, y para otras formas farmacéuticas, como por ejemplo
oftálmicas, áticas, nasales, de irrigación y líquidos de diálisis (ver Formas Farmacéuticas (1151 )). Para los propósitos de la prue-
ba, "acuoso" se define como una actividad de agua de más de 0,6 (ver Determinación de Actividad de Agua en Productos Farma-
céuticos No Estériles (1112) ).
Los organismos de desafío se basan generalmente en los posibles contaminantes del producto farmacéutico, teniendo en
cuenta los atributos físicos, la formulación y el uso previsto del mismo. La serie de organismos de desafío estándar descrita en
esta prueba no necesita prevenir la inclusión de otras especies, si se considera útil para medir la actividad biológica de los con-
servantes de un producto específico. Estos organismos de desafío suplementarios no se discuten en este capítulo, pero se pue-
den añadir a los organismos de prueba descritos.

PROCEDIMIENTOS GENERALES
Este capítulo proporciona procedimientos para demostrar la eficacia de conservantes antimicrobianos agregados. Estos con-
servantes anti microbianos deben estar declarados en la etiqueta. Los procedimientos y los criterios de aceptación para la efica-
cia se aplican a un producto en el envase original sellado en el que fue distribuido por el fabricante (ver la Tabla 7 para catego-
rías de productos). Esta prueba no tiene que realizarse en estos envases, pero se debe evitar el uso de materiales que puedan
interaccionar con el conservante en los envases que se usan para la prueba de eficacia microbiana.

Procedimiento de Promoción del Crecimiento y Aptitud del Método de Recuperación

CONSIDERACIONES GENERALES

Debe establecerse la capacidad del procedimiento para detectar microorganismos de desafío en presencia de un producto a
examinar adecuadamente neutralizado. La aptitud del procedimiento debe volver a confirmarse si se produce algún cambio en
los materiales o métodos, el producto o los materiales que están en contacto directo con el producto y que pueda alterar los
resultados de la prueba.
USP 40 Pruebas Microbiológicas/ (51) Pruebas de Eficacia Anti microbiana 125

Debe establecerse la capacidad promotora del crecimiento de los medios usados en este procedimiento.

PREPARACIÓN DE CEPAS DE PRUEBA

Usar suspensiones estandarizadas de cepas de prueba o preparar según se indica a continuación. Las técnicas de manteni-
miento de cultivos de lote de siembra (sistemas de lote de siembra) se usan para que los microorganismos viables empleados
para inoculación correspondan a no más de cinco pasajes desde el lote de siembra maestro original. Cultivar por separado
cada cepa bacteriana y fúngica de prueba (ver la Tabla 2).
Usar los cultivos de los siguientes microorganismos: 1 Candida a/bicans (ATCC Nº 10231 ), Aspergillus brasiliensis (ATCC Nº
16404), Escherichia coli (ATCC Nº 8739), Pseudomonas aeruginosa (ATCC Nº 9027) y Staphylococcus aureus (ATCC Nº 6538).
Los microorganismos viables empleados en el procedimiento deben formar parte de un cultivo de crecimiento reciente (p.ej.,
en fase logarítmica de crecimiento) a excepción de las esporas A. brasiliensis. Se describen las condiciones de cultivo para el
inóculo (ver la Tabla 2) donde los medios adecuados son el Agar Digerido de Caseína y Soja o Medio de Agar Sabouraud Dex-
trosa.
Para cosechar los cultivos bacterianos y de C. albicans, emplear solución salina SR estéril, lavar la superficie de crecimiento y
recogerlo en un recipiente adecuado. Para cosechar las esporas de A. brasiliensis, usar solución salina SR estéril que contenga
0,05% de polisorbato 80. La suspensión de esporas debe tratarse asépticamente (p.ej., filtración a través de lana de vidrio esté-
ril) para eliminar hitas. Todas las suspensiones microbianas deben prepararse para garantizar que no se produce un traslado de
medio de crecimiento residual del inóculo (p.ej., centrifugación seguida de resuspensión en un líquido de suspensión estéril
apropiado).
Como alternativa, los organismos del cultivo madre pueden crecer en un medio líquido adecuado (es decir, Caldo Digerido
de Caseína y Soja o Caldo Sabouraud Dextrosa) y las células se pueden cosechar mediante centrifugación, luego lavar y resus-
pender en líquido de suspensión estéril apropiado. Las suspensiones microbianas que se usan para inoculaciones deben ajustar-
se para obtener un recuento microbiano de aproximadamente 1 x 108 ufc/ml. Usar las suspensiones bacterianas y de levaduras
dentro de las 2 horas o dentro de las 24 horas, si se almacenan entre 2º y 8º. Se puede preparar una suspensión de esporas
estable y mantenerla a 2º-8º hasta 7 días. [NOTA-El cálculo estimado de la concentración del inóculo se puede obtener me-
diante procedimientos turbidimétricos para los microorganismos de desafío y luego confirmarse mediante un recuento en pla-
ca.]

PROMOCIÓN DEL CRECIMIENTO DE LOS MEDIOS

Los medios usados en este procedimiento deben ser capaces de permitir el crecimiento microbiano. Analizar cada partida de
medio listo para usar y cada partida de medio preparado a partir de medio deshidratado o de los ingredientes descritos.
Para medios sólidos, los recuentos obtenidos deben ser al menos 50% del valor calculado para un inóculo estandarizado.
Para un inóculo recientemente preparado, se produce un crecimiento de microorganismos comparable al obtenido anterior-
mente con una partida de medio analizada y aprobada previamente.

Aptitud del Método de Recuento en Presencia del Producto

Preparar una dilución 10-1 (en volumen) agregando 1 mL del producto a 9 mL de solución salina u otro diluyente neutrali-
zante. Continuar este patrón de dilución hasta niveles de dilución 10-2 y 1Q- 3 • Agregar un número apropiado de organismos
de desafío a cada tubo de producto diluido, mezclar y sembrar en placa un volumen adecuado de cada dilución para obtener
menos de 250 ufc/placa para bacterias y levaduras (idealmente entre 25 y 250 ufc) o menos de 80 ufc/placa para A. brasiliensis
(idealmente entre 8 y 80 ufc). Esta siembra en placa debe realizarse como mínimo por duplicado (aunque un número mayor
de repeticiones puede ser útil para minimizar la variabilidad en la estimación del recuento en placa). Se realiza un control posi-
tivo de este procedimiento al introducir los mismos inóculos en solución salina y transferir volúmenes similares de solución sali-
na a placas de agar. Un patrón de recuperación adecuado es aquél que proporciona al menos 50% del recuento de esta solu-
ción salina de control (promediado).
Si el producto diluido presenta propiedades antimicrobianas, quizás deban incorporarse neutralizadores específicos a los di-
luyentes o a los medios de recuperación. Para más información, ver Validación de Recuperación Microbiana en Artículos Farmaco-
peicos (1227).
La capacidad del procedimiento para medir la eficacia de los conservantes puede verse comprometida si la aptitud del méto-
do requiere una dilución significativa (10- 2 ó 10- 3), ya que esto afectará la recuperación medida (p.ej., puede ser difícil medir
una reducción logarítmica de 3 unidades para un inóculo de 1QL10 6). Si no se encuentra un agente neutralizador o método
adecuado y la aptitud del método requiere una dilución significativa, se puede usar un nivel más alto de inóculo (p.ej., 10 7-
108 ) de manera que se pueda medir una reducción logarítmica de 3 unidades. El promedio de la recuperación informada no
puede ser menos de 1 ufc/placa (o 100 ufc/mL si se realiza el recuento en placa de 1 mL por duplicado a una dilución de
1Q-2).

1 Disponible en American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209 (http://www.atcc.org).
126 (51) Pruebas de Eficacia Anti microbiana / Pruebas Microbiológicas USP 40

La filtración por membrana se puede usar para filtrar volúmenes más grandes de diluciones para contrarrestar esta dificultad
o para asistir en la neutralización de las propiedades antimicrobianas.

Análisis del Producto

CATEGORÍAS DE PRODUCTOS

Para los fines de análisis, los artículos farmacopeicos se dividen en cuatro categorías (ver la Tabla 7). Los criterios de eficacia
antimicrobiana para estos productos se establecen en función de la ruta de administración. Es de esperar que las formulaciones
que contienen conservantes cumplan con los estándares mínimos de eficacia, si están envasados en envases multidosis o en
envases unitarios.
Tabla 1. Categorías de Productos Farmacopeicos
Categoría Descripción del Producto
Inyectables, otros parenterales incluyendo emulsiones, productos óticos, productos nasales estériles y productos
1 oftálmicos preparados con bases o vehículos acuosos
Productos empleados de manera tópica preparados con bases o vehículos acuosos, productos nasales no estéri-
2 les y emulsiones, incluyendo aquéllos que se aplican a membranas mucosas
3 Productos orales a excepción de antiácidos, preparados con bases o vehículos acuosos
4 Antiácidos preparados con una base acuosa

PROCEDIMIENTO

El procedimiento puede realizarse ya sea en cinco envases originales, si hay suficiente volumen de producto disponible en
cada envase y si el envase del producto puede ser penetrado asépticamente (es decir, aguja y jeringa a través de un tapón de
goma elastomérico), o en cinco recipientes bacteriológicos estériles con tapa [inerte con respecto a los agentes antimicrobia-
nos] de tamaño adecuado a los que se ha transferido un volumen suficiente de producto. Inocular cada envase o recipiente,
según corresponda, con uno de los inóculos preparados y normalizados, y mezclar. El volumen de suspensión del inóculo em-
pleado está entre 0,5% y 1,0% del volumen del producto para minimizar los efectos potenciales en el producto. La concentra-
ción de microorganismos de prueba agregados al producto (Categoría 7; 2 ó 3) es tal que la concentración final de la prepara-
ción de prueba después de la inoculación está comprendida entre 1 x 105 y 1 x 106 ufc/mL del producto. En los productos de
la Categoría 4 (antiácidos), la concentración final de la preparación de prueba después de la inoculación está comprendida en-
tre 1 x 10 3 y 1 x 104 ufc/mL del producto.
La concentración inicial de microorganismos viables en cada preparación de prueba se calcula a partir de la concentración
de microorganismos en cada inóculo normalizado determinada mediante el método de recuento en placa. Incubar los envases
o recipientes inoculados a 22,5 ± 2,5º. Tomar muestras de cada uno de ellos en los intervalos apropiados (especificados en la
Tabla 3). Registrar todos los cambios de apariencia observados en estos intervalos. Determinar mediante el procedimiento de
recuento en placa el número de ufc presentes en cada preparación de prueba en los intervalos correspondientes (ver Procedi-
mientos Generales en Pruebas de Recuento Microbiano (61 )). El recuento en placa se realizará usando un mínimo de placas por
duplicado, con el número de ufc promediado antes de la determinación de ufc/mL deducido. Si se usa filtración por membra-
na, usar filtros de membrana por duplicado para cada estimación. Usando las concentraciones calculadas de ufc/mL presentes
al inicio de la prueba, calcular el cambio en valores log 10 de la concentración de ufc/mL para cada microorganismo en los in-
tervalos de prueba aplicables, y expresar los cambios en la concentración en términos de reducciones logarítmicas. La reduc-
ción logarítmica se define como la diferencia entre el valor de la concentración inicial de ufc/mL en la suspensión, en unidades
log 10, y el valor de ufc/mL, en unidades log 10, de los sobrevivientes al tiempo correspondiente.
Tabla 2. Condiciones de Cultivo para la Preparación de lnóculos
Tiempo de
Tiempo Incubación de
Temperatura de Incubación Recuperación
Organismo Medio Apropiado de Incubación del lnóculo Microbiana
Caldo Digerido de Caseína y
Soja;
Escherichia coli Agar Digerido de Caseína y
(ATCC Nº 8739) Soja 32,5 ± 2,5º 18-24 horas 3-5 días
Caldo Digerido de Caseína y
Soja;
Pseudomonas aeruginosa Agar Digerido de Caseína y
(ATCC Nº 9027) Soja 32,5 ± 2,5º 18-24 horas 3-5 días
Caldo Digerido de Caseína y
Soja;
Staphylococcus aureus Agar Digerido de Caseína y
(ATCC Nº 6538) Soja 32,5 ± 2,5º 18-24 horas 3-5 días
USP 40 Pruebas Microbiológicas/ (55) Indicadores Biológicos 127

Tabla 2. Condiciones de Cultivo para la Preparación de lnóculos (Continuación)

Tiempo de
Tiempo Incubación de
Temperatura de Incubación Recuperación
Organismo Medio Apropiado de Incubación del lnóculo Microbiana
Medio de Agar Sabouraud
Candida albicans Dextrosa;
(ATCC Nº 10231) Caldo Sabouraud Dextrosa 22,5 ± 2,5º 44-52 horas 3-5 días
Aspergil/us brasiliens Agar Sabouraud Dextrosa;
(ATCC Nº 16404) Caldo Sabouraud Dextrosa 22,5 ± 2,5º 6-10 días 3-7 días

Criterios de Eficacia Antimicrobiana

Los requisitos de eficacia antimicrobiana se alcanzan si se cumplen los criterios especificados en la Tabla 3 (ver Resultados de
Pruebas en Advertencias Generales). La expresión "ningún incremento" en los recuentos se define como no más de 0,5 unida-
des log 10 por encima del valor con el que se compara.
Tabla 3. Criterios para los Microorganismos Evaluados
En productos de la Categoría 1
A los 7 días, una reducción logarítmica de no menos de 1,0 desde el recuento inicial cal-
culado; a los 14 días, una reducción logarítmica de no menos de 3,0 del recuento ini-
Bacterias cial; y a los 28 días ningún incremento con respecto al recuento de los 14 días.
Levaduras y Hongos Ningún incremento a los 7, 14 y 28 días con respecto al recuento inicial
Filamentosos
En productos de la Categoría 2
A los 14 días, una reducción logarítmica de no menos de 2,0 desde el recuento inicial; y
Bacterias a los 28 días ningún incremento con respecto al recuento de los 14 días
Levaduras y Hongos Ningún incremento a los 14 y 28 días con respecto al recuento inicial
Filamentosos
En productos de la Categoría 3
A los 14 días, una reducción logarítmica de no menos de 1,0 desde el recuento inicial; y
Bacterias a los 28 días ningún incremento con respecto al recuento de los 14 días
Levaduras y Hongos Ningún incremento a los 14 y 28 días con respecto al recuento inicial
Filamentosos
En productos de la Categoría 4
Bacterias, Levaduras y Hongos Filamentosos Ningún incremento a los 14 y 28 días con respecto al recuento inicial

(55) INDICADORES BIOLÓGICOS-PRUEBAS DE RESISTENCIA

INTRODUCCIÓN
Un indicador biológico (BI, por sus siglas en inglés) es una preparación bien caracterizada de un microorganismo específico
de resistencia conocida a un proceso de esterilización específico. El uso correcto de los indicadores biológicos en el desarrollo,
validación y control de los procesos de esterilización requiere conocer con exactitud su población y resistencia. La población y
resistencia pueden seleccionarse para confirmar la aptitud de las condiciones del proceso de esterilización individual para un
artículo. Las recomendaciones del capítulo Esterilización de Artículos Farmacopeicos (1229) deben seguirse para un uso eficaz de
los indicadores biológicos. Los métodos descritos a continuación pueden usarse para establecer la población y la resistencia, de
modo que la respuesta del indicador biológico al proceso de esterilización usado sea apropiada. Aunque se requiere que los
fabricantes de indicadores biológicos mantengan un control riguroso de la población y de la resistencia mediante el uso del
número de determinaciones repetidas especificado a continuación, no se requiere que los usuarios finales usen el mismo nú-
mero de determinaciones repetidas para la verificación de dichas determinaciones. Realizar todas las pruebas descritas en este
capítulo en condiciones de laboratorio microbiológico apropiadas (ver el capítulo Óptimas Prácticas de Laboratorio Microbiológi-
co (1117)).
128 (55) Indicadores Biológicos/ Pruebas Microbiológicas USP 40

RECUENTO TOTAL DE ESPORAS VIABLES

Recolección/Recuperación de Muestras

INDICADORES DE PAPEL/FIBRA

Para portadores de papel o fibra de vidrio para indicadores biológicos, retirar al menos cuatro muestras de prueba de sus
envases individuales. Desmenuzar el indicador hasta reducirlo a las fibras que lo componen colocando las muestras de prueba
en un vaso estéril que contenga 100 mL de Agua Purificada esterilizada y enfriada a 2º-8º y alterar mecánicamente hasta lograr
una suspensión homogénea. Para indicadores biológicos autocontenidos, retirar asépticamente cuatro portadores de indicador
biológico de sus envases y proceder según se indicó anteriormente.

INDICADORES EN OTROS SUSTRATOS

Para todos los demás indicadores biológicos, retirar al menos cuatro muestras de sus envases individuales. Colocar las mues-
tras de prueba en un vaso estéril que contenga 100 mL de Agua Purificada esterilizada y enfriada a 2º-8º y alterar mecánica-
mente hasta lograr una suspensión homogénea de las esporas en agua.

SUSPENSIONES DE ESPORAS

Para suspensiones de esporas de indicadores biológicos, preparar una dilución en serie apropiada de la suspensión de espo-
ras original en Agua Purificada esterilizada y enfriada a 2º-8º, en un envase estéril, y seguir los procedimientos de recuento de
esporas viables según se especifican a continuación. Los requisitos de las pruebas se cumplen si el número promedio de espo-
ras viables está dentro del 50%-300% del recuento declarado de la suspensión de esporas.

Recuento de Esporas Viables

Transferir una alícuota de 1 O mL de la suspensión a un tubo estéril. Para indicadores biológicos que usan esporas de Geobaci-
1/us stearothermophilus, Bacillus coagulans y otros formadores de esporas termófilos, calentar el tubo que contiene la suspensión
en un baño de agua a 95º-100º durante 15 minutos (choque térmico), comenzando a medir el tiempo cuando la temperatura
alcanza 95º. Para indicadores biológicos que contienen formadores de esporas no termófilos, calentar el tubo que contiene la
suspensión en un baño de agua a 80º-85º durante 1O minutos, comenzando a medir el tiempo cuando la temperatura alcanza
80º. Enfriar rápidamente las suspensiones en un baño de agua con hielo a 0º-4º. Transferir dos alícuotas de 1 mL a tubos ade-
cuados y hacer diluciones en serie apropiadas en Agua Purificada esterilizada. Calcular las diluciones para generar 30-300 colo-
nias por placa para un par de placas, cuando se tratan según se indica a continuación. Cuando el indicador biológico tiene una
concentración baja de esporas, puede ser necesario modificar la serie de diluciones y usar más placas en cada dilución.
Preparar una serie independiente de placas para cada alícuota. Colocar 1,0 mL de cada dilución seleccionada en cada placa
de un par de placas de Petri de 15 mm x 100 mm. En un plazo de 20 minutos, agregar a cada placa 20 mL de Medio Agar
Digerido de Caseína y Soja que se haya fundido y enfriado a aproximadamente 45º. Agitar por rotación suave para obtener una
suspensión homogénea y dejar solidificar. Incubar las placas en posición invertida a 55º-60º para formadores de esporas ter-
mófilos y a 30º-35º para los formadores de esporas no termófilos o a la temperatura de recuperación óptima especificada por
el fabricante. Examinar las placas después de transcurridas al menos 48 horas, registrando el número de colonias para cada
placa. Calcular el número promedio de esporas por muestra de prueba a partir de los resultados, usando el factor de dilución
apropiado. Al evaluar los indicadores biológicos provistos por proveedores, el recuento de esporas viables debe estar entre
50% y 300% del valor declarado por el fabricante.

DETERMINACIÓN DEL VALOR D

Aparato

El equipo de prueba usado para la determinación de la resistencia microbiana ("valor D") se describe en detalle en la norma
ISO 18472, Sterilization of Health Care Products--Biological and Chemical lndicators-Test Equipment (Esterilización de Pro-
ductos para el Cuidado de la Salud-Indicadores Biológicos y Químicos-Equipo de Prueba) (7). Los detalles de los Resistóme-
tros para Evaluación de Indicadores Biológicos (BIER, por sus siglas en inglés) individuales varían según su diseño y el proceso
de esterilización particular para el que se usan. Se aceptan diferencias en el diseño siempre y cuando el desempeño del tanque
del BIER cumpla con los requisitos de la norma ISO para exposición del indicador biológico. Para procesos de esterilización de
una sola fase en los que no se ha definido un BIER aceptable, la determinación del valor D se puede lograr adaptando un dise-
ño de BIER destinado para un proceso de esterilización que opera en la misma fase. En la actualidad no hay métodos disponi-
bles para la determinación del valor D para procesos de esterilización de fases múltiples.
USP 40 Pruebas Microbiológicas/ (55) Indicadores Biológicos 129

Procedimiento

Realizar las pruebas para valor D en las condiciones de esterilización que se correspondan con las previstas para el uso. Usar
20 muestras de prueba repetidas de indicadores biológicos en sus envases individuales originales, sometidos a por lo menos
cinco condiciones de exposición para un total de 100 pruebas. El número de condiciones de exposición se selecciona para
proveer un intervalo de observaciones que va de no menos de un valor D declarado por debajo del tiempo de supervivencia
esperado hasta no menos de un valor D declarado por encima del tiempo de muerte esperado. Colocar cada grupo en sendos
portamuestras adecuados que permitan exponer cada muestra a la condición de esterilización indicada en una ubicación espe-
cífica en la cámara de esterilización del BIER. Verificar los parámetros operativos del aparato BIER, usando portamuestras sin
muestras de prueba. Seleccionar una serie de tiempos de esterilización para las muestras a analizar en incrementos a partir del
tiempo más breve. Las diferencias en los tiempos de esterilización a lo largo de las series deben ser tan constantes como sea
posible y la diferencia entre los tiempos adyacentes no es mayor al 75% del valor D esperado. Los procedimientos de prueba
para el uso del tanque del BIER en la evaluación de la resistencia microbiana se definen en una serie de normas ISO bajo la
serie 11138 (2-5). Se debe seguir la norma apropiada para el indicador biológico. Los métodos de prueba y portadores usados
con el BIER pueden adaptarse a los aspectos específicos del indicador biológico. El método y aparatos usados para portadores
de papel pueden diferir de los de otros portadores y serán sustancialmente diferentes de los usados para suspensiones de indi-
cadores biológicos.
Las condiciones de exposición para el valor D de portadores de materiales alternativos son iguales a las condiciones usadas
para determinar el valor D de portadores de papel. Si la etiqueta del fabricante permite el uso del portador de indicador bioló-
gico con múltiples métodos de esterilización, entonces los datos sobre el valor D, tiempo de supervivencia y tiempo de muerte
tendrán que ser proporcionados por el fabricante para cada método de esterilización.
Para indicadores biológicos que son suspensiones de esporas, efectuar las determinaciones del valor D para cada uno de los
microorganismos que se proporcionan como una suspensión líquida de cultivo de esporas. La prueba se efectúa usando dilu-
ciones en serie apropiadas basadas en el título declarado de esporas de la suspensión en Agua Purificada en un tubo estéril.
Cuando la suspensión se coloca sobre o en un sustrato como un cierre elastomérico o un producto formulado, su resistencia
puede diferir de la determinada en Agua Purificada. Esta diferencia puede ser significativa para el uso de indicadores biológicos
y para las medidas apropiadas tomadas antes del uso en actividades de validación de la esterilización.

Recuperación

Después de completar el procedimiento de esterilización para los indicadores biológicos y dentro de un tiempo determinado
(no mayor de 4 horas), retirar asépticamente y agregar cada indicador biológico a un medio adecuado (ver medios en Pruebas
de Esterilidad (71 )) sumergiéndolo por completo en un tubo apropiado. Para indicadores biológicos autocontenidos, la tira de
papel se sumerge en el medio autocontenido según las instrucciones del fabricante, dentro de un tiempo determinado no ma-
yor de 4 horas. Para artículos insolubles inoculados con una suspensión de esporas, transferir asépticamente estos artículos de
manera individual a un medio adecuado (ver medios en el capítulo (71 )) y sumergir el artículo completamente en dicho me-
dio. Cuando un envase con contenido acuoso sellado se haya inoculado, analizar las unidades individualmente, según se des-
cribe en el capítulo (71 ).
Incubar cada tubo a la temperatura de recuperación óptima apropiada para el indicador biológico. Observar cada tubo que
contenga medio inoculado a intervalos apropiados durante un total de 7 días después de la inoculación. Cuando se observa
crecimiento en cualquier momento de la observación en particular, se puede suspender la incubación de dicha muestra de
prueba. Tomar nota del número de muestras que no presentan evidencia de crecimiento en ningún momento.
Cuando se usa Clostridium sporogenes u otro microorganismo anaerobio como indicador biológico, los métodos para la pre-
paración e inoculación, así como los métodos y medios de recuperación, deben adaptarse al uso de estos formadores de espo-
ras anaerobios.

Cálculos

La determinación de los valores D de los indicadores biológicos se puede efectuar usando el Método de Spearman-Karber
Limitado, el Método de la Curva de Supervivencia o los procedimientos de Stumbo-Murphy-Cochran (6-8). Cuando se haya
comprado el indicador biológico, usar el mismo método definido por el fabricante del indicador biológico para determinar
subsiguientemente los valores D. El uso de un método alternativo puede producir diferencias que son más un artefacto del
método que una variación en el desempeño del indicador biológico.

Tiempo de Supervivencia y Tiempo de Muerte

Tomar dos grupos de indicadores biológicos, cada uno integrado por 1O muestras de prueba, en sus envases individuales
originales. Colocar las muestras de cada grupo en portamuestras adecuados que permitan exponer cada muestra a las condi-
ciones de esterilización en una ubicación específica en la cámara del BIER.
130 (55) Indicadores Biológicos / Pruebas Microbiológicas USP 40

Exponer las muestras durante el tiempo de supervivencia requerido, ingresar a la cámara y retirar los portamuestras con las
1O muestras de prueba. Repetir el procedimiento anterior inmediatamente, o precalentar si transcurrió un tiempo sustancial, a
fin de someter el segundo portamuestras con 1O muestras de prueba a condiciones similares a las primeras pero durante el
tiempo de muerte requerido. Recuperar los indicadores biológicos según se indicó anteriormente. El Tiempo de Supervivencia y
Tiempo de Muerte deben ser provistos por el fabricante del indicador biológico y verificados por el usuario final.

REFERENCIAS
1. American National Standards lnstitute (ANSl)/Association for the Advancement of Medical lnstrumentation (AAMl)/lnter-
national Organization for Standardization (ISO) 18472:2006. Sterilization of health care products-biological and chemi-
cal indicators-test equipment. 1st ed. Arlington, VA: AAMI.
2. ANSl/AAMl/ISO 11138-1 :2006. Sterilization of health care products-biological indicators-part 1: general requirements.
2nd ed. Arlington, VA: AAMI.
3. ANSl/AAMl/150 11138-2:2006. Sterilization of health care products-biological indicators-part 2: biological indicators
for ethylene oxide sterilization processes. 3rd ed. Arlington, VA: AAMI.
4. ANSl/AAMl/ISO 11138-3:2006. Sterilization of health care products-biological indicators-part 3: biological indicators
for moist heat sterilization processes. 1st ed. Arlington, VA: AAMI.
5. ANSl/AAMl/ISO 11138-4:2006. Sterilization of health care products-biological indicators-part 4: biological indicators
for dry heat sterilization processes. 1st ed. Arlington, VA: AAMI.
6. Pflug lj. Syllabus for an introductory course in the microbiology and engineering of sterilization processes. 4th ed. St. Paul,
MN: Environmental Sterilization Services; 1980.
7. Pflug lj, Smith GM. The use of biological indicators for monitoring wet-heat sterilization processes. En: Gaughran ERL, Ke-
reluk K, eds. Sterilization of medical products. New Brunswick, Nj: johnson and johnson; 1977:193-230.
8. Holcomb RG, Pflug lj. The Spearman-Karber method of analyzing quantal assay microbial destruction data. En: Pflug lj,
ed. Microbiology and engineering sterilization processes. St. Paul, MN: Environmental Sterilization Services; 1979.

(61) EXAMEN MICROBIOLÓGICO DE PRODUCTOS NO

ESTÉRILES: PRUEBAS DE RECUENTO MICROBIANO

INTRODUCCIÓN
Las pruebas que se describen en este capítulo permitirán el recuento cuantitativo de bacterias mesófilas y hongos que pue-
den desarrollarse en condiciones aeróbicas.
Las pruebas han sido diseñadas principalmente para determinar si una sustancia o preparación cumple con una especifica-
ción establecida de calidad microbiológica. Si se emplean con tales propósitos, seguir las instrucciones que se indican a conti-
nuación, incluyendo el número de muestras a tomar, e interpretar los resultados según se indica más abajo.
Los métodos no son aplicables a productos que contengan microorganismos viables como ingredientes activos.
Pueden utilizarse procedimientos microbiológicos alternativos, incluidos los métodos automatizados, siempre que se haya
demostrado su equivalencia con el método Farmacopeico.

PROCEDIMIENTOS GENERALES
Realizar la determinación en condiciones diseñadas para evitar la contaminación microbiana extrínseca del producto a exa-
minar. Las precauciones a tomar para evitar la contaminación deben ser tales que no afecten a ningún microorganismo que
deba detectarse en la prueba.
Si el producto a examinar posee actividad antimicrobiana, ésta debe eliminarse o neutralizarse en la medida de lo posible. Si
se usan inactivadores para este fin, se debe demostrar su eficacia y la ausencia de toxicidad para los microorganismos.
Si se emplean sustancias tensoactivas en la preparación de la muestra, se debe demostrar la ausencia de toxicidad para los
microorganismos y su compatibilidad con cualquier inactivador usado.

MÉTODOS DE RECUENTO
Usar, según se indica, el método de Filtración por Membrana o uno de los Métodos de Recuento en Placa. El Método del Núme-
ro Más Probable (NMP) es generalmente el método de recuento microbiano menos exacto; sin embargo, para algunos grupos
de productos con biocarga muy baja, puede resultar el método más apropiado.
USP 40 Pruebas Microbiológicas/ (61) Examen Microbiológico 131

La elección de un método se basa en factores tales como la naturaleza del producto y el límite de microorganismos requeri-
do. El método seleccionado debe permitir el análisis de un tamaño de muestra suficiente para juzgar el cumplimiento con la
especificación. Se debe establecer la aptitud del método seleccionado.

PRUEBA DE PROMOCIÓN DEL CRECIMIENTO, APTITUD DEL MÉTODO DE RECUENTO V

CONTROLES NEGATIVOS

Consideraciones Generales

Se debe establecer la aptitud de la prueba para detectar microorganismos en presencia del producto a examinar.
Se debe confirmar la aptitud si se introduce un cambio en la realización de la prueba o en el producto que pudiera afectar
los resultados del análisis.

Preparación de Cepas de Prueba

Usar suspensiones estables estandarizadas de cepas de prueba o preparar según se indica más abajo. Las técnicas de mante-
nimiento de cultivos de lote de siembra (sistemas de lote de siembra) se usan para que los microorganismos viables empleados
para inoculación correspondan a no más de cinco pasajes desde el lote de siembra maestro original. Cultivar, por separado,
cada cepa bacteriana y fúngica de prueba según se indica en la Tabla 7.
Tabla 1. Preparación y Uso de Microorganismos de Prueba
Aptitud del Método de Recuento en
Promoción del Crecimiento Presencia del Producto
Recuento Total Recuento To-
Recuento Total de de Hongos Fila- Recuento Total de tal de Hongos
Preparación de Ce- Microorganismos Ae- mentosos y Le- Microorganismos Filamentosos y
Microorganismo pas de Prueba rublos vaduras Aerobios Levaduras
Staphylococcus aureus por Agar Digerido de Caseí- Agar Digerido de Caseína Agar Digerido de Caseí-
ejemplo ATCC 6538, na y Soja o Caldo Di- y Soja y Caldo Digerido na y Soja/NMP Caldo
NCIMB 9518, CIP 4.83 o gerido de Caseína y de Caseína y Sojas 100 Digerido de Caseína y
NBRC 13276 Soja 30º-35º ufc Soja s 100 ufc
18-24 horas 30º-35º s 3 días 30º-35º s 3 días
Pseudomonas aeruginosa Agar Digerido de Caseí- Agar Digerido de Caseína Agar Digerido de Caseí-
por ejemplo ATCC 9027, na y Soja o Caldo Di- y Soja y Caldo Digerido na y Soja/NMP Caldo
NCIMB 8626, CIP 82.118 gerido de Caseína y de Caseína y Soja s 100 Digerido de Caseína y
o NBRC 13275 Soja 30º-35º ufc Soja s 100 ufc
18-24 horas 30º-35° s 3 días 30º-35º s 3 días
Bacillus subtilis por ejem- Agar Digerido de Caseí- Agar Digerido de Caseína Agar Digerido de Caseí-
plo ATCC 6633, NCIMB na y Soja o Caldo Di- y Soja y Caldo Digerido na y Soja/NMP Caldo
8054, CIP 52.62 o NBRC gerido de Caseína y de Caseína y Soja s 100 Digerido de Caseína y
3134 Soja 30º-35º ufc Soja s 100 ufc
18-24 horas 30º-35º s 3 días 30º-35º s 3 días
Candida albicans por ejem- Agar Sabouraud Dextro- Agar Digerido de Caseína Agar Sabouraud Agar Digerido de Caseí- Agar Sabouraud
ploATCC 10231, NCPF sa o Caldo Sabouraud y Soja s 100 ufc Dextrosa s 100 na y Soja s 100 ufc Dextrosa s 100
3179, IP 48.72 o NBRC Dextrosa 20º -25º 2-3 30º-35º s 5 días ufc 20º-25º s 5 30º-35º s 5 días NMP: ufc 20º-25º s 5
1594 días días no aplica días
Aspergillus brasi/iensis por Agar Sabouraud Dextro- Agar Digerido de Caseína Agar Sabouraud Agar Digerido de Caseí- Agar Sabouraud
ejemplo ATCC 16404, sa o Agar Papa Dextro- y Soja s 100 ufc Dextrosa s 100 na y Soja s 100 ufc Dextrosa s 100
IMI 149007, IP 1431.83 sa 20º-25º 30º-35º s 5 días ufc 20º-25º s 5 30º-35º s 5 días NMP: ufc 20º-25º<:: 5
o NBRC 9455 5-7 días o hasta alean- días no aplica días
zar una buena esporu-
lación

Usar Solución Amortiguada de Cloruro de Sodio-Peptona de pH 7,0 o Solución Amortiguadora de Fosfato de pH 7,2 para realizar
las suspensiones de prueba; para suspender esporas de A. brasiliensis, se puede añadir 0,05% de polisorbato 80 a la solución
amortiguadora. Utilizar las suspensiones dentro de las 2 horas o dentro de las 24 horas si se almacenan a una temperatura
entre 2º y 8º. Como alternativa para la preparación y posterior dilución de una suspensión fresca de las células vegetativas de
A. brasiliensis o B. subtilis, preparar una suspensión estable de esporas y luego usar un volumen apropiado de la suspensión de
esporas para la inoculación de prueba. La suspensión estable de esporas puede mantenerse a una temperatura de 2º a 8º du-
rante un período validado.
132 (61) Examen Microbiológico /Pruebas Microbiológicas USP 40

Control Negativo

Para verificar las condiciones de prueba, realizar un control negativo usando el diluyente seleccionado en lugar de la prepa-
ración de prueba. No debe observarse crecimiento de microorganismos. Asimismo, realizar un control negativo al analizar los
productos según se indica en Pruebas de Productos. Es necesario investigar cualquier falla en el control negativo.

Promoción del Crecimiento de los Medios

Analizar cada partida de medio listo para usar y cada partida de medio preparado a partir de medio deshidratado o de los
ingredientes indicados.
Inocular porciones/placas de Caldo Digerido de Caseína y Soja y Agar Digerido de Caseína y Soja con un número pequeño (no
más de 100 ufc) de los microorganismos indicados en la Tabla 1, empleando una porción/placa individual de medio para cada
uno. Inocular placas de Agar Sabouraud Dextrosa con un número pequeño (no más de 100 ufc) de los microorganismos indica-
dos en la Tabla 1, empleando una placa individual de medio para cada uno. Incubar de acuerdo con las condiciones descritas
en la Tabla 1.
Para medios sólidos, el crecimiento obtenido no debe diferir en un factor mayor de 2 a partir del valor calculado para un
inóculo estandarizado. Para un inóculo recién preparado, se produce un crecimiento de microorganismos comparable al obte-
nido anteriormente con una partida de medio analizada y aprobada previamente. Los medios líquidos son adecuados si se pro-
duce un crecimiento claramente visible de microorganismos comparable al obtenido anteriormente con una partida de medio
analizada y aprobada previamente.

Aptitud del Método de Recuento en Presencia del Producto

PREPARACIÓN DE LA MUESTRA

El método para preparar la muestra depende de las características físicas del producto a examinar. Si ninguno de los procedi-
mientos que se describen a continuación resultara satisfactorio, se debe desarrollar un procedimiento alternativo adecuado.
Productos Solubles en Agua-Disolver o diluir (por lo general se prepara una dilución 1 en 1O) del producto a examinar
en Solución Amortiguada de Cloruro de Sodio-Peptona de pH 7,0, en Solución Amortiguadora de Fosfato de pH 7,2 o en Caldo Di-
gerido de Caseína y Soja. Si fuera necesario, ajustar a un pH de 6 a 8. Preparar diluciones adicionales, con el mismo diluyente, si
fuera necesario.
Productos No Grasos Insolubles en Agua-Suspender el producto a analizar (por lo general se prepara una dilución 1 en
1O) en Solución Amortiguada de Cloruro de Sodio-Peptona de pH 7,0, en Solución Amortiguadora de Fosfato de pH 1,2 o en Caldo
Digerido de Caseína y Soja. Se puede añadir un agente tensoactivo, tal como 1 g por L de polisorbato 80, para favorecer la
suspensión de sustancias poco humectables. Si fuera necesario, ajustar a un pH de 6 a 8. Preparar diluciones adicionales, con el
mismo diluyente, si fuera necesario.
Productos Grasos-Disolver el producto a examinar en miristato de isopropilo esterilizado por filtración o mezclarlo con la
cantidad mínima necesaria de polisorbato 80 estéril u otro reactivo tensoactivo estéril no inhibitorio que se calienta, si fuera
necesario, a no más de 40º o, en casos excepcionales, a no más de 45º. Mezclar cuidadosamente y, si fuera necesario, mante-
ner la temperatura en un baño de agua. Agregar una cantidad suficiente del diluyente seleccionado precalentado para obtener
una dilución 1 en 1O del producto original. Mezclar cuidadosamente, manteniendo la temperatura durante el menor tiempo
necesario para la formación de una emulsión. Se puede preparar una serie de diluciones decimales adicionales empleando el
diluyente seleccionado que contenga una concentración adecuada de polisorbato 80 estéril u otro reactivo tensoactivo estéril
no inhibitorio.
Líquidos o Sólidos en Forma de Aerosol-Transferir el producto asépticamente a un aparato con filtro de membrana o un
recipiente estéril para un muestreo posterior. Usar el contenido completo o una cantidad definida de dosis fijas de cada envase
analizado.
Parches Transdérmicos-Retirar las láminas protectoras ("cubiertas de protección") de los parches transdérmicos y colo-
carlas, con el adhesivo hacia arriba, sobre bandejas de vidrio o plástico estériles. Cubrir la superficie adhesiva con un material
poroso estéril adecuado (p.ej., gasa estéril) para prevenir que los parches se peguen unos a otros y transferirlos a un volumen
adecuado del diluyente seleccionado que contenga inactivadores tales como polisorbato 80 y/o lecitina. Agitar la preparación
vigorosamente por lo menos durante 30 minutos.

INOCULACIÓN Y DILUCIÓN

Agregar a la muestra, preparada según las instrucciones previas, y a un control (sin incluir material de la prueba) un volumen
suficiente de suspensión microbiana para obtener un inóculo de no más de 100 ufc. El volumen de la suspensión del inóculo
no debe exceder del 1% del volumen del producto diluido.
Para demostrar una recuperación microbiana aceptable del producto, se debe usar el factor de dilución más bajo posible de
la muestra preparada para la prueba. Si esto no fuera posible debido a la actividad anti microbiana o la baja solubilidad, deben
USP 40 Pruebas Microbiológicas/ (61) Examen Microbiológico 133

desarrollarse otros protocolos adecuados. Si la inhibición del crecimiento por la muestra no puede evitarse de cualquier otra
manera, la alícuota de suspensión microbiana puede agregarse después de la neutralización, la dilución o la filtración.

NEUTRALIZACIÓN/ELIMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA

Comparar el número de microorganismos recuperados a partir de la muestra preparada, diluida según se indica en Inocula-
ción y Dilución e incubada siguiendo el procedimiento descrito en Recuperación de Microorganismos en Presencia del Producto,
con el número de microorganismos recuperados a partir de la preparación de control.
Si se inhibe el crecimiento (reducción en un factor mayor de 2), modificar el procedimiento para la prueba de recuento par-
ticular con el objeto de garantizar la validez de los resultados. La modificación del procedimiento puede incluir, por ejemplo,
(1) Un aumento en el volumen del diluyente o medio de cultivo;
(2) Incorporación de agentes neutralizantes generales o específicos en el diluyente;
(3) Filtración por membrana; o
(4) Una combinación de todas las medidas anteriores.
Agentes Neutralizantes-Los agentes neutralizantes pueden usarse para neutralizar la actividad de los agentes antimicro-
bianos (ver la Tabla 2). Pueden añadirse al diluyente seleccionado o al medio, preferentemente antes de la esterilización. Si se
usan, se debe demostrar su eficacia y la ausencia de toxicidad para los microorganismos mediante un blanco con neutralizador
y sin el producto.
Tabla 2. Agentes Neutralizantes Comunes/Métodos para
Sustancias de Interferencia
Agentes Neutrallzantes
Sustancia de Interferencia Potenciales/Método
Glutaraldehído, mercuriales Sulfito ácido de sodio (Bisulfito de sodio)
Fenólicos, alcohol, aldehídos, sorbato Dilución
Aldehídos Glicina
Compuestos de amonio cuaternario (CAC), parahidroxibenzoatos (parabenos), bis-biguanidas Lecitina
CAC, yodo, parabenos Polisorbato
Mercuriales Tioglicolato
Mercuriales, halógenos, aldehídos Tiosulfato
EDTA (edetato) Iones de Mg o Ca

Si no se encuentra un método de neutralización adecuado, puede suponerse que la imposibilidad de aislar el microorganis-
mo inoculado es atribuible a la actividad microbicida del producto. Esta información permite deducir que no es probable que
el artículo se contamine con esa determinada especie de microorganismo. No obstante, es posible que el producto inhiba sola-
mente algunos microorganismos especificados en este capítulo pero que no inhiba otros no incluidos entre las cepas de prue-
ba o aquellos para los cuáles éstas no son representativas. En consecuencia, realizar la prueba con el factor de dilución más alto
compatible con el crecimiento microbiano y el criterio de aceptación específico.

RECUPERACIÓN DE MICROORGANISMOS EN PRESENCIA DEL PRODUCTO

Para cada uno de los microorganismos en la lista, realizar pruebas individuales. Contar sólo los microorganismos de la cepa
de prueba agregada.
Filtración por Membrana-Usar filtros de membrana con un tamaño nominal de poro no mayor de 0,45 µm. Escoger el
tipo de material del filtro de manera que la eficiencia en la retención de bacterias no se vea afectada por los componentes de
la muestra a investigar. Usar un filtro de membrana para cada uno de los microorganismos mencionados.
Transferir una cantidad adecuada de la muestra preparada según se indica en Preparación de la Muestra, Inoculación y Dilu-
ción y Neutralización/Eliminación de la Actividad Antimicrobiana (que preferiblemente represente 1 g del producto, o menos si se
espera un gran número de ufc) al filtro de membrana, filtrar inmediatamente y enjuagar el filtro de membrana con un volu-
men adecuado de diluyente.
Para determinar el recuento total de microorganismos aerobios (RTMA), transferir el filtro de membrana a la superficie del
Agar Digerido de Caseína y Soja. Para determinar el recuento total combinado de hongos filamentosos y levaduras (RTCHL),
transferir la membrana a la superficie del Agar Sabouraud Dextrosa. Incubar las placas según se indica en la Tabla 1. Realizar el
recuento.
Métodos de Recuento en Placa-Aplicar los métodos de recuento en placa al menos por duplicado para cada medio y
usar el recuento medio del resultado.
Método de Vertido en Placa-Para placas de Petri de 9 cm de diámetro, agregar a la placa 1 mL de la muestra preparada
según se indica en Preparación de la Muestra, Inoculación y Dilución y Neutralización/Eliminación de la Actividad Antimicrobiana y
de 15 a 20 mL de Agar Digerido de Caseína y Soja o Agar Sabouraud Dextrosa, manteniendo la temperatura de ambos medios a
no más de 45º. Si se emplean placas de Petri más grandes, aumentar la cantidad del medio de agar proporcionalmente. Em-
plear al menos dos placas de Petri para cada microorganismo mencionado en la Tabla 1.
134 (61) Examen Microbiológico /Pruebas Microbiológicas USP 40

Incubar las placas según se indica en la Tabla 7. Tomar la media aritmética de los recuentos obtenidos en cada medio y
calcular el número de ufc en el inóculo original.
Método de Extensión en Superficie-Agregar de 15 a 20 ml de Agar Digerido de Caseína y Soja o Agar Sabouraud Dextrosa a
cada placa de Petri de 9 cm de diámetro, aproximadamente a 45º, y dejar solidificar. Si se emplean placas de Petri más gran-
des, aumentar el volumen del agar proporcionalmente. Secar las placas, por ejemplo, en un gabinete con flujo de aire laminar
o en una incubadora. Emplear al menos dos placas de Petri para cada microorganismo mencionado en la Tabla 7. Esparcir un
volumen medido de no menos de O, 1 ml de la muestra, preparada según se indica en Preparación de la Muestra, Inoculación y
Dilución y Neutralización/Eliminación de la Actividad Antimicrobiana sobre la superficie del medio. Incubar y realizar el recuento
según se indica en Método de Vertido en Placa.
Método del Número Más Probable (NMP)-La precisión y exactitud del Método del NMP son menores que las del méto-
do de Filtración por Membrana o el Método de Recuento en Placa. Los resultados no confiables se obtienen particularmente para
el recuento de hongos filamentosos. Por estas razones, el Método del NMP se reserva para el RTMA en situaciones en las que no
haya otro método disponible. Si se justifica el empleo del método, proceder de la siguiente manera:
Preparar una serie de al menos tres diluciones decimales en serie del producto según se indica en Preparación de la Muestra,
Inoculación y Dilución y Neutralización/Eliminación de Actividad Antimicrobiana. A partir de cada nivel de dilución, usar tres alí-
cuotas de 1 g o 1 ml para inocular tres tubos con 9 a 1 O ml de Caldo Digerido de Caseína y Soja. Si fuera necesario, se puede
agregar al medio un agente tensoactivo, tal como polisorbato 80, o un inactivador de agentes antimicrobianos. Por lo tanto, si
se preparan tres niveles de dilución, inocular nueve tubos.
Incubar todos los tubos a una temperatura de 30º a 35º durante no más de 3 días. Si la lectura de los resultados resulta
difícil o dudosa dada la naturaleza del producto a examinar, subcultivar en el mismo caldo o en Agar Digerido de Caseína y Soja
durante un período de 1 a 2 días a la misma temperatura y usar estos resultados. A partir de la Tabla 3, determinar el número
más probable de microorganismos por g o por ml del producto a examinar.
Tabla 3. Valores del Número Más Probable de Microorganismos
Combinaciones Observadas de Números de NMP porgo Límites
Tubos que Muestran Crecimiento en Cada por mL de de Confianza
Juego Producto de95%
Número de g o mL de Producto por Tubo
0,1 0,01 0,001
o o o <3 0-9,4
o o 1 3 o, 1-9,5
o 1 o 3 o, 1-1 o
o 1 1 6,1 1,2-17
o 2 o 6,2 1,2-17
o 3 o 9,4 3,5-35
1 o o 3,6 0,2-17
1 o 1 7,2 1,2-17
1 o 2 11 4-35
1 1 o 7,4 1,3-20
1 1 1 11 4-35
1 2 o 11 4-35
1 2 1 15 5-38
1 3 o 16 5-38
2 o o 9,2 1,5-35
2 o 1 14 4-35
2 o 2 20 5-38
2 1 o 15 4-38
2 1 1 20 5-38
2 1 2 27 9-94
2 2 o 21 5-40
2 2 1 28 9-94
2 2 2 35 9-94
2 3 o 29 9-94
2 3 1 36 9-94
3 o o 23 5-94
3 o 1 38 9-104
3 o 2 64 16-181
,
3 1 o 43 9-181
USP 40 Pruebas Microbiológicas/ (61) Examen Microbiológico 135

Tabla 3. Valores del Número Más Probable de Microorganismos (Continuación)

Combinaciones Observadas de Números de NMP porgo Límites
Tubos que Muestran Crecimiento en Cada por mL de de Confianza
Juego Producto de95%
Número de g o mL de Producto por Tubo
0,1 0,01 0,001
3 1 1 75 17-199
3 1 2 120 30-360
3 1 3 160 30-380
3 2 o 93 18-360
3 2 1 150 30-380
3 2 2 210 30-400
3 2 3 290 90-990
3 3 o 240 40-990
3 3 1 460 90-1980
3 3 2 1100 200-4000
3 3 3 >1100

RESULTADOS E INTERPRETACIÓN

Al verificar la aptitud del método de Filtración por Membrana o del Método de Recuento en Placa, se debe obtener un recuen-
to medio de cualquier microorganismo de prueba que no difiera en un factor mayor de 2 del valor del control definido en
Inoculación y Dilución en la ausencia del producto. Al verificar la aptitud del Método del NMP, el valor calculado a partir del
inóculo debe estar dentro de los límites de confianza de 95% de los resultados obtenidos con el control.
Si los criterios mencionados anteriormente no pueden cumplirse para uno o más de los microorganismos analizados con
cualquiera de los métodos descritos, se debe utilizar para examinar el producto, el método y las condiciones de prueba más
cercanas a esos criterios.

PRUEBA DE PRODUCTOS

Cantidad Usada para la Prueba

A menos que se indique algo diferente, usar 1O g o 1O mL del producto a examinar, tomados con las precauciones mencio-
nadas anteriormente. Para líquidos o sólidos en forma de aerosol, muestrear 1O envases. Para parches transdérmicos, mues-
trear 1O parches.
Se puede reducir la cantidad a analizar de las sustancias activas que se formulan en las siguientes condiciones: la cantidad
por unidad de dosificación (por ej., tableta, cápsula, inyección) es menor o igual a 1 mg o la cantidad por g o mL (para prepa-
raciones que no se presentan en unidades de dosificación) es menor de 1 mg. En estos casos, la cantidad de la muestra a anali-
zar no es menor que la cantidad presente en 1O unidades de dosificación o 1 Og o 1O mL del producto.
Para materiales que se usan como sustancias activas en los que la cantidad de la muestra es limitada o el tamaño de la parti-
da es extremadamente pequeño (es decir, menos de 1000 mL o 1000 g), la cantidad analizada debe ser 1% de la partida a
menos que se indique, o justifique y autorice una cantidad menor.
Para productos cuyo número total de entidades en una partida es menor de 200 (por ej. muestras que se usan en ensayos
clínicos), el tamaño de la muestra puede reducirse a dos unidades o a una unidad si el tamaño es menor de 1OO.
Escoger la(s) muestra(s) aleatoriamente a partir del material a granel o de los envases disponibles de la preparación. Para
obtener la cantidad requerida, mezclar los contenidos de un número suficiente de envases para proporcionar la muestra.

Examen del Producto

FILTRACIÓN POR MEMBRANA

Usar un aparato de filtración diseñado para permitir la transferencia del filtro al medio. Preparar la muestra empleando un
método cuya aptitud se haya demostrado según se indica en Prueba de Promoción del Crecimiento y Aptitud del Método de Re-
cuento, transferir la cantidad adecuada a dos filtros de membrana y filtrar inmediatamente. Lavar cada filtro siguiendo el proce-
dimiento que haya demostrado su aptitud.
Para determinar el RTMA, transferir uno de los dos filtros de membrana a la superficie del Agar Digerido de Caseína y Soja.
Para determinar el RTCHL, transferir la otra membrana a la superficie del Agar Sabouraud Dextrosa. Incubar la placa de Agar
Digerido de Caseína y Soja a una temperatura de 30º a 35º durante un período de 3 a 5 días y la placa de Agar Sabouraud
136 (61) Examen Microbiológico /Pruebas Microbiológicas USP 40

Dextrosa a una temperatura de 20º a 25º durante un período de 5 a 7 días. Calcular el número de ufc por g o por mL del
producto.
Al examinar los parches transdérmicos, filtrar por separado 10% del volumen de la preparación descrita en Preparación de la
Muestra a través de cada una de las dos membranas de filtración estériles. Transferir una membrana al Agar Digerido de Caseína
y Soja para el RTMA y la otra membrana al Agar Sabouraud Dextrosa para el RTCHL.

MÉTODOS DE RECUENTO EN PLACA

Método de Vertido en Placa-Preparar la muestra empleando un método cuya aptitud se haya demostrado según se des-
cribe en Prueba de Promoción del Crecimiento y Aptitud del Método de Recuento. Preparar al menos dos placas de Petri para cada
medio por cada nivel de dilución. Incubar las placas de Agar Digerido de Caseína y Soja a una temperatura entre 30º y 35º
durante un período de 3 a 5 días y las placas de Agar Sabouraud Dextrosa a una temperatura entre 20º y 25º durante un perío-
do de 5 a 7 días. Escoger las placas correspondientes a una dilución determinada y que muestren el mayor número de colo-
nias, menor de 250 para el RTMA y 50 para el RTCHL. Tomar la media aritmética de los recuentos por medio de cultivo y
calcular el número de ufc por g o por mL del producto.
Método de Extensión en Superficie-Preparar la muestra empleando un método cuya aptitud se haya demostrado según
se describe en Prueba de Promoción del Crecimiento y Aptitud del Método de Recuento. Preparar al menos dos placas de Petri para
cada medio y cada nivel de dilución. Para la incubación y cálculo del número de ufc, proceder según se indica en el Método de
Vertido en Placa.

MÉTODO DEL NÚMERO MÁS PROBABLE

Preparar y diluir la muestra empleando un método cuya aptitud se haya demostrado según se describe en Prueba de Promo-
ción del Crecimiento y Aptitud del Método de Recuento. Incubar todos los tubos durante un período de 3 a 5 días a una tempera-
tura de 30º a 35º. Subcultivar, si fuera necesario, empleando el procedimiento cuya aptitud se haya demostrado. Registrar para
cada nivel de dilución el número de tubos que muestran crecimiento microbiano. A partir de la Tabla 3, determinar el número
más probable de microorganismos por g o por mL del producto a examinar.

Interpretación de los Resultados

El recuento total de microorganismos aerobios (RTMA) se considera equivalente al número de ufc encontrado usando Agar
Digerido de Caseína-Soja; si se detectan colonias de hongos en este medio, contarlas como parte del RTMA. El recuento total
combinado de hongos filamentosos y levaduras (RTCHL) se considera equivalente al número de ufc encontrado empleando
Agar Sabouraud Dextrosa; si se detectan colonias de bacterias en este medio, contarlas como parte del RTCHL. Cuando se espe-
ra que el RTCHL exceda el criterio de aceptación debido al crecimiento bacteriano, se puede usar Agar Sabouraud Dextrosa que
contenga antibióticos. Si se realiza el recuento mediante el Método del MNP, el valor calculado es RTMA.
Cuando se indica un criterio de aceptación para la calidad microbiológica, éste se interpreta de la siguiente manera:
- 10 1 ufc: recuento máximo aceptable = 20;
- 102 ufc: recuento máximo aceptable = 200;
- 103 ufc: recuento máximo aceptable = 2000;
y así sucesivamente.
Las soluciones y medios recomendados se indican en Pruebas de Microorganismos Específicos (62).

(62) EXAMEN MICROBIOLÓGICO DE PRODUCTOS NO

ESTÉRILES: PRUEBAS DE MICROORGANISMOS ESPECÍFICOS

INTRODUCCIÓN

Las pruebas que se describen en este capítulo permitirán determinar la ausencia, o presencia limitada, de microorganismos
específicos que puedan ser detectados en las condiciones descritas.
Las pruebas han sido diseñadas principalmente para determinar si una sustancia o preparación cumple con alguna especifi-
cación establecida de calidad microbiológica. Si se emplean con tales propósitos, seguir las instrucciones que se indican a con-
tinuación, incluyendo el número de muestras a tomar, e interpretar los resultados según se indica más abajo.
Pueden utilizarse procedimientos microbiológicos alternativos, incluyendo métodos automatizados, siempre que se haya de-
mostrado su equivalencia con el método farmacopeico.
USP 40 Pruebas Microbiológicas/ (62) Examen Microbiológico 137

PROCEDIMIENTOS GENERALES

La preparación de muestras se realiza según se indica en Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Recuento
Microbiano (61 ).
Si el producto a examinar posee actividad antimicrobiana, ésta debe eliminarse o neutralizarse en la medida de lo posible
según se describe en Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Recuento Microbiano (61 ).
Si se emplean sustancias tensoactivas en la preparación de la muestra, se debe demostrar su ausencia de toxicidad para los
microorganismos y su compatibilidad con cualquier inactivador usado, según se describe en Examen Microbiológico de Produc-
tos No Estériles: Pruebas de Recuento Microbiano (61 ).

PROPIEDADES DE PROMOCIÓN DEL CRECIMIENTO E INHIBITORIAS DE LOS MEDIOS,

APTITUD DE LA PRUEBA Y CONTROLES NEGATIVOS

Se debe establecer la capacidad de la prueba para detectar microorganismos en presencia del producto a examinar. Se debe
confirmar la aptitud de la prueba si se introduce un cambio en la ejecución de la prueba o en el producto que pudiera afectar
los resultados.

Preparación de Cepas de Prueba

Usar suspensiones estables estandarizadas de cepas de prueba según se indica más abajo. Las técnicas de mantenimiento de
cultivos de lote de siembra (sistemas de lote de siembra) se usan para que los microorganismos viables empleados para inocu-
lación correspondan a no más de cinco pasajes desde el lote de siembra maestro original.

MICROORGANISMOS AEROBIOS

Cultivar por separado cada cepa bacteriana de prueba en recipientes que contengan Caldo Digerido de Caseína y Soja o Agar
Digerido de Caseína y Soja a una temperatura de 30º a 35º durante un período de 18 a 24 horas. Cultivar por separado la cepa
de prueba de Candida albicans en Agar Sabouraud Dextrosa o Caldo Sabouraud Dextrosa a una temperatura de 20º a 25º duran-
te un período de 2 a 3 días.
Staphy/ococcus aureus Por ejemplo ATCC 6538, NCIMB 9518, CIP 4.83 o NBRC 13276
Pseudomonas aeruginosa Por ejemplo ATCC 9027, NCIMB 8626, CIP 82.118 o NBRC
13275
Escherichia coli Por ejemplo ATCC 8739, NCIMB 8545, CIP 53.126 o NBRC
3972
Salmonella enterica subesp. enterica serovar Typhimurium o, como alternativa, Por ejemplo ATCC 14028
Salmonella mterica subesp. enterica serovar Abony Por ejemplo NBRC 100797, NCTC 6017 o CIP 80.39
Candida a/bicans Por ejemplo ATCC 10231, NCPF 3179, IP 48.72 o NBRC 1594

Usar Solución Amortiguada de Cloruro de Sodio-Peptona de pH 7,0 o Solución Amortiguadora de Fosfato de pH 7,2 para preparar
las suspensiones de prueba. Usar las suspensiones dentro de las 2 horas o dentro de las 24 horas si se almacenan a una tempe-
ratura de 2º a 8º.

CLOSTRIDIOS

Usar Clostridium sporogenes, como por ejemplo ATCC 11437 (NBRC 14293, NCIMB 12343, CIP 100651) o ATCC 19404
(NCTC 532 o CIP 79.3). Cultivar la cepa clostridial de prueba en condiciones anaeróbicas en Medio Reforzado para Clostridios a
una temperatura de 30º a 35º durante un período de 24 a 48 horas. Como alternativa para la preparación y posterior dilución
de una suspensión fresca de las células vegetativas de CI. sporogenes, se emplea una suspensión estable de esporas para la ino-
culación de prueba. La suspensión estable de esporas puede mantenerse a una temperatura de 2º a 8º durante un período
validado.

Control Negativo

Para verificar las condiciones de prueba, realizar un control negativo usando el diluyente seleccionado en lugar de la prepa-
ración de prueba. No debe observarse crecimiento de microorganismos. Asimismo, realizar un control negativo al analizar los
productos según se indica en Pruebas de Productos. Es necesario investigar cualquier falla en el control negativo.
138 (62) Examen Microbiológico/ Pruebas Microbiológicas USP 40

Propiedades de Promoción del Crecimiento e Inhibitorias de los Medios

Analizar cada partida de medio listo para usar y cada partida de medio preparado a partir de medio deshidratado o de los
ingredientes. Verificar las propiedades adecuadas de los medios pertinentes según se indica en la Tabla 1.
Tabla 1. Propiedades Indicadoras de Promoción del Crecimiento e Inhibitorias de los Medios
Prueba/Medio Propiedad Cepas de Prueba
Prueba e.ara bacterias Gram-negativas tolerantes a la bilis
Caldo Mossel para Enriquecimiento de En- Promoción del crecimiento E. coli
terobacterias
P. aeruginosa
Inhibitoria S. aureus
Agar Violeta Rojo Bilis Glucosa Promoción del crecimiento+ Indicadora E. coli
P. aeruginosa
Prueba de Escherichia coli
Caldo MacConkey Promoción del crecimiento E. coli
Inhibitoria S. aureus
Agar MacConkey Promoción del crecimiento+ Indicadora E. coli
Prueba de Salmonel/a
Caldo Rappaport-Vassiliadis para Enrique- Promoción del crecimiento Salmonella enterica subesp. enterica serovar Typhimu-
cimiento de Salmonella riumo
Salmonella enterica subesp. enterica serovar Abony
Inhibitoria S. aureus
Agar Xilósa Lisina Desoxicolato Promoción del crecimiento + Indicadora Salmonella enterica subesp. enterica serovar Typhimu-
rium o
Salmonella enterica subesp. enterica serovar Abony
Prueba de Pseudomonas aeruginosa
Agar Cetrimida Promoción del crecimiento P. aeruginosa
Inhibitoria E. coli
Prueba de Stag_hi¿lococcus aureus
Agar Manitol Salado Promoción del crecimiento+ Indicadora S. aureus
Inhibitoria E. coli
Prueba de Clostridios
Medio Reforzado para Clostridios Promoción del crecimiento CI. sporogenes
Agar Columbia Promoción del crecimiento CI. sporogenes
Prueba de Candida albicans
Caldo Sabouraud Dextrosa Promoción del crecimiento C. albicans
Agar Sabouraud Dextrosa Promoción del crecimiento+ Indicadora C. albicans

Prueba de las Propiedades de Promoción del Crecimiento, Medios Líquidos-Inocular una porción del medio apropia-
do con un número pequeño (no más de 100 ufc) del microorganismo adecuado. Incubar a la temperatura especificada duran-
te un tiempo no mayor que el período menor indicado en la prueba. Se produce un crecimiento claramente visible de micro-
organismos comparable al obtenido anteriormente con una partida de medio analizada y aprobada previamente.
Prueba de las Propiedades de Promoción del Crecimiento, Medios Sólidos-Usar el Método de Extensión en Superficie
(ver Métodos de Recuento en Placa en Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Recuento Microbiano (61 )), ino-
culando cada una de las placas con un número pequeño (no más de 100 ufc) del microorganismo adecuado. Incubar a la
temperatura especificada durante un tiempo no mayor que el período menor indicado en la prueba. Se produce un crecimien-
to de microorganismos comparable al obtenido anteriormente con una partida de medio analizada y aprobada previamente.
Prueba de las Propiedades Inhibitorias, Medios Sólidos o Líquidos-Inocular el medio apropiado con al menos 100 ufc
del microorganismo adecuado. Incubar a la temperatura especificada durante un tiempo no menor del período mayor indica-
do en la prueba. No se produce crecimiento del microorganismo de prueba.
Prueba de las Propiedades Indicadoras-Usar el Método de Extensión en Superficie (ver Métodos de Recuento en Placa en
Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Recuento Microbiano (61 )), inoculando cada una de las placas con
un número pequeño (no más de 100 ufc) del microorganismo adecuado. Incubar a la temperatura especificada durante un
período que se encuentre en el intervalo indicado en la prueba. Las colonias son comparables, en apariencia y reacciones indi-
cadoras, a aquellas anteriormente obtenidas con una partida de medio analizada y aprobada previamente.
USP 40 Pruebas Microbiológicas/ (62) Examen Microbiológico 139

Aptitud del Método de Prueba

Para cada producto nuevo a analizar, realizar una preparación de la muestra según se indica en el párrafo pertinente en
Pruebas de Productos. Al momento de la mezcla, agregar cada cepa de prueba en el medio de crecimiento indicado. Inocular
individualmente las cepas de prueba. Usar un número de microorganismos equivalente a no más de 100 ufc en la preparación
de prueba inoculada.
Realizar la prueba según se indica en el párrafo pertinente en Pruebas de Productos empleando el período más corto de incu-
bación indicado.
Se deben detectar los microorganismos específicos con las reacciones indicadoras según se describe en Pruebas de Productos.
Cualquier actividad antimicrobiana del producto requiere de una modificación del procedimiento de la prueba (ver Neutrali-
zación/Eliminación de la Actividad Antimicrobiana en Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Recuento Micro-
biano (61)).
Para un producto determinado, si la actividad antimicrobiana con respecto al microorganismo para el cual se indica la prue-
ba no puede neutralizarse, se asume que el microorganismo inhibido no estará presente en el producto.

PRUEBAS DE PRODUCTOS

Bacterias Gram-Negativas Tolerantes a la Bilis

Preparación de la Muestra e Incubación Previa-Preparar una muestra empleando una dilución 1 en 1O de no menos de
1 g del producto a analizar según se indica en Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Recuento Microbiano
(61 ), excepto que se debe usar Caldo Digerido de Caseína y Soja como diluyente de elección, mezclar e incubar a una tempera-
tura de 20º a 25º durante un período suficiente para resucitar las bacterias pero que no estimule la multiplicación de los orga-
nismos (por lo general 2 horas pero no más de 5 horas).
Prueba de Ausencia-A menos que se indique algo diferente, usar un volumen correspondiente a 1 g del producto, según
se indica en Preparación de la Muestra e Incubación Previa, para inocular Caldo Mossel para Enriquecimiento de Enterobacterias.
Incubar a una temperatura de 30º a 35º durante un período de 24 a 48 horas. Subcultivar en placas de Agar Violeta Rojo Bilis
Glucosa. Incubar a una temperatura de 30º a 35º durante un período de 18 a 24 horas.
El producto cumple con la prueba si no se desarrollan colonias.
Prueba Cuantitativa-
Selección y Subcultivo-lnocular cantidades adecuadas de Caldo Mossel para Enriquecimiento de Enterobacterias con la prepa-
ración según se indica en Preparación de la Muestra e Incubación Previa y/o diluciones de la misma que contengan respectiva-
mente O, l g; 0,01 g y 0,001 g (ó 0, 1 ml; 0,01 ml y 0,001 ml) del producto a examinar. Incubar a una temperatura de 30º a
35º durante un período de 24 a 48 horas. Subcultivar cada uno de los cultivos en una placa de Agar Violeta Rojo Bilis Glucosa.
Incubar a una temperatura de 30º a 35º durante un período de 18 a 24 horas.
Interpretación-El crecimiento de colonias constituye un resultado positivo. Indicar la menor cantidad del producto que pro-
duce un resultado positivo y la mayor cantidad que produce un resultado negativo. Determinar la cantidad probable de bacte-
rias a partir de la Tabla 2.
Tabla 2. Interpretación de Resultados
Resultados para Cada Cantidad
del Producto Cantidad Probable de Bacterias por
0,1go0,1 ml 0,01 g o 0,01 ml 0,001 g o 0,001 ml g o ml del Producto
+ + + más de 10 3
+ + - menos de 10 3 y más de 102
+ - - menos de 10 2 y más de 1O
- - - menos de 10

Escherichia coli

Preparación de la Muestra e Incubación Previa-Preparar una muestra usando una dilución 1 en 1O de no menos de 1 g
del producto a analizar según se indica en Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Recuento Microbiano (61)
y usar 1O ml o la cantidad correspondiente a 1 g o 1 ml, para inocular una cantidad adecuada (determinada según se descri-
be en Aptitud del Método de Prueba) de Caldo Digerido de Caseína y Soja, mezclar e incubar a una temperatura de 30º a 35º
durante un período de 18 a 24 horas.
Selección y Subcultivo-Agitar el recipiente, transferir 1 ml de Caldo Digerido de Caseína y Soja a 100 ml de Caldo Mac-
Conkey e incubar a una temperatura de 42º a 44º durante un período de 24 a 48 horas. Subcultivar en una placa de Agar
MacConkey a una temperatura de 30º a 35º durante un período de 18 a 72 horas.
Interpretación-El crecimiento de colonias indica la posible presencia de E. coli. Esto se confirma mediante pruebas de
identificación.
140 (62) Examen Microbiológico/ Pruebas Microbiológicas USP 40

El producto cumple con la prueba si no se desarrollan colonias o si los resultados de las pruebas de identificación son negati-
vos.

Salmonella
Preparación de la Muestra e Incubación Previa-Preparar el producto a analizar según se indica en Examen Microbiológico
de Productos No Estériles: Pruebas de Recuento Microbiano (61)y usar una cantidad correspondiente a no menos de 1Og ó 1O
ml, para inocular una cantidad adecuada (determinada según se describe en Aptitud del Método de Prueba) de Caldo Digerido
de Caseína y Soja, mezclar e incubar a una temperatura de 30º a 35º durante un período de 18 a 24 horas.
Selección y Subcultivo-Transferir 0, 1 ml de Caldo Digerido de Caseína y Soja a 1 O ml de Caldo Rappaport-Vassiliadis para
Enriquecimiento de Salmonella e incubar a una temperatura de 30º a 35º durante un período de 18 a 24 horas. Subcultivar en
placas de Agar Xi/osa Lisina Desoxicolato. Incubar a una temperatura de 30º a 35º durante un período de 18 a 48 horas.
Interpretación-El crecimiento de colonias bien desarrolladas de color rojo, con o sin centros negros indica la posible pre-
sencia de Salmone/la. Esto se confirma mediante pruebas de identificación.
El producto cumple con la prueba si no se desarrollan colonias de los tipos descritos o si los resultados de las pruebas de
identificación confirmatorias son negativos.

Pseudomonas aeruginosa
Preparación de la Muestra e Incubación Previa-Preparar una muestra usando una dilución 1 en 1 O de no menos de 1 g
del producto a analizar según se indica en Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Recuento Microbiano (61)
y usar 1O ml o la cantidad correspondiente a 1 g ó 1 ml, para inocular una cantidad adecuada (determinada según se descri-
be en Aptitud del Método de Prueba) de Caldo Digerido de Caseína y Soja y mezclar. Al analizar parches transdérmicos, filtrar el
volumen de muestra correspondiente a un parche de la preparación (ver Parches Transdérmicos en Preparación de la Muestra en
Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Recuento Microbiano (61)) a través de un filtro de membrana estéril
y colocar en 100 ml de Caldo Digerido de Caseína y Soja. Incubar a una temperatura de 30º a 35º durante un período de 18 a
24 horas.
Selección y Subcultivo-Subcultivar en una placa de Agar Cetrimida e incubar a una temperatura de 30º a 35º durante un
período de 1 8 a 72 horas.
Interpretación-El crecimiento de colonias indica la posible presencia de P. aeruginosa. Esto se confirma mediante pruebas
de identificación.
El producto cumple con la prueba si no se desarrollan colonias o si los resultados de las pruebas de identificación confirma-
torias son negativos.

Staphylococcus aureus
Preparación de la Muestra e Incubación Previa-Preparar una muestra usando una dilución 1 en 1O de no menos de 1 g
del producto a analizar según se indica en Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Recuento Microbiano (61)
y usar 1 O ml o la cantidad correspondiente a 1 g ó 1 ml, para inocular una cantidad adecuada (determinada según se descri-
be en Aptitud del Método de Prueba) de Caldo Digerido de Caseína y Soja y homogenizar. Al analizar parches transdérmicos, fil-
trar el volumen de muestra correspondiente a un parche de la preparación (ver Parches Transdérmicos en Preparación de la
Muestra en Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Recuento Microbiano (61 )) a través de un filtro de mem-
brana estéril y colocar en 100 ml de Caldo Digerido de Caseína y Soja. Incubar a una temperatura de 30º a 35º durante un
período de 18 a 24 horas.
Selección y Subcultivo-Subcultivar en una placa de Agar Manito/ Salado e incubar a una temperatura de 30º a 35º duran-
te un período de 1 8 a 72 horas.
Interpretación-El crecimiento de colonias amarillas o blancas rodeadas de una zona amarilla indica la posible presencia de
S. aureus. Esto se confirma mediante pruebas de identificación.
El producto cumple con la prueba si no se desarrollan colonias de los tipos descritos o si los resultados de las pruebas de
identificación confirmatorias son negativos.

Clostridios
Preparación de la Muestra y Tratamiento Térmico-Preparar una muestra usando una dilución 1 en 1O (con un volumen
total mínimo de 20 ml) de no menos de 2 g o 2 ml del producto a analizar según se indica en Examen Microbiológico de Pro-
ductos No Estériles: Pruebas de Recuento Microbiano (61 ). Dividir la muestra en dos porciones de al menos 1 O ml. Calentar una
porción a 80º durante 1 O minutos y enfriar rápidamente. No calentar la otra porción.
Selección y Subcultivo-Usar 1 O ml o la cantidad correspondiente a 1 g o 1 ml del producto a analizar de ambas porcio-
nes para inocular cantidades adecuadas (determinadas según se indica en Aptitud del Método de Prueba) de Medio Reforzado
para Clostridios. Incubar bajo condiciones anaeróbicas a una temperatura de 30º a 35º durante 48 horas. Después de la incuba-
USP 40 Pruebas Microbiológicas/ (62) Examen Microbiológico 141

ción, realizar subcultivos a partir de cada recipiente en Agar Columbia e incubar bajo condiciones anaeróbicas a una temperatu-
ra de 30º a 35º durante 48 a 72 horas.
Interpretación-El crecimiento anaeróbico de bacilos (con o sin endosporas) que dan una reacción de catalasa negativa
indica la presencia de Clostridios.
Esto se confirma mediante pruebas de identificación. Si no se detectan colonias de los tipos descritos o si las pruebas de
identificación confirmatorias resultan negativas, el producto cumple con la prueba.

Candida albicans

Preparación de la Muestra e Incubación Previa-Preparar el producto a analizar según se indica en Examen Microbiológico
de Productos No Estériles: Pruebas de Recuento Microbiano (61) y usar 1O ml o la cantidad correspondiente a no menos de 1 g ó
1 ml, para inocular 100 ml de Caldo Sabouraud Dextrosa y mezclar. Incubar a una temperatura de 30º a 35º durante un perío-
do de 3 a 5 días.
Selección y Subcultivo-Subcultivar en una placa de Agar Sabouraud Dextrosa e incubar a una temperatura de 30º a 35º
durante un período de 24 a 48 horas.
Interpretación-El crecimiento de colonias blancas puede indicar la presencia de C. albicans. Esto se confirma mediante
pruebas de identificación.
El producto cumple con la prueba si no se desarrollan tales colonias o si las pruebas de identificación confirmatorias resultan
negativas.

SOLUCIONES RECOMENDADAS Y
MEDIOS DE CULTIVO
[NOTA-Esta sección se proporciona como información.]
Las siguientes soluciones y medios de cultivo han resultado satisfactorios en el cumplimiento de los objetivos para los cuales
se indican en la prueba de contaminación microbiana en la Farmacopea. Se pueden usar otros medios siempre que se pueda
demostrar su aptitud.
Solución Amortiguadora Madre-Transferir 34 g de fosfato monobásico de potasio a un matraz volumétrico de 1000 ml,
disolver en 500 ml de Agua Purificada, ajustar con hidróxido de sodio a un pH de 7,2 ± 0,2, agregar Agua Purificada a volumen
y mezclar. Dispensar en recipientes y esterilizar. Almacenar a una temperatura de 2º a 8º.
Solución Amortiguadora de Fosfato de pH 7,2-Preparar una mezcla de Agua Purificada y Solución Amortiguadora Madre
(800:1 v/v) y esterilizar.

Solución Amortiguada de Cloruro de Sodio-Peptona

de pH 7,0
Fosfato Monobásico de Potasio 3,6 g
Fosfato Dibásico de Sodio Dihidrato 7,2 g (equivalente a fosfato 0,067 M)
Cloruro de Sodio 4,3 g
Peptona (de carne o caseína) 1,0 g
Agua Purificada 1000 ml

Esterilizar en un autoclave utilizando un ciclo validado.

Caldo Digerido de Caseína y Soja

Digerido Pancreático de Caseína 17,0 g
Digerido Papaínico de Soja 3,0 g
Cloruro de Sodio 5,0 g
Fosfato Dibásico de Potasio 2,5 g
Glucosa Monohidrato 2,5 g
Agua Purificada 1000 ml

Ajustar el pH para que después de la esterilización sea de 7,3 ± 0,2 a 25º. Esterilizar en un autoclave utilizando un ciclo vali-
dado.

Agar Digerido de Caseína y Soja

Digerido Pancreático de Caseína 15,0 g
Digerido Papaínico de Soja 5,0 g
Cloruro de Sodio 5,0 g
Agar 15,0 g
Agua Purificada 1000 ml
142 (62) Examen Microbiológico/ Pruebas Microbiológicas USP 40

Ajustar el pH para que después de la esterilización sea de 7,3 ± 0,2 a 25º. Esterilizar en un autoclave utilizando un ciclo vali-
dado.

Agar Sabouraud Dextrosa

Dextrosa 40,0 g
Mezcla de Digerido Péptico de Tejido Animal y Digerido Pancreático de Caseína (1 :1) 10,0 g
Agar 15,0 g
Agua Purificada 1000 mL

Ajustar el pH para que después de la esterilización sea de 5,6 ± 0,2 a 25º. Esterilizar en un autoclave utilizando un ciclo vali-
dado.

Agar Papa Dextrosa

Infusión de papas 200 g
Dextrosa 20,0 g
Agar 15,0 g
Agua Purificada 1000 mL

Ajustar el pH para que después de la esterilización sea de 5,6 ± 0,2 a 25º. Esterilizar en un autoclave utilizando un ciclo vali-
dado.

Caldo Sabouraud Dextrosa

Dextrosa 20,0 g
Mezcla de Digerido Péptico de Tejido Animal y Digerido Pancreático de Caseína (1 :1) 10,0 g
Agua Purificada 1000 mL

Ajustar el pH para que después de la esterilización sea de 5,6 ± 0,2 a 25º. Esterilizar en un autoclave utilizando un ciclo vali-
dado.

Caldo Mossel para Enriquecimiento de Enterobacterias

Digerido Pancreático de Gelatina 10,0 g
Glucosa Monohidrato 5,0 g
Bilis de Buey Deshidratada 20,0 g
Fosfato Monobásico de Potasio 2,0 g
Fosfato Dibásico de Sodio Dihidrato 8,0 g
Verde Brillante 15 mg
Agua Purificada 1000 mL

Ajustar el pH para que después del calentamiento sea de 7,2 ± 0,2 a 25º. Calentar a 100º durante 30 minutos y enfriar inme-
diatamente.

Agar Violeta Rojo Bilis Glucosa

Extracto de Levadura 3,0 g
Digerido Pancreático de Gelatina 7,0 g
Sales Biliares 1,5 g
Cloruro de Sodio 5,0 g
Glucosa Monohidrato 10,0 g
Agar 15,0 g
Rojo Neutro 30 mg
Cristal Violeta 2 mg
Agua Purificada 1000 mL

Ajustar el pH para que después del calentamiento sea de 7,4 ± 0,2 a 25º. Calentar hasta el punto de ebullición; no calentar
en autoclave.

Caldo MacConkey
Digerido Pancreático de Gelatina 20,0 g
Lactosa Monohidrato 10,0 g
Bilis de Buey Deshidratada 5,0 g
Púrpura de Bromocresol 10 mg
Agua Purificada 1000 mL
USP 40 Pruebas Microbiológicas/ (62) Examen Microbiológico 143

Ajustar el pH para que después de la esterilización sea de 7,3 ± 0,2 a 25º. Esterilizar en un autoclave utilizando un ciclo vali-
dado.

Agar MacConkey
Digerido Pancreático de Gelatina 17,0 g
Peptonas (de carne y caseína) 3,0 g
Lactosa Monohidrato 10,0 g
Cloruro de Sodio 5,0 g
Sales Biliares 1,5 g
Agar 13,5 g
Rojo Neutro 30,0 mg
Cristal Violeta 1 mg
Agua Purificada 1000 ml

Ajustar el pH para que después de la esterilización sea de 7, 1 ± 0,2 a 25º. Calentar a ebullición durante 1 minuto, agitando
constantemente, y luego esterilizar en un autoclave usando un ciclo validado.

Caldo Rappaport-Vassiliadis para Enriquecimiento de

Salmonella
Peptona de Soja 4,5 g
Cloruro de Magnesio Hexahidrato 29,0 g
Cloruro de Sodio 8,0 g
Fosfato Dibásico de Potasio 0,4 g
Fosfato Monobásico de Potasio 0,6 g
Verde de Malaquita 0,036 g
Agua Purificada 1000 ml

Disolver, calentando ligeramente. Esterilizar en un autoclave utilizando un ciclo validado a una temperatura que no exceda
de 115º. El pH debe ser de 5,2 ± 0,2 a 25º luego del calentamiento y esterilización en autoclave.

Agar Xilosa Lisina Desoxlcolato

Xilosa 3,5 g
L-Lisina 5,0 g
Lactosa Monohidrato 7,5 g
Sacarosa 7,5 g
Cloruro de Sodio 5,0 g
Extracto de Levadura 3,0 g
Rojo de Fenol 80 mg
Agar 13,5 g
Desoxicolato de Sodio 2,5 g
Tiosulfato de Sodio 6,8 g
Citrato Férrico Amónico 0,8 g
Agua Purificada 1000 mL

Ajustar el pH para que después del calentamiento sea de 7,4 ± 0,2 a 25º. Calentar a ebullición, enfriar a 50º y verter en
placas de Petri. No calentar en un autoclave.

Agar Cetrimida
Digerido Pancreático de Gelatina 20,0 g
Cloruro de Magnesio 1,4 g
Sulfato de Potasio 10,0 g
Cetrimida 0,3 g
Agar 13,6 g
Agua Purificada 1000 mL
Glicerol 10,0 mL

Calentar a ebullición durante 1 minuto con agitación. Ajustar el pH para que después de la esterilización sea de 7,2 ± 0,2 a
25º. Esterilizar en un autoclave utilizando un ciclo validado.
144 (62) Examen Microbiológico/ Pruebas Microbiológicas USP 40

Agar Manitol Salado

Digerido Pancreático de Caseína 5,0 g
Digerido Péptico de Tejido Animal 5,0 g
Extracto de Carne 1,0 g
D-Manitol 10,0 g
Cloruro de Sodio 75,0 g
Agar 15,0 g
Rojo de Fenal 0,025 g
Agua Purificada 1000 mL

Calentar a ebullición durante 1 minuto con agitación. Ajustar el pH para que después de la esterilización sea de 7,4 ± 0,2 a
25º. Esterilizar en un autoclave utilizando un ciclo validado.

Medio Reforzado para Clostridios

Extracto de Carne 10,0 g
Peptona 10,0 g
Extracto de Levadura 3,0 g
Almidón Soluble 1,0 g
Glucosa Monohidrato 5,0 g
Clorhidrato de Cisteína 0,5 g
Cloruro de Sodio 5,0 g
Acetato de Sodio 3,0 g
Agar 0,5 g
Agua Purificada 1000 mL

Hidratar el agar y disolver calentando hasta ebullición y revolviendo constantemente. Si fuera necesario, ajustar el pH para
que después de la esterilización sea de 6,8 ± 0,2 a 25º. Esterilizar en un autoclave utilizando un ciclo validado.

Agar Columbia
Digerido Pancreático de Caseína 10,0 g
Digerido Péptico de Carne 5,0 g
Digerido Pancreático de Corazón 3,0 g
Extracto de Levadura 5,0 g
Almidón de Maíz 1,0 g
Cloruro de Sodio 5,0 g
Agar, de acuerdo con la capacidad de gelificación 10,0-15,0 g
Agua Purificada 1000 mL

Hidratar el agar y disolver calentando hasta ebullición y revolviendo constantemente. Si fuera necesario, ajustar el pH para
que después de la esterilización sea de 7,3 ± 0,2 a 25º. Esterilizar en un autoclave utilizando un ciclo validado. Dejar enfriar a
una temperatura de 45º a 50º, agregar, cuando sea necesario, sulfato de gentamicina correspondiente a 20 mg de gentamici-
na base y verter en placas de Petri.

(63) PRUEBAS PARA MICOPLASMAS

INTRODUCCIÓN

El género micoplasma representa un grupo de bacterias diminutas que no tienen pared celular. Este género comprende más
de 120 especies. Son los organismos procariotas autorreplicantes más pequeños. Las células varían en tamaño y morfología y
no se pueden colorear con Gram, pero las impresiones de las colonias sobre agar sólido se pueden colorear con azul de metile-
no o una tinción equivalente. Los micoplasmas son parásitos y comensales, y algunos pueden ser patógenos para una gran
variedad de huéspedes animales y vegetales. En humanos, los micoplasmas son por lo general parásitos de superficie que colo-
nizan el epitelio de los tractos respiratorio y urogenital. Los micoplasmas son comunes y pueden ser causa de contaminación
seria en los cultivos de células y/o tejidos usados para producir artículos farmacopeicos. También pueden causar contamina-
ción en el caldo de digestión de caseína de soja filtrado y esterilizado. Una infección en un cultivo celular puede persistir por
un periodo prolongado sin causar un daño celular aparente. La infección de las células en un cultivo puede afectar práctica-
USP 40 Pruebas Microbiológicas/ (63) Pruebas para Micoplasmas 145

mente todas las vías del metabolismo celular, alterando incluso las características fenotípicas de las células y su crecimiento
normal. La presencia de especies de micoplasma no siempre trae como resultado turbidez debido a crecimiento en los cultivos
o una alteración visible de las células.
La prueba para detección de micoplasmas es un requisito necesario de control de calidad para garantizar de manera confia-
ble la pureza de los productos biotecnológicos y de los materiales afines usados para producir dichos productos. Este capítulo
de pruebas generales describe dos métodos requeridos para detectar la contaminación por micoplasma en los artículos de
prueba y en los cultivos tisulares y/o celulares usados para producir dichos artículos, caldos de digestión o cualquier otro mate-
rial en el que se sospeche contaminación por micoplasma. Estos son: (A) el procedimiento en medios de agar y caldos y (B) el
procedimiento en cultivo de células indicadoras. Estas pruebas requieren una cuidadosa técnica aséptica y condiciones de labo-
ratorio apropiadas. Con el fin de garantizar que las pruebas y la interpretación de los resultados sean apropiadas, el personal
debe estar adecuadamente capacitado y calificado. Para detectar micoplasmas se puede utilizar una técnica validada de ampli-
ficación de ácidos nucleicos (NAT, por sus siglas en inglés) o un método basado en la actividad enzimática, siempre que el
método usado demuestre ser comparable con ambos métodos (A) y (B). Los métodos alternativos se deben validar apropiada-
mente. Los requisitos de validación para los métodos alternativos no se tratarán en este capítulo.

MÉTODO DE CULTIVO

Elección de los Medios de Cultivo

La prueba se efectúa usando un número suficiente de medios de cultivo tanto sólidos como líquidos para garantizar el creci-
miento en las condiciones de incubación elegidas de pequeñas cantidades de micoplasmas (aproximadamente 100 unidades
formadoras de colonias o ufc; o 100 unidades cambiadoras de color, o ucc) que puedan estar presentes en el artículo o mate-
rial de prueba. Los medios de cultivo líquidos deben contener rojo de fenol. La gama de medios de cultivo escogidos ha de-
mostrado tener propiedades nutritivas satisfactorias al menos para los microorganismos que aparecen en Cepas de Microorga-
nismos de Prueba para Control de Calidad (a continuación). Las propiedades nutritivas de cada nuevo lote de medio de cultivo
se verifican para los microorganismos apropiados en la lista. Cuando se hagan las pruebas para micoplasmas se deben incluir
en cada una al menos dos especies o cepas conocidas de micoplasmas (listadas en Cepas de Microorganismos de Prueba para
Control de Calidad) como controles positivos, una de las cuales debe ser fermentadora de dextrosa (es decir, M. pneumoniae o
una especie y cepa equivalente) y la otra debe ser hidrolizadora de arginina (es decir, M. ora/e o una especie y cepa equivalen-
te). Solo al examinar líneas celulares de insectos se debe incluir una cepa de control de espiroplasma (p.ej., S. citri ATCC 29747,
S. melliferum ATCC 29416 o una especie y cepa equivalente). Adicionalmente, estas cepas pueden ser un poco más exigentes
en sus requerimientos nutricionales. Necesitan temperaturas de incubación más bajas (al igual que las líneas celulares de insec-
tos).

Cepas de Microorganismos de Prueba para Control de Calidad

Los cultivos de controles positivos no deben tener más de 15 pases desde el aislamiento. Las especies o cepas de micoplas-
mas aptas para el uso se enumeran a continuación:
- Acholeplasma /aidlawii (vacunas y/o materiales derivados de células o cultivos para uso humano y veterinario cuando se ha
usado un antibiótico durante la producción)
- M. gallisepticum (cuando se ha usado material aviar durante la producción o cuando la vacuna o el cultivo celular están
destinados al uso en aves de corral)
- M. hyorhinis (vacunas o cultivos celulares veterinarios no aviares)
- M. ora/e (vacunas para uso humano y veterinario)
- M. pneumoniae (vacunas o bancos de células para uso humano) u otras especies apropiadas de fermentadores de o-gluco-
sa como M. fermentans
- M. synoviae (cuando se ha usado material aviar durante la producción o cuando la vacuna o el banco de células está desti-
nado al uso en aves de corral)
Las cepas de prueba pueden ser aislados de campo que han sufrido un número limitado de subcultivos (no más de 15), se
almacenan congeladas (-20º o menos) o liofilizadas y se identifican como pertenecientes a las especies requeridas, por compa-
ración con cultivos tipo, por ejemplo, los que aparecen en la Tabla 1.
Tabla 1. Cultivos Tipo para Identificar Aislados de Campo Usados como Cepas de Prueba
Organismo de Prueba Número NCTC Número CIP Número ATCC
A. /aidlawii NCTC 10116 CIP 75,27 ATCC 23206
M. gallisepticum NCTC 10115 CIP 104967 ATCC 19610
M. fermentans NCTC 10117 CIP 105680 ATCC 19989
M. hyorhinis NCTC 10130 CIP 104968 ATCC 17981
M. ora/e NCTC10112 CIP 104969 ATCC 23714
M. pneumoniae NCTC10119 CIP 103766 ATCC 15531
146 (63) Pruebas para Micoplasmas / Pruebas Microbiológicas USP 40

Tabla 1. Cultivos Tipo para Identificar Aislados de Campo Usados como Cepas de Prueba (Continuación)
Organismo de Prueba Número NCTC Número CIP Número ATCC
M. synoviae NCTC 10124 CIP 104970 ATCC 25204

Condiciones de Incubación

Incubar los medios de cultivo líquidos en recipientes herméticamente tapados a 36±1 º. Incubar los medios de cultivo sóli-
dos en condiciones microaerofílicas (atmósfera de hidrógeno que contenga< 0,5% de oxígeno y/o nitrógeno que contenga
5% a 10% de dióxido de carbono en nitrógeno). Debe aportarse la humedad suficiente para evitar la desecación de la superfi-
cie del agar a 36±1 º.

Propiedades Nutritivas

Efectuar la prueba de propiedades nutritivas para cada nueva partida de medio de cultivo. Inocular el medio de cultivo elegi-
do con los microorganismos de prueba apropiados; no usar más de 100 ufc por placa que contenga al menos 9 mL de medio
de cultivo sólido y por recipiente de 100 mL de medio de cultivo líquido; usar una placa y un recipiente aparte para cada espe-
cie de microorganismo. Incubar el medio de cultivo y hacer subcultivos a partir de 0,2 mL de medio líquido en medio sólido a
los intervalos especificados (ver a continuación en Prueba de Micoplasmas en el Material o Artículo de Prueba). El medio sólido
cumple con la prueba si se encuentra un recuento dentro del intervalo de 0,5 unidades logarítmicas de la cantidad inoculada
para cada microorganismo de prueba. El medio líquido cumple con la prueba si se encuentra crecimiento en las placas de agar
subcultivadas a partir del caldo, por lo menos en 1 subcultivo para cada microorganismo de prueba. El uso de un microscopio
con un aumento de 1OOx o mayor puede ser útil.

Sustancias lnhibidoras

La prueba de sustancias inhibidoras se efectúa una vez para un producto determinado y se repite siempre que haya un cam-
bio en el método de producción que pueda afectar la detección de micoplasmas. Para demostrar la ausencia de sustancias
inhibidoras, llevar a cabo la prueba de propiedades nutritivas en presencia y ausencia del artículo o material de prueba. Si el
crecimiento de un microorganismo de prueba en más de 1 subcultivo ocurre en ausencia del artículo o material de prueba
antes que en su presencia, se encuentran presentes sustancias inhibidoras. Lo mismo es cierto si las placas directamente inocu-
ladas con el artículo o material de prueba no están dentro del intervalo de 0,5 unidades logarítmicas del número de colonias
de aquellas inoculadas sin el artículo o material de prueba. En ambos casos, las sustancias inhibidoras se deben neutralizar o
contrarrestar su efecto por un método apropiado; por ejemplo, por pase en sustratos que no contengan inhibidores o por dilu-
ción en un volumen mayor de medio antes de la prueba. Si se usa la dilución, se pueden usar volúmenes mayores de medio o
se puede dividir el volumen del inóculo en varios matraces de 100 ml. La eficacia de la neutralización o de otros procesos se
controla repitiendo la prueba de sustancias inhibidoras después de la neutralización.

Prueba para Micoplasmas en el Artículo o Material de Prueba

Inocular no menos de 1 O mL del artículo o material de prueba por 100 mL de cada medio líquido. Si ocurre un cambio de
pH significativo después de la adición del artículo o material de prueba, se restablece el valor original de pH del medio de
cultivo por medio de la adición de una solución estéril de hidróxido de sodio o de ácido clorhídrico. Inocular 0,2 mL del artícu-
lo o material de prueba en cada placa de medio sólido. Incubar el medio líquido durante 20 a 21 días. Incubar el medio sólido
durante no menos de 14 días, excepto para aquellas placas correspondientes al subcultivo de 20 a 21 días, las cuales se incu-
ban durante 7 días. Simultáneamente, incubar una porción de 100 mL, sin inóculo, de cada medio líquido y placa de agar,
como control negativo. En los días 2 a 4 después de la inoculación, subcultivar cada medio líquido por inoculación de 0,2 mL
al menos en 1 placa de cada medio sólido. Repetir el procedimiento entre los días 6 y 8, de nuevo entre los días 13 y 15 y una
vez más entre los días 19 y 21 de la prueba. Observar el medio líquido cada 2 ó 3 días y si se presenta un cambio de color,
subcultivar. Si un medio líquido muestra contaminación bacteriana o fúngica, la prueba es inválida. La prueba es válida si se
puede leer al menos 1 placa por medio y por día de inoculación. Incluir en la prueba controles positivos preparados por inocu-
lación de no más de 100 ufc de al menos 1 microorganismo de prueba en medio de agar o caldo. Cuando se lleve a cabo la
prueba de detección de micoplasmas periódicamente, se recomienda utilizar los microorganismos de prueba en rotación pe-
riódica. Los microorganismos de prueba usados son los listados en Elección de los Medios de Cultivo. Incubar los caldos nutritivos
y las placas en una atmósfera humidificada con condiciones microaerofílicas (5% a 10% de C0 2 ).

Interpretación de los Resultados

Al finalizar el periodo de incubación prescrito, examinar todos los medios sólidos inoculados en busca de la presencia de
colonias de micoplasmas. El producto cumple con la prueba si no ha ocurrido crecimiento de las colonias típicas de micoplas-
USP 40 Pruebas Microbiológicas/ (63) Pruebas para Micoplasmas 147

mas. El producto no cumple con la prueba si ha ocurrido crecimiento de las colonias típicas de micoplasmas en cualquiera de
los medios sólidos. La prueba es inválida si 1 o más de los controles positivos no muestra crecimiento de micoplasmas al me-
nos en 1 placa de subcultivo. La prueba es inválida si 1 o más de los controles negativos muestra crecimiento de micoplasmas.
Si se observan colonias sospechosas, usar un método validado apropiado para determinar si se deben a micoplasmas.

Soluciones y Medios Recomendados para el Método de Cultivo

[NOTA-Esta sección se proporciona como información.]

SOLUCIONES

Caldo de infusión de Corazón Vacuno

Corazón vacuno (para preparar la infusión) 500 g
Peptona 10 g
Cloruro de sodio 5g
Agua destilada hasta 1000 ml

Vitaminas Esenciales
Biotina 100 mg
Pantotenato de calcio 100 mg
Cloruro de colina lOOmg
Ácido fólico 100 mg
i-lnositol 200 mg
Nicotinamida 100 mg
Clorhidrato de piridoxal 100 mg
Riboflavina 10 mg
Clorhidrato de tiamina 100 mg
Agua destilada hasta 1000 ml

Agar, Purificado
Un agar altamente refinado para usar en microbiología e inmunología, preparado por un procedimiento de intercambio iónico que da como resultado
un producto con superior pureza, claridad y poder gelificante. Contiene los siguientes ingredientes:
Agua 12,2%
Cenizas 1,5%
Cenizas insolubles en ácido 0,2%
Cloro o
Fosfato (calculado como P2 0,) 0,3%
Nitrógeno total 0,3%
Cobre 8 ppm
Hierro 170 ppm
Calcio 0,28%
Magnesio 0,32%

Solución Salina Balanceada de Hanks (modificada)

Cloruro de sodio 6,4 g
Cloruro de potasio 0,32 g
Sulfato de magnesio heptahidrato 0,08 g
Cloruro de magnesio hexahidrato 0,08 g
Cloruro de calcio anhidro 0,112 g
Fosfato ácido disódico dihidrato 0,0596 g
Fosfato diácido de potasio anhidro 0,048 g
Agua destilada hasta 800 ml

Infusión de Cerebro-Corazón
Infusión de cerebro de ternero 200 g
Infusión de corazón vacuno 250 g
Proteosa peptona 10 g
Glucosa monohidrato 2g
148 (63) Pruebas para Micoplasmas / Pruebas Microbiológicas USP 40

Infusión de Cerebro-Corazón (Continuación)

Cloruro de sodio 5g
Fosfato ácido disódico anhidro 2,5 g
Agua destilada hasta 1 000 ml

Caldo PPLO
Infusión de corazón vacuno 50 g
Peptona 10 g
Cloruro de sodio 5g
Agua destilada hasta 1 000 ml

MEDIOS

Se recomiendan los siguientes medios. Se pueden usar otros medios, siempre que cumplan los criterios dados en las seccio-
nes Elección de los Medios de Cultivo, Condiciones de Incubación, Propiedades Nutritivas y Sustancias lnhibidoras.
Medios de Hayflick
(recomendado para la detección general de micoplasmas)
Medio Líquido
Caldo de infusión de corazón vacuno 90,0 ml
Suero de caballo (sin calentar) 20,0 ml
Extracto de levadura (250 g/L) (se recomienda extracto de levadura fresca) 10,0 ml
Rojo de fenal (solución de 0,6 g/L) 5,0 ml
Penicilina (20 000 Ul/ml) 0,25 ml
Ácido desoxirribonucleico (solución de 2 g/L) 1,2 ml
Ajustar a un pH de 7,8
Medio Sólido
Preparar como se describió anteriormente, reemplazando el caldo de infusión de corazón vacuno por agar de infusión de corazón vacuno que canten-
ga 15 g/L de agar.

Medios de Frey
(recomendado para la detección de M. synoviae)
Medio Líquido
Caldo de infusión de corazón vacuno 90,0 ml
Vitaminas esenciales 0,025 ml
Glucosa monohidrato (solución de 500 g/L) 2,0 ml
Suero de cerdo (inactivado a 56º durante 30 min) 12,0 ml
f3 -Nicotinamida adenina dinucleótido (solución de 1O g/L) 1,0 ml
Clorhidrato de cisteína (solución de 1O g/L) 1,0 ml
Rojo de fenal (solución de 0,6 g/L) 5,0 ml
Penicilina (20 000 Ul/ml) 0,25 ml
Mezclar las soluciones de f3 -nicotinamida adenina dinucleótido y clorhidrato de cisteína y después de 1O minutos agregar a los demás ingredientes.
Ajustar a un pH de 7,8
Medio Sólido
Caldo de infusión de corazón vacuno 90,0 ml
Agar, purificado 1,4 g
Ajustar a un pH de 7,8; esterilizar en autoclave y luego agregar:
Vitaminas esenciales 0,025 ml
Glucosa monohidrato (solución de 500 g/L) 2,0 ml
Suero de cerdo (sin calentar) 12,0 ml
f3 -Nicotinamida adenina dinucleótido (solución de 1O g/L) 1,0 ml
Clorhidrato de cisteína (solución de 1O g/L) 1,0 ml
Rojo de fenal (solución de 0,6 g/L) 5,0 ml
Penicilina (20 000 Ul/ml) 0,25 ml
USP 40 Pruebas Microbiológicas/ (63) Pruebas para Micoplasmas 149

Medios de Friis
(recomendado para la detección de micoplasmas no aviares)
Medio Líquido
Solución salina balanceada de Hanks (modificada) 800 ml
Agua destilada 67 ml
Infusión de cerebro-corazón 135 ml
Caldo PPLO 248 ml
Extracto de levadura (1 70 g/L) 60 ml
Bacitracina 250 mg
Meticilina 250 mg
Rojo de fenol (5 g/L) 4,5 ml
Suero de caballo 165 ml
Suero de cerdo 165 ml
Ajustar a un pH de 7,40 a 7,45
Medio Sólido
Solución salina balanceada de Hanks (modificada) 200 ml
DEAE-dextrano 200 mg
Agar, purificado 15,65 g
Mezclar bien y esterilizar en autoclave. Enfriar a 100º. Agregar a 1740 ml de Medio Líquido como se describió anteriormente.

MÉTODO DE CULTIVO DE CÉLULAS INDICADORAS

Los cultivos celulares se tiñen con un colorante fluorescente que se une al ADN. Los micoplasmas se detectan por su patrón
de fluorescencia filamentoso o particulado característico sobre la superficie celular y, si la contaminación es abundante, en las
áreas vecinas. Las mitocondrias en el citoplasma se pueden teñir pero se distinguen fácilmente de los micoplasmas. Para sus-
pensiones virales, si la interpretación de los resultados se ve afectada por efectos citopáticos marcados, neutralizar el virus
usando un antisuero específico que no tenga efectos inhibidores sobre los micoplasmas o usar un sustrato de cultivo celular
que no permita el crecimiento del virus. Para demostrar la ausencia de efectos inhibidores del suero, efectuar las pruebas con
controles positivos en presencia y ausencia del antisuero.

Verificación del Sustrato

Usar células Vero o un cultivo celular equivalente (por ejemplo, la línea de células de producción) que tenga una eficacia
equivalente para detectar micoplasmas. Probar la eficacia de las células que se van a usar aplicando el procedimiento descripto
a continuación e inoculando no más de 100 ufc o ucc de microorganismos de cepas de referencia adecuadas de M. hyorhinis y
M. orate. Las células son adecuadas si se detectan ambas cepas de referencia. Las células indicadoras se deben subcultivar sin
antibióticos antes de usarlas en la prueba.

Método de Prueba
[NOTA-Lo siguiente se proporciona como información.]

SOLUCIONES

Solución Salina Amortiguada con Fosfato

Fosfato Monobásico de Potasio 2,0 M-Disolver 13,61 g de fosfato monobásico de potasio anhidro en 50 mL de agua.
Fosfato Dibásico de Potasio 2,0 M-Disolver 17,42 g de fosfato dibásico de potasio anhidro en 50 mL de agua.
Solución Salina Amortiguada con Fosfato (pH 7,4)-Combinar 3,6 mL de Fosfato Monobásico de Potasio 2,0 M, 16,4 mL de
Fosfato Dibásico de Potasio 2, O M, 8 g de cloruro de sodio, y 1 L de agua. Mezclar bien. Ajustar el pH si fuera necesario.
Solución Madre de Bisbenzimida-Disolver 5 mg de bisbenzimida en agua y diluir con el mismo disolvente hasta 100 ml.
Almacenar en la oscuridad.
Solución de Trabajo de Bisbenzimida-lnmediatamente antes de usar, diluir 100 µL de Solución Madre de Bisbenzimida
con Solución Salina Amortiguada con Fosfato (pH 7,4) hasta 100 ml.
Solución Amortiguadora de Fosfato-Citrato de pH 5,5-Mezclar 56,85 mL de una solución de 28,4 g/L de fosfato ácido
disódico anhidro y 43, 15 mL de una solución de 21 g/L de ácido cítrico.
150 (63) Pruebas para Micoplasmas / Pruebas Microbiológicas USP 40

MÉTODO

1. Sembrar el cultivo de células indicadoras con una densidad apropiada (por ejemplo, 2 x 104 a 2 x 1 os células/mL, 4 x 10 3 a
2,5 x 104 células/cm 2 ) que lleven a la confluencia después de 3 días de crecimiento. Inocular 1 mL del producto a exami-
nar en el recipiente con cultivo celular e incubar a 36 ± 1º.
2. Después de 3 días de incubación como mínimo, cuando las células hayan alcanzado la confluencia, hacer un subcultivo
sobre cubreobjetos en recipientes adecuados o sobre alguna otra superficie (por ejemplo, portaobjetos con cámara para
cultivo) adecuada para el procedimiento de prueba. Sembrar las células con baja densidad, de forma que puedan alcanzar
una confluencia del 50% después de 3 a 5 días de incubación. La confluencia completa impide la visualización de mico-
plasmas después de la tinción y debe evitarse.
3. Retirar el medio y enjuagar las células indicadoras con solución salina amortiguada con fosfato, pH 7,4; luego agregar una
solución fijadora adecuada (una mezcla recién preparada de 1 volumen de ácido acético glacial SR y 3 volúmenes de me-
tano! se considera adecuada cuando se usa bisbenzimida para la tinción).
4. Retirar la solución fijadora y lavar las células con Agua Purificada estéril. Secar los portaobjetos completamente si se van a
colorear más de 1 hora después (es preciso tener especial cuidado cuando se colorean las láminas después del secado
debido a los artefactos que se podrían producir).
5. Agregar un colorante apto para ADN y dejar en reposo durante el tiempo adecuado (la solución de trabajo de bisbenzimi-
da y un tiempo de reposo de 1O minutos se consideran adecuados).
6. Retirar el colorante y enjuagar la monocapa con Agua Purificada.
7. Montar cada cubreobjetos, cuando corresponda (una mezcla de volúmenes iguales de glicerol y Solución Amortiguadora
de Fosfato-Citrato de pH 5,5 es apropiada para el montaje). Examinar por fluorescencia (para la coloración con bisbenzimi-
da resulta apropiado usar un filtro de excitación de 330 nm a 380 nm y un filtro de barrera LP de 440 nm) con un au-
mento de 400x o mayor.
8. Comparar la apariencia microscópica de los cultivos de prueba con la de los controles negativos y positivos, buscando
fluorescencia extranuclear. Los micoplasmas producen puntitos o filamentos en el citoplasma de la célula indicadora.
También pueden producir puntitos y filamentos en los espacios intercelulares. Siguiendo el protocolo establecido durante
la validación, se examinan múltiples campos microscópicos.

Interpretación de los Resultados

El producto a examinar cumple con la prueba si no está presente la fluorescencia típica de los micoplasmas. La prueba es
inválida si los controles positivos no presentan la fluorescencia típica de los micoplasmas. La prueba es inválida si los controles
negativos presentan la fluorescencia típica de los micoplasmas.

(71) PRUEBAS DE ESTERILIDAD

•Algunas partes de este capítulo general han sido armonizadas con los textos correspondientes de la Farmacopea Europea
y/o la Farmacopea Japonesa. Las partes no armonizadas están marcadas con los símbolos (..) para indicar esta situación .•
Estos procedimientos farmacopeicos no se han diseñado para garantizar que una partida de un producto es estéril o ha sido
esterilizada. Esta garantía se consigue principalmente mediante la validación del proceso de esterilización o de los procedi-
mientos del procesamiento aséptico.
La prueba se aplica a sustancias, preparaciones o artículos cuya esterilidad es requerida por la Farmacopea. Sin embargo, un resul-
tado satisfactorio únicamente indica que no se han encontrado microorganismos contaminantes en la muestra examinada bajo las
condiciones de la prueba.

PRECAUCIONES CONTRA LA CONTAMINACIÓN MICROBIANA

La prueba de esterilidad se lleva a cabo bajo condiciones asépticas, por lo que, para lograr tales condiciones, el entorno de la
prueba debe adaptarse a la manera en que ésta se realice. Las precauciones para evitar la contaminación se deben tomar de
modo tal que no se afecte a ningún microorganismo que deba detectarse en esta prueba. Las condiciones de trabajo en las
que se efectúan las pruebas se monitorean regularmente mediante el muestreo adecuado del área de trabajo y la realización
de controles apropiados.
USP 40 Pruebas Microbiológicas/ (71) Pruebas de Esterilidad 151

MEDIOS DE CULTIVO Y TEMPERATURAS DE INCUBACIÓN

Los medios para la prueba se pueden preparar según se indica a continuación o se pueden usar medios equivalentes dispo-
nibles comercialmente siempre y cuando cumplan con los requisitos de la Prueba de Promoción del Crecimiento de Organismos
Aerobios, Anaerobios y Hongos.
Se ha hallado que los medios de cultivo siguientes son adecuados para la prueba de esterilidad. El Medio Líquido de Tioglico-
lato sirve principalmente para el cultivo de bacterias anaerobias. Sin embargo, también detecta bacterias aerobias. El Medio de
Digerido de Caseína y Soja es adecuado para el cultivo tanto de hongos como de bacterias aerobias.
Medio Líquido de Tioglicolato
L-Cistina 0,5 g
Cloruro de Sodio 2,5 g
Dextrosa Monohidrato/Anhidra 5,5/5,0 g
Agar 0,75 g
Extracto de Levadura (soluble en agua) 5,0 g
Digerido Pancreático de Caseína 15,0 g
Tioglicolato de Sodio 0,5 g
o Ácido Tioglicólico 0,3 ml
Solución de Resazurina Sódica (1 en 1000), recién preparada 1,0 ml
Agua Purificada 1000 ml

El pH después de la esterilización es de 7, l ± 0,2.

Mezclar la L-cistina, el agar, el cloruro de sodio, la dextrosa, el extracto de levadura y el digerido pancreático de caseína con
el agua purificada y calentar hasta su disolución. Disolver el tioglicolato de sodio o el ácido tioglicólico en la solución y, de ser
necesario, agregar hidróxido de sodio 1 N de modo que, después de la esterilización, la solución tenga un pH de 7, 1 ± 0,2. Si
se requiere filtración, calentar nuevamente la solución sin llegar a ebullición y filtrar mientras está caliente a través de un papel
de filtro humedecido. Agregar la solución de resazurina sódica, mezclar y colocar el medio en recipientes adecuados, de forma
que la relación entre superficie y profundidad sea tal que no más de la mitad superior del medio haya experimentado un cam-
bio de color indicativo de la captación de oxígeno al final del período de incubación. Esterilizar usando un proceso validado. Si
el medio se almacena, mantenerlo a una temperatura entre 2º y 25º en un envase estéril y hermético. Si una porción mayor
que el tercio superior del medio ha adquirido un color rosado, el medio puede recuperarse una vez calentando los recipientes
en un baño de agua o en vapor fluente hasta que desaparezca el color rosado, y enfriar rápidamente tratando de evitar la
entrada de aire no estéril en el recipiente. No usar el medio por un periodo de almacenamiento más largo que el que ha sido
validado.
El Medio Líquido de Tioglicolato debe incubarse a 30º-35º. Para productos que contienen un conservante mercurial que no se
pueden analizar mediante el método de filtración por membrana, se puede utilizar Medio Líquido de Tioglicolato incubado a
20º-25º en lugar de Medio de Digerido de Caseína y Soja, siempre y cuando haya sido validado según se indica en Prueba de
Promoción del Crecimiento de Organismos Aerobios, Anaerobios y Hongos. Es posible utilizar el siguiente medio de tioglicolato
alternativo para los casos en que se prescriba o justifique y autorice. Preparar una mezcla que tenga la misma composición que
la del Medio Líquido de Tioglicolato, pero omitiendo el agar y la solución de resazurina sódica. Esterilizar según se indica ante-
riormente. El pH después de la esterilización es 7, 1 ± 0,2. Calentar en un baño de agua antes de usar e incubar a 30º-35º bajo
condiciones anaeróbicas.
Medio de Digerido de Caseína y Soja
Digerido Pancreático de Caseína 17,0 g
Digerido Papaínico de Harina de Soja 3,0 g
Cloruro de Sodio 5,0 g
Fosfato Dibásico de Potasio 2,5 g
Dextrosa Monohidrato/Anhidra 2,5/2,3 g
Agua Purificada 1000 ml

El pH después de la esterilización es de 7,3 ± 0,2.

Disolver los sólidos en el Agua Purificada, calentando ligeramente hasta lograr la disolución. Enfriar la solución a temperatura
ambiente y ajustar el pH con hidróxido de sodio 1 N de modo que, después de la esterilización, se obtenga un pH de 7,3 ±
0,2. Filtrar el medio si fuera necesario para lograr una solución transparente, y verter en recipientes adecuados y esterilizar
usando un procedimiento validado. Almacenar a temperatura entre 2º y 25º en un recipiente estéril y bien cerrado, a menos
que se use inmediatamente. No usar el medio por un periodo de almacenamiento más largo que el que ha sido validado.
El Medio de Digerido de Caseína y Soja debe incubarse a 22,5 ± 2,5º.
152 (71) Pruebas de Esterilidad / Pruebas Microbiológicas USP 40

•Medios para Penicilinas o Cefalosporinas

Cuando deban usarse medios de prueba de esterilidad en el método de Inoculación Directa del Medio de Cultivo que se indica
en Prueba de Esterilidad del Producto a Examinar, modificar la preparación del Medio Líquido de Tioglicolato y del Medio de Digeri-
do de Caseína y Soja según se indica a continuación. Transferir asépticamente a los recipientes de cada medio una cantidad de
j3 -lactamasa suficiente para inactivar la cantidad de antibiótico presente en la muestra de prueba. Determinar la cantidad de
j3 -lactamasa requerida para inactivar el antibiótico empleando una preparación de j3 -lactamasa cuyo poder inactivante de pe-
nicilinas o cefalosporinas haya sido valorado previamente. [NOTA-Los medios complementados con jJ-lactamasa también
pueden usarse en la prueba de filtración por membrana.]
Alternativamente (en un lugar completamente separado del usado para las pruebas de esterilidad), confirmar que se incor-
pora una cantidad adecuada de j3 -lactamasa en el medio, siguiendo cualquiera de los dos métodos indicados en Prueba de
Aptitud del Método, usando como desafío menos de 100 unidades formadoras de colonias (ufc) de Staphylococcus aureus (ver
Tabla 1). Debe observarse un crecimiento microbiano típico del cultivo inoculado como confirmación de que la concentración
de j3 -lactamasa es adecuada .•
Tabla 1. Cepas de Microorganismos de Prueba Adecuados para Usar en la Prueba de Promoción del Crecimiento y en la
Prueba de Aptitud del Método
Bacterias Aerobias
Staphylococcus aureus ATCC 6538, CIP 4.83, NCTC 10788, NCIMB 9518, NBRC 13276
Bacillus subtilis ATCC 6633, CIP 52.62, NCIMB 8054, NBRC 3134
Pseudomonas aeruginosa• \ ATCC 9027, NCIMB 8626, CIP 82.118, NBRC 13275
Bacteria anaerobia
Clostridium sporogenes• 2 • ATCC 19404, CIP 79.3, NCTC 532 or ATCC 11437, NBRC 14293
Hongos
Candida a/bicans ATCC 10231, IP48.72, NCPF 3179, NBRC 1594
Aspergillus brasi/iensis (Aspergillus Níger) ATCC 16404, IP 1431.83, IMI 149007, NBRC 9455
•l Un microorganismo alternativo es Kocuria rhizophila (Micrococcus luteus) ATCC 9341 .•
+2 Una alternativa para Clostridium sporogenes, cuando se desea usar un microorganismo no formador de esporas, es Bacteroides vulgatus (ATCC 8482) .•

Los medios usados cumplen con las pruebas siguientes, realizadas antes o en forma paralela, con la prueba sobre el produc-
to a examinar.

Esterilidad

Incubar porciones del medio durante 14 días. No se produce crecimiento de ningún organismo.

Prueba de Promoción del Crecimiento de Organismos Aerobios, Anaerobios y Hongos

Evaluar cada lote de medio listo para usar, y cada partida de medio preparado ya sea a partir de medio deshidratado o mez-
clando los ingredientes. Las cepas adecuadas de microorganismos se indican en la Tabla 7.
Inocular porciones de Medio Líquido de Tioglicolato con un número pequeño (no más de 100 ufc) de los microorganismos
siguientes, usando una porción de medio distinta para cada una de las especies: Clostridium sporogenes, Pseudomonas aerugino-
sa y Staphylococcus aureus. •Inocular porciones de medio de tioglicolato alternativo con un número pequeño (no más de 100
ufc) de Clostridium sporogenes .• Inocular porciones de Medio de Digerido de Caseína y Soja con un número pequeño (no más de
100 ufc) de los microorganismos siguientes, usando una porción de medio distinta para cada una de las especies: Aspergillus
brasiliensis, Bacilfus subtilis y Candida albicans. Incubar durante no más de 3 días en el caso de bacterias y durante no más de 5
días en el caso de hongos. Las técnicas de mantenimiento de cultivos de lote de siembra (sistemas de lote de siembra) se usan
para que los microorganismos viables empleados para la inoculación correspondan a no más de cinco pasajes desde el lote de
siembra maestro original.
Los medios son adecuados si se produce un crecimiento claramente visible de los microorganismos.

•LÍQUIDOS DE DILUCIÓN V LAVADO PARA FILTRACIÓN POR MEMBRANA

Líquido A

PREPARACIÓN

Disolver 1 g de digerido péptico de tejido animal en agua para obtener 1 litro, filtrar o centrifugar para clarificar, si fuera
necesario, y ajustar a un pH de 7, 1 ± 0,2. Transferir a envases y esterilizar empleando un proceso validado.
USP 40 Pruebas Microbiológicas/ (71) Pruebas de Esterilidad 153

PREPARACIÓN PARA PENICILINAS O CEFALOSPORINAS

Agregar asépticamente a la Preparación anterior, si fuera necesario, una cantidad de f3 -lactamasa estéril suficiente para inac-
tivar cualquier actividad residual de antibióticos en las membranas después de haber filtrado la solución de la muestra de prue-
ba (ver Medíos para Penicilinas o Cefalosporinas).

Líquido D

Agregar 1 mL de polisorbato 80 por cada litro de Líquido A, y ajustar a un pH de 7, 1 ± 0,2. Transferir a envases y esterilizar
empleando un proceso validado. Usar este líquido para artículos que contengan lecitina o aceite, o para dispositivos etiqueta-
dos "para administración estéril".

Líquido K

Disolver 5,0 g de digerido péptico de tejido animal, 3,0 g de extracto de carne bovina y 10,0 g de polisorbato 80 en agua
para obtener 1 litro. Ajustar el pH para obtener, después de la esterilización, un pH de 6,9 ± 0,2. Transferir a envases y esterili-
zar empleando un proceso validado .•

PRUEBA DE APTITUD DEL MÉTODO

Llevar a cabo una prueba según se describe más adelante en Prueba de Esterilidad del Producto a Examinar usando exacta-
mente los mismos métodos, a excepción de las modificaciones siguientes.

Filtración por Membrana

Después de transferir a la membrana el contenido del envase o envases a analizar, agregar un inóculo de un número peque-
ño de microorganismos viables (no más de 100 ufc) en la porción final del diluyente estéril usado para enjuagar el filtro.

Inoculación Directa

Después de transferir al medio de cultivo el contenido del envase o envases a analizar (para catgut y otros materiales de
sutura quirúrgica para uso veterinario: hebras), agregar al medio un inóculo de un número pequeño de microorganismos via-
bles (no más de 100 ufc).
En ambos casos, usar los mismos microorganismos que los mencionados anteriormente en Prueba de Promoción del Creci-
miento de Organismos Aerobios, Anaerobios y Hongos. Realizar una prueba de promoción del crecimiento como control positivo.
Incubar todos los recipientes que contienen medio durante no más de 5 días.
Si después de la incubación se obtiene un crecimiento claramente visible de microorganismos, comparable visualmente con
el del recipiente de control sin producto, el producto no posee actividad antimicrobiana en las condiciones de la prueba o tal
actividad se ha eliminado satisfactoriamente. La prueba de esterilidad puede entonces llevarse a cabo sin otras modificaciones.
Si no se obtiene un crecimiento claramente visible en presencia del producto a evaluar, comparable visualmente con el de
los recipientes de control sin producto, el producto posee actividad antimicrobiana que no se ha eliminado satisfactoriamente
en las condiciones de la prueba. Modificar las condiciones con el fin de eliminar la actividad antimicrobiana y repetir la Prueba
de Aptitud del Método.
Esta prueba de aptitud del método se lleva a cabo (a) cuando la prueba de esterilidad tiene que realizarse en un producto
nuevo; y (b) siempre que haya un cambio en las condiciones experimentales de la prueba. La prueba de aptitud del método
podrá llevarse a cabo simultáneamente con la Prueba de Esterilidad del Producto a Examinar.

PRUEBA DE ESTERILIDAD DEL PRODUCTO A EXAMINAR

•Número de Artículos a Evaluar

A menos que se especifique algo diferente en otra parte de este capítulo o en la monografía individual, evaluar el número de
artículos especificado en la Tabla 3. Si el contenido de cada artículo está en cantidad suficiente, (ver la Tabla 2) se puede divi-
dir para agregarlo a cada uno de los medios especificados en porciones iguales y apropiadas. [NOTA-Realizar las pruebas de
esterilidad empleando dos o más de los medios especificados.] Si cada artículo no contiene las cantidades suficientes para cada
medio, usar el doble del número de artículos indicado en la Tabla 3.•
154 (71) Pruebas de Esterilidad / Pruebas Microbiológicas USP 40

Tabla 2. Cantidad Mínima a Usar para cada Medio

Cantidad Mínima a Usar
Cantidad por Envase (a menos que se justifique y autorice algo diferente)
Líquidos
Menos de 1 mL El contenido total de cada envase
1-40 mL La mitad del contenido de cada envase, pero no menos de 1 mL
Más de 40 mL y no más de 100 mL 20 mL
Más de 100 mL 10% del contenido del envase, pero no menos de 20 mL
Líquidos antibióticos 1 mL
Preparaciones insolubles, cremas y ungüentos que deben suspenderse o emul- Usar el contenido de cada envase para suministrar no menos de 200 mg
sionarse
Sólidos
Menos de 50 mg El contenido total de cada envase
50 mg o más, pero menos de 300 mg La mitad del contenido de cada envase, pero no menos de 50 mg
300 mg-5 g 150 mg
Más de 5 g 500 mg
Catgut y otros materiales de sutura quirúrgica para uso veterinario 3 secciones de una hebra (cada una de 30 cm de longitud)
•Apósito quirúrgico/algodón/gasa (en envases) 1 00 mg por envase
Material de sutura y otro material de un solo uso envasado individualmen- El dispositivo completo
te
Otros dispositivos médicos El dispositivo completo, cortado en piezas o desmontado.

Tabla 3. Número Mínimo de Artículos a Evaluar en Relación con el Número de Artículos en la Partida
Número Mínimo de Artículos a Analizar para cada Medio
Número de Artículos en la Partida* (a menos que se justifique y autorice algo diferente)**
Preparaciones parenterales
No más de 1 00 envases 10% o 4 envases, lo que resulte mayor
Más de 100 pero no más de 500 envases 1 O envases
Más de 500 envases 2% o 20 envases, lo que resulte menor
•Para preparaciones parenterales de gran volumen 2% o 1 O envases, lo que resulte menor
Antibióticos sólidos
Envases a granel para farmacias (<5 g) 20 envases
Envases a granel para farmacias (ó g) 6 envases
Graneles y mezclas Ver Productos sólidos a granel+
Preparaciones oftálmicas y otras preparaciones no inyectables
No más de 200 envases 5% o 2 envases, lo que resulte mayor
Más de 200 envases 1 O envases
Si el producto se presenta en la forma de envases monodosis, aplicar el
esquema mostrado anteriormente para preparaciones para uso parente-
ral.
Catgut y otros materiales de sutura quirúrgica para uso veterinario 2% o 5 envases, lo que resulte mayor, hasta un total máximo de 20 enva-
ses
•No más de 100 artículos 10% o 4 artículos, lo que resulte mayor
Más de 100, pero no más de 500 artículos 1 O artículos
Más de 500 artículos 2% o 20 artículos, lo que resulte menor•
Productos sólidos a granel
Hasta 4 envases Cada envase
Más de 4 envases, pero no más de 50 envases 20% o 4 envases, lo que resulte mayor
Más de 50 envases 2% o 1O envases, lo que resulte mayor
* Si no se conoce el tamaño de la partida, usar el número máximo de artículos prescritos.
** Si el contenido de un envase es suficiente para inocular dos medios, esta columna da el número de envases necesarios para los dos medios juntos.

La prueba puede llevarse a cabo mediante la técnica de Filtración por Membrana o por Inoculación Directa del Medio de Cultivo
con el producto a examinar. Se incluyen controles negativos adecuados. La técnica de filtración por membrana se usa cuando
la naturaleza del producto lo permite, es decir, para preparaciones acuosas filtrables, para preparaciones alcohólicas o aceitosas
y para preparaciones miscibles con, o solubles en, disolventes acuosos o aceitosos, siempre que dichos disolventes no posean
un efecto antimicrobiano en las condiciones de la prueba.
USP 40 Pruebas Microbiológicas/ (71) Pruebas de Esterilidad 155

Filtración por Membrana

Usar filtros de membrana con un tamaño nominal de poro no mayor de 0,45 µm, cuya eficacia para retener microorganis-
mos haya sido establecida. Por ejemplo, se usan filtros de nitrato de celulosa para soluciones acuosas, oleosas y con bajo con-
tenido alcohólico; y se usan filtros de acetato de celulosa, por ejemplo, para soluciones con alto contenido alcohólico. Es posi-
ble que para ciertos productos (p.ej., antibióticos) se necesiten filtros especialmente adaptados.
La técnica descrita más adelante supone que se usarán membranas de aproximadamente 50 mm de diámetro. Si se usan
filtros de un diámetro diferente, los volúmenes de las diluciones y los lavados deben ajustarse según corresponda. El aparato de
filtración y la membrana se esterilizan usando técnicas adecuadas. El aparato se diseña de tal modo que la solución a examinar
se pueda introducir y filtrar en condiciones asépticas: permite retirar asépticamente la membrana para transferirla al medio de
cultivo, o es adecuado para llevar a cabo la incubación dentro del aparato mismo después de agregarle el medio.

SOLUCIONES ACUOSAS

Si corresponde, transferir una pequeña cantidad de un diluyente estéril adecuado, como por ejemplo el •Líquido A (ver Líqui-
dos de Dilución y Lavado para Filtración por Membrana),. a la membrana en el aparato y filtrar. El diluyente puede contener
sustancias neutralizantes adecuadas y/o sustancias inactivantes apropiadas, por ejemplo, en el caso de los antibióticos.
Transferir a la membrana o membranas el contenido del envase o envases a analizar, si fuera necesario, después de diluirlo
hasta el volumen usado en la Prueba de Aptitud del Método con el diluyente estéril elegido, pero usando no menos de las canti-
dades del producto a examinar indicadas en las Tablas 2 y 3. Filtrar inmediatamente. Si el producto posee propiedades antimi-
crobianas, lavar la membrana no menos de tres veces, filtrando en cada lavado el volumen del diluyente estéril elegido usado
en la Prueba de Aptitud del Método. El ciclo de lavado no debe exceder de cinco lavados con 100 mL por filtro, cada uno, inclu-
so si durante la prueba de aptitud del método se ha demostrado que tal ciclo no elimina por completo la actividad antimicro-
biana. Transferir la membrana completa al medio de cultivo o cortarla asépticamente en dos partes iguales y transferir cada
mitad a sendos medios adecuados. Usar el mismo volumen de cada medio que el empleado en la Prueba de Aptitud del Méto-
do. Alternativamente, transferir el medio a la membrana en el aparato. Incubar los medios durante no menos de 14 días.

SÓLIDOS SOLUBLES

Usar para cada medio no menos de la cantidad de producto indicada en las Tablas 2 y 3 disuelto en un disolvente adecua-
do, como por ejemplo el disolvente suministrado con la preparación, Agua Estéril para Inyección, solución salina estéril o una
solución estéril adecuada como por ejemplo •Líquido A (Líquidos de Dilución y Lavado para Filtración por Membrana),. y proceder
con la prueba según lo indicado anteriormente para Soluciones Acuosas usando una membrana adecuada para el disolvente
elegido.

ACEITES Y SOLUCIONES OLEOSAS

Usar para cada medio no menos de la cantidad de producto indicada en las Tablas 2 y 3. Los aceites y las soluciones oleosas
de viscosidad lo suficientemente baja se pueden filtrar sin dilución a través de una membrana seca. Los aceites viscosos se pue-
den diluir según sea necesario con un diluyente estéril adecuado, como por ejemplo el miristato de isopropilo, que ha demos-
trado no tener actividad antimicrobiana en las condiciones de la prueba. Dejar que el aceite penetre la membrana por su pro-
pio peso y, a continuación, filtrar, aplicando presión o succión gradualmente. Lavar la membrana al menos tres veces filtrando
cada vez aproximadamente 100 mL de una solución estéril adecuada, como por ejemplo el •Líquido A (ver Líquidos de Dilución
y Lavado para Filtración por Membrana),. que contenga un agente emulsionante adecuado a una concentración que haya de-
mostrado ser apropiada en la Prueba de Aptitud del Método, como por ejemplo polisorbato 80 a una concentración de 1Og por
L •(Líquido K) •. Transferir la membrana o membranas al medio o medios de cultivo, o viceversa, según lo descrito anteriormen-
te para Soluciones Acuosas e incubar a las mismas temperaturas y durante los mismos tiempos.

UNGÜENTOS Y CREMAS

Usar para cada medio no menos de las cantidades de producto indicadas en las Tablas 2 y 3. Los ungüentos en base grasa y
las emulsiones del tipo agua en aceite pueden diluirse al 1% en miristato de isopropilo según lo descrito anteriormente, calen-
tando si fuera necesario a no más de 40º. Es probable que en casos excepcionales se requiera calentar hasta no más de 44º.
Filtrar tan rápidamente como sea posible y proceder según lo descrito anteriormente para Aceites y Soluciones Oleosas.

•JERINGAS PRELLENADAS

Para jeringas prellenadas sin agujas estériles acopladas, expulsar el contenido de cada jeringa en uno o dos embudos para
filtración por membrana individuales o en recipientes individuales antes de la transferencia. Si se adjunta una aguja estéril, ex-
pulsar directamente el contenido de la jeringa tal como se ha indicado anteriormente y proceder según lo descrito para So/u-
156 (71) Pruebas de Esterilidad / Pruebas Microbiológicas USP 40

ciones Acuosas. Evaluar la esterilidad de la aguja mediante el procedimiento de Inoculación Directa que se indica en Prueba de
Aptitud del Método.

SÓLIDOS PARA INYECCIÓN DISTINTOS DE ANTIBIÓTICOS

Reconstituir los artículos de prueba según las instrucciones de la etiqueta y proceder según lo indicado para Soluciones Acuo-
sas o Aceites y Soluciones Oleosas, lo que corresponda aplicar. [NOTA-Si fuera necesario, se puede agregar diluyente en exceso
para facilitar la reconstitución y filtración del artículo de prueba reconstituido.]

ANTIBIÓTICOS SÓLIDOS PARA INYECCIÓN

Envases a Granel para Farmacias, <5g-Tomar una cantidad aproximada a 300 mg de sólido de cada uno de 20 envases,
transferir asépticamente a un matraz Erlenmeyer estéril de 500 mL, disolver en aproximadamente 200 mL de Líquido A (ver
Líquidos de Dilución y Lavado para Filtración por Membrana) y mezclar; o bien, reconstituir según lo indicado en la etiqueta,
cada uno de 20 envases y transferir una cantidad de líquido o suspensión que equivalga aproximadamente a 300 mg de sólido
a un matraz Erlenmeyer estéril de 500 mL, disolver en aproximadamente 200 mL de Líquido A y mezclar. Proceder según lo
indicado para Soluciones Acuosas o para Aceites y Soluciones Oleosas, lo que corresponda aplicar.
Envases a Granel para Farmacias, ::::5 g-Tomar aproximadamente 1 g de sólido de cada uno de 6 envases, transferir asép-
ticamente a un matraz Erlenmeyer estéril de 500 mL, disolver en aproximadamente 200 mL de Líquido A y mezclar; o bien,
reconstituir según lo indicado en la etiqueta, cada uno de 6 envases y transferir una cantidad de líquido que equivalga aproxi-
madamente a 1 g de sólido a un matraz Erlenmeyer estéril de 500 mL, disolver en aproximadamente 200 mL de Líquido A y
mezclar. Proceder según lo indicado para Soluciones Acuosas.

ANTIBIÓTICOS SÓLIDOS, GRANELES Y MEZCLAS

Retirar asépticamente una cantidad suficiente de sólido de la cantidad adecuada de envases (ver Tabla 2), mezclar hasta ob-
tener una mezcla que equivalga aproximadamente a 6 g de sólido y transferir a un matraz Erlenmeyer estéril de 500 ml. Disol-
ver en aproximadamente 200 mL de Líquido A y mezclar. Proceder según lo indicado para Soluciones Acuosas.

PRODUCTOS ESTÉRILES EN AEROSOL

Para productos líquidos en forma de aerosol presurizado, congelar los envases en una mezcla de hielo seco y alcohol por lo
menos a -20º durante aproximadamente 1 hora. Si es posible, dejar que el propelente escape antes de abrir asépticamente el
envase y transferir el contenido a un recipiente de combinación estéril. Agregar 100 mL de Líquido D al recipiente de combina-
ción y mezclar suavemente. Proceder según lo indicado para Soluciones Acuosas o para Aceites y Soluciones Oleosas, según co-
rresponda.

DISPOSITIVOS CON GUÍAS QUE DECLARAN SER ESTÉRILES

Pasar asépticamente un volumen de Líquido D no inferior a 1O veces el volumen de las guías a través de cada dispositivo
analizado. Recoger los líquidos en un recipiente estéril adecuado y proceder según lo indicado para Soluciones Acuosas o Aceites
y Soluciones Oleosas, según corresponda.
En el caso de jeringas vacías estériles, extraer diluyente estéril hacia el émbolo a través de la aguja estéril, si está acoplada, o
a través de una aguja estéril acoplada para el propósito de la prueba y expulsar el contenido en un recipiente de combinación
estéril. Proceder según lo indicado anteriormente .•

Inoculación Directa del Medio de Cultivo

Transferir directamente en el medio de cultivo la cantidad de la preparación a examinar que se indica en las Tablas 2 y 3, de
modo que el volumen del producto no sea mayor que el 10% del volumen del medio, a menos que se indique algo diferente.
Si el producto a examinar posee actividad antimicrobiana, realizar la prueba después de neutralizar esta actividad con una
sustancia neutralizante adecuada o mediante su dilución en una cantidad suficiente de medio de cultivo. Cuando sea necesario
usar un volumen grande del producto, probablemente sea preferible usar un medio de cultivo concentrado preparado de tal
modo que se tenga en cuenta la dilución subsiguiente. Cuando corresponda, el medio concentrado podrá agregarse directa-
mente al producto en su envase.

LÍQUIDOS OLEOSOS

Usar medios a los que se les haya agregado un agente emulsionante apropiado a una concentración que haya demostrado
ser adecuada en la Prueba de Aptitud del Método, por ejemplo polisorbato 80 a una concentración de 1Og por L.
USP 40 Pruebas Microbiológicas/ (71) Pruebas de Esterilidad 157

UNGÜENTOS Y CREMAS

Realizar una dilución de aproximadamente 1 en 1O, emulsionando con el agente elegido en un diluyente estéril adecuado,
como por ejemplo el •Líquido A (ver Líquidos de Dilución y Lavado para Filtración por Membrana) .• Transferir el producto diluido
a un medio que no contenga agente emulsionante.
Incubar los medios inoculados durante no menos de 14 días. Observar los cultivos varias veces durante el período de incuba-
ción. Agitar suavemente los cultivos que contengan productos oleosos todos los días. Sin embargo, cuando se use Medio Líqui-
do de Tioglicolato para detectar microorganismos anaerobios, agitar o mezclar mínimamente con el fin de mantener las condi-
ciones anaerobias.

CATGUT Y OTROS MATERIALES DE SUTURA QUIRÚRGICA PARA USO VETERINARIO

Usar para cada medio no menos de las cantidades del producto indicadas en las Tablas 2 y 3. Abrir el envase sellado tenien-
do en cuenta las precauciones de asepsia y retirar tres secciones de la hebra para cada medio de cultivo. Llevar a cabo la prue-
ba sobre las tres secciones, cada una de 30 cm de longitud, que se han cortado al comienzo, medio y final de la hebra. Usar
hebras completas de envases recién abiertos. Transferir cada una de las secciones de la hebra a los medios elegidos. Usar sufi-
ciente medio para cubrir adecuadamente el material a analizar (de 20 mL a 150 mL).

•SÓLIDOS

Transferir una cantidad de producto en forma de sólido seco (o preparar una suspensión del producto agregando diluyente
estéril al envase primario) correspondiente a no menos de la cantidad indicada en las Tablas 2 y 3. Transferir el material así
obtenido a 200 mL de Medio Líquido de Tioglicolato y mezclar. Del mismo modo, transferir la misma cantidad a 200 mL de
Medio de Digerido de Caseína y Soja y mezclar. Proceder según lo indicado anteriormente.

ALGODÓN PURIFICADO, GASA, APÓSITOS QUIRÚRGICOS Y ARTÍCULOS RELACIONADOS

De cada envase de algodón, vendas de gasa enrollada o apósitos quirúrgicos grandes que se deba evaluar, extraer aséptica-
mente dos o más porciones de 100 a 500 mg cada una de la parte más interna de la muestra. Para materiales de un solo uso
envasados individualmente, extraer asépticamente todo el artículo. Sumergir las porciones o el artículo en cada medio y proce-
der según lo indicado anteriormente.

DISPOSITIVOS ESTÉRILES

Los artículos pueden sumergirse ensamblados o desmontados. Para asegurar que los conductos del dispositivo también es-
tén en contacto con los medios, sumergir la cantidad adecuada de unidades en un volumen de medio suficiente para sumergir
completamente el dispositivo y proceder según lo indicado anteriormente. Para dispositivos extremadamente grandes, sumer-
gir aquellas porciones del dispositivo que han de entrar en contacto con el paciente en un volumen de medio suficiente para
lograr la inmersión completa de esas porciones.
Para catéteres en los que se requiere la esterilidad del lumen interno y de la parte externa, cortarlos en piezas de modo que
el medio entre en contacto con todo el lumen, o llenar el lumen con medio y sumergir la unidad intacta .•

OBSERVACIÓN E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS

A intervalos durante el período de incubación, y al momento de su finalización, examinar los medios en busca de evidencias
macroscópicas de crecimiento microbiano. Si el material que se está evaluando enturbia el medio de modo que no puede de-
terminarse fácilmente la presencia o ausencia de crecimiento microbiano mediante examen visual, transferir porciones de me-
dio (no menores de 1 mL cada una) 14 días después de comenzada la incubación, a recipientes nuevos con el mismo medio y,
a continuación, incubar el recipiente original y el de transferencia durante no menos de 4 días.
Si no se hallan evidencias de crecimiento microbiano, el producto examinado cumple con la prueba de esterilidad. Si se ha-
llan pruebas de crecimiento microbiano, el producto examinado no cumple con la prueba de esterilidad, a menos que pueda
demostrarse claramente que la prueba resultó inválida por causas no relacionadas con el producto examinado. La prueba pue-
de considerarse inválida sólo si se cumplen una o más de las siguientes condiciones:
a. Los datos de monitoreo microbiológico de las instalaciones para pruebas de esterilidad demuestran una falla.
b. Una revisión del procedimiento analítico usado durante la prueba en cuestión revela un error.
c. Se halla crecimiento microbiano en los controles negativos.
d. Después de determinar la identidad de los microorganismos aislados de la prueba, el crecimiento de esta especie (o espe-
cies) puede atribuirse de manera inequívoca a errores con respecto al material o a la técnica usados al realizar el procedi-
miento de la prueba de esterilidad.
158 (71) Pruebas de Esterilidad / Pruebas Microbiológicas USP 40

Si la prueba se declara inválida, se repetirá con el mismo número de unidades de la prueba original. Si no se hallan pruebas
de crecimiento microbiano en la prueba repetida, el producto examinado cumple con la prueba de esterilidad. Si se hallan
pruebas de crecimiento microbiano en la prueba repetida, el producto examinado no cumple con la prueba de esterilidad.

APLICACIÓN DE LA PRUEBA A PREPARACIONES PARENTERALES, OFTÁLMICAS V OTRAS

PREPARACIONES NO INYECTABLES QUE DEBEN CUMPLIR CON LA PRUEBA DE ESTERILIDAD

Al usar la técnica de filtración por membrana, utilizar, siempre que sea posible, el contenido total del envase, pero no menos
de las cantidades indicadas en las Tablas 2, diluyendo cuando sea necesario hasta aproximadamente 100 mL con una solución
estéril adecuada, como por ejemplo el •Líquido A (ver Líquidos de Dilución y Lavado para Filtración por Membrana) .•
Al usar la técnica de inoculación directa de medios, usar las cantidades que se muestran en la Tabla 2, a menos que se justifi-
que y autorice algo diferente. Las pruebas de esterilidad bacteriana y fúngica se llevan a cabo sobre la misma muestra del pro-
ducto a examinar. Cuando el volumen o la cantidad de un único envase sea insuficiente para llevar a cabo las pruebas, se usará
el contenido de dos o más envases para inocular los distintos medios.

NÚMERO MÍNIMO DE ARTÍCULOS A ANALIZAR

En la Tabla 3 se indica el número mínimo de artículos a analizar en relación con el tamaño de la partida.

Pruebas y Valoraciones Biológicas

(81) ANTIBIÓTICOS-VALORACIONES MICROBIOLÓGICAS

INTRODUCCIÓN E INFORMACIÓN GENERAL

En las condiciones adecuadas, la actividad (potencia) de los antibióticos puede demostrarse por su efecto inhibidor sobre los
microorganismos. La reducción en la actividad microbiana puede ser difícil de demostrar por métodos químicos. Este capítulo
resume los procedimientos para antibióticos reconocidos en la Farmacopea de los Estados Unidos (USP) para los que la valora-
ción microbiológica es el método analítico estándar.
Se utilizan dos técnicas generales: la valoración en cilindro-placa (o en placa) y la valoración turbidimétrica (o en tubo). La
Tabla 7 lista todos los antibióticos que incluyen valoraciones microbiológicas y especifica el tipo de valoración (cilindro-placa o
turbidimétrica).
Tabla 1
Antibiótico Tipo de Valoración
Amfotericina B Cilindro-placa
Bacitracina Cilindro-placa
Bleomicina Cilindro-placa
Capreomicina Turbidimétrica
Carbenicilina Cilindro-placa
Cloranfenicol Turbidimétrica
Clortetraciclina Turbidimétrica
Cloxacilina Cilindro-placa
Colistimetato Cilindro-placa
Colistina Cilindro-placa
Cilindro-placa
Dihidroestreptomicina Turbidimétrica
Eritrom ici na Cilindro-placa
Gentamicina Cilindro-placa
Gramicidina Turbidimétrica
Nafcilina Cilindro-placa
USP 40 Pruebas Biológicas/ (81) Antibióticos-Valoraciones Microbiológicas 159

Tabla 1 (Continuación)
Antibiótico Tipo de Valoración
Natamicina Cilindro-placa
Cilindro-placa
Neomicina Turbidimétrica
Novobiocina Cilindro-placa
Nistatina Cilindro-placa
Oxitetraciclina Turbidimétrica
Paromomicina Cilindro-placa
Penicilina G Cilindro-placa
Polimixina B Cilindro-placa
Sisomicina Cilindro-placa
Tetraciclina Turbidimétrica
Tioestreptona Turbidimétrica
Troleandomicina Turbidimétrica
Ti losina Turbidimétrica
Vancomicina Cilindro-placa

[NOTA-Realizar todos los procedimientos descritos en las monografías asépticamente. Tomar las precauciones de seguridad
adecuadas al realizar estas valoraciones debido a las posibles alergias a los fármacos y a que se usan cultivos vivos de organis-
mos en los procedimientos]
Valoración en cilindro-placa: La valoración en cilindro-placa se basa en la difusión del antibiótico desde un cilindro vertical a
través de una capa de agar solidificado en un plato o placa de Petri. El crecimiento del microorganismo específico inoculado en
el agar resulta inhibido en un área circular o zona en torno al cilindro que contiene la solución del antibiótico.
Valoración turbidimétrica: La valoración turbidimétrica se basa en la inhibición del crecimiento de un microorganismo en
una solución uniforme del antibiótico en un medio fluido que favorezca el crecimiento del microorganismo en ausencia del
antibiótico.
Unidades y Estándares de Referencia: La potencia de los antibióticos se designa en unidades (U) o en µg de actividad. En
ambos casos, la unidad o µg de actividad del antibiótico se establece originalmente contra un Estándar Maestro Federal de los
Estados Unidos para el antibiótico en cuestión. El Estándar de Referencia USP correspondiente se calibra en términos del están-
dar maestro.
En un principio, se consideraba que un antibiótico seleccionado como estándar de referencia constaba en su totalidad de
una sola entidad química y, por lo tanto, se le asignaba una potencia de 1000 µg/mg. En muchos de estos casos, a medida
que los métodos de fabricación y purificación para ciertos antibióticos avanzaron en su desarrollo, fue posible obtener antibió-
ticos con más de 1000 µg de actividad/mg. Tales antibióticos tenían una actividad equivalente a un número determinado de
µg del estándar de referencia original. No obstante, la mayoría de las veces, los µg de actividad son, numéricamente, exacta-
mente equivalentes a los µg (peso) de la sustancia pura. En ciertas ocasiones, como las citadas a continuación, los µg de activi-
dad definidos en términos del estándar maestro original equivalen a una unidad:
1. Cuando el antibiótico se presenta como la base libre y en forma de sal, y los µg de actividad han sido definidos en térmi-
nos de una de estas formas.
2. Cuando la sustancia antibiótica consta de un número de componentes que son químicamente similares pero que difieren
en actividad antibiótica.
3. Cuando las potencias de una familia de antibióticos se expresan en términos de un estándar de referencia que consta de
un solo miembro de la familia el cual, no obstante, puede ser por sí mismo heterogéneo.
No se debe asumir que los µg de actividad corresponden a los µg (peso) de la sustancia antibiótica.
Aparato: El material de laboratorio usado para almacenar y transferir microorganismos y diluciones de prueba debe ser esté-
ril y estar exento de residuos que pudieran interferir en la valoración (ver Limpieza de Material de Vidrio (1051 )). Usar un méto-
do de esterilización validado tal como calor seco, vapor o irradiación; o usar material de laboratorio estéril y desechable.
Control de temperatura: Se requiere control termostático en varias etapas de una valoración microbiológica: durante el cul-
tivo de un microorganismo y la preparación de su inóculo, así como durante la incubación en las valoraciones en placa y tubo.
Referirse a los requisitos específicos de temperatura provistos más adelante para cada tipo de valoración.
Organismos de prueba: El organismo de prueba para cada antibiótico se lista en la Tabla 3 para la valoración en cilindro-
placa y en la Tabla 8 para la valoración turbidimétrica. Los organismos de prueba se especifican mediante su número de identi-
ficación en la American Type Culture Collection (Colección de Cultivos Tipo de los EE.UU. o ATCC).
Para asegurar el desempeño aceptable de los organismos de prueba, estos deben ser almacenados y conservados de manera
apropiada. Se deben establecer las condiciones de almacenamiento específicas durante la validación o verificación del método.
Desechar los cultivos si se observa un cambio en las características del organismo.
Almacenamiento prolongado: Para el almacenamiento prolongado, mantener los organismos de prueba en una solución
de almacenamiento adecuada, tal como suero fetal de ternero al 50% en caldo, glicerol al 10%-15% en caldo tripticasa de
160 (81) Antibióticos-Valoraciones Microbiológicas/ Pruebas Biológicas USP 40

soja (caldo digerido de caseína y soja), sangre de oveja desfribinada o leche descremada. Los cultivos que se van a almacenar
durante periodos prolongados se almacenan mejor en estado liofilizado; se prefieren temperaturas de -60º o inferiores; son
aceptables temperaturas inferiores a -20º.
Cultivos primarios: Preparar los cultivos primarios transfiriendo organismos de prueba desde los viales de almacenamien-
to prolongado a medios apropiados e incubando en condiciones de crecimiento adecuadas. Almacenar los cultivos primarios a
la temperatura apropiada, por lo general a 2º- 8º, y desechar después de tres semanas. Se puede usar el mismo cultivo prima-
rio para preparar los cultivos de trabajo por un máximo de siete días únicamente.
Cultivos de trabajo: Preparar los cultivos de trabajo transfiriendo el cultivo primario a medios sólidos apropiados para ob-
tener colonias aisladas. Incubar los cultivos de trabajo en condiciones apropiadas para obtener un crecimiento satisfactorio pa-
ra la preparación de los inóculos de prueba. Preparar cultivos de trabajo nuevos para cada día de análisis.
Crecimiento o desempeño no característicos de un organismo de prueba: Usar cultivos madre, cultivos primarios o
cultivos de trabajo nuevos cuando un organismo de prueba presente crecimiento o desempeño no característicos.
Diseños de valoración: Los diseños experimentales adecuados son clave para incrementar la precisión y minimizar el sesgo.
Controlar los parámetros de incubación, la distribución de temperaturas y el tiempo es crítico para minimizar el sesgo; esto se
puede lograr acomodando las placas y gradillas, según se indica en cada valoración.
Valoración en cilindro-placa: Las comparaciones se limitan a las relaciones entre las mediciones del diámetro de la zona
dentro de las placas, sin tener en cuenta la variación entre placas. Las respuestas individuales de las placas se normalizan ba-
sándose en el tamaño relativo de la zona del estándar comparado con el tamaño medio de la zona del estándar en todas las
placas.
Valoración turbidirnétrica: Para evitar un sesgo sistemático, colocar aleatoriamente tubos duplicados en gradillas separa-
das de manera que cada gradilla contenga un conjunto completo de tratamientos. El propósito de esta configuración es mini-
mizar la influencia de la distribución de la temperatura sobre las muestras duplicadas. La valoración turbidimétrica, debido a la
configuración de las muestras en las gradillas para tubos de ensayo, es sensible a ligeras variaciones de temperatura. Asimismo,
la influencia de la variación de la temperatura se puede disminuir al asegurar un flujo de aire o la convección de calor adecua-
dos durante la incubación. Se deben colocar por lo menos tres tubos para cada concentración muestra y estándar (un conjun-
to completo de muestras) en una sola gradilla. Las comparaciones se limitan a las relaciones entre los valores de turbidez ob-
servados dentro de las gradillas.
Consideraciones sobre potencia: Dentro de las restricciones citadas anteriormente, el diseño de valoración recomendado
emplea una curva estándar de cinco concentraciones y una sola concentración de cada preparación muestra.
Para la valoración en cilindro-placa, cada placa incluye únicamente dos tratamientos, el tratamiento de referencia (mediana
de los niveles del estándar, es decir, 5) y una de las otras cuatro concentraciones del estándar (5¡, 52 , 54 y 55) o la muestra (U 3 ).
La concentración de la muestra es una estimación basada en la concentración deseada. La muestra se debe diluir para propor-
cionar una concentración nominal que se estima es equivalente a la mediana de la concentración de referencia del estándar
(53). El propósito de diluir a la mediana de la concentración de referencia es asegurar que el resultado de la muestra caerá
dentro de la porción lineal de la curva estándar. La prueba determina la potencia relativa de U3 en función de la curva están-
dar. La muestra (U 3) debe tener una potencia relativa de aproximadamente 100%. La potencia final de la muestra se obtiene
multiplicando el resultado de U3 por el factor de dilución.
Una valoración debe considerarse preliminar si el valor de potencia de la muestra calculado es inferior al 80% o superior al
125%. En dicho caso, los resultados sugieren que la concentración de la muestra supuesta durante la preparación de la solu-
ción madre de la muestra era incorrecta. Si esa fuera la situación, se puede ajustar la potencia supuesta de la muestra basándo-
se en el valor de potencia preliminar y repetir la valoración. De otro modo, la potencia se derivará de una porción de la curva
donde las respuestas del estándar y la muestra probablemente no serán paralelas.
Las determinaciones microbiológicas de potencia están sujetas a variables intervaloración e intravaloración, de modo tal que
se requieren dos o más valoraciones independientes para obtener una estimación confiable de la potencia de una muestra de-
terminada. Partiendo de soluciones madre y diluciones de prueba tanto del estándar como de la muestra, preparadas por se-
pardo, llevar a cabo otro día valoraciones adicionales de una muestra determinada. La potencia media debe incluir los resulta-
dos de todas las valoraciones independientes válidas. El número de valoraciones requerido para lograr una estimación de po-
tencia confiable depende de la variabilidad de la valoración y de la incertidumbre máxima requerida para la estimación de po-
tencia. Ésta última se evalúa mediante la amplitud del intervalo de confianza (ver Cálculos, Límites de confianza y combinaciones
de cálculos de valoración). El resultado combinado de una serie de valoraciones independientes más pequeñas a lo largo de
varios días es una estimación de potencia más confiable que la obtenida de una sola valoración grande con el mismo número
total de placas o tubos. Se debe tomar en cuenta que las valoraciones adicionales o una menor variabilidad permite que el
producto cumpla con intervalos de especificación más estrechos. Al reducir la variabilidad de las valoraciones se logra el límite
de confianza requerido con menos valoraciones.

MÉTODO DE CILINDRO-PLACA

Control de Temperatura

Usar equipo calificado y calibrado de manera apropiada para obtener los rangos de temperatura especificados en la Tabla 3.
USP 40 Pruebas Biológicas/ (81) Antibióticos-Valoraciones Microbiológicas 161

Aparato

PLACAS

Placas de Petri de plástico desechables o de vidrio (de aproximadamente 20 x 100 mm) con tapas

CILINDROS

Cilindros de acero inoxidable o porcelana; de 8±O,1 mm de diámetro externo; de 6±O,1 mm de diámetro interno; de
1O±O,1 mm de altura. [NOTA-Limpiar los cilindros cuidadosamente para eliminar cualquier residuo; es necesario limpiar oca-
sionalmente en un baño ácido, por ejemplo, con ácido nítrico aproximadamente 2 N o con ácido crómico (ver Limpieza de
Aparatos de Vidrio (1051 )).]

Soluciones Estándar

Para preparar una solución madre, disolver una cantidad adecuada del Estándar de Referencia USP de un determinado anti-
biótico o todo el contenido de un vial de Estándar de Referencia USP, cuando corresponda, en el disolvente especificado en la
Tabla 2 y diluir a la concentración especificada. Almacenar a 2º-8º y usar dentro del periodo indicado. En el día de la valora-
ción, preparar a partir de la solución madre cinco o más diluciones de prueba, con un aumento de concentración entre dilu-
ciones sucesivas, por lo general, en una proporción de 1 :1,25. Usar el diluyente final especificado de tal manera que la media-
na tenga la concentración sugerida en la Tabla 2.

Soluciones Muestra

Asignar a la muestra una potencia supuesta por unidad de peso o volumen. En el día de la valoración, preparar una solución
madre de la misma manera que se especifica para el Estándar de Referencia USP (Tabla 2). Diluir la solución madre de la mues-
tra en el diluyente final especificado hasta obtener una concentración nominal igual a la mediana de la concentración del es-
tándar (5 3).
Tabla 2
Solución Madre Dilución de Prueba
Mediana
Concentra- dela
Disolvente ción Diluyente Concentración Usar Diluyente Concentración
Antibiótico Inicial Inicial Adicional Final dentro de Final (S,)•,b
Anfotericina B<,d Dimetil sulfóxido - - 1 mg/ml El mismo día B.1 oe 1 µg/ml
Ácido clorhídrico
- -
Bacitracina1 0,01 N 100 U/ml El mismo día B.1 e 1 U/ml
Bleomicina B.16e - - 2 U/ml 14 días B.16e 0,04 U/ml
Carbenicilina B.1 e - - 1 mg/ml 14 días B.1 e 20 µg/ml
Cloxacilina B.1 e - - 1 mg/ml 7 días B.F 5 µg/ml
Colistemetato< Agua 10 mg/ml B.6e 1 mg/ml El mismo día B.6e 1 µg/ml
Colistina Agua 10 mg/ml B.6e 1 mg/ml 14 días B.6e 1 µg/ml
Dihidrostreptomicina9 B.3e - - 1 mg/ml 30 días B.3e 1 µg/ml
Eritromicina Methanol 10 mg/ml B.3e 1 mg/ml 14 días B.3e 1 µg/ml
Gentamicina B.3e - - 1 mg/ml 30 días B.3e 0.1 µg/ml
Nafcilina B.1 e - - 1 mg/ml 2 días B.l e 2 µg/ml
ª Se puede ajustar la mediana de la concentración para optimizar los tamaños de la zona si los datos se mantienen en el intervalo lineal.
b µg en esta columna se refiere a µg de actividad.
e Preparar el Estándar de Referencia USP y las diluciones de prueba de la muestra al mismo tiempo.
d Diluir adicionalmente la solución madre con dimetil sulfóxido para obtener concentraciones de 12,8; 16; 20; 25 y 31,2 µg/mL antes de realizar las diluciones
de prueba. La dilución de prueba de la muestra debe contener la misma cantidad de dimetil sulfóxido que las diluciones de prueba del Estándar de Referencia
USP.
e La letra B se refiere a la solución amortiguadora. Ver Medios y Soluciones, Soluciones amortiguadoras para una descripción de cada solución amortiguadora lista-
da en esta tabla.
1 Cada una de las diluciones de prueba del estándar debe contener la misma cantidad de ácido clorhídrico que la dilución de prueba de la muestra.
g Se puede usar la valoración turbidimétrica como un procedimiento alternativo.
h Diluir adicionalmente la solución madre con dimetilformamida para obtener concentraciones de 256; 320; 400; 500 y 624 U/mL antes de preparar las dilucio-
nes de pruebas. Preparar las diluciones de prueba del estándar al mismo tiempo que las diluciones de prueba de la muestra a analizar. La dilución de prueba de
la muestra debe contener la misma cantidad de dimetilformamida que las diluciones de prueba del estándar. Usar material de vidrio con protección actínica.
i Preparar la solución madre agregando 2 mL de agua por cada 5 mg del Estándar de Referencia USP.
162 (81) Antibióticos-Valoraciones Microbiológicas/ Pruebas Biológicas USP 40

Tabla 2 (Continuación)
Solución Madre Dilución de Prueba
Mediana
Concentra- de la
Disolvente ción Diluyente Concentración Usar Diluyente Concentración
Antibiótico Inicial Inicial Adicional Final dentro de Final (S,)•,b
Natamicina Dimetil sulfóxido - - 1 mg/ml El mismo día B.1oe 5 µg/ml
Neomicina9 B.3e - - 1 mg/ml 14 días B.3e 1 µg/ml
Novobiocina alcohol 1 O mg/ml B.3e 1 mg/ml 5 días B.6e 0,5 µg/ml
Nistatinac,h Dimetilformamida - - 1000 U/ml El mismo día B.6e 20 U/ml
Paromomicina B.3e - - 1 mg/ml 21 días B.3e 1 µg/ml
Penicilina G B.le - - 1000 U/ml 4 días B.1 e 1 U/ml
Polimixina Bi Agua - B.6e 10 000 14 días B.6e 10 U/ml
U/ml
Sisomicina B.3e - - 1 mg/ml 14 días B.3e 0,1 µg/ml
Vancomicina Agua - - 1 mg/ml 7 días B.4e 10 µg/ml
ª Se puede ajustar la mediana de la concentración para optimizar los tamaños de la zona si los datos se mantienen en el intervalo lineal.
b µg en esta columna se refiere a µg de actividad.
e Preparar el Estándar de Referencia USP y las diluciones de prueba de la muestra al mismo tiempo.
d Diluir adicionalmente la solución madre con dimetil sulfóxido para obtener concentraciones de 12,8; 16; 20; 25 y 31,2 µg/mL antes de realizar las diluciones
de prueba. La dilución de prueba de la muestra debe contener la misma cantidad de dimetil sulfóxido que las diluciones de prueba del Estándar de Referencia
USP.
e La letra B se refiere a la solución amortiguadora. Ver Medios y Soluciones, Soluciones amortiguadoras para una descripción de cada solución amortiguadora lista-
da en esta tabla.
1 Cada una de las diluciones de prueba del estándar debe contener la misma cantidad de ácido clorhídrico que la dilución de prueba de la muestra.
g Se puede usar la valoración turbidimétrica como un procedimiento alternativo.
h Diluir adicionalmente la solución madre con dimetilformamida para obtener concentraciones de 256; 320; 400; 500 y 624 U/mL antes de preparar las dilucio-
nes de pruebas. Preparar las diluciones de prueba del estándar al mismo tiempo que las diluciones de prueba de la muestra a analizar. La dilución de prueba de
la muestra debe contener la misma cantidad de dimetilformamida que las diluciones de prueba del estándar. Usar material de vidrio con protección actínica.
i Preparar la solución madre agregando 2 mL de agua por cada 5 mg del Estándar de Referencia USP.

lnóculos

Suspender el organismo de prueba obtenido de un cultivo o cultivo inclinado (slant) recientes en 3 ml de solución salina SR
estéril. Se pueden usar perlas de vidrio para facilitar la suspensión. Esparcir la suspensión salina sobre la superficie de dos o más
placas de agar (cubriendo toda la superficie) o sobre la superficie de un frasco Roux que contenga 250 ml del medio especifi-
cado (ver la Tabla 3).
Incubar durante el tiempo y a la temperatura especificados en la Tabla 3, o hasta que el crecimiento sea evidente.
Después de incubar, recolectar el organismo de las placas o frasco Roux con aproximadamente 50 ml de solución salina SR
estéril (excepto en el caso de bleomicina para el que debe usarse Medio 34; ver la sección Medios y Soluciones), usando una
varilla de vidrio doblada en ángulo estéril o perlas de vidrio estériles. Pipetear y transferir la suspensión a un frasco de vidrio
estéril. Ésta es la suspensión de recolección.
Diluir una cantidad apropiada de la suspensión de recolección con solución salina SR estéril. Usando el espectrofotómetro de
UV-visible, medir el % de transmitancia a 580 nm. El valor deseado es aproximadamente 25% de transmitancia a 580 nm. Este
valor se usa para estandarizar el volumen de suspensión de recolección agregado a la capa de agar para siembra.
Determinar durante la verificación del método, comenzando con los volúmenes sugeridos en la Tabla 3, las proporciones de
suspensión madre que se habrán de agregar al medio de inóculo que resulten en zonas satisfactorias de inhibición de aproxi-
madamente 14-16 mm de diámetro para la mediana de la concentración del estándar (5 3). [NOTA-Los tamaños de las zonas
fuera del intervalo de 11 a 19 mm no son adecuados, debido a que contribuyen a la variabilidad de la valoración.] Si el por-
centaje de transmitancia de la dilución está por encima de 25%, se puede usar un cociente para normalizar la adición de mi-
croorganismos a la capa de siembra. El factor de normalización se puede determinar dividiendo por 25 el porcentaje de trans-
mitancia obtenido de la dilución. Posteriormente, se puede multiplicar este cociente por la cantidad sugerida de inóculo para
obtener el volumen (ml) de suspensión de recolección que se requiere agregar a la capa de siembra. Ajustar la cantidad de
inóculo diariamente, si fuera necesario, para obtener una relación de concentración-respuesta óptima.
Alternativamente, determinar durante la verificación del método la proporción de suspensión de recolección que se habrá
de incorporar al inóculo, comenzando con los volúmenes indicados en la Tabla 3, que resulten en una demarcación satisfacto-
ria de las zonas de inhibición de aproximadamente 14-16 mm de diámetro para la mediana de la concentración del estándar
(53) y que produzcan una relación de concentración-respuesta reproducible. Preparar el inóculo agregando una porción de
suspensión madre a una cantidad suficiente de medio de agar que se ha fundido y enfriado a 45º-50º. Agitar la mezcla por
rotación suave sin crear burbujas hasta obtener una suspensión homogénea.
USP 40 Pruebas Biológicas/ (81) Antibióticos-Valoraciones Microbiológicas 163

Tabla 3
Composición
Condiciones de Incubación Sugerida del lnóculo
Temperatu-
Númeroª ra Tiem- Cantidad
Antibiótico Organismo de Prueba ATCC Mediob (°) po Mediob (ml/100 ml)
Amfotericina B Saccharomyces cerevisiae 9763 19 29-31 48 h 19 1,0
Bacitraci na Micrococcus luteus 10240 1 32-35 24 h 1 0,3
Bleomicina Mycobacterium smegmatis 607 36 36-37,5 48 h 35 1,0
Carbenicilinac Pseudomonas aeruginosa 25619 1 36-37,5 24 h 10 0,5
Cloxacilina Staphylococcus aureus 29737 1 32-35 24 h 1 o, 1
Colistimetato Bordetella bronchiseptica 4617 1 32-35 24 h 10 o, 1
Colistina Bordetella bronchiseptica 4617 1 32-35 24 h 10 o, 1
Dihidroestreptomi- Según se re-
cina Bacil/us subtilis 6633 32 32-35 5 días 5 quiera
Eritromicina Micrococcus luteus 9341 1 32-35 24 h 11 1,5
Gentamicina Staphylococcus epidermidis 12228 1 32-35 24 h 11 0,03
Nafcilina Staphylococcus aureus 29737 1 32-35 24 h 1 0,3
Neomicina Staphylococcus epidermidis 12228 1 32-35 24 h 11 0,4
Novobiocina Staphylococcus epidermidis 12228 1 32-35 24 h 1 4,0
Nistatina Saccharomyces cerevisiae 2601 19 29-31 48 h 19 1,0
Paromomicina Staphylococcus epidermidis 12228 1 32-35 24 h 11 2,0
Penicilina G Staphylococcus aureus 29737 1 32-35 24 h 1 1,0
Polimixina B Bordetella bronchiseptica 4617 1 32-35 24 h 10 o, 1
Sisomicina Staphylococcus epidermidis 12228 1 32-35 24 h 11 0,03
Según se re-
Vancomicina Bacillus subtilis 6633 32 32-35 5 días 8 quiera
ª American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas VA 20110-2209 (http://www.atcc.org)
b Ver Medios y Soluciones, Medios.
e Usar 0,5 ml de una dilución 1:25 de la suspensión madre/l 00 ml de Medio 1O.

Análisis

Preparar la capa base para el número requerido de placas de Petri para la valoración, usando el medio y el volumen mostra-
dos en la Tabla 4. Dejar que se endurezca formando una capa base lisa de profundidad uniforme. Preparar la cantidad apropia-
da de inóculo para la capa de siembra (Tabla 5), según se indica para el antibiótico correspondiente (Tabla 3), realizando los
ajustes necesarios basándose en el análisis de ensayo preparatorio. Inclinar la placa hacia atrás y hacia adelante para esparcir el
inóculo uniformemente sobre la superficie de la capa base y dejar que se endurezca.
Tabla 4 (capa base)
Volumen
Objetivo
Antibiótico Medioª (ml)
Amfotericina Bb - -
Bleomicina 35 10
Carbenicilina 9 21
Colistimetato 9 21
Colistina 9 21
Dihidroestreptomicina 5 21
Eritromicina 11 21
Gentamicina 11 21
Neomicina 11 21
Nistatinab - -
Paromomicina 11 21
Polimixina B 9 21
ª Ver Medios y Soluciones, Medios.
b No se usa capa base.
[NOTA-La capa base se puede entibiar para facilitar la formación de una capa uniforme.]
164 (81) Antibióticos-Valoraciones Microbiológicas/ Pruebas Biológicas USP 40

Tabla 4 (capa base) (Continuación)

Volumen
Objetivo
Antibiótico Medioª (ml)
Sisomicina 11 21
Vancomicina 8 10
Todos los demás 2 21
ª Ver Medíos y Soluciones, Medíos.
b No se usa capa base.
[NOTA-La capa base se puede entibiar para facilitar la formación de una capa uniforme.]

Tabla 5 (capa de siembra)

Volumen
Objetivo
Antibiótico Medioª (ml)
Amfotericina B Referirse a la Tabla 3 8
Bleomicina 6
Nistatina 8
Todos los demás 4
ª Ver Medíos y Soluciones, Medíos.

Dejar caer seis cilindros de valoración sobre la superficie inoculada desde una altura de 12 mm, utilizando una guía mecáni-
ca u otro dispositivo para asegurar el espaciado uniforme en un radio de 2,8 cm y tapar las placas para evitar la contamina-
ción. Llenar los seis cilindros en cada placa con diluciones de antibiótico que contengan los niveles de prueba (S 1-S5 y U3) espe-
cificados en el párrafo siguiente. Incubar las placas según se especifica en la Tabla 6 durante 16-18 horas y retirar los cilindros.
Medir y registrar el diámetro de cada zona de inhibición del crecimiento con una aproximación de O, 1 mm.
Tabla 6
Antibiótico Temperatura de Incubación (°)
Amfotericina B 29-31
Carbenicilina 36-37,5
Colistimetato 36-37,5
Colistina 36-37,5
Dihidroestreptomicina 36-37,5
Gentamicina 36-37,5
Neomicina 36-37,5
Novobiocina 34-36
Nistatina 29-31
Paromomicina 36-37,5
Polimixina B 36-37,5
Sisomicina 36-37,5
Vancomicina 36-37,5
Todos los demás 32-35

Se usarán durante la valoración los estándares (S 1-S5 ) y un solo nivel de prueba de la muestra (U 3 ) correspondiente a S3 de la
curva estándar, según se definen en Soluciones estándar y Soluciones muestra. Para derivar la curva estándar, llenar cilindros
alternos en tres placas con la dilución correspondiente a la mediana de la dilución de prueba (S 3) del estándar y cada uno de
los nueve cilindros remanentes con una de las otras cuatro diluciones de prueba del estándar. Repetir el proceso para las tres
diluciones de prueba del estándar. Para la muestra, llenar cilindros alternos en tres placas con la dilución correspondiente a la
mediana de la dilución de prueba (S 3 ) y llenar los nueve cilindros remanentes con la dilución de prueba correspondiente (U 3 )
de la muestra.

MÉTODO TURBIDIMÉTRICO

Control de Temperatura

Usar un equipo calificado y calibrado de manera apropiada para obtener los rangos de temperatura especificados en la Tabla
8. [NOTA-El control de la temperatura se puede lograr con circulación de aire o agua. La mayor capacidad térmica del agua
representa cierta ventaja sobre el aire circulante.]
USP 40 Pruebas Biológicas/ (81) Antibióticos-Valoraciones Microbiológicas 165

Espectrofotómetro

La medición de la absorbancia o transmitancia dentro de una banda de frecuencia muy estrecha requiere un espectrofotó-
metro adecuado en el que se pueda variar o restringir la longitud de onda usando filtros de 580 nm o 530 nm. Como alterna-
tiva, se puede usar un espectrofotómetro con longitud de onda variable y ajustar a una longitud de onda de 580 nm o 530
nm.
El instrumento se puede modificar de la siguiente manera:
1 . Para que acepte el tubo en el que se lleva a cabo la incubación (ver Aparato a continuación).
2. Para que acepte una celda modificada equipada con un drenaje que facilite el cambio rápido del contenido.
3. Para que contenga una celda de flujo para un análisis de flujo continuo.
Ajustar automáticamente el instrumento a cero con un caldo no inoculado transparente, preparado según las especificacio-
nes de cada antibiótico, incluyendo la misma cantidad de dilución de prueba (incluyendo formaldehído si se especifica) que se
encuentra en cada muestra.
Durante la preparación de los inóculos se puede medir tanto la absorbancia como la transmitancia.

Aparato

Tubos de ensayo de vidrio o plástico, p.ej., de 16 x 125 mm o de 18 x 150 mm. [NOTA-Usar tubos que tengan una longi-
tud, diámetro y espesor relativamente uniformes y que estén exentos de defectos y rayaduras en la superficie. En el espectrofo-
tómetro, usar tubos idénticos exentos de defectos y rayaduras. Limpiar los tubos minuciosamente para eliminar todos los resi-
duos de antibiótico y restos de soluciones de limpieza. Esterilizar los tubos antes de usar.]

Soluciones estándar

Para preparar una solución madre, disolver una cantidad del Estándar de Referencia USP de un antibiótico determinado o
todo el contenido de un vial de Estándar de Referencia USP, cuando corresponda, en el disolvente especificado en la Tabla 7 y
diluir hasta la concentración requerida. Almacenar a 2º-8º y usar dentro del periodo indicado. En el día de la valoración, pre-
parar a partir de la solución madre cinco o más diluciones de prueba, con un aumento de concentración entre diluciones suce-
sivas, por lo general, en una proporción de 1:l ,25. [NOTA-Puede ser necesario usar relaciones más pequeñas para diluciones
sucesivas de la solución madre para la valoración turbidimétrica.] Usar el diluyente final especificado de manera tal que la me-
diana de los niveles del estándar (5 3) tenga la concentración sugerida en la Tabla 7.

Soluciones muestra

Asignar una potencia supuesta por unidad de peso o volumen a la muestra desconocida y, en el día de la valoración, prepa-
rar una solución madre de la misma manera que se especifica para el Estándar de Referencia USP (Tabla 7). Diluir la solución
madre de la muestra en el diluyente final especificado a una concentración nominal igual a la mediana de la concentración del
estándar (5 3) según se especifica en la Tabla 1.
Tabla 7
Solución Madre Dilución de Prueba
Concentra- Concentra- Usar Diluyen- Mediana de la
Disolvente ción Diluyente ción Dentro te Concentración
Antibiótico Inicial Inicial Adicional Madre Final de Final (S,)ª
Capreomicina Agua - - 1 mg/ml 7 días Agua 100 µg/ml
Cloranfenicol Alcohol 10 mg/ml Agua 1 mg/ml 30 días Agua 2,5 µg/ml
Clortetraciclina Ácido clorhídrico 0,01 N - - 1 mg/ml 4 días Agua 0,06 µg/ml
Dihidroestreptomicinab Agua - - 1 mg/ml 30 días Agua 30 µg/ml
Gramicidina Alcohol - - 1 mg/ml 30 días Alcohol 0,04 µg/ml
Neomicinab,d B.3c - - 100 µg/ml 14 días B.3c 1,0 µg/ml
Oxitetraciclina Ácido clorhídrico O, 1 N - - 1 mg/ml 4 días Agua 0,24 µg/ml
Tetraciclina Ácido clorhídrico O, 1 N - - 1 mg/ml 1 día Agua 0,24 µg/ml
ª µg en esta columna se refiere a µg de actividad.
b Se puede usar la valoración en cilindro-placa como un procedimiento alternativo.
e La letra B se refiere a la solución amortiguadora. Ver Medios y Soluciones, Soluciones amortiguadoras para una descripción de cada solución amortiguadora lista-
da en esta tabla.
d Diluir la solución madre de 100 µg/ml con Solución amortiguadora B.3 para obtener una solución con una concentración equivalente a 25 µg/ml de neomici-
na. Agregar 1,39; 1,67; 2,00; 2,40 y 2,88 ml de esta solución a sendos matraces volumétricos de 50 ml. Agregar 5,0 ml de ácido clorhídrico 0,01 Na cada
matraz, diluir con Solución amortiguadora B.3 a volumen y mezclar para obtener soluciones con concentraciones de 0,69; 0,83; 1,0; 1,2 y 1,44 µg/ml de neomi-
cina. Usar estas soluciones para preparar la línea de respuesta estándar.
166 (81) Antibióticos-Valoraciones Microbiológicas/ Pruebas Biológicas USP 40

Tabla 7 (Continuación)
Solución Madre Dilución de Prueba
Concentra- Concentra- Usar Diluyen- Mediana de la
Disolvente ción Diluyente ción Dentro te Concentración
Antibiótico Inicial Inicial Adicional Madre Final de Final (S,)ª
Tioestreptona El mismo Dimetil
- -
Dimetil sulfóxido 1 U/ml día sulfóxido 0,80 U/ml
Troleandomicina Alcohol isopropílico y agua El mismo
- -
(4:1) 1 mg/ml día Agua 25 µg/ml
Tilosina Metanol y
Metano! 10 mg/ml B.16< 1 mg/ml 30 días B.3< (1:1) 4 µg/ml
ª µg en esta columna se refiere a µg de actividad.
b Se puede usar la valoración en cilindro-placa como un procedimiento alternativo.
e La letra B se refiere a la solución amortiguadora. Ver Medios y Soluciones, Soluciones amortiguadoras para una descripción de cada solución amortiguadora lista-
da en esta tabla.
d Diluir la solución madre de 100 µg/ml con Solución amortiguadora 8.3 para obtener una solución con una concentración equivalente a 25 µg/ml de neomici-
na. Agregar 1,39; 1,67; 2,00; 2,40 y 2,88 ml de esta solución a sendos matraces volumétricos de 50 ml. Agregar 5,0 ml de ácido clorhídrico 0,01 N a cada
matraz, diluir con Solución amortiguadora 8.3 a volumen y mezclar para obtener soluciones con concentraciones de 0,69; 0,83; 1,0; 1,2 y 1,44 ftg/ml de neomi-
cina. Usar estas soluciones para preparar la línea de respuesta estándar.

lnóculos

Suspender el organismo de prueba obtenido de un cultivo o cultivo inclinado (slant) recientes en 3 ml de solución salina SR
estéril. Se pueden usar perlas de vidrio para facilitar la suspensión. Enterococcus hirae (ATCC 10541) y 5taphylococcus aureus
(ATCC 9144) se cultivan en un medio líquido, no en agar. Esparcir la suspensión salina sobre la superficie de dos o más placas
de agar (cubriendo toda la superficie) o sobre la superficie de un frasco Roux que contenga 250 ml del medio especificado
(ver la Tabla 8). Incubar durante el tiempo y a la temperatura especificados en la Tabla 8, o hasta que el crecimiento sea evi-
dente.
Después de incubar, recolectar el organismo de las placas o frasco Roux con aproximadamente 50 ml de solución salina SR
estéril, usando una varilla de vidrio doblada en ángulo estéril o perlas de vidrio estériles. Pipetear y transferir la suspensión a un
frasco de vidrio estéril. Ésta es la suspensión de recolección.
Determinar durante la verificación del método la cantidad de suspensión de recolección que se usará como el inóculo, co-
menzando con el volumen sugerido en la Tabla 8. Preparar también una 53 extra como una prueba de crecimiento. Incubar las
pruebas de ensayo durante los tiempos indicados en la Tabla 7 7. Ajustar la cantidad de inóculo a diario, si fuera necesario, para
obtener la relación de concentración-respuesta óptima a partir del organismo de prueba en los tubos de valoración. Una vez
completados los periodos de incubación especificados, los tubos que contienen la mediana de la concentración del estándar
deben presentar los valores de absorbancia especificados en la Tabla 9. Determinar la duración exacta de la incubación, obser-
vando el crecimiento en la concentración de referencia (mediana de la concentración) del estándar (53).
Tabla 8
Composición
Condiciones de Incubación Sugerida del lnóculo
Tempera-
Número Me- tura Tiem- Cantidad
Antibiótico Organismo de prueba ATCca diob (°) po Mediob (ml/100 mL)
Capreomicina Klebsiella pneumoniae 10031 1 36-37,5 16-24 h 3 0,05
Cloranfenicol Escherichia co/i 10536 1 32-35 24 h 3 0,7
Clortetraciclina Staphylococcus aureus 29737 1 32-35 24 h 3 o, 1
Dihidroestreptomicina Klebsiella pneumoniae 10031 1 36-37,5 16-24 h 3 o, 1
Gramicidina Enterococcus hirae 10541 3 36-37,5 16-18 h 3 1,0
Neomicina Klebsiella pneumoniae 10031 1 36-37,5 16-24 h 39 2
Oxitetraciclina Staphylococcus aureus 29737 1 32-35 24 h 3 o, 1
Tetraciclina Staphylococcus aureus 29737 1 32-35 24 h 3 o, 1
Tioestreptona Enterococcus hirae 10541 40 36-37,5 18-24 h 41 0,2
Troleandomicina Klebsiella pneumoniae 10031 1 36-37,5 16-24 h 3 o, 1
Tilosina Staphylococcus aureus 9144 3 35-39 16-18 h 39 2-3
ª American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas VA 20110-2209 (http://www.atcc.org)
b Ver Medios y Soluciones, Medios.
USP 40 Pruebas Biológicas/ (81) Antibióticos-Valoraciones Microbiológicas 167

Tabla 9
Absorbancia,
Antibiótico No menos de (u.a.)
Capreomicina 0,4
Clortetraciclina 0,35
Gramicidina 0,35
Tetraciclina 0,35
Todos los demás 0,3

Análisis

En el día de la valoración, preparar la concentración necesaria de antibiótico, diluyendo soluciones madre del estándar y de
cada una de las muestras, según se especifica en Soluciones estándar y Soluciones muestra. Preparar cinco niveles de prueba,
cada uno por triplicado, del estándar (S 1-S5 ) y un solo nivel de prueba (U 3), también por triplicado, de hasta 20 muestras co-
rrespondientes a S3 (mediana de la concentración) del estándar.
Tabla 10
Volumen de
Dilución de Volumen de
Prueba lnóculo
Antibiótico (ml) (ml)
Gramicidina 0,10 9,0
Tioestreptona 0,10 10,0
Ti losina 0,10 9,0
Todos los demás 1,0 9,0

Colocar los tubos en gradillas para tubos de ensayo u otro portador. Incluir en cada gradilla 1-2 tubos de control que con-
tengan 1 mL del diluyente de prueba (ver la Tabla 7) pero sin antibiótico. Agregar los volúmenes de las diluciones de prueba
del estándar y de la muestra, según se indica en la Tabla 7O. Distribuir aleatoriamente un set completo, incluyendo los contro-
les, en una gradilla para tubos. Agregar el volumen de inóculo especificado en la Tabla 7O a cada tubo en la gradilla, uno por
vez, y colocar la gradilla completada inmediatamente en una incubadora o un baño de agua mantenidos a 36,0º-37,5º duran-
te el tiempo especificado en la Tabla 7 7.
Tabla 11
Tiempo de Incubación
Antibiótico (h)
Capreomicina 3-4
Cloranfenicol 3-4
Cicloserina 3-4
Dihidroestreptomicina 3-4
Estreptomicina 3-4
Troleandomicina 3-4
Ti losina 3-5
Todos los demás 4-5

Después de la incubación, inhibir inmediatamente el crecimiento del organismo, agregando 0,5 mL de formaldehído diluido
a cada tubo, excepto para tilosina. Para tilosina, calentar la gradilla en un baño de agua a 80º-90º durante 2-6 minutos o en
un baño de vapor durante 5-1 O minutos y llevar a temperatura ambiente. Leer la absorbancia o la transmitancia a 530 ó 580
nm, analizando una gradilla cada vez.

MEDIOS V SOLUCIONES
Los medios requeridos para la preparación de los inóculos de los organismos de prueba se preparan con los ingredientes
listados en esta sección. Se permiten pequeñas modificaciones de los ingredientes individuales; asimismo, se pueden usar me-
dios deshidratados reconstituidos, siempre que los medios resultantes tengan propiedades promotoras de crecimiento equiva-
lentes o superiores y que produzcan una curva de respuesta estándar similar.

Medios

Disolver los ingredientes en agua para obtener 1 L y ajustar las soluciones con hidróxido de sodio 1 N o ácido clorhídrico
1 N, según se requiera, de modo que, después de la esterilización con vapor, el pH sea el especificado.
168 (81) Antibióticos-Valoraciones Microbiológicas/ Pruebas Biológicas USP 40

Medio 1
Peptona 6,0 g
Digerido pancreático de caseína 4,0 g
Extracto de levadura 3,0 g
Extracto de carne 1,5 g
Dextrosa 1,0 g
Agar 15,0 g
Agua 1000 ml
pH después de la esterilización 6,6 ± 0,1

Medio 2
Peptona 6,0 g
Extracto de levadura 3,0 g
Extracto de carne 1,5 g
Agar 15,0 g
Agua 1000 ml
pH después de la esterilización 6,6 ± 0,1

Medio 3
Peptona 5,0 g
Extracto de levadura 1,5 g
Extracto de carne 1,5 g
Cloruro de sodio 3,5 g
Dextrosa 1,0 g
Fosfato Dibásico de Potasio 3,68 g
Fosfato monobásico de potasio 1,32 g
Agua 1000 ml
pH después de la esterilización 7,0 ± 0,05

Medlo4
Peptona 6,0 g
Extracto de levadura 3,0 g
Extracto de carne 1,5 g
Dextrosa 1,0 g
Agar 15,0 g
Agua 1000 ml
pH después de la esterilización 6,6±o,1

Medio 5
Peptona 6,0 g
Extracto de levadura 3,0 g
Extracto de carne 1,5 g
Agar 15,0 g
Agua 1000 ml
pH después de la esterilización 7,9±o,1

Medios
Peptona 6,0 g
Extracto de levadura 3,0 g
Extracto de carne 1,5 g
Agar 15,0 g
Agua 1000 ml
pH después de la esterilización 5,9±o,1

Medlo9
Digerido pancreático de caseína 17,0 g
Digerido papaínico de soja 3,0 g
Cloruro de sodio 5,0 g
USP 40 Pruebas Biológicas/ (81) Antibióticos-Valoraciones Microbiológicas 169

Medio 9 (Continuación)
Fosfato dibásico de potasio 2,5 g
Dextrosa 2,5 g
Agar 20,0 g
Agua 1000 ml
pH después de la esterilización 7,2 ± 0,1

Medio 10
Digerido pancreático de caseína 17,0 g
Digerido papaínico de soja 3,0 g
Cloruro de sodio 5,0 g
Fosfato dibásico de potasio 2,5 g
Dextrosa 2,5 g
Agar 12,0 g
Agua 1000 ml
Polisorbato 80 (agregado después de calentar a ebullición el medio para disolver el agar) 10 ml
pH después de la esterilización 7,2 ± 0,1

Medio 11
Peptona 6,0 g
Digerido pancreático de caseína 4,0 g
Extracto de levadura 3,0 g
Extracto de carne 1,5 g
Dextrosa 1,0 g
Agar 15,0 g
Agua 1000 ml
pH después de la esterilización 8,3 ± 0,1

Medio 13
Peptona 10,0 g
Dextrosa 20,0 g
Agua 1000 ml
pH después de la esterilización 5,6 ± 0,1

Medio 19
Peptona 9,4 g
Extracto de levadura 4,7 g
Extracto de carne 2,4 g
Cloruro de sodio 10,0 g
Dextrosa 10,0 g
Agar 23,5 g
Agua 1000 ml
pH después de la esterilización 6,1±0,1

Medio 32
Peptona 6,0 g
Digerido pancreático de caseína 4,0 g
Extracto de levadura 3,0 g
Extracto de carne 1,5 g
Sulfato de manganeso 0,3 g
Dextrosa 1,0 g
Agar 15,0 g
Agua 1000 ml
pH después de la esterilización 6,6 ± 0,1

Medio 34
Glicerol 10,0 g
Peptona 10,0 g
170 (81) Antibióticos-Valoraciones Microbiológicas/ Pruebas Biológicas USP 40

Medio 34 (Continuación)
Extracto de carne 10,0 g
Cloruro de sodio 3,0 g
Agua 1000 ml
pH después de la esterilización 7,0 ± 0,1

Medio 35
Glicerol 10,0 g
Peptona 10,0 g
Extracto de carne 10,0 g
Cloruro de sodio 3,0 g
Agar 17,0 g
Agua 1000 ml
pH después de la esterilización 7,0 ± 0,1

Medio 36
Digerido pancreático de caseína 15,0 g
Digerido papaínico de soja 5,0 g
Cloruro de sodio 5,0 g
Agar 15,0 g
Agua 1000 ml
pH después de la esterilización 7,3 ± 0,1

Medio 39
Peptona 5,0 g
Extracto de levadura 1,5 g
Extracto de carne 1,5 g
Cloruro de sodio 3,5 g
Dextrosa 1,0 g
Fosfato Dibásico de Potasio 3,68 g
Fosfato monobásico de potasio 1,32 g
Agua 1000 ml
pH después de la esterilización 7,9 ± 0,1

Medlo40
Extracto de levadura 20,0 g
Polipeptona 5,0 g
Dextrosa 10,0 g
Fosfato monobásico de potasio 2,0 g
Polisorbato 80 0,1 g
Agar 10,0 g
Agua 1000 ml
pH después de la esterilización 6,7 ± 0,2

Medio 41
Digerido pancreático de caseína 9,0 g
Dextrosa 20,0 g
Extracto de levadura 5,0 g
Citrato de sodio 10,0 g
Fosfato monobásico de potasio 1,0 g
Fosfato Dibásico de Potasio 1,0 g
Agua 1000 ml
pH después de la esterilización 6,8 ±0,1
USP 40 Pruebas Biológicas/ (81) Antibióticos-Valoraciones Microbiológicas 171

Soluciones

SOLUCIONES AMORTIGUADORAS

Preparar según se indica en la Tabla 72 o por otros medios adecuados. Las soluciones amortiguadoras se esterilizan después
de su preparación; el pH especificado en cada caso es el pH después de la esterilización.
Tabla 12. Soluciones amortiguadoras
Concentración de Concentración de
Fosfato Fosfato Volumen de
Di básico Mono básico Hidróxido de
de Potasio de Potasio Potasio 10 N pH después de la
Solución amortiguadora (g/L} (g/L} (ml) Esterilizaciónª
Solución amortiguadora B.1 (1 %, pH 6,0) 2 8 - 6,0 ± 0,05
Solución amortiguadora B.3(O,1 M, pH 8,0) 16,73 0,523 - 8,0 ± 0,1
'
Solución amortiguadora B.4 (O, 1 M, pH 4,5) - 13,61 - 4,5 ± 0,05
Solución amortiguadora B.6 (10%, pH 6,0) 20 80 - 6,0 ± 0,05
Solución amortiguadora B.1 O (0,2 M, pH 10,5) 35 - 2 10,5 ± 0,1
Solución amortiguadora B.16 (O, 1 M, pH 7,0) 13,6 4 - 7,0 ± 0,2
ª Ajustar el pH con ácido fosfórico 18 N o hidróxido de potasio 1O N.

Otras soluciones: Ver Reactivos, Indicadores y Soluciones.

Agua: Usar Agua Purificada.
Solución salina: Usar Solución salina SR.
Formaldehído diluido: Solución de formaldehído y agua (1 :3)

CÁLCULOS

Introducción

La potencia del antibiótico se calcula mediante la interpolación de una recta estándar o patrón obtenida por transformación
logarítmica y ajustada por cuadrados mínimos (ver los detalles sobre los cálculos a continuación). El analista debe considerar
tres conceptos esenciales al interpretar los resultados de potencia del antibiótico:
1. Las relaciones biológicas de concentración-respuesta por lo general no son lineales. El método de potencia del antibiótico
permite ajustar los datos a una línea recta, evaluando un intervalo de concentración estrecho en el que los resultados se
acercan a la linealidad. Los resultados de la valoración se considerarán válidos únicamente si la potencia calculada es
80%-125% de la potencia asumida al preparar la solución madre de la muestra. Cuando la potencia calculada está fuera
del intervalo de 80%-125%, el resultado para la muestra puede quedar fuera del intervalo de concentración estrecho en
el que se ha establecido la linealidad, en cuyo caso, se debe ajustar la potencia asumida de la muestra según corresponda
y repetir la valoración para obtener un resultado válido.
2. El medio más efectivo para reducir la variabilidad del valor de informe (la media geométrica de la potencia de todos los
ensayos y duplicados) son los ensayos independientes del procedimiento de valoración. El resultado combinado de una
serie de valoraciones independientes más pequeñas realizadas a lo largo de varios días es una estimación de potencia más
confiable que la obtenida de una sola valoración grande con el mismo número total placas o tubos. Se requieren tres o
más valoraciones independientes para determinaciones de potencia de antibióticos.
3. El número de valoraciones requeridas para obtener una estimación confiable de potencia del antibiótico depende del in-
tervalo de especificación requerido y de la variabilidad de la valoración. El cálculo del límite de confianza descrito a conti-
nuación se determina a partir de varios logaritmos de las potencias que son aproximadamente iguales en precisión. Si el
valor calculado para la amplitud del intervalo de confianza, W, es demasiado amplio, no será posible tomar una decisión
útil con respecto a si la potencia cumple con su especificación.
El laboratorio debe determinar de antemano en sus procedimientos operativos estándar un valor máximo aceptable para la
amplitud del intervalo de confianza. El valor máximo se debe determinar durante el desarrollo y confirmarse durante la valida-
ción o la verificación. Si el intervalo de confianza calculado excede este límite, el analista debe llevar a cabo determinaciones
de potencia independientes adicionales para cumplir con el requisito del límite. Se debe tomar en cuenta que la decisión de
realizar determinaciones adicionales no depende de la potencia estimada, sino únicamente de la incertidumbre en dicha esti-
mación, según lo determina la amplitud del intervalo de confianza. La variabilidad de la valoración tiene un impacto mayor en
el límite de confianza calculado que el número de determinaciones de potencia independientes. Como resultado, el analista
debe considerar primeramente reducir la variabilidad en la medida de lo posible antes de realizar determinaciones de potencia.
Las siguientes secciones describen los cálculos para determinar la potencia de los antibióticos, así como la realización del
cálculo de límite de confianza. Asimismo, se presentan métodos para calcular el error estándar con el propósito de obtener
estimaciones de la varianza de la valoración. Cuando se usan logaritmos, resulta aceptable cualquier base logarítmica. El Apén-
1 72 (81) Antibióticos-Valoraciones Microbiológicas/ Pruebas Biológicas USP 40

dice 7 proporciona fórmulas para cálculos manuales cuando las concentraciones están equitativamente espaciadas en la escala
logarítmica. Se pueden usar métodos estadísticos alternativos siempre que se validen adecuadamente.

Valoración en Cilindro-Placa

Esta sección detalla el análisis de datos de muestra y la determinación de la potencia de una muestra desconocida, usando la
valoración en cilindro-placa.

DATOS DE MUESTRA

La Tabla 73 presenta los datos de una valoración que se usarán a manera de ejemplo a lo largo de esta sección. Para cada
una de las 12 placas, las zonas 1, 3 y 5 corresponden a la concentración de referencia y las otras tres zonas son para una de las
otras cuatro concentraciones, según se indican. Las otras columnas son necesarias para los cálculos y se explican más adelante.
Paso 1: Realizar los cálculos iniciales y la verificación de aptitud de variabilidad.
Para cada conjunto de tres placas, promediar los nueve valores de referencia y promediar los nueve valores estándar.
Ejemplo (ver la Tabla 73)
15,867 = X(l 6, 1; 15,6; ... ; 15,8)
14,167=X(l4,6;14,1; ... ; 14,8)
Para cada conjunto de tres placas, determinar la desviación estándar de los nueve valores de referencia y de la desviación es-
tándar de los nueve valores estándar. Para cada desviación estándar, determinar la desviación estándar relativa correspondien-
te.
Ejemplo: (ver la Tabla 73)
0,200 = cr(l 6, 1, ... , 15,8)
1,3% = (0,200/15,867) X 100
0,324 = cr(14,6, ... , 14,1)
2,3% = (0,324/14, 167) X 100
Para el criterio de aptitud de variabilidad, cada laboratorio debe determinar un valor máximo aceptable para la desviación es-
tándar relativa. Si alguna de las ocho desviaciones estándar relativas (cuatro para la referencia y cuatro para el estándar) sobre-
pasan este máximo predeterminado, los datos de la valoración no serán adecuados y deben desecharse. [NOTA-El límite suge-
rido para la desviación estándar relativa es no más de 10%.]
Paso 2: Realizar una corrección de variación entre placas.
Esta corrección se aplica para convertir la medición de zona promedio obtenida para cada concentración al valor que se ob-
tendría si la medición de la concentración de referencia promedio para dicho conjunto de tres placas repetidas fuera la misma
que el valor del punto de corrección:

Xc = media corregida del estándar

X5 = media original del estándar
XR = media de la referencia
P = punto de corrección
Ejemplo: Para el primer conjunto de tres placas en la Tabla 73 (5 7), la corrección es:
14,022 = 14, 167 - (15,867 - 15,722) = 14, 167 - o, 145
Paso 3: Determinar la línea de la curva estándar.
Generar la línea de la curva estándar, graficando las mediciones corregidas de la zona en función del logaritmo de los valores
de concentración estándar. Calcular la ecuación de la línea de la curva estándar, realizando una regresión lineal no ponderada
estándar sobre estos valores, usando software adecuado o los cálculos manuales del Apéndice 7. [NOTA-Usar el logaritmo na-
tural o el logaritmo en base 1O para graficar la curva estándar y determinar la ecuación de regresión; ambos proporcionan el
mismo resultado de prueba final.] Cada laboratorio debe determinar un valor mínimo del coeficiente de determinación (%R 2 )
para una regresión aceptable. La regresión es aceptable sólo si la %R 2 obtenida excede este valor predeterminado. [NOTA-El
límite sugerido para el coeficiente porcentual de determinación es no menos de 95%.]
 Tabla 13. Datos de Muestra (Valoración en Cilindro-Placa) eVl
Referencia (5,) Media "V
Repeti- Media .¡:.,.
Están- ción Zona de la Muestra o
dar de Pla- Zona 1 Zona 3 Zonas Media 2 Zona4 Zona6 Media Corregida
(U/ml) Concentración ca (mm) (mm) (mm) (mm) SD %RSD (mm) (mm) (mm) (mm) SD %RSD (mm)
51 3,20 1 16,l 15,6 15,8 15,867 0,200 1,3 14,6 14,1 13,5 14,167 0,324 2,3 14,022
2 16,0 15,9 16,2 14,5 14,1 14,4
3 15,7 15,7 15,8 14,0 14,2 14,1
52 4,00 1 15,8 15,6 15,5 15,567 0,158 1,0 14,7 15,1 14,8 14,833 0,265 1,8 14,989
2 15,7 15,5 15,6 14,7 14,9 15,2
3 15,7 15,4 15,3 14,8 15,0 14,3
54 6,25 1 15,6 15,8. 16,0 15,789 0,169 1,1 16,6 16,8 16,3 16,578 0,233 1,4 16,511
2 15,8 15,6 15,7 16,6 16,5 16,2
3 16,1 15,7 15,8 16,9 16,5 16,8
55 7,8125 1 15,6 15,6 15,5 15,667 0,141 0,9 17,3 17,0 17,0 17, 167 0,224 1,3 17,222
2 15,6 15,7 15,5 17,3 17,4 17,2
3 15,9 15,8 15,8 17,3 17,3 16,7 2
(1)
15,722ª o-
U3 desconocida 1
2
15,7
15,9
15,8
15,7
15,7
15,7
15,678 0,179 1,1 15,3
15,8
15,8
15,8
15,7
15,5
15,478 0,307 2,0 15,522
ª°"a·
3 15,5 15,8 15,3 15,2 15,1 15,1 ~
ªÉste es el valor de la media de referencia general, referida más adelante como el "punto de corrección".
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174 (81) Antibióticos-Valoraciones Microbiológicas/ Pruebas Biológicas USP 40

Ejemplo: La Tabla 74 resume la porción de la Tabla 73 requerida para esta parte del cálculo.
Tabla 14
Mediciones de la
Conjunto de Zona Corregida Concentración
Estándares (mm) (U/ml)
S¡ 14,022 3,2
s, 14,989 4,0
Referencia (5,) 15,722 5
s, 16,511 6,25
s, 17,222 7,8125

RESULTADOS DE LA REGRESIÓN LINEAL

Línea de la curva estándar:

Z = [3,551 X ln(C)] + 9,978

Z = medición de zona corregida

C = concentración
%R2 = 99,7

DETERMINACIÓN DE POTENCIA DE LA MUESTRA

Para estimar la potencia de la muestra desconocida, promediar las mediciones de la zona del estándar y las mediciones de la
zona de la muestra en las tres placas usadas. Corregir por variación entre placas, usando el punto de corrección determinado
anteriormente para obtener un promedio corregido para la muestra desconocida, TJ. [NOTA-Un método alternativo aceptable
al uso del punto de corrección consiste en corregir usando el valor en la línea de regresión estimada correspondiente al logarit-
mo de la concentración de 53 .] Usar la medición de zona promedio corregida en la ecuación de la línea de la curva estándar
para determinar el logaritmo de la concentración de la muestra, Lu, mediante:

Lu =(U - a)/b
a= intersección de la línea de regresión
b = pendiente de la línea de regresión
Para obtener la potencia de la muestra desconocida, tomar el antilogaritmo de Lu y multiplicar el resultado por cualquier
factor de dilución aplicable. Este valor también se puede expresar como porcentaje del valor de la concentración de referencia.
Ejemplo: Medición corregida de la zona de la muestra (Tabla 73) = 15,522
Logaritmo natural de la concentración de la muestra:

Lu = (15,522 - 9,978)/3,551 = 1,561

Concentración de la muestra:
Cu= ei,s61 = 4,765

Porcentaje de concentración de referencia:

Resultado= (4,765/5,000) x 100 = 95,3%

Valoración Turbidimétrica

Esta sección detalla el análisis de los datos de muestra y la determinación de la potencia de una muestra desconocida usan-
do la valoración turbidimétrica. El método asume que los tubos se distribuyen en forma aleatoria dentro del bloque de calenta-
miento u otro dispositivo de control de temperatura. Si el dispositivo tiene un perfil de temperatura que no es uniforme, se
prefiere un diseño en bloques aleatorizados. En dicho diseño, la gradilla se divide en áreas (bloques) de temperatura relativa-
mente uniforme y en cada área se coloca al menos un tubo de cada concentración del Estándar y de cada muestra desconoci-
da. El análisis de datos del diseño en bloques aleatorizados es diferente del siguiente.

DATOS DE MUESTRA

La Tabla 75 presenta los datos de una valoración que se usarán como ejemplo a lo largo de esta sección. Se requieren otras
columnas para los cálculos, las cuales se explican a continuación.
USP 40 Pruebas Biológicas/ (81) Antibióticos-Valoraciones Microbiológicas 1 75

Tabla 15. Datos de Muestra (Valoración Turbidlmétrica)

Concentración Absorbancia Promedio Desviación
Estándar (µg/ml) Repetición (u.a.) (u.a.) Estándar
1 0,8545
2 0,8422
5, 64 3 0,8495 0,8487 0,0062
1 0,8142
2 0,8273
52 80 3 0,8392 0,8269 0,0125
1 0,6284
2 0,6947
5, 100 3 0,7563 0,6931 0,0640
1 0,6933
2 0,6850
54 125 3 0,6699 0,6827 0,0119
1 0,5299
2 0,5779
S, 156 3 0,5316 0,5465 0,0272

1 0,7130
2 0,7960
u, desconocida 3 0,7201 0,7430 0,0460

Paso 1: Realizar los cálculos iniciales y la verificación de aptitud de variabilidad.

Para cada concentración (incluyendo la muestra), promediar los tres valores de absorbancia.
Ejemplo: Ver 5 7 en la Tabla 75.
0,8487 = X(0,8545; 0,8422; 0,8495)

Para cada concentración, determinar la desviación estándar de las tres lecturas y una desviación estándar combinada para to-
das las concentraciones.
Ejemplo: Ver 5 7 en la Tabla 75.
0,0125 = 50(0,8545; 0,8422; 0,8495)
El valor combinado se calcula tomando la raíz cuadrada del promedio de las cinco varianzas:
0,0325 = {[(0,0062)2 + (0,0125)2 + (0,0640)2 + (0,0119)2 + (0,0272)2]/5} 1/2

Para el criterio de aptitud de variabilidad, cada laboratorio debe determinar una desviación estándar combinada máxima acep-
table. Si la desviación estándar combinada excede este máximo predeterminado, los datos de valoración no son adecuados y
se deben descartar. [NOTA-El límite sugerido para la desviación estándar combinada es no más de 10% del valor de absor-
bancia promedio a través de las cinco concentraciones.] Si el número de determinaciones repetidas por concentración es al
menos cinco, entonces se puede calcular una desviación estándar relativa para cada concentración después de verificar valores
atípicos y comparar con una desviación estándar relativa máxima aceptable. [NOTA-El límite sugerido para la desviación es-
tándar relativa es no más de 10%.]
Paso 2: Determinar la línea de la curva estándar.
Generar la línea de la curva estándar, graficando los valores de absorbancia promedio en función del logaritmo de los valo-
res de concentración del estándar. Calcular la ecuación de la línea de la curva estándar, realizando una regresión lineal no pon-
derada sobre estos valores usando software apropiado o los cálculos manuales del Apéndice 7. [NOTA-Usar el logaritmo natu-
ral o el logaritmo en base 1O para graficar la curva estándar y determinar la ecuación de regresión; ambos proporcionan el
mismo resultado de prueba final.] Cada laboratorio debe determinar un valor mínimo del coeficiente porcentual de determina-
ción (%R2) para una regresión aceptable. La regresión es aceptable únicamente si el valor %R 2 obtenido excede este valor pre-
determinado. [NOTA-El límite sugerido para el coeficiente porcentual de determinación es no menos de 90%.]
Ejemplo: La Tabla 76 resume la porción de la Tabla 75 requerida para esta parte del cálculo.
Tabla 16
Valores Promedio de
Conjunto de Absorbancia Concentración
Estándares (u.a.) (µg/ml)
5, 0,8487 64
52 0,8269 80
176 (81) Antibióticos-Valoraciones Microbiológicas/ Pruebas Biológicas USP 40

Tabla 16 (Continuación)
Valores Promedio de
Conjunto de Absorbancia Concentración
Estándares (u.a.) (µg/ml)
S3 0,6931 100
S4 0,6827 125
Ss 0,5465 156

RESULTADOS DE LA REGRESIÓN LINEAL

Línea de la curva estándar:

Absorbancia = 2,2665 - [0,7735 x log 10 (concentración)]

%R2 = 93,0%

DETERMINACIÓN DE POTENCIA DE LA MUESTRA

Para estimar la potencia de la muestra desconocida, promediar las tres mediciones de absorbancia para obtener un prome-
dio para la muestra desconocida, D. Usar esta medición promedio en la ecuación de la línea de la curva estándar para determi-
nar el logaritmo de la concentración de la muestra desconocida, Lu, mediante:

Lu=(U-a)/b

a= intersección de la línea de regresión

b = pendiente de la línea de regresión
Para obtener la potencia de la muestra desconocida, tomar el antilogaritmo de Lu y multiplicar el resultado por cualquier
factor de dilución aplicable. Este valor también se puede expresar como porcentaje del valor de la concentración de referencia.
Ejemplo: Absorbancia promedio de la muestra (Tabla 75) = 0,7430.

log 10 (Cu) = (0,7430 - 2,2665)/(- 0,7735) = 1,9696

Cu= 101,9696 = 93,2

Porcentaje de concentración de referencia = (93,2/100,0) x 100 = 93,2%

Cu = concentración de la muestra

Límites de Confianza y Combinación de los Cálculos de las Valoraciones

Debido a la variabilidad entre valoraciones, se requieren tres o más determinaciones independientes para una estimación
confiable de la potencia de la muestra. Para cada determinación independiente, comenzar con soluciones madre y diluciones
de prueba tanto del Estándar como de la muestra, preparadas por separado, y repetir la valoración de una muestra determina-
da otro día.
Usando un conjunto de al menos tres determinaciones de la potencia desconocida, usar el método del Apéndice 2 para verifi-
car valores atípicos. Esta determinación debe realizarse en la escala logarítmica.
Para obtener una estimación combinada de la potencia desconocida, calcular el promedio, M, y la desviación estándar de los
logaritmos de las potencias aceptadas. [NOTA-Usar el logaritmo natural o el logaritmo en base 1O.] Determinar el intervalo de
confianza para la potencia, según se indica a continuación:
antilog[M - t(0,05, N - 1) x SD!-YN], antilog[M + t(0,05, N - 1) x SO !-YN]
M =promedio
SO= desviación estándar
N = número de valoraciones
t(0,05, N-1) = el punto del 5% de dos colas de una distribución t de Student con N-1 grados de libertad
[NOTA-El valor t está disponible en hojas de cálculos, textos estadísticos y software estadístico.]
W = antilog{[t(0,05, N - 1) x SO/-VN]}
W = mitad de la amplitud del intervalo de confianza
Comparar la mitad de la amplitud del intervalo de confianza con un valor máximo predeterminado aceptable. Si la mitad de
la amplitud es mayor que el límite de aceptación, continuar con valoraciones adicionales.
USP 40 Pruebas Biológicas/ (81) Antibióticos-Valoraciones Microbiológicas 177

EJEMPLO

Suponer que la muestra se valora cuatro veces, con resultados de potencia en la escala logarítmica natural de 1,561; 1,444;
1,517 y 1,535. Entonces:

N=4
M = X(l,561; 1,444; 1,517; 1,535) = 1,514

SD = cr(l ,561; 1,444; 1,517; 1,535) = 0,050

t = 3, 182
El intervalo de confianza en la escala logarítmica es

1,514 ± (3,182 X 0,050/..,14) = (1,434, 1,594)

Tomando antilogaritmos, la potencia estimada es

el,514 = 4,546

con un intervalo de confianza de 95% para la potencia de el, 434, e1,5 94 =(4,197; 4,924)
La mitad de la amplitud del intervalo de confianza para comparar con un valor de aceptación es el cociente 4,924/4,546 =
1,083.

APÉNDICES

Apéndice 1. Fórmulas para Cálculos Manuales de Regresión y Concentración de la Muestra

Cuando las concentraciones están igualmente espaciadas en la escala logarítmica, los cálculos se pueden realizar usando la
siguiente fórmula. Donde:
sk = media de la medición de zona corregida (valoración en cilindro-placa) o valor de absorbancia promedio (valoración
turbidimétrica) para el conjunto estándar k
k = 1, 2, 3, 4, 5
s = media de los cinco valores sk
Lk = logaritmo de la concentración k correspondiente. [NOTA-Usar el logaritmo natural o el logaritmo en base 1O.] La
pendiente de la línea de regresión se calcula mediante:

b= (Ya/ta - Ybaja)J(Xalta - Xbaja)

Yalta = 1/5(3S5 + 2S4 + S3 - S7)

Ybaja = 1/5(3S 7 + 2S2 + S3 - S5 )
Xalta = Ls
Xbaja = L¡
Combinar y simplificar a:

El logaritmo de la concentración de la muestra se halla usando:

Lu = Lreferencia +[(U - S)Jb]

Por ejemplo, usando los datos para la valoración en cilindro-placa en la Tabla 13 y logaritmos naturales:

b = [(4 X 17,222) + (2 X 16,511) - (2 X 14,989) - (4 X 14,020)]/{5[1n(7,81) - ln(3,2)]} = 3,551

s= (14,020 + 14,989 + 15,722 + 16,511 + 17,222)/5 = 15,693

Logaritmo natural de la concentración de la muestra= ln(5) + [(15,522 - 15,693)/3,551] = 1,561

Concentración de la muestra= e1·561 = 4,765

Apéndice 2: Procedimiento para Verificar Valores Atípicos; Rechazo de Mediciones Atípicas o

Aberrantes

Toda medición que sea claramente cuestionable debido a una falla en el procedimiento de valoración deberá ser rechazada,
sin importar si se descubre durante el procedimiento de medición o tabulación. El rechazo o la retención arbitrarios de una
1 78 (81) Antibióticos-Valoraciones Microbiológicas / Pruebas Biológicas USP 40

medición aparentemente aberrante puede representar una fuente seria de sesgo. Por lo general, el rechazo de mediciones que
se basa únicamente en su magnitud relativa es un procedimiento que debe usarse con poca frecuencia.
Toda medición de potencia sospechada, o atípica, se puede analizar en función del criterio siguiente, el cual se basa en la
variación dentro de un solo grupo de mediciones supuestamente equivalentes a partir de una distribución normal. En prome-
dio, el criterio rechazará una observación válida una vez cada 25 ensayos o una vez cada 50 ensayos. Designar las mediciones
en orden de magnitud de y, a yN, donde y, es el posible valor atípico, y N es el número de mediciones en el grupo. Calcular la
brecha (gap) relativa usando la Tabla A2- 7, Prueba para Detectar Mediciones Atípicas y las fórmulas siguientes:
Cuando N = 3 a 7:

Cuando N = 8 a 1 O:

Cuando N = 11 a 1 3:

Si G,, G2 , o G3, según corresponda, excede el valor crítico en la Tabla A2-1, Prueba para Detectar Mediciones Atípicas, para la
N observada, existe una base estadística para omitir la(s) medición( es) atípica(s).
Tabla A2-1. Prueba para Detectar Mediciones Atípicas
En las muestras de una población normal, las brechas iguales o mayores que los valores siguientes de G1, G2 y G3 ocurren con una probabilidad de P
= 0,01, cuando las mediciones atípicas pueden ocurrir únicamente en un extremo; o con P = 0,02, cuando éstas pueden ocurrir en cualquiera de los
extremos.
N 1 3 1 4 1 5 1 6 1 7
G, 1 0,987 1 0,889 1 0,781 1 0,698 1 0,637

N 1 8 1 9 1 10 1 1

G, 1 0,681 1 0,634 1 0,597 1 1

N 1 11 1 12 1 13 1 1

G, 1 0,674 1 0,643 1 0,617 1 1

EJEMPLO

Potencias estimadas de la muestra en escala logarítmica= 1,561; 1,444; 1,517; 1,535

Verificar la potencia más baja para la medición atípica:
e, = (1,517 - 1,444)/(1,561 - 1,444) = o,624 < o,889
Por lo tanto, 1,444 no es una medición atípica.
Verificar la potencia más alta para la medición atípica:
e,= (1,561 - 1,535)/(1,561 - 1,444) =0,222 < o,889
Por lo tanto, 1,561 no es una medición atípica.
Las potencias atípicas deben marcarse como valores atípicos y deben excluirse de los cálculos de la valoración. No se puede
excluir más de una potencia como medición atípica.

(85) PRUEBA DE ENDOTOXINAS BACTERIANAS

•Partes de este capítulo general han sido armonizadas con los textos correspondientes de la Farmacopea Europea y/o de la
Farmacopea japonesa. Aquellas partes que no han sido armonizadas están marcadas con los símbolos (..) para especificar dicha
situación .•
La Prueba de Endotoxinas Bacterianas (PEB) es una prueba para detectar o cuantificar endotoxinas de bacterias gramnegati-
vas usando un lisado de amebocitos del cangrejo herradura (Limulus polyphemus o Tachypleus tridentatus).
Hay tres técnicas para esta prueba: la técnica de coagulación (gel-clot), la cual está basada en la formación de gel; la técnica
turbidimétrica, basada en la producción de turbidez después de la ruptura de uniones de un sustrato endógeno; y la técnica
cromogénica que se basa en el desarrollo de color después de la ruptura de un complejo sintético péptido-cromógeno. Efec-
USP 40 Pruebas Biológicas/ (85) Prueba de Endotoxinas Bacterianas 1 79

tuar la prueba con cualquiera de las tres técnicas. En caso de duda o controversia, la decisión final se toma basándose en la
prueba de límite de coagulación, a menos que se indique algo diferente en la monografía del producto en análisis. La prueba
se efectúa de forma tal que se evite la contaminación por endotoxinas.

APARATOS

Eliminar los pirógenos de todo el material de vidrio y otros materiales termoestables en un horno de aire caliente, mediante
un proceso validado.+\ Habitualmente se usan 30 minutos a 250º como tiempo y temperatura mínimos. Si se emplean mate-
riales de plástico, tales como microplacas y puntas de pipetas para pipeteadores automáticos, usar los que han demostrado
estar exentos de endotoxinas detectables y no interferir con la prueba. [NOTA-En este capítulo, el término "tubo" incluye cual-
quier otro receptáculo, como por ejemplo los pocillos de las placas de microtitulación.]

REACTIVOS V SOLUCIONES DE PRUEBA

Usado de Amebocitos

Un producto liofilizado obtenido a partir de un lisado de amebocitos (leucocitos) del cangrejo herradura (Umulus polyphemus
o Tachypleus tridentatus). Este reactivo se refiere sólo a un producto fabricado de conformidad con las reglamentaciones de la
autoridad competente. [NOTA-El Usado de Amebocitos reacciona con algunos jJ -glucanos además de reaccionar con las endo-
toxinas. Existen preparaciones de Usado de Amebocitos que no reaccionan con los glucanos: se preparan retirando del Usado de
Amebocitos el factor G que reacciona con los glucanos o inhibiendo el sistema de reacción del factor G del Usado de Ameboci-
tos. Se pueden usar para pruebas de endotoxinas en presencia de glucanos.]

Agua para Prueba de Endotoxinas Bacterianas (PEB)

Usar Agua para Inyección o agua producida por otros procedimientos y que no reaccione con el lisado empleado, en el lími-
te de detección del reactivo.

Usado SR

Disolver con agitación suave el Usado de Amebocitos en Agua para PEB o en un amortiguador recomendado por el fabricante
del lisado. Almacenar el lisado reconstituido, refrigerado o congelado, de acuerdo con las especificaciones del fabricante.

PREPARACIÓN DE LAS SOLUCIONES

Solución Madre del Estándar de Endotoxina

Preparar una Solución Madre del Estándar de Endotoxina a partir de un Estándar de Referencia de Endotoxina USP que haya
sido calibrado con el Estándar Internacional para Endotoxinas vigente de la OMS. Seguir las especificaciones en el prospecto
del empaque y en la etiqueta para la preparación y almacenamiento de la Solución Madre del Estándar de Endotoxina. El conte-
nido de endotoxina se expresa en Unidades de Endotoxina (UE). [NOTA-Una Unidad USP de Endotoxina (UE) es igual a una
Unidad Internacional (UI) de endotoxina.]

Soluciones Estándar de Endotoxina

Después de mezclar vigorosamente la Solución Madre del Estándar de Endotoxina, preparar las diluciones seriales apropiadas
de la Solución Estándar de Endotoxina, usando Agua para PEB. Usar las diluciones tan pronto como sea posible para evitar la
pérdida de actividad por adsorción.

Soluciones Muestra

Preparar las Soluciones Muestra disolviendo o diluyendo los medicamentos, usando Agua para PEB. Algunas sustancias o pre-
paraciones se pueden disolver o diluir adecuadamente en otras soluciones acuosas. Si fuera necesario, ajustar el pH de la solu-
ción (o de la dilución) a examinar de modo que el pH de la mezcla del lisado y la Solución Muestra se encuentre dentro del
intervalo de pH especificado por el fabricante del lisado, por lo general entre 6,0-8,0. El pH se puede ajustar con un ácido, una
base o una solución amortiguadora adecuada según lo recomiende el fabricante del lisado. Los ácidos y las bases se pueden
preparar a partir de concentrados o sólidos con Agua para PEB en recipientes exentos de endotoxinas detectables. Las solucio-

•1 Para una prueba de validez del procedimiento para inactivar endotoxinas, ver Esterilización por Calor Seco en Esterilización y Garantía de Esterilidad de Artículos
Farmacopeicos (1211 ). Usar un Usado SR con una sensibilidad no menor de O, 15 Unidades de Endotoxina por ml.+
180 (85) Prueba de Endotoxinas Bacterianas/ Pruebas Biológicas USP 40

nes amortiguadoras se deben validar para garantizar que están exentas de endotoxinas y otros factores de interferencia detec-
tables.

DETERMINACIÓN DE LA MÁXIMA DILUCIÓN VÁLIDA (MDV)

La máxima dilución válida es la dilución máxima permisible de una muestra a la que se le puede determinar el límite de
endotoxina. Determinar la MDV a partir de la siguiente ecuación:

MDV =(límite de endotoxina x concentración de la Solución Muestra)/('A)

Límite de Endotoxina

El límite de endotoxina para medicamentos de administración parenteral, definido según la dosis, es igual a K/M• 2 ., donde K
es la dosis pirogénica umbral de endotoxina por kg de peso corporal y Mes igual a la dosis máxima recomendada del produc-
to, en bolo, por kg de peso corporal. Cuando el producto se va a inyectar a intervalos frecuentes o por infusión continua, Mes
la dosis máxima total administrada durante un periodo de una hora. El límite de endotoxinas para los medicamentos de admi-
nistración parenteral se especifica en la monografía individual en unidades como UE/mL, UE/mg, UE/Unidad de actividad bio-
lógica, etc.

Concentración de la Solución Muestra

mg/mL: en el caso del límite de endotoxina especificado por peso (UE/mg);

Unidades/mL: en el caso del límite de endotoxina especificado por unidad de actividad biológica (UE/Unidad);
mL/mL: cuando el límite de endotoxina se especifica por volumen (UE/mL).
'A: la sensibilidad declarada en la Técnica de Coagulación (UE/mL) o la concentración más baja usada en la curva estándar
para la Técnica Turbidimétrica o la Técnica Cromogénica.

TÉCNICA DE COAGULACIÓN
La técnica de coagulación se usa para detectar o cuantificar endotoxinas basándose en la coagulación del lisado empleado
como reactivo en presencia de endotoxina. La concentración mínima de endotoxina requerida para hacer que el lisado se coa-
gule en las condiciones estándar es la sensibilidad declarada del lisado empleado como reactivo. Para garantizar tanto la preci-
sión como la validez de la prueba, efectuar las pruebas para confirmar la sensibilidad declarada del lisado y para determinar
factores de interferencia según se describe en Pruebas Preparatorias.

Pruebas Preparatorias

PRUEBA DE CONFIRMACIÓN DE LA SENSIBILIDAD DECLARADA DEL USADO

Confirmar en cuatro determinaciones repetidas la sensibilidad declarada, 'A, expresada en UE/mL del lisado antes de usarlo
en la prueba. La prueba de confirmación de sensibilidad del lisado se debe llevar a cabo cuando se usa una partida nueva de
lisado o cuando hay algún cambio en las condiciones de la prueba que pueda afectar el resultado. Preparar soluciones estándar
con al menos cuatro concentraciones equivalentes a 2'A, 'A, 0,5'A y 0,25'A, diluyendo el ER Endotoxina USP con Agua para PEB.
Mezclar un volumen del Usado SR con un volumen igual (como por ejemplo alícuotas de O, 1 mL) de una de las Soluciones
Estándar de Endotoxina en cada tubo de ensayo. Cuando se usen viales o ampollas de prueba individuales que contengan lisa-
do liofilizado, agregar directamente las soluciones al vial o a la ampolla. Incubar la mezcla de reacción durante un período
constante según las instrucciones del fabricante del lisado (habitualmente a 37±1 ºdurante 60 ± 2 minutos), evitando vibracio-
nes. Para analizar la integridad del gel, sacar uno a uno los tubos directamente de la incubadora y con un único movimiento
suave, invertirlos aproximadamente a 180º. Si se ha formado un gel firme que permanece en su lugar después de invertir los
tubos, registrar el resultado como positivo. Un resultado es negativo si no se forma un gel intacto. La prueba se considera váli-
da cuando la concentración más baja de las soluciones estándar presenta un resultado negativo en todas las pruebas repetidas.
El punto final es la concentración más baja en la serie de concentraciones decrecientes de endotoxina estándar que coagula
el lisado. Determinar la media geométrica del punto final calculando la media de los logaritmos de las concentraciones en el
punto final de la serie de cuatro determinaciones repetidas y calculando luego el antilogaritmo de la media, según se indica en
la siguiente fórmula:

•2 K es 5 UE-USP/kg de peso corporal para cualquier vía de administración distinta de la intratecal (para la cual K es 0,2 UE-USP/kg de peso corporal). En el caso de
productos radiofarmacéuticos que no se administren por vía intratecal, el límite de endotoxina se calcula como 175 UE/V, donde V es la dosis máxima recomenda-
da en ml. En el caso de radiofármacos administrados por vía intratecal, el límite de endotoxina se obtiene mediante la fórmula 14 UE/V. Para formulaciones (por lo
general productos oncológicos) que se administran por metro cuadrado de superficie corporal, la fórmula es K/M, donde K = 100 UE/m 2 y Mes la dosis
máxima/m2 .•
USP 40 Pruebas Biológicas/ (85) Prueba de Endotoxinas Bacterianas 181

media geométrica de la concentración en el punto final = antilogaritmo (L.e/f)

donde L.e es la suma de los logaritmos de las concentraciones en el punto final de la serie de diluciones utilizadas, y fes el
número de tubos de ensayo repetidos. La media geométrica de la concentración en el punto final es la sensibilidad medida del
lisado (en UE/mL). Si no es menor de 0,51.. y no es mayor de 2A, se confirma la sensibilidad declarada y se usa en las pruebas
realizadas con este lisado.

PRUEBA DE FACTORES DE INTERFERENCIA

Por lo general, preparar soluciones (A-D) como se muestra en la Tabla 7, y efectuar la prueba de inhibición o potenciación
en las Soluciones Muestra con una dilución menor que la máxima dilución válida (MDV), que no contenga endotoxinas detec-
tables, procediendo según se describe en Prueba de Confirmación de la Sensibilidad Declarada del Lisado. La media geométrica
de las concentraciones en el punto final de las Soluciones By C se determina usando la fórmula descrita en la Prueba de Confir-
mación de la Sensibilidad Declarada del Usado. La prueba de factores de interferencia deberá repetirse siempre que se presenten
cambios en alguna de las condiciones que pudieran influir en el resultado de la prueba.
Tabla 1. Preparación de Soluciones para la Prueba de Inhibición/Potenciación para Técnicas de Coagulación
Concentración de Endotoxlna/
Solución a la que se Agrega Factor de Concentración Número de
Solución Endotoxina Diluyente Dilución de Endotoxlna Repeticiones
N Ninguna/ Solución Muestra - - - 4
Bb 2A/ Solución Muestra Solución Muestra 1 21c 4
2 n 4
4 0,51c 4
8 0,25/.., 4
ce 2A/ Agua para PEB Agua para PEB 1 2A 2
2 n 2
4 0,51c 2
8 0,25/.., 2
Dci Ninguna/Aguo para PEB - - - 2
ª Solución A: Una Solución Muestra de la preparación en análisis que esté exenta de endotoxinas detectables.
b Solución B: Prueba de interferencia.
e Solución C: Control para sensibilidad declarada del lisado.
d Solución O: Control negativo de Agua para PEB

Esta prueba se considera válida cuando todas las determinaciones repetidas de las Soluciones A y D no muestran ninguna
reacción y el resultado de la Solución C confirma la sensibilidad declarada.
Si la sensibilidad del lisado determinada en presencia de la Solución B no es menor de 0,51.. y no es mayor de 2A, la Solución
Muestra no contiene factores que interfieran en las condiciones experimentales usadas. En caso contrario, la Solución Muestra a
examinar interfiere con la prueba.
Si la muestra en análisis no cumple con la prueba a una dilución menor que la MDV, se debe repetir la prueba empleando
una dilución mayor que no exceda la MDV. El uso de un lisado de mayor sensibilidad permite una dilución mayor de la mues-
tra a examinar y esto puede contribuir a la eliminación de la interferencia.
La interferencia se puede resolver mediante un tratamiento adecuado, como filtración, neutralización, diálisis o calentamien-
to. Para establecer que el tratamiento elegido elimina eficazmente la interferencia sin pérdida de endotoxinas, realizar la valo-
ración descrita anteriormente, utilizando la preparación a examinar, a la que se ha agregado Estándar de Endotoxina y se ha
sometido al tratamiento seleccionado.

Prueba de Límite

PROCEDIMIENTO

Preparar las Soluciones A B, C y D según se indica en la Tabla 2 y llevar a cabo la prueba en estas soluciones siguiendo el
procedimiento indicado anteriormente en la Prueba de Confirmación de la Sensibilidad Declarada del Lisado en Pruebas Prepara-
torias.
182 (85) Prueba de Endotoxinas Bacterianas / Pruebas Biológicas USP 40

Tabla 2. Preparación de Soluciones para la Prueba de Límite de Coagulación

Concentración de Endotoxina/
Solución a la que se Agrega
Solución* Endotoxina Número de Repeticiones
A Ninguna/Solución Muestra Diluida 2
B 2A/Solución Muestra Diluida 2
e 2A/ Agua para PEB 2
D Ninguna/Agua para PEB 2
• Preparar la Solución A y la Solución B de control positivo del producto utilizando una dilución no mayor que la MDV y tratamientos según se indica en la Prueba
de Factores de Interferencia en Pruebas Preparatorias. Las Soluciones By C de control positivo contienen la Solución Estándar de Endotoxina a una concentración que
corresponde al doble de la sensibilidad declarada del lisado. La Solución D de control negativo consiste en Agua para PEB.

INTERPRETACIÓN

La prueba se considera válida cuando ambas determinaciones repetidas de las Soluciones By C son positivas y las de la Solu-
ción O son negativas. Cuando se obtiene un resultado negativo para ambas determinaciones repetidas de la Solución A, la pre-
paración en análisis cumple con la prueba. Cuando se obtiene un resultado positivo para ambas determinaciones repetidas de
la Solución A, la preparación en análisis no cumple con la prueba.
Cuando se obtiene un resultado positivo para una de las determinaciones de la Solución A y un resultado negativo para la
otra, repetir la prueba. En la repetición, la preparación en análisis cumple con la prueba si se obtiene un resultado negativo en
ambas determinaciones repetidas de la Solución A. La preparación no cumple con la prueba si se obtiene un resultado positivo
para una o ambas determinaciones repetidas de la Solución A. Sin embargo, si la preparación no cumple con la prueba a una
dilución menor que la MDV, se puede repetir la prueba empleando una dilución mayor que no exceda la MDV.

Prueba Cuantitativa

PROCEDIMIENTO

La prueba cuantifica endotoxinas bacterianas en las Soluciones Muestra por valoración volumétrica hasta un punto final. Pre-
parar Soluciones A, B, C y O según se indica en la Tabla 3 y analizar siguiendo el procedimiento en la Prueba de Confirmación de
la Sensibilidad Declarada del Lisado en Pruebas Preparatorias.
Tabla 3. Preparación de Soluciones para la Prueba de Coagulación
Factor
Concentración de Endotoxina/ de
Solución a la cual se Agrega Dilu- Concentración Número de
Solución Endotoxina Diluyente clón de Endotoxina Repeticiones
A" Ninguna/Solución Muestra Agua para PEB 1 - 2
2 - 2
4 - 2
8 - 2
Bb 2A/ Solución Muestra - 1 2/c 2
ce 21.,/ Agua para PEB Agua para PEB 1 2/c 2
2 n 2
4 0,5/c 2
8 0,25/c 2
Dd Ninguna/Aguo para PEB - - - 2
ª Solución A: Solución Muestra en análisis a la dilución, que no debe exceder la MDV, con la cual se completó la Prueba de Factores de Interferencia. Las diluciones
subsiguientes de la Solución Muestra no deben exceder la MDV. Usar Agua para PEB para efectuar una serie de diluciones en cuatro tubos que contengan la
Solución Muestra en análisis a concentraciones de 1, '/,, '/,,y 1/s con respecto a la concentración usada en la Prueba de Factores de Interferencia. Se pueden usar
otras diluciones hasta la MDV, según sea necesario.
b Solución B: Solución A que contenga endotoxina estándar a una concentración de 2/c (control positivo del producto).
e Solución C: Dos series repetidas de cuatro tubos de Agua para PEB que contengan la endotoxina estándar a una concentración de 2/c, 'A, 0,5/c, y 0,25/c, respecti-
vamente.
d Solución D: Agua para PEB (control negativo).

CÁLCULO E INTERPRETACIÓN

La prueba se considera válida cuando se cumplen las tres condiciones siguientes: (1) ambas determinaciones repetidas de la
Solución O de control negativo son negativas; (2) ambas determinaciones repetidas de la Solución B de control positivo del pro-
USP 40 Pruebas Biológicas/ (85) Prueba de Endotoxinas Bacterianas 183

dueto son positivas; y (3) la media geométrica de la concentración en el punto final de la Solución C está comprendida en el
intervalo de 0,5/,,, a 2A.
Para determinar la concentración de endotoxinas de la Solución A, calcular la concentración en el punto final para cada repe-
tición multiplicando cada factor de dilución del punto final por A. La concentración de endotoxinas en la Solución Muestra es la
concentración en el punto final de las repeticiones. Si la prueba se realiza con una Solución Muestra diluida, calcular la concen-
tración de endotoxinas en la Solución Muestra original multiplicando por el factor de dilución. Si ninguna de las diluciones de la
Solución Muestra es positiva en un ensayo válido, informar la concentración de endotoxina como menor que A, (si se analizó la
muestra diluida, informar como menor que A, multiplicado por el factor de dilución más bajo de la muestra). Si todas las dilu-
ciones son positivas, la concentración de endotoxina se informa como igual o mayor que el factor de dilución mayor por A,
(p.ej., el factor de dilución inicial multiplicado por 8 y por A, en la Tabla 3).
La preparación cumple con los requisitos de la prueba si la concentración de endotoxinas en ambas determinaciones repeti-
das es menor que la especificada en la monografía individual.

TÉCNICAS FOTOMÉTRICAS CUANTITATIVAS

Técnica Turbidimétrica

Esta técnica es una valoración fotométrica que mide los incrementos en turbidez del reactante. Dependiendo del principio
empleado en la valoración, esta técnica se puede clasificar como valoración turbidimétrica de punto final o valoración turbidi-
métrica cinética. La valoración turbidimétrica de punto final se basa en la relación cuantitativa entre la concentración de endo-
toxinas y la turbidez (absorbancia o transmisión) de la mezcla de reacción al término de un período de incubación. La valora-
ción turbidimétrica cinética es un método para medir el tiempo necesario para alcanzar una absorbancia o transmisión prede-
terminada de la mezcla de reacción (tiempo de iniciación) o la velocidad de desarrollo de turbidez. La prueba se efectúa a la
temperatura de incubación recomendada por el fabricante del lisado (por lo general 37 ± 1 º).

Técnica Cromogénica

Esta técnica es una valoración para medir el cromóforo liberado de un péptido cromogénico adecuado por la reacción de las
endotoxinas con el lisado. Dependiendo del principio empleado en la valoración, esta técnica se puede clasificar como valora-
ción cromogénica de punto final o valoración cromogénica cinética. La valoración cromogénica de punto final se basa en la
relación cuantitativa entre la concentración de endotoxinas y la liberación del cromóforo al término de un período de incuba-
ción. La valoración cromogénica cinética es un método para medir el tiempo (tiempo de iniciación) necesario para alcanzar
una absorbancia predeterminada de la mezcla de reacción o la velocidad de desarrollo de color. La prueba se efectúa a la tem-
peratura de incubación recomendada por el fabricante del lisado (por lo general 37 ± 1º).

Pruebas Preparatorias

Con el fin de garantizar la precisión o validez de las técnicas turbidimétricas y cromogénicas, se realizan las pruebas prepara-
torias para verificar que los criterios para la curva estándar son válidos y que la solución muestra no interfiere con la prueba.
Cuando cambian las condiciones que pueden influir en el resultado de la prueba es necesaria la validación del método de
prueba.

GARANTÍA DE LOS CRITERIOS PARA LA CURVA ESTÁNDAR

La prueba se debe efectuar para cada lote de lisado empleado como reactivo. Utilizando la Solución Estándar de Endotoxina,
preparar por lo menos tres concentraciones de endotoxina dentro del intervalo indicado por el fabricante del lisado para gene-
rar la curva estándar. Realizar la valoración usando por lo menos tres determinaciones repetidas de cada concentración de en-
dotoxina estándar, siguiendo las instrucciones del fabricante del lisado (con respecto a relaciones de volumen, tiempo de incu-
bación, temperatura, pH, etc.). Si el intervalo deseado en los métodos cinéticos es mayor de dos logaritmos, se deben incluir
estándares adicionales para que cada aumento logarítmico esté comprendido en el intervalo de la curva estándar. El valor ab-
soluto del coeficiente de correlación, r, debe ser mayor o igual a 0,980 para el intervalo establecido de concentraciones de
endotoxina.

PRUEBA PARA FACTORES DE INTERFERENCIA

Seleccionar una concentración de endotoxina en o cerca del centro de la curva estándar de endotoxina. Preparar las Solucio-
nes A, 8, C y O según se indica en la Tabla 4. Llevar a cabo la prueba en las Soluciones A, B, C y O al menos por duplicado, de
acuerdo con las instrucciones del lisado empleado, por ejemplo, en lo que respecta al volumen entre la Solución Muestra y el
Usado SR, la relación de volumen de la Solución Muestra y el Usado SR, el tiempo de incubación, etc.
184 (85) Prueba de Endotoxinas Bacterianas / Pruebas Biológicas USP 40

Tabla 4. Preparación de Soluciones para la Prueba de Inhibición/Potenciación para Técnicas Fotométricas

Solución a la cual se Agrega
Solución Concentración de Endotoxina Endotoxina Número de Repeticiones
N Ninguna Solución Muestra No menos de 2
Bb Concentración central de la curva estándar Solución Muestra No menos de 2
ce Al menos 3 concentraciones (la concentración más baja se Agua para PEB No menos de 2 para cada una
denomina le)
Dd Ninguna Agua para PEB No menos de 2
ª Solución A: Solución Muestra se puede diluir sin que exceda la MDV.
b Solución 8: La preparación en análisis a la misma dilución que la Solución A, que contenga endotoxina agregada a una concentración igual o cercana a la
concentración central de la curva estándar.
e Solución C: La endotoxina estándar a las concentraciones usadas en la validación del método descrito para Garantía de Criterios para la Curva Estándar en
Pruebas Preparatorias (controles positivos).
d Solución D: Agua para PEB (control negativo).

La prueba se considera válida cuando se cumplen las condiciones siguientes.

1. El valor absoluto del coeficiente de correlación de la curva estándar generada usando la Solución Ces mayor o igual a
0,980.
2. El resultado de la Solución O no excede el límite del valor del blanco requerido en la descripción del lisado empleado co-
mo reactivo o es menor que el límite de detección de endotoxina del lisado empleado como reactivo.
Calcular la recuperación media de la endotoxina agregada restando la concentración media de endotoxina en la solución, si
la hubiera (Solución A, Tabla 4), de la que contiene la endotoxina agregada (Solución B, Tabla 4). Para considerar que no pre-
senta factores que interfieran con la valoración en las condiciones de la prueba, la concentración medida de endotoxina agre-
gada a la Solución Muestra debe estar entre 50%-200% de la concentración conocida de endotoxina agregada después de
restar la endotoxina detectada en la solución sin endotoxina agregada.
Cuando la recuperación de endotoxina se encuentra fuera de los intervalos especificados, se considera que la Solución Mues-
tra en análisis contiene factores de interferencia. Luego, repetir la prueba usando una dilución mayor que no exceda la MDV.
Además, la interferencia de la Solución Muestra o de la Solución Muestra diluida que no exceda la MDV se puede eliminar me-
diante un tratamiento validado apropiado, como filtración, neutralización, diálisis o calentamiento. Para establecer que el trata-
miento elegido elimina eficazmente la interferencia sin pérdida de endotoxinas, realizar la valoración descrita anteriormente
utilizando la preparación a examinar, a la que se ha agregado Endotoxina Estándar y se ha sometido posteriormente al trata-
miento seleccionado.

Procedimiento de Prueba

Seguir el procedimiento descrito anteriormente para Prueba de Factores de Interferencia en Pruebas Preparatorias.

Cálculo

Calcular la concentración de endotoxina de cada una de las determinaciones repetidas de la Solución A usando la curva es-
tándar generada con la Solución C de control positivo. La prueba se considera válida cuando se cumplen las tres condiciones
siguientes.
1. Los resultados de la Solución C de control cumplen con los requisitos de validación definidos en Garantía de Criterios para
la Curva Estándar, en Pruebas Preparatorias.
2. La recuperación de endotoxina, calculada a partir de la concentración encontrada en la Solución B después de restar la
concentración de endotoxina encontrada en la Solución A está dentro del intervalo de 50%-200%.
3. El resultado de la Solución O de control negativo no excede el límite del valor del blanco requerido en la descripción del
lisado empleado o es menor que el límite de detección de endotoxina del lisado empleado como reactivo.

1nterpretación

En las valoraciones fotométricas, la preparación en análisis cumple con la prueba si la concentración media de endotoxinas
de las determinaciones repetidas de la Solución A, después de la corrección por dilución y concentración, es menor que el lími-
te de endotoxina para el producto.
 USP 40 Pruebas Biológicas / (87) Pruebas de Reactividad Biológica, In Vitro 185

(87) PRUEBAS DE REACTIVIDAD BIOLÓGICA, IN VITRO

Las pruebas que se describen a continuación han sido diseñadas para determinar la reactividad biológica de cultivos de células
de mamíferos después de entrar en contacto con plásticos elastoméricos y otros materiales poliméricos que, a su vez, están
en contacto directo o indirecto con el paciente, o de extractos específicos preparados a partir de los materiales en análisis. Es
esencial que las pruebas se realicen en la superficie especificada. Cuando esta no se puede determinar, usar O, 1 g de elastó-
mero o 0,2 g de plástico u otro material por cada mL de líquido de extracción. Tomar precauciones en la preparación de los
materiales para evitar la contaminación con microorganismos y otra materia extraña.
Se describen tres pruebas (es decir, la Prueba de Difusión en Agar, la Prueba de Contacto Directo y la Prueba de Elución).1 La deci-
sión acerca del tipo de prueba o el número de pruebas a realizar para la evaluación de la posible respuesta biológica de una
muestra o extracto específico depende del material, el producto final y el uso previsto. Otros factores que también pueden
afectar la aptitud de una muestra para un uso específico son: la composición polimérica, los procedimientos de procesa-
miento y limpieza, el medio de contacto, las tintas, los adhesivos, la absorción, la adsorción y la permeabilidad de los conser-
vantes, y las condiciones de almacenamiento. La evaluación de tales factores se debe realizar mediante pruebas específicas
adicionales apropiadas antes de determinar si un producto fabricado a partir de un material específico es apto para el uso
previsto. Los materiales que no cumplen con las pruebas in vitro son candidatos para las pruebas in vivo descritas en Pruebas
de Reactividad Biológica, In Vivo (88).

PROCEDIMIENTOS
• CONTROL DE PRUEBA
Control positivo: Una película de poliuretano que contenga dietilditiocarbamato de cinc (ZDEC, por sus siglas en inglés) 2
o dibutilditiocarbamato de cinc (ZDBC, por sus siglas en inglés).
Preparación del cultivo de células: Preparar múltiples cultivos de células de fibroblastos de mamífero L-929 (ATCC línea
celular CCL 1, NCTC clon 929; pueden usarse líneas celulares alternativas obtenidas de un repositorio de estándares siem-
pre que se sometan a una validación adecuada) en un medio de cultivo esencial mínimo suplementado con suero, con una
densidad de siembra de aproximadamente 10 5 células por ml. Incubar los cultivos a 37 ± 1 ºen una incubadora humidifica-
da durante no menos de 24 horas en una atmósfera de 5 ± 1 % de dióxido de carbono hasta obtener una monocapa con
una confluencia superior al 80%. Observar al microscopio los cultivos preparados para asegurar que las monocapas sean
uniformes y tiendan a la confluencia. [NOTA-La reproducibilidad de las pruebas de reactividad biológica in vitro depende
de la obtención de una densidad uniforme del cultivo celular.]
Disolventes de extracción: Inyección de Cloruro de Sodio [ver monografía-usar Inyección de Cloruro de Sodio que contenga
cloruro de sodio (NaCI) al 0,9%). De modo alternativo, se pueden usar medios de cultivo de células de mamífero sin suero
o medios de cultivo de células de mamífero suplementados con suero. Se usa el suplemento de suero cuando la extracción
se realiza a 37° durante 24 horas.
•APARATOS
Autoclave: Emplear un autoclave capaz de mantener una temperatura de 121 ± 2º, equipado con un termómetro, un ma-
nómetro, una válvula de ventilación, una gradilla adecuada para acomodar los recipientes de prueba por encima del nivel
del agua y un sistema de enfriamiento de agua que permita enfriar los recipientes de prueba hasta aproximadamente 20º,
pero no por debajo de 20º, inmediatamente después del ciclo de calentamiento.
Estufa: Usar una estufa, preferentemente un modelo de convección mecánica, que mantenga las temperaturas de funcio-
namiento en un intervalo de 50º-70º ± 2º.
Incubadora: Usar una incubadora capaz de mantener una temperatura de 37 ± 1 ºy una atmósfera humidificada de 5 ± 1 %
de dióxido de carbono en el aire.
Recipientes de extracción: Usar únicamente recipientes de vidrio Tipo 1, como por ejemplo, ampollas o tubos de ensayo
para cultivo con tapa de rosca, o equivalentes. En caso de utilizar tubos de ensayo para cultivo, o equivalentes, deben ce-
rrarse con una tapa de rosca que tenga un recubrimiento interno elastomérico adecuado. La superficie expuesta del recu-
brimiento interno elastomérico está completamente protegida con un disco sólido inerte con un espesor de 50-75 µm. Se
puede fabricar un disco adecuado de teflón.
Preparación del aparato: Limpiar minuciosamente todo el material de vidrio con una mezcla limpiadora de ácido crómico
y, si fuera necesario, con ácido nítrico caliente y luego enjuagar con Agua Estéril para Inyección durante un tiempo prolon-
gado. Esterilizar y secar mediante un proceso adecuado para recipientes y dispositivos usados para la extracción, transfe-
rencia o administración del material de prueba. Si se usa óxido de etileno como agente esterilizante, dejar que pasen no
menos de 48 horas para la desgasificación total.

1 Para más detalles, consulte las siguientes publicaciones de la American Society for Testing and Materials, 1916 Race St., Philadelphia, PA 19103: Standard test
method for agar diffusion cell culture screening for cytotoxicity, Designación de ASTM F 895-84; Standard practice for direct contact cell culture evaluation of
materials for medica! devices, Designación de ASTM F 813-83.
2 Los poliuretanos ZDEC y ZDBC se encuentran disponibles en Food and Drug Safety Center, Hatano Research lnstitute, Ochiai 729-5, Hadanoshi, Kanagawa 257,
Japón.
186 (87) Pruebas de Reactividad Biológica, In Vitro / Pruebas Biológicas USP 40

• PROCEDIMIENTO
Preparación de la muestra para extractos: Preparar según se indica en Procedimiento en (88).
Preparación de extractos: Preparar según se indica en Preparación de Extractos en (88) y usar Inyección de Cloruro de Sodio
[cloruro de sodio (NaCI) al 0,9%] o medio de cultivo de células de mamífero sin suero como Disolventes de Extracción.
[NOTA-Si la extracción se realiza a 37º durante 24 horas en una incubadora, usar medio de cultivo de células suplementa-
do con suero. Las condiciones de extracción no deben causar en ningún caso cambios físicos como la fusión o el ablanda-
miento de los trozos de material, excepto una ligera adherencia.]
• PRUEBA DE DIFUSIÓN EN AGAR
Esta prueba está diseñada para cierres elastoméricos de diferentes formas. La capa de agar actúa como protector de las cé-
lulas y evita daños mecánicos mientras permite la difusión de las sustancias químicas lixiviables de las muestras poliméri-
cas. Los extractos de los materiales que se van a analizar se aplican a una pieza de papel de filtro.
Preparación de muestra: Usar extractos preparados según se indica o usar porciones de las muestras de prueba que ten-
gan superficies planas con un área de no menos de 100 mm 2 •
Preparación de control positivo: Proceder según se indica en Preparación de muestra.
Preparación de control negativo: Proceder según se indica en Preparación de muestra.
Procedimiento: Usando 7 mL de suspensión de células preparada según se indica en Preparación del cultivo de células, pre-
parar las monocapas en placas de 60 mm de diámetro. Después de la incubación, aspirar el medio de cultivo de las mono-
capas y reemplazarlo con medio de cultivo suplementado con suero que contenga no más de 2% de agar. [NOTA-La cali-
dad del agar debe ser adecuada para mantener el crecimiento celular. La capa de agar debe ser lo suficientemente delgada
para permitir la difusión de las sustancias químicas lixiviables.] Colocar las superficies planas de la Preparación de muestra, la
Preparación de control positivo y la Preparación de control negativo o sus extractos en un medio de extracción apropiado, en
cultivos duplicados, en contacto con la superficie de agar solidificado. Usar no más de tres muestras por placa preparada.
Incubar todos los cultivos durante no menos de 24 horas a 37±1 º, preferentemente en una incubadora humidificada que
contenga 5 ± 1% de dióxido de carbono. Observar al microscopio cada cultivo alrededor de cada muestra, control negati-
vo y control positivo usando una tinción adecuada, si se desea.
Interpretación de los resultados: La reactividad biológica (degeneración y malformación celular) se describe y clasifica en
una escala de 0-4 (ver la Tabla 1). Determinar las respuestas de los cultivos de células de la Preparación de muestra, la
Preparación de control positivo y la Preparación de control negativo. El sistema de prueba de cultivos de células es adecuado si
las respuestas observadas de la Preparación de control negativo es grado O (no reactiva) y de la Preparación de control positivo
es al menos grado 3 (moderada). La muestra cumple con los requisitos de la prueba si la respuesta de la Preparación de
muestra no es mayor que grado 2 (levemente reactiva). Repetir el procedimiento si la aptitud del sistema no se confirma.
Tabla 1. Grados de Reactividad en la Prueba de Difusión en Agar y la Prueba de Contacto Directo
Grado Reactividad Descripción de la Zona de Reactividad
o Ninguna No se detecta zona reactiva alrededor ni debajo de la muestra
1 Escasa Algunas células malformadas o degeneradas debajo de la muestra
2 Leve Zona limitada al área debajo de la muestra y menos de 0,45 cm alrededor de la muestra
3 Moderada Zona reactiva que se extiende de 0,45-1,0 cm alrededor de la muestra
4 Grave Zona reactiva que se extiende más de 1,0 cm alrededor de la muestra

• PRUEBA DE CONTACTO DIRECTO

Esta prueba está diseñada para materiales de diferentes formas. Este procedimiento permite la extracción y el análisis simul-
táneos de sustancias químicas lixiviables de la muestra en un medio suplementado con suero. El procedimiento no es ade-
cuado para materiales de muy baja o muy alta densidad que puedan causar daños mecánicos a las células.
Preparación de muestra: Usar porciones de la muestra de prueba que tengan superficies planas con un área de no menos
de 100 mm2.
Preparación de control positivo: Proceder según se indica en Preparación de muestra.
Preparación de control negativo: Proceder según se indica en Preparación de muestra.
Procedimiento: Usando 2 mL de suspensión de células preparada según se indica en Preparación del cultivo de células, pre-
parar las monocapas en placas de 35 mm de diámetro. Después de la incubación, aspirar el medio de cultivo de los cultivos
y reemplazarlo con 0,8 mL de medio de cultivo recientemente preparado. Colocar una única Preparación de muestra, una
Preparación de control positivo y una Preparación de Control Negativo en cada uno de los cultivos duplicados. Incubar todos
los cultivos durante no menos de 24 horas a 37 ± 1º en una incubadora humidificada que contenga 5 ± 1% de dióxido de
carbono. Observar al microscopio cada cultivo alrededor de cada Preparación de muestra, Preparación de control positivo y
Preparación de control negativo, usando una tinción adecuada, si se desea.
Interpretación de los resultados: Proceder según se indica en Interpretación de Jos resultados en Prueba de Difusión en
Agar. La muestra cumple con los requisitos de la prueba si la respuesta de la Preparación de muestra no es mayor que grado
2 (levemente reactiva). Repetir el procedimiento si la aptitud del sistema no se confirma.
USP 40 Pruebas Biológicas/ (88) Pruebas de Reactividad Biológica, In Vivo 187

• PRUEBA DE ELUCIÓN
Esta prueba está diseñada para la evaluación de extractos de materiales poliméricos. El procedimiento permite la extracción
de muestras a temperaturas fisiológicas o no fisiológicas para distintos intervalos de tiempo. Es apropiada para materiales
de alta densidad y para evaluaciones de dosis-respuesta.
Preparación de muestra: Preparar según se indica en Preparación de extractos, usando una Inyección de Cloruro de Sodio
[cloruro de sodio (NaCI) al 0,9%] o medio de cultivo de células de mamífero sin suero como Disolventes de Extracción. Si el
tamaño de la muestra no se puede determinar inmediatamente, se puede usar no menos de O, 1 g de material elastomérico
o 0,2 g de material plástico o polimérico por mL de medio de extracción. De modo alternativo, usar un medio de cultivo
de células de mamífero suplementado con suero como medio de extracción para simular mejor las condiciones fisiológicas.
Preparar los extractos calentando la muestra durante 24 horas en una incubadora que contenga 5±1 % de dióxido de car-
bono. Mantener la temperatura de extracción a 37±1 º, ya que temperaturas superiores pueden desnaturalizar las proteí-
nas séricas.
Preparación de control positivo: Proceder según se indica en Preparación de muestra.
Preparación de control negativo: Proceder según se indica en Preparación de muestra.
Procedimiento: Usando 2 mL de suspensión de células preparada según se indica en Preparación del Cultivo de Células,
preparar las monocapas en placas de 35 mm de diámetro. Después de la incubación, aspirar el medio de cultivo de las
monocapas y reemplazarlo con extractos de la Preparación de Muestra, Preparación de Control Positivo o Preparación de Con-
trol Negativo. Los extractos de los medios de cultivo de células suplementados con suero y sin suero se analizan por dupli-
cado sin dilución (100%). El extracto de Inyección de Cloruro de Sodio se diluye con el medio de cultivo de células suple-
mentado con suero y se analiza por duplicado a una concentración del extracto del 25%. Incubar todos los cultivos duran-
te 48 horas a 37±1 º, en una incubadora humidificada que contenga preferentemente 5 ± 1% de dióxido de carbono. Ob-
servar al microscopio cada cultivo a las 48 horas, usando una tinción adecuada, si se desea.
Interpretación de los resultados: Proceder según se indica en Interpretación de los Resultados en Prueba de Difusión en
Agar, pero usando la Tabla 2. La muestra cumple con los requisitos de la prueba si la respuesta de la Preparación de Muestra
no es mayor que grado 2 (levemente reactiva). Repetir el procedimiento si la aptitud del sistema no se confirma. Para reali-
zar evaluaciones de dosis-respuesta, repetir el procedimiento, usando diluciones cuantitativas del extracto de la muestra.
Tabla 2. Grados de Reactividad en la Prueba de Elución
Grado Reactividad Condiciones de Todos los Cultivos
o Ninguna Gránulos intracitoplasmáticos diferenciados; no hay lisis celular
El 20% o menos de las células son redondas, levemente adheridas y sin gránulos intraci-
1 Escasa toplasmáticos; hay algunas células lisadas
Más del 20% pero menos o hasta el 50% de las células son redondas y desprovistas de
2 Leve gránulos intracitoplasmáticos; no hay lisis celular extensiva ni áreas vacías entre células
Más del 50% pero menos del 70% de las capas celulares contienen células redondas o
3 Moderada lisadas
4 Grave Destrucción casi total de las capas celulares

REQUISITOS ADICIONALES
• ESTÁNDARES DE REFERENCIA USP (11)
ER Polietileno de Alta Densidad USP (Control Negativo)

(88) PRUEBAS DE REACTIVIDAD BIOLÓGICA, IN VIVO

Las siguientes pruebas están diseñadas para determinar la respuesta biológica de animales a materiales elastoméricos, plásti-
cos y otros materiales poliméricos en contacto directo o indirecto con el paciente, o mediante la inyección de extractos especí-
ficos preparados a partir del material en análisis. Es esencial conocer el área específica para la extracción. Cuando ésta no se
puede determinar, utilizar O, 1 g de elastómero o 0,2 g de plástico u otro material por cada mL de líquido de extracción. Tam-
bién es fundamental tomar las precauciones necesarias en la preparación de los materiales que se van a inyectar o instilar para
evitar la contaminación con microorganismos y otra materia extraña. Se describen tres pruebas. La Prueba de Inyección Sistémi-
ca y la Prueba lntracutánea se utilizan para materiales elastoméricos, especialmente para cierres elastoméricos para los que las
Pruebas de Reactividad Biológica, In Vitro (87) correspondientes han indicado una reactividad biológica significativa. Estas dos
pruebas se utilizan para plásticos y otros polímeros además de una tercera prueba, la Prueba de Implantación, para probar la
aptitud de estos materiales destinados a la fabricación de envases y accesorios, para uso en preparaciones parenterales y en
dispositivos médicos, implantes y otros sistemas.
Estas tres pruebas se aplican a materiales o dispositivos médicos, cuando existe la necesidad de clasificar los plásticos y otros
polímeros basándose en las pruebas de reactividad biológica in vivo.
 188 (88) Pruebas de Reactividad Biológica, In Vivo / Pruebas Biológicas USP 40

A 'los efectos de este capítulo, se aplicarán las siguientes definiciones: la Muestra es la muestra en análisis o un extracto pre-
parado a partir de dicha muestra. Un Blanco consiste en la misma cantidad del mismo medio de extracción usado para extraer
la muestra en análisis, tratado de la misma manera que el medio de extracción que contiene dicha muestra. Un Control Negati-
vo1 es una muestra que no produce ninguna reacción en las condiciones de prueba.

CLASIFICACIÓN DE PLÁSTICOS
Se definen seis Clases de Plásticos (ver la Tabla 7). Esta clasificación se basa en las respuestas a una serie de pruebas in vivo
para las que se especifican extractos, materiales y vías de administración. Estas pruebas están directamente relacionadas con el
uso final al que están destinados los artículos de plástico. La elección de extractantes es representativa de los vehículos en pre-
paraciones con las que es probable que los plásticos entren en contacto. La clasificación de la Tabla 7 facilita la comunicación
entre proveedores, usuarios y fabricantes de plásticos ya que resume las pruebas a las que deben someterse los envases de
inyectables y dispositivos médicos cuando es necesaria su clasificación.
Tabla 1. Clasificación de Plásticos
Clases de Plásticoª Pruebas por Realizar
1 11 111 IV V VI Material de Prueba Animal Dosis Procedimientob
X X X X X X Ratón 50 ml/kg A(IV)
Extracto de Muestra en Inyección de C/o- 0,2 ml/animal en cada
X X X X X X ruro de Sodio Conejo o Cobayo uno de 1 O ó 6 sitios B(IC)
X X X X X
Extracto de Muestra en Solución 7 en 20 Ratón 50 ml/kg A(IP)
de Alcohol en Inyección de Cloruro de So- 0,2 ml/animal en cada
X X X X X dio Conejo o Cobayo uno de 1 O ó 6 sitios B (IC)
X X X Ratón 1 o g/kg A (IP)
Extracto de Muestra en Polietilenglicol 0,2 ml/animal en cada
X X 400 Conejo o Cobayo uno de 1 O ó 6 sitios B(IC)
X X X X Ratón 50 ml/kg A (IP)
0,2 ml/animal en cada
X X X Extracto de Muestra en Aceite Vegetal Conejo o Cobayo uno de 1 O ó 6 sitios B(IC)
X X Tiras de implante de Muestra Conejo 4 tiras/animal c
X X Implante de Muestra Rata 2 Muestras/animal c
ª Las pruebas requeridas para cada clase de plástico se indican con una "x" en las columnas correspondientes.
b Leyenda: A (IP)-Prueba de Inyección Sistémica (intraperitoneal); A (IV)-Prueba de Inyección Sistémica (intravenosa); B (IC)-Prueba lntracutánea (intracutá-
nea); C-Prueba de Implantación (implantación intramuscular o subcutánea).

Con excepción de la Prueba de Implantación, los procedimientos se basan en el uso de extractos que, según la resistencia
térmica del material, se preparan a una de las tres temperaturas estándar: 50º, 70º y 121 º. Por lo tanto, la designación del tipo
de plástico debe estar acompañada por una indicación de la temperatura de extracción (p.ej., IV-121 º, que representa un plás-
tico clase IV extraído a 121 º o 1-50º, que representa un plástico clase 1extraído a 50º).
Los plásticos pueden clasificarse como Clases de Plástico USP 1-VI únicamente sobre la base de los criterios de respuesta pres-
critos en la Tabla 7.
Esta clasificación no es válida para plásticos destinados al uso como envases de productos orales o tópicos o que pudieran
utilizarse como una parte integral de la formulación de un medicamento. La Tabla 7 no es válida para elastómeros naturales,
los cuales deben analizarse con Inyección de Cloruro de Sodio y aceites vegetales únicamente.
La Prueba de Inyección Sistémica y la Prueba lntracutánea están diseñadas para determinar las respuestas biológicas sistémica
y local, respectivamente, de animales a plásticos y otros polímeros mediante la inyección monodosis de extractos específicos
preparados a partir de una Muestra. La Prueba de Implantación está diseñada para evaluar la reacción del tejido vivo al plástico
y a otros polímeros mediante la implantación de la Muestra propiamente dicha en el tejido animal. Para la realización de la
Prueba de Implantación, son importantes la preparación y la colocación adecuadas de las muestras en condiciones asépticas.
Estas pruebas están diseñadas para la aplicación de plásticos y otros polímeros en la condición en la que se utilizan. Si el
material va a exponerse a cualquier proceso de limpieza o esterilización antes de su uso final, las pruebas deben realizarse con
una Muestra preparada a partir de una muestra preacondicionada mediante el mismo procesamiento.
Ciertos factores, como por ejemplo la composición del material, los procedimientos de procesamiento y limpieza, el contac-
to con los medios, tintas, adhesivos, absorción, adsorción y permeabilidad de los conservantes y las condiciones de almacena-
miento también pueden afectar la aptitud de un material para un uso específico. Para determinar la aptitud de un material
para su uso indicado, deben evaluarse estos factores mediante pruebas específicas adicionales.
Estándares de Referencia USP (11 )-fR Polietileno de Alta Densidad USP.
Medios de Extracción-
INYECCIÓN DE CLORURO DE SODIO (ver la monografía). Usar Inyección de Cloruro de Sodio que contenga NaCI al 0,9%.

1 ER Polietileno de Alta Densidad USP.

USP 40 Pruebas Biológicas/ (88) Pruebas de Reactividad Biológica, In Vivo 189

SOLUCIÓN 1 EN 20 DE ALCOHOL EN INYECCIÓN DE CLORURO DE SODIO

POLIETILENGLICOL 400 (ver la monografía).
ACEITE VEGETAL-Usar Aceite de Sésamo recién refinado (ver la monografía) o Aceite de Semilla de Algodón (ver la monogra-
fía) u otros aceites vegetales adecuados.
VEHÍCULO DEL PRODUCTO FARMACÉUTICO (donde corresponda).
AGUA PARA INYECCIÓN (ver la monografía).
[NOTA-El Aceite de Sésamo o el Aceite de Semilla de Algodón u otros aceites vegetales cumplen con los siguientes requisi-
tos adicionales. Obtener, si es posible, aceite recientemente refinado. Usar tres animales debidamente preparados e inyectar el
aceite por vía intracutánea en una dosis de 0,2 mL en 1 O sitios por animal y observar los animales a las 24, 48 y 72 horas
después de la inyección. Calificar las observaciones en cada sitio con la escala numérica indicada en la Tabla 2. Para los 3 cone-
jos o cobayos (30 ó 18 sitios de inyección), en cualquier momento de observación, la respuesta promedio para eritema no es
mayor de 0,5 y para edema no es mayor de 1,0; y ningún sitio muestra una reacción tisular de más de 1O mm de diámetro
general. El residuo de aceite en el lugar de la inyección no debe confundirse con edema. El tejido edematoso se blanquea al
presionarlo suavemente.]
Tabla 2. Evaluación de las Reacciones Cutáneasª
Eritema y Formación de Escaras Puntaje
Ausencia de eritema o
Eritema muy leve (apenas perceptible) 1
Eritema bien definido 2
Eritema de moderado a grave 3
Eritema grave (rojo intenso) a leve formación de escaras (lesiones profundas) 4
Formación de Edemab Punta je
Ausencia de edema o
Edema muy leve (apenas perceptible) 1
Edema leve (los bordes están bien definidos con una elevación clara) 2
Edema moderado (aproximadamente 1 mm de elevación) 3
Edema grave (más de 1 mm de elevación y extendido más allá del área de exposición) 4
ª Draize JH, Woodward G, Calvery HO. Methods far the study of irritation and toxicity of substances applied topically to the skin and mucous membranes. j
Pharmaco/ Exp Ther 1944;82:377-390.
b Excluye edemas no inflamatorios (mecánicos) del blanco o líquido de extracción.

Aparatos-Los aparatos requeridos para las pruebas incluyen los siguientes.

AUTOCLAVE-Usar un autoclave capaz de mantener una temperatura de 121 º ± 2,0º, equipado con un termómetro, un medi-
dor de presión, una llave de ventilación, una gradilla adecuada para acomodar los recipientes de prueba por encima del nivel
del agua y un sistema enfriador de agua que permita enfriar los recipientes de prueba hasta aproximadamente, pero no por
debajo de 20º inmediatamente después del ciclo de calentamiento.
ESTUFA-Usar una estufa, preferentemente un modelo de circulación forzada, que mantenga las temperaturas de funciona-
miento de 50º o 70º ±2º.
RECIPIENTES DE EXTRACCIÓN-Usar únicamente recipientes, como ampollas o tubos de ensayo para cultivo de vidrio Tipo 1 con
tapa de rosca. En caso de usarse, los tubos de ensayo para cultivo deben cerrarse con tapas de rosca que tengan revestimien-
tos elastoméricos adecuados. La superficie expuesta del revestimiento elastomérico está completamente protegida con un dis-
co sólido inerte con un espesor de 0,05-0,075 mm. Puede fabricarse un disco adecuado a partir de una resina de teflón.
Preparación del Aparato-Limpiar minuciosamente todos los elementos de vidrio con mezcla limpiadora de ácido crómico
o, si fuera necesario, con ácido nítrico caliente y luego enjuagar con agua durante un tiempo prolongado. Limpiar los utensi-
lios para cortar con un método adecuado (por ejemplo, limpieza sucesiva con acetona y cloruro de metileno) antes de utilizar-
los para subdividir una muestra. Limpiar todos los demás equipos cepillándolos minuciosamente con un detergente adecuado
y enjuagar con agua durante un tiempo prolongado.
Esterilizar y secar los recipientes y equipos utilizados para la extracción, transferencia y administración de material de prueba
con un proceso adecuado. [NOTA-Si se usa óxido de etileno como agente esterilizante, dejar transcurrir el tiempo suficiente
para la desgasificación total.]
Procedimiento-
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA-Tanto la Prueba de Inyección Sistémica como la Prueba lntracutánea pueden realizarse utilizando
el mismo extracto, si se desea, o bien pueden utilizarse extractos diferentes para cada prueba. Seleccionar y subdividir en por-
ciones una Muestra del tamaño indicado en la Tabla 3. Eliminar las partículas, como pelusas y partículas sueltas, tratando cada
Muestra subdividida o Control Negativo del siguiente modo. Colocar la Muestra en una probeta graduada limpia de 100 mL
con tapón de vidrio Tipo 1 y agregar aproximadamente 70 mL de Agua para Inyección. Agitar aproximadamente 30 segundos y
escurrir el agua. Repetir este paso y secar las piezas preparadas para la extracción con Aceite Vegetal en una estufa a una tem-
peratura máxima de 50º. [NOTA-No limpiar la Muestra con un paño seco o húmedo ni enjuagando o lavando con un disol-
vente orgánico, agente tensoactivo, etc.]
190 (88) Pruebas de Reactividad Biológica, In Vivo/ Pruebas Biológicas USP 40

Tabla 3. Superficie de la Muestra a Utilizar"

Cantidad de Muestra por cada 20 ml de Medio de
Forma del Material Espesor Extracción Subdividida en
Equivalente a 120 cm 2 de superficie total (ambos lados Tiras de aprox. 5 x
Película o lámina <0,5 mm combinados) 0,3 cm
Equivalente a 60 cm 2 de superficie total (ambos lados
0,5-1 mm combinados)
Longitud (en cm) = 120 cm 2 /(suma de las circunferencias Secciones de aprox.
Tubos <0,5 mm (pared) del DI y DE) 5x0,3cm
Longitud (en cm)= 60 cm 2 /(suma de circunferencias del
0,5-1 mm (pared) DI y DE)
Placas, tubos y elementos moldea- Equivalente a 60 cm 2 de superficie total (todas las superfi- Piezas hasta aprox. 5
dos >l mm cíes expuestas combinadas) x 0,3 cm
Equivalente a 25 cm2 de superficie total (todas las superfi- No subdividirb
Elastómeros >l mm cíes expuestas combinadas)
ª Cuando la superficie no se puede determinar debido a la configuración de la muestra, usar O, 1 g de elastómero o 0,2 g de plástico u otros polímeros por cada
ml de líquido de extracción.
b Los cierres elastoméricos moldeados se prueban intactos.

PREPARACIÓN DE EXTRACTOS-Colocar una Muestra debidamente preparada para su análisis en un recipiente de extracción y
agregar 20 ml del medio de extracción adecuado. Repetir estas indicaciones para cada medio de extracción requerido para la
prueba. Preparar también un blanco de 20 ml de cada medio para inyecciones paralelas y comparaciones. Extraer calentando
en un autoclave a 121 ºdurante 60 minutos, en una estufa a 70º durante 24 horas o a 50º durante 72 horas. Dejar transcurrir
suficiente tiempo para que el líquido que se encuentra dentro del recipiente alcance la temperatura de extracción. [NOTA-Las
condiciones de extracción no deberían en ningún caso causar cambios físicos, como fusión o ablandamiento de los trozos de
Muestra, lo cual provocaría una reducción de la superficie disponible. Puede tolerarse una ligera adherencia de los trozos. Agre-
gar siempre las piezas limpias al medio de extracción en forma individual. Si se utilizan tubos para cultivo para extracciones en
autoclave con Aceite Vegetal, sellar las tapas de rosca en forma adecuada con cinta sensible a la presión.]
Enfriar hasta una temperatura cercana a la ambiente pero no inferior a 20º, agitar vigorosamente durante varios minutos y
decantar cada extracto de inmediato en un recipiente seco estéril, tomando las precauciones asépticas pertinentes. Almacenar
los extractos a una temperatura de 20º-30º y no utilizar para las pruebas después de transcurridas 24 horas. Es importante el
contacto del medio de extracción con la superficie disponible del plástico y el tiempo y la temperatura durante la extracción, el
enfriamiento adecuado, la agitación y el proceso de decantación, así como la manipulación y almacenamiento aséptico de los
extractos después de la extracción.

PRUEBA DE INYECCIÓN SISTÉMICA

Esta prueba está diseñada para evaluar respuestas sistémicas a los extractos de materiales en análisis después de su inyección
en ratones. Pueden usarse vías alternativas de inyección, si se justifican.
Animales de Prueba-Utilizar ratones albinos sanos que pesen de 17-23 g y que no hayan sido utilizados previamente.
Para cada grupo de prueba, utilizar únicamente ratones del mismo origen. Suministrar agua y comida ad líbitum, del tipo nor-
malmente utilizado para animales de laboratorio y de composición conocida.
Procedimiento-[NOTA-Agitar cada extracto vigorosamente antes de retirar las dosis de inyección para asegurar la distri-
bución uniforme de la materia extraída.] Inyectar a cada uno de los cinco ratones del grupo de prueba la Muestra o el Blanco
según se indica en la Tabla 4, excepto que se debe diluir cada g del extracto de la Muestra preparada con Polietilenglicol 400 y
el Blanco correspondiente con 4, 1 volúmenes de Inyección de Cloruro de Sodio para obtener una solución con una concentra-
ción de aproximadamente 200 mg de polietilenglicol por ml.
Tabla 4. Procedimiento de Inyección-Prueba de Inyección Sistémica
Extracto o Blanco Dosis por kg Víaª
Inyección de Cloruro de Sodio 50 mL IV
Solución 1 en 20 de Alcohol en Inyección de Cloruro de Sodio 50 mL IV
Polietilenglicol 400 10 g IP
Vehículo del producto farmacéutico (cuando corresponda) 50 mL IV
50 mL IP
Aceite Vegetal 50 mL IP
ª IV= intravenosa (muestra acuosa y blanco); IP = intraperitoneal (muestra oleaginosa y blanco).
Observar a los animales de inmediato después de la inyección, nuevamente 4 horas después de la inyección y luego a las 24,
48 y 72 horas como mínimo. Si durante el período de observación ninguno de los animales tratados con el extracto de la
Muestra evidencia una reactividad biológica significativamente mayor que los animales tratados con el Blanco, la Muestra cum-
 USP 40 Pruebas Biológicas/ (88) Pruebas de Reactividad Biológica, In Vivo 191

ple con los requisitos de esta prueba. Si dos o más ratones mueren, o si se produce una conducta anormal, como por ejemplo
convulsiones o postración, en dos o más ratones, o si se registra una pérdida de peso de más de 2 g en tres o más ratones, la
Muestra no cumple con los requisitos de la prueba. Si cualquiera de los animales tratados con la Muestra sólo presenta signos
leves de reactividad biológica y no más de un (1) animal presenta síntomas de marcada reactividad biológica o muere, repetir
la prueba utilizando grupos de 1 O ratones. Al repetir la prueba, los 1 O animales tratados con la Muestra no presentan reactivi-
dad biológica significativa superior a la de los animales tratados con el Blanco durante el período de observación.

PRUEBAINTRACUTÁNEA

Esta prueba está diseñada para evaluar las respuestas locales a los extractos de materiales en análisis después de su inyección
intracutánea en conejos o cobayos.
Animales de Prueba-Seleccionar conejos o cobayos sanos que puedan esquilarse bien y cuya piel esté libre de irritación o
traumatismos mecánicos. Al manipular los animales, evitar tocar los sitios de la inyección durante los períodos de observación,
salvo para discriminar entre edema y residuos de aceite.
Procedimiento-[NOTA-Antes de retirar las dosis de inyección, agitar cada extracto vigorosamente para asegurar la distri-
bución uniforme de la materia extraída.] El día de la prueba, esquilar bien el lomo del animal a ambos lados de la columna
vertebral sobre un área de prueba suficientemente grande. Evitar la irritación y los traumatismos mecánicos. Eliminar los pelos
sueltos mediante aspiración. Si fuera necesario, frotar la piel ligeramente con un hisopo humedecido en alcohol diluido y secar
antes de aplicar la inyección. Puede utilizarse más de un extracto de un determinado material por conejo o cobayo, siempre y
cuando se haya determinado que los resultados de la prueba no se verán afectados. Para cada Muestra utilizar dos animales e
inyectar a cada uno por vía intracutánea, utilizando un lado del animal para la Muestra y el otro lado para el Blanco, según se
indica en la Tabla 5. [NOTA-Diluir cada g del extracto de la Muestra preparada con Polietilenglicol 400 y el Blanco correspon-
diente, con 7,4 volúmenes de Inyección de Cloruro de Sodio para obtener una solución con una concentración de aproximada-
mente 120 mg de polietilenglicol por mL.]
Tabla 5. Prueba lntracutánea
Número de Sitios Dosis
Extracto o Blanco (por animal) (µL por sitio)
Muestra 5 200
Blanco 5 200

Examinar los sitios de inyección en busca de evidencia de cualquier reacción del tejido, como por ejemplo eritema, edema y
necrosis. En caso de ser necesario, frotar la piel ligeramente con un hisopo con alcohol diluido para facilitar la lectura de los
sitios de inyección. Observar a todos los animales 24, 48 y 72 horas después de la inyección. Calificar las observaciones en una
escala numérica para el extracto de la Muestra y para el Blanco, utilizando la Tabla 2. Volver a esquilar el pelaje según sea nece-
sario durante el período de observación. Se determinan los puntajes promedio de eritema y edema para los sitios de la Muestra
y el Blanco en cada periodo de observación (24, 48 y 72 horas) para cada conejo o cobayo. Después del puntaje de las 72
horas, todos los puntajes de eritema más los puntajes de edema se suman por separado para cada Muestra y Blanco. Dividir
cada uno de los totales por 12 (2 animales x 3 períodos de observación x 2 categorías de puntaje) para determinar el puntaje
medio de cada Muestra frente al de cada Blanco correspondiente. Los requisitos de la prueba se cumplen si la diferencia entre
el puntaje medio de la Muestra y del Blanco es de 1,0 o menos. Si en cualquier período de observación, la reacción promedio a
la Muestra es cuestionablemente mayor que la reacción promedio al Blanco, repetir la prueba utilizando tres conejos o cobayos
adicionales. Los requisitos de la prueba se cumplen si la diferencia entre el puntaje medio de la Muestra y el Blanco es de 1,0 o
menos.

PRUEBA DE IMPLANTACIÓN

La prueba de implantación está diseñada para la evaluación de materiales plásticos y otros materiales poliméricos que están
en contacto directo con tejido vivo. Es importante la preparación adecuada de las tiras de implante y su adecuada implanta-
ción en condiciones asépticas. Se requieren conejos adultos saludables de Nueva Zelanda para la prueba de implantación intra-
muscular. Las muestras de prueba se colocan dentro de agujas para ser implantadas. Aunque la mayoría de los materiales se
ajustan fácilmente a este método, existen algunos materiales que son inadecuados para la implantación intramuscular. El mo-
delo de implantación subcutánea en ratas es una alternativa factible para materiales cuyas características físicas son inadecua-
das para la implantación intramuscular de rutina.

Implantación Intramuscular en Conejos

Preparar para implantación 8 tiras de la Muestra y 4 tiras de ER Polietileno de Alta Densidad USP. Cada tira debe medir no
menos de 1 O mm x 1 mm. Los bordes de las tiras deben ser tan lisos como sea posible para evitar traumatismos mecánicos
adicionales durante la implantación. Las tiras del tamaño mínimo especificado se implantan con una aguja hipodérmica (cali-
bre 15-19) con una punta intravenosa y un trocar estéril. Utilizar agujas previamente esterilizadas dentro de las cuales se inser-
192 (88) Pruebas de Reactividad Biológica, In Vivo/ Pruebas Biológicas USP 40

tan asépticamente las tiras de plástico estériles o insertar cada tira limpia en una aguja cuya cánula y conector hayan sido pro-
tegidos con una cubierta adecuada y sometidos posteriomente al proceso de esterilización adecuado. [NOTA-Permitir la des-
gasificación adecuada si se usan agentes como óxido de etileno.]
Animales de Prueba-Seleccionar conejos adultos sanos con un peso de al menos 2,5 kg y cuyos músculos paravertebrales
sean lo suficientemente grandes para permitir la implantación de las tiras de prueba. No utilizar ningún tejido muscular que no
sea el sitio paravertebral. Los animales deben anestesiarse con un agente anestésico de uso común hasta un grado suficiente
como para evitar los movimientos musculares, como espasmos. Ver las pautas de la Asociación Internacional para la Evaluación
y Acreditación del Cuidado de Animales de Laboratorio (AAALAC, por sus siglas en inglés).
Procedimiento-Realizar la prueba en un área limpia. El día de la prueba, o hasta 20 horas antes del análisis, esquilar a los
animales a ambos lados de la columna vertebral. Eliminar los pelos sueltos mediante aspiración. Frotar la piel ligeramente con
un hisopo con alcohol diluido y secar antes de aplicar la inyección.
Implantar cuatro tiras de la Muestra en el músculo paravertebral a un lado de la columna de cada uno de dos conejos, 2,5-5
cm respecto a la línea media y en forma paralela a la columna vertebral, con una separación de aproximadamente 2,5 cm
entre sí. De manera similar, implantar dos tiras de ER Polietileno de Alta Densidad USP en el músculo opuesto de cada animal.
Insertar un estilete estéril en la aguja para sostener la tira de implante en el tejido mientras se extrae la aguja. En caso de obser-
var sangrado excesivo después de implantar una tira, colocar una tira duplicada en otro lugar.
Mantener los animales durante 120 horas como mínimo y luego sacrificarlos al final del período de observación, adminis-
trándoles una sobredosis de un agente anestésico u otros agentes adecuados. Dejar transcurrir suficiente tiempo para cortar el
tejido sin que se presente sangrado. Examinar macroscópicamente el área del tejido que rodea la porción central de cada tira
de implante. Utilizar una lente de aumento y una fuente de luz auxiliar. Observar los sitios de implante de la Muestra y del
Control para detectar la presencia de hemorragia, necrosis, cambio de color e infecciones y registrar las observaciones. Medir la
encapsulación, si la hubiera, registrando el ancho de la cápsula (desde la periferia del espacio ocupado por el implante Control
o Muestra hasta la periferia de la cápsula) redondeado a la décima de mm. Calificar la encapsulación según se indica en la
Tabla 6.
Tabla 6. Evaluación de la Encapsulación en la Prueba de Implantación
Ancho de la Cápsula Puntaje
Ninguna o
Hasta 0,5 mm 1
0,6-1,0 mm 2
1,1-2,0 mm 3
Más de 2,0 mm 4

Calcular las diferencias entre puntajes promedio para los sitios de la Muestra y el Control. Los requisitos de la prueba se cum-
plen si la diferencia no es mayor de 1,0, o si la diferencia entre los puntajes medios de la Muestra y el Control para más de uno
de los cuatro sitios de implantación no es mayor de 1 en cualquiera de los animales implantados.

Prueba de Implantación Subcutánea en Ratas

Preparar para implantación 1O muestras de prueba y 1O muestras control. El tamaño y la forma de las muestras control de-
ben ser lo más parecido posible a los de las muestras de prueba. Por ejemplo, las muestras preparadas en láminas deben tener
un diámetro de 10-12 mm y un espesor de 0,3-1 mm. Los bordes de las muestras deben ser tan lisos como sea posible para
evitar traumatismos mecánicos adicionales durante la implantación.
Animales de Prueba-Seleccionar ratas albinas saludables con un peso entre 225-350 g al momento de la implantación.
Procedimiento-Realizar la prueba en un área limpia. Anestesiar (ver las pautas de la AAALAC) al animal hasta lograr un
plano quirúrgico. Esquilar el pelaje de los animales en ambos lados de la columna vertebral. Retirar los pelos sueltos mediante
aspiración. Limpiar el área esquilada con solución de yodo-povidona. Usando una técnica aséptica, realizar dos incisiones en la
línea media (de aproximadamente 1,0 cm de largo) a través de la piel en las regiones craneal y caudal sobre la superficie dor-
sal. Mediante disección roma, separar la fascia que conecta la piel con el músculo para formar una bolsa debajo de la piel late-
ral a cada costado de la incisión (la base de la bolsa es de aproximadamente 20 mm a partir de la línea del implante). Insertar
una muestra estéril en cada bolsa y cerrar la incisión mediante sutura o ganchos quirúrgicos. Implantar dos muestras de prue-
ba y dos muestras control en cada una de cinco ratas. Mantener a los animales durante un periodo de al menos siete días y
sacrificarlos al final del periodo de observación mediante hipoxia inducida por C0 2 o administrando una sobredosis de un
agente anestésico. Dejar transcurrir un tiempo suficiente para que el tejido pueda cortarse sin que sangre. Cortar longitudinal-
mente la piel (superficie dorsal) y levantarla. Examinar macroscópicamente y con cuidado el área del tejido que rodea el im-
plante. Cortar la muestra por la mitad y retirarla para examinar de cerca el tejido que está en contacto directo con la muestra.
Usar una lente de aumento y una fuente de luz auxiliar, si fuera apropiado. Observar los sitios de implante de la Muestra y del
Control en busca de hemorragias, necrosis, cambio de color e infecciones y registrar las observaciones. Medir la encapsulación,
si la hubiera, registrando el ancho de la cápsula (desde la periferia del espacio ocupado por el implante Control o Muestra hasta
la periferia de la cápsula) redondeando a la décima de mm. Registrar el puntaje de la encapsulación de acuerdo con la Tabla 6.
USP 40 Pruebas Biológicas/ (89) Enzimas 193

Calcular las diferencias entre los puntajes promedio para los sitios de la Muestra y el Control. Los requisitos de la prueba se
cumplen si la diferencia no excede de 1,0.

PRUEBAS DE SEGURIDAD-PRODUCTOS BIOLÓGICOS

La prueba de seguridad aquí descrita está diseñada para detectar cualquier reactividad biológica imprevista e inaceptable en
un artículo. Esta prueba in vivo es para la evaluación de la seguridad de los productos obtenidos por biotecnología.

Prueba de Seguridad

Seleccionar cinco ratones sanos que no hayan sido utilizados previamente para pruebas y que pesen de 17-23 g, a menos
que se indique algo diferente en la monografía individual correspondiente o en otra parte de este capítulo, mantenidos con
una dieta equilibrada adecuada. Preparar una solución de prueba según las indicaciones de la monografía individual corres-
pondiente. A menos que se indique lo contrario en la monografía individual o en otra parte de este capítulo, inyectar una dosis
de 0,5 mL de la solución de prueba a cada uno de los ratones, utilizando una aguja de calibre 26 de la longitud adecuada o de
la longitud especificada a continuación, según corresponda. Observar a los animales durante las 48 horas posteriores a la in-
yección. Si al cabo de las 48 horas todos los animales sobreviven y no más de uno de los animales presenta síntomas externos
de una reacción inesperada debido al nivel de toxicidad relacionado con el artículo, se cumplen los requisitos de esta prueba.
Si uno o más animales mueren o si más de uno de los animales presenta signos de toxicidad anormal o indebida del artículo
en análisis, repetir la prueba utilizando al menos otros 1 O ratones similares a los utilizados para la prueba inicial pero con un
peso de 20 ± 1 g. En cualquiera de los casos, si todos los animales sobreviven durante 48 horas y no presentan síntomas de
una reacción indicativa de un nivel de toxicidad anormal o indebido del artículo, se cumplen los requisitos de la prueba. De-
ben obtenerse los pesos corporales de los ratones antes de la prueba y al finalizarse para detectar cualquier efecto inapropiado.
Los animales que presenten signos de toxicidad deberán someterse a una necropsia completa y a estudios de histopatología, si
fuera necesario.
Para los productos biológicos, realizar la prueba según los procedimientos que se describen en el Código de Reglamentos Fe-
derales, Sección 61 O.11 .

(89) ENZIMAS USADAS COMO MATERIALES AUXILIARES EN LA

FABRICACIÓN DE PRODUCTOS FARMACÉUTICOS

INTRODUCCIÓN
El propósito de este capítulo es describir los atributos de calidad y las pruebas relacionadas con los criterios de aceptación para
preparaciones enzimáticas usadas en la fabricación de productos biofarmacéuticos. La calidad de los materiales auxiliares,
incluyendo enzimas, usados en la fabricación de productos biofarmacéuticos puede tener un impacto sobre los productos
terapéuticos. Se usan diversas enzimas en este tipo de procesamiento celular. Los ejemplos incluyen tripsina, colagenasa,
pepsina y papaína. Este capítulo no trata las aplicaciones de dichas enzimas, sino que se enfoca en las pruebas para evaluar
su calidad como materiales del proceso.
Tripsina Recombinante
IVGGYTCAAN SIPYQVSLNS GSHFCGGSLI NSQWVVSAAH CYKSRIQVRL
GEHNID~ NEQFINAAKI ITHPNFNGNT LDNDIMLIKL SSPATLNSRV
ATVSLPRSCA AAGTECLISG WGNTKSSGSS YPSLLQ¿LKA PVLSDSSCKS
SYPGQITG~ ICVGFLEGGK OSCQGDSGGP VVCNGOLQGI VSWGYGCAQK
NKPGVYTKVC NYVNWIOOTI AAN

C1020H1s91N2s1Ü321 S,4
23 463 (para /J-Tripsina)
[9002-07-7].
DEFINICIÓN
La tripsina recombinante, una materia prima clave para la fabricación de productos biofarmacéuticos, es una serina proteasa
que rompe cadenas de péptidos principalmente en el extremo carboxílico de los aminoácidos arginina y lisina. La secuencia
de aminoácidos de la tripsina recombinante es idéntica a la de la tripsina de páncreas porcino y la tripsina recombinante se
produce usando métodos basados en tecnología de ADN recombinante en la levadura Pichia pastoris. Por lo tanto, las espe-
cificaciones descritas en este capítulo aplican únicamente a la tripsina porcina recombinante producida en levadura. Debido
al proceso de producción recombinante, la tripsina recombinante está exenta de quimotripsina. Se conocen dos formas acti-
vas de tripsina: f3 -tripsina (23 463 daltones) y a-tripsina (23 481 daltones). La autólisis de la f3 -tripsina en el enlace peptídi-
co entre Arg99 y Val1ºº, Lys12s y Ser12 6 o Lys 1l 9 y Ala 14º resulta en tres isoformas posibles de a-tripsina. Todas las isoformas se
mantienen unidas mediante puentes disulfuro y se conservan correctamente dobladas. Como consecuencia de la hidrólisis
 194 (89) Enzimas / Pruebas Biológicas USP 40

de un enlace peptídico, el peso molecular de a-tripsina es mayor que el de f3 -tripsina por 18 daltones. El área del pico de f3 -
tri psi na es no menos de 70% y el área del pico de a-tripsina es no más de 20%, según se determinan en el procedimiento
de HPLC descrito en la prueba de Pureza. La actividad específica es no menos de 180 Unidades/mg de proteína usando ace-
tato de carbobenzoxi-valil-glicil-arginina-4-nitril-anilida como el sustrato descrito en la Valoración.
[NOTA-Una Unidad de actividad de tripsina usando acetato de carbobenzoxi-valil-glicil-arginina-4-nitril-anilida como el sustra-
to corresponde a 21 Unidades USP de Tripsina. Una Unidad USP de Tripsina es la actividad que causa un cambio en la absor-
bancia de 0,003 por minuto en las condiciones especificadas en la Valoración de la monografía de Tripsina Cristalizada usan-
do clorhidrato del éster etílico de N-benzoil-L-arginina como sustrato. Por ende, la actividad específica de 180 Unidades/mg
de proteína usando acetato de carbobenzoxi-valil-glicil-arginina-4-nitril-anilida como sustrato para tripsina recombinante co-
rresponde a 3800 Unidades USP de Tripsina/mg de proteína.]

IDENTIFICACIÓN
• A. Cumple con los requisitos de la Valoración.
• B. El tiempo de retención del pico principal de f3 -tripsina en la Solución muestra corresponde al de la Solución estándar, se-
gún se obtienen en la prueba de Pureza.

VALORACIÓN
• PROCEDIMIENTO
Solución amortiguadora: Disolver 1,21 g de tris(hidroximetil)aminometano y 0,29 g de cloruro de calcio dihidrato en 100
mL de agua, y ajustar con ácido clorhídrico 2 N a un pH de 8,0 (a 25 ± 1º).
Solución madre de sustrato: Disolver 20 mg de acetato de carbobenzoxi-valil-glicil-arginina-4-nitril-anilida1, pesado con
exactitud, en 3,0 mL de agua. [NOTA-Usar únicamente una solución recientemente preparada.]
Solución de sustrato: Preparar una solución mezclando 28 mL de Solución amortiguadora y 2,8 mL de Solución madre de
sustrato. [NOTA-Usar únicamente una solución recientemente preparada.]
Soluciones estándar: Enfriar previamente el ER Tripsina Porcina Recombinante USP y el agua hasta aproximadamente 4º.
Comenzar a preparar las Soluciones estándar inmediatamente cuando la temperatura haya alcanzado 4º. Preparar cada So-
lución estándar diluyendo ER Tripsina Porcina Recombinante USP con agua hasta obtener una dilución 1:68 921. Preparar al
menos cinco Soluciones estándar en paralelo. Valorar cada Solución estándar por duplicado. [NOTA-Usar una micropipeta
ajustable para cada medición y dilución. Usar tubos de ensayo de poliestireno para preparar las Soluciones estándar y las
Soluciones muestra, y usar puntas de pipeta de poliestireno que contengan filtros de polietileno para transferir las muestras.
La punta de pipeta no debe mojarse antes de la transferencia y cada punta debe usarse sólo para transferir una muestra.]
[NOTA-Se puede lograr una dilución 1 :68 921 mediante tres etapas de dilución sucesivas en las que cada etapa tiene una
dilución 1 :41 (1 :41 /1 :41 /l :41 ). Por ejemplo, para la dilución inicial, extraer O, 1 mL de ER Tripsina Porcina Recombinante
USP usando una micropipeta con punta de poliestireno que contenga filtros de polietileno, limpiar la parte externa de la
punta para eliminar cualquier residuo de solución y agregar el Estándar de Referencia a un tubo de ensayo de poliestireno
que contenga 4,0 mL de agua previamente enfriada, enjuagar la punta pipeteando la solución hacia arriba y hacia abajo 2-
3 veces, desechar la punta y mezclar la solución en un mezclador de vórtice durante aproximadamente 2 segundos a máxi-
ma velocidad. Para la segunda y tercera etapa de dilución, proceder según se describe para la dilución inicial, excepto que
se debe transferir O, 1 mL de solución de la etapa de dilución previa.]
Soluciones muestra: Preparar al menos cinco Soluciones muestra de tripsina recombinante en paralelo según se indica en
Soluciones estándar para obtener una concentración final de al menos O, 16 Unidades/mL usando agua previamente enfria-
da como diluyente. Cada Solución muestra se valora por duplicado.
Condiciones instrumentales
(Ver Espectroscopía Ultravioleta-Visible (857).)
Modo: UV
Longitud de onda analítica: 405 nm
Longitud de paso: 1 cm
Temperatura: 25º
Análisis
Muestras: Soluciones estándar y Soluciones muestra
Transferir 1, 1O mL de Solución de sustrato a una semi-microcubeta de poliestireno, dejar que la temperatura se estabilice,
verificar la temperatura especificada en la cubeta y esperar durante 1O minutos. Comenzar la reacción agregando 0,020
mL de Solución estándar o Solución muestra. Registrar la absorbancia durante al menos 5 minutos y determinar el cambio
en la absorbancia (L'lA/min) a partir del intervalo lineal de la reacción.
Calcular la actividad de tripsina recombinante en Unidades/mL:
Resultado= [Vrf(i; x V x B)] x (M/min) x O

Vr = volumen de la mezcla de reacción, 1, 12 mL

¡; =coeficiente de extinción para 405 nm, 10,4 (mmol-1 · 1 cm-1)

1 Un acetato de carbobenzoxi-valil-glicil-arginina-4-nitril-anilida adecuado es Chromozym TRY de Roche Applied Science (Nº de catálogo 10378496103) o equiva-
lente.
USP 40 Pruebas Biológicas/ (89) Enzimas 195

V =volumen de la Solución estándar o la Solución muestra, 0,020 mL

B = longitud de paso de absorción, 1 cm
D = factor de dilución
[NOTA-Una unidad liberará el equivalente a 1 mmol de 4-nitril anilina a partir de acetato de carbobenzoxi-valil-glicil-argini-
na-4-nitril-anilida por minuto en las condiciones de la Valoración.]
Calcular la actividad específica de tripsina recombinante en Unidades/mg de proteína:
Resultado= Actividad/C
C = concentración de proteína en la tripsina recombinante (mg/mL)
Aptitud del sistema
Muestras: Soluciones estándar y Soluciones muestra
Requisitos de aptitud: L1A/min debe ser 0,03-0,07 para las Soluciones estándar y las Soluciones muestra. La actividad pro-
medio calculada para las Soluciones estándar es de 90%-110% del valor en la etiqueta.
Criterios de aceptación
Actividad específica: No menos de 180 Unidades/mg de proteína
Desviación estándar relativa: No más de 5% para las actividades determinadas a partir de 5 determinaciones repetidas

PUREZA
• PROCEDIMIENTO
Solución A: Diluir 1 mL de ácido fosfórico (85%) con agua hasta 1000 mL.
Solución B: Diluir 1 mL de ácido fosfórico (85%) con acetonitrilo hasta 1000 ml.
Fase móvil: Ver la Tabla 7.
Tabla 1
Tiempo Solución A Solución B
(mln) (%) (%)
o 75 25
25 55 45
30 10 90
34 10 90
35 75 25
45 75 25

Solución estándar: Descongelar 100 µL de ER Tripsina Porcina Recombinante USP a temperatura ambiente durante apro-
ximadamente 1 hora, mezclar y transferir a un vial para HPLC. La concentración deseada de la proteína debe ser 70±1 O
mg/ml.
Solución muestra: Descongelar 100 µL de tripsina recombinante a temperatura ambiente durante 1 hora, mezclar y trans-
ferir a un vial para HPLC. La concentración deseada de la proteína debe ser 70 ± 1O mg/ml.
[NOTA-Mantener la Solución estándar y la Solución muestra a 2º-8º si no están listas para ser inyectadas inmediatamente des-
pués de su preparación.]
Sistema cromatográfico
(Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
Detector: UV 280 nm
Columna: 4,6 mm x 25 cm; relleno L1 de 3 µm con un tamaño de poro de 200 A
Temperatura de la columna: 40º
Velocidad de flujo: 1,0 mL/min
Volumen de inyección: 1 µL
Aptitud del sistema
Muestra: Solución estándar
[NOTA-El tiempo de retención del pico principal de tripsina recombinante es 12-17 minutos.]
Requisitos de aptitud
Resolución: No menos de 1 entre los picos de a-tri psi na y f3 -tripsina
Análisis
Muestra: Solución muestra
Registrar los cromatogramas y medir las áreas de los picos. Evaluar la pureza de la tripsina usando el método de área-%. El
tiempo de integración es de 25 minutos. El blanco debe considerarse para la integración. Los picos que no se separan
completamente y eluyen antes del pico de a-tripsina se integran mediante una línea perpendicular únicamente si se for-
ma un mínimo. Los picos que no se separan completamente y eluyen luego del pico de f3 -tripsina se integran tangencial-
mente únicamente si se forma un mínimo.
196 (89) Enzimas / Pruebas Biológicas USP 40

Criterios de aceptación: No menos de 70% para el área del pico de f3 -tripsina y no más de 20% para el área del pico de
a-tri psi na

PRUEBAS ESPECÍFICAS
• CONTENIDO DE PROTEÍNA
Solución de ácido clorhídrico 4 N: Mezclar 10,4 mL de ácido clorhídrico al 25% con 9,6 mL de agua.
Solución amortiguadora de almacenamiento: Disolver 2,9 g de cloruro de calcio dihidrato en agua, agregar 2,5 mL de
Solución de ácido clorhídrico 4 N y diluir con agua hasta un volumen final de 1000 ml. Ajustar con Solución de ácido clorhídri-
co 4 Na un pH de 2,0 ± 0,2, si fuera necesario.
Soluciones muestra: Agregar 0,025 mL de tripsina recombinante a 3 mL de Solución amortiguadora de almacenamiento.
Preparar al menos por triplicado.
Solución blanco: Solución amortiguadora de almacenamiento, 3 mL
Condiciones instrumentales
(Ver Espectroscopía Ultravioleta-Visible (857).)
Modo: UV
Longitud de onda analítica: 280 nm
Longitud de paso: 1 cm
Aptitud del sistema
Muestra: Soluciones muestra
Requisitos de aptitud: ~A (según se define a continuación) está en el intervalo de O, 13-1,8.
Análisis
Muestras: Soluciones muestra y Solución blanco
Calcular la concentración de proteína en mg/mL:

l
Resultado ~ A
(MxF) -
1% x O
2801cm

= absorbancia de la Solución muestra

= absorbancia de la Solución blanco
=factor de conversión de 1% a mg/mL, 1O
= coeficiente de extinción para tripsina, 1 3,6
D =factor de dilución
• PRUEBAS DE RECUENTO MICROBIANO (61 ): El recuento total bacteriano no excede de 100 ufc/mL, realizando la prueba en 1
mL de tripsina recombinante por duplicado.

REQUISITOS ADICIONALES
• ENVASADO v ALMACENAMIENTO: Almacenar en envases cerrados a -15º a -25º.
• ETIQUETADO: El etiquetado indica que el material es de origen de ADN recombinante, junto con el número de producto y el
número de lote, las condiciones de almacenamiento y la fecha de caducidad.
•ESTÁNDARES DE REFERENCIA USP (11)
ER Tripsina Porcina Recombinante USP
USP 40 Pruebas Biológicas / (89 .1) Colagenasa 1 197

Agregar lo siguiente:

·(89 .1) COLAG ENASA 1

lANTNS~1'YD- fEYLN_GLSYT :SlTNL.lt<NlK wNQ!NGLF:N-Y STGSQKf-"FGO

KNRVQAHNA lQESGRTYTA NDMKGIETFT EVlRAGFYLG YYNDGLSYLN
' ORNFQDJ(t;:!j) AMJ!üQKtilffl F!(LGTA~E VITSLGKLIG WA-SANAEVVN
NCVPVLKQF'R ENUtQ:YAPDY VKGTAVNELt KGIEFDFSGA AYEKOVKTMP
WYGK!Ot'FIN ELAALGLYGN ITSAnWASO VGIVYlSKFG LYSTNRNDlV
QSLEKAVDMY KYGKIAfVAM -ERITWOYOGI GSNGl<KVDHD KFLODAE:KHY
LF'KTYTFON~ TFIIRAOOKV SEEKlKRLYW ASREVKSQFH RVVGNOl<ALE
V(;NADOVLTM KIFNSPEEVK FNTNil<JGVST ONGGtYIEf)R GTFYTV'ERTP
QQSIFSLEEl FRHEYTHYLQ ARYlVDGLWG QGPFYEKNRL TWFDE-GTAEF
FAGSTRTSGV LPRKSILGYL AKOJ(VDHRYS 1.-KKTLNSGYD DSOWMFYNYG
i'AVAHYL YEK DMPTFIKMNK ÁXlNTOVKSY OEIIKKLSDO ANKNTEYQNH
IQELAOKYQG AGIPL.VSDDY- LKDHGYKKAS EVYSEISKAA SlTNTSVTAE
KSQYf'NTFTl MTYTGETSK GEF¡.j:('MDEMS KKLOGTLESl AKNSWSGYKT
LTAYF'fNYRV TSDNKVQYVV VFH<lVLTDNA DISN.NKAPlA KVTGPSTGAV
GRNIEFSGKO SKDEDGtHVS YDWDFGOOAT SRGKNSVHAY KKAGTYNVTL
KVTDDKGl\iA TtoSrfIEIKN EOTTTPITKE MEPNDDIKEA NGPlVEGVTV
K<iDLN.GSODA DTFYA:lVJ:OlP GbVTIELPYS GSS.NFfWLVY KEGt:ll)QNHIA
SG!OKNNSKV GIFKSTKGftH YVFIYKHl'.)SA SNI$YSLNIJ< Gt.,GNEKl...l<EK
ENNOSSOKAT VIPN-FNTT"1Q GSLlGDD~RO YY$F-EVKEEG EVNlElJ)KKD
Ef'.G,\ITWTLH~ ESNINDRITY WVOGNKVSt-¡ Kytl:t.RPGKYY ll.VYKYSGSG
tNELRVNK

Cso99H7711N,32901610514
11 3 897 daltons {para subtipo p)
[9001-12-1 ].
DEFINICIÓN
La colagenasa 1(EC 3.4,24.3), aislada de Clostridium histolyticum y codificada por el gen co/G (número de acceso GenBank
BM77453. l ), es una materia prima esencial usada en la disociación.o disgregación de una gran variedad de tipos de tejido.
La colagenasa 1 es una metaloproteasa que actúa como una endoproteasa y presenta también actividad de tripeptiqil carbo-
xipeptidasa. Presenta actividad endopeptídica, con el sitio principal de escisión ubicado frente al dúplex de los aminoácidos
glicina-prolina del colágeno humano. La hidrólisis tiene lugar cerca de los extremos de los dominios triple hélice del coláge-
no.
La colagenasa 1también se conoce como colagenasa de clase 1y consta de tres subtipos: a, p y y. la colagenasa l p es la
enzima de longitud completa mientras que la colagenasa 1a (68 000 Da) y la colagenasa 1y(79000 Da) se consideran pro-
ductos de degradación proteolftica de la colagenasa 1p producidos por otras proteasas presentes en e hístolytícum (princi-
palmente una enzima similar a la tripsina y clostripaína/endc;iproteinasa Arg C).
La colagenasa 1 puede obtenerse como una formulación líquida que contiene ácido N-2-hidroxíetilpiperazína-N'-2-etanosulfó-
nico (HEPES) 5 mM y cloruro de calcio 1 mM de pH 7,5, y es almacenada congelada. La actividad específica de colagenasa 1
es 0, 10-0,60 unidades/mg de proteína, usando 4-fenilazobenciloxicarbonil (PZ)-Pro-Leu-Gly-Pro-o-Arg como el sustrato des-
crito en la Valoración. El área del pico de colagenasa 1es no menos de 90%, según se determina usando el método de HPLC
descrito en la prueba de Pureza. La prueba de Actividad de Clostripaína se usa para eval.uar la actividad de la impureza de
dostripaína y el criterio de aceptación es no más de 0,5 unidades/mg de proteína. La prueba de Actividad de Tripsina se.usa
para evaluar la actividad de la impureza de la enzima similar a la tripsina y el criterio de aceptación es no más de 0,5 unida-
des/mg de proteína.
IDENTIFICACIÓN
•A. Cumple con los requisitos de la Valoración.
• B. El tiempo de retención del pico principal de la Solución muestra corresponde al de la Solución estándar, según se obtienen
en la prueba de Pureza.
VALORACIÓN
• PROCEDIMIENTO
Solución amortiguadora de Tris: Tris O, 1 M de pH 7, 1, que se prepara según se indica a continuación. Disolver 6,05 g de
tris(hidroximetil)aminometano (Tris) en 400 mL de agua y ajustar con ácido clorhídrico 2 N a un pH de 7, 1 (a 25±1 º}.
Diluir con agua a un volumen final de 500 ml.
Solución de sustrato: Disolver 1 O mg de PZ-Pro-Leu-Gly-Pro-o-Arg en 0,2 mL de metano! y diluir esta solución con Solu-
ción amortiguadora de Tris a un volumen final de 10 ml. [NOTA-Usar solo una solución recientemente preparada.]
Solución de cloruro de calcio: O, 1 M, que se prepara según se indica a continuación. Pesar 1,47 g de cloruro de calcio
dihidrato en un matraz volumétrico y dlluir con agua a un volumen final de 100 ml.
Solución de ácido cítrico: 0,025 M, que se prepara según se indica a continuación. Pesar 525 mg de ácido cítrico mo-
nohidrato en un matraz volumétrico y diluir con agua a un volumen final de 100 111L
Mezcla de extracción: Pipetear y transferir 5,0 mL de acetato de etilo y 1,0 mL de Solución de ácido cítrico a un tubo de
ensayo por muestra que se va a analizar. [NOTA-Usar solo una mezcla recientemente preparada.]
198 (89 .1) Colagenasa 1 / Pruebas Biológicas USP 40
USP 40 Pruebas Biológicas / (89 .1) Colagenasa 1 199

TabhJ 1
Tiempo Solución A SoluciónB
(min} (%) (%)
o lOO o
2 100 o
22 85 15
32 o 100
34 100 o
40 100 o
Solución amortiguadora de almaéenamient(I: HEPES 5 mM y cloruro de caldo l mM de pH 7,5, que se prepara según se
indica a continuación. Disolver 1, 19 g de HEPES y 147 mg dedoruro de calcio dínidrato en 900 mL de agua. Ajustar con
solución de hidróxido de sodio 4 N a un pH de 7,5: Dilúir con agua a un .\fofümen final de 1000 ml.
Solución estándar: Descongelar el ER Colagenasa 1 USP a temperatura ambiente poco tiempo antes de usar y mezclar.
Mantener en hielo o a 5º. Diluir con Solución amortiguadora de almacenamiento para obtener una concentración de proteí-
na de 5,5 mg/ml. Transferir a un vial para HPLC y mantener a 5°. Preparar por duplicado e inyectar cada duplicado una
vez.
Solución de colagenasa 11: Descongelar el ER Colagenasa 'll USP a temperatura ambiente poco tiempo antes de usar y
mezclar. Mantener en hielo o a 5.º. Diluir con Solución amortiguadora de JJ/m(lcenarniento para obtener una concentración
de proteína de 5,5 mg/mL. Transferir a un vial para HPLC y mantener a 5°. Preparar por duplicado e inyectar cada duplica-
do una vez.
Solución muestra: Diluir colagenasa 1con Solución amortiguadora de almacenamiento para obtener una concentración de
proteína de 5,5 mg/mly mantener a 5º.
Blanco: Solución amortíguadora de almacenamiento
Sistema cromatográfico
0/er Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
Detector: UV 280 nm
Columna: 5 mm x 5 cm; relleno L91 de 1 O µm
Temperaturas
Columna: 25º
Muestreador automático: 5°
Velocidad de flujo: 1,5 mL/min
Volumen de inyección: 20 µL
Aptitud del sistema
Muestra: Solución estándar
Requisito. de aptitud: El cromatograma de la Sqlución estándar corresponde al· cromatograma típico provisto con el ER
Colagenasa 1 USP.
Análisis
Muestra: Solución muestra
El Blanco debe considerarse para la integración. Identificar el pico correspondiente.a la colagenasa 11 comparando su tiem-
po de retención con el del pico principal de la Solución de colagenosa ll. Evaluar la pureza de la colagenasa l usando el
método de área-%, pero excluyendo los picos asociados con el Blqnco. Todos.los picos qúeno se'separan completamente
y eluyen antes y después del pico principal se integran mediante .una línea perpenditular en los puntos de inflexión, y se
consideran impurezas separadas. No tomar en cuenta los picos con tiempos de .reten1Zión mayores de 25 minutos.
Criterios de aceptación: No menos de 90% para el pico principal de colagenasa 1y no más de 3% de colagenaS:á 11
IMPUREZAS
• ACTIVIDAD DE CLOSTRIPAÍNA
Solución amortiguadora de fosfato de potéilsio: O, 1 Mde pH 7,6, .quí:) se prepara .según se iodíca a continuación, D($ol-
ver.1,36 g de fosfato . monobásico <::le .potasio en agqa y diluir h~ta ·100 m.L Disolver 2,~á g. cie fosfato. c;libásico .d.e potasio
trihidrato en agua y diluir hasta· 100 rnL.•. Aji!star el. pH <;lela sí:)gundi!I sohJciífm a ?,6 con I" primera solución.
Solución de ditiotreitol.: o,194 M, que s~.prepara según ~e tnJ:lica a. 1J:Qntin1,1ac:iófí, Oi.sol.ve.r. 60 mg de ditiot~itol (DTI) en
2 mL de Solución amoHJguadora defosfa~q de pqtasí.o.
Solución de. cloruro de caldo: 0,01 M,.que se p.repara según se indica.acq.ntinuacióo. Di~lver 14.7 mg de cloruro de
cal.do dihiclrato en 1OQ mL de aguá.
Solución madre de sustrato.: ~8 mM, que se prepara ~egún se indit:;a a c:ontím¡ación. Ojsolver 13 mg de clorhidrato de
éster etílico de benzoil-L-arginina (BAEE · HCI) en 1 mL de. Solución amortiguadora de fosfato de potasio,
Solución de sustrato: BAEE · HCI 0,73 mM, DIT 7,8 mMy cloruro de calcio 0,4 mM, que se prepara según se Indica a
continuación. Transferir 0,5 mL de Solución madre de sustrato, 1,0 mL de Solución de ditiotreitoJ y 1,O mL de Solución de
cloruro de calcio a un matraz volumétrico de 25 mL y diltlir c:on Solución amortiguadora de fosfato de potasio a volumen.
200 (89 .1) Colagenasa 1/ Pruebas Biológicas USP 40

Solución muestra: Preparar de manera tal que M/min se encuentre en el intervalo 0,02-0,06. Diluir con Solución amorti-
guadora de fosfatodepotasio helada, si fllera necesario.
Condiciones instrumentales
(Ver Espectroscopía Ultravioleta-Visible (857).)
Modo: UV
Longitud de onda analítka: 255 nm
Longitud de paso: l cm
Temperatura: 25º
Análisis
Muestra: Solución· muestra
Transferir :3,(J m Lde la Solución de sustrato a um1 qµbetay equiJiprar.la.cul::lf;!ta a.25º.lnicia~Ja reacción agreg(}odo (),O;í f'l'll
de la .Soluciónmu~stra.•Ptep(lrar.¡,¡nb~nc9Je.emplazando••'a•··Solución .mvestra cqn . 0,05 .f'l'l~. de.la . solución•.amortiguodora de
fosfato de potasio. fV1ezclarbien..()ete.rf'l'linar elcarnt:liC> en ~bs9rbanqiá (t!A/mín), a partir del• ínteMlio Hrn:~al de la .reacción.
Analizarla SQ/ución muestraportrlplicado,
Aptitud del siste!)'.la
Muestra: SQluciónmvestr(J
Requisito de aptitud: 0,02c...0,06 para M/min
Calcularla.activídad•dedo$tripaínae.nunictá~es/rnlen•láporció11decolagenasa ltof'l'lada:

>: .d!A/rriih>< fJ
Vr =volumen dela mezcla de reacción, 3,05 ml
s ,,,.. coeficiente de. extincíóná2$5.nm1J118l (l .c.rn~. ·mmoF 1)
Vu ""volumen de la Solución muestra, 0,05 ml
B == longitud de paso de absorción, 1 cm
M/min =cambio en absorbancia en el intervalo lineal de la reacción
D ==.factor de dilución
Calcular la actividad específica en unidades/mg de proteína:
Resultado = Actividad/<;
Actividad= actividad de dostripafna (Unidades/ml)
C = concentración de proteína (mg/ml)
Criterios de aceptación: No más de 0,5 ·unidades de actividad de dostripaína por mg de proteína
• ACTIVJDAD DE•TRIPSINA
Solución amortiguadora: Tris O, 1 M y cloruro de calcio 0,02 M de pH 8,0, que se prepara según se indica a<c.ontinuádón.
Disolver 6,05 g de Tris y l ,45 g de. cloruro de cak:io dihidrato en4.00 ml de agua. Ajustar con ácido clor~fdrico 2N a un
pH de 8,0 (a 25 ±lº).Dilüir con agua.a un volumen finatde 500ml.
Sollldon.mádre·de.sustí"áto: Dtsdl\l~r·.lo·mgdeatetato••dec~rbQ!benioxi.~vaUl~glidl~arginina-4,nltlil-anilida, 1 pesadoscon
exactitud, en 1,5 mLde agua; Manteneren hielo. [NOTA-.;Usar solosolución recientemente preparada.J
Solución de sustrato: Preparar Una solución mezclando 9,2 ml de Solución amortiguadora y l,O ml de Solución madre de
sustrato. Mantener en hiefo. [NOTA--'---Usar solo solµdón recientemente preparada.}
Soll.!ciqn· muestra: Soll.íción••ctf,lc;:(fllilgeha$a•I ~in dfluir
cond1d!lneslnstrufl'!el1tales
(Ver·Espedroscop(u·.Uftravio/eta· Visible {8.51).)
Modo: Vis
Longitudde.onda.analíti~a: 405 nm
Lol'lgftud el~ paso; T c.m
Temperatura: 25º
Análisis
Muestra: Soluciónmuestra
Transferir· 1·,Q2 .·rn Ldela Solucíórrt;Je sustrato a.•·ana sellli•lllicroCtíbeta de poll.estireno, detarque la·temperatóra. Se estabilice,
equilibrar ta. cubeta·•a·25°y·esp~ar dür;it'JteJ O•mítl.títbs:•.1rfü:iar.la• reaccioh•agregan¡jo O,JO•.n:\Lde .· 1a•.S(jllieión· muestra.
loiciar a registrarla .a!Jsgrbanday coritioüardU!'afate al menos· S·.rriih{Jtosdespues di? agreg<1r la•· Solucíqf'Jmúéstt(I, Deterrni·
nar el. cambio en··abs6rbanda ú:lA/mln);a pattlr del lntervalo•línéal dsl~ reacpí9n. Ar~.Hzarl~ Sot9ctón oJ~es.traportrrpHca­
do. [NOTA---Usar puntas de pipeta de.polietileno .para .transferir .la.·Soluá<)nmyestra, l.a punta d~ ll'!.Pip~ta no del:le hume-
decerse·· antes de•1a·ttarisferehc.ia\y··cadi;l •pal1ta dé plpetil.•debeüsarse··soló pal'á.transterír una·•ml.lestra. ·()espuesde.retirar
la solución muestra, limpiar la· superfiqie externa de< la punta par(} eliminar cualquier solúdon ·residual/Despüe~ ('.fe agregar
1a· SoJueióhmuestra• a··1a•··soluci6hde.•sústrato,erijuagar•1a. púnt~ pipeteando.la s61ud6hide .arriba aabafo2:...l veces,· dese~
char la p\]nta y mezclar.]

1 Un acetato de carbohen;:oxi~valil.glidl,arginina4"nítril~~nilida ;i(jecuado es Chrom9zym !RY de Rod1e Applied Sdeni::e (núfT!ero de tatálog<;> 10378496103) o
equivalente.
USP 40 Pruebas Biológicas/ (89. l > Colagenasa 1 201

Aptitud del sistema

Muestra: Solución muestra
Requisito de aptitud: >0,01 para .M/min
Calcular la actividad de tri psi na, en unidades/ml, en la pordórf de tolagenasa 1tomada:
Resultado= [\17/(s x Vu x B)]x LIA/min x D
Vr = vo!Umen de la rne.Zda de reacción, l,12 ml
s = coeficiente d~ extintj{m a 405 nm; 10;4 (lcm2 , mmoH)
Vu =volumen de láSolucion muestra; 0 .ló ml 1

B = longitud de paso de absorción, 1 cm

M/min = cambio en absorban cía en elinter\lalo linealde la· reacción
D = factorde dilución
Calcu!ar·{a.activrdad especítíca en unidades/mg qe . proteína:
=
Resültado ActividadtC
Actividad= actívidad de tripsifla(unidades/ml)
e =•·concentración de proteína (mg/rn L)
Criterios de <:i<:eptación: No más de 0,5 unidades de actívidad de tripsina por mg de proteína
PRUEBAS ESPECÍFICAS
• CONTENIDO DE PROTEfNA
Soludones muestra: Diluir colagenasa 1en agua. Preparar por lo menos por triplicado. [NOTA-Preparar la dilución usan,
do puntas plásticas de pipeta. No usar pipetas de vidrio. Limpiar cuidadosamente la superficie externa de la punta P'9fá
eliminarcvalqµier solugión residual.]
Soludón planco: Agua
Condiciones instrumentales
(Ver Espt?ctroscopfa Ult[avioleta~ViS/ble\85 7).)
Modo: uv
longitmld~ ol'íd<J anl'!litica: 280 nlTl
L9ngitudd~ P<JSo: 1 trn
Aptitud d~I sistema
Muestras: Soluciones muestra
Req'-'isito deaptitud: La absorbancia se encuentra en el intervalo 0;10-1,00.
Análisis
Muest.ras: Soluciones tnüestra y Soludón blanco
Oeterrrtinar la absqrbaocia neta de las Sqludones muestra restandOla absorbanéia de Ja Sqludón blanco de la absorbánci¡11 de
cada Solución muestra. Oetermín~r la absorbarkja netá promedio delqs Soludones muestra.
Cakular la concentración de proteína enfog/rnL:
Resultado =Aux Dfs
Au = absorbancia neta promedio de las Soluciones muestra
D = fattot de dilución
E =coeficiente de extinción (A 2800, 1 %/cm) para colagenasa, 1,4
• .PRUEBA .l)E ENDOTOXjHAs BACTERIANAS {85): No más de SO Unidades USPde Endotoxína/mg de proteína
• PRUEBAS DE RECUENtO MICROBIANO (61): El recuento total bacteriano es no más de 100 ufc/mL

REQUISITOS ADICIONALES
•ENVASADO Y ALMACENAMIENTO: Almacenar en envases cerrados a -'-l5º a.-25° .
• ETíqUETADO: El etiquetado indica que el materialderiva de Clostrídium hístolyticurn, junto con el número de lote, número de
producto o de catálogo y condidones de allTlacenarrtiento.
• ESTÁNDARES DE REFERENCIA USP (11)
ERColageriasa 11,,JSP
ER Colagenasa>U USP
ER Endotoxina USP
4USP40
202 <89.2) Colagenasa 11 /Pruebas Biológicas USP 40

Agregar lo siguiente:

·(89.2) COLAGENASA ll

VQNE.SJ{~YTV SYlKTLNYYn ·lVD1,U(KTEI ENt.PDLFgY$. ,SDAKEF'fGJl!K

TRMSFIMDEI GRRA.PQYTEI DHKGIPTLVE WAAGMGff 'flNk~t..tt;J;NK'·
RSFKERVIPS IL4¡QK~prJFr ·,Kl.AITE'.\(Ql)KX: \J$A!<;;t:.~ ..tTAPPf:VÍt)J~ ',
FTP'ILQOCIK NI~YAUlPI,. KSl<A\~NvtA 0APTYntrét~; 'AA~&;f>íWr .,
pWYG1ci'.wFI N:EUKLALY(l KtNONNSW+l ONGt~¡\/i(q:¿~~~~U; ,'.
l-E'.TllfZ\IMKV YPYLSMQHlQ StlDQlK.ftltvp, É>KDAE~KI~, ~Kf'.K~E°GKi"
KYCPKiYT-FO OGKVJ:l::l<AGA RYt::EEKYkRi. YWA$,K~Vt4SQ ~-F~IDkt:>·,,:·
LEEGNPOOIL JMV:VNSP~E.:~10..~Y,l~. ,Q'.;~~Y# :·~~~~~ER.'
-EAQESl:rfLE ELFf(lo(E'fTHY lQGRYAVPG.Q: W'~~'n<LVPNQ' ~t.TWYJSE;~

:~:;:;;~ =~~~~.::: ~~:::~:·;:~~:;~:~ º~::;:·

HMQ!iRIIJNYÍ:: »L1VPi=VAOb vlv~~Yf(~ '~Ei'VsEicS~ ~~v,
KK5ºYFSTF'f ,LRGSYTGGAs'. KGKLruXiKAM NKFIDDSt.Ji<tl:: t,-DTY$\fS&YK,
Tli~~1'.Ni<~· ~~~~~;p· w.i:iGftPN~c.~N~~~· KÍJ1!~ITTE.·
KEKIKl=SSEG $,FDPEffiK~S. YE~.GJ?~· ·siiiéNP,i~SY D~G't'fÍ'VKL ,,: '
KVTDDKGES$ V$TTTAEIKD Í.5'ENKL~Y MMVPlj;~~N QKVVfY~GT
YVPO~S,1~' QW!!;FGPG~DF' S$EQN:P$M, ,TKK,GE~, ll~~~;«
EKlJIKlKri-0 ,PVYPlÚE~É. PN_NSKEIASG PlVPGtpYS,G 'flSffrsQ~Y
f:YFQvrtf'.(;E: VKIDI-NKL~ ~'TWWYt>E. flÍN~AVS'fATD ,oe>QN[~~Ri,'.," :,
AQl<!'Gl!Y'V:\~ píolF',.;$YM~ ~~a~~~G .~. . .

Cso2sH1666N130001s64521
112 023 (para subtipo L;)
[9001-12·1].
DEFINICIÓN
La colagenasa 11 (EC 3.4.24.3), aislada de Clostridium histotyticum y codificada por el .gen collf{númel'Q cJ.e acceso GenBank
BAA06251.1 ), es una materia prima esendal usada en la disociación o .disgregación de. una grah v~l'iedad d~(tfpos· detejidp.
La colagenasa 11 es una metaloproteasa que actúa como una endoproteasa y p~eseotªJ~tnbi~n aétNicJ.~cJ. de tri~pfü:tll carbo-
xipeptidasa. Presenta actividad endopeptídica con el sitio principal d.e escisiól"I ubiead~ freote aldúplexde los at:ninoªddps
glicina-prolina del colágeno humano. La hidrólisis tiene lugar en el interior qe .los cJOrniOios triple .tiéli<::e del col~geno:
La colagenasa 11 también se conoce como colagenasa de clase 11 y consta de tres subtipos: ~; s, y~' ta. ccil~gen~s~ 11 ~j:~s l.a
enzima de longitud completa mientras que la colagenasa 11. () .(l oO 000 Da) y la i:olágenasa 11 ¡¡ (1 HroOO .[)a)sei:phslderan
productos de degradación proteo lítica de la colagenasa ll ~ pr0dudclos por otras proteasás presE!ntes.en C: hístdlyrk:¡¡m (prin.
cípalmente una enzima similar a la tripsinay <;lostripaína/en,doProtei.11jJsa.Atg C),
la colagenasa 11 puede obtenerse en una formulaeióh líqUloa que contiene ái:tdo N;.:Z•hi:OrQX:letifplper¡tzlna.,N' .2.,etánoS!;Jlfóf!icP
(HEPES) 5 mM y cloruro de cal<;io 1 mM de pH 7,5, y se almacena coh~l~{fa. ~·· . . . e5peqfi(:a de tolagenása. tl.~s:J O~
16 unidades/mg qe proteíri;a, usando 47Jení,15.tz01;>enc!loxicart>0nil (Pi)~PJ!o~J.,$:!;J~<;;fy.,p. g córno.elsust.rát9 q$:sí:i~lt9:ei:J la
ValoraCi6rí. El área del pico de ccilagenása'll e~ no
menos de. 90~, ~e!;)t':Í~ ~e detl:!#J:llPJ'I íJsai:J9o: el clTl~~ódtfae f:IPtC,: d~~rlto
en la prueba de Pureza. La prueba de Actividad deClostripaína se usápatáevaJuá~ la ai:füti<l~tldef~j~gl;lr~ad$: ctosfüparna
y el criterio de aceptación es no más de 0,,5 !lnídades/mg de prQteJna.J.a pruWade A~ivid!Jtt qe Trlpsiriase usa par~ evaluar
la actividad de la. impureza de la enzima s.imiJar ala trips.il'la :y el crit!i\rio de :á:cepta¡;iqn es .no· más de 0¡$ unidades/mg de
proteína.
IDENTIFICACIÓN
• A. Cumple con los requisitos de la Valoración.
• B. El tiempo de retención del pico pr:ineipaf de.· la Sqfución muesttu C,orrej¡ponde al de la $..o#{;lcíóh e$tárfrir,¡r, segúr¡ se obtienen
en la prueba de Pureza.
VALORACIÓN
• PRO(EOIMIENTO
Solución amortiguadora de Tris: Trís .O, 1 M de pH. 7, l; •q!Je se prepara segúl'.l se:~ridltia.a continuacióo~ Disph/!i\f :6¡Q.$ g .C{e
tris(hidroximetil)aminometano (Tris) en 400 mL de agua y ajustar con ácído clo.l'hfdlicó .2N a un pi;! dé:7;. l(a.?S: ::t 11').
Diluir con agua a un volumen final de .500 ml.
Solución de sustrato: Disolver 1Omg de PZ-Pro-leu·Gly~Pro-o-Arg en. 0,2 mh de .h'let~nol y. diluir .estíl sqlQciÓJ'.l.COn Sotu-
ción amortiguadora de Tris a un volumen final de.JO mL [NOTA-Usar solo uria soh.;1dón recientement~ preparada.}
Solución de cloruro de calcio; O, 1 M, que se prepara según se indica a continuación. Pesar 1,47 g de1doruro:de caldo
dihidrato en un matraz volumétrico y dilu.ir con agua a un volt,irnen final efe 1. 00 ml.
Solución de ácido cítrico: 0,02.5 M, que se.prepara según se indica a contit"\l,lación' Pesar 525 mg de ácido cítrico mo-
nohidrato en un matraz volumétrico y diluir eón· agua a .un volumen .final de H>O ·ml.
Mezcla de extracción: Pipetear y transferir 5,0 ml de acetato de etilo y 1,0 ml.de Solución de ácida cítrica a un tubo de
ensayo por muestra que se va a analizar. [NOTA-Usar solo una solución reeiente.men.te preparada.]
Tubo de secado: Agregar 0,35-0,40 g de sulfato de sodio anhidro a un tubo de ensayo por mu~stra que se va a analizar.
Sellar el tubo de ensayo con parafilm.
USP 40 Pruebas Biológicas/ (89.2) Colagenasa 11 203

Solución.estándar: Diluir E.R Colagenasa UVSPconSohA~1'Qf1<J{J'lortigu91:,Jora deTri:sen el intervalo del :2000 a·l:4000 (v/V):
[NOTA-,.,Evitaric0ngelªry.descongelar el ER C:olagena~i•¡OrO~P* pe$pué~ de reti.farel E.R Colagenasa ll>\JSP1Jimpiar 1(1 superfi.
cie exterra de la(puntas pl~st\cas e.je¡ la pipeta pár<1. elimll'l<1.f: ~(¡ªlq1.1!e~ soli.¡cl()n re~iQllaL]
Soluciones muestra: . Diluir colagenasa ncon.iS@lucíóf1 ~p¡o~igqttd()ra .Qe[ris ~~~ta una dilución apropiada para lograr iobte·
ner el intervalo de absórbancia ·O, 3~{), 9 .del Análisis. Preparar por triplic()do; [NOTA+'-Evitar congelar y descongelar la. mues~
tra de. colagenasaJI .. Después de retlr¡¡r lá muestr<:1 de {:ólágef!asa 11, lirnpi¡¡f lásuperfkie externa de la punta para eliminar
cualquier solucióit\ residual.]
Cóndidones instrumentales
0/er Espectroscopíd U/travfoleta· Visible (857}.)
Modo: UV
Longitl.ld de ¡onda <1n~lítica: 320 nm
kotigituq de pa~o: l~t'tl
Temperatura: 25º
Análbis
Mue:Slf!lS! S.blt/clón es.tandary Jqlu<,:lon~s.fhl;¡f!~~t;a
TFansf\;rihJ,q.¡m¡~i·•de Ji!i.·S.oly~iqp¡l:,Jg.sijsft'Q.tóy; Q,~·rn.tG.qe;Jªr$f:>tt/fÍQtl q~.:iªlf)i:Qrg eleFªq/~iQ.ailJfl·•tl.ll'><:ii·pe.el]Sªyo.yi eqollíbtar el
tubo ..efl~••~ns.a~.i. a.i$•~·¡··.!1li~lªf •la ~á(:dé~iágt~gªJt!d~¡¡¡Q~Q~ mlE•cl.e•!l:J ~({lii.tlºói~~t4nli1a.r:(I íil~ (:a!:Ja••$o!l..#Cióni. mµe:stra. Pref:)ªrªr
un blanc()i¡reemplázándolá Solución esfán#qt'.b 'ªSªliJGigrj'f[¡Ue.s~fo tb~ o;psffit 9~¡.S.qlij~i9a0.morti{Ju0.dora q~ ttí~·i Me?:C:lar
e incubar ·durante·· exactamen'é 1.si¡minQtos. a 25.º.··Tra!'l:Sferir Q,.$ml..de ~reágdól"!;ialtl.J~i~ e!l:s.áyé)iq.ue ~oofiene;p,(firnl
de la ·Mezda de extracción,¡ Mezclar iinmedlataF11enteerí t1nifue7ciadq!"qe'lój'tite··aurafite20 ségufit\lps.]"ransferír3 rnkde
la· fase de a<:etato de. etilo (capa·.spperi()r) ¡¡un Tull<> pa~a secado usancl!l u~a pipet<:1 dl!li l/idrio y me~élár 1'11.inLIC:iqs<i_rnente
en un mezclador devórtite' ·rransfe(it el sol:?teoaclante conüna pipet<l.Pa$teüfra liria semi;.rr\i<:;tol:Ubeta desectlábl~ ~íile"
cuada·paraabsorbanda UV. Registrarlá absoroanda.
Calcular la actividad de colagenasá lfen unidadés/fflL;
Resµltacló=(A-"'A¡i)}(.[\t7>< v,/(&xVxVR X .8 X m~· [)
A = absorbancia del¡¡Solúcíón estándaro laSolvt:í6nmu:estra
A8 =absorbanda del blanco
Vr =volumen de 1<:1 mezcláde l'eacciión, 1,45 rr!L
v, = volumen dé acetato de• etilo en lá f'.4~icla t,Jée~traccfón, i.S10rnl
e: =coeficiente deextin<:iónaJ2Qflm1.í!f(11:;rn•:¡Jfüok1)
v :;;···.volurnenideit<:1i••soJqr;i~nestarú:l.Cttoi.1asP~üti~Pi•~ªestr.{;1,·¡0¡~§cmL
vR =volumen delareacdón·transfefldáafoMezc/adeextiacc/ón,OísmL
B == longitud de paso de absort;ióncl <;m
T == tiempo de incubación, 1.S rniri
D == fatt()r de clilut;íón
[NOIA .·i ¡· l.Jnaiunid.<:1d•líberará el.equiyalente•i.á•>·l.·• µmot..cle P2i.:PrO:-f:e~,.a<P.aíl:ír deP,Zd'n:>-Lell·Oly-pro~D•Arg por minuto en.>las
tondii:tones ¡de la .Valoración,]
Calcular la actividad específica. d~ cqlagen<:1~a 11 ~n\.Jn¡iclacl~slrn9 ei~ prQ!:~r;¡~;

Actividad==actividad de colagenasa ll(uriidades/rnl)

e = conc~ntración de proteína {mglrnL)
Ap~itud <tel s.1.stema
Muestras: Solución· estarJdo(y •Solucióh'ét<muestfa
Requisitos de aptitUd
Aaividad·¡p.fomedioi.cálcutada: BS%...,J>t$%del.ivatorénla etlqóeta,¡SóJucíótJ e~tandar
Absorbancia: 0,3....,0,9, •Sofucfqn f!Stcíndar ySolucl<Jt;í1;1smue~tra
Criteri<1s de aceptación: lO-"ló t.ir)idactes{t't\g deprotéí:na
PUREZA
• PROCEDIMIEl\ITO
Solución¡A: Tri.si20 mMy•clorpr9·decalcío••l<t't\M de'pf-17,S.1 1;:1.lle' s~<pr~p¡¡...-ª segúitls~indica a c()ntinuación.o Disolveri142
g de·Trisy147mg de dón,1to de'lt:<)lció dihic.Jl"~toen 90Q rnldeag!;.J<), AjQ~taf~()nácidQdothíqrlc92N a·.un pHde 7,.$..
Diluir con.agua aun volumen ;final .idelüi)Q 11)1:..
Solu<ión a: Tris20 mM, clotUrodecllki9J.füM y;i~lorl,!t!f.!de•sodioJ.1\4 clépi"!.71füqü~septepara.·según seinc.Jica•a .cónti-
nuación. Disolver 2,42 g de Tris, 147 mg dedoruro dec¡ilció dihidtaf<;Jy'5~i44>gde clófl,lfodesodioen900 ml de agua.
Ajustar con ácido dorhídrico2 Na un.pH de7,5.Di1Uirconagua aun vofümenfinal de lOOOm\,,
Fase móvil: Ver la Tabla 1.
204 (89.2) Colagenasa 11 /Pruebas Biológicas USP 40

Titbla 1
Tiempo Solución A Solución B
(min) (%) (%)
o 100 o
2 lOO o
22 85 15
32 o 100
34 100 o
40 100 o
Solución amortiguadora de almacenamiento: HEPES 5 mM y cloruro de calcio 1 mM de pH 7,5, que se prepara según se
indica a continuación. Disolver l, 19 g de HEPES y 147 mg de cloruro de calcio dihidrato en 900 ml de agua. Ajustar con
solución de hidróxido de sodio 4 N a un pH de 7,5. Diluir con agua a un volumen final de 1000 ml.
Solución estándar: Descongelar ER Colagenasa 11 USP a temperatura ambiente poco tiempo antes de usar y mezclar. Man-
tener en hielo o a 5º. Diluir con Solución amortiguadora de almacenamiento para obténér una concentración de proteína de
5,5 mg/ml. Transferir a un vial para HPlC y mantel)er a 5". Prep<,lrar por duplicado e inyectar cada duplicado una vez.
Soluc.ión muestra: Diluir la co,agen(lsa 11 con· Solución amortiguaaora de almacenamiento para obtener una concentración
de proteína de 5,5 mg/ml y mantener a 5º.
Blanco: Solución amortiguadora de alrriacenamiffnto
Sistema cromatográficó
(Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: HPlC
Detector: UV 280 nm
Columna: 5 mm x 5 cm; relleno L91 de 1O µm
Temperaturas
Columna: 25º
Muestreador automático: 5º
Velocidad de flujo: 1,5 ml/min
Volumen de inyección: 20 µL
Aptitud del sistema
Muestra: Solución estándar
Requisito de aptitud: El cromatograma de la Solución estándar correspohde al cromatogramatípico provisto con ER Co-
lagenasa 11 USP.
Análisis
Muestra: Solución muestra
El Blanco debe considerarse para la integración. Evaluar la pureza de la colagenasa 11 usando el método de área-%, pero
excluyendo los picos asociados con el Blanco. .Todos los picos que no se separan completárrlenté y eluyen antes y después
del pico principal se integran mediante una línea perpendicular en los puntos de inflexión, y se consideran impurezas se-
paradas. No tomar en cuenta los picos con tiempos dé retención mayores de 25 minutos.
Criterios de aceptacióo: No menos de 90% para el pico principal de colagenasa 11
IMPUREZAS
• ACTIVIDAD DE CLOSTRIPAÍNA
Solución amortiguadora de fosfato de potasio: O, 1 M de pH 7,6, que se prepara según se indica a continuación. Disol-
ver 1,36 g de fosfato monobásico de potasio en agua y diluir hasta 1OOm~. Disolver 2,28 g de fosfato dibásico de potasio
trihidrato en agua y diluir hasta 100 ml. Ajustar el pH de la segunda solución a 7,6 con la primera.solución.
Solución de ditiotreitol: O, 194 M, que se prepara según .se indica a continuación. Disolver 60. mg de ditiotreitol (DTI) en
2 ml de Solución amortiguadora de fosfato de potasio.
Solución de cloruro de calcio: 0,01 M, que se prepara según se indita a c:ontiriu¡¡ción. Disolver 147 mg de cloruro de
calcio di hidrato en 100 mL de agua.
Solución madre de sustrato: 38 mM, que se prepara según se indica a continuación. Disolver 13 mg de clorhidrato de
éster etílico de benzoil-L-arginina (BAEE · HCI) en 1 ml de Solución amortiguadora de fosfato de potasio.
Solución de sustrato: BAEE · HCI 0,73 mM, DTT 7,8 mM y cloruro de calció-0,4 mM, que se prepara según se indita a
continuación. Transferir O,S ml dé SoluciómTladredé sustrato, 1,0 ml de Solución deditiotreitoly 1,0 mL de Solución de
cloruro de calcio a un matraz volumétrico de 25 mL y diluir con Solución amortiguadora de fosfato de potasio a volumen.
Solución muestra: Preparar de manera tal que M/mirí se encuentré eh el intervalo 0,02-0,06. Diluir con Solución amorti-
guaiiora de fosfat<J de potastO'hí:!lada; si fuera necesatio.
Condiciones instrumentales
(Ver Espectroscopía Ultravioleta-Visible {857).)
Modo: UV
Longitud de onda analítica: 255 nm
USP 40 Pruebas Biológicas/ (89.2) Colagenasa 11 205

Longitud de paso: 1 cm
Temperatura: 25º
Análisis
Muestra: Solución muestra
Transferir 3,0 ml de la Solución de sustrato a una cubeta y equilibrar.la cubeta a 25°: Iniciar la reacción agregando 0,05 mL
de la Solución muestra. Preparar un blanco reemplazando la Solución muestra con 0,05 ml de la Solución amortiguadora de
fosfato de potasio. Mezclar bien. Determinar el cambio en absorbancia (L1.A/min), en el intervalo lineal de la reacción. Ana-
lizar la Solución muestra por triplicado.
Aptitud del sistema
Muestra: Solución muestra
Requisito de aptitud: 0,02-0,06 para LlA/min
Calcular fa actividad de dostripaína, en unidades/mL, en la porción de colagenasa 1.l.tomada:
Resultado = fVrf(e x Vu x 8)] x LlA/min x D

Vr = volumen de la mezcla de reacción, 3,05 ml

s =coeficiente de extinción a 255 nm, 0;81 (1 cm2 • mmo1~1 )
Vu =volumen de fa Solución muestra, 0,05 mL
B = longitud de paso de absorción, 1 cm
LlA/min = cambio en absorbancia en el intervalo lineal de la reacción
D = factor de dilución
Calcular la actividad específica en unidades/mg de proteína:
Resultado= Activídad/C
Actividad= actividad de clostripaína (unidades/ml)
C = concentración de proteína (mg/mL)
Criterios de aceptación: No más de 0,5 unidades de actividad de dostripaína por mg de proteína
• ACTIVIDAD DE TRIPSINA
Solución amortiguadora: Tris O, 1 M y cloruro de calcio 0,02 M de pH 8,0, que se prepara según se indica a continuación.
Disolver 6,05 g de Tris y 1,45 g de cloruro de calcio.dihidrato en 400 ml de agua. Ajustar con ácido clorhídrico 2 Na un
pH de 8,0 (a 25 ± 1º). Diluir con agua a un volumen final de 500 mL
Solución madre de sustrato: Disolver 1 o mg de acetato de carbobenzoxi-valil-glicil-arginina-4-nitril-anilida, 1 pesados con
exactitud, en 1,5 ml de agua. Mantener en hielo. [NOTA-Usar solo solueión recientemente preparada.]
Solución de sustrato: Preparar una solución m.ezclando 9,2 ml. de Solución amortiguadora y 1,0 ml de Solución madre de
sustrato. Mantener en hielo. [NOTA-Usar solo solueión recientemente preparada.]
Solución muestra: Solución de colagenasa ti sin diluir
Condiciones instrumentales
(Ver Espectroscopía Ultravioleta-Visible (857).)
Modo: Vis
Longitud de onda analítica: 405 nm
Longitud de paso: 1 cm
Temperatura: 25º
Análisis
Muestra: Solución muestra
Transferir 1,02 ml de la Solución de sustrato a una semi-microéubeta de poliestireno, dejár que la temperaturá se estabilice,
equilibrar la cubeta a 25º y esperar durante 1O minutos. Iniciar la reacción agregando O, 1O ml de la Solución muestra.
Comenzar a registrar la absorbancia y continuar durante al menos 5 minutos después de agregar la Solución muestra. De-
terminar el cambio en absorbancia (LlA/min), en el intervalo lineal de la reacción. Analizar la Solución muestra por triplica-
do. [NOTA-Usar puntas de pipeta de polietileno para transferir la Solución muestra. la punta de la pipeta no debe hume-
decerse antes de la transferencia y cada punta de pipeta debe usarse solo para transferir una muestra. Después de retirar
la Solución muestra, limpiar la superficie externa de la punta para eliminar cualquier solución residual. Después de agregar
la Solución muestra a la Solución de sustrato, enjuagar la punta pipeteando la solucion de arriba a abajo 2-3 veces, dese-
char la punta y mezclar.]
Aptitud del sistema
Muestra: Solución muestra
Requisito de aptitud: >0,01 para L1.A/min
Calcular la actividad de tripsina, en unidades/mL, en la porción de colagenasa 11 tomada:
Resultado= CVr/(s x Vu x 8)] x Li.A/min x D

1 Un acetato de carbobenzoxi-valil-glicíf-arglnina-4-nltrH-anilída adecuado es Chromozym TRY de Roche Applied Science (número de catálogo 10378496103) o
equivalente.
206 (89.2) Colagenasa 11 /Pruebas Biológicas USP 40

V7 =volumen oe lq me.zda de reacc:;ión, 1,1 i mL

e = co~ficiente de extin<;l()n pará4Q.5 n(I'), 10,4 (1 cm2 , mmo1~1 )
Vu ""·volumen de Ja Solución muestra, O,lOrTIL
B = longituifde paso de absorción, 1 cm
Mfmin =<:;altíbioen absorbanciaen elít"lte~alalfüeal•··•d•e•li:trea~~ión
o ~ .facfütde dilutlón
Cak:ularla.·attlvídadespec~fica·e•o ünidadestmgde prote~n~:

Resultado =Actividadf(
Actividad= actividad detripsina(unidades/mL)
C = concentración de proteína (rog/m~)
Criterios de aceptación: No:ma.s de Q~.5 l:Jnldadés deá<Ztl!tidaifde tripsina pormg de .proteína
PRUEBAS ESPECÍFICAS
• Cot\ITEMil.)o DE PROTEÍNA
Soluciones muestra: Diluir colagenasa H en ag1.1a. P~eparí\lr po:r 1() meflos po:n trlpl.icado. {NOTA:...:...Preparar la .dilución usan-
do puntas plásfü:as de pipeta. No usar pipetas de vidrió. Urnpiarcl.,lidí\lclos¡:ill")ehteJ¡:isuperfidé e><t~rna oe la punta para
el.imillar cualquier solución. residúal.]
Solución.blanco: Agua
Condiciones ihstrumelltales
0fer Espectroscopfa Ultravioleta-Visible (85 7),)
Modo: IJV
Lt>ngitud de onda analíti<.:a: 2$0nm
L()ngitud de pas(): 1cm
Aptitud del sistema
Muestras: Solucionesmues~ra
Requisito de aptitud: l:éí.absorbaricia se encuétfüa en eflnteNa!o O¡l0·--1 100 .
.¡\náHsi~
M!Jestras: ·SoluciqMs.·iti:u~$.tr:ay.~o/W6íón blqrj6efi
Deterrninarla· abs8rbanda6etade··ta$.S'o1Udof¡es.if¡!Je.$t(<;l.r~5tang(>la ab$(:}.rba6(!ia de .la•·sotudótJ. :J;¡/anco·.de. lá ab$9rbancia de
~aoa. Sptucif].n. mµestta,···.l?eterm!!"l!:lt la a.b~ort:lál'"l~ia•f:ié.ta,ptó!lried"1~.d~Jll;ls•@t:udif!'r~s•mu~stra.
calci:ila r la con<:enti:a~ion de Pf9t~~r[1:1 ~rirTl9/rrftJ:

Au =
absorba.ncia neta promedio de las Soluciones maestra
D =factor< de dilución
e .·.. = c9efidentede extinc:;ió~ (A¡800,J%/cmJpa~a<:ol~(;)l"l~.s¡¡!l,4
• .PRüEBA DE ENl)(>1'0Xlt(AS ~~CTElllANAS.•(862:r-Jii> má~d~ .50.~t'lidades USP de Endo.toxina/mg de proteína
• PRUEBAS DE RECUENTO·MIClf.OBIANO (61): 1:1 re<;uelltototalbacteriano es no más oelQO.uf<;/!Tll.

REQUISITOS ADICIONALES
•· EN\fASAoo.v ·Aí.,...A(f.NAMIEmo: •AllT!acellaten.~nva~s.·cer~adosa -óo~ a'7-909 •
• ETIQ.UUADO: El etiquetado indica que el material se deriva de Clostrídiumhist.ofyticúrn, junto <:0.n.el número de lot:~1 húm~r'O
~Gpr901,.1st:P.•.2clf!<:~t~lpQ hdfc:;ionesq~.•. al!Tlai:enall"lfenf9,
• EsT,4MJ)A~ Ji)~. ~Ef'.~"'l'I~ . (11}
~R:·•C919gerias~•trps11
E.R Ell<fütoxlda 1.1$1'
JtlfSP.411

(90) SUERO FETAL BOVINO-ATRIBUTOS DE CALIDAD Y PRUEBAS DE

FUNCIONALIDAD

INTRODUCCIÓN
El Suero Fetal Bovino (FBS, por sus siglas en inglés) es la fracción líquida de color marrón claro de la sangre bovina fetal coagu-
lada de la que se ha eliminado células, fibrina y factores de coagulación. Aunque no se ha definido la composición completa
del FBS, éste contiene altos niveles de factores de crecimiento y bajos niveles de inmunoglobulinas. Además, contiene otros
ingredientes claves que son esenciales para sustentar la proliferación de células en cultivos. Este producto se usa tanto en la
investigación básica de las ciencias biológicas como en la fabricación industrial. El FBS es un subproducto de la industria de
la carne y se recolecta a partir de fetos bovinos extraídos del ganado que se encuentra preñado al momento de su faena. El
USP 40 Pruebas Biológicas/ (90) Suero Fetal Bovino 207

FBS se recolecta en mataderos inspeccionados por la autoridad competente del país de origen. La recolección y el procesa-
miento deben ser llevados a cabo por personal capacitado siguiendo procedimientos escritos y aprobados. La sangre se re-
colecta en un sistema cerrado en un área dedicada dentro de la instalación y se procesa rápidamente para evitar la hemólisis.
Posteriormente, se permite que la sangre coagule y luego, por lo general, se centrifuga en una centrífuga refrigerada para
separar el suero de los demás componentes. Por lo regular, el suero se extrae del coágulo, se transfiere a envases etiqueta-
dos, y se congela. Todos los fabricantes emplean filtración estéril antes del envasado final. Además, la radiación gamma pro-
porciona la garantía más alta de ausencia de actividad viral. Las dosis de radiación gamma de 25-40 kGy proporcionan una
reducción logarítmica significativa de agentes virales y de otros agentes adventicios, al tiempo que preservan el desempeño
para el crecimiento celular.
La detección de contaminación viral en el FBS se logra usando todas las pruebas aplicables descritas en el Code of Federal Re-
gulations (Código de Reglamentos Federales) Título 9 CFR 113.53 (conocido como el análisis completo del Título 9 del CFR).
Los ensayos para micoplasmas se realizan según se indica en Pruebas para Micoplasmas (63).

IDENTIFICACIÓN
• IDENTIFICACIÓN-INMUNODIFUSIÓN RADIAL
Reactivos
• Muestras de prueba de FBS
• Suero de caballo, muestras de control negativo
• Calibrador de lgG bovina (500 mg/L)
•Diluyente de albúmina ovina (albúmina ovina al 1%, EDTA al 0, 18%, NaCI al 1,75% y Tris/HCI de pH 7,4 al 1,21 %).
Materiales/Aparato: Calibrar el dispositivo de medición de anillos (halos) en incrementos de O, l mm. Las placas de inmu-
nodifusión radial (IDR) están disponibles comercialmente y contienen antisuero anti-lgG bovina en un gel de agarosa al
1,5%, solución amortiguadora de fosfato O, 1 M de pH 7,0, azida de sodio al 0, 1% como agente bacteriostático y 1 µg/mL
de anfotericina B como agente antifúngico. Almacenar a una temperatura de 2º-8º. Usar placas de IDR que puedan medir
lgG bovina en el intervalo de 50-500 mg/L.
Curva estándar: Usar los calibradores de lgG bovina para la aptitud del sistema y para generar una curva de calibración.
Preparar dos diluciones a partir de una solución madre de lgG bovina de 500mg/ml. Diluir 120 µL de la solución madre de
500 mg/L con 80 µL de diluyente (dilución media) y 25 µL de la solución madre de 500 mg/L con 225 µL de diluyente
(dilución baja). Etiquetar cada dilución respectivamente como calibradores de 300 mg/L y de 50 mg/L. Usar las soluciones
de 500 mg/L, 300 mg/L y 50 mg/L para generar la curva estándar. [NOTA-Preparar y analizar las soluciones calibradoras
de lgG bovina por duplicado.] Cargar 5 µL de cada muestra en los pocillos de 2,5 mm de la placa. A las 72 horas de la
incubación, medir los diámetros de los anillos con una aproximación de O, 1 mm usando un dispositivo de medición de
anillos apropiado. Registrar los resultados y generar una curva estándar.
El diámetro del anillo debe desarrollarse completamente a temperatura ambiente durante 72 horas. Usando el resultado de
cada punto de la curva estándar, generar una gráfica de linealidad en la que y es el diámetro cuadrado (mm 2 ) del anillo
de precipitina alrededor del pocillo y x es la concentración de lgG bovina (mg/L). Calcular la curva de regresión lineal por
cuadrados mínimos de la forma y= m(x) + b con ayuda de un software adecuado y determinar los valores para la pen-
diente (m), la ordenada al origen y (b) y el coeficiente de determinación (R 2). La curva estándar para el método es lineal si
R2 es ¿0,98.
Análisis: Las muestras congeladas sin diluir de FBS se descongelan y analizan dentro de las 24 horas si se almacenan a 4º.
El análisis de las muestras de prueba de FBS y de ER Suero Fetal Bovino USP se realiza por triplicado. Preparar placas de IDR
que contengan anti-lgG bovina para el análisis de varios tipos de suero. Dejar que las placas y los reactivos se equilibren a
temperatura ambiente antes de su uso dejando las placas abiertas durante 10-15 minutos a temperatura ambiente para
permitir que se evapore cualquier condensación de humedad en los pocillos o en la superficie del gel. Las muestras no se
deben aplicar a los pocillos en los que se observe humedad. Preparar diluciones en serie, si fuera necesario, de las muestras
de prueba de FBS y de ER Suero Fetal Bovino USP en diluyente. Diluir el suero de caballo para control negativo en diluyen-
te. Cargar 5 µL de cada muestra en los pocillos de 2,5 mm de la placa e incubar a temperatura ambiente durante 72 horas.
[NOTA-Las muestras de prueba y el control negativo se cargan en la misma placa.]
Cálculo: Después de 72 horas, medir los diámetros de los anillos usando el dispositivo de medición de anillos y registrar los
resultados. Usando la ecuación de regresión desarrollada para la desviación de la curva estándar, calcular la concentración
de lgG bovina en las muestras de FBS. La concentración se expresa en mg/L.
Criterios de aceptación: El suero de caballo es negativo (no debe presentar un anillo de precipitación). Las muestras de
prueba de FBS y de ER Suero Fetal Bovino USP son positivas y deben contener no más de 500 mg/L de lgG.
• CONTENIDO DE HEMOGLOBINA
(Ver Espectroscopía Ultravioleta-Visible (85 7).)
Preparación de la muestra: Las muestras de FBS se descongelan, se almacenan a 4º y se analizan dentro del mismo día.
Análisis: Determinar la absorbancia de la muestra de suero usando una celda espectrofotométrica con una longitud de pa-
so de 1 cm a las longitudes de onda de absorbancia de 576, 623 y 700 nm y usando agua como blanco. Calcular la con-
centración de hemoglobina en mg/dL por la fórmula:
(Abs 576 x 115) - (Abs 623 x 102) - (Abs 700 x 39, 1)
208 (90) Suero Fetal Bovino / Pruebas Biológicas USP 40

Criterios de aceptación: No más de 30 mg/dL

PRUEBAS ESPECÍFICAS
• PRUEBAS DE FUNCIONALIDAD DEL FBS
En caso de no existir un ensayo de funcionalidad definido por el usuario, las siguientes pruebas son adecuadas para deter-
minar la funcionalidad de lotes específicos de FBS y para ayudar en la optimización de las condiciones de crecimiento de
cultivos de células mamíferas en presencia de FBS. Para una confirmación válida de la funcionalidad, independiente de las
aplicaciones específicas del usuario, las pruebas se realizan en las líneas celulares especificadas. Para la validación interna
de aplicaciones especializadas de cultivos celulares, se deben usar y caracterizar líneas celulares específicas para tales apli-
caciones. Usar frascos de cultivo de tejidos apropiados. Las dos pruebas descritas en este capítulo son la Curva de Promo-
ción de Crecimiento y el Ensayo Clona/. La decisión sobre el tipo de prueba o el número de pruebas que se van a realizar
para evaluar la aptitud de un lote específico de FBS depende del tipo de línea celular usada. Para líneas celulares adheren-
tes, el número de colonias al final del periodo de cultivo representa una buena evaluación de la capacidad de estas células,
a baja concentración, para crecer en presencia de un lote específico de FBS. Para líneas celulares que crecen en cultivos en
suspensión, la cinética óptima de crecimiento se mide contando las células viables después de 7 días de cultivo.
Líneas celulares: Se recomiendan cinco líneas celulares:
1. HFL 1 (ATCC CCL-153) fibroblasto de pulmón normal
2. Mvl Lu (ATCC CCL-64) epitelio de pulmón de visón
3. HL-60 (ATCC CCL-240) promieloblasto de sangre periférica, suspensión
4. VERO (ATCC CCL-81) fibroblasto de riñón de mono
5. CHO (CCL-61) ovario de hámster chino
Las pruebas de funcionalidad descritas se deben realizar en tres líneas celulares, dos de las cuales corresponden a la lista de
las cinco líneas celulares recomendadas, mientras que la tercera es la línea celular pertinente a la aplicación del usuario. Las
líneas celulares se cultivan con medios específicos según lo recomendado por la ATCC.
Materiales
• Frasco/recipiente de crecimiento adecuado
• Cabina de Seguridad Biológica Clase 11, Tipo A
• Contador de células/hemacitómetro
• Microscopio invertido con accesorio para cámara digital
• Frascos de cultivo de tejidos: T25 cm 2
Preparación de células para ensayos: Descongelar rápidamente un vial en un baño de agua a 37º y determinar el recuen-
to y la viabilidad celular. Preparar múltiples cultivos a partir de cada línea celular en un medio de crecimiento suplementa-
do con suero. Incubar los cultivos a 37º siguiendo las instrucciones provistas por la ATCC para cada una de las líneas celula-
res usadas para la prueba. Examinar los cultivos celulares en un microscopio para asegurarse de la existencia de monocapas
uniformes casi confluentes o suspensiones uniformes. Expandir las células hasta que se tengan suficientes para el ensayo
(aproximadamente 1 x 107 células totales; >90% viabilidad)
Recolección de cultivos
1. Retirar y desechar el medio de crecimiento y luego enjuagar cada cultivo con medio sin FBS.
2. Para las células adherentes, agregar 1 mL de Tripsina/EDTA durante unos pocos minutos para que las células se disper-
sen. Incubar a 37º, si fuera necesario. Neutralizar con 1 mL de medio de cultivo que contenga por lo menos 10% de
FBS.
3. Centrifugar brevemente (spin down) las células en una centrífuga. Aspirar el medio de lavado y resuspender las células
en un volumen apropiado para siembra.
Siembra de células
1. En el día O: Para las tres líneas celulares que se van a analizar, preparar cultivos múltiples usando densidades de siem-
bra que abarquen el intervalo entre 2 x 103 y 2 x 104 células viables/ml. (En un inicio, se seleccionan inóculos diferen-
tes para determinar las condiciones de crecimiento óptimas. Una vez que se ha seleccionado el inóculo apropiado,
dicha condición se usa para propagar las células). A continuación se presentan las densidades de siembra recomenda-
das:
Densidad de siembra baja: 2 x 103 células viables/mL
Densidad de siembra media: 6 x 103 células viables/mL
Densidad de siembra alta: 2 x 104 células viables/mL
2. Preparar cultivos por triplicado para al menos cinco puntos de tiempo (en días u horas de acuerdo con la línea celu-
lar), para determinar la densidad de siembra que producirá condiciones de crecimiento óptimo para cada línea celular
usada.
3. Incubar los cultivos a 37° en una incubadora humidificada saturada con C0 2 al 5%.
4. Para cada punto de tiempo de medición (días O, 1, 2, 3, 4 y 7), tomar una fotografía de cada cultivo, por triplicado,
tanto para el material de prueba de FBS como del ER Suero Fetal Bovino USP a cada una de las tres concentraciones
para cada línea celular y registrar el porcentaje de confluencia para cada una de las condiciones. [NOTA-Realizar esta
etapa antes de la tripsinización y del conteo celular.]
USP 40 Pruebas Biológicas/ (90) Suero Fetal Bovino 209

5. Recolectar las células de los tres cultivos de diferente densidad de siembra para cada punto de tiempo específico. Para
cultivos adherentes, recolectar las células según se describió anteriormente.
6. Realizar y registrar el recuento de células totales y la viabilidad para cada uno de los nueve cultivos de la muestra de
FBS y de ER Suero Fetal Bovino USP para cada línea celular usando un contador de células o hemacitómetro apropia-
do. [NOTAS-Es posible que tenga que cambiarse el programa de recuento para líneas celulares de crecimiento rápido
o células grandes que confluyan antes del día 7 y/o para líneas celulares de lento crecimiento que requieran estar en
cultivo 8-1 O días antes de alcanzar una meseta. Algunas líneas celulares adherentes nunca lograran la confluencia.]
• CURVA DE PROMOCIÓN DE CRECIMIENTO
Las mediciones de las velocidades de proliferación celular a menudo se usan para determinar la respuesta de las células a
estímulos exógenos. La evaluación cuantitativa de las condiciones de crecimiento celular es un factor importante para mo-
nitorear la constancia de las condiciones de cultivo. El intervalo de concentración celular óptimo para subcultivos, el inó-
culo óptimo y el tiempo de duplicación son parámetros que se pueden cuantificar y para los que se pueden establecer
tendencias. La información acerca de la cinética del crecimiento de un cultivo es crítica para el diseño de experimentos
celulares. Los cultivos varían significativamente en sus propiedades de crecimiento en la fase de latencia, la fase de creci-
miento exponencial o logarítmica y la fase estacionaria. Documentar las características de crecimiento del cultivo durante
las tres etapas de crecimiento para determinar el tiempo de duplicación de la población y el tiempo del ciclo celular. Las
células que han entrado en la fase estacionaria pueden demostrar un potencial de crecimiento reducido y cambios en la
morfología. Las células se pueden volver polarizadas y pueden segregar más matriz extracelular, lo que las vuelve difíciles
de retirar del sustrato. Al final de la fase de crecimiento exponencial las células presentan su mayor rendimiento y su más
alta reproductibilidad.
Reactivos
• Medios de crecimiento sin FBS
• Muestras de prueba de FBS
• Medio de crecimiento + 10% de FBS
•Solución de Tripsina/EDTA (0,25%/0,53 mM) en Solución Salina Balanceada de Hank (HBSS)
Análisis: Una vez que las células hayan alcanzado el final de la fase logarítmica, subcultivar las células para la prueba. Se-
guir el procedimiento descrito en Siembra de células y preparar múltiples cultivos para el ER Suero Fetal Bovino USP y anali-
zar el FBS para diferentes líneas celulares a tres densidades de siembra para las que al menos una curva de crecimiento
presenta una fase de latencia, una fase logarítmica y una fase estacionaria, y para la cual la fase logarítmica es lineal en tres
o más puntos de tiempo.
Los recuentos de células viables se determinan en los días O, 1, 2, 3, 4 y 7.
Cálculo y Análisis de datos: Calcular el recuento promedio de células viables [células/cm2 (adherentes) o células/mL (en
suspensión)] y la viabilidad media porcentual para cada punto. Graficar los datos en una gráfica de escala semilogarítmica
con el recuento de células viables sobre la escala logarítmica en el eje y y los días (u horas) en cultivo sobre una escala
aritmética en el eje x. Estimar el tiempo de duplicación usando una curva de crecimiento que sea lineal sobre tres o más
puntos.
Criterios de aceptación: El valor R2 de la curva debe ser igual o mayor que 0,98 a fin de respaldar el cálculo de un tiempo
de duplicación válido. El tiempo de duplicación correspondiente a la muestra de prueba debe ser no menos de 90% del
tiempo de duplicación correspondiente a ER Suero Fetal Bovino USP.
•ENSAYO CLONAL
Este ensayo está diseñado para evaluar el crecimiento óptimo de las líneas celulares adherentes. La eficiencia del plaqueo o
formación de colonias a baja densidad celular es un método preferido para analizar la capacidad de proliferación y la su-
pervivencia de células individuales en condiciones óptimas de crecimiento. Esta es una prueba muy sensible y a menudo
se usa para evaluar la calidad de los lotes de suero. Esta técnica revela diferencias en la velocidad de crecimiento dentro de
la población celular y es capaz de distinguir entre cambios en la velocidad de crecimiento (tamaño de colonias) y la super-
vivencia de las células (número de colonias). Debido a la heterogeneidad de la población celular de algunos cultivos celu-
lares, cabe recordar que las células crecen de manera diferente como colonias aisladas a bajas densidades. Por consiguien-
te, pocas células sobreviven incluso en condiciones ideales debido a la pérdida de toda interacción celular. La clonación es
un ensayo de supervivencia que se usa también para optimizar las condiciones de crecimiento (selección de medio y sue-
ro). Si es posible confirmar que una colonia individual surgió de una sola célula, entonces se puede determinar la eficien-
cia de la clonación.
Reactivos
• Medio de crecimiento+ 10% de FBS (suero de prueba)-Medio esencial mínimo de Eagle (EMEM, por sus siglas en
inglés) con L-glutamina 2 mM y BSS de Earle ajustado para que contenga 1,5 g/L de carbonato de sodio, aminoáci-
dos no esenciales O, 1 mM y piruvato de sodio conteniendo 100 U/mL de penicilina y 100 g/mL de estreptomicina
más 10% de FBS.
•Solución de Tripsina/EDTA (0,25%/0,53 mM) en HBSS.
• Solución Salina Amortiguadora de Fosfato de Dulbecco sin calcio ni magnesio.
• Solución de Carbol Fucsina-Azul de Metileno-Mezclar 20 g de carbol fucsina en 2 L de metanol y mezclar durante
1O minutos (carbol fucsina al 1%). Mezclar 50 g de azul de metileno en 5 L de metanol y mezclar durante 1 O minu-
tos (azul de metileno al 1%). Preparar una solución de trabajo de Carbol Fuscina-Azul de Metileno mezclando azul
21 O (90) Suero Fetal Bovino / Pruebas Biológicas USP 40

de metileno al 1%, metanol y carbal fucsina al 1% en una proporción de 3:2:1. Mezclar durante 20 minutos y filtrar
a través de cuatro pliegues de gasa (cheesecloth) en un embudo. Preparar alícuotas y almacenar en frascos de vidrio
marrón a una temperatura de 15º a 25º.
Muestra: Se usan múltiples lotes de FBS para este ensayo. Por cada lote de suero a analizar, agregar 20 ml de FBS a 180
ml de EMEM y usar la misma muestra para toda la prueba. Esterilizar usando filtros de baja unión a proteínas de 0,22 µm.
Almacenar el medio de crecimiento a 4º hasta el momento de su uso.
Preparación de las células: Esta prueba es únicamente para cultivos adherentes y se realiza con las líneas celulares adhe-
rentes descritas en Líneas celulares (HFL 1 y Mv 1 Lu). Una semana antes de analizar el suero, expandir las líneas celulares
según se indica en Siembra de células, cambiar el medio cada 2-3 días, y subcultivar las células cuando presenten una con-
fluencia aproximada de 90%. Determinar el recuento y la viabilidad celular (la viabilidad debe ser >90%) antes de realizar
el ensayo. Recolectar las células según se indica en Recolección de células, lavar dos veces, y resuspender las células en
EMEM basal.
Análisis: El procedimiento implica el plaqueo de una suspensión unicelular en densidades bajas (2-50 células/cm 2) a partir
de la cual se formarán colonias discretas. Al final del ensayo, se debe fijar, teñir, y contar el número de colonias según se
indica a continuación.
1. Para cada línea celular, etiquetar 1O placas de cultivo de tejidos de 60 mm x 15 mm por cada lote de suero a analizar.
Etiquetar el costado de la mitad inferior de cada plato, incluyendo los controles.
2. Transferir 5 ml de medio que contenga 10% del suero de prueba correspondiente (1 O réplicas). Agregar 400 células
por placa de cultivo (se busca una concentración celular de aproximadamente 800 células/ml).
3. Incubar durante 10-14 días a 37° en una incubadora humidificada, saturada con C0 2 al 5%.
4. Retirar el sobrenadante y agregar suficiente Solución de Carbal Fucsina-Azul de Metileno para cubrir cada una de las
placas de cultivo durante 1O minutos.
5. Retirar la solución colorante; enjuagar las placas de cultivo con varios enjuagues de agua destilada; invertir los platos
en toallas de papel; y dejar que se sequen.
6. Contar y registrar (1) el número de colonias y (2) la superficie total de colonias teñidas (mm 2). Calcular las medias y
desviaciones estándar.
Criterios de aceptación: La eficiencia de plaqueo porcentual se expresa contando el número de colonias en un área defi-
nida, dividido por el número de células sembradas y multiplicado por 1OO. Comparar los resultados entre los lotes de FBS y
seleccionar un lote de suero que sea apropiado para varios tipos de células y óptimo para una aplicación de cultivo celular
específica.
• pH (791): 7,00-8,00 en muestras de suero sin diluir
• OSMOLALIDAD y OSMOLARIDAD (785), Osmolalidad: 280-360 müsmol/kg
• o
PRUEBA DE ENDOTOXINAS BACTERIANAS (85): Contiene no más de 1 Unidades USP de Endotoxina/ml de suero.
• Contenido de Proteínas Totales (1057): 30-45 mg/ml
• Pruebas de Esterilidad (71): Cumple con los requisitos.

REQUISITOS ADICIONALES
• ENVASADO v ALMACENAMIENTO: Almacenar en envases sellados a una temperatura de -1 Oº o menor.
• ETIQUETADO: Etiquetar indicando que contiene Suero Fetal Bovino e indicar el número de lote, la fecha de caducidad y las
condiciones de almacenamiento. Asimismo, indicar el país de origen en el etiquetado del producto.
•ESTÁNDARES DE REFERENCIA USP (11)
ER Endotoxina USP
ER Suero Fetal Bovino USP

(91) VALORACIÓN DE PANTOTENATO DE CALCIO

VALORACIÓN
Procedimiento
Solución madre del estándar de pantotenato de calcio: En un matraz volumétrico de 1000 ml, disolver, en aproxima-
damente 500 ml de agua, 50 mg de ER Pantotenato de Calcio USP, previamente secado y almacenado en un lugar oscuro
sobre pentóxido de fósforo, y pesado con exactitud evitando la absorción de humedad durante la pesada. Agregar 1O ml
de ácido acético 0,2 N y 100 ml de solución de acetato de sodio (1 en 60) y diluir a volumen con agua. Cada ml contiene
50 µg de ER Pantotenato de Calcio USP. Almacenar bajo tolueno en un refrigerador.
Preparación estándar: Diluir, el mismo día de la valoración, un volumen medido de Solución madre del estándar de panto-
tenato de calcio con una cantidad de agua suficiente para obtener entre 0,01 µg y 0,04 µg de pantotenato de calcio por
ml, cuya concentración exacta sea tal que las respuestas obtenidas según se indica en el Procedimiento, utilizando 2,0 y 4,0
ml de la Preparación estándar, se encuentren en la parte lineal de la curva de respuesta en función del logaritmo de la con-
centración.
USP 40 Pruebas Biológicas/ (91) Valoración de Pantotenato de Calcio 211

Preparación de valoración: Proceder según se indica en la monografía individual y preparar una solución que se espera
que contenga aproximadamente el equivalente a la concentración de pantotenato de calcio en la Preparación estándar.
Solución madre de medio basal: Disolver la dextrosa anhidra y el acetato de sodio en las soluciones previamente mezcla-
das y ajustar con hidróxido de sodio 1 N a un pH de 6,8. Finalmente, diluir con agua a 250 ml y mezclar.

Solución de hidrolizado ácido de caseína 25 ml

Solución de cistina-triptófano 25 ml
Solución de polisorbato 80 0,25 ml
Dextrosa, anhidra 10 g
Acetato de sodio, anhidro 5g
Solución de adenina-guanina-uracilo 5 ml
Solución de riboflavina-clorhidrato de tiamina-biotina 5 ml
Solución de ácido paraaminobenzoico-niacina-clorhidrato de piridoxina 5 ml
Solución salina A 5 ml
Solución salina B 5 ml

Solución de hidrolizado ácido de caseína: Mezclar 100 g de caseína sin vitaminas con 500 ml de ácido clorhídrico 6 N y
someter la mezcla a reflujo entre 8 y 12 horas. Eliminar el ácido clorhídrico de la mezcla mediante destilación bajo presión
reducida hasta que quede una pasta espesa. Redisolver la pasta resultante en agua, ajustar la solución con hidróxido de
sodio 1 N a un pH de 3,5 ±O, 1 y agregar agua para obtener 1000 ml. Agregar 20 g de carbón activado, revolver durante
1 hora y filtrar. Repetir el tratamiento con carbón activado. Almacenar bajo tolueno en un refrigerador a una temperatura
no inferior a 1Oº. Filtrar la solución si se formara un precipitado durante el almacenamiento.
Solución de cistina-triptófano: Suspender 4,0 g de L-cistina y 1,0 g de L-triptófano (o 2,0 g de D,L-triptófano) en un volu-
men de agua entre 700 y 800 ml, calentar hasta entre 70º y 80º y agregar, gota a gota y agitando, ácido clorhídrico dilui-
do (1 en 2), hasta que los sólidos se disuelvan. Enfriar y agregar agua para obtener 1000 ml. Almacenar bajo tolueno en
un refrigerador a una temperatura no inferior a 1Oº.
Solución de Adenina-guanina-uracilo: Disolver 200 mg de sulfato de adenina, 200 mg de clorhidrato de guanina y 200
mg de uracilo, con ayuda de calor, en 1O ml de ácido clorhídrico 4 N, enfriar y agregar agua para obtener 200 ml. Alma-
cenar bajo tolueno en un refrigerador.
Solución de polisorbato 80: Disolver 25 g de polisorbato 80 en alcohol para obtener 250 ml.
Solución de riboflavina-clorhidrato de tiamina-biotina: Disolver riboflavina, clorhidrato de tiamina y biotina en ácido
acético 0,02 N para obtener una solución que contenga 20 µg de riboflavina, 1O µg de clorhidrato de tiamina y 0,04 µg de
biotina por ml. Almacenar, protegida de la luz, bajo tolueno en un refrigerador.
Solución de ácido paraaminobenzoico-niacina-clorhidrato de piridoxina: Preparar una solución en alcohol al 25 por
ciento neutralizado para obtener las siguientes concentraciones: 1O µg de ácido paraaminobenzoico, 50 µg de niacina y 40
µg de clorhidrato de piridoxina por ml. Almacenar en un refrigerador.
Solución salina A: Disolver 25 g de fosfato monobásico de potasio y 25 g de fosfato dibásico de potasio en agua para ob-
tener 500 ml. Agregar 5 gotas de ácido clorhídrico y almacenar bajo tolueno.
Solución salina B: Disolver en agua 1O g de sulfato de magnesio, 0,5 g de cloruro de sodio, 0,5 g de sulfato ferroso y 0,5
g de sulfato de manganeso para obtener 500 ml. Agregar 5 gotas de ácido clorhídrico y almacenar bajo tolueno.
Cultivo madre de Lactobacillus plantarum: Disolver 2,0 g de extracto de levadura hidrosoluble en 100 ml de agua, agre-
gar 500 mg de dextrosa anhidra, 500 mg de acetato de sodio anhidro y 1,5 g de agar y calentar agitando en un baño de
vapor hasta que el agar se disuelva. Verter porciones de aproximadamente 1O ml de la solución caliente en tubos de ensa-
yo, tapar o cubrir adecuadamente, esterilizar a 121 ºy dejar que se enfríen en posición vertical. Preparar cultivos en cuña en
tres o más de los tubos, usando un cultivo puro de Lactobacil/us plantarum*, incubar durante 16 a 24 horas a una tempera-
tura seleccionada entre 30º y 37º pero mantenerla constante con una aproximación de± 0,5º y luego almacenar en un
refrigerador. Preparar un cultivo madre en cuña nuevo una vez por semana y no usar para inoculación si el cultivo tiene
más de 1 semana.
Medio de cultivo: Preparar una serie de tubos de ensayo con 5,0 ml de Solución Madre de Medio Basal y agregar 5,0 ml
de agua con 0,2 µg de pantotenato de calcio a cada tubo. Tapar los tubos con algodón, esterilizar en un autoclave a 121 º
y enfriar.
lnóculo: Transferir células del cultivo madre de Lactobacillus plantarum a un tubo estéril que contenga 1O ml de medio de
cultivo. Incubar este cultivo durante 16 a 24 horas a una temperatura seleccionada entre 30º y 37° pero mantenerla cons-
tante con una aproximación de± 0,5º. La suspensión de células así obtenida es el inóculo.
Procedimiento: Agregar a tubos de ensayo similares, por duplicado, 1,0 ml y/o 1,5 ml; 2,0 ml; 3,0 ml; 4,0 ml y 5,0 ml,
respectivamente, de la Preparación estándar. A cada tubo y a 4 tubos similares sin Preparación estándar agregar 5,0 ml de
Solución madre de medio basal y agua suficiente para obtener 1O ml.

* La cepa ATCC (American Type Culture Collection) Nº 8014 es apropiada. Esta cepa se conocía anteriormente como Lactobacillus arabinosus Loctobacillus arabino-
sus 17-5.
212 (91) Valoración de Pantotenato de Calcio / Pruebas Biológicas USP 40

Agregar, por duplicado, a tubos de ensayo similares los volúmenes de Preparación de valoración correspondientes a tres o
más de los niveles especificados anteriormente para la Preparación estándar, incluidos los niveles de 2,0 mL, 3,0 mL y 4,0
mL. Agregar a cada tubo 5,0 mL de Solución madre de medio basal y agua suficiente para obtener 1O mL. Colocar un con-
junto completo de tubos de Estándar y Muestra juntos en una gradilla y el conjunto duplicado en una segunda gradilla o
en otra sección de la misma gradilla, preferentemente en orden aleatorio.
Cubrir los tubos de ambas series para prevenir la contaminación y colocar en un autoclave a 121 º durante 5 minutos. En-
friar, agregar 1 gota de inóculo a cada uno de los tubos, excepto a dos de los cuatro tubos que no contengan Preparación
Estándar (para que sirvan como blancos no inoculados) y mezclar. Incubar los tubos a una temperatura entre 30º y 37º
mantenida con variaciones permitidas de ± 0,5º hasta que, una vez incubados durante un período entre 16 y 24 horas, no
haya habido un aumento sustancial de la turbidez en los tubos que contienen el nivel más alto de estándar durante un
período de 2 horas.
Determinar la transmitancia de los tubos de la siguiente manera: Mezclar el contenido de cada tubo y transferir a un reci-
piente apto para la lectura óptica si fuera necesario. Colocar el recipiente en un espectrofotómetro ajustado a una longi-
tud de onda específica entre 540 nm y 660 nm y tomar la lectura de la transmitancia cuando se alcanza un estado esta-
cionario. Este estado estacionario se observa unos pocos segundos después de agitar cuando la lectura del galvanómetro
permanece constante durante 30 segundos o más. Emplear aproximadamente el mismo intervalo de tiempo para la lectu-
ra de cada tubo.
Con la transmitancia fija en 1,00 para el blanco no inoculado, leer la transmitancia del blanco inoculado. Con la transmi-
tancia fija en 1,00 para el blanco inoculado, leer la transmitancia para cada uno de los tubos restantes. Si hay evidencia de
contaminación con un microorganismo extraño, descartar el resultado de la valoración.
Cálculos: Preparar una curva estándar de concentración-respuesta del siguiente modo. Para cada nivel del estándar, calcu-
lar la respuesta a partir de la suma de los valores duplicados de transmitancia como la diferencia y= 2,00 - I (de transmi-
tancia). Graficar la respuesta en la ordenada de un papel cuadriculado contra el logaritmo del volumen de Preparación es-
tándar en cada tubo, en mL, en la abscisa, usando para la ordenada una escala aritmética o logarítmica (eligiendo entre
estas dos la que más se aproxime a una recta). Trazar la línea recta o la curva continua que mejor se ajuste los puntos
graficados.
Calcular la respuesta, y, sumando las dos transmitancias para cada nivel de la Preparación de valoración. Leer, a partir de la
curva estándar, el logaritmo del volumen de la Preparación estándar correspondiente a cada uno de los valores de y que
estén dentro del intervalo entre los puntos máximos y mínimos graficados para el estándar. Restar de cada logaritmo así
obtenido el logaritmo del volumen, en mL, de la Preparación de valoración para obtener la diferencia, x, de cada nivel de
x
dosificación. Promediar los valores de x para cada uno de tres o más niveles de dosificación para obtener = M', el loga-
ritmo de la potencia relativa de la Preparación de valoración. Determinar la cantidad, en mg, de ER Pantotenato de Calcio
USP correspondiente al pantotenato de calcio en la porción del material tomada para el ensayo como antilog:

M = antilog (M' + log R)

R =es el número de mg de pantotenato de calcio que se supuso que estaban presentes por mg (o cápsula o table-
ta) del material tomado para valoración
Repetición: Repetir toda la determinación al menos una vez, usando Preparaciones de Valoración preparadas por separado.
Si la diferencia entre los dos logaritmos de las potencias M no es mayor de 0,08, su promedio, M, es el logaritmo de la
potencia del material de prueba analizado (ver Intervalo de Confianza y Límites de Potencia (111 )). Si las dos determinacio-
nes difieren en más de 0,08, realizar una o más determinaciones adicionales. Del promedio de dos o más valores de M que
no difieren en más de O, 15, calcular la potencia media de la preparación objeto de la valoración.

REQUISITOS ADICIONALES
• ESTÁNDARES DE REFERENCIA USP (11)
ER Pantotenato de Calcio USP

(92) FACTORES DE CRECIMIENTO Y CITOKINAS USADOS EN LA

FABRICACIÓN DE PRODUCTOS DE TERAPIA CELULAR

INTRODUCCIÓN
La calificación de reactivos, de materiales de origen y el control de los procesos de fabricación son elementos claves que asegu-
ran la calidad y seguridad de las terapias celulares. Los factores de crecimiento y las citokinas son importantes para el mante-
nimiento, crecimiento, selección y purificación de cultivos de productos de terapia celular. Este capítulo describe las pruebas,
procedimientos y criterios de aceptación aceptados para factores de crecimiento y citokinas que pueden estar implicados en
la fabricación de productos de terapia celular.
 USP 40 Pruebas Biológicas/ (92) Factores de Crecimiento 213

INTERLEUKINA RECOMBINANTE HUMANA 4 (rhll-4, por sus siglas en inglés)

MHKCDITLQE llKTLNSLTE QKTLCTELTV TDIFAASKNT
TEKETFCRAA TVLRQFYSHH EKDTRCLGAT AQQFHRHKQL
IRFLKRLDRN LWGLAGLNSC PVKEANQSTL ENFLERLKTI
MREKYSKCSS

15 096 Da

La rhlL-4 es un polipéptido de cadena simple de 130 residuos de aminoácido expresados en Escherichia coli. Se produce como
un polvo liofilizado y contiene no menos de 0,5 x 10 7 Unidades USP de IL-4/mg de proteína total. Las impurezas de ADN de
la célula anfitriona específicas del proceso en IL-4 con límites de menos de 1 ng/mg se determinan según se indica en Técni-
cas Basadas en Ácidos Nucleicos-Enfoques para Detectar Trazas de Ácidos Nucleicos (Análisis de ADN Residual) (1130). La IL-4
que se usa como material auxiliar durante la fabricación no requiere licencia de fabricación ni aprobación comercial. A conti-
nuación se presentan los atributos de calidad típicos de la IL-4.

IDENTIFICACIÓN
• A. El análisis de la secuencia amino-terminal de al menos ocho aminoácidos se realiza con un secuenciador automático. Los
feniltiohidantoín-aminoácidos liberados en etapas se identifican mediante cromatografía líquida de alta resolución en fase
reversa en línea, basándose en sus tiempos de elución.
• B. Usar el método de electroforesis seguido del análisis por Western blot para visualizar la proteína IL-4. El método es electro-
foresis en gel de poliacrilamida-dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE), descrito en la prueba de Pureza.
Solución salina amortiguada con fosfatos; Solución amortiguadora de Laemmli, reductora; y Solución amortiguadora
de Laemmli, no reductora: Proceder según se indica en la prueba de Pureza en la Valoración.
Solución madre del estándar: 50 µg/mL de ER rlnterleukina 4 Humana USP reconstituida en Solución salina amortiguada
con fosfatos. [NOTA-No agitar mientras se mezcla; mezclar suavemente por rotación.]
Solución estándar: 20 µg/mL de IL-4, a partir de Solución madre del estándar, en Solución salina amortiguada con fosfatos
Solución estándar, reductora: Combinar 20 µL de Solución estándar y 5 µL de Solución amortiguadora de Laemmli, reducto-
ra.
Solución estándar, no reductora: Combinar 20 µL de Solución estándar y 5 µL de Solución amortiguadora de Laemmli, no
reductora.
Solución madre de la muestra: 50 µg/mL de IL-4 reconstituida en Solución salina amortiguada con fosfatos. [NOTA-No
agitar mientras se mezcla; mezclar suavemente por rotación.]
Solución muestra: 20 µg/mL de IL-4, a partir de Solución madre de Ja muestra, en Solución salina amortiguada con fosfatos
Solución muestra, reductora: Combinar 20 µL de Solución muestra y 5 µL de Solución amortiguadora de Laemmli, reducto-
ra.
Solución muestra, no reductora: Combinar 20 µL de Solución muestra y 5 µL de Solución amortiguadora de muestra de
Laemmli, no reductora.
Análisis
Muestras: Solución estándar, reductora; Solución estándar, no reductora; Solución muestra, reductora; y Solución muestra, no
reductora
Western blot: Después de la electroforesis, las proteínas se transfieren a una membrana de fluoruro de polivinilideno
(PVDF) usando procedimientos estándares. Incubar la membrana durante 1 hora a temperatura ambiente con Solución sali-
na amortiguada con fosfatos que contenga O, 1% de polisorbato 20 y 5% de leche en polvo descremada. Posteriormente, la
membrana se incuba con un anticuerpo anti-IL-4 1 (diluido apropiadamente en Solución salina amortiguada con fosfatos), y
luego con un anticuerpo secundario, a temperatura ambiente y agitación suave, durante 1 hora para cada uno de los anti-
cuerpos. La banda de la proteína IL-4 se identifica desarrollando la membrana usando un sistema de detección adecuado.2
Criterios de aceptación: El Western blot desarrollado debe proporcionar una señal positiva equivalente al ER rlnterleukina
4 Humana USP.

VALORACIÓN
• PUREZA: [NOTA-La pureza se determina sobre la materia prima.] Se lleva a cabo una SDS-PAGE según se indica en Artículos
Obtenidos por Biotecnología-Electroforesis en Gel de Poliacrilamida (1056) en condiciones reductoras y no reductoras.
Marcador de peso molecular: Usar un marcador de peso molecular adecuado que contenga bandas de proteínas entre
1O y 200 kDa.
Solución salina amortiguada con fosfatos: Cloruro de potasio 2,67 mM, fosfato de potasio (KH 2 P0 4 ) 1,47 mM, cloruro
de sodio 137,93 mM y fosfato dibásico de sodio 8,06 mM en agua. Ajustar a un pH de 7,0-7,3.
Solución amortiguadora de Laemmli, no reductora: TRIS-HCI 100 mM, pH 6,8, 50% de glicerol, 0,25% de indicador de
azul de bromofenol y 10% de lauril sulfato de sodio en agua

1 Un anticuerpo anti-IL-4 adecuado se puede obtener de fuentes comerciales (p.ej., Dianova lnc.).
2 Un sistema de detección adecuado se puede obtener de fuentes comerciales (p.ej., Pierce/Perbio Science).
214 (92) Factores de Crecimiento/ Pruebas Biológicas USP 40

Solución amortiguadora de Laemmli, reductora: Agregar 2,5 µL mercaptoetanol a 50 µL de Solución amortiguadora de

Laemmli, no reductora.
Solución madre de la muestra: 400 µg/mL de IL-4 a granel en Solución salina amortiguada con fosfatos
Solución muestra 1: Combinar 20 µL de Solución madre de la muestra y 5 µL de Solución amortiguadora de Laemmli, no
reductora.
Solución muestra 2: Combinar 20 µL de Solución madre de la muestra y 5 µL de Solución amortiguadora de Laemmli, reduc-
tora.
Solución madre de control A: 4 µg/mL de IL-4, a partir de Solución madre de la muestra en Solución salina amortiguada con
fosfatos. [NOTA-Las soluciones de control A se corren por triplicado tanto en condiciones reductoras como en no reducto-
ras.]
Solución 1 de control A: Combinar 20 µL de Solución madre de control A y 5 µL de Solución amortiguadora de Laemmli, no
reductora.
Solución 2 de control A: Combinar 20 µL de Solución madre de control A y 5 µL de Solución amortiguadora de Laemmli,
reductora.
Solución madre de control B: 12 µg/mL de IL-4, a partir de Solución madre de la muestra en Solución salina amortiguada
con fosfatos. [NOTA-Las soluciones de control B se corren por duplicado tanto en condiciones reductoras como en no reduc-
toras.]
Solución 1 de control B: Combinar 20 µL de Solución madre de control By 5 µL de Solución amortiguadora de Laemmli, no
reductora.
Solución 2 de control B: Combinar 20 µL de Solución madre de control By 5 µL de Solución amortiguadora de Laemmli,
reductora.
Condiciones electroforéticas
(Ver Artículos Obtenidos por Biotecnología-Electroforesis en Gel de Poliacrilamida (1056).)
Modo: Gel para PAGE discontinuo
Gel concentrador: Acrilamida al 4%
Gel de resolución: Acrilamida al 12%
Condiciones de corrida: 1O minutos a 100 V; luego 30 minutos a 200 V
Detección de proteínas: Tinción con plata
Análisis
Muestras: Solución muestra 7, Solución muestra 2, Solución 7 de control A, Solución 2 de control A, Solución 7 de control By
Solución 2 de control B
Incubar 25 µL de Solución muestra y de Solución control en condiciones no reductoras durante 5 minutos a 60º y cargar en
el gel. Incubar 20 µL de Solución muestra y de Solución control en condiciones reductoras durante 5 minutos a 60º, y
cargar en el gel. Después de la tinción con plata y de barrer todo el gel, determinar la intensidad de todas las bandas de
proteína detectables por densitometría y calcular el porcentaje de cada banda de proteína detectable en la Solución
muestra dos veces comparando la intensidad de los pixeles de cada banda contaminante con el valor promedio de las
Soluciones de Control A y B, respectivamente, por las fórmulas:

Resultado= (A100) x 1 /(A1 ); y

Resultado = (A100) x 3/(A 3)

A100 = intensidad de una banda contaminante de la Solución muestra

A1 = intensidad promedio de todas las bandas detectables de la Solución de control A
A3 = intensidad promedio de todas las bandas detectables de la Solución de control B
El análisis de las soluciones de control de IL-4 debe producir una banda detectable con un peso molecular aparente de
aproximadamente 15 kDa. Si los valores calculados mediante la Solución de control A son diferentes de los que se obtie-
nen por comparación con la Solución de control B, se debe tomar el valor correspondiente a la cantidad más alta de im-
pureza. Si la intensidad de una de las bandas contaminantes es menor que el valor de la Solución de control A (correspon-
diente a 1%), el valor de esta contaminación se ajusta a 1%. La pureza de la solución muestra se calcula de la siguiente
manera:

Resultado = 100 - L Cn

C = porcentaje de cada contaminación provista en números enteros redondeados

n = número de contaminantes de IL-4 de la Solución muestra
Criterios de aceptación: La pureza de IL-4 es no menos de 97%, según se determina mediante SDS-PAGE.
• CONTENIDO DE PROTEÍNAS: [NOTA-El contenido de proteínas se determina basándose en el producto envasado.]
Solución salina amortiguada con fosfatos: Proceder según se indica en la prueba de Pureza.
Solución muestra: 50 µg/mL de IL-4 en Solución salina amortiguada con fosfatos. [NOTA-No agitar mientras se mezcla;
mezclar suavemente por rotación.]
Blanco: Solución salina amortiguada con fosfatos
USP 40 Pruebas Biológicas/ (92) Factores de Crecimiento 215

Condiciones espectrornétricas
(Ver Espectroscopía Ultravioleta-Visible (857).)
Modo: UV
Longitud de paso: 1 cm
Longitud de onda analítica: 280 nm
Análisis
Muestras: Solución muestra y Blanco
Calcular la concentración de proteínas:

C = A280 /0,63

C =concentración de IL-4 de la Solución muestra (mg/ml)

A280 = absorbancia a 280 nm

PRUEBAS ESPECÍFICAS
• IDENTIDAD BIOLÓGICA: [NOTA-La medición de la actividad biológica se determina basándose en el producto envasado.]
Medio RPMI 1640 con L-glutarnina: Preparar una mezcla de los ingredientes en las cantidades que se presentan en la si-
guiente tabla en suficiente agua para obtener 1 L de medio y esterilizar mediante filtración:

Material Cantidad
Nitrato de calcio (Ca(N0,)-4H,O) 100 mg
Sulfato de magnesio (MgS0 4 ·7H,O) 100 mg
Cloruro de potasio 400mg
Cloruro de sodio 6000 mg
Fosfato dibásico de sodio anhidro 800 mg
Bicarbonato de sodio 2000 mg
Glicina lOmg
L-Arginina 200mg
L-Asparagina 50 mg
Ácido L-aspártico 20 mg
Diclorhidrato de L-cistina 20 mg
Ácido L-glutámico 20 mg
L-Glutamina 300 mg
L-Histidina 15 mg
L-Hidroxiprolina 20 mg
L-lsoleucina 50 mg
L-Leucina 50 mg
Clorhidrato de L-lisina 40 mg
L-Metionina 15 mg
L-Fenilalanina 15 mg
L-Prolina 20 mg
L-Serina 30 mg
L-Treonina 20 mg
L-Triptófano 5 mg
Sal disódica de L-tirosina dihidrato 20 mg
L-Valina 20 mg
Biotina 0,2 mg
Cloruro de colina 3 mg
D-Pantotenato de calcio 0,25 mg
Ácido fálico 1 mg
i-lnositol 35 mg
Niacinamida 1 mg
Ácido para-aminobenzoico 1 mg
Clorhidrato de piridoxina 1 mg
Riboflavina 0,2 mg
Clorhidrato de tiamina 1 mg
Vitamina B12 0,005 mg
216 (92) Factores de Crecimiento/ Pruebas Biológicas USP 40

Material Cantidad
D-Glucosa (dextrosa) 2000 mg
Glutationa (reducida) 1 mg
Rojo de fenol 5 mg

Medio de crecimiento: Usando procedimientos asépticos, preparar el siguiente medio de cultivo de tejidos:

RPMl-1640 con L-glutamina 500 ml

Piruvato de sodio 100 mM 5 ml
Suero fetal bovino 50 ml
rFEC-GM humanoª 3 x 104 Unidades Internacionales
ª El Factor Estimulante de Colonias de Granulocitos y Macrófagos (FEC-GM) se agrega de manera extemporánea.

Esterilizar mediante filtración y almacenar a una temperatura entre 2º y 8º. Usar dentro del periodo de 1 mes. Agregar el
FEC-GM inmediatamente antes de su uso.
Medio de valoración: Usar Medio de crecimiento que no contenga FEC-GM.
Solución salina amortiguada con fosfatos: Proceder según se indica en la prueba de Pureza en la Valoración.
Solución de resazurina : 11 mg de resazurina en 100 mL de Solución salina amortiguada con fosfatos. [NOTA-Esterilizar
mediante filtración y almacenar la solución protegida de la luz a 4º. La Solución de resazurina es estable durante al menos 6
meses si se trata en condiciones estériles.]
[NOTA-Para todas las Soluciones estándar y Soluciones muestra, la concentración de IL-4 se determina mediante fotometría
a 280 nm usando un coeficiente de extinción (t:) de 0,63 mg-1cm- 1.]
Solución madre del estándar: 50 µg/mL de ER rlnterleukina 4 Humana USP en Solución salina amortiguada con fosfatos.
[NOTA-No agitar mientras se mezcla; mezclar suavemente por rotación.]
Soluciones estándar: 36; 12; 4; 1,33; 0,44; O, 15; 0,05; 0,016; 0,006 ng/mL de IL-4, a partir de Solución madre del están-
dar en Medio de valoración
Solución madre de la muestra: 50 µg/mL de IL-4 en Solución salina amortiguada con fosfatos. [NOTA-No agitar mientras
se mezcla; mezclar suavemente por rotación.]
Soluciones muestra: 36; 12; 4; 1,33; 0,44; 0, 15; 0,05; 0,016; 0,006 ng/mL de IL-4, a partir de Solución madre de la mues-
tra en Medio de valoración
Solución control: Usar el Medio de valoración.
Preparación del cultivo celular: Preparar cultivos celulares de la línea celular TF-1 dependiente del factor humano (ATCC
Nº CRL-2003), siguiendo el protocolo descrito en la hoja de información de ATCC. Realizar transferencias de los cultivos
cada 2-3 días, usando subcultivos 1 :3 de las células durante un máximo de 1 mes. La densidad de siembra debe ser de 0,5
x 106 células/mL y la densidad máxima debe ser de 3 x 106 células/ml. La viabilidad de las células debe ser >90%. El núme-
ro máximo de pasajes es 24 y el tiempo de cultivo máximo a partir de la descongelación es 28 días. Después de 28 días,
iniciar un nuevo cultivo. Las células se propagan usando Medio de cultivo a 37°, suplementado con aire y dióxido de carbo-
no al 5%.
Análisis
Muestras: Soluciones estándar, Soluciones muestra y Solución control
La actividad de la Solución muestra se determina por duplicado. Lavar las células tres veces en Solución salina amortiguada
con fosfatos. Colocar en una placa 2 x 104 células TF-1 resuspendidas en 100 µL de Medio de valoración por pocillo en
microplacas de fondo plano de 96 pocillos. Incubar durante 72 horas a 37º y en una atmósfera de C0 2 al 5% en un
incubador humidificado en presencia o ausencia de diversas concentraciones de Solución estándar, Solución muestra o
Solución control agregando 100 µL de la solución correspondiente a cada pocillo. Agregar 30 µL de Solución de resazurina
a cada pocillo e incubar durante 24 horas más. Determinar la intensidad de la fluorescencia por pocillo leyendo la placa
con un lector de microplaca usando 544 nm (excitación) y 590 nm (emisión). Convertir la intensidad de fluorescencia
en cada pocillo a un porcentaje de intensidad de fluorescencia máxima. Para la Solución muestra y la Solución estándar,
graficar el porcentaje de la intensidad de fluorescencia en función de la concentración de la solución pertinente. Usando
el método de cuadrados mínimos del análisis de regresión, calcular el ED50 en ng/mL de la Solución muestra y la Solución
estándar. El coeficiente de determinación para la curva de regresión debe ser 2 0,98. Calcular la potencia en Unidades
USP de lnterleukina 4/mg:
Resultado = A x Es/Eu

A =actividad de ER rlnterleukina 4 Humana USP (unidades USP/mg)

E5 = ED 50 determinado de la Solución estándar (ng/mL)
Eu = ED 50 determinado de la Solución muestra (ng/mL)
Criterios de aceptación: No menos de 0,5 x 10 7 Unidades USP de IL-4/mg
• PRUEBAS DE ESTERILIDAD (71 ): Cumple con los requisitos
USP 40 Pruebas Biológicas/ (111) Diseño y Análisis de Valoraciones Biológicas 21 7

• PRUEBA DE ENDOTOXINAS BACTERIANAS (85): Contiene no más de 50 Unidades USP de Endotoxina/mg

REQUISITOS ADICIONALES
• ENVASADO Y ALMACENAMIENTO: Conservar en envases impermeables y almacenar a -80º.
• ETIQUETADO: El material se origina de ADN recombinante.
• ESTÁNDARES DE REFERENCIA USP (11)
ER Endotoxina USP
ER rlnterleukina 4 Humana USP

(111) DISEÑO Y ANÁLISIS DE VALORACIONES BIOLÓGICAS

INTRODUCCIÓN

La potencia de varios artículos Farmacopeicos debe ser determinada mediante valoraciones biológicas. El objetivo de este
capítulo es presentar un resumen conciso de algunos procedimientos biométricos esenciales para las valoraciones biológicas
incluidas en los capítulos o monografías de los compendios USP-NF, en particular para la identificación de valores aberrantes,
la determinación de los intervalos de confianza para mediciones de potencia relativa y la combinación de valoraciones inde-
pendientes. Para las valoraciones biológicas que no forman parte de los compendios USP-NF, pueden ser apropiados otros mé-
todos. Se recomienda ver el capítulo de información general Análisis de Valoraciones Biológicas (1034) que puede ser una guía
útil, mas no obligatoria.

RECHAZO DE OBSERVACIONES ABERRANTES

Una respuesta que es dudosa debido a que no cumple con el procedimiento durante el curso de una valoración es rechaza-
da. Otros valores aberrantes pueden descubrirse sólo después de tabular las respuestas, pero entonces pueden ser relacionadas
con irregularidades en la valoración que justifiquen su omisión. El rechazo o retención arbitraria de una respuesta aparente-
mente aberrante puede ser una importante fuente de sesgo. Por lo general, el rechazo de observaciones basado únicamente
en la magnitud relativa, sin investigar la causa, es un procedimiento que debe usarse con poca frecuencia. Si se entendiera
que, ya sea después investigar la causa o basándose en la experiencia práctica del ensayo, es poco probable que la discrepan-
cia en los valores observados surja de una respuesta esperable del ensayo, entonces la respuesta aberrante o atípica debería ser
analizada contra uno de dos criterios, los cuales asumen que los datos tienen una distribución aproximadamente normal (la
cual podría ser satisfecha sólo después de una transformación adecuada de las respuestas originales). Se pueden usar métodos
alternativos estadísticamente sólidos para la detección de valores aberrantes. Las condiciones en las que debe llevarse a cabo el
análisis de valores aberrantes y los criterios que deben usarse, deben estar previamente especificados en los procedimientos del
laboratorio cuando no se especifiquen en la monografía o el capítulo.

Criterio 1 (Prueba de Dixon)

El primer criterio se basa en la variación dentro de un grupo único de respuestas supuestamente equivalentes, tal como las
obtenidas de un grupo de animales al que se trato con una concentración habitual de la muestra. A un nivel de confianza de
99%, una observación válida será rechazada en uno de cada 100 ensayos (cuando el valor atípico sospechado pueda presen-
tarse en un solo extremo) o en uno de cada 50 ensayos (cuando el valor atípico pueda presentarse en cualquiera de los dos
extremos), siempre y cuando pocas o ninguna de las respuestas dentro del grupo sean idénticas. Ordenar las respuestas en el
orden de magnitud desde y7 hasta yN, donde N es el número de observaciones en el grupo. Calcular el intervalo relativo usan-
do las fórmulas de la siguiente Tabla 7.
Tabla 1
El valor aberrante candidato es el más pe- El valor aberrante candidato es el más
Tamaño de la Muestra (N) queño (y,) grande (YN)
3-7 G¡ =(Y; - Y1)/(yN - Y1) e,= (YN - YN-1)/(yN - Y1)
8-10 G2 = (Y2 - Y1)/(YN-1 - Y1) Gz = (YN - YN-1)/(yN - y,)
11-13 G, = (y3 - Y1)f(YN-1 - Y1) G3 = (YN - YN-2)/(YN - Y2)

Si Gu G2 o G3, según corresponda, exceden el valor crítico de la Tabla 2, para el valor N observado, existe una base estadísti-
ca para identificar la medición discordante como un valor aberrante y para considerar su eliminación. Para un valor N mayor
que 1 3, usar el Criterio 2.
En muestras tomadas de una población normal, a un nivel de confianza de 99%, los intervalos iguales o mayores que los
siguientes valores de G7, G2 y G3 ocurren c:on una probabilidad de P = 0,01, en donde las mediciones de valores aberrantes
218 (111) Diseño y Análisis de Valoraciones Biológicas / Pruebas Biológicas USP 40

pueden ocurrir sólo en un extremo o con una probabilidad de P = 0,02 en donde pueden ocurrir en cualquiera de los dos
extremos.
Tabla 2. Prueba para Mediciones de Valores Aberrantes
N 1 3 1 4 1 5 1 6 1 7
G¡ 1 0,988 1 0,889 1 0,780 1 0,698 1 0,637

N 1 8 1 9 1 10 1 - 1 -

G2 1 0,683 1 0,635 1 0,597 1 - 1 -

N 1 11 1 12 1 13 1 - 1 -

G, 1 0,679 1 0,642 1 0,615 1 - 1 -

Criterio 2 (Grubbs, Prueba Estudentizada de Desviación Extrema)

El segundo criterio se puede usar para detectar la presencia de valores aberrantes en grupos de respuestas supuestamente
equivalentes y también se puede usar al examinar el conjunto de residuales a partir de un modelo ajustado (lineal o no lineal)
cuando existe una varianza constante. El modelo final (que produce residuales para la detección de valores aberrantes) debe
incluir todas las variables importantes del diseño. (Para mayor información sobre las variables del diseño, ver el capítulo de
información general Diseño y Desarrollo de Valoraciones Biológicas (1032), que puede ser un recurso útil, mas no obligatorio.)
(Se debe tener en cuenta que, para su aplicación a residuales, la siguiente información es una aproximación. Si el software
estadístico provee residuales estudentizados, dichos valores deben usarse en lugar de los obtenidos con la siguiente ecuación.)
Para el valor, R, que está más alejado de la media de la muestra, calcular la desviación estandarizada Z:

Z= (R- R)/S
donde Ry S son la media y la desviación estándar, respectivamente, del conjunto de valores. Para residuales obtenidos de un
ajuste de cuadrados mínimos, como en el caso de una valoración por el método de líneas paralelas, R = O y Ses la raíz cuadra-
da del cuadrado medio residual del análisis. Si IZI es mayor que C según se determina a continuación, entonces el valor R se
identifica como un valor aberrante estadístico al nivel de 1%.

C= (N - l)taf-1,p
JN( N-2+t~f-l,p)
donde N es el tamaño de la muestra, tes el punto porcentual 1OOp unilateral a partir de la distribución t con los grados de
libertad df los grados de libertad relacionados con 5:

p=1-JLlll_
2N
Se encuentran disponibles métodos alternativos para valores aberrantes que están diseñados para el análisis de conjuntos de
datos que pueden contener múltiples valores aberrantes y para la detección de valores aberrantes relacionados con el diseño o
modelo de la valoración biológica. Para mayor información sobre valores aberrantes, ver el capítulo de información general
Datos Analíticos-Interpretación y Tratamiento (1010), que puede ser un recurso útil, mas no obligatorio.

EL INTERVALO DE CONFIANZA V LOS LÍMITES DE POTENCIA

El siguiente método (de Fieller) se usa para determinar el intervalo de confianza para una estimación del logaritmo de poten-
cia relativa a partir de una valoración por el método de líneas paralelas o valoración por el método de razón de pendientes. Se
supone que M =a/bes el cociente para el cual se requiere un intervalo de confianza. Para las estimaciones, a y b, se cuenta
con sus respectivos errores estándar, SE0 y SEb, y una covarianza entre estos, denotada Cov. El intervalo de confianza, (M 80¡01
MA 1,0 ), para el logaritmo de potencia relativa estimado es entonces el siguiente:

¡ M - gCov ±
SE2
_!__
b
(l-g)SE2 + M 2 SE2 - 2MCov + gCov'
º b SE 2
(M,,,,,M,,,Jol ' 1-g "

donde:
USP 40 Pruebas Biológicas/ (111) Diseño y Análisis de Valoraciones Biológicas 219

y t =tdt,a/2 es el punto porcentual superior a/2 (o el punto porcentual a bilateral) con los grados de libertad residuales, df,
obtenidos del análisis estadístico y el nivel de confianza seleccionado, 100*(1-u), (por lo regular 95%). Si g:::: 1, significa que el
denominador, b, desde el punto de vista estadístico, no es significativamente distinto de O y el uso del cociente no es prudente
para dichos datos. La longitud, L, de este intervalo de confianza es MAita - M80¡0 •
Para aquellos casos en los que las estimaciones de a y b no tenga una correlación estadística (Cov =O), la fórmula del inter-
valo de confianza se simplifica a la siguiente:

(M,,;,,M,,,'°) -
-!M ± ~~(1-1g) SE~ + M 2 SE~)
-g

Para mayor información sobre los intervalos de confianza para potencia, ver el capítulo (1034) que puede ser un recurso útil,
pero no obligatorio.

COMBINACIÓN DE VALORACIONES INDEPENDIENTES

Cuando la monografía o el capítulo lo permitan, se pueden realizar múltiples valoraciones independientes hasta que los re-
sultados combinados reduzcan el ancho del intervalo de confianza hasta que éste quede comprendido dentro de los límites
especificados en la monografía o capítulo pertinente. Cuando se requieren dos o más valoraciones independientes y cada una
de ellas conduce a un logaritmo de la potencia M, los valores M se combinan usando uno de los dos métodos siguientes.

Método 1

Se define M1 como el logaritmo de potencia relativa de la ima valoración de h resultados de valoración que se van a combi-
nar. Para combinar los resultados h, la media, la desviación estándar y el error estándar del valor M1 se calculan siguiendo el
procedimento usual :
h
Media ÑI= I,MJh
¡ ~1

Desviación Estándar S = -
h-1H
-i_: (M; - M)'
1

Error Estándar SE= S / Jh

Entonces, un intervalo de confianza de 100(1 - a)% se encuentra como:

M± fh-1,a/2SE
donde th-l,a/2 es el punto porcentual superior a/2 (o el punto porcentual a bilateral) de una distribución t con h - 1 grados de
libertad. El ancho, L, de este intervalo es 2th-J,ai2 SE.

Método 2

Se supone que los resultados de cada una de las h valoraciones han sido analizados para proveer h valores de logaritmo de
potencia con límites de confianza relacionados. Para cada valoración, i, se obtiene el intervalo de confianza para el logaritmo
de potencia o el logaritmo de potencia relativa. Posteriormente, se calcula el valor L1 restando el imo límite de confianza infe-
rior del imo límite de confianza superior. El peso w, para cada valor del logaritmo de la potencia relativa, M1, se calcula según se
indica a continuación, donde t1 tiene el mismo valor de distribuciónt que el usado en el cálculo de los límites de confianza en la
ima valoración y se basa en n1 grados de libertad:

4t~
, e
w.=-1-
1

Se calculan los productos w1M1 para cada valoración, y la suma de estos se divide por el peso total (w) de todas las valoracio-
nes para obtener la media ponderada del logaritmo de potencia relativa y su error estándar según se indica a continuación:
- h
Media, M = L w,M, I w
(:=1

Error Estándar Aproximado, SE = 1I rw (1)

h
donde w= ,Lw,
jo;;1
220 (111 > Diseño y Análisis de Valoraciones Biológicas / Pruebas Biológicas USP 40

A continuación, calcular un chi cuadrado aproximado:

i=l Í=l

Si el valor aproximado de x2 M está bien por debajo del valor de 5% presentado en la Tabla 3, calcular el intervalo de confian-
za usando las ecuaciones de media y error estándar aproximados en (1) anteriores; de otro modo, usar Pesos alternativos según
se describe a continuación. Es necesario que los laboratorios especifiquen en sus procedimientos cómo cuantificar los valores
que están "bien por debajo". En ausencia de dicha especificación, se sugieren los valores de 20% de la Tabla 3.
Entonces, un intervalo de confianza de 100(1 - a)% en la escala logarítmica se encuentra como:
M± L/2

donde L= 2tdf,a/2
rw
l+_i_x
W2
I
i=l
w,(w-w,)
n;
h-2
n' =n-4x--
' ' h-1
y df = wjj
/ ~w~ In,

donde tN,a/l es el punto porcentual superior a/2 (o el punto porcentual a bilateral) de una distribución t con grados de liber-
tad, df. El ancho de este intervalo es L.
Tabla 3. Valores Críticos para la Prueba de Chl Cuadrado Aproximado
Valores Críticos
h 5% 20%
2 3,841 1,642
3 5,991 3,219
4 7,815 4,642
5 9,488 5,989
6 11,070 7,289
7 12,592 8,558
8 14,067 9,803
9 15,507 11,030
10 16,919 12,242

Pesos Alternativos: La variación observada entre los logaritmos de potencia o de potencias relativas estimados se puede
dividir en dos componentes:
• variación intravaloración para la valoración i: V,= 1/w,
•componente intervaloración de variación:

1 h -2 lh
528-- máx{o,-I(M; -M) - - ¿v;}
h-1 i=l h i=l
Posteriormente, para cada valoración se calcula un coeficiente ponderado como:

1
w.=--
f

' 11 + s2
V¡ B

Entonces, el intervalo de confianza se encuentra como:

M±txSE',
h
donde SE'=l/N y w'= ¿w;
i=l

y t, el valor de distribución t, a menudo se aproxima mediante el valor 2.

Para mayor información sobre la combinación de valoraciones, ver el capítulo (1034), que puede ser un recurso útil, mas no
obligatorio.
USP 40 Pruebas Biológicas/ (115) Valoración de Dexpantenol 221

APÉNDICE-BIBLIOGRAFÍA IMPORTANTE

Bliss, CI. Analysis of the biological assays in USP XV. Drug Standards, 24, 33-67, 1956.
Bohrer A. One-sided and two-sided critica! values for Dixon's outlier test for sample sizes up to n = 30. Economic Quality
Control 23, 5-13, 2008.
Cochran, WG. The combination of estimates from different experiments. Biometrics 1O, 101-129, 1954.
Fieller, EC. Sorne problems in interval estimation. journal of the Royal Statistical Society, B 16, 175-185, 1954.
lglewicz, B and Hoaglin, OC. How to Detect and Handle Outliers. Quality Press, Milwaukee, 1993.

(115) VALORACIÓN DE DEXPANTENOL

VALORACIÓN
• PROCEDIMIENTO
Este procedimiento se utiliza para realizar la valoración de dexpantenol cuando se presenta como ingrediente de prepara-
ciones multivitamínicas. Se aplica también para determinar el componente dextrógiro del pantenol racémico y de otras
mezclas que contengan pantenol dextrógiro.
Pueden usarse medios preparados según se indica a continuación o mezclas deshidratadas que proporcionen formulaciones
similares, siempre y cuando, una vez reconstituidas de acuerdo con las instrucciones del fabricante o del distruidor, po-
sean propiedades de promoción del crecimiento equivalentes o superiores a las obtenidas con las fórmulas incluidas en
este capítulo.
Solución madre del estándar de dexpantenol: Disolver en agua una cantidad pesada con exactitud de ER Dexpantenol
USP, diluir cuantitativamente con agua para obtener una solución con una concentración conocida de aproximadamente
800 µg por ml y mezclar. Almacenar en un refrigerador, al resguardo de la luz, y usar dentro de los 30 días de preparada.
Preparación estándar: El día de la valoración, preparar una dilución de la Solución madre del estándar de dexpantenol en
agua para obtener una concentración de 1,2 µg de dexpantenol por ml.
Preparación de valoración: Proceder según se indica en la monografía individual y preparar una solución que se espera
que contenga aproximadamente el equivalente a la concentración de dexpantenol en la Preparación estándar.
Medio de pantotenato modificado: Disolver la dextrosa anhidra y el acetato de sodio en las soluciones previamente mez-
cladas; ajustar con hidróxido de sodio 1 N a un pH de 6,8. Finalmente, diluir con agua a 250 ml y mezclar.

Solución de Hidrolizado Ácido de Caseína 25 ml

Solución de Cistina-Triptófano 25 ml
Solución de Polisorbato 80 0,25 ml
Dextrosa, Anhidra 10 g
Acetato de Sodio, Anhidro 5g
Solución de Adenina-Guanina-Uracilo 5 ml
Solución de Riboflavina-Clorhidrato de Tiamina-Biotina 5 ml
Solución de Ácido Paraaminobenzoico-Niacina-Clorhidrato de Piridoxina 5 ml
Solución Salina A 5 ml
Solución Salina B 5 ml
Solución de Pantotenato de Calcio-Piridoxal 5 ml
Solución de Polisorbato 40-Ácido Oleico 5 ml

Medio de pantotenato modificado de doble concentración: Preparar según se indica en Medio de pantotenato modifica-
do, pero hacer que la dilución final sea de 125 ml en vez de 250 ml. Preparar a diario.
Solución de hidrolizado ácido de caseína: Mezclar 100 g de caseína sin vitaminas con 500 ml de ácido clorhídrico 6 N y
someter la mezcla a reflujo entre 8 y 12 horas. Eliminar el ácido clorhídrico de la mezcla mediante destilación bajo presión
reducida hasta que quede una pasta espesa. Redisolver la pasta resultante en aproximadamente 500 ml de agua, ajustar la
solución con hidróxido de sodio 1 N a un pH de 3,5 ± O, 1 y agregar agua para obtener 1000 ml. Agregar 20 g de carbón
activado, revolver durante 1 hora y filtrar. Repetir el tratamiento con carbón activado. Almacenar bajo tolueno en un refri-
gerador a una temperatura no inferior a 1Oº. Filtrar la solución si se formara un precipitado durante el almacenamiento.
Solución de cistina-triptófano: Suspender 4,0 g de L-cistina y 1,0 g de L-triptófano (o 2,0 g de D,L-triptófano) en un volu-
men de agua entre 700 y 800 ml, calentar a 75 ± 5º y agregar, gota a gota y agitando, ácido clorhídrico diluido (1 en 2)
hasta que los sólidos se disuelvan. Enfriar, agregar agua para obtener 1000 ml y mezclar. Almacenar bajo tolueno en un
refrigerador a una temperatura no inferior a 1Oº.
Solución de adenina-guanina-uracilo: Disolver 200 mg de sulfato de adenina, 200 mg de clorhidrato de guanina y 200
mg de uracilo, con ayuda de calor, en 1O ml de ácido clorhídrico 4 N, enfriar, agregar agua para obtener 200 ml y mez-
clar. Almacenar bajo tolueno en un refrigerador.
222 (115) Valoración de Dexpantenol / Pruebas Biológicas USP 40

Solución de polisorbato 80: Disolver 25 g de polisorbato 80 en alcohol para obtener 250 ml y mezclar.
Solución de riboflavina-clorhidrato de tiamina-biotina: Disolver riboflavina, clorhidrato de tiamina y biotina en ácido
acético 0,02 N para obtener una solución que contenga 20 µg de riboflavina, 1O µg de clorhidrato de tiamina y 0,04 µg de
biotina por ml. Almacenar, protegida de la luz, bajo tolueno en un refrigerador.
Solución de ácido paraaminobenzoico-niacina-clorhidrato de piridoxina: Preparar una solución con alcohol neutraliza-
do al 25 por ciento para obtener las siguientes concentraciones: 1O µg de ácido paraaminobenzoico, 50 µg de niacina y 40
µg clorhidrato de piridoxina por ml. Almacenar en un refrigerador.
Solución salina A: Disolver 25 g de fosfato monobásico de potasio y 25 g de fosfato dibásico de potasio en agua para ob-
tener 500 ml. Agregar 5 gotas de ácido clorhídrico, mezclar y almacenar bajo tolueno.
Solución salina B: Disolver en agua 1Og de sulfato de magnesio, 0,5 g de cloruro de sodio, 0,5 g de sulfato ferroso y 0,5
g de sulfato de manganeso para obtener 500 ml. Agregar 5 gotas de ácido clorhídrico, mezclar y almacenar bajo tolueno.
Solución de piridoxal-pantotenato de calcio: Disolver 40 mg de clorhidrato de piridoxal y 375 µg de pantotenato de
calcio en alcohol al 1O por ciento para obtener 2000 ml y mezclar. Conservar en un refrigerador y usar dentro de los 30
días de preparada.
Solución de polisorbato 40-ácido oleico: Disolver 25 g de polisorbato 40 y 0,25 g de ácido oleico en alcohol al 20 por
ciento para obtener 500 ml y mezclar. Conservar en un refrigerador y usar dentro de los 30 días de preparada.
Cultivo madre de Pediococcus acidilactici: Disolver con ayuda de calor 6,0 g de peptona, 4,0 g de digerido pancreático de
caseína, 3,0 g de extracto de levadura, 1,5 g de extracto de carne, 1,0 g de dextrosa y 15,0 g de agar en aproximadamen-
te 800 ml de agua. Ajustar con hidróxido de sodio O, 1 N o ácido clorhídrico 0, 1 N a un pH entre 6,5 y 6,6, agregar agua
hasta 1000 ml y mezclar. Agregar porciones de aproximadamente 1O ml de la solución a tubos de cultivo, tapar y esterili-
zar a 121 º durante 15 minutos. Enfriar en pendiente y almacenar en un refrigerador. Preparar un cultivo madre de Pedio-
coccus acidilactici* en un tubo conteniendo una cuña de este medio. Incubar a 35º durante 20 a 24 horas y almacenar en
un refrigerador. Mantener el cultivo madre realizando transferencias mensuales en tubos con medio en cuña nuevos.
lnóculo: Inocular tres porciones de 250 ml de Medio de pantotenato modificado de una pendiente de cultivo madre e incu-
bar a 35º durante 20 a 24 horas. Centrifugar la suspensión de las porciones combinadas y lavar las células con Medio de
pantotenato modificado. Resuspender las células en suficiente Medio de pantotenato modificado de manera que una dilución
1:50, cuando se analiza en un tubo de ensayo de 13 mm de diámetro, proporciona una transmisión de luz de 80% a 530
nm. Transferir porciones de 1,2 ml de esta suspensión madre a ampollas de vidrio, sellar, congelar en nitrógeno líquido y
almacenar en un congelador. El día de la valoración, dejar que las ampollas alcancen temperatura ambiente, mezclar el
contenido y diluir 1 ml del cultivo descongelado con solución salina estéril SR hasta 150 ml. [NOTA-Esta dilución se pue-
de modificar, cuando sea necesario, para obtener la respuesta deseada.]
Procedimiento: Preparar por triplicado series de ocho tubos de cultivo agregando las siguientes cantidades de agua a los
tubos de una serie: 5,0 ml, 4,5 ml, 4,0 ml, 3,5 ml, 3,0 ml, 2,0 ml, 1,0 ml y 0,0 ml. A estos mismos tubos y en ese
mismo orden agregar 0,0 ml, 0,5 ml, 1,0 ml, 1,5 ml, 2,0 ml, 3,0 ml, 4,0 ml y 5,0 ml de la Preparación estándar.
Preparar por duplicado una serie de cinco tubos de cultivo agregando las siguientes cantidades de agua a los tubos de una
serie: 4,0 ml, 3,5 ml, 3,0 ml, 2,0 ml y 1,0 ml. A estos mismos tubos y en ese mismo orden, agregar 1,0 ml, 1,5 ml, 2,0
ml, 3,0 ml y 4,0 ml de la Preparación de valoración.
Agregar 5,0 ml de Medio de pantotenato modificado de doble concentración a cada tubo y mezclar. Cubrir los tubos con
tapas metálicas y esterilizar en autoclave a 121 º durante 5 minutos. Enfriar a temperatura ambiente en un baño de agua
fría e inocular cada tubo con 0,5 ml del lnóculo. Dejar incubando a 37º durante 16 horas. Detener el crecimiento calen-
tando a una temperatura no inferior a 80º, por ejemplo mediante la aplicación de vapor a presión atmosférica en un este-
rilizador adecuado durante 5 a 1O minutos. Enfriar y determinar concomitantemente el porcentaje de transmitancia de la
suspensión, en celdas de igual paso óptico, en un espectrofotómetro adecuado, a 530 nm.
Cálculo: Dibujar una curva de dosis-respuesta en papel para gráficos aritméticos trazando la respuesta promedio, en por-
centaje de transmitancia, para cada conjunto de tubos de la curva estándar en función de las concentraciones del estándar.
La curva se traza uniendo cada par adyacente de puntos con una línea recta. A partir de esta curva estándar, determinar la
potencia por interpolación, en función del dexpantenol, de cada tubo que contiene porciones de la Preparación de valora-
ción. Dividir la potencia de cada tubo por la cantidad de Preparación de valoración agregada para obtener las respuestas
individuales. Calcular la respuesta media realizando el promedio de las respuestas individuales que varían de su media en
no más de un 15%, utilizando no menos de la mitad del número total de tubos. Calcular la potencia de la porción de
material tomada para la valoración, en función del dexpantenol, multiplicando la respuesta promedio por el factor de dilu-
ción adecuado.

* La cepa ATCC (American Type Culture Collection) No. 8042 es adecuada.

USP 40 Pruebas Biológicas/ (121) Valoración de Insulina 223

REQUISITOS ADICIONALES
• ESTÁNDARES DE REFERENCIA USP (11)
ER Dexpantenol USP

(121) VALORACIÓN DE INSULINA

INTRODUCCIÓN
La manifestación más importante de la actividad de la insulina, un brusco descenso de la glucosa en sangre, sirvió de base para
valoraciones biológicas desde sus primeros usos clínicos. El procedimiento, si bien es relativamente complejo, tiene el gran
mérito de reflejar con exactitud el efecto en el paciente diabético. La aparición de métodos fisicoquímicos prácticos pero
sofisticados (por ejemplo la cromatografía líquida) para medir cuantitativamente la potencia de la insulina ha dado lugar a
pruebas farmacopeicas más precisas y exactas para la insulina y los productos derivados de la insulina. Sin embargo, no se
puede determinar la identidad biológica de la insulina y de sus productos por estos métodos. Por esta razón, se incluye en
este capítulo una prueba de bioidentidad en conejos y su uso se especifica en las monografías correspondientes.
El Método de Determinación de Glucosa en Sangre de Conejos-Cuantitativo se usa para determinar la potencia de los Estándares
de Referencia de la Insulina, para la validación de la estabilidad de nuevas preparaciones de insulina y para determinar las
actividades específicas de los análogos de la insulina.

VALORACIÓN
•MÉTODO DE DETERMINACIÓN DE GLUCOSA EN SANGRE DE CONEJOS-CUANTITATIVO
Diluyente: Preparar una solución acuosa que contenga de O, l % a 0,25% (p/v) de cresol o de fenol, de 1,4% a 1,8% (p/v)
de glicerina y suficiente ácido clorhídrico para obtener un pH entre 2,5 y 3,5 a menos que se especifique algo diferente en
la monografía individual.
Solución madre del estándar: Preparar una solución que contenga 40 Unidades USP de lnsulina/mL a partir de ER Insuli-
na USP de las especies apropiadas en Diluyente y con un pH entre 2,5 y 3,5, a menos que se especifique de otro modo en
la monografía individual. Para la insulina de especies bovina y porcina mezcladas, preparar una solución que contenga 34,8
Unidades USP de Insulina Bovina/mL y 5,2 Unidades USP de Insulina Porcina/mL en Diluyente con un pH entre 2,5 y 3,5.
Almacenar en un lugar frío, proteger contra la congelación y usarla dentro de un período de 6 meses.
Soluciones estándar: Diluir porciones de la Solución madre del estándar con Diluyente para obtener dos soluciones, una
que contenga 1,0 Unidad USP de lnsulina/mL (Solución estándar 7), y otra que contenga 2,0 Unidades USP de lnsulina/mL
(Solución estándar 2).
Solución madre de la muestra: Proceder según se indica en Solución madre del estándar, excepto que se debe usar una
cantidad adecuada de la preparación en análisis en lugar de ER Insulina USP de la especie apropiada. La Solución madre de
la muestra contiene aproximadamente 40 Unidades USP de lnsulina/ml.
Soluciones muestra: Diluir porciones de la Solución madre de Ja muestra con Diluyente para obtener dos diluciones de la
preparación en análisis, una de las cuales se puede esperar que contenga 1,0 Unidad USP de lnsulina/mL (Solución muestra
7), basándose en la potencia supuesta, y la otra que contenga 2,0 Unidades USP de lnsulina/mL (Solución muestra 2). En el
caso de una inyección de insulina neutra, ajustar a un pH entre 2,5 y 3,5 antes de realizar las diluciones.
Dosis de las soluciones a inyectar: Seleccionar la dosis de las diluciones a inyectar, basándose en pruebas o experiencias
anteriores, cuyo volumen generalmente está entre 0,30 mL y 0,50 ml. Para cada animal, el volumen de la Solución están-
dar es el mismo que el de la Solución muestra.
Preparación de los animales: Seleccionar conejos adecuados y sanos que no pesen menos de 1,8 kg cada uno. Mantener
los conejos en el laboratorio durante no menos de 1 semana antes de utilizarlos en la valoración y alimentarlos con una
dieta uniforme satisfactoria, con acceso libre al agua en todo momento.
Análisis: Dividir los conejos en cuatro grupos iguales, preferentemente de no menos de seis conejos cada uno. El día ante-
rior al procedimiento, aproximadamente 20 horas antes de la valoración, suministrar a cada conejo alimento suficiente pa-
ra que se consuma en 6 horas. Seguir este mismo programa de alimentación antes de cada día de prueba. Durante la valo-
ración, no suministrar alimentos hasta no haber extraído la última muestra de sangre. Manipular los conejos con cuidado
para evitar una excitación indebida e inyectar subcutáneamente las dosis indicadas en el siguiente diseño (ver la Tabla 7), la
segunda inyección se debe administrar el día posterior a la primera inyección o no más de 1 semana después. El tiempo
entre la primera y la segunda inyección es el mismo para todos los conejos.
Tabla 1
Grupo Primera Inyección Segunda Inyección
1 Solución estándar 2 Solución muestra 7
2 Solución estándar 7 Solución muestra 2
3 Solución muestra 2 Solución estándar 7
4 Solución muestra 7 Solución estándar 2
224 (121) Valoración de Insulina/ Pruebas Biológicas USP 40

Muestras de sangre: A 1 hora ± 5 minutos y 2 1/2 horas± 5 minutos después de la inyección, extraer de cada conejo una
muestra adecuada de sangre de una vena marginal de la oreja. La sangre también se puede extraer eficazmente de la arte-
ria auricular central.
Determinación de dextrosa: Determinar el contenido de dextrosa en las muestras de sangre mediante un procedimiento
adecuado que se adapte a un análisis automatizado. Se puede utilizar el siguiente procedimiento.
Solución anticoagulante: Disolver 1 g de edetato sódico y 200 mg de fluoruro de sodio en 1 L de agua y mezclar.
Preparaciones estándar de dextrosa: Transferir concentraciones conocidas de ER Dextrosa USP a recipientes adecuados
y diluir cuantitativamente y en diluciones sucesivas con Solución anticoagulante (1 :9) para obtener una serie de Preparacio-
nes estándar de dextrosa que contengan entre 20 mg y 100 mg por 100 mL con concentraciones conocidas similares a las
concentraciones de las muestras de sangre de los conejos.
Preparaciones muestra: Pipetear y transferir a sendos recipientes adecuados O, 1 mL de cada Muestra de sangre y 0,9 mL
de Solución anticoagulante.
Análisis: Someter a diálisis las Preparaciones muestra a través de una membrana semipermeable durante un tiempo sufi-
ciente de modo que la dextrosa pase a través de la membrana a una solución salina SR que contenga oxidasa de glucosa,
peroxidasa de rábano, clorhidrato de 3-metil-2-benzotiazolinona hidrazona SR y N,N-dimetilanilina. Las absorbancias de
las Preparaciones muestra se determinan a 600 nm en un colorímetro con registrador. Las absorbancias de las Preparacio-
nes Estándar de Dextrosa se determinan de manera similar al comienzo y al final de cada corrida.
Cálculos: Calcular la respuesta de cada conejo a cada inyección a partir de la suma de los dos valores de glucemia y restar
su respuesta, sin tomar en cuenta el orden cronológico en el cual se observaron las respuestas, para obtener las diferencias
individuales, y, según se indica en la Tabla 2.
Cuando falten datos de uno o más conejos en una valoración, no usar las fórmulas de intervalo de confianza que se brin-
dan en la presente valoración, sino usar un procedimiento estadístico. Los datos aún pueden analizarse con un análisis de
varianza apropiado.
Cuando el número de conejos, f, usado en la valoración sea igual en cada grupo, determinar la suma de y para cada grupo
y calcular:

El logaritmo de la potencia relativa de las diluciones de prueba es M' = 0,301 T0 /Tb. La potencia de la inyección en Unidades
USP/mg es igual al antilogaritmo (log R + M'), donde:

R = VsfVu
Vs =número de Unidades USP/mL de la Solución estándar
Vu = número de mg/mL de insulina de la Solución muestra correspondiente
Determinar el intervalo de confianza del logaritmo de la potencia relativa con una confianza del 95% usando el Teorema
de Fieller (ver el Apéndice y Diseño y Análisis de Valoraciones Biológicas (111 )). Si el intervalo de confianza es mayor de
0,082, que corresponde, a P = 0,95, a límites de confianza de aproximadamente± 10% de la potencia calculada, repetir
la valoración hasta que los datos combinados de dos o más valoraciones, redeterminadas según se describe en Combina-
ción de Valoraciones Independientes en Diseño y Análisis de Valoraciones Biológicas (111 ), cumplan con este límite aceptable.
Tabla 2
Respuesta Respuesta Desviaciones
Individual Total Estándar
Grupo Diferencias (y) (1) de Diferencias (S)
Solución estándar 2 - Solución
1 muestra 1 y, T¡ s,
Solución muestra 2 - Solución
2 estándar 1 Y2 T2 S2
Solución muestra 2 - Solución
3 estándar 1 Y1 Ti S3
Solución estándar 2 - Solución
4 muestra 1 Y4 T4 S4

Apéndice:Teorema de Fieller para Determinar el Intervalo de Confianza para un Cociente

Esta versión del Teorema de Fieller es para el caso en el cual el numerador y el denominador no están correlacionados. La
ecuación asume que el numerador y el denominador están normalmente distribuidos y que los grupos de conejos son del
mismo tamaño.
USP 40 Pruebas Biológicas/ (121.1) Procedimientos Analíticos para Insulinas 225

Entonces, el intervalo de confianza de 95% para el cociente es:

M' ± _t_ ~(1- g) S~+ (M')2 S~

(L,U) = _ _T.~b_ _ _ _ __
1-g

donde f (grados de libertad en los errores estándar)= 4(k - 1), donde k es la cantidad de conejos en un grupo, tes el per-
centil superior de 97,5 de la distribución t con f grados de libertad, y
t2s2
g= r.2º
b

Si g "2 1, el denominador no es significativamente diferente a O y la fórmula no funciona.

sN =0,301.JkJs12 +sg +Si +s;

• PRUEBA DE BIOIDENTIDAD
Proceder según se indica en el Método de Determinación de Glucosa en Sangre de Conejos-Cuantitativo con las siguientes
modificaciones.
Procedimiento: Dividir los conejos en cuatro grupos iguales de 2 conejos cada uno.
Cálculo: Proceder según se indica para Cálculos en Método de Determinación de Contenido de Glucosa en Sangre de Cone-
jos-Cuantitativo, pero no determinar el intervalo de confianza del logaritmo de la potencia relativa, M'.
Interpretación: Si el valor de la potencia obtenido no es menor de 15 Unidades USP/mg, se cumple el requisito de la
Prueba de Bioidentidad. Si el valor de la potencia es menor de 15 Unidades USP/mg, repetir la prueba usando ocho conejos
más. Si la potencia promedio de los 2 conjuntos de pruebas no es menor de 15 Unidades USP/mg, se cumple el requisito
de la prueba.

REQUISITOS ADICIONALES
• ESTÁNDARES DE REFERENCIA USP (11)
ER Dextrosa USP
ER Insulina Asparta USP
ER Insulina Bovina USP
ER Insulina Glargina USP
ER Insulina Humana USP
ER Insulina Lispro USP
ER Insulina Porcina USP

(121.1) PROCEDIMIENTOS ANALÍTICOS FISICOQUÍMICOS PARA

INSULINAS

INTRODUCCIÓN
Existen diversos procedimientos fisicoquímicos que se utilizan para la evaluación de los atributos de calidad de la Insulina Hu-
mana, diversos análogos de insulina y de insulinas derivadas de animales, en lo sucesivo referidos como insulinas. De éstos,
el mapeo de péptidos y la determinación de proteínas de alto peso molecular tienen características similares para el análisis
de los diversos fármacos y medicamentos basados en insulina. Este capítulo describe las pruebas para mapeo de péptidos y
para el análisis cuantitativo de proteínas de alto peso molecular que se pueden usar para las diversas insulinas.
Las instrucciones específicas que difieran de los procedimientos generales aquí descritos se proporcionan en las monografías
correspondientes de fármacos o medicamentos para las diferentes insulinas.
MAPEO DE PÉPTIDOS
La digestión de insulina se lleva a cabo usando proteasa de la cepa V8 de Staphylococcus aureus (S. aureus V8) (también referi-
da como Endoproteinasa Glu-C), una serin-endoproteinasa que escinde desde el lado C-terminal a nivel de los residuos glu-
tamilo y aspartilo en solución amortiguadora de fosfato de pH 7,8. Esta proteasa es específica para la digestión de Glu-C en
bicarbonato de amonio y otras soluciones amortiguadoras de pH 7,8 que no contienen fosfato. La presencia de prolina en el
lado carboxi de la unión peptídica inhibe la escisión. El sistema amortiguador usado debe escindir todas las uniones glutami-
lo de la insulina sin escindir las uniones aspartilo. En general, usando el sistema amortiguador descrito en la Solución muestra
siguiente, la insulina se digiere en cuatro péptidos.
226 (121 .1) Procedimientos Analíticos para Insulinas / Pruebas Biológicas USP 40

A continuación se muestran las diferencias de aminoácidos entre los análogos de la insulina y la Insulina Humana, y las diferen-
cias in silico en los fragmentos obtenidos al momento de la digestión con proteasa S. aureus VB.
La Figura 7 presenta los cuatro fragmentos de Insulina Humana después de la digestión con proteasa V8 de S. aureus.

Fragmento IV Fragmento I Fragmento II

s s
A1 1 A10 1 A20
Gly-lle-Val-Glu Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-lle-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu Asn-Tyr-Cys-Asn
1 1
s s
\s s
/ Fragmento III
81 1 810 1 820 830
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr
1

Figura 1. Insulina Humana: Fragmentos de digerido con proteasa V8 de S. aureus.

La Tabla 7 presenta las diferencias de aminoácidos entre los análogos de insulina, insulinas derivadas de animales e Insulina
Humana.
Tabla 1. Diferencias de Aminoácidos entre los Análogos de Insulina, Insulinas Derivadas de Animales e Insulina Humana
Insulina Diferencias de Aminoácidos con la Insulina Humana
Insulina asparta B28 Asp
Insulina glargina A21 Gly, dos Arg agregadas al e-terminal de la cadena B
Insulina glulisina B3 Lys, B29 Glu
Insulina lispro B28 Lys, B29 Pro
Insulina porcina B30 Ala
Insulina bovina A8 Ala, A1O Val, B30 Ala

La Tabla 2 presenta los fragmentos específicos del digerido de proteasa V8 de S. aureus de los análogos de insulina y de las
insulinas derivadas de animales. Se resaltan las diferencias de aminoácidos en comparación con la Insulina Humana.
Tabla 2. Diferencias de Aminoácidos: Insulina Humana, Análogos de Insulina, e Insulina Derivada de Animales (Las Diferencias con
la Insulina Humana Se Presentan en Negrilla)
Insulina Diferencias de Aminoácidos en Comparación con la Insulina Humanaª
Insulina asparta Fragmento 111 (B22) Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Asp-Lys-Thr (B30)
Fragmento 11 (A1s) Asn-Tyr-Cys-Gly (A21)
Insulina glargina Fragmento 111 (B22) Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr-Arg-Arg (B32)
Fragmento 1 (Bl) Phe-Val-Lys-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu (B11)
Insulina glulisina Fragmento 111 (B22) Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Glu-Thr (B3o)
Insulina lispro Fragmento 111 (B22) Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Lys-Pro-Thr (B3o)
Insulina porcina Fragmento 111 (B22) Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Ala (B3ü)
(As) Gln-Cys-Cys-Ala-Ser-Val-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu
Fragmento 1 (A17)
Insulina bovina Fragmento 111 (B22) Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Ala (B3o)
ª Las letras A y B indican las cadenas Ay Bde insulina, respectivamente; los números indican la posición del aminoácido en la cadena.
• PROCEDIMIENTO PARA El MAPEO DE PÉPTIDOS
El siguiente procedimiento se aplica a la preparación de mapas peptídicos de Insulina Humana, análogos de insulina e insu-
linas derivadas de animales.
Solución amortiguadora de HEPES: Disolver 2,38 g de HEPES (ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-etanosulfónico) en
aproximadamente 90 mL de agua en un matraz volumétrico de 100 ml. Ajustar con hidróxido de sodio 5 M a un pH de
7,5, diluir con agua a volumen y mezclar.
Solución amortiguadora de sulfato: Sulfato de amonio 2,0 M y ácido sulfúrico 0,5 M (1 :1 ). Mezclar y filtrar.
• DIGESTIÓN DE INSULINA
El siguiente procedimiento provee una escisión eficiente de las uniones a nivel del glutamilo de la insulina. [NOTA-Se pue-
den usar volúmenes hasta 20 veces mayores siempre que la proporción de las soluciones siga siendo la misma. Si al correr
un digerido de la enzima sola se obtienen subproductos de autolisis interferentes en el cromatograma, la relación enzima
a insulina deberá reducirse y se deberá aumentar el tiempo de digestión.]
Solución enzimática: Preparar una solución de proteasa V8 de S. aureus (aproximadamente 500 unidades/mg usando
caseína como sustrato) de 1 mg/mL en agua.
Solución muestra: Preparar una solución de la insulina a examinar de 2,0 mg/mL en ácido clorhídrico 0,01 N. Agregar a
un vial limpio 25 µL de la solución de insulina de 2,0 mg/mL, 100 µL de Solución amortiguadora de HEPES y 20 µL de
USP 40 Pruebas Biológicas/ (121 .1) Procedimientos Analíticos para Insulinas 227

Solución enzimática (relación final 25:100:20). Tapar el vial e incubar a 25º durante 6 horas. Detener la reacción agregan-
do un volumen igual de Solución amortiguadora de sulfato. Puede ser necesario aumentar los tiempos de incubación para
los análogos de baja solubilidad a un pH de 7,5.
Solución estándar: Preparar al mismo tiempo y de la misma manera una solución del Estándar de Referencia de Insulina
USP correspondiente, según se indica en la Solución muestra.
• DETERMINACIÓN DE FRAGMENTOS PEPTÍDICOS
Determinar los fragmentos peptídicos usando el siguiente procedimiento de mapeo de péptidos (ver Artículos Obtenidos Por
Biotecnología-Mapeo de Péptidos (1055)).
Solución A: Acetonitrilo, agua y Solución amortiguadora de sulfato (100:700:200). Filtrar y desgasificar.
Solución B: Acetonitrilo, agua y Solución amortiguadora de sulfato (400:400:200). Filtrar y desgasificar.
Fase móvil: Ver la Tabla 3.
Tabla 3
Tiempo Solución A Solución B
(min) (%) (%)
o 95 5
3 95 5
30 41 59
35 20 80
40 95 5
50 95 5

Sistema cromatográfico
(Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
Detector: UV 214 nm
Columna: 4,6 mm x 1O cm; relleno L1 de 5 µm
Temperatura de la columna: 40º
Velocidad de flujo: 1 mL/min
Volumen de inyección: 50-100 µL
Aptitud del sistema
Muestra: Solución estándar
Requisitos de aptitud
Comparabilidad de los cromatogramas: En el cromatograma obtenido a partir de la Solución estándar, identificar los
picos debidos a los fragmentos de digestión 1, 11, 111 y IV. El cromatograma de la Solución estándar corresponde al cro-
matograma típico provisto con el Estándar de Referencia de Insulina USP correspondiente.
Resolución: Debe existir separación completa de los picos debidos a los fragmentos 11y111. La resolución se define en la
monografía de la insulina correspondiente.
Factor de asimetría: No más de 1,5 para los fragmentos de digestión 11 y 111
Análisis
Muestras: Solución muestra y Solución estándar
Acondicionar el Sistema cromatográfico mediante una corrida en condiciones iniciales, t = O minutos, durante al menos 15
minutos. Correr un programa de gradientes blanco antes de inyectar los digeridos. Inyectar por separado volúmenes
iguales de la Solución estándar y la Solución muestra, y registrar las respuestas de cada pico.
Criterios de aceptación: El perfil cromatográfico de la Solución muestra corresponde al de la Solución estándar.
LÍMITE DE PROTEÍNAS DE ALTO PESO MOLECULAR
• PROCEDIMIENTO
Solución A: 1 mg/mL de L-arginina en agua
Fase móvil: Solución A, acetonitrilo y ácido acético glacial (65:20:15). Filtrar y desgasificar.
Solución de resolución: Almacenar una cantidad adecuada de fármaco basado en insulina a temperatura ambiente du-
rante un periodo suficiente (5-1 O días, o según sea necesario) para obtener insulina con más de 0,4% de proteínas de
alto peso molecular. Preparar una solución de 4 mg/mL en ácido clorhídrico 0,01 N. Almacenar la solución en un refrige-
rador y usar dentro de los 7 días. Como alternativa, disolver aproximadamente 4 mg de ER Insulina Humana de Alto Peso
Molecular USP en 1 mL de ácido clorhídrico 0,01 N.
Solución muestra: En un vial pequeño, preparar una solución de insulina de 4 mg/mL en ácido clorhídrico 0,01 N y mez-
clar hasta disolver. Almacenar en un refrigerador y usar dentro de los 7 días.
Sistema cromatográfico
(Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
Detector: UV 276 nm
Columna: 7,8 mm x 30 cm; relleno L20 de 5 a 1O µm
228 (121.1) Procedimientos Analíticos para Insulinas / Pruebas Biológicas USP 40

Temperaturas
Muestreador automático: Se recomienda usar un muestreador automático refrigerado.
Columna: Ambiente
Velocidad de flujo: 0,5 mL/min
Volumen de inyección: 100 µL
Aptitud del sistema
Muestra: Solución de resolución
Requisitos de aptitud
Tiempos de retención: Entre 13 y 17 minutos para los complejos de insulina polimérica, aproximadamente 17,5 mi-
nutos para el dímero covalente de insulina, y entre 18 y 22 minutos para el monómero de insulina, con sales que elu-
yen después del monómero de insulina.
Cociente entre el pico y el valle: El cociente entre la altura del pico del dímero covalente de insulina y la altura del
valle entre el pico del dímero covalente de insulina y el pico del monómero de insulina es no menos de 2,0.
Análisis
Muestra: Solución muestra
No tomar en cuenta los picos con tiempos de retención mayores que el del monómero de insulina.
Calcular el porcentaje de proteínas de alto peso molecular en la porción de Insulina tomada:

Resultado = L.rH/(L.rH + rM) x 100

L.rH = suma de las respuestas de todos los picos con tiempos de retención menores que el del monómero de insulina
rM = respuesta del pico del monómero de insulina
Criterios de aceptación: Según se indica en la monografía de insulina correspondiente.

REQUISITOS ADICIONALES
• ESTÁNDARES DE REFERENCIA USP (11)
ER Insulina Humana de Alto Peso Molecular USP (uso alternativo u opcional)

(123) PRUEBAS DE IDENTIDAD BIOLÓGICA DE GLUCAGÓN

DEFINICIÓN
El Glucagón es una hormona polipeptídica que posee la propiedad de incrementar la concentración de glucosa en la sangre
mediante su liberación a partir de la reserva de glucógeno del hígado y que se usa en la práctica clínica para tratar la hipo-
glucemia. El glucagón humano, porcino y bovino comparten la misma secuencia de 29 aminoácidos. Anteriormente, el glu-
cagón disponible comercialmente se purificaba a partir de glándulas pancreáticas bovinas y porcinas. En la actualidad, el
glucagón humano es producido recombinantemente (por ADNr) (rGlucagón) con diversos sistemas de fermentación micro-
biana usando la secuencia de aminoácidos humana. La monografía de los compendios USP-NF, Glucagón para Inyección, de-
fine las pruebas de identificación para glucagón. La identidad biológica del glucagón se debe determinar usando un método
de valoración biológica validado, aprobado por una autoridad competente. La valoración biológica debe demostrar que el
proceso de fabricación produce Glucagón con una actividad biológica de no menos de 0,80 Unidades USP/mg de glucagón.
Este capítulo describe una prueba de identidad biológica validada que mide la glucosa liberada a partir de células de hígado
(hepatocitos) de rata preparadas recientemente, estimuladas in vitro con Glucagón.

VALORACIÓN
•VALORACIÓN CON CÉLULAS HEPÁTICAS PRIMARIAS
[NOTA-Todas las soluciones amortiguadoras deben estar oxigenadas, preparadas con Agua Estéril para Inyección o Agua Esté-
ril para Irrigación, entibiadas a 37° y ajustadas a un pH final de 7,4, a menos que se indique algo distinto. Se deben realizar
por lo menos dos valoraciones independientes (determinaciones repetidas) utilizando dos hígados de rata para cada lote
de Glucagón. La Figura 1 demuestra el proceso usado para generar un valor repetido. Se debe combinar como mínimo dos
determinaciones repetidas de acuerdo con la sección Cálculos. Los intervalos de concentración de las Preparaciones estándar
y las Preparaciones de valoración se pueden modificar para que caigan dentro del intervalo lineal de la Valoración; asimismo,
los cálculos se pueden ajustar de manera correspondiente. Como alternativa, se puede emplear un análisis de curva com-
pleta usando métodos estadísticos no lineales validados, siempre y cuando se demuestre la similitud cuando los analistas
comparen las respuestas de las Preparaciones estándar y las Preparaciones de valoración.]
USP 40 Pruebas Biológicas/ (123) Pruebas de Identidad Biológica de Glucagón 229

Suspensión de Hepatocitos de
Rata ( 1 Rata)
Dividida en 2 Suspensiones

/
Suspensión 1 Suspensión 2
1 Vial de ER 1 Vial de ER
5 Viales de Muestra 5 Viales de Muestra

Un Resultado de Un Resultado de
Medición Medición

Figura 1. Diagrama de flujo del método de valoración de hepatocitos de rata (ER = Estándar de Referencia).

Preparación de Hepatocitos
Solución amortiguadora para perfusión sin calcio con dextrosa: Preparar una solución que contenga 7,92 g/L de clo-
ruro de sodio, 0,35 g/L de cloruro de potasio, 1,80 g/L de dextrosa, O, 19 g/L de ácido edético (EDTA) y 2,38 g/L de ácido
4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetanosulfónico (HEPES). Oxigenar antes de su uso.
Solución amortiguadora de colagenasa: Preparar una solución que contenga 3,62 g/L de cloruro de sodio, 23,83
g/L de HEPES, 0,35 g/L de cloruro de potasio, 0,52 g/L de cloruro de calcio y 1,8 g/L de dextrosa. Ajustar a un pH de 7,6.
Inmediatamente antes de la perfusión, disolver en esta solución una cantidad de colagenasa para obtener una concentra-
ción de 0,02%-0,05%. La concentración exacta de colagenasa se determina empíricamente para cada lote nuevo de enzi-
ma y es la cantidad que puede disociar el tejido uniformemente dentro de los 1O minutos del ingreso de la solución amor-
tiguadora y producir una concentración celular viable de no menos de 3 x 106 células/mL.
Solución amortiguadora para lavado: Preparar una solución que contenga 7,92 g/L de cloruro de sodio, 0,35 g/L de
cloruro de potasio, O, 19 g/L de EDTA, 2,38 g/L de HEPES, O, 11 g/L de cloruro de calcio y 0,06 g/L de sulfato de magne-
sio.
Solución amortiguadora para incubación: Preparar una solución que contenga 6, 19 g/L de cloruro de sodio, 0,35 g/L
de cloruro de potasio, 0,22 g/L de cloruro de calcio, O, 12 g/L de sulfato de magnesio, O, 16 g/L de fosfato monobásico de
potasio, 11,915 g/L de HEPES y 1Og/L de albúmina sérica bovina (BSA al 1%). Ajustar a un pH de 7,5.
Animales de prueba: Mantener ratas macho Sprague-Dawley con una dieta estándar de alimento para rata, con agua a
voluntad y permitir que se ajusten a su nuevo ambiente antes del análisis. En la mañana de la prueba, seleccionar una rata
sana con un peso aproximado de 300-400 g y administrar 100 Unidades de Heparina Sódica por vía subcutánea.
Procedimiento: [NOTA-Efectuar este procedimiento por la mañana para asegurarse de que la rata tenga un nivel óptimo
de glucógeno en el hígado y que el procedimiento pueda completarse en un solo día.] Anestesiar a la rata con un anesté-
sico adecuado. Abrir la cavidad abdominal y aislar la vena porta. Introducir un angiocatéter en la vena porta y ligarlo en la
ubicación general de la rama esplénica. Luego conectarlo a una bomba de perfusión. Comenzar la perfusión (25 mL/min)
in situ con la Solución amortiguadora para perfusión sin calcio con dextrosa previamente entibiada y oxigenada. Mientras el
hígado aumenta de tamaño, cortar la vena cava inferior para permitir que la presión se equilibre. [NOTA-Se requieren
aproximadamente 300 mL del líquido de perfusión para limpiar el hígado de glóbulos rojos a una velocidad de flujo de
25-60 mL/min.] Después, hacer que circule Solución amortiguadora de colagenasa a una velocidad de flujo apropiada de
manera que el hígado empiece a drenar el líquido de perfusión de los lóbulos en aproximadamente 1O minutos (por lo
general 25-60 mL/min). Cuando el hígado aumente significativamente de tamaño, cambie de color y consistencia, y co-
mience a drenar el líquido de perfusión de los lóbulos, cambiar el sistema a la Solución amortiguadora para lavado previa-
mente entibiada y oxigenada. Se requieren aproximadamente 100 mL de Solución amortiguadora para lavado para lavar el
hígado de colagenasa a una velocidad de flujo de 25 mL/min. Retirar quirúrgicamente el hígado del animal y colocarlo en
una cápsula de Petri previamente entibiada que contenga una pequeña cantidad de Solución amortiguadora para lavado
230 (123) Pruebas de Identidad Biológica de Glucagón / Pruebas Biológicas USP 40

oxigenada (37°). Peinar suavemente el hígado con un peine de dientes finos de acero inoxidable para liberar los hepatoci-
tos. Filtrar y lavar los hepatocitos con Solución amortiguadora para lavado a través de gasa (con un grosor de 3 capas, o a
través de una red de polietileno con un tamaño de malla de 150 µm), previamente humedecida, en un vaso de precipita-
dos. Transferir las células a dos tubos de centrífuga y centrifugar durante aproximadamente 1 minuto a 600 rpm. Dese-
char el sobrenadante y volver a suspender los dos pellets en Solución amortiguadora para incubación. Combinar los dos
pellets en un recipiente adecuado y agregar suficiente Solución amortiguadora para incubación para obtener 150 ml.
Aptitud del sistema de la preparación de las células: La concentración de las células puede variar debido a la actividad
de colagenasa y a la viabilidad de los hepatocitos. Para verificar la viabilidad de las células y determinar la concentración
de células viables, diluir una alícuota de 100 µL de la suspensión celular con 400 µL de Solución amortiguadora para lavado
y 500 µL de solución isotónica de azul de tripán al 0,4%. Cargar alícuotas de la suspensión celular en las dos cámaras de
un hemocitómetro y contar los ocho cuadrantes. Para cumplir con la aptitud del sistema del método de preparación de
las células, se debe obtener una concentración de células viables de 3 x 106 células/mL (un intervalo aceptable es de 2,5 x
106 a 3,4 x 106 células/mL) a fin de proseguir con la valoración biológica. Si la concentración de células viables excede el
límite superior, se puede agregar a las células un volumen adicional de Solución amortiguadora para incubación para ajus-
tar la concentración a 3 x 10 6 células/ml. En este caso, se realiza un nuevo recuento de las células en un hemocitómetro,
según se indicó anteriormente para verificar la concentración. [NOTA-Las células viables son aquéllas que excluyen el azul
de tripán.]
Determinación de Glucosa
Solución de control negativo: Preparar una solución que contenga BSA al 0,5% usando Agua Estéril para Inyección o
Agua Estéril para Irrigación.
Matraces para incubación: Usar matraces Erlenmeyer de 25 mL especialmente preparados, cuyos fondos se hayan calen-
tado y empujado hacia adentro para formar un centro elevado cónicamente o matraces similares que permitan un mez-
clado suficiente al agitar por rotación suave. Colocar los Matraces para incubación en un baño de agua con agitador orbi-
tal a 35º.
Preparaciones estándar: En el día de la valoración, disolver dos viales de ER rGlucagón USP, medidos con exactitud, en
ácido clorhídrico 0,01 N u otro diluyente adecuado (el volumen se basa en la potencia del lote del Estándar de Referencia)
para obtener dos soluciones que contengan 1 Unidad USP de rGlucagón/mL cada una. Todas las diluciones posteriores se
realizan con Solución de control negativo. Diluir con exactitud volúmenes medidos de cada solución con Solución de control
negativo para obtener una concentración intermedia de 400 µU/mL y luego diluir la concentración intermedia para pro-
ducir cinco concentraciones: 200; 100; 50; 25 y 12,5 µU/mL (Preparaciones estándar). Pipetear y transferir 0, 1 mL de cada
una de las Preparaciones estándar a distintos Matraces para incubación. Pipetear y transferir 0, 1 mL de Solución de control
negativo a cada uno de dos matraces (Soluciones de control negativo 1 y 2).
Preparaciones de valoración: Usando cantidades pesadas con exactitud de muestras de Glucagón, proceder según se
indica en Preparaciones estándar o, si se está analizando Glucagón para Inyección, reconstituir 1O viales agregando lenta-
mente el contenido de las jeringas prellenadas adjuntas que contienen un diluyente apropiado para glucagón. Mezclar
suavemente cada vial hasta que se disuelva el glucagón. Con las mismas jeringas, extraer el contenido de cinco viales y
colocar las soluciones en un matraz volumétrico de 25 ml. Repetir la operación para los cinco viales remanentes, transfi-
riendo el contenido a un segundo matraz volumétrico de 25 mL. Diluir cada matraz con ácido clorhídrico 0,01 N a volu-
men. Diluir una cantidad exacta de cada solución con BSA al 0,5% hasta obtener una concentración de 400 µU/mL y
diluir la concentración intermedia hasta producir cinco concentraciones de Preparación de valoración: 200; 100; 50; 25 y
12,5 µU/mL. Luego, proceder según se indica en Preparaciones estándar.
Solución madre de referencia: Secar ER Dextrosa USP y luego transferir 1,0 g, pesados con exactitud, a un matraz volu-
métrico de 100 ml. Disolver y diluir con solución saturada de ácido benzoico a volumen.
Soluciones de referencia: Transferir cantidades adecuadas de Solución madre de referencia a cuatro matraces y diluir con
solución saturada de ácido benzoico hasta obtener Soluciones de referencia con concentraciones de 100; 500; 1000 y 1500
mg/L.
Solución de ferrocianuro de potasio: Disolver 1,25 g de ferrocianuro de potasio trihidrato en 125 mL de Agua Estéril
para Inyección o usar una fuente comercial apropiada.
Aptitud del sistema: Analizar la Solución de ferrocianuro de potasio, las Soluciones de referencia y cinco determinaciones
repetidas adicionales de la Solución de referencia de 500 ó 1000 mg/L en un analizador de glucosa adecuado. [NOTA-Las
Soluciones de ferrocianuro de potasio son estándares apropiados únicamente para analizadores de glucosa que miden acti-
vidad de glucosa oxidasa. El procedimiento también se puede realizar usando plataformas alternativas.] Preparar una cur-
va estándar usando las Soluciones de referencia según se indica en Preparaciones estándar. La raíz cuadrada del error cua-
drático medio residual, a partir de la regresión, dividida por el promedio de la respuesta multiplicada por 100% (desvia-
ción estándar relativa porcentual [%RSD] de la línea) debe ser no más de 2,0%. Asimismo, la respuesta de la Solución de
ferrocianuro de potasio debe ser no más de 30 mg/L y la desviación estándar relativa debe ser no más de 2,0% en los
análisis repetidos de la Solución de referencia media.
Procedimiento: Dispensar 5 mL de Preparación de Hepatocitos en los Matraces para incubación en secuencia desde la con-
centración más alta de glucagón hasta la concentración más baja de glucagón, alternando las Preparaciones estándar con
las Preparaciones de valoración. Agitar los matraces por rotación suave en un baño de agua giratorio a 125 rpm a una tem-
peratura de 30º-35º durante aproximadamente 30 minutos. Después de la incubación, extraer alícuotas de 1,0 mL de
USP 40 Pruebas Biológicas/ (124) Valoraciones Biológicas de Eritropoyetina 231

cada Matraz para incubación, transferir a tubos de microcentrífuga rotulados y centrifugar a 13 000 rpm durante 15 se-
gundos. Colocar cada fracción sobrenadante en un tubo de muestreo rotulado para analizador de glucosa y determinar la
concentración de glucosa (mg/L) de cada una de las Preparaciones estándar y Preparaciones de valoración. Medir la lectura
de fondo de las Soluciones de control negativo 1 y 2, y calcular el promedio de las dos respuestas.
Para cumplir con el intervalo lineal del instrumento que se esté usando, puede ser necesario que los analistas ajusten cada
una de las Preparaciones estándar y Preparaciones de valoración mediante dilución. Se debe usar un analizador de glucosa
que haya demostrado una especificidad, exactitud, precisión y respuesta lineal apropiadas para el intervalo de las con-
centraciones que se están determinando. Determinar el incremento en la concentración de glucosa para cada una de las
Preparaciones estándar y Preparaciones de valoración en comparación con el valor promedio de la Solución de control ne-
gativo.
Cálculos
Calcular la potencia relativa de las muestras de Glucagón usando métodos estadísticos para valoraciones de líneas paralelas,
comparando la curva del Estándar de Referencia (a partir de las Preparaciones estándar) con la curva de la muestra de Glu-
cagón (a partir de las Preparaciones de valoración). No puede presentarse ninguna inversión de dosis-respuesta dentro de
una corrida para las Preparaciones estándar y Preparaciones de valoración de 25; 50 ó 100 µU/ml. [NOTA-Se puede excluir
el nivel bajo o alto de dosis, pero no ambos, del cálculo para cumplir con los requisitos de linealidad.] Debido a que se
requiere un mínimo de dos valoraciones válidas (ratas), las potencias estimadas se combinan usando los procedimientos
del capítulo general Diseño y Análisis de Valoraciones Biológicas (111 ), Combinación de Valoraciones Independientes; asimis-
mo, se calcula la amplitud, L, de un intervalo de confianza de 95% para el logaritmo estimado de la potencia relativa. Los
resultados son válidos si Les no más de O, 1938. Si Les >0, 1938, se pueden realizar valoraciones adicionales y combinarlas
hasta obtener un término L válido, y posteriormente se calcula la potencia relativa a partir de todas las corridas indepen-
dientes válidas. Calcular la potencia de las muestras de Glucagón en Unidades USP de rGlucagón/mg, multiplicando el
resultado de la potencia relativa por la potencia del ER rGlucagón USP. Cumple con el requisito de identidad biológica si
la potencia es no menos de 0,80 Unidades USP de rGlucagón/mg.

REQUISITOS ADICIONALES
• ESTÁNDARES DE REFERENCIA USP (11)
ER Dextrosa USP
ER rGlucagón USP

(124) VALORACIONES BIOLÓGICAS DE ERITROPOYETINA

INTRODUCCIÓN
Este capítulo provee pautas sobre el uso de valoraciones biológicas para medir la actividad biológica de eritropoyetina (EPO,
por sus siglas en inglés). Basándose en uno de los enfoques de potencia relativa descritos en el capítulo general Diseño y
Desarrollo de Valoraciones Biológicas (1032), la actividad biológica de una preparación de EPO desconocida por lo general se
determina mediante comparación con la actividad biológica de un Estándar de Referencia (ER). Para este propósito, se ha
desarrollado un ER Eritropoyetina para Valoraciones Biológicas USP. Las valoraciones descritas en el capítulo no son aplica-
bles a formas de EPO modificadas por ingeniería para prolongar su vida media.
El ER Eritropoyetina para Valoraciones Biológicas USP se ha calibrado contra el Estándar Internacional para EPO de la Organiza-
ción Mundial de la Salud (OMS) usando el método de valoración biológica con ratón normocitémico y el método de valora-
ción biológica con ratón policitémico exhipóxico. Por consiguiente, el ER Eritropoyetina para Valoraciones Biológicas USP tie-
ne una medida en unidades asignada en términos de Unidades Internacionales (IU) de EPO conforme a lo definido por la
OMS. De estas dos valoraciones biológicas in vivo, el método de valoración biológica con ratón normocitémico es menos
complicado y se usa ampliamente para la determinación de la potencia de EPO. La valoración se basa en la medición de la
maduración de los reticulocitos estimulados por EPO. Debido a que el ER Eritropoyetina para Valoraciones Biológicas USP se
ha calibrado contra el Estándar Internacional para EPO de la OMS mediante una valoración biológica in vivo, se puede usar
directamente en el método de valoración biológica con ratón normocitémico para la calibración de cualquier preparación de
EPO específica del proceso.
Sin embargo, si la intención es usar una valoración biológica in vitro validada para transferir la medida en unidades del ER Eri-
tropoyetina para Valoraciones Biológicas USP a una preparación de EPO específica del proceso, entonces es necesario de-
mostrar que el ER Eritropoyetina para Valoraciones Biológicas USP y la preparación de EPO específica del proceso presentan
una relación equivalente entre la potencia in vitro e in vivo. Esto se debe a que la actividad biológica de la EPO presenta una
relación compleja entre la estructura y la función. En particular, la relación entre la actividad in vitro e in vivo está inversa-
mente correlacionada con el tipo y el grado de sialilación terminal. Los productos que presentan una alta sialilación tienen
un mayor nivel de actividad in vivo; por ende, tienen una relación entre actividad in vitro e in vivo relativamente más baja.
Debido a las diferencias en los procesos de fabricación usados en la preparación de EPO, el tipo y el grado de sialilación
terminal puede variar entre preparaciones de EPO, incluyendo las preparaciones de EPO que se usan como Estándares de
Referencia. Como resultado, el uso de una valoración in vitro para medir la actividad biológica de una preparación de EPO
232 (124) Valoraciones Biológicas de Eritropoyetina / Pruebas Biológicas USP 40

requiere conocer muy bien la relación entre la actividad in vivo e in vitro de la EPO. La mejor manera de lograr dicho conoci-
miento es comparar la preparación de prueba de EPO con el ER Eritropoyetina para Valoraciones Biológicas USP en la valora-
ción in vivo y en una valoración in vitro específica.
El ER Eritropoyetina para Valoraciones Biológicas USP tiene asignada una medida en unidades que representa su actividad en
valoraciones in vivo e in vitro. Si las relaciones entre la potencia in vitro e in vivo para el material que se está analizando y el
ER Eritropoyetina para Valoraciones Biológicas USP son equivalentes, entonces se puede usar el ER Eritropoyetina para Valo-
raciones Biológicas USP directamente en la valoración in vitro para calibrar el material que se está analizando. No obstante,
si las relaciones no son equivalentes, el material que se está analizando y el ER Eritropoyetina para Valoraciones Biológicas
USP tendrán una relación de potencia in vitro e in vivo diferente. Por este motivo el estándar no podrá usarse con su poten-
cia designada en la valoración in vitro. En su lugar, se debe usar esta relación determinada para el material que se está anali-
zando para asignar al ER Eritropoyetina para Valoraciones Biológicas USP una medida en unidades específica para el proceso
de valoración in vitro. Posteriormente, el ER Eritropoyetina para Valoraciones Biológicas USP, con sus unidades ajustadas para
valoración in vitro, se podrá usar en la valoración in vitro para transferir la medida en unidades del ER Eritropoyetina para
Valoraciones Biológicas USP al material que se está analizando.

VALORACIÓN
•VALORACIÓN CON RATÓN NORMOCITÉMICO
Solución A: Disolver 10,75 g de fosfato dibásico de sodio dodecahidrato, 7,6 g de cloruro de sodio y 1Og de albúmina
bovina en 1000 mL de agua. Inmediatamente antes de su uso, ajustar con solución de hidróxido de sodio o de ácido fosfó-
rico a un pH de 7,2.
Solución estándar 1: Disolver ER Eritropoyetina para Valoraciones Biológicas USP en Solución A hasta una concentración de
80 Ul/ml.
Solución estándar 2: Mezclar volúmenes iguales de Solución A y Solución estándar 7.
Solución estándar 3: Mezclar volúmenes iguales de Solución A y Solución estándar 2.
Solución muestra 1: Preparar la muestra a analizar en Solución A a una concentración de 80 Ul/ml.
Solución muestra 2: Mezclar volúmenes iguales de Solución A y Solución muestra 7.
Solución muestra 3: Mezclar volúmenes iguales de Solución A y Solución muestra 2.
Las concentraciones exactas de cada Solución estándar y Solución muestra pueden requerir ajustes basándose en el intervalo
de respuesta en los animales usados.
Preparación de los animales: Al inicio del procedimiento de valoración, distribuir de forma aleatoria en seis jaulas ratones
de edad y cepa adecuadas (los ratones B6D2Fl de 8 semanas de vida son adecuados). Se recomienda un mínimo de ocho
ratones por jaula. Inyectar cada animal por vía subcutánea con 0,5 mL del tratamiento apropiado (una solución por jaula) y
colocar al animal en una nueva jaula. Combinar los ratones de tal manera que cada jaula aloje un ratón representativo de
cada uno de los seis tratamientos diferentes (cada una de las Soluciones estándar y de las Soluciones muestras; seis ratones
por jaula).
Análisis: Cuatro días después de las inyecciones, recolectar muestras de sangre de los animales y determinar el número de
reticulocitos usando un procedimiento adecuado. Se puede emplear el siguiente método.
Puede ser necesario modificar el volumen de sangre, el procedimiento de dilución y el reactivo fluorescente para asegurar
el máximo desarrollo y estabilidad de la fluorescencia.
Para solución colorante concentrada, usar una solución de anaranjado de tiazol adecuada para la determinación de reticu-
locitos. Preparar a una concentración que sea el doble de la necesaria para el análisis.
Proceder con los siguientes pasos de dilución. Diluir sangre entera 500 veces en la solución amortiguadora usada para pre-
parar la solución colorante. Diluir esta solución a la mitad en la solución colorante concentrada. Después de teñir durante
3-1 O minutos, determinar el recuento de reticulocitos por microfluorometría en un citómetro de flujo. El porcentaje de
reticulocitos se determina usando un histograma biparamétrico: número de células/fluorescencia roja (620 nm).
Calcular la potencia usando métodos estadísticos convencionales para valoración de líneas paralelas. Para información adi-
cional, consultar el capítulo general Análisis de Valoraciones Biológicas (1034).
Criterios de aceptación: La actividad de cada Solución muestra se compara con la del ER Eritropoyetina para Valoraciones
Biológicas USP y se expresa en UI. Los límites de confianza de la potencia estimada (P = 0,95) son no menos de 64% y no
más de 156% de la potencia, según se determinó mediante el método provisto anteriormente. La potencia estimada es no
menos de 80% y no más de 125% de la potencia declarada.

REQUISITOS ADICIONALES
• ESTÁNDARES DE REFERENCIA USP (11)
ER Eritropoyetina para Valoraciones Biológicas USP
 USP 40 Pruebas Biológicas/ (126) Pruebas de Identidad 233

(126) PRUEBAS DE IDENTIDAD BIOLÓGICA DE SOMATROPINA

La Somatropina es una hormona proteica que contiene la misma secuencia de aminoácidos que la hormona de crecimiento
humana producida por la glándula pituitaria. Se usa un procedimiento cromatográfico fisicoquímico, robusto y preciso en la
Valoración para asignar potencia en términos de masa. Ya que la determinación de la identidad biológica sigue siendo nece-
saria, se presentan a continuación dos procedimientos diferentes: un procedimiento de valoración biológica in vivo basado
en el aumento de peso corporal en ratas inducido por somatropina y un enfoque más preciso basado en una línea celular de
rata que mide la producción de ATP como un indicador directo del crecimiento celular. [NOTA-La prueba de identidad bio-
lógica de somatropina puede realizarse en el fármaco a granel o en el producto farmacéutico.]
PROCEDIMIENTO
• PRUEBA DE IDENTIDAD BIOLÓGICA IN VIVO
Solución amortiguadora: Bicarbonato de amonio O, 1 M. Ajustar con hidróxido de sodio a un pH de 8,0.
Soluciones estándar: 10-100 µg/mL de ER Somatropina USP en Solución amortiguadora
Soluciones muestra: 10-100 µg/mL de Somatropina en Solución amortiguadora. [NOTA-No agitar mientras se mezcla;
agitar por rotación suave.]
Control: Solución amortiguadora
Animales de prueba: Seleccionar un número apropiado de ratas Sprague Dawley que sean sólo machos o sólo hembras y
que hayan sido hipofisectomizadas a los 25-30 días de vida. Después de la hipofisectomía, alimentar las ratas con alimento
para ratas y solución de dextrosa al 5% en agua durante al menos 72 horas. Después de 72 horas, alimentar las ratas con
alimento para ratas y agua filtrada y desionizada ajustada con ácido clorhídrico 1 N a un pH de 3,0 ± 0,25. Pesar las ratas
cuando tengan 37-44 días de vida y conservar únicamente las que estén sanas. Volver a pesar las ratas escogidas 7 días
después y utilizar sólo aquellas que estén sanas y cuyo peso no haya aumentado o disminuido más del 10% durante los 7
días anteriores.
Análisis: Dividir aleatoriamente las ratas en grupos de control, grupos estándar y grupos de prueba, cada grupo debe con-
tener aproximadamente 1 O ratas. Cada día durante 1 O días, inyectar por vía subcutánea O, 1 mL de Control, Soluciones es-
tándar y Soluciones muestra a los grupos de control, estándar y de prueba, respectivamente. Registrar el peso corporal de
cada animal al inico de la prueba y aproximadamente 18 horas después de la 1 Oª inyección.
Cálculos: Determinar el cambio en el peso corporal de cada rata durante los 1 O días y calcular la potencia de la Solución
muestra con respecto a la de la Solución estándar usando un análisis estadístico apropiado. Calcular la potencia media en
Unidades USP de Somatropina/mg y, usando métodos estadísticos apropiados, calcular la amplitud, L, de un intervalo de
confianza de 95% para el logaritmo en base 1 O estimado de la potencia relativa. Si Les más de 0,40, repetir la prueba
hasta que los resultados de dos o más pruebas, combinados por métodos estadísticos apropiados, produzcan un valor L de
no más de 0,40, correspondiente a límites de confianza del 63%-158% de la potencia calculada.
Criterios de aceptación: No menos de 2 Unidades USP de Somatropina/mg, cuando Les no más de 0,40.
• PRUEBA DE IDENTIDAD BIOLÓGICA IN VITRO BASADA EN CÉLULAS
Medio A: Medio de Fischer1 que contenga suero fetal bovino al 10% inactivado por calor2, suero de caballo al 1 0% inacti-
vado por calor 3, bicarbonato de sodio al 1 % y 2-mercaptoetanol 0,05 mM. Esterilizar por filtración. [NOTA-Almacenar du-
rante un máximo de 2 semanas a 2º-8º.]
Medio B: Medio de Fischer que contenga suero de caballo al 1 %, bicarbonato de sodio al 1 % y 2-mercaptoetanol 0,05
mM. Esterilizar por filtración. [NOTA-Almacenar durante un máximo de 2 semanas a 2º-8º.]
Solución salina amortiguada con fosfatos: 4 Solución salina amortiguada con fosfatos exenta de calcio y magnesio que
contenga fosfato monobásico de potasio 1,5 mM, cloruro de sodio 155 mM y fosfato dibásico de sodio 3 mM, de pH 7,2-
7,4.
Preparación del cultivo celular: Preparar cultivos de células Nb2-11 s en suspensión en Medio A en una incubadora humi-
dificada a 37º que contenga dióxido de carbono al 5%. Las células deben someterse a pasajes dos veces por semana y
volver a sembrarse en Medio A con una densidad de 1 x 1 os células/mL durante 2 días, 2 x 104 células/mL durante 3 días y
1 x 104 células/mL durante 4 días. [NOTA-Puede ser necesario adaptar las densidades de siembra cuando los analistas cali-
fiquen lotes nuevos de suero fetal bovino y suero de caballo.] En el día de la valoración, recolectar las células de los matra-
ces y centrifugarlas durante 7 minutos a aproximadamente 218 x g para formar un pellet. Desechar el sobrenadante y lavar
las células dos veces con Solución salina amortiguada con fosfatos, y luego centrifugar. Resuspender las células en Medio B,
contarlas y ajustar la concentración de células a 1 x 1 os células/mL con Medio B. A exepción de los pocillos de la primera
columna, transferir 50 µL de suspensión de células a cada pocillo de una placa negra para cultivo de tejidos de 96 pocillos
con fondo transparente. 6 Pipetear y transferir 50 µL de Medio Bacada pocillo de la primera columna de la placa. [NOTA-

1 Quality Biological, Nº de catálogo 112-032-101 o equivalente.

2 Gibco, Nº de catálogo 10082-147 o equivalente.
3 Gibco, Nº de catálogo 26050-088 o equivalente.
4 Amimed, Nº de catálogo 8-05F291; Gibco, Nº de catálogo 20012-019 o equivalente.

s HPA Culture Collections o Sigma-Aldrich HPA Culture Collection Nº de catálogo #97041101 o equivalente.
6 Costar, Nº de catálogo 3904 o equivalente.
234 (126) Pruebas de Identidad / Pruebas Biológicas USP40

Cubrir la placa e incubar a 37° durante un máximo de 1 hora mientras se preparan las Soluciones estándar y las Soluciones
de prueba.]
Soluciones estándar: Reconstituir ER Somatropina USP en 1 mL de Solución salina amortiguada con fosfatos y luego diluir
adicionalmente este material con Medio B hasta una concentración de 2,0 ng/ml. [NOTA-Usar tubos de ensayo de poli-
propileno para realizar las diluciones. Se requiere aproximadamente 1 mL de esta solución para cada placa. No usar dilucio-
nes de una sola etapa mayores de 1:100 ni transferir volúmenes menores de 40 µL.]
Soluciones de prueba: Deben obtenerse dos resultados por cada solución de prueba usando dos preparaciones de soma-
tropina independientes. Reconstitutir dos preparaciones de somatropina independientes en Agua para Inyección hasta una
concentración de 5 mg/ml. Preparar las soluciones de prueba diluyendo adicionalmente este material con Medio B hasta
una concentración de 2,0 ng/ml. [NOTA-Usar tubos de ensayo de polipropileno para realizar las diluciones. Se requiere
aproximadamente 1 mL de esta solución para cada placa. No usar diluciones de una sola etapa mayores de 1:100 ni trans-
ferir volúmenes menores de 40 µL.] Una preparación es la Solución de prueba A y la otra es la Solución de prueba B.
Solución de control positivo: Comenzando con una concentración madre de 5 mg/mL de ER Somatropina USP reconsti-
tuida en Agua para Inyección, diluir con Medio B hasta una concentración de 20 ng/ml. [NOTA-Usar tubos de ensayo de
polipropileno para realizar las diluciones. No usar diluciones de una sola etapa mayores de 1:100 ni transferir volúmenes
menores de 40 µL.]
Procedimiento: Dispensar 100 µL de Medio Ben cada pocillo de una placa transparente de 96 pocillos de fondo redondo/
a exepción de los pocillos de la columna 12 (pocillos A12-Hl 2 =control positivo) y los pocillos A2-A 1 O. [NOTA-Por cada
placa negra de cultivo de tejidos sembrada con células según se describe en Preparación del cultivo celular, se usa una placa
con pocillos de fondo redondo diferente para preparar las diluciones de la Solución estándar y la Solución de prueba.] Luego,
dispensar 200 µL de Solución estándar de 2,0 ng/mL en los pocillos A3, A6 y A9 de la placa de dilución. Dispensar 200 µL
de Solución de prueba A de 2,0 ng/mL en los pocillos A2, AS y A8 de la placa de dilución. Dispensar 200 µL de Solución de
prueba B de 2,0 ng/mL en los pocillos A4, Al y A1 O de la placa de dilución. Dispensar 100 µL de Solución de control positivo
de 20 ng/mL en la última columna de la placa de dilución (pocillos A12-Hl 2). Usando una pipeta de 12 canales, realizar
en la placa diluciones en serie al medio, aspirando 100 µL de la primera hilera (A2-A 1 O), transferir a la segunda hilera y
mezclar tres veces. Luego, aspirar 100 µL de la segunda hilera, transferir a la tercera y mezclar tres veces, etc. Repetir este
procedimineto a lo largo de toda la placa hasta la hilera H. Desechar los 100 µL aspirados de la última hilera. [NOTA-Los
pocillos de la columna 11 (pocillos A11-Hl 1) son controles negativos que contienen 100 µL de Medio B; los pocillos de la
columna 1 (pocillos A1-Hl) son blancos.]
Comenzando con la concentración más baja y usando una pipeta de 12 canales, transferir 50 µL de cada solución en la
placa de dilución al pocillo respectivo de la placa negra de cultivo que contiene las células. [NOTA-Durante la transferen-
cia, sumergir las puntas de la pipeta en la suspensión celular. Esta transferencia produce una dilución adicional 1 :2 de
somatropina, o una concentración final de 1,0 ng/mL para la dosis más alta agregada a las células y 1 O ng/mL para la
Solución de control positivo. La Tabla 7 muestra el diagrama (layout) de la placa.] Después de realizar todas las transferen-
cias, agitar suavemente la placa negra durante 30 segundos y luego incubarla en una incubadora humidificada a 37º que
contenga dióxido de carbono al 5% durante 30 ± 2 horas. Luego, agregar 100 µL de solución reconstituida de sustrato
luminiscentes a todos los pocillos. Incubar las placas durante 15 minutos a temperatura ambiente mientras se agitan sua-
vemente en un agitador para placas apropiado protegidas de la luz. Incubar las placas sin agitación durante 15 minutos
adicionales a temperatura ambiente protegidas de la luz. Leer la luminiscencia de los pocillos de las placas en un lector de
placas adecuado con modo de detección de luminiscencia.
Tabla 1. Representacíon Esquemática de la Placa de Valoración Final
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A BL A,#1 St,#1 B,#1 A,#1 St,#1 B,#1 A,#1 St,#1 B,#1 NEG POS
B BL A,#2 St,#2 B,#2 A,#2 St,#2 B,#2 A,#2 St,#2 B,#2 NEG POS
c BL A,#3 St,#3 B,#3 A,#3 St,#3 B,#3 A,#3 St,#3 B,#3 NEG POS
D BL A,#4 St,#4 B,#4 A,#4 St,#4 B,#4 A,#4 St,#4 B,#4 NEG POS
E BL A,#5 St,#5 B,#5 A,#5 St,#5 B,#5 A,#5 St,#5 B,#5 NEG POS
F BL A,#6 St,#6 B,#6 A,#6 St,#6 B,#6 A,#6 St,#6 B,#6 NEG POS
G BL A,#7 St,#7 B,#7 A,#7 St,#7 B,#7 A,#7 St,#7 B,#7 NEG POS
LEYENDA:
BL = Blanco: sin somatropina, sin células.
A= Serie de diluciones de la Solución de prueba A (Concentración inicial de 1,0 ng/ml).
St = Serie de diluciones de la Solución estándar (Concentración inicial de 1,0 ng/ml).
B =Serie de diluciones de la Solución de prueba B (Concentración inicial de 1,0 ng/ml).
NEG =Control negativo: sin somatropina, con células.
POS = Solución de control positivo: concentración máxima de somatropina (1 O ng/ml).

7 Placa Greiner Nº 650 160 o equivalente.

8 CellTiterGlo Luminescence Kit, p.ej., Promega Nº G7573 o equivalente.
USP 40 Pruebas Biológicas/ (127) Recuento por Citometría de Flujo 235

Tabla 1. Representacíon Esquemática de la Placa de Valoración Final (Continuación)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
H BL A,#8 St,#8 B,#8 A,#8 St,#8 B,#8 A,#8 St,#8 B,#8 NEG POS
LEYENDA:
BL = Blanco: sin somatropina, sin células.
A= Serie de diluciones de la Solución de prueba A (Concentración inicial de 1,0 ng/ml).
St =Serie de diluciones de la Solución estándar (Concentración inicial de 1,0 ng/ml).
B = Serie de diluciones de la Solución de prueba B (Concentración inicial de 1,0 ng/ml).
NEG =Control negativo: sin somatropina, con células.
POS= Solución de control positivo: concentración máxima de somatropina (1 O ng/ml).

Cálculos: Debe usarse un mínimo de dos preparaciones de Solución de prueba independientes para cada muestra de prue-
ba. Las Soluciones de prueba y las Soluciones estándar se normalizan por el contenido proteico antes de calcular la potencia
relativa. [NOTA-Un mg de somatropina anhidra equivale a 3,0 Unidades USP de Somatropina.] Se omiten los valores abe-
rrantes debidos a la técnica (pero no más de 4/curva) y luego se usa el mismo número de respuestas a la dosis de la Solu-
ción estándar y la Solución de prueba, incluyendo la respuesta al 50% (EC 50 ) del estándar y la muestra dentro de este inter-
valo, para calcular la potencia relativa de cada muestra de somatropina usando métodos estadísticos de análisis de líneas
paralelas. Para cada Solución de prueba individual comparada con la Solución estándar, los resultados de las pruebas estadís-
ticas de linealidad, pendiente y paralelismo deben pasar al nivel de 95%. El límite de confianza de cada potencia relativa
calculada debe estar dentro del 75%-133%. La potencia relativa de una Solución de prueba debe estar dentro del intervalo
validado para la valoración (potencia relativa de 50%-200%) de las Soluciones estándar. El logaritmo de la potencia relativa
media no ponderada se calcula a partir de muestras individuales válidas y posteriormente se calcula la potencia en Unida-
des USP/mg relativas a ER Somatropina USP.
Criterios de aptitud del sistema: La relación señal-ruido entre la señal de quimioluminiscencia media de la Solución de
control positivo y la señal de quimioluminiscencia media de los pocillos de control negativo debe ser no menos de 3. No se
pueden omitir más de 4 valores aberrantes debidos a la técnica por curva estándar. Debe rechazarse toda placa que no
cumpla con uno o más de estos criterios y el procedimiento deberá repetirse.
Criterios de aceptación: No menos de 2 Unidades USP de Somatropina/mg
• ESTÁNDARES DE REFERENCIA USP (11)
ER Somatropina USP

Agregar la siguiente:

•(127) RECUENTO DE CÉLULAS CD34+ POR CITOMETRÍA DE FLUJO

INTRQDUC(IQN
El antígeno CD34 se expresa en la supMicie de. cas]t:odas l~s célula~ madre y progenitoras herr)atopoyéticas humanas. El
número absoluto de células madre hematopoyéticas CD34+ (HSC; por sus siglas en inglés) ha mostrado una correlación con la
actividad de valoración de unida(jes. fprmadoras <:1e.c9lonia5(UFC).i11Vi.tr<Jy.con el prendimiento clínico de injertos hematopo-
yéticos preparados a partir de fUéntes como $ímgré periférica, m 1édula ósea ydé sangre del cordón umbfütat: El método de

recl1ento de cél!Jlas CD34+ por citometría de flujo de plataforma únicél descrito en este capítulo se ba.sa en un protocolo de
laboratorio. clínico, 1 establecido por la lnternationa1 Soci°Eity of Heinatotherapy and Graft tngineerihg (Sociedad Internacional
de Hematoterapia e 1ngeniería de Injertos o 1$HACiE}, ·hoy conoéida como la 1nternatiorial Sodety for Cellu.lar Therapy (Socie-
dad Internacional de Terapia Celular o ISCT). Esté protocolo puede usarse para el recuetitb de células CD54+ en rl:lt.iestras de
sangre periférica, productos de le!Jcaféresis, méd1Jla. ós.ea y sangre de cPrdón 1Jrnbilical. El recuento de células CD34+ por clto-
metría de. flujo es un análisis de eventos poco comunes, el cual requiere !nstrucdones esp~cíficas de uso de ventanas que se
proveen en este capítulo. Además, se ha (jesarroJlado $1 ER Aptltud del· Sistema para Recuento de Células CD 34.+ USP par~
evaluar los reactivos y asegurar el establecim!ento .de las vehtahas de análi.sis co.rrectas durante la adquisición y el anállsis de
datos.

IDENTIFICACIÓN DE CÉLULAS MAl)RE H~M~TQPOVÉTICAS CD34+

El recuento de células CD34+ por citometría de flUjo es unanálisis de eventos poco frecuentes o raros. Para el análisis de las
células madre hematopoyéticas C034+, las muestras d.e células se tiñen ccm anticuerpos marcados con fluprocromós contra el
antígeno de la célula madre hematopoyética CD34 y contra el antígeno pan-leucocitario CD45. Se combinan cinco parámé-

1 Sutherland DR, Keeney M, Gratama JW. Enumeration of CD34+ hematopoietk stem and progenitor cells. Curr Protoc Cytom. 2003;6:6.4.1-6.4.24.
236 (127) Recuento por Citometría de Flujo/ Pruebas Biológicas USP 40

tros-dispersión frontal de luz (FSC, por sus siglas en inglés), dispersión lateral de luz (SSC, por sus siglas en inglés), tinción de
CD34, tinción de CD45 y tinción con colorante para viabilidad, mediante una estrategia de uso de ventanas de análisis secuen-
cial o booleana para identificar las células viables CD34+.
Las células madre hematopoyéticas CD34+ tienen características de dispersión frontal de luz y de dispersión lateral de luz
similares a las de los linfocitos; expresan ambos CD45 y CD34, presentan una expresión tenue de CD45 y una dispersión late-
ral de luz baja. El colorante para viabilidad no tiñe células vivas, lo que permite la exclusión de células muertas del análisis de
preparaciones de células viables. Para el análisis de preparaciones de células no viables, fijadas (conservadas), tales como el
Estándar de Referencia (ER) Aptitud del Sistema para Recuento de Células CD34+ USP, la ventana del análisis de células viables
por citometría de flujo se abre por completo para incluir todas las células, o se omite del análisis el Colorante para viabilidad.

CONSIDERACIONES DEL RECUENTO

El método de recuento de cé~ulas .CD34+ aquí descrito se.basa en el uso de microesferas fluorescentes sintéticas (perlas de
referencia) como controles internos de recuento. Se agregan perlas de referencia homogéneas a la muestra de células en una
concentración y volumen :conocidos, o las perlas de referencia se pueden procurar pre-fraccionadas en alícuotas y liofilizadas
en tubos de muestra especiales, en los que se llevan a cabo todos los pasos subsiguientes de tinción y procesamiento de las
células. Para evitar la pérdida de perlas de refereocia, s.e omiten las etapas de lavado y se usan soluciones amortiguadoras que
contienen proteína. Se usa un protocolo de lisado de eritrocitos basado en cloruro de amonio para preparaciones recientes de
células; el lisado no es necesario para preparaciones de células congeladas, descongeladas o fijadas.
Después de la tinción y el procesamiento de las células, se analizan en simultáneo las perlas de referencia y tas células en un
citómetro de flujo. El número de células CD34+/µL en la muestra de .células se puede calcular directamente comparando en el
mismo archivo de datos el número absoluto de células blanco CD34+ y el número de perlas de referencia detectadas. El ER
Aptitud del Sistema para Recuento de Células CD34+ USP se usa para verificar que se hayan usado los reactivos y parámetros
de ventanas de análisis correctos en el citómetro,de flujo.

ESPECIFICACIONES DE EQUIPO
Se requiere el siguiente equipo:
• Una micropipeta capaz de realizar un pipeteo inverso exacto de volúmenes en microlitros
• Un citómetro de flujo con las siguientes especificaciones mínimas (ver Citometría de Flujo (1027)):
• Capacidades de detección para dispersión frontal de luz; dispersión lateral de luz; emisión de fluorescencia "verde"
(intervalo, 510-5.50 nm); emisión de fluorescencia "amarilla" (intervalo, 560-590 nm); y emisión de fluorescencia
"roja" (>600 nm)
• Mediciones de dispersión de 1.uz y fluorescencia que se correlacionan con el tiempo
• Resolución de díspersJón ·de IUz que permita la id~ntifícación de linfocitos, monocitos, granulocitos y perlás de refe.
renda fluorescentes
• Velocidades de detección y de adquisición de datos de al menos 5000 células/s
• Una fuente de excitación láser de 488 nm
•Una sensibilidad de intensidad de fluorescencia que permita la detección de autofluorescencia celular
• Software de análisis, incluida una estruct(Jra. de archivos de datos en el Estánd;;ir de Citom.etría de Flujo (FCS, por sus
siglas en inglés) o equivalente, con éapacidad de corrección de superposicíón de espectros ·

CONFIGURACIÓN Y CONSIDERAC.IONES DEL. CITÓMETRO DE. FLUJO

[NOTA-Para inf()rmación general, ver el. capítul() (J(),47) y liis recomendaciones del fabricante .del citómetro de flujo.]
Asegurarse de que el receptáculo de líquido envolvente esté Uen9 1 que el receptáculo de fluido de desecho esté vacío, y que
tooas l;;is tapas estén bíen cerradas. Verificar. que l;;i poteocia del láser, el vacío del sistema y la presión. estén configuradas de
forma apropíada.
Mediante microesferas de calil;lración conjugadas con.fluorocromo, veríficar la alineación apropiada del sistema midiendo la
velocidad de detección prornedio, la.tti:.iorescencia media, la dispersíón frontal de luz medía, la dispersión lateral de luz media y
los valores calculados del coeficiente de variación respectivos según lo medido por cada detector. Todos los valores deben es.·
tar dentro de los intervalos recomendados por el fabricante del citómetro de flújo. Ajustar el umbral del detector para asegurar
que se incluyen todos los eventos de perlas de referencía.
Es posible usar microesferas q:m capacidaq de \.mir antic1,1erpos o células conserv;;idas, tales como el ER Aptitud del Sistema
para Recuento de Células CD34+ USP, para establecer una matriz de valores del detector al mismo tiempo que se realizan ajus-
tes por superposición espectral (compensación). Tener en cuenta que, aunque las m icroesferas o las preparaciones de células
se pueden teñir con anticuerpos anti-CD3.4 conjugados con ficoeritrina (PE, por sus siglas en inglés} y con anticuerpos anti-
CD45 conjugado con isotiocianato de flúOresceína (FITC, por sus siglas en inglés), solo las preparaciones recientes de.células
pueden teñirse con· Cóforantes para vii:Jbilidad.
 USP 40 Pruebas Biológicas/ (127) Recuento por Citometría de Flujo 237

REACTIVOS
Solución salina amortiguada con fosfatos (PBS, por sus siglas en inglés): Cloruro de sodio 138 mM, cloruro de potasio
2,7 mM, fosfato dibásico de sodio 8 mM y fosfato monobásico de potasio 1,47 mM. [NoTA-pH 7,0-7,4. Si fuera necesa-
rio, ajustar el pH con ácido clorhídrico.]
Solución amortiguadora de dilución: Albúmina sérica bovina o albúmina sérica humana al 1 % (p/v) en solución salina
amortiguada con fosfatos . .
Solución amortiguadora madre para lisado de eritrocitos con cloruro de amonio 1 OX: Cloruro de amonio 1,5 M, bi-
carbonato de sodio 0,01 M y ácido etilendiaminotetraacético 0,01 M (EDTA, por sus siglas en inglés)2
Solución amortiguadora para lisado de. eritrocitos diluida (1 X): Solución amqrtiguadora madre para lisado de eritrocítos
con cloruro de amonio 10X diluida 1 :10 con agua ·. ·
Anti-CD34 conjugado con ficoeritrina: Anticuerpo lgG1 de ratón anti-<:;D34 humano conjugado con ficqeritrina (clones
QBEndl O, 8G12, 581, Birma K31 o anticuerpos anti-CD34 conjugados con flcoeritrina clase 11 o clase 111 equivalentes), titu-
l¿¡dos de forma apropiada .· .. · ·· . ·. · ·
Anti-C045 conjugado con isotiocianato de fluoresceína: Anticuerpo lgGl de ratón anti-C045 humano conjugado con
isotiocianato de fluoresceína (clones J33, T29/33, o HLE-1 o anticuerpos anti-(:[);45 conjugados con isotio.cianato de flúo-
resceína equivalentes), titulados de forma apropiada ·· · · . . · ··
Colorante para viabilidad: Solución de 1 µg/ml de 7-aminoactinomicina D (7'~AAD) o equivalente, recientemente diluida
a partir de una solución madre d.e 100 µg/ml 3
Microesferas para calibración del instrumento: Microesferas para calibradón de instrúmento conjugadas con fluorocro-
mo4
Perlas de referencia suspendidas: Perlas de referencia conjugadas confluO:rocromo, formuladas en suspensión líquida>'
Tubo con perlas de referencia liofilizadas: Perlas de referencia conjugadas con fluorocromo, formuladas y liofilizadas en
un tubo de recuentoli
Estándar de aptitud del sistema ER Aptitud del Sistema para Recuento de Células CD34-t- USP: Reconstituir un vial
completo de ER Aptitud del Sistema para Recuento de Células CD34+ USP con 0,5 ml de agua destilada.
Muestras de células: Suspensiones recientes de células, fijadas, o crioconservadas y descongeladas que contengan células
CD34+, con un mínimo de 100 000 células nucleadas/mll€stra. las muestras de células pueden incluir sangre periférica,
producto de leucaféresis, sangre de cordón umbilical, o médula ósea.

PREPARACIÓN DE lA MUESTRA
Usar técnicas de pipeteo inverso para todas las diluciones y transferencias de muestras. Diluir las Muestras de células con
Solución amortiguadora de dilución hasta obtener una concentración total de células nucleadas de 10-30 x 106 células/ml.
Agregar a un tubo de poliestireno de 12 mm x 75 mm (o a un Tubo con perlas de referencia fíofilízadas), Anti-CD45 conjugado
con isotiocianato de fluoresceína y Anti-CD34 conjugado con ficoeritrina seguidas de. Coloránte para viabilidad hasta una concen-
tración final de 1 µg/mL. Agregar 100 µL de Muestras de células bien mezcladas a la parte inferior del tubo y mezclar. Incubar
durante 20 minutos protegiendo de la luz. Agregar 2 ml de Solución amortíguacfora para lisado de eritrocitos diluida (1X) a
muestras recientes o agregar 2 ml de Solución amortiguadora de dilución a una muestra fijada o congelada y descongelada;
mezclar en un mezclador de vórtice. Para Muestras recíentes de células, ín.tubardurante 1 O minutos protegiendo de la luz; para
Muestras de células fijadas o congeladas y luego descongeladas, no se requiere tiempo de incubación. Colocar las muestras
sobre hielo. Las muestras deben analizarse dentro de la primera hora del lisado.
Inmediatamente antes de adquirir los datos en el citómetro de flujo, pipetear y transferir 100 µL de Perlas de referencia sus-
pendidas bien me:z:cladas (si no se usan Tubos de perlas de referencia liofilizadas) a las Muestras de células preparadas descritas
anteriormente. Tapar el tubo y mezclar suavemente por inversi.ón. No agregar perlas de referencia a las Muestras de células que
se vayan a usar para el ajuste de la matriz de compensación del instrumento.
Proceder inmediatamente con la adquisición de datos para recolectar un mínimo de 75 000 eventos de CD45+ y un mínimo
de 100 células CD34+. Adquirir y analizar los datos creando regiones y ventanas lógicas (de forma manual o usando un soft-
ware apropiado para el citómetro de flujo), según se describe en la Tabla 1.

Requisitos de Aptitud del Sistema

Usar el ER Aptitud del Sistema para Recuento de Células CD34+ USP para verlticar que la estrategia de uso de ventanas des-
crita más adelante permite la detección y cuantificación de células madre hematopoyéticas CD34+. rener en cuenta que para

2 Se puede obtener un reactivo adecuado para 11sado de eritrocitos exento de fijadores en BD Bíosciences: BD Pharm Lyse™ Lysing Buffer, Nº de catálogo 555899,
BD Ammonium Chloride Lysing Solution (1 OX), Nº de catálogo 344563, o equivalente.
3 Se pueden obtener reactivos adecuados en BD Bíosciences como parte de un kit, Nº de catálogo 344563, o BD Bíosciences, Nº de catálogo 555899, o equivalen-
tes.
4 Se puede obtener un reactivo adecuado en BD Biosciences: Nº de catálogo 641 319 o equivalente.
s Se pueden obtener reactivos adecuados en Dako: Nº de catálogo 1<2370 (en un kit), o Dako, Nº de catálogo S2366, o equivalentes.
6 Se puede obtener un reactivo adecuado en BD Biosciences: Nº de catálogo 340334.
238 (127) Recuento por Citometría de Flujo/ Pruebas Biológicas USP 40

las Muestras de células fijadas que la ventana de viabilidad {Rt en la Tabla 1) debe abrirse para incluir todos los eventos; alter-
nativamente, se puede omitir el Colorante para víabiliáad. Calcular el número de células madre hematopoyéticas C034+/µL en
el ER Aptitud del Sistema para Recuento de Células C034+ USP.

Criterios de Aceptación
Los resultados deben estar dentro del intervalo provisto enel certifk:ado dél ER Aptitud del Sistema para Recuento de Células
CD34+ USP.

ADQUISICIÓN Y ANÁLISIS l>E DATOS

Para la adquisición de datos, .recolectar un mínimo dé. 75 000 event0s dé CD45+ .Y .un mínimo de 100 célu.las CD34+. Adqui-
ñr y analizar los datos creando regionen ventanas lógicas (de forma rriar1Uafo úSando un sqftware apropiado para el citélme-
tro de flujo), según se qésctibe en la .Tcibla t. Los.mejqres r.esllltacios se obtien.en ct1ar1do los datos de células y Perlas (eventos)
se preselltán comti gráficas de puntos bJvariantes. ·La Tab/(11 fontiené gráficas qe puntos y estrategias de· uso de .ventanas
representativas pata muestras reCientes de célu1~s .. Las visu.aJizaeiones .dli! las gráficas de puntos pueden variar dependiendo de
la muestra de células, del citómetro de flujoyd~lsoftware usado. Se pueden·enmntrar guías para la resolución de ptoplemas
en la Tábta 2.

Gráficas de Puntos y Estrategias

Formato lnstl'líc;c;ic)nes para Uso de Ventanas e.le Uso.de Ventanas Represe1J~ti1as

Dispersión
lateral de • Mostrar tod6sloseventós no Séle<;di;>na-
luz {lineal) i;lp.s. c~r una régiéin RI alreded!'>:r (le
vs. fl uóres- eventos éon poca a sJr:i fluorescenda,
cen cfa1 del •Se incluyen en la regÍón R1: células viables,
Colorante Definir i;le~ritus,.. .· . . ,. ·.. ... · . . .
para viabilí- células • seexdu~er:i'de.1a fegion Rkcél.i:ílas rriuer- 10° 101 1a2 103 10• 10•
dad (log) viables tas y moribundas, erlas de referenda. 7-AAD

•• Mostrar eventos Sélecdonados /U. Crea~

ul1a ~~lón 82 alrededqt de .i;Vli!nfoS; con
fluóres~em:ja CD4$+~ exduyend() petrltus
(~ de<:ir~ eventqs t6n una dispersión late:.
· ral ae'Juz mity b¡ija:) Dentro.de R2; úear
una régi:ón Rs'afí'éé!edor (!e éveritos con
: ft1.1o:res~cíadl! CD45+ al~a y dlsp!.!tsión
.. late~al de luz baja. . .. . .
• se ir'u:lt.iyen eri la región R~: leucocitos
. f c~$f viables. .• . ..·. · .· .. ·.
•Se induyeri ~nla regíón Rl: litifocitos ··
Dispersión viable$. . ..
lateral de • Se excluyen de Ja reg¡ón RZ: los detñtt:¡s de
luz(llneal) Definir leuco., célµl¡is~ plaqu.eta~ y eritr()ci~os noiisa\lo.$•.
vs. fluores· citos ylinfoc • Se excluyen de la región R1: . . . ..
cencia citosCD45+ ·granulildfos, n1Ón6Citosyotras células
2 CD45 (log) viables no linfocitos. · · ·· ·

• Mostrar eventos selecclonados R2. Crear

µna. región R4. <!llrede¡ior(¡Íe eyentos con..
Dispersión fluor~i::eticia dé CD43+ ydispersión rate-
lateral de ra! de)uz baja. .. ·
luz(llneal) •Se !nduy.l!n.enla regign 84: 'élulas<l:D34+
vs .. f.Juores" Definir células :v¡¡¡.bles: ·•.:'. .· ·.
cencia de CD34+ via- • Se excluyen de la región 114: células
3 CD34 {log) bles CD34-. .
USP 40 Pruebas Biológicas/ (127) Recuento por Citometría de Flujo 239

Tabla 1. Descripciones de Gráficas de Puntos e Instrucciones para el Uso de Ventanas {Continuqción)

Gráficas de Puntos.y Estrategias
Pas!> Formato ltr!>póslto lllStrucclones parcl flso de VentanClls ele Uso. de Ventanas Representativas
250K Vefltarfa 3 "" R3

200K
• Mostrar eventos seleccionados R3. Crear
una región RS p¡¡ra exdu.ir detritus (disper-
Dlspersióri sió11 latéral (:fe lúZ bá:ja y dis¡>efs~órffronfal
laíerálde delt.12 baja)• · · ·
luz (lineal) • Se inclliyen en la. región R5: linfocitos y
v~. Cllsper- blastos vl<1bles~ .. . .·
s.íón frontal Definir . • se exéluyerf ae '~ región R5: dettit.us Re-
Cle.1úz linfotitos y ·. queños}' even~os con valores altos de dis,.
(llnéaO blastqs · .erslón lateral. cjé h.i~, · ·

200K

•.MQstrap event0cs ;~e(:don;¡dqs .R1., crear .

una región R~ de eventós (:on R6
Dispersión d!~f.le~sló11 l!1iet . . baja a Íntennedia
lateral de ...... y expresión "de CD45 intermedia.
luz (lineal) Definir células :. • Se índuyeo en já región Ró:célQlas madre
vs. fluores~ CD34+ton nematopoyétitásCD34+ Viábles~
centia baja expre- .... • se excluyen de la región R6: célúlas que
5 CD45 (lag) sion de C$45 ex resan<nivelesalt0c5. de CD45.
~·Mr:istrar eventos seleccionados Ró y pegar
UO<t~opia dé lí:¡sparátnetrosde la ventana
dé ~5 ~t:r la gráfü:a: fo!i eventos en RStie- gsol< Ve11tana 5""' R1 -t RZ+ R'f+ R6

neti carac;tét(s~ié:as dé dispersión defüz

200K
similarefa !il detOs·linfocitos y blastós/lo
que éqnflrrna la ldenti<:lad de los éventos ü100l<
Dispersión ·:O'.!rnoéé11.11as··madr¡¡·l'remiltop0cyéticas
lateral de CD34+; ··· .... i.81_
luz (lineal) • Sé incluyen en 1¡¡. :región RS: células. madre 5oK
vs. disper- Confirmar cé- ·.·.·. hérriatopqyétkas CD34+ viables
sión frontal lulas madre ·cónfirrná.dai
Cle luz hematopoyé- • Se excluyen Cle la región Rs: ·detritus.y o .SOK 100K 150K 20QK 250K
FSC
6 (lineal) ticas CD34+ otros eventos irrelevantes. ·

• Mostr1:1r todos los eventOs que está11 afuera

Fluorescen- de la ventana. Crear una región Rl alrede-
cia.de dor de eventos con fluorescencia de
CD34 (lqg) CD34+ alta y de CD45+ alta. 101
vs. fluores- Cuantificar las • Se incluyen en la región Rl: perlas de refe-
cencia rencia totalé~. . . 1-0•-i-...-.,.,-~..---,;o;;
pertas de re-
1o" 1-01 102 1o" fo4 · 1o'
CleCD45 ferencia tota- • Se excluyen de la región Rí: cé!Ulas
CD45
7 (log) les y:detritus.

1()5 Ventana 6 = R7

10' R8
• Cuando lo recomienda el fabricante de las
Cuantificar perlas de referencia, mostrar eventos selec-
las .perlas de •cionaClos Rl. Crear una región .R8 alrede-
referencia ('.lor de eventos c9n intensidaa de fluores-
~luorescen­ irídíviduales centíí1 menor. 10'
da de (singlet) {p. • Se incluyen eri la región R8< perlas de refe-
CD45.(log) ej., renciá individuales "(singlet) 1'.. 10•-.--.~~~~~~~~

vs. tiempo no agrega- • Se excluyen Cle la región R8: agregados de o 00 60 90 120

8 (lineal) das) perlas de ·referencia. Tiempo

CÁLCULO DEL NÚMERO ABSOLUTO DE.CD34

El número absoluto de células <;:;D~4+/µL se calcula según se indica a continuación:
Células viables CD34+/µL =·(número de células CD34+)/(número de perlas de referencia) X (concentración de perlas X DF)
240 (127) Recuento por Citometría de Flujo / Pruebas Biológicas USP 40

DF = factor de dilución de la muestra

El número de células CD34+ se determina a partir de las células CD34+ viables (región RS de la Tabla 1, Etapa 6). Depen-
diendo de las recomendaciones del fabric;ante de las perlas de referencia, es posible determinar el número de perlas .de referen-
cia a partir del total de perlas de referencia (región R7 de la Tabla 1, gráfica 7) o de las perlas de referencia individuales "(sin-
glet)" (región RB de la Tabla 1, gráfica 8). La concentración de perlas es especificada por el fabricante de las perlas de referen-
cia.
Tabla 2. Guías para la Resolución de Problemas (ver también el capítulo (1027})
Problemas Razones Posibles Soluciones Comenbtrios
Las perlas de referencia son alta-
Muestra reciente de células degra- Usar un caria! de fluorescencia del mente fluorescentes en todos los
No es posible definir con claridad la dada; muestra fiíada; demasiadas rojo lejano (>600 nm), en lugar de canales. La interferencia por auto-
ventana de perlas {Rl) en la Tabla plaquetas; lisado de eritrocitos ln- lsotiocianato de fluoresceína, para fluorescencia se reduce dramática-
1, gráfica 7 debido a los detritus completo; eritrocitos nucleados (p. formar una ventana de perlas de mente a longitudes de onda ma-
fluorescentes ej., en sangre de cordón umbilkal) referencia. yores (>600 nm}.
Asegurarse de que las perlas de re-
Repetir e! procedimiento de com- ferencia no están en la muestra de
No es posible encontrar la pobla- Configuraciones de compensación pensación espectral y ajustar la la matriz de compensación, debí-
ción CD34+ en la Tabla 1, gráfica incorrecta para ficoeritrina y Colo- configuración dec manera corres- do a que pueden interferir con la
3 ronte para viabilidad pondiente. configuración de la compensación.
Inseguridad al establecer las venta- Seguir la recomendacióri del fabri· Los cálculos de concentración de
nas para perlas individuales "(sin- Altos niveles de agregados de perlas canfe de las perlas de referencia perlas .de referencia variarán para
glet)" o totales de referencia para induír o excluir agregados. cada fabricante.
Los clones de anticuérpos alternati-
vos deben validarse cuidadosa-
mente conti:a los. anticuerpos anti-
CD34 especificados. Seleccionar
un antk:uerpo clase 11 o clase 111
Se desea usar un don de anticuerpo Consideraciones sobre dtometría que detecte todas .las isoformas y Los anticuerpos clase 1 no detectan
CD34 distinto de flujo multiparamétrica glicoformas de CD34. todas las glicoformas de CD34.
Los clones de anticuerpos alternati-
vos deben validarse cuidadosa-
mente contra los antkuerpos anti·
C045 especificados: Seleccionar
un anticuerpo que·detecte todas
-
Se desea usar un don de anticuerpo Consideraciones sobre cltometría las isoformas y todas las glicofor-
anti·CD45 distinto de flujo multipararnétrica masdeCD45:

REQUISITOS ADICIONALES
Estándares de Referencia USP (11)

ER Aptitud del Sistema para Recuento de Células CD34+ USP

í.USP40

(129) PROCEDIMIENTOS ANALÍTICOS PARA ANTICUERPOS

MONOCLONALES RECOMBINANTES DE USO TERAPÉUTICO

INTRODUCCIÓN
Este capítulo provee procedimientos analíticos para anticuerpos monoclonales murinos, quiméricos y humanizados de isotipo
lgG y subtipos (p.ej., lgGl e lgG2). Las subclases presentan diferencias en la secuencia de aminoácidos y en el número de
enlaces disulfuro y en algunos casos requieren análisis específicos para subclases. Este capítulo se aplica a anticuerpos mono-
clonales para uso terapéutico y profiláctico y para uso en diagnósticos in vivo. Este capítulo no es aplicable a anticuerpos
monoclonales usados como reactivos en la fabricación de productos medicinales cuyos requisitos aplicables son determina-
dos por la agencia reglamentaria apropiada.
Los anticuerpos policlonales que ocurren naturalmente en suero o plasma pueden unirse a muchas dianas diferentes como par-
te del sistema inmune. Por el contrario, los anticuerpos monoclonales terapéuticos para uso humano son preparaciones de
una inmunoglobulina (o un fragmento de una inmunoglobulina) que tienen especificidad para una diana y se derivan de un
solo don de células. Los anticuerpos monoclonales terapéuticos pueden unirse para neutralizar antígenos solubles y su me-
canismo de acción a menudo implica bloquear la unión del ligando con su receptor específico. Alternativamente, los anti-
cuerpos monoclonales terapéuticos pueden reconocer y unirse a antígenos unidos a células y en estos casos también pueden
involucrar al sistema inmune a través de las funciones efectoras mediadas por el fragmento cristalizable (Fe, por sus siglas en
USP 40 Pruebas Biológicas/ (129) Anticuerpos Monoclonales Terapéuticos 241

inglés) como parte del mecanismo de acción. Los anticuerpos monoclonales que tienen una especificidad de unión definida
individual son monoespecíficos, mientras que los anticuerpos monoclonales biespecíficos obtenidos por ingeniería recombi-
nante pueden unirse a dos dianas distintas (p.ej., antígenos). Los anticuerpos monoclonales de tipo lgG tienen un peso mo-
lecular de aproximadamente 150 kDa. Cada molécula consta de dos cadenas polipeptídicas pesadas y dos cadenas livianas
que tienen un peso molecular de aproximadamente 50 y 25 kDa, respectivamente. Los anticuerpos pueden representarse de
manera esquemática como una Y enlazada por puentes disulfuro, en donde cada brazo de la Y se denomina dominio Fab y
el tallo de la Y recibe el nombre de dominio Fe. Los anticuerpos monoclonales son glicoproteínas que tienen un sitio de
glicosilación ubicado en la porción Fe de cada una de las cadenas pesadas, y tienen posibles sitios adicionales de glicosila-
ción en el dominio Fab, dependiendo de la molécula.
La especificidad de un anticuerpo monoclonal se basa en su sitio de unión al antígeno, el cual se ubica en el dominio Fab de la
molécula. El dominio Fe contiene sitios de unión a receptores que están asociados con funciones efectoras del anticuerpo
que tienen aplicaciones específicas para subclases tales como citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo y citotoxici-
dad dependiente de complemento. Los efectos farmacocinéticos mediante la unión al receptor Fe neonatal también están
mediados por este dominio.
Los anticuerpos monoclonales se producen en un cultivo celular usando un sistema de lote de siembra con bancos de células
maestro y de trabajo. Después de la recolección, los pasos de purificación aseguran que el producto y las impurezas relacio-
nadas con el proceso se reduzcan a un nivel aceptable.
En la actualidad, los productos terapéuticos con anticuerpos monoclonales autorizados incluyen aquellos implicados en la acti-
vación de células efectoras, muerte celular, apoptosis inducida por entrecruzamiento, antagonismo contra diversas dianas y
anticuerpos agonistas.
Este capítulo incluye evaluaciones de pureza de las preparaciones de anticuerpos monoclonales mediante cromatografía de ex-
clusión por tamaño (SE-HPLC), electroforesis capilar y análisis de oligosacáridos unidos a los anticuerpos, y provee procedi-
mientos validados para cada una de ellas.
Aunque este capítulo se enfoca en anticuerpos monoclonales tipo lgG, los principios de las pruebas incluidas se pueden aplicar
a otras moléculas relacionadas, tales como lgM u otros isotipos, fragmentos de anticuerpos y proteínas de fusión a Fe. Cuan-
do la sustancia activa es un anticuerpo conjugado, dichas pruebas pueden realizarse en el anticuerpo purificado antes de la
modificación o conjugación.
Se pueden usar métodos y/o procedimientos alternativos siempre que provean ventajas en términos de exactitud, sensibilidad,
precisión, selectividad o adaptabilidad para la automatización o reducción de datos computarizados o en otras circunstan-
cias especiales. Dichos procedimientos y métodos alternativos deben ser validados conforme a lo descrito en el capítulo Vali-
dación de Procedimientos Farmacopeicos (1225) y deben demostrar que proveen resultados equivalentes o mejores.

• CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN POR TAMAÑO

Aunque la SE-HPLC es robusta para medir monómeros y especies de alto peso molecular (HMWS, por sus siglas en inglés,
agregados), la cuantificación de especies de bajo peso molecular (LMWS, por sus siglas en inglés, fragmentos) puede ser
altamente variable dependiendo del anticuerpo monoclonal estudiado. La medición de especies de bajo peso molecular se
cuantifica de mejor manera mediante electroforesis capilar con dodecil sulfato de sodio (CE-SDS).
Fase móvil: Preparar mezclando 10,5 g de fosfato dibásico de potasio, 19, 1 g de fosfato monobásico de potasio y 18,6 g
de cloruro de potasio por litro de agua. Verificar que el pH sea 6,2 ±O, 1. Pasar a través de un filtro de membrana con un
tamaño de poro de<:: 0,45 µm o menor.
Solución de aptitud del sistema: Preparar una solución de 1O mg/mL de ER Aptitud del sistema de lgG Monoclonal USP
en Fase móvil reconstituyendo el contenido de un vial con 200 µL de Fase móvil. La Solución de aptitud del sistema reconsti-
tuida debe usarse dentro de las 24 horas después de su reconstitución y debe almacenarse a 2º-8º si no se usa inmediata-
mente.
Blanco de aptitud del sistema: Usar Fase móvil.
Solución muestra: Diluir la muestra a 1O mg/mL en Fase móvil si se requiere dilución. De manera similar, se debe preparar
un blanco usando una dilución equivalente de la solución amortiguadora de la formulación en Fase móvil.
Sistema cromatográfico
(Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
Detector: UV 280 nm
Columna: 7,8 mm x 30 cm; relleno L59 de 5 µm
Temperaturas
Columna: Ambiente
Muestreador automático: Mantener a 2º-8º
Velocidad de flujo: 0,5 mL/min
Volumen de inyección: 20 µL
Tiempo de corrida: 30 min
Aptitud del sistema
Muestra: Solución de aptitud del sistema
242 (129) Anticuerpos Monoclonales Terapéuticos/ Pruebas Biológicas USP 40

[NOTA-Los tiempos de retención aproximados para polímero, dímero, monómero y especies de bajo peso molecular son
12; 15; 18 y 22 minutos, respectivamente.]
Requisitos de aptitud
Cromatograma: El cromatograma de la Solución de aptitud del sistema es consistente con el cromatograma típico según
se ilustra en el Certificado USP para el ER Aptitud del Sistema de lgG Monoclonal USP.
Similitud de los cromatogramas: Los perfiles cromatográficos de las inyecciones de Solución de aptitud del sistema que
se realizan antes y después de las inyecciones de las Soluciones muestra en un conjunto de muestra son uniformes entre sí
y con el perfil cromatográfico típico según se ilustra en el Certificado USP para el ER Aptitud del sistema de lgG Mono-
clonal USP. Todos los picos nombrados en el cromatograma típico deben estar presentes, estar bien resueltos y en el
mismo orden de elución que en los cromatogramas de la Solución de aptitud del sistema.
Criterios cuantitativos: Las inyecciones de la Solución de aptitud del sistema que se realizan antes y después que las de la
muestras, (Bracketing), deben cumplir los siguientes criterios cuantitativos:
El valor porcentual del área del pico de las especies de alto peso molecular en la Solución de aptitud del sistema debe ser
0,4%-0,67%.
El valor porcentual del área del pico principal en la Solución de aptitud del sistema debe ser 99, 1%-99,6%.
El valor porcentual del área del pico de las especies de bajo peso molecular en la Solución de aptitud del sistema debe ser
no más de 0,2%.
Análisis
Muestras: Blanco, Solución de aptitud del sistema y Solución muestra
Como mínimo, se deben flanquear (bracket) las inyecciones de la Solución muestra con inyecciones individuales de la Solu-
ción de aptitud del sistema. Se debe incluir una inyección de un Blanco como la inyección final antes de la inyección de la
Solución de aptitud del sistema.
Cálculos: Usando un integrador electrónico adecuado o un sistema computarizado, analizar las inyecciones de Solución de
aptitud del sistema que se realizan antes y después de la inyección de la solución de muestra (Bracketing). Excluir de la
integración cualquier pico que esté presente en el Blanco. Los picos relacionados con proteínas que eluyen antes que el
pico principal se clasifican como especies de alto peso molecular; aquéllos que eluyen después del pico principal se clasifi-
can como especies de bajo peso molecular. Informar el valor porcentual de las áreas de los picos para las especies de alto
peso molecular, el pico principal, y las especies de bajo peso molecular.
• ELECTROFORESIS CAPILAR CON SDS (REDUCTORA Y No REDUCTORA)
La electroforesis capilar con dodecil sulfato de sodio (CE-SDS) es un método sensible y analítico para la estimación cuantita-
tiva de impurezas relacionadas con el producto tales como moléculas no glicosiladas, medio anticuerpos y fragmentos, y
es, por consiguiente, útil también como una valoración indicadora de estabilidad. Después de la desnaturalización con
SDS, el método permite el análisis del anticuerpo completo en condiciones no reductoras, y el análisis de las cadenas livia-
nas y de las cadenas pesadas (LC y HC, respectivamente) en condiciones reductoras.
[NOTA-Pueden ser necesarias pequeñas variaciones en la preparación de la muestra dependiendo de la estabilidad del anti-
cuerpo individual. Si la incubación durante 15 minutos a 70º conlleva a la fragmentación o escisión de enlaces disulfuro
para una muestra de anticuerpo particular, ajustar el tiempo de incubación de manera correspondiente.]
Solución amortiguadora de muestra de SOS: Preparar una solución que contenga clorhidrato de tris(hidroximetil)amino-
metano (tris-HCI) 100 mM,de pH8,95 ± 0,05 y SDS al 1% (p/p).
Solución amortiguadora de gel de SOS: Solución amortiguadora de pH 8,0 que contenga SDS al 0,2% (p/p) y un polí-
mero hidrófilo apropiado que actúe como tamiz molecular. 1
Solución de alquilación: Yodoacetamida 250 mM en agua, preparada inmediatamente antes de su uso
Solución de aptitud del sistema: Reconstituir 1 vial de ER Aptitud del sistema de lgG Monoclonal USP con 0,5 mL de
Agua para Inyección a una concentración final de 4 mg/ml.
Solución de estándar interno: 5 mg/mL de estándar interno de 1O kDa 2 en agua que contenga SDS al 0,5% (p/p) y azida
sódica al 0,2% (p/v).
Solución de aptitud del sistema no reducida: Mezclar 25 µL de Solución de aptitud del sistema con 4 µL de Solución de
estándar interno. Mezclar 66 µL de Solución amortiguadora de muestra de SOS con 5 µL de Solución de a/qui/ación. Agregar la
mezcla de Solución amortiguadora de muestra de SOS y Solución de a/qui/ación a la mezcla de Solución de aptitud del sistema y
Solución de estándar interno. Mezclar bien y calentar la mezcla a 70º durante 15 minutos. Dejar que se enfríe durante 3
minutos a temperatura ambiente, centrifugar a 300 x g durante 1 minuto y transferir 100 µLa viales para muestreador
automático.
Solución de aptitud del sistema reducida: Mezclar 25 µL de Solución de aptitud del sistema con 66 µL de Solución amorti-
guadora de muestra de SOS. Agregar 4 µL de Solución de estándar interno y 5 µL de f3 -mercaptoetanol sin diluir. Mezclar
bien y calentar la mezcla a 70º durante 15 minutos. Dejar que se enfríe durante 3 minutos a temperatura ambiente, centri-
fugar a 300 x g durante 1 minuto y transferir 100 µLa viales para muestreador automático.
Solución blanco: Mezclar 45 µL de agua con 50 µL de Solución amortiguadora de muestra de SOS. Agregar 4 µL de Solución
de estándar interno y 5 µL de f3-mercaptoetanol sin diluir para condiciones reductoras o 5 µL de Solución de a/qui/ación para

1 Disponible en Beckman Coulter como un componente del kit de prueba, número de catálogo A10663, o un equivalente adecuado.
2 Disponible en Beckman Coulter como un componente del kit de prueba, número de catálogo A10663, o un equivalente adecuado.
USP 40 Pruebas Biológicas/ (129) Anticuerpos Monoclonales Terapéuticos 243

condiciones no reductoras. Mezclar bien y calentar la mezcla a 70º durante 15 minutos. Dejar que se enfríe durante 3 mi-
nutos a temperatura ambiente, centrifugar a 300 x g durante 1 minuto y transferir 100 µLa viales para muestreador auto-
mático.
Solución muestra no reducida: Diluir 100 µg de la muestra que se va a analizar con 50-95 µL de la Solución amortiguado-
ra de muestra SOS para obtener un volumen final de 95 µL. Agregar 4 µL de Solución de estándar interno y 5 µL de Solución
de a/qui/ación. Mezclar bien y calentar la mezcla a 70º durante 15 minutos. Dejar que se enfríe durante 3 minutos a tempe-
ratura ambiente, centrifugar a 300 x g durante 1 minuto y transferir 100 µL a viales para muestreador automático.
Solución muestra reducida: Diluir 100 µg de la muestra que se va a analizar con 50-95 µL de Solución amortiguadora de
muestra de SOS para obtener un volumen final de 95 µL. Agregar 4 µL de Solución de estándar interno y 5 µL de f3 -mercap-
toetanol sin diluir. Mezclar bien y calentar la mezcla a 70º durante 15 minutos. Dejar que se enfríe durante 3 minutos a
temperatura ambiente, centrifugar a 300 x g durante 1 minuto y transferir 100 µLa viales para muestreador automático.
Condiciones instrumentales
Modo: CE-SDS
Detector: UV o arreglo de diodos 220 nm
Capilar: Capilar de sílice fundida (diámetro interno de 50 µm) cortado hasta una longitud total de 30 cm con una longi-
tud efectiva de 20 cm.3 Se requieren los siguientes pasos de preacondicionamiento y prellenado entre cada corrida.
Preacondicionamiento del capilar: Enjuagar durante 3 minutos a 70 psi con hidróxido de sodio O, l N seguido de áci-
do clorhídrico O, 1 N durante 1 minuto a 70 psi y agua durante 1 minuto a 70 psi.
Prellenado del capilar: Enjuagar durante 1O minutos a 70 psi con Solución amortiguadora de gel de SOS.
Inyección de la muestra: Inyección electrocinética, polaridad inversa de 5,0 kV durante 20 segundos
Separación por voltaje
Condiciones no reductoras: Tiempo de corrida de 40 minutos a 15 kV, polaridad inversa
Condiciones reductoras: Tiempo de corrida de 40 minutos a 15 kV, polaridad inversa
Temperaturas
Almacenamiento de la muestra: Aproximadamente 25º
Capilar: Aproximadamente 25º
Aptitud del sistema
Requisitos de aptitud para condiciones reductoras
Muestra: Solución de aptitud del sistema reducida
Electroferograma: El electroferograma de la Solución de aptitud del sistema reducida es consistente con el electroferogra-
ma típico ilustrado en el Certificado USP para el ER Aptitud del Sistema de lgG Monoclonal USP.
Resolución: El pico principal de la cadena pesada y el pico de la cadena pesada no glicosilada pueden identificarse cla-
ramente. La resolución entre la cadena pesada no glicosilada y la cadena pesada intacta es no menos de 1,2.
Cociente entre la cadena no glicosilada y el total de los picos de la cadena pesada: Usar las áreas de los picos corre-
gidos por el tiempo (ver Electroforesis Capilar (1053), Cuantificación, que puede ser un recurso útil, mas no obligatorio)
para el cálculo. Calcular el cociente entre la cadena no glicosilada y el total de los picos de la cadena pesada dividiendo
la cantidad relativa de cadena pesada no glicosilada por la suma de todos los picos de la cadena pesada y multiplicar por
1OO. El cociente entre la cadena no glicosilada y el total de los picos de la cadena pesada en la Solución de aptitud del
sistema debe estar dentro de los límites de 0,75%-1,34%.
Requisitos de aptitud para condiciones no reductoras
Muestra: Solución de aptitud del sistema no reducida
Electroferograma: El electroferograma de la Solución de aptitud del sistema no reducida es consistente con el electrofero-
grama típico ilustrado en el Certificado USP para el ER Aptitud del Sistema de lgG Monoclonal USP.
Resolución: El pico principal de lgG puede identificarse claramente. La resolución entre el pico principal de lgG y el
Fragmento 1 (Fl) es no menos de 1, 3.
Cantidad del pico principal: Calcular la cantidad relativa del pico principal dividiendo el área del pico principal de lgG
(corregido por el tiempo) por la suma de todas las áreas de los picos (corregidos por el tiempo), excluyendo los picos del
estándar interno y todos los picos del sistema y multiplicar por 1OO. La cantidad relativa del pico principal de lgG de la
Solución de aptitud del sistema debe estar dentro de los límites de 61,4%-86,4%.
Desviación estándar relativa: No más de 2% para la migración del estándar interno en la Solución blanco de los extre-
mos (bracketing). No se detecta ningún otro pico que migre después del estándar interno.
Análisis
Muestras: Solución blanco, Solución de aptitud del sistema y Solución muestra
[NOTA-Basándose en los requisitos del instrumento, el campo aplicado a través del capilar y las condiciones para la inyec-
ción de la muestra pueden ajustarse para lograr la Aptitud del sistema.] Aplicar una potencia de campo de 500 V/cm (polari-
dad inversa) durante 40 minutos, usando la Solución amortiguadora de gel de SOS como electrólito en ambos reservorios de
solución amortiguadora. Someter las muestras a electroforesis, usando una polaridad inversa de 20 segundos y una inyec-
ción electrocinética a 5,0 kV, en el extremo anódico del capilar y registrar los electroferogramas a 220 nm. Enjuagar duran-

3 Beckman Coulter, número de catálogo 338472 o equivalente.

244 (129) Anticuerpos Monoclonales Terapéuticos/ Pruebas Biológicas USP 40

te 3 minutos a 70 psi con hidróxido de sodio O, 1 N seguido de ácido clorhídrico O, 1 N durante 1 minuto a 70 psi y agua
durante 1 minuto a 70 psi. Inyectar al menos por duplicado.
Calcular las áreas de los picos corregidos por el tiempo de todos los picos que migran después del pico del estándar inter-
no.
Condiciones reductoras: Calcular la cantidad relativa de los picos que pertenecen al anticuerpo monoclonal, presente en
el producto, dividiendo la suma de las áreas de los picos (corregidos por el tiempo) de la cadena pesada, de la cadena
pesada no glicosilada y de la cadena liviana por la suma de todas las áreas de los picos (corregidos por el tiempo) para los
picos que aparecen después del pico del estándar interno y multiplicar por 1OO.
Condiciones no reductoras: Calcular la cantidad relativa del pico del producto dividiendo el área del pico principal de lgG
(corregido por el tiempo) por la suma de todas las áreas de los picos (corregidos por el tiempo) que aparecen después del
pico del estándar interno y multiplicar por 1OO.
• ANÁLISIS DE ÜLIGOSACÁRIDOS-ANÁLISIS DE ÜLIGOSACÁRIDOS N-LIGADOS DE ANTICUERPOS MONOCLONALES
La inclusión de análisis de oligosacáridos en una especificación para un fármaco de anticuerpo monoclonal debe evaluarse
usando enfoques científicos y basados en riesgos, y deben definirse para cada producto específico. Si es aplicable, se pue-
de emplear uno o más de los siguientes enfoques analíticos para determinar el perfil de oligosacáridos o la cuantificación
de estructuras individuales. Se pueden usar otros métodos validados que son adecuados para la determinación de glicosi-
lación N- ligada usando diferentes modos de separación, marcado o detección. [NOTA-Para anticuerpos monoclonales
con oligosacáridos N-ligados en los dominios Fe y Fab, se pueden usar procedimientos adicionales de preparación de la
muestra (p.ej., tratamiento con la enzima papaína) para separar los dominios antes de los análisis de modo que se pueda
obtener información en los sitios de glicosilación individuales. Todos los pasos adicionales de preparación de la muestra
para el método requieren validación.]
[NOTA-Se pueden definir criterios de aceptación numéricos para estructuras de glicanos individuales. Si es aplicable, los cri-
terios de aceptación deben derivarse de información específica del producto teniendo en cuenta un rango adecuado de
datos históricos de partida.]
Método A: Electroforesis capilar con detección de fluorescencia inducida por láser
Solución amortiguadora de corrida: Preparar trietanolamina (TEA) 100 mM y glicerol al 10% a un pH de 7,5 disolvien-
do 1,492 g de TEA y 1O g de glicerol en 80 mL de agua. Ajustar con ácido clorhídrico 1 N a un pH de 7,5, y diluir con
agua hasta un volumen final de 100 ml.
Solución amortiguadora de muestra: Diluir 1 mL de Solución amortiguadora de corrida con 9 mL de agua.
Solución amortiguadora de reacción enzimática: Preparar fosfato de sodio 50 mM, pH 7,5.
Reactivo de marcación con APTS: Disolver 5 mg de 8-aminopireno-1,3,6-trisulfonato (APTS) en 48 µL de ácido acético
al 15% y mezclar.
Solución muestra: Agregar 2 µL de N-glicosidasa F peptídica (PNGasa F, por sus siglas en inglés) (5 unidades/mL) a 50
µg de muestra y ajustar con Solución amortiguadora de reacción enzimática a un volumen de 50 µL. [NOTA-La definición
de unidad para PNGasa F puede diferir entre fuentes comerciales. Puede ser necesario determinar de forma experimental
la cantidad apropiada de PNGasa F requerida para la liberación completa de oligosacáridos N-ligados en la muestra.] In-
cubar a 37º durante 18 horas. Separar los oligosacáridos liberados mediante centrifugación usando una celda de ultrafil-
tración centrífuga con membrana con un límite de corte de peso molecular de 1O 000. Secar los oligosacáridos liberados
en una centrífuga evaporadora con vacío. Agregar 2 µL de Reactivo de marcación con APTS y 2 µL de cianoborohidruro de
sodio 1 M a los oligosacáridos secos. Incubar a 55º durante 90 minutos. Agregar 46 µL de agua para detener la reacción y
mezclar. Agregar 5 µL de muestra marcada con APTS a 95 µL de Solución amortiguadora de muestra.
Solución de aptitud del sistema: Resuspender cada uno de los estándares de glicano adecuados (1 O µg) en 50 µL de
agua y mezclar usando un mezclador de vórtice. Agregar 5 µL de un estándar de glicano adecuado (1 µg) a un tubo de
microcentrífuga. Secar el estándar de glicano usando una centrífuga evaporadora con vacío a temperatura ambiente.
Agregar 2 µL de cianoborohidruro de sodio a cada estándar. Agregar 2 µL de Reactivo de marcación con APTS a cada es-
tándar. Mezclar los estándares usando un mezclador de vórtice y centrifugar brevemente para que el líquido repose antes
de la incubación a 55º durante 90 minutos. Detener la reacción agregando 46 µL de agua a cada estándar. Los estándares
pueden almacenarse a -20º hasta 5 semanas.
Condiciones instrumentales
Modo: Electroforesis Capilar
Detector: Detector de fluorescencia inducida por láser (longitud de onda de excitación 488 nm; longitud de onda de
emisión de 520 nm)
Capilar: Capilar de sílice fundida sin recubrimiento con un diámetro interno de 50 µm y una longitud total de 50 cm y
una longitud de separación de 40 cm
Inyección de la muestra: Inyección hidrodinámica de 1O segundos
Voltaje de separación: 22kV durante 50 minutos
Muestras: Solución muestra y Solución de aptitud del sistema
Análisis: Integrar los picos en el electroferograma resultante e informar los porcentajes relativos de las áreas de los picos
(corregidos por el tiempo) de las estructuras de glicano principales pertinentes al producto. Se puede realizar una com-
paración con el estándar de referencia adecuado específico del producto.
USP 40 Pruebas Biológicas/ (129) Anticuerpos Monoclonales Terapéuticos 245

Método B: Cromatografía de líquidos con detección de fluorescencia

Solución amortiguadora de reacción enzimática: Preparar fosfato de sodio 100 mM con un pH de 7,5.
Solución amortiguadora de marcación: Preparar soluciones de acetato de sodio trihidrato al 8% (p/v) y de ácido bórico
al 4% (p/v) en metanol disolviendo 800 mg de acetato de sodio trihidrato y 400 mg de ácido bórico en 1O mL de meta-
no!.
Solución reactivo de marcación: Preparar una solución madre de ácido antranílico (2-AA) de 100 mg/mL en Solución
amortiguadora de marcación. Mezclar con un volumen igual de cianoborohidruro de sodio 1 M en metanol para preparar
una Solución reactivo de marcación final que contenga 50 mg/mL de 2-AA y cianoborohidruro de sodio 0,5 M. [NOTA-
Mantener el reactivo de marcación protegido de la luz.]
Solución A: Preparar formiato de amonio 50 mM, pH 4,4.
Solución B: Acetonitrilo
Fase móvil: Ver la Tabla 1.
Tabla 1
Tiempo Solución A Solución B
(min) (%) (%)
0,0 32,5 67,5
48,0 42,5 57,5
49,0 100 o
53,0 100 o
54,0 32,5 67,5
60,0 32,5 67,5

Preparación de la muestra: Transferir 80 µg de la muestra de prueba a un tubo de microcentrífuga. Agregar 3 µL de

PNGasa F (2,5 unidades/mL). [NOTA-La definición de unidad para PNGasa F puede diferir entre fuentes comerciales. Pue-
de ser necesario determinar experimentalmente la cantidad apropiada de PNGasa F requerida para la liberación completa
de oligosacáridos N-ligados en la muestra.] Agregar 14 µL de la Solución amortiguadora de reacción enzimática. Agregar
agua hasta 70 µL del volumen total e incubar a 37º durante 18 horas. Agregar 70 µL de Solución reactivo de marcación
recientemente preparada e incubar a 70º durante 2 horas en una campana de extracción. Dejar que se enfríe y agregar
60 µL de metanol al 50% a cada muestra. Mezclar y luego centrifugar. Retirar 140 µL del sobrenadante y transferirlos a un
tubo de microcentrífuga. Agregar 500 µL de acetonitrilo al tubo que contiene el sobrenadante. Cargar la muestra en un
cartucho de extracción en fase sólida para interacción hidrofílica para eliminar el exceso de reactivo de marcado. Lavar el
cartucho con acetonitrilo al 95% (aproximadamente 1O mL). Eluir los glicanos marcados del cartucho con 0,5 mL de ace-
tronitrilo al 20%. Diluir el eluato 1 :1 con acetonitrilo.
Sistema cromatográfico
(Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
Columna: 4,6 mm x 15 cm; relleno L68 de 3 µm
Detector: Fluorescencia (longitud de onda de excitación 360 nm; longitud de onda de emisión 420 nm)
Temperatura de la columna: Mantener la columna a 30º.
Velocidad de flujo: 0,8 mL/min
Volumen de inyección: 50 µL
Análisis
Muestra: Preparación de la muestra
Integrar los picos en el cromatograma resultante e informar los porcentajes relativos de las áreas de los picos de los glica-
nos principales pertinentes al producto. Se puede realizar una comparación con el estándar de referencia adecuado es-
pecífico del producto.
• ANÁLISIS DE ÜLIGOSACÁRIDOS-ANÁLISIS DE ÁCIDO SIÁLICO
[NOTA-Puede ser necesario modificar el intervalo de la curva estándar o de la masa de la muestra de prueba dependiendo
del contenido de ácido siálico del anticuerpo monoclonal.]
Solución A: Preparar hidróxido de sodio 100 mM diluyendo 10,4 mL de una solución de hidróxido de sodio al 50% (p/p)
en 2 litros de agua. [NOTA-Usar agua de alta calidad y alta resistividad (18 MO-cm o mejor) que contiene la menor canti-
dad de oxígeno disuelto posible.]
Solución B: Preparar una solución que contenga hidróxido de sodio 100 mM y acetato de sodio 1 M agregando 82,0 g de
acetato de sodio a 800 mL de agua. Agregar 5,2 mL de hidróxido de sodio al 50% (p/p) y diluir con agua hasta un volu-
men final de 1000 ml.
Fase móvil: Ver la Tabla 2.
246 (129) Anticuerpos Monoclonales Terapéuticos/ Pruebas Biológicas USP 40

Tabla 2
Tiempo Solución A Solución B
(min) (%) (%)
0,0 93 7
10,0 70 30
11,0 70 30
12,0 93 7
15,0 93 7

Solución madre del estándar: Preparar soluciones 0,2 mM de ER Ácido N-Acetilneuramínico USP (NeuAc) y ER Ácido N-
Glicolilneuramínico USP (NeuGc) en solución amortiguadora de acetato de sodio 20 mM, pH 5,2. Diluir un volumen apro-
piado de esta solución con solución amortiguadora de acetato de sodio 20 mM, pH 5,2, hasta obtener una Solución madre
del estándar 0,02 mM.
Solución madre del estándar interno: Preparar una solución 0, 1 mM de ácido 3-desoxi-o-glicero-o-galacto-2-nonulosóni-
co (KDN) en solución amortiguadora de acetato de sodio 20 mM, ajustada a un pH de 5,2.
Soluciones estándar: Preparar según se indica en la Tabla 3.
Tabla 3
Volumen de
Solución Amortiguado- Volumen de Solución
Volumen de Solución ra de Acetato de Sodio Madre del Estándar
Concentración Madre del Estándar 20 mM, pH 5,2 Interno
Estándar (µM) (µL) (µL) (µL)
1 10 250 235 15
2 5 125 360 15
3 4 100 385 15
4 2 50 435 15
5 1 25 460 15
6 0,4 10 475 15

Solución de aptitud del sistema: Preparar soluciones 3 µM de NeuAc, NeuGc y KDN en solución amortiguadora de aceta-
to de sodio 20 mM, ajustada a un pH de 5,2. Almacenar la Solución de aptitud del sistema a -70º.
Solución muestra: Pipetear y transferir un volumen de muestra de prueba equivalente a 0,5 mg a un tubo de microcentrí-
fuga. Diluir con solución amortiguadora de acetato de sodio 20 mM, pH 5,2, hasta un volumen total de 475 µL. Confirmar
el pH con una tira de prueba y agregar 1O µL de neuraminidasa de 1O miliunidades/µL. Incubar durante 5 horas a 37°.
Agregar 15 µL de Solución madre del estándar interno. Mezclar en un mezclador de vórtice y transferir la muestra a un vial
para muestreador automático. [NOTA-Puede ser necesario un ligero ajuste en la preparación de la muestra dependiendo
de la muestra de prueba y la calidad de la enzima. Ajustar el tiempo de incubación de manera correspondiente.]
Sistema cromatográfico
(Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
Detector: Detector amperométrico integrado con electrodo de oro
Columna: 4 mm x 25 cm; relleno L46 de 1O µm
Velocidad de flujo: 1 ml/min
Volumen de inyección: 50 µL
Usar la siguiente forma de onda para el detector electroquímico (ver la Tabla 4).
Tabla 4
Tiempo Potencial
(s) (V) Integración
0,00 +0,10 -

0,20 +0,10 Inicio

0,40 +0,10 Final
0,41 -2,00 -

0,42 -2,00 -
0,43 +0,60 -
0,44 -0,10 -
0,50 -0,10 -

Análisis
Muestras: Soluciones estándar, Solución de aptitud del sistema y Solución muestra
USP 40 Pruebas Biológicas/ (130) Atributos de Calidad de la Proteína A 247

Integrar los picos de NeuAc, NeuGc y la Solución madre del estándar interno en cada cromatograma. Para las Soluciones es-
tándar, evaluar las áreas de los picos de NeuAc y NeuGc con respecto al área del pico de la Solución madre del estándar
interno según se indica a continuación.
Área del pico de NeuAc/área del pico de la Solución madre del estándar interno x 100
Área del pico de NeuGc/área del pico de la Solución madre del estándar interno x 100
Generar curvas estándar para NeuAc y NeuGc. Cuantificar NeuAc y NeuGc en la Solución muestra comparando el porcenta-
je relativo de NeuAc de la Solución madre del estándar interno y el porcentaje relativo de NeuGc de la Solución madre del
estándar interno, usando las curvas estándar.
Dividir las concentraciones determinadas de NeuAc y NeuGc por la concentración de muestra de prueba e informar como
cociente molar (es decir, números de NeuAc y NeuGc por molécula de muestra de prueba).

(130) ATRIBUTOS DE CALIDAD DE LA PROTEÍNA A

INTRODUCCIÓN
La Proteína A se acopla a un soporte de resina con el fin de crear medios cromatográficos de afinidad con la proteína A, usados
comúnmente en la fabricación de anticuerpos monoclonales terapéuticos recombinantes. La proteína A natural se obtiene
del Staphylococcus aureus y contiene cinco regiones homólogas de unión a anticuerpos y una región (-terminal de unión a la
pared celular. Además de la proteína A de origen natural, existe en el mercado proteína A recombinante producida en Esche-
richia coli, así como varias versiones de la proteína modificadas por ingeniería, también fabricadas en forma recombinante.
Cuando se inmoviliza sobre una columna, la proteína A proporciona un método altamente eficiente y robusto para purificar
anticuerpos en diversas escalas. Sin embargo, la proteína A inmovilizada en la columna (ligando de proteína A) puede tam-
bién coeluir con el anticuerpo durante la purificación, un efecto conocido a menudo como leaching de la proteína A. Esta
tendencia aumenta a medida que envejece el medio cromatográfico. Las versiones de la proteína A modificadas por ingenie-
ría podrían mejorar la tolerancia del medio al pH, pero no eliminan el leaching. La expectativa reglamentaria actual se centra
en que la proteína A coeluida se elimine durante la purificación de los anticuerpos para uso humano y los procesos de fabri-
cación se validen de acuerdo con ello. Generalmente, durante el desarrollo y validación del proceso se utiliza un Enzimoin-
munoensayo (ELISA) para asegurar la eliminación eficiente de la proteína A residual durante las etapas del proceso posterio-
res a la cromatografía de afinidad con la proteína A. Adicionalmente, el fabricante deberá poseer un claro conocimiento y
documentación sobre la calidad de la resina y el ligando, mediante la calificación de las materias primas y estudios de vida
útil de la columna.
El Capítulo General (130) describe los atributos de calidad de los ligandos de proteína A que se usan en los medios cromato-
gráficos para la fabricación de anticuerpos monoclonales terapéuticos: Proteína A; rProteína A; rProteína A, C-Cys; rProteína
A, B4, C-Cys.
•PROTEÍNA A
C199sH3163Ns910697s3
46 760
Secuencia N-terminal AQHDEA
Secuencia (-terminal IAADNK
La Proteína A se obtiene del Staphylococcus aureus. La estructura se compone de una única cadena de polipéptidos que
contiene cuatro dominios de unión a lgG. Con excepción de lgG 3, todas las demás lgG humanas se unen a la proteína A.
Cada molécula de Proteína A es capaz de unirse a dos moléculas de lgG. Se fabrica como una solución a granel con una
concentración mayor de 20 mg de proteína A por mL y una potencia de unión a lgG mayor de 95%. Dado que la Proteí-
na A se usa como un material auxiliar en la fabricación de fármacos terapéuticos recombinantes, los requisitos regulatorios
difieren de los de productos farmacéuticos terapéuticos.
• ENVASADO Y ALMACENAMIENTO: Almacenar en envases cerrados a la temperatura indicada en la etiqueta.
• ETIQUETADO: Conservar en envases sellados y almacenar a una temperatura de -20º o menor.
• ESTÁNDARES DE REFERENCIA USP (11)
ER Endotoxina USP
ER Proteína A USP
• IDENTIFICACIÓN
A. SDS-PAGE: Cumple con los requisitos de la prueba A de Identificación en rProteína A usando ER Proteína A USP.
B. Unión a lgG: Cumple con los requisitos de la prueba 8 de Identificación en rProteína A usando ER Proteína A USP .
• PRUEBAS DE RECUENTO MICROBIANO (61) y PRUEBAS DE MICROORGANISMOS ESPECÍFICOS (62): El recuento total de microorga-
nismos aerobios no excede de 100 ufc por mL y el recuento total combinado de hongos filamentosos y levaduras no excede
de 1O ufc por ml.
• PRUEBA DE ENDOTOXINAS BACTERIANAS (85): No contiene más de 1 Unidad USP de Endotoxinas por mg de proteína total.
[NOTA-La prueba de Endotoxinas bacterianas para Proteína A se usa para describir la calidad de este material auxiliar. Esta
prueba no define el nivel aceptable de endotoxina bacteriana en la preparación de las formas farmacéuticas inyectables en
las cuales se usa la Proteína A.]
248 (1 30) Atributos de Calidad de la Proteína A / Pruebas Biológicas USP 40

• PROTEÍNA TOTAL
(Ver Espectroscopía Ultravioleta-Visible (857).)
Preparar muestras por triplicado para análisis diluyendo Proteína A hasta 3,0 mg por mL en Agua para Inyección. Medir la
absorbancia de cada muestra a 275 nm después de corregirla usando Agua para Inyección como blanco. Determinar la
concentración de proteína con la siguiente ecuación:
Concentración de proteína (mg por mL) = (A275/0, 149)
en donde A es la absorbancia de Proteína A a la longitud de onda de 275 nm y O, 149 es la absortividad molar. Promediar
los resultados de las tres muestras y determinar el coeficiente de variación (CV): el CV es :0::5%.
•LÍMITE DE PROTEÍNA CONTAMINANTE HABITUAL Y VALORACIÓN CORRESPONDIENTE
Enterotoxina B: La enterotoxina B se determina con un kit de enzimoinmunoensayo en microplaca disponible comercial-
mente.1 Los pocillos de las microplacas están recubiertos con anticuerpos de oveja anti enterotoxina B. Las curvas están-
dar se realizan utilizando el kit control de ELISA. Los controles negativos son pocillos recubiertos con suero de oveja no
inmunizada. El nivel de enterotoxina se determina a partir de la curva estándar. La especificación para el nivel de la ente-
rotoxina B es :S:l ng por mg de proteína total.
•PUREZA CROMATOGRÁFICA
[NOTA-La prueba de pureza por cromatografía de exclusión por tamaño resuelve la Proteína A de los contaminantes de alto
peso molecular.]
Fase móvil: Preparar una solución de fosfato diácido de sodio 50 mM de pH 6,5 de la siguiente manera. Agregar 6,9 ±
O, 1 g de fosfato diácido de sodio a un vaso de precipitados de 1000 mL. Diluir con agua a 900 mL y ajustar con hidróxido
de sodio 5 M a un pH de 6,50 ± 0,05. Transferir la solución a un matraz volumétrico de 1000 mL y diluir con agua a
volumen. Pasar la solución a través de un filtro de membrana de 0,22 µm.
Solución regeneradora de columna: Preparar una solución de fosfato diácido de sodio O, 1 M de pH 3,0 de la siguiente
manera. Agregar 13,8 ± O, 1 g de fosfato diácido de sodio a un vaso de precipitados de 1000 ml. Diluir con agua hasta
obtener 900 mL y ajustar con ácido clorhídrico a un pH de 3,0±O,1. Transferir la solución a un matraz volumétrico de
1000 mL y diluir a volumen con agua. Pasar la solución a través de un filtro de membrana de 0,22 µm.
Solución de almacenamiento de la columna: Mezclar 100 mL de metano! con 900 mL de agua.
Solución de prueba: Diluir Proteína A hasta aproximadamente 1 mg por mL con Fase móvil.
Estándares de calibración: Usando Fase móvil, preparar por separado soluciones de 1 mg por mL de cada una de las
siguientes proteínas: tiroglobulina (670 kDa), lgG (150 kDa), beta lactoglobulina (36 kDa) y lisozima (14 kDa).
Solución estándar: Preparar una solución que contenga 1 mg por mL de ER Proteína A USP en Fase móvil.
Sistema cromatográfico
(Ver Cromatografía (621).)
Equipar un cromatógrafo de líquidos con un detector a 280 nm y una columna de 7,8 mm x 30 cm rellena con material
L33. Equilibrar la columna durante aproximadamente 30 minutos a 0,5 mL de Fase móvil por minuto o hasta que se consi-
ga una línea base estable.
Procedimiento: Inyectar por separado 100 µL de cada muestra y correrlas en la siguiente secuencia: Estándares de calibra-
ción, tiroglobulina, lgG, beta lactoglobulina y lisozima; la Solución estándar; y la Solución de prueba. Correr la secuencia
tres veces isocráticamente usando Fase móvil a 0,5 mL por minuto durante 30 minutos. La absorbancia se detecta a 280
nm. Analizar los datos de los picos a 280 nm y seleccionar el tiempo de retención (TR) con el área de pico más grande.
Usando los datos de los Estándares de calibración, graficar la media del TR en función del logaritmo del peso molecular
para obtener la curva estándar. La pureza debe ser 2:95% en el pico principal. Utilizar la fórmula de la curva estándar para
obtener los logaritmos de los pesos moleculares de las Soluciones de prueba. Convertir los logaritmos de los pesos molecu-
lares de las Soluciones de prueba y de las Soluciones estándar a pesos moleculares reales. El peso molecular aparente de la
proteína A a partir de la Solución estándar está entre 156 y 205 kDa; y el de la Proteína A a partir de la Solución de prueba
está dentro del mismo intervalo.
Limpieza y almacenamiento de la columna: Enjuagar la columna con 100 mL de Solución regeneradora de columna y
almacenar lavando con 100 mL de Solución de almacenamiento de Ja columna.
rPROTEÍNA A, C-CVS
C141sH 2320N432Üso3S4
34317,5 Da
Secuencia N-terminal AQHDEAQQNA
La rProteína A, C-Cys es una Proteína A recombinante que carece de la parte (-terminal de unión a la membrana; en cambio,
se le ha introducido una cisteína (-terminal para permitir una inmovilización dirigida. Tiene cinco dominios homólogos de
unión a lgG idénticos a los de la Proteína A nativa y se produce usando Escherichia coli como célula anfitriona, seguido de
purificación por cromatografía convencional. La rProteína A, C-Cys se fabrica como una solución a granel con una potencia
de unión a lgG mayor de 95%. Dado que la rProteína A, C-Cys se usa como material auxiliar en la fabricación de fármacos
terapéuticos recombinantes, los requisitos regulatorios difieren de los de productos farmacéuticos terapéuticos.
• ENVASADO Y ALMACENAMIENTO: Almacenar en envases cerrados a la temperatura indicada en la etiqueta.

1 Se puede obtener un kit de enzimoinmunoensayo adecuado de TECRA lnternational Pty Ltd., Australia (Nº SETVIA96).
USP 40 Pruebas Biológicas/ (1 30) Atributos de Calidad de la Proteína A 249

• ETIQUETADO: Conservar en envases sellados y almacenar a una temperatura de -20º o menor.

• ESTÁNDARES DE REFERENCIA USP (11)
ER Endotoxin¡¡ USP
ER rProteína A, C-Cys USP
• IDENTIFICACIÓN
A. SDS-PAGE: Cumple con los requisitos de la prueba A de Identificación en rProteína A usando ER rProteína A, C-Cys USP.
B. lgG Binding: Cumple con los requisitos de la prueba B de Identificación en rProteína A usando ER rProteína A, C-Cys
USP .
• PRUEBAS DE RECUENTO MICROBIANO (61) y PRUEBAS DE MICROORGANISMOS ESPECÍFICO (62): El recuento total de microorga-
nismos aerobios no excede de 100 ufc por mL y el recuento total combinado de hongos filamentosos y levaduras no excede
de 1O ufc por ml.
• PRUEBA DE ENDOTOXINAS BACTERIANAS (85): No contiene más de 1 Unidad USP de Endotoxinas por mg de proteína total.
[NOTA-La prueba de Endotoxinas bacterianas para rProteína A, C-Cys se usa para describir la calidad de este material auxi-
liar. Esta prueba no define el nivel aceptable de endotoxina bacteriana en la preparación de las formas farmacéuticas inyec-
tables en las cuales se usa la rProteína A, C-Cys.]
•PROTEÍNA TOTAL
(Ver (857).)
Preparar muestras por triplicado para análisis diluyendo rProteína A, C-Cys hasta 3,0 mg por mL en Agua para Inyección.
Medir la absorbancia de cada muestra a 275 nm después de corregirla usando Agua para Inyección como blanco. Determi-
nar la concentración de proteína con la siguiente ecuación:
Concentración de proteína (mg por mL) = (A275/0,22)
en donde A es la absorbancia de rProteína A, C-Cys a la longitud de onda de 275 nm y 0,22 es la absortividad molar.
Promediar los resultados de las tres muestras y determinar el coeficiente de variación (CV): el CV es ::::2,5%.
•PUREZA CROMATOGRÁFICA
[NOTA-La prueba de pureza por cromatografía de exclusión por tamaño resuelve la rProteína A, C-Cys de los contaminantes
de alto peso molecular y de los contaminantes de bajo peso molecular.]
Fase móvil: Preparar una solución de fosfato de sodio 0,02 M de pH 7,2 que contenga cloruro de sodio O, 15 M, de la
siguiente manera. Agregar 0,96 ± 0,02 g de fosfato monobásico de sodio hidrato, 2,32 ± 0,02 g de fosfato dibásico de
sodio dihidrato y 8,76 g ± 0,02 g de cloruro de sodio a un vaso de precipitados de 1000 mL. Diluir con agua a 900 mL y
ajustar con hidróxido de sodio 1 M a un pH de 7,2 ± 0,05. Transferir esta solución a un matraz volumétrico de 1000 mL y
diluir a volumen con agua. Pasar la solución a través de un filtro de membrana de 0,45 µm.
Solución de EDTA: Preparar una solución de ácido elitendiaminotetraacético (EDTA) 20 mM, disolviendo 0,74 ± 0,02 g
de EDTA en 100 mL de Fase móvil.
Solución de DTT: Preparar una solución de DL-ditiotreitol (DTI) 100 mM, disolviendo 1,54 ± 0,02 g de DTI en 100 mL
de Fase móvil.
Solución de pretratamiento: Preparar una solución que contenga una mezcla de Solución de EDTA y Solución de DTT
(1 :1, v/v). [NOTA-Preparar inmediatamente antes de su uso.]
Solución de prueba: Diluir rProteína A, C-Cys 1 a 5 en Solución de pretratamiento, y mezclar suavemente. Incubar la
muestra a 40º durante 60 minutos.
Sistema cromatográfico
(Ver Cromatografía (621 ).)
Equipar un cromatógrafo de líquidos con un detector a 214 nm y una columna de 1O mm x 30 cm rellena con material
L54. Equilibrar la columna con por lo menos dos volúmenes de columna de Fase móvil a una velocidad de flujo de 0,4
mL por minuto.
Procedimiento: Inyectar 100 µL de Solución de pretratamiento y dejar que la cromatografía continúe durante por lo me-
nos dos volúmenes de columna. Repetir dos veces antes de inyectar 100 µL de la Solución de prueba. La absorbancia se
detecta a 214 nm. Integrar el pico principal de la corrida a partir de la Solución de prueba y todos los demás picos que no
estén presentes en las corridas de la Solución de pretratamiento. Calcular el porcentaje de impurezas en la porción de la
rProteína A, C-Cys tomada, por la fórmula:

1OO(r/r,)
en donde r; es la respuesta del pico de cada impureza; y r, es la suma de las respuestas de todos los picos: la suma de
todas las impurezas no es más de 5%; y la Solución de prueba presenta un pico principal aproximadamente a los 35 minu-
tos.
rPROTEÍNA A
C1911H3039Ns6s06ssS3
44 618
Secuencia N-terminal FLRPVE
250 (1 30) Atributos de Calidad de la Proteína A/ Pruebas Biológicas USP 40

La Proteína A es un componente de la pared celular del Staphylococcus aureus. La Proteína A recombinante (rProteína A) consta
de cinco dominios homólogos de unión (E, D, A, B, C) a la inmunoglobulina (lgG) seguidos de una secuencia parcial del
dominio X. Se expresa en Escherichia coli y se purifica por medio de un proceso de cromatografía en columna. Las columnas
de lgG no se usan en el proceso de purificación. Se fabrica como una solución a granel con una potencia de unión a lgG
mayor de 95%. Los métodos de pruebas para su liberación y las especificaciones se describen a continuación. Dado que la
rProteína A se usa como un material auxiliar en la fabricación de fármacos terapéuticos recombinantes, los requisitos regula-
torios difieren de los de productos farmacéuticos terapéuticos.
• ENVASADO Y ALMACENAMIENTO: Almacenar en envases cerrados a la temperatura indicada en la etiqueta.
• ETIQUETADO: El etiquetado indica que el material proviene de ADN recombinante, así como el número de lote, las condicio-
nes de almacenamiento y la leyenda "Formulado en Agua para Inyección".
•ESTÁNDARES DE REFERENCIA USP (11)
ER Endotoxina USP
ER rProteína A USP
• IDENTIFICACIÓN
A. SDS-PAGE
Marcador de peso molecular: Usar un marcador de peso molecular (MWM, por sus siglas en inglés) apropiado, que
contenga bandas de proteínas entre 20 y 200 kDa.
Solución de PBS: Preparar una solución que contenga 8065,0 mg de cloruro de sodio y 200,0 mg de cloruro de potasio
por L de solución amortiguadora de fosfato de sodio 0,01 M de pH 7,4.
Solución amortiguadora de la muestra 4X:2 Disolver 0,666 g de tris-clorhídrico, 0,682 g de tris base, 0,800 g de do-
decil sulfato de litio (LOS, por sus siglas en inglés), 0,006 g de ácido etilendinitrilotetracético (EDTA) y 4 g de glicerol en
8 mL de agua; agregar 0,75 mL de solución de azul brillante de Coomassie G-250 al 1% (ver Azul de Coomassie G-250
en Reactivos en Reactivos, Indicadores y Soluciones) y 0,25 mL de solución de rojo de fenol al 1%. Mezclar bien y ajustar el
volumen con agua a 1O ml.
Solución amortiguadora de la muestra 2X: Preparar una mezcla de Solución amortiguadora de la muestra 4X y agua
(1: 1).
Solución amortiguadora de la muestra 1 X: Preparar una mezcla de Solución amortiguadora de la muestra 2X y agua
(1 :1 ).
Solución de ditiotreitol 1 M: Disolver O, 154 g de DL-ditiotreitol (DTI) en 1 mL de agua.
Solución amortiguadora reductora de la muestra 2X: Mezclar 180 µL de Solución amortiguadora de la muestra 2X y 20
µL de Solución de ditiotreitol 7 M.
Solución amortiguadora de corrida 20X:3 Disolver 104,6 g de ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico (MOPS, por sus
siglas en inglés), 60,6 g de tris base, 1O g de dodecil sulfato de sodio (SOS, por sus siglas en inglés) y 3,0 g de EDTA en
400 mL de agua. Mezclar bien y ajustar con agua hasta 500 ml.
Solución amortiguadora de corrida 1 X: Preparar una solución de agua y Solución amortiguadora de corrida 20X (19:1 ).
Solución de tinción del gel: Preparar una solución de azul brillante de Coomassie R-250 (ver Azul Brillante de Coomas-
sie R-250 en Reactivos en Reactivos, Indicadores y Soluciones) que contenga una concentración de 0,5 g por L en una
mezcla de agua, isopropanol y ácido acético (6,5:2,5:1,0). Filtrar y almacenar a temperatura ambiente. No se recomien-
da la tinción con plata.
Solución decolorante: Mezclar 100 mL de ácido acético con 900 mL de agua.
Preparación estándar: Diluir ER rProteína A USP hasta 0,4 mg por mL con Solución de PBS. Diluir adicionalmente esta
solución 1 :1 con Solución amortiguadora reductora de la muestra 2X e incubar en un tubo cerrado durante 5 minutos a
90º. Mezclar y centrifugar brevemente (quick spin) antes de cargar.
Preparación de prueba: Diluir rProteína A con Solución de PBS hasta 0,4 mg por ml. Proceder según se indica en Prepa-
ración estándar, comenzando donde dice "Diluir adicionalmente".
Solución combinada: Diluir rProteína A y ER rProteína A USP con Solución de PBS hasta 0,8 mg por ml. Esta solución
contiene 0,4 mg por mL de cada proteína. Proceder según se indica en Preparación estándar, comenzando donde dice
"Diluir adicionalmente".
Montaje del aparato y gel de SDS-PAGE: Montar el aparato para el gel según las instrucciones del fabricante. Asegurar
en su lugar la cuña de presión del gel y llenar la cámara interna con aproximadamente 200 mL de Solución amortiguado-
ra de corrida 7X. Si no se verifican pérdidas de líquido, verter 600 mL de Solución amortiguadora de corrida 7X en la cáma-
ra externa. Sacar cuidadosamente el peine del gel para sumergir los pocillos (wells) en la Solución amortiguadora de corri-
da 7X. Cargar 1O µL de cada preparación según se indica a continuación en Carga del gel en un gel de Bis-Tris SDS-PAGE
al 10%. 4
Carga del gel: Usar el siguiente esquema de carga del gel al correr una Preparación de prueba (ver la Tabla 1). Cada
Preparación de prueba se corre sola y como parte de la Solución combinada que contiene la rProteína A y la ER rProteína A
USP.

2 La Solución amortiguadora de la muestra 4X NuPAGE LDS se puede obtener de lnvitogen (Nº NP0007).
3 La Solución Amortiguadora de Corrida 20X NuPAGE MOPS SDS se puede obtener de lnvitrogen (Nº NPOOOl ).
4 El gel de Bis-Tris SDS-PAGE al 10% se puede obtener de lnvitrogen (Nº NP0301 ).
 USP 40 Pruebas Biológicas/ (130) Atributos de Calidad de la Proteína A 251

Tabla 1
Volumen Cantidad
de Carga de Carga
Calle Muestra (µL} (µg}
1 Solución amortiguadora de la muestra 7X 10 N/D
2 MWM 20 N/D
3 Preparación de prueba #1 10 2
4 Solución combinada #1 10 4 (total)
5 Preparación de prueba #1 10 2
6 Solución amortiguadora de la muestra 7X 10 N/D
7 Preparación estándar 10 2
8 MWM 20 N/D
9 - - -
10 - - -
Corrida del gel: Fijar el voltaje en 125 volts y correr a un voltaje constante. Correr los geles hasta que la banda de azul
de bromofenol quede aproximadamente a 5 mm del borde inferior del gel (aproximadamente de 120 a 140 minutos).
Tinción del gel: Verter aproximadamente 100 mL de Solución de tinción del gel dentro del recipiente de tinción. Colocar
el gel dentro del recipiente de tinción y dejar que la solución colorante cubra el gel por completo. Calentar en un horno
de microondas durante 30 segundos. Colocar el recipiente de tinción en un agitador orbital y teñir el gel durante 1 ho-
ra, agitando suavemente.
Decoloración: Escurrir la Solución de tinción del gel y agregar suficiente Solución decolorante al recipiente hasta cubrir el
gel. Colocar el recipiente en un agitador orbital y agitar a baja velocidad. Cambiar la Solución decolorante según sea ne-
cesario hasta obtener un fondo transparente. Después de decolorar, enjuagar bien el gel con agua y dejarlo en agua
durante 1O minutos antes del escaneo.
Escaneo del gel: Colocar un poco de agua en la placa de vidrio del escáner y colocar los geles sobre una placa de vidrio
humedecida. Eliminar las burbujas. Escanear los geles realizando los ajustes apropiados.
Análisis de los datos: Escoger una banda entre las bandas de 20 kDa y 30 kDa del MWM para calcular el porcentaje del
factor de retención. Trazar una línea en una calle (la calle que contiene la Solución amortiguadora de muestra 1X) desde el
pocillo hasta el ápice (región de mayor intensidad) de la banda escogida.
La longitud de esta línea se designa como la distancia total (Dr). En las calles que contienen muestras, trazar una línea
desde el pocillo hasta el ápice de cada banda. Para cada banda, la longitud de esta distancia es la distancia de migra-
ción (DM) en mm. Registrar la Dr y la DM en la hoja de informe para cada pico o banda. La distancia total debe ser la
misma para cada calle en un gel. Calcular el porcentaje del factor de retención (RF) de cada pico o banda principal y
documentar en la hoja de informe, usando la siguiente ecuación:

%RF = DM/Dr x 100

También para cada gel, registrar el número de bandas y el peso molecular aproximado de cada banda en cada mues-
tra.
Aptitud del sistema: Todas las bandas entre 20 kDa y 70 kDa están presentes. La calle que contiene la Solución amorti-
guadora de la muestra 1X no contiene ninguna banda.
Especificidad: La rProteína A tiene una banda principal y un peso molecular similar que corresponden a los de la ER
rProteína A USP. La Solución combinada presenta también una única banda principal.
B. Unión a lgG: [NOTA-El ensayo de unión a lgG es un método funcional para determinar el porcentaje de rProteína A
capaz de unirse a inmunoglobulina policlonal humana inmovilizada. Dado que el porcentaje de rProteína A funcional en
cada lote no es menor de 95%, el ensayo mide la proteína no unida en función de la proteína total inyectada. Esto se
realiza mediante la comparación entre la absorbancia del flujo que atraviesa la columna y la absorbancia de una inyección
desviada de la misma.]
Pretratamiento de la muestra (desalinización): Con el fin de eliminar cualquier componente de la solución amorti-
guadora que pudiera contribuir a la absorbancia en la fracción "no unida" a lgG en la columna, las muestras se desalini-
zan con Solución A. La desalinización se puede llevar a cabo usando una columna de desalinización adecuada 5 , depen-
diendo de los volúmenes requeridos.
Columna lgG: Para este ensayo se requiere una columna Sepharose 6 de 1 mL con lgG policlonal humana inmovilizada
(hlgG, por sus siglas en inglés). [NOTA-La columna de lgG requiere lavado cuando es nueva, cuando se han efectuado
varios ciclos de análisis o después de una falla de la aptitud del sistema. No es necesario efectuar el procedimiento de
lavado de la columna para cada inyección de muestra.]

5 Las columnas Zeba se pueden obtener de Pierce; las columnas Nap-1 O se pueden obtener de GE Healthcare.
6 La columna HiTrap lgG Sepharose 6 FF se puede obtener de GE Healthcare (Nº 90-1003-97).
252 (1 30) Atributos de Calidad de la Proteína A/ Pruebas Biológicas USP 40

Solución A para lavado de la columna: Preparar una solución de ácido acético 0,5 M de pH 3,4, agregando 28,6 mL
de ácido acético a un vaso de precipitados de 1000 mL, diluyendo a 900 mL con agua y ajustando a pH 3,4 con acetato
de amonio. Transferir la solución a un matraz volumétrico de 1000 mL y diluir a volumen con agua. Pasar la solución a
través de un filtro de membrana de 0,45 µm.
Solución B para lavado de la columna: Preparar una solución de Tris 50 mM de pH 7,6; cloruro de sodio 150 mM y
Tween 20 al 0,05% por el siguiente procedimiento. Agregar 6,06 ± 0,01 g de Tris y 8,77 ± 0,01 g de cloruro de sodio a
un vaso de precipitados de 1000 ml. Diluir con agua a 900 mL y ajustar con hidróxido de sodio 0,5 M a un pH de 7,60
± 0,05. Transferir la solución a un matraz volumétrico de 1000 mL y diluir a volumen con agua. Pasar la solución a través
de un filtro de membrana de 0,45 µm (solución amortiguadora). Agregar 0,5 mL de Tween 20 a 1 L de la solución
amortiguadora y mezclar bien.
Solución A: Preparar una solución de fosfato monobásico de sodio 20 mM y cloruro de sodio 150 mM de pH 7,6 por el
siguiente procedimiento. Agregar 2,76 ± 0,01 g de fosfato monobásico de sodio hidrato y 8,77 ± 0,01 g de cloruro de
sodio a un vaso de precipitados de 1000 mL. Diluir con agua a 900 mL y ajustar con hidróxido de sodio 5 M a un pH de
7,60 ± 0,05. Transferir la solución a un matraz volumétrico de 1000 mL y diluir a volumen con agua. Pasar la solución a
través de un filtro de membrana de 0,45 µm.
Solución B: Preparar una solución de ácido fosfórico 100 mM de pH 2,8 por el siguiente procedimiento. Agregar 6,8
mL de ácido fosfórico a un vaso de precipitados de 1000 ml. Diluir con agua a 900 mL y ajustar con hidróxido de pota-
sio 2 M a un pH de 2,80 ± 0,05. Transferir la solución a un matraz volumétrico de 1000 mL y diluir a volumen con agua.
Fase móvil: Usar mezclas variables de Solución A y de Solución B, según se indica en el Sistema cromatográfico. Hacer
ajustes si fuera necesario (ver Aptitud del Sistema en Cromatografía (621 )).
Preparación estándar: Descongelar el ER rProteína A USP y usarlo directamente.
Preparación de prueba: Preparar una solución de 4,0 a 6,0 mg por mL de rProteína A en Solución A.
Sistema cromatográfico: Equipar el cromatógrafo de líquidos con un detector a 280 nm y una columna de 1 mL con
hlgG inmovilizada. Equipar un cromatógrafo con una válvula que permita desviar el flujo de la columna. Cada análisis
consta de una serie de dos inyecciones, una donde la muestra se inyecta en la columna y otra donde la muestra se des-
vía de la columna y fluye directamente al detector. Efectuar tres análisis repetidos. Programar el cromatógrafo (ver la
Tabla 2) del siguiente modo.
Tabla 2
Velocidad de flu-
jo Tiempo Solución A Solución B Posición de la
(mL por minuto) (minutos) (%) (%) Válvula Eluclón
1,0 0-6 100 o Columna Reequilibrio
1,0 6-12 100--+0 0--+ 100 Columna Reequilibrio
1,0 12-22 100 o Columna Equilibrio
0,4 22-25 100 o Columna Equilibrio
0,4 (muestra 25-35 100 o
inyectada) Columna !socrática
1,0 35-49 100--+0 0--+ 100 Columna Regeneración
1,0 49-63 0--+ 100 100--+0 Columna Reequilibrio
1 63-65 100 o Desvío Equilibrio
0,4 65-68 100 o Desvío Equilibrio
0,4 (muestra 68-75 100 o
inyectada) Desvío !socrática

Inyectar en el cromatógrafo la Preparación estándar, registrar el cromatograma y calcular el porcentaje de unión a hlgG
según se indica en el Procedimiento: el porcentaje de unión a hlgG es 2 95% y la desviación estándar relativa para el aná-
lisis repetido no es más de 1%.
Procedimiento: Inyectar en el cromatógrafo un volumen (aproximadamente 100 µL) de la Preparación de prueba. Regis-
trar el cromatograma y medir las respuestas de los picos. Calcular el porcentaje de actividad de unión a la hlgG, por la
siguiente fórmula:

en donde re es la respuesta del pico del material no unido obtenido a partir de la inyección de la columna y r8 es la
respuesta del pico obtenido a partir de la inyección desviada de la columna. La unión a hlgG no es menor de 95% en
cada análisis repetido de la Preparación de prueba. Informar el valor promedio de los tres análisis repetidos .
• PRUEBAS DE RECUENTO MICROBIANO (61) y PRUEBAS DE MICROORGANISMOS ESPECÍFICO (62): El recuento total de microorga-
nismos aerobios no excede de 100 ufc por mL y el recuento total combinado de hongos filamentosos y levaduras no excede
de 1O ufc por ml.
• PRUEBA DE ENDOTOXINAS BACTERIANAS (85): No contiene más de 0,5 Unidades USP de Endotoxinas por mg de proteína
total. [NOTA-La prueba de Endotoxinas bacterianas para rProteína A se usa para describir la calidad de este material auxiliar.
 USP 40 Pruebas Biológicas/ (1 30) Atributos de Calidad de la Proteína A 253

Esta prueba no define el nivel aceptable de endotoxina bacteriana en la preparación de las formas farmacéuticas inyectables
en las cuales se usa la rProteína A.]
•PROTEÍNA TOTAL
(Ver (857).)
Preparar muestras por triplicado para análisis diluyendo rProteína A hasta 3,0 mg por mL en Agua para Inyección. Medir la
absorbancia de cada muestra a 275 nm después de corregirla usando Agua para Inyección como blanco. Determinar la
concentración de proteína con la siguiente ecuación:
Concentración de proteína (mg por mL) = (A275 /0, l 65)

en donde A es la absorbancia de rProteína A a la longitud de onda de 275 nm y 0, 165 es la absortividad molar. Promediar
los resultados de las tres muestras y determinar el coeficiente de variación (CV): el CV es ::;5%.
• ANÁLISIS ESPECTRAL UV: Diluir rProteína A a 1 mg por mL en Agua para Inyección. Usar un espectrofotómetro de barrido UV
con Agua para Inyección como blanco, obtener los barridos espectrales en el intervalo de 240 a 360 nm. De los datos resul-
tantes, calcular el valor de la absorbancia a 270 nm y el cociente de absorbancias a 270 y a 250 nm (es decir, E270/E250): la
absorbancia a 270 nm de una solución de 1 mg por mL de rProteína A en Agua para Inyección está dentro del intervalo
0,14-0,20.
•PUREZA (ROMATOGRÁFICA
[NOTA-La prueba de pureza por cromatografía de exclusión por tamaño resuelve la rProteína A de los contaminantes de alto
peso molecular.]
Fase móvil: Preparar una solución de fosfato de sodio 0,3 M de pH 7, mezclando soluciones de fosfato monobásico y
dibásico de la siguiente manera. Pesar 21,3±0,1 g de fosfato dibásico de sodio anhidro y disolver en 500 mL de agua
hasta obtener una solución de fosfato dibásico de sodio 0,3 M (Solución 1). En otro recipiente, pesar 18,0 ±O, l g de fosfa-
to monobásico de sodio anhidro y disolver en 500 mL de agua hasta obtener una solución de fosfato monobásico de
sodio 0,3 M (Solución 2). Calibrar un medidor de pH usando calibradores de pH 7 y 1O. Agregar 400 mL de Solución 1 a
un vaso de precipitados de 1 L. Transferir la sonda de pH al vaso de precipitados. Agregar lentamente la Solución 2 hasta
que el pH sea 7,0 ±O, l. Pasar la solución a través de un filtro de membrana de 0,45 µm.
Solución estándar: Diluir ER rProteína A USP hasta 1 mg por mL en Fase móvil.
Solución de prueba: Diluir rProteína A hasta 1 mg por mL en Fase móvil.
Sistema cromatográfico
(Ver Cromatografía (621 ).)
Equipar un cromatógrafo de líquidos con un detector a 214 nm y a 280 nm, y una columna de 9,4 mm x 25 cm rellena
con material L35. La velocidad de flujo es de 1 mL por minuto. Cromatografiar la Solución estándar según se indica en el
Procedimiento: la rProteína A presenta un único pico principal aproximadamente a los 9 minutos y el porcentaje de área
es 2:98% a 214 nm y 2:95% a 280 nm.
Procedimiento: Inyectar en el cromatógrafo 100 µL de la Solución de prueba, correr isocráticamente durante 15 minutos
y registrar el cromatograma. Los valores para la rProteína A a partir de la Solución de prueba corresponden a las especifica-
ciones del ER rProteína A USP a partir de la Solución estándar.
• ISOFORMAS
Solución estándar: Descongelar ER rProteína A USP y usarlo directamente.
Solución de prueba: Diluir rProteína A a 4 mg por mL en Agua para Inyección.
Marcadores de pi: Usar un set de marcadores adecuado que contenga marcadores entre 3 y 10.7
Gel de IEF (isoelectroenfoque) Usar un gel adecuado con intervalo de pH 3-1 O y un tamaño de 100 x 125 mm.s
Procedimiento: Aplicar alícuotas de 5 µL de los Marcadores de pi de la Solución de prueba y de la Solución estándar al gel
de IEF y correrlas a 1W de potencia durante aproximadamente 1O minutos. Retirar la máscara de aplicación de la muestra
y suministrar potencia, con enfriamiento simultáneo entre 5º y 1Oº de la cámara de enfoque, durante 40 minutos a
1OOOV, 20 mA y 25W. Fijar el gel de IEF durante 1 hora en ácido tricloroacético al 20%, luego teñirlo con una tinción
adecuada para geles de IEF. 9 Por último, lavar y secar el gel: el coeficiente de correlación para la línea de mejor ajuste para
los Marcadores de pi en función de su migración en cm es 2:0,990, y la rProteína A a partir de la Solución estándar presenta
una única banda principal dentro del intervalo de pi de 4,6 a 5,2. En la Solución de prueba se observa una única banda
que corresponde al intervalo de pi de la Solución estándar.
• LÍMITE DE TRITON X-100
Fase móvil: Preparar una mezcla filtrada y desgasificada de agua y acetonitrilo (60:40).
Solución de prueba: Diluir rProteína A a 5 mg por mL en Agua para Inyección.
Solución de Triton X-100 con una cantidad conocida agregada: Combinar 5 mg por mL de ER rProteína A USP y Tri-
ton X-100 al 0, 15% (9:1) para obtener una solución con una concentración conocida de rProteína A y Triton X-100 al
0,015%.

7 Los marcadores de pi en el intervalo 3-1 O se pueden obtener de BioRad (Nº 161-031 O).
8 Los geles de IEF en el intervalo 3-1 O se pueden obtener de Cambrex (Nº 56015).
9 155 Pro-Blue se puede obtener de lntegrated 5eparation 5ystems.
254 (1 30) Atributos de Calidad de la Proteína A/ Pruebas Biológicas USP 40

Sistema cromatográfico
(Ver Cromatografía (621 ).)
Equipar un cromatógrafo de líquidos con un detector a 214 nm y 280 nm y una columna de 4,6 mm x 25 cm rellena con
material L11 de 5 µm. La velocidad de flujo es de 1 mL por minuto. Cromatografiar la Solución de Triton X-100 con una
cantidad conocida agregada según se indica en el Procedimiento: el Triton X-100 tiene un único pico principal aproxima-
damente a los 9 minutos y la rProteína A presenta un pico menor o indetectable con el mismo tiempo de retención.
Procedimiento: Inyectar en el cromatógrafo aproximadamente 100 µL de la Solución de prueba, correr isocráticamente
durante 35 minutos y registrar el cromatograma. La absorbancia se detecta a 223 nm: el pico de Triton X-100 no es ma-
yor de 0,015% (equivalente a la Solución de Triton X-100 con una cantidad conocida agregada).
rPROTEÍNA A, 8 41 C-CVS
C11 nH1ss4N326Ü3s4S1
26747,6 Da
Secuencia N-terminal AQGTVDAKFD
La rProteína A, B4 , C-Cys es una proteína recombinante derivada del dominio B de la Proteína A. El dominio de la Proteína A ha
sido estabilizado al álcali por mutagénesis sitio-específica y multimerizado en un tetrámero con una cisteína C-terminal para
permitir una inmovilización dirigida. La rProteína A, B4 , C-Cys se produce usando Escherichia coli como célula anfitriona, se-
guido de purificación por cromatografía convencional. La rProteína A, B4 , C-Cys se fabrica como una solución a granel con
una potencia de unión a lgG mayor de 95%. Dado que la rProteína A, B4, C-Cys se usa como un material auxiliar en la fabri-
cación de fármacos terapéuticos recombinantes, los requisitos regulatorios difieren de los de productos farmacéuticos tera-
péuticos.
• ENVASADO Y ALMACENAMIENTO: Almacenar en envases cerrados a la temperatura indicada en la etiqueta.
• ETIQUETADO: Conservar en envases sellados y almacenar a una temperatura de -20º o menor.
• ESTÁNDARES DE REFERENCIA USP (11)
ER Endotoxina USP
ER rProteína A, 84, C-Cys USP
• IDENTIFICACIÓN
A. SDS-PAGE: Cumple con los requisitos de la prueba A de Identificación en rProteína A usando ER rProteína A, B4 , C-Cys
USP.
B. Unión a lgG: Cumple con los requisitos de la prueba B de Identificación en rProteína A usando ER rProteína A, B4 , C-Cys
USP .
• PRUEBAS DE RECUENTO MICROBIANO (61) y PRUEBAS DE MICROORGANISMOS ESPECÍFICO (62): El recuento total de microorga-
nismos aerobios no excede de 100 ufc por mL y el recuento total combinado de hongos filamentosos y levaduras no excede
de 1O ufc por ml.
• PRUEBA DE ENDOTOXINAS BACTERIANAS (85): No contiene más de 1 Unidad USP de Endotoxinas por mg de proteína total.
[NOTA-La prueba de Endotoxinas bacterianas para rProteína A, B4 , C-Cys se usa para describir la calidad de este material
auxiliar. Esta prueba no define el nivel aceptable de endotoxina bacteriana en la preparación de las formas farmacéuticas
inyectables en las cuales se usa la rProteína A, B4 , C-Cys.]
• PROTEÍNA TOTAL
(Ver (85 7).)
Solución amortiguadora de formulación: Preparar una solución de fosfato de potasio 0,02 M de pH 7,0, que contenga
cloruro de potasio O, 15 M y ácido elitendiaminotetraacético (EDTA) 2 mM de la siguiente manera. Agregar 2,72 ± 0,01 g
de fosfato monobásico de potasio anhidro, 11, 18 g ± 0,22 g de cloruro de potasio y 0,744 ± 0,02 g de EDTA en un vaso
de precipitados de 1000 ml. Diluir con agua a 900 mL y ajustar con hidróxido de sodio 1 M a un pH de 7,00 ± 0,05.
Transferir la solución a un matraz volumétrico de 1000 mL y diluir a volumen con agua. Pasar la solución a través de un
filtro de membrana de 0,45 µm.
Preparación de prueba: Diluir la rProteína A, B4 , C-Cys a 3,0 mg por mL con Solución amortiguadora de formulación.
Procedimiento: Preparar muestras por triplicado para análisis. Medir la absorbancia de cada Preparación de prueba a 275
nm después de corregirla usando Solución amortiguadora de formulación como blanco. Determinar la concentración de
proteína con la siguiente ecuación:

Concentración de proteína (mg por mL) = (A275/0,22)

en donde A es la absorbancia de rProteína A, B4 , C-Cys a la longitud de onda de 275 nm y 0,22 es la absortividad molar.
Promediar los resultados triplicados y determinar el coeficiente de variación (CV): el CV es Q,5%.
•PUREZA CROMATOGRÁFICA
[NOTA-La prueba de pureza por cromatografía de exclusión por tamaño resuelve la rProteína A, B4 , C-Cys de los contaminan-
tes de alto peso molecular y de los contaminantes de bajo peso molecular.]
Fase móvil: Preparar una solución de fosfato de sodio 0,02 M de pH 7,2 que contenga cloruro de sodio O, 15 M, de la
siguiente manera. Agregar 0,96 ± 0,02 g de fosfato monobásico de sodio hidrato, 2,32 ± 0,02 g de fosfato dibásico de
sodio dihidrato, y 8,76 g ± 0,02 g de cloruro de sodio a un vaso de precipitados de 1000 ml. Diluir con agua a 900 mL y
ajustar con hidróxido de sodio 1 M a un pH de 7,2 ± 0,05. Transferir esta solución a un matraz volumétrico de 1000 mL y
diluir a volumen con agua. Pasar la solución a través de un filtro de membrana de 0,45 µm.
USP 40 Pruebas Biológicas/ (151) Prueba de Pirógenos 255

Solución de EDTA: Preparar una solución de EDTA 20 mM, disolviendo 0,74 ± 0,02 g de EDTA en 100 mL de Fase móvil.
Solución de DTT: Preparar una solución de DL-ditiotreitol (DTI) 100 mM, disolviendo 1,54 ± 0,02 g de DTI en 100 mL
de Fase móvil.
Solución de pretratamiento: Preparar una solución que contenga una mezcla de Solución de EDTA y Solución de DTT
(1 :1, v/v). [NOTA-Preparar inmediatamente antes de su uso.]
Solución de prueba: Diluir rProteína A, B4 , C-Cys 1 a 5 en Solución de pretratamiento y mezclar suavemente. Incubar la
muestra a 40º durante 60 minutos.
Sistema cromatográfico
(Ver Cromatografía (621 ).)
Equipar un cromatógrafo de líquidos con un detector a 214 nm y una columna de 1O mm x 30 cm rellena con material
L54. Equilibrar la columna con por lo menos dos volúmenes de columnna de la Fase móvil a una velocidad de flujo de
0,4 mL por minuto.
Procedimiento: Inyectar 100 µL de Solución de pretratamiento, y dejar que la cromatografía continúe durante por lo me-
nos dos volúmenes de columna. Repetir dos veces antes de inyectar 100 µL de la Solución de prueba. La absorbancia se
detecta a los 214 nm. Integrar el pico principal a partir de la corrida de la Solución de prueba y todos los demás picos que
no estén presentes en las corridas de la Solución de pretratamiento. Calcular el porcentaje de impurezas en la porción de
rProteína A, B4 , C-Cys, por la fórmula:
1OO(r/r,)
en donde r; es la respuesta del pico de cada impureza; y r, es la suma de todas las respuestas de todos los picos: la suma
de todas las impurezas no es más de 5%; y la Solución de prueba presenta un pico principal aproximadamente a los 37
minutos.

(151) PRUEBA DE PIRÓGENOS

Cambio en la redacción:

•INTROQUCCIÓN.._usl'4o

La prueba de pirógenos está diseñada para limitar a un nivel aceptable el riesgo de reacción febril en pacientes a los que se
inyecta un determinado producto. La prueba mide el aumento de la temperatura corporal en conejos a los que se inyecta una
solución de prueba por vía intravenosa. Este ensayo está diseñado para productos que pueden ser tolerados por conejos en
una dosis que no exceda de 1O mL/kg del peso del conejo, inyectados por vía intravenosa durante un período de no más de
1O minutos. En el caso de productos que requieren una preparación preliminar o que están sujetos a condiciones especiales de
administración, se deben seguir las indicaciones adicionales establecidas en la monografía individual o, en el caso de antibióti-
cos o de productos biológicos, seguir las indicaciones adicionales establecidas en las reglamentaciones federales (ver Productos
Biológicos (1041)). •Se puede usar una prµeba para pirógenos o ele enf:loto.xinas bac;:terianas in vitro equivalente y validada en
lugar de la prueba para pirógenos en conejos in vivó1cuando.corresporida .• u5P40

APARATOS V DILUYENTES
Despirogenar jeringas, agujas y material de vidrio por calentamiento a 250º durante no menos de 30 minutos o utilizando
otro método adecuado. Todos los diluyentes y soluciones para lavado y enjuague de los dispositivos o sistemas de inyección
parenteral, se deben tratar de manera que garanticen la esterilidad y la ausencia de pirógenos. Se deben realizar periódica-
mente pruebas de control de pirógenos en porciones representativas de los diluyentes y soluciones que se emplean para lava-
do y enjuague de los aparatos. Cuando se especifique el uso de Inyección de Cloruro de Sodio como diluyente, emplear una
Inyección que contenga 0,9% de cloruro de sodio (NaCI).

REGISTRO DE LA TEMPERATURA
Emplear dispositivos sensores de temperatura exactos, tales como termómetros clínicos, sondas termométricas u otra clase
de sonda calibrada, que aseguren una exactitud de ±0, 1ºy que faciliten la lectura máxima en menos de 5 minutos. Insertar la
sonda sensora de temperatura en el recto del conejo, de prueba a una profundidad de no menos de 7,5 cm y, después de un
período no menor que el previamente estimado como suficiente, registrar la temperatura corporal del animal de prueba.

1 United States Food and Drug Administration. Guidance far industry. Pyrogen and endotoxins testing: questions arid answers. Rockville, MD: Food and Drug
Admin istration; Junio 2012. http://www.fda.govJdown loads/drugs/guidancecom plianceregulatoryi nformation/guídances/ucm3 l 0098.pdf.
256 (151) Prueba de Pirógenos /Pruebas Biológicas USP 40

ANIMALES DE PRUEBA

Emplear conejos adultos y sanos. Mantenerlos individualmente en un lugar sin perturbaciones que los puedan excitar y a
una temperatura uniforme entre 20º y 23º, con una variación máxima de ±3º respecto de la temperatura seleccionada. Antes
de emplear por primera vez un conejo en una prueba de pirógenos, se lo debe acondicionar durante un período de no más de
7 días anteriores a la prueba, realizando un ensayo simulado que incluya todos los pasos indicados en el Procedimiento, pero
omitiendo la inyección. No utilizar el mismo conejo para pruebas de pirógenos más de una vez cada 48 horas, ni antes de que
hayan transcurrido 2 semanas después de una elevación de la temperatura corporal de 0,6º o más mientras es sometido a la
prueba de pirógenos o después de administrarle una sustancia considerada pirogénica.

PROCEDIMIENTO

El ensayo se debe llevar a cabo en un área destinada exclusivamente a la prueba de pirógenos, con condiciones ambientales
similares a las del espacio donde están alojados los animales y libres de perturbaciones que puedan excitarlos. Durante el pe-
ríodo de prueba se les suspenderá todo alimento. El acceso al agua está permitido en todo momento pero podrá restringirse
durante la prueba. Si el dispositivo empleado para medir la temperatura rectal debe dejarse insertado durante el período de
prueba, sujetar los conejos mediante sujetadores en el cuello, no muy ajustados, que les permita adoptar una postura natural
de descanso. Determinar la temperatura control de cada conejo no más de 30 minutos antes de la inyección de la dosis de
prueba: ésta es la base para determinar si existe aumento de temperatura provocado por la inyección de una solución de prue-
ba. En cada uno de los grupos de conejos de prueba, emplear solamente aquellos conejos cuya temperatura control no varíe
más de 1º respecto de los demás. Descartar los conejos cuya temperatura corporal exceda de 39,8º.
A menos que se especifique algo diferente en la monografía correspondiente, inyectar a cada uno de tres conejos, en una
vena de la oreja, 1O mL de la solución de prueba por kg de peso, completándose cada inyección dentro de los 1O minutos
desde el inicio de su administración. La solución de prueba es o bien el producto, reconstituido de acuerdo con las especifica-
ciones de la etiqueta, o bien el material en análisis, tratado según se indica en la monografía individual e inyectado en la dosis
especificada en la misma. Para la prueba de pirógenos de dispositivos médicos o sistemas de inyección, lavar o enjuagar las
superficies del dispositivo o sistema que entran en contacto con el material administrado por vía parenteral, o con el sitio de
inyección, o con los tejidos internos del paciente. Asegurarse de que todas las soluciones de prueba estén protegidas de la
contaminación. Administrar la inyección después de entibiar la solución de prueba a una temperatura de 37 ± 2º. Registrar la
temperatura a intervalos de 30 minutos durante el período de 1 a 3 horas posteriores a la inyección.

INTERPRETACIÓN V CONTINUACIÓN DE LA PRUEBA

Considerar cualquier disminución de la temperatura como elevación cero. El producto cumple con los requisitos de la prue-
ba para determinar la ausencia de pirógenos si ningún conejo muestra un aumento de 0,5º o más por encima de su tempera-
tura de control respectiva. Si algún conejo muestra un aumento de 0,5º o más, continuar la prueba empleando otros cinco
conejos. El material en análisis cumple con los requisitos para determinar la ausencia de pirógenos cuando no más de tres de
los ocho conejos tienen un aumento de temperatura de 0,5º o más y si la suma del aumento máximo de las temperaturas
individuales de los ocho conejos no excede de 3,3º.

PRODUCTOS FARMACÉUTICOS RADIOACTIVOS

Dosis de Prueba para Productos Preformulados, Listos para Usar Marcados con Radioactividad

ALBÚMINA AGREGADA Y OTROS PRODUCTOS QUE CONTIENEN PARTÍCULAS

Para la prueba de pirógenos en conejos, diluir el producto con Inyección de Cloruro de Sodio a no menos de 100 µCi/mL e
inyectar a cada conejo una dosis de 3 mL/kg de peso corporal.

OTROS PRODUCTOS

Cuando la vida media física de los radionucleidos es de más de 1 día: Calcular el volumen máximo del producto que
puede inyectarse a una persona. Este cálculo debe tener en cuenta la dosis radioactiva máxima recomendada del producto, en
µCi, y la valoración de la radioactividad, en µCi/mL, del producto a la hora o fecha de su caducidad. Utilizando esta informa-
ción, se calcula el volumen de la dosis máxima por kg en una persona de 70 kg.
Para la prueba de pirógenos en conejos, inyectar a cada conejo un mínimo de 1O veces esta dosis por kg de peso corporal.
Si fuera necesario, diluir la dosis con Inyección de Cloruro de Sodio. El volumen total inyectado por conejo no debe ser menos de
1 mL ni más de 1O mL de solución.
Cuando la vida media física de los radionucleidos es de menos de 1 día: Para productos cuya etiqueta indica que con-
tienen radionucleidos con una vida media inferior a 1 día, los cálculos de dosificación son idénticos a los descritos en el primer
USP 40 Pruebas Biológicas/ (161) Dispositivos Médicos 257

párrafo en Otros Productos. Se puede autorizar la distribución de estos productos antes de terminar la prueba de pirógenos en
conejos, pero las pruebas se deben comenzar antes de las 36 horas de la autorización a más tardar.

Dosis de Prueba para Componentes de Productos Farmacéuticos o Reactivos a Ser Marcados

Se establecen los siguientes requisitos para la dosis de prueba de reactivos a ser marcados o reconstituidos antes del uso por
agregado directo de soluciones radioactivas tales como Inyección de Pertecnetato de Sodio Te 99m, por ejemplo: equipos fríos.
Se debe suponer que el contenido total del vial de reactivo no radioactivo se inyectará a una persona de 70 kg o que se
inyectará el 1/ 70 del contenido total por kg. Si el contenido es seco, reconstituirlo con un volumen medido de Inyección de Clo-
ruro de Sodio.
Para la prueba de pirógenos en conejos, inyectar (1 / 7) del contenido de un vial por kg de peso corporal de cada conejo. La
dosis máxima por conejo será igual al contenido completo de un solo vial. El volumen total inyectado por conejo no debe ser
menos de 1 mL ni más de 1O mL de solución.

(161) DISPOSITIVOS MÉDICOS-PRUEBAS DE ENDOTOXINAS

BACTERIANAS Y PIRÓGENOS

INTRODUCCIÓN
Los métodos y requisitos de este capítulo se aplican a dispositivos o equipos que entran en contacto directo o indirecto con
el sistema cardiovascular, el sistema linfático o el líquido cefalorraquídeo y que se etiquetan como estériles y apirógenos. Esto
incluye entre otros a los siguientes dispositivos:
•Vías para el paso de líquidos de catéteres y de equipos de administración tales como equipos de administración de solu-
ciones, conjuntos de extensión, conjuntos de transferencia, conjuntos de administración de sangre, catéteres intraveno-
sos, implantes, tubuladuras y accesorios de oxigenadores extracorpóreos, tubuladuras para diálisis, catéteres de liberación
intramuscular de fármacos, y ensamblajes para transfusión e infusión
• Dispositivos médicos líquidos tales como dializados
• Dispositivos médicos implantables tales como válvulas cardíacas, injertos vasculares, otros dispositivos médicos que pue-
den entrar en contacto con la sangre o líquido cefalorraquídeo y que llevan una declaración de apirogenicidad
• Geles con una declaración de apirogenicidad incluyendo matrices óseas desmineralizadas y sistemas de liberación de fár-
macos

ENDOTOXINAS BACTERIANAS
Proceder según se indica en Prueba de Endotoxinas Bacterianas (85) para los parámetros de valoración los procedimientos,
estándares y controles de la prueba de endotoxinas bacterianas (PEB) de las pruebas de coagulación, cinéticas y de punto final,
usando el eluato del dispositivo médico en lugar de la Solución Muestra.

DEFINICIONES
Límite de endotoxina
• El límite de endotoxina para el dispositivo terminado es no más de 20 Unidades USP de Endotoxina por dispositivo y no
más de 2, 15 Unidades USP de Endotoxina para dispositivos que entran en contacto con líquido cefalorraquídeo.
• Para dispositivos que entren en contacto directo o indirecto con el entorno intraocular, se puede aplicar un límite menos
estricto de endotoxina.
• El límite de endotoxina para el extracto del dispositivo en Unidades de Endotoxina/mL se calcula de la siguiente manera:
(K X N)!V

K = límite para cada dispositivo

N = número de dispositivos analizados
V= volumen total del extracto
Kit: Un kit se define como un conjunto de dispositivos individuales en su envase primario o una variedad de dispositivos rela-
cionados. Cada tipo individual de dispositivo puede tener su propio límite de endotoxina y debe analizarse y evaluarse indivi-
dualmente [ver la Tabla 1. Selección de Unidades de Productos para Análisis-(Referencia ANSl/AAMI ST72)].
258 (161) Dispositivos Médicos/ Pruebas Biológicas USP 40

Tabla 1. Selección de Unidades de Productos para Análisis

Producto Artículo para Análisis
Dispositivo médico individual en un envase primario en el que cada dispo-
sitivo médico se usa individualmente en la práctica clínica Dispositivo médico individual
Conjunto de componentes en un envase primario en el que los campo-
nentes se ensamblan como producto y se usan en conjunto en la prácti-
ca clínica Combinación de componentes
Número de dispositivos médicos idénticos en un envase primario en el
que cada dispositivo médico se usa independientemente en la práctica
clínica Dispositivo médico individual tomado del envase primario
Kit de dispositivos médicos relacionados con un determinado procedi-
miento, donde cada dispositivo médico se usa independientemente en la Cada tipo de dispositivo médico que presenta una declaración de apiro-
práctica clínica y donde cada dispositivo médico puede tener un límite genicidad o
de endotoxina diferente Todos los artículos juntos

Lambda (A,): A, es la sensibilidad del método de prueba para técnicas de coagulación. Para la técnica turbidimétrica o cromo-
génica, A, es igual a la concentración más baja de endotoxina en la curva estándar de referencia.
Familias de productos: Para los propósitos de la Prueba de Endotoxinas Bacterianas, las familias de productos pueden defi-
nirse con respecto a los materiales de construcción comunes y/o componentes comunes. Se debe justificar y documentar la
selección de los miembros de la familia. Si una familia de productos contiene dispositivos de muchos tamaños, se selecciona el
dispositivo con declaración de apirogenicidad con mayor área superficial como el miembro representativo de la familia que se
va a usar en la prueba de aptitud.
Solución de extracción o de enjuague: Para extraer o enjuagar el dispositivo médico, se usa Agua para Prueba de Endotoxi-
nas Bacterianas [ver (85>, Agua para Prueba de Endotoxinas Bacterianas (PEB)] u otro disolvente adecuado que no interfiera con
la Prueba de Endotoxinas Bacterianas.
Muestreo
1. Muestra-Una muestra para el análisis de un producto final debe estar en su configuración y envasado finales, incluyendo
todos los componentes que constituyen el dispositivo médico final.
2. Muestreo representativo-Un muestreo representativo es un plan de muestreo que se crea y justifica basándose en la supo-
sición de que el proceso de fabricación se encuentra validado y controlado.
3. Tamaño de la Muestra-El número de dispositivos seleccionado para el análisis de rutina depende del tamaño del lote,
nivel de control, consideraciones estadísticas y desempeño histórico. En la mayoría de los casos, se debe analizar cada lote
de producto usando un número de muestras apropiado, no más de 1 O, tomadas de manera aleatoria para representar la
calidad del lote. Los planes de muestreo alternativos que usen muestras de pequeños tamaños o que no analicen cada
lote de producto deben estar claramente definidos y deben estar fundamentados/justificados por una evaluación de ries-
gos bien establecida.
4. Muestras previas y posteriores a la esterilización-Al calificar una valoración de la Prueba de Endotoxinas Bacterianas para
muestras previas a la esterilización, se debe demostrar la equivalencia con los resultados de las pruebas en las muestras
posteriores a la esterilización, para asegurar que la manipulación durante y luego de la esterilización no impacte adversa-
mente sobre la exactitud del resultado de la prueba. El análisis previo a la esterilización es inapropiado para productos que
favorecen el crecimiento microbiano.
Análisis de aptitud (también conocido como prueba de factores de interferencia): Los estudios de aptitud de los extrac-
tos del dispositivo están diseñados para asegurar que el extracto del dispositivo que se está analizando no impacte adversa-
mente sobre la exactitud del resultado de la prueba ya sea por a) ocasionar que la valoración subestime el nivel de endotoxina
(inhibición) o b) sobreestime el nivel de endotoxina (potenciación).

REACTIVOS V SOLUCIONES DE PRUEBA

Ver el capítulo (85>.

REQUISITOS PREVIOS PARA EL ANÁLISIS

Aparato: Todo equipo usado en el proceso de extracción o análisis debe calificarse y/o calibrarse apropiadamente. Los equi-
pos incluyen, entre otros, baños de agua, bloques de calentamiento, pipeteadores mecánicos (pipeteadores fijos, ajustables y
de repetición), termómetros y lectores de placas/tubos/cartuchos.
Despirogenar todo el material de vidrio y demás materiales termoestables en un horno de aire caliente usando un proceso
validado. Si se emplean aparatos de plástico como microplacas y puntas de pipeta para pipeteadores automáticos, usar apara-
tos que demuestren estar exentos de endotoxinas detectables y que no interfieran con la prueba.
Los analistas deben estar apropiadamente capacitados para llevar a cabo la valoración.
La sensibilidad de la valoración debe confirmarse según lo descrito en las secciones Prueba de Confirmación de la Sensibilidad
Declarada del Usado para reactivos de la técnica coagulación y Garantía de los Criterios para la Curva Estándar para métodos
cuantitativos, del capítulo (85>. La confirmación de la sensibilidad de la valoración debe llevarse a cabo cuando se usa una nue-
USP 40 Pruebas Biológicas/ (161) Dispositivos Médicos 259

va partida de reactivo (lisado o endotoxina) o cuando se presenta algún cambio en las condiciones de la prueba que pudiera
afectar el resultado de la misma.

PREPARACIÓN DE LOS DISPOSITIVOS: MÉTODOS ESTÁNDAR

Límite de endotoxina: El límite de endotoxina para la solución de extracción o de enjuague es:

(K X N)/V
K = cantidad de endotoxina permitida por dispositivo (20 Unidades de Endotoxina por dispositivo; 2, 15 para dispositivos
intratecales)
N = número de dispositivos analizados
V= volumen total del extracto o enjuague
[NOTA-El volumen del enjuague o extracto puede ajustarse según el tamaño y la configuración del dispositivo.]
El líquido de extracción estándar para extraer, enjuagar o empapar dispositivos médicos es Agua para Prueba de Endotoxinas
Bacterianas (ver el capítulo (85)). Si fuera necesario, se pueden usar otros disolventes después de que se haya demostrado que
no interfieren con el desempeño de la valoración. El dispositivo completo, cuando indica una declaración de apirogenicidad, o
todos los componentes del mismo con declaración de apirogenicidad, incluyendo las vías de paso de líquidos, deben entrar en
contacto con el líquido de extracción durante todo el transcurso de la extracción.
El método de extracción estándar consiste en empapar o sumergir el dispositivo o purgar la vía de paso del líquido con líqui-
do de extracción calentado a 37 ± 1,0º, manteniendo el líquido de extracción en contacto con las superficies relevantes duran-
te no menos de 1 hora. Se pueden usar métodos alternativos de extracción o enjuague, pero debe demostrarse que son equi-
valentes o mejores que el método estándar. Por lo general, los extractos obtenidos a partir de dispositivos médicos individuales
se combinan para el análisis.
Aptitud: La aptitud de la valoración de la Prueba de Endotoxinas Bacterianas debe demostrarse para cada producto o familia
de productos. El número de partidas de producto seleccionado para el estudio de aptitud refleja el nivel de control del proceso
y debe justificarse.
En el caso de la prueba de aptitud, se considera que los extractos de los dispositivos médicos son las soluciones muestra que
se están analizando, y se analizan según lo descrito en el capítulo (85) para la técnica seleccionada en la sección Prueba de
Factores de Interferencia.
Si fuera necesario, ajustar el pH de la solución que se va a examinar (o una dilución de la misma) de modo que el pH de la
mezcla del lisado y la solución muestra caiga dentro del intervalo de pH especificado por el fabricante del lisado, que general-
mente es un intervalo de pH 6,0-8,0. El pH puede ajustarse usando un ácido, base, o una solución amortiguadora adecuada,
según lo recomendado por el fabricante del lisado. Se pueden preparar ácidos y bases a partir de concentrados o sólidos con
Agua para Prueba de Endotoxinas Bacterianas (ver el capítulo (85)) en recipientes exentos de endotoxinas detectables. Se debe
demostrar que las soluciones amortiguadoras están exentas de endotoxinas detectables y factores de interferencia.
Si se determina que la solución de enjuague o extracción sin diluir no es adecuada para realizar la prueba según el capítulo
(85), se puede repetir la prueba de factores de interferencia usando dilución, o un método que neutralice o elimine la sustancia
interferente.
Si se sospecha la presencia de una interferencia de glucano, se permite el uso de un agente bloqueante de glucanos o un
lisado específico para la endotoxina.
Se permite la dilución en Agua para Prueba de Endotoxinas Bacterianas (ver el capítulo (85)) u otro disolvente validado por un
factor que no exceda la máxima dilución válida (MDV). La máxima dilución válida para dispositivos médicos es la siguiente:
MDV =Límite de endotoxina (de la solución de enjuague o extracción en Unidades de Endotoxina/mL)/A,
A= sensibilidad del método de prueba en Unidades de Endotoxina/mL
La interferencia se puede resolver mediante el tratamiento adecuado del extracto del dispositivo. Los métodos para resolver
la interferencia y la calificación de dichos tratamientos se describen en el capítulo (85). Para establecer que el tratamiento se-
leccionado elimina de manera efectiva la interferencia sin pérdida de endotoxinas, realizar la valoración descrita en el capítulo
(85) usando la preparación a examinar a la que se le ha agregado el Estándar de Endotoxina y se ha sometido al tratamiento
seleccionado.

DEMOSTRACIÓN DE APTITUD CONTINUA

La aptitud continua de la valoración debe volver a evaluarse cuando se realicen cambios significativos al producto, proceso,
abastecimiento de materias primas, sitio de fabricación y/o de análisis, fuente de reactivos para la Prueba de Endotoxinas Bac-
terianas, o cualquier otro cambio que pudiera afectar de manera adversa la exactitud del resultado de la Prueba de Endotoxi-
nas Bacterianas. Los resultados de esta reevaluación deben documentarse, y los estudios de aptitud deben llevarse a cabo nue-
vamente, según se requiera.
Los cambios en las técnicas de extracción requieren un nuevo estudio de aptitud. Debido a los posibles cambios en los pa-
trones de interferencia entre los métodos estándar de la Prueba de Endotoxinas Bacterianas, un cambio en la metodología de
260 (161) Dispositivos Médicos/ Pruebas Biológicas USP 40

la Prueba de Endotoxinas Bacterianas (p.ej., cambiar de una prueba de límite por coagulación a una prueba cromogénica ciné-
tica) requiere la reejecución del estudio de aptitud.
Análisis de rutina: El análisis de rutina de los dispositivos médicos terminados debe usar las mismas técnicas de extracción
que se documentaron en el estudio de aptitud exitoso.
El análisis de rutina debe llevarse a cabo según lo descrito en el capítulo (85), siguiendo las instrucciones para incubación y
los controles indicados en la técnica de valoración seleccionada.
Interpretación de los resultados de la prueba: Referirse al capítulo (85). La preparación en análisis cumple con la prueba si
la concentración media de endotoxina de determinaciones repetidas de la Solución A, después de corregir por dilución y con-
centración, es menos de 20 Unidades de Endotoxina por dispositivo médico (2, 15 Unidades de Endotoxina por dispositivo mé-
dico para aquellos dispositivos que entran en contacto con el líquido cefalorraquídeo.)
Si un dispositivo incumple con este requisito, se puede iniciar una investigación de acuerdo con los procedimientos docu-
mentados. Si una valoración válida de la Prueba de Endotoxinas Bacterianas falla, no se puede reemplazar por la Prueba de
Pirógenos (151) como repetición.

PIRÓGENOS

El capítulo (151) se aplica para las muestras que no puedan analizarse mediante la Prueba de Endotoxinas Bacterianas debi-
do a una intereferencia por inhibición o potenciación de la prueba que no se puede eliminar. Seleccionar un número apropia-
do de dispositivos, no más de 1O, y obtener un extracto combinado, usando métodos de preparación adecuados para el dis-
positivo, según se indica para endotoxinas bacterianas, pero con volúmenes de líquido de extracción o de enjuague que no
excedan de 40 mL de solución salina SR estéril por dispositivo. Se deben cumplir los requisitos del capítulo (151 ).

REFERENCIAS

1. ANSl/AAMI ST72: 2011, Bacteria/ endotoxins-Test methods, routine monitoring, and a/ternatives to batch testing. Associa-
tion for the Advancement of Medica! lnstrumentation, Arlington, VA.
2. United States Food and Drug Administration, Guidance for industry pyrogen and endotoxins testing: questions and answers,
]une 2012. http://www.fda.gov/Drugs/GuidanceComplianceRegulatorylnformation/Guidances/ucm314718.htm

(162) PRUEBA DE POTENCIA ANTITOXINA DIFTÉRICA EN

INMUNOGLOBULINAS HUMANAS

Se provee un método in vitro que es adecuado para determinar la potencia de la antitoxina diftérica (anticuerpos contra la
toxina diftérica) en preparaciones de inmunoglobulinas humanas derivadas de plasma. La toxina diftérica es producida por
Corynebacterium diphtheriae y tiene la capacidad de producir un efecto citopatogénico en líneas de células epiteliales suscep-
tibles. La prueba se basa en la capacidad de la antitoxina diftérica para neutralizar la toxina diftérica, reduciendo su efecto
citotóxico. La prueba determina específicamente la potencia de la antitoxina diftérica basándose en su capacidad para inhi-
bir el efecto citotóxico de la toxina diftérica en células Vero cultivadas (células epiteliales de riñón de mono verde africano)
con respecto a un estándar de referencia. Las deshidrogenasas mitocondriales de células Vero vivas pueden reducir el colo-
rante bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5 difenil tetrazolio (MTI, por sus siglas en inglés) a un producto de color azul/
negro, que se puede medir posteriormente determinando la absorbancia a 540 nm. Si la antitoxina diftérica se encuentra
presente en una cantidad pequeña o nula, entonces la toxina diftérica induce la muerte celular y la incapacidad de las célu-
las para reducir el MTI, lo que resulta en la presencia de pocillos blancos o incoloros. Los criterios de aceptación son defini-
dos por las agencias reglamentarias apropiadas.

VALORACIÓN
• PROCEDIMIENTO
Solución de DMEM-5: Medio de Eagle modificado por Dulbecco 1 , suplementado para contener 5% de suero fetal bovino
(SFB), L-glutamina 2 mM, 50 µg/mL de gentamicina y 2,5 µg/mL de fungizona. [NOTA-Alternativamente, se puede usar
una combinación de 0, 1 mg/mL de sulfato de kanamicina, 0, 1 unidades/mL de penicilina y O, l mg/mL de estreptomicina
en lugar de gentamicina.]
Solución de DMEM-2: Medio de Eagle modificado por Dulbeccoi, suplementado para contener 2% de suero fetal bovino
(SFB), L-glutamina 2 mM, 50 µg/mL de gentamicina y 2,5 µg/mL de fungizona. [NOTA-Alternativamente, se puede usar
una combinación de 0, 1 mg/mL de sulfato de kanamicina, 0, 1 unidades/mL de penicilina y 0, 1 mg/mL de estreptomicina
en lugar de gentamicina.]

1 11885-092 Lile Technologies o equivalente.

 USP 40 Pruebas Biológicas/ (162) Antitoxina Diftérica 261

Solución de MTT: 5 mg/mL de MTI en solución salina amortiguada con fosfatos. 2 Preparar inmediatamente antes de su
uso y minimizar la exposición a la luz ambiental.
Solución de extracción: Ácido clorhídrico 0,4 N en isopropanol
Solución de prueba de toxina: Obtener una preparación líquida de toxina a partir de un cultivo de C. diphtheriae 3 • Se
puede esterilizar mediante filtración y la esterilidad puede mantenerse mediante el agregado de un conservante antimicro-
biano adecuado. Almacenar el filtrado en la oscuridad a 2º-8º durante varias semanas hasta que la actividad se considere
constante, según se determine mediante análisis. Diluir la toxina en Solución de DMEM-5 hasta obtener una Solución de
prueba de toxina adecuada que provea una equivalencia de trabajo con la Solución estándar. [NOTA-Se puede determinar
empíricamente una Solución de prueba de toxina adecuada según se indica a continuación. Valorar la toxina contra una con-
centración fija de antitoxina (p.ej., O, 125 unidades/mL) usando volúmenes y medios según se define a continuación. Deter-
minar la concentración más baja de toxina que ocasiona toxicidad en células Vero en presencia de la concentración de an-
titoxina seleccionada. Esto puede definirse como LCD/20 (donde "LCD" representa el límite de dosis citotóxica y "/20" se
refiere a 1/20 unidades/mL = 0,05 unidades/mL). Esta es una concentración mínima que debe usarse en la Valoración.]
Solución de tripsina-EDTA: Disolver 0,4 g de tripsina, 0,2 g de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) y 0,85 g de cloru-
ro de sodio en 100 mL de agua estéril. Usar reactivos estériles y de grado cultivo celular para preparar las soluciones descri-
tas anteriormente. Como alternativa, se puede usar una preparación estéril prefabricada.
Preparación del cultivo celular: Preparar células Vero4 cultivándolas en frascos de cultivo de tejidos de 75 cm 2 en Solución
de DMEM-5 a 36 ± 1 º, dióxido de carbono al 5% (C0 2 ) y un ambiente humidificado. [NOTA-Se pueden usar tamaños alter-
nativos de frascos de cultivo ajustando los volúmenes usados a continuación.] Después de 2-3 días de crecimiento, el me-
dio puede reemplazarse por Solución de DMEM-2, dejando que continúe el crecimiento. Cuando las células hayan alcanza-
do una monocapa confluente, desechar el medio de cultivo. Lavar la capa de células pipeteando y transfiriendo 5 mL de la
Solución de tripsina-EOTA al frasco de cultivo. Luego aplicar al frasco de cultivo un movimiento bascular suave hacia adelan-
te y hacia atrás durante aproximadamente 30 segundos. Retirar y desechar la Solución de tripsina-EDTA. Agregar 5 mL adi-
cionales de Solución de tripsina-EDTA y mover suavemente de forma bascular hacia adelante y hacia atrás durante 1 minu-
to. Retirar y desechar todo excepto 1 mL. Incubar a 36 ± 1º, con dióxido de carbono al 5% (C0 2 ), en un ambiente humidi-
ficado durante aproximadamente 1O minutos o hasta que la capa de células comience a desprenderse del frasco y golpe-
tear suavemente el frasco de cultivo para liberar las células. Agregar 1O mL de Solución de DMEM-5 a las células tripsiniza-
das, contar las células y ajustar la suspensión celular a 1 x 1os células/mL en el mismo medio.
Soluciones estándar: En tubos estériles, preparar cuatro concentraciones del estándar diluyendo el Estándar de los EE.UU.
de Antitoxina Diftéricas con la Solución de DMEM-2, hasta una concentración de 1 unidad/mL, seguido de diluciones en
serie con el mismo medio hasta obtener tres soluciones adicionales de 0,5; 0,25yO,1 unidades/ml.
Soluciones muestra: Diluir en tubos estériles cada una de las muestras de prueba de inmunoglobulinas humanas con Solu-
ción de DMEM-2 hasta obtener una concentración de 1,25% de proteína. Usando las muestras diluidas, diluir adicionalmen-
te con Solución de DMEM-2 hasta lograr una concentración de antitoxina diftérica esperada que esté dentro del intervalo de
las Soluciones estándar (es decir, 1 a O, 1 unidades/mL).
Análisis
Muestras: Solución de prueba de toxina, Soluciones estándar y Soluciones muestra
Analizar cada Solución estándar o Solución muestra por duplicado. Rotular placas de cultivo de 96 pocillos marcando lasco-
lumnas de 8 pocillos en grupos de dos; se pueden analizar las cuatro Soluciones estándar y una Solución muestra por placa.
De acuerdo a lo que se describe seguidamente, las columnas 11 y 12 pueden usarse para el control de células sin tratar y
el control de toxina, respectivamente. [NOTA-Se pueden usar diseños de placas alternativos manteniendo las diluciones.]
Agregar 112,5 µL de Solución de DMEM-2 a cada pocillo de la fila A, columnas 1-1 O únicamente (estos son controles de
toxicidad no específicos de estándar o de muestra). Agregar 75 µL de Solución de DMEM-2 a cada pocillo de las filas B-H,
columnas 1-1 O únicamente.
Agregar 37,5 µL de una dilución de Solución estándar o una Solución muestra a los pocillos A1-A2 y agregar 75 µL de la
misma solución a los pocillos Bl-B2. Agregar 37,5 µL de una segunda dilución de Solución estándar o Solución muestra a
los pocillos A3-A4 y agregar 75 µL de la misma solución a los pocillos B3-B4. Continuar realizando adiciones similares de
diluciones de Solución estándar o Soluciones muestra a cada grupo de dos columnas en las columnas 1-1 O. Realizar dilucio-
nes en serie al medio transfiriendo 75 µL de cada pocillo de la fila B a cada pocillo de la fila C de la misma columna.
Mezclar y luego continuar transfiriendo 75 µL de la misma manera hacia abajo en cada columna. Desechar los últimos 75
µL después de mezclar la fila H. Agregar 75 µL de Solución de prueba de toxina a las filas B-H en las columnas 1-1 O. Agre-
gar 150 µL de Solución de DMEM-2 a todos los pocillos de la columna 11 (control de células) y agregar 75 µL de Solución
de DMEM-2 más 75 µL de Solución de prueba de toxina a todos los pocillos de la columna 12 (control de toxina).
Cubrir las placas e incubarlas durante 1 hora a 36 ± 1º, en dióxido de carbono al 5% (C0 2 ) en un ambiente humidificado.
Agregar 150 µL de suspensión de células a todos los pocillos, cubrir las placas e incubarlas a 36 ± 1º, en dióxido de carbo-
no al 5% (C0 2 ), y en un ambiente humidificado. Incubar durante 4-5 días, verificando periódicamente la contaminación

2 14190-250 Lile Technologies o equivalente.

3 Toxina diftérica código 12/282 de NIBSC o una alternativa adecuada.
4 American Type Culture Collection CCL-81.
s Usar el Estándar de los EE.UU. de Antitoxina Diftérica según lo indicado por el Center far Biologics Evaluation and Research (Centro para la Evaluación e Investi-
gación de Productos Biológicos) de la Food and Drug Administration (Administración de Alimentos y Medicamentos).
262 (162) Antitoxina Diftérica / Pruebas Biológicas USP 40

microbiana mediante examen microscópico. Una vez que los pocillos de control de toxicidad en la fila A que contienen la
concentración más baja de una Solución estándar sean casi confluentes, agregar 15 µL de Solución de MTT a cada pocillo.
Cubrir las placas e incubarlas en la incubadora de dióxido de carbono (C0 2 ) a 37º durante 3 horas. Desechar el medio y
agregar a cada pocillo 150 µL de Solución de extracción. Cubrir las placas y colocar papel aluminio sobre éstas para mini-
mizar la exposición a la luz. Agitar suavemente para solubilizar el formazán azúl formado por las células viables. Usando
un lector de placas adecuado, leer la absorbancia de cada pocillo a una longitud de onda de 540 nm.
Cálculo: La dilución de corte es la dilución más alta en la que aún se presentan células viables en el pocillo pero más allá de
la cual no se encuentra ya ninguna célula viable. La dilución de corte se define mediante una absorbancia correspondiente
(Abs). [NOTA-El valor de absorbancia promedio puede calcularse para los pocillos de control de células en la columna 11 y
dividirse por 2 para obtener un valor Abs de control del 50%. Este valor puede usarse para determinar las diluciones de
corte. La dilución de corte para cada Solución estándar y Solución muestra puede por ende definirse como la dilución más
alta en la que el valor Abs es mayor que el valor Abs de control del 50%.] Determinar las diluciones de corte para cada
Solución estándar y Solución muestra. Graficar las diluciones de corte obtenidas para todas las Soluciones estándar (expresa-
das como la inversa de la dilución de corte) en función de las unidades de Antitoxina Diftérica Estándar de los EE.UU. Cal-
cular una línea de regresión lineal a partir de los datos. Calcular la media geométrica para las cuatro diluciones de corte
asociadas con cada Solución muestra. Comparar la dilución de corte media con la regresión lineal de los datos de la Solución
estándar para determinar un título, en unidades/mL, para cada Solución muestra. Para obtener el valor de potencia final
para la Solución muestra, multiplicar el título por cualquier dilución que se haya realizado a la Solución muestra antes de la
Valoración.
Aptitud del sistema: El coeficiente de correlación de la curva estándar debe ser >0,995. La pendiente de la curva estándar
debe estar entre 26 y 38. La prueba es válida si las células en los pocillos de la fila A, de las columnas 1-1 O, parecen norma-
les y similares a las células de los pocillos de control de la columna 11. Además, los valores de dilución de corte para los
duplicados de la Solución estándar y de la Solución muestra deben estar dentro de una dilución en serie entre sí, y la dilución
de corte debe estar dentro del intervalo de las diluciones en serie de la Solución muestra.

Agregar lo siguiente:

·{165) ACTIVADOR DE P.R~CALl(;.REÍNA

DEFINICIÓN
El actívador de precalicre(na (PKA, por ~us slgl¡;¡s en ing1és),li:tmbiénconoddp c;aroo F.actor Xlla, c9n!v'ierj:e ia precalkreína en
calicreína. la calk:reína activada escindeyccinvierte los qulriiri<}genos en quih}has {p;ej,;: b/'at:Jiquiniha) lo que. puéQe resultar
en una caída de la presión arterial. sanguínea. El a<!tivadorde p.recalicreína se valora pdr .medio de S!:.i habilidad para activar la
precalicreína, la cual una veZactívada escinde un suStr11t0 ..pep~ídico sintético y lib:er¡;¡ u1;i<;r9móforo que puede medirse es~
pectrofotométricamente. ta cantidad de activadcir d.e. precalicreíná se cietf!l'Jll.ina ¡:foh!:O.ri'ipar.aeión con el material estándar
de referencia. El prócedimíentq que se.pn~senta en
este dp~ulo tlasidotratfü;ionalrf'iE!nte usado para determiriarlatantidad
de activádor de precalicrefna en los derivados. defplaSri'ia hqmano tales como las preparaciones .de albúmina yde inmuno-
gJobulinas.
Algunas preparaciortes de ínmunoglo.bulinás p(ledeci d:inteherealitte(ij¡i b ~tivh:lad sjmiJ:¡:j;ta la cafk:teíQá ebausencia de pre-
caJicreína agregada como svstt'ato (Pte<;ali<;reína sustrato), fo que resulta en u.na [E!aceión deJsustráto peptídico síritético. Si
o
estuviera. presente, ~sta calicre(na á(;tividad similar a•la calictE!ína debe tenerse en al
d.lelita verificar la aptitud de la vá.lor¡!l-
ción. en las condiciones de. uso.· Algunas preguntas que deben. carisicierarsE! dUfante ·1a verifíca(;l@ri de lá ~lJ:>~itud de la valor11-
ci6n en las cóndidonesdE!uso.in(;luyen:
•¿Se Observan efectoschi 41 matnz•de látf10E!str~? .·.· .·. / . ··• ..• •{ >
• ¿Se está usando. el in0defo estadístico apropia a(.') pata aoaliz¡¡Hos datOsT. •··•
• ¿Es sufiderite un arí~Hsis <,te púnto flnalo se
necesita;\.!~ a~íillsis C:i.ti~t~o? · · . ..· . .· . . . .. ..
(Solo párá fines informativos, refer'irse a la$ 's~~iones ·2.; 4 J'!i tlel capítulo 'Qiseño JI' (Jesartf>1f6dc Vqfcitadones Blot6gicás
0:032} al momento de t<irlsiderar l¡t .áp~ítu1fde ti.So de. una való.rat¡¡ipr¡,)
YALO~CIÓN
• VALQRACIÓl\I DE PRE~Al,ICREÍNA
So.loc,ión am(lrtigu!U:lera At Prt1parar ufta, sqlud<)n de. tris(hidro){imetjf}amínametano Or105. M y d4lrt1ro de $Odio 0,1 5M.
Ajustar tón .át¡¡ido clorbídrícp ,2N ¡fuh pHde. 7;;95,...8;()5.:
Solución amortlguaclóra .B: P.-eparar una solüci<Sri 'de tris(hldroi¡;!rti1etil)ám.inometal'19 J,O M. Ajustar con ácido élorhídric:o
2 Na un pH.de 7,95~8,()5.
Solución A: Preparar una soludón de áciao clqthídrlco. 0,33 N;
Soll!dón B: Prepáríi!r.una s<:>lucíón de hldr<)xído deso<:Uo Q;33N.
Solución C: Preparar una solución de ácido acético al 50%.
USP 40 Pruebas Biológicas/ (171) Valoración de Actividad de Vitamina Bl 2 263

Solución de sustirato .cromogénico: preparar í.Jna sol.ución di; un sustrato C:romogénicopara.1a •. prueba amidolítica adecua-
do específico para c<;ilicreína en Solución ctrnortigwadoraA para Qbteoer· una sql1,1C:ión con un<;i concentrac;i()n de apro?dmada-
mente 1,2 mM,
Precalicrefüa sustrato: Usar ·una.Precali<:r;efnd Stistrdto adec:uada1AriaH.z:arlaausenéia <:le actividad .·de.caJíc;refna. en·. la. Preca-
licréína su~trato, me.Zclando·1•· parte. t.ori .20.partescie 5oltlcir5n aé.sustfatQ••{'JfUfr/ogenicf;! previaml\ll'lteentibiada a 37"·.e incu-
bara 37".dí.lrant¡;2 minutos;. El sustrato es adecuado si el.a!:.u!rlent() en.laab:$orp.al'Jciaa 405 nm es.menora O,OOl/mín.
[NOT.A.·•·····Para.elirninarfoc.ontaminació.n·de.inhipidt°)res·ciepfótel~asa·d~la • • 1fü:c/1liáek/ast,1stmt9,.·debellevarsea.e:abo·.µn
tratamiento dela precalk:reína··con átidó i=n:tada muestra itíd!vi(;!ual(an~es. de ~U· uso,J ~¡esta ··congelado,·descongelilrta
Precaliaeína sustrato a 35º-39º. Agregar 2,0 rnL de Solud6nA a. 4 mL de Precaliáeiha SJJstrato e incubar durante 1$ minutos
a• . 2.3ºc-25°.· Volver·a •. neutraliza.r .el pH .col'.l 2iO m~de·•Soluci6n 8.• Agregar·.200·•µL de·•.Soludón amortiguadora 8y almacenar a
temperatura ambiente •dúrante notnás dEt4horas.
SolU«;ipnes estándar: Disolver·el contenido de un víalqe ERActivadot.de Precalicrefna l,;lSP en 0;5 mL .de ag.ua .. Diluir ER
Activador de. Precallcrefna USP con• 50/1;1cíón om9rtiguadota A (1:5). Preparar clricQ Soluciones estándar uniformemente espa-
ciadas con· concentraciones entre Oy.8,5 Ul/mL,
S~lución ·rnuestra: Diluir apropiadamente laml.Jestra con. sohtci6n amortig¿¡adQtaA para que se encuentre en el intervalo
delas diluciones de estándar,.reali:z;ando c()mo mínimo uí\adiluc¡Q.n(l ;1).
Aptitud del Sistema
Muestras; Solución amortiguadora A y Sol1;1dories estándar
Requisitos de aptitud
Intervalo de v<1loración: Si et valor deabsorbanciade una JJ1uestr<1 esrnayorqueel valor más alto de la curva estándar,
diluir la muestr(l con• So/IJ.cíón amortigµqdoraAy repetir la Valoración. $i la absorbancia de una muestr<;i es menor que( el
límite de detección de la Valoración, la activid<1d .Clebe informarse C:omo menor' que el límite de detección.
Coeficiente de correlación: No menosde0199
Análisis
Muestras: Solución amortíguadoraA, Solutfüne$ estándcry Soi¡Jtión muestra
[NOTA-Este• procedimiento ·tambiéM se.puedeteí!lizar us(lndo pl<1taform<1s.alternatív<;is. Se ciebeprocurar minimizar· el ·tiempo
entre la ·adición de la Precalic;t;eínqsustrato a lasSolucio~esestándat yJaSpludón muestra1yaque·a1.descongelarse, JaPrec()f¡.
cteína sustrato·puede presentar•·ciertogradb dedeg~adaci611 cónel.•paso•deltiem¡::>o.]
Transferir 25 µL de las Soluc;Jgnes. e$tám::Jqr Q.de la So.IQcic!intn!-teStra a cuatr() pocillQs clístjntos indivi ciu<1 l~s eje una pl¡;¡c<rde
microtitü laci6n.· adecuada. lncubát la pl~:ea·.de roieroti.\(]lacióM dul'allte .2:.:-:I· minutos a .3..5P':"l9":·.· Iniciar el.precalentamiento
de la Sotuci6n ·amortíguadora A, la PrecdJict;eína sl.!strato y laSc#uclón a:e sµstrat() crómogéhico <135 """":39~, ·Para cada Solyción
estándar y Solución mvestra, agrega!' lOo ¡j[de $olüdói? atr¡oi"tlg(ladóra Aen. dgs de los :Cuatro pooillosya.gregarJ oq µ~.ele
Précalicrefna sustrato precalentadoal()s ottosclos¡::>ocJllos.!nclibata35"~.39~durante 1Ominutos. Agregar 12~ µL de
Solución de sustrato cromogénico preéa1ef'ltada a<tod()s IC>s Pocill()s ell elmism() orden eh •que se agregaron Ja Solución
amortigJJadora Ay la Precalicteírya sustr~tp e 1hó.1bª-~ a.35e"""a9° durante 20 mb1utos. D~tener l¡is reaC:ciol1es con 50 µL de
so/ucióncy·mezcfor.bien.Leerlaªb~orba!'!ciáC!ecactáwci!l<:>d~l¡¡plat:áa4Q'5bm.i:l~n~.odet¡;¡~4.hól'ªs,Restar:etpro­
medio cte Ja A40~ de los.qqs .• p9oillos que· cqntieo:e~ S()lu~fÓtJ.ªTP2(ti~uqd.oro Ap~r~·· ~<1da•S()fu9ió~ están4ary Solucf6n rnwestra
para obtener .losyalores . A40s..corregigqs.·· Usando.~l·•rn.~tqdo•.deregresi9n• lineal q:e rnínimoscl,ladra(jps, gen~r(l:r1Jna•.curva
estándar . a.partir eje. lasacthtic:laejesde las. SoAL1iz.ío1Jf!S(!S{Qntfa.r(l)l/mL).y sl1~ c;o!"~esponcliente~ valores.de absorbaQci<;i· corre-
gidos, C:aloí.Jlar .la actlvi!:!ad ·de .prl\\Cálie:r~ína(;!~ lás mt.iestrªs a,:iartir ·.<:le la.cl,ll'Vll· decaHQracJón. de.·tos estandarllls.Multipli-
car cada actividaq. por el factor eje diluciph deila .mu~~tra para !i>tit~ne.r la ~ctivídc;lCl oororeglda er1 uvmi.,.
REQUISITOS ADICIONALES
• Esl'ÁÍllDAHffDE REFEllEfl!CiA0$P (11)
ER.Activador de Precalicrefna USP
.&USP4lJ

(171) VALORACIÓN DE ACTIVIDAD DE VITAMINA B 12

VALORACIÓN
• PROCEDIMIENTO
Preparación de valoración: Colocar una cantidad adecuada del material a valorar, previamente reducida a polvo fino si
fuera necesario y medida o pesada con exactitud, en un recipiente apropiado que contenga, por cada g o mL del material
tomado, 25 ml de una solución acuosa para extracción preparad a justo antes de usar, en donde, cada 100 ml contienen
1,29 g de fosfato disódico, 1, 1 g de ácido cítrico anhidro y 1,0 g de metabisulfito de sodio. Colocar la mezcla en autoclave
a 121 ºdurante 1O minutos. Dejar sedimentar las partículas no disueltas del extracto y filtrar o centrifugar si fuera necesario.
Diluir una alícuota de la solución transparente con agua, de manera que la solución de prueba final contenga una actividad
de vitamina B12 que equivalga aproximadamente a la actividad de la Solución estándar de cianocobalamina que se agrega a
los tubos de valoración.
264 (1 71) Valoración de Actividad de Vitamina Bl 2 / Pruebas Biológicas USP 40

Solución madre del estándar de cianocobalamina: A una cantidad adecuada de ER Cianocobalamina USP, pesada con
exactitud, agregar suficiente alcohol al 25 por ciento para obtener una solución con una concentración conocida de 1,0 µg
de cianocobalamina por ml. Almacenar en un refrigerador.
Solución de cianocobalamina estándar: Diluir un volumen adecuado de Solución madre del estándar de cianocobalamina
con agua hasta un volumen medido tal que después del período de incubación según se indica en el Procedimiento, la dife-
rencia en la transmitancia entre el blanco inoculado y el nivel de 5,0 ml de la Solución de cianocobalamina estándar no sea
menor de aquella correspondiente a la diferencia de 1,25 mg en peso seco de las células. Generalmente, esta concentra-
ción está entre 0,01 ng y 0,04 ng por ml de Solución de cianocobalamina estándar. Preparar una solución estándar nueva
para cada valoración.
Solución madre de medio basal: Preparar el medio de acuerdo con la fórmula y las instrucciones que aparecen a conti-
nuación. Puede usarse una mezcla deshidratada que contenga los mismos ingredientes siempre que, una vez reconstituida
según se indica en la etiqueta, proporcione un medio comparable al obtenido a partir de la fórmula que aparece en este
procedimiento.
Agregar los ingredientes en el orden indicado, disolviendo con cuidado la cistina y el triptófano en el ácido clorhídrico an-
tes de agregar las ocho soluciones siguientes a la solución resultante. Agregar 100 ml de agua, mezclar y disolver la dex-
trosa, el acetato de sodio y el ácido ascórbico. Filtrar, si fuera necesario, agregar la solución de polisorbato 80, ajustar la
solución a un pH entre 5,5 y 6,0 con hidróxido de sodio 1 N y agregar agua purificada hasta obtener 250 ml.

L-Cistina 0,1 g
L-Triptófano 0,05 g
Ácido Clorhídrico 1 N 10 ml
Solución de Adenina-Guanina-Uracilo 5 ml
Solución de Xantina 5 ml
Solución Vitamínica 1 10 ml
Solución Vitamínica 11 10 ml
Solución Salina A 5 ml
Solución Salina B 5 ml
Solución de Asparagina 5 ml
Solución de Hidrolizado Ácido de Caseína 25 ml
Dextrosa Anhidra 10 g
Acetato de Sodio, Anhidro 5g
Ácido Ascórbico 1g
Solución de Polisorbato 80 5 ml

Solución de hidrolizado ácido de caseína: Preparar según se indica en Valoración de Pantotenato de Calcio (91 ).
Solución de asparagina: Disolver 2,0 g de L-asparagina en agua hasta obtener 200 ml. Almacenar bajo tolueno en un
refrigerador.
Solución de adenina-guanina-uracilo: Preparar según se indica en Valoración de Pantotenato de Calcio (91 ).
Solución de xantina: Suspender 0,20 g de xantina en 30 ml a 40 ml de agua, calentar a una temperatura de aproxima-
damente 70º, agregar 6,0 ml de hidróxido de amonio 6 N y mezclar hasta que el sólido se disuelva. Enfriar y agregar
agua para obtener 200 ml. Almacenar bajo tolueno en un refrigerador.
Solución salina A: Disolver 1Og de fosfato monobásico de potasio y 1Og de fosfato di básico de potasio en agua para
obtener 200 ml. Agregar 2 gotas de ácido clorhídrico y almacenar bajo tolueno.
Solución salina B: Disolver 4,0 g de sulfato de magnesio, 0,20 g de cloruro de sodio, 0,20 g de sulfato ferroso y 0,20 g
de sulfato de manganeso en agua para obtener 200 ml. Agregar 2 gotas de ácido clorhídrico y almacenar bajo tolueno.
Solución de polisorbato 80: Disolver 20 g de polisorbato 80 en alcohol para obtener 200 ml. Almacenar en un refrigera-
dor.
Solución vitamínica 1: Disolver 1O mg de riboflavina, 1O mg de clorhidrato de tiamina, 100 µg de biotina y 20 mg de
niacina en ácido acético glacial 0,02 N para obtener 400 ml. Almacenar, bajo tolueno protegiendo de la luz, en un refri-
gerador.
Solución vitamínica 11: Disolver 20 mg de ácido paraaminobenzoico, 1O mg de pantotenato de calcio, 40 mg de clorhi-
drato de piridoxina, 40 mg de clorhidrato de piridoxal, 8 mg de diclorhidrato de piridoxamina y 2 mg de ácido fálico en
alcohol neutralizado diluido (1 en 4) para obtener 400 ml. Almacenar, protegiendo de la luz, en un refrigerador.
Preparación de jugo de tomate: Centrifugar jugo de tomate enlatado comercial para extraer la mayor parte de la pulpa.
Suspender aproximadamente 5 g por L de coadyuvante de filtración analítico en el sobrenadante y filtrar, con ayuda de
presión reducida, a través de una capa de coadyuvante de filtración. Repetir la filtración, si fuera necesario, hasta obtener
un filtrado transparente, color amarillo claro. Almacenar bajo tolueno en un refrigerador.
Medio de cultivo: [NOTA-Se puede usar una mezcla deshidratada que contenga los mismos ingredientes siempre que,
una vez reconstituida según las indicaciones del etiquetado, proporcione un medio equivalente al obtenido a partir de la
fórmula descrita en este procedimiento.] Disolver 0,75 g de extracto de levadura hidrosoluble, 0,75 g de peptona seca, 1,0
USP 40 Pruebas Biológicas/ (171 >Valoración de Actividad de Vitamina Bl 2 265

g de dextrosa anhidra y 0,20 g de bifosfato de potasio en 60 ml a 70 ml de agua. Agregar 1 O ml de Preparación de jugo

de tomate y 1 ml de Solución de polisorbato 80. Ajustar la solución con hidróxido de sodio 1 N hasta un pH de 6,8 y agregar
agua para obtener 100 ml. Colocar porciones de 1 O ml de la solución en tubos de ensayo y tapar con algodón. Esterilizar
los tubos y su contenido en autoclave a 121 ºdurante 15 minutos. Enfriar con la mayor prontitud posible para evitar forma-
ción de colores que resultan del sobrecalentamiento del medio.
Medio de suspensión: Diluir un volumen medido de la Solución madre de medio basal con un volumen igual de agua. Co-
locar porciones de 1 O ml del medio diluido en tubos de ensayo. Esterilizar y enfriar según se ha indicado en Medio de culti-
vo.
Cultivo madre de Lactobacillus leichmannii: Agregar 1,0 g a 1,5 g de agar a 100 ml de Medio de Cultivo y calentar la
mezcla en un baño de vapor, con agitación, hasta que el agar se disuelva. Colocar porciones de aproximadamente 1O ml
de la solución caliente en los tubos de ensayo, tapar bien los tubos, esterilizarlos a 121 ºdurante 15 minutos en autoclave
(temperatura de la salida) y dejar que los tubos se enfríen en posición vertical. Inocular tres o más de los tubos, por transfe-
rencias en cuña de un cultivo puro de Lactobacillus leichmannii.* (Antes de usar un cultivo nuevo por primera vez en esta
valoración, hacer no menos de 1O transferencias sucesivas del cultivo en un período de 2 semanas.) Incubar durante 16 a
24 horas, a cualquier temperatura seleccionada entre 30º y 40º, pero mantenida termostáticamente dentro de ±0,5º y fi-
nalmente almacenar en un refrigerador.
Preparar cultivos nuevos en cuña al menos tres veces por semana y no usarlos para preparar el inóculo si tienen más de 4
días. La actividad del microorganismo se puede aumentar mediante transferencias del cultivo en cuña realizadas a diario o
dos veces al día, hasta el punto en que se pueda observar una evidente turbidez en el inóculo líquido 2 a 4 horas después
de la inoculación. Un cultivo de crecimiento lento raramente proporciona una curva de respuesta adecuada y puede con-
ducir a resultados irregulares.
lnóculo: [NOTA-Una suspensión congelada de Lactobacil/us /eichmannii puede usarse como cultivo madre, siempre que
proporcione un inóculo comparable a un cultivo nuevo.] Transferir las células del Cultivo madre de Lactobacillus leichmannii
a 2 tubos estériles que contengan 1O ml de Medio de cultivo cada uno. Incubar estos cultivos durante 16 a 24 horas a cual-
quier temperatura seleccionada entre 30º y 40º, pero mantenida termostáticamente dentro de ±0,5º. En condiciones asép-
ticas, centrifugar los cultivos y decantar el sobrenadante. Suspender las células de cultivo en 5 ml de Medio de suspensión
estéril y mezclar. Usando Medio de Suspensión estéril, ajustar el volumen para que una dilución 1 en 20 en solución salina
SR produzca transmitancia de 70% cuando se lee en un espectrofotómetro apropiado a una longitud de onda ajustada a
530 nm, equipado con una celda de 1O mm y se lee contra solución salina SR ajustada a una transmitancia de 100%. Pre-
parar una dilución 1 en 400 de la suspensión ajustada usando Solución madre de medio basal y usarla para el inóculo de
prueba. (Esta dilución puede alterarse, cuando sea necesario, para obtener la respuesta deseada.)
Calibración del espectrofotómetro: Comprobar la longitud de onda del espectrofotómetro periódicamente, usando una
celda de longitud de onda estándar u otro dispositivo apropiado. Previamente a la lectura de las soluciones, calibrar el es-
pectrofotómetro con agua para fijar el 0% y el 100% de transmitancia, a la longitud de onda de 530 nm.
Procedimiento: Limpiar meticulosamente, por medios apropiados, los tubos de ensayo de vidrio duro, de 20 mm x 150
mm de tamaño aproximado y otro material de vidrio necesario, preferentemente seguido de un calentamiento a 250º du-
rante 2 horas, debido a la alta sensibilidad del organismo de prueba a la actividad de cantidades diminutas de vitamina B12
y a trazas de muchos agentes de limpieza.
Agregar a los tubos de ensayo, por duplicado: 1,0 ml; 1,5 ml; 2,0 ml; 3,0 ml; 4,0 ml y 5,0 ml, respectivamente, de la
Solución de cianocobalamina estándar. A cada uno de estos tubos y a cuatro tubos vacíos similares, agregar 5,0 ml de
Solución madre de medio basal y agua para completar 1 O ml.
En tubos de ensayo similares, agregar, por duplicado, respectivamente, 1,0 ml; 1,5 ml; 2,0 ml; 3,0 ml y 4,0 ml de la
Preparación de valoración. Agregar a cada tubo 5,0 ml de Solución madre de medio basal y agua para completar 1 O ml.
Colocar juntos un juego completo de tubos del estándar y de la valoración en una gradilla y el conjunto duplicado en una
segunda gradilla o en otra sección de la misma gradilla, preferentemente en orden aleatorio.
Cubrir los tubos apropiadamente para prevenir la contaminación bacteriana y esterilizar los tubos y su contenido en un
autoclave a 121 º durante 5 minutos, procurando alcanzar esta temperatura en no más de 1 O minutos, precalentando el
autoclave si fuera necesario. Enfriar tan rápidamente como sea posible para evitar formación de color como resultado del
sobrecalentamiento del medio. Tomar precauciones para mantener la uniformidad de las condiciones de esterilización y
enfriamiento durante toda la valoración ya que si los tubos se colocan demasiado juntos o si se sobrecarga el autoclave
podría variar la velocidad de calentamiento.
Agregar asépticamente 0,5 ml de lnóculo a cada tubo así preparado, excepto a dos de los cuatro que no contengan Solu-
ción de cianocobalamina estándar (los blancos no inoculados). Incubar los tubos a una temperatura entre 30º y 40º, man-
tenida termostáticamente dentro de ±0,5º, durante 16 a 24 horas.
Terminar el crecimiento calentando a una temperatura no inferior a 80º durante 5 minutos. Enfriar a temperatura ambien-
te. Después de agitar su contenido, colocar el tubo en un espectrofotómetro que se ha fijado a una longitud de onda de
530 nm y leer la transmitancia cuando se alcanza un estado estacionario. Este estado estacionario se obi;erva unos pocos

* Se pueden obtener cultivos puros de Lactobacillus /eichmannii, Número 7830, de la American Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas, VA
20110.
266 (171) Valoración de Actividad de Vitamina Bl 2 / Pruebas Biológicas USP 40

segundos después de agitar, cuando la lectura se mantiene constante durante 30 segundos o más. Emplear aproximada-
mente el mismo intervalo de tiempo para la lectura de cada tubo.
Con la transmitancia fija en 100% para el blanco no inoculado, leer la transmitancia del blanco inoculado. Si la diferencia
es mayor de 5% o si hay evidencia de contaminación con un microorganismo extraño, descartar los resultados de la valo-
ración.
Con la transmitancia fija en 100% para el blanco no inoculado, leer la transmitancia de cada uno de los tubos restantes.
Descartar los resultados de la valoración si la pendiente de la curva estándar indica un problema de sensibilidad.
Cálculos: Preparar una curva estándar de concentración-respuesta según el siguiente procedimiento. Examinar los resulta-
dos para detectar y reemplazar cualquier valor de transmitancia aberrante. Para cada nivel del estándar, calcular la respues-
ta a partir de la suma de los valores duplicados de las transmitancias (L) como la diferencia, y= 2,00 - L. Graficar esta
respuesta en la ordenada del papel cuadriculado, contra el logaritmo de los ml de Solución de cianocobalamina estándar
por tubo en la abscisa, usando para la ordenada una escala aritmética o logarítmica, la que produzca una mejor aproxima-
ción a una línea recta. Trazar la línea recta o la curva continua que mejor se ajuste a los puntos graficados.
Calcular la respuesta, y, sumando las dos transmitancias para cada nivel de la Preparación de valoración. Leer de la curva
estándar el logaritmo del volumen de la Preparación estándar correspondiente a cada uno de esos valores de y que estén
comprendidos en el intervalo entre el punto más bajo y más alto graficados para el estándar. Restar de cada logaritmo así
obtenido el logaritmo del volumen, en ml, de la Preparación de Valoración para obtener la diferencia, x, de cada nivel de
x
dosificación. Promediar los valores de x para cada uno de tres o más niveles de dosis para obtener = M', el logaritmo de
la potencia relativa de la Preparación de valoración. Determinar la cantidad, en µg, de ER Cianocobalamina USP correspon-
diente a la cianocobalamina en la porción de material tomada para la valoración con la ecuación:
antilog M = antilog (M' + lag R)
R =número de µg de cianocobalamina que se supone presente en cada mg (o cápsula o tableta) del material toma-
do para la valoración
Repetición: Repetir toda la determinación al menos una vez, usando Preparaciones de Valoración preparadas por separado.
Si la diferencia entre los dos logaritmos de las potencias M no es mayor de 0,08; su promedio, M, es el logaritmo de la
potencia resultado de la valoración del material de prueba (ver Valoración de la Actividad de la Vitamina 812 en Diseño y Aná-
lisis de Valoraciones Biológicas (111 )). Si las dos determinaciones difieren en más de 0,08 hay que realizar una o más deter-
minaciones adicionales. Del promedio de dos o más valores de M que no difieren en más de O, 15 calcular la potencia me-
dia de la preparación valorada.

REQUISITOS ADICIONALES
• ESTÁNDARES DE REFERENCIA USP (11)
ER Cianocobalamina USP

Pruebas y Valoraciones Químicas

PRUEBAS DE IDENTIFICACIÓN

(181) IDENTIFICACIÓN-BASES ORGÁNICAS NITROGENADAS

INTRODUCCIÓN
El propósito de esta prueba es identificar los compuestos de aminas terciarias. Esta prueba espectroscópica tiene un grado limi-
tado de especificidad y, por lo tanto, se debe cumplir con todas las pruebas de identificación adicionales listadas en una
monografía particular para asegurar la identidad de la muestra en análisis.

VALORACIÓN
• PROCEDIMIENTO
Solución estándar: Disolver en un separador 50 mg del Estándar de Referencia USP correspondiente en 25 ml de ácido
clorhídrico 0,01 N.
Solución muestra: Dependiendo de la naturaleza de la muestra, disolver 50 mg de la sustancia a granel en análisis en 25
ml de ácido clorhídrico 0,01 N, o agitar una cantidad de tabletas reducidas a polvo o el contenido de las cápsulas, equiva-
USP 40 Pruebas Químicas/ (191) Identificación-Pruebas Generales 267

lente a 50 mg de la sustancia, con 25 mL de ácido clorhídrico 0,01 N durante 1O minutos. Transferir el líquido a un separa-
dor, filtrando si fuera necesario y lavando el filtro y el residuo con varias porciones pequeñas de agua.
Condiciones instrumentales
(Ver Espectroscopía en el Infrarrojo Medio (854).)
Modo: IR
Intervalo de longitud de onda: 7-15 µm (1430 cm- 1 a 650 cm- 1)
Celda: 1 mm
Blanco: Disulfuro de carbono
Análisis
Muestras: Solución estándar y Solución muestra
Tratar cada solución según se indica a continuación: Agregar 2 mL de hidróxido de sodio 1 N y 4 mL de disulfuro de carbo-
no, y agitar durante 2 minutos. Si fuera necesario, centrifugar hasta que la fase inferior se torne transparente y pasarla a
través de un filtro seco, recogiendo el filtrado en un matraz pequeño con tapón de vidrio. Determinar inmediatamente el
espectro de absorción de la Solución estándar y la Solución muestra filtradas.
Criterios de aceptación: El espectro de la Solución muestra debe presentar todas las bandas de absorción significativas pre-
sentes en el espectro de la Solución estándar.

(191) IDENTIFICACIÓN-PRUEBAS GENERALES

(Este capítulo será oficial a partir del 7ºde mayo de 20 77).

INTRODUCCIÓN
En las monografías se hace referencia a los procedimientos contenidos en este capítulo para la identificación de artículos oficia-
les y sus componentes. Los ácidos, bases u otros reactivos usados en estos procedimientos no deben interferir con los resul-
tados. Los volúmenes pueden ajustarse proporcionalmente, a menos que se indique algo diferente. Todas las pruebas inclu-
yen cantidades aproximadas, excepto cuando se indique expresamente que se trata de cantidades específicas.
Las técnicas instrumentales descritas en este capítulo pueden usarse para reemplazar las pruebas químicas de identificación.
Estas técnicas instrumentales no son las únicas que se pueden usar, ya que otras técnicas, tales como la resonancia magnéti-
ca nuclear, electrodos para iones específicos e infrarrojo cercano, pueden usarse para reemplazar la prueba química de iden-
tificación siempre y cuando demuestren su aptitud y sean validadas.
A menos que se especifique algo diferente en la monografía, si se selecciona una prueba química de identificación para un ion,
deben llevarse a cabo todos los procedimientos de prueba químicos listados para el ion. Si se selecciona una prueba instru-
mental de identificación, entonces una sola técnica instrumental para el ion es suficiente.

PRUEBAS QUÍMICAS DE IDENTIFICACIÓN

Acetatos
• A. Disolver aproximadamente 30 mg de la sustancia a examinar en 3 mL de agua o usar 3 mL de la solución prescrita. Ajus-
tar el pH de la solución con hidróxido de sodio hasta alcalinizar ligeramente. Agregar 0,25 mL de solución reactivo de nitra-
to de lantano (SR). Si se forma un precipitado de color blanco, filtrar la solución. Agregar sucesivamente O, 1 mL de yodo y
yoduro de potasio SR 3yO,1 mL de amoníaco SR 2 a la solución. Si no se observa un color azul, calentar cuidadosamente
hasta ebullición. En presencia de acetatos, se desarrolla un color oscuro o se forma un precipitado de color azul.
• B. Con soluciones neutras de acetatos, el cloruro férrico SR produce un color rojo que se elimina con la adición de ácidos
minerales.
Aluminio
• A. Al usar hidróxido de amonio 6 N, las soluciones de sales de aluminio producen un precipitado gelatinoso de color blanco
que es insoluble en un exceso de hidróxido de amonio 6 N.
• B. El hidróxido de sodio 1 N o el sulfuro de sodio SR con soluciones de sales de aluminio produce un precipitado similar
gelatinoso de color blanco, que se disuelve en un exceso de cualquiera de los mismos reactivos.
Amonio
• A. Agregar 0,2 g de óxido de magnesio a la solución en análisis. Pasar una corriente de aire a través de la mezcla y dirigir el
gas que escapa apenas por debajo de la superficie de la solución indicadora, previamente preparada mezclando 1 mL de
ácido clorhídrico O, 1 M y 0,05 mL de rojo de metilo SR 2. En presencia de amonio, el color de la solución indicadora cambia
a amarillo. Después de dirigir el gas hacia el interior de la solución indicadora durante un periodo suficiente, agregar a la
solución indicadora 1 mL de cobaltinitrito de sodio SR recientemente preparado. Con la adición de cobaltinitrito de sodio
SR, se forma un precipitado de color amarillo en presencia de amonio.
Antimonio
• A. Con sulfuro de hidrógeno, las soluciones de compuestos de antimonio (111), fuertemente acidificadas con ácido clorhídri-
co, producen un precipitado de sulfuro de antimonio de color anaranjado que es insoluble en hidróxido de amonio 6 N,
pero que es soluble en sulfuro de amonio SR.
268 (191) Identificación-Pruebas Generales / Pruebas Químicas USP 40

Bario
• A. Las soluciones de sales de bario producen un precipitado de color blanco con la adición de ácido sulfúrico 2 N. Este preci-
pitado es insoluble en ácido clorhídrico y en ácido nítrico.
Benzoatos
• A. En soluciones neutras, los benzoatos producen un precipitado de color salmón con cloruro férrico SR.
• B. En soluciones moderadamente concentradas, los benzoatos producen un precipitado de ácido benzoico al acidificarse
cuando se agrega ácido sulfúrico 2 N. Este precipitado es fácilmente soluble en éter etílico.
Bicarbonatos
• A. Los bicarbonatos son efervescentes en ácidos y liberan un gas incoloro que, cuando se hace pasar por hidróxido de calcio
SR, produce inmediatamente un precipitado de color blanco.
• B. Una solución fría (1 :20) de un bicarbonato soluble o la solución prescrita en la monografía específica no presenta cambios
o presenta únicamente una coloración leve con fenolftaleína SR.
Bismuto
• A. Cuando se disuelven en un ligero exceso de ácido nítrico o ácido clorhídrico, las sales de bismuto producen un precipita-
do de color blanco al diluirlas con agua. Este precipitado se torna de color marrón en presencia de sulfuro de hidrógeno y el
compuesto resultante se disuelve en una mezcla tibia de partes iguales de ácido nítrico y agua.
Bisulfitos
Ver Sulfitos.
Boratos
• A. A 1 mL de una solución de borato acidificada con ácido clorhídrico, agregar 3 ó 4 gotas de yodo SR y 3 ó 4 gotas de
solución de alcohol polivinílico (1 :50): se produce un color azul intenso.
Bromuros
• A. Las soluciones de bromuros, con la adición de cloro SR gota a gota, liberan bromo que se disuelve en cloroformo por
agitación y colorean el cloroformo de un color rojo a marrón rojizo.
• B. El nitrato de plata SR, en soluciones de bromuro, produce un precipitado de color blanco amarillento que es insoluble en
ácido nítrico y poco soluble cuando se agrega hidróxido de amonio 6 N.
Calcio
• A. Las soluciones de sales de calcio forman oxalatos insolubles cuando se tratan de la siguiente manera. Agregar a una solu-
ción de sal de calcio (1 :20) o a la solución prescrita en la monografía específica 2 gotas de rojo de metilo SR y neutralizar con
hidróxido de amonio 6 N. Agregar ácido clorhídrico 3 N, gota a gota, hasta que la solución sea ácida frente al indicador. Se
forma un precipitado de color blanco con la adición de oxalato de amonio SR. Este precipitado es insoluble cuando se agre-
ga ácido acético 6 N pero se disuelve en ácido clorhídrico.
Carbonatos
• A. Los carbonatos son efervescentes en ácidos y liberan un gas incoloro que, cuando se hace pasar por hidróxido de calcio
SR, produce inmediatamente un precipitado de color blanco.
• B. Una solución fría (1 :20) de un carbonato soluble o la solución prescrita en la monografía específica se torna de color rojo
con fenolftaleína SR, mientras que una solución similar de un bicarbonato no presenta cambios o presenta únicamente una
coloración leve.
Cloratos
• A. Las soluciones de cloratos no producen un precipitado con nitrato de plata SR. La adición de ácido sulfuroso a esta mezcla
produce un precipitado de color blanco que es insoluble en ácido nítrico, pero que es soluble en hidróxido de amonio 6 N.
• B. Al incinerarlos, los cloratos producen cloruros que se identifican mediante las pruebas correspondientes.
• C. Cuando se agrega ácido sulfúrico a un clorato seco, éste crepita y libera un gas amarillo verdoso. [PRECAUCIÓN-Usar solo
una pequeña cantidad de clorato para esta prueba y extremar las precauciones al realizarla.]
Cloruros
• A. Con nitrato de plata SR, las soluciones de cloruros producen un precipitado grumoso de color blanco, que es insoluble en
ácido nítrico pero soluble en un ligero exceso de hidróxido de amonio 6 N.
• B. Cuando se analizan clorhidratos de amina (incluidos los alcaloides) que no responden a la prueba anterior, agregar 1 gota
de ácido nítrico diluido y 0,5 mL de nitrato de plata SR a una solución de la sustancia que se está examinando que conten-
ga, a menos que se indique algo distinto en la monografía, aproximadamente 2 mg de ion cloruro en 2 mL: se forma un
precipitado grumoso de color blanco. Centrifugar la mezcla sin demora y decantar la capa sobrenadante. Lavar el precipita-
do con tres porciones de 1 mL de solución de ácido nítrico (1:100) y desechar los lavados. Agregar amoníaco SR, gota a
gota, a este precipitado. Se disuelve rápidamente.
• C. Cuando una monografía especifica que un artículo responde a la prueba de cloruros secos, mezclar el sólido que se va a
analizar con un peso igual de dióxido de manganeso, humedecer con ácido sulfúrico y calentar moderadamente la mezcla:
se produce cloro, que es reconocible por la producción de un color azul con papel de yoduro-almidón humedecido.
Citratos
• A. Agregar a 15 mL de piridina una solución o suspensión de unos pocos mg de sal de citrato en 1 mL de agua o la solución
prescrita en la monografía específica y agitar. Agregar 5 mL de anhídrido acético a esta mezcla y agitar: se produce un color
rojo claro.
USP 40 Pruebas Químicas / (191) Identificación-Pruebas Generales 269

Cobalto
• A. Las soluciones de sales de cobalto (1 :20) en ácido clorhídrico 3 N o la solución prescrita en la monografía específica pro-
ducen un precipitado de color rojo cuando se calientan en un baño de vapor con un volumen igual de una solución calien-
te, recientemente preparada de 1-nitroso-2-
naftol (1 :1 O) en ácido acético 9 N.
• B. Las soluciones de sales de cobalto, cuando se saturan con cloruro de potasio y se tratan con nitrito de potasio y ácido
acético, producen un precipitado de color amarillo.
Cobre
• A. Los compuestos cúpricos, acidificados con ácido clorhídrico, depositan una película roja de cobre metálico sobre una su-
perficie de hierro metálico brillante y no oxidada.
• B. Un exceso de hidróxido de amonio 6 N, agregado a una solución de una sal cúprica, produce al principio un precipitado
azulado y posteriormente una solución de color azul intenso.
• C. Las soluciones de sales cúpricas producen, con ferrocianuro de potasio SR, un precipitado de color marrón rojizo insoluble
en ácidos diluidos.
Hipofosfitos
• A. Los hipofosfitos en solución producen un precipitado de color blanco con cloruro mercúrico SR. Este precipitado se torna
gris ante la presencia de un exceso de hipofosfito.
• B. Las soluciones de hipofosfitos, acidificadas con ácido sulfúrico y con sulfato cúprico SR, calentadas, producen un precipita-
do de color rojo.
Yoduros
• A. Las soluciones de yoduros, con la adición de cloro SR gota a gota, liberan yodo que colorea la solución de amarillo a rojo.
Si la solución se agita con cloroformo, esta se torna de color violeta. El yodo así liberado produce un color azul con almidón
SR.
• B. El nitrato de plata SR produce, en soluciones de yoduros, un precipitado grumoso de color amarillo, que es insoluble en
ácido nítrico y en hidróxido de amonio 6 N.
Hierro
• A. Los compuestos ferrosos y férricos en solución producen un precipitado de color negro con sulfuro de amonio SR. Este
precipitado se disuelve en ácido clorhídrico 3 N frío y libera sulfuro de hidrógeno.
Sales férricas
• A. Las soluciones ácidas de sales férricas producen un precipitado de color azul oscuro con ferrocianuro de potasio SR.
• B. Al agregar a las soluciones de sales férricas un exceso de hidróxido de sodio 1 N, se produce un precipitado de color
marrón rojizo.
• C. Las soluciones de sales férricas con tiocianato de amonio SR producen un color rojo intenso que no se elimina al agre-
gar ácidos minerales diluidos.
Sales ferrosas
• A. Las soluciones de sales ferrosas con ferricianuro de potasio SR producen un precipitado de color azul oscuro. Este preci-
pitado es insoluble en ácido clorhídrico 3 N pero se descompone con hidróxido de sodio 1 N.
• B. Las soluciones de sales ferrosas con hidróxido de sodio 1 N producen un precipitado de color blanco verdoso que,
cuando se agita cambia rápidamente de color a verde y luego a marrón.
Lactatos
• A. Cuando las soluciones de lactatos se acidifican con ácido sulfúrico, se agrega permanganato de potasio SR, se calienta la
mezcla y se libera acetaldehído. El acetaldehído se puede detectar al permitir que los vapores entren en contacto con un
papel de filtro humedecido con una mezcla recientemente preparada de volúmenes iguales de solución acuosa de morfolina
al 20% y nitroferricianuro de sodio SR: se produce un color azul.
Plomo
• A. Las soluciones de sales de plomo con ácido sulfúrico 2 N producen un precipitado de color blanco insoluble en ácido
clorhídrico 3 N o ácido nítrico 2 N, pero soluble en hidróxido de sodio 1 N tibio y acetato de amonio SR.
• B. Las soluciones de sales de plomo, exentas o casi exentas de ácidos minerales, con cromato de potasio SR, producen un
precipitado de color amarillo insoluble en ácido acético 6 N pero soluble en hidróxido de sodio 1 N.
Litio
• A. Con carbonato de sodio SR las soluciones de sales de litio, moderadamente concentradas y alcalinizadas con hidróxido de
sodio, producen un precipitado de color blanco al llevarlas a ebullición. El precipitado es soluble en cloruro de amonio SR.
• B. Las soluciones de sales de litio no precipitan en ácido sulfúrico 2 N o sulfatos solubles (a diferencia de estroncio).
Magnesio
• A. Las soluciones de sales de magnesio en presencia de cloruro de amonio, producen solamente un precipitado ligeramente
turbio cuando se neutralizan con carbonato de amonio SR, pero con la adición posterior de fosfato dibásico de sodio SR,
forman un precipitado cristalino de color blanco insoluble en hidróxido de amonio 6 N.
Manganeso
• A. Las soluciones de sales manganosas con sulfuro de amonio SR, producen un precipitado de color salmón que se disuelve
en ácido acético.
270 (191) Identificación-Pruebas Generales/ Pruebas Químicas USP 40

Mercurio
• A. Cuando se aplican sobre una lámina de cobre brillante, las soluciones de sales de mercurio, exentas de un exceso de
ácido nítrico, producen un precipitado que, al frotarlo, adquiere una apariencia plateada y brillante.
• B. Las soluciones de compuestos de mercurio con sulfuro de hidrógeno, producen un precipitado de color negro insoluble
en sulfuro de amonio SR y en ácido nítrico 2 N en ebullición.
Sales mercúricas
• A. Las soluciones de sales mercúricas con hidróxido de sodio 1 N, producen un precipitado de color amarillo.
• B. Las soluciones de sales mercúricas, en soluciones neutras con yoduro de potasio SR, producen un precipitado de color
escarlata que es muy soluble en un exceso del reactivo.
Sales mercuriosas
• A. Los compuestos mercuriosos se descomponen en hidróxido de sodio 1 N y producen un color negro.
• B. Las soluciones de sales mercuriosas con ácido clorhídrico, producen un precipitado de color blanco que se ennegrece
con la adición de hidróxido de amonio 6 N.
• C. Con yoduro de potasio SR se forma un precipitado de color amarillo que en reposo puede tornarse verde.
Nitratos
• A. Cuando una solución de un nitrato se mezcla con un volumen igual de ácido sulfúrico, se enfría la mezcla y se superpone
una solución de sulfato ferroso; se desarrolla un color marrón en la unión de los dos líquidos.
• B. Cuando se calienta un nitrato con ácido sulfúrico y cobre metálico, se liberan humos de color rojo amarronado.
• C. Los nitratos no decoloran el permanganato de potasio SR acidificado (a diferencia de los nitritos).
Nitritos
• A. Cuando se tratan con ácidos minerales diluidos o con ácido acético 6 N, los nitritos liberan humos de color rojo amarro-
nado. La solución colorea el papel de almidón-yoduro de azul.
Oxalatos
• A. Las soluciones neutras y alcalinas de oxalatos producen un precipitado de color blanco con cloruro de calcio SR. Este pre-
cipitado es insoluble en ácido acético 6 N pero se disuelve con ácido clorhídrico.
• B. Las soluciones de oxalatos acidificadas y calientes decoloran el permanganato de potasio SR.
Permanganatos
• A. Las soluciones de permanganatos acidificadas con ácido sulfúrico se decoloran en frío con peróxido de hidrógeno SR y
con bisulfito de sodio SR, y con ácido oxálico SR en una solución caliente.
Peróxidos
• A. Las soluciones de peróxidos acidificadas ligeramente con ácido sulfúrico, producen un color azul intenso con la adición de
dicromato de potasio SR. Cuando la mezcla se agita con un volumen igual de éter etílico y se deja que los líquidos se sepa-
ren, el color azul se encuentra en la capa de éter etílico.
Fosfatos
[NOTA-Cuando la monografía especifica la prueba de identificación de Fosfatos, usar las pruebas de ortofosfatos, a menos que
las instrucciones especifiquen que se deben usar las pruebas de pirofosfatos o que se debe incinerar el producto antes de
realizar la prueba.]
Ortofosfatos
• A. Las soluciones neutras de ortofosfatos con nitrato de plata SR producen un precipitado de color amarillo soluble en
ácido nítrico 2 N y en hidróxido de amonio 6 N.
• B. Las soluciones acidificadas de ortofosfatos con molibdato de amonio SR producen un precipitado de color amarillo so-
luble en hidróxido de amonio 6 N. Este precipitado puede tardar en formarse.
Pirofosfatos
• A. Con nitrato de plata SR, los pirofosfatos obtenidos por incineración producen un precipitado de color blanco soluble
en ácido nítrico 2 N y en hidróxido de amonio 6 N.
• B. Con molibdato de amonio SR, los pirofosfatos obtenidos por incineración producen un precipitado de color amarillo
soluble en hidróxido de amonio 6 N.
Potasio
• A. En soluciones neutras, concentradas o moderadamente concentradas, de sales de potasio (dependiendo de la solubilidad
y del contenido de potasio), el bitartrato de sodio SR produce un precipitado cristalino de color blanco soluble en hidróxido
de amonio 6 N y en soluciones de hidróxidos alcalinos y carbonatos alcalinos. La formación del precipitado, que usualmente
es lenta, se acelera al mezclar o frotar el interior del tubo de ensayo con una varilla de vidrio. La adición de una pequeña
cantidad de ácido acético glacial o alcohol también favorece la precipitación.
Salicilatos
• A. En soluciones moderadamente concentradas de salicilatos, el cloruro férrico SR produce un color violeta.
• B. La adición de ácidos a soluciones moderadamente concentradas de salicilatos produce un precipitado cristalino de color
blanco de ácido salicílico, que funde entre 158º y 161 º.
Plata
• A. Las soluciones de sales de plata con ácido clorhídrico producen un precipitado grumoso de color blanco, que es insoluble
en ácido nítrico pero fácilmente soluble en hidróxido de amonio 6 N.
USP 40 Pruebas Químicas/ (191) Identificación-Pruebas Generales 271

• B. Una solución de una sal de plata a la que se agrega hidróxido de amonio 6 N y una pequeña cantidad de formaldehído
SR, deposita, al entibiarla, un espejo de plata metálica en las paredes del recipiente.
Sodio
• A. A menos que se especifique algo diferente en una monografía individual, preparar una solución que contenga O, l g del
compuesto de sodio en 2 mL de agua. Agregar 2 mL de carbonato de potasio al 15% y calentar hasta ebullición. No se
forma precipitado. Agregar 4 mL de piroantimoniato de potasio SR y calentar hasta ebullición. Dejar que se enfríe en agua
helada y, si fuera necesario, frotar el interior del tubo de ensayo con una varilla de vidrio. Se forma un precipitado denso.
Sulfatos
• A. Las soluciones de sulfatos con cloruro de bario SR, producen un precipitado de color blanco insoluble en ácido clorhídrico
y en ácido nítrico.
• B. Las soluciones neutras de sulfatos con acetato de plomo SR, producen un precipitado de color blanco soluble en acetato
de amonio SR.
• C. El ácido clorhídrico no produce precipitado cuando se agrega a las soluciones de sulfatos (a diferencia de los tiosulfatos).
Sulfitos
• A. Cuando se tratan con ácido clorhídrico 3 N, los sulfitos y bisulfitos desprenden dióxido de azufre que ennegrece el papel
de filtro humedecido con nitrato mercurioso SR.
Tartratos
• A. Disolver algunos mg de sal de tartrato en 2 gotas de solución de metaperyodato de sodio (1 :20). Agregar 1 gota de ácido
sulfúrico 1 N y después de 5 minutos, agregar algunas gotas de ácido sulfuroso, seguido de algunas gotas de fucsina-ácido
sulfuroso SR: se produce un color rosado rojizo dentro de los 15 minutos.
Ti ocia natos
• A. Las soluciones de tiocianatos con cloruro férrico SR, producen un color rojo que no se elimina con ácidos minerales mo-
deradamente concentrados.
Tiosulfatos
• A. Las soluciones de tiosulfatos con ácido clorhídrico, producen un precipitado de color blanco que se torna amarillo rápida-
mente; con la adición de dióxido de azufre el papel de filtro humedecido con nitrato mercurioso SR ennegrece.
• B. La adición de cloruro férrico SR a las soluciones de tiosulfatos, produce un color violeta oscuro que desaparece rápida-
mente.
Cinc
• A. En presencia de acetato de sodio, las soluciones de sales de cinc producen un precipitado de color blanco con sulfuro de
hidrógeno. Este precipitado es insoluble en ácido acético pero se disuelve con ácido clorhídrico 3 N.
• B. El sulfuro de amonio SR produce un precipitado similar en soluciones neutras y alcalinas.
• C. Las sales de cinc en solución con ferrocianuro de potasio SR, producen un precipitado de color blanco insoluble en ácido
clorhídrico 3 N.

PRUEBAS INSTRUMENTALES DE IDENTIFICACIÓN

Las técnicas instrumentales descritas en esta sección pueden usarse para reemplazar los procedimientos descritos en Pruebas
Químicas de Identificación. Las técnicas instrumentales proveen flexibilidad en la elección de las pruebas de identificación. To-
das las técnicas instrumentales deben seguir los procedimientos de validación de métodos para las pruebas de identificación
(ver Validación de Procedimientos Farmacopeicos (1225), Validación, Datos Requeridos para Ja Validación, Categoría IV). Las Prue-
bas Instrumentales de Identificación deben demostrar especificidad. Asimismo, pueden usarse otras técnicas instrumentales
adecuadas validadas.
La selección de la preparación apropiada de la muestra depende del material que se está analizando y debe ser apropiada para
la técnica usada. Se puede usar cualquiera de los siguientes procedimientos de preparación con la verificación apropiada. Se
puede usar un espectro de la biblioteca electrónica del Estándar de Referencia para comparar la muestra de prueba siempre
que se mantenga la especificidad adecuada. Cuando se usan disolventes, estos debe estar exentos de especies interferentes.
Usar Estándares de Referencia USP cuando se encuentren disponibles (ver Advertencias Generales, 5.80 Estándares de Referen-
cia USP).
• IDENTIFICACIÓN POR ESPECTROMETRÍA DE FLUORESCENCIA DE RAYOS X
La espectrometría de fluorescencia de rayos X (XRF, por sus siglas en inglés) puede usarse generalmente para identificar
elementos con números atómicos desde el magnesio hasta el uranio. El intervalo real de elementos para los cuales el ins-
trumento tiene capacidad depende del diseño del mismo. Pueden encontrarse pautas con respecto al uso de la XRF en
Espectrometría de Fluorescencia de Rayos X (735).
Preparación de la muestra
Polvos/sólidos: Los polvos o sólidos pueden usarse sin manipulación adicional o el material puede comprimirse en forma
de pellets, según se describe en el capítulo (735).
Líquidos sin diluir: Los líquidos pueden usarse sin manipulación adicional, siempre que el líquido conste de una sola fase,
sea compatible con el portamuestras y su volatilidad sea suficientemente baja.
Muestras en solución: Las muestras pueden disolverse en un disolvente apropiado.
272 (191) Identificación-Pruebas Generales / Pruebas Químicas USP 40

Procedimiento
Blanco: Para Polvos/sólidos y Líquidos sin diluir, preparar un portamuestras blanco. Para las Muestras en solución, usar el
disolvente como blanco.
Estándar de referencia y Muestra: Preparar cada Estándar de referencia y Muestra usando suficiente material, según se
requiera para la instrumentación del fabricante específico.
Análisis: Analizar el Blanco, el Estándar de referencia y la Muestra, según las sugerencias del fabricante para el instrumento
específico. Si se presenta alguna interferencia, usar el Blanco para realizar la corrección. El espectro del Estándar de referencia
presenta la radiación característica de los elementos que se están investigando. Las bandas de energía de la Muestra pre-
sentan la radiación característica de los elementos que se están investigando y se compara cualitativamente con la del Es-
tándar de referencia.
• IDENTIFICACIÓN POR TÉCNICAS DE ESPECTROSCOPÍA ATÓMICA: ESPECTROSCOPÍA DE ABSORCIÓN ATÓMICA, ESPECTROSCOPÍA DE
EMISIÓN ÓPTICA DE PLASMA INDUCTIVAMENTE ACOPLADO, ESPECTROMETRÍA DE MASAS DE PLASMA INDUCTIVAMENTE
ACOPLADO
Las técnicas de espectroscopía de absorción atómica (AA) pueden usarse para la identificación de muchos elementos. Pue-
den encontrarse pautas con respecto al uso de la espectroscopía de AA en Espectroscopía de Absorción Atómica (852). Pue-
den encontrarse pautas con respecto al uso de la espectroscopía de emisión óptica de plasma inductivamente acoplado
(ICP-OES, por sus siglas en inglés) o la espectrometría de masas de plasma inductivamente acoplado (ICP-MS, por sus
siglas en inglés) en Espectroquímica de Plasma (730).
Preparación de la muestra: Las muestras deben disolverse en un disolvente apropiado. Si no es posible disolver la muestra
puede ser necesaria su digestión.
Procedimiento
Blanco: Preparar una solución apropiada que no contenga los analitos de interés y que sea compatible con la técnica usa-
da.
Solución estándar: Los estándares deben contener el analito de interés. De ser posible, se deben igualar las matrices de
todas las soluciones.
Solución muestra: Preparar la muestra en el mismo disolvente que el estándar.
Análisis: Analizar el Blanco, la Solución estándar y la Solución muestra, según las sugerencias del fabricante para el instru-
mento específico. Cuando se usa una técnica basada en longitudes de onda seleccionar, de ser posible, por lo menos dos
longitudes de onda características de los analitos de interés. Cuando se usa una técnica basada en masa seleccionar, de ser
posible, por lo menos dos isótopos característicos de los analitos de interés. Si no se dispone de dos isótopos, o si el ele-
mento es monoisotópico, puede ser posible monitorear el óxido del analito (m + 16), si se forma uno. Si no se forma un
óxido, o si no se pueden evaluar múltiples isótopos debido a interferencias o a un número limitado de isótopos, puede ser
necesario usar una técnica diferente. Si existen elementos interferentes en la solución muestra, las longitudes de onda o
masas examinadas deben seleccionarse de manera que los analitos de interés se puedan identificar inequívocamente.
• IDENTIFICACIÓN POR CROMATOGRAFÍA IÓNICA
La cromatografía iónica (IC, por sus siglas en inglés) puede usarse para identificar un numero de aniones y cationes que se
encuentran en fármacos (para información adicional, ver Cromatografía Jónica (1065)).
Aparato: La detección de analitos usará generalmente conductividad con supresión, aunque se pueden usar otros méto-
dos de detección dependiendo del analito (ver (1065)). La columna de intercambio iónico debe tener la capacidad de se-
parar el analito de cualquier otro ion con la misma carga, que se sepa que está presente en la muestra, a una concentra-
ción de 25% de la concentración del analito.
Procedimiento
Blanco: Usar el disolvente de la muestra como un blanco.
Estándar y Soluciones muestra: Disolver o diluir la muestra en agua. Se pueden usar otros disolventes si son compatibles
con la columna para IC.
Análisis: Analizar un volumen igual del Blanco, el Estándar de Referencia y la muestra (según las sugerencias del fabricante
para el instrumento específico y las dimensiones de la columna). El contraión se identifica si un pico de la muestra tiene el
mismo tiempo de retención que el pico del Estándar de Referencia y no se presenta un pico de 25% de su tamaño en el
mismo tiempo de retención en el Blanco.
•IDENTIFICACIÓN POR OTRAS TÉCNICAS DE CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS EN CROMATOGRAFÍA (621)
Algunos de los iones adecuados para la identificación por IC pueden también identificarse mediante otras formas de croma-
tografía de líquidos. Las concentraciones de la Muestra y el Estándar de Referencia, así como los volúmenes de inyección,
deben ajustarse dependiendo de la técnica de detección usada. Todos los componentes con altas concentraciones en la
sustancia de prueba deben analizarse para determinar si existe interferencia con el analito de interés.
• IDENTIFICACIÓN POR ESPECTROSCOPÍA RAMAN
La espectroscopía Raman puede usarse para identificar contraiones. Pueden encontrarse pautas con respecto al uso de la
espectroscopía Raman en Espectroscopía Raman (11 20).
Aparato: Preparar el espectrómetro según el manual de instrucciones del instrumento y las recomendaciones del fabrican-
te del mismo. Una verificación del desempeño del instrumento y la calidad de los espectros recolectados debe evaluarse en
el momento de uso o siguiendo las instrucciones del fabricante.
USP 40 Pruebas Químicas/ (191) Identificación-Pruebas Generales 273

Procedimiento
Estándar de referencia y Muestra: Todos los espectros del material de referencia y de la muestra deben recolectarse
usando parámetros instrumentales idénticos. Se pueden determinar estos parámetros instrumentales basándose en la na-
turaleza de la muestra y el tipo de análisis, y se deben seleccionar de acuerdo con la calidad de espectros que se requiere.
Usar el recipiente de muestra y/o el aparato portamuestras apropiado, según el tipo de material de referencia y la muestra
(polvo, líquido, pasta, película u otro) que se está analizando. Transferir la muestra o el material de referencia al recipiente
y/o al portamuestras apropiado, según sea necesario, y obtener el espectro de cada uno.
Análisis: Comparar cualitativamente los espectros Raman obtenidos del material de referencia y la Muestra. La Muestra
cumple con la prueba de identificación si el espectro presenta máximos solo a las misma longitudes de onda que el de una
preparación similar del Estándar de Referencia USP correspondiente, cuando se encuentre disponible.
• IDENTIFICACIÓN POR ESPECTROSCOPÍA EN EL INFRARROJO MEDIO
Las técnicas de espectroscopía en el infrarrojo medio pueden usarse para identificar contraiones. Pueden encontrarse pautas
con respecto al uso de la espectroscopía en el infrarrojo medio en Espectroscopía en el Infrarrojo Medio (854) y Pruebas de
Identificación Espectrofotométrica (197). Si la monografía contiene una prueba de identificación por radiación infrarroja (IR,
por sus siglas en inglés) (p.ej.,(197)) y una referencia al capítulo (191 ), el infrarrojo medio no puede usarse como reempla-
zo instrumental de las pruebas químicas de identificación prescritas en este capítulo.
Procedimiento
Estándar y Soluciones muestra: La preparación de la muestra puede llevarse a cabo usando cualquiera de los procedi-
mientos descritos en el capítulo (854) que sean apropiados para la muestra de interés. La preparación del estándar debe
llevarse a cabo de la misma manera pero usando el Estándar de Referencia USP de la sustancia que se está analizando,
cuando se encuentre disponible.
Análisis: Registrar los espectros de la muestra de prueba y el Estándar de Referencia correspondiente en el intervalo de
aproximadamente 3800 a 650 cm- 1 (2,6-15 µm). El espectro de absorción IR de la preparación de la muestra de prueba,
previamente secada en las condiciones especificadas para el Estándar de Referencia correspondiente, a menos que el Están-
dar de Referencia se deba usar sin secar, presenta máximos solo a las mismas longitudes de onda que el de una prepara-
ción similar de Estándar de Referencia USP correspondiente, cuando se encuentre disponible.

(191) IDENTIFICACIÓN-PRUEBAS GENERALES

(Este capítulo será oficial hasta el 30 de abril de 2017)

Bajo este encabezado se describen las pruebas que se mencionan con frecuencia para identificar los artículos oficiales en la
Farmacopea. Antes de usar cualquier ácido o base para modificar el pH de la solución muestra, asegurarse de que la sustancia
agregada no interferirá con los resultados de la prueba. [NOTA-Estas pruebas no están destinadas a mezclas de sustancias, a
menos que se indique específicamente.]
Acetatos-Disolver aproximadamente 30 mg de la sustancia a examinar en 3 mL de agua o usar 3 mL de la solución pres-
crita. Ajustar el pH de la solución con hidróxido de sodio hasta alcalinizar levemente. Agregar 0,25 mL de nitrato de lantano
SR. Si se produce un precipitado blanco, filtrar la solución. Agregar sucesivamente O, l mL de yodo y yoduro de potasio SR 3 y
0, 1 mL de amoníaco SR 2 a la solución. Si no se observa un color azul, calentar cuidadosamente hasta ebullición. En presencia
de acetatos, se desarrolla un color oscuro o se produce un precipitado azul. Con soluciones neutras de acetatos, el cloruro
férrico SR produce un color rojo que se elimina con la adición de ácidos minerales.
Aluminio-Con hidróxido de amonio 6 N, las soluciones de sales de aluminio producen un precipitado blanco gelatinoso
que es insoluble en un exceso de hidróxido de amonio 6 N. El hidróxido de sodio 1 N o el sulfuro de sodio SR producen el
mismo precipitado, que se disuelve en un exceso de cualquiera de los reactivos mencionados.
Amonio-Agregar 0,2 g de óxido de magnesio a la solución en análisis. Pasar una corriente de aire a través de la mezcla y
dirigir el gas que escapa apenas por debajo de la superficie de una solución indicadora, preparada mezclando 1 mL de ácido
clorhídrico 0, 1 M y 0,05 mL de rojo de metilo SR 2. En presencia de amonio, el color de la solución indicadora cambia a amari-
llo. Después de dirigir el gas hacia el interior de la solución indicadora durante un periodo suficiente, agregar a la solución
indicadora 1 mL de cobaltinitrito de sodio SR preparado recientemente. Con la adición de cobaltinitrito de sodio SR se produ-
ce un precipitado amarillo en presencia de amonio.
Antimonio-Con el sulfuro de hidrógeno, las soluciones de compuestos de antimonio (111) fuertemente acidificadas con áci-
do clorhídrico producen un precipitado de sulfuro de antimonio de color anaranjado que es insoluble en hidróxido de amonio
6 N, pero que es soluble en sulfuro de amonio SR.
Bario-Las soluciones de sales de bario forman un precipitado blanco con ácido sulfúrico 2 N. Este precipitado es insoluble
en ácido clorhídrico y en ácido nítrico. Las sales de bario confieren un color verde amarillento a una llama no luminosa, que
parece de color azul cuando se la mira a través de un vidrio verde.
274 (191) Identificación-Pruebas Generales/ Pruebas Químicas USP 40

Benzoato-En soluciones neutras, los benzoatos forman un precipitado de color salmón con cloruro férrico SR. En solucio-
nes moderadamente concentradas, los benzoatos producen un precipitado de ácido benzoico al acidificarse con ácido sulfúri-
co 2 N. Este precipitado es fácilmente soluble en éter etílico.
Bicarbonato-Ver Carbonatos.
Bismutos-Cuando se disuelven en un ligero exceso de ácido nítrico o ácido clorhídrico, las sales de bismuto proporcionan
un precipitado blanco al diluirse con agua. Este precipitado se torna de color marrón en presencia de sulfuro de hidrógeno y el
compuesto resultante se disuelve en una mezcla tibia de partes iguales de ácido nítrico y agua.
Bisulfitos-Ver Sulfitos.
Boratos-Agregar 3 ó 4 gotas de yodo SR y 3 ó 4 gotas de solución de alcohol polivinílico (1 in 50) a 1 mL de una solución
de borato, acidificada con ácido clorhídrico al tornasol: se produce un color azul intenso. Cuando a un borato se le trata con
ácido sulfúrico, se le agrega metano! y se incinera la mezcla, arde con una llama de borde verde.
Bromuros-Las soluciones de bromuros, con la adición gota a gota de cloro SR, liberan bromo que se disuelve en clorofor-
mo por agitación y colorean el cloroformo de un color rojo a marrón rojizo. El nitrato de plata SR en soluciones de bromuro
produce un precipitado blanco-amarillento que es insoluble en ácido nítrico y poco soluble en hidróxido de amonio 6 N.
Calcio-Las soluciones de sales de calcio forman oxalatos insolubles cuando se tratan de la siguiente manera. Agregar
2 gotas de rojo de metilo SR a una solución de sal de calcio (1 en 20) y neutralizar con hidróxido de amonio 6 N. Agregar,
gota a gota, ácido clorhídrico 3 N hasta que la solución sea ácida frente al indicador. Las soluciones de sales de calcio forman
un precipitado blanco al agregar oxalato de amonio SR. Este precipitado es insoluble en ácido acético 6 N pero se disuelve en
ácido clorhídrico. Las sales de calcio humedecidas con ácido clorhídrico proporcionan un color rojo amarillento transitorio a
una llama no luminosa.
Carbonatos-Los carbonatos y bicarbonatos son efervescentes en ácidos, y desprenden un gas incoloro que, cuando se ha-
ce pasar por hidróxido de calcio SR, produce inmediatamente un precipitado de color blanco. Una solución fría (1 en 20) de
un carbonato soluble se colorea de rojo con fenolftaleína SR, mientras que una solución similar de bicarbonato no se modifica
o sólo se colorea ligeramente.
Cinc-En presencia de acetato de sodio, las soluciones de sales de cinc forman un precipitado blanco con sulfuro de hidró-
geno. Este precipitado es insoluble en ácido acético, pero se disuelve con ácido clorhídrico 3 N. El sulfuro de amonio SR produ-
ce un precipitado similar en soluciones neutras y alcalinas. Con ferrocianuro de potasio SR, las sales de cinc en solución forman
un precipitado blanco que es insoluble en ácido clorhídrico 3 N.
Citratos-Agregar algunos mg de sal de citrato disueltos o suspendidos en 1 mL de agua, a 15 mL de piridina, y agitar.
Agregar 5 mL de anhídrido acético a esta mezcla y agitar: se produce un color rojo claro.
Cloratos-Las soluciones de cloratos no producen un precipitado con nitrato de plata SR. La adición de ácido sulfuroso a
esta mezcla produce un precipitado blanco que es insoluble en ácido nítrico, pero que es soluble en hidróxido de amonio 6 N.
Al incinerarlos, los cloratos producen cloruros que se identifican mediante las pruebas correspondientes. Cuando se agrega áci-
do sulfúrico a un clorato seco, éste crepita y desprende un gas amarillo verdoso. [Precaución-Emplear sólo una pequeña canti-
dad de clorato para esta prueba y extremar las precauciones para realizarla.]
Cloruros-Con nitrato de plata SR, las soluciones de cloruros producen un precipitado blanco, grumoso, que es insoluble
en ácido nítrico pero soluble en un ligero exceso de hidróxido de amonio 6 N. Cuando se analizan clorhidratos de aminas (in-
cluidos los alcaloides) que no responden a la prueba anterior, agregar una gota de ácido nítrico diluido y 0,5 mL de nitrato de
plata SR a una solución de la sustancia que está siendo examinada que contenga, a menos que se indique algo diferente en la
monografía, aproximadamente 2 mg de ión cloruro en 2 mL: se forma un precipitado blanco, grumoso. Centrifugar la mezcla
sin demora y decantar la capa sobrenadante. Lavar el precipitado con tres porciones de 1 mL de solución de ácido nítrico (1 en
100) y desechar los lavados. Agregar. amoníaco SR gota a gota a este precipitado. Se disuelve rápidamente. Cuando una mo-
nografía especifica que un artículo responde a la prueba para cloruros secos, mezclar el sólido que se va a analizar con un peso
igual de dióxido de manganeso, humedecer con ácido sulfúrico y calentar moderadamente la mezcla: se produce cloro, que es
reconocible por la producción de un color azul con papel de yoduro-almidón humedecido.
Cobalto-Las soluciones de sales de cobalto (1 en 20) en ácido clorhídrico 3 N producen un precipitado rojo cuando la
mezcla se calienta en un baño de vapor, con un volumen igual de una solución caliente, recién preparada, de 1-nitroso-2-
-naftol (1 en 1O) en ácido acético 9 N. Las soluciones de sales de cobalto, cuando se saturan con cloruro de potasio y se tratan
con nitrito de potasio y ácido acético, producen un precipitado amarillo.
Cobre-Las soluciones de compuestos cúpricos acidificadas con ácido clorhídrico, depositan una película roja de cobre me-
tálico sobre una superficie de hierro brillante y no oxidado. Un exceso de hidróxido de amonio 6 N, agregado a una solución
de una sal cúprica, produce al principio un precipitado azulado y posteriormente una solución de color azul intenso. Las solu-
ciones de sales cúpricas con ferrocianuro de potasio SR producen un precipitado de color marrón rojizo insoluble en ácidos
diluidos.
Fosfatos-[NOTA-Cuando la monografía especifica la prueba de identificación de Fosfatos, utilizar las pruebas para ortofos-
fatos, a menos que las instrucciones especifiquen que se deben emplear las pruebas para pirofosfatos o que se debe incinerar
el producto antes de realizar la prueba.] Con nitrato de plata SR, las soluciones neutras de ortofosfatos producen un precipita-
do amarillo que es soluble en ácido nítrico 2 N y en hidróxido de amonio 6 N. Con molibdato de amonio SR, las soluciones
acidificadas de ortofosfatos producen un precipitado amarillo que es soluble en hidróxido de amonio 6 N. Este precipitado
puede tardar en formarse. Con nitrato de plata SR, los pirofosfatos obtenidos por incineración producen un precipitado blanco
USP 40 Pruebas Químicas/ (191 > Identificación-Pruebas Generales 275

que es soluble en ácido nítrico 2 N y en hidróxido de amonio 6 N. Con molibdato de amonio SR se forma un precipitado ama-
rillo que es soluble en hidróxido de amonio 6 N.
Hierro-Los compuestos férricos y ferrosos en solución producen un precipitado negro con sulfuro de amonio SR. Este pre-
cipitado se disuelve en presencia de ácido clorhídrico 3 N frío con desprendimiento de sulfuro de hidrógeno.
Sales Férricas-Las soluciones ácidas de sales férricas producen un precipitado azul oscuro con ferrocianuro de potasio SR.
Con un exceso de hidróxido de sodio 1 N, se forma un precipitado marrón rojizo. Con tiocianato de amonio SR, las soluciones
de sales férricas producen un color rojo intenso que no se elimina con el agregado de ácidos minerales diluidos.
Sales Ferrosas-Las soluciones de sales ferrosas producen un precipitado azul oscuro con ferricianuro de potasio SR. Este pre-
cipitado es insoluble en ácido clorhídrico 3 N pero se descompone con hidróxido de sodio 1 N. Las soluciones de sales ferrosas
con hidróxido de sodio 1 N producen un precipitado blanco-verdoso que cambia de color rápidamente a verde y luego, cuan-
do se agita, se torna marrón.
Hipofosfitos-Cuando se los calienta enérgicamente, los hipofosfitos desprenden fosfina que es espontáneamente inflama-
ble. Los hipofosfitos en solución producen un precipitado blanco con cloruro mercúrico SR. Este precipitado se torna gris ante
la presencia de un exceso de hipofosfito. Las soluciones de hipofosfitos, acidificadas con ácido sulfúrico y calentadas con sulfa-
to cúprico SR, producen un precipitado rojo.
Lactatos-Cuando las soluciones de lactatos se acidifican con ácido sulfúrico, se les agrega permanganato de potasio SR y
se calienta la mezcla, desprenden acetaldehído. Éste se puede detectar al permitir que los vapores entren en contacto con un
papel de filtro humedecido con una mezcla recién preparada de volúmenes iguales de solución acuosa de morfolina al 20% y
de nitroferricianuro de sodio SR: se produce un color azul.
Litio-Con carbonato de sodio SR, las sales de litio en soluciones moderadamente concentradas, alcalinizadas con hidróxi-
do de sodio, producen un precipitado blanco al llevarlas a ebullición. El precipitado es soluble en cloruro de amonio SR. Las
sales de litio humedecidas con ácido clorhídrico proporcionan un color carmesí intenso a una llama no luminosa. Las solucio-
nes de sales de litio no precipitan en ácido sulfúrico 2 N o sulfatos solubles (a diferencia del estroncio).
Magnesio-Las soluciones de sales de magnesio en presencia de cloruro de amonio producen solamente un precipitado
ligeramente turbio cuando se neutralizan con carbonato de amonio SR, pero con la adición posterior de fosfato dibásico de
sodio SR producen un precipitado blanco cristalino, insoluble en hidróxido de amonio 6 N.
Manganeso-Con sulfuro de amonio SR, las soluciones de sales manganosas producen un precipitado color salmón que se
disuelve en ácido acético.
Mercurio-Cuando se aplican sobre una lámina de cobre brillante, las soluciones de sales de mercurio, exentas de un exce-
so de ácido nítrico, producen un precipitado que, al frotarlo, adquiere una apariencia plateada y brillante. Con sulfuro de hi-
drógeno, las soluciones de compuestos de mercurio producen un precipitado negro que es insoluble en sulfuro de amonio SR
y en ácido nítrico 2 N en ebullición.
Sales Mercúricas-Las soluciones de sales mercúricas producen un precipitado amarillo con hidróxido de sodio 1 N. En solu-
ciones neutras con yoduro de potasio SR, también producen un precipitado escarlata que es muy soluble en un exceso de
reactivo.
Sales Mercuriosos-Los compuestos mercuriosos se descomponen en hidróxido de sodio 1 N y producen un color negro.
Con ácido clorhídrico, las soluciones de sales mercuriosas producen un precipitado blanco que se ennegrece con hidróxido de
amonio 6 N. Con yoduro de potasio SR producen un precipitado amarillo que, al quedar en reposo, puede tornarse verde.
Nitratos-Cuando una solución de nitrato se mezcla con un volumen igual de ácido sulfúrico, se enfría la mezcla y se su-
perpone una solución de sulfato ferroso, se desarrolla un color marrón en la unión de los dos líquidos. Cuando se calienta un
nitrato con ácido sulfúrico y cobre metálico, se desprenden humos de color rojo amarronado. Los nitratos no decoloran el per-
manganato de potasio SR acidificado (a diferencia de los nitritos).
Nitritos-Cuando se los trata con ácidos minerales diluidos o con ácido acético 6 N, los nitritos desprenden humos de color
rojo-amarronado. Las soluciones colorean de azul el papel de almidón-yoduro.
Oxalatos-Las soluciones neutras y alcalinas de oxalatos forman un precipitado blanco con cloruro de calcio SR. Este preci-
pitado es insoluble en ácido acético 6 N pero se disuelve con ácido clorhídrico. Las soluciones de oxalatos acidificadas y calien-
tes decoloran el permanganato de potasio SR.
Permanganatos-Las soluciones de permanganatos acidificadas con ácido sulfúrico se decoloran con peróxido de hidróge-
no SR y con bisulfito de sodio SR en frío y con ácido oxálico SR en solución caliente.
Peróxidos-Las soluciones de peróxidos acidificadas ligeramente con ácido sulfúrico proporcionan un color azul intenso
con la adición de dicromato de potasio SR. Si la mezcla se agita con un volumen igual de éter etílico y se deja que se separen
los líquidos, el color azul se encuentra en la capa de éter etílico.
Plata-Con ácido clorhídrico, las soluciones de sales de plata producen un precipitado grumoso, blanco, que es insoluble
en ácido nítrico pero fácilmente soluble en hidróxido de amonio 6 N. Una solución de una sal de plata a la que se le agrega
hidróxido de amonio 6 N y una pequeña cantidad de formaldehído SR, al entibiarla, deposita un espejo de plata metálica en
las paredes del recipiente.
Plomo-Las soluciones de sales de plomo con ácido sulfúrico 2 N producen un precipitado blanco que es insoluble en áci-
do clorhídrico 3 N o en ácido nítrico 2 N, pero que es soluble en hidróxido de sodio 1 N tibio y en acetato de amonio SR. Con
cromato de potasio SR, las soluciones de sales de plomo, exentas o casi exentas de ácidos minerales, producen un precipitado
amarillo que es insoluble en ácido acético 6 N pero que es soluble en hidróxido de sodio 1 N.
276 (191) Identificación-Pruebas Generales/ Pruebas Químicas USP 40

Potasio-Los compuestos de potasio confieren un color violeta a una llama no luminosa, pero la presencia de pequeñas
cantidades de sodio enmascara el color a menos que el color amarillo producido por el sodio se elimine con un filtro azul que
bloquee la emisión a 589 nm (sodio) pero que sea transparente a la emisión a 404 nm (potasio). Tradicionalmente se ha usado
vidrio cobalto, pero también hay otros filtros satisfactorios que están disponibles comercialmente. En soluciones neutras, con-
centradas o moderadamente concentradas, de sales de potasio (dependiendo de la solubilidad y del contenido de potasio), el
bitartrato de sodio SR produce un precipitado blanco cristalino que es soluble en hidróxido de amonio 6 N y en soluciones de
hidróxidos alcalinos y carbonatos alcalinos. La formación del precipitado, que usualmente es lenta, se acelera al agitar o frotar
el interior del tubo de ensayo con una varilla de vidrio. La adición de una pequeña cantidad de ácido acético glacial o alcohol
también favorece la precipitación.
Salicilatos-En soluciones moderadamente diluidas de salicilatos, el cloruro férrico SR produce un color violeta. La adición
de ácidos a soluciones moderadamente concentradas de salicilatos produce un precipitado blanco cristalino de ácido salicílico,
que se funde entre 158º y 161 º.
Sodio-A menos que se especifique algo diferente en una monografía individual, preparar una solución que contenga 0, 1 g
del compuesto de sodio en 2 mL de agua. Agregar 2 mL de carbonato de potasio al 15% y calentar hasta ebullición. No se
forma precipitado. Agregar 4 mL de piroantimoniato de potasio SR y calentar hasta ebullición. Dejar que se enfríe en agua
helada y, si fuera necesario, frotar el interior del tubo de ensayo con una varilla de vidrio. Se forma un precipitado denso. Los
compuestos de sodio confieren un intenso color amarillo a una llama no luminosa.
Sulfatos-Las soluciones de sulfatos con cloruro de bario SR producen un precipitado blanco que es insoluble en ácido clor-
hídrico y en ácido nítrico. Con acetato de plomo SR, las soluciones neutras de sulfatos forman un precipitado blanco que es
soluble en acetato de amonio SR. El ácido clorhídrico no produce precipitado cuando se agrega a las soluciones de sulfatos (a
diferencia de los tiosulfatos).
Sulfitos-Cuando se los trata con ácido clorhídrico 3 N, los sulfitos y bisulfitos desprenden dióxido de azufre que ennegrece
el papel de filtro humedecido con nitrato mercurioso SR.
Tartratos-Disolver algunos mg de sal de tartrato en 2 gotas de solución de metaperyodato de sodio (1 en 20). Agregar
1 gota de ácido sulfúrico 1 N y después de 5 minutos, agregar algunas gotas de ácido sulfuroso seguido de algunas gotas de
ácido sulfuroso-fucsina SR: se produce un color rosado rojizo dentro de los 15 minutos.
Tiocianatos-Con cloruro férrico SR, las soluciones de tiocianato producen un color rojo que no se elimina con ácidos mi-
nerales moderadamente concentrados.
Tiosulfatos-Con ácido clorhídrico, las soluciones de tiosulfatos producen un precipitado de color blanco que se torna
amarillo rápidamente y dióxido de azufre, que ennegrece el papel de filtro humedecido con nitrato mercurioso SR. La adición
de cloruro férrico SR a las soluciones de tiosulfatos produce un color violeta oscuro que desaparece rápidamente.
Yoduros-Las soluciones de yoduros, con la adición de cloro SR gota a gota, liberan yodo que colorea la solución de amari-
llo a rojo. Si esta solución se agita con cloroformo, éste se torna de color violeta. El yodo así liberado proporciona un color azul
con almidón SR. El nitrato de plata SR, en soluciones de yoduros, produce un precipitado amarillo grumoso, que es insoluble
en ácido nítrico y en hidróxido de amonio 6 N.

(193) IDENTIFICACIÓN-TETRACICLINAS

Los procedimientos cromatográficos descritos a continuación se suministran para confirmar la identidad de los fármacos de la
Farmacopea que son del tipo tetraciclina, como por ejemplo la doxiciclina, oxitetraciclina y tetraciclina, y para confirmar la
identidad de dichos compuestos en sus respectivas formas farmacéuticas de la Farmacopea. Se describen dos procedimien-
tos, uno basado en cromatografía en papel (Método/) y otro en cromatografía en capa delgada (Método 11). Utilizar el Méto-
do I a menos que se especifique algo diferente en la monografía individual.

PROCEDIMIENTOS
Solución estándar: A menos que se especifique algo diferente en la monografía individual, disolver el Estándar de Referen-
cia USP del fármaco que se quiere identificar en el mismo disolvente y con la misma concentración que los utilizados para la
Solución de prueba.
Solución de prueba: Preparar según se indica en la monografía individual correspondiente .
• MÉTODO 1
Solución amortiguadora de pH 3,5: Disolver 13,4 g de ácido cítrico anhidro y 16,3 g de fosfato dibásico de sodio en
1000 mL de agua y mezclar.
Fase móvil: El día de la prueba, mezclar 1O volúmenes de cloroformo, 20 volúmenes de nitrometano y 3 volúmenes de
piridina.
Solución de prueba mezclada: Mezclar volúmenes iguales de la Solución estándar y de la Solución de prueba.
Hoja cromatográfica: Trazar una línea de aplicación a 2,5 cm de uno de los bordes de una hoja de papel de filtro, (What-
man No. 1, o equivalente) de 20 cm x 20 cm. Impregnar la hoja pasándola a través de una cuba con Solución amortiguado-
ra de pH 3,5, eliminar el exceso de disolvente presionando con firmeza la hoja entre papeles secantes no fluorescentes.
USP 40 Pruebas Químicas/ (197) Pruebas de Identificación Espectrofotométrica 277

Procedimiento: En una cámara cromatográfica adecuada preparada para cromatografía ascendente (ver Cromatografía
(621 )), colocar Fase móvil hasta una altura de 0,6 cm. Aplicar 2 µL de la Solución estándar, 2 µL de la Solución de prueba y 2
µL de la Solución de prueba mezclada a intervalos de 1,5 cm sobre la línea de aplicación de la Hoja cromatográfica. Dejar que
la hoja se seque parcialmente y, mientras aún esté húmeda, colocarla en la cámara cromatográfica con el borde inferior en
contacto con la Fase móvil. Cuando el frente de la fase móvil haya recorrido aproximadamente 1 O cm, retirar la hoja de la
cámara y exponerla a vapores de amoníaco. Examinar el cromatograma bajo luz UV de longitud de onda larga. Registrar
las posiciones de las manchas amarillas fluorescentes principales: el valor RF de la mancha principal obtenida a partir de la
Solución de prueba y de la Solución de prueba mezclada se corresponde con el de la mancha obtenida de la Solución están-
dar.
• MÉTODO 11
Solución de resolución: A menos que se especifique algo diferente en la monografía individual, preparar una solución en
metanol que contenga 0,5 mg de ER Clorhidrato de Clortetraciclina USP, 0,5 mg de ER Hiclato de Doxiciclina USP, 0,5 mg
de ER Oxitetraciclina USP y 0,5 mg de ER Clorhidrato de Tetraciclina USP por ml.
Fase móvil: Preparar una mezcla de ácido oxálico 0,5 M, previamente ajustado con hidróxido de amonio a un pH de 2,0,
acetonitrilo y metanol (80:20:20).
Placa cromatográfica: Utilizar una placa para cromatografía en capa delgada adecuada (ver Cromatografía en Capa Delga-
da en Cromatografía (621 )) recubierta con una capa de 0,25 mm de mezcla de gel de sílice octilsilanizada para cromatogra-
fía. Activar la placa calentándola a 130º durante 20 minutos, dejar que se enfríe y utilizarla mientras aún esté tibia.
Procedimiento: Aplicar por separado 1 µL de la Solución estándar, 1 µL de la Solución de prueba y 1 µL de la Solución de
resolución a la Placa para cromatografía. Dejar que las aplicaciones se sequen y desarrollar el cromatograma en la Fase móvil
hasta que el frente de la fase móvil haya recorrido aproximadamente tres cuartos de la longitud de la placa. Retirar la placa
de la cámara de desarrollo, marcar el frente de la fase móvil y dejar que la placa se seque al aire. Exponer la placa a vapores
de amoníaco durante 5 minutos y localizar rápidamente las manchas en la placa observándola bajo luz UV de longitud de
onda larga: el cromatograma de la Solución de resolución presenta manchas bien separadas y el valor RF, la intensidad y el
aspecto de la mancha principal obtenida de la Solución de prueba se corresponden con los de la mancha obtenida de la
Solución estándar.

(197) PRUEBAS DE IDENTIFICACIÓN ESPECTROFOTOMÉTRICA

Las pruebas espectrofotométricas son las de mayor importancia en la identificación de muchas de las sustancias químicas del
compendio. Los procedimientos de prueba que se indican a continuación se aplican a sustancias que absorben radiación infra-
rroja (IR) y/o ultravioleta (UV) (ver Espectroscopía en el Infrarrojo Medio (854) y Espectroscopía Ultravioleta-Visible (857)).
El espectro de absorción IR de una sustancia, en comparación con el que se obtuvo concomitantemente para el Estándar de
Referencia USP correspondiente, proporciona quizá la evidencia más concluyente de la identidad de la sustancia, que puede
obtenerse en una sola prueba. El espectro de absorción UV, por otro lado, no presenta un alto grado de especificidad. La con-
formidad con las especificaciones de prueba referentes tanto para la absorción IR como con la absorción UV, según se indica
en una gran proporción de monografías oficiales, deja pocas dudas, si las hubiera, con respecto a la identidad de la muestra
que se está examinando.

ABSORCIÓN EN EL INFRARROJO

Se indican siete métodos para la preparación de muestras de prueba y Estándares de Referencia previamente secados para el
análisis. La referencia (l 97K) en una monografía significa que la sustancia que se está examinando se mezcla íntimamente con
bromuro de potasio. La referencia (l 97M) en una monografía significa que la sustancia que se está examinando se muele fina-
mente y se dispersa en aceite mineral. La referencia (l 97F) en una monografía significa que la sustancia que se está examinan-
do se suspende pura entre placas adecuadas (por ejemplo, de cloruro de sodio o bromuro de potasio). La referencia (1975)
significa que se prepara una solución de concentración especificada en el disolvente especificado en la monografía individual, y
que la solución se examina en celdas de O, 1 mm, a menos que se especifique una longitud de paso diferente para las celdas en
la monografía individual. La referencia (197 A) significa que la sustancia que se está examinando está en contacto íntimo con
un elemento de reflexión interna para el análisis de reflectancia total atenuada (ATR, por sus siglas en inglés). La referencia
(l 97E) significa que la sustancia que se está analizando se presiona como una muestra muy delgada contra una placa adecua-
da para el microanálisis IR. La referencia (l 97D) en una monografía significa que la sustancia que se está examinando se mezc-
la íntimamente con un material transparente para IR y se transfiere a un recipiente de muestra para análisis por reflexión difusa
(DR, por sus siglas en inglés). Las técnicas ATR (197 A) y (l 97E) pueden usarse como métodos alternativos para (197K),
(l 97M), (l 97F) y (1975) cuando la prueba se realiza cualitativamente y los espectros del Estándar de Referencia se obtienen de
manera similar.
278 (197) Pruebas de Identificación Espectrofotométrica / Pruebas Químicas USP 40

Registrar los espectros de la muestra de prueba y el correspondiente Estándar de Referencia USP en el intervalo de aproxima-
damente 2,6 µm a 15 µm (3800 cm- 1 a 650 cm- 1 ) a menos que se especifique algo diferente en la monografía individual. El
espectro de absorción IR de la preparación obtenida a partir de la muestra de prueba, previamente secada bajo las condiciones
especificadas para el Estándar de Referencia correspondiente, a menos que se especifique algo diferente, o que el Estándar de
Referencia se emplee sin secar, presenta máximos sólo a las mismas longitudes de onda que el de una preparación similar del
Estándar de Referencia USP correspondiente.
Las diferencias que pueden observarse en los espectros así obtenidos a veces se atribuyen a la presencia de polimorfos, lo
cual no es siempre aceptable (ver Procedimiento en (854)). Por lo tanto, a menos que se especifique algo diferente en la mono-
grafía individual, continuar del siguiente modo. Si aparece una diferencia en los espectros IR del analito y del estándar, disolver
porciones iguales de la muestra de prueba y del Estándar de Referencia en volúmenes iguales de un disolvente apropiado, eva-
porar la solución hasta sequedad en envases similares, bajo condiciones idénticas, y repetir la prueba con los residuos.

ABSORCIÓN EN EL ULTRAVIOLETA

La referencia (197U) en una monografía significa que una solución de prueba y una Solución estándar se examinan espectro-
fotométricamente, en celdas de 1 cm, sobre el intervalo espectral de 200 nm a 400 nm, a menos que se especifique algo dife-
rente en la monografía individual.
Disolver una porción de la sustancia que se está examinando en el Medio especificado para obtener una solución de prueba
que tenga la concentración especificada en la monografía para Solución. En forma similar, preparar una Solución Estándar que
contenga el Estándar de Referencia USP correspondiente.
Registrar y comparar los espectros obtenidos concomitantemente para la solución de prueba y la Solución Estándar. Calcular
los cocientes de absortividad y/o absorbancia si estos criterios están incluidos en una monografía individual. A menos que se
especifique algo diferente, las absorbancias indicadas para estos cálculos son aquellas medidas a la absorbancia máxima, apro-
ximadamente a la longitud de onda especificada en la monografía individual. Cuando la absorbancia se deba medir aproxima-
damente a la longitud de onda especificada en lugar de la máxima absorbancia, las abreviaturas (min) y (sh) se utilizan para
indicar un mínimo y un hombro (shoulder), respectivamente, en un espectro de absorción. Los requisitos se cumplen si los
espectros de absorción UV de la solución de prueba y de la Solución Estándar presentan máximos y mínimos a las mismas
longitudes de onda y los cocientes de absortividad y/o absorbancia están dentro de los límites especificados.

(201) PRUEBA DE IDENTIFICACIÓN POR CROMATOGRAFÍA EN CAPA

DELGADA

PROCEDIMIENTOS
• PROCEDIMIENTO GENERAL
El procedimiento descrito a continuación tiene como fin verificar la identificación de muchos fármacos farmacopeicos y de
sus formas farmacéuticas correspondientes.
Preparar una solución de prueba según las indicaciones de la monografía individual correspondiente. En una placa para cro-
matografía en capa delgada adecuada, recubierta con una capa de mezcla de gel de sílice para cromatografía de 0,25 mm
(ver Cromatografía (621 )), aplicar, en una línea paralela al borde y aproximadamente a 2 cm, 1O µL de esta solución y 1O
µL de una Solución estándar; preparada a partir del Estándar de Referencia USP del fármaco que se quiere identificar, en el
mismo disolvente y a la misma concentración que para la solución de prueba, a menos que se especifique algo diferente
en la monografía individual. Dejar que se sequen las aplicaciones y desarrollar el cromatograma con una fase móvil consti-
tuida por una mezcla de cloroformo, metano! y agua (180:15:1 ), a menos que se especifique algo diferente en la mono-
grafía individual, hasta que el frente de la fase móvil haya recorrido aproximadamente tres cuartos de la longitud de la
placa. Retirar la placa de la cámara de desarrollo, marcar el frente de la fase móvil y dejar que el disolvente se evapore. A
menos que se especifique algo diferente en la monografía individual, localizar las manchas de la placa examinándolas bajo
luz UV de longitud de onda corta. El valor RF de la mancha principal obtenida a partir de la solución de prueba se corres-
ponde con el obtenido a partir de la Solución estándar.
• PROCEDIMIENTO PARA BACITRACINA, NEOMICINA V POLIMIXINA 8
El procedimiento de cromatografía en capa delgada descrito a continuación tiene como fin verificar la identificación de los
ingredientes activos bacitracina, neomicina y polimixina By en sus formas farmacéuticas cuando se encuentran presentes
de forma aislada o en mezclas de dos o tres componentes. La referencia (201 BNP) en una monografía indica que éste es el
procedimiento a seguir.
Preparar una Solución de prueba según se indica a continuación, a menos que se especifique algo diferente en la monografía
individual.
Solución de prueba
USP 40 Pruebas Químicas/ (202) Identificación de Aceites Fijos 279

Para fármacos: Disolver una porción de Bacitracina, Bacitracina Cinc, Sulfato de Neomicina o Sulfato de Polimixina Ben
ácido clorhídrico O, 1 N para obtener una solución que contenga 500 Unidades USP de Bacitracina por mL, 3,5 mg de
neomicina (base) por mL, o 1O000 Unidades USP de Polimixina B por ml.
Para soluciones: Si la Solución contiene neomicina y polimixina B, diluir una porción de solución con ácido clorhídrico
O, l N para obtener una solución que contenga, aproximadamente, la cantidad equivalente a 3,5 mg de neomicina (base)
por ml. Si la Solución contiene polimixina B pero no neomicina, diluir una porción de solución con ácido clorhídrico O, 1
N para obtener una solución que contenga aproximadamente 1O000 Unidades USP de Polimixina B por ml.
Para cremas, lociones y ungüentos: Si la Crema, la Loción o el Ungüento contiene Bacitracina o Bacitracina Cinc, trans-
ferir una porción que equivalga aproximadamente a 500 Unidades USP de Bacitracina a un tubo de centrífuga de 15 ml.
Si la Crema, la Loción o el Ungüento contiene neomicina pero no contiene Bacitracina ni Bacitracina Cinc, transferir una
porción que equivalga aproximadamente a 3,5 mg de neomicina (base) por mL a un tubo de centrífuga de 15 mL. Agre-
gar 4 mL de cloroformo al tubo de centrífuga y agitar bien para dispersar la Crema, la Loción o el Ungüento. Agregar 1
mL de ácido clorhídrico O, 1 N, mezclar en un mezclador por vórtice durante 4 minutos, centrifugar y usar el sobrenadan-
te transparente.
[NOTA-En el Procedimiento modificado se puede usar la Solución de prueba modificada preparada según se indica a continua-
ción en lugar de la Solución de prueba.]
Solución de bacitracina estándar: Disolver una porción de ER Bacitracina Cinc USP en ácido clorhídrico O, 1 N para obte-
ner una solución que contenga 500 Unidades USP de Bacitracina por mL.
Solución de neomicina estándar: Disolver una porción de ER Sulfato de Neomicina USP en ácido clorhídrico O, 1 N para
obtener una solución que contenga el equivalente a 3,5 mg de neomicina (base) por ml.
Solución de polimixina B estándar: Disolver una porción de ER Sulfato de Polimixina B USP en ácido clorhídrico O, 1 N
para obtener una solución que contenga 1O000 Unidades USP de Polimixina B por ml. Si el artículo en análisis también
contiene Bacitracina o Bacitracina Cinc, disolver una porción de ER Sulfato de Polimixina B USP en ácido clorhídrico O, 1N
para obtener una solución que contenga 500/ Unidades USP de Polimixina B por mL, donde j es el cociente entre las canti-
dades de Unidades USP de Polimixina By de Unidades USP de Bacitracina declaradas en la etiqueta por g de Crema, Lo-
ción o Ungüento.
Fase móvil: Preparar una mezcla de metanol, alcohol isopropílico, cloruro de metileno, hidróxido de amonio y agua
(4:2:2:2: 1,5).
Procedimiento: Aplicar 1O µL de Solución de prueba y 1O µL de cada una de las Soluciones Estándar que corresponda a una
placa para cromatografía en capa delgada adecuada (ver Cromatografía (621 )), recubierta con una capa de gel de sílice
para cromatografía de 0,25 mm de espesor. Colocar la placa en una cámara cromatográfica presaturada y desarrollar los
cromatogramas con la Fase móvil hasta que el frente de la fase móvil haya recorrido aproximadamente tres cuartos de la
longitud de la placa. Retirar la placa de la cámara y secar a 105º durante 1O minutos. Rociar la placa con una solución al
0,2% de ninhidrina en alcohol butílico y calentarla a 105º durante 5 minutos. El valor RF de cada mancha principal en el
cromatograma de la Solución de prueba se corresponde con el de la mancha principal en el cromatograma obtenido a partir
de cada Solución estándar que corresponda según el o los ingredientes activos declarados en la etiqueta. Si el cromatogra-
ma de la Solución de prueba presenta demasiadas bandas, proceder según se indica en el Procedimiento modificado.
Procedimiento modificado: Transferir la Solución de Prueba a un tubo de centrífuga de 15 mL, agregar 1O mL de solución
acuosa de ácido pícrico saturada (1,2%, p/v), mezclar en un mezclador por vórtice durante 1 minuto, centrifugar durante
1O minutos y desechar el sobrenadante. Lavar el residuo con porciones de agua de 1 mL hasta que no se observe color
amarillo en el lavado. Desechar los lavados y secar el residuo bajo una corriente de nitrógeno a 50º. Disolver el residuo en 1
mL de acetona, agregar 1 mL de una solución de ácido sulfúrico en acetona (1 en 100) recién preparada, agitar, centrifu-
gar durante 5 minutos y desechar el sobrenadante. Enjuagar el residuo con 1 mL de acetona, centrifugar brevemente y
desechar el lavado. Repetir el lavado hasta que no se observe color amarillo. Secar el residuo bajo una corriente de nitróge-
no a 50º. Disolver el residuo en 0,5 mL de ácido clorhídrico O, l N (Solución de prueba modificada). Repetir el Procedimiento
utilizando esta Solución de prueba modificada en lugar de la Solución de prueba. El valor RF de cada mancha principal en el
cromatograma de la Solución de prueba modificada se corresponde con el de la mancha principal en el cromatograma obte-
nido a partir de cada Solución estándar que corresponda según el o los ingredientes activos declarados en la etiqueta.

(202) IDENTIFICACIÓN DE ACEITES FIJOS POR CROMATOGRAFÍA EN

CAPA DELGADA

INTRODUCCIÓN
El siguiente procedimiento para la prueba de Identificación de la USP se usa para identificar aceites fijos usando cromatografía
en capa delgada de alta resolución (HPTLC), con un gel de sílice octadecilsilanizado adecuado como sustancia de recubri-
miento.

IDENTIFICACIÓN
• MÉTODO 1
280 (202) Identificación de Aceites Fijos / Pruebas Químicas USP 40

Fase móvil 1: Éter etílico

Fase móvil 2: Cloruro de metileno, ácido acético glacial y acetona (20:40:50)
Solución de aptitud del sistema 1: Disolver aproximadamente 20 mg (1 gota) de ER Aceite de Maíz USP en 3 mL de clo-
ruro de metileno.
Solución de aptitud del sistema 2: Disolver aproximadamente 20 mg (1 gota) de ER Aceite de Oliva USP en 3 mL de clo-
ruro de metileno.
Solución estándar: Disolver aproximadamente 20 mg (1 gota) del Estándar de Referencia USP apropiado en 3 mL de clo-
ruro de metileno.
Solución muestra: Disolver aproximadamente 20 mg (1 gota) de una muestra de aceite fijo en 3 mL de cloruro de metile-
no.
Sistema cromatográfico
(Ver Cromatografía (621 ), Cromatografía en Capa Delgada.)
Modo: HPTLC
Placa: 20 cm x 1O cm, capa de gel de sílice 60 RP-18 de O, 15-0,2 mm, con un tamaño de partícula de 4-8 µmi
Volumen de aplicación: 1 µL, aplicación manual
Solución reveladora: 100 mg/mL de ácido fosfomolíbdico en alcohol al 96%
Aptitud del sistema
Muestras: Solución de aptitud del sistema 1 y Solución de aptitud del sistema 2
Requisitos de aptitud
Resolución: Las cuatro manchas principales de aceite de maíz están claramente identificadas y separadas, al igual que
las dos manchas principales de aceite de oliva.
[NOTA-Los factores de retardo (RF) se proveen sólo para propósitos informativos para ayudar en la identificación de las
manchas. Los valores RF de las cuatro manchas principales de ER Aceite de Maíz USP son 0,39; 0,45; 0,51 y 0,56, y los
valores RF de las dos manchas principales del ER Aceite de Oliva USP son 0,39 y 0,45.]
Análisis
Muestras: Solución estándar y Solución muestra
Aplicar las Muestras en bandas separadas en el punto de inicio previamente marcado en una placa para HPTLC y desarrollar
la placa en el orden siguiente:
(1) Asegurar que las aplicaciones estén al menos 3 mm por encima de la superficie de la fase móvil. Desarrollar dos veces
a lo largo de un recorrido de 0,5 cm usando la Fase móvil 1. Retirar la placa de la cámara después de cada corrida y
dejar que la placa se seque al aire.
(2) Desarrollar dos veces a lo largo de un recorrido de 8 cm usando la Fase móvil 2. Dejar que la placa se seque durante
aproximadamente 5 minutos después de cada desarrollo y antes de rociar con la solución reveladora.
Rociar la placa con la Solución reveladora.
Calentar la placa a 120º durante aproximadamente 1 minuto y observar bajo luz diurna.
Criterios de aceptación: Los valores RF de las manchas principales de la Solución muestra corresponden a los de la Solución
estándar.
• MÉTODO 11
Fase móvil: Cloruro de metileno, ácido acético glacial y acetona (20:40:50)
Solución de aptitud del sistema 1: Disolver 25 µL de ER Aceite de Maíz USP en 3 mL de cloruro de metileno.
Solución de aptitud del sistema 2: Disolver 25 µL de ER Aceite de Oliva USP en 3 mL de cloruro de metileno.
Solución estándar: Disolver 25 µL del Estándar de Referencia USP apropiado en 3 mL de cloruro de metileno.
Solución muestra: Disolver 25 µL de una muestra de aceite fijo en 3 mL de cloruro de metileno.
Sistema cromatográfico
(Ver Cromatografía (621 ), Cromatografía en Capa Delgada.)
Modo: HPTLC
Placa: 20 cm x 1O cm, capa de gel de sílice 60 RP 18 (o RP-18 F254 ) de O, 15-0,2 mm, con un tamaño de partícula de 4-8
µm
Acondicionamiento de la placa: Acondicionar la placa a una humedad relativa de aproximadamente 33%.
Volumen de aplicación: 2 µLen bandas de 8 mm. Se usa un aparato automatizado adecuado.
Solución reveladora: 25 mg/mL de ácido fosfomolíbdico en alcohol al 96%
Aptitud del sistema
Muestras: Solución de aptitud del sistema 1 y Solución de aptitud del sistema 2
Requisitos de aptitud
Resolución: Las cuatro bandas principales de aceite de maíz están claramente identificadas y separadas, al igual que las
dos bandas principales de aceite de oliva.
[NOTA-Los factores de retardo (RF) se proveen sólo para propósitos informativos para ayudar en la identificación de las
bandas. Los valores RF de las cuatro bandas principales del ER Aceite de Maíz USP son 0,20; 0,26; 0,30 y 0,34, y los valo-
res RF para las dos bandas principales del ER Aceite de Oliva USP son 0,20 y 0,26.]

1 Placa de Gel de Sílice para HPTLC 60 RP-18 de Merck EMD o equivalente.

USP 40 Pruebas Químicas/ (203) Cromatografía en Capa Delgada 281

Análisis
Muestras: Solución estándar y Solución muestra
Desarrollar previamente la placa con cloruro de metileno hasta el borde superior. Secar la placa a 120º durante 1O minutos.
Aplicar las Muestras en bandas separadas en el punto de inicio previamente marcado en una placa para HPTLC.
Asegurar que las bandas estén al menos 3 mm por encima de la superficie de la fase móvil.
Desarrollar durante un recorrido de 7 cm usando la Fase móvil. Dejar que la placa se seque al aire.
Tratar la placa con la Solución reveladora.
Calentar la placa a 120º durante 3 minutos y observar bajo luz diurna.
Criterios de aceptación: Los valores RF de las bandas principales de la Solución muestra corresponden a los de la Solución
estándar.

REQUISITOS ADICIONALES
• ESTÁNDARES DE REFERENCIA USP (11)
ER Aceite de Almendra USP
ER Aceite de Semilla de Borraja USP
ER Aceite de Canola USP
ER Aceite de Maíz USP
ER Aceite de Semilla de Algodón USP
ER Aceite de Onagra USP
ER Aceite de Semilla de Lino USP
ER Aceite de Oliva USP
ER Aceite de Palma USP
ER Aceite de Cacahuate USP
ER Aceite de Cártamo USP
ER Aceite de Sésamo USP
ER Aceite de Soja USP
ER Aceite de Girasol USP

(203) PROCEDIMIENTO DE CROMATOGRAFÍA EN CAPA DELGADA DE

ALTA RESOLUCIÓN PARA IDENTIFICACIÓN DE ARTÍCULOS DE ORIGEN
BOTÁNICO

INTRODUCCIÓN

Este capítulo describe un procedimiento para uso en una prueba de Identificación de la USP que se basa en la técnica de
cromatografía en capa delgada de alta resolución (HPTLC). Se aplica a la identificación de artículos de origen botánico en los
compendios USP que sirven como fármaco o medicamento, o como ingrediente dietético o suplemento dietético. Se describe
brevemente como controlar cuidadosamente las variables para la técnica de HPTLC incluyendo referencias a información más
detallada provista en los manuales de los equipos. La reproducibilidad de los resultados permite comparar materiales botánicos
con ingredientes no oficiales aunque estén estrechamente relacionados. La técnica analítica emplea placas para cromatografía
de alta resolución, equipo apropiado para controlar variables y una prueba de aptitud del sistema para propósitos de califica-
ción del desempeño. [NOTA-Para información adicional, ver Identificación de Artículos de Origen Botánico por Cromatografía en
Capa Delgada de Alta Resolución (1064).]

EQUIPO REQUERIDO

El equipo usado para la técnica de HPTLC incluye lo siguiente:

• Placas: A menos que se especifique de otro modo en la monografía individual, usar placas recubiertas con una capa uni-
forme de 200 µm de gel de sílice poroso (con un tamaño de poro de 60 Á) con partículas irregulares de entre 2-1 O µm y
un tamaño promedio de partícula de 5 µm, un aglutinante polimérico y un indicador fluorescente (F 254 ) de 20 x ó 1 O cm.
[NOTA-Se prefieren los métodos cromatográficos que usan placas de vidrio para cromatografía en capa delgada de alta
resolución a los que usan láminas con soporte de aluminio debido a la mayor rigidez y estabilidad mecánica del vidrio.]
• Un dispositivo adecuado para la aplicación de los volúmenes de muestras especificados, en bandas de las longitudes espe-
cificadas, y en las posiciones especificadas
• Una cámara cromatográfica adecuada (por ejemplo, una cámara de cubetas gemelas) que permita el control de la satura-
ción y de la distancia de desarrollo
282 (203) Cromatografía en Capa Delgada/ Pruebas Químicas USP 40

• Un dispositivo adecuado para controlar la actividad de la fase estacionaria mediante humedad relativa
• Un dispositivo adecuado para el secado reproducible de la placa ya desarrollada
• Un dispositivo adecuado para el tratamiento de la placa con reactivo de derivatización, si fuera necesario
• Un dispositivo adecuado para el calentamiento como parte del procedimiento de derivatización, si fuera necesario
• Un sistema adecuado para la documentación de cromatogramas bajo UV 254 nm, UV 366 nm y luz blanca
Cada uno de estos dispositivos así como el sistema en su totalidad deben pasar la calificación de la instalación, operación y
desempeño ( IQ, OQ y PQ, por sus siglas en inglés) para asegurar que los instrumentos estén funcionando de acuerdo con sus
especificaciones para controlar variables dentro de los intervalos designados. [NOTA-Para información adicional, ver Califica-
ción de Instrumentos Analíticos (1058).] Por lo general, los fabricantes del instrumento realizan la calificación de la instalación y
de la operación. El analista lleva a cabo la prueba de aptitud del sistema como prueba de la calificación del desempeño.

PROCEDIMIENTO

Preparación de la Solución de Prueba

A menos que se indique de otro modo en la monografía individual, someter a ultrasonido durante 15 minutos con 1 mL de
metanol, 100 mg de un ingrediente botánico reducido a polvo, 1O mg de un extracto o fracción secos, o la cantidad de una
forma farmacéutica que contenga el equivalente a las cantidades mencionadas anteriormente del correspondiente ingrediente
botánico. Después de centrifugar o flitrar, usar el filtrado o el sobrenadante como la Solución muestra. A menos que se indique
de otro modo en la monografía individual, disolver 50 µL de un aceite esencial en 1 mL de tolueno y usar como la Solución
muestra.

Preparación de las Soluciones Estándar

A menos que se indique de otro modo en la monografía individual, disolver los Estándares de Referencia USP de compuestos
marcadores individuales a una concentración de 1 mg/mL en metanol. Agitar y someter a ultrasonido los Extractos Estándares
de Referencia USP en metanol a una concentración de 1O mg/mL o, para aceites esenciales, disolver los Materiales de Referen-
cia USP en tolueno a una concentración de 50 µL/mL.

Aplicación de la Muestra y Distribución de la Placa

Aplicar las muestras en bandas estrechas de 8,0 ± 0,5 mm de longitud a una distancia de 8,0 ± 0,5 mm del borde inferior de
la placa. Aplicar los estándares de aptitud del sistema en el carril más cercana al borde lateral a no menos de 20 mm del borde
lateral de la placa. La distancia entre los carriles (centro a centro) es no menos de 11,0 ± 0,5 mm. Todos los volúmenes de
aplicación se especifican en la monografía individual. Los volúmenes de aplicación por lo regular van de 2,0 a 10,0 µL. La dis-
tancia de desarrollo se marca con un lápiz cerca de uno de los bordes laterales de la placa antes del desarrollo, aunque tam-
bién se puede utilizar un dispositivo electrónico de detección de frente de fase móvil.

Preacondicionamiento de la Placa

Después de la aplicación de la muestra y a menos que se indique de otro modo en la monografía individual, acondicionar la
placa a una humedad relativa de 33% durante un mínimo de 1O minutos (por ejemplo, dejándola en reposo en una cámara
cerrada que contenga una solución saturada de cloruro de magnesio).

Preparación de la Cámara de Desarrollo y Desarrollo de la Placa

Cuando se use una cámara de cubetas gemelas, recubrir la pared trasera con papel de filtro inmerso en la cubeta trasera.
Cargar la cámara con un volumen suficiente de fase móvil para humedecer completamente el papel de filtro y lograr un nivel
de fase móvil de exactamente 5 mm en ambas cubetas. Dejar la cámara con la tapa cerrada durante 20 minutos para lograr la
saturación. Introducir la placa en posición vertical en la cubeta delantera de la cámara de modo que la capa de recubrimiento
esté orientada hacia el papel de filtro. Cuando la fase móvil haya alcanzado una distancia correspondiente a una distancia de
desarrollo de 6 cm, retirar la placa de la cámara y secarla en posición vertical en una corriente de aire frío que no afecte la
integridad de las zonas separadas. La monografía individual puede especificar otras configuraciones de cámara y distancias de
desarrollo. [NOTA-Se pueden usar otras cámaras de desarrollo si los resultados obtenidos cumplen con todos los requisitos de
aptitud del sistema.]

Procedimiento de Derivatización

Cuando se usen reactivos de derivatización, rociar de manera homogénea volúmenes definidos de reactivos en solución (por
lo general 1-2 mL) sobre la placa, o sumergir la placa en la solución reactivo a una velocidad definida y durante un tiempo de
USP 40 Pruebas Químicas/ (206) Aluminio 283

inmersión definido. [NOTA-Una velocidad de inmersión de 50 mm/segundo y un tiempo de inmersión de 1 segundo funciona
bien para la mayoría de los reactivos no acuosos.]

Visualización

Los cromatogramas en la placa se visualizan según se indica en la monografía individual. La observación y la evaluación se
pueden realizar bajo luz UV 254 nm, UV 366 nm o luz blanca antes y después de la derivatización.

Aptitud del Sistema

Para verificar la aptitud del sistema en lo que respecta a resolución, posición y color de las bandas, a menos que se indique
de otro modo en la monografía individual, seleccionar dos o más sustancias de referencia que tengan valores RF similares pero
apenas separables en las condiciones cromatográficas que se van a usar; por ejemplo, ácido clorogénico (azul) e hiperósido
(anaranjado amarillento) en sistemas cromatográficos usados para flavonoides. Pueden estar disponibles mezclas de Estándares
de Referencia USP para aptitud del sistema, o las sustancias designadas para verificar la aptitud del sistema en lo que respecta a
resolución, posición y colores de las bandas pueden estar incluidas en los Extractos Estándares de Referencia USP. La descrip-
ción de la resolución, posición y colores para las bandas clave de la identificación del material de referencia deben correspon-
derse con la descripción de la monografía dentro de un intervalo de tolerancia especificado. Los requisitos de aptitud del siste-
ma en una monografía individual se cumplen cuando los resultados obtenidos cumplen con los especificados en la monogra-
fía.

Evaluación y Criterios de Aceptación

Los cromatogramas de la Solución muestra y la Solución estándar se comparan contra la descripción de la sección Criterios de
aceptación de la monografía con respecto a la posición de las zonas, la separación de las zonas, el color y la intensidad relativa.

Documentación

La documentación es necesaria para registrar los resultados de manera que se puedan auditar, a fin de cumplir con las bue-
nas prácticas de fabricación vigentes. Se deben usar herramientas apropiadas de documentación; por ejemplo, una cámara
adecuada para tomar fotos digitales bajo luz UV y blanca, así como software de generación de imágenes adecuado para archi-
var, recuperar y analizar los resultados lo que facilita el mantenimiento de registros electrónicos.

PRUEBAS DE LÍMITE

(206) ALUMINIO

El objetivo de este procedimiento es demostrar que el contenido de aluminio (Al) no excede el límite establecido en la mo-
nografía individual de una sustancia cuya etiqueta indica que está destinada a ser usada en hemodiálisis. [NOTA-Las Prepara-
ciones Estándar y la Preparación de Prueba pueden modificarse, si fuera necesario, para obtener soluciones de concentraciones
adecuadas adaptables al intervalo lineal o de trabajo del instrumento.]

DILUYENTE DE ÁCIDO NÍTRICO

Transferir 40 mL de ácido nítrico a un matraz volumétrico de 1000 mL y diluir a volumen con agua.

PREPARACIONES ESTÁNDAR

Tratar un alambre de aluminio con ácido clorhídrico 6 N a 80º durante algunos minutos. Disolver aproximadamente 100 mg
del alambre tratado, pesados con exactitud, en una mezcla de 1O mL de ácido clorhídrico y 2 mL de ácido nítrico calentando
aproximadamente a 80º durante aproximadamente 30 minutos. Continuar el calentamiento hasta que el volumen se reduzca
aproximadamente a 4 mL. Enfriar a temperatura ambiente y agregar 4 mL de agua. Evaporar hasta aproximadamente 2 mL
calentando. Enfriar y transferir esta solución, con ayuda de agua, a un matraz volumétrico de 100 mL, diluir a volumen con
284 (206) Aluminio/ Pruebas Químicas USP 40

agua y mezclar. Transferir 10,0 mL de esta solución a un segundo matraz volumétrico de 100 mL, diluir a volumen con agua y
mezclar. Transferir 1,0 mL de esta solución a un tercer matraz volumétrico de 100 mL, diluir a volumen con agua y mezclar. La
concentración de aluminio en esta Preparación Estándar es aproximadamente 1,0 µg por ml. Si se requiere una Preparación
Estándar más diluida, transferir porciones de 1,0; 2,0 y 4,0 mL de esta solución a sendos matraces volumétricos de 100 mL,
diluir a volumen con Diluyente de Ácido Nítrico y mezclar. Estas soluciones contienen 0,01 µg; 0,02 µg y 0,04 µg de Al por mL,
respectivamente.

PREPARACIÓN DE PRUEBA

A menos que se indique algo diferente en la monografía correspondiente, transferir una cantidad de la sustancia de prueba
pesada con exactitud (en g), según se indica en la monografía, a un matraz volumétrico de plástico de 100 mL, agregar 50 mL
de agua y someter a ultrasonido durante 30 minutos. Agregar 4 mL de ácido nítrico, diluir a volumen con agua y mezclar.

PROCEDIMIENTO

Determinar las absorbancias de las Preparaciones Estándar y de la Preparación de Prueba en la línea de emisión del aluminio a
309,3 nm, con un espectrofotómetro de absorción atómica adecuado (ver Espectroscopía de Absorción Atómica (852)), equipa-
do con una lámpara de aluminio de cátodo hueco y un horno eléctrico sin llama, empleando Diluyente de Ácido Nítrico como
blanco. Graficar las absorbancias de las Preparaciones Estándar en función del contenido de Al, en µg por mL y trazar la línea
recta que mejor se ajuste a los tres puntos graficados. A partir del gráfico así obtenido, determinar la cantidad, en µg, de Al en
cada mL de la Preparación de Prueba. Calcular la cantidad de Al en la muestra tomada, en µg por g, multiplicando este valor
por 100/W, donde W es el peso, en g, de la sustancia tomada para preparar la Preparación de Prueba.

(207) PRUEBA PARA EL DERIVADO 1,6-ANHIDRO DE ENOXAPARINA

SÓDICA

El siguiente procedimiento se usa para determinar los niveles de las formas 1,6-anhidro en la enoxaparina sódica. [NOTA-La
prueba para el derivado 1,6-anhidro sólo se realiza cuando se especifica en la monografía individual.]

INTRODUCCIÓN
Los disacáridos especificados en este capítulo general se listan por nombre y estructura en el Apéndice 7; los oligosacáridos se
listan en el Apéndice 2.
La despolimerización de la heparina hasta enoxaparina sódica produce una conversión parcial pero característica de glucosami-
nas en las terminales reductoras de las cadenas de oligosacáridos con glucosamina 6-0 sulfato terminal, produciendo deriva-
dos 1,6-anhidro (ver Figura 7).

ºf~o fa~lº*~º fa,:º{to ve

HO OR 1 HO /H
R2
HO OR 1 R1 0 /H
R2 n
HO OR1 HO /H
R2

n=Oa20

Figura 1. Estructura de la enoxaparina sódica que contiene un derivado 1,6-anhidro en el extremo reductor de la cadena.

El porcentaje de cadenas de oligosacáridos que se encuentran cíclicos en un anillo 1,6-anhidro es una característica de la eno-
xaparina sódica.

PROCEDIMIENTOS
• DESPOLIMERIZACIÓN DE ENOXAPARINA SÓDICA POR LAS HEPARINASAS V OLIGOSACÁRIDOS RESULTANTES
La valoración involucra un análisis de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC, por sus siglas en inglés) de una solu-
ción de enoxaparina sódica despolimerizada por una mezcla de heparinasas. Después de la despolimerización enzimática,
los residuos 1,6-anhidro principales de la enoxaparina sódica observados son el 1,6-anhidro LillS, el 1,6-anhidro LillSepi, el
1,6-anhidro LilS y el 1,6-anhidro LilS-ISepi (ver Apéndice 2).
USP 40 Pruebas Químicas/ (207) Prueba para el Derivado 1,6-Anhidro 285

Las heparinasas no escinden completamente el tetrasacárido 1,6-anhidro AIS-ISepi (forma de manosamina 2-0-sulfatada).
Los dos disacáridos (el 1,6-anhidro AllS y el 1,6-anhidro AllSepi), que generalmente coeluyen, tienen mala resolución com-
parados con AllA (ver Apéndice 7), especialmente porque este último se presenta como dos anómeros: a y f3. Para poder
cuantificar el 1,6-anhidro AllS y el 1,6-anhidro AllSePi, la muestra de enoxaparina sódica ya despolimerizada por las hepari-
nasas se reduce con borohidruro de sodio (ver Figura 2).

OR, OH OH O OH OH

RO---- OH
~
~
R1 0 !
~H
' 11 • NaBH4
--
R,O f
~OH
].
OR NHR2 ÓR NHR2
HO NHR2

Figura 2. Reducción de oligosacáridos con borohidruro de sodio

ª
La reducción con borohidruro de sodio elimina el efecto anomérico B /J al abrir el anillo del oligosacárido terminal. Los
cuatro derivados 1,6-anhidro (ver Apéndice 2) no se reducen con el borohidruro de sodio porque el puente 1,6-anhidro
bloquea la apertura del anillo. La reducción de los oligosacáridos disminuye su tiempo de retención, mientras que el tiem-
po de retención de los derivados 1,6-anhidro permanece inmutable. Por esa razón, es posible separar los dos compuestos,
el 1,6-anhidro AllS y el 1,6-anhidro AllSepi, del pico del disacárido AllA reducido. [NOTA-El 1,6-anhidro AllS y el 1,6-anhi-
dro AllSepi eluyen como dos picos sin resolver y se cuantifican juntos como un solo compuesto, el 1,6-anhidro AllS. Por lo
tanto, con el objeto de simplificar, la forma epimérica no se menciona en adelante.]
• PROCEDIMIENTO
Soluciones
Solución A: Disolver 0,280 g de fosfato monobásico de sodio en 950 mL de agua, ajustar con ácido fosfórico a un pH de
3,0 y diluir con agua a 1000 ml.
Solución B: Disolver 140 g de perclorato de sodio en 950 mL de Solución A, ajustar con ácido fosfórico a un pH de 3,0 y
diluir con Solución A a 1000 ml.
Fase móvil: Usar mezclas variables de Solución A y Solución B, filtradas y desgasificadas, según se indica en el Sistema Cro-
matográfico.
Solución de acetato de calcio y sodio de pH 7,0: Disolver 1O mg de albúmina sérica bovina y 32 mg de acetato de
calcio en 60 mL de agua. Agregar 580 µL de ácido acético glacial y ajustar con hidróxido de sodio 2 M a un pH de 7,0.
Transferir a un matraz volumétrico de 100 mL y diluir a volumen con agua. Pasar la solución a través de un filtro con un
tamaño de poro de 0,45 µm o 0,22 µm.
Solución amortiguadora de fosfato de potasio de pH 7,0: Disolver 68 mg de fosfato monobásico de potasio y 1O mg
de albúmina sérica bovina en 30 mL de agua en un matraz volumétrico de 50 mL. Ajustar con hidróxido de potasio, si
fuera necesario, a un pH de 7,0 y diluir a volumen con agua. Pasar la solución a través de un filtro con un tamaño de poro
de 0,45 µm o 0,22 µm.
Solución de borohidruro de sodio: Disolver 12 mg de borohidruro de sodio en 400 µL de agua y mezclar en un mezcla-
dor por vórtice. [NOTA-Preparar inmediatamente antes de usar.]
Solución de heparinasa 1: Disolver heparinasa 1 (ver Especificaciones de Reactivos en Reactivos, Indicadores y Soluciones)
[referencia: heparina liasa 1, EC 4.2.2.7] en Solución Amortiguadora de Fosfato de Potasio de pH 7,0 para obtener una solu-
ción con una actividad de 0,4 UI por ml. Almacenar la solución a -20º hasta el momento de su uso. [NOTA-Las solucio-
nes de heparinasa se pueden almacenar durante 3 meses a -20º.]
Solución de heparinasa 2: Disolver heparinasa 2 (ver Especificaciones de Reactivos en Reactivos, Indicadores y Soluciones
[sin número EC] en Solución amortiguadora de fosfato de potasio de pH 7,0 para obtener una solución con una actividad de
0,4 UI por ml. Almacenar la solución a -20º hasta el momento de su uso.
Solución de heparinasa 3: Disolver heparinasa 3 (ver Especificaciones de Reactivos en Reactivos, Indicadores y Soluciones)
[referencia: heparitinasa 1, EC 4.2.2.8] en Solución amortiguadora de fosfato de potasio de pH 7, O para obtener una solución
con una actividad de 0,4 UI por ml. Almacenar la solución a -20º hasta el momento de su uso.
Solución de Heparinasas 1, 2 y 3: Preparar una mezcla 1: 1: 1 (v:v:v) de Solución de heparinasa 7, Solución de heparinasa 2
y Solución de heparinasa 3.
Soluciones para identificación de los picos
[NOTA-Las soluciones de prueba y las Soluciones estándar despolimerizadas se deben preparar al mismo tiempo. Las solucio-
nes de prueba despolimerizadas son estables durante 1 mes a -20º. Igualmente, las soluciones de prueba y las Soluciones
estándar reducidas se deben preparar al mismo tiempo. Las soluciones reducidas también son estables durante 1 mes a
-20º.]
Soluciones de disacáridos: Preparar por separado una solución con 0,25 mg por mL de cada disacárido 1 AIA, AllA, AlllA,
AIVA, AIS, AllS, AlllS, AIVS (ver Apéndice 7). Inyectar en el cromatógrafo cada solución de disacárido y registrar el cromato-
grama.

1Se pueden obtener disacáridos adecuados de Grampian Enzymes (GE-Hl 001, GE-Gl 002, GE-Hl 003, GE-Hl 004, GE-Hl 005, GE-Hl 006, GE-Hl 007, GE-Hl 008),
Nisthouse, Harray, Orkney, KWl 7 2LQ, Reino Unido, Tel: 01856 771 771, Scottish Local Authority: Orkney lslands.
286 (207) Prueba para el Derivado 1,6-Anhidro / Pruebas Químicas USP 40

Soluciones de disacáridos reducidos: A 60 µL de cada Solución de Disacárido, agregar 1O µL de Solución de Borohidruro

de Sodio recién preparada. Mezclar en un mezclador por vórtice y dejar en reposo a temperatura ambiente durante al
menos 4 horas. Inyectar en el cromatógrafo cada solución y registrar el cromatograma.
Solución blanco: Preparar una mezcla de 20 µL de agua, 70 µL de Solución de acetato de calcio y sodio de pH 1,0 y 100 µL
de la Solución de heparinasas 7, 2 y 3. Mezclar suavemente por inversión y dejar en reposo durante al menos 48 horas en
un baño de agua a 25º. Preparar una mezcla de 60 µL de esta solución despolimerizada con 1O µL de Solución de borohi-
druro de sodio recién preparada. Homogeneizar y dejar en reposo a temperatura ambiente durante al menos 4 horas. In-
yectar en el cromatógrafo la solución resultante y registrar el cromatograma.
Solución de prueba 1: Preparar dos soluciones, cada una con 20 mg de enoxaparina sódica en 1 mL de agua.
Solución estándar 1: Preparar una solución que contenga 20 mg de ER Enoxaparina Sódica USP en 1 mL de agua.
Solución de prueba 2: Para cada solución, preparar una mezcla de 20 µL de Solución de prueba 7, 70 µL de Solución de
acetato de calcio y sodio de pH 7,0 y 100 µL de la Solución de heparinasas 7, 2 y 3. Mezclar suavemente por inversión y
dejar en reposo durante al menos 48 horas en un baño de agua a 25º. Después de 48 horas de despolimerización, inyec-
tar en el cromatógrafo la solución y registrar el cromatograma.
Solución estándar 2: Preparar una mezcla de 20 µL de Solución estándar 7, 70 µL de Solución de acetato de calcio y sodio
de pH 7, O y 100 µL de la Solución de heparinasas 1, 2 y 3. Mezclar suavemente y dejar en reposo durante al menos 48
horas en un baño de agua a 25º. Después de 48 horas de despolimerización, inyectar en el cromatógrafo la solución y
registrar el cromatograma.
Solución de prueba 3: Para cada solución de prueba despolimerizada, preparar una mezcla de 60 µL de Solución de Prue-
ba 2 y 1O µL de Solución de Borohidruro de Sodio recién preparada. Homogeneizar y dejar en reposo, sin ajustar la tapa, a
temperatura ambiente durante al menos 4 horas antes de inyectarla en el cromatógrafo. La Solución de Prueba 3 es estable
durante 48 horas a temperatura ambiente.
Solución estándar 3: Preparar una mezcla de 60 µL de Solución Estándar 2 y 1O µL de Solución de Borohidruro de Sodio
recién preparada. Homogeneizar, mezclar en un mezclador por vórtice y dejar en reposo, sin ajustar la tapa, a temperatu-
ra ambiente durante al menos 4 horas antes de inyectarla en el cromatógrafo. La Solución Estándar 3 es estable durante 48
horas a temperatura ambiente.
Sistema cromatográfico
(Ver Cromatografía (621 ).)
Equipar el cromatógrafo de líquidos con un detector a 234 nm y una columna de 3 mm x 25 cm rellena con material L14
de 5 µm de. Se debe usar también una guarda columna rellena con el mismo material. La velocidad de flujo es de 0,45
mL por minuto, la temperatura de la columna se mantiene a 50º y el volumen de inyección es 1O µL. Programar el cro-
matógrafo del siguiente modo.

Tiempo
(minutos) Solución A(%) Solución B (%) Eluclón
0-20 97-->65 3-->35 Gradiente lineal
20-50 65-->0 35--> 100 Gradiente lineal
50-60 o 100 !socrática
60-61 0--.97 100-->3 Gradiente lineal para reequilibrio
61-79 97 3 !socrática para reequilibrio

Inyectar en el cromatógrafo la Solución de Ppueba 3 reducida y la Solución estándar 3 reducida y registrar el cromatograma
según se indica en el Procedimiento.
Prueba de aptitud de la despolimerización: El cociente de área entre los picos de 1,6-anhidro-~IS-IS y 1,6-anhidro ~IS
no es mayor de 1, 15 para la Solución estándar 2 despolimerizada.
Prueba de aptitud del desempeño de la columna: Identificar los picos correspondientes al ~IA reducido y al 1,6-anhi-
dro-~IS para la Solución estándar 3: el tiempo de retención del ~IS reducido está entre 27 y 33 minutos para la Solución
estándar 3 despolimerizada y reducida; y la resolución, R, entre el ~ 1A reducido y el 1,6-anhidro-~IS no es menor de 1,5.
Prueba de aptitud de la reducción: El cociente de área entre los picos de disacárido ~IS y ~IS reducido en la Solución
estándar 3 despolimerizada y reducida y la Solución de prueba 3 no es más de 0,02%.
Procedimiento y Cálculos: Inyectar por separado en el cromatógrafo volúmenes iguales de la Solución de Prueba 3 redu-
cida y de la Solución Estándar 3 reducida. Usar el método de porcentaje de área normalizada para el cálculo. Los picos se
integran desde el pico de volumen muerto hasta el último pico detectado. Medir el área del pico de cada analito exclu-
yendo los picos de los disolventes al comienzo del cromatograma y en la Solución Blanco. Usando los cromatogramas de
las Soluciones de Disacáridos Reducidos obtenidos previamente, identificar los picos pertenecientes a los ocho disacáridos
reducidos en los cromatogramas de la Solución de Prueba 3 y la Solución Estándar 3. Los picos pertenecientes al 1,6-Anhi-
dro ~IS, 1,6-Anhidro ~llS y 1,6-Anhidro ~IS-ISepi se identifican a partir de los tiempos de retención relativos proporciona-
dos en la Tabla 7 y del Cromatograma de referencia proporcionado con el ER Enoxaparina Sódica USP. Una vez identifica-
dos los picos, utilizar los valores en la Tabla 7 para calcular el porcentaje (p/p) de los tres principales derivados 1,6-anhi-
dro, obtenidos después de la despolimerización de la enoxaparina sódica, usando la siguiente fórmula:
USP 40 Pruebas Químicas/ (207) Prueba para el Derivado 1,6-Anhidro 287

% 1,6-anhidro i (p/p) = (100 x MW; x A;)/ L(MWx x Ax)

MW; = peso molecular del pico i del 1,6-anhidro

A; = área del pico i del 1,6-anhidro
MWx = peso molecular del pico X o de la zona X especificados por su tiempo de retención
Ax = área del pico X o de la zona X especificados por su tiempo de retención
[NOTA-Una vez establecido el método, los picos pertenecientes a los diferentes disacáridos y tetrasacáridos se pueden identifi-
car fácilmente por medio del cromatograma del ER Enoxaparina Sódica USP. Por lo tanto, el uso de los Estándares de disacá-
ridos sólo es necesario durante la etapa de implementación del método.]
Calcular el porcentaje molar de los componentes que contienen una estructura 1,6-anhidro en el extremo reductor de su
cadena en la muestra de prueba de enoxaparina sódica de acuerdo con la siguiente fórmula:

%1,6anhidro =100xLM:,~Áreax x
(ÁreaLlls1,6anhidro + ÁreaLllls1 ,6anhidro + ÁreaLlls - ls1 ,6anhidro)

en donde MW es el peso molecular promedio en peso (ver prueba de Identificación D en Enoxaparina Sódica); MWx y
Áreax son el peso molecular y el área, respectivamente, del pico X o del intervalo X, especificados por su tiempo de re-
tención. El porcentaje molar de los componentes que tienen una estructura 1,6-anhidro en el extremo reductor de su
cadena está entre 15% y 25%. En la Tabla 1 se proporcionan los tiempos de retención y las masas moleculares típicos
atribuidos a las diferentes estructuras de oligosacáridos.
Tabla 1. Tiempos de Retención Relativos (tRR) y Masas Moleculares Típicos Atribuidos a los Diferentes Compuestos*
Masa
Molecular
Compuesto tRR (daltones)
- < 0,25 741
L'.IVA reducido 0,25 401
- 0,25 <t 00 < 0,51 741
L'.IV5 reducido 0,51 461
- 0,51 < tRR < 0,55 483
L'.llA reducido 0,55 503
- 0,55 < tRR < 0,59 503
1,6-Anhidro L'.115 0,59 443
- 0,59 < tRR < 0,64 503
t.lllA reducido 0,64 503
- 0,64 < tRR < 0.72 533
L'.115 reducido 0,72 563
- 0,72 < tRR < 0,80 563
t.1115 reducido 0,80 563
- 0,80 < tRR < 0,88 583
t.IA reducido 0,88 605
- 0,88 <t•• < 0,90 635
1,6-Anhidro t.15 0,90 545
- 0,90 < tRR <0,98 635
t.llA-IV5glu reducido 0,98 1066
- 0,98< tRR <1,00 635
L'.15 reducido 1,00 665
- 1,00< tRR <1,04 665
L'.15 1,04 665
- 1,04< tRR <1,10 1228
t.llA-~ reducido 1,10 1168
- 1,10< t 00 <1,27 1228
1,6-Anhidro t.15-15 1,27 1210
- tRR >1,27 1228
* Los tiempos de retención relativos se obtuvieron con una partida de enoxaparina sódica despolimerizada y reducida. Se expresan con respecto al tiempo de
retención del pico principal correspondiente al LllS reducido. Se debe tener en cuenta que los tiempos de retención relativos pueden variar un poco, dependien-
do de la calidad de la columna.
288 (207) Prueba para el Derivado 1,6-Anhidro / Pruebas Químicas USP 40

REQUISITOS ADICIONALES
• ESTÁNDARES DE REFERENCIA USP (11)
ER Enoxaparina Sódica USP

APÉNDICES
• APÉNDICE 1: ESTRUCTURAS DE DISACÁRIDOS ESTÁNDARES

AIVA O- Na+ OH AUA-(1->4)a-GlcNAc

ºQ-0-~
HO OH HO NH

o=(
CH,

AIVS AUA-(1->4)a-GlcN(NS)

ºP-h-o•
HO OH HO

o'i\o
NH
º..:::::-1
No'

AllA O- Na+ AUA-(1->4)a-GlcNAc(6S)

º~¡
O- Na+ º/b

ºJtº.~00 o=(
CH,

AlllA O- Na+ OH AUA-2S-(1->4)a-GlcNAc

ºQ-~
HO
1/
",b
o
o~~

HO
o
\NH
OH

o~
o'i b- Na+
o=(
CH,

AllS 0- Na+ AUA-(l ->4)a-GlcN (NS,65)

O- Na+ ~\

ºft·b--00
HO OH HO
º~l
NH

o'i b- Na+

AlllS O- Na+ OH AUA-2S-(1->4)a-GlcN (NS)

º~h-o ~o
HO
1/
\:i
O ~

HO \NH
OH

º?\
o O-Na+
º?\
o O-Na+

AIA O- Na+ AUA-2S-(1->4)a-GlcNAc(6S)

º~i
O- Na+ º-:/b

º~Je º-::::-!
o-::::-\ - o
=(
O Na+ CH3
USP 40 Pruebas Químicas/ (207) Prueba para el Derivado 1,6-Anhidro 289

1\15 O- Na+ UA-25-(1 ~4)a-GlcN (NS,65)

O- Na+ >~

ºG-~r
HO
o~
O HO NH
º::::::./
o-:/ 'o- Na+ O-/ b- Na+

• APÉNDICE 2: ESTRUCTURAS DE OLIGOSACÁRIDOS

1,6-Anhidro !\IS o
1,6-Anhidro 1\15 glucosa

1,6-Anhidro 1\115 o
1,6-Anhidro 1\115 glucosa

1,6-Anhidro 1\115 epi o

fj-~"
1,6-Anhidro 1\115 manosa

HO OH HO NH
o~
o'i b- Na+
l\llA-IVSglu

1,6-Anhidro 1\15-15 epi

o
1,6-Anhidro 1\15-15 manosa
290 (208) Valoración de Actividad Anti-Factor / Pruebas Químicas USP 40

(208) VALORACIÓN DE ACTIVIDAD ANTI-FACTOR Xa Y ANTI-FACTOR

lla PARA HEPARINAS NO FRACCIONADAS Y DE BAJO PESO
MOLECULAR

Este capítulo provee información y procedimientos para determinar la actividad inhibitoria del factor Xa y la actividad inhibito-
ria del factor lla (trombina) de las heparinas no fraccionadas (HNF) y heparinas de bajo peso molecular (HBPM).
INTRODUCCIÓN
Las heparinas no fraccionadas y las heparinas de bajo peso molecular ejercen su efecto anticoagulante mediante la potencia-
ción de la actividad de los inhibidores de coagulación del plasma. De todos los glicosaminoglicanos comúnmente conoci-
dos, sólo las HNF, las HBPM y el heparán sulfato (referidos en lo sucesivo como heparina) contienen una secuencia de penta-
sacáridos específica que puede unirse al inhibidor de coagulación del plasma, la antitrombina (AT). Por lo tanto, se desarro-
llan valoraciones que dependen de la AT para asegurar la especificidad de los métodos para medir la actividad anticoagulan-
te de la heparina. La unión de la heparina con la AT provoca un cambio de conformación en la molécula de AT. Este cambio
de conformación incrementa la unión del complejo AT-heparina con los factores activados de coagulación, principalmente
el factor lla (trombina) y el factor Xa, causando su inhibición. Una vez que la AT ha sido activada por la secuencia de penta-
sacáridos de la heparina, ésta interactúa con los factores Xa y lla mediante su bucle central reactivo. Para conseguir una inhi-
bición eficiente de trombina, la molécula de heparina también debe unirse a la antritombina y al factor lla. Dicha interacción
requiere un segmento extra de aproximadamente 13 monosacáridos, acoplados al extremo no reductor de la secuencia de
pentasacáridos de la heparina, que se une a la AT. Este segmento mínimo de la molécula de heparina necesario para inhibir
la trombina con AT, conocido como dominio C, tiene un peso molecular aproximado de 5400 Da. Aunque la potenciación
de la capacidad de la antitrombina para inactivar el factor Xa también depende del peso molecular, las unidades adicionales
de sacáridos del dominio C no son esenciales, y una heparina con un peso molecular menor de 5400 Da puede potenciar la
capacidad de la antitrombina para inactivar el factor Xa. Por convención, el cociente de potencia entre el anti-factor Xa y el
anti-factor llapara HNF es 1. La HNF es heterogénea y polidispersa, pero contiene poco o ningún material con un peso mo-
lecular menor de 5400 Da. Los pesos moleculares promedio de los productos de HBPM son menores que aquéllos de las
HNF, y contienen una proporción mayor de material de peso molecular menor de 5400 Da. El cociente entre las potencias
de anti-factor Xa y anti-factor lla para HBPM es mayor que 1,5. Este capítulo describe procedimientos de valoración para
medir la actividad anti-factor Xa y anti-factor lla de las HBPM en presencia de AT.
En el sistema de prueba, la heparina se une a la AT, y el factor lla o el factor Xa agregado a la mezcla se une al complejo de
heparina-AT. El factor lla o factor Xa residual no inhibido por el complejo de heparina-AT se cuantifica mediante un sustrato
cromogénico que es específico para el factor lla o el factor Xa y se agrega en la etapa final. Los analistas observan una rela-
ción inversa en la que una mayor cantidad de enzima residual produce más color, lo cual equivale a una menor actividad de
heparina.
Al igual que con cualquier valoración enzimática, la temperatura y el tiempo de la reacción, el manejo adecuado de los reacti-
vos y su orden de adición representan aspectos críticos para el desempeño óptimo de la valoración.
Valoraciones de Actividad Anti-factor Xa y Anti-factor lla para Heparinas No Fraccionadas
• ACTIVIDAD ANTI-FACTOR Xa PARA HNF
El siguiente procedimiento se usará siempre que se especifique en las monografías individuales. Esta valoración se puede
llevar a cabo manualmente en tubos de plástico usando un bloque termostático o un baño de agua termostatizado. Un
equipo para placa de microtitulación con un lector y un coagulómetro automático pueden mejorar la reproducibilidad y el
rendimiento.
Solución amortiguadora de pH 8,4: Disolver cantidades de tris(hidroximetil)aminometano, ácido edético o edetato só-
dico y cloruro de sodio en agua que contenga O, 1% de polietilenglicol 6000 para obtener soluciones con concentraciones
0,050 M, 0,0075 M y O, 175 M, respectivamente. Ajustar, si fuera necesario, con ácido clorhídrico o solución de hidróxido
de sodio a un pH de 8,4.
Solución de antitrombina: Reconstituir un vial de antitrombina (ver Reactivos, Indicadores y Soluciones-Especificaciones
de Reactivos) según lo indicado por el fabricante y diluir esta solución con Solución amortiguadora de pH 8,4 hasta obtener
una solución con una concentración de 1,0 UI de Antitrombina/ml.
Solución de factor Xa: Reconstituir factor Xa bovino según lo indicado por el fabricante (ver Factor Xa en Reactivos, Indi-
cadores y Soluciones-Especificaciones de Reactivos) y diluir con Solución amortiguadora de pH 8,4 hasta obtener una solu-
ción que proporcione un valor de absorbancia de 0,65-1,25 a 405 nm cuando se valora según se indica a continuación,
pero usando 30 µL de Solución amortiguadora de pH 8,4 en lugar de 30 µL de las Soluciones estándar o de las Soluciones
muestra. [NOTA-La Solución de factor Xa contiene aproximadamente 3 unidades nanocatalíticas/mL, pero puede variar
dependiendo del fabricante del factor Xa o del sustrato usado.]
Solución de sustrato cromogénico: Preparar una solución de un sustrato cromogénico adecuado para la prueba amido-
lítica (ver Reactivos, Indicadores y Soluciones-Especificaciones de Reactivos) específico para factor Xa en agua para obtener
una concentración 1 mM.
Solución de detención: Solución de ácido acético al 20% (v/v)
USP 40 Pruebas Químicas/ (208) Valoración de Actividad Anti-Factor 291

Soluciones estándar: Reconstituir todo el contenido de una ampolla de ER Heparina Sódica para Valoraciones USP con
agua y diluir con Solución amortiguadora de pH 8,4 hasta obtener al menos 5 diluciones en el intervalo de concentración
de 0,03-0,375 Unidades USP de Heparina/ml.
Soluciones muestra: Disolver o diluir una cantidad medida con exactitud de Heparina Sódica en Solución amortiguadora
de pH 8,4 y diluir con la misma solución amortiguadora hasta obtener soluciones con actividades aproximadamente igua-
les a las de las Soluciones estándar.
Análisis: [NOTA-El procedimiento también se puede realizar usando plataformas alternativas. Realizar la prueba con cada
Solución estándar y Solución muestra por duplicado.]
Transferir 120 µL de Solución amortiguadora de pH 8,4 a cada una de las series de tubos de plástico adecuados colocados
en un baño de agua ajustado a 37°. Luego, transferir por separado 30 µL de las diferentes diluciones de las Soluciones
estándar o de las Soluciones muestra a los tubos. Agregar 150 µL de Solución de antitrombina, entibiada previamente a
37° durante 15 minutos, a cada tubo, mezclar e incubar durante 2 minutos. Agregar 300 µL de Solución de factor Xa,
entibiada previamente a 37° durante 15 minutos, a cada tubo, mezclar e incubar durante 2 minutos. Agregar 300 µL de
Solución de sustrato cromogénico, entibiada previamente a 37º durante 15 minutos, a cada tubo, mezclar e incubar du-
rante exactamente 2 minutos. Agregar 150 µL de Solución de detención a cada tubo y mezclar. Preparar un blanco para
ajustar a cero el espectrofotómetro, agregando los reactivos en el orden inverso, comenzando con la Solución de deten-
ción y finalizando con la adición de 150 µL de Solución amortiguadora de pH 8,4, y omitiendo las Soluciones estándar o las
Soluciones muestra. Registrar la absorbancia a 405 nm contra el blanco. Se puede aumentar o reducir el volumen de los
reactantes para ajustarse al formato de la valoración, siempre que las proporciones de la muestra de referencia o de la
muestra de prueba y de los reactivos se mantengan iguales.
Cálculos: Graficar el logaritmo de los valores de absorbancia de las Soluciones estándar y de las Soluciones muestra en fun-
ción de las concentraciones de heparina, en Unidades USP. Calcular la actividad de heparina sódica, en Unidades
USP/mg, usando métodos estadísticos para análisis de razón de pendientes. Calcular la actividad antifactor Xa de la hepa-
rina sódica:
Resultado= A x (Sri S5)

A = potencia del ER Heparina Sódica para Valoraciones USP

Sr = pendiente de la recta de las Soluciones muestra
S5 = pendiente de la recta de las Soluciones estándar
Expresar la actividad anti-factor Xa de la Solución muestra como Unidades USP de Heparina/mg, calculada con respecto a
la sustancia seca. Calcular el cociente de la actividad anti-factor Xa en función de la potencia anti-factor lla (ver la Valora-
ción a continuación):

actividad anti-factor Xa/potencia anti-factor lla

Criterios de aceptación: 0,9-1, 1
• ACTIVIDAD ANTI-FACTOR Ha PARA HEPARINAS No FRACCIONADAS
Solución amortiguadora de pH 8,4: Disolver 6, l O g de tris(hidroximetil)aminometano, 10,20 g de cloruro de sodio,
2,80 g de edetato sódico y, si fuera adecuado, 0-10,00 g de polietilenglicol 6000 y/o 2,00 g de albúmina sérica bovina
en 800 mL de agua. [NOTA-Se pueden usar 2,00 g de albúmina humana en lugar de 2,00 g albúmina sérica bovina.]
Ajustar con ácido clorhídrico a un pH de 8,4 y diluir con agua hasta 1000 ml.
Solución de antitrombina: Reconstituir un vial de antitrombina (ver Reactivos, Indicadores y Soluciones-Especificaciones
de Reactivos) en agua para obtener una solución de 5 UI de Antitirombina/mL. Diluir esta solución con Solución amortigua-
dora de pH 8,4 hasta obtener una solución con una concentración de 0, 125 UI de Antitrombina/ml.
Solución de trombina humana: Reconstituir trombina humana (factor lla) (ver Reactivos, Indicadores y Soluciones-Especi-
ficaciones de Reactivos) en agua para obtener una solución de 20 UI de Trombina/mL y diluir con Solución amortiguadora
de pH 8,4 hasta obtener una solución con una concentración de 5 UI de Trombina/ml. [NOTA-La trombina debe tener
una actividad específica de no menos de 750 Ul/mg.]
Solución de sustrato cromogénico: Preparar una solución de un sustrato cromogénico de trombina adecuado para
prueba amidolítica (ver Reactivos, Indicadores y Soluciones-Especificaciones de Reactivos) en agua para obtener una con-
centración 1,25 mM.
Solución de detención: Solución de ácido acético al 20% (v/v)
Soluciones estándar: Reconstituir todo el contenido de una ampolla de ER Heparina Sódica para Valoraciones USP con
agua y diluir con Solución amortiguadora de pH 8,4 hasta obtener al menos cuatro diluciones en el intervalo de concentra-
ción de 0,005-0,03 Unidades USP de Heparina/mL.
Soluciones muestra: Proceder según se indica en Soluciones estándar para obtener concentraciones de Heparina Sódica
similares a las obtenidas para las Soluciones estándar.
Análisis: [NOTA-El procedimiento también se puede realizar usando plataformas alternativas.] Para cada una de las dilu-
ciones de las Soluciones estándar y de las Soluciones muestra, se deben analizar al menos muestras por duplicado. Etiquetar
un número adecuado de tubos dependiendo del número de determinaciones repetidas a analizar. Por ejemplo, si se van a
usar cinco blancos: Bl, B2, B3, B4 y B5 para los blancos; Tl, T2, T3 y T4 cada uno al menos por duplicado para las dilu-
ciones de las Soluciones muestra; y Sl, S2, S3 y S4 cada uno al menos por duplicado para las diluciones de las Soluciones
292 (208) Valoración de Actividad Anti-Factor/ Pruebas Químicas USP 40

estándar. Distribuir los blancos sobre las series de manera que representen exactamente el comportamiento de los reacti-
vos durante los experimentos. [NOTA-Tratar los tubos en el siguiente orden: Bl, Sl, S2, S3, S4, B2, Tl, T2, T3, T4, B3,
Tl, T2, T3, T4, B4, Sl, S2, S3, S4, B5.] Cabe destacar que después de cada adición de un reactivo, la mezcla de incuba-
ción se debe mezclar evitando la formación de burbujas. Agregar el doble del volumen (100-200 µL) de Solución de anti-
trombina a cada tubo que contenga un volumen (50-100 µL) de Solución amortiguadora de pH 8,4 o de una dilución apro-
piada de las Soluciones muestra o de las Soluciones estándar. Mezclar evitando la formación de burbujas. Incubar a 37°
durante al menos 1 minuto. Agregar a cada tubo 25-50 µL de Solución de trombina humana e incubar durante al menos 1
minuto. Agregar 50-100 µL de Solución de sustrato cromogénico. Es importante destacar que todos los reactivos, Soluciones
estándar y Soluciones muestra deben entibiarse previamente a 37º justo antes de su uso. Se puede aumentar o reducir el
volumen de los reactantes para ajustarse al formato de la valoración, siempre que las proporciones de la muestra de refe-
rencia o de la muestra de prueba y de los reactivos se mantengan iguales.
Se pueden registrar dos tipos de mediciones diferentes:
1. Medición del Punto Final: Detener la reacción después de al menos 1 minuto con 50-100 µL de Solución de deten-
ción. Medir la absorbancia de cada solución a 405 nm usando un espectrofotómetro adecuado (ver Espectroscopía
Ultravioleta-Visible (857)). La desviación estándar relativa es menos de 10% para las lecturas del blanco.
2. Medición Cinética: Seguir el cambio en la absorbancia para cada solución durante 1 minuto a 405 nm usando un
espectrofotómetro adecuado (ver (857)). Calcular el cambio en la absorbancia/min (L'iOD/min). Los blancos para la
medición cinética también se expresan en L'iOD/min y deben proporcionar los valores más altos debido a que se
realizan en ausencia de heparina. La desviación estándar relativa es menos de 10% para las lecturas del blanco.
Cálculos: Se pueden usar los modelos estadísticos de Método de razón de pendientes o Método de líneas paralelas depen-
diendo de qué modelo describa mejor la correlación entre concentración y respuesta.
Método de razón de pendientes: Para cada una de las series, calcular la regresión del logaritmo de absorbancia o el
logaritmo del cambio en la absorbancia/minuto en función de las concentraciones de las Soluciones muestra y de las Solu-
ciones estándar, y calcular la potencia de heparina sódica en Unidades USP/mL, usando métodos estadísticos para los mé-
todos de razón de pendientes. Expresar la potencia de heparina sódica/mg, calculada con respecto a la sustancia seca.
Método de líneas paralelas: Para cada una de las series, calcular la regresión de la absorbancia o el cambio en la absor-
bancia/minuto en función del logaritmo de las concentraciones de las Soluciones muestra y de las Soluciones estándar, y
calcular la potencia de heparina sódica, en Unidades USP/mL, usando métodos estadísticos para métodos de líneas para-
lelas. Expresar la potencia de heparina sódica/mg, calculada con respecto a la sustancia seca.
Criterios de aceptación: La potencia de heparina sódica, calculada con respecto a la sustancia seca, es no menos de 180
Unidades USP de Heparina en cada mg.
Valoraciones de Actividad Anti-factor Xa y Anti-factor Ha para Heparinas de Bajo Peso Molecular
El siguiente procedimiento se usará siempre que se especifique en las monografías individuales. Esta valoración se puede llevar
a cabo manualmente en tubos de plástico usando un bloque termostático o un baño de agua termostatizado. Un equipo
para placa de microtitulación con un lector y un coagulómetro automático pueden mejorar la reproducibilidad y el rendi-
miento. Se usa solución de ácido acético (solución de detención) para la valoración manual y en placa de microtitulación.
Los coagulómetros automáticos miden la velocidad cinética inicial y, por consiguiente, no es necesario detener la reacción.
• ACTIVIDAD ANTI-FACTOR Xa PARA HEPARINAS DE BAJO PESO MOLECULAR
Solución de ácido acético: Ácido acético glacial y agua (42:58)
Solución amortiguadora de polietilenglicol 6000 de pH 7,4: Disolver 6,08 g de tris(hidroximetil)aminometano y 8,77 g
de cloruro de sodio en 500 mL de agua. Agregar 1,0 g de polietilenglicol 6000 ó 10,0 g de albúmina sérica bovina, ajus-
tar con ácido clorhídrico a un pH de 7,4 y diluir con agua hasta 1000 ml.
Solución amortiguadora de pH 7,4: Disolver 6,08 g de tris(hidroximetil)aminometano y 8,77 g de cloruro de sodio en
500 mL de agua. Ajustar con ácido clorhídrico a un pH de 7,4 y diluir con agua hasta 1000 ml.
Solución amortiguadora de pH 8,4: Disolver 3,03 g de tris(hidroximetil)aminometano, 5, 12 g de cloruro de sodio y
1,40 g de edetato sódico en 250 mL de agua. Ajustar con ácido clorhídrico a un pH de 8,4 y diluir con agua hasta 500
mL.
Solución de antitrombina humana: Reconstituir un vial de antitrombina humana (ver Reactivos, Indicadores y Solucio-
nes-Especificaciones de Reactivos) en agua para obtener una solución que contenga 5 Unidades de Antitrombina por ml.
Diluir esta solución con Solución amortiguadora de polietilenglicol 6000 de pH 7,4 hasta obtener una solución con una con-
centración de 1,0 Unidad de Antitrombina/mL.
Solución de factor Xa: Reconstituir una cantidad pesada con exactitud de factor Xa bovino (ver Reactivos, Indicadores y
Soluciones-Especificaciones de Reactivos) según se indica en las instrucciones del fabricante. Diluir esta solución madre con
Solución amortiguadora de polietilenglicol 6000 de pH 7,4 hasta obtener una solución que proporcione un incremento en el
valor de absorbancia a 405 nm de no más de 0,20 unidades de absorbancia/min o 0,8 unidades de absorbancia después
de 4 minutos de incubación con el sustrato cromogénico cuando se valora según se describe a continuación, pero usando
como un volumen apropiado, V, el volumen, en µL, de Solución amortiguadora de pH 7,4 en lugar de V µL de la solución
estándar o la solución muestra.
Solución de sustrato cromogénico: Preparar una solución de un sustrato cromogénico adecuado para prueba amidolíti-
ca (ver Reactivos, Indicadores y Soluciones-Especificaciones de Reactivos) para factor Xa en agua para obtener una concen-
USP 40 Pruebas Químicas/ (208) Valoración de Actividad Anti-Factor 293

tración aproximadamente 3 mM. Diluir con Solución amortiguadora de pH 8,4 hasta obtener una solución con una con-
centración de 0,5 mM. [NOTA-Calentar previamente los reactivos a 37 ± 1º 15 minutos antes de su uso.]
Soluciones estándar: Reconstituir y diluir todo el contenido de una ampolla de ER Heparina de Bajo Peso Molecular para
Valoraciones Biológicas USP con agua destilada y luego diluir con Solución amortiguadora de pH 7,4 hasta obtener al me-
nos cuatro diluciones en el intervalo de concentración de 0,025-0,2 Unidades USP de anti-factor Xa/ml.
Soluciones muestra: Proceder según se indica en Soluciones estándar para obtener concentraciones de HBPM similares a
las obtenidas para las Soluciones estándar.
Análisis
Muestras: Soluciones estándar, Soluciones muestra, Solución de antitrombina humana, Solución amortiguadora de pH 7,4,
Solución de factor Xa, Solución de sustrato cromogénico y Solución de ácido acético
Etiquetar 18 tubos adecuados: Bl y B2 para los blancos; Tl, T2, T3 y T4 cada uno por duplicado para las diluciones de
las Soluciones muestra; y 51, 52, 53 y 54 cada uno por duplicado para las diluciones de las Soluciones estándar. [NOTA-
Tratar los tubos en el orden siguiente: Bl, 51, 52, 53, 54, Tl, T2, T3, T4, Tl, T2, T3, T4, 51, 52, 53, 54, B2.] Agregar a
cada tubo 50 µL de Solución de antitrombina humana y un volumen igual, V, de la Solución amortiguadora de pH 7,4
(Blanco) o de una dilución apropiada de las Soluciones muestra o de las Soluciones estándar. Mezclar evitando la forma-
ción de burbujas. Incubar a 37º durante al menos 1,O minuto. Agregar a cada tubo 100 µL de Solución de factor Xa e
incubar durante 1,0 minuto. Agregar 250 µL de Solución de sustrato cromogénico. Detener la reacción después de apro-
ximadamente 4,0 minutos con 250 µL de Solución de ácido acético. Medir la absorbancia de cada solución a 405 nm
usando un espectrofotómetro adecuado (ver (857)). Usar cubetas de cuarzo o de poliestireno desechables. Se puede
aumentar o reducir el volumen de los reactantes para ajustarse al formato de la valoración, siempre que las proporcio-
nes de la muestra de referencia o de la muestra de prueba y de los reactivos se mantengan iguales.
Aptitud del sistema: La valoración es válida si se cumplen los siguientes requisitos:
1. Una solución blanco proporciona un incremento en el valor de absorbancia a 405 nm de no más de 0,20 unidades
de absorbancia/min (o un total de 0,8 unidades de absorbancia) cuando se valora usando un volumen apropiado (50
µL) de Solución amortiguadora de pH 1,4 en lugar de 50 µL de la Solución estándar o de la Solución muestra.
2. La lectura del blanco B2 no difiere en más de ±0,05 unidades de absorbancia con respecto al blanco Bl.
Cálculos: Para esta valoración biológica, se pueden aplicar análisis de líneas paralelas o de razón de pendientes.
Calcular la potencia de la muestra de prueba, en Unidades USP de anti-factor Xa/mL, usando un modelo estadístico para
líneas paralelas, graficando la absorbancia en función de las concentraciones logarítmicas de las Soluciones muestra y de
las Soluciones estándar. En algunos casos, la transformación logarítmica de la absorbancia puede ser necesaria para obte-
ner la linealidad para las curvas de dosis-respuesta. La valoración es válida cuando los datos cumplen con los criterios de
aceptación para regresión, linealidad y paralelismo, conforme a lo requerido para el método de líneas paralelas. Para el
análisis de razón de pendientes, graficar la absorbancia en función de las concentraciones de las Soluciones muestra y de
las Soluciones estándar. En algunos casos, la transformación logarítmica de la absorbancia puede ser necesaria para obte-
ner la linealidad de las curvas de dosis-respuesta. La valoración es válida cuando los datos cumplen con los criterios de
aceptación para regresión, linealidad y ordenada al origen común, conforme a lo requerido para el método de razón de
pendientes (ver Diseño y Análisis de Valoraciones Biológicas (111) y Análisis de Valoraciones Biológicas (l 034)).
Expresar la actividad anti-factor Xa de la muestra/mg, calculada con respecto a la sustancia seca:
Unidades USP de Anti-factor Xa/mg = [potencia del estándar
(Unidades USP/mL) x cociente de potencia]/[concentración de la muestra (mg/mL)]
• ACTIVIDAD ANTI-FACTOR lla PARA HEPARINAS DE BAJO PESO MOLECULAR
Solución de ácido acético, Solución amortiguadora de polietilenglicol 6000 de pH 7,4, Solución amortiguadora de
pH 7,4, Solución amortiguadora de pH 8,4 y Solución de antitrombina humana: Proceder según se indica en Activi-
dad Anti-Factor Xa, excepto que la concentración de la Solución de antitrombina humana es 0,5 Unidades de
Antitrombina/ml.
Solución de trombina humana: Reconstituir trombina (ver Reactivos, Indicadores y Soluciones-Especificaciones de Reacti-
vos) en agua y diluir con Solución amortiguadora de polietilenglicol 6000 de pH 7,4 hasta obtener una solución con una
concentración de 5 Unidades de Trombina/ml. Usar la Solución de trombina humana inmediatamente después de su pre-
paración.
Solución de sustrato cromogénico: Preparar una solución de un sustrato cromogénico adecuado para la prueba amido-
lítica (ver Reactivos, Indicadores y Soluciones-Especificaciones de Reactivos) para trombina en agua para obtener una con-
centración aproximadamente 3 mM. Diluir inmediatamente antes de su uso con Solución amortiguadora de pH 8,4 hasta
0,5 mM.
Soluciones estándar: Reconstituir y diluir todo el contenido de una ampolla de ER Heparina de Bajo Peso Molecular para
Valoraciones Biológicas USP con agua destilada y diluir con Solución amortiguadora de pH 7,4 hasta obtener al menos cua-
tro diluciones en el intervalo de concentración de 0,015-0,075 Unidades USP de actividad de anti-factor lla/ml.
Soluciones muestra: Proceder según se indica en Soluciones estándar para obtener concentraciones de HBPM similares a
las obtenidas para las Soluciones estándar.
Procedimiento: Proceder según se indica en Actividad Anti-Factor Xa, pero usar Solución de trombina humana en lugar de
Solución de factor Xa y usar la Solución de antitrombina humana según se describió anteriormente.
294 (208) Valoración de Actividad Anti-Factor / Pruebas Químicas USP 40

Aptitud del sistema: La valoración es válida si se cumple el siguiente requisito:

1. La lectura del blanco B2 no difiere en más de ±0,05 unidades de absorbancia con respecto al blanco Bl.
Cálculos: Proceder según se indica en el cálculo de Actividad Anti-Factor Xa.

REQUISITOS ADICIONALES
• ESTÁNDARES DE REFERENCIA USP (11)
ER Heparina Sódica para Valoraciones USP
ER Heparina de Bajo Peso Molecular para Valoraciones Biológicas USP

(209) DETERMINACIONES DE PESO MOLECULAR DE HEPARINAS DE

BAJO PESO MOLECULAR

Este capítulo provee procedimientos usados para determinar la distribución del peso molecular (PM) y el peso molecular pro-
medio en peso para heparinas de bajo peso molecular (HBPM).
INTRODUCCIÓN
Las heparinas de bajo peso molecular se preparan a partir de Heparina Sódica USP mediante despolimerización parcial. Las
heparinas de bajo peso molecular son polidispersas, es decir, están compuestas por cadenas de polisacárido con una varie-
dad de pesos moleculares. La distribución del peso molecular es una característica definitoria para cada producto de hepari-
nas de bajo peso molecular. La USP contiene monografías específicas para productos de heparinas de bajo peso molecular,
incluyendo límites sobre los parámetros de distribución del peso molecular.
La mayoría de las técnicas para la determinación de la distribución del peso molecular de heparinas de bajo peso molecular
utilizan cromatografía de permeación en gel (GPC, por sus siglas en inglés), en ocasiones referida como cromatografía de
exclusión por tamaño (SEC, por sus siglas en inglés). Para derivar la distribución del peso molecular de una muestra de hepa-
rina de bajo peso molecular a partir de un cromatograma, es necesario conocer la relación entre el tiempo de retención y el
peso molecular. Este capítulo describe un método de GPC en el cual la calibración se llevó a cabo usando el Estándar de
Referencia (ER) Calibrador de Peso Molecular de Heparina de Bajo Peso Molecular USP. Esta preparación es un Estándar indi-
vidual polidisperso cuya distribución de pesos moleculares se describe en forma de una Tabla Estándar de Amplio Rango
(Broad Standard Table) (ver el Certificado USP para el ER Calibrador de Peso Molecular de Heparina de Bajo Peso Molecular
USP) que lista el logaritmo del peso molecular (log PM) de varios puntos de referencia y las fracciones porcentuales corres-
pondientes en peso del calibrador superiores o inferiores a estos puntos de referencia. La Tabla Estándar de Amplio Rango se
usa junto con un cromatograma del calibrador para ajustar una función adecuada, en este caso, un polinomio de tercer or-
den, a la relación entre el log PM y el tiempo de retención, con lo que se genera una curva de calibración para el sistema
cromatográfico. Con esta curva de calibración, el analista calcula el peso molecular promedio en peso y los parámetros de
distribución a partir del cromatograma de una muestra de heparina de bajo peso molecular.
Todos los cálculos descritos en este capítulo se pueden realizar usando un programa de hoja de cálculo, aunque dicho método
no se recomienda debido a que es laborioso y está abierto a error humano. El software patentado capaz de automatizar la
calibración y los cálculos de peso molecular se puede obtener de diversos fabricantes de sistemas cromatográficos.

PROCEDIMIENTO
• MEDICIONES DEL PESO MOLECULAR DE HEPARINAS DE BAJO PESO MOLECULAR MEDIANTE CROMATOGRAFÍA DE PERMEACIÓN EN
GEL
El siguiente procedimiento, con cualquier variación necesaria, se usa cuando así se especifique en las monografías indivi-
duales.
Solución madre de acetato de amonio: Acetato de amonio 1 M en agua
Solución de azida sódica: Azida sódica al 1% (p/v) en agua
Fase móvil: Transferir 100 mL de Solución madre de acetato de amonio a un matraz volumétrico de 1 L, agregar 20 mL de
Solución de azida sódica y diluir con agua a volumen. Filtrar usando una membrana de nailon con un tamaño de poro de
0,45 µm antes de su uso.
Solución de calibración: Agregar 2 mL de Fase móvil a un vial que contenga ER Calibrador de Peso Molecular de Heparina
de Bajo Peso Molecular USP. Filtrar usando una membrana de nailon con un tamaño de poro de 0,45 µm antes de su uso.
Solución muestra: 5 mg/mL de muestra de heparina de bajo peso molecular en Fase móvil. Filtrar usando una membrana
de nailon con un tamaño de poro de 0,45 µm.
Solución de aptitud del sistema: 5 mg/mL de ER Dalteparina Sódica USP en Fase móvil. Filtrar usando una membrana de
nailon con un tamaño de poro de 0,45 µm.
Sistema cromatográfico
(Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.)
[NOTA-Se debe ajustar la temperatura del detector de índice de refracción a la misma temperatura que la Temperatura de la
columna.]
Modo: HPLC
 USP 40 Pruebas Químicas/ (211) Arsénico 295

Detector: Índice de refracción

Columnas
Guarda columna: 6 mm x 4 cm; relleno L59 de 7 µm
Analítica: 7,8 mm x 30 cm; relleno L59 de 5 µm en serie con una columna de 7,8 mm x 30 cm; relleno L59 de 5 µm 1
Temperatura de la columna: 30º
Velocidad de flujo: 0,5 ml/min
Equilibración de las columnas: 0,5 ml/min durante al menos 2 horas
Volumen de inyección: 20 µL
Aptitud del sistema
Muestra: Solución de aptitud del sistema
Requisitos de aptitud
Resolución: Existe una resolución en la línea base entre el último pico del ER Calibrador de Peso Molecular de Heparina
de Bajo Peso Molecular USP y el pico de sal, o picos de intercambio negativos.
Curva de calibración: El coeficiente de determinación de la curva de calibración ajustado a los valores de la Tabla Están-
dar de Amplio Rango deben ser no menos de 0,990, cuando se usa una ecuación polinómica de tercer orden.
Peso molecular promedio en peso (Mw): Tomar la media del Mw calculado mediante inyecciones por duplicado de la
Solución de aptitud del sistema y redondear con una aproximación de 50 Da. El sistema cromatográfico es adecuado si el
Mw del ER Dalteparina Sódica USP está dentro de 150 Da del valor declarado según lo indicado en el Certificado USP del
ER Dalteparina Sódica USP.
Análisis
Muestras: Inyectar 20 µL de la Solución de calibración (una sola inyección), la Solución de aptitud del sistema (por duplica-
do) y la Solución muestra (por duplicado), y registrar los cromatogramas durante el tiempo necesario para asegurar la elu-
ción completa, incluyendo los picos de sal y disolvente (aproximadamente 50 minutos).
[NOTA-El calibrador, el Estándar o la muestra de heparina de bajo peso molecular presentará un pico ancho a un tiempo entre
aproximadamente 25 y 45 minutos, seguido por un pico agudo de sal de elución tardía, según se ilustra en el Certificado
USP del ER Calibrador de Peso Molecular de Heparina de Bajo Peso Molecular USP.]
Cálculos: Calcular el área total bajo el pico de heparina de bajo peso molecular a partir de la Solución de calibración y el
área acumulativa en cada punto debajo del pico como porcentaje del total. No incluir el pico de sal. Usando la Tabla Es-
tándar de Amplio Rango provista en el Certificado USP del ER Calibrador de Peso Molecular de Heparina de Bajo Peso
Molecular USP, identificar aquellos puntos en el cromatograma para los que el área acumulativa porcentual sea la más
cercana a las fracciones porcentuales listadas en la Tabla Estándar de Amplio Rango y asignar el peso molecular (MW, por
sus siglas en inglés) en esta Tabla al tiempo de retención correspondiente (RT, por sus siglas en inglés) en el cromatogra-
ma. Para el conjunto de tiempos de retención y pesos moleculares identificados, ajustar el log(PM) en función del tiempo
de retención (TR) a una función polinómica de tercer orden usando un software adecuado para cromatografía de permea-
ción en gel o encontrar los valores de a, b, e y d de modo que log PM =a+ (b x TR) +[ex (TR) 2 ] + [d x (TR) 3].
Usando el mismo software para GPC, para cada uno de los cromatogramas duplicados de la Solución de aptitud del sistema
y de la Solución muestra, y con la función de calibración obtenida según se describió anteriormente, calcular Mw:

RI; = respuesta del detector en cada punto

M; = PM en cada punto
Redondear el valor de la media de Mw con una aproximación de 50 Da. Usando el mismo software para GPC, determinar
para cada uno de los cromatogramas duplicados de la Solución muestra el porcentaje de producto con peso molecular
según lo indicado en la monografía del producto.
Criterios de aceptación: Según se indican en la monografía.

REQUISITOS ADICIONALES
• ESTÁNDARES DE REFERENCIA USP (11)
ER Dalteparina Sódica USP
ER Calibrador de Peso Molecular de Heparina de Bajo Peso Molecular USP

(211) ARSÉNICO

Este procedimiento está diseñado para determinar la presencia de trazas de arsénico (As) convirtiendo el arsénico en las sustan-
cias en análisis en arsina, la cual se pasa luego a través de una solución de dietilditiocarbamato de plata y forma un complejo
de color rojo. El color rojo producido de esta manera se compara, en forma visual o espectrofotométrica, con el color produ-

1 El método fue validado usando una guarda columna TSK SWXL de 6 mm x 4 cm; 7 µm en serie con dos columnas analíticas: TSK G3000 SWXL de 7,8-mm x 30
cm; 5 µm en serie con una columna TSK G2000 SWXL de 7,8 mm x 30 cm; 5 µm.
296 (211) Arsénico/ Pruebas Químicas USP 40

cido de manera similar en un control que contiene una cantidad de arsénico que equivale al límite especificado en la mono-
grafía individual. Los límites se establecen en términos de arsénico (As). El contenido de arsénico no debe exceder el límite
indicado en la monografía individual.
Existen 2 métodos que sólo difieren en el tratamiento preliminar de la sustancia de prueba y del estándar. Por lo general, el
Método I se usa para materiales inorgánicos en tanto que el Método 11 se utiliza para los materiales orgánicos.

PROCEDIMIENTOS
Aparato
El aparato (ver la /lustración) consta de un generador de arsina (a) equipado con una unidad depuradora (e) y un tubo de ab-
sorción (e) con juntas cónicas estándar o juntas de rótula esférica de vidrio esmerilado (by d) entre las unidades. No obstan-
te, se puede usar cualquier otro aparato adecuado cuyo principio de funcionamiento sea el mismo que el del aparato descri-
to e ilustrado.

e
d

Aparato para la Prueba de Arsénico

Solución Madre de Trióxido de Arsénico: Disolver 132,0 mg de trióxido de arsénico, previamente secados a 105º duran-
te una hora y pesados con exactitud, en 5 mL de solución de hidróxido de sodio (1 en 5) en un matraz volumétrico de
1000 ml. Neutralizar la solución cor¡ ácido sulfúrico 2 N, agregar 1O mL más de ácido sulfúrico 2 N y luego llevar a volu-
men con agua recientemente hervida y enfriada, y mezclar.
Solución Estándar de Arsénico: Transferir 10,0 mL de la Solución Madre de Trióxido de Arsénico a un matraz volumétrico de
1000 mL, agregar 1O mL de ácido sulfúrico 2 N, llevar a volumen con agua recientemente hervida y enfriada, y mezclar.
Cada mL de la Solución Estándar de Arsénico contiene el equivalente a 1 µg de arsénico (As). Conservar esta solución en un
recipiente que sea totalmente de vidrio y usarla durante los tres días posteriores a su preparación.
Método 1
Preparación Estándar: Pipetear 3,0 mL de la Solución Estándar de Arsénico y transferir a un matraz generador. Diluir con
agua hasta obtener un volumen de 35 ml.
Preparación de Prueba: Excepto que se indique algo diferente en la monografía individual, transferir al matraz generador
la cantidad, en g, de la sustancia de prueba calculada, por la fórmula:

3,0/L
L = límite de arsénico (ppm)
Disolver en agua y diluir con agua hasta obtener un volumen de 35 ml.
Procedimiento: Tratar la Preparación Estándar y la Preparación de Prueba de la misma manera, tal como se describe a conti-
nuación. Agregar 20 mL de ácido sulfúrico 7 N, 2 mL de yoduro de potasio SR y 0,5 mL de solución ácida de cloruro estan-
noso concentrada SR y 1 mL de alcohol isopropílico, y mezclar. Dejar en reposo a temperatura ambiente durante 30 minu-
tos. Rellenar el tubo depurador (e) con dos trozos de algodón previamente impregnados con solución saturada de acetato
de plomo, exprimidos para eliminar el exceso de solución y secados al vacío a temperatura ambiente, dejando un pequeño
espacio de 2 mm entre los dos trozos de algodón. Lubricar las juntas (by d) con una grasa adecuada para llaves de paso,
apropiada para usarse con disolventes orgánicos y conectar la unidad depuradora al tubo de absorción (e). Transferir 3,0
mL de dietilditiocarbamato de plata SR al tubo de absorción. Agregar 3,0 g de cinc granulado (malla Nº 20) a la mezcla del
matraz y conectar inmediatamente la unidad depuradora ensamblada y permitir el desprendimiento de hidrógeno y el de-
sarrollo de color a temperatura ambiente durante 45 minutos, agitando el matraz por rotación moderada cada 1O minutos.
Desconectar el tubo de absorción de la unidad depuradora y del matraz generador y transferir la solución absorbente a
USP 40 Pruebas Químicas/ (212) Análisis de Oligosacáridos 297

celdas de absorción de 1 cm. La coloración roja producida por la Preparación de Prueba no excederá la producida por la
Preparación Estándar. Si fuera necesario o conveniente, determinar la absorbancia a la longitud de onda de máxima absor-
ción entre 535 nm y 540 nm con un espectrofotómetro o colorímetro adecuado, usando dietilditiocarbamato de plata SR
como blanco.
Sustancias Químicas lnterferentes: Los metales o las sales de metales, como el cromo, cobalto, cobre, mercurio, molibde-
no, níquel, paladio y plata, pueden interferir con la formación de arsina. El antimonio, que forma estibina, produce una
interferencia positiva en el desarrollo del color con dietilditiocarbamato de plata SR. Cuando se sospecha la presencia de
antimonio, el color rojo que se produce en las dos soluciones de dietilditiocarbamato de plata, puede compararse a la lon-
gitud de onda de máxima absorción entre 535 nm y 540 nm con un colorímetro apropiado, ya que a esta longitud de
onda la interferencia debida a la estibina es inapreciable.
Método 11
(NOTAS-]
(1) Precaución-Algunas sustancias pueden reaccionar en forma de explosiones violentas cuando se digieren con peróxido de hidró-
geno. Extremar las medidas de seguridad en todo momento.
(2) Si se trabaja con compuestos que contienen halógenos, calentar las muestras con ácido sulfúrico a una temperatura más
baja evitando que la mezcla entre en ebullición y agregar cuidadosamente el peróxido de hidrógeno antes de que tenga
lugar la carbonización para prevenir la pérdida de arsénico trivalente.
(3) Si la sustancia de prueba reacciona con demasiada rapidez y comienza a carbonizarse con 5 mL de ácido sulfúrico antes de
calentarse, se deberá usar en su lugar 1 O mL de ácido sulfúrico diluido frío (1 en 2) y agregar algunas gotas de peróxido de
hidrógeno antes de calentar.
Preparación Estándar: Pipetear 3,0 mL de Solución Estándar de Arsénico y transferir al matraz generador, agregar 2 mL de
ácido sulfúrico, mezclar y agregar la cantidad total de peróxido de hidrógeno al 30 por ciento empleado en la Preparación
de Prueba. Calentar la mezcla hasta que se desprenda humo denso. Dejar que se enfríe, agregar cuidadosamente 1 O mL de
agua y volver a calentar hasta que se produzca humo irritante. Se debe repetir este procedimiento con otros 1O mL de
agua para eliminar cualquier traza de peróxido de hidrógeno. Enfriar y diluir con agua hasta obtener 35 ml.
Preparación de Prueba: Excepto que se indique algo diferente en la monografía individual, transferir un matraz generador
la cantidad, en g, de la sustancia de prueba calculada por la fórmula:
3,0/L
L = límite de arsénico (ppm)
Agregar 5 mL de ácido sulfúrico y algunas perlas de vidrio y digerir en una campana de extracción, preferentemente en
una placa de calentamiento, y a una temperatura de no más de 120º, hasta que se inicie la carbonización. (Agregar más
ácido sulfúrico si fuera necesario para humedecer completamente algunas muestras pero teniendo en cuenta que el volu-
men total agregado no puede exceder de 1O mL.) Agregar cuidadosamente, gota a gota, peróxido de hidrógeno al 30%, y
dejar que la reacción disminuya y calentar nuevamente entre una y otra gota. Agregar las primeras gotas muy lentamente
mezclando lo suficiente para evitar una reacción rápida. Interrumpir el calentamiento si se produce excesiva espuma. Cuan-
do la reacción ha terminado, calentar cuidadosamente, rotando el matraz ocasionalmente para evitar que algunas porcio-
nes de la muestra queden adheridas a las paredes del matraz expuestas a la unidad de calentamiento. Mantener las condi-
ciones de oxidación en todo momento durante la digestión agregando pequeñas cantidades de la solución de peróxido de hidró-
geno cada vez que la mezcla se torne de color marrón o se oscurezca. Continuar la digestión hasta que la materia orgánica se
destruya, aumentando gradualmente la temperatura de la placa de calentamiento hasta que se desprenda abundante hu-
mo de trióxido de azufre y la solución se vuelva incolora o presente solamente un color ligeramente pajizo. Enfriar, agregar
cuidadosamente 1O mL de agua, mezclar y volver a evaporar hasta que aparezca humo irritante; repetir este procedimiento
para eliminar cualquier traza de peróxido de hidrógeno. Enfriar, agregar cuidadosamente 1 O mL de agua, lavar las paredes
del matraz con algunos mL de agua y diluir con agua a 35 mL.
Procedimiento: Proceder según se indica en el Procedimiento en Método l.
Sustancias Químicas lnterferentes: Ver Sustancias Químicas lnterferentes en Método l.

(212) ANÁLISIS DE OLIGOSACÁRIDOS

INTRODUCCIÓN
El análisis de la composición de oligosacáridos unidos a asparagina (Asn) (también conocidos como oligosacáridos N-ligados o
N-glicanos) se ha vuelto necesario para la caracterización de ciertas proteínas terapéuticas recombinantes o para establecer
sus especificaciones de liberación. Ver el capítulo Análisis de Glicoproteínas y Glicanos-Consideraciones Generales (1084) para
información sobre la caracterización y evaluación de la glicosilación de proteínas. El capítulo (1084) incluye estrategias analí-
ticas generales y también resalta criterios para seleccionar métodos apropiados para desafíos analíticos específicos, proveyen-
do así el contexto para este capítulo. Este capítulo se enfoca en el análisis de oligosacáridos unidos a Asn escindidos enzimá-
ticamente de proteínas terapéuticas recombinantes glicosiladas. Por lo tanto, el capítulo provee 1) un procedimiento genéri-
co para la liberación enzimática de N-glicanos usando N-glicosidasa F (PNGasa F) peptídica, 2) dos métodos diferentes para
298 (212) Análisis de Oligosacáridos / Pruebas Químicas USP 40

el marcado con fluoróforos de los N-glicanos liberados y 3) cinco procedimientos analíticos de separación cromatográfica y
electroforética, así como criterios de desempeño para la separación. El capítulo (1084) trata estrategias analíticas alternativas.
Aunque los procedimientos de este capítulo están validados, estos deben ser verificados para cada producto específico indi-
vidual (ver Verificación de Procedimientos Farmacopeicos (1226)). Además, la validación es necesaria cuando se modifica el
procedimiento para optimizarlo a un producto específico [p.ej., fuera de los límites de los parámetros permitidos que se defi-
nen en Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema (ver Validación de Procedimientos Farmacopeicos (1225))). Las monografías
individuales de los productos proveerán el análisis de datos, la cuantificación y las especificaciones de liberación de lote, las
cuales se espera sean específicas para cada producto. Por lo tanto, estos aspectos no se tratan en este capítulo.
El marcado de los oligosacáridos con un fluoróforo antes del análisis mejora la detección de los oligosacáridos durante la sepa-
ración, debido a que los oligosacáridos tienen baja o nula absortividad de luz ultravioleta (UV) o visible y tampoco tienen
grupos fluoróforos significativos. Este capítulo describe dos métodos diferentes para el marcado con fluoróforos de los oligo-
sacáridos. El primero utiliza derivatización de oligosacáridos con 2-aminobenzamida (2-AB) y se usa cuando la separación es
por cromatografía de líquidos; el segundo utiliza marcación con el ácido 8-aminopireno-1,3,6- trisulfónico (APTS, por sus
siglas en inglés) y se usa cuando la separación es por electroforesis capilar (CE, por sus siglas en inglés). Aunque la detección
electroquímica (detección amperométrica por pulsos o detección electroquímica por pulsos) también se usa en el análisis de
los oligosacáridos por elución con base fuerte, el método de detección electroquímica es menos sensible y tiene una relación
ruido-señal más alta. Por lo tanto, este método no se trata en este capítulo.
Se han desarrollado muchos métodos de cromatografía y electroforesis diferentes para analizar oligosacáridos, y los procedi-
mientos descritos en este capítulo han sido usados con éxito para este propósito. La elección de los procedimientos aquí
tratados pretende reflejar los enfoques de uso más común y amplio para medicamentos biológicos glicosilados recombinan-
tes que se comercializan en la actualidad. Estos procedimientos analíticos incluyen cromatografía líquida en fase normal
(NPLC, por sus siglas en inglés) o cromatografía de líquidos de interacción hidrofílica (HILIC, por sus siglas en inglés), croma-
tografía de líquidos de intercambio aniónico de alta resolución (HPAEC, por sus siglas en inglés) y electroforesis capilar. Exis-
ten varios métodos cromatográficos diversos que separan oligosacáridos por tamaño, forma y polaridad que también se utili-
zan rutinariamente, pero estos otros métodos cromatográficos no se tratan en este capítulo. Los principios generales de cro-
matografía se tratan en el capítulo (621) y por lo tanto el capítulo (621) debe considerarse dentro de dicho contexto.
Se han desarrollado Estándares de Referencia USP (ER) para evaluar la aptitud del sistema para estos procedimientos analíticos:
• El ER Mezcla A de Aptitud del Sistema de Oligosacáridos USP es una mezcla de oligosacáridos biantenarios parcialmente
sialilados, parcialmente galactosilados y parcialmente fucosilados N-ligados escindidos de inmunoglobulina policlonal
humana (lgG) mediante PNGasa F.
• El ER Mezcla B de Aptitud del Sistema de Oligosacáridos USP es una mezcla de oligosacáridos N-ligados de alto conteni-
do en manosa con trazas de cadenas híbridas escindidos de ribonucleasa B (RNasa B) bovina mediante PNGasa F.
• El ER Mezcla C de Aptitud del Sistema de Oligosacáridos USP es una mezcla de oligosacáridos bi-, tri- y tetra-antenarios
N-enlazados con niveles variables de sialilación con o sin fucosa (Fue; también contienen estructuras tipo Lex); la mezcla
fue escindida de la al glicoproteina ácida humana por la PNGasa F.
• El ER Mezcla D de Aptitud del Sistema de Oligosacáridos USP es una mezcla de oligosacáridos de estructuras complejas
sialiladas bi- y tri-antenarias con un ácido siálico adicional en una de las estructuras tri-antenenarias; la mezcla es escin-
dida de la fetuina bovina por la PNGasa F.
ASPECTOS GENERALES DE LOS PROCEDIMIENTOS ANALÍTICOS
La Tabla 7 describe las aplicaciones y los principios de separación de los procedimientos analíticos incluidos en este capítulo. La
selección del ER apropiado dependerá del contenido de glicanos esperado del producto que se está analizando.
Tabla 1
Tipo de Oligosacáridos N-ligados Que Se
Procedimientos Analíticos Van a Separar Estándares de Referencia USP Aplicables
Cromatografía de líquidos en fase normal/ Cadenas biantenarias relativamente simples con
HILIC procedimiento 7: niveles bajos o nulos de estructuras sialiladas, ER Mezcla A de Aptitud del Sistema de Oligosa-
• Columna: 2,0 mm x 15 cm; relleno después del marcado con 2-AB cáridos USP
L68 de 3 µm
• Produce más picos de oligosacári-
dos en comparación con el procedí-
miento 2 en modo HIL/C
• Fase móvil en gradiente más llano
(menos empinado) y más prolonga-
do en comparación con el procedí-
miento 2 en modo HIL/C
• Mejor sensibilidad que permite me- Cadenas con alto contenido de manosa, des- ER Mezcla B de Aptitud del Sistema de Oligosa-
nor tamaño de muestra pués del marcado con 2-AB cáridos USP
USP 40 Pruebas Químicas/ (212) Análisis de Oligosacáridos 299

Tabla 1 (Continuación)
Tipo de Oligosacárldos N-ligados Que Se
Procedimientos Analíticos Van a Separar Estándares de Referencia USP Aplicables
Cromatografía de líquidos en fase normal/ Cadenas biantenarias relativamente simples con
HIL/C procedimiento 2: niveles bajos o nulos de estructuras sialiladas, ER Mezcla Ade Aptitud del Sistema de Oligosa-
• Columna: 4,6 mm x 25 cm; relleno después del marcado con 2-AB cáridos USP
L68 de 5 µm
• Se observan menos picos de
oligosacáridos en comparación con
el procedimiento 1 en modo HILIC
• Fase móvil en gradiente más corto
y menos llano (más empinado) en
comparación con el procedimiento 1 Cadenas con alto contenido de manosa, des- ER Mezcla Bde Aptitud del Sistema de Oligosa-
en modo HIL/C pués del marcado con 2-AB cáridos USP
HPAEC procedimiento 1 Cadenas biantenarias relativamente simples con
• Guarda columna: 4,0 mm x 5 cm; niveles bajos o nulos de estructuras sialiladas, ER Mezcla Ade Aptitud del Sistema de Oligosa-
relleno L46 de 1O µm después del marcado con 2-AB cáridos USP
• Columna: 4,0 mm x 25 cm; relleno
L46de10 µm
• Fase móvil: Acetato de sodio 0-75
mM en hidróxido de sodio O, 15 N
isocrático
• La selectividad es diferente a la de
los procedimientos 1 y 2 en modo HI-
L/C con respecto al tamaño y la
composición de los Cadenas con alto contenido de manosa, des- ER Mezcla Bde Aptitud del Sistema de Oligosa-
oligosacáridos pués del marcado con 2-AB cáridos USP
HPAEC procedimiento 2 Oligosacáridos bi-, tri- y tetra-antenarios N-liga-
• Guarda columna: 4,0 mm x 5 cm; dos con niveles variables de sialilación, después ER Mezcla C de Aptitud del Sistema de Oligosa-
relleno L46 de 1O µm del marcado con 2-AB cáridos USP
• Columna: 4,0 mm x 25 cm; relleno
L46de10 µm
• Fase móvil: Acetato de sodio 150-
450 mM en hidróxido de sodio Oligosacáridos de estructuras complejas, sialila-
O, 15 N isocrático das bi- y tri-antenarias con un ácido siálico adi-
• Adecuado para separación de aligo- cional en una de las estructuras tri-antenarias, ER Mezcla D de Aptitud del Sistema de Oligosa-
sacáridos N-ligados cargados después del marcado con 2-AB cáridos USP
Electroforesis capilar Cadenas biantenarias relativamente simples con
• Apropiado para Oligosacáridos niveles bajos o nulos de estructuras sialiladas, ER Mezcla A de Aptitud del Sistema de Oligosa-
APTS después del marcado con APTS cáridos USP
• Capilar: Diámetro interno de 50 µm
con una longitud total de 50 cm y
una longitud de separación de 40 Cadenas con alto contenido de manosa, des- ER Mezcla Bde Aptitud del Sistema de Oligosa-
cm pués del marcado con APTS cáridos USP

PREPARACIÓN DE MUESTRAS
Ver el Apéndice (Tabla 77) para las abreviaciones y estructuras de los glicanos. La preparación de muestras es para todos los
procedimientos que se listan a continuación.
Las muestras deberían estar idealmente exentas de sales, excipientes y otros materiales portadores que pueden interferir con el
análisis. Esto se puede lograr mediante: 1) diálisis contra agua, contra una solución amortiguadora adecuada o contra una
solución amortiguadora con componentes volátiles usando una membrana apropiada, 2) captura de la muestra en un cartu-
cho de extracción en fase sólida (SPE, por sus siglas en inglés) seguido por la eliminación de sales y excipientes mediante
lavado y elución de la muestra requerida o 3) ultrafiltración usando una membrana apropiada.
[NOTA-Además de un Estándar de Referencia, una muestra control con un perfil de glicanos conocido debe incluirse en el
procedimiento general para confirmar el desempeño correcto del análisis. También se puede incluir un control o blanco de
reacción que contenga únicamente la matriz amortiguadora de la muestra de glicoproteína usada en el procedimiento ge-
neral.]
• LIBERACIÓN ENZIMÁTICA DE N-GLICANOS
[NOTA-El siguiente es un método genérico que debe optimizarse para productos individuales dependiendo de la cantidad de
glicoproteína que se va a digerir y de las estructuras de los glicanos, en particular se debe considerar la relación proteína-
glicano en la molécula y la accesibilidad de la enzima a las uniones de los azúcares con las proteínas.]
Procedimiento 1 para separación cromatográfica
Solución amortiguadora de reacción enzimática: Fosfato de sodio 50 mM de pH 7,5 o tris(hidroximetil)-aminometa-
no 15 mM ajustado con ácido clorhídrico a un pH de 7,0.
Digestión con PNGasa F: Transferir O, l-2,25 mg de glicoproteína a un vial, ajustar con Solución amortiguadora de reac-
ción enzimática a un volumen final de 30-100 µL. Agregar PNGasa F a la muestra de glicoproteína en una relación de
0,5-15 unidades de PNGasa F/O, 1 mg de glicoproteína. Incubar a 37º durante 12-24 horas. Enfriar a temperatura am-
biente durante aproximadamente 5 minutos. Mezclar suavemente usando un mezclador de vórtice y centrifugar breve-
300 (212) Análisis de Oligosacáridos / Pruebas Químicas USP 40

mente. [NOTA-Una unidad de PNGasa F se define como la cantidad de enzima requerida para catalizar la liberación de
oligosacáridos N-ligados de 1,0 nmol de ribonucleasa B desnaturalizada por minuto a un pH de 7,5 a 37º y es igual a 1
miliunidad de la Unión de Bioquímica Internacional (IUB, por sus siglas en inglés). La digestión completa mediante
PNGasa F se puede evaluar observando un cambio en la movilidad de las proteínas desglicosiladas durante una electro-
foresis en gel de poliacrilamida-dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) seguida por una tinción con Azul de Coomassie o
una electroforesis en gel con SOS (SDS-CGE), evidenciada por una reducción de la masa de aproximadamente 2 kDa por
cadena de glicano escindida.]
A continuación, se describen dos métodos para llevar a cabo la separación de los glicanos liberados de la glicoproteína.
Método 1, usando una membrana de ultrafiltración con un límite de peso molecular de 30 kDa: 1• 2 [NOTA-Se
pueden usar membranas de ultrafiltración con un límite de peso molecular más bajo para proteínas con un tama-
ño< 150 kDa.] Eliminar las trazas de glicerina enjuagando la membrana con 0,5 ml de agua y centrifugando a 11 000 x
g. Desechar el permeado. Agregar O, 1 ml de agua en el reservorio de la muestra y luego agregar la muestra de glicopro-
teína digerida al reservorio. Enjuagar el vial de reacción con O, 1 ml de agua y agregar al reservorio de la muestra. Centri-
fugar a 11 000 x g y recoger el permeado. Enjuagar el reservorio de la muestra dos veces con O, 1 ml de agua para cada
lavado y recoger el permeado. Combinar los permeados (aproximadamente 0,5 ml) y secar completamente las mues-
tras usando un concentrador centrífugo sin calor.
Método 2, usando un cartucho de extracción en fase sólida (SPE) de fase reversa:3 Agregar 2,0 ml de metanol a
una jeringa, acoplar la jeringa al cartucho y usar el émbolo de la jeringa para pasar metanol y desecharlo. Agregar 6,0
ml de ácido acético al 5% (v/v) en agua a una jeringa. Acoplar la jeringa al cartucho y usar el émbolo de la jeringa para
pasar la solución de ácido acético y desecharla. Aplicar con cuidado la muestra digerida a un cartucho individual. Agre-
gar 0,5 ml de ácido acético al 5% (v/v) a una jeringa de 1 ml, acoplar la jeringa al cartucho y usar el émbolo de la
jeringa para pasar el ácido acético y descartar. Agregar 1,5 ml de ácido acético al 5% (v/v) a una jeringa de 2 a 3 ml.
Acoplar la jeringa al cartucho y usar el émbolo de la jeringa para pasar la solución de ácido acético, y recoger el eluato
en un tubo de 1,5 ml. Secar por completo los eluatos usando un concentrador centrífugo sin calor.
Procedimiento 2 para separación por electroforesis capilar
Solución amortiguadora de reacción enzimática: Fosfato de sodio 50 mM de pH 7,5
Digestión con PNGasa F: Agregar 2 µL de PNGasa F (5 unidades/µL) a una muestra de 50 µg de glicoproteína y ajustar
con Solución amortiguadora de reacción enzimática a un volumen final de 50 µL. Incubar a 37° durante 18 horas. Separar
mediante centrifugación los oligosacáridos escindidos usando un filtro centrífugo con un límite de peso molecular de
1O kDa. 2 Secar los oligosacáridos liberados hasta sequedad en una evaporador centrífugo de vacío.
[NOTA-Seguir las guías citadas en la Tabla 7 para seleccionar el Estándar de Referencia USP apropiado y el tipo de marcado.]
• MARCADO CON 2-AB4 PARA SEPARACIÓN POR CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS
Solución A: Mezclar ácido acético glacial y dimetil sulfóxido (3:7, v/v).
Solución B: Agregar 1,5 ml de Solución A a 75 mg de 2-AB. Mezclar bien y suavemente con un mezclador de vórtice
hasta disolver por completo el 2-AB.
Solución de marcado: Agregar 1 ml de Solución B a 63 mg de cianoborohidruro de sodio. Mezclar bien y suavemente
con un mezclador de vórtice. Tapar la muestra herméticamente e incubar a 70º durante 1-2 minutos para disolver por
completo. Enfriar a temperatura ambiente durante 1O minutos. Usar esta Solución de marcado dentro de la primera hora
de su preparación y proteger la solución de la luz.
Solución estándar marcada con 2-AB: Agregar 5-15 µL de Solución de marcado a 1 vial de ER Mezcla A de Aptitud del
Sistema de Oligosacáridos USP, ER Mezcla B de Aptitud del Sistema de Oligosacáridos USP, ER Mezcla C de Aptitud del
Sistema de Oligosacáridos USP o de ER Mezcla D de Aptitud del Sistema de Oligosacáridos USP y mezclar bien.
Solución muestra marcada con 2-AB: Agregar 5-15 µL de Solución de marcado a la muestra de glicano secada después
de las etapas de liberación enzimática y separación, y mezclar bien.
Procedimiento: Incubar inmediatamente la Solución estándar marcado con 2-AB y la Solución muestra marcada con 2-AB a
37º durante 16-18 horas o a 65º durante 2 horas. Dejar que se enfríe a temperatura ambiente durante 1O minutos. Cen-
trifugar brevemente.
Estándar seco marcado con 2-AB o muestra seca marcada con 2-AB: A continuación se describen dos métodos para
eliminar el 2-AB libre.
Método 1, usando una columna de filtración en gel para centrifugación: Preparar columnas de filtración en gel para
microcentrifugación G-1 O adecuadas 5 golpeteando suavemente la columna para asegurar que la resina seca sedimente
en el fondo. Retirar las tapas y colocar la columna en un tubo de recolección de 2 ml. Agregar 0,5 ml de agua a la
resina y dejar que se rehidrate durante al menos 15 minutos. Un tiempo de rehidratación más largo (hasta 24 horas) es

1 Un dispositivo con membrana de ultrafiltración adecuado es el filtro centrífugo Microcón YM-30 disponible en Millipore (números de catálogo 42422, 42409 y
4241 O) o equivalente.
2 Un dispositivo con membrana de ultrafiltración adecuado es el filtro centrífugo Ultra-0.5 de EMD Millipore (número de catálogo UFC501 096) o equivalente.
3 Un cartucho SPE adecuado es Glyko GlycoClean R Cartridge disponible de Prozyme (número de catálogo GKl-4756) o equivalente.
4 Un kit de marcado con 2-AB adecuado es el Glyko Signal 2-AB Labeling Kit disponible en Prozyme (número de catálogo GKK-404), el kit de marcado LudgerTage
2-AB disponible en QA Bio (número de catálogo LT-KAB-A2) o equivalente.
5 Una columna adecuada preempacada con Sephadex G-1 O es la columna Macro Spin G-1 O mini SEC disponible en Harvard Apparatus (número de catálogo
743900) o en The Nest Group (número de catálogo SMM 501 O) o equivalente.
USP 40 Pruebas Químicas/ (212) Análisis de Oligosacáridos 301

aceptable si se mantiene la columna a 2º-8º. Centrifugar la columna a máxima velocidad durante 5-1 O segundos. Reti-
rar el agua del tubo de recolección. Lavar la resina agregando 0,5 mL de agua y centrifugar la columna. Repetir la etapa
de lavado una vez más. Después de eliminar el agua de la etapa de lavado final, centrifugar a máxima velocidad durante
1O segundos para retirar el agua residual de la resina. La resina se torna blanca cuando se remueve suficiente agua resi-
dual. Colocar la columna en un nuevo tubo de recolección marcado. Agregar 100 µL de agua a la Solución estándar mar-
cada con 2-AB y a la Solución muestra marcada con 2-AB, y luego aplicar toda la solución al centro de cada una de las
columnas G-1 O lavadas, respectivamente. Colocar las columnas G-1 O en la microcentrífuga y centrifugar a aproximada-
mente 200 x g durante 1 minuto. Aplicar el eluato de la primera columna (aproximadamente 90-120 µL) al centro de
una segunda columna G-1 O, que no ha sido previamente usada pero ha sido lavada, y centrifugar a aproximadamente
200 x g durante 1 minuto. Colectar este segundo eluato (aproximadamente 60-100 µL) y transferirlo a un tubo de mi-
crocentrífuga de 0,5 ml. Secar los eluatos mediante evaporación centrífuga sin calor.
Método 2, usando un cartucho para SPE: Preparar cartuchos para SPE adecuados 6 lavándolos con 1,0 mL de agua,
seguido con 5 x 1,0 mL de ácido acético al 30% (v/v) y luego con 1,0 mL de acetonitrilo. Aplicar la Solución estándar
marcada con 2-AB y la Solución muestra marcada con 2-AB a la superficie central de los discos de cartucho y dejar que la
solución se incube en el disco durante 15-20 minutos. Lavar cada disco con 1 mL de acetonitrilo, seguido por 6 x 1,0
mL de acetonitrilo al 96% (v/v), dejando que escurra cada alícuota antes de aplicar la siguiente. Eluir la Solución estándar
marcada con 2-AB y la Solución muestra marcada con 2-AB con 3 x 0,5 mL de agua, dejando que escurra cada alícuota
antes de aplicar la siguiente. Secar los eluatos usando una evaporación centrífuga sin calor. [NOTA-Durante este proce-
dimiento, podrían perderse los glicanos hidrófobos muy pequeños. Durante la verificación del método, se debe confir-
mar que no haya pérdida de especies de oligosacáridos en la etapa de eliminación de 2-AB mediante la comparación de
los perfiles cromatográficos de un blanco de reacción no extraído, una muestra no extraída y una muestra extraída.]
• MARCADO CON APTS PARA SEPARACIÓN POR ELECTROFORESIS CAPILAR
Reactivo de marcado con APTS: Disolver 5 mg de APTS trisódico en 48 µL de ácido acético al 15% (v/v).
Cianoborohidruro de sodio 1 M: Cianoborohidruro de sodio 1 M en tetrahidrofurano
Solución amortiguadora de corrida: Disolver 1,492 g de trietanolamina (TEA) y 1O g de glicerol, pesados con exactitud,
en 80 mL de agua. Ajustar a un pH de 7,5 con ácido clorhídrico 1 N y diluir con agua a un volumen final de 100 ml.
Solución amortiguadora de muestra: Diluir 1,0 mL de Solución amortiguadora de corrida con 9,0 mL de agua.
Solución estándar marcada con APTS: Agregar 2 µL de Reactivo de marcado con APTS y 2 µL de Cianoborohidruro de
sodio 7 M a un vial de ER Mezcla A de Aptitud del Sistema de Oligosacáridos USP o de ER Mezcla B de Aptitud del Sistema
de Oligosacáridos USP. Incubar a 55º durante 90 minutos. Agregar 46 µL de agua para detener la reacción y mezclar.
Transferir 5 µL del ER USP marcado con APTS a 1,995 mL de Solución amortiguadora de muestra antes de la separación.
[NOTA-Puede ser necesario ajustar el volumen de la Solución amortiguadora de muestra para que las señales de fluorescen-
cia de los oligosacáridos sean similares a las de la Solución muestra marcada con APTS.]
Solución muestra marcada con APTS: Agregar 2 µL de Reactivo de marcado con APTS y 2 µL de Cianoborohidruro de sodio
7 M a la muestra de glicano seca después de las etapas de liberación enzimática y separación. Incubar a 55º durante 90
minutos. Agregar 46 µL de agua para detener la reacción y mezclar. Transferir 5 µL de la solución de glicanos marcados
con APTS a 95 µL de Solución amortiguadora de muestra antes de la separación.
[NOTA-Seguir las guías citadas en la Tabla 7 para seleccionar el Estándar de Referencia USP apropiado y el tipo de marcado.]
SEPARACIÓN E IDENTIFICACIÓN DE OLIGOSACÁRIDOS
• CROMATOGRAFÍA EN FASE NORMAL/HILIC
Procedimiento 1
Solución de ácido fórmico 1,4 M: Mezclar 273 mL de agua con 15 mL de ácido fórmico al 98%-100%.
Solución de amoniaco 1,4 M: Mezclar 155 mL de agua con 40 mL de solución de amoniaco al 26%.
Solución amortiguadora de formiato de amonio: Agregar Solución de amoniaco 7,4 M a Solución de ácido fórmico 7,4
M.
Solución A: Acetonitrilo, Solución amortiguadora de formiato de amonio y agua (75: 4,3: 20,7)
Solución B: Acetonitrilo, Solución amortiguadora de formiato de amonio y agua (54: 8,3: 37,7)
Fase móvil: Ver la Tabla 2.
Tabla 2
Tiempo Solución A Solución B
(min) (%) (%)
0,0 79 21
80,0 47 53
81,0 o 100
92,0 o 100
93,0 79 21
113,0 79 21

6 Un cartucho adecuado para eliminar el 2-AB libre es Glyko GlycoClean S Cartridge disponible en Prozyme (número de catálogo GKl-4726) o un equivalente.
302 (212) Análisis de Oligosacáridos / Pruebas Químicas USP 40

Solución estándar: Reconstituir el Estándar seco marcado con 2-AB con no más de 500 µL de agua. [NOTA-Puede ser
necesario ajustar el volumen de agua para que las señales fluorescentes de la Solución estándar sean similares a las de la
Solución muestra.]
Solución muestra: Reconstituir la Muestra seca marcada con 2-AB con un volumen apropiado de agua. [NOTA-Usar una
relación de 30 µL de agua por cada 100 µg de glicoproteína usada en la prueba de Liberación Enzimática de N-Glicanos
como punto de inicio.]
Solución blanco: Matriz amortiguadora de muestra de glicoproteína usada en el procedimiento de Preparación de Mues-
tras.
Sistema cromatográfico
(Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
Detector: Fluorescencia (longitud de onda de excitación de 250 nm y longitud de onda de emisión de 428 nm)
Columna: 2,0 mm x 15 cm; relleno L68 de 3 µm
Temperaturas
Columna: 45º
Muestreador automático: 2º-8º
Velocidad de flujo: 0,2 ml/min
Volumen de inyección: 2 µL
Aptitud del sistema
Muestras: Solución estándar y Solución blanco
Requisitos de aptitud
Blanco: No se observan picos en el cromatograma de la Solución blanco dentro de la ventana del tiempo de retención
entre los 5-113 minutos.
Similitud de los cromatogramas: El cromatograma obtenido de la Solución estándar corresponde al cromatograma
de referencia provisto con el Certificado del ER Mezcla A de Aptitud del Sistema de Oligosacáridos USP o del ER Mezc-
la B de Aptitud del Sistema de Oligosacáridos USP.
Presencia de especies de N-glicanos: Si se usa el ER Mezcla A de Aptitud del Sistema de Oligosacáridos USP, identifi-
car los picos correspondientes a GO, GOF, G 7Fa, G 7Fb, G2F, A 7F y A2F (ver la Tabla 3; ver también el Apéndice) en el
cromatograma obtenido de la Solución estándar comparando con el cromatograma de referencia provisto con el Cer-
tificado USP del ER Mezcla A de Aptitud del Sistema de Oligosacáridos USP. Si se usa el ER Mezcla B de Aptitud del
Sistema de Oligosacáridos USP, identificar los picos correspondientes a oligomanosa (MAN) MAN-5, MAN-6, MAN-7,
MAN-8 y MAN-9 (ver la Tabla 4; ver también el Apéndice) en el cromatograma obtenido de la Solución estándar com-
parando con el cromatograma de referencia provisto con el Certificado USP del ER Mezcla B de Aptitud del Sistema
de Oligosacáridos USP.
Tiempos de retención relativos: Correspondiente a los tiempos de retención relativos de N-glicanos listados en la
Tabla 3 o la Tabla 4.
Tabla 3. Solución Estándar Usando el ER Mezcla A de Aptitud del Sistema de Oligosacáridos USP
N-Gllcano Tiempo de Retención Relativo Aproximado
GO (NGA2) 0,47
GOF (NGA2F) 0,57
GlFa (NAlF, FA2Gl o NA2G1F) 0,75
GlFb (NAlF, FA2Gl o NA2G1F) 0,78
G2F (NA2F) 1,00
AlF (G2fSl) 1,39
A2F (G2f52) 1,76

Tabla 4. Solución Estándar Usando el ER Mezcla B de Aptitud del Sistema de Ollgosacárldos USP
N-Gllcano Tiempo de Retención Relativo Aproximado
MAN-5 0,74
MAN-6 1,00
MAN-7 1,29
MAN-8 1,60
MAN-9 1,85

Análisis: Equilibrar el Sistema cromatográfico durante al menos 1 hora con las condiciones iniciales descritas en la Tabla
2. Inyectar la Solución blanco hasta que la línea base permanezca estable (1-3 inyecciones).
Muestra: Solución muestra
USP 40 Pruebas Químicas/ (212) Análisis de Oligosacáridos 303

Integrar los picos en el cromatograma resultante e informar las áreas relativas (con respecto al área total) de los picos
pertinentes a las estructuras de glicano relevantes al producto. Trazar una línea base desde el primero hasta el último
pico. Para información general sobre la integración de los picos cromatográficos, ver el capítulo (621 ).
Procedimiento 2
Solución A: Formiato de amonio 250 mM de pH 4,0, que se prepara según se indica a continuación. Mezclar 500 ml
de agua con 9,8 ml de ácido fórmico al 96%. Ajustar con hidróxido de amonio al 30% a un pH de 4,0±O,1. Diluir con
agua hasta un volumen final de 1000 ml. Pasar la solución a través de un filtro de membrana compuesto de acetato de
celulosa con un tamaño de poro de 0,22 µm.
Solución B: Acetonitrilo
Fase móvil: Ver la Tabla 5.
Tabla 5
Tiempo Solución A Solución B
(min) (%) (%)
0,0 20 80
2,0 30 70
67,0 52 48
67,1 80 20
73,0 80 20
73,1 20 80
85,0 20 80

Solución estándar: Reconstituir el Estándar seco marcado con 2-AB con no menos de 500 µL de agua. [NOTA-Puede ser
necesario ajustar el volumen de agua para que las señales fluorescentes de la Solución estándar sean similares a las de la
Solución muestra.]
Solución muestra: Reconstituir la Muestra seca marcada con 2-AB con un volumen apropiado de agua. [NOTA-Usar una
relación de 50 µL de agua por cada 100 µg de glicoproteína usada en la prueba de Liberación Enzimática de N-Glicanos
como punto de inicio.]
Solución blanco: Matriz amortiguadora de muestra de glicoproteína usada en el procedimiento de Preparación de Mues-
tras.
Sistema cromatográfico
(Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
Detector: Fluorescencia; ajustar las longitudes de onda de excitación y emisión según se listan en la Tabla 6.
Tabla 6
Tiempo Excitación Emisión
(min) (nm) (nm)
0,00 330 420
1,00 330 420
1,01 400 500
10,00 400 500
10,01 330 420
85,00 330 420

Columna: 4,6 mm x 25 cm; relleno L68 de 5 µm

Temperaturas
Columna: 35º
Muestreador automático: 2º-8º
Velocidad de flujo: 0,4 ml/min
Volumen de inyección: 1O µL
Aptitud del sistema
Muestra: Solución estándar
Requisitos de aptitud
Similitud de los cromatogramas: El cromatograma obtenido de la Solución estándar corresponde al cromatograma
de referencia provisto con el Certificado del ER Mezcla A de Aptitud del Sistema de Oligosacáridos USP o del ER Mezc-
la B de Aptitud del Sistema de Oligosacáridos USP.
Presencia de especies de N-glicanos: Si se usa el ER Mezcla A de Aptitud del Sistema de Oligosacáridos USP, identifi-
car los picos correspondientes a GO, GOF, G 1Fa, G 1Fb, G2, G2F, A 1F y A2F (ver la Tabla 7; ver también el Apéndice) en
el cromatograma obtenido de la Solución estándar comparando con el cromatograma de referencia provisto con el
Certificado USP del ER Mezcla A de Aptitud del Sistema de Oligosacáridos USP. Si se usa el ER Mezcla B de Aptitud del
304 (212) Análisis de Oligosacáridos / Pruebas Químicas USP 40

Sistema de Oligosacáridos USP, identificar los picos correspondientes a MAN-5, MAN-6, MAN-7, MAN-8 y MAN-9 (ver
la Tabla 8; ver también el Apéndice) en el cromatograma obtenido de la Solución estándar comparando con el croma-
tograma de referencia provisto con el Certificado USP del ER Mezcla B de Aptitud del Sistema de Oligosacáridos USP.
Tiempos de retención relativos: Correspondiente a los tiempos de retención relativos de N-glicanos listados en la
Tabla 7 o la Tabla 8.
Tabla 7. Solución Estándar Usando el ER Mezcla A de Aptitud del Sistema de Ollgosacáridos USP
N-Glicano Tiempo de Retención Relativo Aproximado
GO (NGA2) 0,78
GOF (NGA2F) 0,83
GlFa (NAlF, FA2Gl o NA2G1F) 0,91
GlFb (NAlF, FA2Gl o NA2G1F) 0,92
G2 (NA2) 0,96
G2F (NA2F) 1,00
AlF(G2fS1) 1, 11
A2F (G2fS2) 1,20

Tabla 8. Solución Estándar Usando el ER Mezcla B de Aptitud del Sistema de Oligosacáridos USP
N-Glicano Tiempo de Retención Relativo Aproximado
MAN-5 0,77
MAN-6 0,86
MAN-7 0,93
MAN-8 1,00
MAN-9 1,05

Análisis
Muestra: Solución muestra
Integrar los picos en el cromatograma resultante e informar las áreas relativas (con respecto al área total) de los picos
pertinentes de estructuras de glicano relevantes al producto. Para información general sobre la integración de los picos
cromatográficos, ver el capítulo (621 ).
•CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE INTERCAMBIO ANIÓNICO DE ALTA RESOLUCIÓN CON DETECCIÓN FLUOROMÉTRICA
Procedimiento 1
Solución A: Agua; desgasificar antes de usar.
Solución B: Acetato de sodio 0,5 M, que se prepara según se indica a continuación. Disolver 20,5 g de acetato de sodio
anhidro en 450 ml de agua y mezclar bien. Diluir con agua hasta un volumen final de 500 ml. Filtrar la solución a través
de una membrana con un tamaño de poro de no más de 0,45 µm y desgasificar antes de usar.
Solución C: Acetato de sodio 0,5 M, que se prepara según se indica a continuación. Agregar 26 ml de solución de hi-
dróxido de sodio al 50% (p/p) a 972 ml de agua. Pasar la solución a través de un filtro de membrana resistente a solu-
ciones alcalinas con un tamaño de poro de no más de 0,45 µm y desgasificar antes de usar.
Fase móvil: Ver la Tabla 9.
Tabla 9
Tiempo Solución A Solución B Solución C
(min} (%} (%} (%} Elución
0,0 70 o 30 Condición inicial
15,0 70 o 30 Acetato de sodio 0-75 mM,
hidróxido de sodio O, 15 N
65,0 55 15 30 isocrático
66,0 o 50 50 Acetato de sodio 250 mM,
hidróxido de sodio 0,25 N
74,0 o 50 50 para lavado
75,0 70 o 30
90,0 70 o 30 Re-equilibrio

Solución estándar: Reconstituir el Estándar seco marcado con 2-AB con no más de 500 µL de agua. [NOTA-Puede ser
necesario ajustar el volumen de agua para que las señales fluorescentes de la Solución estándar sean similares a las de la
Solución muestra.]
Solución muestra: Reconstituir la Muestra seca marcada con 2-AB con un volumen apropiado de agua. [NOTA-Usar una
relación de 20 µL de agua por cada 100 µg de glicoproteína usada en la prueba de Liberación Enzimática de N-Glicanos
como punto de inicio.]
USP 40 Pruebas Químicas/ (212) Análisis de Oligosacáridos 305

Solución blanco: Matriz amortiguadora de muestra de glicoproteína usada en el procedimiento de Preparación de Mues-
tras.
Sistema cromatográfico
(Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
Detector: Fluorescencia (longitud de onda de excitación de 330 nm y longitud de onda de emisión de 420 nm)
Columnas
Guarda columna: 4,0 mm x 5 cm; relleno L46 de 1O µm
Columna analítica: 4,0 mm x 25 cm; relleno L46 de 1O µm
Temperaturas
Columna: 25º
Muestreador automático: 4º
Velocidad de flujo: 0,8 ml/min
Volumen de inyección: 50 µL
Aptitud del sistema
Muestra: Solución estándar
Requisitos de aptitud
Similitud de los cromatogramas: El cromatograma obtenido de la Solución estándar corresponde al cromatograma
de referencia provisto con el Certificado del ER Mezcla A de Aptitud del Sistema de Oligosacáridos USP o del ER Mezc-
la B de Aptitud del Sistema de Oligosacáridos USP.
Presencia de especies de N-glicanos: Si se usa el ER Mezcla A de Aptitud del Sistema de Oligosacáridos USP, identifi-
car los picos correspondientes a GOF, G 1F, GO, G2F, A 1F y A2F (ver la Tabla 1O; ver también el Apéndice) en el croma-
tograma obtenido de la Solución estándar comparando con el cromatograma de referencia provisto con el Certificado
USP del ER Mezcla A de Aptitud del Sistema de Oligosacáridos USP. Si se usa el ER Mezcla B de Aptitud del Sistema de
Oligosacáridos USP, identificar los picos correspondientes a MAN-5, MAN-6, MAN-1, MAN-8 y MAN-9 (ver la Tabla 11;
ver también el Apéndice) en el cromatograma obtenido de la Solución estándar comparando el cromatograma de refe-
rencia provisto con el Certificado USP del ER Mezcla B de Aptitud del Sistema de Oligosacáridos USP.
Tiempos de retención relativos: Correspondientes a los tiempos de retención relativos de N-glicanos listados en la
Tabla 1O o la Tabla 11.
Tabla 10. Solución Estándar Usando el ER Mezcla A de Aptitud del Sistema de Oligosacárldos USP
N-Glicano Tiempo de Retención Relativo Aproximado
GOF (NGA2F) 0,67
Gl F (NAl F, FA2Gl o NA2Gl F) 0,86
GO (NGA2) 0,92
G2F (NA2F) 1,00
AlF (G2fSl) 1,75
A2F (G2fS2) 2,22

Tabla 11. Solución Estándar Usando el ER Mezcla B de Aptitud del Sistema de Oligosacárldos USP
N-Glicano Tiempo de Retención Relativo Aproximado
MAN-5 0,86
MAN-6 1,00
MAN-7 1,09
MAN-8 1,15
MAN-9 1,24

Análisis: Equilibrar el Sistema cromatográfico con las condiciones iniciales de Fase Móvil descritas en la Tabla 9 durante un
mínimo de 15 minutos. Inyectar 50 µL de agua para la primera inyección.
Muestra: Solución muestra
Integrar los picos en el cromatograma resultante e informar las áreas relativas (con respecto al área total) de los picos
pertinentes de estructuras de glicano relevantes al producto. Para información general sobre la integración de los picos
cromatográficos, ver el capítulo (621 ).
Procedimiento 2
Solución A: Agua; desgasificar antes de usar
Solución B: Acetato de sodio 0,5 M, que se prepara según se indica a continuación. Disolver 41,0 g de acetato de sodio
anhidro en 900 ml de agua. Transferir la solución a un matraz volumétrico de 1 litro y llevar con agua a volumen. Filtrar
la solución a través de una membrana de nailon con un tamaño de poro de no más de 0,45 µm y desgasificar antes de
usar.
306 (212) Análisis de Oligosacáridos / Pruebas Químicas USP 40

Solución C: Hidróxido de sodio 0,5 M, que se prepara según se indica a continuación. Agregar 26 ml de solución de
hidróxido de sodio al 50% (p/p) a 900 ml de agua y mezclar bien. Llevar la solución con agua al volumen final de 1000
ml. Filtrar la solución a través de una membrana de nailon resistente a soluciones alcalinas con un tamaño de poro de
no más de 0,45 µm y desgasificar antes de usar.
Fase móvil: Ver la Tabla 12.
Tabla 12
Tiempo Solución A Solución B Solución C
(min) (%) (%) (%) Elución
0,0 80 10 10 Condición inicial
Acetato de sodio
50-150 mM, hidróxido de
15,0 80 10 10 sodio 0,05 N isocrático
Acetato de sodio
150-450 mM, hidróxido
70,0 60 30 10 de sodio 0,05 N isocrático
94,0 o 90 10 Lavado con acetato de so-
99,0 o 90 10 dio, sin gradiente
105 o 10 90 Lavado con hidróxido de so-
11 o 00 10 90 dio, sin gradiente
111 80 10 10
130 80 10 10 Re-equilibrio

Solución estándar: Reconstituir el Estándar seco marcado con 2-AB con no más de 500 µL de agua. [NOTA-Puede ser
necesario ajustar el volumen de agua para que las señales fluorescentes de la Solución estándar sean similares a las de la
Solución muestra.]
Solución muestra: Reconstituir la Muestra seca marcada con 2-AB con un volumen apropiado de agua. [NOTA-Usar una
relación de 20 µL de agua por cada 100 µg de glicoproteína usada en la prueba de Liberación Enzimática de N-Glicanos
como punto de inicio.]
Solución blanco: Matriz amortiguadora de muestra usada en el procedimiento de Preparación de Muestras.
Sistema cromatográfico
(Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
Detector: Fluorescencia (longitud de onda de excitación de 330 nm y longitud de onda de emisión de 420 nm)
Columnas
Guarda columna: 4,0 mm x 5 cm; relleno L46 de 1O µm
Columna analítica: 4,0 mm x 25 cm; relleno L46 de 1O µm
Temperaturas
Columna: 25º
Muestreador automático: 4º
Velocidad de flujo: 0,5 ml/min
Volumen de inyección: 25 µL
Aptitud del sistema
Muestras: Solución estándar y Solución blanco
Requisitos de aptitud
Blanco: El cromatograma de la Solución blanco no debe tener componentes que interfieran en las regiones de elución
de los N-glicanos.
Similitud de los cromatogramas: El cromatograma obtenido de la Solución estándar corresponde al cromatograma
de referencia provisto con el Certificado del ER Mezcla C de Aptitud del Sistema de Oligosacáridos USP o del ER Mezc-
la D de Aptitud del Sistema de Oligosacáridos USP.
Presencia de especies de N-glicanos: Si se usa el ER Mezcla C de Aptitud del Sistema de Oligosacáridos USP, identifi-
car los picos correspondientes a A1 (pico 1 y pico 2), A2 y A3 (ver la Tabla 13; ver también el Apéndice) en el cromato-
grama obtenido de la Solución estándar comparando con el cromatograma de referencia provisto con el Certificado. Si
se usa el ER Mezcla D de Aptitud del Sistema de Oligosacáridos USP, identificar los picos correspondientes a A 1 (pico
1), A2, A3 y A3G3S4 (ver la Tabla 14; ver también el Apéndice) en el cromatograma obtenido de la Solución estándar
comparando con el cromatograma de referencia provisto con el Certificado.
Tiempos de retención relativos: Correspondientes a los tiempos de retención relativos de N-glicanos listados en la
Tabla 13 o la Tabla 14.
Tabla 13. Solución Estándar Usando el ER Mezcla C de Aptitud del Sistema de Ollgosacáridos USP
N-Glicano Tiempo de Retención Relativo Aproximado
Al (GlSl), pico 1 0,31
USP 40 Pruebas Químicas/ (212) Análisis de Oligosacáridos 307

Tabla 13. Solución Estándar Usando el ER Mezcla C de Aptitud del Sistema de Ollgosacárldos USP (Continuación)
N-Gllcano Tiempo de Retención Relativo Aproximado
Al (GlSl), pico 2 0,32
A2 (G2S2) 0,73
A3 (G3S3) 1,00

Tabla 14. Solución Estándar Usando ER Mezcla D de Aptitud del Sistema de Ollgosacáridos USP
N-Gllcano Tiempo de Retención Relativo Aproximado
Al (GlSl), pico 1 0,23
A2 (G2S2) 0,57
A3 (G3S3) 0,78
A3G3S4 (S4NA3 o A3 + Sa) 1,00

Análisis: [NOTA-Equilibrar la columna con las condiciones iniciales de fase móvil durante un mínimo de 15 minutos.]
Muestra: Solución muestra
Inyectar 25 µL de agua y completar el programa de elución por gradiente por lo menos una vez para equilibrar la co-
lumna y el sistema. Integrar los picos en el cromatograma resultante e informar las áreas relativas (con respecto al área
total) de los picos pertinentes a las estructuras de glicano relevantes para el producto. Para información general sobre
la integración de los picos cromatográficos, ver el capítulo (621 ).
• ELECTROFORESIS (APILAR
Solución amortiguadora de corrida: Disolver 1,492 g de TEA y 1Og de glicerol en 80 ml de agua. Ajustar con ácido
clorhídrico 1 N a un pH de 7,5 y diluir con agua a un volumen final de 100 ml.
Solución estándar: Solución estándar marcada con APTS, que se prepara según se indica en la prueba de Marcado con
APTS para Separación por Electroforesis Capilar.
Solución muestra: Solución muestra marcada con APTS, que se prepara según se indica en la prueba de Marcado con APTS
para Separación por Electroforesis Capilar.
Solución blanco: Matriz amortiguadora de muestra de glicoproteína usada en el procedimiento de Preparación de Mues-
tras.
Condiciones instrumentales
Modo: Electroforesis Capilar
Detector: Fluorescencia inducida por láser (longitud de onda de excitación de 488 nm y longitud de onda de emisión
de 520 nm)
Capilar: Sílice fundida sin recubrimiento, con un diámetro interno de 50 µm, una longitud total de 50 cm y una longi-
tud de separación de 40 cm
Preacondicionamiento del capilar: Entre cada corrida, enjuagar durante 5 minutos a 40 psi con hidróxido de sodio
0,5 N, seguidos de agua durante 1 minuto a 40 psi. [NOTA-Preacondicionar un capilar nuevo o según se requiera:
Enjuagar durante 5 minutos a 20 psi con metano!, seguidos de agua durante 1 minuto a 50 psi, de ácido clorhídrico
1 N durante 5 minutos a 20 psi, de agua durante 1 minuto a 50 psi, de hidróxido de sodio 0,5 N durante 25 minutos a
20 psi y de agua durante 5 minutos a 50 psi.]
Prellenado del capilar: Enjuagar durante 5 minutos a 40 psi con Solución amortiguadora de corrida.
Inyección muestra: inyección hidrodinámica (presión) de 1O segundos
Voltaje: 22 kV durante 60 minutos
Temperaturas
Cartucho del capilar: 18º
Almacenamiento de la muestra: 20º
Aptitud del sistema
Muestra: Solución estándar
Requisitos de aptitud
Similitud de los electroferogramas: El electroferograma obtenido de la Solución estándar corresponde al electrofero-
grama de referencia provisto con el Certificado del ER Mezcla A de Aptitud del Sistema de Oligosacáridos USP o del ER
Mezcla B de Aptitud del Sistema de Oligosacáridos USP.
Presencia de especies de N-glicanos: Si se usa el ER Mezcla A de Aptitud del Sistema de Oligosacáridos USP, identifi-
car los picos correspondientes a G2F, G2, G 7Fa, G 7Fb, GOF, MAN-5, GO y A 7F (ver la Tabla 75; ver también el Apéndice)
en el electroferograma obtenido de la Solución estándar comparando con el electroferograma de referencia provisto
con el Certificado USP del ER Mezcla A de Aptitud del Sistema de Oligosacáridos USP. Si se usa el ER Mezcla B de Apti-
tud del Sistema de Oligosacáridos USP, identificar los picos correspondientes a MAN-5, MAN-6, MAN-7, MAN-8 y
MAN-9 (ver la Tabla 76; ver también el Apéndice) en el electroferograma obtenido de la Solución estándar comparando
con el electroferograma de referencia provisto con el Certificado USP del ER Mezcla B de Aptitud del Sistema de Oligo-
sacáridos USP.
308 (212) Análisis de Oligosacáridos / Pruebas Químicas USP 40

Tiempos de migración relativos: Correspondientes a los tiempos de migración relativos listados en la Tabla 75 o Ta-
bla 76.
Tabla 15. Solución Estándar Usando el ER Mezcla A de Aptitud del Sistema de Ollgosacáridos USP
N-Glicano Tiempo de Migración Relativo Aproximado
G2F (NA2F) 0,79
G2 (NA2) 0,84
GlFb (NA1F, FA2G1 o NA2G1F) 0,87
G1Fa (NA 1F, FA2G1 o NA2G1F) 0,90
GOF (NGA2F) 1,00
MAN-5 1,03
GO (NGA2) 1, 12
A1F (G2f51) 1, 18

Tabla 16. Solución Estándar Usando el ER Mezcla B de Aptitud del Sistema de Oligosacárldos USP
N-Glicano Tiempo de Migración Relativo Aproximado
MAN-9 0,82
MAN-8 0,85
MAN-7 0,91; 0,92; 0,94
MAN-6 1,00
MAN-5 1, 11

Análisis
Muestra: Solución muestra
Integrar los picos en el electroferograma resultante e informar las áreas relativas (con respecto al área total) de los picos
pertinentes de estructuras de glicano relevantes al producto.

REQUISITOS ADICIONALES
• ESTÁNDARES DE REFERENCIA USP (11)
ER Mezcla A de Aptitud del Sistema de Oligosacáridos USP
ER Mezcla B de Aptitud del Sistema de Oligosacáridos USP
ER Mezcla C de Aptitud del Sistema de Oligosacáridos USP
ER Mezcla D de Aptitud del Sistema de Oligosacáridos USP

APÉNDICE
Tabla 17. Descripciones de Gllcanos
Gllcano Descripción
Oligosacárido biantenario asialo-agalacto

GlcNAc~ 1---+2Mana 1 \

6
Man~ 1---+4GlcNAc~ 1---+4GlcNAc
3

/
GlcNAc~1---+2Mana1
GO (NGA2)
Oligosacárido biantenario asialo-agalacto-fucosilado

Fuca1
GlcNAc~ 1---+2Mana 1 \

1
6 6
Man~ 1---+4GlcNAc~ 1---+4GlcNAc
3

/
GlcNAc~ 1---+2Mana 1
GOF (NGA2F)
USP 40 Pruebas Químicas/ (212) Análisis de Oligosacáridos 309

Tabla 17. Descripciones de Glicanos Continuacion)

Glicano Descripción
Oligosacárido biantenario asialo-monogalactosilado fucosilado con galac-
tosilación en el enlace a(l ,6)

Galp 1~4GlcNAcp1~2Mana1 Fuca1

\6 6
Manp1~4GlcNAcp1~4GlcNAc
3

GlcNAc¡J 1~2Mana1
/
GlFa (NAlF, FA2Gl o NA2G1F) con enlace a(l,6)
Oligosacárido biantenario asialo-, monogalactosilado, fucosilado con ga-
lactosilación en el enlace a(l ,3)

Fuce<1
GlcNAcp 1~2Mana1

\
6 6
Manp 1~4GlcNAcp1 ~4GlcNAc
3

Galp1~4GlcNAcp1~2Mana1
/
GlFb (NAlF, FA2Gl o NA2G1F) con enlace a(l,3)
Oligosacárido biantenario asialo, galactosilado

Gaip 1~4GlcNAcp1~2Mana1 \

6
Manp 1~4GlcNAc~1 ~4GlcNAc
3

Galp 1~4GlcNAcp1~2Mana1
/
G2 (NA2)
Oligosacárido biantenario asialo-fucosilado

Fuca1
Gal~1~4GlcNAc¡J1~2Mane<1 \ 1

6 6
Man~ 1~4GlcNAc¡J1 ~4GlcNAc
3

Gal 01~4GlcNAcp1~2Mane<1
/
G2F (NA2F)
Oligosacárido biantenario monosialo-fucosilado

Fuca1
r GalP1->4GlcNAcP1->2Mana1 \

1
6 6
Neu5Aca2---+6 Manp 1->4GlcNAcp 1->4GlcNAc
3

Gaip 1->4GlcNAcf 1->2Mana1

/
AlF (G2f51)
Oligosacárido biantenario disialo-fucosilado

Fuca1
Neu5Acrx2->6GalP1->4GlcNAcP1->2Mana1 \

6 6
Man p 1->4GlcNAcf 1->4GlcNAc
3

Neu5Aca2->6Galll 1->4GlcNAcp 1->2Mana1

/
A2F (G2f52)
31 O (212) Análisis de Oligosacáridos /Pruebas Químicas USP 40

Tabla 17. Descripciones de Glicanos (Continuación)

Gllcano Descripción
Oligomanosa 5
Oligomanosa N-ligada con 5 residuos manosilo

Mana1 \

6
Mana 1~6Manp1~4GlcNAcp1 ~4GlcNAc
3 3

Mana1
/ Mana1
1

MAN-5
Oligomanosa 6
Oligomanosa N-ligada con 6 residuos manosilo

Mana1 \

6
Mana1

/
3
\6
Mana1 Man p 1~4GlcNAcp1 ~4GlcNAc
3

Mana 1~2Mana1
/
MAN-6
Oligomanosa 7
Oligomanosa N-ligada con 7 residuos manosilo

,,-- Mana1 \

6
Mana1

Mana1-->2
/
3
\6
Mana1
Man~ 1-->4GlcNAc~ 1-->4GlcNAc
3

'- Mana1-->2Mana1
/
MAN-7
Oligomanosa 8
Oligomanosa N-ligada con 8 residuos manosilo

,,-- Mana1 \

Mana1-->2 6
Mana1

/
3
\6
Mana1
Man~ 1-->4GlcNAc~ 1-->4GlcNAc
Mana1-->2 3

'- Mana 1-->2Mana 1

/
MAN-8
USP 40 Pruebas Químicas/ (212) Análisis de Oligosacáridos 311

Tabla 17. Descripciones de Gllcanos (Continuación)

Glicano Descripción
Oligomanosa 9
Oligomanosa N-ligada con 9 residuos manosilo

Mana1--.+2Mana1 \

6
Mana1

/
3
\6
Mana1--.+2Mana1
Man f31--.+4GlcNAcf31---+4GlcNAc
3

Mana1--.+2Mana1--.+2Mana1
/
MAN-9
Oligosacárido biantenario monosialisado, galactosilado

GalP1->4GlcNAcp1->2Mana1 \

Neu5Aca2->3/6
{
~anµ1->4GlcNAql1->4GlcNAc
/ -

GalP1->4GlcNAcB1-+2Mana1
Al (GlSl)
Oligosacárido biantenario disialisado, galactosilado

Neu5Aca2-;3/6Galp 1-;4GlcNAcP 1-->2Mana 1 \

6
Manp 1-->4GlcNAcp 1-->4GlcNAc
3

Neu5Aca2-->3/6Galp 1-->4GlcNAcp 1--;2Mana1

/
A2 (G2S2)
Oligosacárido triantenario trisialisado, galactosi/ado

Neu5Aca2-->3/6Galp 1-->4GlcNAcp 1-->2Mana 1 \

6
Neu5Aca2-;3/6Galp 1-;3/4GlcNAcp 1 \ ~anp 1-+4GlcNAcp 1-+4GlcNAc

4 /
Mana1
2

Neu5Aca2-+3/6Galp 1--t4GlcNAcp 1
/
A3 (G3S3)
Oligosacárido triantenario tetrasialisado, galactosilado

Neu5Aca2-;3/6Galp1-->4GlcNAcP1-;2Mana1 \

6
Neu5Aca2--;3/6Galp 1--;4GlcNAcp 1 \ ~anp 1-+4GlcNAcp 1-->4GlcNAc

2 /
Neu5Aca2->3/6Galp1 \ ~ana1

3 /
GlcNAcp1
6

Neu5Aca2
/
A3G3S4 (S4NA3 o A3 + Sa)
312 (221) Cloruros y Sulfatos/ Pruebas Químicas USP 40

(221) CLORUROS Y SULFATOS

Las siguientes pruebas de límites se utilizan como procedimientos generales en aquellos casos en que se especifican los lími-
tes de cloruros y sulfatos en las monografías individuales.
Realizar las pruebas y los controles utilizando tubos de vidrio que tengan el mismo diámetro y sean tan semejantes en las
restantes características como sea posible (ver Nefelometría, Turbidimetría y Comparación Visual (855), Comparación VisuaD. Em-
plear las mismas cantidades de los mismos reactivos tanto para la solución en análisis como para la solución control que con-
tiene el volumen especificado de cloruro o sulfato. Si, después de la acidificación, la solución no queda totalmente transparen-
te, filtrarla a través de un papel de filtro exento de cloruro y sulfato. Agregar el precipitante, nitrato de plata SR o cloruro de
bario SR, según sea necesario, a la solución de prueba y a la solución de control en secuencia inmediata.
En aquellos casos en que la monografía individual indique la realización de la prueba sobre un volumen específico de una
solución de la sustancia y el límite para cloruro o sulfato corresponda a 0,20 mL o menos de ácido clorhídrico 0,020 N o de
ácido sulfúrico 0,020 N, respectivamente, realizar la prueba a la solución sin dilución adicional. En tales casos, mantener las
mismas relaciones de volumen para la solución de control y para la solución en análisis. Cuando se realiza la prueba a sales de
metales pesados, que muestran normalmente una reacción ácida, omitir la acidificación y no neutralizar la solución. Disolver
las sales de bismuto en unos pocos mL de agua y 2 mL de ácido nítrico antes del tratamiento con el agente precipitante.
Cloruros-Disolver la cantidad especificada de la sustancia en análisis en 30 mL a 40 mL de agua o, si la sustancia ya está
en solución, agregar agua para obtener un volumen total de 30 mL a 40 mL y, si fuera necesario, neutralizar la solución al
tornasol con ácido nítrico. Agregar 1 mL de ácido nítrico y 1 mL de nitrato de plata SR y agua suficiente para obtener 50 ml.
Mezclar y dejar eri reposo durante 5 minutos protegido de la luz solar directa. A menos que se especifique algo diferente en la
monografía correspondiente, comparar la turbidez, si la hubiera, con la producida en una solución que contenga el volumen
de ácido clorhídrico 0,020 N especificado en la monografía.
Sulfatos-Disolver la cantidad especificada de la sustancia en análisis en 30 mL a 40 mL de agua, o, si la sustancia ya está
en solución, agregar agua para obtener un volumen total de 30 mL a 40 mL y, si fuera necesario, neutralizar la solución al
tornasol con ácido clorhídrico. Agregar 1 mL de ácido clorhídrico 3 N, 3 mL de cloruro de bario SR y agua suficiente para obte-
ner 50 mL. Mezclar y dejar en reposo durante 1 O minutos. A menos que se especifique algo diferente en la monografía corres-
pondiente, comparar la turbidez, si la hubiera, con la producida en una solución que contenga el volumen de ácido sulfúrico
0,020 N especificado en la monografía.

(223) DIMETILANILINA

La siguiente prueba de límite se utiliza como un procedimiento general para la determinación de trazas de dimetilanilina en
artículos farmacopeicos utilizando cromatografía de gases, cuando esta determinación se especifica en la monografía indivi-
dual correspondiente. La dimetilanilina es un depurador del ácido clorhídrico que puede haber sido arrastrado durante el
proceso.

PROCEDIMIENTO
Solución de estándar interno: A menos que se especifique algo diferente en la monografía individual, preparar una solu-
ción de naftaleno en ciclohexano que contenga aproximadamente 50 µg por ml.
Preparación estándar: A menos que se especifique algo diferente en la monografía individual, transferir 50,0 mg de N,N-
dimetilanilina a un matraz volumétrico de 50 mL, agregar 25 mL de ácido clorhídrico 1 N, agitar por rotación suave hasta
disolver, diluir a volumen con agua y mezclar. Transferir 5,0 mL de la solución resultante a un matraz volumétrico de 250
mL, diluir a volumen con agua y mezclar. En un tubo de centrífuga adecuado agregar 1,0 mL de esta solución, 5,0 mL de
hidróxido de sodio 1 N y 1,0 mL de Solución de estándar interno, agitar vigorosamente durante 1 minuto y centrifugar. Em-
plear el sobrenadante transparente como Preparación estándar.
Preparación de prueba: A menos que se especifique algo diferente en la monografía individual, transferir 1,0 g de la sus-
tancia a analizar a un tubo de centrífuga adecuado, agregar 5 mL de hidróxido de sodio 1 N, agitar por rotación suave hasta
disolver la muestra, agregar 1,0 mL de Solución de Estándar Interno, agitar vigorosamente durante 1 minuto y centrifugar.
Emplear el sobrenadante transparente como Preparación de prueba.
Sistema cromatográfico
(Ver Cromatografía (621 ).)
Equipar el cromatógrafo de gases con un detector de ionización a la llama, mantenido aproximadamente a 250º y una colum-
na capilar de sílice fundida, de 0,53 mm x 30 m, unida con una película de fase G42 de 1,0 µm. El gas transportador es
helio, con una velocidad lineal de aproximadamente 30 cm por segundo y una relación de partición de 1O: 1. Mantener la
temperatura de la columna a 11 Oº durante los primeros 4 minutos después de inyectar, luego aumentar de 11 Oº a 200º a 8º
por minuto, y mantener a 200º durante 5 minutos. Mantener la temperatura del inyector a 250º. Inyectar en el cromatógra-
fo la Preparación estándar y registrar las respuestas según se indica en el Procedimiento: identificar los picos de dimetilanilina y
USP 40 Pruebas Químicas/ (227) 4-Aminofenol en Medicamentos 313

naftaleno según sus tiempos de retención relativos, que son 1,0 y 1,3, respectivamente. La relación señal-ruido para el pico
de dimetilanilina es no menor de 1O.
Procedimiento: Inyectar en el cromatógrafo volúmenes iguales (aproximadamente 1 µL) de la Preparación estándar y de la
Preparación de prueba, registrar los cromatogramas y medir las áreas de los picos principales. El cociente entre la respuesta
de cualquier pico de dimetilanilina y la respuesta del pico de naftaleno obtenido a partir de la Preparación de prueba no es
mayor que el que se obtiene a partir de la Preparación estándar (0,002%).

(226) 4-EPIAN H1DROTETRACICLI NA

Este procedimiento cromatográfico se utiliza para demostrar que el contenido de 4-epianhidrotetraciclina, un producto de de-
gradación de la tetraciclina, no excede el límite indicado en la monografía individual.

PROCEDIMIENTO
Solución amortiguadora de EDTA: Disolver 37,2 g de edetato disódico en 800 mL de agua, ajustar con hidróxido de
amonio hasta un pH de 7,8, diluir con agua a 1000 mL y mezclar.
Fase de soporte: Agregar 5 mL de Solución amortiguadora de EDTA a 1O g de tierra silícea cromatográfica lavada con ácido
para cromatografía en columna y mezclar hasta que la tierra silícea se humedezca uniformemente.
Solución de prueba: Preparar según se indica en la monografía individual correspondiente.
Procedimiento: Preparar un tubo cromatográfico de 15 mm x 170 mm con una salida de 4 mm x 50 mm rellenándolo
con Fase de soporte, en porciones, apisonando firmemente cada porción, hasta que el tubo se llene hasta una altura de apro-
ximadamente 1O cm. En un vaso de precipitados preparar una mezcla de 1 g de tierra silícea cromatográfica lavada con áci-
do para cromatografía en columna y 1 mL de Solución de prueba. Transferir la mezcla a la parte superior de la columna. Lavar
en seco el vaso de precipitados con Fase de soporte y transferir a la columna para proporcionar una capa adicional de 1 cm
en la parte superior de la mezcla que contiene la Solución de prueba. Dentro de los 30 minutos, pasar cloroformo a través de
la columna y recolectar fracciones sucesivas de 5,0 mL, 5,0 mL, 10,0 mL, 10,0 mL y 5,0 ml. Observar la columna durante la
elución y prestar atención a la aparición de dos bandas amarillas separadas. La fracción o fracciones correspondientes a la
primera banda amarilla contienen las anhidrotetraciclinas. Descartar estas fracciones. Las fracciones que aparecen después
de la primera banda amarilla contienen la 4-epianhidrotetraciclina. Determinar la absorbancia de cada fracción de 4-epianhi-
drotetraciclina a la longitud de onda de máxima absorción, aproximadamente a 438 nm, con un espectrofotómetro apro-
piado, diluyendo cada fracción, si fuera necesario, con cloroformo y empleando cloroformo como blanco. Calcular la canti-
dad, en mg, de 4-epianhidrotetraciclina en cada fracción, por la fórmula:

Resultado= AuVD/A5

Au = absorbancia de la fracción tomada

V =volumen de la fracción tomada (mL)
O = factor de dilución, si la fracción se diluyó
A5 = absortividad de la 4-epianhidrotetraciclina a 438 nm, 20,08
A partir de la suma de las cantidades de 4-epianhidrotetraciclina encontrada en las diferentes fracciones, calcular el porcentaje
de 4-epianhidrotetraciclina en relación con el equivalente de clorhidrato de tetraciclina contenido en la Solución de prueba.

(227) 4-AMINOFENOL EN MEDICAMENTOS QUE CONTIENEN

ACETAMINOFENO

INTRODUCCIÓN
Este capítulo de pruebas generales provee un procedimiento y un criterio de aceptación (límite) para controlar el producto de
degradación principal de acetaminofeno, el 4-aminofenol, una impureza que se puede formar por la hidrólisis del acetami-
nofeno.
PREPARACIÓN DE LAS SOLUCIONES
Todas las soluciones que contienen acetaminofeno o 4-aminofenol deben protegerse de la luz y deben almacenarse sólo du-
rante el tiempo que se pueda sustentar mediante datos de estabilidad de las soluciones adquiridos durante la verificación en
las condiciones reales de uso.
Solución amortiguadora: 4,0 g/L de citrato de sodio dihidrato y 1,5 g/L de ácido cítrico anhidro, en agua.
Diluyente: Solución amortiguadora y acetonitrilo (9:1)
Solución A: Solución amortiguadora de fosfato 1O mM, que se prepara agregando 0,60 g de fosfato monobásico de pota-
sio y 0,82 g de fosfato dibásico de sodio a un matraz volumétrico de 1 L, disolviendo y diluyendo con agua a volumen a un
pH de 7,0.
314 (227) 4-Aminofenol en Medicamentos / Pruebas Químicas USP 40

Solución B: Agua
Solución C: Acetonitrilo
Fase móvil: Ver la Tabla 1.
Tabla 1
Tiempo Solución A Solución B Solución C
(min) (%) (%) (%)
o 90 5 5
5 90 5 5
7 10 10 80
7,1 90 5 5
10 90 5 5

Solución madre del estándar: 25 µg/ml de ER 4-Aminofenol USP en Diluyente. Preparar en el momento de su uso junto
con las otras soluciones descritas a continuación. Desechar después de 4 horas o conforme a los datos de estabilidad de las
soluciones. [NOTA-Ver Ajustes Cromatográficos, estabilidad de la solución, a continuación.]
Solución de aptitud del sistema: 2,5 µg/ml de ER 4-Aminofenol USP, a partir de Solución madre del estándar en Diluyente
Solución madre de la muestra: Nominalmente 1O mg/ml de acetaminofeno, a partir de una cantidad adecuada de medi-
camento en Diluyente. [NOTA-Se puede incorporar primero cualquiera de los componentes del Diluyente al medicamento,
seguido por la adición del otro componente manteniendo las proporciones de Solución amortiguadora y acetonitrilo, y ob-
teniendo el volumen final apropiado definido para el Diluyente.] [NOTA-Se recomienda preparar de manera simultánea la
Solución muestra y la Solución estándar dentro de un lapso de tiempo corto (p.ej., 30 minutos) para cada muestra de medi-
camento.]
Solución estándar: Agregar 25,0 ml de Solución madre de la muestra y 15,0 ml de Solución madre del estándar a un ma-
traz volumétrico de 50 ml y diluir con Diluyente a volumen. Pasar a través de un filtro adecuado con un tamaño de poro de
0,45 µm, desechando los primeros 3 ml del filtrado.
Solución muestra: Agregar 25,0 ml de Solución madre de la muestra a un matraz volumétrico de 50 ml y diluir con Dilu-
yente a volumen. Pasar a través de un filtro adecuado con un tamaño de poro de 0,45 µm, desechando los primeros 3 ml
del filtrado.
MÉTODO CROMATOGRÁFICO
Sistema cromatográfico
(Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
Detector: UV 300 nm
Columna: 4,6 mm x 15 cm; relleno L85 de 5 µm
Temperatura de la columna: 30º
Velocidad de flujo: 1 ml/min
Volumen de inyección: 1O µL
Aptitud del sistema
Muestras: Solución de aptitud del sistema y Solución estándar
[NOTA-El tiempo de retención típico de 4-aminofenol es aproximadamente 4,2-5,3 minutos.]
Requisitos de aptitud
Resolución: No menos de 1,0 entre 4-aminofenol y el pico más cercano, Solución estándar
Factor de asimetría: No más de 1,5 para el pico de 4-aminofenol, Solución estándar
Desviación estándar relativa: No más de 5,0%, Solución estándar
Relación señal-ruido: No menos de 20 para el pico de 4-aminofenol, Solución de aptitud del sistema
ANÁLISIS
Muestras: Solución estándar y Solución muestra
Inyectar la Solución muestra y la Solución estándar para cada muestra de medicamento de manera secuencial, es decir, una tras
otra.
Calcular el porcentaje de 4-aminofenol (C 6 H7NO) con respecto a acetaminofeno en la porción de medicamento tomada:

Resultado= [ruf(r5 - ru)] x (W5/Wu) x 100

ru = respuesta del pico de 4-aminofenol de la Solución muestra

r5 = respuesta del pico de 4-aminofenol de la Solución estándar
W5 =cantidad de ER 4-Aminofenol USP agregada a la Solución estándar (mg)
Wu = cantidad de acetaminofeno en la Solución muestra (mg)
Criterios de aceptación: (a menos que se especifique de otro modo en la monografía): No más de 0, 15% de 4-aminofe-
nol con respecto a acetaminofeno
USP 40 Pruebas Químicas / (228) Óxido de Etileno y Dioxano 315

AJUSTES CROMATOGRÁFICOS
Se puede ajustar el tiempo de retención de 4-aminofenol para conseguir la especificidad para una matriz de producto determi-
nada. Esta posibilidad de ajuste reemplaza a las disposiciones del capítulo Cromatografía (621) para el ajuste de condiciones
cromatográficas y tiene el propósito de proporcionar una medida de flexibilidad cuando así se requiera. La Tabla 2 propor-
ciona sugerencias para cambiar la retención del 4-aminofenol. El uso de un sistema ternario de fase móvil permite cambios
fáciles en la concentración iónica (agua de la Solución B) y en la concentración orgánica (acetonitrilo de la Solución C), pero
éste puede simplificarse a un sistema binario de fase móvil.
Tabla 2
Cambio en la Retención del
Cambio de Condición 4-Aminofenol
Aumento en la concentración orgánica (Solución C) Reduce la retención del 4-aminofenol
Reducción del pH (Solución A) Aumenta la retención del 4-aminofenol
Aumento en la concentración iónica (Solución B) Reduce la retención del 4-aminofenol
Aumento en la temperatura
de la columna Aumenta la retención del 4-aminofenol

Los ajustes al procedimiento cromatográfico pueden requerir de verificación o validación. Ver los capítulos Validación de Proce-
dimientos Farmacopeicos (1225) y Verificación de Procedimientos Farmacopeicos (1226) para orientación. Las condiciones cro-
matográficas ajustadas deben cumplir con todos los requisitos de aptitud del sistema.
La estabilidad de la solución debe verificarse en condiciones reales de uso para asegurar que el 4-aminofenol permanece esta-
ble en la Solución muestra y en la Solución estándar según se demuestra por un cambio de no más de ± 10% en las áreas de
los picos de 4-aminofenol.

(228) ÓXIDO DE ETILENO Y DIOXANO

El siguiente procedimiento se usa para determinar el contenido de óxido de etileno y dioxano residuales en los productos que
se preparan a partir de óxido de etileno. A menos que se especifique algo diferente en la monografía individual, usar el
Método l.
Método 1
[PRECAUCIÓN-El óxido de etileno es tóxico e inflamable. Preparar estas soluciones en una campana bien ventilada con mucho
cuidado. Proteger manos y rostro usando guantes protectores de polietileno y una máscara adecuada. Almacenar todas las
soluciones en recipientes herméticos y refrigerar a una temperatura entre 4º y 8º.]
[NOTA-Antes de usar el polietilenglicol 200 en esta prueba, eliminar cualquier componente volátil colocando 500 mL de po-
lietilenglicol 200 en un matraz de fondo redondo de 1000 mL y acoplando el matraz a un evaporador rotatorio mantenido a
60º y bajo un vacío de 10-20 mm Hg durante 6 horas.]
Solución de acetaldehído: 1O µg/mL de acetaldehído. [NOTA-Preparar inmediatamente antes de su uso.]
Solución madre de óxido de etileno: 2,5 mg/g de óxido de etileno.
Preparar según se indica a continuación: Tarar un matraz Erlenmeyer con tapón de vidrio, agregar 50 mL de polietilenglicol
200, y volver a pesar el matraz. Transferir 5 mL del óxido de etileno líquido a un vaso de precipitados de 100 mL enfriado
en una mezcla de cloruro de sodio y hielo (1 :3). Transferir 300 µL (correspondientes a 250 mg) de óxido de etileno líqui-
do al polietilenglicol 200 y agitar por rotación suave hasta mezclar. Colocar de nuevo el tapón, volver a pesar el matraz, y
determinar la cantidad de óxido de etileno absorbido por diferencia de peso. Ajustar el peso de la mezcla con polietilen-
glicol 200 a 100,0 g, colocar de nuevo el tapón, y agitar por rotación suave hasta mezclar. [NOTA-Llenar con óxido de
etileno líquido un frasco resistente a la presión enfriado y almacenar en un congelador cuando no se use. Usar un trozo
pequeño de película de polietileno para proteger el líquido del contacto con la junta de caucho. Usar un aparato enfriado
adecuadamente cuando sea apropiado. Preparar esta solución madre inmediatamente antes de su uso y almacenar en un
refrigerador después de su preparación.]
Solución de óxido de etileno: Tarar un matraz Erlenmeyer con tapón de vidrio y enfriarlo en un refrigerador. Agregar 35
mL de polietilenglicol 200 y volver a pesar el matraz. Transferir 1 g de Solución madre de óxido de etileno enfriada al matraz
Erlenmeyer tarado. Ajustar el peso de la solución con polietilenglicol 200 a 50,0 g, colocar de nuevo el tapón, y agitar por
rotación suave hasta mezclar. Transferir 1Og de esta solución a un matraz volumétrico de 50 ml. Agregar 30 mL de agua y
mezclar. Diluir con agua a volumen y mezclar para obtener una solución que contenga 1O µg/mL de óxido de etileno.
[NOTA-Usar un aparato enfriado adecuadamente cuando sea apropiado. Preparar inmediatamente antes de su uso.]
Solución de dioxano: 500 µg/mL de dioxano
Solución estándar A: Transferir O, 1 mL de Solución de óxido de etileno a un vial para muestreo de fase gaseosa de 1O ml.
[NOTA-Se pueden usar otros tamaños de vial para muestreo de fase gaseosa, como por ejemplo de 22 mL, dependiendo
de las condiciones operativas; sin embargo, se debe usar el mismo tamaño para la Solución estándar A, la Solución estándar
By la Solución muestra.] Agregar O, 1 mL de Solución de acetaldehído y O, 1 mL de Solución de dioxano, sellar el vial, y mez-
clar.
316 (228) Óxido de Etileno y Dioxano / Pruebas Químicas USP 40

Solución estándar B: Transferir 1,0 g de la sustancia de prueba a un vial para muestreo de fase gaseosa de 1O mL y agre-
gar O, 1 mL de Solución de óxido de etileno, O, 1 mL de Solución de dioxano y 1,0 mL de N,N-dimetilacetamida. Sellar el vial y
mezclar.
Solución muestra: Transferir 1,0 g de la sustancia de prueba a un a vial para muestreo de fase gaseosa de 1O mL y agregar
1,0 mL de N,N-dimetilacetamida y 0,2 mL de agua. Sellar el vial y mezclar.
Sistema cromatográfico
(Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: Cromatografía de Gases con muestreador de cámara gaseosa (Headspace GC)
Detector: Ionización a la llama
Columna: Capilar de vidrio o cuarzo, de 0,32 mm x 30 m, con una capa de fase Gl de 1,0 µm
Temperatura
Inyector: 150º
Detector: 250º
Columna: Ver la tabla de temperatura de la columna siguiente.
Tiempo de Espera (Hold Time)
Temperatura Rampa de Temperatura Temperatura a la Temperatura
Inicial(°) (°/min) Final (º) Final (min)
50 - 50 5
50 5 180 -
180 30 230 5

Gas transportador: Helio

Velocidad lineal: 20 cm/s
Volumen de inyección: 1 mL (fase gaseosa)
Tipo de inyección: Relación de partición 20:1
Muestreador de fase gaseosa
Tiempo de equilibrio: 45 min
Temperatura de equilibrio
70º para la Solución estándar A
90º para la Solución estándar B
90º para la Solución muestra
Temperatura de la línea de transferencia: 150º
Tiempo de presurización: 1 min
Tiempo de inyección: 12 s
Aptitud del sistema
Muestra: Solución estándar A
[NOTA-Los tiempos de retención relativos para acetaldehído y óxido de etileno son 0,94 y 1,0, respectivamente.]
Requisitos de aptitud
Resolución: No menos de 2,0 entre acetaldehído y óxido de etileno
Relación señal-ruido: No menos de 5, determinado a partir del pico de dioxano
Desviación estándar relativa: No más de 15%
Análisis
Muestras: Solución estándar By Solución muestra
[NOTA-Los tiempos de retención relativos para óxido de etileno y dioxano son 1,0 y 2,5, respectivamente.]
Calcular el contenido de óxido de etileno, en ppm, en la porción de la sustancia de prueba tomada:
Resultado= AE x ru/[(r5 x Wu) - (ru x W5)]
AE = cantidad de óxido de etileno agregado a la Solución estándar B (µg)
ru =respuesta del pico de óxido de etileno de la Solución muestra
r5 = respuesta del pico de óxido de etileno de la Solución estándar B
Wu = peso de la sustancia de prueba tomada para preparar la Solución muestra (g)
W5 = peso de la sustancia de prueba tomada para preparar la Solución estándar B (g)
Calcular el contenido de dioxano, en ppm, en la porción de la sustancia de prueba tomada:
Resultado= AD x ru/[(r5 x Wu) - (ru x W5)]
AD = cantidad de dioxano agregado a la Solución estándar B (µg)
ru = respuesta del pico de dioxano de la Solución muestra
r5 = respuesta del pico de dioxano de la Solución estándar B
Wu = peso de la sustancia de prueba tomada para preparar la Solución muestra (g)
W5 = peso de la sustancia de prueba tomada para preparar la Solución estándar B (g)
USP 40 Pruebas Químicas/ (228) Óxido de Etileno y Dioxano 31 7

Método 11
Solución estándar de óxido de etileno: Diluir 0,5 mL de óxido de etileno en cloruro de metileno (50 mg/mL) 1 con agua
hasta 50,0 mL. [NOTA-La solución es estable durante 3 meses si se almacena en viales con tapas precintadas de membra-
na de silicona recubiertas con politetrafluoroetileno (polytef) a -20º.] Dejar que alcance la temperatura ambiente. Diluir 1,0
mL con agua hasta 250,0 mL para obtener una solución con una concentración de 2 µg/mL de óxido de etileno. [NOTA-
Usar esta solución inmediatamente después de su preparación.]
Solución estándar de dioxano: 0,05 µL/mL de dioxano
Solución estándar de acetaldehído: 1O µg/mL de acetaldehído. [NOTA-Preparar inmediatamente antes de su uso.]
Solución de resolución: Agregar 2,0 mL de Solución estándar de acetaldehído y 2,0 mL de Solución estándar de óxido de
etileno a un vial para muestreo de fase gaseosa de 1O mL. Sellar el vial inmediatamente con una membrana de silicona
recubierta con teflón y una tapa de aluminio, y mezclar cuidadosamente.
Solución estándar A: 0,48 µg/mL de óxido de etileno, a partir de Solución estándar de óxido de etileno y 0,005 µL/mL de
dioxano, a partir de Solución estándar de dioxano, en agua
Solución estándar B: Transferir 1,0 g de la sustancia de prueba a un vial para muestreo de fase gaseosa de 1O mL. Agregar
2,0 mL de Solución estándar A, sellar el vial inmediatamente con una membrana de silicona recubierta con teflón y una tapa
de aluminio, y mezclar cuidadosamente.
Solución muestra: Transferir 1,0 g de la sustancia de prueba a un vial para muestreo de fase gaseosa de 1O mL. Agregar
2,0 mL de agua, sellar el vial inmediatamente con una membrana de silicona recubierta con teflón y una tapa de aluminio,
y mezclar cuidadosamente.
Sistema cromatográfico
(Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: Cromatografía de Gases con muestreador de cámara gaseosa (Headspace GC)
Detector: Ionización a la llama
Columna: Capilar de sílice fundida, de 0,53 mm x 50 m, con una capa de fase G27 de 5,0 µm
Temperatura
Inyector: 85º
Detector: 250º
Columna: Ver la tabla de temperatura de la columna siguiente.

Tiempo de Espera {Hold Time)

Temperatura Rampa de Temperatura Temperatura a la Temperatura
Inicial {º) {º/min) Final {º) Final {min)
70 10 250 5

Gas transportador: Helio

Velocidad de flujo: 4 mL/min
Volumen de inyección: 1 mL (fase gaseosa)
Tipo de inyección: Relación de partición 3,5 : 1
Muestreador de fase gaseosa
Tiempo de equilibrio: 30 min
Temperatura de equilibrio: 80º
Aptitud del sistema
Muestra: Solución de resolución
[NOTA-Los tiempos de retención relativos para acetaldehído y óxido de etileno son 0,9 y 1,0, respectivamente.]
Requisitos de aptitud
Resolución: No menos de 2,0 entre acetaldehído y óxido de etileno
Análisis
Muestras: Solución estándar By Solución muestra
[NOTA-Los tiempos de retención relativos para óxido de etileno y dioxano son 1,0 y 1,9, respectivamente.]
Calcular el contenido de óxido de etileno, en ppm, en la porción de la sustancia de prueba tomada:
Resultado= C¡ x V x ruf[(rs x Wu) - (ru x Ws)]

C¡ = concentración de óxido de etileno en la Solución estándar A (µg/mL)

V =volumen de Solución estándar A agregada a la Solución estándar B (2,0 mL)
ru = respuesta del pico de óxido de etileno de la Solución muestra
rs = respuesta del pico de óxido de etileno de la Solución estándar B
Wu = peso de la sustancia de prueba tomada para preparar la Solución muestra (g)
Ws = peso de la sustancia de prueba tomada para preparar la Solución estándar B (g)
Calcular el contenido de dioxano, en ppm, en la porción de la sustancia de prueba tomada:

1 Esta es una solución disponible comercialmente.

318 (228) Óxido de Etileno y Dioxano /Pruebas Químicas USP 40

Resultado= CD x V x p x Fx ru/[(r5 x Wu) - (ru x W5)]

CD = concentración de dioxano en la Solución estándar A (µL/ml)
V =volumen de la Solución estándar A agregada a la Solución estándar B (2,0 ml)
p =densidad de dioxano (1,03 g/ml = 1,03 mg/µL)
F = factor de conversión (1000 µg/mg)
ru = respuesta del pico de dioxano de la Solución muestra
r5 = respuesta del pico de dioxano de la Solución estándar B
Wu = peso de la sustancia de prueba tomada para preparar la Solución muestra (g)
W5 = peso de la sustancia de prueba tomada para preparar la Solución estándar B (g)

Ell1JJin11.r la siguiente:

·(231) METALES PESADOS

Esta prueba se proporciona para demostrar que el contenido de impurezas rnetálk:¡u éoloreadas.p():ref ión sulfuro, en las
condiciones de prueba especificadas, no excede el límite. de Metales pes(jd<J;s especificadQ en la monogriífía individµal com~s­
pondiente al porcentaje (en peso) de plomo enla sustaheia en análisis, segúnse(jetl!![niirra:mediá.nte®mpara~ióhvis:Ual:<:ón­
comitante (ver Comparcrción Visual en la sección Procedimiento en fJ~<:trototomefrft;t yf.})i~pef'Slóh:de Luz <B~ l)) con un control
prep¡;¡rado a partir de una solución .Están.dar de Plomo. [NOTA-'-tas s\::Jstanci¡;¡s qt,1~ generaírnerite respond~rán .a .e~a prueba son:
plomo,· mercurio, bismuto, arséniCo, antimonio, estaño, cadmio, plata, cobfeYmQlil;li:l:e.no:)
Determinar la cantidad de metales pl!!sados por el Método t a menos q1.,1e. se ~~pt;!cifique algo difet~nt.e en: la monografía
individual. El Método 1se emplea para sustancias que producen preparacione~ transparentes eincoloras en· 1as com:liciones de
prueba épedficadas. El Método 11 se emplea par<1 susta.ncias que rio pl'<>dUc;en preparacio:nes transparent~s e: ihc<>loras én las
condiciones de prueba especiflcadas par<1 el Método/, o p<1ra sust<mc;láfqUe.persunat\::i!'Rlezat<>mpleíá,interfiérill)con:la pred-
pitac;i(m de r:netales medi¡;¡nte el ión sulfuro; o para aceites fijos y voládles •. ~J Método lfles ún método de digestión húmeda
que sé usá sé\lo d-1andó no sé..pllede usar ni .e.! Méto<Jo I ni el Método/{,

Soludórr Mádre de Nitrato dé Plomo-:Dlsolver •J.59,8 mg de nitrat-0 dé p.lomo en 1QO' ff!L de a,gtia a la que se:le ha agre-
gado 1 ml de ácido nítrico, luego diluir Con agua hasta l 000 ml. Pteparar y almac;enafesta sC11uciórien r&ipi~tes de vidrio
libres de sales de plomo solubles.
Soludón Estándar c::le Plomo~En el día. de usq1 dlluir CQn agua 10,0 mt dé Solí;i(.'io'rJ tvler:[r:e dé N/trp~o Q'e PJOOioh!!íSta lOQ,O
ml. Cada ml de la Solución. Estándar de plqmo contiene e.I equivalente a lo µg de:pl9mo; Una ~~idn ~eCt:imparati~n prepa-
ráda sobre la base de 100 µL de Solucí6n Estándar de Ptomo pot g. aé sústancia .en án~lisis co:ntiérté er"eq~jV~lénteá 1 parte de
plomo por mi116n de partes de la sustancia en análisis.

ME'TOOOI
. ... ,.
Sotudón Amortiguadora de Acetato de pff;3,~-0jsolyer 25,0 g <ie.ac~ta:to dé amoni<:! en 15 l'i\4 de:agua y atjrég¡ir 38,0
mL de ácido clorhíarlco 6 N. Ajustar, si. h1eta. nece5ario; con hidróxido qearhbnio 6N,9 aJ:ido i::lothídrko 6Nhastá 1:1n Pl:i de
3,5¡ diluir (:on.agua.hasta loo mi;. y mezclar:
Prepa:racidn tstándar:'-Pipetear.2 mt de la Solücíó/'1 f.~tó:ndar ríe, P/()fl'l:g(:l:O ~g'0de.Pl;¡)jtt;~n~f$rír.~ u(l tiJpb de tomparadón
de color de so irhLy aif~tr'con agua hasta 2.s m,~. (Jsarrdo un medi<iorde pfl o'lífi p~pel ln~i::adbrde: pH de lntéiva.lo cort:o
como indica<ior extemo, ajustar con acldo ~céticó lbfó hidr6x1do .<:Je9mpnló '6)\l fiasta t:irl pH ent~e 3,o y 4;0; ciilúirc:6n agua
hasta 40 mL y mezda.r.
Preparac:~ón de Prueba....::En uh. tubo. de comp¡;¡t¡;¡ción de tolor de 50 r:nl.., cPlo(at. 2.5:ffiL dela .solución preparáda para· la
prueba según se. indica en la monografía ir:ídlvldual;6usa:n@ el'~oll:ifT1én.!'.)e~ddbfod:icai::IO.;:cuandó se:espedfi(:a: enla mono-
grafí~ individual, disolver y diluir.con agt:iabasta lS ml l<.t<:antidad,:;éng;:ae'la>su$t;¡jn:C!a~a.naH,za,r{segnnse q\lcula; por la
f6rmula:
2191(1 OoO() /
en donde Les el límite de Metales pesqdos, exp~e$adó com~ ·potc;:entaje:. t;Js~.oae)fü média(:!f<ife:pfi o Un p~pel rndicado.r de
pH ae intervalo corto como indicador E!Xtérho, ajustar c9n ácidd atéti~<f1 N b hidró>Cid(l,(le amonio 611\H'last¡¡ un pH entre 3,Q
y 4,0, diluir con agua hasta 40 mty mezclar. .
 USP 40 Pruebas Químicas/ (231) Metales Pesados 319

Preparación Control:;....En un tercer tubo de comparación de color de 50 mL, colocar 25 mL de una solución preparada
según se indica en la Preparación dePrueba yagregar2,0mL de.ta 5oluc;ón Estpndarde Plomo. Usando un medidor de pH o un
papel indicador de pHde intervalo corto como indicador externo, ajustar con ~cido acético 1 N o hidróxido de amonio 6 N
hasta un.pH entre 3,0y4,0; diluircon agua hasta 40m!-y mezdar.
Procedimiento-A cada u110 de los tres tubos que. contengan la Préparación Estándar, la Preparación de Prueba .y la Prepara-
ción Control agregar 2. mL de. la Solúción Amortiguadora de Acetato de pH 3,S; luegó agregar .1,2 ml de tioacetamida~lieerlna
básica SR, diluir con agua· hasta 50 mL, mezclar, dejar en reposo durante 2 rninutos y observar hada abajo sobre una s!Jper'.fide
blanca*: el color de la solución de l;;iPrepqraciónde Prueba no.es más osC:uro:q:Ue el de la solución de fa Preparaciónfistándar y
el color de la s.olución de la Preparación Control es igual .o más oscuro que.el color de la so.lución de la Preparación Estáridqr.
[NOTA--Sí erc:olor de la Preparación Control. es. más daro que el de la Preparación Estándar, usar el Método IJ en lugar del Méto-
do 1 para la sustancia en análisis.]

MÉTODOll
[NotA~Este método no recupera mercurio~]
Solucic)n Amortiguadora .de Aéétatc> d.e pH 3,5-~reparar según se indica en el f¡Jetod(> l.
Prépara;ción Estándar--,Préparar según ~e indica ·eh el Método f.
Prépafación de Prueba-'-Usaruna cantfdad, en g, de la sustant.ia a analizar cal.culada por la fórmula:
2~0/(1 OOOL)

en donde L es el lím.ite de Metales pesados, expresado como p9.rcentaje.Tr¡;¡nsferir .la cantidad. pesada de la sustancla a un criso.1
adectiado, agregar sµfidente ácido sulfúrico para hurrredecerla e .incinerar cµidad9samente a bája temperatura basta que se
carbonice por completo. (Ef crisol puede estar cubiérfo con. un¡;¡ .U!pa adecua°ª 110 ajustada durante la carbonización}. Agregar
2 ml ·de ácido nítrico y 5 gotas de. ácido• sulfúrico a la masa carbonizada y <:;alentar c911 cuidado hasta que ya· no se produzcan
humos bl¡:¡ncos. 1ncinerar preferiblemente en una mufla, a una temperatura de 500"' a 600º hasta que el carbón se haya l:¡ue-
mado completamente: Enfriar, agregar 4 mL de ácido cl9rhíclrlco. ¡:¡ N; .c[Jljrir y digerir en un baño de vapor durante JS minu-
tos, remover la tapa y evaporar. leotamente hasta sequeoi!d el) uh baño dé Vapór. H.umede{}er .et res.iduo con 1 gota de ácido
clorhídrico, agregar 1Q mL de agua caliente y digeri.r durante•2 minut9$. Ag~egaJ, gota a gota, hidróxido de amoni9 6 N·nasta
que la soluc.ión sea alcalina al papel tornasol, diluir con agua a 25 mL y ajustar con áddo acetico 1 N a Ufl pHentre 3,0 y 4;0,
empleando Un papel indicador de pH de intervalo corto como indicador externo. Filtrar si fuera necesario, enjuagar el crisol y
el filtro con 1O ml de .agua, combinar el filtrado y el enjuague en un tubo de comparación de color de 50 ml, dilulr con agua
a 40 ml y mezclar.
Procedimiento-A cada uno de los tubos que contengan la Preparación Estándar y la Preparación de Prueba, agregar 2 ml
de la Solución Amortiguadora de Acetato. de pH 3.,5; luego agrega.r 112 ml de tioacetami<:la~licerina básica SR, diluir con agua
hasta 50 ml, mezclar, dejar en reposo durante 2 minutos y. observar hacia abajo· sobre una superficie blanca*: el color de I¡:¡
solución de la Preparación de Prueba no es más oscuro que el de la solución de la Preparación Estándar.

MÉTOl>O 111
Solución Amortiguadora de Acetato de pH 3,~Preparar según se indica en el Metodo l.
preparación Estándar,,..;..oTransferir a un matraz l<jeldahl de.100 mL limpio y seco; una mezcla de 8 mL de ácido .sulfúrico y
1O ml de ácido nítrico, y agregar otro volumen de á.cido nítrico igual al ya lumen• extra de ácido .nítrico agregado a la Prepara-
ción de Pruepa. Calentar la.solución hasta. que se produzcan numos blancos.densos;. enfriar; agregar cuJdadosament.e l OmL de
agua; y si se usó peróxido de hidrógeno para.tratar la Prep<ir<Jción de Prueba; agregar un volumen de peróxido de hidrógeno al
30 por ciento, igual al que se usó para la sustancia en análisis: Calentar a ebuUidón moderada hasta que se produzcan humos
blancós densos. Volver. a enfriar, agregar cuidadosamente 5. mL de agua, mezclar y calentar a ebullición moderada hasta que
se produzcan humos blanws densos y hasta obtel'lerunvolumen de 2 a 3.ml. Enfriar~ diluir cuidadosamente .con. unos pocos
ml de aguá; agregar 2,0 mlde la Solución.Estándar de Plomo (20.¡.¡9 de. Pb) ymezclar. Transferir a un tubo de comparación de
color de 50 mL, enjuagar el matraz con agua, agregando los enjuagues al tubo hasta obtener un volumen de 25 mL y mezclar.
Preparación de Prueba-,.A menos 1:¡ue se indique algo diferente. en la monografía individual, usar una cantidad, en g¡ de la
sustancia a analizar calculada por la fórmul¡;¡:
2,0/(1 OOOL)
en donde l., es el límite de Metales pesados, expresado como porcentaje.
Si la sustancia es un sótído-Transfetir la cantidad pesada de 1a sustancia en análl.sis a un matraz Kjeldahl de 100 mL limpio y
seco. [NOiA-'-Se puede usar un matraz de 300 ml si la reacción produce mucha espuma.] Fijar el matraz con una pinza en un
ángulo de 45º y agregar una cantidad suficiente de una mezda de 8 ml de áddo sulfúrico y 10 mL de ácido nítrico para hu;.
medecer bien la sustancia. Entibiar suavemente hasta que se inicie la reacción, dejar que la reacción disminuya y agregar por~

• En aquellos países o jurisdicciones en los que no se pueda usar tioacetamída, agregar a cada uno de los tubos 1O rnL de sulfuro de hidrógeno SR reciéri prepara-
do, mezclar, deiar en reposo durante 5 minutos y observar hm::ia abajo sobre una superficie blanca.
320 (231) Metales Pesados/ Pruebas Químicas USP 40

ciones de la misma mezcla de ácidos, .calentando después de cada adición, hasta que se haya agregado un total de 18 ml de
la mezcla de ácidos. Aumentar el calor y calentar a ebullición moderada hasta que la solución se oscurezca. Enfriar, agregar 2
ml de ácido nítrico y volver a calentar hasta que la solución se oscurezca. Continuar el calentamiento y agregar luego ácido
nítrico hasta que no se observe más oscurecimiento, luego calentar intensamente hasta que se produzcan humos blancos den-
sos. Enfriar, agregar cuidadosamente 5 ml de agua, calentar a ebullición moderada hasta que se produzcan humos blancos
densos y continuar el calentamiento hasta que el.volumen se reduzca a unos pocos mL Enfriar, agregar cuidadosamente 5 mL
de agua y examinar el color de la solución. Si es amarilla, agregar cuidadosamente 1 mL de peróxido de hidrógeno al 30 por
ciento y evaporar nuevamente hasta que se produzcan humos blancos densos y hasta un volumen de 2 a 3 m~. Si la sotución
aún está amarilla, repetir la adición de 5 ml de agua y el tratamiento con peróxido. Enfdar, diluir cuidadosamente con unos
pocos ml de agua, enjuagar y recoger en un t:ubo de comparación de color de 50 ml, teniendo cuidado de que el ·volumen
combinado no exceda de 25 mL.
Si Ja sustancia es un líquido-Transferir la cantidad pesada de la sustancia en análisis a un matraz Kjeldahl de 100 mL limpio
y seco. [NOTA-Se puede usar un matraz de 300 ml si la reacción proi;:fuce mucha espuma.] Fijar el matraz con una pinza en
un ángulo de 45º y agregar cuidadosamente unos pocos mL de una mezcla de 8 ml de ácido sulfúrico y 1O ml de ácido
nítrico. Entibiar suavemente hasta que se inicie la reacción, dejar que la reacción disminuya y proceder según se indica en Si la
sustancia es un sólido, comenzando donde. dice "agregar porciones de .la misma mezcla. de. ácidos".
Preparación Control-Proceder con la digestión, usando la misma cantidad de muestra y el mismo pro.cedimiento, según
se indica en el párrafo Si la sustancia es un sólido en la sección Preparación .de Prueba, .hasta el paso· "Enfriar, dilu.ir cuidáciosa-
mente con unos pocos mL de agua". Agregar 2,0 ml de la Solución Estándar de Plomo (20 µg de plomo) y mezclar. Transferir a
un tubo de comparación de color de 50 ml, enjuagar el matraz con agua, agregando los enjuagues al tubo hastá obtener un
volumen de 2.5 ml y mezclar.
Procedimiento-Tratar la Preparación de Prueba, la Preparación Estándp¡ y la Preparación C<:mtrol del siguiente. modo. Usan-
do un medidor de pH o un papel indicador de pH de intervalo corto como .indi<;:ador externo, ajustar la solución a. un pH entre
3,0 y 4,0 con hidróxido de amonio (se puede usar .una solución de amoníaco diluida, si se desea, a medida que se acerca. al pH
especificado), diluir c.on agua hasta 40 rnL y mezclar.
Agregar a cada tubo 2 mL de la Solución Amortiguadora de Aceta.to de. pH 3,S, luego a.gregar 1,2 rnl de. tioacetamida~glíceri­
na básica SR, diluir con agua hasta 50 ml, mezclar, dejaren reposo durante 2 minutos y observar.hacia abajo sobre una super-
ficie blanca*: el color de la Preparación de Prueba no es más oscuro que el de la Pr:eparación Estándar, y el color de la Prepara-
ción Control es igual o más oscuro que el de la Preparación Estándar.
Oficial~ Ol de enero de 2018

• (Oficial 01-ene-2018)

(232) IMPUREZAS ELEMENTALES-LÍMITES

INTRODUCCIÓN
Este capítulo general especifica límites para la cantidad de impurezas elementales en productos farmacéuticos. Las impurezas
elementales incluyen catalizadores y contaminantes ambientales que pueden estar presentes en fármacos, excipientes o medi-
camentos. Estas impurezas pueden presentarse de manera natural, agregarse intencionalmente o introducirse inadvertidamen-
te (p.ej. mediante interacciones con el equipo de procesamiento y el sistema de envase y cierre). Cuando se conoce la presen-
cia de impurezas elementales, cuando se han agregado o cuando se pueden introducir potencialmente, es necesario asegurar
el cumplimiento con los límites especificados. Una estrategia de control basada en riesgos puede ser adecuada cuando los ana-
listas determinan la forma en que se va a asegurar el cumplimiento de esta norma. La evaluación de riesgos debe considerar
(como mínimo) al arsénico, cadmio, plomo y mercurio, debido a su naturaleza ubicua. Independientemente de la metodología
empleada, todos los medicamentos deben cumplir con los límites especificados a menos que se especifique de otro modo en
una monografía individual o se excluya en el tercer párrafo de esta introducción.
Los medicamentos que contienen proteínas y polipéptidos purificados (incluyendo proteínas y polipéptidos producidos a
partir de fuentes recombinantes o no recombinantes), sus derivados y los productos de los que son componentes (p.ej., conju-
gados) están dentro del alcance de este capítulo, al igual que los medicamentos que contienen polipéptidos, polinucleótidos y
oligosacáridos producidos de manera sintética.
Este capítulo no se aplica a radiofarmacéuticos, vacunas, metabolitos celulares, productos de ADN, extractos alergénicos, cé-
lulas, sangre entera, componentes celulares o derivados de la sangre, incluido el plasma y los derivados del plasma, soluciones
para diálisis no destinadas para circulación sistémica y elementos que se incluyen intencionalmente en el medicamento para
beneficio terapéutico. Este capítulo no se aplica a productos basados en genes (terapia génica), células (terapia celular) y teji-
dos (tejidos modificados por ingeniería).
Los límites presentados en este capítulo no se aplican a excipientes ni fármacos, excepto cuando se especifique en este capí-
tulo o en las monografías individuales. Sin embargo, es necesario conocer, documentar y proporcionar en caso de que sean
solicitados los niveles de impurezas elementales presentes en fármacos y excipientes.
USP 40 Pruebas Químicas/ (232) Impurezas Elementales-Límites 321

Este capítulo no se aplica a los artículos destinados únicamente para uso veterinario. Los requisitos listados en este capítulo
tampoco se aplican a los productos de nutrición parenteral total (TPN, por sus siglas en inglés) y soluciones para diálisis. Los
suplementos dietéticos y sus ingredientes se tratan en el capítulo Contaminantes Elementales en Suplementos Dietéticos (2232).

ESPECIACIÓN
La determinación del estado de oxidación, complejo orgánico o combinación recibe el nombre de especiación. Cada una de
las impurezas elementales tiene el potencial de estar presente en diferentes estados de oxidación o de formación de complejos.
No obstante, el arsénico y el mercurio son de especial cuidado debido a las diferentes toxicidades de sus formas inorgánicas y
orgánicas complejas.
Los límites de arsénico se basan en la forma inorgánica (la más tóxica). El arsénico se puede medir usando un procedimiento
para arsénico total asumiendo que todo el arsénico contenido en el material en análisis se encuentra en la forma inorgánica.
Cuando el límite se excede usando el procedimiento para arsénico total, puede ser posible demostrarlo mediante un procedi-
miento que cuantifique las diferentes formas en que la forma inorgánica cumple con la especificación.
Los límites de mercurio se basan en el estado de oxidación (2+) inorgánico. El metilmercurio (la forma más tóxica de mercu-
rio) no es un problema común para la industria farmacéutica. Por consiguiente, el límite se estableció asumiendo la forma inor-
gánica más común (mercúrica). Los límites para artículos que tienen el potencial de contener metilmercurio (p.ej., productos
obtenidos a partir de peces) se proporcionan en las monografías correspondientes.

VÍAS DE EXPOSICIÓN
La toxicidad de una impureza elemental se relaciona con su grado de exposición (biodisponibilidad). Se ha determinado el
grado de exposición para cada una de las impurezas elementales de interés para las tres vías de administración: oral, parenteral
e inhalatoria. Estos límites se basan en la exposición crónica. Se deben considerar las exposiciones diarias orales permitidas
(EDP) de la Tabla 7 como punto de partida para el desarrollo de exposiciones diarias orales permitidas específicas para otras
vías de administración, excepto cuando se indique de otro modo en la monografía individual. [NOTA-Las vías de administra-
ción de medicamentos se definen en el capítulo general Formas Farmacéuticas (1151 ).]

MEDICAMENTOS
Los límites descritos en la segunda, tercera y cuarta columnas de la Tabla 7 son las exposiciones diarias permitidas en la dosis
diaria base de las impurezas elementales de interés para un medicamento tomado por un paciente de acuerdo con las vías de
administración indicadas.

Productos Parenterales

Los medicamentos parenterales con volúmenes máximos diarios de hasta 2 litros pueden usar el volumen máximo diario
para calcular las concentraciones permitidas a partir de las exposiciones diarias permitidas. En el caso de los productos cuyos
volúmenes diarios, según se especifican en el etiquetado y/o se establecen mediante la práctica clínica, pueden exceder de 2
litros (p.ej., solución salina, dextrosa, productos de nutrición parenteral total, soluciones para irrigación), se puede usar un vo-
lumen de 2 litros para calcular las concentraciones permitidas a partir de las exposiciones diarias permitidas.
Tabla 1. Impurezas Elementales para Medicamentos
EDP EDP EDP
para Dosis para Dosis para Dosis
Diaria Diaria Diaria
Oral" Parenteral de Inhalación
Elemento (µg/día) (µg/día) (µg/día)
Cadmio 5 2 2
Plomo 5 5 5
Arsénico inorgánicoª 15 15 2
Mercurio inorgánicoª 30 3 1
Iridio 100 10 1
Osmio 100 10 1
Paladio 100 10 1
Platino 100 10 1
Rodio 100 10 1
Rutenio 100 10 1
ª Ver la sección Especiación.
322 (232) Impurezas Elementales-Límites/ Pruebas Químicas USP 40

Tabla 1. Impurezas Elementales para Medicamentos (Continuación)

EDP EDP EDP
para Dosis para Dosis para Dosis
Diaria Diaria Diaria
Oraia Parenteral de Inhalación
Elemento (µg/día) (µg/día) (µg/día)
Cromo 11000 1100 3
Molibdeno 3000 1500 10
Níquel 200 20 5
Vanadio 100 10 1
Cobre 3000 300 30
ª Ver la sección Especiación.

Opciones para Demostrar el Cumplimiento

OPCIÓN DE ANÁLISIS DEL MEDICAMENTO

Los resultados obtenidos a partir del análisis de una unidad de dosificación típica, multiplicados por la dosis diaria máxima,
se comparan con la EDP por Dosis Diaria.

EDP por Dosis Diaria¿ valor medido (µg/g) x dosis diaria máxima (g/día)

La cantidad medida de cada impureza no es mayor que la EDP por Dosis Diaria, a menos que se indique de otro modo en la
monografía individual.

OPCIÓN DE SUMATORIA

Sumar por separado las cantidades de cada impureza elemental (en µg/g) presente en cada uno de los componentes del
medicamento usando la siguiente ecuación:
EDP por Dosis Diaria¿ [LM 7(CM x WM)] x D0

M =cada ingrediente usado para fabricar una unidad de dosificación

CM= concentración de elemento en el componente (fármaco o excipiente) (µg/g)
WM =peso del componente en una unidad de dosificación (g/unidad de dosificación)
D0 = número de unidades en la dosis diaria máxima (unidad/día)
El resultado de la sumatoria de cada impureza no es mayor que la EDP para Dosis Diaria, a menos que se indique algo dife-
rente en la monografía individual. Antes de que se puedan evaluar los productos con esta opción, el fabricante debe asegurar
que no se hayan agregado impurezas elementales adicionales de manera inadvertida durante el proceso de fabricación o me-
diante el sistema de envase y cierre durante la vida útil del producto.

OPCIÓN DE COMPONENTE INDIVIDUAL

Para medicamentos con una dosis diaria de no más de 1Og, si todas los fármacos y excipientes en una formulación cumplen
con los límites de concentración mostrados en la Tabla 2, entonces dichos componentes pueden usarse en cualquier propor-
ción. No es necesario realizar cálculos adicionales. Aunque las impurezas elementales derivadas del proceso de fabricación o
del sistema de envase y cierre no se preveen específicamente en la Opción de Componente Individual, se espera que el fabrican-
te del medicamento asegure que dichas fuentes no contribuyen de manera significativa con el contenido total de impurezas
elementales.

FÁRMACOS Y EXCIPIENTES
Se debe controlar la concentración de impurezas elementales en fármacos y excipientes y documentarla cuando estén pre-
sentes. Los niveles aceptables para estas impurezas dependen del uso final previsto del material. Por consiguiente, los fabrican-
tes de medicamentos deben determinar el nivel aceptable de impurezas elementales en los fármacos y excipientes usados para
producir sus productos.
Los valores provistos en la Tabla 2 son ejemplos de límites de concentración para componentes (fármacos y excipientes) de
medicamentos dosificados a una dosis diaria máxima de 1O g/día. Estos valores funcionan como límites de concentración pre-
determinados para facilitar las discusiones entre los fabricantes de medicamentos y los proveedores de los componentes para
sus medicamentos. [NOTA-Puede ser necesario limitar los componentes individuales a niveles distintos de los presentados en
la tabla, dependiendo de los factores mitigantes específicos de la monografía.]
USP 40 Pruebas Químicas/ (233) Impurezas Elementales-Procedimientos 323

Tabla 2. Ejemplos de Límites de Concentración para Componentes de Medicamentos con una Dosis Diaria Máxima de 10 g
Límites de Concentración
Límites de Concentración Límites de Concentración (µg/g} para Componentes
(µg/g} para Componentes (µg/g} para Componentes Usados en
Usados en Medicamentos Ora- Usados en Medicamentos para Inhala-
Elemento les Medicamentos Parenterales ción
Cadmio 0,5 0,2 0,2
Plomo 0,5 0,5 0,5
Arsénico inorgánicoª 1,5 1,5 0,2
Mercurio inorgánicoª 3 0,3 o, 1
Indio 10 1 o, 1
Osmio 10 1 o, 1
Paladio 10 1 o, 1
Platino 10 1 o, 1
Rodio 10 1 o, 1
Rutenio 10 1 o, 1
Cromo 1100 11 o 0,3
Molibdeno 300 150 1
Níquel 20 2 0,5
Vanadio 10 1 o, 1
Cobre 300 30 3
ª Ver la sección Especiación.

PRUEBAS ANALÍTICAS
Cuando los fabricantes pueden demostrar el cumplimiento, mediante el monitoreo del proceso y control en la cadena de
abastecimiento, entonces puede no ser necesario aplicar pruebas adicionales. Cuando las pruebas se realizan para demostrar el
cumplimiento, se debe proceder según se indica en el capítulo general Impurezas Elementales-Procedimientos (233) y la eva-
luación de Elementos Diana debe incluir como mínimo arsénico, cadmio, plomo y mercurio.

(233) IMPUREZAS ELEMENTALES-PROCEDIMIENTOS

INTRODUCCIÓN
Este capítulo describe dos procedimientos analíticos (Procedimientos 1 y 2) para la evaluación de los niveles de impurezas ele-
mentales. Asimismo, el capítulo describe criterios para procedimientos alternativos aceptables. Los analistas confirmarán me-
diante estudios de validación que los procedimientos analíticos aquí descritos sean adecuados para su uso en el material es-
pecífico.
Uso de Procedimientos Alternativos
Este capítulo también describe criterios para procedimientos alternativos aceptables. Los procedimientos alternativos que cum-
plen con los requisitos de validación de este capítulo pueden usarse de acuerdo con las Advertencias y Requisitos Generales
6.30, Métodos y Procedimientos Alternativos y Armonizados. La información sobre los Requisitos para la Validación de Procedi-
mientos Alternativos se provee más adelante en este capítulo.
Especiación
La determinación del estado de oxidación, complejo orgánico o combinación recibe el nombre de especiación. Los procedi-
mientos analíticos para especiación no se incluyen en este capítulo, pero se pueden encontrar ejemplos en diversas partes de
los compendios USP-NF y en la literatura.

PROCEDIMIENTOS
• PROCEDIMIENTOS fARMACOPEICOS 1 V 2
La estandarización del sistema y la evaluación de la aptitud usando materiales de referencia aplicables debe realizarse el día
del análisis.
Procedimiento y técnica de detección: El Procedimiento 1 se puede usar para impurezas elementales que por lo general
son fáciles de detectar mediante espectroscopía de emisión (óptica) atómica de plasma inductivamente acoplado (ICP-AES
o ICP-OES). El Procedimiento 2 se puede usar para impurezas elementales que por lo general son fáciles de detectar me-
diante ICP-MS. Antes del uso inicial, el analista debe verificar que el procedimiento sea apropiado para el instrumento y la
muestra usados (verificación del procedimiento) mediante el cumplimiento de los requisitos de Validación de Procedimiento
Alternativo siguientes.
324 (233) Impurezas Elementales-Procedimientos/ Pruebas Químicas USP 40

Preparación de la muestra: Las formas para la preparación de la muestra incluyen: Sin diluir, Solución acuosa directa, Solu-
ción orgánica directa y Solución indirecta. La selección de la forma apropiada de preparación de la muestra depende del ma-
terial en análisis y es responsabilidad del analista. Cuando no se indica una forma de preparación de la muestra en la mo-
nografía, el analista puede usar cualquiera de los siguientes procedimientos de preparación adecuadamente validados. Para
casos en los que sea necesario agregar cantidades conocidas (spiking) a un material en análisis a fin de proporcionar una
señal de intensidad aceptable, el blanco también debe ser adicionado con los mismos Elementos diana y, cuando sea posi-
ble, con la misma solución usada para adicionar la muestra. Las soluciones estándar pueden contener múltiples Elementos
diana. [NOTA-Se deben pesar todas las muestras líquidas.]
Sin diluir: Se usa para líquidos o procedimientos alternativos que permiten examinar muestras sin disolventes.
Solución acuosa directa: Se usa cuando la muestra es soluble en un disolvente acuoso.
Solución orgánica directa: Se usa cuando la muestra es soluble en un disolvente orgánico.
Solución indirecta: Se usa cuando un material no es directamente soluble en disolventes acuosos u orgánicos. La extrac-
ción total de metales es el método de preparación de la muestra preferido para obtener una Solución indirecta. La muestra
debe digerirse usando el procedimiento con vaso de digestión cerrado provisto a continuación o uno similar a éste. El
esquema de preparación de la muestra debe proveer una cantidad suficiente de muestra para cuantificar cada elemento
en el límite especificado en la monografía o capítulo correspondiente.
Vaso de digestión cerrado: El procedimiento de preparación de la muestra se diseña para muestras que deben digerirse
en un Ácido concentrado usando un aparato de vaso de digestión cerrado. El vaso de digestión cerrado minimiza la pérdi-
da de impurezas volátiles. La selección de un Ácido concentrado depende de la matriz de la muestra. Puede ser apropiado
el uso de cualquiera de los Ácidos concentrados, pero cada uno implica riesgos de seguridad inherentes. Por consiguiente,
se deben tomar precauciones de seguridad adecuadas en todo momento. [NOTA-Los pesos y volúmenes provistos se
pueden ajustar para cumplir con los requisitos del aparato de digestión usado.]
Un procedimiento ilustrativo que ha demostrado una amplia aplicabilidad es el siguiente. Deshidratar y predigerir 0,5 g
de muestra primaria en 5 mL de Ácido Concentrado recientemente preparado. Dejar en reposo con la tapa sin ajustar
durante 30 minutos en una campana de extracción. Agregar 1 O mL adicionales de Ácido Concentrado y digerir, usando
una técnica de vaso cerrado, hasta completar la digestión o la extracción. Repetir, si fuera necesario, agregando 5 mL
adicionales de Ácido Concentrado. [NOTA-Cuando se requiera una digestión en vaso cerrado, seguir los procedimientos
recomendados por el fabricante para garantizar el uso seguro.]
Como alternativa se pueden realizar lixiviados siempre que se justifique mediante estudios científicos validados de disponi-
bilidad de los metales, los cuales pueden incluir estudios en animales, de especiación u otros medios para estudiar la
disponibilidad del metal específico desde el producto farmacéutico.
Reactivos: Todos los reactivos usados para la preparación de las soluciones estándar y muestra deben estar exentos de
impurezas elementales, de conformidad con el capítulo Espectroquímica de Plasma (730).
• PROCEDIMIENTO 1: ICP-OES
Solución de estandarización 1: 1,5/ de los Elementos diana en una Matriz equiparada
Solución de estandarización 2: 0,5/ de los Elementos diana en una Matriz equiparada
Solución madre de la muestra: Proceder según se indica anteriormente en Preparación de la muestra. Si fuera necesario,
dejar que la muestra se enfríe. Para la determinación de mercurio, agregar un estabilizador apropiado.
Solución muestra: Diluir la Solución madre de Ja muestra con un disolvente apropiado hasta obtener una concentración
final de los Elementos Diana de no más de 1,5/.
Blanco: Matriz equiparada
Sistema espectrométrico elemental
(Ver Espectroquímica de Plasma (730).)
Modo: ICP
Detector: Sistema de detección óptica
Enjuague: El diluyente usado
Estandarización: Solución de estandarización 1, Solución de estandarización 2 y Blanco
Aptitud del sistema
Muestra: Solución de estandarización 1
Requisitos de aptitud
Deriva: Comparar los resultados obtenidos de la Solución de estandarización 1 antes y después del análisis de la Solución
muestra.
Criterios de aptitud: No más de 20% para cada Elemento diana. [NOTA-Si las muestras tienen un alto contenido mi-
neral, enjuagar bien el sistema antes de introducir la Muestra para minimizar el arrastre.]
Análisis: Analizar de acuerdo con las sugerencias del fabricante con respecto al programa y la longitud de onda. Calcular
e informar los resultados basándose en el tamaño de la muestra original. [NOTA-Se deben tomar medidas apropiadas
para corregir por interferencias inducidas por la matriz (p.ej., superposiciones de longitud de onda).]
• PROCEDIMIENTO 2: ICP-MS
Solución de estandarización 1: 1,5/ de los Elementos Diana en una Matriz equiparada
Solución de estandarización 2: 0,5/ de los Elementos Diana en una Matriz equiparada
USP 40 Pruebas Químicas/ (233) Impurezas Elementales-Procedimientos 325

Solución madre de la muestra: Proceder según se indica anteriormente en Preparación de Ja muestra. Si fuera necesario,
dejar que la muestra se enfríe. Para la determinación de mercurio, agregar un estabilizador apropiado.
Solución muestra: Diluir la Solución madre de la muestra con un disolvente apropiado hasta obtener una concentración
final de los Elementos diana de no más de 1,5}.
Blanco: Matriz equiparada
Sistema espectrométrico elemental
(Ver Espectroquímica de Plasma (730).)
Modo: ICP. [NOTA-Se recomienda un instrumento con una cámara de rocío enfriada. (Una celda de colisión o una cel-
da de reacción también puede ofrecer beneficios.)]
Detector: Espectrómetro de masas
Enjuague: El diluyente usado
Estandarización: Solución de estandarización 7, Solución de estandarización 2 y Blanco
Aptitud del sistema
Muestra: Solución de estandarización 7
Requisitos de aptitud
Deriva: Comparar los resultados obtenidos de la Solución de estandarización 7 antes y después del análisis de la Solución
muestra.
Criterios de aptitud: Deriva no más de 20% para cada Elemento Diana. [NOTA-Si las muestras tienen un alto conteni-
do mineral, enjuagar bien el sistema antes de introducir la Muestra para minimizar el arrastre.]
Análisis: Analizar de acuerdo con las sugerencias del fabricante con respecto al programa y a miz. Calcular e informar los
resultados basándose en el tamaño de la muestra original. [NOTA-Se deben tomar medidas apropiadas para corregir por
interferencias inducidas por la matriz (p.ej., interferencia de cloruro de argón en determinaciones de arsénico).]
REQUISITOS PARA LA VALIDACIÓN DE PROCEDIMIENTOS ALTERNATIVOS
Si los procedimientos farmacopeicos especificados no cumplen con las necesidades de una aplicación específica, se puede de-
sarrollar un procedimiento alternativo (ver Advertencias y Requisitos Generales 6.30, Métodos y Procedimientos Alternativos y
Armonizados). Los procedimientos alternativos deben ser validados y se debe demostrar que son aceptables de acuerdo con
los requisitos de validación para procedimientos alternativos descritos a continuación. El nivel de validación necesario para
asegurar que un procedimiento alternativo es aceptable depende de si se especifica en la monografíauna prueba de límite o
una determinación cuantitativa. A continuación se describen los requisitos para la validación de un procedimiento de impu-
rezas elementales para cada tipo de determinación. Cualquier procedimiento alternativo que ha sido validado y que cumple
con los criterios de aceptación siguientes se considera adecuado para uso.
PROCEDIMIENTOS DE LÍMITE
La siguiente sección define los parámetros de validación que se deben cumplir para que los procedimientos alternativos de
límite sean aceptables. El cumplimiento con estos requisitos se debe demostrar de manera experimental usando un procedi-
miento de aptitud del sistema y un material de referencia adecuados.
La aptitud del método se debe determinar mediante estudios que empleen los materiales o mezclas en análisis adicionados
con concentraciones conocidas de cada Elemento Diana de interés a la concentración del límite de aceptación apropiada. Las
cantidades conocidas deben agregarse al material o mezcla en análisis antes de llevar a cabo las etapas de preparación de la
muestra.
• CAPACIDAD DE DETECCIÓN
Solución estándar: Una preparación de materiales de referencia para los Elementos Diana a las Concentraciones Diana
Solución muestra adicionada 1: Preparar una solución de la muestra en análisis, a la que se le agregan cantidades cono-
cidas de los materiales de referencia apropiados para los Elementos Diana a la Concentración Diana, solubilizada o digerida
según se indica en Preparación de Ja Muestra.
Solución muestra adicionada 2: Preparar una solución de la muestra en análisis, a la que se le agregan cantidades cono-
cidas de los materiales de referencia apropiados para los Elementos Diana al 80% de la Concentración Diana, solubilizada o
digerida según se indica en Preparación de Ja Muestra.
Solución muestra no adicionada: Una muestra del material en análisis, solubilizado o digerido de la misma manera que
las Soluciones muestra
Criterios de aceptación
Procedimientos no instrumentales: La Solución muestra adicionada 7 proporciona una señal o intensidad equivalente o
mayor que la de la Solución estándar. La Solución muestra adicionada 2 debe proporcionar una señal o intensidad menor
que la de la Solución muestra adicionada 7. [NOTA-La señal de cada Solución muestra adicionada no es menor que la
determinación de la Solución muestra no adicionada.]
Procedimientos instrumentales: El valor promedio de las tres mediciones repetidas de la Solución muestra adicionada 7
está dentro de(± 15%) del valor promedio obtenido para las mediciones repetidas de la Solución estándar. El valor pro-
medio de las mediciones repetidas de la Solución muestra adicionada 2 debe proveer una intensidad o valor de señal me-
nor que los de la Solución estándar. [NOTA-Corregir los valores obtenidos para cada una de las soluciones adicionadas
usando la Solución muestra no adicionada.]
• PRECISIÓN PARA MÉTODOS INSTRUMENTALES (REPETIBILIDAD)
[NOTA-La precisión no instrumental se demuestra cumpliendo con el requisito de Capacidad de Detección anterior.]
326 (233) Impurezas Elementales-Procedimientos/ Pruebas Químicas USP 40

Soluciones muestra: Seis muestras independientes del material en análisis, a las que se les agregan cantidades conocidas
de materiales de referencia apropiados para los Elementos diana a la Concentración diana.
Criterios de aceptación
Desviación estándar relativa: No más de 20% para cada Elemento diana
• ESPECIFICIDAD
El procedimiento debe ser capaz de evaluar de manera inequívoca (ver Validación de Procedimientos Farmacopeicos (1225))
cada Elemento diana ante la presencia de los componentes esperados, incluyendo otros Elementos diana y componentes de
la matriz.
PROCEDIMIENTOS CUANTITATIVOS
La siguiente sección define los parámetros de validación que se deben cumplir para que los procedimientos cuantitativos alter-
nativos sean aceptables. El cumplimiento de estos requisitos se debe demostrar de manera experimental usando un procedi-
miento de aptitud del sistema y materiales de referencia adecuados. El cumplimiento con estos requisitos demuestra que el
procedimiento es equivalente al procedimiento farmacopeico con el propósito de cuantificar los Elementos diana.
•EXACTITUD
Soluciones estándar: Preparar soluciones que contengan los Elementos diana a concentraciones en el intervalo de 50% a
150% de/, usando materiales de referencia apropiados.
Muestras de prueba: Preparar muestras del material en análisis, a las que se les agregan cantidades conocidas de mate-
riales de referencia apropiados antes de cualquier etapa de preparación de la muestra (digestión o solubilización), a con-
centraciones que caigan dentro del intervalo de 50% a 150% de j para cada Elemento diana.
Criterios de aceptación
Recuperación de cantidades conocidas agregadas: 70%-150% para la media de tres preparaciones repetidas a cada
concentración
•PRECISIÓN
Repetibilidad
Muestras de prueba: Seis muestras independientes del material en análisis (tomadas del mismo lote) con materiales de
referencia apropiados para los Elementos diana al nivel indicado.
Criterios de aceptación
Desviación estándar relativa: No más de 20% (N = 6) para cada Elemento diana
Precisión intermedia (tolerancia)
Realizar el análisis de Repetibilidad nuevamente en un día diferente, usando un instrumento diferente, un analista distinto,
o una combinación de estos. Combinar los resultados de este análisis con el análisis de Repetibilidad de modo que el
número total de análisis sea 12.
Criterios de aceptación
Desviación estándar relativa: No más de 25% (N = 12) para cada Elemento diana
• ESPECIFICIDAD
El procedimiento debe ser capaz de evaluar de manera inequívoca (ver Validación de Procedimientos Farmacopeicos (1225))
cada Elemento diana en presencia de aquellos componentes que se espera estén presentes, incluyendo otros Elementos dia-
na y componentes de la matriz.
• LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN, INTERVALO Y LINEALIDAD
Se demuestra cumpliendo con el requisito de Exactitud.
GLOSARIO
Ácido concentrado: Los ácidos nítrico, sulfúrico, clorhídrico o fluorhídrico concentrados ultrapuros o el Agua Regia.
Agua regia: El Agua regia es una mezcla de ácidos clorhídrico y nítrico concentrados, por lo general en proporciones de 3:1
ó 4:1, respectivamente.
Matriz equiparada: Son soluciones que tienen la misma composición de disolvente que la Solución muestra. En el caso de
una solución acuosa, la Matriz Equiparada indicaría que se están usando los mismos ácidos, concentraciones ácidas y estabili-
zador de mercurio en ambas preparaciones.
Elementos diana: Elementos que potencialmente estarían presentes en el material en análisis. Cuando el análisis se lleva a
cabo para demostrar el cumplimiento, la evaluación de elementos diana incluye arsénico (As), cadmio (Cd), plomo (Pb) y
mercurio (Hg). Los Elementos diana también deben incluir cualquier elemento que pudiera agregarse a través del procesa-
miento o almacenamiento del material.
Límite diana o Concentración diana: Valor de aceptación para la impureza elemental que se está evaluando. Un exceso en
el límite diana indica que un material en análisis excede el valor aceptable. La determinación del cumplimiento se trata en
otros capítulos. [NOTA-Cuando este capítulo se aplica a los capítulos Impurezas Elementales-Límites (232) y Contaminantes
Elementales en Suplementos Dietéticos (2232), es posible obtener una aproximación de los Límites Diana dividiendo las Exposi-
ciones Diarias Permitidas (EOP) para Dosis Diaria por la dosis diaria máxima para la Opción de Análisis del Medicamento del
capítulo (232) o la EDP por Ración Diaria dividida por el tamaño de ración diaria máximo del capítulo (2232).]
J: La concentración (p/p) de los elementos de interés en el Límite Diana se diluye apropiadamente hasta el intervalo de traba-
jo del instrumento. Por ejemplo, si los elementos diana son Pb y As para un análisis de un medicamento sólido oral, con una
dosis diaria de 1O g/día, usando espectrometría de masas de plasma inductivamente acoplado (ICP-MS), el límite diana para
USP 40 Pruebas Químicas/ (241) Hierro 327

estos elementos sería 0,5µg/gy1,5 µg/g (ver la Tabla 2 del capítulo (232)). No obstante, en este caso, se sabe que el inter-
valo dinámico lineal de la ICP-MS se extiende desde 0,01 ng/ml hasta O, 1 µg/ml para estos elementos. Por consiguiente, se
requiere un factor de dilución de al menos 1:100 para asegurar que el análisis se realice en el intervalo dinámico lineal del
instrumento. j sería, en consecuencia, igual a 5 ng y 15 ng/ml para plomo y arsénico, respectivamente, cuando se suma el
factor de dilución.
Materiales de referencia apropiados: Cuando se especifiquen Materiales de Referencia Apropiados en el capítulo, se deben
usar materiales de referencia certificados (CRM) de un instituto nacional de metrología, o materiales de referencia que sean
rastreables al material de referencia certificado de un instituto nacional de metrología. Un ejemplo de un instituto nacional
de metrología en los Estados Unidos es el National lnstitute of Standards and Technology.

(241) HIERRO

Esta prueba de límite se suministra para demostrar que el contenido de hierro, en forma férrica o ferrosa, no excede el límite
de hierro especificado en la monografía individual. La determinación se realiza mediante la comparación visual concomitante
con un control preparado a partir de una solución estándar de hierro.

REACTIVOS ESPECIALES

Solución Estándar de Hierro

Disolver 863,4 mg de sulfato férrico amónico [FeNH 4 (S0 4 ) 2 • 12Hp] en agua, agregar 1O ml de ácido sulfúrico 2 N y diluir
con agua hasta 100,0 ml. Pipetear 1O ml de esta solución y transferirlos a un matraz volumétrico de 1000 ml, agregar 1O ml
de ácido sulfúrico 2 N, diluir con agua a volumen y mezclar. Esta solución contiene el equivalente a 0,01 mg (1 O µg) de hierro
por ml.

Solución de Tiocianato de Amonio

Disolver 30 g de tiocianato de amonio en agua para obtener 100 ml.

PREPARACIÓN ESTÁNDAR

Pipetear 1 ml de Solución Estándar de Hierro (1 O µg de Fe) y transferirlos a un tubo para comparación de color de 50 ml,
diluir con agua hasta 45 ml, agregar 2 ml de ácido clorhídrico y mezclar.

PREPARACIÓN DE PRUEBA

Colocar en un tubo para comparación de color de 50 ml la solución preparada para la prueba según se indica en la mono-
grafía individual y, si fuera necesario, diluir con agua hasta 45 ml; o disolver en agua y diluir con agua hasta 45 ml la canti-
dad, en g, de la sustancia a analizar, según se calcula por la fórmula:

1,0/(1 OOOL)
en donde Les el límite de Hierro expresado como porcentaje. Agregar 2 ml de ácido clorhídrico y mezclar.

PROCEDIMIENTO

A cada uno de los tubos que contienen la Preparación Estándar y la Preparación de Prueba agregar 50 mg de cristales de pe-
roxidisulfato de amonio y 3 ml de Solución de Tiocianato de Amonio y mezclar: el color de la solución obtenida con la Prepara-
ción de Prueba no es más oscuro que el de la solución de la Preparación Estándar.
328 (251) Plomo / Pruebas Químicas USP 40

(251) PLOMO

La imposición de límites estrictos para las cantidades de plomo que pueden estar presentes en los productos farmacéuticos
ha dado como resultado la utilización de dos métodos. El que se presenta en este capítulo se basa en la extracción de plomo
mediante soluciones de ditizona.
Seleccionar todos los reactivos para esta prueba de forma que tengan un contenido de plomo lo más bajo posible y almace-
nar todas las soluciones reactivo en recipientes de vidrio de borosilicato. Enjuagar minuciosamente todos los materiales de vi-
drio con ácido nítrico diluido (1 en 2) tibio y luego con agua.

REACTIVOS ESPECIALES

Solución de cianuro y amoníaco: Disolver 2 g de cianuro de potasio en 15 ml de hidróxido de amonio y diluir con agua
hasta 100 ml.
Solución de citrato de amonio: Disolver 40 g de ácido cítrico en 90 ml de agua. Agregar 2 ó 3 gotas de rojo fenol SR, luego
agregar cuidadosamente hidróxido de amonio hasta que la solución adquiera un color rojizo. Eliminar todo el plomo que pue-
da estar presente extrayendo la solución con porciones de 20 ml de Solución de extracción de ditizona (ver a continuación),
hasta que la solución de ditizona retenga su color verde anaranjado.
Solución de piorno estándar diluida: Diluir un volumen medido con exactitud de solución estándar de plomo SR (que con-
tenga 1O µg de plomo por ml) con 9 volúmenes de ácido nítrico diluido (1 en 100) para obtener una solución que contenga
1 µg de plomo por ml.
Solución de extracción de ditizona: Disolver 30 mg de ditizona en 1000 ml de cloroformo y agregar 5 ml de alcohol. Al-
macenar la solución en un refrigerador.
Antes de usar, agitar un volumen adecuado de la solución de extracción de ditizona con aproximadamente la mitad de su
volumen de ácido nítrico diluido (1 en 100), desechando el ácido nítrico.
Solución de clorhidrato de hidroxilarnina: Disolver 20 g de clorhidrato de hidroxilamina en suficiente agua para obtener
aproximadamente 65 ml. Transferir a un separador, agregar 5 gotas de azul de timol SR, luego agregar hidróxido de amonio
hasta que la solución adquiera un color amarillo. Agregar 1O ml de solución de dietilditiocarbamato de sodio (1 en 25), mez-
clar y dejar en reposo durante 5 minutos. Extraer esta solución con porciones sucesivas de 1O a 15 ml de cloroformo hasta que
una porción de 5 ml del extracto clorofórmico no presente color amarillo al agitarla con sulfato cúprico SR. Agregar ácido
clorhídrico 3 N hasta que la solución adquiera un color rosado (si fuera necesario, agregar 1 ó 2 gotas adicionales de azul de
timol SR), luego diluir con agua hasta 100 ml.
Solución de cianuro de potasio: Disolver 50 g de cianuro de potasio en suficiente agua para obtener 100 ml. Eliminar el
plomo de esta solución extrayendo con porciones sucesivas de Solución de extracción de ditizona, según se describe en Solución
de citrato de amonio, luego extraer cualquier ditizona remanente en la solución de cianuro agitando con cloroformo. Finalmen-
te diluir la solución de cianuro con suficiente agua para que cada porción de 100 ml contenga 1O g de cianuro de potasio.
Solución de ditizona estándar: Disolver 1O mg de ditizona en 1000 ml de cloroformo. Mantener la solución en un frasco
exento de plomo con tapón de vidrio, envuelto adecuadamente para protegerlo de la luz, y almacenar en un refrigerador.

PROCEDIMIENTO

Preparación de prueba o Solución muestra

[NOTA-Si en la siguiente preparación, la sustancia en análisis reacciona con demasiada rapidez y empieza a carbonizarse
con 5 ml de ácido sulfúrico antes del calentamiento, usar en su lugar 1O ml de ácido sulfúrico diluido (1 en 2) enfriado y
agregar unas pocas gotas de peróxido de hidrógeno antes del calentamiento.]
Cuando la monografía no especifique la preparación de una solución, preparar una Preparación de prueba o Solución muestra,
según se indica a continuación. [Precaución-Tomar precauciones de seguridad en este procedimiento, ya que algunas sustancias
pueden reaccionar con violencia explosiva al digerirlas con peróxido de hidrógeno.]
Transferir 1,0 g de la sustancia en análisis a un matraz adecuado, agregar 5 ml de ácido sulfúrico y algunas perlas de vidrio, y
digerir sobre una placa de calentamiento en una campana hasta que comience la carbonización. Se pueden usar otros medios
de calentamiento adecuados. (Agregar ácido sulfúrico adicional, si fuera necesario, para humedecer la sustancia completamen-
te, pero no agregar más de un total de 1O ml.) Agregar, gota a gota y con cuidado, peróxido de hidrógeno al 30%, permi-
tiendo que la reacción disminuya y calentar después de agregar cada gota. Agregar las primeras gotas muy lentamente, mez-
clar con cuidado para evitar una reacción rápida y suspender el calentamiento si se produce espuma en exceso. Agitar por
rotación suave la solución en el matraz para evitar que la sustancia sin reaccionar se aglutine a las paredes del matraz. [NOTA-
Agregar peróxido cuando la mezcla se torne de color marrón o se oscurezca.] Continuar la digestión hasta que la sustancia se
destruya por completo, se desprendan humos de trióxido de azufre abundantes y la solución se torne incolora. Enfriar y agre-
gar cuidadosamente 1O ml de agua. Evaporar hasta que se genere trióxido de azufre nuevamente y enfriar. Repetir este proce-
dimiento con otros 1O ml de agua para eliminar cualquier traza de peróxido de hidrógeno. Diluir cuidadosamente con 1O ml
de agua y enfriar.
USP 40 Pruebas Químicas/ (261) Mercurio 329

Análisis: Transferir a un separador la Preparación de prueba o la Solución muestra, enjuagando con 1O mL de agua o con el
volumen de la muestra preparada especificado en la monografía y, a menos que se indique algo diferente en la monografía,
agregar 6 mL de Solución de citrato de amonio y 2 mL de Solución de clorhidrato de hidroxilamina. (Para la determinación de
plomo en sales de hierro, usar 1O mL de Solución de citrato de amonio.) Agregar 2 gotas de rojo fenol SR y alcalinizar la solución
(sólo hasta color rojo) agregando hidróxido de amonio. Enfriar la solución, si fuera necesario, y agregar 2 mL de Solución de
cianuro de potasio. Extraer de inmediato la solución con porciones de 5 mL de Solución de extracción de ditizona, vaciando cada
extracto en otro separador, hasta que la solución de ditizona retenga su color verde. Agitar las soluciones de ditizona combina-
das durante 30 segundos con 20 mL de ácido nítrico diluido (1 en 100) y desechar la capa clorofórmica. Agregar 5,0 mL de
Solución de ditizona estándar y 4 mL de Solución de cianuro y amoníaco a la solución ácida y agitar durante 30 segundos.
Criterios de aceptación: El color de la capa clorofórmica no tiene un tono violeta más intenso que el de un control prepara-
do con un volumen de Solución de plomo estándar diluida, equivalente a la cantidad de plomo permitida en la muestra en análi-
sis, y usando las mismas cantidades de los mismos reactivos y de la misma manera que en la prueba con la muestra.

(261) MERCURIO

MÉTODO 1
[NOTA-El ditizonato mercúrico es fotosensible. Realizar esta prueba en un lugar con luz tenue.]

Reactivos

SOLUCIÓN MADRE DE DITIZONA

Disolver 40 mg de ditizona en 1000 mL de cloroformo.

SOLUCIÓN VOLUMÉTRICA DE DITIZONA

Diluir 30,0 mL de Solución Madre de Ditizona con cloroformo hasta 100,0 ml. Esta solución contiene aproximadamente 12
mg de ditizona por litro.

SOLUCIÓN MADRE DE MERCURIO

Transferir 135,4 mg de cloruro mercúrico a un matraz volumétrico de 100 mL y diluir a volumen con ácido sulfúrico 1 N.
Esta solución contiene la cantidad equivalente a 100 mg de Hg en 100 mL.

SOLUCIÓN DE MERCURIO PARA ESTANDARIZAR LA SOLUCIÓN VOLUMÉTRICA DE DITIZONA

Transferir 2,0 mL de Solución Madre de Mercurio a un matraz volumétrico de 100 mL y diluir a volumen con ácido sulfúrico
1 N. Cada mL de esta solución contiene el equivalente a 20 µg de Hg.
Las siguientes soluciones son necesarias en la prueba de límite para mercurio que se especifica en las monografías de Fuma-
rato Ferroso, Sulfato Ferroso y Sulfato Ferroso Seco.

SOLUCIÓN DE CLORHIDRATO DE HIDROXILAMINA

Preparar según se indica en la prueba para Plomo (251 ).

SOLUCIÓN ESTÁNDAR DE MERCURIO

En el día de uso, diluir cuantitativamente 1,0 mL de la Solución Madre de Mercurio con ácido sulfúrico 1 N hasta 1000 ml.
Cada mL de la solución resultante contiene el equivalente a 1 µg de mercurio.

SOLUCIÓN DE EXTRACCIÓN CON DITIZONA

Preparar según se indica en la prueba para Plomo (251 ).

330 (261) Mercurio/ Pruebas Químicas USP 40

SOLUCIÓN DE EXTRACCIÓN CON DITIZONA DILUIDA

Inmediatamente antes de usar, diluir 5 mL de la Solución de Extracción con Ditizona con 25 mL de cloroformo.

Estandarización de la Solución Volumétrica de Ditizona

Transferir 1,0 mL de la Solución de Mercurio para Estandarizar la Solución Volumétrica de Ditizona a un separador de 250 mL y
agregar 100 mL de ácido sulfúrico 1 N, 90 mL de agua, 1 mL de ácido acético glacial y 1O mL de solución de clorhidrato de
hidroxilamina (1 en 5). Valorar la solución con la Solución Volumétrica de Ditizona transferida desde una microbureta de 1O mL,
agitando la mezcla 20 veces después de cada adición y dejando que la capa clorofórmica se separe, y luego desechar la capa
clorofórmica. Continuar hasta que una última adición de la Solución Volumétrica de Ditizona haga que la solución tome una
coloración verde después de agitarla. Calcular la cantidad, en µg, de Hg equivalente a cada ml de la Solución Volumétrica de
Ditizona, por la fórmula:

20/V
en donde V es el volumen, en mL, de la Solución Volumétrica de Ditizona agregada.

Preparación de Prueba

Transferir aproximadamente 2 g de la sustancia en análisis, pesados con exactitud, a un matraz Erlenmeyer de 250 mL con
tapón de vidrio, agregar 20 mL de una mezcla de volúmenes iguales de ácido nítrico y ácido sulfúrico, acoplar un condensador
adecuado, someter la mezcla a reflujo durante 1 hora, enfriar, diluir cuidadosamente con agua y calentar a ebullición hasta
que no se perciban vapores de ácido nitroso. Enfriar la solución, diluir cuidadosamente con agua, transferir a un matraz volu-
métrico de 200 mL, diluir a volumen con agua, mezclar y filtrar.

Procedimiento

Transferir 50,0 mL de la Preparación de Prueba a un separador de 250 mL y extraer con pequeñas porciones sucesivas de
cloroformo hasta que el último extracto clorofórmico permanezca incoloro. Desechar el extracto clorofórmico y agregar 50 mL
de ácido sulfúrico 1 N, 90 mL de agua, 1 mL de ácido acético glacial y 1O mL de solución de clorhidrato de hidroxilamina (1
en 5) a la Preparación de Prueba extraída. Proceder según se indica en Estandarización de la Solución Volumétrica de Ditizona,
comenzando donde dice "Valorar la solución". Calcular la cantidad de mercurio.

MÉTODO HA V MÉTODO 118

Instrumento de Detección de Mercurio

Usar cualquier espectrofotómetro de absorción atómica adecuado equipado con un registrador de respuesta rápida y capaz
de medir la radiación absorbida por los vapores de mercurio en la línea de resonancia del mercurio a 253,6 nm. [NOTA-Lavar
todo el material de vidrio asociado a la prueba con ácido nítrico y enjuagar bien con agua antes de usar.]

Aparato de Aireación

El aparato (ver el diagrama adjunto) consiste en un caudalímetro capaz de medir velocidades de flujo entre 500 y 1000 mL
por minuto, conectado a través de una llave de paso de tres vías equipada con un tapón de teflón a un vaso de aireación
(frasco de lavado de gases de 250 mL), seguido de una trampa, un tubo de secado relleno con perclorato de magnesio, una
celda de flujo de 1O cm x 25 mm con ventanas de cuarzo y, por último, un orificio de ventilación a una campana de extrac-
ción.
USP 40 Pruebas Químicas/ (261) Mercurio 331

Llave de paso de tres vías

con tapón de teflón
Desvío

Aireo
nitrógeno
Tubo de secado
relleno con
Caudalímetro Mg(CI04)2
flujo 5oo a 1000 Trampa
ml por minuto 100mL Orificio de

Vaso de Aireación
(Frasco lavadora de gases) Celda de 1O cm,
con ventanas de cuarzo

Las conexiones son de vidrio o de PVC

Aparato de Aireación de Mercurio

Reactivos

SOLUCIÓN DE PERMANGANATO DE POTASIO

Disolver 5 g de permanganato de potasio en 100 mL de agua.

SOLUCIÓN DE CLORHIDRATO DE HIDROXILAMINA

Disolver 1Og de clorhidrato de hidroxilamina en 100 mL de agua.

SOLUCIÓN DE CLORURO ESTANNOSO

Disolver 1Og de SnCl 2 • 2H 2 0 en 20 mL de ácido clorhídrico tibio y agregar 80 mL de agua. Preparar soluciones nuevas cada
semana.

SOLUCIÓN ESTÁNDAR DE MERCURIO

Preparar a partir de la Solución Madre de Mercurio según se indica en Método l. Cada mL de la Solución Estándar de Mercurio
contiene el equivalente a 1 µg de mercurio.

Preparación de Prueba

A menos que se indique algo diferente en la monografía individual, usar la cantidad, en g, de la sustancia de prueba calcula-
da por la fórmula:

2,0/L
en donde L es el límite de mercurio, en ppm.

MÉTODO HA

Preparación Estándar

Pipetear 2,0 mL de la Solución Estándar de Mercurio, transferir a un vaso de precipitados de 100 mL y agregar 35 mL de
agua, 3 mL de ácido sulfúrico y 1 mL de solución de permanganato de potasio. Cubrir el vaso de precipitados con un vidrio de
reloj, calentar a ebullición durante unos segundos y enfriar.

Preparación de Prueba

Transferir la cantidad calculada de la sustancia de prueba a un vaso de precipitados de 100 mL y agregar 35 mL de agua.
Mezclar y entibiar para disolver, si fuera necesario. Agregar 2 gotas de fenolftaleína SR y, según sea necesario, neutralizar lenta-
mente revolviendo constantemente, usando hidróxido de sodio 1 N o ácido sulfúrico 1 N. Agregar 3 mL de ácido sulfúrico y 1
332 (261) Mercurio/ Pruebas Químicas USP 40

ml de la Solución de Permanganato de Potasio. Cubrir el vaso de precipitados con un vidrio de reloj, calentar a ebullición duran-
te unos segundos y enfriar.

Procedimiento

Ensamblar el Aparato de Aireación según se muestra en el diagrama adjunto, con el vaso de aireación y la trampa vacíos y la
llave de paso en la posición de desvío. Conectar el aparato a una celda de absorción y ajustar la velocidad de flujo del aire o
del nitrógeno de modo que, en el procedimiento siguiente, se obtengan una absorción y una reproducibilidad máximas sin la
formación excesiva de espuma en la solución de prueba. Obtener una lectura inicial estable a 253,6 nm según las instrucciones
de funcionamiento del fabricante del instrumento.
Tratar la Preparación Estándar y la Preparación de Prueba de modo similar, de la siguiente manera. Eliminar el exceso de per-
manganato agregando Solución de Clorhidrato de Hidroxilamina, gota a gota, hasta que la solución quede incolora. Lavar inme-
diatamente con agua la solución en el vaso de aireación y diluir con agua hasta 100 ml. Agregar 2 ml de la Solución de Cloruro
Estannoso y reconectar inmediatamente el vaso de aireación al aparato de aireación. Girar la llave de paso de la posición de
desvío a la posición de aireación y continuar la aireación hasta que se haya pasado el pico de absorción y la pluma registradora
vuelva al valor inicial. Desconectar el vaso de aireación del aparato y lavar con agua después de cada uso. Después de hacer
correcciones por cualquier blanco de reactivo, toda absorbancia producida por la Preparación de Prueba no excede la produci-
da por la Preparación Estándar.

MÉTODO llB
[Precaución-Algunas sustancias pueden reaccionar con violencia explosiva cuando se digieren con peróxido de hidrógeno. Tomar
precauciones de seguridad en todo momento.]

Preparación Estándar

Pipetear 2,0 ml de la Solución Estándar de Mercurio y transferir a un matraz Erlenmeyer de 125 ml, agregar 3 ml de ácido
nítrico y 3 ml de ácido sulfúrico, mezclar y agregar una cantidad de peróxido de hidrógeno al 30 por ciento igual a la canti-
dad total usada para preparar la Preparación de Prueba. Acoplar un condensador enfriado por agua adecuado con una junta
ahusada estándar que se ajuste al matraz y someter a reflujo la mezcla en una campana de extracción durante 1 hora. Cortar el
agua que circula a través del condensador y calentar hasta que aparezcan humos blancos en el matraz. Enfriar y agregar cuida-
dosamente 1O ml de agua a través del condensador mezclando, por rotación suave. Volver a calentar hasta que aparezcan
humos blancos, enfriar y agregar otros 15 ml de agua. Retirar el condensador y enjuagar las paredes del matraz para obtener
un volumen de 35 ml. Agregar 1 ml de la Solución de Permanganato de Potasio, calentar a ebullición durante unos segundos y
enfriar.

Preparación de Prueba

Transferir la cantidad calculada de la sustancia de prueba a un matraz Erlenmeyer de 125 ml. Agregar 5 ml de ácido nítrico,
5 ml de ácido sulfúrico y algunas perlas de vidrio. Acoplar un condensador refrigerado por agua adecuado con una junta ahu-
sada estándar que se ajuste al matraz y digerir en una campana de extracción, preferentemente sobre una placa de calenta-
miento, y a una temperatura que no exceda los 120º hasta que comience la carbonización. (Si se necesita ácido sulfúrico adi-
cional para humedecer la muestra por completo, agregarlo cuidadosamente a través del condensador, pero sin permitir que el
volumen total agregado exceda de 1O ml.) Después de que el ácido haya descompuesto la sustancia de prueba, agregar cui-
dadosamente, gota a gota a través del condensador, peróxido de hidrógeno al 30 por ciento, permitir que la reacción dismi-
nuya su intensidad, calentar nuevamente entre las gotas (agregar las primeras gotas muy lentamente y mezclando bien para
evitar una reacción rápida; detener el calentamiento si la espuma se torna excesiva). Cuando la reacción haya disminuido, ca-
lentar cuidadosamente y girar el matraz ocasionalmente para evitar que la muestra se aglutine sobre el vidrio expuesto a la
unidad de calentamiento. Mantener las condiciones de oxidación en todo momento durante la digestión agregando pequeñas
cantidades de solución de peróxido de hidrógeno cuando la mezcla se vuelva de color marrón o se oscurezca. Continuar la
digestión hasta que la materia orgánica se destruya y luego calentar a reflujo la mezcla durante 1 hora. Cortar el agua que
circula a través del condensador y calentar hasta que se desprendan abundantes humos de trióxido de azufre y la solución se
vuelva incolora o presente solamente un color pajizo claro. Enfriar y agregar cuidadosamente 1O ml de agua a través del con-
densador, mezclando por rotación suave. Calentar nuevamente hasta que aparezcan humos blancos. Enfriar y agregar cuida-
dosamente 15 ml de agua. Retirar el condensador y enjuagar las paredes del matraz con algunos ml de agua para obtener un
volumen de 35 ml. Agregar 1 ml de la Solución de Permanganato de Potasio, calentar a ebullición durante unos segundos y
enfriar.
USP 40 Pruebas Químicas/ (267) Porosimetría por Intrusión de Mercurio 333

Procedimiento

Proceder según se indica en el Procedimiento en Método Jla.

(267) POROSIMETRÍA POR INTRUSIÓN DE MERCURIO

En general, los diversos tipos de poros se pueden representar como aberturas, canales o cavidades dentro de un cuerpo sóli-
do o como espacios (es decir, intersticios o espacios vacíos) entre partículas sólidas en un lecho, compacto o agregado. Porosi-
dad es un término comúnmente usado para indicar la naturaleza porosa de un material sólido y se define con mayor precisión
como la relación entre el volumen de poros y espacios vacíos accesibles y el volumen total ocupado por una cantidad dada del
sólido. Además de los poros accesibles, un sólido puede comprender poros cerrados, que están aislados de la superficie exter-
na y a los cuales no son capaces de penetrar los fluidos. Este capítulo general no abarca la caracterización de poros cerrados, es
decir, cavidades sin acceso a una superficie externa.
Los materiales porosos pueden presentarse en forma de polvos finos o gruesos, compactos, extrudidos, láminas o monolitos,
y su caracterización a menudo implica la determinación del volumen total de los poros o porosidad, así como la distribución
del tamaño de los poros.
Se ha establecido debidamente que el desempeño de un sólido poroso (p.ej., su resistencia, reactividad, permeabilidad o
poder adsorbente) depende de la estructura de sus poros. Se ha desarrollado un gran número de métodos distintos para carac-
terizar la estructura de los poros. En vista de la complejidad de la mayoría de los sólidos porosos, no resulta extraño obtener
resultados que no siempre concuerdan y que no exista una técnica definitiva que pueda garantizar una imagen completa de la
estructura de los poros. La selección del método más adecuado depende de la aplicación del sólido poroso, de su naturaleza
física y química, y del rango de tamaños de poro.
Este capítulo ofrece pautas para medir la porosidad y la distribución del tamaño de los poros mediante porosimetría de mer-
curio, la cual es una prueba comparativa, generalmente destructiva, en la que el volumen de mercurio que penetra en un poro
o espacio vacío se determina como una función de la presión hidrostática aplicada, que se puede relacionar con el diámetro
del poro. Asimismo, se puede inferir otra información a partir de las curvas de volumen-presión, por ejemplo, la forma de los
poros y sus interconexiones, el área de las superficies interna y externa, la granulometría del polvo y la densidad aparente y
después del asentamiento; sin embargo, el alcance del presente capítulo no abarca dichos aspectos de la técnica.
Las consideraciones prácticas actualmente limitan la presión absoluta máxima aplicada que pueden alcanzar algunos equi-
pos de aproximadamente 400 MPa, que corresponde a un diámetro mínimo de poro equivalente a aproximadamente 0,003
µm. El diámetro máximo estará limitado por el tamaño de la muestra debido a la diferencia del frente hidrostático del mercu-
rio entre los extremos superior e inferior de la muestra. Para la mayoría de los propósitos, se puede considerar que este límite
es de aproximadamente 400 µm.
Resulta posible determinar la porosidad interparticular e intraparticular, pero el método no distingue entre estas porosidades
cuando coexisten.
El método es apropiado para el estudio de la mayoría de los materiales porosos. Sin embargo, puede no ser apropiado para
materiales que se amalgaman con mercurio, como ciertos metales, o puede ser necesaria una pasivación preliminar. Asimismo,
la presión puede deformar o compactar otros materiales. En algunos casos, se pueden aplicar correcciones a la compresibilidad
de la muestra y aún así obtener datos comparativos útiles.
La porosimetría de mercurio debe considerarse una técnica comparativa, debido a que, para la mayoría de los medios poro-
sos, no se encuentra disponible una teoría que permita un cálculo absoluto de resultados de la distribución del tamaño de los
poros. Por lo tanto, esta técnica se recomienda principalmente para estudios de desarrollo.
El mercurio es tóxico. Se deben tomar precauciones adecuadas para salvaguardar la salud del operador y de aquéllos que
operen en el área. El material de desecho se debe eliminar de una manera adecuada, de conformidad con los reglamentos
locales.

PRINCIPIO

La técnica se basa en la medición del volumen de mercurio resultante de la intrusión en un sólido poroso como una función
de la presión aplicada. La medición incluye únicamente aquellos poros en los que el mercurio puede penetrar a la presión apli-
cada.
Un líquido no humectante penetra en un sistema poroso sólo a presión. La presión aplicada es inversamente proporcional al
ancho interno del poro. En poros cilíndricos, la correlación entre el diámetro del poro y la presión se obtiene mediante la ecua-
ción de Washburn:

4·o-
dp =---cose (1)
p
334 (267) Porosimetría por Intrusión de Mercurio/ Pruebas Químicas USP 40

p presión aplicada, en pascales

dP diámetro del poro, en metros
cr tensión superficial del mercurio, en newtons por metro
8 ángulo de contacto entre el mercurio y la muestra, en grados

APARATO
El portamuestras, conocido como penetrómetro o dilatómetro, tiene un tubo capilar calibrado a través del cual se puede
evacuar la muestra y por el que puede entrar el mercurio. El tubo capilar está unido a un tubo más ancho en el que se coloca
la muestra. El cambio en el volumen de mercurio resultante de la intrusión por lo general se mide por el cambio de la capaci-
tancia entre la columna de mercurio en el tubo capilar y una funda metálica que rodea la parte externa del tubo capilar. Cuan-
do se requieren mediciones precisas, el volumen interno del tubo capilar debe ser entre 20% y 90% del volumen previsto del
poro y de los espacios vacíos de la muestra. Debido a que los distintos materiales presentan un amplio rango de porosidad,
pueden ser necesarios varios penetrómetros equipados con tubos capilares con diferentes diámetros y volúmenes de muestra.
La Figura 1 presenta una configuración típica para un instrumento de porosimetría de mercurio. El porosímetro puede tener
diferentes puertos para la operación a alta y baja presión; también es posible llevar a cabo la medición a baja presión en una
unidad distinta.
El intervalo de presión es, por lo general, de 4 kPa a 300 kPa para la operación a baja presión, y superior a 300 kPa para la
operación a alta presión, lo cual depende particularmente del diseño del aparato y del uso previsto.

Aceite
6
c+J 1
1
Indicador de 1
volumen de 1
penetración 1
Cámara de 1
alta presión 1
1
Mercurio 1
1
Muestra 1

1. Reservorio para fluido hidráulico

de baja presión
2. Bomba hidráulica
3. Multiplicador de presión
4. Transductor de presión
3
-8
5. Reservorio para fluido hidré.ulico
de alta presión
6. Bomba de vacío con manómetro
7. Reservorio para mercurio

Figura 1. Ejemplo de la configuración de un instrumento para porosimetría de mercurio.

MÉTODO

Preparación de la Muestra

Tratar la muestra previamente mediante calentamiento y/o evacuación o con un flujo de gas inerte para eliminar el material
adsorbido que pudiera ocultar su porosidad accesible. La pasivación de la superficie de sólidos humectables o amalgamables se
puede lograr produciendo una capa fina de óxido o recubriendo con estearato. Pesar la muestra del sólido previamente trata-
do y transferir al penetrómetro. Luego, desgasificar el sistema de poros de la muestra al vacío hasta una presión residual máxi-
ma de 7 Pa.

Llenado del Penetrómetro con Mercurio

Usar mercurio de calidad analítica. Cubrir la muestra con mercurio al vacío. El vacío es necesario para asegurar la transferen-
cia del mercurio desde el reservorio al penetrómetro. En un penetrómetro lleno, la presión de llenado comprende la presión
aplicada más la contribución de presión generada por el frente de mercurio que entra en contacto con la muestra. La presión
de llenado típica es aproximadamente 4 kPa. Se puede minimizar la presión hidrostática del mercurio sobre la muestra llenan-
do el penetrómetro en las posiciones horizontales.
USP 40 Pruebas Químicas/ (267) Porosimetría por Intrusión de Mercurio 335

Medición a Baja Presión

Aplicar aire o nitrógeno de manera controlada para incrementar la presión en las etapas correspondientes a los tamaños de
los poros de interés o de manera continua a una velocidad baja. Registrar el cambio concomitante en la longitud de la colum-
na de mercurio en el tubo capilar. Una vez alcanzada la presión máxima requerida, reducirla hasta presión ambiental.

Medición a Alta Presión

Después de medir en condiciones de baja presión, transferir el penetrómetro cargado con mercurio al puerto o unidad de
alta presión del instrumento y cubrir con fluido hidráulico. El mercurio penetra en el sistema de poros por medio del fluido
hidráulico. Incrementar la presión en el sistema hasta la presión máxima alcanzada en la medición a baja presión y registrar el
volumen de intrusión a esta presión, debido a que los volúmenes de intrusión subsiguientes se calculan a partir de este volu-
men inicial. Incrementar la presión en las etapas correspondientes a los tamaños de poro de interés o de manera continua a
una velocidad baja. La caída en la columna de mercurio se mide hasta la presión máxima requerida. En caso necesario, se pue-
de reducir la presión por etapas o de manera continua a una velocidad baja para determinar la curva de extrusión del mercu-
rio. Corregir para considerar los cambios en el volumen del mercurio, el penetrómetro y demás componentes del sistema de-
tector de volumen a presión elevada. El grado de las correcciones requeridas se puede determinar a través de mediciones blan-
co aplicando las mismas condiciones. La Figura 2 presenta una curva de volumen-presión determinada experimentalmente.

'ff!E 240
5
~ 180
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e
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0 11..0'!"., 1_0'_ _ _ _1_1rt

Presión (MPa)

Figura 2. Curva de volumen-presión como gráfica semilogarítmica.

INFORME DE LOS RESULTADOS

Convertir las lecturas de la presión a diámetro de los poros usando la ecuación de Washburn u otro modelo.
La tensión superficial de mercurio, cr, no sólo depende de la temperatura y del material, sino también-en el caso de las
áreas superficiales con curvas marcadas-del radio de la curvatura. En general, los valores entre 0,41 N · m- 1 y 0,52 N · m-1 se
miden a temperatura ambiente. Si no se conoce el valor, se puede usar cr = 0,48 N · m-1 .
El ángulo de contacto del mercurio, e, es más de 90º en la mayoría de los casos y se puede determinar con un instrumento
para medir el ángulo de contacto. Si no se conoce el valor e, se puede usar 130º. Informar los valores de ángulo de contacto,
tensión superficial, así como el modelo usado para el cálculo. La visualización de los datos se puede realizar mediante varios
tipos de gráficas. Frecuentemente, se visualiza la distribución del tamaño de poros representando el diámetro de poro en las
abscisas y el volumen específico dependiente de la intrusión en las ordenadas. En este caso, resulta apropiado representar las
abscisas en escala logarítmica (ver la Figura 3). Los espacios entre las partículas de la muestra sólida se incluyen como poros en
el cálculo. Si los poros difieren en tamaño de los espacios vacíos, éstos últimos se pueden separar seleccionando el intervalo de
tamaño de poro pertinente.
No se pueden usar las curvas de extrusión para calcular la distribución del tamaño de los poros (para histéresis, ver la Figura
2), debido a que una parte del mercurio resultante de la intrusión siempre permanece en el sistema de poros. La relación de
retención puede ser de utilidad para la caracterización cualitativa de los poros a los que únicamente se puede acceder a través
de aberturas estrechas ("poros en forma de tintero").
Los valores característicos más comunes, como el volumen específico total resultante de la intrusión, la media y la mediana
del diámetro de poro se calculan a partir de la distribución del tamaño de los poros. Asimismo, la documentación del procedi-
miento debe comprender la muestra, su preparación, las condiciones de evacuación y el instrumento utilizado.
336 (267) Porosimetría por Intrusión de Mercurio / Pruebas Químicas USP 40

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Diámetro de poro (nm)

Figura 3. Distribución del volumen de los poros como gráfica semilogarítmica.

CONTROL DEL DESEMPEÑO DEL INSTRUMENTO

Puesto que la técnica de porosimetría de mercurio es considerada una prueba comparativa, este capítulo no proporciona
detalles sobre la misma. Sin embargo, se recomienda analizar un material de comparación estable de manera rutinaria para
monitorear la calibración y el desempeño del instrumento.

(268) POROSIDAD MEDIANTE ADSORCIÓN-DESORCIÓN DE

NITRÓGENO

INTRODUCCIÓN

La porosidad es un término comúnmente usado para indicar la naturaleza porosa de un material sólido y se define, con ma-
yor precisión, como la relación entre el volumen de poros y espacios vacíos accesibles y el volumen total ocupado por una
cantidad dada del sólido. Los poros cerrados o inaccesibles que están aislados de la superficie externa se excluyen de esta defi-
nición de volumen de poro. Los poros (o espacios vacíos) pueden incluir aberturas, canales o cavidades dentro de un cuerpo
sólido o espacios entre partículas sólidas en un compacto o agregado. Los poros se presentan en una variedad de materiales
sólidos más allá de los compactos y los agregados, tales como polvos y tabletas, y su caracterización a menudo implica la de-
terminación del volumen de poro total o porosidad, así como la distribución del tamaño de poro. Por lo general, la clasifica-
ción de los poros se hace por tamaño en los siguientes grupos:
• Microporos-menores de 2 nm
• Mesoporos-2 a 50 nm
• Macroporos-mayores de 50 nm
El método del presente capítulo, Porosidad Mediante Adsorción-Desorción de Nitrógeno (268), es complementario al del capí-
tulo general Porosimetría por Intrusión de Mercurio (267). La porosimetría por mercurio puede, en principio (teóricamente),
usarse con diámetros de poro de 3 nm a 400 µm, aunque se aplica mayormente para el intervalo de 100 nm a 200 µm. La
adsorción-desorción de nitrógeno se puede usar para caracterizar poros con tamaños menores de aproximadamente 300 nm,
pero es más apropiado para el análisis de mesoporos y en el intervalo inferior de macroporos de 2 a 100 nm.

APARATO

Las mediciones generalmente se llevan a cabo usando el procedimiento volumétrico estático, aunque también se pueden
emplear métodos de flujo dinámico. Los usuarios de equipos comercialmente disponibles deben referirse a los documentos y
manuales del fabricante para obtener una descripción de su aparato en particular. Por ejemplo, un aparato volumétrico estáti-
co debe proveer lo siguiente: sistema de vacío para una presión de menos de 1O Pa, suministro de volúmenes conocidos de
nitrógeno y helio de alta pureza, medición exacta de presión y temperatura, y un medio para enfriar la muestra a la tempera-
tura del nitrógeno líquido.

PRINCIPIO DE MEDICIÓN

La adsorción de un gas inerte sobre las superficies sólidas a bajas temperaturas es un fenómeno bien conocido y es el funda-
mento para la medición del área superficial de los sólidos (ver el capítulo general Área Superficial Específica (846)). A medida
que el gas se adsorbe sobre una superficie, se puede condensar en el interior de los poros accesibles. El volumen total de poro
y la distribución de tamaño de poro se pueden derivar de la isoterma de adsorción de gas, la cual es una medición de la canti-
dad adsorbida como una función de la presión parcial del adsorbato. Las isotermas de adsorción se dividen en seis categorías
USP 40 Pruebas Químicas/ (268) Porosidad Mediante Adsorción-Desorción de Nitrógeno 337

generales, dependiendo de la energética relativa de la adsorción y la presencia de poros. La Figura 7 representa las seis catego-
rías generales de isotermas de adsorción.

rcu
"'O
111

..e
.....
o(/)
"'O
cu
"'O
cu
"'O
;,¡::¡
V
e
cu
ü

Presión relativa---~

Figura 1. Tipos de Isotermas. [Reproducido con autorización y modificado de: Sing KSW, Everett DH, Haul RAW, et al. Repor-
ting physisorption for gas/solid systems with special reference to the determination of surface area and porosity (recommenda-
tions 1984)(1nforme de fisisorción para sistemas de gas/sólido con referencia especial a la determinación del área superficial y
la porosidad. (Recomendaciones 1984) Pure Appl Chem. 1985;57(4):603-619, Figura 2.]

Los microporos (poros con tamaños menores de 2 nm) con frecuencia generan isotermas tipo l. Los mesoporos y macropo-
ros normalmente producen isotermas tipo IV, pero la histéresis puede ser difícil de observar en poros con tamaños mayores a
aproximadamente 100 nm, lo que produce una isoterma tipo 11. Aunque es posible derivar cierta información, tal como la po-
rosidad total, para materiales microporosos, la determinación de las distribuciones del tamaño de poro en dicho intervalo de
tamaño está fuera del alcance de este capítulo.
El adsorbato preferido es nitrógeno, mientras que la isoterma se determina a la temperatura del nitrógeno líquido (77,4 K).
Se pueden usar otros adsorbatos para propósitos especiales, aunque no se tratan en este capítulo.

PROCEDIMIENTO

Preparación de la Muestra

Antes del análisis, los analistas deben desgasificar la muestra para eliminar gases y vapores que se hayan adsorbido física-
mente sobre la superficie. Resulta necesario demostrar las condiciones de desgasificación para obtener una adsorción-desor-
ción reproducible, un peso constante de la muestra y que no se produzcan cambios físicos o químicos detectables en la mues-
tra. La desgasificación de un gran número de sustancias a menudo se consigue mediante vacío, purgando la muestra en una
corriente fluida de gas seco no reactivo o aplicando un procedimiento de adsorción-desorción cíclica. Si resultara apropiado,
los analistas pueden aplicar temperaturas elevadas para aumentar la velocidad a la que los contaminantes abandonan la super-
ficie. Los analistas deben ser precavidos para evitar que se afecte la naturaleza de la superficie y la integridad de la muestra
cuando se desgasifica a temperaturas elevadas. Si se emplea calentamiento, la temperatura y el tiempo de desgasificación re-
comendados deben ser los mínimos requeridos para lograr una medición reproducible de la isoterma de adsorción-desorción.
Los analistas deben determinar la masa de la muestra después de desgasificar o como alternativa, deben determinar la masa
después de la medición de adsorción-desorción. El área superficial total de la muestra debe ser mayor que 1 m 2 y de preferen-
cia mayor que 5 m 2 •
338 (268) Porosidad Mediante Adsorción-Desorción de Nitrógeno/ Pruebas Químicas USP 40

Medición de las Isotermas

Los detalles específicos del proceso de medición dependen del procedimiento usado. Los analistas deben seguir las instruc-
ciones del fabricante para el instrumento usado en particular. La siguiente descripción puede aplicarse de manera general:
- Los analistas deben determinar la presión de vapor saturado del adsorbato, p0 • Es preferible determinar p0 de manera ex-
perimental al momento de la medición, aunque los analistas pueden usar un valor calculado.
- Los analistas deben determinar la isoterma de sorción de nitrógeno y deben medir el volumen adsorbido, Vª' a la presión
relativa más baja deseada (p/p 0, el cociente entre la presión de adsorbato medida y la presión de su vapor saturado).
- Los analistas repiten la medición de Vª a valores de presión relativa sucesivamente mayores hasta la máxima presión relati-
va deseada (por lo general, 0,99). Posteriormente, los analistas reducen la presión relativa de manera sucesiva para deter-
minar las cantidades sorbidas en la porción de desorción de la isoterma. Los analistas deben medir al menos 20 puntos en
los segmentos de adsorción y desorción, abarcando un intervalo de presión relativa (p/p 0) de aproximadamente 0,05-
0,99. Los valores p/p 0 se pueden distribuir para lograr la mejor resolución de la distribución del tamaño de poro. Cuando
se esté usando únicamente el segmento de desorción para calcular la distribución del tamaño de poro, se pueden usar
menos puntos en el segmento de adsorción.

ANÁLISIS DE DATOS

Análisis de la Isoterma

La isoterma se presenta como una gráfica de la cantidad de nitrógeno adsorbido (en volumen, Vª, o moles, nª) en función de
p/p 0 • Los datos de la isoterma también pueden presentarse en formato de tabla. Los tipos de isoterma e histéresis se determi-
nan a partir de la gráfica, comparándola con los ejemplos de las Figuras 1 y 2. Una isoterma tipo 1es común para materiales
microporosos. Una isoterma tipo IV por lo general se presenta en materiales que contienen mesoporos o macroporos peque-
ños.

H1 H2

ro
"O
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o
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"O
ro
"O
ro
"O
:;:;
e:
ro
ü

Presión relativa----
Figura 2. Tipos de Ciclos de Histéresis. [Reproducido con autorización y modificado de: Sing KSW, Everett DH, Haul RAW, et
al. Reporting physisorption for gas/solid systems with special reference to the determination of surface area and porosity (re-
commendations 1984)(1nforme de fisisorción para sistemas de gas/sólido con referencia especial a la determinación del área
superficial y la porosidad. (Recomendaciones 1984). Pure Appl Chem. 1985;57(4):603-619, Figura 3.]

Generar una gráfica to a5 para comparar la isoterma de la muestra de prueba con la de una isoterma de referencia también
ayuda a ilustrar la presencia de micro y mesoporosidad. La isoterma de referencia se puede calcular usando una expresión ma-
USP 40 Pruebas Químicas/ (268) Porosidad Mediante Adsorción-Desorción de Nitrógeno 339

temática, aunque cuando el adsorbente tiene propiedades químicas similares a las de la muestra de prueba, se recomienda
usar una isoterma de referencia determinada de manera experimental.
El método de la gráfica t se basa en la curva t, que es una gráfica de la cantidad de nitrógeno adsorbido en el sólido no
poroso como una función de t, el espesor estadístico de la capa adsorbida. El valor t se calcula mediante:

nm = cantidad de monocapa
(5 0 =espesor de una capa molecular simple, por lo general tomada como 0,354 nm para nitrógeno
En el método de la gráfica a 5, la cantidad de nitrógeno adsorbido por el sólido no poroso de referencia se normaliza usando
la cantidad adsorbida a alguna presión relativa fija (n' 0 ) 1 a menudo tomada como 0,4. Posteriormente, la adsorción normaliza-
da a5 (igual a naf n' 0) se grafica contra plp 0 para obtener una curva a5•
La gráfica to la gráfica a 5 se construye graficando la cantidad de nitrógeno adsorbido por la muestra de prueba en función
de to a 5 para el material de referencia, en lugar de plp 0• La conversión de plp 0 ato a 5 se lleva a cabo tomando como referen-
cia la curva to la curva a 5 • La forma de la gráfica depende de la naturaleza de la porosidad presente en la muestra de prueba,
conforme a lo siguiente:
(a) si la gráfica to a 5 es lineal y pasa a través del origen, la muestra de prueba es no porosa o macroporosa.
(b) si la muestra de prueba contiene mesoporos, la gráfica presenta una desviación hacia arriba a la presión relativa corres-
pondiente al comienzo de la condensación capilar en los mesoporos más pequeños
(c) si la muestra de prueba contiene microporos, la gráfica presenta una desviación hacia abajo debido a que no se pueden
desarrollar múltiples capas dentro del espacio limitado en el interior de los microporos.
Algunos materiales contienen combinaciones de poros, lo que puede resultar en una gráfica compleja y difícil de interpretar.
En dichos casos, los analistas deben tener cuidado al analizar la isoterma.

Cálculo de la Distribución del Tamaño de Poro

Este análisis es válido únicamente para cálculos de las distribuciones del tamaño de mesoporos.
El cálculo de la distribución del tamaño de poro se basa en la ecuación de Kelvin:

2 X a, X V¡ X cos( 11) X 103

rk =
RxTxln(plp0 )

rK =radio del núcleo del poro (o radio de Kelvin) (nm)

Ui =tensión superficial (Nlm) del adsorbato líquido (nitrógeno)
v1 =volumen molar del adsorbato condensado (nitrógeno) (cm 3lmol)
R =constante universal de los gases, 8,3144 (j · K- 1 · mol-1)
T = temperatura (K)
() = ángulo de contacto del adsorbato (O para una superficie humedecida)
Para nitrógeno, la ecuación 2 se reduce a:

-0.953
r: =----
k ln(p/ p0 )

El radio real del poro, rP, se calcula a partir del radio de Kelvin, corrigiendo por el espesor, t, del adsorbato en las paredes del
poro. Para poros cilíndricos, rP = rk + t, y el diámetro del poro, dP, se obtiene mediante dP = 2(rk + t). Debido a la diferente
geometría de los poros en forma de ranura con lados paralelos, el ancho de la ranura se obtiene mediante rk + 2t.
Los analistas pueden calcular la distribución del tamaño de poro por volumen usando el método de Barrett, joyner y Halen-
da. Este modelo asume que los poros son rígidos y tienen una forma regular (p.ej., cilíndrica o en forma de ranura), que no
hay microporos presentes y que la distribución del tamaño de poro no se extiende continuamente sobre los poros más gran-
des que se pueden medir usando este procedimiento, lo cual implica que todos los poros evaluados se llenan a la presión rela-
tiva más alta.
Los cálculos de porosidad y de distribución del tamaño de poro que emplean la ecuación de Kelvin deben realizarse usando
la isoterma de desorción. La ecuación de Kelvin se derivó para sistemas macroscópicos y no es estrictamente válida a la escala
molecular. Por ende, la ecuación de Kelvin se basa en un menisco intacto para describir con exactitud el fenómeno experimen-
tales. Para los sistemas tratados en este capítulo, esto se logra únicamente para la isoterma de desorción. Sin embargo, para la
desorción, la aplicación de la ecuación de Kelvin a tamaños de poro menores se ve limitada por la tensión superficial del adsor-
bato. El límite se ilustra mediante el punto de cierre del ciclo de histéresis en la isoterma. Para nitrógeno, este punto ocurre a
una presión relativa de aproximadamente 0,45, que corresponde a un radio de poro cilíndrico limitante de aproximadamente
2 nm. Por consiguiente, la ecuación de Kelvin no es aplicable a los microporos.
340 (268) Porosidad Mediante Adsorción-Desorción de Nitrógeno/ Pruebas Químicas USP 40

Cálculo del Volumen de Microporos

Si la gráfica to a 5 indica la presencia de microporos, el volumen de los microporos se puede obtener a partir de la intersec-
ción de la porción lineal extrapolada de la curva.

Informe de Resultados

Por lo general, los resultados informados pueden incluir el volumen o la porosidad total de los poros, el volumen de los mi-
croporos, la media o la mediana del diámetro de poro, la distribución del tamaño de poro y el área superficial de los poros.

CALIBRACIÓN Y VERIFICACIÓN DEL DESEMPEÑO DEL SISTEMA

Los analistas deben llevar a cabo la calibración de los componentes individuales de acuerdo con las recomendaciones del
fabricante. La calibración de transductores de presión y de sensores de temperatura se logra con referencia a dispositivos es-
tándar de medición de temperatura y presión que cuentan con calibraciones rastreables a estándares nacionales. La calibración
del volumen del distribuidor múltiple (manifold) se logra a través de las mediciones apropiadas de presión y temperatura,
usando espacios volumétricos con temperatura constante o sólidos con volumen rastreable y conocido.
Un material de referencia certificado o un material de referencia definido localmente que sea rastreable a un material de
referencia certificado debe analizarse de manera regular para monitorear la calibración y el desempeño del instrumento.

(271) PRUEBA PARA SUSTANCIAS FÁCILMENTE CARBONIZABLES

En las pruebas para sustancias fácilmente carbonizables, a menos que se indique algo diferente, agregar la cantidad especifi-
cada de la sustancia, reducida a polvo fino si se encuentra en forma sólida, en pequeñas porciones al recipiente para compara-
ción que es de vidrio incoloro resistente a la acción del ácido sulfúrico y contiene el volumen especificado de ácido sulfúrico
(ver en Especificaciones de Reactivos en la sección Reactivos, Indicadores y Soluciones).
Revolver la mezcla con una varilla de vidrio hasta completar su disolución, dejar la solución en reposo durante 15 minutos, a
menos que se indique algo diferente, y comparar el color de la solución con el del Líquido de Comparación especificado (ver
Color y Acromatismo (631 )) utilizando un recipiente para comparación, que también es de vidrio incoloro y tiene las mismas
dimensiones internas y cruzadas, observando los líquidos transversalmente contra un fondo de porcelana blanca o de vidrio
blanco.
Cuando se aplica calor para disolver la sustancia en el ácido sulfúrico, mezclar la muestra y el ácido en un tubo de ensayo,
calentar según se indica y transferir la solución al recipiente para comparación para observarla con el Líquido de Comparación
designado (ver Color y Acromatismo (631 )).

(281) RESIDUO DE INCINERACIÓN

Partes de este capítulo general han sido armonizadas con los textos correspondientes de la Farmacopea Europea y de la Far-
macopea japonesa. Las partes que no están armonizadas se indican con los símbolos(..). Los textos armonizados de estas far-
macopeas son por lo tanto intercambiables y, en lugar de este capítulo general de la Farmacopea de los Estados Unidos, se pue-
den usar los métodos de la Farmacopea Europea y/o la Farmacopea japonesa para demostrar el cumplimiento con los requisitos.
Estas farmacopeas se han comprometido a no realizar ningún cambio unilateral a este capítulo armonizado.
La prueba de Residuo de Incineración/Cenizas Sulfatadas emplea un procedimiento para medir la cantidad de sustancia resi-
dual no volatilizada de una muestra cuando ésta se incinera en presencia de ácido sulfúrico conforme al procedimiento que se
describe a continuación. Generalmente esta prueba se emplea para determinar el contenido de impurezas inorgánicas en una
sustancia orgánica.

PROCEDIMIENTO

Calcinar un crisol adecuado (por ejemplo de sílice, platino, cuarzo o porcelana) a 600 ± 50º durante 30 minutos, enfriar el
crisol en un desecador (gel de sílice u otro desecante adecuado) y pesarlo con exactitud. Pesar con exactitud •1 a 2 g de la
sustancia º• la cantidad que se especifica en la monografía individual, en el crisol.
Humedecer la muestra con una pequeña cantidad (generalmente 1 mL) de ácido sulfúrico y luego calentar suavemente a
una temperatura tan baja como sea posible hasta que la sustancia se carbonice totalmente. Enfriar; y luego•, a menos que se
USP 40 Pruebas Químicas/ (291) Selenio 341

indique algo diferente en la monografía individual,. humedecer el residuo con una pequeña cantidad (generalmente 1 mL) de
ácido sulfúrico; calentar suavemente hasta que no se generen humos blancos y calcinar a 600 ± 50º •, a menos que se especifi-
que otra temperatura en la monografía individual,. hasta que el residuo esté completamente incinerado. Asegurarse, durante
todo el procedimiento, de que no se produzcan llamas en ningún momento. Enfriar el crisol en un desecador (gel de sílice u
otro desecante adecuado), pesar con exactitud y calcular el porcentaje del residuo.
A menos que se especifique algo diferente, si la cantidad del residuo así obtenido excede el límite especificado en la mono-
grafía individual, humedecer nuevamente con ácido sulfúrico, calentar y calcinar como se indicó anteriormente, usando un
período de incineración de 30 minutos, hasta que dos pesadas consecutivas del residuo no difieran en más de 0,5 mg o hasta
que el porcentaje del residuo cumpla con el límite establecido en la monografía individual.
•Realizar la incineración en una campana bien ventilada, pero protegida de las corrientes de aire y a la menor temperatura
posible para lograr la combustión completa del carbón. Puede usarse una mufla, si se desea, cuyo uso para la calcinación final
se recomienda a 600 ± 50º.
La mufla se puede calibrar empleando un termómetro digital adecuado y una sonda termopar de trabajo calibrada contra
un termopar estándar rastreable al Instituto Nacional de Normas y Tecnología (NIST, por sus siglas en inglés).
Verificar la exactitud de los circuitos de medición y control de la mufla mediante la comprobación de la temperatura fijada
para el uso previsto en distintas posiciones dentro de la mufla. Seleccionar las posiciones que reflejen el método de uso even-
tual con respecto a la ubicación de la muestra en análisis. La tolerancia es de± 25º en cada posición medida .•

(291) SELENIO

SOLUCIÓN MADRE
Disolver 40,0 mg de selenio metálico en 100 mL de ácido nítrico diluido (1 en 2) en un matraz volumétrico de 1000 mL,
calentar moderadamente en un baño de vapor, si fuera necesario para completar la disolución, agregar agua a volumen y
mezclar. Pipetear 5 mL de esta solución y transferir a un matraz volumétrico de 200 mL, agregar agua a volumen y mezclar.
Cada mL de la solución resultante contiene la cantidad equivalente a 1 µg de selenio (Se).

SOLUCIÓN DE DIAMINONAFTALENO
Disolver 100 mg de 2,3-diaminonaftaleno y 500 mg de clorhidrato de hidroxilamina en ácido clorhídrico O, 1 N para obtener
100 mL. Preparar esta solución el mismo día de su uso.

SOLUCIÓN ESTÁNDAR
Pipetear 6 mL de Solución Estándar y transferir a un vaso de precipitados de 150 mL, y agregar 25 mL de ácido nítrico dilui-
do (1 en 30) y 25 mL de agua.

SOLUCIÓN DE PRUEBA
La combustión completa del material de prueba es un factor importante para realizar la prueba. Para los compuestos que se
queman mal y producen hollín, la adición de óxido de magnesio por lo general da como resultado una combustión más minu-
ciosa y reduce la formación de hollín. Cuando se haya detectado la necesidad de agregar óxido de magnesio, ésta se especifi-
cará en la monografía individual. Utilizando un matraz de combustión de 1000 mL y empleando 25 mL de ácido nítrico dilui-
do (1 en 30) como líquido absorbente, proceder según se indica en Combustión en Matraz con Oxígeno (471 ), empleando 100
mg a 200 mg de muestra de prueba, a menos que se indique algo diferente en la monografía individual. Al finalizar la com-
bustión, colocar algunos mL de agua en el matraz, aflojar el tapón, luego enjuagar el tapón, el portamuestras y las paredes del
matraz con aproximadamente 1O mL de agua. Transferir la solución a un vaso de precipitados de 150 mL con la ayuda de
aproximadamente 20 mL de agua y calentar moderadamente hasta temperatura de ebullición. Calentar a ebullición durante
1O minutos y dejar que se enfríe a temperatura ambiente.

PROCEDIMIENTO
Tratar concomitantemente y en paralelo la Solución Estándar, la Solución de Prueba y el blanco de reactivos constituido por
25 mL de ácido nítrico diluido (1 en 30) y 25 mL de agua, según se indica a continuación. Agregar solución de hidróxido de
amonio (1 en 2) para ajustar a un pH de 2,0 ± 0,2. Diluir con agua a 60 mL y transferir a un separador de vidrio con protec-
ción actínica con la ayuda de 1O mL de agua, agregando los 1O mL al separador. Agregar 200 mg de clorhidrato de hidroxila-
mina, agitar por rotación moderada para disolver; de inmediato agregar 5,0 mL de Solución de Diaminonaftaleno, tapar y mez-
342 (291) Selenio / Pruebas Químicas USP 40

ciar por rotación suave. Dejar la solución en reposo a temperatura ambiente durante 100 minutos. Agregar 5,0 ml de ciclohe-
xano, agitar vigorosamente durante 2 minutos y dejar que las capas se separen. Desechar la capa acuosa y centrifugar el ex-
tracto de ciclohexano para eliminar el agua dispersada. Determinar las absorbancias de los extractos de ciclohexano de la Solu-
ción de prueba y de la Solución estándar en una celda de 1 cm, a la longitud de onda de máxima absorción, aproximadamente
a 380 nm, con un espectrofotómetro adecuado, usando el extracto de ciclohexano del blanco de reactivos como blanco, y
comparar las absorbancias: la absorbancia de la Solución de Prueba no es mayor que la de la Solución Estándar cuando se ha
tomado una muestra de prueba de 200 mg, o no es mayor que la mitad de la absorbancia de la Solución Estándar cuando se
ha tomado una muestra de prueba de 100 mg.

OTRAS PRUEBAS Y VALORACIONES

(301) CAPACIDAD NEUTRALIZANTE DE ÁCIDO

[NOTA-Todas las pruebas se deben realizar a una temperatura de 37 ± 3º.]

Calibración del medidor de pH: Calibrar un medidor de pH usando soluciones amortiguadoras de calibración de biftalato
de potasio 0,05 m y de tetraoxalato de potasio 0,05 m como se describe en pH (791 ).
Mezclador magnético: Transferir 100 ml de agua a un vaso de precipitados de 250 ml que contenga una barra mezcla-
dora magnética de 40 mm x 1 O mm (u otro tamaño adecuado) recubierta con teflón y con un anillo de giro en el centro.
Ajustar la velocidad de la barra mezcladora, de forma que cuando la barra mezcladora se centra en el vaso de precipitados,
la velocidad de mezclado sea de 300 ± 30 rpm, determinada con un tacómetro óptico adecuado.
Preparación de prueba
Polvos: Transferir a un vaso de precipitados de 250 ml, la porción pesada con exactitud de la sustancia especificada en la
monografía individual, agregar 70 ml de agua y mezclar en el Mezclador magnético durante 1 minuto.
Sólidos efervescentes: Transferir a un vaso de precipitados de 250 ml, una cantidad pesada con exactitud, que equivalga
a la dosificación mínima declarada en la etiqueta, agregar 1O ml de agua y mezclar por rotación moderada el vaso de pre-
cipitados mientras se reduce la intensidad de la reacción. Agregar 1O ml más de agua y mezclar por rotación suave. Lavar
las paredes del vaso de precipitados con 50 ml de agua, y mezclar en el Mezclador magnético durante 1 minuto.
Suspensiones y otros líquidos: Agitar el recipiente hasta que el contenido sea uniforme y determinar la densidad. Transfe-
rir a un vaso de precipitados de 250 ml una cantidad de la mezcla uniforme, pesada con exactitud, que equivalga a la
dosificación mínima declarada en la etiqueta, agregar agua hasta obtener un volumen de aproximadamente 70 ml y mez-
clar en el Mezclador magnético durante 1 minuto.
Tabletas de disolución bucal: Pesar con exactitud no menos de 20 tabletas de disolución bucal y determinar el peso pro-
medio. Seleccionar y pesar 2 tabletas de disolución bucal y transferirlas a un vaso de precipitados de 250 ml que contenga
70 ml de agua.
Tabletas no masticables: Pesar con exactitud no menos de 20 tabletas y determinar el peso promedio de las tabletas. Mo-
ler las tabletas hasta un polvo fino, mezclar para obtener una mezcla uniforme y transferir a un vaso de precipitados de 250
ml una cantidad pesada con exactitud, que equivalga a la dosificación mínima declarada en la etiqueta. Si se desea hume-
decer, agregar no más de 5 ml de alcohol (neutralizado a un pH aparente de 3,5) y mezclar para humedecer bien la mues-
tra. Agregar 70 ml de agua y mezclar en el Mezclador magnético durante 1 minuto.
Tabletas masticables: Preparar según se indica en Tabletas no masticables.
Tabletas que deben masticarse: Transferir 1 Tableta a un vaso de precipitados de 250 ml, agregar 50 ml de agua y mez-
clar en el Mezclador magnético durante 1 minuto.
Cápsulas: Pesar con exactitud no menos de 20 cápsulas. Extraer completamente el contenido de las cápsulas con la ayuda
de un hisopo de algodón si fuera necesario. Pesar con exactitud las cápsulas vacías y determinar el peso promedio del con-
tenido de cada cápsula. Mezclar el contenido combinado de las cápsulas para obtener una mezcla uniforme y proceder
según se indica en Tabletas no masticables, comenzando donde dice "transferir una cantidad pesada con exactitud".
PROCEDIMIENTOS
• PROCEDIMIENTO PARA POLVOS, SÓLIDOS EFERVESCENTES, SUSPENSIONES Y OTROS LÍQUIDOS, TABLETAS DE DISOLUCIÓN BUCAL,
TABLETAS No MASTICABLES, TABLETAS MASTICABLES Y CÁPSULAS
Pipetear 30,0 ml de ácido clorhídrico 1,0 N SV y transferir a la Preparación de prueba mientras se continúa mezclando con
el Mezclador magnético. [NOTA-Cuando la capacidad neutralizante de ácido de la muestra en análisis es mayor de 25
mEq, usar 60,0 ml de ácido clorhídrico 1,0 N SV, y hacer las modificaciones correspondientes en los cálculos.] Mezclar
durante 15 minutos, cronometrados exactamente, después de agregar el ácido, comenzar a valorar de inmediato y en un
período que no exceda los 5 minutos adicionales, valorar el ácido clorhídrico en exceso con hidróxido de sodio 0,5 N SV
para obtener un pH de 3,5 estable (durante 1O a 15 segundos). Calcular el número de mEq de ácido consumido por la
fórmula:
 USP 40 Pruebas Químicas/ (311) Valoración de Alginatos 343

mEq totales= (30 x NH0 ) - (VNaOH x NNaoH)

NHo = normalidad del ácido clorhídrico SV

VNaoH =volumen del hidróxido de sodio SV usado para la valoración
NNaoH = normalidad del hidróxido de sodio SV
Expresar el resultado como mEq del ácido consumido por g de la sustancia analizada.
• PROCEDIMIENTO PARA TABLETAS QUE DEBEN MASTICARSE
Pipetear 30,0 ml de ácido clorhídrico 1,0 N SV y transferir a la Preparación de prueba mientras se continúa mezclando con
el Mezclador magnético durante 1O minutos, cronometrados con exactitud, después de agregar el ácido. Interrumpir el
mezclado brevemente y retirar sin demora cualquier base gomosa del vaso de precipitados usando una aguja larga. Enjua-
gar sin demora la aguja con 20 ml de agua, recogiendo los lavados en el vaso de precipitados y continuar mezclando
durante 5 minutos exactamente cronometrados, después comenzar a valorar de inmediato y en un período que no exce-
da los 5 minutos adicionales, valorar el ácido clorhídrico en exceso con hidróxido de sodio 0,5 N SV para obtener un pH
de 3,5 estable (durante 1O a 15 segundos). Calcular el número de mEq de ácido consumido por la Tableta analizada por
la fórmula:

mEq totales= (30 x NHo) - (VNaOH x NNaoH)

(311) VALORACIÓN DE ALGINATOS

APARATO

El aparato necesario (ver Figura 7) contiene una válvula dosificadora capilar, A, seguida de un caudalímetro, B, para controlar
y vigilar el flujo de nitrógeno a través del sistema. Se emplean tubos de plástico vinílico halogenado* y una conexión de cau-
cho, C, para conectar el caudalímetro a un brazo lateral de un matraz de reacción, D. El matraz Des un matraz de fondo
redondo, de 250 ml, para ebullición, apoyado en un manto de calefacción adecuado, E. El matraz D está equipado con un
condensador de reflujo de bobina Hopkins de 225 mm, F. El condensador termina en una trampa en U, G, que contiene dos
bandas de 25 g de cinc de malla 20; estas bandas están limitadas y separadas por tres tapones de lana de vidrio de 3 pulgadas.
La trampa termina en un adaptador, H, que por medio de un tubo de plástico vinílico halogenado y un conector con llave de
paso por torsión, 1, se conecta con un frasco lavador de gas de 250 ml, J. El tubo de entrada (burbujeo) se extiende casi hasta
el fondo del frasco de lavado de gas y termina en un disco sinterizado con una porosidad gruesa. El tamaño de todas las juntas
de vidrio es de 24 / 40, excepto la junta de 45 / 50 del frasco de lavado de gas.
G

Figura 1. Aparato para Valoración de Alginatos.

* Este tipo de tubos se denominan comúnmente tubos Tygon. Esta nota se agrega a los efectos de una mayor claridad y no implica que la USP avale este producto.
344 (311) Valoración de Alginatos / Pruebas Químicas USP 40

APTITUD DEL SISTEMA

Empleando D-glucuronolactona como el estándar, proceder como se indica en el Procedimiento, pero no realizar los pasos
previos a la ebullición. El sistema es adecuado si se cumplen los siguientes criterios: (1) la determinación con un blanco da
como resultado un valor neto de volumetría, C, de entre 0,02 y 0,06 mEq, calculado de la siguiente manera:

Ab - Bb

en donde Abes el número de mEq de hidróxido de sodio 0,25 Nen los 25 mL utilizados y Bbes el número de mEq de ácido
clorhídrico O, 1 N utilizado en la volumetría con un blanco; y (2) el porcentaje de dióxido de carbono, C0 2, obtenido a partir
del estándar está entre 24,2% y 25,7%.

PROCEDIMIENTO

A menos que se indique algo diferente en la monografía individual, transferir una muestra de aproximadamente 250 mg,
pesados con exactitud, al matraz de reacción, D, agregar 50 mL de ácido clorhídrico O, 1 N, agregar varias perlas de ebullición
y conectar el matraz al condensador de reflujo, F, empleando ácido fosfórico como lubricante. [NOTA-Se puede emplear grasa
para llaves de paso para las otras conexiones.] Conectar la línea de nitrógeno al brazo lateral del matraz y ajustar el flujo de
agua refrigerante aproximadamente a 2 L por minuto.
[NOTA-Los pasos previos a la ebullición que se describen en este párrafo son opcionales y únicamente es necesario realizar-
los cuando se sospecha de la presencia de carbonatos inorgánicos.] Mantener el flujo de nitrógeno a través del aparato a una
velocidad de 90 mL a 100 mL por minuto. Acercar el manto de calefacción, E, hasta el matraz, calentar la muestra y llevarla a
ebullición, y mantener una ebullición moderada durante 2 minutos. Apagar la fuente de calor, bajar el manto, E, y dejar que la
muestra se enfríe durante aproximadamente 1O minutos.
Conectar el frasco lavador de gas vacío, J, y purgar el sistema con nitrógeno a una velocidad de 90 mL a 100 mL por minuto
durante 5 minutos. Reducir el flujo de nitrógeno hasta 60 mL a 65 mL por minuto, agregar al frasco 1Ogotas de alcohol butíli-
co, 25,0 mL de hidróxido de sodio 0,25 N SV y 50 mL de agua destilada, enjuagando hacia el interior del frasco lavador de gas
y volver a colocar la tapa. Desconectar la conexión de caucho, C, del brazo lateral y agregar 46 mL de ácido clorhídrico a
través del brazo lateral del matraz de ebullición. Volver a unir la línea de nitrógeno, acercar el manto de calefacción y calentar
la mezcla de reacción hasta ebullición. Después de 2 horas de ebullición, aumentar el flujo de nitrógeno hasta 90 mL a 100 mL
por minuto, suspender el calentamiento y bajar el manto. Dejar que se enfríe durante 1O minutos. Desconectar y desmontar el
frasco lavador de gas. Empleando un chorro dirigido de agua destilada, enjuagar bien todas las partes del tubo de burbujeo y
tapar, recolectando los lavados en el frasco de lavado de gas. Emplear nitrógeno para forzar suavemente la salida de toda el
agua del tubo de burbujeo. Agregar al frasco inmediatamente 1O mL de solución de cloruro de bario al 10% y una barra de
agitación. Tapar herméticamente y mezclar lentamente durante 1 minuto. Dejar en reposo durante un mínimo de 5 minutos.
Agregar tres gotas de fenolftaleína SR y valorar con ácido clorhídrico O, 1 N SV. Realizar una determinación con un blanco (ver
Valoraciones Volumétricas Residuales en Volumetría (541 )). Calcular el porcentaje de dióxido de carbono, C0 2, por la fórmula:
2200[(A - B) - C]/(l OOOW)(l - D)
en donde A es el número de mEq de hidróxido de sodio 0,25 N en los 25 mL empleados; B es el número de mEq de ácido
clorhídrico O, 1 N empleado para la volumetría de la muestra o del estándar; C es el valor neto de volumetría calculado en la
determinación con un blanco; W es el peso, en g, de la muestra o del estándar tomado; y D es el porcentaje expresado hasta
la décima de unidad (1 lugar decimal), obtenido en la prueba de Pérdida por Secado para la muestra o para el estándar.

(341) AGENTES ANTIMICROBIANOS-CONTENIDO

Un componente esencial de las Inyecciones conservadas en envases multidosis es el agente antimicrobiano o los agentes anti-
microbianos que se incorporan para reducir el riesgo de que, en el momento de retirar parte del contenido, se produzca una
contaminación microbiana accidental del contenido remanente. Es un requisito farmacopeico que la presencia y la cantidad
agregada de tal( es) agente(s) antimicrobianos se declaren en la etiqueta del envase. Este capítulo general provee métodos
para los agentes antimicrobianos de uso más común. Estos métodos u otros métodos validados de forma adecuada deben
emplearse para demostrar que el agente antimicrobiano declarado está presente pero no excede la cantidad declarada en la
etiqueta en más de 20%.
La concentración de un conservante antimicrobiano agregado a una preparación para uso oftálmico, nasal, ótico y parenteral,
en envases multidosis o monodosis, puede disminuir durante la vida útil del producto. Por ende, el fabricante debe determi-
nar el nivel mínimo en el que el conservante resulta eficaz y debe formular el producto de modo que se garantice que se
excede este nivel de efectividad durante toda la vida útil del producto. En el momento de su fabricación, el producto debe
contener la cantidad declarada del conservante antimicrobiano (dentro de un ±20% considerando las variaciones originadas
en la fabricación y el análisis). La declaración de la cantidad de conservante que se indica en la etiqueta no está destinada a
USP 40 Pruebas Químicas/ (341) Agentes Anti microbianos-Contenido 345

significar que la cantidad de conservante declarado se mantiene durante la vida útil del producto; por el contrario, es una
declaración de la cantidad que fue agregada, dentro de las limitaciones del proceso, y que no se excedió en más de 20%.
Un ejemplo de tal declaración en la etiqueta es "_(unidad) agregado como conservante." [NOTA-" __ (unidad)" es un
número seguido de la unidad de medida, p.ej., 0,015 mg/mL o O, 1%.]
Los agentes antimicrobianos más usados incluyen alcohol bencílico, clorobutanol, fenol; los cuatro ésteres homólogos del áci-
do p-hidroxibenzoico (metil, etil, propil y butil parabenos); y los dos derivados mercuriales, nitrato fenilmercúrico y timero-
sal. El método usado para el nitrato fenilmercúrico es polarográfico, mientras que para el timerosal y los cuatro ésteres ho-
mólogos del ácido p-hidroxibenzoico se usó cromatografía líquida cuantitativa. Se usa cromatografía de gases para la deter-
minación de fenol, alcohol bencílico y clorobutanol.
MÉTODOS GENERALES POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA V DE GASES
Los procedimientos generales por cromatografía de gases que se establecen a continuación son aplicables a la determinación
cuantitativa de alcohol bencílico, clorobutanol y fenol. Preparar la Solución de estándar interno y la Solución estándar para
cada agente antimicrobiano, según se indica a continuación. A menos que se indique lo contrario en la monografía indivi-
dual, preparar la Solución muestra a partir de porciones medidas con exactitud de la muestra en análisis y la Solución de es-
tándar interno, de manera que la concentración del agente antimicrobiano y la composición del disolvente se correspondan
estrechamente con la concentración y la composición de la Solución estándar. Se proveen en esta sección parámetros opera-
tivos recomendados para el cromatógrafo de gases.
Los procedimientos generales para cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) que se establecen a continuación son apli-
cables a la determinación cuantitativa de parabenos y Timerosal. Preparar la Solución de estándar interno y la Solución están-
dar para cada agente antimicrobiano, según se indica a continuación. A menos que se indique lo contrario, preparar la Solu-
ción muestra a partir de porciones medidas con exactitud de la muestra en análisis y la Solución de estándar interno, si fuera
aplicable, de manera que la concentración del agente antimicrobiano y la composición del disolvente sean aproximadamen-
te las mismas que la concentración y la composición de la Solución estándar. Se proveen en esta sección parámetros operati-
vos recomendados para el cromatógrafo de líquidos.
• ALCOHOL BENCÍLICO
Diluyente: Metanol y agua (20:80)
Solución de estándar interno: 3,8 mg/mL de fenol, que se prepara según se indica a continuación. Disolver una canti-
dad adecuada de fenol en un volumen de metanol equivalente al 10% del volumen del matraz y diluir con agua a volu-
men.
Solución estándar: 1,8 mg/mL de ER Alcohol Bencílico USP y 1,5 mg/mL de fenol, que se prepara según se indica a con-
tinuación. Disolver 180 mg de ER Alcohol Bencílico USP en 20 mL de metanol contenidos en un matraz volumétrico de
100 ml. Agregar 40,0 mL de Solución de estándar interno y diluir con agua a volumen.
Sistema cromatográfico
(Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: Cromatografía de Gases
Detector: Ionización a la llama
Columna: Sílice fundida, de 30 m x 0,32 mm; con una película ligada de fase Gl 6 de 0,5 µm
Temperaturas
Inyector: 200º
Detector: 31 Oº
Columna: Ver la Tabla 7.
Tabla 1
Tiempo de Espera
Temperatura Inicial Rampa de Temperatura Temperatura Final (Hold Time) a la Temperatura
(º) (°/min) (°) Final (min)
150 o 150 5
150 10 230 7

Gas transportador: Helio

Velocidad de flujo (constante): 2 mL/min
Volumen de inyección: 1 µL
Relación de partición: 10:1
Tiempo de corrida: 20 min
Aptitud del sistema
Muestra: Solución estándar
[NOTA-Los tiempos de retención relativos para alcohol bencílico y fenol son aproximadamente 1,0 y 1,25, respectiva-
mente.]
Requisitos de aptitud
Resolución: No menos de 2,0 entre los picos de alcohol bencílico y fenol
Factor de asimetría: No más de 2,0 para el pico de alcohol bencílico
346 (341) Agentes Antimicrobianos-Contenido / Pruebas Químicas USP 40

Desviación estándar relativa: No más de 2,0% para el cociente de respuesta entre los picos de alcohol bencílico y
fenol
Análisis
Muestras: Solución estándar y Solución muestra
Calcular el porcentaje de la cantidad declarada de alcohol bencílico (C 7 H8 0) en la porción de muestra tomada:
Resultado= (Ruf R5) x (C5/Cu) x 100

Ru = cociente de respuesta entre los picos de alcohol bencílico y fenol de la Solución muestra
R5 = cociente de respuesta entre los picos de alcohol bencílico y fenol de la Solución estándar
C5 = concentración de ER Alcohol Bencílico USP en la Solución estándar
Cu = concentración nominal de alcohol bencílico en la Solución muestra
• (LOROBUTANOL
Diluyente: Metanol y agua (50:50)
Solución de estándar interno: 1O mg/ml de 2,2,2-tricloroetanol en Diluyente
Solución madre del estándar: 5 mg/ml de ER Clorobutanol USP en metanol
Solución estándar: 1,25 mg/ml de ER Clorobutanol USP y 2 mg/ml de 2,2,2-tricloroetanol, que se prepara según se
indica a continuación. Transferir 2,5 ml de Solución madre del estándar, 2,0 ml de Solución de estándar interno y 0,5 ml
de metanol a un matraz volumétrico de 1O ml. Diluir con agua a volumen.
Solución madre de la muestra: Diluir cuantitativamente, si fuera necesario, un volumen medido con exactitud corres-
pondiente a 2,5 mg/ml de clorobutanol en agua.
Solución muestra: Combinar 5,0 ml de Solución madre de Ja muestra con 2,0 ml de Solución de estándar interno en un
matraz volumétrico de 1O ml y diluir con Diluyente a volumen.
Sistema cromatográfico
(Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: Cromatografía de Gases
Detector: Ionización a la llama
Columna: Sílice fundida, de 30 m x 0,32 mm; con una película ligada de fase Gl 6 de 0,25 µm
Temperaturas
Inyector: 260º
Detector: 280º
Columna: 1 35º
Gas transportador: Helio
Velocidad de flujo: 1 ml/min
Volumen de inyección: 0,5 µL
Relación de partición: 10:1
Tiempo de corrida: 12 min
Aptitud del sistema
Muestra: Solución estándar
[NOTA-Los tiempos de retención relativos para clorobutanol y 2,2,2-tricloroetanol son aproximadamente 1,0 y 1,4, res-
pectivamente.]
Requisitos de aptitud
Resolución: No menos de 2,0 entre clorobutanol y 2,2,2-tricloroetanol
Desviación estándar relativa: No más de 1,0% para el cociente de respuesta entre los picos de clorobutanol y 2,2,2-
-tricloroetanol
Análisis
Muestras: Solución estándar y Solución muestra
Calcular el porcentaje de la cantidad declarada de clorobutanol (C 4 H7Clp), con respecto a la sustancia anhidra, en la por-
ción de muestra tomada:
Resultado= (Ruf R5) x (C5/Cu) x 100

Ru = cociente de respuesta entre los picos de clorobutanol y 2,2,2-tricloroetanol de la Solución muestra

Rs = cociente de respuesta entre los picos de clorobutanol y 2,2,2-tricloroetanol de la Solución estándar
Cs = concentración de ER Clorobutanol USP en la Solución estándar
Cu =concentración nominal de clorobutanol en la Solución muestra
• FENOL
Solución de estándar interno: 2 mg/ml de ER Alcohol Bencílico USP en metanol
Solución madre del estándar: 4 mg/ml de ER Fenol USP en agua
Solución estándar: 0,4 mg/ml de ER Fenol USP y de ER Alcohol Bencílico USP, que se prepara según se indica a conti-
nuación. Combinar 5,0 ml de Solución madre del estándar con 10,0 ml de Solución de estándar interno en un matraz volu-
métrico de 50 ml y diluir con agua a volumen.
USP 40 Pruebas Químicas/ (341) Agentes Antimicrobianos-Contenido 347

Sistema cromatográfico
(Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: Cromatografía de Gases
Detector: Ionización a la llama
Columna: Sílice fundida, de 30 m x 0,32 mm; con una película ligada de fase Gl 6 de 0,5 µm
Temperaturas
Inyector: 200º
Detector: 31 Oº
Columna: Ver la Tabla 2.
Tabla 2
Tiempo de Espera
Temperatura Inicial Rampa de Temperatura Temperatura Final (Hold Time) a la Temperatura
(°) (º/min) (º) Final (min)
150 o 150 5
150 10 230 7

Gas transportador: Helio

Velocidad de flujo (constante): 2 ml/min
Volumen de inyección: 1 µL
Relación de partición: 10:1
Tiempo de corrida: 20 min
Aptitud del sistema
Muestra: Solución estándar
[NOTA-Los tiempos de retención relativos para alcohol bencílico y fenol son aproximadamente 0,85 y 1,0, respectiva-
mente.]
Requisitos de aptitud
Resolución: No menos de 2,0 entre alcohol bencílico y fenol
Factor de asimetría: No más de 2,0 para el pico de fenol
Desviación estándar relativa: No más de 1,0% para el cociente de respuesta entre los picos de fenol y alcohol bencíli-
co
Análisis
Muestras: Solución estándar y Solución muestra
Calcular el porcentaje de la cantidad declarada de fenol (C 6 H6 0) en la porción de muestra tomada:
Resultado= (RufR 5) x (C5/Cu) x 100

Ru = cociente de respuesta entre los picos de fenol y alcohol bencílico de la Solución muestra
R5 = cociente de respuesta entre los picos de fenol y alcohol bencílico de la Solución estándar
C5 = concentración de ER Fenol USP en la Solución estándar
Cu =concentración nominal de fenol en la Solución muestra
• METILPARABENO Y PROPILPARABENO
Solución amortiguadora: 7 g/L de fosfato monobásico de potasio en agua
Fase móvil: Metanol y Solución amortiguadora (65:35)
Solución de estándar interno: 0,013 mg/ml de ER Etilparabeno USP en Fase móvil
Solución de aptitud del sistema: 0,01 mg/ml de ER Butilparabeno USP, de ER Propilparabeno USP, de ER Etilparabeno
USP, de ER Metilparabeno USP y de ácido p-hidroxibenzoico en Fase móvil
Solución madre del estándar: 0,2 mg/ml de ER Metilparabeno USP y 0,03 mg/ml de ER Propilparabeno USP en Fase
móvil
Solución estándar: Combinar 5 ml de Solución madre del estándar con 5 ml de Solución de estándar interno y extraer tres
veces con alícuotas de 1 O ml de éter etílico. Filtrar las capas etéreas combinadas a través de sulfato de sodio anhidro.
Evaporar el extracto etéreo hasta sequedad y disolver el residuo en 50 ml de Fase móvil.
Solución muestra: Combinar 5 ml de la muestra en análisis con 5 ml de Solución de estándar interno y extraer tres veces
con alícuotas de 1O ml de éter etílico. Filtrar las capas etéreas combinadas a través de sulfato de sodio anhidro. Evaporar
el extracto etéreo hasta sequedad y disolver el residuo en 50 ml de Fase móvil.
Sistema cromatográfico
(Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
Detector: UV 272 nm
Columnas
Guarda columna: 4,0 mm x 3 mm; relleno L1
Columna analítica: 4,6 mm x 15 cm; relleno L1 de 5 µm
Velocidad de flujo: 1,3 ml/min
348 (341) Agentes Antimicrobianos-Contenido / Pruebas Químicas USP 40

Volumen de inyección: 1O µL
Tiempo de corrida: 1 O min
Aptitud del sistema
Muestras: Solución de aptitud del sistema y Solución estándar
[NOTA-Los tiempos de retención relativos para ácido p-hidroxibenzoico, metilparabeno, etilparabeno y propilparabeno
son aproximadamente 0,58; 1,0; 1,4y2,1, respectivamente.]
Requisitos de aptitud
Resolución: No menos de 2,0 entre ácido p-hidroxibenzoico y metilparabeno, no menos de 2,0 entre metilparabeno y
etilparabeno; Solución de aptitud del sistema
Factor de asimetría: No más de 2,0 para los picos de metilparabeno y propilparabeno, Solución estándar
Desviación estándar relativa: No más de 2,0% para el cociente de respuesta entre los picos de metilparabeno y etil-
parabeno, no más de 2,0% para el cociente de respuesta entre los picos de propilparabeno y etilparabeno; Solución de
aptitud del sistema
Análisis
Muestras: Solución estándar y Solución muestra
Calcular el porcentaje de la cantidad declarada de metilparabeno (C 8 H8 0 3) en la porción de muestra tomada:
Resultado= (Ru/R 5) x (C5/Cu) x 100
Ru = cociente de respuesta entre los picos de metilparabeno y etilparabeno de la Solución muestra
R5 = cociente de respuesta entre los picos de metilparabeno y etilparabeno de la Solución estándar
C5 = concentración de ER Metilparabeno USP en la Solución estándar
Cu = concentración nominal de metilparabeno en la Solución muestra
Calcular el porcentaje de la cantidad declarada de propilparabeno (C 10 H12 0 3) en la porción de muestra tomada:
Resultado= (Ruf R5) x (C5/Cu) x 100
Ru = cociente de respuesta entre los picos de propilparabeno y etilparabeno de la Solución muestra
R5 = cociente de respuesta entre los picos de propilparabeno y etilparabeno de la Solución estándar
C5 = concentración de ER Propilparabeno USP en la Solución estándar
Cu = concentración nominal de propilparabeno en la Solución muestra
El etilparabeno y el butilparabeno pueden determinarse de modo similar, usando soluciones de estándar interno apropia-
das. Sin embargo, debido a que la recuperación de la extracción depende de la matriz, el usuario debe verificar la apti-
tud del procedimiento para su medicamento y para diferentes formulaciones de productos.
• TIMEROSAL
Solución A: Ácido trifluoroacético y agua (0,5: 1000)
Fase móvil: Metanol y Solución A (60:40)
Solución estándar: 25 µg/ml de ER Timerosal USP en agua
Sistema cromatográfico
(Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
Detector: UV 222 nm
Columna: 2, 1 mm x 1 O cm; relleno L1 de 2 µm
Temperatura del muestreador automático: 4º
Velocidad de flujo: 0,35 ml/min
Volumen de inyección: 2,5 µL
Aptitud del sistema
Muestra: Solución estándar
Factor de asimetría: No más de 1,5
Desviación estándar relativa: No más de 1,0%
Análisis
Muestras: Solución estándar y Solución muestra
Calcular el porcentaje de la cantidad declarada de timerosal (C 9 H9 HgNa0 2 S) en la porción de muestra tomada:
Resultado= <ruf r5) x (C5/Cu) x 100
ru = respuesta del pico de timerosal de la Solución muestra
r5 = respuesta del pico de timerosal de la Solución estándar
C5 = concentración de ER Timerosal USP en la Solución estándar
Cu = concentración nominal de timerosal en la Solución muestra
USP 40 Pruebas Químicas/ (345) Valoración de Ácido Cítrico/Citrato y Fosfato 349

MÉTODO POLAROGRÁFICO
• NITRATO FENILMERCÚRICO
Solución madre del estándar: O, l mg/ml de nitrato fenilmercúrico en solución de hidróxido de sodio (1 en 250). Enti-
biar, si fuera necesario, para disolver.
Solución estándar: Pipetear y transferir 1O ml de Solución madre del estándar a un matraz volumétrico de 25 ml y proce-
der según se indica en la Solución muestra, comenzando desde donde dice "agregar 2 ml de solución de nitrato de pota-
sio (1 en 100)."
Solución muestra: Pipetear y transferir 1 O ml de la muestra en análisis a un matraz volumétrico de 25 ml, agregar 2 ml
de solución de nitrato de potasio (1 en 100) y 1 O ml de solución amortiguadora alcalina de borato de pH 9,2 (ver Solucio-
nes Amortiguadoras en la sección Reactivos, Indicadores y Soluciones) y, si fuera necesario, ajustar a un pH de 9,2 agregan-
do ácido nítrico 2 N. Agregar 1,5 ml de solución de gelatina (1 en 1000) recientemente preparada, luego agregar la solu-
ción amortiguadora alcalina de borato de pH 9,2 a volumen.
Análisis: Pipetear y transferir una porción de la Solución muestra a la celda polarográfica y desgasificar burbujeando nitró-
geno a través de la solución durante 15 minutos. Insertar el electrodo de goteo de mercurio de un polarógrafo adecuado
(ver Po/orografía (801 )) y registrar el polarograma desde -0,6 hasta -1,5 voltios en comparación con el electrodo de calo-
mel saturado.
Calcular la cantidad, en µg/ml, de nitrato fenilmercúrico (C 6 H5 HgN0 3) en la porción de muestra tomada:

Resultado = 2,5C[(id)uf(id)s]

C = concentración de nitrato fenilmercúrico en la Solución estándar (µg/ml)

(id)u = corriente de difusión de la Solución muestra, como la diferencia entre la corriente residual y la corriente limitante
(id)s = corriente de difusión de la Solución estándar, como la diferencia entre la corriente residual y la corriente limitante
• ESTÁNDARES DE REFERENCIA USP (11)
ER Alcohol Bencílico USP
ER Butilparabeno USP
ER Clorobutanol USP
ER Etilparabeno USP
ER Metilparabeno USP
ER Fenal USP
ER Propilparabeno USP
ER Timerosal USP

(345) VALORACIÓN DE ÁCIDO CÍTRICO/CITRATO Y FOSFATO

INTRODUCCIÓN
El siguiente procedimiento general de cromatografía iónica se emplea para determinar el contenido de ácido cítrico/citrato y
fosfato en los artículos farmacopeicos, cuando se especifica en las monografías individuales. Con respecto a la teoría y los
principios de las mediciones usando cromatografía iónica, ver Cromatografía Jónica (1065).

VALORACIÓN
• PROCEDIMIENTO
Fase móvil: Hidróxido de sodio o hidróxido de potasio 20 mM, a partir de un volumen apropiado de una solución de
hidróxido de sodio o hidróxido de potasio, exentos de carbonato, de concentración conocida y agua (de una resistividad
de no menos de 18 Mohmios-cm). Como alternativa, la Fase móvil se puede generar mediante electrolisis usando un gene-
rador automático de eluyente. Proteger la Fase móvil del dióxido de carbono atmosférico.
Solución estándar 1 (sólo para la valoración de ácido cítrico/citrato): 20 µg/ml de citrato (C 6 Hs0 7) en hidróxido de
sodio 1 mM recientemente preparado, a partir de ER Ácido Cítrico USP
Solución estándar 2 (para la valoración concomitante de citrato y fosfato): 20 µg/ml de citrato (C 6 H5 0 7) y 12 µg/ml
de fosfato (P0 4 ) en hidróxido de sodio 1 mM recientemente preparado, a partir de ER Ácido Cítrico USP y fosfato monobá-
sico de sodio
Solución muestra (para la valoración de ácido cítrico/citrato): Nominalmente 20 µg/ml de citrato en hidróxido de so-
dio 1 mM recientemente preparado, a menos que se indique algo diferente en la monografía.
Solución muestra (para la valoración de fosfato): Nominalmente 12 µg/ml de fosfato en hidróxido de sodio 1 mM re-
cientemente preparado, a menos que se indique algo diferente en la monografía.
Sistema cromatográfico
(Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
Detector: De conductividad con supresión
350 (345) Valoración de Ácido Cítrico/Citrato y Fosfato / Pruebas Químicas USP 40

Columnas
Guarda columna: 4 mm x 5 cm; relleno L61 de 13 µm
Columna analítica: 4 mm x 25 cm; relleno L61 de 13 µm
Temperaturas
Columna: 30º
Detector: 35º
Supresor: Membrana autosupresora de aniones de 4 mm o un sistema de supresión química adecuado
Velocidad de flujo: 2 ml/min
Volumen de inyección: 1 O µL
Aptitud del sistema
Muestras: Solución estándar 7 y/o Solución estándar 2, según corresponda.
[NOTA-Los tiempos de retención relativos para fosfato y citrato son 0,57 y 1,0, respectivamente.]
Requisitos de aptitud
Factor de asimetría: No más de 2,0 para los picos de citrato y/o fosfato, según corresponda.
Desviación estándar relativa: No más de 1,5% para los picos de citrato y/o fosfato, en seis inyecciones repetidas, se-
gún corresponda.
Análisis
Muestras: Solución estándar 7 y/o Solución estándar 2, y Solución muestra
A menos que se indique algo diferente en la monografía, calcular la concentración de citrato o fosfato en la porción de
Solución muestra tomada:
Resultado= (ruf r5) x ( 5
ru = respuesta del pico de citrato o fosfato de la Solución muestra
r5 = respuesta del pico de citrato o fosfato de la Solución estándar 7 o la Solución estándar 2
C5 = concentración de citrato o fosfato en la Solución estándar 7 o la Solución estándar 2 (µg/ml)

(351) VALORACIÓN DE ESTEROi DES

El siguiente procedimiento se aplica para determinar los esteroides Farmacopeicos que poseen grupos funcionales reductores
tales como a-cetoles.

PREPARACIÓN ESTÁNDAR

Disolver en alcohol una cantidad adecuada del Estándar de Referencia USP especificado en la monografía individual, previa-
mente secado en las condiciones especificadas en la monografía individual y pesado con exactitud, y diluir cuantitativamente y
en diluciones sucesivas con alcohol para obtener una solución con una concentración de aproximadamente 1 O µg por ml.
Pipetear 20 ml de esta solución y transferir a un matraz Erlenmeyer de 50 ml con tapón de vidrio.

PREPARACIÓN DE VALORACIÓN

Preparar según se indica en la monografía individual.

PROCEDIMIENTO

A sendos matraces que contienen la Preparación de Valoración y la Preparación Estándar, respectivamente, y a un matraz simi-
lar que contenga 20,0 ml de alcohol como blanco, agregar 2,0 ml de una solución preparada por disolución de 50 mg de
azul de tetrazolio en 1O ml de metanol y mezclar. Agregar después a cada matraz 2,0 ml de una mezcla de alcohol e hidróxi-
do de tetrametilamonio SR (9:1 ), mezclar y dejar en reposo en la oscuridad durante 90 minutos. Sin demora, determinar al
mismo tiempo las absorbancias de las soluciones de la Preparación de Valoración y la Preparación Estándar aproximadamente a
525 nm, utilizando un espectrofotómetro adecuado, contra el blanco. Calcular el resultado por la fórmula dada en la mono-
grafía individual, en donde Ces la concentración, en µg por ml, del Estándar de Referencia en la Preparación Estándar; y Au y
A5 son las absorbancias de las soluciones de la Preparación de Valoración y la Preparación Estándar, respectivamente.
 USP40 Pruebas Químicas/ (371) Valoración de Cobalamina con Marcador Radioactivo 351

(371) VALORACIÓN DE COBALAMINA CON MARCADOR

RADIOACTIVO

Todas las determinaciones de radioactividad requeridas por este método deben hacerse con un equipo de conteo apropia-
do, durante un período de tiempo que sea óptimo de acuerdo con el equipo de conteo específico empleado. Todos los proce-
dimientos deben realizarse varias veces para obtener la mayor exactitud posible.

ESTÁNDARES DE REFERENCIA USP (11)

ER Cianocobalamina USP.

REACTIVO MARCADOR DE CIANOCOBALAMINA

Diluir con agua un volumen medido con exactitud de una solución de cianocobalamina radioactiva* para producir una solu-
ción que tenga una radioactividad entre 500 y 5000 conteos por minuto por ml. Agregar 1 gota de cresol por litro de solución
preparada y almacenar en un refrigerador.
Estandarización-Preparar en agua una solución de una cantidad de ER Cianocobalamina USP, pesada con exactitud, que
contenga 20 µg a 50 µg por ml. Realizar la valoración entera de una porción de 10,0 ml de esta solución, procediendo según
se indica en la Preparación de Valoración, comenzando donde dice "Agregar agua para obtener un volumen medido".

SOLUCIÓN DE CRESOL-TETRACLORURO DE CARBONO

Mezclar volúmenes iguales de tetracloruro de carbono y cresol recientemente destilado.

SOLUCIÓN DE FOSFATO-CIANURO

Disolver 100 mg de cianuro de potasio en 1000 ml de una solución saturada de fosfato dibásico de sodio y mezclar.

SOLUCIÓN DE BUTANOL-CLORURO DE BENZALCONIO

Diluir una solución de cloruro de benzalconio (17 en 100) con agua (3:1) y mezclar con 36 volúmenes de alcohol butílico.

COLUMNA DE ALÚMINA-RESINA

Colocar un trozo de lana de vidrio en el fondo de un tubo de vidrio que posea una constricción en uno de sus extremos,
como por ejemplo una bureta de 50 ml. Sosteniendo el tubo en posición vertical, agregar un volumen de una suspensión
acuosa espesa de resina de intercambio iónico (ver en la sección Reactivos, Indicadores y Soluciones), suficiente para obtener
una columna de resina sedimentada de 7 cm de alto. Cuando el sólido se haya sedimentado parcialmente, dejar que el agua
drene, de manera que quede sólo 1 cm de líquido encima de la columna de resina y comprimir la resina suavemente. Luego
agregar una suspensión acuosa espesa de alúmina anhidra (que no esté lavada con ácido) suficiente para aumentar la altura de
la columna sedimentada a 1O cm; dejar que drene el agua hasta que quede aproximadamente a 1 cm por encima de la alúmi-
na. Agregar un trozo de lana de vidrio y lavar la columna, empleando un total de 50 ml de agua y drenar nuevamente hasta
un nivel de 1 cm por encima de la columna. Preparar una columna nueva para cada determinación.

PREPARACIÓN DE VALORACIÓN

Transferir a un vaso de precipitados una cantidad pesada o un volumen medido de la preparación a valorar, con una activi-
dad de vitamina B12 equivalente a la de 200 µg a 500 µg de cianocobalamina. Agregar agua para obtener un volumen medido
de no menos de 25 ml; luego agregar 5,0 ml de Reactivo Marcador de Cianocobalamina. Trabajando bajo una campana, agre-
gar 5 mg de nitrito de sodio y 2 mg de cianuro de potasio por cada ml de la solución resultante. Ajustar la solución con ácido
clorhídrico diluido hasta pH 4 aproximadamente y calentar en baño de vapor durante 15 minutos. Enfriar y ajustar la solución
con hidróxido de sodio 1 N hasta un pH entre 7,6 y 8,0. Centrifugar o filtrar para eliminar cualquier sólido no disuelto.

* Una solución de cianocobalamina, transformada en radioactiva mediante la incorporación de 60 co, está disponible de Merck and Co., lnc., Rahway, N) 07065.
352 (371) Valoración de Cobalamina con Marcador Radioactivo/ Pruebas Químicas USP 40

PROCEDIMIENTO
Transferir la Preparación de Valoración a un frasco de centrífuga de 250 mL, agregar 1O mL de Solución de Cresol-Tetracloruro
de Carbono, cerrar adecuadamente el frasco con un tapón de vidrio, de polietileno o de goma envuelto en papel de aluminio,
agitar vigorosamente durante 2 a 5 minutos y centrifugar. Retirar y guardar la capa de disolvente inferior. Repetir la extracción
empleando una porción de 5 mL de Solución de Cresol-Tetracloruro de Carbono y combinar los extractos de las capas de disol-
vente inferiores en un frasco de centrífuga o separador de 50 mL a 100 mL de capacidad.
Lavar los extractos combinados con porciones sucesivas de 1O mL de ácido sulfúrico 5 N hasta que el último lavado sea prác-
ticamente incoloro (dos lavados bastan generalmente). Durante cada lavado, agitar durante 2 a 5 minutos, dejar que las capas
se separen, centrifugar si fuera necesario y descartar la capa ácida. Lavar luego con dos porciones sucesivas de 1O mL de Solu-
ción de Fosfato-Cianuro. Finalmente, lavar con 1O mL de agua. Descartar todos los lavados.
Al extracto lavado agregarle 30 mL de una mezcla de Solución de Butanol-Cloruro de Benzalconio y tetracloruro de carbono
(2:1 ). Extraer con dos porciones de agua de 5 mL cada una, agitando vigorosamente cada vez durante 1 minuto, centrifugar,
retirar y guardar la capa superior acuosa.
Pasar los extractos acuosos combinados a través de la Columna de Alúmina-Resina a una velocidad de aproximadamente 1
mL por minuto, mantener una capa de 1 cm de líquido sobre la parte superior de la columna, agregando agua según sea
necesario. Descartar los primeros mL incoloros (generalmente alrededor de 5 mL) y recoger el eluato coloreado (generalmente
alrededor de 1O mL) en un tubo de centrífuga o separador de 50 mL que contenga 500 µL de ácido acético diluido. Extraer el
eluato agitando durante 2 a 5 minutos con 5 mL de Solución de Cresol-Tetracloruro de Carbono y desechar la capa acuosa supe-
rior. Agregar al extracto 5,0 mL de agua, 5 mL de tetracloruro de carbono y 1O mL de alcohol butílico. Agitar, dejar que se
separe hasta que la capa superior esté transparente y retirar la capa superior acuosa.
Determinar las absorbancias del extracto acuoso en una celda de 1 cm, a 361 nm y 550 nm, con un espectrofotómetro
apropiado, empleando una fuente de iluminación de tungsteno. Hacer la lectura a 361 nm empleando un filtro capaz de redu-
cir la luz dispersada. Calcular el cociente A 361 /A 550 : la pureza del extracto acuoso es aceptable si el cociente es entre 3, 1O y
3,40. Si se observa un cociente fuera de este intervalo, purificar el extracto acuoso repitiendo el ciclo de extracción, procedien-
do según se indica en el párrafo anterior.
Si se observa un cociente de absorbancia aceptable en el extracto acuoso, determinar la radioactividad, en conteos por mi-
nuto, empleando un equipo de conteo apropiado durante un período de tiempo óptimo de acuerdo al equipo de conteo es-
pecífico empleado. Promediar los resultados y corregir el promedio por la radioactividad de fondo observada durante dos o
más períodos de 30 minutos.

CÁLCULOS
Calcular el contenido de cobalamina, expresado en µg de cianocobalamina, de la porción tomada para la valoración, por la
fórmula:

en donde Res la cantidad, en µg, de cianocobalamina en la porción de la solución estándar tomada; C5 y Cu son los valores de
radioactividad promedio corregidos, expresados en conteos por minuto por mL, de la solución estándar y de la solución de
valoración, respectivamente; y Au y A5 son las absorbancias, determinadas a 361 nm, de la solución de valoración y de la solu-
ción estándar, respectivamente.

(381) TAPONES ELASTOMÉRICOS PARA INYECTABLES

INTRODUCCIÓN
Los tapones elastoméricos para los envases usados en los tipos de preparaciones definidas en el capítulo de pruebas genera-
les Medicamentos Inyectables y en Implantes (1 ), están hechos de materiales obtenidos por vulcanización (entrecruzamiento),
polimerización, poliadición, o policondensación de sustancias orgánicas macromoleculares (elastómeros). Las formulaciones de
los tapones contienen elastómeros naturales o sintéticos y aditivos orgánicos e inorgánicos para facilitar o controlar la vulcani-
zación, impartir propiedades físicas y químicas o color, o estabilizar la formulación del tapón.
Este capítulo se refiere a tapones usados para el almacenamiento a largo plazo de preparaciones definidas en el capítulo de
pruebas generales Requisitos de Envasado y Almacenamiento (659), Envasado de Inyectables. Dichos tapones se utilizan general-
mente como parte de un vial, frasco o sistema de envasado de una jeringa prellenada.
Este capítulo se refiere a tapones formulados con sustancias elastoméricas naturales o sintéticas. No concierne a tapones he-
chos de elastómero de silicona; sin embargo, sí se refiere a tapones tratados con silicona (p.ej., Dimeticona, NF). Al efectuar las
USP 40 Pruebas Químicas/ (381) Tapones Elastoméricos para Inyectables 353

pruebas de este capítulo, no es necesario tratar los tapones con silicona, aunque ninguna restricción prohíbe el uso de tapones
sil iconizados.
Este capítulo también se refiere a tapones recubiertos con otros materiales lubricantes (p.ej., materiales unidos química o
mecánicamente al tapón) no destinados a proporcionar una barrera para el elastómero base, y que de hecho no funcionan
como tal. Al efectuar las pruebas, los tapones con recubrimientos lubricantes sin función de barrera deben analizarse en su
estado recubierto.
Los siguientes comentarios se refieren únicamente a los tapones laminados o recubiertos con materiales destinados a propor-
cionar, o que funcionan como, una barrera para el elastómero base (p.ej., recubrimientos de PTFE o laca). No se permite usar
un material de barrera en un tapón que no cumpla con los requisitos farmacopeicos para convertirlo en uno que sí los cumpla.
Por lo tanto, todas las Pruebas Fisicoquímicas conciernen a la fórmula base de dichos tapones, así como sobre el tapón recubier-
to o laminado. Con el fin de obtener los resultados de las Pruebas Fisicoquímicas, éstas deben efectuarse sobre tapones del mis-
mo compuesto elastomérico sin recubrimiento o laminado, así como al tapón recubierto o laminado. Las Pruebas de Funcionali-
dad corresponden y deben efectuarse usando el tapón elastomérico laminado o recubierto. Las Pruebas Biológicas conciernen
tanto al material de laminación o recubrimiento como a la fórmula base. Las Pruebas Biológicas pueden efectuarse sobre el ta-
pón laminado o recubierto, o sobre el material de laminación o recubrimiento y los tapones del mismo compuesto elastoméri-
co sin recubrimiento o laminado. En este último caso, los resultados deben informarse por separado. La fórmula base usada
para las pruebas fisicoquímicas o biológicas, destinada a sustentar la conformidad farmacopeica de un tapón recubierto con
material de barrera, debería ser similar al tapón recubierto correspondiente en cuanto a configuración y tamaño.
Para todas las pruebas de este capítulo, Nefelometría, Turbidimetría y Comparación Visual (855), efectuadas sobre cualquier
tipo de tapón, es importante documentar el tapón en análisis, incluyendo una descripción completa del elastómero y de cual-
quier lubricante, recubrimiento, laminación o tratamiento aplicado.
Este capítulo establece los límites de prueba para los tapones elastoméricos Tipo 1y Tipo 11. Los tapones Tipo 1son usados
generalmente para preparaciones acuosas. Los tapones Tipo 11 son los destinados generalmente a preparaciones no acuosas,
que si bien tienen propiedades optimizadas para usos especiales, es posible que no cumplan con todos los requisitos listados
para los tapones Tipo 1 debido a su configuración física, al material de construcción o a ambos. Si un tapón no cumple con
uno o más de los requisitos de prueba para Tipo 1 pero cumple con los requisitos para Tipo 11, se le asigna una clasificación final
de Tipo 11. Todos los tapones elastoméricos adecuados para usar en preparaciones inyectables deben cumplir con los límites de
prueba para Tipo 1o Tipo 11. Sin embargo, no se pretende que esta especificación sirva como único criterio de evaluación para
la selección de dichos tapones.
El uso de este capítulo resulta apropiado al identificar tapones elastoméricos que pueden ser aceptables para usar en prepa-
raciones inyectables basándose en su reactividad biológica, las propiedades fisicoquímicas de su extracto acuoso y su funciona-
lidad.
Los siguientes requisitos para la evaluación de los tapones están fuera del alcance de este capítulo:
- El establecimiento de pruebas y especificaciones para la identificación de tapones
- La verificación de la compatibilidad fisicoquímica entre el tapón y el producto
- La identificación y determinación de seguridad de los lixiviados de los tapones que se encuentran en el producto envasa-
do
- La verificación de la funcionalidad del tapón del producto envasado bajo condiciones reales de almacenamiento y uso
El fabricante del producto inyectable (el usuario final) debe obtener del proveedor del tapón la garantía de que la composi-
ción del tapón no varía y que es igual a la del tapón usado durante las pruebas de compatibilidad. Cuando el proveedor infor-
ma al usuario final de cambios en la composición, se deben repetir las pruebas de compatibilidad, total o parcialmente, depen-
diendo de la naturaleza de los cambios. Los tapones deben almacenarse apropiadamente, limpiarse para remover los contami-
nantes ambientales y las endotoxinas, y para procesos asépticos, esterilizarse antes de usar en el envasado de productos inyec-
tables.

CARACTERÍSTICAS

Los tapones elastoméricos son translúcidos u opacos y no tienen un color característico; éste depende de los aditivos usados.
Son homogéneos y prácticamente libres de rebabas y materiales adventicios (p.ej., fibras, partículas extrañas y residuos de go-
ma).

IDENTIFICACIÓN

Los tapones se hacen de una gran variedad de materiales elastoméricos y recubrimientos poliméricos opcionales. Por esta
razón, está más allá del propósito de este capítulo especificar pruebas de identificación que abarquen todas las posibles presen-
taciones de los tapones. Sin embargo, es responsabilidad del proveedor del tapón y del fabricante del producto inyectable (el
usuario final) verificar la formulación elastomérica del tapón y cualquier recubrimiento o material laminado usado, de acuerdo
con las pruebas de identificación apropiadas. Ejemplos de algunas de las metodologías analíticas de prueba que se pueden
usar incluyen peso específico, análisis del porcentaje de cenizas, determinación del contenido de azufre, prueba FTIR-ATR, cro-
matografía en capa delgada de un extracto, espectrofotometría de absorción UV de un extracto o espectrofotometría de ab-
sorción IR de un pirolisado.
354 (381) Tapones Elastoméricos para Inyectables/ Pruebas Químicas USP 40

PROCEDIMIENTOS DE PRUEBA

Los tapones elastoméricos deben ajustarse a los requisitos biológicos, fisicoquímicos y de funcionalidad, tanto cuando son
enviados por el proveedor de tapones al fabricante del producto inyectable (el usuario final) como cuando el usuario final los
pone en su estado definitivo, listos para usar.
Para aquellos tapones elastoméricos procesados por el proveedor antes de la distribución al usuario final, el proveedor debe-
rá demostrar el cumplimiento con los requisitos farmacopeicos de los tapones expuestos a dichos pasos de procesamiento y/o
esterilización. De igual manera, si los tapones elastoméricos recibidos por el usuario final son posteriormente procesados o es-
terilizados, el usuario final es responsable de demostrar que los tapones siguen cumpliendo con los requisitos farmacopeicos
después de dichas condiciones de procesamiento y/o esterilización (es decir, en su estado listo para usar). Esto es especialmen-
te importante si los tapones se deben exponer a procesos o condiciones que podrían impactar significativamente las caracterís-
ticas biológicas, fisicoquímicas o de funcionalidad del tapón (p.ej., radiación gamma).
Para tapones que normalmente se lubrican con silicona antes de usar, está permitido efectuar las pruebas fisicoquímicas en
los tapones no lubricados con el fin de evitar una posible interferencia del método y/o dificultades en la interpretación de los
resultados de la prueba. Para tapones suministrados con otros recubrimientos lubricantes sin función de barrera, todas las
pruebas se deben efectuar usando el tapón recubierto.
Para tapones recubiertos o laminados con recubrimientos destinados a proveer una barrera (p.ej., recubrimientos de PTFE o
laca), las pruebas farmacopeicas fisicoquímicas se aplican al elastómero base no recubierto, así como al tapón recubierto. En
este caso, los proveedores son responsables de demostrar el cumplimiento con los requisitos fisicoquímicos farmacopeicos tan-
to del tapón recubierto como del no recubierto, procesado o tratado de forma tal que se simulen las condiciones usadas para
los tapones recubiertos antes del envío al usuario final. El tapón no recubierto sujeto a las pruebas fisicoquímicas debería ser
similar en tamaño y configuración al tapón recubierto correspondiente. Los usuarios finales de los tapones recubiertos son res-
ponsables también de demostrar el continuo cumplimiento con los requisitos fisicoquímicos farmacopeicos del tapón recubier-
to, procesado o tratado en una forma que simule las condiciones típicas empleadas por el usuario final previo al uso.
En todos los casos, al informar los resultados de las pruebas es apropiado documentar todas las condiciones del procesa-
miento, pretratamiento, esterilización o lubricación de los tapones.
La Tabla 7 resume los requisitos de prueba de los tapones y las responsabilidades del proveedor y del usuario final.
Tabla 1
Tipos de Tapones (Tal como Requisitos de Prueba
se Suministran o Utilizan) Pruebas Fisicoquímlcas Pruebas de Funcionalidad Pruebas Biológicas
Tapón con o sin • Estas pruebas son obligatorias. • Estas pruebas son obligatorias. • Estas pruebas son obligatorias.
Recubrimiento de Silicona
• El uso de silicona es opcional. • El uso de silicona es opcional. • El uso de silicona es opcional.
• Responsibilidad: proveedor y • Responsibilidad: proveedor y usua- • Responsibilidad: proveedor y
usuario final. rio final. usuario final.
Tapones con Recubrimiento • Estas pruebas se deben • Estas pruebas se deben realizar so- • Estas pruebas se deben realizar so-
Lubricante (Material realizar sobre el tapón recubier- bre el tapón recubierto. bre el tapón recubierto.
Sin Función de Barrera; Diferen- to.
• Responsibilidad: proveedor y usua- • Responsibilidad: proveedor y
te de Silicona)
• Responsibilidad: proveedor y rio final. usuario final.
usuario final.
Tapones con Recubrimiento • Estas pruebas se deben realizar • Estas pruebas se deben realizar so- • Estas pruebas se deben realizar so-
de Barrera sobre los tapones recubiertos. bre los tapones recubiertos. bre los tapones recubiertos.
• Responsibilidad: proveedor y • Responsibilidad: proveedor y usua- O:
usuario final. rio final.
Y: • Estas pruebas se deben realizar so-
bre los tapones sin recubrimiento
• Estas pruebas se deben realizar
sobre los tapones sin recubri- (fórmula base) y al material de la-
minado/recubrimiento (los resulta-
miento (fórmula base).
dos se informan por separado).
• Responsibilidad: proveedor. • Responsibilidad: proveedor y
usuario final.

PRUEBAS BIOLÓGICAS

Se establecen dos etapas de pruebas. La primera etapa es la realización de un procedimiento de prueba in vitro según se
describe en el capítulo de pruebas generales Pruebas de Reactividad Biológica, In Vitro (87). Los materiales que no cumplen con
los requisitos de la prueba in vitro están sujetos a la segunda etapa de pruebas, que es la realización de pruebas in vivo, Prueba
de Inyección Sistémica y Prueba lntracutánea, según los procedimientos presentados en el capítulo de pruebas generales Pruebas
de Reactividad Biológica, In Vivo (88). Los materiales que cumplen con los requisitos de las pruebas in vitro no necesitan some-
terse a pruebas in vivo.
USP 40 Pruebas Químicas/ (381) Tapones Elastoméricos para Inyectables 355

Los tapones Tipo 1 y Tipo 11 deben cumplir con los requisitos de las pruebas de reactividad biológica in vitro o in vivo.
[NOTA-Ver también el capítulo de información general Biocompatibilidad de los Materiales Usados en Envases de Medicamentos,
Dispositivos Médicos e Implantes (1031 ).]

PRUEBAS FISICOQUÍMICAS

Preparación de la Solución S

Colocar dentro de un recipiente de vidrio adecuado, tapones enteros, sin cortar, que equivalgan a un área superficial de
100 ± 1 O cm 2 • Cubrir los tapones con 200 mL de Agua Purificada o Agua para Inyección. Si no es posible conseguir el área
superficial de tapón prescrita (100 ± 1O cm2) usando tapones sin cortar, seleccionar el número de tapones que se aproximen
mejor a los 100 cm 2, y ajustar el volumen de agua usado al equivalente de 2 mL por cada 1 cm 2 de área superficial real de
tapón utilizada. Calentar a ebullición durante 5 minutos y enjuagar cinco veces con Agua Purificada o Agua para Inyección.
Colocar los tapones lavados en un matraz Erlenmeyer de vidrio Tipo 1 con cuello ancho (ver Envases-Vidrio (660)), agregar
la misma cantidad de Agua Purificada o Agua para Inyección agregada inicialmente a los tapones, y pesar. Cubrir la boca del
matraz con un vaso de precipitados de vidrio Tipo l. Calentar en un autoclave hasta alcanzar una temperatura de 121 ± 2º den-
tro de 20 a 30 minutos y mantenerla durante 30 minutos. Enfriar a temperatura ambiente durante un periodo de aproximada-
mente 30 minutos. Agregar Agua Purificada o Agua para Inyección para completar de nuevo la masa original. Agitar e inme-
diatamente decantar y recoger la solución. [NOTA-Esta solución se debe agitar antes de usarse en cada una de las pruebas.]

Preparación del Blanco

Preparar una solución blanco en forma similar, usando 200 mL de Agua Purificada o de Agua para Inyección, pero omitien-
do los tapones.

APARIENCIA DE LA SOLUCIÓN (TURBIDEZ/OPALESCENCIA Y COLOR)

Determinación de Turbidez (Opalescencia)

[NOTA-La determinación de turbidez se puede efectuar por comparación visual (Procedimiento A), o instrumentalmente, con
un turbidímetro de relación adecuado (Procedimiento 8). Para mayor información sobre turbidimetría, ver Nefelometría, Turbidi-
metría y Comparación Visual (855). La evaluación instrumental de transparencia constituye una prueba más sensible que no de-
pende de la agudeza visual del analista.]
Solución de Sulfato de Hidrazina-Disolver 1,0 g de sulfato de hidrazina en agua y diluir con agua hasta 100,0 ml. Dejar en
reposo durante 4 a 6 horas.
Solución de Hexametilentetramina-Disolver 2,5 g de hexametilentetramina en 25,0 mL de agua en un matraz Erlenmeyer
de vidrio tapado de 100 mL.
Suspensión Madre de Opalescencia-Agregar 25,0 mL de Solución de Sulfato de Hidrazina a la Solución de Hexametilentetrami-
na en el matraz. Mezclar y dejar en reposo durante 24 horas. Esta suspensión es estable durante un período de 2 meses, siem-
pre y cuando se almacene en un envase de vidrio sin defectos en su superficie. La suspensión no debe adherirse al vidrio y
debe mezclarse bien antes de usar.
Suspensión del Estándar de Opalescencia-Preparar una suspensión diluyendo 15,0 mL de la Suspensión Madre de Opalescen-
cia con agua hasta 1000,0 ml. La Suspensión del Estándar de Opalescencia es estable durante aproximadamente 24 horas des-
pués de la preparación.
Suspensiones de Referencia-Preparar de acuerdo con la Tabla 2. Mezclar y agitar antes de usar. [NOTA-Las suspensiones de
formacina estabilizada que se pueden usar para preparar estándares de turbidez estables y diluidos, están disponibles comer-
cialmente y se pueden usar después de la comparación con los estándares preparados como se ha descrito.]
Tabla 2
Suspensión de Referen- Suspensión de Referen- Suspensión de Referen- Suspensión de Referen-
cla A cia B cia e cia D
Estándar de Opalescencia 5,0 ml 10,0 ml 30,0 ml 50,0 ml
Agua 95,0 ml 90,0 ml 70,0 ml 50,0 ml
Unidades de Turbidez Nefe- 3 NTU 6 NTU 18 NTU 30 NTU
lo métrica

Procedimiento A: Comparación Visual-Usar tubos de prueba idénticos, de vidrio neutro, incoloro y transparente con base
plana y un diámetro interno de 15 a 25 mm. Llenar un tubo hasta una altura de líquido de 40 mm con Solución S, un tubo
hasta la misma altura con agua, y cuatro tubos más hasta la misma altura con Suspensiones de Referencia A, B, Cy D. Comparar
las soluciones bajo luz diurna difusa 5 minutos después de la preparación de las Suspensiones de Referencia, observándolas verti-
calmente contra un fondo negro. Las condiciones de luz deben ser tales que la Suspensión de Referencia A puede distinguirse
fácilmente del agua y la Suspensión de Referencia B puede distinguirse fácilmente de la Suspensión de Referencia A.
356 (381) Tapones Elastoméricos para Inyectables/ Pruebas Químicas USP 40

Requisito-La Solución S no es más opalescente que la Suspensión de Referencia B para tapones Tipo 1y no más opalescente
que la Suspensión de Referencia C para tapones Tipo 11. La Solución S se considera transparente si su transparencia es igual que la
del agua cuando se examina según se describió anteriormente o si su opalescencia no es más pronunciada que la de Suspen-
sión de Referencia A (ver la Tabla 3).
Procedimiento B: Comparación Instrumental-Medir la turbidez de las Suspensiones de Referencia en un turbidímetro calibrado
adecuado (ver (855)). Medir el blanco y corregir los resultados por el blanco. Las Suspensiones de Referencia A, B, Cy O repre-
sentan 3, 6, 18 y 30 Unidades de Turbidez Nefelométrica (NTU, por sus siglas en inglés), respectivamente. Medir la turbidez
de la Solución S con el turbidímetro calibrado.
Requisito-La turbidez de la Solución S no es mayor que la de la Suspensión de Referencia B (6 NTU FTU) para tapones Tipo 1 y
no es mayor que la de la Suspensión de Referencia C (18 NTU FTU) para tapones Tipo 11 (ver la Tabla 3).
Tabla 3
Método de Comparación
Requisitos de Procedimiento A Procedimiento B
Opalescencia (Visual) (Instrumental)
Tapones Tipo 1 No más opalescente que la Suspensión B No más de 6 NTU
Tapones Tipo 11 No más opalescente que la Suspensión C No más de 18 NTU

Determinación de Color
Estándar de Color-Preparar una solución diluyendo 3,0 mL de Líquido de Comparación O (ver Color y Acromatismo (631 ))
con 97,0 mL de ácido clorhídrico diluido.
Procedimiento-Usar tubos idénticos de vidrio neutro, incoloro y transparente con base plana y un diámetro interno de 15 a
25 mm. Llenar un tubo hasta una altura de líquido de 40 mm con Solución S y el segundo con Estándar de Color. Comparar los
líquidos bajo luz diurna difusa, observándolos verticalmente contra un fondo blanco.
Requisito-La Solución S no está más intensamente coloreada que el Estándar de Color.

Acidez o Alcalinidad

Solución de Azul de Bromotimol-Disolver 50 mg de azul de bromotimol en una mezcla de 4 mL de hidróxido de sodio 0,02
M y 20 mL de alcohol. Diluir con agua hasta 100 mL.
Procedimiento-A 20 mL de Solución S, agregar O, 1 mL de Solución de Azul de Bromotimol. Si la solución es amarilla, valorar
con hidróxido de sodio 0,01 N hasta alcanzar un punto final azul. Si la solución es azul, valorar con ácido clorhídrico 0,01 N
hasta alcanzar un punto final amarillo. Si la solución es verde, es neutra y no se requiere una valoración.
Corrección del Blanco-Probar 20 mL de Blanco de manera similar. Corregir los resultados obtenidos para la Solución S, sus-
trayendo o agregando el volumen de la solución volumétrica requerida para el Blanco según sea apropiado. (Ver Volumetría
(541 ).)
Requisito-No más de 0,3 mL de hidróxido de sodio 0,01 N producen un color azul, o no más de 0,8 mL de ácido clorhídri-
co 0,01 N producen un color amarillo o no se requiere una valoración.

Absorbancia

Procedimiento-[NOTA-Efectuar esta prueba dentro de las 5 horas de la preparación de la Solución S.] Pasar la Solución S a
través de un filtro con tamaño de poro 0,45 µm, desechando los primeros mL de filtrado. Medir la absorbancia del filtrado a
una longitud de onda entre 220 y 360 nm en una celda de 1 cm, usando el blanco en una celda pareada en el haz de referen-
cia. Si se requiere diluir el filtrado antes de medir la absorbancia, corregir los resultados de la prueba por la dilución.
Requisito-Las absorbancias a estas longitudes de onda no exceden de 0,2 para tapones Tipo 1o 4,0 para tapones Tipo 11.

Sustancias Reductoras

Procedimiento-[NOTA-Efectuar esta prueba dentro de las 4 horas de la preparación de la Solución S.] A 20,0 mL de Solución
S, agregar 1 mL de ácido sulfúrico diluido y 20,0 mL de permanganato de potasio 0,002 M. Calentar a ebullición durante 3
minutos. Enfriar, agregar 1 g de yoduro de potasio, y valorar de inmediato con tiosulfato de sodio 0,01 M, usando 0,25 mL de
solución de almidón SR como indicador. Efectuar una valoración usando 20,0 mL de blanco y anotar la diferencia en volumen
de tiosulfato de sodio 0,01 M requerido.
Requisito-La diferencia entre los volúmenes de las valoraciones no es mayor de 3,0 mL para tapones Tipo 1 y no es mayor
de 7,0 mL para tapones Tipo 11.

Metales Pesados

Procedimiento-Proceder según se indica en Método 7 en Metales Pesados (231 ). Preparar la Preparación de Prueba usando
10,0 mL de Solución S.
USP 40 Pruebas Químicas/ (381) Tapones Elastoméricos para Inyectables 357

Requisito-La Solución S contiene no más de 2 ppm de metales pesados como plomo.

Cinc Extraíble

Solución de Prueba-Preparar una Solución de Prueba diluyendo 10,0 mL de Solución S con ácido clorhídrico O, l N hasta 100
ml. Preparar un blanco de prueba de forma similar, usando el Blanco en lugar de la Solución S.
Solución Estándar de Cinc-Preparar una solución (1 O ppm de Zn) disolviendo sulfato de cinc en ácido clorhídrico O, 1 N.
Soluciones de Referencia-Preparar no menos de tres Soluciones de Referencia, diluyendo la Solución Estándar de Cinc con áci-
do clorhídrico O, l N. Las concentraciones de cinc en estas Soluciones de Referencia deben abarcar el límite esperado para la
Solución de Prueba.
Procedimiento-Usar un espectrofotómetro de absorción atómica apropiado (ver Espectroscopía de Absorción Atómica (852))
equipado con una lámpara de cinc de cátodo hueco y una llama de aire-acetileno. Se puede usar un procedimiento alterno tal
como un análisis de plasma inductivamente acoplado (ICP, por sus siglas en inglés) apropiadamente validado.
Probar cada una de las Soluciones de Referencia en la línea de emisión de cinc a 213,9 nm por lo menos tres veces. Registrar
las lecturas estables. Enjuagar el aparato con la solución del blanco de prueba cada vez, para garantizar que la lectura retorna
al valor inicial del blanco. Preparar una curva de calibración a partir de la media de las lecturas obtenidas para cada Solución de
Referencia. Registrar la absorbancia de la Solución de Prueba. Determinar la concentración de cinc en ppm de la Solución de
Prueba usando la curva de calibración.
Requisito-La Solución S contiene no más de 5 ppm de cinc extraíble.

Amonio

Solución de Tetrayodomercuriato de Potasio Alcalina-Preparar una solución de 100 mL que contenga 11 g de yoduro de po-
tasio y 15 g de yoduro mercúrico en agua. Inmediatamente antes de usar, mezclar 1 volumen de esta solución con un volu-
men igual de una solución de hidróxido de sodio de 250 g por L.
Solución de Prueba-Diluir 5 mL de Solución S con agua hasta 14 ml. Alcalinizarla, si fuera necesario, agregando hidróxido
de sodio 1 N y diluir hasta 15 mL con agua. Agregar 0,3 mL de Solución de Tetrayodomercuriato de Potasio Alcalina y cerrar el
recipiente.
Solución Estándar de Amonio-Preparar una solución de cloruro de amonio en agua (1 ppm NH 4 ). Mezclar 1O mL de la solu-
ción de cloruro de amonio de 1 ppm con 5 mL de agua y 0,3 mL de Solución de Tetrayodomercuriato de Potasio Alcalina. Cerrar
el recipiente.
Requisito-Después de 5 minutos, cualquier color amarillo en la Solución de Prueba no es más oscuro que el de la Solución
Estándar de Amonio (no más de 2 ppm de NH 4 en la Solución S).

Sulfuros Volátiles

Procedimiento-Colocar tapones, cortados si fuera necesario, con un área superficial total de 20 ± 2 cm 2 en un matraz de
100 mL y agregar 50 mL de una solución de ácido cítrico de 20 g por L. De la misma manera y en forma simultánea, preparar
una solución de control en otro matraz de 100 mL, disolviendo O, 154 mg de sulfuro de sodio en 50 mL de una solución de
ácido cítrico de 20 g por L. Colocar un trozo de papel de acetato de plomo sobre la boca de cada matraz y asegurarlo en
posición, poniendo sobre él un frasco para pesada invertido. Calentar los matraces en un autoclave a 121 ± 2º durante 30 mi-
nutos.
Requisito-Cualquier mancha negra en el papel, producida por la solución de prueba, no es más intensa que la producida
por la solución de control.

PRUEBAS DE FUNCIONALIDAD

[NOTA-Las muestras tratadas según se describió para la preparación de la Solución S y secadas al aire, se deben usar para las
Pruebas de Funcionalidad de Penetrabilidad, Fragmentación y Capacidad de Autosellado. Las Pruebas de Funcionalidad se efectúan
en tapones destinados a ser perforados por una aguja hipodérmica. La prueba de Capacidad de Autosel/ado se requiere sólo
para tapones destinados a envases multidosis. La aguja especificada para cada prueba es una aguja hipodérmica lubricada de
bisel largo (ángulo de bisel: 12 ± 2º)1.]

Penetrabilidad

Procedimiento-Llenar con agua 1O viales adecuados hasta el volumen nominal, colocar los tapones a examinar y asegurar
con una tapa. Usando una aguja hipodérmica nueva, según se describió anteriormente, para cada tapón, perforar el tapón con
la aguja perpendicular a la superficie.

1 Consultar ISO 7864, Agujas hipodérmicas estériles para único uso con un diámetro externo de 0,8 mm (Calibre 21 ).
358 (381) Tapones Elastoméricos para Inyectables / Pruebas Químicas USP 40

Requisito-La fuerza de la perforación no es mayor que 1O N (1 kgf) para cada tapón, determinada con una exactitud de ±
0,25 N (25 gf).

Fragmentación

Tapones para Preparaciones Líquidas-Llenar con agua 12 viales limpios hasta 4 mL menos de la capacidad nominal. Colocar
los tapones a examinar, asegurarlos con una tapa y dejar en reposo durante 16 horas.
Tapones para Preparaciones Secas--Colocar los tapones a examinar en 12 viales limpios y asegurar cada uno con una tapa.
Procedimiento-Usando una aguja hipodérmica según se describió anteriormente, colocada en una jeringa limpia, inyectar
dentro de cada vial 1 mL de agua mientras se retira 1 mL de aire. Repetir este procedimiento cuatro veces para cada tapón,
perforando cada vez en un sitio diferente. Usar una aguja nueva para cada tapón, verificando que no se vuelva roma durante la
prueba. Filtrar el volumen total de líquido en todos los viales a través de un único filtro con un tamaño de poro nominal no
mayor que 0,5 µm. Contar los fragmentos de caucho que se puedan ver a simple vista en la superficie del filtro.
Requisito-No hay más de cinco fragmentos visibles. Este límite se basa en la suposición de que los fragmentos con un diá-
metro >50 µm se pueden ver a simple vista. En caso de duda o controversia, examinar las partículas microscópicamente para
verificar su naturaleza y tamaño.

Capacidad de Autosellado

Procedimiento-Llenar 1O viales adecuados con agua hasta el volumen nominal. Colocar los tapones a examinar y tapar.
Usando una jeringa hipodérmica nueva para cada tapón, según se describió anteriormente, perforar cada tapón 1O veces en
un sitio diferente cada vez. Sumergir los 1 O viales en una solución de azul de metileno al O, 1% (1 g por L) y reducir la presión
externa en 27 kPa durante 1O minutos. Restablecer la presión atmosférica y dejar los viales sumergidos durante 30 minutos.
Enjuagar el exterior de los viales.
Requisito-Ninguno de los viales contiene vestigios de solución azul.

(391) VALORACIÓN DE EPINEFRINA

VALORACIÓN
Solución ferro-cítrica: El día en que se va a utilizar, disolver 1,5 g de sulfato ferroso en 200 mL de agua, a los que se ha
agregado 1,0 mL de ácido clorhídrico diluido (1 en 12) y 1,0 g de bisulfito de sodio. Disolver 500 mg de citrato de sodio en
1O mL de esta solución y mezclar.
Solución amortiguadora: En un matraz volumétrico de 50 mL, mezclar 4,2 g de bicarbonato de sodio, 5,0 g de bicarbo-
nato de potasio y 18 mL de agua (no todos los sólidos se disolverán en esta etapa). A otros 18 mL de agua, agregar 3,75 g
de ácido aminoacético y 1, 7 mL de hidróxido de amonio 6 N; mezclar para disolver y transferir esta solución al matraz volu-
métrico de 50 mL que contiene la otra mezcla. Diluir a volumen con agua y mezclar hasta dilución completa.
Preparación estándar: Transferir aproximadamente 18 mg de ER Bitartrato de Epinefrina USP pesados con exactitud, a un
matraz volumétrico de 100 mL con ayuda de 20 mL de solución de bisulfito de sodio (1 en 50), diluir a volumen con agua y
mezclar. Transferir 5,0 mL de esta solución a un matraz volumétrico de 50 mL, diluir a volumen con solución de bisulfito de
sodio (1 en 500) y mezclar. [NOTA-Hacer la dilución final en el momento de llevar a cabo la valoración.] La concentración
de ER Bitartrato de Epinefrina USP en la Preparación Estándar es aproximadamente 18 µg por ml.
Preparación de valoración: Transferir a un matraz volumétrico de 50 mL un volumen medido con exactitud de la Inyec-
ción a valorar, que equivalga aproximadamente a 500 µg de epinefrina, diluir a volumen con solución de bisulfito de sodio
(1 en 500), si fuera necesario, y mezclar. [NOTA-La concentración final de bisulfito de sodio está en el intervalo de 1 a 3 mg
por mL, teniendo en cuenta todo el bisulfito presente en la Inyección a valorar.]
Procedimiento: A tres matraces Erlenmeyer de 50 mL con tapones de vidrio, transferir sendas alícuotas de 20,0 mL de la
Preparación estándar, de la Preparación de valoración y de la solución de bisulfito de sodio (1 en 500) para proporcionar el
blanco. A cada matraz, agregar 200 µL de Solución ferro-cítrica y 2,0 mL de Solución amortiguadora, mezclar y dejar las solu-
ciones en reposo durante 30 minutos. Determinar las absorbancias de las soluciones en celdas de 5 cm a la longitud de onda
de máxima absorción, aproximadamente a 530 nm, con un espectrofotómetro apropiado, utilizando el blanco para ajustar
el instrumento
Calcular la cantidad, en mg, de epinefrina (C 9 H13 N0 3) en cada mL de Inyección, por la fórmula, en donde 183,21 y 333,30
son los pesos moleculares de epinefrina y bitartrato de epinefrina, respectivamente:
Resultado= (183,21 /333,30)(0,05C/\/)(Au/ A5)

C = concentración de ER Bitartrato de Epinefrina USP Preparación estándar (µg/mL)

V =volumen de Inyección tomada (mL)
Au = absorbancia de la Preparación de valoración
USP 40 Pruebas Químicas/ (401) Grasas y Aceites Fijos 359

A5 = absorbancia de la Preparación estándar

REQUISITOS ADICIONALES
• ESTÁNDARES DE REFERENCIA USP (11)
ER Bitartrato de Epinefrina USP

(401) GRASAS Y ACEITES FIJOS

Las siguientes definiciones y procedimientos generales se aplican a grasas, aceites fijos, ceras, resinas, bálsamos y sustancias
similares.
Preparación de la Muestra
Si la muestra de aceite se presenta turbia debido a la presencia de estearina, entibiar el recipiente en un baño de agua a 50º
hasta que el aceite quede transparente; si el aceite no se clarifica al entibiarlo, filtrarlo a través de un papel de filtro seco en
un embudo dentro de una camisa de agua caliente. Mezclar minuciosamente y pesar de una vez tantas porciones como
sean necesarias para las distintas determinaciones, empleando preferiblemente una botella que tenga una pipeta gotero o
una bureta de pesaje. Si la muestra se solidifica a temperatura ambiente, mantenerla fundida hasta que se hayan tomado las
porciones necesarias.
PROCEDIMIENTOS
• PESO ESPECÍFICO
Determinar el peso específico de una grasa o aceite según se indica en Peso Específico (841 ).
• TEMPERATURA DE FUSIÓN
Determinar la temperatura de fusión según se indica para las sustancias de Clase 11 (ver Intervalo o Temperatura de Fusión
(741)).
Índice de Acidez (Ácidos Grasos Libres)
La acidez de las grasas y los aceites fijos en esta farmacopea pueden expresarse como el número de mL de álcali O, 1 N requeri-
do para neutralizar los ácidos libres en 10,0 g de sustancia. La acidez se expresa frecuentemente como el Índice de Acidez,
que es el número de mg de hidróxido de potasio necesario para neutralizar los ácidos libres en 1,0 g de la sustancia. A me-
nos que se indique algo diferente en la monografía individual, usar el Método l.
Método 1
Procedimiento: A menos que se especifique algo diferente, disolver aproximadamente 10,0 g de la sustancia, pesados
con exactitud, en 50 mL de una mezcla de volúmenes iguales de alcohol y éter (que se haya neutralizado a la fenolftaleína
con hidróxido de potasio O, 1 N o hidróxido de sodio O, 1 N, a menos que se especifique algo diferente) contenidos en un
matraz. Si la muestra de prueba no se disuelve en el disolvente frío, conectar el matraz a un condensador adecuado y
entibiar lentamente, agitando con frecuencia, hasta que la muestra se disuelva. Agregar 1 mL de fenolftaleína SR y valorar
con hidróxido de potasio O, 1 N SV o hidróxido de sodio O, 1 N SV hasta que la solución permanezca de color ligeramente
rosado después de agitar durante 30 segundos. Calcular el Índice de Acidez o el volumen de álcali O, 1 N requerido para
neutralizar 10,0 g de muestra (ácidos grasos libres), según corresponda. Calcular el Índice de Acidez:
Resultado= (M, x V) x (N!W)
M, = peso molecular del hidróxido de potasio, 56, 11
V =volumen (mL)
N = normalidad de la solución de hidróxido de potasio o la solución de hidróxido de sodio
W = peso de la muestra tomada (g)
Si el volumen de hidróxido de potasio O, 1 N SV o hidróxido de sodio O, 1 N SV requerido para la volumetría es menos de
2 mL, puede utilizarse una solución volumétrica más diluida o ajustar el tamaño de la muestra de acuerdo con las necesi-
dades. Los resultados pueden expresarse en términos del volumen de solución volumétrica utilizado o en términos del
volumen equivalente de hidróxido de potasio O, 1 N o hidróxido de sodio O, 1 N.
Si se ha saturado el aceite con dióxido de carbono para preservarlo, someter la solución de alcohol-éter a reflujo suave-
mente durante 1O minutos antes de la volumetría. También se puede eliminar el dióxido de carbono del aceite, expo-
niéndolo al vacío durante 24 horas dentro de una cápsula de poca profundidad en un desecador, antes de pesar las
muestras de prueba.
Método 11
Procedimiento: Preparar 125 mL de una mezcla de disolventes que contenga volúmenes iguales de alcohol isopropílico y
tolueno. Antes de su uso, agregar 2 mL de una solución de fenolftaleína al 1% en alcohol isopropílico a la mezla de 125
mL y neutralizar con álcali hasta que se produzca un color rosado leve pero permanente. Pesar con exactitud la cantidad
adecuada de una muestra líquida bien mezclada, indicada en la Tabla 1 y disolverla en la mezcla de disolventes neutraliza-
da. Si la muestra de prueba no se disuelve en el disolvente frío, conectar el matraz a un condensador adecuado y entibiar
lentamente, agitando con frecuencia, hasta que la muestra se disuelva. Agitar vigorosamente mientras se valora con hi-
360 (401) Grasas y Aceites Fijos/ Pruebas Químicas USP 40

dróxido de potasio O, 1 N SV o hidróxido de sodio O, 1 N SV hasta que se produzca el primer color rosado permanente, de
la misma intensidad que la del disolvente neutralizado antes de mezclar con la muestra. Calcular el Índice de Acidez se-
gún se indica en el Método /.
Tabla 1
Índice de Acidez Peso de Muestra (g)
0-1 20
1-4 10
4-15 2,5
15-74,9 0,5
::]5,0 0,1

• ÍNDICE DE ESTERIFICACIÓN
El Índice de Esterificación es el número de mg de hidróxido de potasio necesario para saponificar los ésteres en 1,0 g de la
sustancia. Si se han determinado el Índice de Saponificación y el Índice de Acidez, la diferencia entre éstos dos representa
el Índice de Esterificación, es decir, Índice de Esterificación = Índice de Saponificación - Índice de Acidez.
Procedimiento: Colocar 1,5-2 g de la sustancia, pesados con exactitud, en un matraz tarado de 250 ml, agregar 20-30
ml de alcohol neutralizado y agitar. Agregar 1 ml de fenolftaleína SR y valorar con hidróxido de potasio alcohólico 0,5 N
SV hasta que se neutralice el ácido libre. Agregar 25,0 ml de hidróxido de potasio alcohólico 0,5 N SV y proceder según se
indica en Índice de Saponificación, comenzando donde dice "Calentar el matraz", pero omitiendo la adición posterior de
fenolftaleína SR. Calcular el Índice de Esterificación:

Resultado= [M, x (Va - Vr) x N]/W

M, = peso molecular del hidróxido de potasio, 56, 11

Va =volumen de ácido clorhídrico 0,5 N consumido en la prueba del blanco (ml)
Vr =volumen de ácido clorhídrico 0,5 N consumido en la prueba real (ml)
N = normalidad exacta del ácido clorhídrico
W = peso de la sustancia tomada para la prueba (g)
• ÍNDICE DE HIDROXILO
El Índice de Hidroxilo es el número de mg de hidróxido de potasio equivalente al contenido de hidroxilo de 1,0 g de la
sustancia.
Reactivo de piridina-anhídrido acético: Antes de usar, mezclar 3 volúmenes de piridina recientemente abierta o recién
destilada con 1 volumen de anhídrido acético recién abierto o recién destilado.
Procedimiento: Transferir una cantidad de la sustancia, pesada con exactitud y ajustada a la Tabla 2, a un matraz Erlenme-
yer de 250 ml con tapón de vidrio y agregar 5,0 ml de Reactivo Piridina-Anhídrido Acético. Transferir 5,0 ml de Reactivo
Piridina-Anhídrido Acético a un segundo matraz Erlenmeyer de 250 ml con tapón de vidrio para proporcionar el blanco del
reactivo. Equipar ambos matraces con condensadores de reflujo con juntas de vidrio adecuadas, calentar en un baño de
vapor durante 1 hora, agregar 1O ml de agua a través de cada condensador y calentar en el baño de vapor durante 1O
minutos adicionales. Enfriar y agregar 25 ml de alcohol butílico previamente neutralizado a la fenolftaleína SR con hidróxi-
do de potasio alcohólico 0,5 N a cada matraz, vertiendo 15 ml a través de cada condensador y lavando las paredes de
cada matraz con las porciones de 1O ml restantes después de retirar los condensadores. Agregar 1 ml de fenolftaleína SR a
cada matraz y valorar con hidróxido de potasio alcohólico 0,5 N SV, registrando el volumen, en ml, consumido por el áci-
do residual en la solución de prueba como Ty el consumido por el blanco como B. En un matraz Erlenmeyer de 125 ml,
mezclar aproximadamente 1Og de la sustancia, pesada con exactitud, con 1O ml de piridina recién destilada y previamen-
te neutralizada a la fenolftaleína SR, agregar 1 ml de fenolftaleína SR y valorar con hidróxido de potasio alcohólico 0,5 N
SV, registrando el volumen, en ml, consumido por el ácido libre en la muestra de prueba como A. Calcular el Índice de
Hidroxilo:

Resultado = [(M, x N)!W] x {B + [(W x A)IC] - 7}

M, = peso molecular del hidróxido de potasio, 56, 11

N = normalidad exacta del hidróxido de potasio alcohólico
W = peso de la sustancia tomada para la acetilación (g)
e = peso de la sustancia tomada para la determinación de ácido libre (g)
Si se conoce el Índice de Acidez para la sustancia de prueba, calcular el Índice de Hidroxilo:
Resultado= [(M, x N)!W] x (B - T) + Índice de Acidez

M, = peso molecular del hidróxido de potasio, 56, 11

N = normalidad exacta del hidróxido de potasio alcohólico
W = peso de la sustancia tomada para la acetilación (g)
USP 40 Pruebas Químicas/ (401) Grasas y Aceites Fijos 361

Tabla 2
Intervalo del Índice Peso de la Muestra de Prueba
de Hidroxilo (g)
0-20 10
20-50 5
50-100 3
100-150 2
150-200 1,5
200-250 1,25
250-300 1,0
300-350 0,75

• ÍNDICE DE YODO
El Índice de Yodo representa el número de g de yodo absorbido, en las condiciones prescritas, por 100 g de la sustancia. A
menos que se especifique de otro modo en la monografía individual, determinar el Índice de Yodo mediante el Método l.
Método 1 (Método de Hanus)
Procedimiento: Transferir una cantidad de la muestra pesada con exactitud, según se determina en la Tabla 3, a un ma-
traz para yodo de 250 mL, disolver en 1 O mL de cloroformo, agregar 25,0 mL de yodobromuro SR, tapar el vaso en forma
segura y dejar en reposo durante 30 minutos, protegido de la luz, agitando ocasionalmente. Luego agregar, en este or-
den, 30 mL de yoduro de potasio SR y 100 mL de agua, valorar el yodo liberado con tiosulfato de sodio O, 1 N SV, agitan-
do minuciosamente después de cada adición de tiosulfato. Cuando el color del yodo se torne muy pálido, agregar 3 mL
de almidón SR y continuar la valoración con tiosulfato de sodio O, 1 N SV hasta que el color azul desaparezca. Realizar una
prueba blanco al mismo tiempo con las mismas cantidades de los mismos reactivos y de la misma forma (ver Volumetría
(541 ), Va/oraciones Residuales). Calcular el Índice de Yodo:
Resultado= [A, x (V8 - V5) x N]/(1 O x W)

A, = peso atómico del yodo, 126,90

V8 =volumen de tiosulfato de sodio O, 1 N SV consumido por la prueba del blanco (mL)
V5 =volumen de tiosulfato de sodio O, 1 N SV consumido por la prueba real (mL)
N = normalidad exacta del tiosulfato de sodio SV
W = peso de la sustancia tomada para la prueba (g)
[NOTA-Si la porción de sustancia tomada absorbe más de la mitad del yodobromuro SR, repetir la determinación empleando
una porción más pequeña de la sustancia en análisis.]
Tabla 3. Peso de las Muestras
Índice de Peso (g)
Yodo Esperado ±0,1
<5 3,0
5-20 1,0
21-50 0,4
51-100 0,2
101-150 o, 13
151-200 o, 1
Método 11
Solución de yoduro de potasio: Disolver 10,0 g de yoduro de potasio en agua para obtener 100 mL. Almacenar en reci-
pientes resistentes a la luz.
Solución indicadora de almidón: Mezclar 1 g de almidón soluble con suficiente agua fría para obtener una pasta fina.
Agregar, mezclando, a 100 mL de agua hirviendo. Mezclar y enfriar. Emplear sólo la solución transparente.
Procedimiento: Fundir la muestra si no estuviera líquida todavía. [NOTA-La temperatura durante la fusión debe exceder
el punto de fusión de la muestra en no más de 1 Oº.] Pasar a través de dos trozos de papel de filtro para eliminar cualquier
impureza sólida y los últimos restos de humedad. El filtrado puede realizarse en un horno de aire a 100º pero debe com-
pletarse dentro de los 5 minutos± 30 segundos. La muestra debe estar absolutamente seca. Todo el material de vidrio
debe estar absolutamente limpio y completamente seco. Después del filtrado, dejar que la muestra filtrada alcance una
temperatura de 68º-71 ± 1 ºantes de pesar la muestra. Una vez que la muestra alcance una temperatura de 68º-71 ± 1 º,
pesar inmediatamente la muestra en un matraz para yodo de 500 mL, ajustándose a los pesos y la exactitud de pesada de
la tabla adjunta. [NOTA-El peso de la sustancia debe ser tal que se produzca un exceso de yodocloruro SR de 50-60% de
la cantidad agregada, es decir, del 100-150% de la cantidad absorbida.] Agregar 15 mL de una mezcla recién preparada
de ciclohexano y ácido acético glacial (1 :1) y agitar por rotación suave hasta disolver la muestra. Agregar 25,0 mL de
yodocloruro SR, tapar el matraz de forma segura y agitar por rotación suave para mezclar. Dejar en reposo a 25 ± 5º, pro-
362 (401) Grasas y Aceites Fijos/ Pruebas Químicas USP 40

tegido de la luz, agitando ocasionalmente, durante 1,0 ó 2,0 horas, dependiendo del Índice de Yodo (IV) de la muestra:
IV< 150, 1,0 hora; IV?: 150, 2,0 horas. Luego, dentro de los 3 minutos después del tiempo de reacción indicado, agregar
en este orden, 20 mL de Solución de Yoduro de Potasio y 150 mL de agua recién hervida y enfriada, y mezclar. Dentro de
los 30 minutos, valorar el yodo liberado con tiosulfato de sodio 0, 1 N SV mientras se mezcla mecánicamente después de
cada adición de tiosulfato. Cuando el color amarillo del yodo haya desparecido casi por completo, agregar 1-2 mL de
Solución Indicadora de Almidón y continuar la valoración con tiosulfato de sodio O, 1 N SV hasta que desaparezca el color
azul. Realizar una prueba blanco al mismo tiempo, con las mismas cantidades de los mismos reactivos y de la misma for-
ma (ver Volumetría (541) Valoraciones Residuales). Calcular el Índice de Yodo, según se indica en Método l.
• ÍNDICE DE PERÓXIDO
El Índice de Peróxido es el número que expresa, en miliequivalentes de oxígeno activo, la cantidad de peróxido contenido
en 1000 g de la sustancia. [NOTA-Esta prueba debe realizarse inmediatamente después de tomar la muestra para evitar la
oxidación de la muestra de prueba.]
Procedimiento: A menos que se indique algo diferente, colocar aproximadamente 5 g de la sustancia, pesada con exacti-
tud, en un matraz Erlenmeyer de 250 mL con tapón de vidrio esmerilado. Agregar 30 mL de una mezcla de ácido acético
glacial y cloroformo (3:2), agitar hasta disolver y agregar 0,5 mL de solución de yoduro de potasio saturada. Agitar durante
1 minuto exactamente y agregar 30 mL de agua. Valorar con tiosulfato de sodio 0,01 N SV, agregando lentamente la solu-
ción volumétrica y agitando continuamente, hasta que el color amarillo desaparezca casi por completo. Agregar 5 mL de
almidón SR y continuar la valoración, agitando enérgicamente, hasta que desaparezca el color azul. Realizar una determi-
nación con un blanco en las mismas condiciones. [NOTA-El volumen de solución volumétrica empleada en la determina-
ción con el blanco no debe exceder O, 1 ml.] Calcular el Índice de Peróxido:

Resultado= [1000 (Vr - V8) x N]/W

Vr =volumen de tiosulfato de sodio 0,01 N consumido en la prueba real (mL)

V8 =volumen de tiosulfato de sodio 0,01 N consumido en la prueba del blanco (mL)
N = normalidad exacta de la solución de tiosulfato de sodio
W = peso de la sustancia tomada para la prueba (g)
• ÍNDICE DE SAPONIFICACIÓN
El Índice de Saponificación es el número de mg de hidróxido de potasio necesario para neutralizar los ácidos libres y sapo-
nificar los ésteres existentes en 1,0 g de la sustancia.
Procedimiento: Colocar 1,5-2 g de la sustancia, pesados con exactitud, en un matraz tarado de 250 mL y agregar 25,0
mL de hidróxido de potasio alcohólico 0,5 N. Calentar el matraz en un baño de vapor, bajo un condensador adecuado
para mantener el reflujo durante 30 minutos, rotando el contenido con frecuencia. [NOTA-El tiempo de reflujo puede ser
de hasta 90 minutos para asegurar la saponificación completa, dependiendo del tipo de éster a analizar.] Agregar a conti-
nuación 1 mL de fenolftaleína SR y valorar el exceso de hidróxido de potasio con ácido clorhídrico 0,5 N SV. Realizar una
determinación con un blanco en las mismas condiciones (ver Volumetría (541 ), Valoraciones Residuales). La valoración tam-
bién puede realizarse potenciométricamente. Calcular el Índice de Saponificación:

Resultado= [M, x (V8 - Vr) x N]!W

M, = peso molecular del hidróxido de potasio, 56, 11

V8 =volumen de ácido clorhídrico 0,5 N consumido en la prueba del blanco (mL)
Vr =volumen de ácido clorhídrico 0,5 N consumido en la prueba real (mL)
N = normalidad exacta del ácido clorhídrico
W = peso de la sustancia tomada para la prueba (g)
Si el aceite se ha saturado con dióxido de carbono con el propósito de conservarlo, dejarlo en una cápsula poco profunda
en un desecador de vacío durante 24 horas antes de pesar las muestras de prueba.
•MATERIA INSAPONIFICABLE
El término "materia insaponificable" en aceites o grasas, se refiere a aquellas sustancias que no son saponificables por me-
dio de hidróxidos alcalinos, pero que son solubles en disolventes de grasas ordinarios, y a los productos de saponificación
que son solubles en dichos disolventes.
Procedimiento: Transferir aproximadamente 5,0 g del aceite o grasa, pesados con exactitud, a un matraz Erlenmeyer de
250 mL, agregar 50 mL de una solución de hidróxido de potasio alcohólico preparada disolviendo 12 g de hidróxido de
potasio en 1 O mL de agua y diluyendo esta solución con alcohol hasta 100 mL, y calentar el matraz en un baño de vapor
bajo un condensador adecuado para mantener el reflujo durante 1 hora, agitando frecuentemente por rotación suave. En-
friar a una temperatura inferior a 25º y transferir el contenido del matraz a un separador con una llave de paso de teflón,
enjuagando el matraz con dos porciones de 50 mL de agua que se agregan al separador (no usar grasa en la llave de paso).
Extraer con tres porciones de 100 mL de éter, combinando los extractos de éter en otro separador que contenga 40 mL de
agua. Rotar o agitar suavemente el separador durante unos minutos. [NOTA-Si se agita con demasiada fuerza, puede for-
marse una emulsión difícil de separar.] Dejar que la mezcla se separe y desechar la fase acuosa inferior. Lavar el extracto de
éter con dos porciones adicionales de 40 mL de agua y desechar la fase acuosa inferior. Lavar el extracto de éter sucesiva-
mente con una porción de 40 mL de solución de hidróxido de potasio (3 en 100) y una porción de 40 mL de agua. Repetir
USP 40 Pruebas Químicas/ (401) Grasas y Aceites Fijos 363

tres veces esta secuencia de lavado con solución de hidróxido de potasio y agua. Lavar el extracto de éter con porciones de
40 mL de agua hasta que el último lavado no se torne rojo con la adición de 2 gotas de fenolftaleína SR. Transferir el ex-
tracto de éter a un matraz tarado y enjuagar el separador con 1O mL de éter, agregando los enjuagues al matraz. Evaporar
el éter en un baño de vapor y agregar 6 mL de acetona al residuo. Extraer la acetona en una corriente de aire y secar el
residuo a 105º hasta que las pesadas sucesivas difieran en no más de 1 mg. Calcular el porcentaje de materia insaponifica-
ble en la porción de aceite o grasa tomada:
Resultado= 100 x (WR/W5)

WR = peso del residuo (g)

W5 = peso del aceite o grasa tomado para la prueba (g)
Disolver el residuo en 20 mL de alcohol, neutralizado previamente en el punto final de la fenolftaleína, agregar fenolftaleína
SR y valorar con hidróxido de sodio alcohólico O, 1 N SV hasta la primera aparición de un color rosado pálido que perma-
nezca durante no menos de 30 segundos. Si el volumen requerido de hidróxido de sodio alcohólico O, 1 N es superior a
0,2 mL, la separación de las capas no fue completa; el residuo pesado no puede considerarse como "materia insaponifica-
ble" y debe repetirse la prueba.
• TEMPERATURA DE SOLIDIFACIÓN DE ÁCIDOS GRASOS
Preparación de los ácidos grasos: Calentar 75 mL de solución de glicerina-hidróxido de potasio (preparada disolviendo
25 g de hidróxido de potasio en 100 mL de glicerina) en un vaso de precipitados de 800 mL a 150º y agregar 50 mL de la
grasa clarificada, fundida si fuera necesario. Calentar la mezcla durante 15 minutos mezclando con frecuencia, pero sin per-
mitir que la temperatura sobrepase los 150º. La saponificación se considera completa cuando la mezcla es homogénea, sin
partículas que se adhieran al vaso de precipitados en el menisco. Verter el contenido del vaso de precipitados en 500 mL
de agua próxima a su punto de ebullición, en una cápsula con mango o un vaso de precipitados de 800 mL, agregar lenta-
mente 50 mL de ácido sulfúrico diluido [preparado agregando agua y ácido sulfúrico (3:1 )] y calentar la solución, mezclan-
do con frecuencia, hasta que los ácidos grasos se separen claramente, formando una capa transparente. Lavar los ácidos
con agua hirviendo hasta que queden libres de ácido sulfúrico, recogerlos en un vaso de precipitados pequeño, colocar en
un baño de vapor hasta que el agua se haya sedimentado y los ácidos grasos se vuelvan transparentes, filtrar en un vaso de
precipitados seco mientras esté caliente y secar a 105º durante 20 minutos. Colocar los ácidos grasos aún calientes en un
recipiente adecuado y enfriar en un baño de hielo hasta que se solidifiquen.
Prueba de saponificación completa: Colocar 3 mL de los ácidos secos en un tubo de ensayo y agregar 15 mL de alcohol.
Calentar la solución a ebullición y agregar un volumen igual de hidróxido de amonio 6 N. Se obtiene una solución transpa-
rente.
Procedimiento: Empleando un aparato similar al Aparato de Temperatura de Solidificación especificado en el capítulo Tem-
peratura de Solidificación (651 ), proceder según se indica en Procedimiento, leyendo "temperatura de solidificación" por
"punto de solidificación" (los términos son sinónimos). El promedio de no menos de cuatro lecturas consecutivas del punto
más alto al que llega la temperatura es la temperatura de solidificación de los ácidos grasos.
• COMPOSICIÓN DE ÁCIDOS GRASOS
Solución estándar: Preparar una mezcla de éster de composición conocida que contenga los ésteres requeridos en la mo-
nografía individual. Esta Solución Estándar puede contener otros componentes. [NOTA-Las mezclas de ésteres están dispo-
nibles comercialmente en Nu-Chek-Prep, lnc., PO Box 295, Elysian, MN 56028. Las mezclas de ésteres habituales que son
útiles para esta prueba incluyen Nu-Chek 17A y Nu-Chek 19A.] La mezcla Nu-Chek 17A tiene la siguiente composición:
Tabla 4
Longitud de la Cadena Nº de
Porcentaje Éster de Ácido Graso de Carbono Enlaces Dobles
1,0 Miristato de metilo 14 o
4,0 Palmitato de metilo 16 o
3,0 Estearato de metilo 18 o
3,0 Araquidato de metilo 20 o
3,0 Behenato de metilo 22 o
3,0 Lignocerato de metilo 24 o
45,0 Oleato de metilo 18 1
15,0 Linoleato de metilo 18 2
3,0 Linolenato de metilo 18 3
20,0 Erucato de metilo 22 1

La mezcla Nu-Chek l 9A tiene la siguiente composición:

Tabla 5
Longitud de la Cadena Nº de
Porcentaje Éster de Ácido Graso de Carbono Enlaces Dobles
7,0 Caprilato de metilo 8 o
364 (401) Grasas y Aceites Fijos/ Pruebas Químicas USP 40

Tabla 5 (Continuación)
Longitud de la Cadena Nº de
Porcentaje Éster de Ácido Graso de Carbono Enlaces Dobles
5,0 Caprato de metilo 10 o
48,0 Laurato de metilo 12 o
15,0 Miristato de metilo 14 o
7,0 Palmitato de metilo 16 o
3,0 Estearato de metilo 18 o
12,0 Oleato de metilo 18 1
3,0 Linoleato de metilo 18 2

Solución de hidróxido de sodio metanólico 0,5 N- Disolver 2 g de hidróxido de sodio en 100 mL de metano!.
Solución de prueba: [NOTA-Si en la muestra de prueba hay ácidos grasos que contengan más de 2 enlaces dobles, ex-
traer el aire del matraz purgándolo con nitrógeno durante unos minutos.] Transferir aproximadamente 100 mg de la mues-
tra de prueba a un matraz Erlenmeyer de 50 mL equipado con un condensador de reflujo adecuado enfriado con agua y
una barra mezcladora magnética. Agregar 4 mL de Solución de hidróxido de sodio metanólico 0,5 N y someter a reflujo hasta
que desaparezcan los glóbulos de grasa (generalmente 5-1 O minutos). Agregar 5 mL de una solución preparada disolvien-
do 14 g de trifluoruro de boro en metano! para obtener 100 mL, agitar por rotación suave para mezclar y someter a reflujo
durante 2 minutos. Agregar 4 mL de n-heptano cromatográfico, a través del condensador y someter a reflujo durante 1
minuto. Enfriar, retirar el condensador, agregar aproximadamente 15 mL de solución de cloruro de sodio saturada, agitar y
dejar que las capas se separen. Pasar la capa de n-heptano a través de O, 1 g de sulfato de sodio anhidro (lavado previamen-
te con n-heptano cromatográfico) a un matraz apropiado. Transferir 1,0 mL de esta solución a un matraz volumétrico de
1 O mL, diluir con n-heptano cromatográfico a volumen y mezclar.
Solución de aptitud del sistema: Transferir aproximadamente 20 mg de ácido esteárico, de ácido palmítico y de ácido
oleico a un matraz Erlenmeyer de 25 mL equipado con un condensador a reflujo enfriado por agua adecuado y una barra
mezcladora magnética, y proceder según se indica para la Solución de Prueba, empezando donde dice "Agregar 5,0 mL de
una solución preparada disolviendo".
Sistema cromatográfico
(Ver Cromatografía (621 ).)
Equipar un cromatógrafo de gases con un detector de ionización a la llama, mantenido a una temperatura de aproximada-
mente 260º, un sistema de inyección no dividido y una columna capilar de sílice fundida de 0,53 mm x 30 m, ligada con
una capa de fase Gl 6 de 1,0 µm. Programar el cromatógrafo para que mantenga una temperatura de columna de 70º
durante aproximadamente 2 minutos después de la inyección, luego para que aumente la temperatura a una velocidad
de 5º /min hasta 240º y finalmente para que mantenga esta temperatura durante 5 minutos. Mantener la temperatura del
inyector aproximadamente a 220º. El gas transportador es helio con una velocidad lineal de aproximadamente 50 cm/s.
Cromatografiar la Solución de aptitud del sistema y registrar las respuestas de los picos según se indica en Procedimiento: los
tiempos de retención relativos son aproximadamente 0,87 para el palmitato de metilo, 0,99 para el estearato de metilo y
1,0 para el oleato de metilo; la resolución, R, entre el estearato de metilo y el oleato de metilo es no menos de 1,5; y la
desviación estándar relativa de las respuestas de las áreas de los picos de palmitato y estearato en inyecciones repetidas es
no más de 6,0%. La desviación estándar relativa del cociente entre las respuestas de los picos del palmitato y del estearato
en inyecciones repetidas es no más de 1,0%.
Procedimiento: Inyectar por separado volúmenes iguales (aproximadamente 1 µL) de la Solución estándar y la Solución de
Prueba en el cromatógrafo, registrar los cromatogramas, identificar los picos de éster de los ácidos grasos en el cromatogra-
ma de la Solución de prueba, comparando los tiempos de retención de estos picos con los del cromatograma de la Solución
Estándar y medir las áreas de los picos para todos los picos de éster de los ácidos grasos en el cromatograma de la Solución
de prueba. Calcular el porcentaje de cada componente de ácido graso en la muestra de prueba:

Resultado= 100 x (AJB)

A = área de la respuesta de los picos obtenidos para cada componente de éster de ácido graso individual
B = suma de las áreas de todos los picos, excluido el pico del disolvente, en el cromatograma de la Solución de Prueba
• DETERMINACIÓN Y PERFIL DE ÁCIDOS GRASOS OMEGA-3
El siguiente procedimiento se puede usar para la determinación de ácido eicosapentaenoico (EPA) (C20:5 n-3), ácido doco-
sahexaenoico (DHA) (C22:6 n-3) y ácidos omega-3 totales que se obtienen de peces, plantas o fuentes microbianas en
aceites a granel y aceite encapsulado, ya sea como triglicéridos o como ésteres etílicos. El término "triglicérido" es aplica-
ble a aceites de algas, aceites de pescado, aceites de hígado de pescado y productos que contienen ácidos omega-3 en
forma de triglicéridos. Los resultados se expresan como ácidos grasos libres o ésteres etílicos. Realizar las pruebas lo más
rápidamente posible. Proteger las soluciones de la luz actínica, agentes oxidantes, catalizadores de oxidación y aire.
Contenido de EPA y DHA
Solución antioxidante: Disolver una cantidad, pesada con exactitud, de butil hidroxitolueno en 2,2,4-trimetilpentano
para obtener una solución con una concentración de 0,05 mg por mL.
USP 40 Pruebas Químicas/ (401) Grasas y Aceites Fijos 365

Solución de estándar interno: Transferir una cantidad de ER Tricosanoato de Metilo USP, pesada con exactitud, a un
matraz volumétrico. Disolver en Solución Antioxidante y diluir con el mismo disolvente hasta obtener una solución con una
concentración de aproximadamente 7,0 mg/ml. [NOTA-Proteger la solución de la evaporación durante su uso.]
Tabla 6
Cantidad de Muestra
Suma Aproximada a Pesar
EPA+ DHA (g)
30%-50% 0,4-0,5
50%-70% 0,3
>70% 0,25

Solución de prueba 1 (para triglicéridos): En un matraz volumétrico de 1O mL, disolver la masa de la muestra a exami-
nar, de acuerdo con la Tabla 6, en Solución antioxidante y diluir con la misma solución a volumen. Transferir 2,0 mL de
esta solución a un tubo de vidrio y evaporar el disolvente con una corriente suave de nitrógeno. Agregar 1,5 mL de una
solución de hidróxido de sodio en metanol al 2% (p/v), tapar herméticamente con una tapa con recubrimiento interno
de politetrafluoroetileno, mezclar y calentar en un baño de agua hirviendo durante 7 minutos. Enfriar, agregar 2 mL de
solución de tricloruro de boro-metanol (120 g en 1000 mL de metanol), cubrir con nitrógeno, tapar herméticamente,
mezclar y calentar en un baño de agua hirviendo durante 30 minutos. Enfriar a una temperatura de 40º-50º, agregar 1,0
mL de 2,2,4-trimetilpentano, tapar y mezclar en un mezclador de vórtice o agitar vigorosamente durante al menos 30
segundos. Agregar inmediatamente 5 mL de solución saturada de cloruro de sodio que contenga 1 volumen de cloruro
de sodio y 2 volúmenes de agua. [NOTA-Agitar de vez en cuando. Antes de usar, decantar la solución de cualquier sus-
tancia no disuelta y filtrar si fuera necesario.] Cubrir con nitrógeno, tapar y mezclar en un mezclador de vórtice o agitar
minuciosamente durante al menos 15 segundos. Dejar que la capa superior se torne transparente y transferir a otro tubo.
Agitar la capa de metano! una vez más con 1,0 mL de 2,2,4-trimetilpentano y combinar los extractos de 2,2,4-trimetil-
pentano. Lavar los extractos combinados dos veces, cada una con 1 mL de agua, y secar sobre sulfato de sodio anhidro.
Solución de prueba 2 (para triglicéridos): Transferir la cantidad equivalente de la muestra usada para preparar la Solución
de prueba 7 a un matraz volumétrico de 1O mL, disolver y diluir con Solución de estándar interno a volumen. Puede aplicar-
se calor suave (hasta un máximo de 60º) para obtener una solución transparente. Después, proceder según se indica en
Solución de prueba 7, comenzando donde dice "Transferir 2,0 mL".
Solución de prueba 3 (para ésteres etílicos): En un matraz volumétrico de 1O mL, disolver la masa de la muestra a exami-
nar, ajustándose a la Tabla 6, en Solución de estándar interno y diluir con la misma solución a volumen. Puede aplicarse
calor suave (hasta un máximo de 60º) para obtener una solución transparente.
Solución de prueba 4 (para ésteres etílicos): Transferir la cantidad equivalente de la muestra usada para preparar la Solu-
ción de prueba 3 a un matraz volumétrico de 1O mL, disolver y diluir con Solución antioxidante a volumen.
Solución estándar la: Transferir 60 mg de ER Éster Etílico del Ácido Docosahexaenoico USP, pesados con exactitud, a un
matraz volumétrico de 1O mL, disolver y diluir con Solución de estandar interno a volumen. Puede aplicarse calor suave
(hasta un máximo de 60º) para obtener una solución transparente.
Solución estándar 1b: Transferir 90 mg de ER Éster Etílico del Ácido Eicosapentaenoico USP, pesados con exactitud, a un
matraz volumétrico de 1O mL, disolver y diluir con Solución de estandar interno a volumen. Puede aplicarse calor suave
(hasta un máximo de 60º) para obtener una solución transparente.
La Solución estándar 7a y la Solución estándar 7b están listas para el análisis de ésteres etílicos. Para el análisis de triglicéri-
dos, continuar con la Solución estándar 2a y la Solución estándar 2b.
Solución estándar 2a: Transferir 2,0 mL de Solución estándar 7a a un tubo de vidrio y evaporar el disolvente con una
corriente suave de nitrógeno. Después, proceder según se indica en Solución de prueba 7, comenzando donde dice,
"Agregar 1,5 mL".
Solución estándar 2b: Transferir 2,0 mL de Solución estándar 7b a un tubo de vidrio y evaporar el disolvente con una
corriente suave de nitrógeno. Después, proceder según se indica en Solución de prueba 7, comenzando donde dice,
"Agregar 1,5 mL".
Solución de aptitud del sistema 1: Transferir 0,300 g de palmitato de metilo, 0,300 g de estearato de metilo, 0,300 g
de araquidato de metilo y 0,300 g de behenato de metilo, pesados con exactitud, a un matraz volumétrico de 1O mL,
disolver y diluir con Solución antioxidante a volumen.
Solución de aptitud del sistema 2: [NOTA-Esta solución debe prepararse sólo para triglicéridos y sólo si el éster metílico
del ácido tetracos-15-enoico no se observa claramente en el cromatograma obtenido con la Solución de prueba 2.] Trans-
ferir 55,0 mg de éster metílico del ácido docosahexaenoico y aproximadamente 5,0 mg de éster metílico del ácido tetra-
cos-15-enoico (ácido nervónico), pesados con exactitud, a un matraz volumétrico de 1O mL, disolver y diluir con Solución
antioxidante a volumen.
Sistema cromatográfico
(Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: Cromatografía de gases
Detector: Ionización a la llama
Columna: Capilar de sílice fundida, de 0,25 mm x 25 m; ligada con una película de fase Gl 6 de 0,20 µm
366 (401) Grasas y Aceites Fijos / Pruebas Químicas USP 40

Temperaturas
Inyector
Inyección dividida: 250º
Inyección no dividida: 90º-250º
Detector: 270º
Columna: Ver la Tabla la o la Tabla lb.
Tabla 7a (Inyección Dividida)
Tiempo de
Tiempo de Espera
Espera (Hold Time)
(Hold ala
Temperatura Time) Rampa de Temperatura Temperatura
Inicial a 170º Temperatura Final Final
(º) (mln) (°/mln) (º) (min)
170 2 3 240 2,5

Ta bl a 7b (1 nyecc I'on no DI V idld a )

Tiempo de
Espera
Tiempo de (Hold
Espera Hasta Time)
(Hold Rampa de Hasta Rampa de Temperatu- ala
Temperatura Time) Temperatura Temperatu- Temperatura ra Temperatura
Inicial a 90º Número 1 ra Número 2 Final Final
(º) (min) (º/mln) (º) (º/min) (°) (min)
90 2 30 170 3 240 2

Gas transportador: Helio

Velocidad de flujo: 1 ml/min
Relación de partición del flujo: 200:1. [NOTA-Si fuera necesario, ajustar la relación de partición y/o la dilución de la
muestra para obtener un factor de asimetría de 0,8-1,5 para los picos de los ésteres metílicos de ácidos grasos en la
Solución de aptitud del sistema 7, los picos de éster metílico o éster etílico del ácido eicosapentaenoico y ácido doco-
sahexaenoico en la Solución de prueba 7 y Solución de prueba 4, observando al mismo tiempo que para la Solución de
prueba 7 o Solución de prueba 4 los picos debidos a los ésteres correspondientes de Cl 8:3 n-3, Cl 8:4 n-3, C20:4 n-3,
C21 :5 n-3 y C22:5 n-3 son claramente detectables. Si se utiliza la modalidad de inyección no dividida, las soluciones
deben diluirse adicionalmente 1 en 200 con Solución antioxidante.]
Volumen de inyección: 1 µL
Aptitud del sistema (para triglicéridos)
Muestras: Solución de aptitud del sistema 7 y Solución de prueba 2 o Solución de aptitud del sistema 2 (si es aplicable)
Aptitud del sistema (para ésteres etílicos)
Muestra: Solución de aptitud del sistema 7
Requisitos de aptitud del sistema
Porcentajes de área teóricos (Solución de Aptitud del Sistema 1): Los porcentajes de las áreas, después de ajustar
por el peso real, de los picos de palmitato de metilo, estearato de metilo, araquidato de metilo y behenato de metilo,
deben estar cada uno dentro de± 1,0% (absoluto) de los valores teóricos provistos en la Tabla 8.
Tabla 8
Área Teórica(%) en una Solución de Pesos Iguales de Palmitato de
Éster Metílico del Metilo, Estearato de Metilo, Araquidato de Metilo y Behenato de Me-
Ácido Graso tilo
Palmitato de metilo 24,37
Estearato de metilo 24,84
Araquidato de metilo 25,23
Behenato de metilo 25,56

[NOTA-El área teórica (%)en una solución de pesos iguales (Tabla 8) se deriva de los factores de respuesta teórica
calculados, que son 1,049; 1,029; 1,013 y 1,000 para palmitato de metilo, estearato de metilo, araquidato de metilo
y behenato de metilo, respectivamente.]
Resolución: Para triglicéridos (Solución de prueba 2 o Solución de aptitud del sistema 2): No menos de 1,2 entre los
picos de éster metílico del ácido docosahexaenoico y éster metílico del ácido tetracos-15-enoico
Analisis (para triglicéridos)
Muestras: Solución pstándar 2a, Solución pstándar 2b, Solución de prueba 7 y Solución de prueba 2
USP 40 Pruebas Químicas/ (401) Grasas y Aceites Fijos 367

Inyectar cada muestra por duplicado y medir las respuestas de los picos. Comparar el perfil cromatográfico de la Solución
de prueba 2 con el de la Solución de prueba 7 e identificar el pico del estándar interno presente en la Solución de prueba
2. Calcular el porcentaje de EPA o DHA en la muestra de triglicéridos tomada:
Resultado= (Ruf R5) x (W5/Wu) x F x 100
Ru =cociente entre la respuesta del pico de EPA o DHA y la respuesta del pico corregida del estándar interno en
el cromatograma de la Solución de prueba 2, calculado:
Resultado= 1![(rU2/rd - <ruif rn)]
[NOTA-Si ru 1 = O debido a que no se observan picos en el sitio del estándar interno en el cromatograma de la Solución
de prueba 7, entonces Ru = rrzf rU2.]
rU2 = respuesta del pico del estándar interno en el cromatograma de la Solución de prueba 2
rr2 = respuesta del pico de EPA o DHA en el cromatograma de la Solución de prueba 2
ru 1 = respuesta de cualquier pico en el sitio del estándar interno en el cromatograma de la Solución de prueba 7
rn = respuesta del pico de EPA o DHA en el cromatograma de la Solución de prueba 7
R5 =cociente entre la respuesta del pico de DHA o EPA y la respuesta del pico del estándar interno en el croma-
tograma de la Solución estándar 2a o la Solución estándar 2b
W5 = peso del DHA tomado para preparar la Solución estándar 7a o peso del EPA tomado para preparar la Solu-
ción estándar 7b (mg)
Wu = peso de la muestra tomada para preparar la Solución de prueba 2 (mg)
F =factor para expresar el contenido de DHA como ácidos grasos libres, 0,921; y factor para expresar el conte-
nido de EPA como ácidos grasos libres, 0,915
Análisis (para ésteres etílicos)
Muestras: Solución estándar 7a, Solución estándar 7b, Solución de prueba 3 y Solución de prueba 4
Inyectar cada muestra por duplicado y medir las respuestas de los picos. Comparar el perfil cromatográfico de la Solución
de prueba 3 con el de la Solución de prueba 4 e identificar el pico del estándar interno presente en la Solución de prueba
3. Calcular el porcentaje de EPA o DHA en la muestra de ésteres etílicos tomada:
Resultado= (Ru/R 5) x (W5/Wu) x 100
Ru =cociente entre la respuesta del pico de EPA o DHA y la respuesta del pico corregida del estándar interno en el
cromatograma de la Solución de prueba 3, calculada según se indica a continuación:
Resultado= 1![(rwlrn) - (ru41rr4 )]
[NOTA-Si ru 4 =O debido a que no se observan picos en el sitio del estándar interno en el cromatograma de la Solución
de prueba 4, entonces Ru = rnlrw.]
rU3 = respuesta del pico del estándar interno en el cromatograma de la Solución de prueba 3
rn = respuesta del pico de EPA o DHA en el cromatograma de la Solución de prueba 3
ru 4 = respuesta de cualquier pico en el sitio del estándar interno en el cromatograma de la Solución de prueba 4
rr4 = respuesta del pico de EPA o DHA en el cromatograma de la Solución de prueba 4
R5 =cociente entre la respuesta del pico de DHA o EPA y la respuesta del pico del estándar interno en el croma-
tograma de la Solución estándar 7a o Solución Estándar 7b
W5 = peso del DHA tomado para preparar la Solución Estándar 7a o peso del EPA tomado para preparar la Solu-
ción estándar 7b (mg)
Wu = peso de la muestra tomada para preparar la Solución de prueba 3 (mg)
Contenido de Ácidos Omega-3 Totales (para triglicéridos)
Calcular el porcentaje de los ácidos omega-3 totales en la porción de muestra de triglicéridos tomada:
Resultado = EPA+ DHA + [(An- 3 x (EPA+ DHA)/(AEPA + AoHA)]
EPA =contenido de EPA de la prueba de Contenido de EPA y DHA (%)
DHA =contenido de DHA de la prueba de Contenido de EPA y DHA (%)
An_ 3 =suma de las áreas de los picos correspondientes a los ésteres metílicos Cl 8:3 n-3, Cl 8:4 n-3, C20:4 n-3, C21 :5
n-3 y C22:5 n-3 en el cromatograma obtenido con la Solución de prueba 7
>AEPA = área del pico correspondiente al éster metílico de EPA en el cromatograma obtenido con la Solución de prueba 7
AoHA =área del pico correspondiente al éster metílico de DHA en el cromatograma obtenido con la Solución de prueba 7
Contenido de Ácidos Omega-3 Totales (para ésteres etílicos)
Calcular el porcentaje de los ácidos omega-3 totales en la porción de muestra de ésteres etílicos tomada:
Resultado= EPA+ DHA + [(An _3 x (EPA+ DHA)l(AEPA + AoHA)]
EPA =contenido de EPA de la prueba de Contenido de EPA y DHA (%)
DHA =contenido de DHA de la prueba de Contenido de EPA y DHA (%)
368 (401) Grasas y Aceites Fijos/ Pruebas Químicas USP 40

An _ 3 =suma de las áreas de los picos correspondientes a los ésteres etílicos Cl 8:3 n-3, Cl 8:4 n-3, C20:4 n-3, C21 :5 n-3
y C22:5 n-3 en el cromatograma obtenido con la Solución de prueba 4
AEPA =área del pico correspondiente al éster etílico de EPA en el cromatograma obtenido con la Solución de prueba 4
AoHA = área del pico correspondiente al éster etílico de DHA en el cromatograma obtenido con la Solución de prueba 4
• AGUA V SEDIMENTOS EN ACEITES FIJOS
Aparato: La centrífuga preferida tiene un diámetro de giro (d =distancia entre los extremos de los tubos cuando éstos
están girando) de 38-43 cm y opera a una velocidad aproximada de 1500 rpm. Si se emplea una centrífuga de dimensio-
nes diferentes, calcular la velocidad deseada de las revoluciones:

rpm = 1500-.)40,6/d

Los tubos de la centrífuga tienen forma de pera y se les puede colocar tapones. La capacidad total de cada tubo es de
aproximadamente 125 ml. Las graduaciones son claras y diferenciadas, y se leen hacia arriba desde el fondo del tubo,
según la escala mostrada en la Tabla 9.
Tabla 9
Volumen División de la Escala
(mL) (mL)
0-3 0,1
3-5 0,5
5-10 1,0
10-25 5,0
25-50 25,0
50-100 50,0

Procedimiento: Colocar 50,0 mL de benceno en cada uno de dos tubos de centrífuga y agregar a cada tubo 50,0 mL de
aceite, entibiado, si fuera necesario, para reincorporar la estearina separada y mezclar minuciosamente a 25º. Tapar con
firmeza los tubos y agitarlos enérgicamente hasta que el contenido se mezcle minuciosamente y sumergir los tubos en un
baño de agua a 50º durante 1O minutos. Centrifugar durante 1O minutos. Leer el volumen combinado de agua y sedimen-
to en el fondo de cada tubo. Centrifugar repetidamente en períodos de 1O minutos hasta que el volumen combinado de
agua y sedimento permanezca constante en 3 lecturas consecutivas. La suma de los volúmenes de agua y sedimento com-
binados en los dos tubos representa el porcentaje, en volumen, de agua y sedimento en el aceite.
• ÍNDICE DE ANISIDINA
El Índice de Anisidina se define como 100 veces la densidad óptica medida en una celda de 1 cm de una solución que
contiene 1 g de la sustancia a examinar en 100 mL de una mezcla de disolventes y reactivos, según el método que se
describe a continuación. [NOTA-Realizar las operaciones lo más rápidamente posible, evitando la exposición a la luz actí-
nica.]
Solución de prueba A: Disolver 0,500 g de la sustancia a examinar en isooctano y diluir con el mismo disolvente hasta
25,0 ml.
Solución de prueba B: Agregar 1,0 mL de una solución de 2,5 g/L de p-anisidina en ácido acético glacial a 5,0 mL de la
Solución de prueba A, agitar y almacenar protegida de la luz.
Solución estándar: Agregar 1,0 mL de una solución de 2,5 g/L de p-anisidina en ácido acético glacial a 5,0 mL de isoocta-
no, agitar y almacenar protegida de la luz.
Procedimiento: Medir la absorbancia de la Solución de prueba A a 350 nm usando isooctano como blanco. Medir la absor-
bancia de la Solución de prueba B a 350 nm, exactamente 1O minutos después de su preparación, usando la Solución están-
dar como el líquido de compensación. Calcular el Índice de Anisidina a partir de la expresión:
Resultado= [25 x (l ,2A 5 - A8)]/m

A5 = absorbancia de la Solución de prueba B a 350 nm

A8 = absorbancia de la Solución de prueba A a 350 nm
m = peso de la sustancia a analizar en la Solución de prueba A (g)
•ÍNDICE DE OXIDACIÓN TOTAL (TOTOX)
El Índice de Oxidación Total se define:
Resultado= 2PV +AV
PV = Índice de Peróxido
AV= Índice de Anisidina
•TRAZAS DE METALES
Aparato
El aparato generalmente consiste en lo siguiente:
USP 40 Pruebas Químicas/ (401) Grasas y Aceites Fijos 369

Matraces de Digestión: Usar un matraz de politetrafluoroetileno con un volumen de aproximadamente 120 mL, equipa-
do con un tapón impermeable, una válvula para ajustar la presión en el interior del recipiente y un tubo de politetrafluo-
roetileno para permitir la liberación de gas.
Sistema: Cerrar los matraces de forma impermeable usando la misma fuerza de torsión para cada uno de ellos.
Horno de microondas: Tiene una frecuencia de magnetrón de 2450 MHz, con una potencia de salida seleccionable de O
a 630 ± 70 vatios en incrementos de 1%, una computadora digital programable, una cámara de microondas recubierta
con politetrafluoroetileno con un ventilador para extracción con velocidad variable, un sistema de transmisión con plato
giratorio y tubos de escape para permitir la salida de humos.
Espectrómetro de absorción atómica: Equipado con una lámpara de cátodo hueco como fuente de radiación y una
lámpara de deuterio como corrector de fondo. El sistema se equipa con lo siguiente:
1. Un horno de grafito como el dispositivo de atomización para cadmio, cobre, hierro, plomo, níquel y cinc.
2. Un sistema automatizado de generación de vapores de hidruros de flujo continuo para arsénico y mercurio.
Procedimiento General
[PRECAUCIÓN-Cuando se usan vasos de digestión de alta presión cerrados y equipo de laboratorio de microondas, se deben
seguir las precauciones e intrucciones de operación y seguridad suministradas por el fabricante.]
[NOTA-Si se utiliza un aparato alternativo, es posible que se requiera ajustarle los parámetros.]
Limpieza: Limpiar todo el material de vidrio y el equipo de laboratorio con una solución de 1O mg/mL de ácido nítrico
antes de usarlo.
Ácido nítrico libre de trazas de metal: El ácido nítrico cumple con los requisitos cuando los valores máximos para arsé-
nico (As), cadmio (Cd), cobre (Cu), hierro (Fe), mercurio (Hg), plomo (Pb), níquel (Ni) y cinc (Zn) son iguales a 0,005;
0,005; 0,001; 0,02; 0,002; 0,001; 0,005 y 0,01 ppm, respectivamente.
Ácido clorhídrico libre de trazas de metal: El ácido clorhídrico cumple con los requisitos cuando los valores máximos
para As, Cd, Cu, Fe, Hg, Pb, Ni y Zn son iguales a 0,005; 0,003; 0,003; 0,05; 0,005; 0,001; 0,004 y 0,005 ppm, respecti-
vamente.
Ácido sulfúrico libre de trazas de metal: El ácido sulfúrico cumple con los requisitos cuando los valores máximos para
As, Cd, Cu, Fe, Hg, Pb, Ni y Zn son iguales a 0,005; 0,002; 0,001; 0,05; 0,005; 0,001; 0,002 y 0,005 ppm, respectiva-
mente.
Solución madre de prueba: Colocar en un matraz de digestión aproximadamente 0,5 g de aceite graso, pesados con
exactitud, según se indica en cada monografía individual. Agregar 6 mL de Ácido nítrico libre de trazas de metal y 4 mL de
Ácido clorhídrico libre de trazas de metal. Cerrar el matraz.
Solución madre del blanco: Mezclar 6 mL de Ácido nítrico libre de trazas de metal y 4 mL de Ácido clorhídrico libre de
trazas de metal en un matraz de digestión.
Solución de prueba 1: Colocar el matraz de digestión que contiene la Solución madre de prueba en el horno de microon-
das. Llevar a cabo la digestión en tres etapas, según el siguiente programa: 80% de potencia durante 15 minutos, 100%
de potencia durante 5 minutos y 80% de potencia durante 20 minutos.
Al final del ciclo, dejar que el matraz se enfríe. Agregar 4 mL de Ácido sulfúrico libre de trazas de metal al matraz. Repetir el
programa de digestión. Después de completar la digestión, dejar que el matraz se enfríe a temperatura ambiente. Abrir
el matraz de digestión y transferir la solución transparente e incolora obtenida a un matraz volumétrico de 50 ml. Enjua-
gar el matraz de digestión dos veces, cada una con 15 mL de agua, y recoger los enjuagues en el matraz volumétrico.
Agregar 1,0 mL de una solución de 1O mg/mL de nitrato de magnesio y 1,0 mL de una solución de 100 mg/mL de
fosfato diácido de amonio al matraz volumétrico. Diluir con agua a volumen y mezclar. La solución resultante es la Solu-
ción de prueba 7.
Solución blanco 1: Colocar el matraz de digestión que contiene la Solución madre del blanco en el horno de microondas.
Proceder según se indica en Solución de prueba 7, comenzando donde dice "Llevar a cabo la digestión en tres etapas,
según el siguiente programa".
Calibración directa: [NOTA-Las concentraciones de las soluciones estándar dependerán de los contenidos de metal de la
sustancia de prueba.] Para mediciones de rutina, se preparan y examinan tres soluciones estándar, la Solución blanco 7 y la
Solución de prueba 7.
Emplear la Solución de prueba 7 y la Solución blanco 7 preparadas según se indica anteriormente o según se indica en la
monografía. Preparar no menos de 3 soluciones estándar que contengan todos los metales a analizar. El valor de absor-
bancia esperado en la Solución de prueba 7 para cada metal deberá estar comprendido dentro del intervalo de absorban-
cia calibrado correspondiente, de preferencia en la parte media de dicho intervalo. Cualquier reactivo usado en la prepa-
ración de la Solución de prueba 7 se agrega en la misma concentración en las soluciones estándar.
Introducir cada una de las soluciones en el instrumento usando el mismo número de repeticiones para cada una de las
soluciones para obtener una lectura estable.
Preparar una curva de calibración a partir de la media de las lecturas obtenidas con las soluciones estándar, graficando las
medias en función de la concentración. Determinar la concentración del elemento en la Solución de prueba 7 a partir de
la curva obtenida.
Estándar agregado: Agregar volúmenes iguales de la Solución de prueba 7, preparada según se indica anteriormente o
según se indica en la monografía, a por lo menos cuatro matraces volumétricos idénticos. Agregar a todos los matraces
menos a uno volúmenes progresivamente mayores de una solución estándar que contenga una concentración conocida
370 (401) Grasas y Aceites Fijos/ Pruebas Químicas USP 40

del elemento de prueba para obtener una serie de soluciones con concentraciones crecientes de manera estable del ele-
mento que se sabe produce respuestas en la parte lineal de la curva. Diluir el contenido de cada matraz con el disolvente
especificado en la monografía a volumen y mezclar. Etiquetar el matraz sin el estándar adicionado como la solución de
prueba.
Introducir cada una de las soluciones en el instrumento, usando el mismo número de repeticiones para cada una de las
soluciones, para obtener una lectura estable.
Graficar las absorbancias de las soluciones estándar y de la solución de prueba en función de la cantidad agregada del
elemento de prueba. [NOTA-La solución de prueba debe graficarse como si tuviera un contenido del elemento de prue-
ba agregado equivalente a O mg o µg.] Extrapolar la línea uniendo los puntos en la gráfica hasta que se encuentre con el
eje de concentración. La distancia entre este punto y la intersección de los ejes representa la concentración del elemento
de prueba en la solución de prueba.
Pruebas Específicas
Cadmio (cd), cobre (cu), hierro (fe), plomo (pb), níquel (ni) y cinc (zn)
Solución madre del estándar: Preparar una solución con concentraciones conocidas de 5 µg/mL de cada elemento de
prueba.
Soluciones estándar: En tres matraces volumétricos idénticos de 1O mL, introducir 1O, 20 y 40 µL, respectivamente, de
Solución madre del estándar. Agregar a cada matraz 5,0 mL de la Solución de prueba 1, diluir con agua a volumen y mez-
clar.
Solución de prueba 2: En un matraz volumétrico de 1O mL, agregar 5,0 mL de la Solución de prueba 1, diluir con agua a
volumen y mezclar.
Solución blanco 2: En un matraz volumétrico de 1O mL, agregar 5,0 mL de Solución blanco 1, diluir con agua a volu-
men y mezclar.
Procedimiento: Medir el contenido de Cd, Cu, Fe, Pb, Ni y Zn usando un espectrofotómetro de absorción atómica
equipado con un horno de grafito adecuado. Determinar concomitantemente las absorbancias de la Solución blanco 2,
las Soluciones estándar y Solución de prueba 2 por lo menos tres veces cada una. El valor de absorbancia de la Solución
blanco 2 se resta del valor obtenido usando las Soluciones estándar y la Solución de prueba 2. Proceder según se indica en
el método de Estándar agregado en el Procedimiento general anterior. La Tabla 1O indica los parámetros instrumentales
que pueden usarse.
Tabla 10
Cd Cu Fe Pb Ni Zn
Longitud de onda (nm) 228,8 324,8 248,3 283,5 232 213,9
Ranura (nm) 0,5 0,5 0,2 0,5 0,2 0,5
Corriente de la lámpara (mA) 6 7 5 5 10 7
Temperatura de incineración (°) 800 800 800 800 800 800
Temperatura de atomización (º) 1800 2300 2300 2200 2500 2000
Corrector de fondo Encendido Apagado Apagado Apagado Apagado Apagado
Flujo de nitrógeno (L/min) 3 3 3 3 3 3

Arsénico y mercurio
Medir el contenido de arsénico y mercurio contra sus soluciones estándar de arsénico o mercurio a una concentración
conocida empleando el método de Calibración directa de la sección Procedimiento General anterior, con un sistema auto-
matizado de generación de vapores de hidruros de flujo continuo.
Para el límite de especificación de 1 ppm para arsénico y el límite de especificación de 1 ppm para mercurio, preparar tres
soluciones de calibración de trabajo con concentraciones conocidas de aproximadamente 5, 1O y 20 ng/mL, respectiva-
mente, para cada elemento de prueba.
El valor de absorbancia de la solución blanco se resta automáticamente del valor obtenido usando la solución de prueba.
Arsénico
Solución blanco 3: Agregar 1,0 mL de una solución de 200 mg/mL de yoduro de potasio a 19,0 mL de la Solución
blanco 1 preparada según se indica anteriormente. Dejar esta solución en reposo a temperatura ambiente durante
aproximadamente 50 minutos o a 70º durante aproximadamente 4 minutos.
Solución de prueba 3: Agregar 1,0 mL de una solución de 200 mg/mL de yoduro de potasio a 19,0 mL de la Solución
de prueba 1 preparada según se indica anteriormente. Dejar esta solución en reposo a temperatura ambiente durante
aproximadamente 50 minutos o a 70º durante aproximadamente 4 minutos.
Reactivo ácido 1: Ácido clorhídrico libre de trazas de metal
Reactivo reductor 1: Una solución de 6 mg/mL de tetrahidroborato de sodio en una solución de 5 mg/mL de hidróxi-
do de sodio
Se pueden utilizar los parámetros instrumentales de la Tabla 11.
Mercurio
Solución blanco 4: Proceder según se indica en Solución blanco 3.
Solución de prueba 4: Proceder según se indica en Solución de prueba 3.
 USP 40 Pruebas Químicas/ (401) Grasas y Aceites Fijos 371

Reactivo ácido 2: Una solución de 515 mg/mL de Ácido clorhídrico libre de trazas de metal
Reactivo reductor 2: Una solución de 1 O mg/mL de cloruro estannoso en una solución de 200 mg/mL de Ácido clorhí-
drico libre de trazas de metal
Se pueden utilizar los parámetros instrumentales de la Tabla 7 7.
Tabla 11
As Hg
Longitud de onda (nm) 193,7 253,7
Ancho de ranura (nm) 0,2 0,5
Corriente de la lámpara (mA) 10 4
Velocidad de flujo del reactivo ácido (ml/min) 1,0 1,0
Velocidad de flujo del reactivo reductor (ml/min) 1,0 1,0
Velocidad de flujo para las soluciones blanco, estándar y de prueba (ml/min) 7,0 7,0
Celda de absorción Cuarzo (calentado) Cuarzo (sin calentar)
Corrector de fondo Apagado Apagado
Velocidad de flujo de nitrógeno (L/min) 0,1 0,1

• COMPOSICIÓN DE ESTEROLES
Separación de la fracción de esteroles
Solución de referencia A: Disolver una cantidad de colesterol, pesada con exactitud, en cloroformo para obtener una
solución al 5% (p/v).
Fase móvil: Una mezcla de tolueno y acetona (95:5) o una mezcla de hexano y éter (65:35)
Solución de prueba A: Pesar con exactitud 5 g de la sustancia de prueba en un matraz de 250 ml. Agregar 50 mL de
hidróxido de potasio alcohólico SR 2 (hidróxido de potasio alcohólico 2 N) y calentar hasta ebullición suave, agitando vi-
gorosamente y de manera continua, hasta que ocurra la saponificación (la solución se torna transparente). Continuar ca-
lentando durante 20 minutos adicionales y agregar 50 mL de agua desde la parte superior del condensador. Enfriar el
matraz hasta aproximadamente 30º. Transferir el contenido del matraz a un embudo de separación de 500 mL con varios
enjuagues de agua, hasta un volumen total de aproximadamente 50 ml. Agregar aproximadamente 80 mL de éter, agitar
vigorosamente durante aproximadamente 30 segundos y dejar que sedimente. [NOTA-Cualquier emulsión puede des-
truirse mediante el rociado de pequeñas cantidades de alcohol etílico o alcohol metílico.] Separar la fase acuosa inferior y
recogerla en un segundo embudo de separación. Realizar de la misma forma dos extracciones adicionales en la fase de
agua-alcohol, usando 60-70 mL de éter en cada ocasión. Combinar los extractos etéreos en un solo embudo de separa-
ción y realizar lavados con agua, de 50 mL cada uno, hasta que el agua de lavado no presente reacción alcalina frente a la
fenolftaleína. Secar la fase etérea con sulfato de sodio anhidro y filtrar a través de sulfato de sodio anhidro recolectando en
un matraz de 250 mL previamente pesado, lavando el embudo y filtrando con pequeñas cantidades de éter. Destilar el
éter hasta que el contenido del matraz se reduzca a unos pocos mL y llevar a sequedad aplicando un ligero vacío o una
corriente de nitrógeno. Completar el secado a 100º durante aproximadamente 15 minutos, luego pesar después de en-
friar en un desecador. Disolver la materia insaponificable así obtenida en cloroformo para obtener una solución con una
concentración de aproximadamente 5%.
Solución de prueba B: Tratar 5 g de aceite de canola de la misma forma que se indica para la sustancia de prueba en
Solución de Prueba A, comenzando donde dice "Agregar 50 mL de hidróxido de potasio alcohólico SR 2 (hidróxido de
potasio alcohólico 2 N)".
Solución de prueba C: Tratar 5 g de aceite de girasol de la misma forma que se indica para la sustancia de prueba en
Solución de prueba A, comenzando donde dice "Agregar 50 mL de hidróxido de potasio alcohólico SR 2 (hidróxido de
potasio alcohólico 2 N)".
Procedimiento: Sumergir por completo en hidróxido de potasio alcohólico 0,2 N durante 1O segundos una placa de gel
de sílice para cromatografía en capa delgada (ver Cromatografía (621 )), de 20 cm x 20 cm con un espesor de capa de
200 µm y un tamaño de partícula de 5-17 µm 1 sobre poliéster, luego dejar que se seque en una campana de extracción
durante 2 horas y finalmente colocar a 100º durante 1 hora. [NOTA-Retirar del dispositivo de calentamiento validado y
mantener la placa en un desecador hasta que se requiera su uso. Las placas deben usarse dentro de los 15 días. También
se encuentran disponibles comercialmente placas para cromatografía en capa delgada que no requieren de preacondicio-
namiento]. Usar una placa individual para cada solución de prueba.
Colocar en la cámara una mezcla de tolueno y acetona (95:5) o una mezcla de hexano y éter (65:35) hasta una profundi-
dad de aproximadamente 1 cm. Cerrar la cámara con la cubierta apropiada y dejar en reposo durante al menos 30 mi-
nutos. Se pueden colocar tiras de papel de filtro sumergidas en el eluyente sobre las superficies internas de la cámara.
[NOTA-La fase móvil debería reemplazarse para cada prueba para asegurar condiciones de elución reproducibles.] Apli-
car 0,3 mL de Solución de prueba A aproximadamente a 2 cm a partir del borde inferior formando una franja que sea lo
más delgada y uniforme posible. Colocar 2-3 µL de Solución de referencia A en un extremo de la placa, alineados con la
franja. Desarrollar los cromatogramas en una cámara equilibrada con la Fase móvil hasta que el frente de la fase móvil

1 Se puede obtener una placa para TLC de grado comercial en Sigma-Aldrich, Nº de catálogo zl 22785.
 372 (401) Grasas y Aceites Fijos/ Pruebas Químicas USP 40

haya recorrido aproximadamente 1 cm desde el borde superior de la placa. Retirar la placa de la cámara de desarrollo y
evaporar la fase móvil empleando una corriente de aire caliente [NOTA-Evitar el calor excesivo.] o dejando la placa bajo
una campana durante un periodo corto. Rociar la placa con una solucion alcohólica de 2,7-diclorofluoresceína al 0,2% y
examinar bajo luz UV a 254 nm. [NOTA-También se encuentran disponibles comercialmente placas previamente trata-
das con indicador de UV y se usan en forma equivalente]. En cada una de las placas, marcar los límites de la banda de
esteroles, identificada mediante su alineación con la mancha obtenida a partir de la Solución de referencia A a lo largo de
los bordes de la fluorescencia e incluir además el área de las zonas que se encuentran a 2-3 mm por encima y por deba-
jo de las zonas visibles que corresponden a la Solución de referencia A. Retirar el gel de sílice de las áreas marcadas y colo-
carlo en un embudo de filtración provisto de un septo poroso G3. 2 Agregar 1O mL de cloroformo caliente, mezclar cui-
dadosamente con la espátula de metal, filtrar empleando vacío y recoger el filtrado en el matraz Erlenmeyer acoplado al
embudo de filtración. Lavar el residuo en el embudo tres veces con éter, aproximadamente 1 O mL cada vez, y recoger el
filtrado en el mismo matraz acoplado al embudo. Evaporar el filtrado hasta un volumen de 4-5 mL, transferir la solución
residual a un tubo de ensayo de 1 O mL, previamente pesado, con fondo cónico y tapón de cierre hermético, y evaporar
hasta sequedad mediante calentamiento moderado en una corriente suave de nitrógeno. Disolver el residuo en unas po-
cas gotas de acetona y evaporar de nuevo hasta sequedad. Colocar a 105º durante aproximadamente 1O minutos, dejar
que se enfríe en un desecador y pesar.
Tratar la Solución de prueba By la Solución de prueba C de la misma forma que se indica para la Solución de prueba A.
Determinación de Esteroles
Solución de prueba D: Agregar al tubo de ensayo que contiene la fracción de esteroles separada de la sustancia de prue-
ba mediante cromatografia en capa delgada, una mezcla preparada recientemente de piridina anhidra, hexametildisilaza-
no y clorotrimetilsilano (9:3:1) [NOTA-Este reactivo también se encuentra comercialmente disponible y se utiliza de ma-
nera equivalente.], en una relación de 50 µL por cada mg de esteroles, evitando cualquier absorción de humedad. Tapar
el tubo de ensayo y agitar cuidadosamente hasta disolver completamente los esteroles. Dejar en reposo durante al menos
15 minutos a temperatura ambiente y centrifugar durante unos pocos minutos si fuera necesario. Usar el sobrenadante.
[NOTA-Es normal que se produzca una leve opalescencia y no causa anomalía. Sin embargo, la formación de un flóculo
blanco o la aparición de un color rosado indica la presencia de humedad o el deterioro del reactivo. Si algo de esto ocu-
rre, se debe repetir la prueba].
Solución de referencia E: Agregar a 9 partes de los esteroles separados del aceite de canola mediante cromatografía en
capa delgada, 1 parte de colesterol. Tratar la mezcla de la misma forma que se indica para la Solución de prueba D.
Solución de referencia F: Tratar los esteroles separados del aceite de girasol mediante cromatografia en capa delgada de
la misma forma que se indica para la Solución de prueba D.
Sistema Cromatográfico
(Ver Cromatografía (621 ).)
Equipar el cromatógrafo de gases con un detector de ionización a la llama y una columna capilar de vidrio o de sílice
fundida de 20-30 m de largo, con un diámetro interno de 0,25-0,32 mm, totalmente recubierta con una capa de fase
estacionaria G27 o G36 de O, 1 O a 0,30 µm. Mantener la temperatura del inyector a 280º, la temperatura del detector a
290º y la temperatura de la columna a 260 ± 5º. El gas transportador es helio con una velocidad lineal de 20-35 cm/so
hidrógeno con una velocidad lineal de 30-50 cm/s. Se usa una relación de partición de 1:50 a 1 :1 OO. Inyectar en el
cromatógrafo Solución de referencia E y Solución de referencia F y registrar el cromatograma según se indica en Procedi-
miento: el tiempo de retención debería ser de 20 ± 5 minutos para jJ-sitosterol y todos los esteroles presentes deben es-
tar separados. El cromatograma obtenido con la Solución de referencia E presenta cuatro picos principales correspondien-
tes a colesterol, brasicasterol, campesterol y f3 -sitosterol; y el cromatograma obtenido con la Solución de referencia F
presenta cuatro picos principales correspondientes a campesterol, estigmasterol, /J-sitosterol y i'l7-estigmastenol. Los
tiempos de retención de los esteroles con referencia a /3-sitosterol se indican en la Tabla 12.
Tabla 12. Tiempos de Retención Relativos de Esteroles para Dos Columnas Diferentes
Identificación Columna G36 Columna G27
Colesterol 0,67 0,63
Brasicasterol 0,73 0,71
24-Metileno-colesterol 0,82 0,80
Campesterol 0,83 0,81
Campestanol 0,85 0,82
Estigmasterol 0,88 0,87
b.7-Campesterol 0,93 0,92
b.5,23-Estigmastadienol 0,95 0,95
Clerosterol 0,96 0,96
f3 -Sitosterol 1,00 1,00
Sitostanol 1,02 1,02

2 Se puede obtener un producto comercial en Kimble/Kontes como un filtro buchner con disco sinterizado, Kimax 28400-152.
USP 40 Pruebas Químicas/ (411) Valoración de Ácido Fálico 373

Tabla 12. Tiempos de Retención Relativos de Esteroles para Dos Columnas Diferentes (Continuación)
Identificación Columna G36 Columna G27
~5-Avenasterol 1,03 1,03
~5,24-Estigmastadienol 1,08 1,08
~7-Estigmastenol 1,12 1,12
~7-Avenasterol 1,16 1,16

Procedimiento: Inyectar por separado en el cromatógrafo volúmenes iguales (aproximadamente 1 µL) de Solución de
prueba O, Solución de referencia E y Solución de referencia F, registrar los cromatogramas y medir las áreas de los picos de
esteroles. Calcular el porcentaje de cada esterol individual en la fracción de esteroles de la sustancia de prueba tomada:
Resultado = 100 x (Al S)
A = área del pico debido al componente de esteroles a determinar
S =suma de las áreas de los picos debidos a los componentes indicados en la Tabla 12

REQUISITOS ADICIONALES
•ESTÁNDARES DE REFERENCIA USP (11)
ER Éster Etílico del Ácido Docosahexaenoico USP
ER Éster Etílico del Ácido Eicosapentaenoico USP
ER Tricosanoato de Metilo USP

(411) VALORACIÓN DE ÁCIDO FÓLICO

INTRODUCCIÓN
Los siguientes procedimientos de cromatografía de líquidos se usan para la determinación de ácido fólico como un ingrediente
farmacéutico activo, un ingrediente de suplemento dietético o un componente de suplementos dietéticos o de formas far-
macéuticas.
Durante estos procedimientos, proteger de la atmósfera y la luz las soluciones que contengan y se deriven de la muestra de
prueba y los Estándares de Referencia, de preferencia usando material de vidrio con protección actínica.

VALORACIÓN
• PROCEDIMIENTO 1
Este procedimiento se puede usar para determinar ácido fólico en los siguientes artículos:
•Tabletas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles con Minerales
• Cápsulas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles con Minerales
•Tabletas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles
• Cápsulas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles
•Tabletas de Vitaminas Hidrosolubles con Minerales
• Cápsulas de Vitaminas Hidrosolubles con Minerales
•Tabletas de Vitaminas Hidrosolubles
• Cápsulas de Vitaminas Hidrosolubles
Este procedimiento implica la extracción de analitos de la formulación usando una Solución de estándar interno que conten-
ga metilparabeno, hidróxido de tetrabutilamonio y ácido pentético en solución amortiguadora de fosfato alcohólica y me-
diante agitación mecánica para liberar los analitos de las matrices.
A menos que se especifique de otro modo en las monografías individuales, las soluciones reactivo, la Solución de estándar
interno, Ja Solución estándar y las Soluciones muestra se preparan según se indica a continuación.
Reactivo A: Solución de hidróxido de tetrabutilamonio al 25% en metanol
Reactivo B: Transferir 5,0 g de ácido pentético a un matraz volumétrico de 50 ml. Usando ultrasonido si fuera necesario,
disolver y diluir con hidróxido de sodio 1 N a volumen.
Fase móvil: 2 g de fosfato monobásico de potasio en 650 ml de agua. Agregar 12,0 ml de Reactivo A, 7,0 ml de ácido
fosfórico 3 N y 240 ml de metanol. Enfriar a temperatura ambiente, ajustar con ácido fosfórico o amoniaco SR a un pH de
7,0, diluir con agua hasta 1000 ml y filtrar. Volver a verificar el pH antes de usar agregando agua o metanol a la Fase móvil
preparada para obtener la separación de ácido fólico y el estándar interno a la altura de la línea de base. El pH puede au-
mentarse hasta 7, 15 para obtener una mejor separación. [NOTA-El contenido de metanol y de agua puede modificarse
(1%-3%).]
Solución de estándar interno: Transferir 40 mg de metilparabeno a un matraz volumétrico de 1000 ml y agregar 220 ml
de metanol para disolver. Disolver 2,0 g de fosfato monobásico de potasio en 300 ml de agua en un vaso de precipitados
separado, transferir cuantitativamente esta solución al matraz que contenga la solución de metilparabeno y agregar 300
ml adicionales de agua. Agregar 19 ml de Reactivo A, 7 ml de ácido fosfórico 3 N y 30 ml de Reactivo B. Ajustar con amo-
3 74 ( 411) Valoración de Ácido Fólico / Pruebas Químicas USP 40

niaco SR a un pH de 9,8, burbujear nitrógeno a través de la solución durante 30 minutos, diluir con agua a volumen y
mezclar.
Solución estándar: 0,016 mg/ml de ER Ácido Fólico USP en la Solución de estándar interno
Solución muestra para Tabletas: Triturar no menos de 30 Tabletas hasta reducirlas a polvo fino. Transferir una porción de
polvo, equivalente a 0,4 mg de ácido fólico, a un tubo de centrífuga de color ámbar de 50 ml. Agregar 25,0 ml de Solu-
ción de estándar interno, agitar mecánicamente durante 1O minutos y centrifugar. Filtrar una porción del sobrenadante
transparente y usar el filtrado.
Solución muestra para Cápsulas: Pesar no menos de 20 Cápsulas en un frasco de pesada tarado. Abrir las Cápsulas, sin
perder el material de la cubierta, y transferir el contenido a un vaso de precipitados de 100 ml. Retirar todo el contenido
adherido a las cubiertas de las Cápsulas vacías lavando, si fuera necesario, con varias porciones de éter. Desechar los lava-
dos y secar las cubiertas de las Cápsulas con ayuda de una corriente de aire hasta que deje de percibirse el olor a éter. Pesar
las cubiertas de las cápsulas vacías en el frasco de pesada tarado y calcular el peso neto promedio por Cápsula. Transferir
una cantidad del contenido de las Cápsulas a un tubo de centrífuga adecuado y agregar un volumen de Solución de están-
dar interno para obtener una concentración de 0,016 mg/ml de ácido fólico. Agitar mecánicamente durante 1O minutos y
centrifugar. Filtrar una porción del sobrenadante transparente y usar el filtrado.
Sistema cromatográfico
(Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
Detector: UV 280 nm
Columna: 4,6 mm x 25 cm; relleno L1
Velocidad de flujo: 1 ml/min
Volumen de Inyección: 15 µL
Aptitud del sistema
Muestra: Solución estándar
[NOTA-Los tiempos de retención relativos para ácido fólico y metilparabeno son aproximadamente 0,8 y 1,0, respectiva-
mente.]
Requisitos de aptitud
Desviación estándar relativa: No más de 3,0%
Análisis
Muestras: Solución estándar y Solución muestra correspondiente
Calcular el porcentaje de la cantidad declarada de ácido fólico (C 19 H19 NP6 ) en la porción de Muestra tomada:
Resultado= (RufR 5) x (C5/Cu) x 100

Ru =cociente de estándar interno (respuesta del pico de ácido fólico/respuesta del pico del estándar interno) de la
Solución muestra correspondiente
R5 =cociente de estándar interno (respuesta del pico de ácido fólico/respuesta del pico del estándar interno) de la
Solución estándar
C5 =concentración de ER Ácido Fólico USP en la Solución estándar (µg/ml)
Cu = concentración nominal de ácido fólico en la Solución muestra correspondiente (µg/ml)
• PROCEDIMIENTO 2
Este procedimiento se puede usar para determinar el ácido fólico en los siguientes artículos:
•Tabletas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles con Minerales
• Cápsulas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles con Minerales
• Tabletas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles
• Cápsulas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles
•Tabletas de Vitaminas Hidrosolubles con Minerales
• Cápsulas de Vitaminas Hidrosolubles con Minerales
•Tabletas de Vitaminas Hidrosolubles
• Cápsulas de Vitaminas Hidrosolubles
Este procedimiento implica la extracción de analitos de la formulación usando una solución de extracción que contenga
una mezcla de edetato disódico e hidróxido de amonio o una mezcla de metanol, ácido acético glacial y etilenglicol, y
mediante agitación mecánica para liberar los analitos de las matrices.
A menos que se especifique de otro modo en las monografías individuales, la solución reactivo, el Diluyente, la Solución ma-
dre del estándar, las Soluciones estándar y las Soluciones muestra se preparan según se indica a continuación.
Reactivo: Disolver 7,5 g de edetato disódico, mezclando, en 500 ml de agua que contenga 1O ml de hidróxido de amo-
nio.
Diluyente: 60 µg/ml de hidróxido de amonio
Fase móvil: Transferir 0,4 ml de trietilamina, 15 ml de ácido acético glacial y 350 ml de metanol a un matraz volumétrico
de 2000 ml, y diluir con 1-hexanosulfonato de sodio 0,008 M a volumen.
Solución madre del estándar: 60 µg/ml de ER Ácido Fólico USP en Diluyente. Preparar esta solución a diario.
USP 40 Pruebas Químicas/ (411) Valoración de Ácido Fólico 375

Solución estándar para Tabletas: Mezclar 5,0 ml de Solución madre del estándar con 10,0 ml de metano! y 35,0 ml de
Reactivo. Agitar durante 15 minutos en un baño de agua mantenido a 60º y enfriar. Filtrar, desechando los primeros ml del
filtrado.
Solución estándar para Cápsulas: Mezclar 5,0 ml de Solución madre del estándar con 10,0 ml de una mezcla de metano!
y ácido acético glacial (9:1) y 30,0 ml de una mezcla de metano! y etilenglicol (1 :1 ). Agitar durante 15 minutos en un
baño de agua mantenido a 60º y enfriar. Filtrar, desechando los primeros ml del filtrado.
Solución muestra para Tabletas: Transferir una porción de Tabletas reducidas a polvo fino, equivalente a 0,3 mg de ácido
fólico, a un matraz de 125 ml con tapón. Agregar 10,0 ml de metano! y 35,0 ml de Reactivo. Agitar durante 15 minutos
en un baño de agua mantenido a 60º y enfriar. Filtrar, desechando los primeros ml del filtrado.
Solución muestra para Cápsulas: Pesar no menos de 20 Cápsulas en un frasco de pesada tarado. Abrir las Cápsulas, sin
perder el material de la cubierta, y transferir el contenido a un vaso de precipitados de 100 ml. Retirar todo el contenido
adherido a las cubiertas de las Cápsulas vacías lavando, si fuera necesario, con varias porciones de éter. Desechar los lava-
dos y secar las cubiertas de las Cápsulas con ayuda de una corriente de aire hasta que deje de percibirse el olor a éter. Pesar
las cubiertas de las cápsulas vacías en el frasco de pesada tarado y calcular el peso neto promedio por Cápsula. Transferir
una cantidad del contenido de las Cápsulas, equivalente a 0,3 mg de ácido fólico, a un matraz de 125 ml con tapón. Agre-
gar 10,0 ml de una mezcla de metano! y ácido acético glacial (9:1) y 30,0 ml de una mezcla de metano! y etilenglicol
(1 :1 ). Agitar durante 15 minutos en un baño de agua mantenido a 60º y enfriar. Filtrar, desechando los primeros ml del
filtrado.
Sistema cromatográfico
(Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
Detector: UV 270 nm
Columna: 4,6 mm x 25 cm; relleno L7
Temperatura de la columna: 50º
Velocidad de flujo: 2 ml/min
Volumen de Inyección: 5 µL
Aptitud del sistema
Muestra: Solución estándar
Requisitos de aptitud
Desviación estándar relativa: No más de 2,0%
Análisis
Muestras: Solución estándar correspondiente y Solución muestra correspondiente
Calcular el porcentaje de la cantidad declarada de ácido fólico (C 19 H19 N,0 6) en la porción de Muestra tomada:
Resultado= (ruf r5) x (C5/Cu) x 100

ru = respuesta del pico de ácido fólico de la Solución muestra correspondiente

r5 = respuesta del pico de ácido fólico de la Solución estándar correspondiente
C5 = concentración de ER Ácido Fólico USP en la Solución estándar correspondiente (µg/ml)
Cu =concentración nominal de ácido fólico en la Solución muestra correspondiente (µg/ml)
• PROCEDIMIENTO 3
Este procedimiento se puede usar para determinar el ácido fólico en los siguientes artículos:
• Ingrediente farmacéutico activo
• Ingrediente dietético
Este procedimiento implica la disolución de analitos y estándar interno en Fase móvil.
A menos que se especifique de otro modo en las monografías individuales, las soluciones reactivo, la Solución de estándar
interno, la Solución madre del estándar, la Solución estándar, la Solución madre de la muestra y la Solución muestra se prepa-
ran según se indica a continuación.
Ácido fosfórico 3 N: 98 g/L de ácido fosfórico en agua
Hidróxido de amonio 6 N: Diluir 40 ml de hidróxido de amonio con agua hasta 100 ml.
Fase móvil: Transferir 2,0 g de fosfato monobásico de potasio a un matraz volumétrico de 1000 ml y disolver en 650 ml
de agua. Agregar 15,0 ml de una solución de hidróxido de tetrabutilamonio 0,5 M en metano!, 7,0 ml de Ácido fosfórico
3 N y 270 ml de metano!. Enfriar a temperatura ambiente, ajustar con Ácido fosfórico 3 No Hidróxido de amonio 6 Na un
pH de 5,0 y diluir con agua a volumen. Volver a verificar el pH antes de usar.
Solución de estándar interno: 2 mg/ml de metilparabeno en Fase móvil. Disolver el metilparabeno primero con metano!
(aproximadamente 4% del volumen final) y diluir con Fase móvil a volumen.
Solución madre del estándar: 1 mg/ml de ER Ácido Fólico USP en Fase móvil. Disolver el ácido fólico con ayuda de hidró-
xido de amonio al 10% (aproximadamente 1% del volumen final) y diluir con Fase móvil a volumen.
Solución estándar: Transferir 4,0 ml de Solución madre del estándar y 4,0 ml de Solución de estándar interno a un matraz
volumétrico de 50 ml y diluir con Fase móvil a volumen.
Solución madre de la muestra: Transferir 100 mg de ácido fólico a un matraz volumétrico de 100 ml y disolver en 40 ml
de Fase móvil y 1 ml de hidróxido de amonio al 10%. Diluir con Fase móvil a volumen.
376 (411) Valoración de Ácido Fólico / Pruebas Químicas USP 40

Solución muestra: Transferir 4,0 ml de Solución madre de Ja muestra y 4,0 ml de Solución de estándar interno a un matraz
volumétrico de 50 ml y diluir con Fase móvil a volumen.
Sistema cromatográfico
(Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
Detector: UV 280 nm
Columna: 4,6 mm x 25 cm; relleno L1
Velocidad de flujo: 1,2 ml/min
Volumen de Inyección: 1 O µL
Aptitud del sistema
Muestra: Solución estándar
Requisitos de aptitud
Resolución: No menos de 3,6 entre metilparabeno y ácido fólico
Desviación estándar relativa: No más de 2,0% para los cocientes de respuesta entre los picos de ácido fólico y están-
dar interno
Análisis
Muestras: Solución estándar y Solución muestra
Calcular el porcentaje de ácido fólico (C 19 H19 N¡Ü 6) en la porción de Muestra tomada:

Resultado= (Ruf R5) x (C5/Cu) x 100

Ru =cociente de estándar interno (respuesta del pico de ácido fólico/respuesta del pico del estándar interno) de la
Solución muestra
R5 =cociente de estándar interno (respuesta del pico de ácido fólico/respuesta del pico del estándar interno) de la
Solución estándar
C5 = concentración de ER Ácido Fólico USP en la Solución madre del estándar (mg/ml)
Cu = concentración de ácido fólico en la Solución madre de la muestra (mg/ml)
• PROCEDIMIENTO 4
Este procedimiento se puede usar para determinar el ácido fólico en los siguientes artículos:
•Tabletas de Ácido Fólico
• Inyección de Ácido Fólico
Este procedimiento implica la disolución de analitos en un Diluyente que contenga 2 ml de hidróxido de amonio y 1 g de
perclorato de sodio por cada 100 ml de agua.
A menos que se especifique de otro modo en las monografías individuales, preparar el Diluyente, Ja Solución de aptitud del
sistema, la Solución estándar y las Soluciones muestra según se indica a continuación.
Fase móvil: Transferir 35, l g de perclorato de sodio y 1,40 g de fosfato monobásico de potasio a un matraz volumétrico
de 1 litro. Agregar 7,0 ml de hidróxido de potasio 1 N y 40 ml de metano!, diluir con agua a volumen y mezclar. Ajustar
con hidróxido de potasio 1 N o ácido fosfórico a un pH de 7,2.
Diluyente: Solución acuosa que contenga 2 ml de hidróxido de amonio y 1 g de perclorato de sodio por cada 100 ml.
Solución de aptitud del sistema: 0,2 mg/ml de ER Ácido Fólico USP y de ER Compuesto Relacionado A de Ácido Fólico
USP en Diluyente. [NOTA-Antes de usar, pasar a través de un filtro con un tamaño de poro de 1 µm o menor.]
Solución estándar: 0,20 mg/ml de ER Ácido Fólico USP en Diluyente
Solución muestra para Tabletas: Equivalente a 0,2 mg/ml de ácido fólico, a partir de no menos de 20 Tabletas reducidas
a polvo en Diluyente. Agitar suavemente para facilitar la disolución y filtrar, desechando los primeros ml del filtrado.
Solución muestra para Inyección: Diluir con Diluyente un volumen de Inyección medido con exactitud, cuantitativamente
y en diluciones sucesivas, hasta obtener una solución con una concentración cercana a la de la Solución estándar y entre
0,20 y 0,80 mg/ml.
Sistema cromatográfico
(Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
Detector: UV 254 nm
Columna: 4,6 mm x 25 cm; relleno L1
Velocidad de flujo: 1 ml/min
Volumen de Inyección: 25 µL
Aptitud del sistema
Muestras: Solución de aptitud del sistema y Solución estándar
Requisitos de aptitud
Resolución: No menos de 3,6 entre compuesto relacionado A de ácido fólico y ácido fólico, Solución de aptitud del sis-
tema
Desviación estándar relativa: No más de 2,0%, Solución estándar
Análisis
Muestras: Solución estándar y Solución muestra correspondiente
USP 40 Pruebas Químicas/ (413) Análisis de Impurezas en Gases Medicinales 377

Calcular el porcentaje de ácido fólico (C 19 H19 NP 6) en la porción de Tabletas tomada:

Resultado= (ruf r5) x (C5/Cu) x 100

ru = respuesta del pico de ácido fólico de la Solución muestra para Tabletas

r5 = respuesta del pico de ácido fólico de la Solución estándar
C5 = concentración de ER Ácido Fólico USP en la Solución estándar (mg/ml)
Cu =concentración nominal de ácido fálico en la Solución muestra para Tabletas (mg/ml)
Calcular la cantidad, en mg, de ácido fólico (C 19 H19 NP 6) en cada ml de Inyección tomado:
Resultado= (ruf r5) x (C5/Vu) x V

ru = respuesta del pico de ácido fólico de la Solución muestra para Inyección

r5 = respuesta del pico de ácido fólico de la Solución estándar
C5 =concentración de ER Ácido Fólico USP en la Solución estándar (mg/ml)
Vu =volumen de Inyección tomado para preparar la Solución muestra para Inyección (ml)
V =volumen total usado para diluir la Inyección (ml)

REQUISITOS ADICIONALES
• ESTÁNDARES DE REFERENCIA USP (11)
ER Ácido Fólico USP
ER Compuesto Relacionado A de Ácido Fólico USP
Formiltetrahidrofolato de calcio.

(413) ANÁLISIS DE IMPUREZAS EN GASES MEDICINALES

INTRODUCCIÓN

El presente capítulo de prueba general define los medios seguros y apropiados para el muestreo de envases de gases a alta
presión conteniendo distintas composiciones de gases medicinales usando tubos detectores de acuerdo con las monografías
USP, y utilizando el volumen total de gas recomendado por el fabricante del tubo detector. Ver Reactivos en la sección Reacti-
vos, Indicadores y Soluciones para información sobre cada tubo detector referido.
En la actualidad se fabrican dos tipos de tubos detectores: aquellos que se utilizan con una bomba manual de volumen fijo
(p.ej., 100 ml/bombeo) y aquellos que se usan en un sistema de flujo continuo que se puede ajustar para pasar un volumen
de gas a través del tubo detector a aproximadamente 1 atmósfera. Es importante usar un tipo de tubo detector que corres-
ponda con el modo de intercambio de volumen de gas.
Para asegurar el paso del volumen de gas requerido a través del tubo detector, medir el volumen de gas al momento del
análisis usando una bomba manual o un caudalímetro calibrado para el gas que se analiza o corregido mediante un gráfico de
calibración. Los fabricantes de caudalímetros por lo general proveen gráficos de volumen de flujo para gases comunes con ca-
da uno de los tubos identificados en este capítulo general. [NOTA-Ver el capítulo general Valoración de Gases Medicinales
(415) para el muestreo.]

SISTEMA DE FLUJO CONTINUO

Identificar el gas contenido en el envase y seleccionar el regulador de gas apropiado. Conectar el regulador al envase del
gas. No aplicar lubricante o cinta de Teflón a las conexiones entre el envase y el regulador. Purgar el regulador con el gas en
análisis. Ajustar el nivel del flotador para obtener la velocidad de flujo adecuada a fin de lograr el volumen total de gas reco-
mendado por el fabricante. Acoplar el tubo detector, luego ajustar la velocidad de flujo al nivel requerido, según se indica en
los gráficos que acompañan al caudalímetro y al tubo detector. Cronometrar para alcanzar el volumen total de gas requerido
±1O segundos al flujo fijado. En el tiempo establecido, cerrar la válvula del regulador y luego la válvula principal del envase.
Observar el tubo mientras continúe conectado para determinar el grado de cambio de color y registrar el resultado. Retirar el
tubo y desconectar el aparato, equilibrar la presión de gas en el regulador permitiendo que el gas se libere a la atmósfera y
desconectar el regulador del envase. Desechar el tubo después de su uso.

BOMBA MANUAL DE VOLUMEN FIJO

El método alternativo consiste en aplicar la bomba manual detectora de gases. El sistema extrae un volumen constante con
cada bombeo. Para asegurar la exactitud del volumen total de gas, el usuario debe seguir las recomendaciones de bombeo
sugeridas por el fabricante de la bomba.
378 (415) Valoración de Gases Medicinales/ Pruebas Químicas USP 40

(415) VALORACIÓN DE GASES MEDICINALES

INTRODUCCIÓN

Las monografías de gases medicinales USP tienen como propósito evaluar la pureza de un gas usado para tratamiento médi-
co o como componente de un proceso farmacéutico. En general, la pureza se evalúa mediante una valoración del contenido
del artículo y mediante análisis de trazas de impurezas. La aplicación de cromatografía de gases, análisis paramagnético y tu-
bos detectores para gases medicinales varía con respecto a los procedimientos tradicionales usados para analitos en fase líqui-
da y, por lo tanto, requiere de una descripción separada. Este capítulo de pruebas generales se centra en la valoración para
pruebas de contenido. El muestreo de impurezas se trata en el capítulo general Análisis de Impurezas en Gases Medicinales
(413).
Este capítulo incluye los aspectos relacionados con el muestreo y la calificación para el análisis por cromatografía de gases y
análisis paramagnético de gases medicinales. Asimismo, este capítulo incluye una descripción de la configuración, validación y
calibración iniciales de estos instrumentos. Los procedimientos específicos de valoración se definen en la monografía específica
para cada gas.
Las definiciones básicas sobre calificación y validación instrumental se incluyen en los capítulos de información general Califi-
cación de Instrumentos Analíticos (1058) y Validación de Procedimientos Farmacopeicos (1225), respectivamente, por lo que no se
repiten en este capítulo. No obstante, cuando debido a la naturaleza del analito se requieran variaciones de los materiales pre-
sentados en los capítulos mencionados, tales variaciones serán definidas en este capítulo.

MÉTODOS

Cromatografía de Gases (GC)

Ver Cromatografía (621 ).

Detectores para Valoración de Gases Medicinales

Los dos detectores más comunes usados en los análisis de gases medicinales son el detector de conductividad térmica (TCD,
por sus siglas en inglés) y el detector de ionización a la llama (FID, por sus siglas en inglés).
El TCD detectará cualquier gas o vapor que tenga una conductividad térmica que difiera significativamente de la alta con-
ductividad térmica del gas de referencia, por lo regular helio, y por lo tanto, es prácticamente universal. Sin embargo, el límite
de detección más bajo generalmente aceptado para el TCD es 50 ppm v/v. Esto representa una limitación para la evaluación
de trazas de impurezas en gases medicinales.
El FID también se usa para la evaluación de trazas de impurezas en gases medicinales, debido a que es más sensible a com-
puestos orgánicos pero no produce señales para los gases medicinales más comunes.

CALIFICACIÓN

Calificación de la Instalación (IQ, por sus siglas en inglés)

Los requisitos de la IQ aseguran que el hardware y el software (o dispositivo de lectura) del cromatógrafo de gases se instale
de manera segura y de acuerdo con las instrucciones del fabricante del Cromatógrafo de Gases.
Se debe tener en cuenta lo siguiente según sea aplicable:
•Aptitud del sistema de la muestra (incluyendo conexiones);
• Fugas (debe estar exento de fugas);
• Muestreo representativo;
• Velocidad de flujo de la muestra;
•Tiempo de respuesta;
• Señales de encendido correcto;
• Suministro de energía (incluyendo regulación de voltaje); y
• Condiciones ambientales apropiadas del instrumento y de la muestra misma (p.ej., temperatura y presión).

Calificación Operativa (OQ, por sus siglas en inglés)

La OQ verifica que el desempeño del Cromatógrafo de Gases sea el previsto dentro de su intervalo de operación esperado.
Para el análisis de producto final del gas medicinal, el Cromatógrafo de Gases se prueba para asegurar la repetibilidad (verifica-
ción de que la desviación estándar relativa se corresponde con lo declarado) para cada analito de interés. Debido a la naturale-
USP 40 Pruebas Químicas/ (415) Valoración de Gases Medicinales 379

za específica del análisis de gases medicinales y al número limitado de analitos, en lugar de la OQ inicial o periódica, se pueden
usar la calibración de rutina y la verificación de calibración periódica del Cromatógrafo de Gases, así como el procedimiento de
análisis. Cuando un instrumento se usa para un rango más amplio de analitos, resulta inapropiado realizar la calibración y la
verificación de calibración periódica en lugar de la OQ.

Calificación de Desempeño (PQ, por sus siglas en inglés)

Para el análisis de producto final de los gases medicinales, el Cromatógrafo de Gases se verifica de manera periódica en in-
tervalos apropiados durante los análisis con un gas de calibración (es decir, verificando que los resultados se correspondan con
una determinada concentración en un intervalo de exactitud y precisión aceptables después de un número específico de inyec-
ciones de la muestra).

Medición Paramagnética de Oxígeno

TEORÍA

El analizador paramagnético mide el desplazamiento de un gas diamagnético (nitrógeno) ocasionado por un gas paramag-
nético (oxígeno), en un campo magnético fuerte. Una celda de medición por lo general emplea dos esferas de vidrio conecta-
das por un tubo rellenas de nitrógeno, que se suspenden sobre una cinta de torsión entre imanes que concentran el flujo alre-
dedor de las esferas de vidrio. Cuando las moléculas de oxígeno ingresan a la celda de medición, las esferas de vidrio se mue-
ven por la fuerza ejercida por las moléculas de oxígeno, que son atraídas a la parte más fuerte del campo magnético. Mediante
el uso de sensores ópticos, una bobina de retroalimentación y aparatos electrónicos adecuados, los analistas miden una res-
puesta que es directamente proporcional a la presión parcial de oxígeno.
El oxígeno es el único gas paramagnético de la atmósfera que se encuentra por encima de los niveles de trazas. No obstante,
los analizadores paramagnéticos se pueden ver afectados por la susceptibilidad magnética del gas acompañante. Por lo tanto,
se debe evitar hacer cambios a los gases acompañantes en las monografías USP.

Consideraciones del Diseño

Las consideraciones del diseño para la adquisición de nuevos instrumentos pueden incluir los siguientes parámetros:

DERIVA

Cambio de la respuesta del instrumento para una concentración determinada durante un tiempo establecido en condiciones
constantes y sin ajustes del instrumento por medios externos. La deriva es la suma de dos componentes, deriva del cero y deri-
va de medición. La deriva determina la frecuencia con que se debe calibrar el instrumento.

DERIVA DEL CERO

Cambio en la respuesta cuando se mide gas cero.

DERIVA DE MEDICIÓN

Cambio en la respuesta con respecto a la concentración de oxígeno durante la medición del gas.

TEMPERATURA DE OPERACIÓN

El intervalo de temperatura ambiente en el que continuará siendo válida la especificación de desempeño declarada del ins-
trumento. Un coeficiente de temperatura mayor indicará que se permite un cambio más pequeño en la temperatura ambiente
antes de que se requiera la recalibración.

PRESIÓN OPERATIVA

El instrumento debe operar a las presiones de entrada de las muestras a analizar.

380 (415) Valoración de Gases Medicinales / Pruebas Químicas USP 40

Aspectos de la Calificación

CALIFICACIÓN DE LA INSTALACIÓN (IQ)

Los requisitos de la IQ aseguran que el hardware y el software (o dispositivo de lectura) del analizador de oxígeno se instale
de manera segura y de acuerdo con las instrucciones del fabricante del analizador de oxígeno.
Se debe tener en cuenta lo siguiente según sea aplicable:
•Aptitud del sistema de la muestra (incluyendo conexiones);
• Fugas (debe estar exento de fugas);
• Muestreo representativo;
• Velocidad de flujo de la muestra;
•Tiempo de respuesta;
• Señales de encendido correcto;
• Suministro de energía (incluyendo regulación de voltaje); y
• Condiciones ambientales apropiadas del instrumento y de la muestra misma (p.ej., temperatura y presión).

CALIFICACIÓN OPERATIVA (OQ)

Los requisitos de la OQ verifican que el desempeño del analizador paramagnético sea el previsto dentro de su intervalo de
operación esperado y que sea adecuado para las condiciones reales de uso. Los instrumentos y aparatos se deben calibrar y
usar de acuerdo con las instrucciones del fabricante del analizador de oxígeno. Debido a la naturaleza específica del instrumen-
to, en lugar de la OQ inicial y periódica, se puede usar la calibración de rutina.

CALIFICACIÓN DEL DESEMPEÑO (PQ)

Los requisitos de la PQ verifican que el desempeño del analizador paramagnético sea el esperado en su ambiente normal
operativo. Para el análisis de producto final de los gases medicinales, el analizador paramagnético se calibra inicialmente [ajus-
tando a cero y calibrando (spanning) mediante un estándar certificado] de acuerdo con las instrucciones del fabricante del
analizador de oxígeno y se recalibra periódicamente para asegurar un desempeño continuo aceptable.

AJUSTE A CERO DEL INSTRUMENTO (ESTABLECIMIENTO DEL LÍMITE INFERIOR)

Usando el estándar certificado definido en la monografía, ajustar a cero el analizador pasando el gas cero en el analizador a
la velocidad de flujo recomendada por el fabricante del analizador de oxígeno. Mantener el flujo hasta que se observe una
lectura estable en el instrumento. Conforme se requiera, ajustar la configuración de la posición del cero a un valor de 0,0% de
acuerdo con las instrucciones del fabricante del analizador de oxígeno. Confirmar que la lectura sea estable. [NOTA-Depen-
diendo del uso previsto del instrumento, una alternativa aceptable a este procedimiento es cambiar la configuración de la posi-
ción del cero a un valor diferente de 0,0%, siempre que proporcione una mayor precisión en la medición.]

CALIBRACIÓN (SPANNING) DEL INTERVALO DE USO

Establecer el límite superior (span) con un gas de calibración (span gas) definido en la monografía y apropiado para el inter-
valo de uso. Pasar el gas de calibración a través del instrumento a la velocidad de flujo sugerida por el fabricante. Confirmar
que la lectura sea estable. Ajustar la configuración de la calibración al valor certificado del estándar de referencia de acuerdo
con las instrucciones del fabricante del analizador de oxígeno. Confirmar que la lectura sea estable.

VALIDACIÓN

La validación de este instrumento por lo general se completa durante el proceso (IQ/OQ). La verificación de rutina se lleva a
cabo según se describe en las secciones OQ/PQ de este capítulo y, por lo tanto, no se requiere de información específica sobre
la validación del instrumento.

PROCEDIMIENTO

Para Instrumentos Fuera de Línea

Antes del análisis, ajustar el cero del instrumento y calibrar (span) según se describe en la sección PQ. [NOTA-La calibración
no debe correrse concomitantemente con las muestras de prueba.] Conectar el gas muestra al instrumento y establecer un
flujo constante en el analizador a la velocidad de flujo recomendada por el fabricante del analizador. Mantener el flujo hasta
USP 40 Pruebas Químicas/ (425) Antibióticos-Valoración Yodométrica 381

que se observe una lectura constante en el instrumento. La definición de lectura constante se incluye en las instrucciones del
fabricante del analizador o en la documentación para calificación del instrumento del usuario.

Para Instrumentos en Línea

Los intervalos de calibración son definidos por el fabricante del analizador, por el historial o por medios estadísticos. Estable-
cer un flujo constante en el analizador a la velocidad de flujo recomendada por el fabricante.

MUESTREO

Muestreo de Fase Líquida

Los cilindros que contienen un tubo de inmersión permiten obtener una muestra líquida a partir de la salida de la válvula
con el cilindro en posición vertical. Si no se cuenta con un tubo de inmersión, el cilindro debe colocarse en posición invertida
con el cilindro y la válvula principal sostenidas de manera segura (de modo que la fase líquida esté en contacto con la válvula).
El muestreo de gases medicinales siempre debe realizarse usando el regulador requerido. Los reguladores deben purgarse
con el gas que se va a muestrear. Cuando sea necesario, se debe medir el flujo hacia el analizador usando un caudalímetro
calibrado.

Muestreo de Fase Gaseosa

Los cilindros que no cuentan con un tubo de inmersión permiten obtener una muestra gaseosa de la salida de la válvula con
el cilindro en posición vertical. Si se cuenta con un tubo de inmersión, el cilindro debe colocarse en posición invertida con el
cilindro y la válvula principal sostenidas de manera segura (de modo que la fase gaseosa esté en contacto con el tubo de in-
mersión). El muestreo de gases medicinales siempre debe realizarse usando el regulador requerido.

ESTÁNDARES CERTIFICADOS PARA EL ANÁLISIS DE GASES MEDICINALES

Las monografías USP para gases medicinales requieren de pruebas que usan estándares certificados para la calibración del
instrumento y determinaciones analíticas. Tales análisis farmacopeicos se pueden llevar a cabo usando materiales de referencia
rastreables al U.S. National lnstitute of Standards and Technology (Instituto Nacional de Estándares y Tecnología de EE.UU.,
[NIST]) u otras organizaciones de estándares nacionales, p.ej., el lnstitute for National Measurement Standards (Instituto Na-
cional de Estándares de Medición, Canadá). Las monografías individuales, así como la sección de reactivos, indicadores y solu-
ciones hacen referencia al porcentaje nominal de diversos estándares certificados requeridos para llevar a cabo los análisis de
gases medicinales. Los requisitos para las concentraciones certificadas reales en términos de varianza del valor nominal se indi-
can en la sección Reactivos, Indicadores y Soluciones para cada estándar certificado pertinente.

(425) ANTIBIÓTICOS-VALORACIÓN YODOMÉTRICA

El siguiente método se utiliza para la valoración de la mayoría de los medicamentos antibióticos farmacopeicos derivados de la
penicilina y sus formas farmacéuticas, cuando la valoración yodométrica resulta particularmente apropiada.

VALORACIÓN

Ct1mbio en lá redacción:

Preparación estándar: Disolver en el disolvente especificado en la tabla de Disolventes y Concentraciones Finales una canti-
dad adecuada del Estándar de Referencia USP especificado en la monografía individual, previamente secado bajo las condi-
ciones citadas en la monografía individual y pesado con exactitud, y diluir cuantitativamente y en diluciones sucesivas, con
el mismo disolvente hasta obtener una solución con una concentración conocida aproximada a la que se especifica en la
tabla. Pipetear 2,0 mL de esta solución y transferir a cada uno de dos matraces Erlenmeyer de 125 mL con tapón de vidrio.
Disolventes y Concentraciones Finales
Concentración
Antibiótico Disolvente* Final
Amoxicilina Agua 1,0 mg por ml
Ampicilina Agua 1,25 mg por ml
* A menos que se indique algo diferente, las Soluciones Amortiguadoras son las soluciones amortiguadoras de fosfato de potasio definidas en la sección Medios y
Diluyentes en Antibióticos-Valoraciones Microbiológicas (81 ), excepto que no se requiere su esterilización antes de usarlas.
382 (425) Antibióticos-Valoración Yodométrica /Pruebas Químicas USP 40

Disolventes y Concentraciones Finales (Continuación)

Concentración
Antibiótico Disolvente* Final
Ampicilina Sódica •Solución Amortiguadora B. 1 l ,2S mg por ml
• IAF l'IJ .m>v.1011\
Cloxacilina Sódica Agua 1,25 mg por ml
Ciclacilina Agua 1,0 mg por ml
Dicloxacilina Sódica •Solución Amortiguadora. B. 1 1,25 mg por ml
• t~t ri1::...x. . :'"; ~·
Meticilina Sódica •Solución Amortiguadora B.1 1,25 mg por ml
., :'nr•n. ~~..)M~'

Nafcilina Sódica •Solución Amortiguadora 8.1 1,25 mg por ml

• IAl'm:..;.;L?o17\

Oxacilina Sódica •Solución AmMigumiofa· B.1 1,25 mg por ml

• '""º'·-·';_,ri~?\
Penicilina G Potásica •sal1,1Cl6n Amortiguadora 8.·1 2000 unidades por ml
• rA• 01 ""'ª~c?0171
Penicilina G Sódica • Solutión Amortiguadora B. 1 2000 unidades por ml
a IA< 01.--··201 ll
Penicilina V Potásica •solución Amortígt;iai:iotd B. 1 2000 unidades por ml
• "" 01.~"'·2017l
Feneticilina Potásica •Solución AmortiguiJdora B. 1 2000 unidades por ml
• IAF.Ol-""• .>n1 '>'
0

* A menos que se indique algo diferente, las Soluciones Amortiguadoras son las soluciones amortiguadoras de fosfato de potasio definidas en la sección Medios y
Diluyentes en Antibióticos-Va/oraciones Microbiológicas (81 ), excepto que no se requiere su esterilización antes de usarlas.

Preparación de valoración: A menos que se especifique de otro modo en la monografía individual, disolver en el disol-
vente especificado en la tabla de Disolventes y Concentraciones Finales una cantidad adecuada, pesada con exactitud, de la
muestra en análisis y diluir cuantitativamente con el mismo disolvente hasta obtener una solución con una concentración
final conocida aproximada a la que se especifica en la tabla. Pipetear 2 ml de esta solución y transferir a cada uno de dos
matraces Erlenmeyer de 125 ml con tapón de vidrio.
Procedimiento
lnactivación y Volumetría: Agregar 2,0 ml de hidróxido de sodio 1,0 N a 2,0 ml de la Preparación estándar y de la Prepa-
ración de valoración, en sus respectivos matraces, mezclar por rotación moderada y dejar en reposo durante 15 minutos.
Agregar a cada matraz 2,0 ml de ácido clorhídrico 1,2 N y 10,0 ml de yodo 0,01 N SV. Tapar de inmediato y dejar en
reposo durante 15 minutos. Valorar con tiosulfato de sodio 0,01 N SV. Agregar 1 gota de pasta de almidón yoduro SR al
acercarse al punto final y continuar la volumetría hasta que el color azul desaparezca.
Determinación con un blanco: En un matraz que contenga 2,0 ml de la Preparación estándar, agregar 10,0 ml de yodo
0,01 N SV. Si la Preparación estándar contiene amoxicilina o ampicilina, agregar de inmediato O, 1 ml de ácido clorhídrico
1,2 N. Valorar de inmediato con tiosulfato de sodio 0,01 N SV. Agregar 1 gota de pasta de almidón yoduro SR cerca del
punto final y continuar la volumetría hasta que el color azul desaparezca. Tratar en forma similar un matraz que contenga
2,0 ml de la Preparación de valoración.
Cálculos
Calcular los microgramos (o unidades) equivalentes (F) a cada ml de tiosulfato de sodio 0,01 N consumido por la Prepara-
ción estándar, por la fórmula:

Resultado= (2CP)/(B - /)
C = concentración de Estándar de Referencia en la Preparación estándar (mg/ml)
P = potencia del Estándar de Referencia (µg/mg o unidades/mg)
B =volumen de tiosulfato de sodio 0,01 N consumido en la Determinación con un blanco (ml)
I =volumen de tiosulfato de sodio 0,01 N consumido en la lnactivación y volumetría (ml)
USP 40 Pruebas Químicas/ (429) Medición del Tamaño de Partícula por Difracción de Luz 383

Calcular la potencia de la muestra en análisis por la fórmula especificada en la monografía individual.

(429) MEDICIÓN DEL TAMAÑO DE PARTÍCULA POR DIFRACCIÓN DE

LUZ

INTRODUCCIÓN

El método se basa en las normas ISO 73320- 7(7 999) y 92 76- 7(7 998).
Este capítulo general ha sido armonizado con los textos correspondientes de la Farmacopea Europea y/o la Farmacopea japo-
nesa.
La técnica de difracción de luz láser usada para la determinación de la distribución del tamaño de las partículas se basa en el
análisis del patrón de difracción producido cuando las partículas se exponen a un haz de luz monocromática. Históricamente,
los primeros instrumentos de difracción láser usaban sólo dispersión en ángulos pequeños. No obstante, desde entonces la
técnica se ha ampliado para incluir dispersión de la luz láser en un intervalo angular más amplio y la aplicación de la teoría de
Mie, además de la aproximación de Fraunhofer y de la difracción anómala.
La técnica no puede distinguir entre dispersión por partículas individuales y dispersión por grupos de partículas primarias, es
decir por aglomerados o agregados. Dado que la mayoría de las muestras de partículas contienen aglomerados o agregados y
como el foco de interés generalmente se centra en la distribución del tamano de las partículas primarias, los grupos por lo
general se dispersan en partículas primarias antes de la medición.
Para partículas no esféricas, se obtiene una distribución de tamaño de esferas equivalentes, debido a que la técnica supone
en su modelo óptico que las partículas son esféricas. La distribución de tamaño de partícula resultante puede diferir de la obte-
nida por métodos que se basan en otros principios físicos (p.ej., sedimentación, tamizado).
Este capítulo proporciona una guía para la medición de las distribuciones de tamaño de las partículas en diferentes sistemas
dispersos (p.ej., polvos, atomizaciones, aerosoles, suspensiones, emulsiones y burbujas de gas en líquidos) por medio del análi-
sis de sus patrones angulares de dispersión de luz. No se consideran en este capítulo los requisitos particulares de la medición
del tamaño de las partículas de productos específicos.

PRINCIPIO

Una muestra representativa, dispersada a una concentración adecuada en un líquido o gas apropiado, se pasa a través de un
haz de luz monocromática, generalmente un láser. La luz dispersada por las partículas a diversos ángulos se mide con un de-
tector de multielementos. Se registran los valores numéricos que representan el patrón de dispersión para su posterior análisis.
Estos valores del patrón de dispersión se transforman luego, por medio de un modelo óptico y un procedimiento matemático
adecuados, para obtener la proporción entre el volumen total y un número discreto de clases de tamaño, formando una distri-
bución volumétrica del tamaño de partículas.

INSTRUMENTO

El instrumento se ubica en un entorno donde no se vea afectado por el ruido eléctrico, las vibraciones mecánicas, las fluctua-
ciones de temperatura, la humedad o la luz brillante directa.
En la Figura 7 se muestra un ejemplo de configuración de un instrumento de difracción de luz láser. Se puede usar otro equi-
po.
384 (429) Medición del Tamaño de Partícula por Difracción de Luz/ Pruebas Químicas USP 40

9 11
8 10
7

(/)

5
1. Detector de 5. Luz dispersa no captada 9. Distancia de trabajo de la lente (4)
oscurecimiento por la lente (4) 10. Detector de multielementos
2. Haz dispersado 6. Conjunto de partículas
3. Haz directo 7. Fuente de luz láser 11. Distancia focal de la lente (4)
4. Lente de Fourier 8. Unidad de procesamiento del haz

Figura 1. Ejemplo de configuración de un instrumento de difracción de luz láser.

El instrumento está compuesto por una fuente de luz láser, un sistema óptico para procesar el haz de luz, una región de
medición de la muestra (o celda), una lente de Fourier y un detector de multielementos para medir el patrón de la luz disper-
sada. También se requiere un sistema de datos para la deconvolución de los datos de dispersión en una distribución volumétri-
ca de tamaños, así como el análisis e informe de los datos asociados.
Las partículas pueden entrar al haz láser en dos posiciones. En el caso convencional, las partículas entran al haz paralelo an-
tes de la lente colectora y dentro de su distancia de trabajo. En la llamada óptica de Fourier inversa, las partículas entran por
detrás de la lente colectora y por lo tanto, en un haz convergente. La ventaja de la configuración convencional es que queda
un paso de longitud razonable para la muestra dentro de la distancia de trabajo de la lente. La segunda configuración admite
sólo longitudes de paso pequeñas, pero permite la medición de luz dispersa en ángulos más grandes, lo cual es útil cuando
hay presencia de partículas submicrométricas.
La interacción del haz de luz incidente con el conjunto de las partículas dispersas da como resultado un patrón de dispersión
con distintas intensidades de luz en diversos ángulos. La distribución de intensidad angular total, constituida por la luz directa
y la dispersa, se enfoca entonces sobre un detector de multielementos por medio de una lente o una serie de lentes. Estas
lentes crean un patrón de dispersión que, dentro de ciertos límites, no depende de la ubicación de las partículas en el haz de
luz. Por consiguiente, la distribución de intensidad angular continua se convierte en una distribución de intensidad espacial
discreta en un set de elementos detectores.
Se supone que el patrón de dispersión medido del conjunto de partículas es idéntico a la suma de los patrones de todas las
partículas dispersivas individuales presentadas en posiciones relativas aleatorias. Se debe tener en cuenta que las lentes y por lo
tanto, el detector, sólo captan un intervalo angular limitado de luz dispersa.

DESARROLLO DEL MÉTODO

La medición del tamaño de las partículas por difracción láser puede arrojar datos reproducibles, incluso en la región submi-
crométrica, siempre que el instrumento usado y la muestra analizada sean cuidadosamente controlados para limitar la variabili-
dad de las condiciones de la prueba (p.ej., medio de dispersión, método de preparación de la dispersión de la muestra).
Tradicionalmente, la medición del tamaño de partícula utilizando difracción láser se ha limitado a partículas comprendidas
en un intervalo de aproximadamente O, 1 µm a 3 mm. Debido a los recientes avances en el diseño de lentes y equipos, los
instrumentos modernos son habitualmente capaces de exceder este intervalo. Con el informe de validación, el usuario de-
muestra la aplicabilidad del método para el uso previsto.

Muestreo

La técnica de muestreo debe ser adecuada para obtener una muestra representativa de un volumen apropiado para la medi-
ción del tamaño de partículas. Se pueden aplicar técnicas de división de muestras tales como la del separador rotatorio de
muestras o el método de cono y división por cuarteo.

Evaluación del Procedimiento de Dispersión

La muestra a analizar se inspecciona, visualmente o con la ayuda de un microscopio, para estimar su intervalo de tamaño y
forma de partículas. El procedimiento de dispersión debe ajustarse al propósito de la medición. El propósito puede ser tal, que
se prefiera desaglomerar los grupos en partículas primarias tanto como sea posible o, por el contrario, conservar los grupos tan
intactos como sea posible. En este sentido, las partículas de interés pueden ser partículas primarias o grupos de partículas.
Para el desarrollo de un método, es aconsejable verificar que no ocurra la conminución de las partículas y, a la inversa, que la
dispersión de las partículas o grupos sea satisfactoria. Por lo general, esto puede hacerse cambiando la energía de dispersión y
monitoreando el cambio de la distribución del tamaño de las partículas. La distribución de tamaño medida no debe cambiar
USP 40 Pruebas Químicas/ (429) Medición del Tamaño de Partícula por Difracción de Luz 385

de manera significativa si la muestra está bien dispersada y las partículas no son frágiles ni solubles. Por otra parte, si el proceso
de fabricación (p.ej., cristalización, molienda) del material ha cambiado, se debe verificar la aplicabilidad del método (p.ej., por
comparación microscópica).
Las atomizaciones, aerosoles y burbujas de gas en un líquido se deben medir directamente, siempre que su concentración
sea adecuada, puesto que el muestreo o la dilución generalmente alteran la distribución del tamaño de las partículas.
En otros casos (como por ejemplo emulsiones, pastas y polvos), se pueden dispersar muestras representativas en los líquidos
adecuados. A menudo se usan aditivos dispersantes (humectantes, estabilizadores) y/o fuerzas mecánicas (p.ej., agitación, ul-
trasonido) para la desaglomeración o desagregación de grupos de partículas y la estabilización de la dispersión. Para estas dis-
persiones líquidas, lo que se usa más comúnmente es un sistema de recirculación, que consiste en una celda de medición ópti-
ca, un baño de dispersión por lo general equipado con un mezclador y un generador de ultrasonido, una bomba y tuberías.
Las celdas de agitación sin sistema recirculante son útiles cuando se dispone sólo de pequeñas cantidades de muestra o cuan-
do se utilizan líquidos especiales en la dispersión.
Los polvos secos también pueden convertirse en aerosoles por medio del uso de dispersadores de polvo seco adecuados, los
cuales aplican fuerzas mecánicas para la desaglomeración o desagregación. Por lo general, los dispersadores usan la energía
del gas comprimido o la presión diferencial de un sistema de vacío para dispersar las partículas hasta convertirlas en un aerosol
que es soplado a través de la zona de medición, habitualmente hacia la entrada de una unidad de vacío que recolecta las partí-
culas. Sin embargo, en el caso de partículas o gránulos más gruesos y de libre fluidez, el efecto de la gravedad puede ser sufi-
ciente para dispersar las partículas adecuadamente.
Si el tamaño máximo de las partículas de la muestra excede el intervalo de medición del instrumento, el material que es
demasiado grueso se puede retirar por tamizado, informándose la masa y el porcentaje del material retirado. Sin embargo,
cabe señalar que después del pretamizado la muestra deja de ser representativa, a menos que se compruebe lo contrario.

Optimización de la Dispersión Líquida

Los líquidos, surfactantes y dispersantes usados para dispersar polvos deben:

- ser transparentes a la longitud de onda del láser y estar prácticamente exentos de burbujas de aire o partículas;
- tener un índice de refracción que difiera del correspondiente al material de prueba;
- no ser disolventes del material de prueba (líquido puro o solución saturada, prefiltrada);
- no alterar el tamaño de los materiales de prueba (p.ej., por efecto de la solubilidad, aumento de la solubilidad o recristali-
zación);
- favorecer la fácil formación y estabilidad de la dispersión;
- ser compatibles con los materiales usados en el instrumento (como juntas tóricas, juntas de estanqueidad, tuberías, etc.);
y
- poseer una viscosidad apropiada para facilitar la recirculación, agitación y filtración.
Para humedecer las partículas y estabilizar la dispersión a menudo se usan agentes tensoactivos y/o dispersantes. Para el caso
de ácidos y bases débiles, la amortiguación del medio dispersante a un pH bajo o alto, respectivamente, puede ayudar a la
identificación de un dispersante adecuado.
Se puede hacer una verificación preliminar de la calidad de la dispersión por medio de una inspección visual o microscópica.
También es posible tomar muestras fraccionadas de una dispersión madre bien mezclada. Dichas dispersiones madre se for-
man agregando un líquido a la muestra mientras se mezcla, por ejemplo, con una varilla de vidrio, una espátula o un mezcla-
dor por vórtice. Se debe tener cuidado de asegurar la transferencia de una muestra representativa y de que no se sedimenten
las partículas más grandes. Por lo tanto, se prepara una pasta de la muestra o se lleva a cabo un muestreo rápido de una sus-
pensión que se mantiene bajo agitación.

Optimización de la Dispersión con Gas

Para atomizaciones y dispersiones de polvo seco se puede utilizar un gas comprimido exento de aceite, agua y partículas.
Para retirar dichos materiales del gas comprimido se puede usar una secadora provista de filtro. Toda unidad de vacío debe
estar localizada lejos de la zona de medición, de forma que no altere la medición.

Determinación del Intervalo de Concentración

Con el fin de producir una relación señal-ruido aceptable en el detector, la concentración de partículas en la dispersión debe
exceder un nivel mínimo. De igual manera, debe estar por debajo de un nivel máximo con el fin de evitar la dispersión múlti-
ple. El intervalo de concentración está influenciado por el ancho del haz láser, la longitud de paso de la zona de medición, las
propiedades ópticas de las partículas y la sensibilidad de los elementos detectores.
En vista de lo anterior, se deben efectuar las mediciones con diferentes concentraciones de partículas para determinar el in-
tervalo apropiado de la concentración para cualquier muestra típica de material. [NOTA-En diferentes instrumentos, las con-
centraciones de partículas se representan habitualmente mediante magnitudes y escalas diferentes, p.ej., oscurecimiento, con-
centración óptica, número proporcional de la masa total.]
386 (429) Medición del Tamaño de Partícula por Difracción de Luz/ Pruebas Químicas USP 40

Determinación del Tiempo de Medición

El tiempo de medición, el tiempo de lectura del detector y la frecuencia de adquisición se determinan experimentalmente,
de acuerdo con la precisión requerida. Por lo general, el tiempo de medición permite un gran número de barridos o escaneos
en intervalos de tiempo cortos.

Selección de un Modelo Óptico Apropiado

La mayoría de los instrumentos usan la aproximación de Fraunhofer o la teoría de Mie, aunque a veces se aplican otras apro-
ximaciones para el cálculo de la matriz de dispersión. La elección del modelo teórico depende de la aplicación prevista y las
diferentes suposiciones (tamaño, absorbancia, índice de refracción, rugosidad, orientación cristalina, mezcla, etc.) hechas para
el material de prueba. Si los valores del índice de refracción (partes real e imaginaria para la longitud de onda usada) no se
conocen exactamente, entonces se puede usar la aproximación de Frauenhofer o la teoría de Mie con una estimación realista
del índice de refracción. La primera tiene la ventaja de que es simple y no necesita valores del índice de refracción; la segunda
por lo general arroja distribuciones menos sesgadas del tamaño de las partículas, en el caso de partículas pequeñas. Por ejem-
plo, si se usa el modelo Fraunhofer para muestras que contienen una cantidad apreciable de partículas pequeñas, transparen-
tes, la cantidad de partículas pequeñas calculada puede resultar significativamente sobreestimada. Con el fin de obtener resul-
tados rastreables, es esencial documentar los valores del índice de refracción usados, porque pequeñas diferencias en los valo-
res supuestos para la parte real e imaginaria del índice de refracción complejo pueden ocasionar diferencias significativas en las
distribuciones de tamaño de las partículas resultantes. A menudo se aplican valores bajos de la parte imaginaria del índice de
refracción (aproximadamente 0,01 a 0, 1 i) para permitir la corrección de la absorbancia en función de la rugosidad de superfi-
cie de las partículas. En general, cabe anotar que las propiedades ópticas de la sustancia a analizar, así como la estructura
(p.ej., forma, rugosidad de superficie y porosidad) influyen en el resultado final.

Validación

Típicamente, la validación de un procedimiento se puede determinar por la evaluación de su especificidad, linealidad, inter-
valo, exactitud, precisión y robustez. En el análisis del tamaño de partículas por difracción de luz láser no aplica la especifici-
dad, según la definición de la ICH, y no es posible discriminar los diferentes componentes en una muestra, ni discriminar entre
aglomerados y partículas dispersas a menos que se complemente adecuadamente con técnicas microscópicas. No se puede
aplicar a este procedimiento la exploración de una relación lineal entre concentración y respuesta o un modelo matemático de
interpolación. Más que evaluar la linealidad, este método requiere la definición de un intervalo de concentración dentro del
cual el resultado de las mediciones no varíe significativamente. Las concentraciones por debajo de ese intervalo producen un
error debido a la deficiente relación señal-ruido, mientras que las concentraciones por encima de ese intervalo producen un
error debido a la dispersión múltiple. El intervalo depende principalmente del hardware del instrumento. La exactitud se debe
confirmar a través de una apropiada calificación del instrumento y de una comparación con un análisis microscópico, mientras
que la precisión se puede evaluar por medio de una determinación de repetibilidad.
La repetibilidad que se consiga con el método depende principalmente de las características del material (molido o sin mo-
ler, robusto o frágil, ancho de la distribución de su tamaño, etc.) mientras que la repetibilidad requerida depende del propósi-
to de la medición. Los límites obligatorios no se pueden especificar en este capítulo puesto que la repetibilidad (diferentes pre-
paraciones de la muestra) puede variar apreciablemente de una sustancia a otra. Sin embargo, una buena práctica consiste en
aspirar a criterios de aceptación para repetibilidad, tales como% RSD ~ 10% [n = 6] para cualquier valor central de la distribu-
ción (p.ej., para x50 ). Los valores a los lados de la distribución (p.ej., x 10 y x90 ) serán sometidos a criterios de aceptación menos
estrictos, como% RSD ~ 15% [n = 6]. Por debajo de 1O µm, estos valores deben duplicarse. La robustez se puede analizar du-
rante la selección y optimización de los medios y fuerzas de dispersión. El cambio de la energía dispersante se puede monito-
rear por el cambio en la distribución del tamaño de las partículas.

MEDICIÓN
Precauciones

Seguir las instrucciones en el manual del instrumento:

- no mirar nunca de frente el haz láser directo o sus reflexiones;
- conectar a tierra todos los componentes del instrumento para prevenir la ignición de los disolventes o explosiones del
polvo;
- verificar la configuración del instrumento (p.ej., calentamiento, intervalo de medición y lentes requeridos, distancia de tra-
bajo apropiada, posición del detector, ausencia de luz diurna brillante directa); y
- en el caso de dispersiones húmedas, evitar burbujas de aire, evaporación de líquidos, efecto schlieren u otras inhomoge-
neidades en la dispersión; de igual manera, evitar una relación masa-flujo inapropiada del dispersador o un flujo de aire
USP 40 Pruebas Químicas/ (429) Medición del Tamaño de Partícula por Difracción de Luz 387

turbulento en el caso de dispersiones secas; dichos efectos pueden ocasionar distribuciones erróneas del tamaño de partí-
culas.

Medición de la Dispersión de la Luz de las Muestras Dispersadas

Después de la alineación adecuada de la parte óptica del instrumento se debe efectuar una medición blanco del medio de
dispersión exento de partículas, usando el mismo método utilizado para la medición de la muestra. La señal de ruido de fondo
debe estar por debajo del umbral apropiado. Los datos suministrados por el detector se guardan con el fin de restarlos poste-
riormente de los datos obtenidos con la muestra. La dispersión de la muestra se mide de acuerdo con el método desarrollado.
Para cada elemento del detector se calcula una señal promedio, a veces junto con su desviación estándar. La magnitud de la
señal de cada elemento del detector depende del área de detección, de la intensidad de la luz y de la eficiencia cuántica. Las
coordenadas (tamaño y posición) de los elementos del detector junto con la distancia focal de la lente determinan el intervalo
de los ángulos de dispersión para cada elemento. La mayoría de los instrumentos miden también la intensidad del haz láser
central (sin dispersar). La relación entre la intensidad de una muestra dispersada y la obtenida en su ausencia (la medición
blanco) indica la proporción de luz dispersada y por lo tanto la concentración de partículas.

Conversión del Patrón de Dispersión en Distribución del Tamaño de Partícula

Este paso de deconvolución es la inversa del cálculo de un patrón de dispersión para una distribución dada del tamaño de
partícula. La suposición de la forma esférica de las partículas es especialmente importante por cuanto la mayoría de los algorit-
mos usan la solución matemática para la dispersión por partículas esféricas. Además, los datos medidos siempre contienen
errores aleatorios y sistemáticos que podrían viciar las distribuciones de tamaño. Se han desarrollado varios procedimientos
matemáticos para usar en los instrumentos disponibles. Estos permiten cierta ponderación de las desviaciones entre los patro-
nes de dispersión medidos y calculados (p.ej., cuadrados mínimos), algunas restricciones (p.ej., no negatividad para cantidades
de partículas), y/o cierta suavización de la curva de distribución de tamaño.
Los algoritmos utilizados son específicos para cada marca y modelo de equipo y están amparados por una licencia. Las dife-
rencias en los algoritmos entre distintos instrumentos pueden dar lugar a diferencias en las distribuciones de tamaños de las
partículas calculadas.

Repeticiones

El número de mediciones repetidas (con preparaciones de muestras individuales) a efectuar depende de la precisión requeri-
da en la medición. Se recomienda fijar este número en el método específico de una sustancia.

INFORME DE RESULTADOS
Los datos de distribución del tamaño de las partículas por lo general se informan como una distribución acumulada de los
tamaños inferiores y/o como distribución de la densidad por volumen. El símbolo x se usa para indicar el tamaño de la partícu-
la, que a su vez se define como el diámetro de una esfera de volumen equivalente. Q3(x) indica la fracción en volumen de las
partículas de tamaño menor a x. En una representación gráfica, x se representa sobre la abscisa y la variable dependiente Q3
sobre la ordenada. Los valores característicos más comunes se calculan por interpolación de la curva de distribución del tama-
ño de partículas. Con frecuencia se usan tamaños de partículas de las fracciones acumuladas del 10%, 50%, y 90% (xw x50, y
x90, respectivamente); x50 se conoce también como la mediana del tamaño de partícula. Se reconoce que el símbolo d se usa
también ampliamente para designar el tamaño de partícula, por lo cual el símbolo x podría reemplazarse por d.
Por otra parte, se debe documentar suficiente información sobre la muestra, la preparación de la muestra, las condiciones de
dispersión y el tipo de celda. Dado que los resultados dependen del instrumento particular, el programa de análisis de datos y
el modelo óptico usado, estos detalles también se deben documentar.

CONTROL DEL DESEMPEÑO DEL INSTRUMENTO

Usar el instrumento según las instrucciones del fabricante y llevar a cabo las calificaciones prescritas con la frecuencia ade-
cuada, de acuerdo con el uso del instrumento y las sustancias a examinar.

Calibración

Los sistemas de difracción láser, aunque suponen propiedades idealizadas de las partículas, se basan en los principios funda-
mentales de la dispersión de la luz láser. Por eso, no se requiere una calibración en el sentido estricto. Sin embargo, es necesa-
rio confirmar que el instrumento funciona correctamente. Esto puede efectuarse usando cualquier material de referencia certifi-
cado que sea aceptable en la práctica industrial. Se examina el procedimiento de medición completo, incluidos la recolección
388 (429) Medición del Tamaño de Partícula por Difracción de Luz/ Pruebas Químicas USP 40

de la muestra, la dispersión de la muestra, el transporte de la muestra a través de la zona de medición, la medición y el proce-
dimiento de deconvolución. Es fundamental que el procedimiento operativo total se describa en detalle.
Los materiales de referencia certificados preferidos constan de partículas esféricas de una distribución conocida. Deben estar
certificados en lo que respecta a la distribución del tamaño en porcentaje de masa por medio de una técnica absoluta, si estu-
viese disponible, y usarse junto con un procedimiento operativo acordado y detallado. Si se aplica la teoría de Mie en el análisis
de datos, es fundamental que se indiquen las partes real e imaginaria del índice de refracción complejo del material. La repre-
sentación de la distribución del tamaño de partículas por volumen igualará a la de la distribución por masa, siempre que la
densidad de las partículas sea la misma para todas las fracciones de tamaños.
La respuesta de un instrumento de difracción láser cumple con los requisitos si el valor medio de x50 de por lo menos tres
mediciones independientes no se desvía en más de 3% del intervalo de valores certificado del material de referencia certifica-
do. Los valores medios para x10 y x 90 no se deben desviar del intervalo de valores certificado en más del 5%. Por debajo de 1 O
µm, estos valores deben duplicarse.
Pese a que se prefiere el uso de materiales compuestos por partículas esféricas, también pueden usarse partículas no esféri-
cas. Preferentemente, éstas deben tener valores certificados o típicos provenientes de análisis de difracción láser efectuados se-
gún un procedimiento operativo acordado y detallado. El uso de valores de referencia obtenidos por métodos distintos de la
difracción láser puede ocasionar una desviación significativa. El motivo de esta desviación es que los distintos principios inhe-
rentes a los diversos métodos pueden conducir a diferentes diámetros de esferas equivalentes para la misma partícula no esféri-
ca.
Aunque se prefiere el uso de materiales de referencia certificados, se pueden emplear también otros materiales de referencia
bien definidos. Estos consisten en sustancias de composición y distribución de tamaño de partículas típicas para una clase es-
pecificada de sustancias. La distribución del tamaño de partículas de los mismos ha demostrado ser estable con el tiempo. Los
resultados deben cumplir con los datos previamente determinados, con la misma precisión y desviación que el material de
referencia certificado.

Calificación del Sistema

Además de la calibración, el desempeño del instrumento debe calificarse a intervalos regulares o tan frecuentemente como
sea apropiado. Esto se puede llevar a cabo usando un material de referencia apropiado, como se mencionó en el párrafo ante-
rior.
La calificación del sistema se basa en el concepto de que el equipo, la electrónica, el software y las operaciones analíticas
constituyen un sistema integral que se puede evaluar como una entidad. Se examina el procedimiento de medición completo,
incluidos la recolección de la muestra, la dispersión de la muestra, el transporte de la muestra a través de la zona de medición,
la medición y el procedimiento de deconvolución. Es fundamental que el procedimiento operativo total se describa en detalle.
En general, a menos que se especifique algo diferente en la monografía individual, se considera que la respuesta de un ins-
trumento de difracción láser cumple con los requisitos si el valor x50 no se desvía en más de 10% del intervalo de valores del
material de referencia. Si se evalúan opcionalmente los valores a los lados de la distribución (p.ej., x10 y x90 ), estos valores no se
deben desviar en más de 15% del intervalo de valores certificado. Por debajo de 1 O µm, estos valores deben duplicarse.
[NOTA-Para la calibración del instrumento, en el párrafo sobre Calibración se especifican requisitos más estrictos.]

(431) DETERMINACIÓN DE GRUPOS METOXILO

APARATO

El aparato para la determinación de grupos metoxilos se muestra esquemáticamente en la figura adjunta. El matraz de ebulli-
ción, A, cuenta con un brazo lateral capilar para la introducción de dióxido de carbono o nitrógeno y está conectado a una
columna, B, que sirve para separar el ácido yodhídrico acuoso del yoduro de metilo que es más voláti!. El yoduro de metilo
pasa a través de agua en una trampa depuradora, C, y finalmente es absorbido en la solución de bromo-ácido acético en el
tubo de absorción D. El dióxido de carbono o nitrógeno se introduce a través de un dispositivo que regula la presión y se
conecta al aparato por medio de un capilar pequeño que contiene un pequeño trozo de algodón. [NOTA-Evitar el uso de
disolventes orgánicos al limpiar este aparato, ya que las trazas remanentes pueden afectar la determinación. Esta prueba se
emplea también para la determinación de grupos etoxilo con un tiempo de reacción de 80 minutos y un equivalente de solu-
ción volumétrica de 0,751 mg de (OC 2 H5).]
USP 40 Pruebas Químicas/ (431) Determinación de Grupos Metoxilo 389

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11 mm DE

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u Robinete 2 mm
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Aparato para la Determinación de Grupos Metoxilos

Para mayor comodidad en el uso y la limpieza, una junta esférica de vidrio esmerilado conecta las dos columnas verticales
del aparato. La parte superior del depurador C consta de una junta esférica 35/20, cuya mitad superior está conectada por
medio del brazo lateral al tubo O. Esto permite separar el aparato en partes y facilita el agregado de agua a la trampa. Además,
permite el acceso al tubo de ensayo (de 1O mm) suelto e invertido que sirve como trampa sobre el tubo interno del depurador
c.
REACTIVOS

Solución de Bromo-Ácido Acético

Disolver 100 g de acetato de potasio en 1000 ml de una solución constituida por 900 ml de ácido acético glacial y 100 ml
de anhídrido acético. En el día de su utilización, agregar 5 ml de bromo a 145 ml de esta solución.

Ácido Yodhídrico

Está disponible comercialmente una solución reactivo incolora o casi incolora de punto de ebullición constante preparada
para este fin. Si no se obtiene comercialmente, puede prepararse destilando ácido yodhídrico sobre fósforo rojo, pasando dió-
xido de carbono o nitrógeno a través del aparato durante la destilación. Usar la mezcla de punto de ebullición constante (entre
55% y 58% de HI) que destila entre 126º y 127°, que es incolora o casi incolora. [Precaución-Se deben tomar medidas de segu-
ridad al destilar Ácido Yodhídrico.] Colocar el ácido en frascos pequeños de color ámbar con tapón de vidrio purgados con dió-
xido de carbono o nitrógeno, sellarlos con parafina y almacenar en un sitio fresco y oscuro.
390 (431) Determinación de Grupos Metoxilo / Pruebas Químicas USP 40

PROCEDIMIENTO

Preparar el aparato desconectando la junta esférica y vertiendo agua en la trampa C hasta la mitad. Conectar las dos partes,
empleando una cantidad mínima de una grasa de silicona apropiada para sellar la junta esférica. Agregar 7 mL de Solución de
Bromo-Ácido Acético en el tubo de absorción O. Pesar la muestra en una cápsula de gelatina tarada y colocarla en el matraz de
ebullición junto con unas pocas perlas de ebullición o pedazos de plato poroso. Finalmente agregar 6 mL de Ácido Yodhídrico y
juntar el matraz a la columna, empleando una cantidad mínima de grasa de silicona apropiada para sellar la unión. Burbujear
dióxido de carbono o nitrógeno a través del aparato a una velocidad de 2 burbujas por segundo; colocar el matraz de ebulli-
ción en un baño de aceite o manto de calentamiento a 150º y continuar la reacción durante 40 minutos para la determinación
de grupos metoxilo, u 80 minutos para la determinación de grupos etoxilo. Drenar el contenido del tubo de absorción en un
matraz Erlenmeyer de 500 mL que contenga 1O mL de solución de acetato de sodio (1 en 4). Lavar el tubo con agua, agregar
los líquidos de lavado al matraz y finalmente, diluir con agua hasta aproximadamente 125 ml. Agregar ácido fórmico, gota a
gota, agitando por rotación moderada hasta que el color marrón rojizo del bromo desaparezca; luego agregar 3 gotas adicio-
nales. Por lo general, se requiere un total de 12 a 15 gotas. Dejar en reposo durante 3 minutos y agregar 15 mL de ácido
sulfúrico diluido y 3 g de yoduro de potasio y valorar de inmediato con tiosulfato de sodio 0, 1 N SV usando 3 mL de almidón
SR como indicador. Realizar una determinación con un blanco, incluyendo también una cápsula de gelatina y hacer las correc-
ciones necesarias. Cada mL de tiosulfato de sodio 0, 1 N equivale a 0,517 mg de (OCH 3).

(441) VALORACIÓN DE NIACINA O NIACINAMIDA

VALORACIÓN
Método Químico
• PROCEDIMIENTO
El siguiente procedimiento fotométrico implica la reacción colorimétrica de niacina o niacinamida con bromuro de cianóge-
no en presencia de ácido sulfanílico. Se puede usar para la determinación de niacina o niacinamida en las monografías
como Niacina, Inyección; Niacinamida, Inyección y Niacinamida, Tabletas.
[NOTA-Determinar a partir de la información del etiquetado si la vitamina presente en la muestra de valoración es niacina o
niacinamida y emplear la preparación estándar correspondiente (ya sea Preparación estándar de niacina o Preparación están-
dar de niacinamida) según se indica en el Procedimiento.]
Solución de bromuro de cianógeno: Disolver 5 g de bromuro de cianógeno en agua para obtener 50 ml.
[PRECAUCIÓN-Preparar esta solución bajo una campana, ya que el bromuro de cianógeno se volatiliza a temperatura ambien-
te y el vapor es sumamente irritante y venenoso.]
Solución de ácido sulfanílico: Agregar 15 mL de agua y 3 mL de hidróxido de amonio 6 N a 2,5 g de ácido sulfanílico.
Mezclar y, si fuera necesario, agregar mezclando más hidróxido de amonio 6 N hasta que el ácido se disuelva. Ajustar el
pH de la solución con ácido clorhídrico 3 N a aproximadamente 4,5 empleando verde de bromocresol SR como indicador
externo, y diluir con agua hasta 25 mL.
Solución madre de niacina estándar: Transferir 25,0 mg de ER Niacina USP a un matraz volumétrico de 500 mL, disol-
ver en solución de alcohol (1 en 4), diluir a volumen con solución de alcohol (1 en 4) y mezclar. Almacenar en un refrige-
rador. Cada mL de esta solución contiene 50 µg de ER Niacina USP.
Preparación estándar de niacina: Transferir 10,0 mL de Solución madre de niacina estándar a un matraz volumétrico de
100 mL, diluir con agua a volumen y mezclar. Cada mL de esta solución contiene 5 µg de ER Niacina USP.
Solución madre de niacinamida estándar: Transferir 50,0 mg de ER Niacinamida USP a un matraz volumétrico de 500
mL, disolver en solución de alcohol (1 en 4), diluir con solución de alcohol (1 en 4) a volumen y mezclar. Almacenar en
un refrigerador. Cada mL de esta solución contiene 100 µg de ER Niacinamida USP.
Preparación estándar de niacinamida: Transferir 10,0 mL de Solución madre de niacinamida estándar a un matraz volu-
métrico de 100 mL, diluir con agua a volumen y mezclar. Cada mL de esta solución contiene 1O µg de ER Niacinamida
USP.
Preparación de valoración: Preparar según se indica en la monografía individual.
Procedimiento: Pipetear y transferir a cuatro tubos marcados las cantidades de la Preparación estándar correspondiente,
de la Preparación de valoración, de la Dilución de amoníaco y de Agua según se indican en la Tabla 7. Luego agregar los
demás componentes, respectivamente, según se indican en la tabla, conforme a las instrucciones que se proporcionan en
este capítulo.
Tabla 1. Mezclas de Reacción para la Valoración de Nlaclna o Niaclnamlda-Método Químico
Tubo 1 Tubo2 Tubo 3 Tubo4
Componente (ml) (ml) (ml) (ml)
Preparación estándar 1,0 1,0 - -

Preparación de valoración - - 1,0 1,0

USP 40 Pruebas Químicas/ (441) Valoración de Niacina o Niacinamida 391

Tabla 1. Mezclas de Reacción para la Valoración de Niacina o Niacinamlda-Método Químico (Continuación)

Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo4
Componente (ml) (ml) (ml) (ml)
Dilución de amoníaco (hidróxido de amonio, diluido a 1
en 50) 0,5 0,5 0,5 0,5
Agua 6,5 1,5 6,5 1,5
Solución de bromuro de cianógeno - 5,0 - 5,0
Solución de ácido sulfanílico 2,0 2,0 2,0 2,0
Ácido clorhídrico 1 gota - 1 gota -

Agregar al Tubo 7 la Solución de ácido sulfanílico, agitar bien, agregar el Ácido clorhídrico, mezclar, colocar en un espectro-
fotómetro adecuado y ajustar a absorbancia cero a 450 nm. Agregar al Tubo 2 la Solución de bromuro de cianógeno, mez-
clar y a los 30 segundos, cronometrados con exactitud, después de completar la adición del bromuro de cianógeno,
agregar la Solución de ácido sulfanílico, agitando por rotación suave. Cerrar el tubo, colocarlo en el espectrofotómetro y
después de 2 minutos medir su absorbancia a 450 nm contra el Tubo 7 utilizado como blanco, designando la absorban-
cia como A5• Repetir el procedimiento con el Tubo 3 (como blanco) y el Tubo 4, designando la absorbancia del Tubo 4
como Au. Calcular la cantidad de niacina o niacinamida en la muestra según se indica en la monografía individual.
Métodos Cromatográficos
Los siguientes procedimientos de cromatografía de líquidos se proveen para la determinación de niacina o niacinamida como
un ingrediente farmacéutico activo, como un ingrediente de suplemento dietético o como un componente de suplementos
dietéticos o de formas farmacéuticas.
Usar el Estándar de Referencia USP apropiado para la niacina o niacinamida presente en la formulación.
A lo largo de estos procedimientos, proteger de la atmósfera y de la luz todas las soluciones que contienen y que se derivan de
la muestra de prueba y de los Estándares de Referencia, usando preferiblemente material de vidrio con protección actínica.
• PROCEDIMIENTO 1
• Este procedimiento se puede usar para la determinación de niacina o niacinamida en:
- Vitaminas olesolubles e hidrosolubles con minerales, tabletas
• Este procedimiento implica la extracción de analitos de la formulación usando agua caliente o agitación mecánica
• A menos que se especifiquen en las monografías individuales, la Solución estándar, la Solución muestra y las soluciones
reactivo se preparan según se indica a continuación.
Diluyente: Acetonitrilo, ácido acético glacial y agua (5:1 :94)
Fase móvil: Una mezcla de metanol, ácido acético glacial y agua (27:1 :73) que contenga 140 mg de 1-hexanosulfonato
de sodio por cada 100 mL
Solución estándar: Transferir 80 mg de ER Niacina USP o ER Niacinamida USP a un matraz volumétrico de 200 mL y
agregar 180 mL de Diluyente. Sumergir el matraz en un baño de agua caliente mantenido a 65º-70º durante 1O minutos
agitando regularmente o usando un mezclador de vórtice, hasta que se disuelvan todos los materiales sólidos. Enfriar rápi-
damente en un baño de agua fría durante 1O minutos a temperatura ambiente y diluir con Diluyente a volumen.
Solución muestra: Para tabletas, reducir a polvo fino no menos de 30 tabletas. Transferir una porción del polvo, equiva-
lente a 1O mg de niacinamida y 2,5 mg de clorhidrato de piridoxina, de riboflavina y de clorhidrato de tiamina a un tubo
de centrífuga de 50 mL. Agregar 25,0 mL de Diluyente y mezclar usando un mezclador de vórtice durante 30 segundos
para suspender el polvo completamente. Sumergir el tubo de centrífuga en un baño de agua caliente mantenido a 65º-
70º, calentar durante 5 minutos y mezclar en un mezclador de vórtice durante 30 segundos. Volver a sumergir el tubo en
el baño de agua caliente, calentar durante otros 5 minutos y mezclar en un mezclador de vórtice durante 30 segundos.
Filtrar una porción de la solución, enfriar a temperatura ambiente y usar el filtrado transparente. [NOTA-Usar el filtrado
dentro de las 3 horas de la filtración.]
Sistema cromatográfico
(Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
Detector: UV 280 nm
Columna: 3,9 mm x 30 cm; relleno L1
Velocidad de flujo: 1 mL/min
Volumen de inyección: 1O µL
Aptitud del sistema
Muestra: Solución estándar
Requisitos de aptitud
Desviación estándar relativa: No más de 3,0%
Análisis
Muestras: Solución estándar y Solución muestra
Medir las áreas de los picos de niacina o niacinamida.
Calcular el porcentaje de la cantidad declarada de niacina (C 6 H5 N0 2 ) o niacinamida (C 6 H6 Nz0) en la porción de la Mues-
tra tomada:
392 (441) Valoración de Niacina o Niacinamida / Pruebas Químicas USP 40

Resultado= (ruf r5) x (C5/Cu) x 100

ru = respuesta del pico de niacina o niacinamida de la Solución muestra

r5 = respuesta del pico de niacina o niacinamida de la Solución estándar
C5 = concentración de ER Niacina USP o ER Niacinamida USP en la Solucin estándar (mg/ml)
Cu = concentración nominal de niacina o niacinamida en la Solución muestra (mg/ml)
• PROCEDIMIENTO 2
• Este procedimiento se puede usar para la determinación de niacina o niacinamida en:
- Vitaminas oleosolubles e hidrosolubles con minerales, tabletas
• Este procedimiento implica la extracción de analitos de la formulación mediante el Disolvente de extracción, calor y
agitación mecánica.
• A menos que se especifiquen en las monografías individuales, la Solución estándar, la Solución muestra y las soluciones
reactivo se preparan según se indica a continuación.
Solución A: Transferir 1 ml de ácido acético glacial y 2,5 g de edetato disódico a un matraz volumétrico de 100 ml.
Disolver y diluir con agua a volumen.
Disolvente de extracción: Solución A y metanol (3:1)
Fase móvil: Solución de acetato de sodio O, l M (13,6 mg/ml de acetato de sodio en agua). Ajustar con ácido acético a
un pH de 5,4. [NOTA-Se puede agregar una pequeña cantidad de metanol (hasta 1%) a la Fase móvil para mejorar la
resolución.]
Solución madre del estándar: 1 mg/ml de ER Niacina USP o ER Niacinamida USP en Disolvente de extracción
Solución estándar: Transferir 5,0 ml de Solución madre del estándar a un matraz volumétrico de 25 ml y diluir con Disol-
vente de extracción a volumen.
Solución muestra: [NOTA-Esta preparación es adecuada para la determinación de niacina o niacinamida, piridoxina y
riboflavina, cuando se encuentran presentes en la formulación.] Para tabletas, reducir a polvo fino no menos de 20 table-
tas. Transferir una porción del polvo, equivalente a 2 mg de riboflavina, a un matraz volumétrico de 200 ml. Si la ribofla-
vina no se encuentra presente en la formulación, transferir una porción del polvo, equivalente a 2 mg de piridoxina. Si la
piridoxina no se encuentra presente en la formulación, transferir una porción del polvo, equivalente a 20 mg de niacina o
niacinamida. Agregar 100,0 ml de Disolvente de extracción y mezclar durante 20 minutos, usando un agitador de movi-
miento tipo muñeca (wrist action). Sumergir el matraz en un baño de agua mantenido a 70º-75º y calentar durante 20
minutos. Mezclar en un mezclador de vórtice durante 30 segundos, enfriar a temperatura ambiente y filtrar. Usar el filtra-
do transparente.
Sistema cromatográfico
(Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
Detector: UV 254 nm
Columna: 4,6 mm x 25 cm; relleno L1
Velocidad de flujo: 1 ml/min
Volumen de inyección: 20 µL
Aptitud del sistema
Muestra: Solución estándar
Requisitos de aptitud
Desviación estándar relativa: No más de 3,0% [NOTA-Si fuera necesario, purgar la columna con metanol entre in-
yecciones.]
Análisis
Muestras: Solución estándar y Solución muestra
Calcular el porcentaje de la cantidad declarada de niacina (C 6 H5 N0 2) o niacinamida (C 6 H6 N 2 0) en la porción de la Mues-
tra tomada:

Resultado= Cruf r5) x (C5f Cu) x 100

ru = respuesta del pico de niacina o niacinamida de la Solución muestra

r5 = respuesta del pico de niacina o niacinamida de la Solución estándar
C5 =concentración de ER Niacina USP o ER Niacinamida USP en la Solución estándar (mg/ml)
Cu = concentración nominal de niacina o niacinamida en la Solución muestra (mg/ml)
• PROCEDIMIENTO 3
• Este procedimiento se puede usar para la determinación de niacina o niacinamida en:
- Vitaminas oleosolubles e hidrosolubles con minerales, tabletas
• Este procedimiento implica la extracción de analitos de la formulación mediante mezclas de disolventes orgánicos,
calor y agitación mecánica.
•A menos que se especifiquen en las monografías individuales, la Solución estándar, la Solución muestra y las soluciones
reactivo se preparan según se indica a continuación.
Reactivo: 25 mg/ml de edetato disódico en agua
USP 40 Pruebas Químicas/ (441) Valoración de Niacina o Niacinamida 393

Fase móvil: Transferir 0,4 ml de trietilamina, 15,0 ml de ácido acético glacial y 350 ml de metanol a un matraz volumé-
trico de 2000 ml. Diluir con 1-hexanosulfonato de sodio 0,008 M a volumen.
Solución madre del estándar: 1,5 mg/ml de ER Niacina USP o ER Niacinamida USP en Reactivo, calentando si fuera ne-
cesario.
Solución estándar: Transferir 5,0 ml de Solución madre del estándar a un matraz de 125 ml con tapón. Agregar 10,0 ml
de un a mezcla de metanol y ácido acético glacial (9:1) y 30,0 ml de una mezcla de metanol y etilenglicol (1 :1 ). Tapar,
agitar durante 15 minutos en un baño de agua mantenido a 60º y enfriar. Filtrar, desechando los primeros ml del filtrado.
Solución muestra: Para tabletas, pesar y reducir a polvo fino no menos de 20 tabletas. Transferir una porción del polvo,
equivalente a 7,5 mg de niacina o niacinamida, a un matraz de 125 ml con tapón. Agregar 10,0 ml de una mezcla de
metanol y ácido acético glacial (9:1) y 30,0 ml de una mezcla de metanol y etilenglicol (1 :1 ). Tapar, agitar durante 15
minutos en un baño de agua mantenido a 60º y enfriar. Filtrar, desechando los primeros ml del filtrado.
Sistema cromatográfico
(Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
Detector: UV 270 nm
Columna: 4,6 mm x 25 cm; relleno L7
Temperatura de la columna: 50º
Velocidad de flujo: 2 ml/min
Volumen de inyección: 5 µL
Aptitud del sistema
Muestra: Solución estándar
Requisitos de aptitud
Desviación estándar relativa: No más de 2,0%
Análisis
Muestras: Solución estándar y Solución muestra
Calcular el porcentaje de la cantidad declarada de niacina (C 6 H5 N0 2 ) o niacinamida (C 6 H6 Np) en la porción de la Mues-
tra tomada:

Resultado= (ruf r5) x (C5f Cu) x 100

ru = respuesta del pico de niacina o niacinamida de la Solución muestra

r5 = respuesta del pico de niacina o niacinamida de la Solución estándar
C5 = concentración de ER Niacina USP o ER Niacinamida USP en la Solución estándar (mg/ml)
Cu =concentración nominal de niacina o niacinamida en la Solución muestra (mg/ml)
• PROCEDIMIENTO 4
• Este procedimiento se puede usar para describir niacina como:
- Un ingrediente farmacéutico activo
- Un ingrediente de suplemento dietético
- Un ingrediente en las tabletas de liberación prolongada de niacina
•Este procedimiento implica disolver el analito en Diluyente, una mezcla de metanol y agua (82:18), o extraer el anali-
to de la formulación con Diluyente y agitación mecánica
•A menos que se especifiquen en las monografías individuales, la Solución de aptitud del sistema, la Solución estándar A,
la Solución estándar B, la Solución muestra A, la Solución muestra By las soluciones reactivo se preparan según se indica
a continuación.
Diluyente: Metanol y agua (82:18)
Fase móvil: Metanol y agua (82:18), ajustada con ácido acético glacial a un pH de 3, 15 ± 0,05
Solución de aptitud del sistema: 0,25 mg/ml de ER Niacina USP, 0,050 mg/ml de ER Ácido 6-Hidroxinicotínico USP y
O, 1O mg/ml de piridina en Diluyente
Solución estándar A: Para un ingrediente farmacéutico activo o ingrediente de suplemento dietético, usar 0,25 mg/ml
de ER Niacina USP en Diluyente.
Solución estándar B: Para tabletas de liberación prolongada, usar 0,25 mg/ml de ER Niacina USP, 0,050 mg/ml de ER
Ácido 6-Hidroxinicotínico USP y 0,0978 mg/ml de piridina en Diluyente.
Solución muestra A: Para un ingrediente farmacéutico activo o ingrediente de suplemento dietético, usar 0,25 mg/ml
de Niacina en Diluyente.
Solución muestra B: Para tabletas de liberación prolongada, transferir una cantidad del polvo, equivalente a 50 mg de
niacina, a partir de no menos de 20 tabletas reducidas a polvo fino, a un matraz adecuado. Agregar Diluyente y mezclar
durante 2 horas. Diluir con Diluyente hasta una concentración final de 0,25 mg/ml de niacina.
Sistema cromatográfico
(Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
Detector: UV 260 nm
Columna: 4,6 mm x 15 cm; relleno L8 de 5 µm
394 (441) Valoración de Niacina o Niacinamida /Pruebas Químicas USP 40

Velocidad de flujo: 1 ml/min

Volumen de inyección: 25 µL
Aptitud del sistema
Muestras: Solución de aptitud del sistema y Solución estándar A o Solución estándar B [NOTA-Los tiempos de retención
relativos para piridina, ácido 6-hidroxinicotínico y niacina son 0, 14; 0,64 y 1,0, respectivamente, Solución de aptitud del
sistema.]
Requisitos de aptitud
Resolución: No menos de 1,5 entre piridina y ácido 6-hidroxinicotínico y no menos de 1,5 entre ácido 6-hidroxinicotí-
nico y niacina, Solución de aptitud del sistema
Desviación estándar relativa: No más de 2,0% para el pico de niacina en inyecciones repetidas, Solución estándar A o
Solución estándar B
Análisis
Muestras: Solución estándar A y Solución muestra A o Solución estándar By Solución muestra B
Calcular el porcentaje de niacina (C 6 H5 N0 2) en la porción de la Muestra tomada:
Resultado= (rufr5) x (C5/Cu) x 100

ru = respuesta del pico de niacina de la Solución muestra A o Solución muestra B

r5 = respuesta del pico de niacina de la Solución estándar A o Solución estándar B
C5 = concentración de ER Niacina USP en la Solución estándar A o Solución estándar B (mg/ml)
Cu = concentración de Niacina en la Solución muestra A o concentración nominal de niacina en la Solución muestra B
(mg/ml)
• PROCEDIMIENTO 5
• Este procedimiento se puede usar para la determinación de niacinamida como:
- Un ingrediente farmacéutico activo
- Un ingrediente de suplemento dietético
• Este procedimiento implica disolver niacinamida como el ingrediente farmacéutico activo o ingrediente de suplemen-
to dietético en Fase móvil
•A menos que se especifiquen en las monografías individuales, la Solución de aptitud del sistema, la Solución estándar, la
Solución de niacina, la Solución muestra y las soluciones reactivo se preparan según se indica a continuación.
Fase móvil: Metanol y 1-heptanosulfonato de sodio 0,005 M (30:70)
Solución estándar: Transferir 50 mg de ER Niacinamida USP a un matraz volumétrico de 100 ml. Agregar 3 ml de agua
para disolver y diluir con Fase móvil a volumen. Diluir con Fase móvil hasta 0,04 mg/ml.
Solución de niacina: Preparar según se indica en Solución estándar, usando ER Niacina USP en lugar de ER Niacinamida
USP.
Solución de aptitud del sistema: Mezclar volúmenes iguales de Solución estándar y Solución de niacina.
Solución muestra: Preparar según se indica en Solución estándar, usando Niacinamida en lugar de ER Niacinamida USP.
Sistema cromatográfico
(Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
Detector: UV 254 nm
Columna: 3,9 mm x 30 cm; relleno Ll
Velocidad de flujo: 2 ml/min
Volumen de inyección: 20 µL
Aptitud del sistema
Muestras: Solución de aptitud del sistema y Solución estándar
Requisitos de aptitud
Resolución: No menos de 3,0 entre niacina y niacinamida, Solución de aptitud del sistema
Desviación estándar relativa: No más de 2,0% para el pico de niacinamida en inyecciones repetidas, Solución están-
dar
Análisis
Muestras: Solución estándar y Solución muestra
Calcular el porcentaje de niacinamida (C 6 H6 N 2 0) en la porción de la Muestra tomada:
Resultado= (ruf r5) x (CsfCu) x 100

ru = respuesta del pico de niacinamida de la Solución muestra

r5 = respuesta del pico de niacinamida de la Solución estándar
C5 =concentración de ER Niacinamida USP en la Solución estándar (mg/ml)
Cu = concentración de Niacinamida en la Solución muestra (mg/ml)
• PROCEDIMIENTO 6
• Este procedimiento se puede usar para la determinación de niacina como:
USP 40 Pruebas Químicas/ (451) Volumetría con Nitrito 395

- Un ingrediente activo en las tabletas de niacina

• Este procedimiento implica la extracción de la niacina de la formulación usando agua, calor y agitación mecánica.
• A menos que se especifiquen en las monografías individuales, la Solución estándar, la Solución muestra y las soluciones
reactivo se preparan según se indica a continuación.
Solución A: Solución 5 mM de 1-hexanosulfonato de sodio en agua
Fase móvil: Metanol, acetonitrilo, ácido acético glacial y Solución A (14:7:1 :78)
Solución estándar: 0,050 mg/mL de ER Niacina USP en agua. Disolver con ayuda de calor en un baño de vapor.
Solución muestra: Para tabletas, transferir el equivalente a 500 mg de niacina, a partir de no menos de 20 tabletas redu-
cidas a polvo fino, a un matraz adecuado. Agregar 50 mL de agua y calentar en un baño de vapor durante 30 minutos.
Someter a ultrasonido durante 2 minutos, agitar mecánicamente durante 15 minutos y enfriar a temperatura ambiente.
Diluir con agua hasta 0,050 mg/mL y filtrar.
Sistema cromatográfico
(Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
Detector: UV 262 nm
Columna: 3,9 mm x 30 cm; relleno L1
Velocidad de flujo: 1,3 ml/min
Volumen de inyección: 20 µL
Aptitud del sistema
Muestra: Solución estándar
Requisitos de aptitud
Eficiencia de la columna: No menos de 1000 platos teóricos para el pico de niacina
Factor de asimetría: No menos de 2,0 para el pico de niacina
Desviación estándar relativa: No más de 2,0% para el pico de niacina en inyecciones repetidas, Solución estándar
Análisis
Muestras: Solución estándar y Solución muestra
Calcular el porcentaje de la cantidad declarada de niacina (C 6 H5 N0 2) en la porción de la Muestra tomada:

Resultado= (ruf r5) x (C5/Cu) x 100

ru = respuesta del pico de niacina de la Solución muestra

r5 = respuesta del pico de niacina de la Solución estándar
C5 = concentración de ER Niacina USP en la Solución estándar (mg/mL)
Cu =concentración nominal de niacina en la Solución muestra (mg/mL)

REQUISITOS ADICIONALES
• ESTÁNDARES DE REFERENCIA USP (11)
ER Ácido 6-Hidroxinicotínico USP (ver el Procedimiento 4)
ER Niacina USP
ER Niacinamida USP
[NOTA-Los Estándares de Referencia secados previamente se pueden almacenar en un desecador sobre gel de sílice. Proteger
de la luz.]

(451) VOLUMETRÍA CON NITRITO

El siguiente método general se utiliza para la determinación de la mayoría de los medicamentos farmacopeicos con sulfonami-
das y sus formas farmacéuticas, así como de otros medicamentos farmacopeicos para los cuales la volumetría con nitrito re-
sulta particularmente apropiada.

PROCEDIMIENTO
Pesar con exactitud aproximadamente 500 mg en el caso de una sulfonamida, o la cantidad especificada en la monografía
individual y transferir a un recipiente apropiado abierto. Agregar 20 mL de ácido clorhídrico y 50 mL de agua, mezclar hasta
disolver, enfriar hasta aproximadamente 15º, lentamente valorar con nitrito de sodio O, 1 M SV, previamente normalizado
frente a ER Sulfanilamida USP.
Determinar electrométricamente el punto final empleando electrodos apropiados (de platino-calomel o platino-platino). Colo-
car la punta de la bu reta debajo de la superficie de la solución para evitar la oxidación del nitrito de sodio por efecto del aire
y agitar la solución suavemente, usando un agitador magnético, evitando la formación de un vórtice de aire bajo la superfi-
cie y manteniendo la temperatura aproximadamente a 15º. La volumetría puede llevarse a cabo manualmente, o con un
titulador automático. En la volumetría manual, agregar la solución volumétrica hasta que la volumetría esté cerca de 1 mL
396 (451) Volumetría con Nitrito/ Pruebas Químicas USP 40

del punto final y luego, agregar porciones de O, 1 ml, dejando que transcurra no menos de 1 minuto entre cada adición. (La
aguja del instrumento se desvía y luego regresa aproximadamente a su posición original hasta que se alcanza el punto final).
El peso, en mg, de la sustancia al que equivale cada ml de nitrito de sodio O, 1 M SV es el indicado en la monografía individual.
Para la valoración de Tabletas de sulfonamidas u otros fármacos, reducir a polvo fino no menos de 20 tabletas, pesar con exac-
titud una porción del polvo, que equivalga aproximadamente a 500 mg si es una sulfonamida, o a la cantidad de fármaco
especificada en la monografía individual y proceder según se indica previamente, desde donde dice "transferir a un recipien-
te apropiado abierto".
Para la valoración de Inyectables y otras formas líquidas para las que se especifica la volumetría con nitrito, pipetear una por-
ción, que equivalga aproximadamente a 500 mg si es una sulfonamida, o a la cantidad de fármaco especificada en la mono-
grafía individual, y transferir a un recipiente abierto apropiado y proceder según se indica previamente, desde donde dice
"Agregar 20 ml de ácido clorhídrico".

REQUISITOS ADICIONALES
•ESTÁNDARES DE REFERENCIA USP (11)
ER Sulfanilamida USP

(461) DETERMINACIÓN DE NITRÓGENO

Algunos alcaloides y otros compuestos orgánicos que contienen nitrógeno no proporcionan todo el nitrógeno que contie-
nen al someterlos a digestión con ácido sulfúrico; en consecuencia, estos métodos no pueden emplearse para la determinación
de nitrógeno en todos los compuestos orgánicos.

MÉTODO 1

Nitratos y Nitritos Ausentes

Colocar aproximadamente 1 g de la sustancia, pesado con exactitud, en un matraz de Kjeldahl de 500 ml de vidrio de boro-
silicato duro. El material a analizar, si es sólido o semisólido, puede envolverse en una hoja de papel de filtro exento de nitróge-
no para transferirlo mas cómodamente al matraz. Agregar 1O g de sulfato de potasio en polvo o sulfato de sodio anhidro, 500
mg de sulfato cúprico en polvo y 20 ml de ácido sulfúrico. Inclinar el matraz en un ángulo de aproximadamente 45º y calen-
tar moderadamente la mezcla, manteniendo la temperatura debajo del punto de ebullición hasta que deje de producir espu-
ma. Aumentar el calor hasta que el ácido llegue a una ebullición intensa y continuar el calentamiento hasta que la solución se
torne casi incolora o adquiera un color verde transparente durante 30 minutos. Dejar que se enfríe, agregar 150 ml de agua,
mezclar el contenido del matraz y volver a enfriar. Agregar cuidadosamente 100 ml de solución de hidróxido de sodio (2 en
5), de tal manera que la solución fluya hacia abajo por la pared interna del matraz y forme una capa bajo la solución ácida.
Agregar inmediatamente unos pedazos de cinc granulado y, sin demorarse, conectar el matraz a un bulbo de conexión (tram-
pa) Kjeldahl, previamente unido a un condensador, cuyo tubo de salida esté sumergido debajo de la superficie de 100 ml de
solución de ácido bórico (1 en 25) contenidos en un matraz Erlenmeyer o en un frasco de boca ancha de aproximadamente
500 ml de capacidad. Mezclar el contenido del matraz de Kjeldahl mediante rotación moderada y destilar hasta que se hayan
destilado aproximadamente cuatro quintas partes del contenido del matraz. Valorar con ácido sulfúrico 0,5 N SV, determinan-
do el punto final potenciométricamente. Realizar una determinación con un blanco y hacer las correcciones necesarias. Cada
ml de ácido sulfúrico 0,5 N SV equivale a 7,003 mg de nitrógeno.
Cuando se sabe que el contenido de nitrógeno de la sustancia es bajo, el ácido sulfúrico 0,5 N SV puede reemplazarse por
ácido sulfúrico O, 1 N SV. Cada ml de ácido sulfúrico O, 1 N SV equivale a 1,401 mg de nitrógeno.

Nitratos y Nitritos Presentes

Colocar una cantidad de la sustancia, pesada con exactitud, que corresponda aproximadamente a 150 mg de nitrógeno, en
un matraz de Kjeldahl de 500 ml de vidrio de borosilicato duro y agregar 25 ml de ácido sulfúrico en el cual se ha disuelto
previamente 1 g de ácido salicílico. Mezclar el contenido del matraz y dejar reposar la mezcla durante 30 minutos agitando
frecuentemente. Agregar a la mezcla 5 g de tiosulfato de sodio en polvo y volver a mezclar; luego, agregar 500 mg de sulfato
cúprico en polvo y proceder según se indica en Nitratos y Nitritos Ausentes, desde donde dice "Inclinar el matraz a un ángulo
de aproximadamente 45º".
Cuando se sabe que el contenido de nitrógeno de la sustancia excede de 10%, pueden agregarse entre 500 mg y 1 g de
ácido benzoico, antes de la digestión, para facilitar la descomposición de la sustancia.
USP 40 Pruebas Químicas/ (466) Impurezas Comunes 397

MÉTODO 11

Aparato

Seleccionar un matraz de Kjeldahl de 300 mL adecuado, del cual se libera el nitrógeno por digestión ácida en primer lugar y
luego se transfiere cuantitativamente al recipiente de volumetría mediante destilación con vapor.

Procedimiento

Colocar en el matraz de digestión del aparato una cantidad del material pesada o medida con exactitud, equivalente a 2 a 3
mg de nitrógeno. Agregar 1 g de una mezcla pulverizada de sulfato de potasio y sulfato cúprico (1O:1) y lavar el cuello del
matraz con un chorro fino de agua para desprender cualquier material adherido a él. Agregar 7 mL de ácido sulfúrico, dejando
que se escurra por las paredes del matraz; luego, girando el matraz con rotación suave, agregar cuidadosamente 1 mL de pe-
róxido de hidrógeno al 30 por ciento de manera tal que resbale por la pared del matraz. (No agregar peróxido de hidrógeno
durante la digestión).
Calentar el matraz sobre una llama libre o sobre un calentador eléctrico hasta que fa solución tome un color azul transparen-
te y las paredes del matraz estén exentas de material carbonoso. Agregar cuidadosamente 70 mL de agua a la mezcla de di-
gestión, enfriar la solución y preparar para destilación con vapor. Agregar 30 mL de solución de hidróxido de sodio (2 en 5) a
través de un embudo, de manera tal que fa solución fluya hacia abajo por fa pared interna del matraz para formar una capa
bajo fa solución ácida; enjuagar el embudo con 1O mL de agua, cerrar herméticamente el aparato y comenzar fa destilación
con vapor inmediatamente. Recibir el destilado en 15 mL de solución de ácido bórico (1 en 25), a la cual se le han agregado
3 gotas de rojo de metilo-azul de metifeno SR y agua suficiente para cubrir el extremo del tubo condensador. Continuar fa
destilación hasta que el destilado mida de 80 a 100 ml. Retirar el matraz de absorción, enjuagar el extremo del tubo conden-
sador con una cantidad pequeña de agua y valorar vofumétricamente el destilado con ácido sulfúrico 0,01 N SV. Realizar una
determinación con un blanco y hacer fas correcciones necesarias. Cada mL de ácido sulfúrico 0,01 N SV equivale a 140, 1 µg
de nitrógeno.
Cuando se toma una cantidad de material que contiene más de 2 mg a 3 mg de nitrógeno, puede emplearse ácido sulfúrico
0,02 N o O, 1 N, siempre y cuando se requieran al menos 15 mL para fa volumetría. Si el peso seco total de material tomado es
mayor de 100 mg, aumentar proporcionalmente las cantidades de ácido sulfúrico y de hidróxido de sodio.

(466) IMPUREZAS COMUNES

Esta prueba tiene como fin evaluar fa presencia de impurezas comunes en artículos oficiales y se utiliza cuando una mono-
grafía individual así lo indica. Las impurezas comunes se definen como aquellas especies en fármacos y/o productos farmacéu-
ticos que no poseen una actividad biológica indeseable significativa en fas cantidades presentes. Estas impurezas pueden surgir
de la síntesis, preparación o degradación de los artículos farmacopeicos. En algunos casos, se pueden detectar impurezas que
representan un riesgo potencial para la salud. Dado que dichas impurezas no serían identificadas individualmente por el uso
estricto de este Capítulo General, puede ser necesario realizar otra evaluación diferente para garantizar que fas impurezas de-
tectadas cumplen con los requisitos establecidos en la definición de Impurezas Comunes. La selección de pruebas y valoracio-
nes admite cantidades previstas de impurezas que no son objetables para el uso habitual del artículo.

INFORME Y ESPECIFICACIONES
A menos que la monografía individual indique algo diferente, se seleccionó el valor 2,0% como límite general para la canti-
dad total de impurezas comunes en monografías en las que la documentación no respaldaba la adopción de otros valores.
Cuando una monografía establece límites para componentes concomitantes y/o impurezas/productos de degradación espe-
cificados, estas especies no deben incluirse en la estimación de impurezas comunes a menos que así lo especifique la monogra-
fía individual. Los componentes concomitantes se definen como especies características de muchos fármacos que no se consi-
deran impurezas en el sentido Farmacopeico. Son ejemplos de componentes concomitantes los isómeros geométricos y ópti-
cos (o racematos) y los antibióticos que son mezclas. Cualquier componente que pueda considerarse una impureza tóxica de-
bido a su efecto biológico indeseable significativo no se considera un componente concomitante.

METODOLOGÍA
A menos que se indique algo diferente en la monografía individual, la estimación de la cantidad y número de impurezas
comunes se hace mediante métodos relativos en lugar de la comparación estricta con Estándares de Referencia individuales. La
detección no específica de impurezas comunes también es consecuente con esta clasificación.
398 (466) Impurezas Comunes/ Pruebas Químicas USP 40

Los métodos de evaluación típicos empleados para las impurezas comunes son las técnicas por cromatografía en capa delga-
da (TLC, por sus siglas en inglés). Ver en Cromatografía (621) una explicación general de la técnica por cromatografía en capa
delgada. Las pruebas para sustancias relacionadas o pureza cromatográfica también pueden usarse para evaluar la presencia de
impurezas comunes. También pueden emplearse, con la debida justificación, otros métodos alternativos (p.ej., HPLC, HPTLC,
etc.). A menos que se indique algo diferente en la monografía individual, usar el siguiente método.

Solución de Prueba

Preparar una solución de la sustancia en análisis en el disolvente especificado en la monografía para obtener una concentra-
ción final conocida con exactitud de aproximadamente 1O mg por ml. [NOTA-Para disolver el fármaco se puede utilizar calor
o ultrasonido, siempre y cuando dichos procedimientos no afecten negativamente el compuesto.]

Soluciones Estándar

Preparar soluciones del Estándar de Referencia USP o de la sustancia indicada en el disolvente especificado en la monografía,
para obtener concentraciones conocidas con exactitud de 0,01 mg por mL, 0,05 mg por mL, O, 1 mg por mL y 0,2 mg por
ml. [NOTA-Para disolver el fármaco se puede utilizar calor o ultrasonido, siempre y cuando dichos procedimientos no afecten
negativamente el compuesto.]

Procedimiento

Utilizar una placa para cromatografía en capa delgada recubierta de una capa de mezcla de gel de sílice para cromatografía
de 0,25 mm de espesor y la Fase móvil especificada en la monografía. Aplicar a la placa volúmenes iguales (de 20 µL) de la
Solución de Prueba y de las Soluciones Estándar, empleando una corriente de nitrógeno para secar las manchas.
Desarrollar el cromatograma en una cámara preequilibrada hasta que el frente de la fase móvil haya recorrido aproximada-
mente tres cuartos de la longitud de la placa. Retirar la placa de la cámara y secar al aire. Examinar la placa utilizando las técni-
cas de visualización especificadas. Localizar en el cromatograma de la Solución de Prueba cualquier mancha diferente de la
mancha principal y determinar las intensidades relativas por comparación con las manchas obtenidas en los cromatogramas de
las Soluciones Estándar correspondientes. Ver la discusión anterior en cuanto al informe y especificación de impurezas comunes
totales.

CLAVE DE LAS TÉCNICAS DE VISUALIZACIÓN

1. Utilizar luz UV a 254 nm y aproximadamente a 366 nm.

2. Utilizar Yodoplatinato SR.
3. Solución A-Mezclar 850 mg de subnitrato de bismuto con 40 mL de agua y 1 O mL de ácido acético glacial.
Solución 8-Disolver 8 g de yoduro de potasio en 20 mL de agua. Mezclar A y B para obtener una Solución Madre, la cual
se puede almacenar durante varios meses en un frasco oscuro. Para preparar el reactivo para rociado, mezclar 1O mL de la
Solución Madre con 20 mL de ácido acético glacial y diluir con agua hasta 100 ml.
4. Solución de Ninhidrina para Rociado-Disolver 200 mg de ninhidrina en 100 ml de alcohol. Calentar la placa después de
rociarla.
5. Solución de Ácido para Rociado-En un baño de hielo, agregar lenta y cuidadosamente, y mezclando, 1O mL de ácido sul-
fúrico a 90 ml de alcohol. Rociar la placa y calentarla hasta que se carbonice.
6. Solución de Ácido-Dicromato para Rociado-Agregar suficiente dicromato de potasio a 100 mL de ácido sulfúrico para ob-
tener una solución saturada. Rociar la placa y calentarla hasta que se carbonice.
7. Vainillina-Disolver 1 g de vainillina en 100 ml de ácido sulfúrico.
8. Cloramina T-Ácido Tric/oroacético-Mezclar 1O ml de una solución acuosa de cloramina Tal 3% con 40 mL de una solu-
ción alcohólica de ácido tricloroacético al 25%. Preparar inmediatamente antes de usar.
9. Folin-C-Agregar 1Og de tungstato de sodio y 2,5 g de molibdato de sodio a 70 ml de agua, agregar 5 ml de ácido
fosfórico al 85% y 1O ml de ácido clorhídrico al 36% y someter esta solución a reflujo durante 1O horas.
1O. KMn04-Disolver 100 mg de Permanganato de Potasio en 100 ml de agua.
11. OAB-Mezclar 1 g de p-dimetilaminobenzaldehído en 100 mL de ácido clorhídrico 0,6 N.
12. OAC-Mezclar 100 mg de p-dimetilaminocinamaldehído en 100 ml de ácido clorhídrico 1 N.
13. Ferricianuro-Mezclar volúmenes iguales de una solución de cloruro férrico al 1 % y de una solución de ferricianuro de po-
tasio al 1%. Usar inmediatamente.
14. Fast Blue 8-Reactivo A-Disolver 500 mg de Sal de Fast Blue B en 100 ml de agua.
Reactivo B-Hidróxido de sodio 0, 1 N.
Rociar primero con el Reactivo A y luego con el Reactivo B.
15. Cianuro Férrico Alcalino-Diluir 1,5 ml de una solución de ferricianuro de potasio al 1 % con agua hasta 20 ml y agregar
1 O ml de una solución de hidróxido de sodio al 15%.
USP 40 Pruebas Químicas/ (467) Disolventes Residuales 399

16. Solución de Yodo para Rociado-Preparar una solución de yodo al 0,5% en cloroformo.
17. Exponer la placa durante 1O minutos a los vapores de yodo en una cámara cerrada preequilibrada que tenga cristales de
yodo en el fondo.
18. Solución A-Disolver 0,5 g de yoduro de potasio en 50 mL de agua.
Solución 8-Preparar una solución de 0,5 g de almidón soluble en 50 mL de agua caliente.
Mezclar volúmenes iguales de la Solución A y de la Solución B inmediatamente antes de usar.
19. PTSS-Disolver 20 g de ácido p-toluensulfónico en 100 mL de alcohol, rociar la placa, secarla durante 15 minutos a 11 Oº y
examinarla bajo luz UV a 366 nm.
20. Solución de o-Tolidina para Rociado-Disolver 160 mg de o-tolidina en 30 mL de ácido acético glacial, diluir con agua has-
ta 500 mL, agregar 1 g de yoduro de potasio y mezclar hasta que el yoduro de potasio se haya disuelto.
21. Para preparar el reactivo para rociado, mezclar 3 mL de solución de ácido cloroplatínico (1 en 1O) con 97 mL de agua,
seguido del agregado de 100 mL de una solución de yoduro de potasio (6 en 100).
22. Solución de Yodo-Metano/ para Rociado-Preparar una mezcla de yodo SR y metano! (1: 1).

(467) DISOLVENTES RESIDUALES

INTRODUCCIÓN
Este capítulo general se aplica a fármacos, excipientes y productos existentes. Toda sustancia o producto se encuentra sujeto
al control pertinente de disolventes que pudieran estar presentes en una sustancia o producto.
Generalmente no se mencionan las pruebas de disolventes residuales en las monografías específicas cuando los límites a apli-
car cumplen con los que se especifican más adelante, ya que los disolventes empleados pueden variar de un fabricante a otro.
El objetivo de este capítulo general es proporcionar las cantidades aceptables de disolventes residuales en productos farma-
céuticos para la seguridad del paciente. El capítulo recomienda el uso de disolventes menos tóxicos y describe niveles conside-
rados toxicológicamente aceptables para algunos disolventes residuales.
Para propósitos farmacopeicos, los disolventes residuales en productos farmacéuticos se definen como las sustancias quími-
cas orgánicas volátiles que se emplean o producen durante la fabricación de fármacos o excipientes, o en la preparación de
productos farmacéuticos. Los disolventes residuales no se eliminan por completo mediante las técnicas prácticas de fabrica-
ción. La selección adecuada del disolvente para la síntesis de un fármaco o un excipiente puede mejorar el rendimiento o de-
terminar características tales como la forma cristalina, la pureza y la solubilidad. Por lo tanto, a veces el disolvente puede ser un
elemento crítico en el proceso de síntesis. Este capítulo general no trata los disolventes que se emplean deliberadamente como
excipientes ni los solvatos. No obstante, se debe evaluar y justificar el contenido de disolventes en tales productos.
Dado que los disolventes residuales no proporcionan ningún beneficio terapéutico, deben eliminarse en lo posible, para
cumplir con las especificaciones del producto y de sus ingredientes, las buenas prácticas de fabricación u otros requisitos basa-
dos en la calidad. Los productos farmacéuticos no deben contener niveles de disolventes residuales superiores a los que permi-
tan los datos de seguridad. Evitar el uso de disolventes que ocasionen una toxicidad inaceptable (Clase 1, Tabla 7) en la pro-
ducción de fármacos, excipientes o productos farmacéuticos, a menos que su uso pueda justificarse fehacientemente mediante
una evaluación de riesgo-beneficio. Se deberá limitar el uso de disolventes asociados a una toxicidad menos grave (Clase 2,
Tabla 2) para proteger a los pacientes de posibles efectos adversos. En una situación ideal, se deberían emplear los disolventes
menos tóxicos (Clase 3, Tabla 3). En el Apéndice 7 se proporciona la lista de todos los disolventes incluidos en este capítulo
general. Estas tablas y el listado no son exhaustivos. Para los fines de esta Farmacopea, cuando un fabricante recibe la aproba-
ción por parte de una autoridad reglamentaria competente para usar un disolvente nuevo que no se indica actualmente en
este capítulo, es responsabilidad del fabricante notificar a la USP la identidad del disolvente, el límite de disolvente residual
aprobado en el artículo y el procedimiento de prueba adecuado para dicho disolvente residual en el artículo. La USP considera-
rá entonces este tema en la monografía individual. Cuando se aprueba un disolvente nuevo a través del proceso de ICH, este
disolvente nuevo se agregará a la lista correspondiente en este capítulo general. En ese momento, se considerará la eliminación
del requisito de la prueba para el disolvente específico en la monografía individual.
Se deberán analizar los fármacos, excipientes y productos farmacéuticos para detectar la presencia de disolventes residuales
cuando se sepa que los procesos de purificación o producción dan como resultado la presencia de tales disolventes residuales.
Solamente es necesario realizar pruebas para los disolventes residuales que se emplean o producen en la purificación o fabrica-
ción de fármacos, excipientes o productos.
Aunque los fabricantes pueden optar por realizar una prueba al producto farmacéutico, se puede emplear un procedimiento
acumulativo para calcular los niveles de disolventes residuales en el producto farmacéutico a partir de los niveles en los ingre-
dientes usados para producir el producto farmacéutico. Si los cálculos dan como resultado un nivel igual o inferior al propor-
cionado en este capítulo general, no es necesario considerar la realización de la prueba de disolventes residuales al producto
farmacéutico. Sin embargo, si el nivel calculado está por encima del nivel recomendado, se debe analizar el producto farma-
céutico para determinar si el proceso de formulación redujo el nivel del disolvente correspondiente hasta la cantidad acepta-
ble. También se debe analizar un producto farmacéutico si durante su fabricación se utiliza un disolvente residual.
400 (467) Disolventes Residuales/ Pruebas Químicas USP 40

Para los fines de esta Farmacopea, cuando el fabricante recibe la aprobación por parte de una autoridad reglamentaria com-
petente de un nivel superior de disolvente residual, es responsibilidad de dicho fabricante notificar a la USP la identidad del
disolvente y el límite de disolvente residual aprobado en el artículo. La USP considerará entonces este tema en la monografía
individual.
Ver el Apéndice 2 para obtener información de referencia adicional sobre disolventes residuales.

CLASIFICACIÓN DE DISOLVENTES RESIDUALES POR EVALUACIÓN DE RIESGO

El Programa Internacional de Seguridad de las Sustancias Químicas (lnternational Program on Chemical Safety, IPCS, por sus
siglas en inglés) emplea la expresión ingesta diaria tolerable (IDT) para describir los límites de exposición a sustancias químicas
tóxicas, y la Organización Mundial de la Salud (OMS) y otros institutos y autoridades sanitarias nacionales e internacionales
emplean la expresión ingesta diaria admisible (IDA). La expresión exposición diaria permitida (EDP) se define como la ingesta
farmacéuticamente admisible de disolventes residuales para evitar crear confusiones con valores diferentes de IDA de una mis-
ma sustancia.
Los disolventes residuales que se evalúan en este capítulo general se listan en el Apéndice 7 según su estructura y nombre
común. Los mismos han sido evaluados en función del riesgo que pueden suponer para la salud humana y colocados en una
de las tres clases que figuran a continuación:
Clase de
Disolvente
Residual Evaluación
Disolventes que deben evitarse.
Sustancias conocidas como carcinógenas para los seres humanos.
Clase 1
Sustancias seriamente sospechosas de ser carcinógenas para los seres humanos.
Sustancias que representan riesgos ambientales.
Disolventes que deben limitarse.
Sustancias carcinógenas y no genotóxicas, o posibles agentes causantes de otras toxicidades irreversibles
Clase 2
tales como neurotoxicidad o teratogenicidad, en animales.
Disolventes sospechosos de causar otras toxicidades importantes pero reversibles.
Disolventes con bajo potencial tóxico
Clase 3 Disolventes con bajo potencial tóxico para los seres humanos; no es necesario un límite de exposición
basado en el riesgo para la salud.
[NOTA-Los disolventes residuales de Clase 3 tienen EDP de 50 mg o más por día.]*
* Para disolventes residuales con EDP superior a 50 mg por día, ver las consideraciones presentadas en la sección Clase 3 en Límites de Disolventes Residuales.

MÉTODOS PARA ESTABLECER LÍMITES DE EXPOSICIÓN

El método empleado para establecer la EDP respecto a disolventes residuales se presenta en el Apéndice 3.
Para los artículos designados como "sólo para uso veterinario", se pueden justificar niveles más elevados de EDP y de límite
de concentración en casos excepcionales, basados en la dosis diaria real, la especie para la cual están destinados y los datos
toxicológicos pertinentes, considerando el impacto sobre la seguridad del consumidor. Para los fines de esta Farmacopea,
cuando un fabricante recibe la aprobación por parte de una autoridad reglamentaria competente de un límite superior, es res-
ponsabilidad del fabricante notificar a la USP el límite de disolvente residual aprobado en el artículo y la justificación. La USP
considerará entonces este tema en la monografía individual.

OPCIONES PARA DESCRIBIR LOS LÍMITES DE DISOLVENTES RESIDUALES DE CLASE 2

Existen dos opciones para establecer los límites de disolventes residuales de Clase 2.

Opción 1

Se emplean los límites de concentración en ppm indicados en la Tabla 2. Éstos se calcularon empleando la ecuación que
figura a continuación, suponiendo un peso de producto de 1O g administrado diariamente.
Concentración (ppm) = (1000 µg/mg x EDP)/dosis
En este caso, la EDP se expresa en mg por día y la dosis se expresa en g por día.
Estos límites se consideran aceptables para todos los fármacos, excipientes y productos farmacéuticos. Por lo tanto, esta op-
ción se puede aplicar si la dosis diaria no se conoce o no ha sido fijada. Si todos los fármacos y excipientes de una formulación
cumplen con los límites que se proporcionan en la Opción 1, estos componentes se pueden usar en cualquier proporción. No
USP 40 Pruebas Químicas/ (467) Disolventes Residuales 401

es necesario realizar cálculos adicionales siempre que la dosis diaria no exceda de 1O g. Los productos que se administran en
dosis superiores a 1O g por día se contemplan en la Opción 2.

Opción 2

No se requiere que cada componente del producto farmacéutico cumpla con los límites proporcionados en la Opción 1. Se
puede emplear la EDP expresada en mg por día según se indica en la Tabla 2 con la dosis diaria máxima conocida y la ecua-
ción anteriormente mencionada, para determinar la concentración de disolvente residual permitida en un producto farmacéu-
tico. Tales límites se consideran aceptables, si se demuestra que el disolvente residual se ha reducido al mínimo factible. Los
límites deben ser realistas en cuanto a la precisión analítica, la capacidad de fabricación y la variación razonable en el proceso
de fabricación. Los límites también deben reflejar las normas de fabricación actuales.
La Opción 2 se puede aplicar sumando las cantidades de disolventes residuales presentes en cada uno de los componentes
del producto farmacéutico. La suma de las cantidades de disolvente por día debe ser menor que la indicada por la EDP.
A continuación, se ofrece un ejemplo de la aplicación de la Opción 1 y la Opción 2 para la concentración de acetonitrilo en
un producto farmacéutico. La exposición diaria permitida al acetonitrilo es 4, 1 mg por día; por lo tanto, el límite de la Opción
1 es 41 O ppm. El peso diario máximo administrado de un producto farmacéutico es 5,0 g y el producto farmacéutico contiene
dos excipientes. La composición del producto farmacéutico y el contenido máximo calculado de acetonitrilo residual se mues-
tran en la siguiente tabla.

Cantidad en la Contenido de Exposición

Formulación Acetonltrilo Diaria
Componente (g) (ppm) (mg)
Fármaco 0,3 800 0,24
Excipiente 1 0,9 400 0,36
Excipiente 2 3,8 800 3,04
Producto farmacéutico 5,0 728 3,64

El Excipiente 1 cumple con el límite de la Opción 1, pero el fármaco, el excipiente 2 y el producto farmacéutico no cumplen
con el límite de la Opción 1. No obstante, el producto farmacéutico cumple con el límite de la Opción 2 de 4, 1 mg por día y de
ese modo se ajusta a los criterios de aceptación de este capítulo general.
A continuación, se ofrece otro ejemplo que emplea acetonitrilo como disolvente residual. El peso diario máximo administra-
do de un producto farmacéutico es 5,0 g y el producto farmacéutico contiene dos excipientes. La composición del producto
farmacéutico y el contenido máximo calculado de acetonitrilo residual se muestran en la siguiente tabla.

Contenido de Exposición
Cantidad en la Acetonltrllo Diaria
Componente Formulación (g) (ppm} (mg)
Fármaco 0,3 800 0,24
Excipiente 1 0,9 2000 1,80
Excipiente 2 3,8 800 3,04
Producto farmacéutico 5,0 1016 5,08

En este ejemplo, el producto farmacéutico no cumple con el límite de la Opción 1 ni con el de la Opción 2 según esta suma. El
fabricante podría analizar el producto farmacéutico para determinar si el proceso de formulación redujo el nivel de acetonitrilo.
Si, durante la formulación, el nivel de acetonitrilo no se redujo a los límites permitidos, el producto no cumple con los límites
de disolventes según se describen en este capítulo y el fabricante del producto farmacéutico debe tomar otras medidas para
reducir la cantidad de acetonitrilo en el producto farmacéutico. En algunos casos, el fabricante puede haber recibido la apro-
bación por parte de una autoridad reglamentaria competente sobre dicho nivel más elevado de disolvente residual. Si éste fue-
ra el caso, es responsabilidad del fabricante notificar a la USP la identidad del disolvente y el límite de disolvente residual apro-
bado en el artículo. La USP considerará entonces este tema en la monografía individual.

PROCEDIMIENTOS ANALÍTICOS
Normalmente, los disolventes residuales se determinan empleando técnicas cromatográficas tales como la cromatografía de
gases. Los métodos oficiales para analizar el contenido de disolventes residuales se describen en la sección Identificación, Con-
trol y Cuantificación de Disolventes Residuales de este capítulo general. Las Advertencias Generales tratan el uso de otros métodos
en circunstancias especiales (ver 6.30. Métodos y Procedimientos Alternativos y Armonizados). Si están presentes disolventes de
Clase 3, se puede usar un método no específico como por ejemplo pérdida por secado.
402 (467) Disolventes Residuales/ Pruebas Químicas USP 40

INFORME DE NIVELES DE DISOLVENTES RESIDUALES

Los fabricantes de productos farmacéuticos necesitan cierta información acerca del contenido de disolventes residuales en
fármacos o excipientes para cumplir con los criterios de este capítulo general. Las siguientes declaraciones se proporcionan
como ejemplos aceptables de la información que podría ofrecer un proveedor de fármacos o excipientes a un fabricante de
productos farmacéuticos. El proveedor podría escoger alguna de las que se presentan a continuación, según corresponda:
• Es probable que estén presentes sólo disolventes de Clase 3. La pérdida por secado es menos de 0,5%.
•Es probable que estén presentes sólo los disolventes X, Y, ... de Clase 2. Todos se encuentran por debajo del límite de la
Opción 7. (Aquí el fabricante mencionaría los disolventes de Clase 2 representados por X, Y, ... )
• Es probable que estén presentes sólo los disolventes X, Y, ... de Clase 2 y disolventes de Clase 3. Los disolventes residuales
de Clase 2 se encuentran por debajo del límite de la Opción 7 y los disolventes residuales de Clase 3 se encuentran por
debajo de 0,5%.
La frase "es probable que estén presentes", según se usa en los ejemplos anteriores, hace referencia al disolvente usado o
producido en la etapa final de fabricación y a los disolventes usados o producidos en las etapas iniciales de fabricación y que
no son eliminados uniformemente mediante un proceso validado.
Si es probable que estén presentes los disolventes de Clase 1, éstos se deberían identificar y cuantificar. Si los disolventes de
Clase 2 ó 3 están presentes en cantidades superiores a los límites de la Opción 7 ó 0,5%, respectivamente, éstos se deben iden-
tificar y cuantificar.

LÍMITES DE DISOLVENTES RESIDUALES

Clase 1 (Disolventes que deben evitarse)

Los disolventes residuales de Clase 1 (Tabla 7) no deben emplearse en la fabricación de fármacos, excipientes o productos
farmacéuticos debido a su inaceptable toxicidad o sus efectos ambientales perjudiciales. No obstante, si es inevitable su uso en
la fabricación de un medicamento con una ventaja terapéutica significativa, sus niveles deben estar restringidos tal como se
muestra en la Tabla 7, a menos que se indique algo diferente en la monografía individual. El disolvente l, l, 1-tricloroetano se
ha incluido en la Tabla 7 debido a que representa un riesgo ambiental. El límite indicado de 1500 ppm está basado en la revi-
sión de datos de seguridad.
Cuando se emplean o producen disolventes residuales de Clase 1 en la fabricación o purificación de fármacos, excipientes o
productos farmacéuticos y no son eliminados durante el proceso, estos disolventes se deben identificar y cuantificar. Los proce-
dimientos que se describen en la sección Identificación, Control y Cuantificación de Disolventes Residuales de este capítulo gene-
ral se deben aplicar siempre que sea posible. Si éste no fuera el caso, se debe emplear un procedimiento validado apropiado.
Tabla 1. Disolventes Residuales de Clase 1
(Disolventes que deben evitarse)
Límite de
Disolvente Concentración (ppm) Motivo
Benceno 2 Carcinógeno
Tetracloruro de carbono 4 Tóxico y presenta riesgos para el medio ambiente
1,2-Dicloroetano 5 Tóxico
1, 1-Dicloroeteno 8 Tóxico
1, 1, 1-Tricloroetano 1500 Presenta riesgos para el medio ambiente

Clase 2

Los disolventes residuales de Clase 2 (Tabla 2) deben estar limitados en los fármacos, excipientes y productos farmacéuticos
debido a su toxicidad inherente. Las EDP se proporcionan con una aproximación de O, 1 mg por día y las concentraciones con
una aproximación de 1O ppm. Los valores indicados no reflejan la precisión analítica necesaria del proceso de determinación.
La precisión se debe determinar como parte de la validación del procedimiento.
Si los disolventes residuales de Clase 2 están presentes en cantidades superiores a los límites de la Opción 7, éstos se deben
identificar y cuantificar. Los procedimientos que se describen en la sección Identificación, Control y Cuantificación de Disolventes
Residuales de este capítulo general se deben aplicar siempre que sea posible. Si éste no fuera el caso, se debe emplear un pro-
cedimiento validado apropiado. [NOTA-Los siguientes disolventes residuales de Clase 2 no se detectan con facilidad mediante
las condiciones de inyección de fase gaseosa que se describen en la sección Identificación, Control y Cuantificación de Disolventes
Residuales de este capítulo general: formamida, 2-etoxietanol, 2-metoxietanol, etilenglicol, N-metilpirrolidona y sulfolano. Es
necesario emplear otros procedimientos validados apropiados para la cuantificación de estos disolventes residuales. Tales pro-
cedimientos se deberán remitir a la USP para su revisión y posible inclusión en la monografía individual correspondiente. Ade-
más, puede usarse ER Mezcla C-Disolventes Residuales de Clase 2 USP para desarrollar un procedimiento alternativo.]
USP 40 Pruebas Químicas/ (467) Disolventes Residuales 403

Tabla 2. Disolventes Residuales de Clase 2

Límite de
EDP Concentración
Disolvente (mg/día) (ppm}
Acetonitrilo 4,1 410
Ciclohexano 38,8 3880
Clorobenceno 3,6 360
Cloroformo 0,6 60
Cloruro de metileno 6,0 600
Cu meno 0,7 70
1,2-Dicloroeteno 18,7 1870
N,N-Dimetilacetamida 10,9 1090
N,N-Dimetilformamida 8,8 880
1,2-Dimetoxietano 1,0 100
1,4-Dioxano 3,8 380
Etilenglicol 6,2 620
2-Etoxietanol 1,6 160
Forma mida 2,2 220
Hexano 2,9 290
Metanol 30,0 3000
Metilbutilcetona 0,5 50
Metilciclohexano 11,8 1180
N-Metilpirrolidona 5,3 530
2-Metoxietanol 0,5 50
Nitrometano 0,5 50
Piridina 2,0 200
Sulfolano 1,6 160
Tetrahidrofurano 7,2 720
Tetralina 1,0 100
Tolueno 8,9 890
Tricloroetileno 0,8 80
Xileno* 21,7 2170
• Generalmente 60% de m-xileno, 14% de p-xileno, 9% de o-xileno con 1 7% de etilbenceno

Clase 3

Se considera que los disolventes residuales de Clase 3 (Tabla 3) son menos tóxicos y representan un riesgo menor para la
salud humana que los disolventes residuales de Clase 1 y Clase 2. La Clase 3 no incluye disolventes que representen un riesgo
para la salud humana a los niveles normalmente aceptados en productos farmacéuticos. Sin embargo, no hay estudios de car-
cinogenicidad o toxicidad a largo plazo para muchos de los disolventes residuales de Clase 3. Los datos disponibles indican
que son menos tóxicos en estudios de toxicidad a corto plazo o agudos y que son negativos en estudios de genotoxicidad.
Se considera que aquellas cantidades de disolventes residuales de 50 mg por día o menos (correspondientes a 5000 ppm o
0,5% en la Opción 1) serían aceptables sin necesidad de justificación. Cantidades superiores pueden también ser aceptables
siempre que sean realistas en relación con la capacidad de fabricación y las buenas prácticas de fabricación. Para los fines de
esta Farmacopea, cuando un fabricante recibe la aprobación por parte de una autoridad reglamentaria competente sobre un
nivel superior de disolvente residual, es responsibilidad de dicho fabricante notificar a la USP la identidad del disolvente y el
límite de disolvente residual aprobado para el artículo. La USP considerará entonces este tema en la monografía individual. Si
el límite de disolvente de Clase 3 en una monografía individual es superior a 50 mg por día, ese disolvente residual se debe
identificar y cuantificar. Los procedimientos que se describen en la sección Identificación, Control y Cuantificación de Disolventes
Residuales de este capítulo general, con las debidas modificaciones a las soluciones estándar, se deben aplicar siempre que sea
posible. Si éste no fuera el caso, se debe emplear un procedimiento validado apropiado.
Tabla 3. Disolventes Residuales de Clase 3
(Limitados por las buenas prácticas de fabricación u otros requisitos basados en la calidad en fármacos, excipientes y productos farmacéuticos)
Acetato de butilo Etanol
Acetato de etilo Éter terc-butilmetílico
Acetato de isobutilo Éter etílico
404 (467) Disolventes Residuales/ Pruebas Químicas USP 40

Tabla 3. Disolventes Residuales de Clase 3

(Limitados por las buenas prácticas de fabricación u otros requisitos basados en la calidad en fármacos, excipientes y productos farmacéuticos)
(Continuación)
Acetato de isopropilo Formiato de etilo
Acetato de metilo Heptano
Acetato de propilo 3-Metil-1-butanol
Acetona Metiletilcetona
Ácido acético Metilisobutilcetona
Ácido fórmico 2-Metil-1-propanol
Aniso! Pentano
1-Butanol 1-Pentanol
2-Butanol 1-Propanol
Dimetil sulfóxido 2-Propanol

Otros Disolventes Residuales

Los disolventes residuales que figuran en la Tabla 4 también podrían interesar a los fabricantes de fármacos, excipientes o
productos farmacéuticos. No obstante, no se han encontrado datos toxicológicos adecuados para fundamentar una EDP.
Tabla 4. Otros Disolventes Residuales
(Para los cuales no se han encontrado datos toxicológicos adecuados)
Ácido tricloroacético Éter isopropílico
Ácido trifluoroacético Éter de petróleo
1, 1-Dietoxipropano lsooctano
1, 1-Dimetoximetano Metil isopropil cetona
2,2-Dimetoxipropano Metiltetrahidrofurano

IDENTIFICACIÓN, CONTROL Y CUANTIFICACIÓN DE DISOLVENTES RESIDUALES

Siempre que sea posible, la sustancia en análisis debe disolverse para liberar el disolvente residual. Dado que la USP se ocupa
de productos farmacéuticos, así como de ingredientes activos y excipientes, a veces puede ser aceptable que algunos de los
componentes de la formulación no se disuelvan por completo. En tales casos, puede ser necesario reducir el producto farma-
céutico primero a polvo fino, de manera que se pueda liberar cualquier disolvente residual que pudiera estar presente. Esta
operación debe realizarse lo más rápido posible para evitar la pérdida de disolventes volátiles durante el procedimiento.
[NOTA-El agua exenta de sustancias orgánicas que se especifica en los siguientes procedimientos no produce picos que in-
terfieran significativamente cuando se lleva a cabo una cromatografía.]

Disolventes Residuales de Clase 1 y Clase 2

Los siguientes procedimientos son útiles para identificar y cuantificar disolventes residuales cuando no esté disponible la in-
formación acerca de los disolventes residuales que pudieran estar presentes en el material. Cuando la información acerca de la
presencia de disolventes residuales específicos está disponible, sólo es necesario llevar a cabo el Procedimiento C para cuantificar
la cantidad de disolventes residuales presentes. La Figura 1 muestra un diagrama de flujo para la aplicación de las pruebas de
límite de disolventes residuales.
USP 40 Pruebas Químicas/ (467) Disolventes Residuales 405

Preparación de las
soluciones de prueba y
estándar

PROCEDIMIENTO A

¿Los picos SÍ
correspondientes a los disolventes > - - - - - - C U M P L E CON LA PRUEBA, NO
residuales tienen áreas menores que EQUIERE ACCIÓN POSTERlO
las de los estándares?

¿Los picos SÍ
correspondientes a los disolventes ~------l•ll CUMPLE CON LA PRUEBA. NO
residuales tienen áreas menores que REQUIERE ACCIÓN POSTERIOR
las de los estándares?

del disolvente residual

Etiquetar m 1cando
la cantidad del disolvente
residual encontrado

Fig. 1. Diagrama relativo a la identificación de disolventes residuales y la aplicación de pruebas de límite.

ARTÍCULOS SOLUBLES EN AGUA

Procedimiento A
Solución Madre del Estándar de Clase 7-[NOTA-AI transferir las soluciones, colocar la punta de la pipeta justo por debajo de
la superficie del líquido y mezclar.] Transferir 1,0 mL de ER Mezcla de Disolventes Residuales de Clase 1 USP a un matraz volu-
métrico de 100 mL, al que previamente se han agregado aproximadamente 9 mL de dimetil sulfóxido, diluir con agua a volu-
men y mezclar. Transferir 1,0 mL de esta solución a un matraz volumétrico de 100 mL, al que previamente se le han agregado
aproximadamente 50 mL de agua, diluir con agua a volumen y mezclar. Transferir 1 O mL de esta solución a un matraz volu-
métrico de 100 mL, al que previamente se le han agregado aproximadamente 50 mL de agua, diluir con agua a volumen y
mezclar.
Solución Estándar de Clase 7-Transferir 1,0 mL de Solución Madre del Estándar de Clase 7 a un vial para muestreo de fase
gaseosa apropiado que contenga 5,0 mL de agua (colocar la punta de la pipeta justo por debajo de la superficie del líquido
para dispensar), tapar y mezclar.
Soluciones Madre del Estándar de Clase 2-Transferir 1,0 mL de ER Mezcla A-Disolventes Residuales de Clase 2 USP a un
matraz volumétrico de 100 mL, diluir con agua a volumen y mezclar. Ésta es la Solución Madre A del Estándar de Clase 2. Trans-
ferir 1,0 mL de ER Mezcla B-Disolventes Residuales de Clase 2 USP a un matraz volumétrico de 100 mL, diluir con agua a
volumen y mezclar. Ésta es la Solución Madre B del Estándar de Clase 2.
Solución Estándar Mezcla A de Clase 2-Transferir 1,0 mL de Solución Madre A del Estándar de Clase 2 a un vial para muestreo
de fase gaseosa adecuado, agregar 5,0 mL de agua, tapar y mezclar.
406 (467) Disolventes Residuales/ Pruebas Químicas USP 40

Solución Estándar Mezcla B de Clase 2-Transferir 5,0 mL de Solución Madre B del Estándar de Clase 2 a un vial para muestreo
de fase gaseosa adecuado, agregar 1,0 mL de agua, tapar y mezclar.
Solución Madre de Prueba-Transferir aproximadamente 250 mg del artículo en análisis, pesados con exactitud, a un matraz
volumétrico de 25 mL, disolver y diluir con agua a volumen, y mezclar.
Solución de Prueba-Transferir 5,0 mL de Solución Madre de Prueba a un vial para muestreo de fase gaseosa adecuado, agre-
gar 1,0 mL de agua, tapar y mezclar.
Solución de Aptitud del Sistema de Clase 7-Transferir 1,0 mL de Solución Madre del Estándar de Clase 7 a un vial para mues-
treo de fase gaseosa adecuado, agregar 5,0 mL de la Solución Madre de Prueba, tapar y mezclar.
Sistema Cromatográfico (ver Cromatografía (621 ))-Equipar un cromatógrafo de gases con un detector de ionización a la lla-
ma y una columna de sílice fundida de 0,32 mm x 30 m recubierta con una capa de fase G43 de 1,8 µm o una columna
macrocapilar de 0,53 mm x 30 m recubierta con una capa de fase G43 de 3,0 µm. El gas transportador es nitrógeno o helio
con una velocidad lineal de aproximadamente 35 cm/s y una relación de partición de 1 :5. [NOTA-La relación de partición
puede modificarse para optimizar la sensibilidad.] Mantener la temperatura de la columna a 40º durante 20 minutos, luego
elevarla a una velocidad de 1Oº por minuto hasta 240º y mantenerla a 240º durante 20 minutos. Mantener las temperaturas
del inyector y del detector a 140º y 250º, respectivamente. Inyectar en el cromatógrafo la Solución Estándar de Clase 1, la
Solución de Aptitud del Sistema de Clase 7 y la Solución Estándar Mezcla A de Clase 2, y registrar el cromatograma según se indica
en Procedimiento: la relación señal-ruido del 1, 1, 1-tricloroetano en la Solución Estándar de Clase 7 no es menor de 5; la relación
señal-ruido de cada pico en la Solución de Aptitud del Sistema de Clase 7 no es menor de 3; y la resolución, R, entre acetonitrilo
y cloruro de metileno en la Solución Estándar Mezcla A de Clase 2 no es menor de 1,0.
Procedimiento-[NOTA-Se recomienda incrementar la temperatura de la línea de transferencia entre corridas para eliminar
cualquier condensación potencial de los disolventes.] Inyectar por separado en el cromatógrafo (siguiendo alguno de los sets
de parámetros operativos para el inyector de fase gaseosa descritos en la Tabla 5) volúmenes iguales de la fase gaseosa (aproxi-
madamente 1,0 mL) de Solución Estándar de Clase 7, Solución Estándar Mezcla A de Clase 2, Solución Estándar Mezcla B de Clase
2 y Solución de Prueba, registrar los cromatogramas y medir las respuestas de los picos principales. Si la respuesta de cualquier
pico diferente del pico de 1, 1, 1-tricloroetano en la Solución de Prueba es mayor o igual a la del pico correspondiente en la
Solución Estándar de Clase 7 o en cualquiera de las dos Soluciones Estándar Mezcla de Clase 2, o si la respuesta del pico de
1, 1, 1-tricloroetano es mayor o igual a 150 veces la respuesta del pico correspondiente a 1, 1, 1-tricloroetano en la Solución Es-
tándar de Clase 7, llevar a cabo el Procedimiento B para verificar la identidad del pico; si esto no sucediera, el artículo cumple
con los requisitos de esta prueba.
Tabla S. Parámetros Operativos para el Inyector de Fase Gaseosa
Sets de Parámetros Operativos
para el Inyector de Fase Gaseosa
1 2 3
Temperatura de equilibrio (º) 80 105 80
Tiempo de equilibrio (min) 60 45 45
Temperatura de línea de transferencia (º) (si corresponde) 85 11 o 105
Temperatura de la jeringa (°) (si corresponde) 80-90 105-115 80-90
Gas transportador: nitrógeno o helio a una presión adecuada
Tiempo de presurización (s) (si corresponde) 260 260 260
Volumen de inyección (ml)* 1 1 1
* O seguir las recomendaciones del fabricante del instrumento, siempre y cuando se cumplan los criterios del método. Se permite inyectar una cantidad menor
a la citada siempre y cuando se logre la sensibilidad adecuada.

Procedimiento B
Solución Madre del Estándar de Clase 7, Solución Estándar de Clase 7, Soluciones Madre del Estándar de Clase 2, Solución
Estándar Mezcla A de Clase 2, Solución Estándar Mezcla B de Clase 2, Solución Madre de Prueba, Solución de Prueba y Solución de
Aptitud del Sistema de Clase 7-Preparar según se indica en Procedimiento A.
Sistema Cromatográfico (ver Cromatografía (621 ))-Equipar un cromatógrafo de gases con un detector de ionización a la lla-
ma y una columna de sílice fundida de 0,32 mm x 30 m recubierta con una capa de fase Gl 6 de 0,25 µm o una columna
macrocapilar de 0,53 mm x 30 m recubierta con una capa de fase Gl 6 de 0,25 µm. El gas transportador es nitrógeno o helio
con una velocidad lineal de aproximadamente 35 cm/s y una relación de partición de 1 :5. [NOTA-La relación de partición
puede modificarse para optimizar la sensibilidad.] Mantener la temperatura de la columna a 50º durante 20 minutos, luego
elevarla a una velocidad de 6º por minuto hasta 165º y mantenerla a 165º durante 20 minutos. Mantener las temperaturas del
inyector y del detector a 140º y 250º, respectivamente. Inyectar en el cromatógrafo la Solución Estándar de Clase 7 y la Solución
de Aptitud del Sistema de Clase 7, y registrar el cromatograma según se indica en Procedimiento: la relación señal-ruido del ben-
ceno en la Solución Estándar de Clase 7 no es menor de 5; la relación señal-ruido de cada pico en la Solución de Aptitud del
Sistema de Clase 7 no es menor de 3; y la resolución, R, entre acetonitrilo y cis-dicloroeteno en la Solución Estándar Mezcla A de
Clase 2 no es menor de 1,0.
Procedimiento-[NOTA-Se recomienda incrementar la temperatura de la línea de transferencia entre corridas para eliminar
cualquier condensación potencial de los disolventes.] Inyectar por separado en el cromatógrafo (siguiendo alguno de los sets
USP 40 Pruebas Químicas/ (467) Disolventes Residuales 407

de parámetros operativos para el inyector de fase gaseosa, descritos en la Tabla 5) volúmenes iguales de la fase gaseosa (apro-
ximadamente 1,0 mL) de Solución Estándar de Clase 7, Solución Estándar Mezcla A de Clase 2, Solución Estándar Mezcla B de
Clase 2 y Solución de Prueba, registrar los cromatogramas y medir las respuestas de los picos principales. Si las respuestas de los
picos en la Solución de Prueba de los picos identificados en el Procedimiento A son iguales o mayores que los picos correspon-
dientes en la Solución Estándar de Clase 7 o en cualquiera de las dos Soluciones Estándar Mezcla de Clase 2, llevar a cabo el
Procedimiento C para cuantificar los picos; si esto no sucediera, el artículo cumple con los requisitos de esta prueba.
Procedimiento C
Solución Madre del Estándar de Clase 7, Solución Estándar de Clase 7, Solución Madre A del Estándar de Clase 2, Solución
Estándar Mezcla A de Clase 2, Solución Madre de Prueba, Solución de Prueba y Solución de Aptitud del Sistema de Clase 7-Prepa-
rar según se indica en Procedimiento A.
Solución Madre del Estándar-[NOTA-Preparar por separado una Solución Madre del Estándar para cada pico identificado y
verificado mediante los Procedimientos A y B. Para los disolventes de Clase 1 diferentes de 1, 1, 1-tricloroetano, preparar la pri-
mera dilución según se indica para la primera dilución en Solución Madre del Estándar de Clase 7, Procedimiento A.] Transferir un
volumen, medido con exactitud, de cada Estándar de Referencia USP individual correspondiente a cada pico de disolvente resi-
dual identificado y verificado mediante los Procedimientos A y B a un recipiente adecuado y diluir cuantitativamente con agua,
y si fuera necesario en diluciones sucesivas, para obtener una solución con una concentración final de 1/20 del valor indicado
en la Tabla 7 ó 2 (en Límite de Concentración).
Solución Estándar-Transferir 1,0 mL de esta solución a un vial para muestreo de fase gaseosa apropiado, agregar 5,0 mL de
agua, tapar y mezclar.
Solución de Prueba con una Cantidad Conocida Agregada-[NOTA-Preparar por separado una Solución de Prueba con una
Cantidad Conocida Agregada para cada pico identificado y verificado mediante los Procedimientos A y B.] Transferir 5,0 mL de
Solución Madre de Prueba a un vial para muestreo de fase gaseosa apropiado, agregar 1,0 mL de Solución Madre del Estándar,
tapar y mezclar.
Sistema Cromatográfico (ver Cromatografía (621 ))-[NOTA-Si se verifica que los resultados de la cromatografía del Procedi-
miento A son inferiores a los del Procedimiento B, se puede sustituir el Sistema Cromatográfico del Procedimiento B.] Equipar un
cromatógrafo de gases con un detector de ionización a la llama y una columna de sílice fundida de 0,32 mm x 30 m recubier-
ta con una capa de fase G43 de 1,8 µm o una columna macrocapilar de 0,53 mm x 30 m recubierta con una capa de fase G43
de 3,0 µm. El gas transportador es nitrógeno o helio con una velocidad lineal de aproximadamente 35 cm/s y una relación de
partición de 1:5. [NOTA-La relación de partición puede modificarse para optimizar la sensibilidad.] Mantener la temperatura
de la columna a 40º durante 20 minutos, luego elevarla a una velocidad de 1Oº por minuto hasta 240º y mantenerla a 240º
durante 20 minutos. Mantener las temperaturas del inyector y del detector a 140º y 250º, respectivamente. Inyectar en el cro-
matógrafo la Solución Estándar de Clase 1, la Solución de Aptitud del Sistema de Clase 7 y la Solución Estándar Mezcla A de Clase 2,
y registrar el cromatograma según se indica en Procedimiento: la relación señal-ruido del 1, 1, 1-tricloroetano en la Solución Es-
tándar de Clase 7 no es menor de 5; la relación señal-ruido de cada pico en la Solución de Aptitud del Sistema de Clase 7 no es
menor de 3; y la resolución, R, entre acetonitrilo y cloruro de metileno en la Solución Estándar Mezcla A de Clase 2 no es menor
de 1,0.
Procedimiento-{NOTA-Se recomienda incrementar la temperatura de la línea de transferencia entre corridas para eliminar
cualquier condensación potencial de los disolventes.] Inyectar por separado en el cromatógrafo (siguiendo alguno de los sets
de parámetros operativos para el inyector de fase gaseosa descritos en la Tabla 5) volúmenes iguales de fase gaseosa (aproxi-
madamente 1,0 mL) de Solución Estándar, Solución de Prueba y Solución de Prueba con una Cantidad Conocida Agregada, regis-
trar los cromatogramas y medir las respuestas de los picos principales. Calcular la cantidad, en ppm, de cada disolvente resi-
dual encontrado en el artículo en análisis, por la fórmula:

5(C/W)[ru /(r5r - ru)]

en donde Ces la concentración, en µg por mL, del Estándar de Referencia USP correspondiente en la Solución Madre del Están-
dar; W es el peso, en g, del artículo en análisis tomado para preparar la Solución Madre de Prueba; y ru y r57 son las respuestas de
los picos de cada disolvente residual obtenidas a partir de la Solución de Prueba y la Solución de Prueba con una Cantidad Conoci-
da Agregada, respectivamente.

ARTÍCULOS INSOLUBLES EN AGUA

Procedimiento A-[NOTA-Se puede usar dimetil sulfóxido como disolvente alternativo en lugar de dimetilformamida.]
Solución Madre del Estándar de Clase 7-Transferir 1,0 mL de ER Mezcla de Disolventes Residuales de Clase 1 USP a un ma-
traz volumétrico de 100 mL, al que previamente se han agregado aproximadamente 80 mL de dimetilformamida, diluir con
dimetilformamida a volumen y mezclar. Transferir 1,0 mL de esta solución a un matraz volumétrico de 100 mL, al que previa-
mente se han agregado aproximadamente 80 mL de dimetilformamida, diluir con dimetilformamida a volumen y mezclar (re-
servar una porción de esta solución para la Solución de Aptitud del Sistema de Clase 7). Transferir 1,0 mL de esta solución a un
matraz volumétrico de 1O mL, diluir con dimetilformamida a volumen y mezclar.
Solución Estándar de Clase 7-Transferir 1,0 mL de Solución Madre del Estándar de Clase 7 a un vial para muestreo de fase
gaseosa adecuado, que contenga 5,0 mL de agua, tapar y mezclar.
408 (467) Disolventes Residuales/ Pruebas Químicas USP 40

Soluciones Madre del Estándar de Clase 2-Transferir 1,0 mL de ER Mezcla A-Disolventes Residuales de Clase 2 USP a un
matraz volumétrico de 100 mL, al que previamente se han agregado aproximadamente 80 mL de dimetilformamida, diluir con
dimetilformamida a volumen y mezclar. Ésta es la Solución Madre A del Estándar de Clase 2. Transferir 0,5 mL de ER Mezcla B-
Disolventes Residuales de Clase 2 USP a un matraz volumétrico de 1O mL, diluir con dimetilformamida a volumen y mezclar.
Ésta es la Solución Madre B del Estándar de Clase 2.
Solución Estándar Mezcla A de Clase 2-Transferir 1,0 mL de Solución Madre A del Estándar de Clase 2 a un vial para muestreo
de fase gaseosa adecuado, que contenga 5,0 mL de agua, tapar y mezclar.
Solución Estándar Mezcla B de Clase 2-Transferir 1,0 mL de Solución Madre B del Estándar de Clase 2 a un vial para muestreo
de fase gaseosa adecuado, que contenga 5,0 mL de agua, tapar y mezclar.
Solución Madre de Prueba-Transferir aproximadamente 500 mg del artículo en análisis, pesados con exactitud, a un matraz
volumétrico de 1O mL, disolver y diluir con dimetilformamida a volumen, y mezclar.
Solución de Prueba-Transferir 1,0 mL de Solución Madre de Prueba a un vial para muestreo de fase gaseosa adecuado, que
contenga 5,0 mL de agua, tapar y mezclar.
Solución de Aptitud del Sistema de Clase 7-Mezclar 5 mL de la Solución Madre de Prueba con 0,5 mL de la dilución interme-
dia reservada de la Solución Madre del Estándar de Clase 1. Transferir 1,0 mL de esta solución a un vial para muestreo de fase
gaseosa adecuado, que contenga 5,0 mL de agua, tapar y mezclar.
Sistema Cromatográfico (ver Cromatografía (621 ))-Equipar el cromatógrafo de gases con un detector de ionización a la lla-
ma y una columna macrocapilar de 0,53 mm x 30 m recubierta con una capa de fase G43 de 3,0 µm. El gas transportador es
helio con una velocidad lineal de aproximadamente 35 cm/s y una relación de partición de 1 :3. [NOTA-La relación de parti-
ción puede modificarse para optimizar la sensibilidad.] Mantener la temperatura de la columna a 40º durante 20 minutos, lue-
go aumentarla a una velocidad de 1Oº por minuto hasta 240º y mantenerla a 240º durante 20 minutos. Mantener las tempera-
turas del inyector y del detector a 140º y 250º, respectivamente. Inyectar en el cromatógrafo la Solución Estándar de Clase 1, la
Solución de Aptitud del Sistema de Clase 1 y la Solución Estándar Mezcla A de Clase 2, y registrar el cromatograma según se indica
en Procedimiento: la relación señal-ruido de l, 1, 1-tricloroetano en la Solución Estándar de Clase 1 no es menor de 5; la relación
señal-ruido de cada pico en la Solución de Aptitud del Sistema de Clase 1 no es menor de 3; y la resolución, R, entre acetonitrilo
y cloruro de metileno en la Solución Estándar Mezcla A de Clase 2 no es menor de 1,0.
Procedimiento-[NOTA-Se recomienda incrementar la temperatura de la línea de transferencia entre corridas para eliminar
cualquier condensación potencial de los disolventes.] Inyectar por separado en el cromatógrafo (usar los sets de parámetros
operativos para el inyector de fase gaseosa descritos en la columna 3 de la Tabla 5 con una presión del vial de 1O psi) volúme-
nes iguales de la fase gaseosa (aproximadamente 1,0 mL) de Solución Estándar de Clase 1, Solución Estándar Mezcla A de Clase
2, Solución Estándar Mezcla B de Clase 2 y Solución de Prueba, registrar los cromatogramas y medir las respuestas de los picos
principales. Si la respuesta de cualquier pico diferente del pico de 1, 1, 1-tricloroetano, en la Solución de Prueba es mayor o igual
al pico correspondiente en la Solución Estándar de Clase 7 o en cualquiera de las dos Soluciones Estándar Mezcla de Clase 2, o si
la respuesta del pico de 1, 1, 1-tricloroetano es mayor o igual a 150 veces la respuesta del pico correspondiente a 1, 1, 1-triclo-
roetano en la Solución Estándar de Clase 1, llevar a cabo el Procedimiento B para verificar la identidad del pico; si esto no suce-
diera, el artículo cumple con los requisitos de esta prueba.
Procedimiento B
Solución Madre del Estándar de Clase 1, Solución Estándar de Clase 7, Solución de Aptitud del Sistema de Clase 7, Soluciones
Madre del Estándar de Clase 2, Solución Estándar Mezcla A de Clase 2, Solución Estándar Mezcla B de Clase 2, Solución Madre de
Prueba y Solución de Prueba-Preparar según se indica en Procedimiento A.
Sistema Cromatográfico-Proceder según se indica en Procedimiento Ben Artículos Solubles en Agua con una relación de parti-
ción de 1 :3. [NOTA-La relación de partición puede modificarse para optimizar la sensibilidad.]
Procedimiento-[NOTA-Se recomienda incrementar la temperatura de la línea de transferencia entre corridas para eliminar
cualquier condensación potencial de los disolventes.] Inyectar por separado en el cromatógrafo (usar los sets de parámetros
operativos para inyector de fase gaseosa descritos en la columna 3 de la Tabla 5 con una presión del vial de 1O psi) volúmenes
iguales de la fase gaseosa (aproximadamente 1,0 mL) de Solución Estándar de Clase 1, Solución Estándar Mezcla A de Clase 2,
Solución Estándar Mezcla B de Clase 2 y Solución de Prueba, registrar los cromatogramas y medir las respuestas de los picos prin-
cipales. Si la respuesta de los picos identificados en la Solución de Prueba en el Procedimiento A son mayores o iguales a los picos
correspondientes en la Solución Estándar de Clase 7 o en cualquiera de las dos Soluciones Estándar Mezcla de Clase 2, llevar a
cabo el Procedimiento C para cuantificar los picos; si esto no sucediera, el artículo cumple con los requisitos de esta prueba.
Procedimiento C
Solución Madre del Estándar de Clase 7, Solución Estándar de Clase 7, Solución de Aptitud del Sistema de Clase 7, Solución Madre
A del Estándar de Clase 2 y Solución Estándar Mezcla A de Clase 2-Proceder según se indica en Procedimiento A.
Solución Madre del Estándar-[NOTA-Preparar por separado una Solución Madre del Estándar para cada pico identificado y
verificado mediante los Procedimientos A y B. Para disolventes de Clase 1 diferentes de 1, 1, 1-tricloroetano, preparar la primera
dilución según se indica para la primera dilución en Solución Madre del Estándar de Clase 7 en el Procedimiento A.] Transferir un
volumen, medido con exactitud, de cada Estándar de Referencia USP individual correspondiente a cada pico de disolvente resi-
dual identificado y verificado mediante los Procedimientos A y B a un recipiente adecuado y diluir cuantitativamente con agua,
y si fuera necesario en diluciones sucesivas, para obtener una solución con una concentración final de 1/20 del valor especifica-
do en la Tabla 1 o Tabla 2 (en Límite de Concentración).
USP 40 Pruebas Químicas/ (467) Disolventes Residuales 409

Solución Estándar-Transferir 1,0 mL de la Solución Madre del Estándar a un vial para muestreo de fase gaseosa adecuado,
que contenga 5,0 mL de agua, tapar y mezclar.
Solución Madre de Prueba-Proceder según se indica en Procedimiento A.
Solución de Prueba-Transferir 1,0 mL de la Solución Madre de Prueba a un vial para muestreo de fase gaseosa adecuado, que
contenga 5,0 mL de agua, tapar y mezclar.
Solución de Prueba con una Cantidad Conocida Agregada-[NOTA-Preparar por separado una Solución de Prueba con una
Cantidad Conocida Agregada para cada pico identificado y verificado mediante los Procedimientos A y B.] Transferir 1,0 mL de
Solución Madre de Prueba a un vial para muestreo de fase gaseosa adecuado, agregar 1 mL de Solución Madre del Estándar y 4,0
mL de agua, tapar y mezclar.
Sistema Cromatográfico-Proceder según se indica en Procedimiento C en Artículos Solubles en Agua.
Procedimiento-[NOTA-Se recomienda incrementar la temperatura de la línea de transferencia entre corridas para eliminar
cualquier condensación potencial de los disolventes.] Inyectar por separado en el cromatógrafo (usar los sets de parámetros
operativos para el inyector de fase gaseosa descritos en la columna 3 de la Tabla 5 con una presión del vial de 1 O psi) volúme-
nes iguales de la fase gaseosa (aproximadamente 1,0 mL) de Solución Estándar, Solución de Prueba y Solución de Prueba con una
Cantidad Conocida Agregada, registrar los cromatogramas y medir las respuestas de los picos principales. Calcular la cantidad,
en ppm, de cada disolvente residual encontrado en el artículo en análisis, por la fórmula:
10 x (C!W)[rul<rsr- ru)]
en donde Ces la concentración, en µg por mL, del Estándar de Referencia USP correspondiente en la Solución Madre del Están-
dar; W es el peso, en g, del artículo en análisis tomado para preparar la Solución Madre de Prueba; y ru y r5 r son las respuestas de
los picos de cada disolvente residual obtenidas a partir de la Solución de Prueba y la Solución de Prueba con una Cantidad Conoci-
da Agregada, respectivamente.

Disolventes Residuales de Clase 3

Si están presentes los disolventes de Clase 3, el nivel de disolventes residuales se puede determinar según se indica en Pérdi-
da por Secado (731) cuando la monografía del artículo en análisis incluye un procedimiento de pérdida por secado que especi-
fique un límite superior de no más de 0,5% (de acuerdo con la Opción 7 en este capitulo general), o se puede realizar una
determinación específica del disolvente. Si la monografía del artículo en análisis no incluye un procedimiento de pérdida por
secado o si el límite de disolvente de Clase 3 en una monografía individual es superior a 50 mg por día (lo que corresponde a
5000 ppm ó 0,5% en la Opción 7), el disolvente residual de Clase 3 individual o los disolventes presentes en el artículo en
análisis se deben identificar y cuantificar, aplicando los procedimientos descritos anteriormente, con las debidas modificaciones
a las soluciones estándar, siempre que sea posible. Si éste no fuera el caso, se debe emplear un procedimiento validado apro-
piado. En estos procedimientos se deben usar Estándares de Referencia USP, siempre que estén disponibles.

GLOSARIO

Carcinógenos genotóxicos: Son carcinógenos que producen cáncer al afectar los genes o cromosomas.
Exposición diaria permitida (EDP): La máxima ingesta diaria admisible de un disolvente residual en productos farmacéuti-
cos.
Factor de modificación: Un factor determinado según el criterio profesional de un toxicólogo y que se aplica a datos de
valoraciones biológicas de manera que los datos se puedan relacionar con seres humanos de manera segura.
lngesta diaria admisible (IDA): La máxima ingesta diaria admisible de sustancias químicas tóxicas. Este término es emplea-
do por la Organización Mundial de la Salud (OMS).
lngesta diaria tolerable (IDT): La exposición diaria tolerable a sustancias químicas tóxicas. Este término es empleado por el
Programa Internacional para la Seguridad de las Sustancias Químicas (IPCS).
Neurotoxicidad: La capacidad de una sustancia de ocasionar efectos adversos en el sistema nervioso.
Nivel mínimo de efecto observable (LOEL, por sus siglas en inglés): La dosis mínima de una sustancia en un estudio o
grupo de estudios que produce un incremento biológicamente significativo en la frecuencia o gravedad de los efectos causa-
dos a los seres humanos o animales expuestos a esta sustancia.
Nivel sin efecto observable (NOEL, por sus siglas en inglés): La dosis máxima de una sustancia que no produce un incre-
mento biológicamente significativo en la frecuencia o gravedad de los efectos causados a los seres humanos o animales ex-
puestos a esta sustancia.
Sustancias seriamente sospechosas de carcinogenidad para los seres humanos: Una sustancia para la cual no hay eviden-
cia epidemiológica de carcinogénesis pero de la que existen datos de genotoxicidad positivos y clara evidencia de carcinogé-
nesis en roedores.
Teratogenicidad: La presencia de malformaciones estructurales en un feto en desarrollo ocasionadas cuando se administra
una sustancia durante el embarazo.
Toxicidad reversible: La presencia de efectos nocivos ocasionados por una sustancia que desaparecen cuando termina la ex-
posición.
41 O (467) Disolventes Residuales/ Pruebas Químicas USP 40

APÉNDICES

Apéndice 1: Lista

Ver la tabla Apéndice 7. Lista de Disolventes Residuales Incluidos en Este Capítulo General.
APÉNDICE 1. LISTA DE DISOLVENTES RESIDUALES INCLUIDOS EN ESTE CAPÍTULO GENERAL
Disolvente Otros nombres Estructura Clase
Acetato de butilo Éster butílico del ácido acético CH,COO(CH,),CH 3 Clase 3
Acetato de etilo Éster etílico del ácido acético CH,COOCH,CH, Clase 3
Acetato de isobutilo Éster isobutílico del ácido acético CH,COOCH 2 CH(CH 3)i Clase 3
Éster isopropílico del ácido
Acetato de isopropilo acético CH 3 COOCH(CH 3 ), Clase 3
Acetato de metilo Éster metílico del ácido acético CH 3 COOCH 3 Clase 3
Acetato de propilo Éster propílico del ácido acético CH,COOCH,CH,CH, Clase 3
2-Propanona
Acetona Propan-2-ona CH,COCH, Clase 3
Acetonitrilo CH,CN Clase 2
Ácido acético Ácido etanoico CH 3COOH Clase 3
Ácido fórmico HCOOH Clase 3
UOCH,
""
Anisal Metoxibenceno -"" Clase 3

Benceno Benzol
Alcohol n-butílico
o Clase 1

1-Butanol Butan-1-ol CH,(CH,) 3 0H Clase 3

Alcohol sec-butílico
2-Butanol Butan-2-ol CH 3 CH,CH(OH)CH 3 Clase 3

Ciclohexano Hexametileno o
UCI
Clase 2

Clorobenceno -"" Clase 2

Cloroformo Triclorometano CHCI, Clase 2
Cloruro de metileno Diclorometano CH,Cl 2 Clase 2
CHo
lsopropilbenceno ~CHo
Cu meno (1-Metiletil)benceno Clase 2
sim-Dicloroetano
Dicloruro de etileno
1,2-Dicloroetano Cloruro de etileno CH,CICH,CI Clase 1
1, 1-Dicloroetileno
1, 1-Dicloroeteno Cloruro de vinilideno H,C=CCI, Clase 1
1,2-Dicloroetileno
1,2-Dicloroeteno Dicloruro de acetileno CIHC=CHCI Clase 2
N,N-Dimetilacetamida DMA CH 3CON(CH 3) 2 Clase 2
N,N-Dimetilformamida DMF HCON(CH 3)i Clase 2
Metilsulfinilmetano
Metil sulfóxido
Dimetil sulfóxido DMSO (CH 3h50 Clase 3
Éter dimetílico de etilenglicol
Monoglima
1,2-Dimetoxietano Dimetil celosolve H,COCH,CH,OCH, Clase 2

1,4-Dioxano
p-Dioxano
[1,4]Dioxano
(°)o Clase 2
Etanol Alcohol etílico CH,CH 2 0H Clase 3
Éter terc-butilmetílico 2-Metoxi-2-metilpropano (CH 3 ) 3 COCH 3 Clase 3
* Usualmente 60% de m-xileno, 14% de p-xileno, 9% de o-xileno con 1 7% de etil benceno.
USP 40 Pruebas Químicas / (467) Disolventes Residuales 411

APÉNDICE 1. LISTA DE DISOLVENTES RESIDUALES INCLUIDOS EN ESTE CAPÍTULO GENERAL (Continuación)

Disolvente Otros nombres Estructura Clase
Éter dietílico
Etoxietano
Éter etílico 1, 1 '-Oxibisetano CH,CH?OCH?CH, Clase 3
1,2-Dihidroxietano
Etilenglicol 1,2-Etanodiol HOCH 2 CHpH Clase 2
2-Etoxietanol Celosolve CH,CH?OCH?CH?OH Clase 2
Formamida Metanamida HCONH? Clase 2
Formiato de etilo Éster etílico del ácido fórmico HCOOCH 2 CH 3 Clase 3
Heptano n-Heptano CH 3(CH 2 )sCH 3 Clase 3
Hexano n-Hexano CH,(CH 2) 4 CH 3 Clase 2
Metanol Alcohol metílico CH,OH Clase 2
Alcohol isoamílico
Alcohol isopentílico
3-Metil-1-butanol 3-Metilbutan-1-ol (CH,)?CHCH?CH?OH Clase 3
2-Hexanona
Metilbutilcetona Hexan-2-ona CH,(CH 2),COCH, Clase 2
()CH,
Metilciclohexano Ciclohexilmetano Clase 2
2-Butanona
MEK
Metiletilcetona Butan-2-ona CH 3CH 2 COCH 3 Clase 3
4-Metilpentan-2-ona
4-Metil-2-pentanona
Metil isobutil cetona MIBK CH,COCH 2 CH(CH,) 2 Clase 3
TH3

N-Metilpirrolidona
1-Metilpirrolidin-2-ona
1-Metil-2-pirrolidinona élº Clase 2
Alcohol isobutílico
2-Metil-1-propanol 2-Metilpropan-1-ol (CH,)?CHCH?OH Clase 3
2-Metoxietanol Metil celosolve CH,OCH?CH?OH Clase 2
Nitrometano CH,N0 2 Clase 2
Pentano n-Pentano CH,(CH 2 ),CH 3 Clase 3
Alcohol amílico
Pentan-1-ol
1-Pentanol Alcohol pentílico CH,(CH?),CH?OH Clase 3

Piridina
Propan-1-ol
o "'
Clase 2

1-Propanol Alcohol propílico CH,CH?CH?OH Clase 3

Propan-2-ol
2-Propanol Alcohol isopropílico (CH,) 2 CHOH Clase 3

'\y/
Sulfolano
1, 1-Dióxido de
tetrahidrotiofeno o Clase 2
Tetracloruro de carbono Tetraclorometano CCl 4 Clase 1

Tetrahidrofurano
Óxido de tetrametileno
Oxaciclopentano ó Clase 2

Tetralina 1,2,3,4-Tetrahidronaftaleno 00
()CH,
Clase 2

Tolueno Metilbenceno Clase 2

1, 1, 1-Tricloroetano Metilcloroformo CH 3 CCl 3 Clase 1
Tricloroetileno 1, 1,2-Tricloroeteno HCIC=CCI? Clase 2
* Usualmente 60% de m-xileno, 14% de p-xileno, 9% de o-xileno con 17% de etil benceno.
412 (467) Disolventes Residuales/ Pruebas Químicas USP 40

APÉNDICE 1. LISTA DE DISOLVENTES RESIDUALES INCLUIDOS EN ESTE CAPÍTULO GENERAL (Continuación)

Disolvente Otros nombres Estructura Clase
CH,

Xileno*
Dimetilbenceno
Xilol
()CH, Clase 2
* Usualmente 60% de m-xileno, 14% de p-xileno, 9% de o-xileno con 1 7% de etil benceno.

Apéndice 2: Referencia Adicional

REGLAMENTACIÓN AMBIENTAL DE DISOLVENTES ORGÁNICOS VOLÁTILES

Varios de los disolventes residuales empleados con frecuencia en la elaboración de productos farmacéuticos figuran como
productos químicos tóxicos en las monografías de los Criterios Sanitarios Ambientales (EHC, por sus siglas en inglés) y en el
Sistema Integrado de Información de Riesgo (IRIS, por sus siglas en inglés). Entre los objetivos de grupos tales como el Progra-
ma Internacional para la Seguridad de las Sustancias Químicas (IPCS, por sus siglas en inglés), la Agencia de Protección Am-
biental de los Estados Unidos (EPA, por sus siglas en inglés) y la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados
Unidos (FDA, por sus siglas en inglés) se incluye la determinación de niveles de exposición admisibles. Su propósito es mante-
ner la integridad medioambiental y proteger la salud de los seres humanos frente a los posibles efectos nocivos de las sustan-
cias químicas ocasionados por una exposición medioambiental a largo plazo. Los procedimientos relativos a la estimación de
los límites de exposición máxima segura están basados generalmente en estudios a largo plazo. Cuando no hay disponibles
datos de estudios a largo plazo, se pueden emplear datos de estudios a plazos más cortos modificando el método, por ejemplo
empleando factores de seguridad mayores. El enfoque descrito en esos documentos se refiere en primer lugar a la exposición a
largo plazo o durante toda la vida de la población general al medio ambiente (es decir, el aire ambiental, la comida, el agua
potable y otros medios).

DISOLVENTES RESIDUALES EN PRODUCTOS FARMACÉUTICOS

Los límites de exposición que figuran en este capítulo general están establecidos con respecto a metodologías y datos de
toxicidad descritos en monografías del EHC e IRIS. Sin embargo, se deben tener en cuenta al establecer los límites de exposi-
ción las siguientes suposiciones específicas sobre los disolventes residuales que se emplearán en la síntesis y formulación de
productos farmacéuticos.
1. Los pacientes (no la población en general) emplean los productos farmacéuticos para tratar sus enfermedades o como
profilaxis para prevenir infecciones o enfermedades.
2. La suposición de una exposición del paciente durante toda su vida no es necesaria para la mayoría de los productos far-
macéuticos, pero puede ser adecuada como hipótesis de trabajo para reducir el riesgo para la salud de los seres humanos.
3. Los disolventes residuales son componentes inevitables en la producción de productos farmacéuticos y a menudo son par-
te de los productos medicinales.
4. No se debe exceder el nivel recomendado de disolventes residuales salvo en circunstancias excepcionales.
5. Los datos de los estudios toxicológicos que se emplean para determinar los niveles admisibles de disolventes residuales
deben provenir de protocolos apropiados, como por ejemplo los que describen la Organización para la Cooperación y el
Desarrollo Económico (OECD, por sus siglas en inglés), la EPA y el Libro Rojo de la FDA.

Apéndice 3: Procedimientos para Establecer Límites de Exposición

El método Gaylor-Kodell para la evaluación del riesgo (Gaylor, D. W. y Kodell, R. L., Linear lnterpolation Algorithm for Low
Dose Assessment of Toxic Substance. journal of Environmental Pathology and Toxicology, 4:305, 1980) es apropiado para los
disolventes carcinogénicos de Clase 1 . Solamente cuando se dispone de datos fiables sobre carcinogenicidad puede hacerse
una extrapolación mediante modelos matemáticos para fijar límites de exposición. Los límites de exposición para los disolven-
tes residuales de Clase 1 podrían determinarse empleando un factor de seguridad mayor (es decir, de 1O000 a 100 000) con
respecto al nivel sin efecto observable (NOEL). La detección y la cuantificación de estos disolventes residuales se efectúan me-
diante técnicas analíticas de última generación.
Los niveles de exposición admisibles que figuran en este capítulo general para los disolventes residuales de Clase 2 se esta-
blecieron mediante el cálculo de los valores de EDP conforme a los procedimientos para fijar límites de exposición en produc-
tos farmacéuticos (página 5748 del PF 15(6) [nov.-dic. 1989]) y el método adoptado por la IPCS para la Evaluación del Riesgo
para la Salud Humana de los Productos Químicos [Assessing Human Health Risk of Chemicals (Environmental Health Criterio
770, OMS, 1994)]. Estos procedimientos son similares a los que emplea la EPA de los Estados Unidos (IRIS), la FDA de los Esta-
dos Unidos (Libro Rojo) y otros organismos. El método se describe en este documento para facilitar la comprensión del origen
de los valores de EDP. No es necesario realizar estos cálculos para emplear los valores de EDP que figuran en la Tabla 2 de este
documento.
USP 40 Pruebas Químicas/ (467) Disolventes Residuales 413

La EDP proviene del nivel sin efecto observable (NOEL) o del nivel mínimo de efecto observable (LOEL), en los estudios más
importantes en animales, de la siguiente manera:

EDP = (NOEL x Ajuste por Peso)/(Fl x F2 x F3 x F4 x F5) (1)

La EDP se calcula preferentemente a partir de un NOEL. Si no se obtiene un NOEL, se puede emplear el LOEL. Los factores de
modificación que se proponen en este documento para relacionar datos con seres humanos son del mismo tipo que los "facto-
res de incertidumbre" empleados en los Criterios Sanitarios Ambientales (Environmental Health Criteria 770, OMS, Ginebra,
1994) y los "factores de modificación" o los "factores de seguridad" en el Pharmacopeial Forum. La suposición de una exposi-
ción sistémica del 100% se emplea en todos los cálculos sin tener en cuenta la vía de administración.
Los factores de modificación son los siguientes:

Fl = Un factor que representa la extrapolación entre especies

Fl = 2 para extrapolación de perros a seres humanos
Fl = 2,5 para extrapolación de conejos a seres humanos
Fl = 3 para extrapolación de monos a seres humanos
Fl = 5 para extrapolación de ratas a seres humanos
Fl = 1O para extrapolación de otros animales a seres humanos
Fl = 12 para extrapolación de ratones a seres humanos

El factor Fl tiene en cuenta la relación comparativa entre el área de superficie y el peso corporal de las especies involucradas y
de los seres humanos. El área de superficie (S) se calcula como:
S = kMD,67 (2)

en donde M = peso corporal; y la constante k se ha tomado con valor 1O. Los pesos corporales empleados en la ecuación
figuran a continuación en la Tabla A3. 7.

F2 = Un factor de 1O representa la variabilidad entre individuos. Por lo general, se proporciona un factor de 1O para todos los disolventes orgáni-
cos y 1O se usa en todo este capítulo general.

F3 = Un factor de variabilidad que representa los estudios de toxicidad por exposición a corto plazo.
F3 = 1 para estudios con una duración de al menos la mitad del ciclo vital (1 año para roedores o conejos; 7 años para gatos, perros
y monos).
F3 = 1 para estudios reproductivos que cubren el periodo completo de organogénesis.
F3 = 2 para un estudio de 6 meses en roedores o de 3,5 años en no roedores.
F3 = 5 para un estudio de 3 meses en roedores o de 2 años en no roedores.
F3 = 1O para estudios de más corta duración.

En todos los casos, se ha empleado el factor más alto para los estudios con una duración intermedia (p.ej., un factor de 2 para
un estudio de 9 meses en roedores).

F4 = Un factor que se puede aplicar en casos de toxicidad grave, p.ej., carcinogenicidad no genotóxica, neurotoxicidad o teratogenicidad. En
estudios de toxicidad reproductiva, se emplean los siguientes factores:
F4 = 1 para toxicidad fetal asociada a toxicidad materna
F4 = 5 para toxicidad fetal sin toxicidad materna
F4 = 5 para un efecto teratogénico con toxicidad materna
F4 = 1 O para un efecto teratogénico sin toxicidad materna

F5 = Un factor variable que se puede aplicar si no se ha establecido un nivel sin efecto.

Cuando sólo está disponible un LOEL, se puede emplear un factor de hasta 1O dependiendo de la gravedad de la toxicidad.
Para el ajuste por peso, se supone un peso corporal arbitrario para humanos adultos para ambos sexos de 50 kilogramos (kg).
Este peso relativamente bajo proporciona un factor de seguridad adicional con respecto a los pesos estándar de 60 ó 70 kg
que se usan a menudo en este tipo de cálculos. Se reconoce que algunos pacientes adultos pesan menos de 50 kg; se conside-
ra que estos pacientes se incluyen mediante los factores de seguridad empleados para determinar una EDP. Si el disolvente
estaba presente en una formulación específicamente destinada para uso pediátrico, sería apropiado realizar un ajuste para un
peso corporal inferior.
Como ejemplo de la aplicación de esta ecuación, se considera un estudio de toxicidad de acetonitrilo en ratones que está
resumido en Pharmeuropa, Vol. 9, Nº 1, Suplemento, abril 1997, página S24. Se calcula que el NOEL es de 50,7 mg kg- 1 día-1 •
La EDP para el acetonitrilo en este estudio se calcula de la siguiente manera:

EDP = (50,7 mg kg- 1 día- 1 x 50 kg)/(12 x 1Ox5x1 x 1) = 4,22 mg día- 1

414 (467) Disolventes Residuales/ Pruebas Químicas USP 40

En este ejemplo,

Fl = 12 representa la extrapolación de ratones a seres humanos

F2 = 1O representa las diferencias entre seres humanos individuales
F3 = 5 porque la duración del estudio fue de sólo 1 3 semanas
F4 = 1 porque no se encontró toxicidad grave
F5 = 1 porque se determinó el nivel sin efecto

Valores Empleados en los Cálculos en este Documento

Peso corporal de ratas 425 g
Peso corporal de ratas preñadas 330 g
Peso corporal de ratones 28 g
Peso corporal de ratonas preñadas 30 g
Peso corporal de cobayos 500 g
Peso corporal de monos Rhesus 2,5 kg
Peso corporal de conejas (preñadas o no) 4 kg
Peso corporal de perros Beagle 11,5 kg
Volumen respiratorio de ratas 290 L/día
Volumen respiratorio de ratones 43 L/día
Volumen respiratorio de conejos 1440 L/día
Volumen respiratorio de cobayos 430 L/día
Volumen respiratorio de humanos 28 800 L/día
Volumen respiratorio de perros 9000 L/día
Volumen respiratorio de monos 1150 L/día
Consumo de agua de ratones 5 ml/día
Consumo de agua de ratas 30 ml/día
Consumo de alimentos de ratas 30 g/día

Se emplea la ecuación de gases ideales, PV = nRT, para convertir las concentraciones de gases empleados en estudios de
inhalación de unidades en ppm a unidades en mg/L o mg/m 3 • Se propone como ejemplo un estudio de toxicidad reproducti-
va en ratas por inhalación de tetracloruro de carbono (peso molecular 153,84) resumido en Pharmeuropa, Vol. 9, Nº 1, Suple-
mento, abril 1997, página S9.
n p 300 x 10-6 atm x 153 840 mg mo1- 1 _ 46, 15 mg = 1.89 mg/L
V RT 0,082 L a mK- 1 mo1- 1 x 298K 24.45 L

La relación 1000 L = 1 m 3 se emplea para convertir los valores a mg/m 3 •

(469) ETILENGLICOL, DIETILENGLICOL Y TRIETILENGLICOL EN

SUSTANCIAS ETOXILADAS

El siguiente procedimiento se usa para determinar la concentración de etilenglicol, dietilenglicol y trietilenglicol residuales en
productos etoxilados. Los productos etoxilados pueden contener etilenglicol, dietilenglicol y trietilenglicol residuales como
resultado del proceso de fabricación. El procedimiento es adecuado para las siguientes sustancias:
1. Polietilenglicol 200
2. Polietilenglicol 300
3. Polietilenglicol 400
4. Polietilenglicol 600
5. Polietilenglicol 1000
6. Polisorbato 20
7. Polisorbato 40
8. Polisorbato 60
9. Polisorbato 80
1O. Polietilenglicol monometil éter 350
11 . Polietilenglicol monometil éter 550
12. Aceite de ricino polioxilado 35
1 3. Hidroxiestearato de polioxilo 15
USP 40 Pruebas Químicas/ (469) Etilenglicol, Dietilenglicol y Trietilenglicol 415

14. Polioxil 20 cetoestearil éter

15. Estearato de polioxilo 8
16. Octoxinol 9
17. Nonoxinol 9

IMPUREZAS
• PROCEDIMIENTO
Diluyente: Acetona
Solución estándar: 25 µg/ml de ER Etilenglicol USP, 40 µg/ml de ER Dietilenglicol USP, 40 µg/ml de ER Trietilenglicol
USP y 40 µg/ml de ER 1,3-Butanodiol USP (estándar interno) en Diluyente
Solución muestra: 40 mg/ml de la sustancia de prueba y 40 µg/ml de ER 1,3-Butanodiol USP (estándar interno) en Dilu-
yente
Sistema cromatográfico
(Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: Cromatografía de Gases
Detector: Ionización a la llama
Columna: Capilar, de 0,53 mm x 30 m; ligada con una capa de fase G3 de 1,0 µm
Temperaturas
Detector: 290º
Inyector: 270º
Columna: Ver la Tabla 1.
Tabla 1
Tiempo de Espera (Hold Time)
Temperatura Rampa de Temperatura a la Temperatura
Inicial Temperatura Final Final
(°) (º/min) (°) (min)
40 10 60 5
60 10 170 o
170 15 280 O; 60ª
ª El tiempo de espera fue de O minutos para la Solución estándar y 60 minutos para la Solución muestra y el Diluyente.

Gas transportador: Helio

Velocidad de flujo: 5,0 ml/min
Volumen de inyección: 1,0 µL
Tipo de inyección: Dividida; relación de partición, 2:1
Camisa del inyector (liner): Dispositivo común desactivado, para sistemas de inyección con o sin división, ahusado (ta-
per) y con lana de vidrio, para propósitos generales
Tiempo de corrida: 26 minutos para la Solución estándar; 86 minutos para la Solución muestra y el Diluyente
Aptitud del sistema
Muestra: Solución estándar
[NOTA-Ver la Tabla 2 para los tiempos de retención relativos.]
Tabla 2
Tiempo de
Retención
Nombre Relativo
Etilenglicol 0,45
1,3-Butanodiol (estándar interno) 1,00
Dietilenglicol 1,25
Trietilenglicol 1,70

Requisitos de aptitud del sistema

Resolución: No menos de 20 entre etilenglicol y 1,3-butanodiol; no menos de 20 entre 1,3-butanodiol y dietilenglicol;
no menos de 20 entre dietilenglicol y trietilenglicol
Factor de asimetría: 0,8-1,8 para cada uno de los cuatro picos asignados a etilenglicol, 1,3-butanodiol, dietilenglicol y
trietilenglicol
Desviación estándar relativa: No más de 5,0% para el cociente de respuesta entre los picos del glicol pertinente (eti-
lenglicol, dietilenglicol o trietilenglicol) y el estándar interno
Análisis
Muestras: Solución estándar y Solución muestra
Identificar los picos de etilenglicol, dietilenglicol y trietilenglicol en la Solución muestra por comparación con los de la Solu-
ción estándar.
416 (469) Etilenglicol, Dietilenglicol y Trietilenglicol / Pruebas Químicas USP 40

Calcular el contenido de etilenglicol, dietilenglicol o trietilenglicol, en µg/g, en la porción de la sustancia de prueba toma-
da:

Resultado= (RufR 5) x (C5/Cu) x F

Ru = cociente de respuesta entre los picos del glicol pertinente y el estándar interno (respuesta del pico del glicol
pertinente/respuesta del pico del estándar interno) de la Solución muestra
R5 = cociente de respuesta entre los picos del glicol pertinente y el estándar interno (respuesta del pico del glicol
pertinente/respuesta del pico del estándar interno) de la Solución estándar
C5 =concentración del glicol pertinente (etilenglicol, dietilenglicol o trietilenglicol) en la Solución estándar (µg/mL)
Cu =concentración de la sustancia de prueba en la Solución muestra (mg/mL)
F =factor de conversión (1000 mg/g)

REQUISITOS ADICIONALES
• ESTÁNDARES DE REFERENCIA USP (11)
ER 1,3-Butanodiol USP
ER Dietilenglicol USP
ER Etilenglicol USP
ER Trietilenglicol USP

(471) COMBUSTIÓN EN MATRAZ CON OXÍGENO

El procedimiento de combustión en matraz con oxígeno constituye el paso preparatorio en la determinación de bromo, clo-
ro, yodo, selenio y azufre en algunos artículos farmacopeicos. La combustión del material en análisis (generalmente orgánico)
produce compuestos inorgánicos hidrosolubles, los cuales se analizan para determinar los elementos específicos, según se indi-
ca en la monografía individual o en el capítulo general.
La advertencia que figura en el Procedimiento sólo indica las precauciones de seguridad mínimas y subraya la necesidad de
proceder con extremo cuidado en todas las etapas.

APARATO
El aparato 1 consta de un matraz Erlenmeyer de paredes gruesas, con boca de bordes elevados o en forma de copa, de 500
mL de capacidad (salvo que se indique un matraz de mayor capacidad), equipado con un tapón de vidrio esmerilado al que se
ha soldado un dispositivo para colocar la muestra de prueba, formado por un alambre de platino grueso y una pieza de malla
de platino soldada de aproximadamente 1,5 x 2 cm.

Punto de
ignición
Muestra en
envoltorio de papel

Liquido absorbente

Tapón esmerilado estandardizado

Aparato para la Combustión en Matraz con Oxígeno

PROCEDIMIENTO
[Precaución-Usar lentes de seguridad y colocar una protección de seguridad adecuada entre el aparato y usted. Tomar las precau-
ciones necesarias para asegurar que el matraz esté perfectamente limpio y no contenga ni siquiera trazas de disolventes orgánicos.]
Si se trata de un sólido, pesar la sustancia colocándola sobre un trozo de papel de filtro exento de haluros de aproximada-
mente 4 cm cuadrados y plegar el papel de forma tal que el sólido quede envuelto por aquel. Si se trata de sustancias líquidas,
pesarlas en cápsulas taradas; las cápsulas de policarbonato 1 se utilizan para líquidos cuyos volúmenes no excedan de 200 µL,
mientras que las cápsulas de gelatina resultan adecuadas para volúmenes mayores. [NOTA-Es posible que las cápsulas de gela-
tina contengan cantidades significativas de azufre o haluros combinados. Si se utiliza este tipo de cápsulas, efectuar una deter-

1 Thomas Scientific, localizado en 99 High Hill Road, Swedesboro, NJ 08085 provee un aparato [Números de Catálogo 6513-C20 (de 500 ml de capacidad) y
6513-C30 (de 1000 ml de capacidad)] y cápsulas [Número de Catálogo 6513-84 (1000 cápsulas)] adecuados.
USP 40 Pruebas Químicas/ (481) Valoración de Riboflavina 417

minación con un blanco y realizar las correcciones necesarias.] Colocar la muestra y una tira de papel de filtro, a modo de
mecha, en el soporte de malla de platino. Colocar en el matraz el líquido absorbente especificado en la monografía individual
o en el capítulo general, humedecer la junta del tapón con agua y desplazar el aire del matraz con una corriente rápida de
oxígeno, agitando el líquido por rotación moderada para favorecer la absorción de oxígeno. [NOTA-La saturación del líquido
con oxígeno es clave para el éxito del procedimiento de combustión.] Encender la tira de papel de filtro por medios adecua-
dos. Si se enciende la tira fuera del matraz, introducir inmediatamente el soporte de la muestra en el matraz, invertir el matraz
para que la solución de absorción selle el tapón y sostener el tapón en su lugar con firmeza. Se puede omitir la inversión del
matraz si se enciende en un sistema cerrado. Una vez finalizada la combustión, agitar el matraz vigorosamente y dejarlo en
reposo durante no menos de 1 O minutos agitando intermitentemente. Luego proceder según se indica en la monografía indi-
vidual o en el capítulo general.

<481) VALORACIÓN DE RIBOFLAVINA

VALORACIÓN

Cambio en la redacción:

• •Mí.TODOS QUÍMICOS, PROCEDIMllNTO 1 •usp40

El siguiente procedimiento es adecuado para las preparaciones donde la riboflavina es un elemento constitutivo de una
mezcla de varios ingredientes. Al usar el procedimiento, se debe mantener el pH de las soluciones por debajo de 7,0 y
proteger las soluciones de la luz solar directa en todo momento.
Solución madre del estándar de riboflavina: A 50,0 mg de ER Riboflavina USP, previamente secados y protegidos de la
luz en un desecador sobre pentóxido de fósforo, agregar aproximadamente 300 mL de ácido acético 0,02 N y calentar la
mezcla en un baño de vapor agitando frecuentemente hasta que la riboflavina se haya disuelto, luego enfriar. Agregar
ácido acético 0,02 N a esta solución para obtener 500 mL; luego mezclar. Almacenar la solución bajo tolueno en un refri-
gerador.
Diluir una porción medida con exactitud de esta solución, usando ácido acético 0,02 N, hasta una concentración de 10,0
µg/mL de ER Riboflavina USP seca para obtener la Solución madre del estándar de riboflavina. Almacenar la solución bajo
tolueno en un refrigerador.
Solución estándar: Diluir 10,0 mL de Solución madre del estándar de riboflavina con agua a volumen en un matraz volumé-
trico de 100 mL y mezclar. Cada mL representa 1,0 µg de ER Riboflavina USP. Preparar una Solución estándar nueva para
cada valoración.
Solución muestra: Colocar una cantidad del material a valorar en un matraz de tamaño adecuado y agregar un volumen
de ácido clorhídrico O, 1 N igual en mL a no menos de 1O veces el peso seco del material en gramos, aunque la solución
resultante contendrá no más de 100 µg/mL de riboflavina. Si el material no es fácilmente soluble, pulverizarlo para que
pueda dispersarse uniformemente en el líquido. Agitar vigorosamente y lavar las paredes del matraz con ácido clorhídrico
0, 1 N.
Calentar la mezcla en un autoclave a 121 º-123º durante 30 minutos y enfriar. Si el material se aglutina, agitar la mezcla
hasta que las partículas se dispersen uniformemente. Ajustar la mezcla, agitando vigorosamente, a un pH de 6,0-6,5 con
solución de hidróxido de sodio 1 y, de inmediato, agregar solución de ácido clorhídrico 1 hasta que no haya más precipita-
ción (por lo general a un pH de aproximadamente 4,5, que es el punto isoeléctrico de muchas de las proteínas presen-
tes). Diluir la mezcla con agua para obtener un volumen medido que contenga aproximadamente 0, 11 µg de riboflavina
en cada mL y filtrar a través de papel que se sepa no adsorbe riboflavina. A una alícuota del filtrado, agregar, agitando
vigorosamente, solución de hidróxido de sodio 1 para producir un pH de 6,6-6,8, diluir la solución con agua para obtener
un volumen final medido que contenga aproximadamente O, 1 µg de riboflavina en cada mL y, si la solución se enturbia,
filtrar nuevamente.
Condiciones instrumentales
(Ver Espectroscopía de Fluorescencia (853).)
Modo: Fluorescencia
Longitud de onda de excitación: 444 nm
Longitud de onda de emisión: 530 nm
Análisis
Muestras: Solución estándar, Solución muestra y Blanco
Agregar a cada uno de cuatro o más tubos (o recipientes de reacción) 10,0 mL de la Solución muestra. Agregar a cada uno
de dos o más de estos tubos 1,0 mL de la Solución estándar y mezclar; agregar a cada uno de los dos o más tubos restan-
tes 1,0 mL de agua y mezclar. Agregar a cada tubo 1,0 mL de ácido acético glacial, mezclar; luego agregar, mezclando,
0,50 mL de solución de permanganato de potasio (1 en 25) y dejar en reposo durante 2 minutos. Agregar a cada tubo,

1 Las concentraciones de las soluciones de ácido clorhídrico e hidróxido de sodio usadas no se indican en cada caso porque estas concentraciones pueden variar
según la cantidad de material tomado para la valoración, el volumen de la solución de prueba y el efecto amortiguador del material.
418 (481) Valoración de Riboflavina / Pruebas Químicas USP 40

mezclando, 0,50 ml de solución de peróxido de hidrógeno, con lo cual el color del permanganato desaparecerá dentro
de los 1 O segundos. Agitar vigorosamente los tubos hasta expulsar todo el exceso de oxígeno. Cuando haya cesado la
producción de espuma, eliminar las burbujas de gas que queden en las paredes de los tubos por inclinación de los tubos
para que la solución fluya lentamente de un extremo a otro.
Medir la fluorescencia de todos los tubos, designando la lectura promedio de los tubos que contienen solamente la Solu-
ción muestra como lu y designando el promedio de los tubos que contienen la Solución muestra y la Solución estándar
como Is. Luego, a uno o más tubos de cada tipo agregar, mezclando, 20 mg de hidrosulfito de sodio y medir nuevamente
la fluorescencia dentro de los 5 segundos; designando la lectura promedio como 18 •
Calcular la cantidad, en mg, de riboflavina (C 17H20 N 4 0 6) en cada ml de la Solución muestra tomada:
Resultado= [0,0001 x Uu - 18 )]/(/s - fu)
lu = lectura promedio de los tubos que contienen solamente la Solución muestra
/8 = lectura promedio de la fluorescencia de los tubos después de la adición de 20 mg de hidrosulfito de sodio
Is = lectura promedio de los tubos que contienen la Solución muestra y la Solución estándar
Calcular la cantidad, en mg, de riboflavina (C 17 H20 N 4 0 6) en cada cápsula o tableta.

Agregar lo siguiente:
• '-MÉTODOS QU(MICOS, PROCEDIMIENTO 2
Este procedimiento es adecuado para l.a determinación de riboflavin{I como ingrediente ditetéticó ·o í:ngrediente farmacéuti-
co activo. [NOTA-llevar a cabo todo. el Análisis sin exp<>ner a. la luz solar é:fireda:J
Solución estándar: Transferir 50 mg de ER Riboflavjna usp, a un matra.i volí;ln!létrico de lOoOml que contenga 50 mL de
agua. Agregar 5 ml de ácido acético y suficiente agua para obt~net$0Q m~. Calentar>en. U!'l baño de Vapor, protegida de
la luz, agitando frecuentemente hasta disolver. Enfriar a is• y diluir con ag.ua a volumen. Diluir esta so!uciórr con agua has-
ta que la concentración se encuentre dentro del· intervalo de sensibilidad del ~'u~m.~m~trO usado.
Solución muestra: Transferir 50 mg de Riboflavina' a. un matraz vólumétr!i:::ode >1000 mt que cohtenga so m Lde agua.
Agregar 5 mL de ácido acético y suficiente agua para obtener 800 mL <;alentar:en un baño de Vapor, protegida de la luz,
agitando frecuentemente hasta disolver. Enfriar a 2$º y diluir.con agua a Volumen. Diluir esta solución con agua nasta ob-
téner la misma concentración que la de la Sofutí<5n estándar.
Blanco: Preparar según se indica en So1ucíón muestra, excepto que se debe" omitir la muestra de prueba.
Condiciones instrumentales
(Ver Espectrqscopía de Fluorescencí.d {853).)
Modo: Fluorescencia
tongitud de onda de excitación: 444 nm
l;ongitud de onda de emisión: S30 nm
Análisis
Muestras: Solución estándar, Solución muestra y Blanco
Medir la intensidad de la fluorescenda de la So/Ucfón estándar.. lnmediatamen~ después de la lectura, agregar a la solución
1O mg de hidrosulfito de sodio, mei:clando con una varilla de. vidrio hasta disolver, y sin del"l)ora volver a medir la fluores-
cencia. {NOrA-Dependíendo de la concentración final de. ríboflavina .eii la sciludón, ·pue~ ser néeesário aumenW la can·
tidad de hidtosulfito de sociio pan;t suptimir 'eompletamente la: actividad de la ;ttµore1Scérí;cia.] b difel'l:inda entre. las dos
lecturas representa la intensida;d de. la. flLJorescenda (15) debida a la. $9/ü~lón estándar. De·fl'!anera sfmilat,·rn~ir la lntensl-
dad de la fluorescencia (10) debida a la Sotuciónm¡Jeéta. Realizarla detel\minadón con.el Blanco y l"lat~ftas correc:ci:c¡ines
necesarias.
Calcular el· porc:éntaje de riboflavina (C17 H20N40 6) en la pordóri ·de Ríbpflavina tc¡imada;
Resultado =Ovlls)~ .(Csf.Cul~ JOO
lu = fluorescencia de la Solución muestra
/5 = fluorescencia de la Solución .estándar
C5 = concentración de ER Riboflavina USP eh .la Solucíón estándar (µg/ml)
Cu = concentración de riboflavina en lá Solución muestra, (µg/mt) 4uSP4o

Agregar lo siguiente:
•Los siguientes procedimientos de cromatografía .de líquidos se proveen para la determi.nación de ribofli,tyina como uq ingre-
diente. farmac:éutico activo; un ingrediente de suplementq dietéticQ o un <;ompc¡i.nente de suplementos.dietéticos oJormas
farmacéuticas. Usar los Estándares c;!e Referencia U.SJ] apropíac;los.
Durante estos procedimientos, prc¡iteg.er de .la .atmósfera y la h.1z .las solu<;ioneS; qt¡e cor:itengan y se deriven de. la muestra de
prueba y los Estándares.de Referencia, usando de preferencia material de V:.idríQ.con.pr.c¡itecc.ión.actínica. 4 u51'<o
USP 40 Pruebas Químicas/ (481) Valoración de Riboflavina 419

Agregar.lo siguiente:
• •MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS, PROCEl)IMIENTO 1
Este procedimiento se puede usar p~ra determinar l~ rib<;lf)avína enJos siguieti:tes artículos;
· • Cáps¡¡las de Vitamin(Js Oleosolubles e Hidroso(Ubles ·· ·
•Tabletas de Vitaminas Oleoso/ubíes•e ff}drosáfilbles .
•Cápsulas de Vítaminas•Oleosólubles e Hidr9solu~~escoit.Miner9les•.
. • TQb/etas de VitamínQs (}leqsolubfes e.l:fidrósofubleiconMírf.era/es·
• Cápsuias de. Vitaminqs Hidrosofubles
• Tabletas de Vitaminas. Hidrosq!ufües • , ... ·. · .·.•.· .
• Cápsulas de .vitcitninas.ffidrosofubles con Mineral~s
• . Tabletas de Vitaminas Hidrdsolt1bles con Minerales· . . ••• .. . · · .
Este El~• el procedimiento que implica b1e.%tracdón de ribofl.awnade. l~Jo;rrh.ulacióri. mediant~.el Diluyente,..<;alor y a9itación
mecánica.
A .menos que se especifique de otro modo en las mO:t:iografías .individuales, la Solución f!Stándar; las Soluciones muestra y las
soluciones reactivo se preparan según se indica a continu:adón.
Diluyente: Acetonitrilo, ácido acético glacial y agua (5:}:~4)
Fase móvil: Una mezcla de metano!, áddo acético glacial y água (2.7:1:73) que col)tenga 140 mg de 1-hexanosulfonato
de sodio por 100 ml.
Solución estándar: Transferir 20 mg de.ER Riboflavina USP a un matraz volumétrico de 20.0 mLy agregar l 60 mL:de
Diluyente. Sumergir el matraz en un baño de água calie.nte mantenido a 65º....:70" durante 10 minµtos,agitandoregular-
mente o usando un mezclador de vórtice, hasta qt,ie se disuelva todo el material sólido> Enfriar .de manera rápida a tempe-
ratura ambiente en un baño de agua fríadurante1.0 mínl:ltos y>dtlujrcon Diluyente a volumen.
Solución muestra para cápsulas: Pesar ho rpenosd~ 20 cápsulas en un frasc<>qe pesada.tarado. Abrir las cápsulas, sin
perder material de la cubierta, y transferir el contenido. a un vaso de precipitados de 100 ml. Retirar to.do ef contenido
adherido a las cubiertas .lavando con varias pó'rdones de é~er; Pesechar los lavados y secar las cubiertas delas}cápsulas con
ayuda de una corriente de. aire seco .hasta que deje de .percibitse el olor a éter. Pesar las cubiertas de las .cápsµlas vacías .en
el frasco de pesada tarado y calcular el peso neto promtldi9por cápsula; Transferir.una porción del c.ontenido de las cápsu-
las, equivalente a 2,5 rng de.riboflavina, a un tubo ciecentrífugade SP mb Agregar2$,0 ml.de Diluyente yme+claren un
mezclador de vórtice durante 30 segundos para suspender el· p.olvo cofl)plet¡¡rpente: Sumergir el tubo .de centrífuga en un
ba.ño de agua caliente mantenidóa65"-ZO~, calentar dutante5min01;osymezclarenun.mezclador de vórtice durante 30
segundos. Volver a colocar el tubo en el baño de agua caliente; éalentar du~ánte 5 minutos adicionales y mezclaren un
mezcládor de vórtice durante 30 segundos. Filtrar una porción de Ja ~otución, ,enfriar a temperatura ambiente y usar el fil-
trado transparente. [NmA~Usat el filtrado dentro de las 3 húras<de su filtrac!ón;]
Solución muestra para tabletas; Reducir a polvo fino no menos de 30 tabletas. Transferir una.porción del polvo,. equiva-
lente a 2,5 mg de riboflavina, a un tubo de centrífuga.de 501111:.. Agr'eg<u:25,0 mLdeDiluyente y mezclar en un mezclador
de vórtice durante 30 segundos .para suspender el pofvo completamente. Sumergir el tubo dé centrífuga en un baño de
agua caliente mantenido a 65"~70"', calentar durante 5 minutos y mezclar .en un mezclador de vórtice durante 30 segun·
dos. Volver a colocar el tubo en .el baño.de agua caliente,. calentar durante 5 minutos adicionales y mezclar en un ·rhezcla-
dor de vórtice durante 30 segundos. Filtrar una porción de la solución, enfriar a .temperatura ambiente y usar el filtrado
transparente. [NOTA-Usar el filtrado dentro de las 3 horas de su filtración.]
Sistema cromatográfico
(Ver Cromatografía (621), Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
Detector: UV 280 nm
Columna: 4,6 rnm x 25 cm; relleno L1
Velocidad de flujo: 1 rnL/min
Volumen de inyección: 1O µL
Aptitud del sistema
Muestra: Solución estándar
Requisitos de aptitud
Desviación estándar relativa: No más de 3,0%
Análisis
Muestras: Solución estándar y la .Solución muestra apropiada
Calcular el porcentaje de la cantidad declarada de riboflavina (C17 H20NPJ en la porción de muestra tomada:
Resultado"" (rulrs) x (C5/Cu) x 100
ru = respuesta del pico de riboflavina de la Solución muestra apropiada
r5 =respuesta del pico de riboflavina de la SoJticíóh estándar
C5 = concentración de ER Riboflavina USP en la Solución estánda1 (mg/mL)
Cu =concentración nominal de riboflavina en la Solución muestra apropiada (mg/rnL)..,usNo
420 (481) Valoración de Riboflavina / Pruebas Químicas USP 40

Agregar lo siguiente:
• •MÉTODOS (ROMATOGRÁFICOS, PROCEDIMIENTO 2
Este procedimiento se puede usar para determinar la riboflavina en los siguientes artículos:
• Cápsulas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles
• Tabletas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles
• Cápsulas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles con Minerales
• Tabletas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles con Minerales
• Cápsulas de Vitaminas Hidrosolubles
• Tabletas de Vitaminas Hidrosolubles
• Cápsulas de Vitaminas Hídtosolubles con Minerales
•Tabletas de Vitaminas Hídrosolubfes con Minerales
Este es el procedimiento que implica la extracción de ríboflavina de la formulación mediante el Disolvente de extracción, ca-
lor y agitación mecánica.
A menos que se especifique de otro modo en las monografías individuales, la Solución estándar, las Soluciones muestra y las
soluciones reactivo se preparan según se indica a continuación;
Disolvente de extracción: Transferir l mL de ácido acético glacial y 2,5 g de edetato disódicQ a un matraz volumétrico de
100 mL Disolver y diluir con agua a volumen. Mez:dar la solución resultante con metano! (3:1).
Solución A: 6,8 g de acetato de sodio por 1000 ml de agua
Fase móvil: Preparar. una mezcla de S:olución Ay metanol (13:7). Agregar 2 ml de trietilamina por litro de la mezcla y ajus-
tar con ácido a,cético gladat a un pM .de 5,2.
Solución madre del estándar: Transferir 20 mg de ER Riboftavina USP a un matraz volumétrico de .200 ml y agregar 180
ml de Disolvente de extracción. Sumergir el matraz durante 5 minutos en un baño de agua mantenido a 65º-/5 9 • Mezclar
bien, y repetir si fuera necesario, hasta disolver. Enfriar de manera rápida a temperatura ambiente en un baño de agua fría
y diluir con Disolvente de extracción avQlumen.
Solución estándar: Diluir 5,0 ml de Solución madre del estándar con Disolvente de.extrocdón hasta 25,0mL
Solución muestra para cápsulas: Pesar no menos de 20 cápsulas en·un frasco de pesada tarado. Abrir tas cápsulas, sin
perder material de. lá cubierta, y transferir .el contenido a un vaso de precipitados. Retirar todo el contenido adherido a las
cubiertas lavando c:on varias porciones de éter. Desechar los lavados y secar lás cubiertas de las cápsulas con ayuda de una
corriente de aire seco. Pesar las c;;ubiertas de las cápsulas vacíás .en el fra,sco de pesada tarado y calcular el peso netQ del
contenído de las cápsulas. Transferir una porción del contenido de las cápsulas~ equivalente a 2 mg de ríboflavina, a un
matraz volumétrico de 200 ml. Agregar 100;0 mL de Disolvente de extracción y 111ezclar durante 20 minutos usando un
agitador de movimiento tipo muñeca (wrlst action). Sumergir el matraz en un baño de aguá mantenido a 70"-75º .y .calen-
tar durante 20 minutos. Mezclar en un mezclador .de vórtice durante 3:() segundos, enfriar a temperatura ambiente y filtrar.
Usar el filtrado transparente.
Solue;ión muestra para tabletas: Reducir a polvo finQ no menos de 20 tabletas. Transferir una porción del polvo~ equiva-
lente a 2 mg de riboflavina:, a un matra:z volumétrico de 200 mL Agregar 100,0 mL de Disolvent(' de ~xtracci6n y mezclar
durante 20 mim:JtQs usando un agitador de movimiento tipo muñeca (Wrist action). Sum~rgír el matraz en un .baño de
agt1á mantenido a 70"-75° y calentar durante 20 minutos. Mezclar en un mezclador de vórtice durante 30 segundos, en-
friar a temperatura ambiente y filtrar. Usar el filtrado transparente;
Sistem¡i cromatográfico
(Ver Cromatograffa (621), Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
Detector: UV 254 nm
Columna: 4,6 mm x 25 cm; relleno L1
Velocidad de flujo: 1 ml/min
Volumen de inyección: 20 µL
Aptitud del sistema
Muestra: Solución estándar
Requisitos de aptitud
Desviación estándar relativa: No más de 3,0%
Análisis
Muestras: Solución estándar y la Solución muestra apropiada
Calcular el porcentaje de la cantidad declarada de riboflavina (C 17H20N 40 6) en la p()rción de muestra tomada:
Resultado= (ruf r5) x (CsfCu) x 100
ru =respuesta del pico de riboflavina de la Solución muestra apropiada
r5 = respuesta del pico de riboflavina de la Solución estándar
C5 = concentración de ER Riboflavina USP en la Sofuck?n estánd~r (mg/ml)
Cu =concentración nominal de ríboflavina en la Solución muestra apropiada (mg/mL) 4 usNo
USP 40 Pruebas Químicas/ (481) Valoración de Riboflavina 421

Agregar lo siguiente:

• ..t.MíTODOS CROMATOCRÁFICOS, PROCEDIMIENTO 3

Este procedimiento se puede usar para determinar la riboflavina. en los siguientes artículos;
• Cápsulas de Vítaminas Oleosolubles e Hidrosolubles
• Tabfetas de Vitaminas Oleoso/ubles e .Hidrosoiubfes
• Cápsulas de Vitaminas Oleosolubles.e Hidrosolubles con Minerales
• Tabletas de Vitaminas OleoScolubles e Hidrosolubles.con Minerafes
•Cápsulas de Vitaminas.Hídrosotubles
• Tabletas de Vitaminas Hídrosolubles
• Cápsulas de Vitaminas Hidrbsolubles con Minerales
• Tabletas de Vitaminas Hidrosolubles con Minerales
Este es el procedimiento que implica la extracción de riboflavina de la formulación mediante mezclas dé disolventés orgáni:
cos, calor y agitación mecánica.
A menos que se especifique de otro modo en las monografíasindiV:iduales,las Soluciones estándar, las Soluciones muestra y
las soluciones reactivo se preparan según se índica a continuación.
Diluyente: 25 mg/ml de edetato disódico en agua
Fase móvil: Transforir 0,4 ml de trietllamina, 15,0 ml de ácido acético glacial y 350 ml de metanol a un matraz volUmé-
trico de 2000 m L. Diluir con 1-hexanosulfonato de sodio 0,008 M .a volumen.
Solución madre del estándar: 0,08 mg/ml de ER Riboflavina USP en Diluyente, calentando si fuera necesario.
Solución estándar para cápsulas/tabletas: Transferir 5,0 ml de Solución madre de/estándar a un matraz fon tapón .de
125 ml. Agregar 10,0 ml de una mezcla de metano! y ácido acético glacial (9:.1) y 30,0m.L de una mezcla de metanol y
etilenglicol (1 :1 ). Tapar, agitar durante 15 minutos en un baño de agua.mantenido a 60" y enfriar. Filtrar, desechando los
primeros ml del filtrado.
Solución estándar para solución oral: 8 µg/ml de ER Riboflavina USP en Difuyente, diluida a partir de Solúción madre del
estándar
Solución muestra para cápsulas: Pesar no menos de 20 cápsulas en un ffasco de pesada tarauo. Abrir las cápsulas; si.o
perder material de la cubierta, y transferir el contenido a un vaso de precipitados de 100 ml. Retirar todo el contehídó
adherido a las cubiertas vacías lavando, si fuera necesario, con varias porciones de éter. Desechar los lavados y setarlas
cubiertas de las cápsulas con ayuda de una corriente de aire seco hasta que deje de percibirse el olor a éter. Pesar las cu-
biertas de las cápsulas vacías en el frasco de pesada tarado y calcular el peso neto promedio por cápsula. Transferfruna
porción del contenido de las cápsulas, equivalente a 0,4 mg de riboflavina1 a un matraz con tapón de 125 ml. Agregar
1O, O ml de una mezcla de metanol y ácido acético glacial (9: 1} y 30,0 ml de una mezcla de metano! y etílenglicol (1 :1).
Tapar, agitar durante 15 minutos en un baño de agua mantenido a 60º y enfriar. Filtrar, desechando los primeros ml del
filtrado.
Solución muestra para solución oral: Equivalente a 8 µg/ml de riboflavina, a partir de solución oral en Diluyente
Solución muestra para tabletas: Pesar y reducir a polvo fino no menos de 20 tabletas. Transferir una porción del polvo,
equivalente a 0,4 mg de riboflavina, a un matraz con tapón de 125 ml. Agregar 10,0 ml de una mezcla de metano! y
ácido acético glacial (9:1) y 30,0 ml de una mezcla de metano! y etilenglicol (1 :1 ). Tapar, agitar durante 15 minutos en un
baño de agua mantenido a 60º y enfriar. Filtrar, desechando los primeros mL del filtrado.
Sistema cromatográfico
0/er Cromatografía <621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
Detector: UV 270 nm
Columna: 4,6 mm x 25 cm; relleno L7
Temperatura de la columna: 50º
Velocidad de flujo: 2 ml/min
Volumen de inyección: 5 µL
Aptitud del sistema
Muestra: Solución estándar
Requisitos de aptitud
Desviación estándar relativa: No más de 2,0%
Análisis
Muestras: Solución estándar apropiada y Solución muestra apropiada
Para cápsulas y tabletas, calcular el porcentaje de la cantidad declarada de riboflavina (C 17H20 N4 0 6) en la porción de mues-
tra tomada:
Resultado= (ruf rs) x (Cs/Cu) x 100
ru =respuesta del pico de riboflavina de la Solución muestra apropiada
r5 = respuesta del pico de riboflavina de la Solución estándar para cápsulas/tabletas
C5 = concentración de ER Riboflavina USP en la Solución estándar para cápsulas/tabletas (mg/ml)
422 <481) Valoración de Riboflavina / Pruebas Químicas USP 40

Cu =concentración nominal de.riboflavina en la Soludón m(JeBf!'aapropiada(n:J9/tnt)

Para solución oral, calcular el porcentaje de la cantidad c(ed(!rada de rib()fta\lina (C11H20N40,;)enJ'! po~<;:ié)n de muestra to-
mada:
·Resultado~ (rJrsJ~.(..:;~~~.~.J~~i
ru =respuesta d~I. p¡¡;:o de ñb()flavlna de. Ja. 5qfuc~ón muestraJ:ktr.q j~(tii~rf<!tt:!I
r5 =respuesta del pko de riboflavir:ta.de laSe>l(tción ~táriet<J:f:'l:J(Jf:(!.:~plf.l.~i<m;~tl'H
C5 = concentración.de. ER Ril:>ofla\lir:la. l)SP en !¡, ·$9f!l(::ÍQri ~sta~atpl!fta $tl(uq®; 9tflf:·(f:Ag¡t(t\~}
Cu = concentración· nonirn¡il de r.ibofJavfna en laSr>ludóf:i. mu~stf(:l i:íflt.Q. S.p(fl.i:ii<m pfQf(ífXg/ffiíl::.)~di;~~

Agregar lo siguiente:

• 4 MÉTODOS CROMA'fe>GAAfl.<:9$, .f>M>Q!PIMIEMTO ·~

Este procedimiento se puede usar para dete~minar ía rtt>ofl¡!¡yir)a el) lo$ ~lgu~ntefl!rtíó:.¡lp~:
• Cáp~ula,s {Je, Vitamínl!f.·O~eoS(~J/,f!bles.ºe: Hidf'c;>~(?li<~(~S:º:,, /""· ::.,,.":",.,::" .:<, .. <::;,· ".;º:o , ,:: ,«,,\::::,-<,>";,::--',":> -

CT~blet~s ~~~atnif}as oso/~bb/;s eHHl~drospllubbllif~/

• apsu1as ddee v1tammas o
• 01e
1eoso1u 1es e 1 roso u . es eón. :·• :M: :
tnera1es .. ;.;< {>·.·· ·· .·. ···• ·•.··:>· :· • .· .•·..·.· .·• .•..· ·. •.· ·. :
• Tabletas de Vitaminas Oleosqlul:>fes e flidrq50Jubles (::On Miil~les • · · · '.; ·: · ·. . •: ; ·. ...
• Cápsulas de Vitaminas HidrQsolubles •. •. ·.·•. .· .• .· ••.).•.•·. .•.·.•.·.·.·.·. ·.·.J.u . :. .: • ;: ·. i. ·.• ·. .·· · · ·:···· ·· ·· . ·.· · ··
• Tabletas. de. \tit(1mínas Hidro.solubles . · ·.·: .· ••••· • . · ••···· · ·
• CápsµJas de VítamfnasHidrosoÍu~Íescot{Minir:a1es . ·• .···: •:: .••. i.····.·.:;. :·· · · ·
Tableta~ dg OV,Jta,Y,iRcj,5 ,';fic;frt;?S~~bt~~ C~n /\,~Jfl~~CJ,~s" ,;ºo'º
• »,: :,:<::> ,:~;;~:'.:,:~'~;{:<:>:;:º:o'\,~-,~,º :o~º;~'~:;:"'.~~:;,- "°:,'~' 'º'"'.;«~;" ' ',«: 'i: :~:"::-,:" ,(,
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0 0

::,, ",''o, ,:, "'º e,",,'' j

Este es un procedimiento retienten:J.eflte. agreg}.id() c(>mo p~rte <:ielpr(>~~so •·~~rt'li~ci(if:! 9.e tnO.f:!l:ígr.afíá:s.!)Sf, ~1.pto·
cedimiento usa cromatografía líqui.da delnteracdón hidrofüíci:l(HILl<:'.~ podus siglas en írzjlé$)~la.prep¡1.~ac.ión de.la
mues.tra ímplica la extracc!ón de rU;>oflaVir:ia de J<! Jo~µJae,!.9n meí]Ji<!nte ~l~fll:IY~f:!(e}:·c!'l.loty aQi~ti.Qo:roe~l:l'c~.
A menos que se especifique de otro modo fin las monografías individüale.sí la Si:>ludón.é.sf.á11dar, Jas SoJuciones muestt.o y las
soluc!Qn~s reactivo se preparan ~ún seitldica.a c(>rlt!nll<!dón.
Diluyente: Metano!, ácido acético.glacial y agua (:S:Q;1:49)
Soh.1ción A: Formiato de.amonio .SmM; ¡:¡,jµstar:e,(!n l;iidróxitjíí>:.c:te:.~rt1oni9<!..Ul1P:l'f de:·Q 1f;),
So.lución B: Acetonitrilo
Fase móvil: EluciQn porgradie:nte.Ver.laTa~fa 1.
Tablal
Tiempo $olt,ldónA solutróAB
(mJn) (Vó) (%).
o 11 89
8 1l 8.~
15 23 n
20 30 zo
21 50 so
24 50 @
25 Jl $.9
30 11 89

Solución estándar: Transferir 20 mg de ER Riboflavina USP ¡1: 1;Jr1 ma~raz ~o!um~t~ic9::tje::2Q9:mi:.Y:ii!9~~gar•l64:1:11J:\i:•

Diluyente. Sumergir el matraz en. un baño de agua caliente manten.ido a 6.S"'""70l>:dü!'<inte l:O:tnfn~~:os; a9ital$!º'~eg4lar.,,
mente, o usando un mezclador de vórtice, hasta qué sé C!i:suelva todo él tf:ii!ltéri.al s91i~o•. E~fri~l¡ ~ tnaF!.er~ .r:ápida .a tempe-
ratura am.biente en un b.año. de agµa fria dt¡ranteJOfl'l!n.1.JtO:sY tjHµír~(>nQl{!!*"f:l't~~.a ~ll;lrtteil1·
Solución muestra para cápsulas: Pesar no menos de 20 cápsulaseíl un frase,:odé ~si'l,Q~ ~!'<i<:J(>. Ab.i:!rlasc<;:~ps!Jlás;str:i
perder material de la cubierta, y transferir el contenido a un vaso de precípitadris (le JOl:l ni~.:Q.~~il¡~r ~~í]J.g :l(!!.con~ido
adherido a las cubiertas vacías lavando, si fuera ~cesario, con.varias pi'.)(ciofl~$ ele étef; Oese<;:har.·Jos.'~v,~d<:>:~Y:~E!Car0~as
cubiertas de las cápsulas con ayuda.de una corriente de ake 11ec(> hást¡¡ . g1;1e.:ge~:d.e:>PeÍ'<=i~~~·.e:i:1:>.l;9~ .a:'~tei~·~e$~~$.tu•
biertas de las cápsulas vacías en el frasco de pesada tarl!dO y calé\Jlar el pes() n.etó PfOrríedi() por (:ápsQl!;l~ tran$fe0i;;i;ll1a
porción del contenido de. las cápsulas, equlv,alente 11 41~ rng. <11erJb9fla.v,111a> a lió :tu~•cle1~e~trftl:lg¡¡ <:Je~.O•:f:l'.11:.< AQtega.r
25,o ml.. deOiluyente .y mezclar eo.un ~z<::laclQl'.cle.v,órtlce:iJt;Jt:~ht~ 3Q.~egt;¡:r-cl~~:~rª::st;J~peój;j~:~ pr.l;lv~,.c()mpl~~mi:\nte.
Sumergir el tubo de centrífuga en un baño de agúa <:aliente mantenido a 6$º, calen't(irdlirantelQ mlnutl:isy~iclaren
un mezclador de vórtice durante 30 segµodQ$. Voflíef a colocir.el tUbQ ~ el.bai'.io .~~ agi.¡a•c<!liente,•c¡¡le.nt.ardu~~nte 1.0
minutos adicionales y mezclar en un nie.td~dor dé vórtice dur¡!¡t'l~e ~Q s~tindoi: Filtr;:lr uha p(>r¡:ié)óde la solución, enfriar a
temperatura ambiente y usar el filtrado transpa.r:eJ'lte;
Solución muestra para tabletas: Redu<;:ir a ptjl:Vo::fioo nQ tnl!!n~ cle:~Qt~lil!et~i% "¡;~ris1'eJ;1r,\Jfl.a>pgr~iQ:i:j <:J.el polv,o, equiva-
lente a 2,5 mg de riboflavina, a un tubo de <;:entríft;Jg~ de :SO: mi.,, A:gregaf ~s~o:tnt deOf~l.IY~n~~ y .n:i:ez:<::laren Lm. mezdador
USP 40 Pruebas Químicas/ (501 > Sales de Bases Orgánicas Nitrogenadas 423

de vórtice durante 30 segundos para suspender el pohn;:i·coi11:i:i!:etarnente. Sumerg.it el tubo de centrífuga en un baño de
agua caliente mantenido a 65º-70º, calentar durante 1 O minutos.y mezclar en un mezd<ldor de vórtice durante 30 segun-
dos. Volver <l c;oloci')r el tubo en e.1 baño de agua caliente, .calentar .durante· lO:rriinutos atfü:iOflales y mezclar en un. mezcla-
dor ge '1'<)rtice durante 30. segundos. Filtrar un<! porción de la solución/ .enfriar atemperatura arobierite y usar et fil.tracio
transparente• .[f\¡QTA'"-'-Usar elfiltrado dentro .de las 3. horas de su filtrac:ión.]
Sistemacromat9gráflco
(yer Cromatograffa (621 ), Aptitud def Sistema.)
Modo.: HPLC
Detector: UV 267 nm
Columna: 4,6 mm x 15 cm; relleno t68 de 3,5 µm
Velocidad de flujo: 1,2 ml/min
Volumen de inyección: l O µL
Aptitud del sistema
Muestra: Solución estándar
Requisitos de aptitud
Desviación estándar relativa: No más de 2,0%
Análisis
Muestras: Solución estándar y la Solucíón muestra apropiada
Calcular el porcentaje de. la c.antidad declarada de riboflavina (C17H2<N4 P6).en la porción de muestra tó.mada:
Resultado = (rul r5) x (Csf Cu) x 100
ru ::: respuesta del pico de riboflavina de la Soflltíón muestra apropiada
r5 = respuesta del pico de ríboflavina de la Solución estándar
C5 =concentración de ER Riboflavina USP en la Solución i!stán(jar(mg/mL)
Cu = concentraCión nominal de riboflavina en la Solü?:fón muestra apropiada (rog/mL) ... usMo
REQUISITOS ADICIONALES
• ESTÁNDARES DE REFERENCIA USP (11)
ER Riboflavina USP

(501) SALES DE BASES ORGÁNICAS NITROGENADAS

PREPARACIÓN ESTÁNDAR

A menos que se indique algo diferente, preparar una solución en ácido sulfúrico diluido (1 en 70) que contenga, en cada
mL, aproximadamente 500 µg del Estándar de Referencia USP especificado, calculados con respecto a la sustancia anhidra y
pesados con exactitud.

PREPARACIÓN DE VALORACIÓN

Si la forma farmacéutica es una tableta, pesar y reducir a polvo fino no menos de 20 tabletas, pesar con exactitud una por-
ción del polvo, que equivalga aproximadamente a 25 mg del ingrediente activo y transferir a un separador de 125 mL; o, si la
forma farmacéutica es un líquido, transferir un volumen de éste, que equivalga aproximadamente a 25 mg del ingrediente
activo y medido con exactitud, a un separador de 125 mL. Luego agregar al separador 20 mL de ácido sulfúrico diluido (1 en
350) y agitar vigorosamente durante 5 minutos. Agregar 20 mL de éter, agitar cuidadosamente y filtrar la fase ácida, recogién-
dola en un segundo separador de 125 mL. Agitar la fase etérea con dos porciones de 1O mL de ácido sulfúrico diluido (1 en
350), filtrar cada porción del ácido y recolectarla en el segundo separador y desechar el éter. Agregar 1O mL de hidróxido de
sodio SR y 50 mL de éter al extracto ácido, agitar cuidadosamente y transferir la fase acuosa a un tercer separador de 125 mL
que contenga 50 mL de éter. Agitar cuidadosamente el tercer separador y desechar la fase acuosa. Lavar sucesivamente las dos
soluciones etéreas con una única porción de 20 mL de agua y desechar el agua. Extraer cada una de las dos soluciones etéreas
con porciones de 20 mL, 20 mL y 5 mL de ácido sulfúrico diluido (1 en 70), en el orden indicado, pero siempre extrayendo
primero la solución etérea del tercer separador y después la del segundo separador. Combinar los extractos ácidos en un ma-
traz volumétrico de 50 mL, diluir a volumen con el ácido y mezclar.
[NOTA-El éter puede sustituirse por hexano o heptano si el coeficiente de partición de la base nitrogenada entre el agua y el
hexano, o entre el agua y el heptano, favorece una extracción completa hacia la fase orgánica.]
424 (501) Sales de Bases Orgánicas Nitrogenadas / Pruebas Químicas USP 40

PROCEDIMIENTO

A menos que se indique algo diferente, diluir 5,0 mL de la Preparación Estándar y 5,0 mL de la Preparación de Valoración con
ácido sulfúrico diluido (1 en 70) hasta 100,0 mL y determinar la absorbancia de cada solución a la longitud de onda especifica-
da, usando ácido sulfúrico diluido (1 en 70) como blanco. Designar la absorbancia de la solución de la Preparación Estándar
como A5 y la de la Preparación de Valoración como Au y calcular el resultado de la valoración según se indique en la monografía
individual.

(503) ÁCIDO ACÉTICO EN PÉPTIDOS

INTRODUCCIÓN
Este capítulo provee procedimientos que se deben usar para determinar la cantidad de ácido acético en péptidos. El ácido acé-
tico/acetato es un contraión común en las preparaciones de péptidos .
• MÉTODO 1
Solución de hidróxido de sodio concentrado: Disolver 42 g de hidróxido de sodio en agua y diluir con agua hasta 100
mL.
Solución A: Agregar 0,7 mL de ácido fosfórico a 1000 mL de agua y ajustar con Solución de hidróxido de sodio concentrado
a un pH de 3,0.
Solución B: Metanol
Fase móvil: Ver la Tabla 1.
Tabla 1
Tiempo Solución A Solución B
(min} (%} (%}
o 95 5
5 95 5
10 50 50
20 50 50
22 95 5

Diluyente: Preparar una mezcla de Solución A y Solución B (95:5).

Solución estándar: Disolver en Diluyente una cantidad, pesada con exactitud, de ER Ácido Acético Glacial USP para obte-
ner una solución con una concentración conocida de aproximadamente O, 1 mg/ml. [NOTA-La concentración puede ajus-
tarse dependiendo de la cantidad de acetato o ácido acético que se espera esté presente en el material de prueba.]
Solución muestra: Preparar según se indica en la monografía individual. La cantidad de material usado puede adaptarse
dependiendo de la cantidad de ácido acético esperada.
Sistema cromatográfico
(Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
Detector: UV 21 O nm
Columna: 4,6 mm x 25 cm; relleno L1 de 5 µm
Velocidad de flujo: 1,2 mL/min
Volumen de inyección: 1O µL
Aptitud del sistema
Muestra: Solución estándar
Requisitos de aptitud
Desviación estándar relativa: No más de 5%
Tiempo de retención de ácido acético: 3-4 min
Análisis
Muestras: Solución estándar y Solución muestra
Calcular el porcentaje de ácido acético en la porción de material de prueba tomada:

Resultado= Cruf r5) x (Csf Cu) x 100

ru = respuesta del pico de la Solución muestra

r5 = respuesta del pico de la Solución estándar
C5 = concentración de ER Ácido Acético Glacial USP en la Solución estándar (mg/mL)
Cu = concentración de la Solución muestra (mg/mL)
• MÉTODO 2
Solución A, Solución B, Fase móvil, Diluyente y Sistema cromatográfico: Ver Ácido Trifluoroacético en Péptidos (503.1 ).
USP 40 Pruebas Químicas/ (503.1) Ácido Trifluoroacético 425

Solución estándar: 0,7 mg/mL de ER Acetato de Sodio Trihidrato USP en Diluyente

Calcular la concentración, en mg/mL, de ácido acético en la Solución estándar (C5) tomada:
Cs = 0,441 X e
0,441 =factor de conversión de peso molecular (60,05/136,08)
C =concentración de ER Acetato de Sodio Trihidrato USP en la Solución estándar (mg/mL)
Solución muestra: Aproximadamente 4 mg/mL de muestra de prueba en Diluyente. [NOTA-La concentración de la mues-
tra puede adaptarse dependiendo de la cantidad de ácido acético esperada.]
(NOTA-Como alternativa, se puede preparar la Solución estándar y la Solución muestra según se describe en Método 7.]
Aptitud del sistema
Muestra: Solución estándar
Requisitos de aptitud
Desviación estándar relativa: No más de 5%
Análisis: Proceder según se indica en Método 7.

REQUISITOS ADICIONALES
• ESTÁNDARES DE REFERENCIA USP (11)
ER Ácido Acético Glacial USP
ER Acetato de Sodio Trihidrato USP

(503.1) ÁCIDO TRIFLUOROACÉTICO EN PÉPTIDOS

INTRODUCCIÓN
Los siguientes procedimientos se deben usar para determinar la cantidad de ácido trifluoroacético (TFA, por sus siglas en in-
glés) en péptidos. El TFA/Trifluoroacetato es una impureza residual común del proceso de preparación de péptidos o un
contraión en ingredientes farmacéuticos activos (API, por sus siglas en inglés).

• PROCEDIMIENTO
Solución A: Agregar 7,0 mL de ácido fosfórico y 5,0 mL de hidróxido de amonio a 900 mL de agua. Mezclar y diluir con
agua hasta 1000 mL. [NOTA-El pH de la solución es aproximadamente 2,5.] Pasar a través de un filtro con un tamaño de
poro de 0,45 µm y desgasificar. Agregar 20 mL de metano!, mezclar y desgasificar durante 2 minutos adicionales.
Solución B: Acetonitrilo y agua (50:50). Mezclar y desgasificar.
Fase móvil: Ver la Tabla 7.
Tabla 1
Tiempo Solución A Solución B
(min) (%) (%)
o 100 o
5 100 o
6 o 100
14 o 100
15 100 o
25 100 o
Diluyente: Ácido fosfórico al 0,5% en agua (v/v)
Solución madre de TFA (opción 1): 12 mg/mL de ER Trifluoroacetato de Sodio USP en agua
Calcular la concentración (C5), en mg/mL, de TFA en la Solución madre de TFA tomada:

Cs = 0,838 X e
0,838 = factor de conversión de peso molecular (114,02/136,01)
C =concentración de ER Trifluoroacetato de Sodio USP en la Solución madre de TFA (mg/mL)
Solución madre de TFA (opción 2): 1O mg/mL de TFA en agua, preparada según se indica a continuación. Agregar apro-
ximadamente 50 mL de agua a un matraz volumétrico de 100 mL con tapón. Tarar el matraz tapado en una balanza analí-
tica hasta que no haya cambios significativos en la lectura. Transferir 670 µL de TFA al matraz, tapar de inmediato y pesar.
Diluir con agua a volumen.
Solución de aptitud del sistema: 0,025 mg/mL de TFA en Diluyente, preparada a partir de la Solución madre de TFA
Solución estándar (cuando el contenido de TFA se analiza como una impureza del proceso): 0,01 mg/mL de TFA en Dilu-
yente, preparada a partir de la Solución madre de TFA
426 (503.1) Ácido Trifluoroacético / Pruebas Químicas USP 40

Solución estándar (cuando el contenido de TFA se analiza como un contraión en un ingrediente farmacéutico activo):
0,25 mg/mL de TFA en Diluyente, preparada a partir de la Solución madre de TFA. [NOTA-La concentración puede ser ajus-
tada dependiendo de la cantidad de TFA que se espera esté presente en el material de prueba.]
Solución muestra: No menos de 4 mg/mL de la muestra de prueba en Diluyente. [NOTA-La concentración muestra puede
ser adaptada dependiendo de la cantidad de TFA esperada.]
Sistema cromatográfico
(Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
Detector: UV 21 O nm
Columna: 4,6 mm x 25 cm; relleno L1 de 5 µm. [NOTA-Se puede usar una guarda columna de 4 mm x 2 cm; relleno L1
de 5 µm.]
Velocidad de Flujo: 1,5 mL/min
Volumen de inyección: 20 µL
Aptitud del sistema
Muestra: Solución de aptitud del sistema
[NOTA-El tiempo de retención es aproximadamente 3 minutos para TFA.]
Requisitos de aptitud
Desviación estándar relativa: No más de 5%
Análisis
Muestras: Solución estándar y Solución muestra
Calcular el porcentaje de TFA en la porción de muestra tomada:
Resultado= (ru/r5) x (C5/Cu) x 100
ru = respuestas de los picos de TFA de la Solución muestra
r5 = respuestas de los picos de TFA de la Solución estándar
C5 = concentración de TFA en la Solución estándar (mg/mL)
Cu = concentración de la Solución muestra (mg/mL)
REQUISITOS ADICIONALES
•ESTÁNDARES DE REFERENCIA USP (11)
ER Trifluoroacetato de Sodio USP

(507) PROCEDIMIENTOS PARA LA DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS

INTRODUCCIÓN
Existen diversos procedimientos para determinar la cantidad de proteína total en fármacos y medicamentos farmacéuticos. Los
procedimientos pueden diferir dependiendo de la característica física de la proteína, la cual se usa como fundamento para el
principio de medición (p.ej., absorbancia de la luz ultravioleta debida a los residuos de aminoácidos aromáticos, o absorban-
cia de un colorante unido a la proteína). Para seleccionar un procedimiento de cuantificación de proteína total es importante
conocer la estructura de la proteína y de la matriz de muestra . Los usuarios deben verificar que los métodos validados selec-
cionados que se presentan a continuación son adecuados para sus propósitos específicos (ver Verificación de Procedimientos
Farmacopeicos (1226)).

PROCEDIMIENTO
Se presentan dos opciones para el Método 1: el Método IA, que usa condiciones desnaturalizantes; y el Método 18, que usa con-
diciones nativas. Dependiendo de la estructura de la proteína y la naturaleza de la muestra de proteína (p.ej., las condiciones
de desnaturalización pueden ser más adecuadas para una estructura fuertemente plegada con una mayoría de aminoácidos
aromáticos en el interior de la proteína), un método puede demostrar superioridad con respecto al otro, y los usuarios de-
ben seleccionar el método más adecuado basándose en su proteína y verificarlo según corresponda. Como mínimo, ambos
métodos dependen del cumplimiento de las siguientes condiciones: 1) se debe conocer la secuencia de aminoácidos y el
peso molecular de la proteína; y 2) la proteína debe contener tirosinas y triptófanos, y no debe estar presente otro cromófo-
ro (diferente de cistinas) que absorba cerca de 280 nm (incluyendo ácidos nucleicos y componentes diluyentes) .
• MÉTODO IA. ABSORBANCIA DE Luz ULTRAVIOLETA EN CONDICIONES DESNATURALIZANTES
Solución amortiguadora de muestra A: Preparar una solución de fosfato de sodio 20 mM, de pH 6,5 disolviendo 0,24 g
de fosfato diácido de sodio en aproximadamente 80 mL de agua. Ajustar el pH con solución de hidróxido de sodio (al 10%
p/p) y agregar agua hasta 100 ml. Filtrar.
Solución amortiguadora de muestra B: Preparar una solución de clorhidrato de guanidina 7 M y fosfato de sodio 20 mM
de pH 6,5 disolviendo 0,24 g de fosfato diácido de sodio y 66,87 g de clorhidrato de guanidina en aproximadamente 50
mL de agua. Ajustar con solución de hidróxido de sodio (al 10% p/p) y agregar agua hasta 100 mL. Filtrar.
USP 40 Pruebas Químicas/ (507) Determinación de Proteínas 427

Solución de referencia: Preparar una solución de clorhidrato de guanidina 6 M en Solución amortiguadora de muestra A
mezclando 330 µL de Solución amortiguadora de muestra A y 2000 µL de Solución amortiguadora de muestra B.
Preparación muestra A: Diluir la muestra de prueba agregando Solución amortiguadora de muestra A y Solución amortigua-
dora de muestra B hasta lograr una concentración final de clorhidrato de guanidina 6 M y una absorbancia de aproximada-
mente 0,4-0,6. [NOTA-Se pueden usar diluciones gravimétricas y en ocasiones mejoran la exactitud.] Preparar cada mues-
tra de prueba al menos por triplicado.
Análisis
Muestras: Solución amortiguadora de muestra A, Solución amortiguadora de muestra B, Solución de referencia y Preparación
muestra A
Determinación de la concentración de proteína en solución amortiguadora desnaturalizante: Usando un espectrofo-
tómetro adecuado (ver Espectroscopía Ultravioleta-Visible (857)), medir la absorbancia de la Preparación muestra A encube-
tas de 1 cm a una densidad óptica de 280 nm contra la Solución de referencia y restar el valor de absorbancia a 330 nm
para obtener Acorregida·
Calcular la concentración de proteína (e) en la muestra de prueba:
e= Acorregida X DF X MW/(8230 nm X 1 cm)
Acorregido = absorbancia a 280 nm menos la absorbancia a 330 nm
DF =factor de dilución
MW = peso molecular calculado de la proteína
8 280 nm =coeficiente de extinción de la muestra de prueba a 280 nm

8280 nm = (nTrp X 5690 + nTyr X 1280 + ncys X 120) M- 1 X cm- 1

nr,p = número de triptófanos

nryr = número de tirosinas
ncys = número de cistinas
Aptitud del sistema
Los espectros UV de la muestra de prueba deben presentar un máximo entre 270 y 285 nm y deben presentar un mínimo
entre 243 y 257 nm. La absorbancia medida a 280 nm debe ser no menos de 0,4 y no más de 0,6. La desviación estándar
relativa (RSD, por sus siglas en inglés) de la concentración calculada de todas las determinaciones repetidas debe ser no
más de 3,0% .
• MÉTODO 18. ABSORBANCIA DE Luz ULTRAVIOLETA EN CONDICIONES NATIVAS
Solución amortiguadora de muestra A: Preparar una solución de fosfato de sodio 20 mM de pH 6,5 disolviendo 0,24 g
de fosfato diácido de sodio en aproximadamente 80 mL de agua. Ajustar el pH con solución de hidróxido de sodio (al 10%
p/p) y agregar agua hasta 100 ml. Filtrar.
Preparación muestra A: Diluir la muestra de prueba agregando Solución amortiguadora de muestra A hasta lograr una ab-
sorbancia de aproximadamente 0,4-0,6. [NOTA-Se pueden usar diluciones gravimétricas y en ocasiones mejoran la exacti-
tud.] Preparar cada muestra de prueba al menos por triplicado.
Análisis
Muestras: Solución amortiguadora de muestra A y Preparación muestra A
Determinación de la concentración de proteína en solución amortiguadora nativa: Usando un espectrofotómetro
adecuado (ver el capítulo (857)), medir la absorbancia de la Preparación muestra A en cubetas de 1 cm a 280 nm contra
la Solución amortiguadora de muestra A y restar el valor de absorbancia a 330 nm para obtener Acorregida·
Calcular la concentración de proteína (e) de la muestra de prueba:

e= Acorregido X DF X MW/(82so nm-nativa2 X 1 cm)

Acorregida = absorbancia a 280 nm menos la absorbancia a 330 nm
DF = factor de dilución
MW = peso molecular calculado de la proteína
8280 nm-natival =coeficiente de extinción de la muestra de prueba a 280 nm
donde el coeficiente de extinción 8280 nm-natival se calcula según se indica a continuación:
8280nm-nativa2 = (nTrp X 5500 + nTyr X 1490 + ncys X 125) M- 1 X cm- 1
= número de triptófanos
nTyr = número de tirosinas
ncys = número de cistinas
Aptitud del sistema
Los espectros UV de la muestra de prueba deben presentar un máximo entre 270 y 285 nm y deben presentar un mínimo
entre 243 y 257 nm. La absorbancia medida a 280 nm debe ser no menos de 0,4 y no más de 0,6. La desviación estándar
relativa de la concentración calculada de todas las determinaciones repetidas debe ser no más de 3,0%.
428 (507) Determinación de Proteínas/ Pruebas Químicas USP 40

• MÉTODO 11. MÉTODO DEL ÁCIDO BICINCONÍNICO

Solución reactivo de Ácido Bicinconínico (BCA, por sus siglas en inglés): 1 Preparar una solución de 1 Og/L de ácido bi-
cinconínico, 20 g/L de carbonato de sodio monohidrato, 1,6 g/L de tartrato de sodio, 4 g/L de hidróxido de sodio y 9,5
g/L de bicarbonato de sodio en agua a un pH de 11,25.
Solución reactivo de sulfato de cobre: Preparar una solución de 40 g/L de sulfato cúprico pentahidrato en agua.
Solución reactivo de trabajo de BCA: Mezclar 50 volúmenes de Solución reactivo de BCA con 1 volumen de Solución reacti-
vo de sulfato de cobre. Mezclar hasta que la solución verde se torne transparente.
Solución amortiguadora de dilución de muestra: Agua u otra solución amortiguadora adecuada no interferente
Soluciones estándar: Idealmente, usar el Estándar de Referencia USP para la proteína en análisis. Si la proteína de interés
es desconocida, es una mezcla de proteínas, o el Estándar de Referencia USP específico no está disponible, usar ER Albúmi-
na Sérica Bovina para Cuantificación de Proteína USP. Diluir alícuotas de esta solución con Solución amortiguadora de dilu-
ción de muestra para obtener triplicados de no menos de cinco Soluciones estándar de diferentes concentraciones espacia-
das uniformemente. Las concentraciones seleccionadas de Solución estándar deben resultar en una curva lineal, por lo regu-
lar en el intervalo de 25-1000 µg/mL de proteína.
Solución estándar de aptitud: Preparar una dilución independiente de la misma proteína usada para preparar las Solucio-
nes estándar anteriores usando Solución amortiguadora de dilución de muestra para obtener una Solución estándar de aptitud
con una concentración cercana al punto medio de la curva estándar. Preparar la Solución estándar de aptitud por triplicado.
Solución muestra: Preparar una Solución muestra con una concentración esperada dentro de la curva estándar diluyendo
con Solución amortiguadora de dilución de muestra. Preparar muestras por triplicado.
Análisis
Muestras: Solución amortiguadora de dilución de muestra, Soluciones estándar, Solución estándar de aptitud y Solución mues-
tra
Transferir con exactitud 100 µL de Solución amortiguadora de dilución de muestra, de Soluciones estándar, de Solución están-
dar de aptitud y de Solución muestra a sendos tubos de ensayo. [NOTA-También se pueden usar métodos automatizados
y en placas de 96 pocillos con ajustes de volumen adecuados para el procedimiento siguiente.] Agregar 2,0 mL de Solu-
ción reactivo de trabajo de BCA a cada tubo y mezclar bien.
Cubrir e incubar las soluciones a 37 ± 2º durante 30 ± 1 minutos, luego dejar que las muestras se enfríen a temperatura
ambiente durante no menos de 5 minutos y no más de 60 minutos. Determinar las absorbancias de las soluciones a 562
nm con un espectrofotómetro adecuado (ver el capítulo (857)). Ajustar automáticamente a cero el instrumento con la
muestra de Solución amortiguadora de dilución de muestra.
Medir la absorbancia de todas las muestras de Solución amortiguadora de dilución de muestra, Soluciones estándar, Solución
estándar de aptitud y Solución muestra dentro de los 1O minutos.
Cálculos: Graficar las absorbancias de las Soluciones estándar en función de las concentraciones de proteína de las Solucio-
nes estándar y preparar una curva estándar usando el método de regresión lineal. Usar esta curva estándar y la absorban-
cia de la Solución muestra para determinar la concentración de proteína en cada Solución estándar de aptitud y Solución
muestra.
Aptitud del sistema
Muestras: Soluciones estándar y Solución estándar de aptitud
Requisitos de aptitud
Linealidad: El coeficiente de determinación (r2 ) para un ajuste lineal de todas las Soluciones estándar es no menos de
0,99.
Desviación estándar relativa: No más de 5% para los resultados triplicados de la Solución estándar de aptitud
Exactitud: La concentración calculada de la Solución estándar de aptitud debe estar dentro del 90%-110% de la concen-
tración teórica.
Criterios de aceptación
Desviación estándar relativa: No más de 5% para los resultados triplicados de la Solución muestra
• MÉTODO 111. MÉTODO DE BRADFORD
Solución amortiguadora de dilución de muestra: Agua u otra solución amortiguadora adecuada no interferente
Soluciones estándar: Usar el Estándar de Referencia USP para la proteína en análisis o el ER Albúmina Sérica Bovina para
Cuantificación de Proteína USP si no se conoce la proteína de interés, si es una mezcla de proteínas, o si el Estándar de
Referencia USP específico no está disponible. Diluir alícuotas de esta solución con Solución amortiguadora de dilución de
muestra para obtener triplicados de no menos de cinco Soluciones estándar de diferentes concentraciones espaciadas uni-
formemente. Se proveen dos intervalos de curva estándar para uso: O, 1-1,0 mg/mL de proteína (ver el procedimiento A en
Análisis a continuación) o 5-25 µg/mL de proteína (ver el procedimiento Ben Análisis a continuación).
Solución estándar de aptitud: Diluir el Estándar de Referencia USP para la proteína en análisis o el ER Albúmina Sérica
Bovina para Cuantificación de Proteína USP con Solución amortiguadora de dilución de muestra para obtener una Solución
estándar de aptitud con una concentración cercana al punto medio de la curva estándar. Preparar la Solución estándar de
aptitud por triplicado.

1 Se pueden obtener reactivos de BCA adecuados en Thermo Scientific Nº de catálogo 23225 o equivalente.
USP 40 Pruebas Químicas/ (507) Determinación de Proteínas 429

Solución muestra: Preparar una Solución muestra con una concentración esperada dentro uno de los dos intervalos de
concentración en las opciones A o B siguientes diluyendo con Solución amortiguadora de dilución de muestra. Preparar mues-
tras por triplicado.
Solución reactivo de Coomassie: Disolver 100 mg de azul brillante G2 en 50 mL de alcohol. Agregar 100 mL de ácido
fosfórico, diluir con agua hasta 1 L y mezclar. Pasar la solución a través de papel de filtro (Whatman Nº 1 o equivalente) y
almacenar el reactivo filtrado en un frasco ámbar a temperatura ambiente. [NOTA-Se presentará una precipitación lenta
del colorante durante el almacenamiento del reactivo. Filtrar el reactivo antes de usar.]
Análisis: Seleccionar uno de los dos intervalos de concentración listados a continuación que sea adecuado para las concen-
traciones esperadas de las Soluciones muestra.
A. Intervalo de concentración de proteína: O, 1-1,0 mg/mL
Muestras: Solución amortiguadora de dilución de muestra, Soluciones estándar y Solución muestra
Agregar 1 mL de Solución reactivo de Coomassie a 20 µL de cada muestra de Solución amortiguadora de dilución de muestra,
de Solución estándar y de Solución muestra. Mezclar por inversión, evitando la formación de espuma. Incubar durante
10-30 minutos. Empleando un espectrofotómetro adecuado (ver el capítulo (857)) [NOTA-No usar cubetas de cuarzo
(sílice)], usar la Solución amortiguadora de dilución de muestra para ajustar el instrumento a cero a 595 nm. Ajustar auto-
máticamente a cero el instrumento con la muestra de Solución amortiguadora de dilución de muestra.
Medir la absorbancia de todas las muestras de Solución amortiguadora de dilución de muestra, Soluciones estándar, Solución
estándar de aptitud y Solución muestra dentro de los 60 minutos.
B. Intervalo de concentración de proteína: 5-25 µg/mL
Muestras: Solución amortiguadora de dilución de muestra, Soluciones estándar y Solución muestra
Agregar 0,5 mL de Solución reactivo de Coomassie a 0,5 mL de cada muestra de Solución amortiguadora de dilución de
muestra, Solución estándar y Solución muestra. Mezclar por inversión, evitando la formación de espuma. Incubar durante
10-30 minutos. Empleando un espectrofotómetro adecuado (ver el capítulo (857)) [NOTA-No usar cubetas de cuarzo
(sílice)], usar la Solución amortiguadora de dilución de muestra para ajustar el instrumento a cero a 595 nm. Ajustar auto-
máticamente a cero el instrumento con la muestra de Solución amortiguadora de dilución de muestra. Medir la absorban-
cia de todas las muestras de Solución amortiguadora de dilución de muestra, Soluciones estándar, Solución estándar de apti-
tud y Solución muestra dentro de los 60 minutos.
Cálculos: [NOTA-La relación entre absorbancia y concentración de proteína es no lineal; sin embargo, si el intervalo de
concentración de la curva estándar es lo suficientemente pequeño, se acercará a la linealidad.] Graficar las absorbancias
de las Soluciones estándar en función de las concentraciones de proteína y determinar la curva estándar que mejor se ajus-
te a los puntos graficados. A partir de esta curva estándar y la absorbancia de la Solución muestra, determinar la concen-
tración de proteína en la Solución muestra.
Aptitud del sistema
Muestras: Soluciones estándar y Soluciones estándar de aptitud
Requisitos de aptitud
Linealidad: r2 para un ajuste de todas las Soluciones estándar es no menos de 0,99.
Desviación estándar relativa: No más de 15% para los resultados triplicados de la Solución estándar de aptitud
Recuperación: La concentración calculada de la Solución estándar de aptitud debe estar dentro del 90%-110% de la
concentración teórica.
Criterios de aceptación: El %CV (coeficiente de variación porcentual) de las determinaciones por triplicado de la Solución
muestra es no más de 15%.
• MÉTODO IV. MÉTODO DE LOWRY
Solución de dodecil sulfato de sodio (SOS, por sus siglas en inglés): Cuando se requiera, preparar una solución de
50 g/L de dodecil sulfato de sodio.
Reactivo de Lowry A: Preparar una solución de 1Og/L de hidróxido de sodio en agua y preparar una solución de 50 g/L
de carbonato de sodio anhidro en agua. Mezclar volúmenes iguales (2 volúmenes y 2 volúmenes) de cada solución y diluir
con agua o Solución de SOS, si fuera necesario, hasta 5 volúmenes. [NOTA-Se puede agregar dodecil sulfato de sodio a la
Reactivo de Lowry A cuando la proteína de prueba contenga detergentes o lípidos o tenga una solubilidad deficiente des-
pués del tratamiento para eliminar sustancias interferentes.]
Reactivo de Lowry B: Preparar una solución nueva de 29,8 g/L de tartrato disódico dihidrato en agua. Preparar una solu-
ción de 12,5 g/L de sulfato cúprico pentahidrato en agua. Mezclar volúmenes iguales (2 volúmenes y 2 volúmenes) de
cada solución y diluir con agua hasta 5 volúmenes.
Reactivo de Lowry C: Mezclar 50 volúmenes de Reactivo de Lowry A con 1 volumen de Reactivo de Lowry B. [NOTA-Prepa-
rar en el momento de su uso y proteger de la luz.]
Solución amortiguadora de dilución de muestra: Agua purificada u otra solución amortiguadora no interferente
Soluciones estándar: Usar el Estándar de Referencia USP para la proteína en análisis o el ER Albúmina Sérica Bovina para
Cuantificación de Proteína USP si no se conoce la proteína de interés, si es una mezcla de proteínas, o si el Estándar de
Referencia USP específico no está disponible. Diluir alícuotas de esta solución con Solución amortiguadora de dilución de
muestra para obtener triplicados de no menos de cinco Soluciones estándar de diferentes concentraciones espaciadas uni-

2 Se puede obtener un colorante azul brillante G adecuado en Sigma-Aldrich, Nº de catálogo B0770.

430 (507) Determinación de Proteínas/ Pruebas Químicas USP 40

formemente. Las concentraciones de las soluciones estándar deben seleccionarse de modo que produzcan una curva lineal,
por lo regular en el intervalo de 10-200 µg/mL de proteína.
Solución estándar de aptitud: Diluir el Estándar de Referencia USP para la proteína en análisis o el ER Albúmina Sérica
Bovina para Cuantificación de Proteína USP con Solución amortiguadora de dilución de muestra para obtener una Solución
estándar de aptitud con una concentración cercana al punto medio de la curva estándar. Preparar y analizar la Solución es-
tándar de aptitud por triplicado.
Solución muestra: Preparar una Solución muestra con una concentración esperada dentro de la curva estándar diluyendo
con Solución amortiguadora de dilución de muestra. Preparar y analizar muestras por triplicado.
Reactivo Folin-Ciocalteu para fenoles diluido: Diluir reactivo Folin-Ciocalteu para fenoles con agua (1 :1 ). Se pueden
usar diluciones alternativas siempre que el pH de las muestras (es decir, Soluciones estándar y Soluciones muestra después de
la adición de Reactivo de Lowry C y de Reactivo Folin-Ciocalteu para fenoles diluido) sea 10,0-10,6.
Análisis
Muestras: Solución amortiguadora de dilución de muestra, Soluciones estándar, Solución estándar de aptitud y Solución mues-
tra
Transferir con exactitud 1,0 mL de muestras de Solución amortiguadora de dilución de muestra, Soluciones estándar, Solución
estándar de aptitud y Solución muestra a sendos tubos de ensayo. Agregar a cada tubo de ensayo 5,0 mL de Reactivo de
Lowry C. Dejar en reposo a temperatura ambiente durante 1O minutos. Agregar 0,5 mL de Reactivo Folin-Ciocalteu para
fenoles diluido a cada tubo de ensayo, mezclar inmediatamente e incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos.
Determinar la absorbancia de cada solución a 750 nm con un espectrofotómetro adecuado (ver el capítulo (857)). Ajustar
automáticamente a cero el instrumento con la Solución amortiguadora de dilución de muestra.
Cálculos: Graficar las absorbancias de las Soluciones estándar en función de las concentraciones de proteína de las Solucio-
nes estándar y preparar una curva estándar usando el método de regresión lineal. Usar esta curva estándar y las absorban-
cias de las Soluciones muestra para determinar la concentración de proteína en cada una de las muestras de Solución mues-
tra y Solución estándar de aptitud.
Aptitud del sistema
Muestra: Solución estándar de aptitud
Requisitos de aptitud
Linealidad: r2 para un ajuste lineal de todos los estándares es no menos de 0,995.
Desviación estándar relativa: No más de 5% para los resultados triplicados de la Solución estándar de aptitud
Recuperación: La concentración calculada de la Solución estándar de aptitud debe estar dentro del 90%-110% de la
concentración teórica.
Criterios de aceptación
Desviación estándar relativa: No más de 5% para los resultados triplicados de la muestra
•MÉTODO V. ANÁLISIS DE AMINOÁCIDOS
A continuación se describe la separación y determinación de aminoácidos hidrolizados por cromatografía de intercambio
iónico, seguida de derivatización con ninhidrina postcolumna para muestras de proteína que contienen una proteína con
peso molecular y composición de aminoácidos conocidos. [NOTA-Para información adicional, ver Artículos Obtenidos por
Biotecnología-Análisis de Aminoácidos (1052), que puede ser un recurso útil, aunque no obligatorio.]
Solución para hidrólisis: Ácido clorhídrico 6 N
Preparaciones de hidrolizado de muestra: Preparar una muestra de proteína de modo que el contenido de aminoácidos
esté dentro del intervalo de trabajo lineal establecido del procedimiento. [NOTA-El material de vidrio usado para la hidróli-
sis debe estar limpio.] Colocar volúmenes adecuados de la muestra y la Solución para hidrólisis en un tubo para hidrólisis.
[NOTA-Los volúmenes comunes van de 100 a 500 µL para la muestra y de 1 a 2 mL para la Solución para hidrólisis de
modo que se demuestre la digestión completa de proteína dentro del tiempo de incubación para hidrólisis.] Enfriar la
mezcla hasta que solidifique y aplicar vacío hasta que la presión sea <0,2 bar. Sellar a la llama el tubo para hidrólisis al vacío
derritiendo el cuello del tubo. [NOTA-Alternativamente se pueden usar viales para hidrólisis disponibles comercialmente.]
Hidrolizar a 11 Oº durante 22 horas. Dejar que el tubo se enfríe y retirar el disolvente usando un concentrador centrífugo al
vacío.
Cromatografía
Solución A: Solución amortiguadora de citrato de sodio (0,2 Nen sodio), que contenga citrato trisódico dihidrato al
2,0%, fenol al O, 1%, tiodiglicol al 0,2% y propan-2-ol al 2,0%. Ajustar con ácido clorhídrico concentrado a un pH de 3,2.
Solución B: Solución amortiguadora de citrato de sodio (0,2 Nen sodio), que contenga citrato trisódico dihidrato al
2,0% y fenol al 0, 1%. Ajustar con ácido clorhídrico concentrado a un pH de 4,25.
Solución C: Solución amortiguadora de citrato de sodio (1,2 N en sodio), que contenga citrato trisódico dihidrato al
2,0%, fenol al O, 1% y cloruro de sodio al 5,8%. Ajustar con ácido clorhídrico concentrado a un pH de 6,45.
Solución D: Hidróxido de sodio 0,4 M que contenga ácido etilendiaminotetraacético al O, 1%
Fase móvil: Ver la Tabla 1. Equilibrar el sistema antes de cada corrida.
USP 40 Pruebas Químicas/ (507) Determinación de Proteínas 431

Tabla 1
Flujo,
Flujo, Reactivo
Tiempo Solución Temperatura de la Fase Móvil Postcolumna
(min) (100%) Columna (ml/h) (ml/h)
o A 49º 35 25
8,5 A 49º 35 25
8,51 B 51 o 35 25
23,0 B 51º 35 25
23,01 e 51 o 35 25
24,0 e 51º 35 25
24,01 e 95º 35 25
41,5 e 95º 35 25
41,51 D 95º 35 25
45,5 D 95º 35 25
45,51 A 49º 35 25
49,0 A 49º 35 25
49,01 lsopropanol al 50% 49º o o
51,0 lsopropanol al 50% 49º o o
51,01 A 49º 44 o
62,0 A 49º 44 o
62,01 A 49º 35 25
64,0 A 49º 35 25

Solución amortiguadora de carga: Solución amortiguadora de citrato de sodio (0,2 N en sodio), que contenga citrato
trisódico dihidrato al 2,0%, fenal al O, 1% y tiodiglicol al 2,0%. Ajustar con ácido clorhídrico concentrado a un pH de 2,2.
Reactivo postcolumna
Solución 1: Solución que contenga ácido acético al 7,6%, etilenglicol al 47,7%, agua al 28,7% y acetato de potasio al
16,0%
Solución 2: Solución que contenga metano! al 9%, ninhidrina al 8%, éter metílico de dietilenglicol al 46,4%, etilenglicol
al 36% e hidrindantina al 0,6%. Preparar Reactivo postcolumna mezclando 1,75 litros de Solución 7 y 0,25 litros de Solu-
ción 2. Burbujear nitrógeno por la solución durante su preparación y mezclado. Mantener la solución bajo presión de ni-
trógeno.
Solución estándar: Preparar una solución con cantidades equimolares conocidas de L-alanina, L-arginina, ácido L-aspártico,
ácido L-glutámico, glicina, L-histidina, L-isoleucina, L-leucina, L-lisina, L-metionina, L-fenilalanina, L-prolina, L-serina, L-treoni-
na, L-tirosina y L-valina con la mitad de la cantidad equimolar de L-cistina. [NOTA-Las concentraciones adecuadas son 250
y 125 nmol/mL, respectivamente.]
Solución muestra: Reconstituir las Preparaciones de hidro/izado de muestra en un volumen adecuado de Solución amortigua-
dora de carga.
Blanco: Solución para hidrólisis que se haya sometido a etapas analíticas, incluyendo hidrólisis.
Sistema cromatográfico
(Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
Detector: 440 y 570 nm
Columnas
Prelavado: 4,6 mm x 1O cm; forma sódica de 20 µm, relleno L58
Analítica: 4,6 mm x 20 cm; forma sódica de 8 µm, relleno L58
Volumen de inyección: 40 µL, al primer minuto con restablecimiento de la línea base
Reacción postcolumna: A medida que los aminoácidos eluyen de la columna, agregar Reactivo postcolumna a una veloci-
dad de 25 mL/h. Después del mezclado, pasar el efluente de la columna y el Reactivo postcolumna a través de una espiral
de reacción con un sistema de tubos de PTFE de aproximadamente 1O m x 0,3 mm a una temperatura de aproximada-
mente 135º, donde se desarrolla un color púrpura.
Temperatura de la espiral de reacción: 135º
Aptitud del sistema
Muestra: Solución estándar
Requisitos de aptitud: Los picos de los 1 7 aminoácidos deben ser visibles en la Solución estándar.
Resolución: No menos de 1,2 entre los pares de L-treonina y L-serina, L-cistina y L-valina, y L-isoleucina y L-leucina
Factor de asimetría: 0,8-1,5 para el pico de ácido L-aspártico
Desviación estándar relativa: No más de 2,0% determinada a partir del pico de ácido L-aspártico
432 (507) Determinación de Proteínas/ Pruebas Químicas USP 40

Análisis
Muestras: Blanco, Solución estándar y Solución muestra
Registrar y medir las respuestas para cada pico de aminoácido en la Solución estándar y la Solución muestra. Usar las res-
puestas obtenidas de la Solución estándar para calcular el contenido de cada aminoácido en la muestra. Analizar el Blanco
para confirmar la pureza del reactivo y el diluyente.
Cálculos: Usar aminoácidos bien recuperados para cuantificar la proteína. [NOTA-Para información adicional, ver Artícu-
los Obtenidos por Biotecnología-Análisis de Aminoácidos (1052), Hidrólisis de Proteínas, que puede ser un recurso útil, aun-
que no obligatorio.] Dividir la cantidad, en nmol, de cada uno de los aminoácidos bien recuperados por el número espe-
rado de residuos para tal aminoácido para obtener el contenido de proteína basándose en cada aminoácido bien recupe-
rado. Promediar los resultados del contenido de proteína calculados. Desechar los valores de contenido de proteína que
se desvían >5% de la media. Recalcular la media del contenido de proteína a partir de los valores remanentes para obte-
ner el contenido de proteína de la muestra.
•ESTÁNDARES DE REFERENCIA USP (11)
ER Albúmina Sérica Bovina para Cuantificación de Proteína USP

(511) VALORACIÓN DE UN ESTEROi DE AISLADO

En el siguiente procedimiento, el esteroide a valorar se separa de los esteroides extraños relacionados y excipientes mediante
cromatografía en capa delgada y se determina después de la recuperación a partir del cromatograma.

PREPARACIÓN DE LA PLACA

Preparar una suspensión espesa con 30 g de gel de sílice para cromatografía y una sustancia fluorescente adecuada agregan-
do gradualmente aproximadamente 65 ml de una mezcla de agua y alcohol (5:2), y mezclando. Transferir la suspensión espe-
sa a una placa limpia de 20 cm x 20 cm, extender hasta obtener una capa uniforme de 250 µm de espesor y dejar que se
seque a temperatura ambiente durante 15 minutos. Calentar la placa a 105º durante 1 hora y almacenar en un desecador.

DISOLVENTE A

Mezclar cloruro de metileno con metanol (180:16).

DISOLVENTE B

Mezclar cloroformo con acetona (4:1 ).

PREPARACIÓN ESTÁNDAR

Disolver en una mezcla de volúmenes iguales de cloroformo y alcohol una cantidad adecuada del Estándar de Referencia
USP especificado en la monografía individual, previamente secada según se indicó (ver Estándares de Referencia USP (11 )) y
pesada con exactitud, para obtener una solución con una concentración conocida de aproximadamente 2 mg por ml.

PREPARACIÓN DE VALORACIÓN

Preparar según se indica en la monografía individual.

PROCEDIMIENTO

Dividir el área de la placa cromatográfica en tres secciones iguales y usar las secciones izquierda y derecha para la Prepara-
ción de Valoración y la Preparación Estándar, respectivamente, y la sección central para el blanco. Aplicar 200 µL de la Prepara-
ción de Valoración y 200 µL de la Preparación Estándar en franjas alejadas en 2,5 cm del borde inferior de la sección correspon-
diente de la placa. Secar la solución a medida que se aplica, con ayuda de una corriente de aire. Usando el Disolvente especifi-
cado en la monografía individual, desarrollar el cromatograma en una cámara adecuada, previamente equilibrada y con recu-
brimiento interno de papel absorbente, hasta que el frente de la fase móvil haya recorrido 15 cm por encima de las franjas
iniciales.
Retirar la placa, evaporar el disolvente y localizar la banda principal ocupada por la Preparación Estándar observándola bajo
luz UV. Marcar esta banda, además de las bandas correspondientes en la Preparación de Valoración y en las secciones del blan-
co de la placa. Quitar el gel de sílice de cada banda por separado, ya sea raspando sobre papel satinado o usando un dispositi-
USP 40 Pruebas Químicas/ (525) Dióxido de Azufre 433

vo adecuado recolector por vacío y transferirlo a un tubo de centrífuga de 50 mL con tapón de vidrio. Agregar 25,0 mL de
alcohol a cada tubo y agitar durante no menos de 2 minutos. Centrifugar los tubos durante 5 minutos, pipetear 20 mL del
sobrenadante de cada tubo y transferir a un matraz Erlenmeyer de 50 mL con tapón de vidrio, agregar 2,0 mL de una solución
preparada por disolución de 50 mg de azul de tetrazolio en 1O mL de metano! y mezclar. Proceder según se indica en el
Procedimiento en Valoración de Esteroides (351 ), comenzando donde dice "Luego a cada matraz".

(525) DIÓXIDO DE AZUFRE

Los siguientes métodos se proporcionan a efectos de la determinación de dióxido de azufre en excipientes farmacéuticos.

MÉTODO 1

Procedimiento

Mezclar 20 g de la muestra de prueba, pesados con exactitud, con 200 mL de un disolvente adecuado, según se indica en la
monografía individual, y mezclar hasta obtener una suspensión homogénea. Dejar en reposo la mezcla de prueba hasta que la
mayor parte de la muestra se haya sedimentado y filtrar la porción acuosa a través de papel (Whatman Nº 1 o equivalente). A
100 mL del filtrado transparente, agregar un disolvente adicional según se indica en la monografía individual, agregar 3 mL de
almidón SR y valorar con solución de yodo 0,01 N SV hasta el primer color azul o púrpura permanente. Cada mL de solución
de yodo 0,01 N SV consumido corresponde a 0,003% de dióxido de azufre encontrado.

MÉTODO 11

Procedimiento

Transferir aproximadamente 50 a 100 g de la sustancia en análisis, pesados con exactitud, a un matraz Erlenmeyer de 250
mL, agregar 100 a 150 mL de agua y mezclar. Enfriar entre 5º y 1Oº. Mientras se mezcla con un mezclador magnético, agregar
1O mL de hidróxido de sodio 1,5 N frío (a una temperatura entre 5º y 1Oº). Mezclar durante 20 segundos adicionales y agre-
gar 1O mL de solución indicadora de almidón, preparada de la siguiente manera: mezclar 1O g de almidón soluble con 50 mL
de agua fría, transferir a 1000 mL de agua en ebullición, mezclar hasta que se disuelva por completo, enfriar y agregar 1 g de
ácido salicílico como conservante. [NOTA-Desechar la solución después de 1 mes.] Agregar 1O mL de ácido sulfúrico 2,0 N (a
una temperatura entre 5º y 1Oº) y valorar inmediatamente con yodo 0,005 N SV hasta que persista un color azul claro durante
1 minuto (ver Volumetría (541 )). Realizar una determinación con un blanco, usando 200 mL de agua tratada de manera similar
que la solución en análisis y hacer las correcciones necesarias. Cada mL de yodo 0,005 N equivale a 0, 16 mg de S0 2 •

MÉTODO 111

Procedimiento

Disolver 20,0 g de la muestra de prueba en 150 mL de agua caliente en un matraz de fondo redondo y cuello largo, agregar
5 mL de ácido fosfórico y 1 g de bicarbonato de sodio, e inmediatamente conectar el matraz a un condensador. [NOTA-Se
puede reducir la producción excesiva de espuma mediante el agregado de unas pocas gotas de un agente antiespumante ade-
cuado.] Destilar 50 mL, recibiendo el destilado bajo la superficie de 50 mL de yodo O, l N. Acidificar el destilado con unas
pocas gotas de ácido clorhídrico, agregar 2 mL de cloruro de bario SR y calentar en un baño de vapor hasta que el líquido sea
casi incoloro. El precipitado de sulfato de bario, si lo hubiera, una vez filtrado, lavado e incinerado, pesa no más de 3 mg, que
corresponde a no más de 0,004% de dióxido de azufre, haciendo las correcciones para cualquier sulfato que pudiera estar
presente en 50 mL del yodo O, 1 N.

MÉTODO IV
En esta prueba, el dióxido de azufre se libera a partir de la muestra de prueba en un medio ácido en ebullición y se extrae
con una corriente de dióxido de carbono. El gas separado se recoje en una solución de peróxido de hidrógeno diluida, en la
que el dióxido de azufre se oxida a ácido sulfúrico y se valora con álcali estándar, usando un medidor de pH para controlar el
valor de pH y la valoración. Esta prueba se realiza en condiciones tales que se cumpla con los requisitos especificados en la
prueba de aptitud del sistema.
434 (525) Dióxido de Azufre / Pruebas Químicas USP 40

Reactivos Especiales

DIÓXIDO DE CARBONO

Usar dióxido de carbono con un regulador de flujo que mantenga un flujo de 100 ± 1O ml por minuto.

SOLUCIÓN DE PERÓXIDO DE HIDRÓGENO

Diluir peróxido de hidrógeno al 30% con agua para obtener una solución al 3%. Neutralizar la solución de peróxido de hi-
drógeno al 3% con hidróxido de sodio 0,01 N a un pH de 4, 1 determinado potenciométricamente.

SOLUCIÓN DE METABISULFITO DE POTASIO

Transferir 0,87 g de metabisulfito de potasio (K2 S2 0 5) y 0,2 g de edetato disódico a un matraz volumétrico de 1000 ml.
Diluir con agua a volumen antes de mezclar. [NOTA-Se usa edetato disódico para proteger al ión sulfito de la oxidación.]

Aparato

El diagrama adjunto muestra un aparato adecuado para la determinación de dióxido de azufre (Figura 7).

Figura 1. Aparato para el Método IV.

El aparato consiste en un matraz de ebullición de 500 ml de fondo redondo con tres cuellos, A; un embudo de separación, B,
con una capacidad de 100 ml o mayor; un tubo de entrada de gas de longitud sificiente para permitir la introducción de
dióxido de carbono a 2,5 cm del fondo del matraz de ebullición; un condensador de reflujo, C, con una longitud de la camisa
de 200 mm; y un tubo de salida, E, que conecta el extremo superior del condensador de reflujo con el fondo de un tubo de
ensayo receptor, D. Aplicar una película fina de grasa para llaves de paso a las superificies de sellado de todas las juntas, excep-
to la junta que está entre el embudo de separación y el matraz de ebullición, y sujetar las juntas con abrazaderas para garanti-
zar la hermeticidad.

Prueba de Aptitud del Sistema

PRUEBA A

Usando la Solución de Metabisulfito de Potasio como el estándar, proceder según se indica en Procedimiento, excepto que se
deben reemplazar 25,0 g de la sustancia de prueba por 20 ml de Solución de Metabisulfito de Potasio. Calcular el contenido, en
µg por ml, de dióxido de azufre en la Solución de Metabisulfito de Potasio tomada por la fórmula:
1000(32,03)VN/Vp
USP 40 Pruebas Químicas/ (525) Dióxido de Azufre 435

en donde 1000 es el factor de conversión de mg a µg; 32,03 es el peso miliequivalente de dióxido de azufre; V es el volumen,
en mL, de solución volumétrica consumida; N es la normalidad de la solución volumétrica; y Vr es el volumen, en mL, de la
Solución de Metabisulfito de Potasio tomada para la prueba.

PRUEBA B

En un matraz Erlenmeyer de 100 mL, agregar 20 mL de solución de yodo 0,02 N y 5 mL de ácido clorhídrico 2 N. Agregar 1
mL de almidón SR y valorar con la Solución de Metabisulfito de Potasio hasta que se observe la primera decoloración. Calcular el
contenido, en µg por mL, de dióxido de azufre en la Solución de Metabisulfito de Potasio por la fórmula:
1000(32,03)V¡N¡/Vp

en donde 1000 y 32,03 se definieron anteriormente; V1 es el volumen, en mL, de solución de yodo usado en la prueba; N 1 es la
normalidad de la solución de yodo; y Vr es el volumen, en mL, de la Solución de Metabisulfito de Potasio consumida.
La diferencia entre los contenidos de dióxido de azufre obtenidos a partir de la Prueba A y la Prueba B es no más de 5% de su
valor promedio. La Prueba B se debe realizar dentro de los 15 minutos posteriores a la finalización de la Prueba A. [NOTA-Esto
evita una variación potencial del contenido de dióxido de azufre en la Solución de Metabisulfito de Potasio cuando se almacena
a temperatura ambiente.]

Procedimiento

Agregar 150 mL de agua al matraz de ebullición (A). Cerrar la llave de paso del embudo de separación y comenzar el flujo
de dióxido de carbono a una velocidad de 100 ± 5 mL por minuto a través del aparato. Iniciar el flujo refrigerante del conden-
sador. Colocar 1O mL de Solución de Peróxido de Hidrógeno en el tubo de ensayo receptor (O). Después de 15 minutos, sin
haber interrumpido el flujo de dióxido de carbono, retirar el embudo de separación (8) del matraz de ebullición y transferir
25,0 g de la muestra de prueba al matraz de ebullición con ayuda de 100 mL de agua. Aplicar grasa para llaves de paso a la
junta externa del embudo de separación y volver a colocar el embudo de separación en el matraz de ebullición. Cerrar la llave
de paso del embudo de separación y agregar 80 mL de ácido clorhídrico 2 N al embudo de separación. Abrir la llave de paso
del embudo de separación para permitir que la solución de ácido clorhídrico fluya en el matraz de ebullición, cerrando la llave
de paso antes de que escurran los últimos mL de ácido clorhídrico para evitar que el dióxido de azufre escape hacia el embudo
de separación. Calentar la mezcla a ebullición durante 1 hora. Abrir la llave de paso del embudo, detener el flujo de dióxido de
carbono, discontinuar el calentamiento del matraz, y detener el flujo de agua refrigerante en el condensador. Retirar el tubo de
ensayo receptor y transferir su contenido a un matraz Erlenmeyer de 200 mL de cuello ancho. Enjuagar el tubo de ensayo
receptor con una pequeña porción de agua, agregar el enjuague al matraz Erlenmeyer de 200 mL, y mezclar. Calentar en un
baño de agua durante 15 minutos y dejar que se enfríe. Agregar 0, 1 mL de azul de bromofenol SR y valorar el contenido con
hidróxido de sodio 0, 1 N SV hasta que el color cambie de amarillo a azul violáceo y el cambio de color persista durante al
menos 20 segundos. Realizar una determinación con un blanco y hacer las correcciones necesarias (ver Volumetría (541 )). Cal-
cular el contenido, en µg por g, de dióxido de azufre en la muestra de prueba tomada por la fórmula:
1000(32,03)VN/W
en donde 1000 es el factor de conversión de mg a µg; 32,03 es el peso miliequivalente de dióxido de azufre; V es el volumen,
en mL, de solución volumétrica consumida; N es la normalidad de la solución volumétrica; y W es el peso, en g, de la muestra
de prueba tomada.

MÉTODO V
En este método, de manera similar al Método IV, el dióxido de azufre se libera a partir de la muestra de prueba en un medio
ácido en ebullición y se extrae con una corriente de nitrógeno. El gas separado se recoje en una solución de peróxido de hidró-
geno diluida, en la que el dióxido de azufre se oxida a ácido sulfúrico y se valora con álcali estándar, usando rojo de metilo
como indicador. Esta prueba se realiza en condiciones tales que se cumpla con los requisitos especificados en la prueba de
aptitud del sistema.

Reactivos Especiales

SOLUCIÓN DE PERÓXIDO DE HIDRÓGENO

Diluir una porción de peróxido de hidrógeno al 30 por ciento con agua para obtener una solución al 3%. justo antes de su
uso, agregar 3 gotas de rojo de metilo SR y neutralizar hasta un punto final amarillo con hidróxido de sodio 0,01 N. No exce-
der el punto final.
436 (525) Dióxido de Azufre / Pruebas Químicas USP 40

NITRÓGENO

Usar nitrógeno de alta pureza con un regulador de flujo que mantenga un flujo de 200 ± 1O ml por minuto. Evitar la presen-
cia de oxígeno pasando el nitrógeno a través de un depurador, tal como pirogalol alcalino, que se prepara según se indica a
continuación: agregar 4,5 g de pirogalol a un frasco de lavado de gases, purgar el frasco con nitrógeno durante 3 minutos, y
agregar una solución que contenga 85 ml de agua y 65 g de hidróxido de potasio mientras se mantiene una atmósfera de
nitrógeno en el frasco.

SOLUCIÓN DE METABISULFITO DE POTASIO

Transferir 0,87 g de metabisulfito de potasio (K2 Sp 5 ) y 0,2 g de edetato disódico a un matraz volumétrico de 1000 ml.
Diluir con agua a volumen antes de mezclar. [NOTA-Se usa edetato disódico para proteger al ión sulfito de la oxidación.]

Aparato

El aparato (ver la Figura 2) está diseñado para realizar la transferencia selectiva de dióxido de azufre de la muestra en ácido
clorhídrico acuoso en ebullición a la Solución de Peróxido de Hidrógeno en el vaso G. La contrapresión se limita a la presión inevi-
table debida a la altura de la Solución de Peróxido de Hidrógeno por encima del extremo del burbujeador, F. Mantener la contra-
presión lo más baja posible reduce la probabilidad de pérdida de dióxido de azufre por fugas. Calentar a ebullición previamen-
te los tubos de vinilo y silicona. Aplicar una película fina de grasa para llaves de paso a las superficies de sellado de todas las
juntas, excepto la junta entre el embudo de separación y el matraz, y sujetar las juntas para garantizar la hermeticidad. El em-
budo de separación, B, tiene una capacidad de 100 ml o mayor. El adaptador de entrada, A, con una manguera conectora,
permite aplicar presión de carga a la solución. [NOTA-No se recomienda el uso de un embudo de goteo que equilibre la pre-
sión debido a que el condensado, que puede contener dióxido de azufre, se deposita en el embudo y en el brazo lateral.]

A-+

B---

l
1 1
1 1
e ______..._ i,.. ,,,

Figura 2. Aparato para el Método V.

USP 40 Pruebas Químicas/ (525) Dióxido de Azufre 437

El matraz de fondo redondo, C, es un matraz de 1000 mL con tres juntas cónicas tipo 24/40. El tubo de entrada de gas, O,
tiene una longitud suficiente para permitir la introducción del nitrógeno a 2,5 cm del fondo del matraz. El condensador Allihn,
E, tiene una longitud de camisa de 300 mm. El burbujeador, F (ver la Figura 3), está fabricado con vidrio según las dimensiones
proporcionadas en la Figura 3. La Solución de Peróxido de Hidrógeno está contenida en el vaso, G, con un diámetro interno de
aproximadamente 2,5 cm y una profundidad de aproximadamente 18 cm. Hacer que circule un refrigerante, como por ejem-
plo una mezcla de agua y metanol (4:1) mantenida a 5º, para enfriar el condensador.

T24/40

1
185 mm

_j
Figura 3. Burbujeador (F) para el aparato del Método V.

Prueba de Aptitud del Sistema

PRUEBA A

Usando la Solución de Metabisulfito de Potasio como el estándar, proceder según se indica en Procedimiento, excepto qe se
deben reemplazar los 50,0 g de la sustancia de prueba por 20 mL de Solución de Metabisulfito de Potasio. Calcular el contenido,
en µg por mL, de dióxido de azufre en la Solución de Metabisulfito de Potasio tomada por la fórmula:

1000(32,03)VN/Vr

en donde 1000 es el factor de conversión de mg a µg; 32,03 es el peso miliequivalente de dióxido de azufre; V es el volumen,
en mL, de solución volumétrica consumida; N es la normalidad de la solución volumétrica; y Vr es el volumen, en mL, de
Solución de Metabisulfito de Potasio tomada para la prueba.

PRUEBA B

En un matraz Erlenmeyer de 100 mL, agregar 20 mL de solución de yodo 0,02 N y 5 mL de ácido clorhídrico 2 N. Agregar 1
mL de almidón SR y valorar con la Solución de Metabisulfito de Potasio hasta que se observe la primera decoloración. Calcular el
contenido, en µg por mL, de dióxido de azufre en la Solución de Metabisulfito de Potasio por la fórmula:

1000(32,03)VN/Vr

en donde 1000 y 32,03 se definieron anteriormente; V1 es el volumen, en mL, de solución de yodo usado en la prueba; N 1 es la
normalidad de solución de yodo; y Vr es el volumen, en mL, de Solución de Metabisulfito de Potasio consumida.
La diferencia entre el contenido de dióxido de azufre obtenido a partir de la Prueba A y la Prueba Bes no más de 5% de su
valor promedio. La Prueba B deberá realizarse dentro de los 15 minutos posteriores a la finalización de la Prueba A. [NOTA-Esto
evita la variación potencial del contenido de dióxido de azufre en la Solución de Metabisulfito de Potasio cuando se almacena a
temperatura ambiente.]

Procedimiento

Colocar el aparato en un manto de calentamiento controlado por un dispositivo regulador de energía. Agregar 400 mL de
agua al matraz. Cerrar la llave de paso del embudo de separación y agregar 90 mL de ácido clorhídrico 4 N al embudo de
438 (525) Dióxido de Azufre/ Pruebas Químicas USP 40

separación. Comenzar el flujo de nitrógeno a una velocidad de 200 ± 1O ml por minuto. Iniciar el flujo refrigerante del con-
densador. Agregar 30 ml de Solución de Peróxido de Hidrógeno al vaso (G). Después de 15 minutos, retirar el embudo de sepa-
ración y transferir al matraz una mezcla de 50,0 g de la muestra de prueba, pesados con exactitud, y 100 ml de solución
alcohólica (5 en 100). Aplicar grasa para llaves de paso a la junta externa del embudo de separación, volver a colocar el embu-
do de separación al matraz de junta cónica, y reanudar concomitantemente el flujo de nitrógeno. Aplicar presión de carga
sobre la solución de ácido clorhídrico en el embudo de separación con una pera de goma provista de una válvula. Abrir la llave
de paso del embudo de separación para permitir que la solución de ácido clorhídrico fluya en el matraz. Continuar mantenien-
do por encima de la solución de ácido clorhídrico una presión suficiente para forzarla hacia el interior del matraz. [NOTA-Si
fuera necesario, se puede cerrar la llave de paso temporalmente para incrementar la presión.] Para evitar fugas de dióxido de
azufre hacia el embudo de separación, cerrar la llave de paso antes de que escurran los últimos ml de ácido clorhídrico. Aplicar
suficiente energía al manto de calentamiento para generar aproximadamente 85 gotas de reflujo por minuto. Después de so-
meter a reflujo durante 1,75 horas, retirar el vaso (G), agregar 3 gotas de rojo de metilo SR, y valorar el contenido con hidróxi-
do de sodio 0,01 N SV, usando una bureta de 1 O ml con un tubo de desborde y una manguera que conecte a un tubo de
absorción de dióxido de carbono, hasta un punto final amarillo que persista durante al menos 20 segundos. Realizar una deter-
minación con un blanco y hacer las correcciones necesarias (ver Volumetría (541 )). Calcular la cantidad, en µg, de S0 2 en cada
g de la muestra de prueba tomada por la fórmula:

1000(32,03)VN/W

en donde el factor 1000 convierte mg a µg; 32,03 es el peso miliequivalente de dióxido de azufre; V es el volumen, en ml, de
solución volumétrica consumida; N es la normalidad de la solución volumétrica; y W es el peso, en g, de la muestra de prueba
tomada.

(531) VALORACIÓN DE TIAMINA

VALORACIÓN

(ambio en la redacción:
• MÉTODOS QUÍMICOS, PROCEDIMIENTO 1
•El siguiente procedimiento se proporciona para la dezl:ermin~ción de tiamina como un ingrediente de preparaci()hes.far-
macopeicas que contengan otros componentes activos. El procedimiento implíca la reacción de tiamina con ferrlcianuro
de· potasio y su subsiguiente determinación por deteq:ión de fluorescencia. Durante todo este procedimiento, proteger de
la. atmó.sferá y la. luz las solueióoes qúe contengan y se deriven de la mtJestra de prueba y el t$tándar de Referencia; usan.-
do de preferencia máterialde vidrio ton protecdón a.c:tínita..... usP:io
Solución de ferricianuro de potasio: Disolver 1,0 g de ferricianuro de potasio en agua para obtener 100 ml. Preparar la
solución en el día de su uso.
Reactivo de oxidación: Mezclar 4,0 ml de Solución de ferricianuro de potasio con una cantidad suficiente de hidróxido de
sodio 3,5 N para obtener 100 ml. Usar esta solución dentro de las 4 horas.
Solución madre de sulfato de quinina: Disolver 1O mg de sulfato de quinina en ácido sulfúrico O, 1 N para obtener 1000
ml. Conservar esta solución, protegida de la luz, en un refrigerador.
Solución estándar de sulfato de quinina: Diluir ácido sulfúrico O, 1 N con Solución madre de sulfato de quinina (39:1 ). Esta
solución emite fluorescencia aproximadamente en el mismo grado que el tiocromo obtenido de 1 µg de clorhidrato de
tiamina y se usa para corregir el fluorómetro a intervalos frecuentes debido a la variación en la sensibilidad entre una lectu-
ra y otra dentro de una valoración. Preparar esta solución en el día de su uso.
Solución madre de clorhidrato de tiamina estándar: Transferir aproximadamente 25 mg de ER Clorhidrato de Tiamina
USP, pesados con exactitud, a un matraz volumétrico de 1000 ml. Disolver el Estándar pesado en aproximadamente 300
ml de solución de alcohol diluido (1 en 5) ajustada con ácido clorhídrico 3 N a un pH de 4,0, y llevar a volumen con el
alcohol diluido acidificado. Almacenar en un refrigerador en un envase resistente a la luz. Preparar esta solución madre
nueva cada mes.
Solución estándar: Diluir una porción de la Solución madre de clorhidrato de tiamina estándar, cuantitativamente y en dilu-
ciones sucesivas, con ácido clorhídrico 0,2 N hasta obtener la Solución estándar; cada ml de la cual representa 0,2 µg del
ER Clorhidrato de Tiamina USP.
Solución muestra: Colocar en un matraz volumétrico adecuado una cantidad suficiente del material a valorar, pesada con
exactitud o medida por volumen según se indique, de modo que al diluir con ácido clorhídrico 0,2 N a volumen, la solu-
ción resultante contenga aproximadamente 100 µg de clorhidrato (o mononitrato) de tiamina por ml. Si la muestra es
difícil de disolver, se puede calentar la solución en un baño de vapor y luego enfriarla y diluirla con el ácido a volumen.
Diluir 5 ml de esta solución, cuantitativamente y en diluciones sucesivas, usando ácido clorhídrico 0,2 N hasta una concen-
tración estimada de 0,2 µg de clorhidrato (o mononitrato) de tiamina por ml.
USP 40 Pruebas Químicas/ (531) Valoración de Tiamina 439

Condiciones instrumentales
(Ver Espectroscopía de Fluorescencia (853).)
Modo: Fluorescencia
Longitud de onda de excitación: 365 nm
Longitud de onda de emisión: 435 nm
Análisis: Pipetear y transferir 5 mL de la Solución estándar a cada uno de tres o más tubos (u otros recipientes adecuados)
de aproximadamente 40 mL de capacidad. A cada uno de dos de estos tubos, agregar rápidamente (en 1 a 2 segundos),
mezclando, 3,0 mL del Reactivo de oxidación y dentro de los 30 segundos, agregar 20,0 mL de alcohol isobutílico, luego
mezclar vigorosamente durante 90 segundos por agitación manual de los tubos tapados, o haciendo burbujear una co-
rriente de aire en la mezcla. Preparar un blanco en el tubo restante del estándar, sustituyendo el Reactivo de oxidación con
un volumen igual de hidróxido de sodio 3,5 N y proceder de la misma manera. Pipetear y transferir 5 mL de la Solución
muestra a cada uno de tres o más tubos similares. Tratar estos tubos de la misma manera como se indica para los tubos que
contienen la Solución estándar. Pipetear y transferir 2 mL de alcohol deshidratado a cada uno de seis tubos, agitar por rota-
ción suave durante unos pocos segundos, dejar que las fases se separen y decantar o extraer aproximadamente 1 O mL de
solución de alcohol isobutílico sobrenadante transparente a celdas estandarizadas; luego medir la fluorescencia en un fluo-
rómetro adecuado que tenga un filtro de entrada de intervalo de transmitancia estrecho con un máximo a aproximada-
mente 365 nm y un filtro de salida de intervalo de transmitancia estrecho con un máximo a aproximadamente 435 nm.
Calcular la cantidad, en µg, de clorhidrato de tiamina (C 12 H17 CIN 4 0S · HCI) en cada 5 mL de la Solución muestra:
Resultado= (A - b)/(S - d)
A = lecturas promedio del fluorómetro de las porciones de la Solución muestra tratada con el Reactivo de oxidación
b = lectura del blanco de la Solución muestra
S = lecturas promedio del fluorómetro de las porciones de la Solución estándar tratada con el Reactivo de oxidación
d = lectura del blanco de la Solución estándar
Calcular la cantidad, en mg, de clorhidrato de tiamina (C 12 H17 CIN 4 0S · HCI) en el material de valoración sobre la base de
las alícuotas tomadas. Cuando se indique, la cantidad, en mg, de mononitrato de tiamina (C 12 H17 N5 0 4 S) se puede calcu-
lar multiplicando la cantidad encontrada de clorhidrato de tiamina (C 12 H17 CIN 4 0S · HCI) por 0,9706.

Agregar lo siguiente:
... Los siguientes procedimientos de cromatografía de líquidos se proveen para la determinación de tiamina como un ingredien-
te farmacéutico activo, un ingrediente de suplemento dietético o un componente de suplementos dietéticos o formas far-
macéuticas.
Durante estos procedimientos, proteger de la atmósfera y la luz las soluciones que contengan y se deriven de la muestra de
prueba y los Estándares de Referencia, usando de preferencia material de vidrio con protección actínica .... usP40

Agregar lo siguiente:
• .6.MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS, PROCEDIMIENTO 1
Este procedimiento se puede usar para determinar la tiamina en los siguientes artículos:
• Cápsulas de Vitaminas O/eosolubfes e Hidrosofubles
• Tabletas de Vitaminas Oleosolubles e Hídrosolubles
• Cápsulas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles con Minerales
• Tabletas de Vitaminas Oleosolubles e Hiclrosolubles con Minerales
• Cápsulas de Vitaminas Hidroso/ub/es
• Tabfetas de Vitaminas Hídrosofubles
• Cápsulas de Vitaminas Hidrosolubles con Minerales
• Tabletas de Vitaminas Hidrosolub/es con Minerales
Este es el procedimiento que implica la extracción de tiamina de la formulación mediante el Diluyente, calory agitación
mecánica.
A menos que se especifique de otro modo en las monografías individuales, la Solución estándar, las Soluciones muestra y las
soluciones reactivo se preparan según se indica a continuación.
Diluyente: Acetonitrilo, ácido acético glacial y agua (5:1 :94)
Fase móvil: Una mezcla de metano!, ácido acético glacial y agua (27:1 :73) que contenga 140 mg de 1-hexanosuffonato
de sodio por 100 ml.
Solución estándar: Transferir 20 mg de ER Clorhidrato de Tiamina USP a un matraz volumétrico de 200 mL y agregar 180
mL de Diluyente. Sumergir el matraz en un baño de agua caliente mantenido a 65º-70º durante 1 O minutos, agitando re-
gularmente, o usando un mezclador de vórtice, hasta que se disuelva todo el material sólido. Enfriar de manera rápida a
temperatura ambiente en un baño de agua fría durante 1O minutos y diluir con Diluyente a volumen.
Solución muestra para cápsulas: Pesar no menos de 20 cápsulas en un frasco de pesada tarado. Abrir las cápsulas, sin
perder material de la cubierta, y transferir el contenido a un vaso de precipitados de 100 ml. Retirar todo el contenido
adherido a las cubiertas lavando con varias porciones de éter. Desechar los lavados y secar las cubiertas de las cápsulas con
440 (531) Valoración de Tiamina /Pruebas Químicas USP 40

ayuda de una corriente de aire seco hasta que deje de percibirse el olor a éter. Pesar las cubiertas de las cápsula$ vacías en
el frasco de pesada tarado y calcular el peso neto promedio por cápsula. Transferir una porción del contenido de .lasc¡:ípsu~
las, equivalente a 2,5 mg de clorhidrato de tiamina, a un tubo de centrifuga de 50 ml. Agregar 25,0 rnL de Diluyente y
mezclar usando un mezclador de vórtice.j:lurante 30 segundos para suspender el polvo completamente. 5umergireltubo
de centrífuga en un baño de agua caliente manten ido a. 65º-70º, calentar dura.nte5 minutos y mezclar en un mezdador
de vórtice durante 30 segUlldos. Volver a colocar el tubo en el baño de agua qdiente, <;alentar durante S minutos adiciona-
les y mezclar en un mezclador de vórtice durante. 30 segundos; Filtrar una porción· de la solución, enfriar a temperatura
ambiente y usar el filtrado transparente. [NOTA"'"'"'"Usar el filtrado dentro de las 3 horas de su filtración;]
Solución muestra para tabtetas: Reducir a polvo fino. no menos de 30 tabletas. Transferir una porción del. polvo, .equiva-
lente a 2,5 mg de clorhidrato de tiamina, a un tubo de centfífuga de 50 mL Agregar25,0. mLdeDiluyentey mezclar usan-
do. un mezclador de vórtice durante• 30 segundos para suspender el polvo completamente. Sumergir el .tubo de cenlrff1Jga
en.un baño de agua caliente mantenido a 65º-"'70º, calentardurante S mínutos y mezclar en un mezclador de vórtice du-
rnnte 30 segundos. Volver a colocar el tuboen el baño. de agua caliente, calentar durante 5 mínutos aj:licionalesy mezclar
en un mezclador de vórtice durante 30. segundos. Filtrar una porción.de la solución, enfriara temperatura ambiente y usar
el filtrado transparente. [NOTA-Usar el filtrado dentro de las 3 horas de su filtración.]
Sistema crornatográflco
()ler Cromatografía(62l), Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
Detector: UV 280 nm
Columna: 4,6 mm x 25 cm; relleno Ll
Velócidad de flujo: 1 ml/min
Volumen de inyección: TO 1-lL
Aptitud del sistema
Muestra: Solución estándar
Requisitos de aptit1Jd
Desviación estándar relativa: No más de 3,0%
Análisis
Muestras: Solución es.táf:Jdary Solución muestra apropiada
Para prod\,lt.tos que contengan clorhidrato de ti amina, calcular el· por<::entaje de la cantidad declarada de clorhidrato de
tia mina (C12 H17CINpS · HCI) en la porción de muestra tomada:
Resultado .·=o:· (rufrs} x(CsfCu} x.1 00
ru == respuesta delpico cle]iamina de la Sofü<::íó.r¡ mu!'.'strq apropi<tcla
r5 == respuesta del pico detiamioa de la Solución ¡:.>st<irJdcir
C5 == conteritración de ER tlorhidrafo de Tiarnina USPen la .fofüción éstáf:Jdar (mg/mL)
Cu = concentración nominal de clorhidrato de tiam!f!a en li!I Solt.Jción muestra apropiada (mg/mL)
Para productos que contengan mononitratode tiamina, calcular el porcentaje de la cantidad declarada· de mononitrato de
tiam ina (C11 H17 Np4$) en Ja porción de muestra tomada:
Resultad() ::: (rulrslx (CJCu) ~ (M,¡/M,4) ><100
r0 "' respuesta del pico de tiamina d.e la SoluCión muestra a:prapiada
r5 ::::respuesta del pico<de tiamina de la SoltJciófl ~stántiór
C::S ;:: concentración de ER . Clorhidi'atodeTiamiha•lJSP en la
S(J/uCiórlestánc;Jar (mg/ml}
Cu = ~oncentraciónnominat.del:nonoll.ttra.to . de•tial:nina en ··ta.··soliicíórt.muestta•apropiada (mg/mt)
M,1 ;:: peso.molecularde mononítrat<;tdetiar'llina,· 327,3(5
M,2 = peso molecúlar ge dórhídratp de tia mina, 337,.2 74!JSP41í
Agregor le> siguiente;
• •MÉTODOS (~OMATO(;AAFICO$, PJ&OClDIMIENfO ;z
Este procedimiento se puede usar para determinar la tiarnina<enl()S sigµiE)ntelartícul()~:
• Cápsulas de Vitaminas Oleosolubfes e Hídrosolubles
• Tabl~tas de Vitaminas Qleosol¡,¡ble~ e Hidrósolubte.s .......· . . . • · ... •..·
• Cápsulas de Vitaminas Ofeosolubles e Hidrosolub/es con fv1inerales
• Tabletas de Vitaminas Oleosoli..tbleSerlidrosoliibles c(JnMineta/es
•.Cápsulas de. VítamlnasHiclrosolubles
~· Tabletas. de Vitaminas Hídrosolubles
• Cápsulas de Vitaminas Hidrosolubles con Mín~rales
•·Tabletas de Vitaminas Hidrosolubles con Minerales
Este es el procedimiento que implica la extrai;ción detiamina de ta rormu11ac1on
agitación mecánica.
USP 40 Pruebas Químicas/ (531) Valoración de Tiamina 441

A menos que se especifique de otro modo en las monografías individuales, la Solución estándar, las Soluciones muestra y las
soluciones reactivo se preparan según se indica a continuación.
Solución A: 1,88 g/L de 1-hexanosulfonato de sodio en ácido fosfórico al O, 1%
Fase móvil: Solución Ay acetonitrilo (46:9)
Solución madre del estándar: O, 1 mg/ml de ER Clorhidrato de Tiamina USP en ácido clorhídrico 0,2 N
Solución estándar: 0,02 mg/ml de ER Clorhidrato de Tiamina USP, a partir de Solución madre de( estándar diluida con
ácido clorhídrico 0,2 N
Solución muestra para cápsulas: Pesar no menos de 20 cápsulas en un frasco de pesada tarado. Abrir las cápsulas, sin
perder material de la cubierta, y transferir el contenido a un vaso de precipitados de 100 ml. Retirar todo el contenido
adherido a las cubiertas vacías lavando, si fuera necesario, con varias porciones de éter. Desechar los lavados y secar las
cubiertas de las cápsulas con ayuda de una corriente de aire seco hasta que deje de percibirse el olor a éter. Pesar las cu-
biertas de las cápsulas vacías en el frasco de pesada tarado y calcular el peso neto promedio por cápsula. Mezclar una por-
ción del contenido de las cápsulas con un volumen de ácido clorhídrico 0,2 N hasta obtener una concentración de 0,02
mg/ml de tiamina. Agitar la solución durante 15 minutos con un agitador de movimiento tipo muñeca (wrist action) y
calentar a ebullición durante 30 minutos. Enfriar a temperatura ambiente y filtrar. Usar el filtrado transparente.
Solución muestra para tabletas: Pesar y reducir a polvo fino no menos de 20 tabletas. Mezclar una porción del polvo con
un volumen de ácido clorhídrico 0,2 N hasta obtener una concentración de 0,02 mg/ml de tiamina. Agitar durante 15
minutos con un agitador de movimiento tipo muñeca (wrist actíon} y calentar a ebullición durante 30 minutos. Enfrtar a
temperatura ambiente y filtrar. Usar el filtrado transparente.
Sistema cromatográfico
(Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
Detector: UV 254 nm
Columna: 4,6 mm x 25 cm; relleno L1
Velocidad de flujo: 2 ml/min
Volumen de inyección: 20 µL
Aptitud del sistema
Muestra: Solución estándar
Requisitos de aptitud
Desviación estándar relativa: No más de 3,0%
Análisis
Muestras: Solución estándar y Solución muestra apropiada
Para productos que contengan clorhidrato de tiamina, calcular el porcentaje de la cantidad declarada de clorhidrato de
tiamina (C 12 H17CIN 4 0S · HCI) en la porción de muestra tomada:
Resultado= (ruf r5) x (C5/Cu) x 100
ru = respuesta del pico de tiamina de la Solución muestra apropiada
r5 = respuesta del pico de tiamina de la Solución estándar
C5 = concentración de ER Clorhidrato de Tiamina USP en la Solución estándar (mg/ml)
Cu =concentración nominal de clorhidrato de tiamina en la Solución muestra apropiada (mg/ml)
Para productos que contengan mononitrato de tiamina, calcular el porcentaje de la cantidad declarada de mononitrato de
tiamina (C 12 H17 N5 0 4 S) en la porción de muestra tomada:
Resultado= (ruf r5) x (Cs/Cu) x (M,¡/M,2 ) x 100
ru = respuesta del pico de tiamina de la Solución muestra apropiada
r5 = respuesta del pico de tiamina de la Solución estándar
C5 = concentración de ER Clorhidrato de Tiamina USP en la Solución estándar {mg/ml)
Cu = concentración nominal de mononitrato de tiamina en la Solución muestra apropiada (mg/ml)
M, 1 =peso molecular de mononitrato de tiamina, 327,36
M,2 =peso molecular de clorhidrato de tiamlna, 337,27 i.usp40

Agregar lo siguiente:
• "MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS, PROCEDIMIENTO 3
Este procedimiento se puede usar para determinar la tiamina en los siguientes artículos:
• Cápsulas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles
• Solución Oral de Vitaminas Oleoso/ubles e Hidrosolubles
• Tabletas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles
• Cápsulas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles con Minerales
• Solución Oral de Vitaminas Oíeosolubles e Hidrosolub/es con Minerales
• Tabletas de Vitaminas Ofeosolubles e Hidrosolub/es con Minerales
442 (531) Valoración de Tiamina /Pruebas Químicas USP 40

No más de 2,0%
USP 40 Pruebas Químicas/ (531) Valoración de Tiamina 443

= respuesta del pico de tiamina de la Solución estándar apropiada

= concentración de ER Clorhidrato deTi.amina USP en la Solución estándar apropiada (mg/mL)
= concentración nominal de mononitrato de tiamina en la Solución muestra apropiada {mg/ml)
= peso molecular de mononitrato de tiamina, :327,36
=peso molecular de clorhidrato de tiarnina, 337,27 11 usMo

Agregar lo s;guiente:
• 4 Mtl'oDOS (ROMAToGRÁFICOS, PROCEDIMIENT04
Este procedí mienta se puede usar pata deterrntnar la tiamina en:
·•Un ingredjentefarrnacéutico activo
• Un ingrediente .dietétíco
Este es.el procedimiento que implica la disolución de la muestra directamente en la Fase móvil. El procedimientoseµsa
para la determinación de clorhidrato de tiamina o: mot:lonitrato de tiamina como ingredientes farmacéuticos activos o. in-
gredientes dietéticos.
A menos que se especifique de otro modo en las monografías individuales, 1.a Solución estándar, la Solución muestra y las
soluciones reactivo se preparan según se indica a continuación.
Solución A: 1-0ctat:10sulfonato de sodio 0,005 M en ácido acético glacial diluido (1 en 100)
Solución B: Metanol y acetonítrilo (3:2)
Fase móvil: Solución A :y Solución B (60:40)
Soludón de estándar interno: Metilbenzoato al 2% (v/v) en metano!
Solución estándar: Preparar una solución del mg/mL de ER Clorhidrato de Tiamina USP en Fase móvil. Transferir 20,0 ml
de esta solución y 5,0 mL de Solución de estándar interno a un matraz volumétrico de 50.ml y diluir con Fase móvil a volu-
men; La Solución estándar contiene 400 µg/mL de clorhidrato de tia mina.
Solución muestra: Preparar una solución de 2 mg/mL de clorhidrato de tiamina o mononitrato de tiamina en Fase móvil.
Transferir 10,0 mL de esta solución y 5,0 ml de Solución de estándar interno a un matraz volumétrico de 50 ml :y diluir. con
Fase móvil a volumen.
Sistema cromatográfico
{Ver Cromatografía (621 )1 Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
Detector: UV 254 nm
Columna: 4,6 mm x 25 cm; relleno L1
Velocidad de flujo: 1 ml/min. [NOTA-La velocidad de flujo puede ajustarse para obtener un tiempo de retención de
aproximadamente 12 minutos para tiamina.]
Volumen de inyecdón: 1 O µL
Aptitud del sistema
Muestra: Solución estándar
Requisitos de aptitud
Resolución: No menos de 4,0 entre Jos picos de tiamina y metilbenzoato
Factor de asimetría: No más de 2,0 para el pico de tiamina
Eficiencia de la columna: No menos de 1500 platos teóricos para tlamina
Desviación estándar relativa: No más de 2,0% para los cocientes de respuesta entre los picos de tiamina y estándar
interno
Análisis
Muestras: Solución estándar y Solución muestra
Calcular el porcentaje de clorhidrato de tíamina (C 12H17 CIN 40S · HCI) en la porción de muestra tomada:
Resultado= (RufR 5) x {CsfCu) x 100
Ru = cociente de respuesta entre los picos de tiamina y metilbenzoato de la Solución muestra
R5 = cociente de respuesta entre los picos de tiamina y metilbenzoato de la Solución estándar
C5 =concentración de ER Clorhidrato de Tiamina USP en la Solución estándar(mg/ml)
Cu = concentración de clorhidrato de tiamina en la Solución muestra (mg/ml)
Si el ingrediente farmacéutico activo o ingrediente de suplemento dietético es mononitrato de tiamina, calcular el porcen-
taje de mononitrato de tiamina (C12 H17 N50 4 S) en la porción de muestra tomada:
Resultado= (Ru/R 5) x {Cs/Cu) x (M,1/M,2) >< l 00
Ru = cociente de respuesta entre los picos de tiamina y metilbenzoato de la Solución muestra
R5 = cociente de respuesta entre los picos de tiamina y metilbenzoato de la Solución estándar
C5 = concentración de ER Clorhidrato de Tiamina USP en la Solución estándar (mg/mL)
Cu = concentración de mononitrato de tiamina en la Solución muestra (mg/ml)
M, 1 =peso molecular de mononítrato de tiamina, 327,36
444 (531) Valoración de Tiamina /Pruebas Químicas USP 40

M,2 =peso molecular de clorhidrato de tiamina, 337,27 4 u5r4 o

Agregar lo s~guiente:

• 4 MtTODOS CROMATOGRÁFICOS, PROCEDIMIENTOS

Este procedimiento se puede usar para determinar la tía mina en los siguientes artkUlos:
• Inyección de Clorhídrató de tíamina
• Solución Oral de Clorhidrato de Tiamina
• Solución Oral de Mononitrato de Tiamina
Este es el procedimiento que implica la disolución de la muestra directamente en la fase móvil. El procedimiento se usa
para la determinación. de clorhidrato de· tia mina o rnononitrato detiarnina tomo un ingrediente activo<en formulaciones
tales corno las usadas en lnyecdón de Clorhidrato de· Tiarnina1 Sofucióh óráf de Clorhidrato de fíámlna y Solución Oral de .Mo-
nonitrato de Tiamína.
Amenos que se especifique de otro modo en las monografías individuales, la Solución estándar, la Solución deéstdnt:Jar in ter"
no y fa Solución muestra se preparan según se indica a continuación.
Fase móvil: Metano! y fosfato mono básico> de potasio acuoso 0,04 M (45:55)
Solución de estándar interno: 100 µg/m L dé metilparaberfo en fase m:óvil
Solúción madre del estándar: soo .µg/rnLdéERClorhidtatodeTiamina USP en Fase rl'lóvil
Solución estándar: Diluir una mezcla devolúmenes iguales de Solución madre delestántJarySol1;1ción del'l!itándatintetno
con Fase móvil hasta obtener una concentración de ER Clorhidrato de Tiamina IJSP de aproximadamente SO µgf mL
Solución madre de la muestra: Equivalente a 500 µg/ml de clorhidt~to de tiarnina ó mononitrato de tiamina en
Fase .mó-
vil, a partir de unvolumen, medido. con exactitud; de solüdónoralo inyección
Solución muestra: Diluir una mezcla de volúmenes iguales de Solucíónde estándar internó y Solució.n madre de la muestra
con Fase móvil hasta obtener una concentración de dorhiciratode tiarnlna o mononitrató de tl<Jmina de aproximadamente
SOµg/mL.
Sistema crpmatográfko
(Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modp: HPLC
Detector: UV 2S4 nm
Columna: 4,6 mm x 25 cm; relleno L1
Velocidad de flujo: 1 ml/min
Volumende inyección: 25 µL
Aptitud••del· sistema
Muestra: Solución estándar
[NOTA-Los tiempos de retención relativos para tiamina y metilparabeno son aproximadameritE;! 0,35}fl,U,respectivamente.]
Requisitos de aptitud
Resolución: No menos de 6,0 entre tiamina y metilparabeno
Eficiencia de la columna: No menos de 1SOO platos teóricos paratiamina
Desviación estándar relativa: No más de 210% para los codentesde respuesta entre los picos de.tiaminaymetjlpara-
beno
Análisis
Muestras: Soluciórr.estándor y Soludónmuestra
Calcular el porcentaje de la cantidad declarada de clorhidrato de. tia mina (C12 H17 CIN 4 0S · HCI) en la porción d~ llJuestra
tomada:
Res1.1ltado = (R,;/R 5) ,x(CsfCu)xJ(.}O
Ru :::; .cociente de respuesta entre. los picos oe tia mina Y· rnetilparal;leno de la Solµci(jn muestra
R5 "" cociente de respuesta entre los picos detiarninaY rnetilpatabeno de la. Sofución estándar
C5 =concentración. de ERClorhidrato .cteJiarnina Usi> en la Soltléión estám:far(mglrnL)
Cu = concentradónnominalde doi;hidrato detiarr\ina•enla· Solucf611nl1Jestra(mglrnL)
Si los productos contienen .rnononitrat<;i de tiarnina, éalcular el pq.rcentaie de la• cantidad declarada de mononitrato de. tia-
mina (C12H17N 504S) en la porción dé muestra tomada:
Resulta<:(o "' (Bul R~) 'f (C5((211) x (M,.1/M,2) x lOO
Ru = mciente de respuesta entre los picos de tiamirrn.y qietilparabem:'.l del¡:¡ So/µt;i<)n mt.Jestra
R5 = cociente de respuesta entre los pitos de ti amina ymetilpatabeno de la SOfudón estándar
C5 = conceritracíónde ER Clorhidrato de TiarninaUSP en la ~oludohe!itant:Jat(mglmL)
Cu = concentración de rnpn0nltratodetiarnlnaenla Solución muestra (rng/mL)
M,1 = peso molecular de mpT19nitrato detíatihina, 321136
M,2 =peso molecular de clorhidrato de tiamina, 337,2hus1140
USP 40 Pruebas Químicas/ (531) Valoración de Tiamina 445

Agregar lo siguiente:
• "'MÉTODOS (ROMATOGRÁFICOS, PROCEDIMIENTO 6
Este procedimiento se puede usar para determinar la tiamina en los siguientes artículos:
• Tabletas de Clorhidrato de Tiamina
Este es el procedimiento que implica la disolución de la muestra directamente en agua. Este procedimiento se usa para la
prueba de desempeño (disolución) para Tabletas de Clorhidrato de Tiamina.
A menos que se especifique de otro modo en las monografías individuales, la Solución estándar y la Solución muestra se pre-
paran según se indica a continuación.
Medio: Agua, 900 ml
Aparato 2: 50 rpm
Tiempo: 45 min
Fase móvil: Una mezcla de metano!, ácido acético glacial y agua (27:1 :73) que contenga 140 mg de 1-hexanosulfonato
de sodio por 100 ml.
Solución estándar: Una concentración conocida de ER Clorhidrato de Tiamina USP en Medio (agua)
Solución muestra: Porción filtrada de la solución en análisis, diluida adecuadamente con Medio (agua), si fuera necesario.
Sistema cromatográfico
(Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
Detector: UV 280 nm
Columna: 4,6 mm x 25 cm; relleno L1
Velocidad de flujo: 1 ml/min
Volumen de inyección: l O µL
Aptitud del sistema
Muestra: Solución estándar
Requisitos de aptitud
Desviación estándar relativa: No más de 3,0%
Análisis
Muestras: Solución estándar y Solución muestra
Calcular el porcentaje de la cantidad declarada de clorhidrato de tiamina (C12 H17CIN 40S · HCI} en la porción de muestra
tomada:
Resultado= (rufr5) x (C5 x D x 'vil) x 100
ru = respuesta del pico de tiamina de la Solución muestra
r5 = respuesta del pico de tiamina de la Solución estándar
C5 = concentración de ER Clorhidrato de Tiamina USP en la Solución estándar (mg/ml)
D = factor de dilución para la Solución muestra
V = volumen de Medio, 900 ml
L =cantidad declarada de clorhidrato de tiamina (mg/Tableta).a.usNo
Agregar lo siguiente:
• "'MÉTODOS (ROMATOGRÁFICOS, PROCEDIMIENTO 7
Este procedimiento se puede usar para determinar la tiamina en los siguientes artículos:
• Cápsulas de Vitaminas O/eosolubles e Hidrosolub/es
• Solución Oral de Vitaminas Oleosolubfes e Hidrosolubles
• Tabletas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles
• Cápsulas de Vitaminas Oleosolub/es e Hidrosolubles con Minerales
• Solución Oral de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles con Minerales
• Tabletas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles con Minerales
• Cápsulas de Vitaminas Hidrosolubles
• Tabletas de Vitaminas Hídroso/ubles
• Cápsulas de Vitaminas Hidrosolubles con Minerales
• Solución Oral de Vitaminas Hidroso/ubles con Minerales
• Tabletas de Vitaminas Hidrosolubles con Minerales
Este es un procedimiento recientemente agregado como parte del proceso de modernización de monografías USP. El pro-
cedimiento usa cromatografía de líquidos de interacción hidrofílka (HILIC, por sus siglas en inglés) y la preparación de la
muestra implica la extracción de tiamina de la formulación mediante el Diluyente, calor y agitación mecánica.
A menos que se especifique de otro modo en las monografías individuales, la Solución estándar, las Soluciones muestra y las
soluciones reactivo se preparan según se indica a continuación.
Diluyente: Metano!, ácido acético glacial y agua (50:1 :49)
446 (531) Valoración de Tiamina / Pruebas Químicas USP 40

Solución A: Formiato de amonio 50 mM. Ajustar con hidróxido de amonio a un pH de 9,0.

Solución B: Acetonitrilo
Fase móvil: Gradiente de Elución. Ver la Tabla 1.
Tabla 1
Tiempo Solucló~ A Sol11clón B
(mln) (o/o) (Ó/o)
o 11 89
8 17 83
15 23 77
20 30 70
21 50 50
24 50 50
25 11 89
30 11 89

Solución estándar: Transferir 20 mg de ER Clorhidrato de Tiamina USP a un matraz volumétrico de 200 mLy agregar 160
ml de Diluyente. Sumergir el matraz en un baño de agua caliente mantenido a .65.~-76° durante 1 O minutost agitando re-
gularmente, o usando un mezclador de vórtice, hasta que se disuelva lodo el material sólido. Enfriar de manera ráplda a
temperatura ambiente en un paño de agua fría durante 1 O minutos y diluir con Diluyente a volumen.
Solución muestra para cápsulas: Pesar no menos de 20 cápsulas en un frasco de pes(IQa tarado. Abrir las cápsulas, sin
perder material de la cubierta, y transferir el contenido a un vaso de precipitados de 100 mL. Retirar todo el contenido
adherido a las cubiertas vacías lavando, si fuera necesario, con varias porciones de éter. Dese<;har. los Javados y secar las
cubiertas de las cápsulas con ayuda de una corriente de aire seco hasta que deje de percibirse el olor a éter. Pes<1flas cu~
biertas de las cápsulas vacías en el frasco de pesada tarado y calcular el peso netó promedio por cápsula. Transfe~ir una
porción del contenido de las cápsulas, equivalente a 2,5 mg de clorhidrato de tiamina, a un tubo de centrífuga de 50 ml.
Agregar 25,0 ml de Diluyente y mezclar usando un mezclador de vórtice durante 30 .segundos para suspender el polvo
completamente. Sumergir el tubo de centrífuga en un baño de agua caliente mantenido a 68º1 calentar durante 1Ominu-
tos y mezclar en un mezclador de vórtice durante 30 segundos. Volver a,cólocar eltubC> en el baf\o.cie agua caliente, calen-
tar durante 1O minutos adicionales y mezclar en un mezclador ¡je vórtice durante 30 segundos. Filtrar una porción de la
solución, enfriar a temperatura ambiente y usar el filtrado transparente.
Sol.ución muestra para solución oral: Equivalente a 0,1 mg/ml de dorhidr<jto de tiarnina en Diluyente, a partir de un vo-
lumen, medido con exactitud, de solución oral. En un matrazvolum.étri<:o. apropiado; clisotver la muestra con Diluyente
hasta completar aproximadamente el 80% del volumen total, $Umerglr .el m'!tri'IZ eo. un baño cie agua mantet1ido a 68º
durante 1O minutos, enfriar rápidamente a temperatura aml:>iente en up ,pañó de agua fría y djluir <;PJ1 Díluy:~nte. Mezclar
bien y filtrar una porción de la solución; por último,. usar eUittrad.o .transparente.
Solución muestra para tabletas: Reducir a polvo fíno ·no menos d~ 30 ~abletíis+ Transferk una porción c;let polvo, equi\1(1-
lente a 2,5 mg de clorhidrato de tia mina, a un tubo. de centrífuga de $0 mL Agregar 25,0 mL de DJ(uyente y mezclar usan-
do un mezclador de vórtice durante 30 segundos par¡:¡ suspender e! polyo completamente..$umergir ei t1.;1bo de centrífuga
en un bañ.o de agua caliente mantenido a 65º-70º, calentar ¡;jurante l Ominutos y mezclar en .un mezclador de vórtice
durante 30 segundos. Volver a colocar el tubo en el .baño c;le agua caliente; c¡¡1léntar durante lo m.inutós adicionales y mez-
clar en un mezclador de vórtice durante 30 segundos. Filtrar una porción de Ja ~pluci<)n, enfriar a temperatura ambiente y
usar el filtrado transparente. [NOTA-Usar el filtrado dentro de las 3 horás de so filtra<:;ióll~}
Sistema cromatográfko
(Ver Ciorriatografía {621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
De.tedor: ÜV 267 nm
Col~mna: 4,6 mm x 15 cm; relleno L68 de 315 µIn
Temperatura de.la columna: 40º
Veloddadde flujo: 1,2ml/min
Volumen de inyección~ 1O µt
Apti\u<;f del sistema
Muestr:a: Solución estándar
Requisitos de aptitud
Desvia:dón estándar relativa: No tnás de 2,0%
Análisis
Muestras: Sofll.ción estándar y Solutlón maestra aprop:iacla
Para productos qui:! contengan clorhidrato de tlamlna, cal<;ulár el porcentaje !le fa cantidad declarada de clorhidrato de
tiamina (C 12H17 CIN40S · HCI) en la porción de muestra tomad:i1:
Resultado= (ru/r5)x (C,/Cu) x 100
USP 40 Pruebas Químicas / (541) Volumetría 447

ru =respuesta del pico de tiaminade laSolución.muestra apropiada

r5 = respuesta del pico de tiamina de la Solución estánder
C5 = concentración de ER Clorhidrato de Tiamina USP en la Solución estándar (mg/mL)
Cu :: concentra.ción nominalde tía mina en.la• Solución muestra apropiada {mg/rnL)
Para productos que contengan mononitrato de tiamina, calcular el porcentaje de la cantidad declarada de mononitrato de
tiamina (C 12 H17 N50 4S) en la porción de muestra tomada;
Resultado== (tufrs) x, (CsfCu) x (M,r/M,z) x .100
ru ==respuesta del pico de.tiamina de la Solución muestre ápropiada
r5 =respuesta del pico de tiamina de 1.a Solución estándar
C5 = concentración de ER Clorhidrato de Tiamina USP en la Solución estándar (mgfml)
Cu :;:; concentración nominal de mononltrato detlamina eh la Solución muestra apropiada (mg/ml)
M;¡ = pesó molecular de monorlitr<ito de tiamina, 32/,36
M,2 = peso molecular de clorhidrato de tiamina, 33 7,27 ..t..usp40
REQUISITOS ADICIONALES
• ESTÁNDARES DE REFERENCIA USP (11)
ER Clorhidrato de Tiamina USP

(541) VOLUMETRÍA

VALORACIONES VOLUMÉTRICAS DIRECTAS

La volumetría directa es el tratamiento de una sustancia soluble en solución, y contenida en un recipiente adecuado, con
una solución estandarizada apropiada (la solución volumétrica), donde el punto final se determina en forma instrumental, o
visualmente con ayuda de un indicador adecuado.
La solución volumétrica se agrega desde una bureta de capacidad adecuada que se elige de acuerdo con la concentración
(normalidad), de modo tal que el volumen consumido sea de entre 30% y 100% de la capacidad nominal de la bureta.
[NOTA-En los casos en que se requiera menos de 1O mL de solución volumétrica, se debe utilizar una microbureta adecuada.]
La aproximación al punto final se hace directamente pero con cuidado, y finalmente la solución volumétrica se agrega gota a
gota desde la bureta para que la última gota no sobrepase el punto final. La cantidad de sustancia valorada se puede calcular a
partir del volumen, el factor de normalidad o molaridad de la solución volumétrica, y el factor de equivalencia de la sustancia
que se especifica en la monografía correspondiente.

VALORACIONES VOLUMÉTRICAS RESIDUALES

Algunas valoraciones farmacopeicas requieren la adición de un volumen determinado de una solución volumétrica, en exce-
so del necesario para reaccionar con la sustancia a valorar. Después, el excedente de esta solución se valora con una segunda
solución volumétrica. Esto constituye una volumetría residual y también se conoce como "retrovaloración" o "valoración por
retorno". La cantidad de la sustancia valorada se puede calcular a partir de la diferencia entre el volumen de la solución volu-
métrica que se agregó originalmente corregida por medio de una valoración con un blanco y el consumido por la solución
volumétrica en la retrovaloración, teniendo en cuenta los respectivos factores de molaridad o normalidad de las dos soluciones
y el factor de equivalencia para la sustancia indicado en la monografía correspondiente.

VALORACIONES COMPLEJOMÉTRICAS

El éxito de las valoraciones complejométricas depende de varios factores. La constante de equilibrio de formación del com-
plejo del reactivo en la solución volumétrica-analito debe ser lo suficientemente grande como para que, en el punto final, casi
el 1 00% del analito haya formado el complejo. El complejo final se debe formar lo suficientemente rápido para que el tiempo
de análisis sea práctico. Cuando la reacción analítica no es rápida, algunas veces puede resultar útil realizar una volumetría
residual.
En general, los indicadores para valoraciones complejométricas son en sí mismos agentes formadores de complejos. La reac-
ción entre el ión metálico y el indicador debe ser rápida y reversible. La constante de equilibrio de formación del complejo
metal-indicador debe ser lo suficientemente grande como para producir un cambio de color marcado pero debe ser menor
que la correspondiente al complejo metal-valorante. La elección del indicador también está limitada por el intervalo de pH en
el que se debe efectuar la reacción de formación del complejo y por la interferencia de otros iones presentes en la muestra o
448 (541) Volumetría / Pruebas Químicas USP 40

de la solución amortiguadora. Los iones que interfieren, a menudo se pueden enmascarar o "secuestrar" mediante la adición
de otro agente formador de complejos. (La técnica de enmascaramiento también se usa en las valoraciones redox).

VALORACIONES POR ÓXIDO-REDUCCIÓN (REDOX)

Con frecuencia, se pueden llevar a cabo determinaciones de manera conveniente mediante el uso de un reactivo que provo-
que la oxidación o la reducción del analito. Muchas curvas de valoración redox no son simétricas respecto al punto de equiva-
lencia y, de ese modo, no es posible la determinación gráfica del punto final; pero se dispone de indicadores para muchas
determinaciones y además, frecuentemente los reactivos redox pueden servir como sus propios indicadores. Igual que en cual-
quier tipo de volumetría, el indicador ideal cambia de color en un punto final que está lo más próximo posible al punto de
equivalencia. En consecuencia, cuando la solución volumétrica sirve como su propio indicador, la diferencia entre el punto fi-
nal y el punto de equivalencia sólo está determinada por la habilidad del analista para detectar el cambio de color. Un ejemplo
común es el uso del ión permanganato como componente de una solución volumétrica de oxidación ya que un leve exceso se
puede detectar por su color rosado. Otras soluciones volumétricas que pueden servir como sus propios indicadores son el yo-
do, las sales de cerio (IV) y el dicromato de potasio. En la mayoría de los casos, sin embargo, el uso de un indicador redox
producirá un punto final mucho más marcado.
Puede ser necesario ajustar el estado de oxidación del analito antes de la volumetría mediante el uso de un agente oxidante
o reductor adecuado; después, el exceso de reactivo se debe eliminar, por ejemplo, mediante precipitación. Esta es casi siem-
pre la práctica habitual en la determinación de agentes oxidantes, ya que la mayoría de soluciones volumétricas de agentes
reductores son oxidadas lentamente por el oxígeno atmosférico.

VALORACIONES VOLUMÉTRICAS EN DISOLVENTES NO ACUOSOS

Los ácidos y las bases han sido definidas durante mucho tiempo como sustancias que cuando se disuelven en agua, propor-
cionan iones de hidrógeno e hidroxilo, respectivamente. Esta definición, introducida por Arrhenius, no reconoce el hecho de
que propiedades características de los ácidos o las bases también se pueden desarrollar en otros disolventes. Una definición
más generalizada es la de Brbnsted, quien definió un ácido como una sustancia que proporciona protones y una base como
una sustancia que se combina con protones. Una definición aún más amplia es la de Lewis, quien definió un ácido como cual-
quier sustancia que acepta un par de electrones, una base como cualquier sustancia que dona un par de electrones y la neutra-
lización como la formación de una unión de coordinación entre un ácido y una base.
La fuerza aparente de un ácido o una base se determina por su grado de reacción con un disolvente. En solución acuosa
todos los ácidos fuertes parecen ser igualmente fuertes porque reaccionan con el disolvente para sufrir una conversión casi
completa en el ión oxonio y el anión del ácido (efecto nivelador). En un disolvente débilmente protófilo como el ácido acético,
el grado de formación del ión acidonio del acetato, indica que el orden decreciente de la fuerza para ácidos es perclórico,
bromhídrico, sulfúrico, clorhídrico y nítrico (efecto diferenciador).
El ácido acético reacciona de forma incompleta con el agua para formar ión oxonio y por lo tanto es un ácido débil. En
contraste, se disuelve en una base como etilendiamina y reacciona en forma tan completa con el disolvente que se comporta
como un ácido fuerte. Lo mismo es válido para el ácido perclórico.
Este efecto nivelador también se observa en el caso de las bases. En ácido sulfúrico, casi todas las bases parecen tener la
misma fuerza. A medida que las propiedades del disolvente disminuyen en la serie constituida por ácido sulfúrico, ácido acéti-
co, fenol, agua, piridina y butilamina, las bases se vuelven progresivamente más débiles hasta que todas, excepto las más fuer-
tes, pierden sus propiedades básicas. En orden de fuerza decreciente, las bases más fuertes son 2-aminoetóxido de sodio, me-
tóxido de potasio, metóxido de sodio y metóxido de litio.
Muchos compuestos insolubles en agua adquieren mejores propiedades ácidas o básicas cuando se disuelven en disolventes
orgánicos. De esta manera, la elección del disolvente adecuado permite la determinación de una variedad de tales sustancias
mediante valoración en medios no acuosos. Además, dependiendo de cual sea la parte fisiológicamente activa del compuesto,
con frecuencia es posible valorarla selectivamente, eligiendo el disolvente y el valorante adecuados. Los compuestos puros se
pueden valorar directamente, pero en preparaciones farmacéuticas a menudo es necesario aislar el ingrediente activo de los
excipientes y vehículos que interfieran.
Entre los tipos de compuestos que se pueden valorar como ácidos están los ácidos de haluros, anhídridos de ácidos, ácidos
carboxílicos, aminoácidos, enoles como barbituratos y xantinas, imidas, fenoles, pirroles y sulfonamidas. Entre los tipos de
compuestos que se pueden valorar como bases están las aminas, compuestos heterocíclicos que contienen nitrógeno, oxazoli-
nas, compuestos de amonio cuaternario, sales alcalinas de ácidos orgánicos, sales alcalinas de ácidos inorgánicos débiles y al-
gunas sales de aminas. Muchas sales de ácidos halogenados se pueden valorar en ácido acético o anhídrido acético después de
agregar acetato de mercurio, que elimina iones haluros formando un complejo de halógeno-mercurio sin ionizar e introduce el
acetato ionizado.
Para la volumetría de un compuesto básico se prefiere una solución volumétrica de ácido perclórico en ácido acético glacial,
aunque en casos especiales se usa ácido perclórico en dioxano. El sistema de electrodos de vidrio-calomel resulta útil en este
caso. En ácido acético como disolvente, este sistema de electrodos funciona de acuerdo con la teoría.
Para la volumetría de un compuesto ácido, se dispone de dos clases de soluciones volumétricas: los alcóxidos de metales
alcalinos y los hidróxidos de tetraalquilamonio. Con frecuencia se usa una solución volumétrica de metóxido de sodio en una
USP 40 Pruebas Químicas/ (541) Volumetría 449

mezcla de metanol y tolueno, aunque en algunos casos, cuando se produce un precipitado gelatinoso con el metóxido de
sodio, se emplea metóxido de litio en un disolvente de metanol-benceno.
Cuando se emplean soluciones volumétricas de alcóxidos de metales alcalinos se produce un error alcalino que limita el em-
pleo de un electrodo de vidrio, en particular en disolventes básicos. El electrodo indicador de antimonio, aunque algo errático,
resulta útil en estos casos. El uso de hidróxidos de amonio cuaternario, por ej., el hidróxido de tetra-n-butilamonio y el hidróxi-
do de trimetilhexadecilamonio (en benceno-metano! o alcohol isopropílico), presenta dos ventajas sobre las otras dos solucio-
nes volumétricas: (a) la sal de tetraalquilamonio del ácido valorado es soluble en el medio de valoración y (b) se puede em-
plear un par de electrodos de vidrio calomel, de uso corriente en la mayoría de los laboratorios analíticos, para llevar a cabo
valoraciones volumétricas potenciométricas.
Debido a la interferencia producida por el dióxido de carbono, los disolventes empleados en la valoración de sustancias áci-
das se deben proteger de la exposición excesiva al aire atmosférico durante la valoración mediante una protección adecuada o
una atmósfera inerte. La absorción de dióxido de carbono se puede determinar mediante la volumetría con un blanco. El blan-
co no debe exceder más de 0,01 mL de metóxido de sodio SV O, 1 N por mL de disolvente.
El punto final se puede determinar visualmente por el cambio de color de un indicador, o potenciométricamente, según se
especifique en la monografía correspondiente. Si se usa un electrodo de calomel como referencia, es recomendable sustituir la
solución acuosa de cloruro de potasio del puente salino con perclorato de litio O, 1 N en ácido acético glacial para valoraciones
en disolventes ácidos o cloruro de potasio en metanol para valoraciones en disolventes básicos.
Cuando en la monografía correspondiente se indica el uso de estas u otras mezclas, el electrodo de calomel de referencia se
modifica retirando en primer lugar la solución acuosa de cloruro de potasio y el cloruro de potasio residual, si lo hubiera, en-
juagando con agua y luego eliminando el agua residual enjuagando con el disolvente no acuoso indicado y finalmente, llenan-
do el electrodo con la mezcla no acuosa indicada.
En casi todos los casos, excepto en aquellos en los que el ión de plata podría interferir, el electrodo de calomel se puede
sustituir por un electrodo de referencia de plata-cloruro de plata. El electrodo de plata-cloruro de plata es más resistente y su
uso ayuda a eliminar sales de mercurio tóxicas del laboratorio. En general se puede utilizar un puente salino para evitar la inter-
ferencia del ión plata.
Los sistemas más útiles para volumetría en disolventes no acuosos se indican en la Tabla 7.
Tabla 1. Sistemas para Valoraciones Volumétricas No Acuosas
Relativamente Neutro Relativamente Neutro
Tipo de Ácido (para valoración (para valoración Básico (para valoración (para valoración
Disolvente de bases y sus sales) diferencial de bases) de ácidos) diferencial de ácidos)
Disolvente 1 Ácido acético glacial Acetonitrilo Dimetilformamida Acetona
Anhídrido acético Alcoholes n-Butilamina Acetonitrilo
Ácido fórmico Cloroformo Piridina Metil etil cetona
Ácido propiónico Benceno Etilendiamina Metil isobutil cetona
Cloruro de sulfurilo Tolueno Morfolina Alcohol terc-butílico
Clorobenceno
Acetato de etilo
Dioxano
Indicador Cristal violeta Rojo de metilo Azul de timol Azo violeta
Rojo de quinaldina Naranja de metilo Timolftaleína Azul de bromotimol
p-Naftolbenceína p-Naftolbenceína Azo violeta p-Hidroxiazobenceno
Alfazurina 2-G o-Nitroanilina Azul de timol
Verde de malaquita p-Hidroxiazobenceno
Electrodos Vidrio-calomel Vidrio-calomel Antimonio-calomel Antimonio-calomel
Vidrio-plata-cloruro de pla- Calomel-plata-cloruro de Antimonio-vidrio Vidrio-calomel
ta plata
Mercurio-acetato mercúrico Antimonio-antimonio 2 Vidrio-platino 2
Platino-calomel
Vidrio-calomel
1 Los disolventes relativamente neutros de baja constante dieléctrica como benceno, tolueno, cloroformo o dioxano se pueden emplear junto con cualquier
disolvente ácido o básico para aumentar la sensibilidad del punto final de la valoración.
2 En solución volumétrica.

INDICADORES Y DETECCIÓN POTENCIOMÉTRICA DEL PUNTO FINAL

El método más simple y conveniente para determinar el punto de equivalencia, es decir, el punto en el que la reacción analí-
tica estequiométrica está terminada, es mediante el uso de indicadores. Estas sustancias químicas, generalmente coloreadas,
responden a cambios en la solución antes y después del punto de equivalencia presentando cambios de color que se pueden
detectar visualmente como el punto final de la reacción, lo que constituye una estimación confiable del punto de equivalencia.
450 (541) Volumetría / Pruebas Químicas USP 40

Un método útil de determinación del punto final es mediante mediciones electroquímicas. Si un electrodo indicador, sensi-
ble a la concentración de la especie sometida a la reacción volumétrica y un electrodo de referencia cuyo potencial no es sensi-
ble a ninguna especie disuelta, se sumergen en la solución a valorar para formar una celda galvánica, la diferencia de potencial
entre los electrodos se puede medir con un medidor de pH que permite seguir el curso de la reacción. Cuando es posible grafi-
car correctamente dichas series de cambios (por ejemplo, para el caso de una valoración ácido-base, el pH en función de los
ml de solución volumétrica agregada; para valoraciones de precipitación, complejométricas o de óxido-reducción, los mV en
función de los ml de solución volumétrica agregada), se obtiene una curva sigmoidea con una porción que cambia rápida-
mente (punto de "ruptura") cerca del punto de equivalencia. El punto medio de esta porción vertical o punto de inflexión se
puede considerar como punto final. El punto de equivalencia también se puede determinar matemáticamente sin trazar una
curva de valoración. Sin embargo, se debe tener en cuenta que en reacciones asimétricas en las que el número de aniones que
reaccionan no es igual al número de cationes que reaccionan, el punto final definido por la inflexión de la curva de volumetría
no ocurre exactamente en el punto de equivalencia estequiométrico. En consecuencia, la detección potenciométrica del punto
final mediante este método no es adecuada para reacciones asimétricas, como por ejemplo la reacción de precipitación,
2Ag+ + ero 4- 2

y la reacción de óxido-reducción,
5Fe+ 2 + Mn04 -.

Todas las reacciones ácido-base, sin embargo, son simétricas. De este modo, la detección potenciométrica del punto final se
puede emplear en valoraciones volumétricas ácido-base y en otras valoraciones volumétricas que comprendan reacciones si-
métricas reversibles donde se especifique un indicador, a menos que se indique lo contrario en la monografía correspondiente.
Existen dos tipos de tituladores electrométricos. El primero agrega la solución volumétrica automáticamente y registra las
diferencias de potencial del electrodo durante el curso de la titulación dando la curva sigmoidea esperada. En el segundo tipo,
el agregado de solución volumétrica se lleva a cabo automáticamente hasta que se alcanza un potencial o pH preseleccionado,
que representa el punto final y en ese momento cesa el agregado de solución volumétrica.
Varios sistemas de electrodos, apropiados para valoraciones volumétricas potenciométricas, se resumen en la Tabla 2.
Tabla 2. Sistemas de Electrodos para Valoraciones Volumétricas Potenciométricas
Valoración
volumétrica Electrodo indicador Ecuación 1 Electrodo de referencia Apllcaciones 2
Ácido-base Vidrio E= k + 0,0591 pH Calomel o plata-cloruro de Valoración volumétrica de
plata ácidos y bases
Precipitimetría (plata) Plata E= Eº+ 0,0591 log [Ag+] Calomel (con puente salino Valoración volumétrica con
de nitrato de potasio) plata o de plata que com-
prende haluros o tiocianatos
Complejometría Mercurio-mercurio (11) E= Eº+ 0,0296(109 k'- pM) Calomel Valoración volumétrica de di-
versos metales (M), p.ej.,
Mg+ 2 , Ca+ 2, Al+ 3, Bi+ 3, con
EDTA
Óxido-reducción Platino E= Eº + (0,0591 /n) x log Calomel o plata-cloruro de Valoraciones volumétricas
[ox]/[red] plata con arsenito, bromo, cerato,
dicromato, hexacianoferrato
(111), yodato, nitrito, perman-
ganato, tiosulfato
1 Forma apropiada de la ecuación de Nernst que describe el sistema de electrodos indicado: k = constante del electrodo de vidrio; k' = constante derivada del
equilibrio Hg-Hg(ll)-EDTA; M =cualquier metal que se pueda valorar con EDTA; [ox] y [red] de la ecuación, ox +ne~ red.
2 La lista es representativa pero no está completa.

CORRECCIONES CON UN BLANCO

Como se hizo notar anteriormente, el punto final determinado en una volumetría es una estimación del punto de equivalen-
cia de la reacción. La validez de esta estimación depende, entre otros factores, de la naturaleza de las sustancias a valorar y de
la concentración de la solución volumétrica. Para aumentar la confiabilidad de la determinación del punto final en valoraciones
volumétricas, se realiza una corrección con un blanco adecuado. Dicha corrección con un blanco se obtiene habitualmente me-
diante una valoración residual del blanco, en la que el procedimiento indicado se repite en todos los detalles excepto que la
muestra en análisis se omite. En tales casos, el volumen real de solución volumétrica, equivalente a la sustancia analizada, es la
diferencia entre el volumen consumido en la valoración residual del blanco y el consumido en la valoración de la muestra. El
volumen corregido que se obtiene de esta manera se utiliza para calcular la cantidad de sustancia valorada, de la misma mane-
ra que se indica en Valoraciones volumétricas residuales. Cuando el punto final se determina potenciométricamente, la correc-
ción del blanco en general es inapreciable.
USP 40 Pruebas Químicas/ (551) Valoración de Vitamina E 451

(551) VALORACIÓN DE VITAMINA E

INTRODUCCIÓN
Los siguientes procedimientos de cromatografía de líquidos se usan para la determinación de vitamina E como ingrediente far-
macéutico activo, como ingrediente de suplemento dietético o como componente de formas farmacéuticas farmacopeicas
en las formas alfa tocoferol (C 29 H50 0 2 ), acetato de alfa tocoferilo (C 31 H52 0 3 ), o succinato ácido de alfa tocoferilo (C 33 H54 0 5 ).
Durante toda esta valoración, proteger de la atmósfera y la luz todas las soluciones que contengan la muestra de prueba y el
Estándar de Referencia y las que deriven de éstos, usando preferentemente una atmósfera de gas inerte y material de vidrio
con protección actínica.
Cuando se especifique vitamina E (alfa tocoferol, acetato de alfa tocoferilo, o succinato ácido de alfa tocoferilo) en el siguiente
procedimiento, usar la forma química presente en la formulación y el Estándar de Referencia USP pertinente.

VALORACIÓN
• PROCEDIMIENTO 1
• Este procedimiento se puede usar para la determinación de vitamina E en:
•Tabletas de Vitaminas Oleosolubles
• Cápsulas de Vitaminas Oleosolubles
•Tabletas de Vitaminas Oleosolubles con Minerales
• Cápsulas de Vitaminas Oleosolubles con Minerales
•Tabletas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles
• Cápsulas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles
•Tabletas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles con Minerales
• Cápsulas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles con Minerales
• Éste es un procedimiento neutro que implica el uso de dimetil sulfóxido para disolver los excipientes en la muestra,
seguido de una extracción líquido-líquido de la vitamina E con hexano. Luego, el extracto de hexano se evapora al
vacío hasta sequedad, y el residuo se reconstituye con metanol antes de inyectarlo en el cromatógrafo.
•A menos que se especifiquen en las monografías individuales, la Solución de aptitud del sistema, la Solución estándar,
las Soluciones muestra y las soluciones reactivo se preparan según se indica a continuación.
Solución A: Solución de ácido fosfórico (1 en 100) en agua
Fase móvil: Metanol y Solución A (19:1)
Solución de aptitud del sistema: Preparar una solución de 0,65 mg/mL de ER Ergocalciferol USP en metanol. Transferir
1,0 mL de esta solución a un matraz volumétrico de 100 mL que contenga 100 mg de ER Acetato de Alfa Tocoferilo USP.
Disolver en 30 mL de metanol, con ayuda de ultrasonido, si fuera necesario, y diluir con metanol a volumen. Almacenar
esta solución en un refrigerador.
Solución estándar: 2 mg/mL de ER Alfa Tocoferol USP, ER Acetato de Alfa Tocoferilo USP o ER Succinato Ácido de Alfa
Tocoferilo USP en metanol
Solución muestra para Tabletas: Reducir a polvo fino no menos de 20 Tabletas. Transferir una porción del polvo, típica-
mente equivalente a 20 mg de la forma de vitamina E en análisis, pero que no exceda de 7,5 g del polvo, a un tubo de
centrífuga con tapa de rosca con recubrimiento interno de teflón. Agregar aproximadamente 2 mL de dimetil sulfóxido y
aproximadamente 3 mL de n-hexano por cada g de Tabletas reducidas a polvo y agitar durante 45 minutos en un agitador
en un baño de agua mantenido a 60º. [NOTA-Ajustar el agitador para asegurar que el contenido del recipiente se mezcle
de manera vigorosa y minuciosa.] Centrifugar a 3000 rpm durante 1O minutos y transferir la capa de hexano con una pipe-
ta a un matraz volumétrico. [NOTA-Capacidad del matraz volumétrico: no menos de 20 mL.] Agregar 3 mL de n-hexano
por cada g de Tabletas reducidas a polvo a la capa de dimetil sulfóxido, agitar minuciosamente durante 5 minutos y trans-
ferir la capa de hexano con una pipeta al mismo matraz volumétrico. Repetir esta extracción con tres porciones adicionales
de n-hexano. Diluir los extractos en el matraz volumétrico con n-hexano a volumen. Transferir no menos de 20 mL de esta
solución a un recipiente adecuado y evaporar al vacío a temperatura ambiente hasta sequedad. Transferir el residuo con
ayuda de metanol a un matraz volumétrico adecuado y diluir con metanol a volumen hasta obtener una concentración de
2 mg/mL de alfa tocoferol, acetato de alfa tocoferilo o succinato ácido de alfa tocoferilo.
Solución muestra para Cápsulas: Transferir el contenido de no menos de 20 Cápsulas a un recipiente adecuado, mezclar
y pesar. Transferir una porción de la mezcla, típicamente equivalente a 20 mg de la forma de vitamina E en análisis, pero
que no exceda de 7,5 g de la mezcla, a un tubo de centrífuga con tapa de rosca con recubrimiento interno de teflón.
[NOTA-Para Cápsulas de gelatina dura, retirar, tanto como sea posible, el contenido de no menos de 20 Cápsulas cortan-
do las cubiertas de las Cápsulas para abrirlas, transfiriendo las cubiertas y su contenido a un recipiente adecuado y trituran-
do hasta formar una masa homogénea. Transferir una porción de la masa, típicamente equivalente a 20 mg de la forma de
vitamina E en análisis, pero que no exceda de 7,5 g de la mezcla, a un tubo de centrífuga con tapa de rosca con recubri-
miento interno de teflón.] Agregar aproximadamente 2 mL de dimetil sulfóxido por cada g del contenido de las Cápsulas y
aproximadamente 3 mL de n-hexano por cada g del contenido de las Cápsulas, y agitar durante 45 minutos en un agita-
dor en un baño de agua mantenido a 60º. [NOTA-Ajustar el agitador para asegurar que el contenido del recipiente se
452 (551) Valoración de Vitamina E/ Pruebas Químicas USP 40

mezcle de manera vigorosa y minuciosa.] Centrifugar a 3000 rpm durante 1O minutos y transferir la capa de hexano con
una pipeta a un matraz volumétrico. [NOTA-Capacidad del matraz volumétrico: no menos de 20 mL.] Agregar 3 mL de n-
hexano por cada g del contenido de las Cápsulas a la capa de dimetil sulfóxido, agitar minuciosamente durante 5 minutos
y transferir la capa de hexano con una pipeta al mismo matraz volumétrico. Repetir esta extracción con tres porciones adi-
cionales de n-hexano. Diluir los extractos en el matraz volumétrico con n-hexano a volumen. Transferir no menos de 20 mL
de esta solución a un recipiente adecuado y evaporar al vacío a temperatura ambiente hasta sequedad. Transferir el residuo
con ayuda de metano! a un matraz volumétrico adecuado y diluir con metano! a volumen hasta obtener una concentración
de 2 mg/mL de alfa tocoferol, acetato de alfa tocoferilo o succinato ácido de alfa tocoferilo.
Sistema cromatográfico
(Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
Detector: UV 254 nm
Columna: 8 mm x 1O cm; relleno L1 de 5 µm
Velocidad de flujo: 2 mL/min
Volumen de inyección: 100 µL
Aptitud del sistema
Muestras: Solución de aptitud del sistema y Solución estándar
[NOTA-Los tiempos de retención relativos para ergocalciferol y acetato de alfa tocoferilo son aproximadamente 0,5 y 1,0, res-
pectivamente.]
Requisitos de aptitud
Resolución: No menos de 12 entre ergocalciferol y acetato de alfa tocoferilo, Solución de aptitud del sistema
Factor de asimetría: 0,8-1,2, Solución de aptitud del sistema
Desviación estándar relativa: No más de 3,0%, Solución estándar
Análisis
Muestras: Solución estándar y Solución muestra
Calcular el porcentaje de la cantidad declarada de alfa tocoferol, acetato de alfa tocoferilo, o succinato ácido de alfa tocofe-
rilo en la porción de la muestra tomada:

Resultado= (ruf r 5) x (C5/Cu) x 100

ru = respuesta del pico de la forma de vitamina E pertinente de la Solución muestra

r5 = respuesta del pico de la forma de vitamina E pertinente de la Solución estándar
C5 = concentración de la forma de vitamina E pertinente del Estándar de Referencia USP correspondiente en la Solu-
ción estándar (mg/mL)
Cu =concentración nominal de la forma de vitamina E correspondiente en la Solución muestra (mg/mL)
• PROCEDIMIENTO 2
• Este procedimiento se puede usar para las formulaciones que contienen vitaminas A, D y E. La aplicación incluye:
•Tabletas de Vitaminas Oleosolubles
• Cápsulas de Vitaminas Oleosolubles
•Tabletas de Vitaminas Oleosolubles con Minerales
• Cápsulas de Vitaminas Oleosolubles con Minerales
•Tabletas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles
• Cápsulas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles
•Tabletas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles con Minerales
• Cápsulas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles con Minerales
• Este procedimiento emplea el tratamiento de la muestra con ácido sulfúrico metanólico, seguido de una extracción
con 2,2,4-trimetilpentano.
•A menos que se especifiquen en las monografías individuales, la Solución de aptitud del sistema, la Solución estándar,
las Soluciones muestra y las soluciones reactivo se preparan según se indica a continuación.
Fase móvil: Mezclar 240 mL de metanol con 1O mL de agua, seguido de 0,5 mL de ácido fosfórico al 50%, y diluir con
acetonitrilo hasta 1000 mL.
Solución de ácido sulfúrico metanólico 3 N: Agregar cuidadosamente 9 mL de ácido sulfúrico a 80 mL de metano! en un
matraz volumétrico de 100 ml. Enfriar y diluir con metano! a volumen.
Solución de ascorbato de sodio-pirogalol: Transferir 1Og de ascorbato de sodio y 5 g de pirogalol a un matraz volumé-
trico de 100 mL y agregar agua suficiente para disolver. Agregar 1,7 mL de ácido sulfúrico y diluir con agua a volumen.
Solución de lecitina: 5 mg/mL de lecitina en 2,2,4-trimetilpentano
Solución de aptitud del sistema: 2 mg/mL de ER Alfa Tocoferol USP, de ER Acetato de Alfa Tocoferilo USP y de ER Succi-
nato Ácido de Alfa Tocoferilo USP en metano!
Solución estándar: 2 mg/mL de ER Alfa Tocoferol USP, ER Acetato de Alfa Tocoferilo USP, o ER Succinato Ácido de Alfa
Tocoferilo USP en metanol
Solución muestra para Tabletas: [NOTA-Esta preparación es adecuada para la determinación de vitamina A, vitamina D y
vitamina E, cuando se encuentran presentes en la formulación. La cantidad de muestra se puede ajustar dependiendo de la
USP 40 Pruebas Químicas/ (551) Valoración de Vitamina E 453

presencia o ausencia de las vitaminas apropiadas.] Reducir a polvo fino no menos de 20 Tabletas. Usar una porción del
polvo, nominalmente equivalente a una cantidad de 90 mg de alfa tocoferol, acetato de alfa tocoferilo o succinato ácido
de alfa tocoferilo. Agregar 0,5 g de bicarbonato de sodio, 1,5 mL de Solución de lecitina y 12,5 mL de 2,2,4-trimetilpenta-
no, y dispersar en un mezclador de vórtice. Agregar 6 mL de Solución de ascorbato de sodio-pirogalol, agitar lentamente y
dejar que la solución se desgasifique. Continuar agitando hasta que haya cesado la emisión de gases y luego agitar durante
12 minutos adicionales. Agregar 6 mL de dimetil sulfóxido, mezclar en un mezclador de vórtice hasta formar una suspen-
sión y agitar durante 12 minutos. Agregar 6 mL de Solución de ácido sulfúrico metanólico 3 N, mezclar en un mezclador de
vórtice hasta formar una suspensión y agitar durante 12 minutos. Agregar 12,5 mL de 2,2,4-trimetilpentano, mezclar en un
mezclador de vórtice hasta formar una suspensión y agitar durante 1O minutos. Centrifugar durante 1 O minutos para rom-
per la emulsión y hasta que el sobrenadante se torne transparente. Transferir un volumen de la capa de 2,2,4-trimetilpenta-
no sobrenadante a un matraz volumétrico adecuado; el volumen de la muestra retirada de la capa de 2,2,4-trimetilpentano
y la capacidad del matraz volumétrico son tales que la concentración final de la Solución muestra es equivalente a la de la
Solución estándar. Evaporar casi hasta sequedad, agregar varios mL de metano! y evaporar el 2,2,4-trimetilpentano rema-
nente. Diluir con metanol a volumen.
Solución muestra para Cápsulas: [NOTA-Esta preparación es adecuada para la determinación de vitamina A, vitamina D
y vitamina E, cuando se encuentran presentes en la formulación. La cantidad de muestra se puede ajustar dependiendo de
la presencia o ausencia de las vitaminas apropiadas.] Pesar no menos de 20 Cápsulas en un frasco de pesada tarado. Usan-
do una cuchilla afilada, si fuera necesario, abrir cuidadosamente las Cápsulas, sin perder material de la cubierta, y transferir
el contenido a un vaso de precipitados de 100 mL. Retirar cualquier contenido adherido a las cubiertas de las cápsulas va-
cías lavando con varias porciones de éter. Desechar los lavados y secar las cubiertas de las Cápsulas con ayuda de una co-
rriente de aire seco. Pesar las cubiertas de las Cápsulas vacías en un frasco de pesada tarado y calcular el peso neto del
contenido de las Cápsulas. Transferir una porción del contenido de las Cápsulas, equivalente a 55 mg de vitamina E, a un
recipiente con tapa de rosca con recubrimiento interno de teflón. Agregar 0,5 g de bicarbonato de sodio, 1,5 mL de Solu-
ción de lecitina y 12,5 mL de 2,2,4-trimetilpentano, y dispersar en un mezclador de vórtice. Agregar 6 mL de Solución de
ascorbato de sodio-pirogalol, agitar lentamente y dejar que la solución se desgasifique. Continuar agitando hasta que haya
cesado la emisión de gases y luego agitar durante 12 minutos adicionales. Agregar 6 mL de dimetil sulfóxido, mezclar en
un mezclador de vórtice hasta formar una suspensión y agitar durante 12 minutos. Agregar 6 mL de Solución de ácido sulfú-
rico metanólico 3 N, mezclar en un mezclador de vórtice hasta formar una suspensión y agitar durante 12 minutos. Agregar
12,5 mL de 2,2,4-trimetilpentano, mezclar en un mezclador de vórtice hasta formar una suspensión y agitar durante 1O
minutos. Centrifugar durante 1O minutos para romper la emulsión y hasta que el sobrenadante se torne transparente.
Transferir un volumen de la capa de 2,2,4-trimetilpentano sobrenadante a un matraz volumétrico adecuado, el volumen de
la muestra retirada de la capa de 2,2,4-trimetilpentano y el tamaño del matraz volumétrico son tales que la concentración
final de la Solución muestra es equivalente a la de la Solución estándar. Evaporar casi hasta sequedad, agregar varios mL de
metanol y evaporar el 2,2,4-trimetilpentano remanente. Diluir con metano! a volumen.
Sistema cromatográfico
(Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
Detector: UV 280 nm
Columna: 4,6 mm x 25 cm; relleno L1 de 5 µm
Velocidad de flujo: 1,5 mL/min
Volumen de inyección: 25 µL
Aptitud del sistema
Muestras: Solución de aptitud del sistema y Solución estándar
[NOTA-Los tiempos de retención relativos para succinato ácido de alfa tocoferilo, alfa tocoferol y acetato de alfa tocoferilo son
aproximadamente 0,6; 0,8 y 1,0, respectivamente.]
Requisitos de aptitud
Resolución: No menos de 4,0 entre succinato ácido de alfa tocoferilo y alfa tocoferol; no menos de 3,0 entre alfa toco-
ferol y acetato de alfa tocoferilo, Solución de aptitud del sistema
Desviación estándar relativa: No más de 3,0%, Solución estándar
Análisis
Muestras: Solución estándar y Solución muestra
Calcular el porcentaje de la cantidad declarada de alfa tocoferol, acetato de alfa tocoferilo o succinato ácido de alfa tocofe-
rilo en la porción de la muestra tomada:
Resultado= (ruf r5) x (C5f Cu) x 100

ru = respuesta del pico de la forma de vitamina E pertinente de la Solución muestra

r5 = respuesta del pico de la forma de vitamina E pertinente de la Solución estándar
C5 = concentración de la forma de vitamina E pertinente del Estándar de Referencia USP correspondiente en la Solu-
ción estándar (mg/mL)
Cu = concentración nominal de la forma de vitamina E correspondiente en la Solución muestra (mg/mL)
454 (551) Valoración de Vitamina E/ Pruebas Químicas USP 40

[NOTA-Para calcular la concentración nominal, tomar en cuenta el volumen de extracción inicial de 26,5 mL de 2,2,4-trimetil-
pentano y el factor de dilución al cambiar el disolvente de 2,2,4-trimetilpentano a metanol.]
• PROCEDIMIENTO 3
• Este procedimiento se puede usar para la determinación de vitamina E en:
•Tabletas de Vitaminas Oleosolubles
• Cápsulas de Vitaminas Oleosolubles
•Tabletas de Vitaminas Oleosolubles con Minerales
• Cápsulas de Vitaminas Oleosolubles con Minerales
•Tabletas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles
• Cápsulas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles
•Tabletas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles con Minerales
• Cápsulas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles con Minerales
• Solución Oral de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles
• Solución Oral de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles con Minerales
• Este procedimiento emplea la saponificación de la muestra, seguida de una extracción líquido-líquido de vitamina E a
partir de la muestra con n-hexano. Evaporar el extracto de hexano hasta sequedad y reconstituir el residuo en una
mezcla de acetonitrilo y acetato de etilo (1 :1 ).
• A menos que se especifiquen en las monografías individuales, la Solución estándar, las Soluciones muestra y las solucio-
nes reactivo se preparan según se indica a continuación.
Fase móvil: Metanol, acetonitrilo y n-hexano (46,5: 46,5: 7,0)
Diluyente: Acetonitrilo y acetato de etilo (1 :1)
Solución de hidróxido de potasio: [NOTA-Usada en la muestra para Solución Oral.] Transferir 90 g de pellets de hidróxi-
do de potasio a un matraz volumétrico de 100 mL que contenga 60 mL de agua. Mezclar hasta disolver, enfriar y diluir con
agua a volumen.
Solución estándar: 0,3 mg/mL de ER Alfa Tocoferol USP en Diluyente
Solución muestra para Tabletas: Reducir a polvo fino no menos de 20 Tabletas. Transferir una porción del polvo, equiva-
lente a 8 mg de alfa tocoferol, a un matraz de 125 mL equipado con una junta de vidrio esmerilado. Agregar 25,0 mL de
agua, 25,0 mL de alcohol deshidratado y 3,5 g de pellets de hidróxido de potasio. Agitar durante 1 hora en un baño de
agua mantenido a 55º. Enfriar y transferir con ayuda de un volumen mínimo de agua a un embudo de separación de 125
ml. Enjuagar el matraz con 50 mL de n-hexano y agregar el enjuague al embudo de separación. Tapar, agitar vigorosa-
mente durante 60 segundos y dejar que las capas se separen. Escurrir la capa acuosa a un segundo embudo de separación
de 250 mL y repetir la extracción con 50 mL de n-hexano. Desechar la capa acuosa y combinar los extractos de hexano.
Lavar los extractos combinados con 25 mL de agua, dejar que las capas se separen y desechar la capa acuosa. Agregar
3 gotas de ácido acético glacial y repetir el procedimiento de lavado dos veces más. Filtrar la capa de hexano lavada a tra-
vés de sulfato de sodio anhidro en un matraz de fondo redondo de 250 ml. Enjuagar el embudo y el sulfato de sodio con
unos pocos mL de n-hexano, y agregar el enjuague a la solución de hexano en el matraz. Colocar el matraz en un baño de
agua mantenido a 50º y evaporar la solución de hexano con ayuda de un evaporador rotatorio hasta sequedad. Inmediata-
mente, agregar 25,0 mL de Diluyente y agitar por rotación suave hasta disolver el residuo.
Solución muestra para Cápsulas: Pesar no menos de 20 Cápsulas en un frasco de pesada tarado. Abrir las Cápsulas, sin
perder material de la cubierta, y transferir el contenido a un vaso de precipitados de 100 ml. Retirar cualquier contenido
adherido a las cubiertas de las cápsulas vacías lavando con varias porciones de éter. Desechar los lavados y secar las cubier-
tas de las Cápsulas con ayuda de una corriente de aire seco. Pesar las cubiertas de las Cápsulas vacías en un frasco de pesa-
da tarado y calcular el peso neto del contenido de las Cápsulas. Transferir una porción del contenido de las Cápsulas, equi-
valente a una cantidad de 8,0 mg de alfa tocoferol, a un matraz Erlenmeyer con tapón de vidrio. Agregar 25,0 mL de agua,
25,0 mL de alcohol deshidratado y 3,5 g de pellets de hidróxido de potasio. Agitar durante 1 hora en un baño de agua
mantenido a 55º. Enfriar y transferir con ayuda de un volumen mínimo de agua a un embudo de separación de 125 ml.
Enjuagar el matraz con 50 mL de n-hexano y agregar el enjuague al embudo de separación. Tapar, agitar vigorosamente
durante 60 segundos y dejar que las capas se separen. Escurrir la capa acuosa a un segundo embudo de separación de 250
mL y repetir la extracción con 50 mL de n-hexano. Desechar la capa acuosa y combinar los extractos de hexano. Lavar los
extractos combinados con 25 mL de agua, dejar que las capas se separen y desechar la capa acuosa. Agregar 3 gotas de
ácido acético glacial y repetir el procedimiento de lavado dos veces más. Filtrar la capa de hexano lavada a través de sulfato
de sodio anhidro en un matraz de fondo redondo de 250 ml. Enjuagar el embudo y el sulfato de sodio con unos pocos mL
de n-hexano, y agregar el enjuague a la solución de hexano en el matraz. Colocar el matraz en un baño de agua manteni-
do a 50º y evaporar la solución de hexano hasta sequedad con ayuda de un evaporador rotatorio. Inmediatamente, agre-
gar 25,0 mL de Diluyente y agitar por rotación suave hasta disolver el residuo.
Solución muestra para Solución Oral: Transferir una cantidad de Solución Oral, equivalente a 1,5 mg de alfa tocoferol, a
un matraz Erlenmeyer de 125 mL equipado con una junta de vidrio esmerilado y agregar 25,0 mL de alcohol deshidratado.
Conectar un condensador de reflujo y someter a reflujo en un baño de agua en ebullición durante 1 minuto. Agregar con
cuidado 3 mL de Solución de hidróxido de potasio a través del condensador y continuar sometiendo a reflujo durante 30
minutos. Retirar el matraz del baño y enjuagar el condensador con aproximadamente 15 mL de agua. Enfriar y transferir
con un volumen mínimo de agua a un embudo de separación de 250 ml. Enjuagar el matraz con 50 mL de n-hexano y
USP 40 Pruebas Químicas/ (551) Valoración de Vitamina E 455

agregar los enjuagues al embudo de separación. Tapar, agitar vigorosamente durante 1 minuto y dejar que las capas se
separen. Escurrir la capa acuosa a un segundo embudo de separación de 250 ml y repetir la extracción con 50 ml de n-
hexano. Desechar la capa acuosa y combinar los extractos de hexano. Lavar los extractos combinados con 25 ml de agua,
dejar que las capas se separen y desechar la capa acuosa. Agregar 3 gotas de ácido acético glacial y repetir el procedimien-
to de lavado dos veces más. Filtrar la capa de hexano lavada a través de sulfato de sodio anhidro en un matraz de fondo
redondo de 250 mL. Enjuagar el embudo y el sulfato de sodio con n-hexano, y agregar el enjuague a la solución de hexano
en el matraz. Evaporar la solución de hexano hasta sequedad con ayuda de un evaporador rotatorio sobre un baño de
agua mantenido a aproximadamente 50º. Inmediatamente, agregar 5,0 ml de Diluyente y agitar por rotación suave hasta
disolver el residuo.
Sistema cromatográfico
(Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
Detector: UV 291 nm
Columna: 4,6 mm x 25 cm; relleno L1
Temperatura de la columna: 40º
Velocidad de flujo: 3 ml/min
Volumen de inyección: 20 µL
Aptitud del sistema
Muestra: Solución estándar
Requisitos de aptitud
Desviación estándar relativa: No más de 0,5%
Análisis
Muestras: Solución estándar y Solución muestra
Calcular el porcentaje de la cantidad declarada de vitamina E, como alfa tocoferol, en la porción de la muestra tomada:
Resultado= (ruf r5) x (C5/Cu) x 100
ru =respuesta del pico de alfa tocoferol de la Solución muestra
r5 =respuesta del pico de alfa tocoferol de la Solución estándar
C5 =concentración de ER Alfa Tocoferol USP en la Solución estándar (mg/ml)
Cu =concentración nominal de vitamina E, como alfa tocoferol, en la Solución muestra (mg/ml)
[NOTA-Calcular el alfa tocoferol equivalente a acetato de alfa tocoferilo o succinato ácido de alfa tocoferilo, multiplicando sus
contenidos por los factores 0,91 ó 0,81, respectivamente.]
• PROCEDIMIENTO 4
• Este procedimiento de cromatografía de gases se usa para la determinación de vitamina E como ingrediente farma-
céutico activo, como ingrediente de suplemento dietético o como componente de formas farmacéuticas farmacopei-
cas. Puede usarse para:
•Vitamina E
• Cápsulas de Vitamina E
• Preparación de Vitamina E
•A menos que se especifiquen en las monografías individuales, las Soluciones estándar, las Soluciones muestra y las solu-
ciones reactivo se preparan y se usan apropiadamente según se indica a continuación.
Solución de estándar interno: 1 O mg/ml de escualano en ciclohexano
Solución de aptitud del sistema: O, 1 mg/ml de ER Alfa Tocoferol USP y de ER Acetato de Alfa Tocoferilo USP en ciclohe-
xano
Solución estándar 1: 1 O mg/ml de ER Alfa Tocoferol USP en Solución de estándar interno
Solución estándar 2: 1O mg/ml de ER Acetato de Alfa Tocoferilo USP en Solución de estándar interno
Solución estándar 3: Transferir 30,0 mg de ER Succinato Ácido de Alfa Tocoferilo USP a un vial de 20 ml. Agregar 2,0 ml
de metanol, 1,0 ml de 2,2-dimetoxipropano y O, 1 ml de ácido clorhídrico al vial. Tapar herméticamente y someter a ultra-
sonido. Dejar en reposo en la oscuridad durante 1 hora ± 5 minutos. Retirar de la oscuridad, destapar y evaporar justo has-
ta sequedad en un baño de vapor con ayuda de una corriente de nitrógeno. Agregar 3,0 ml de Solución de estándar interno
y mezclar en un mezclador de vórtice hasta disolver.
Soluciones muestra para Ingredientes Activos Farmacéuticos
Solución muestra 1 (vitamina E como alfa tocoferol o acetato de alfa tocoferilo): 1 O mg/ml de Vitamina E (d- o di-alfa
tocoferol o acetato de d- o di-alfa tocoferilo) en Solución de estándar interno
Solución muestra 2 (vitamina E como succinato ácido de alfa tocoferilo): Transferir 30,0 mg de Vitamina E (succinato
ácido de d- o di-alfa tocoferilo) a un vial de 20 ml. Agregar 2,0 ml de metano!, 1,0 ml de 2,2-dimetoxipropano y O, 1 ml
de ácido clorhídrico al vial. Tapar herméticamente y someter a ultrasonido. Dejar en reposo en la oscuridad durante 1
hora ± 5 minutos. Retirar de la oscuridad, destapar y evaporar justo hasta sequedad en un baño de vapor con ayuda de
una corriente de nitrógeno. Agregar 3,0 ml de Solución de estándar interno y mezclar en un mezclador de vórtice hasta
disolver.
456 (551) Valoración de Vitamina E/ Pruebas Químicas USP 40

Soluciones muestra para Preparaciones de Vitamina E

Solución muestra 1 (vitamina E como alfa tocoferol o acetato de alfa tocoferilo en forma líquida): Disolver una porción
de Preparación en Solución de estándar interno para preparar una solución de Vitamina E (d- o di-alfa tocoferol o acetato
de d- o di-alfa tocoferilo) con una concentración nominal de 1O mg/ml.
Solución muestra 2 (vitamina E como succinato ácido de alfa tocoferilo en forma líquida): Transferir una porción de Pre-
paración, equivalente a 30,0 mg de Vitamina E (succinato ácido de d- o di-alfa tocoferilo), a un vial de 20 mL. Agregar 2,0
mL de metanol, 1,0 mL de 2,2-dimetoxipropano y O, 1 mL de ácido clorhídrico al vial. Tapar herméticamente y someter a
ultrasonido. Dejar en reposo en la oscuridad durante 1 hora ± 5 minutos. Retirar de la oscuridad, destapar y evaporar
justo hasta sequedad en un baño de vapor con ayuda de una corriente de nitrógeno. Agregar 3,0 mL de Solución de es-
tándar interno y mezclar en un mezclador de vórtice hasta disolver.
Solución muestra 3 (vitamina E como alfa tocoferol o acetato de alfa tocoferilo en forma sólida): Transferir una porción
de Preparación, equivalente a 50 mg de alfa tocoferol o acetato de alfa tocoferilo, a un matraz adecuado para reflujo.
Agregar 5 mL de agua y calentar en un baño de agua a 60º durante 1O minutos. Agregar 25 mL de alcohol y someter a
reflujo durante 30 minutos. Enfriar y transferir a un separador con ayuda de 50 mL de agua y 50 mL de éter. Agitar vigo-
rosamente, dejar que las capas se separen y recoger cada capa en sendos separadores. Extraer la capa acuosa con dos
porciones de 25 mL de éter, combinando los extractos con la capa etérea original. Lavar los extractos combinados con
una porción de 25 mL de agua, filtrar las soluciones etéreas a través de 1 g de sulfato de sodio anhidro y, con ayuda de
una corriente de nitrógeno, evaporar la solución etérea en un baño de agua controlado a una temperatura que no cause
que la solución etérea se derrame por ebullición. Retirar el recipiente del baño de agua cuando queden 5 mL y completar
la evaporación sin aplicar calor. Disolver el residuo en Solución de estándar interno para preparar una solución de Vitamina
E (d- o di-alfa tocoferol o acetato de d- o di-alfa tocoferilo) con una concentración nominal de 1O mg/mL.
Solución muestra 4 (vitamina E como succinato ácido de alfa tocoferilo en forma sólida): Transferir una porción de Pre-
paración, equivalente a 30 mg de Vitamina E (succinato ácido de d- o di-alfa tocoferilo), a un matraz adecuado para reflu-
jo. Agregar 5 mL de agua y calentar en un baño de agua a 60º durante 1O minutos. Agregar 25 mL de alcohol y someter
a reflujo durante 30 minutos. Enfriar y transferir a un separador con ayuda de 50 mL de agua y 50 mL de éter. Agitar
vigorosamente, dejar que las capas se separen y recoger cada capa en sendos separadores. Extraer la capa acuosa con dos
porciones de 25 mL de éter, combinando los extractos con la capa etérea original. Lavar los extractos combinados con
una porción de 25 mL de agua, filtrar las soluciones etéreas a través de 1 g de sulfato de sodio anhidro y, con ayuda de
una corriente de nitrógeno, evaporar la solución etérea en un baño de agua controlado a una temperatura que no cause
que la solución etérea se derrame por ebullición. Retirar el recipiente del baño de agua cuando queden 5 ml. Transferir
cuantitativamente el remanente a un vial de 20 mL y completar la evaporación sin aplicar calor. Agregar 2,0 mL de meta-
no!, 1,0 mL de 2,2-dimetoxipropano y O, 1 mL de ácido clorhídrico al vial. Tapar herméticamente y someter a ultrasonido.
Dejar en reposo en la oscuridad durante 1 hora ± 5 minutos. Retirar de la oscuridad, destapar y evaporar justo hasta se-
quedad en un baño de vapor con ayuda de una corriente de nitrógeno. Agregar 3,0 mL de Solución de estándar interno y
mezclar en un mezclador de vórtice hasta disolver.
Soluciones muestra para Cápsulas de Vitamina E
Solución muestra 1 (vitamina E como alfa tocoferol o acetato de alfa tocoferilo): Pesar no menos de 1O Cápsulas en un
frasco de pesada tarado. Usando una cuchilla afilada u otro medio apropiado, abrir cuidadosamente las Cápsulas, sin per-
der material de la cubierta, y transferir el contenido combinado de las Cápsulas a un vaso de precipitados de 100 ml.
Retirar cualquier sustancia adherida a las Cápsulas vacías lavando con varias porciones pequeñas de n-hexano. Desechar
los lavados y dejar que las Cápsulas vacías se sequen en una corriente de aire seco hasta que ya no se perciba olor a n-
hexano. Pesar las Cápsulas vacías en el frasco de pesada tarado original y calcular el peso neto promedio por Cápsula.
Disolver una porción del contenido combinado de las Cápsulas en Solución de estándar interno para preparar una solución
de Vitamina E (d- o di-alfa tocoferol o acetato de d- o di-alfa tocoferilo) con una concentración nominal de 1O mg/mL.
Solución muestra 2 (vitamina E como succinato ácido de alfa tocoferilo): Pesar no menos de 1O Cápsulas en un frasco de
pesada tarado. Usando una cuchilla afilada u otro medio apropiado, abrir cuidadosamente las Cápsulas, sin perder mate-
rial de la cubierta, y transferir el contenido combinado de las Cápsulas a un vaso de precipitados de 100 ml. Retirar cual-
quier sustancia adherida a las Cápsulas vacías lavando con varias porciones pequeñas de n-hexano. Desechar los lavados y
dejar que las Cápsulas vacías se sequen en una corriente de aire seco hasta que ya no se perciba olor a n-hexano. Pesar las
Cápsulas vacías en el frasco de pesada tarado original y calcular el peso neto promedio por Cápsula. Transferir una por-
ción del contenido combinado de las Cápsulas, equivalente a 30,0 mg de Vitamina E (succinato ácido de d- o di-alfa toco-
ferilo), a un vial de 20 mL. Agregar 2,0 mL de metanol, 1,0 mL de 2,2-dimetoxipropano y O, 1 mL de ácido clorhídrico al
vial. Tapar herméticamente y someter a ultrasonido. Dejar en reposo en la oscuridad durante 1 hora ± 5 minutos. Retirar
de la oscuridad, destapar y evaporar justo hasta sequedad en un baño de vapor con ayuda de una corriente de nitrógeno.
Agregar 3,0 mL de Solución de estándar interno y mezclar en un mezclador de vórtice hasta disolver.
Sistema cromatográfico
(Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: Cromatografía de Gases
Detector: Ionización a la llama
Columna: Capilar de sílice fundida, de 0,25 mm x 30 m; ligada con una película de fase G2 de 0,25 µm
USP 40 Pruebas Químicas/ (551) Valoración de Vitamina E 457

Temperaturas
Columna: 280º
Inyector: 290º
Detector: 290º
Gas transportador: Helio
Velocidad de flujo: 1 ml/min
Relación de partición: 100:1
Volumen de inyección: 1 µL
Aptitud del sistema
Muestras: Solución de aptitud del sistema y Solución estándar apropiada
Requisitos de aptitud
Resolución: No menos de 3,5 entre alfa tocoferol y acetato de alfa tocoferilo, Solución de aptitud del sistema
Desviación estándar relativa: No más de 2,0% para los cocientes entre las respuestas de los picos de la forma de vita-
mina E pertinente y el estándar interno en inyecciones repetidas, Solución estándar apropriada
Análisis
Muestras: Solución estándar y Solución muestra apropiadas
Calcular el porcentaje de vitamina E en términos de alfa tocoferol, acetato de alfa tocoferilo o succinato ácido de alfa toco-
ferilo en la porción de la muestra tomada:

Resultado= (Ruf R5) x (C5f Cu) x 100

Ru = cociente de respuesta entre los picos de la forma de vitamina E pertinente y estándar interno de la Solución
muestra apropiada
R5 = cociente de respuesta entre los picos de la forma de vitamina E pertinente y estándar interno de la Solución es-
tándar apropiada
C5 = concentración del Estándar de Referencia USP correspondiente en la Solución estándar apropiada (mg/ml)
Cu = concentración nominal de la forma de vitamina E correspondiente en la Solución muestra apropiada (mg/ml)
• PROCEDIMIENTO 5
• Este procedimiento de cromatografía de gases se usa para la determinación de Vitamina E (como d- o di-alfa tocofe-
rol) en:
• Succinato de Vitamina E y Polietilenglicol (Succinato de vitamina E y polietilenglicol es una mezcla que se forma
mediante la esterificación de succinato ácido de d-alfa tocoferilo y polietilenglicol).
•A menos que se especifiquen en las monografías individuales, las Soluciones estándar, las Soluciones muestra y las solu-
ciones reactivo se preparan según se indica a continuación.
Disolvente: 0,25 ml de fenolftaleína SR en 1 L de alcohol
Solución de estándar interno: 12 mg/ml de araquidato de etilo en isooctano
Solución estándar: Transferir 32,5 mg de ER Alfa Tocoferol USP a un matraz de reacción adecuado. Agregar 2 ml de piri-
dina y 0,5 ml de N,0-bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida con trimetilclorosilano al 1%, y calentar el matraz a 100º durante
1O minutos. Enfriar el matraz, agregar 5,0 ml de Solución de estándar interno seguido de 20 ml de isooctano y agitar.
Solución muestra: Transferir una cantidad equivalente a O, l 00-0, l 60 g de Succinato de Vitamina E y Polietilenglicol fun-
dido a 60º a un tubo de cultivo (de aproximadamente 20 cm de longitud y 2,5 cm de diámetro) equipado con un tapón
de rosca. Agregar 40-50 mg de ácido ascórbico y unas pocas perlas de ebullición, seguido de 20 ml de Disolvente.
[NOTA-Someter la solución a reflujo suavemente sin que se produzca emisión del contenido. Colocar el tubo en un bloque
de calentamiento ajustado a 100º-150º.] Cuando la muestra se disuelva por completo, agregar 0,25 g de hidróxido de
potasio y continuar sometiendo a reflujo durante 30 minutos. Retirar el tubo del calor y, mientras el contenido esté calien-
te, agregar 1-2 ml de ácido clorhídrico, gota a gota, hasta que la coloración rosada desaparezca. [PRECAUCIÓN-Reacción
exotérmica. Dejar que el ácido se deslice poco a poco dentro del tubo para evitar salpicaduras.] Enfriar el tubo, luego lavar
las paredes del tubo con 20 ml de agua. Agregar 5,0 ml de Solución de estándar interno, tapar y agitar para asegurar un
mezclado minucioso. Dejar el tubo en reposo hasta que se formen dos capas diferenciadas. Transferir 2,5-3,5 ml de la
capa superior a un matraz de reacción adecuado y agregar 2,0 ml de piridina seguida de 2,5 ml de N, 0-bis(trimetilsilil)tri-
fluoroacetamida con trimetilclorosilano al 1%. Calentar el matraz a 100º durante 1O minutos. Enfriar y luego agregar 12
ml de isooctano.
Sistema cromatográfico
(Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: Cromatografía de Gases
Detector: Ionización a la llama
Columna: Capilar de sílice fundida, de 0,25 mm x 15 m; ligada con una película de fase G27 de 0,25 µm
Temperaturas
Inyector: 280º
Detector: 345º
Columna: Ver la Tabla 7.
458 (551 >Valoración de Vitamina E/ Pruebas Químicas USP 40

Tabla 1
Tiempo de Espera
(Hold Time)
ala
Temperatura Rampa de Temperatura Temperatura
Inicial Temperatura Final Final
(º) (º/min) (º) (mln)
260 20 340 1

Gas transportador: Helio

Velocidad de flujo: 1,5 ml/min
Relación de partición: 200:1
Volumen de inyección: 1 µL
Aptitud del sistema
Muestra: Solución estándar
Requisitos de aptitud
Factor de asimetría: No más de 2,0 para el pico de alfa tocoferol
Desviación estándar relativa: No más de 2,0% para el cociente entre las respuestas de los picos de alfa tocoferol y el
estándar interno en inyecciones repetidas
Análisis
Muestras: Solución estándar y Solución muestra
Calcular el porcentaje de vitamina E como d-alfa tocoferol en la porción de la muestra tomada:
Resultado= (Ruf R5) x (WsfWu) x 100
Ru = cociente de respuesta entre los picos de alfa tocoferol y estándar interno de la Solución muestra
R5 = cociente de respuesta entre los picos de alfa tocoferol y estándar interno de la Solución estándar
W5 =peso de ER Alfa Tocoferol USP usado para preparar la Solución estándar (mg)
Wu = peso de Succinato de Vitamina E y Polietilenglicol tomado para preparar la Solución muestra (mg)
REQUISITOS ADICIONALES
• ESTÁNDARES DE REFERENCIA USP (11)
ER Alfa Tocoferol USP
ER Acetato de Alfa Tocoferilo USP
ER Succinato Ácido de Alfa Tocoferilo USP
ER Ergocalciferol USP

(561) ARTÍCULOS DE ORIGEN BOTÁNICO

MUESTREO
Con el fin de reducir el efecto de la desviación sistemática de muestreo en los resultados cualitativos y cuantitativos, es nece-
sario asegurar que la composición de la muestra usada sea representativa de la partida de material que está siendo examinada.
Los procedimientos de muestreo siguientes son el mínimo que se considera aplicable a artículos de origen vegetal. Algunos
artículos o algunas pruebas pueden requerir procedimientos más rigurosos que involucren el muestreo de más envases o de
más muestras por envase.

Muestra Bruta
Cuando el examen externo de envases, marcas y etiquetas indica que la partida se puede considerar homogénea, tomar
muestras individuales del número de envases seleccionados de forma aleatoria que se indica a continuación. Cuando la partida
no se puede considerar homogénea, dividirla en subpartidas que sean tan homogéneas como sea posible y, a continuación,
muestrear cada una como una partida homogénea. Cuando el número de envases en la partida (N) es 11 o más y cada envase
de la partida está marcado en orden con un número o una letra, se recomienda incluir muestras de los envases primero, inter-
medio y último.
Nº de Envases Nº de Envases
en la Partida (N) que Deben Ser Muestreados (n)
1-10 Todos
11-19 11
USP 40 Pruebas Químicas/ (561) Artículos de Origen Botánico 459

Nº de Envases Nº de Envases
en la Partida (N) que Deben Ser Muestreados (n)
>19 n = 1O + (N/1 O)

(Redondear "n" al siguiente número entero más alto.)

Las muestras se toman de las secciones superior, media e inferior de cada envase. Si el material sin procesar está formado
por partes componentes que tienen 1 cm o menos en cualquier dimensión, y en el caso de todos los materiales molidos o en
polvo, retirar la muestra por medio de un dispositivo de muestreo que quite un centro de la parte superior a la inferior del
envase, tomando no menos de dos centros desde ángulos diferentes. Para materiales con partes componentes de más de 1 cm
en cualquier dimensión, retirar las muestras manualmente. En el caso de fardos o paquetes grandes, las muestras se deben
tomar a una profundidad de 1O cm porque el contenido de humedad de la capa superficial puede ser diferente del de las
capas interiores.
Preparar la muestra bruta combinando y mezclando las muestras individuales tomadas de cada envase abierto, teniendo cui-
dado de no aumentar el grado de fragmentación ni de afectar significativamente el contenido de humedad.
Para artículos en envases que contienen menos de 1 kg, mezclar el contenido y retirar una cantidad suficiente para las prue-
bas. Para artículos en envases que contienen entre 1 y 5 kg, retirar porciones iguales de la parte superior, media e inferior del
envase, de modo que cada una de las muestras sea suficiente para realizar las pruebas. Mezclar meticulosamente las muestras
y retirar una cantidad suficiente para realizar las pruebas. Para envases que contienen más de 5 kg, retirar tres muestras, de
modo que cada una pese no menos de 250 g, de la parte superior, media e inferior del envase. Mezclar minuciosamente las
muestras y retirar una porción suficiente para realizar las pruebas.

Muestra de Laboratorio

Preparar la Muestra de Laboratorio por cuarteo repetido de la muestra bruta.

[NOTA-La reducción de muestra por cuarteo consiste en la distribución pareja de la muestra, adecuadamente mezclada, en
la forma de un cuadrado, y la posterior división por las diagonales en cuatro partes iguales. Luego se toman las dos partes
opuestas y se mezclan cuidadosamente. El proceso se repite según sea necesario hasta obtener la cantidad requerida.]
La Muestra de Laboratorio debe ser de un tamaño suficiente como para realizar todas las pruebas necesarias.

Muestra de Prueba

A menos que se indique algo diferente en la monografía individual o en el procedimiento de prueba siguiente, preparar la
Muestra de Prueba según se indica a continuación.
Reducir por cuarteo el tamaño de la Muestra de Laboratorio, teniendo cuidado de que cada una de las porciones retiradas
continúe siendo representativa. En el caso de artículos sin moler o que no se presentan en polvo, moler la muestra tomada de
modo que pase a través de un tamiz de malla estándar Nº 20 y mezclar bien el polvo resultante. Si el material no se puede
moler, reducirlo a un estado tan fino como sea posible, mezclarlo haciéndolo rodar sobre un papel o paño de muestreo, exten-
derlo hasta formar una capa delgada y retirar la porción para analizar.

MÉTODOS DE ANÁLISIS

Materia Orgánica Extraña

MUESTRA DE PRUEBA

A menos que se especifique algo diferente en la monografía individual, pesar las cantidades siguientes de la Muestra de Labo-
ratorio, teniendo cuidado de que la porción tomada sea representativa (reducir la muestra por cuarteo si fuera necesario).

Raíces, rizomas, corteza y hierbas 500 g

Hojas, flores, semillas y frutos 250 g
Cortar los fármacos vegetales (el peso promedio de las piezas es menos de 0,5 g) 50 g

Extender la muestra hasta formar una capa delgada y separar a mano la materia orgánica extraña tanto como sea posible.
Pesar y determinar el porcentaje de materia orgánica extraña en el peso del artículo tomado.

Cenizas Totales

Pesar con exactitud, en un crisol tarado, una cantidad de la Muestra de Prueba, que represente 2-4 g del material secado al
aire e incinerar, suavemente al principio, y aumentar gradualmente la temperatura a 675 ± 25º, hasta que no quede carbón y
determinar el peso de la ceniza. Si de esta forma no se puede obtener ceniza sin carbón, extraer la masa carbonizada con agua
caliente, recoger el residuo insoluble en un papel de filtro exento de ceniza, incinerar el residuo y el papel de filtro hasta que la
460 (561) Artículos de Origen Botánico/ Pruebas Químicas USP 40

ceniza quede blanca o casi blanca, luego agregar el filtrado, evaporar hasta sequedad y calentar todo a una temperatura de
675 ± 25º. Si de esta forma no se puede obtener ceniza sin carbón, enfriar el crisol, agregar 15 ml de alcohol, deshacer la
ceniza con una varilla de vidrio, quemar el alcohol y volver a calentar todo a una temperatura de 675 ± 25º. Enfriar en un dese-
cador, pesar la ceniza y calcular el porcentaje de ceniza total con referencia al peso del artículo tomado.

Cenizas Insolubles en Ácido

Calentar a ebullición la ceniza obtenida según se indica anteriormente en Cenizas Totales con 25 ml de ácido clorhídrico 3 N
durante 5 minutos, recoger la materia insoluble en un crisol de filtrado tarado o un filtro exento de ceniza, lavar con agua
caliente, incinerar y pesar. Determinar el porcentaje de ceniza insoluble en ácido calculada con referencia al peso del artículo
tomado.

Cenizas Solubles en Agua

Calentar a ebullición la ceniza obtenida según se indica en Cenizas Totales con 25 ml de agua durante 5 minutos. Recoger la
materia insoluble en un crisol de vidrio sinterizado o sobre un papel de filtro exento de ceniza. Lavar con agua caliente e inci-
nerar durante 15 minutos a una temperatura que no exceda de 450º. Restar el peso de este residuo, en mg, obtenido en
Cenizas Totales, y calcular el porcentaje de ceniza soluble en agua con referencia al peso de la muestra según se determinó en
Cenizas Totales.

Extractos Solubles en Alcohol

MÉTODO 1 (MÉTODO DE EXTRACCIÓN EN CALIENTE)

Transferir aproximadamente 4 g, pesados con exactitud, de material en polvo grueso secado al aire a un matraz Erlenmeyer
con tapón de vidrio. Agregar 100 ml de alcohol y pesar el matraz. Agitar y dejar en reposo durante 1 hora. Acoplar un con-
densador de reflujo al matraz y calentar a ebullición suave durante 1 hora, enfriar y pesar. Volver a ajustar al peso original con
alcohol. Agitar y filtrar rápidamente a través de un filtro seco. Transferir 25 ml del filtrado a una cápsula tarada de fondo plano
y evaporar en un baño de agua hasta sequedad. Secar a 105º durante 6 horas, enfriar en un desecador durante 30 minutos y
pesar sin demora. Calcular el contenido, en mg/g, de materia extraíble en alcohol en la muestra de prueba.

MÉTODO 2 (MÉTODO DE EXTRACCIÓN EN FRÍO))

Transferir aproximadamente 4 g, pesados con exactitud, de material en polvo grueso secado al aire a un matraz Erlenmeyer
con tapón de vidrio. Agregar 100 ml de alcohol, tapar el matraz y macerar durante 24 horas, agitando frecuentemente duran-
te las primeras 8 horas y, a continuación, dejar en reposo. Filtrar rápidamente, procurando no perder alcohol. Evaporar 25 ml
del filtrado hasta sequedad en una cápsula tarada, poco profunda y de fondo plano, y secar a 105º hasta peso constante. Cal-
cular el contenido, en mg/g, de materia extraíble en alcohol en la muestra de prueba.

Extractos Solubles en Agua

MÉTODO 1 (MÉTODO DE EXTRACCIÓN EN CALIENTE)

Proceder según se indica en el Método 1 (Método de Extracción en Caliente) en Extractos Solubles en Alcohol, excepto que se
debe usar agua en lugar de alcohol.

MÉTODO 2 (MÉTODO DE EXTRACCIÓN EN FRÍO)

Proceder según se indica en el Método 2 (método de extracción en frío) en Extractos Solubles en Alcohol, excepto que se debe
usar agua en lugar de alcohol.

Fibra Cruda

Agotar una cantidad pesada de la Muestra de Prueba, que represente aproximadamente 2 g del artículo, con éter. Agregar
200 ml de ácido sulfúrico diluido en ebullición (1 en 78) al residuo agotado con éter, en un matraz de 500 ml, y conectar el
matraz a un condensador de reflujo. Calentar a reflujo la mezcla durante 30 minutos, cronometrados con exactitud, luego pa-
sar a través de un filtro de tela o papel endurecido y lavar el residuo en el filtro con agua hirviendo hasta que el lavado efluente
ya no sea ácido. Volver a colocar el residuo en el matraz enjuagando con 200 ml de solución de hidróxido de sodio en ebulli-
ción, ajustada a 1,25% por valoración volumétrica y sin carbonato de sodio. Someter a reflujo nuevamente la mezcla durante
30 minutos, cronometrados con exactitud, y luego, pasar rápidamente a través de un filtro tarado, lavar el residuo con agua
USP 40 Pruebas Químicas/ (561) Artículos de Origen Botánico 461

hirviendo hasta que el último lavado sea neutro y secar a 11 Oº hasta peso constante. Incinerar el residuo seco hasta peso cons-
tante, enfriar en un desecador y pesar la ceniza: la diferencia entre el peso obtenido mediante el secado a 11 Oº y el de la ceni-
za representa el peso de fibra cruda.
[NOTA-La ebullición con ácido y álcali debe continuar durante 30 minutos, cronometrados con exactitud, desde el momen-
to en que el líquido (que se enfría por debajo del punto de ebullición al agregarlo al matraz frío) vuelve a alcanzar su punto de
ebullición. Después de llevar la solución al punto de ebullición, se debe disminuir el calor lo suficiente como para mantener la
ebullición. Durante la ebullición, el matraz se debe rotar suavemente a intervalos regulares para reincorporar a la solución toda
partícula que pueda adherirse a las paredes del matraz. Una corriente de aire suave introducida en el matraz durante la opera-
ción de ebullición ayuda a evitar la formación excesiva de espuma.]

Contenido de Almidón

MÉTODO 1

El siguiente es un procedimiento general para todos los azúcares reductores y se puede utilizar para determinar el contenido
de almidón en artículos botánicos.
Extracto de Malta: Usar malta de cebada nueva, limpia y de eficacia conocida y moler inmediatamente antes de usar.
Preparar el extracto de malta inmediatamente antes de usar. Por cada 80 mL de extracto de malta que se necesiten, digerir 5 g
de malta molida con 100 mL de agua a temperatura ambiente durante 2 horas. [NOTA-Si se usa un mezclador eléctrico, mez-
clar durante 20 minutos.] Filtrar para obtener un extracto transparente, volver a filtrar, si fuera necesario, y mezclar bien la
infusión.
Solución de prueba: Extraer aproximadamente 5 g de la muestra de prueba finamente molida con cinco porciones de 1O
mL de éter, usando un filtro que retenga completamente el gránulo de almidón más pequeño. Dejar evaporar el éter del resi-
duo y lavar con 250 mL de solución de alcohol acuosa (1 O en 100). Lavar cuidadosamente el residuo del papel y verterlo en un
vaso de precipitados de 500 mL con aproximadamente 100 mL de agua. Calentar aproximadamente a 60º (evitando, si es
posible, gelatinizar el almidón) y dejar en reposo durante aproximadamente 1 hora, mezclando frecuentemente para lograr
una disolución completa de los azúcares. Transferir a un frasco de boca ancha, enjuagar el vaso de precipitados con un poco
de agua tibia y enfriar. Agregar un volumen equivalente de alcohol, mezclar y dejar en reposo durante no menos de 1 hora.
Centrifugar hasta que el precipitado quede bien compacto en el fondo del frasco y decantar el sobrenadante. Lavar el preci-
pitado con porciones sucesivas de 50 mL de solución de alcohol (50 en 100) centrifugando y decantando a través de un filtro
adecuado hasta que los lavados estén exentos de azúcar. [NOTA-Para comprobar la presencia de azúcar, transferir unas gotas
de los lavados a un tubo de ensayo y agregar 3 ó 4 gotas de una solución de 1-naftol en alcohol al 20%, preparada por disolu-
ción de 200 mg de 1-naftol en 1 mL de alcohol y 2 mL de agua. Agitar bien el tubo de ensayo para que la mezcla quede
uniforme, dejar fluir entre 2-4 mL de ácido sulfúrico por las paredes del tubo de ensayo y sostener el tubo de ensayo en posi-
ción vertical. Si hay presencia de azúcar, la interfase de los dos líquidos pasa de color violeta claro a violeta oscuro, y al agitar
toda la solución se torna violeta azulado.]
Transferir el residuo del frasco y del filtro endurecido a un vaso de precipitados con aproximadamente 50 mL de agua. Su-
mergir el vaso de precipitados en agua hirviendo y mezclar constantemente durante 15 minutos o hasta que se gelatinice todo
el almidón. Enfriar el vaso de precipitados a 55º, agregar 20 mL de Extracto de Malta y mantener a esta temperatura durante 1
hora. Volver a calentar a ebullición durante algunos minutos, enfriar a 55º, agregar 20 mL de Extracto de Malta y mantener a
esta temperatura durante 1 hora o hasta que el residuo, cuando se trata con yodo SR, no muestre un matiz azulado en el exa-
men microscópico. Enfriar, diluir con agua hasta 250 mL y filtrar.
Procedimiento general: Transferir 200 mL de la Solución de prueba a un matraz equipado con un condensador de reflujo,
agregar 20 mL de ácido clorhídrico y calentar en un baño de agua hirviendo durante 2 1/2 horas. Enfriar, llevar a pH casi neutro
con hidróxido de sodio SR, completar la neutralización con carbonato de sodio SR, diluir con agua hasta 500 mL, mezclar y
filtrar. El volumen de la alícuota tomada depende del contenido de almidón de la muestra en análisis (ver la Tabla 7). La alícuo-
ta debería contener entre 100 y 200 mg de dextrosa. Transferir 50 mL del filtrado a un vaso de precipitados de vidrio de 400
mL resistente a los álcalis, agregar 50 mL de tartrato cúprico alcalino SR, cubrir el vaso de precipitados con un vidrio de reloj y
calentar. Ajustar la llama del quemador para que el contenido del matraz comience a hervir en 4 minutos y continuar la ebulli-
ción durante 2 minutos exactos. Filtrar la solución caliente de inmediato a través de un filtro de vidrio sinterizado. Lavar minu-
ciosamente el precipitado de óxido cuproso con agua aproximadamente a 60º, luego con 1O mL de alcohol y finalmente con
1O mL de éter.
Tabla 1. Determinación de la Alícuota Óptima
Contenido de Almidón Esperado Alícuota
(%) (ml)
60 25
50 35
40 50
30 50
20 50
462 (561) Artículos de Origen Botánico/ Pruebas Químicas USP 40

Para soluciones de azúcares reductores de relativamente alta pureza, proceder según se indica en el Método 7A para determi-
nar la cantidad de cobre reducido obtenido pesando el óxido cuproso seco. Para soluciones de azúcares reductores que contie-
nen grandes cantidades de impurezas orgánicas, incluida sacarosa, proceder según se indica en el Método 7B para determinar
la cantidad de cobre reducido obtenido por valoración volumétrica con tiosulfato de sodio.
Método 7A-Secar el precipitado obtenido en el Procedimiento General en un horno durante 30 minutos a 11O±2º, enfriar a
temperatura ambiente en un desecador y pesar. Consultar la Tabla 2 para obtener la cantidad de dextrosa, en mg, correspon-
diente al peso del óxido cuproso hallado. Determinar el porcentaje de dextrosa y, luego, el contenido de almidón por la si-
guiente fórmula:
Porcentaje de dextrosa =(peso de dextrosa en mg x O, 1 x 500)/(peso de la muestra en g x alícuota en ml)
Contenido de almidón = % de dextrosa x 0,9

Tabla 2 Cálculo de Dextrosa (Aplicable cuando se pesa directamente CU7•O) (E X presado en m g )

Óxido Dextro- Óxido Dextro- Óxido Óxido Óxido Dextro- Óxido Dextro-
Cu pro- sa Cu pro- sa Cu pro- Dextrosa Cu pro- Dextrosa Cu pro- sa Cu pro- sa
so (o-Glu- so (D-Glu- so (D-Gluco- so (o-Gluco- so (D-Glu- so (D-Glu-
(Cu?O) cosa) (Cu 7 0) cosa) (Cu 20) sa) (Cu 7 0) sa) (Cu 7 0) cosa) (Cu 7 0) cosa)
10 4,0 90 38,9 170 75, 1 250 112,8 330 152,2 410 193,7
12 4,9 92 39,8 172 76,0 252 113,7 332 153,2 412 194,7
14 5,7 94 40,6 174 76,9 254 114,7 334 154,2 414 195,8
16 6,6 96 41,5 176 77,8 256 115,7 336 155,2 416 196,8
18 7,5 98 42,4 178 78,8 258 116,6 338 156,3 418 197,9

20 8,3 100 43,3 180 79,7 260 117,6 340 157,3 420 199,0
22 9,2 102 44,2 182 80,6 262 118,6 342 158,3 422 200,1
24 10,0 104 45, 1 184 81,5 264 119,5 344 159,3 424 201, 1
26 10,9 106 46,0 186 82,5 266 120,5 346 160,3 426 202,2
28 11,8 108 46,9 188 83,4 268 121,5 348 161,4 428 203,3

30 12,6 11 o 47,8 190 84,3 270 122,5 350 162,4 430 204,4
32 13,5 112 48,7 192 85,3 272 123,4 352 163,4 432 205,5
34 14,3 114 49,6 194 86,2 274 124,4 354 164,4 434 206,5
36 15,2 116 50,5 196 87,1 276 125,4 356 165,4 436 207,6
38 16, 1 118 51,4 198 88, 1 278 126,4 358 166,5 438 208,7

40 16,9 120 52,3 200 89,0 280 127,3 360 167,5 440 209,8
42 17,8 122 53,2 202 89,9 282 128,3 362 168,5 442 210,9
44 18,7 124 54,1 204 90,9 284 129,3 364 169,6 444 212,0
46 19,6 126 55,0 206 91,8 286 130,3 366 170,6 446 213,1
48 20,4 128 55,9 208 92,8 288 131,3 368 171,6 448 214, 1

50 21,3 130 56,8 210 93,7 290 132,3 370 172,7 450 215,2
52 22,2 132 57,7 212 94,6 292 133,2 372 173,7 452 216,3
54 23,0 134 58,6 214 95,6 294 134,2 374 174,7 454 217,4
56 23,9 136 59,5 216 96,5 296 135,2 376 175,8 456 218,5
58 24,8 138 60,4 218 97,5 298 136,2 378 176,8 458 219,6

60 25,6 140 61,3 220 98,4 300 137,2 380 177,9 460 220,7
62 26,5 142 62,2 222 99,4 302 138,2 382 178,9 462 221,8
64 27,4 144 63, 1 224 100,3 304 139,2 384 180,0 464 222,9
66 28,3 146 64,0 226 101,3 306 140,2 386 181,0 466 224,0
68 29,2 148 65,0 228 102,2 308 141,2 388 182,0 468 225,l

70 30,0 150 65,9 230 103,2 310 142,2 390 183, 1 470 226,2
72 30,9 152 66,8 232 104, 1 312 143,2 392 184, 1 472 227,4
USP40 Pruebas Químicas/ (561) Artículos de Origen Botánico 463

., )
a cu 1o d e Dextrosa (A p111 ca bl e cuan d o se pesa di rectamente Cu, O) (Expresa d o en mg ) (C ontmuaoon
Ta bl a 2 C'I
Óxido Dextro- Óxido Dextro- Óxido Óxido Óxido Dextro- Óxido Dextro-
Cu pro- sa Cu pro- sa Cu pro- Dextrosa Cu pro- Dextrosa Cu pro- sa Cu pro- sa
so (o-Glu- so (o-Glu- so (o-Gluco- so (o-Gluco- so (o-Glu- so (o-Glu-
(Cu 2 0) cosa) (Cu 2 0) cosa) (Cu,O) sa) (Cu,O) sa) (Cu 2 0) cosa) (Cu 2 0) cosa)
74 31,8 154 67,7 234 105,1 314 144,2 394 185,2 474 228,3
76 32,7 156 68,6 236 106,0 316 145,2 396 186,2 476 229,6
78 33,6 158 69,5 238 107,0 318 146,2 398 187,3 478 230,7

80 34,4 160 70,4 240 108,0 320 147,2 400 188,4 480 231,8
82 35,3 162 71,4 242 108,9 322 148,2 402 189,4 482 232,9
84 36,2 164 72,3 244 109,9 324 149,2 404 190,5 484 234,1
86 37,1 166 73,2 246 110,8 326 150,2 406 191,5 486 235,2
88 38,0 168 74,1 248 111,8 328 151,2 408 192,6 488 236,3

Método 78
SOLUCIÓN DE TIOSULFATO DE SODIO: Transferir 3,9 g de tiosulfato de sodio, pesados con exactitud, a un matraz volumétrico
de 100 mL, disolver y diluir a volumen con agua y mezclar.
SOLUCIÓN DE YODURO DE POTASIO: Disolver 42 g de yoduro de potasio en 100 mL de agua.
SOLUCIÓN DE ACETATO DE SODIO: Disolver 5,74 g de acetato de sodio en 1o mL de agua.
SOLUCIÓN DE COBRE: Transferir aproximadamente 0,3 g de cobre electrolítico puro, pesados con exactitud, a un matraz de
250 mL, agregar 5 mL de ácido nítrico para disolver el cobre, agregar aproximadamente 25 mL de agua y calentar a ebullición
para expulsar humos rojos. Agregar aproximadamente 5 mL de bromo SR y calentar a ebullición hasta eliminar completamen-
te el bromo. Enfriar, agregar 1 O mL de Solución de acetato de sodio seguidos de 1O mL de Solución de yoduro de potasio y valo-
rar con la Solución de tiosulfato de sodio hasta obtener un color amarillo claro. Agregar suficiente almidón SR para producir un
marcado color azul y continuar con la valoración. A medida que se aproxima el punto final, agregar 2 g de tiocianato de pota-
sio y mezclar hasta disolver completamente. Continuar la valoración hasta que el precipitado quede totalmente blanco. Un mL
de Solución de tiosulfato de sodio equivale aproximadamente a 1O mg de cobre. [NOTA-Es esencial que la concentración de la
Solución de yoduro de potasio se regule cuidadosamente. Si la solución contiene menos de 320 mg de cobre al finalizar la volu-
metría, agregar 4,2-5 g de yoduro de potasio para obtener una solución total de 100 mL. Si hay presentes cantidades mayores
de cobre, agregar lentamente Solución de yoduro de potasio desde una bureta con agitación constante en cantidades propor-
cionalmente mayores.]
PROCEDIMIENTO: Lavar con agua el precipitado de óxido cuproso obtenido en el Procedimiento general, cubrir este filtro con
un vidrio de reloj y disolver el óxido cuproso con 5 mL de ácido nítrico vertidos con una pipeta por debajo del vidrio de reloj.
Recoger el filtrado en un matraz de 250 mL, lavar el vidrio de reloj y el filtro con agua. Recoger todos los lavados en el matraz.
Calentar a ebullición el contenido del matraz para expulsar humos rojos. Agregar aproximadamente 5 mL de bromo SR y ca-
lentar a ebullición hasta eliminar completamente el bromo. Enfriar y proceder según se indica en Solución de cobre comenzan-
do donde dice "agregar 1 O mL de Solución de acetato de sodio". A partir del volumen de Solución de tiosulfato de sodio consu-
mido, obtener el peso de cobre, en mg, multiplicándolo por 1, 1259 para obtener el peso, en mg, de óxido cuproso. Basándo-
se en la Tabla 2, obtener la cantidad de dextrosa, en mg, correspondiente al peso de óxido cuproso. El contenido de almidón
equivale al peso, en mg, de dextrosa obtenida multiplicado por 0,9. Realizar una determinación con un blanco usando 50 mL
de tartrato cúprico alcalino SR y 50 mL de Extracto de malta. Si el peso del óxido cuproso así obtenido excede 0,5 mg, corregir
el resultado de la determinación de forma adecuada. [NOTA-El tartrato cúprico alcalino SR se deteriora en reposo y la canti-
dad de óxido cuproso obtenida en la determinación con un blanco aumenta.]

MÉTODO 2

El método siguiente es específico para la dextrosa (glucosa) y, dado que es extremadamente sensible, puede explicar las di-
ferencias detectadas entre valores obtenidos a partir de una misma muestra. Las determinaciones duplicadas no varían en más
de2%.
Solución de glucoamilasa: Preparar una solución de glucoamilasa en agua que contenga 30 Unidades Internacionales
(Ul)/ml. Usar glucoamilasa obtenida preferentemente de Rhizopus delemar. El total de actividad de glucoamilasa en la muestra
de prueba utilizada debe ser no menos de 150 UI.
Solución amortiguadora de acetato: Disolver 16,4 g de acetato de sodio en 100 mL de agua, agregar 12,0 mL de ácido
acético glacial y mezclar. El pH de esta solución es 4,8.
Solución amortiguadora de fosfato: Disolver 3,63 g de tris (hidroximetil) aminometano y 5,0 g de fosfato monobásico
de sodio en 50,0 mL de agua. Ajustar con ácido fosfórico a un pH de 7,0 a una temperatura de 37°, diluir con agua hasta
100,0 mL y mezclar. [NOTA-El pH del medio de la solución amortiguadora es sensible a la temperatura y se debe ajustar al pH
deseado a la temperatura que se utilizará durante la incubación.]
464 (561) Artículos de Origen Botánico/ Pruebas Químicas USP 40

Solución enzimática: Disolver 30 mg de glucosa oxidasa (Tipo 11 de Aspergillus niger), 3 mg de peroxidasa (Tipo 1 de rába-
no picante) y 1 O mg de ferrocianuro de potasio en 100 ml de Solución amortiguadora de fosfato. [NOTA-Esta mezcla se puede
almacenar en un refrigerador durante un período de hasta 1 O días.]
Ácido sulfúrico 18 N: Agregar lentamente, mezclando, 54 ml de ácido sulfúrico a 102 ml de agua, dejar que se enfríe a
25º y mezclar.
Soluciones estándar: Disolver una cantidad pesada con exactitud de ER Dextrosa USP en agua para obtener una solución
que contenga 1,0 mg de ER Dextrosa USP por ml. Diluir cuantitativamente un volumen conocido de esta solución en agua
para obtener las Soluciones Estándares A, 8, C, O y E, con concentraciones conocidas de 1 O, 20, 25, 40 y 50 µg/ml de ER Dex-
trosa USP, respectivamente. [NOTA-Esperar 4 horas para que termine la mutarrotación antes de usar.]
Soluciones de prueba: Extraer aproximadamente 5 g de muestra de prueba finamente molida con cinco porciones de 25
ml de alcohol al 80% y filtrar. Eliminar todo el alcohol del residuo mediante secado en un horno de aire a 105º durante apro-
ximadamente 8 horas. [NOTA 1-Cualquier traza de alcohol que quede en el residuo inhibirá la glucoamilasa.] Enfriar y transfe-
rir el matraz que contiene la muestra de prueba seca a un desecador. Transferir aproximadamente 1 g de la muestra de prue-
ba, pesado con exactitud, a un matraz previamente tarado, agregar 25 ml de agua y ajustar con ácido fosfórico a un pH entre
5,0-7,0; si fuera necesario. Calentar a ebullición la suspensión durante aproximadamente 3 minutos, transferir el matraz a un
autoclave y calentar a 135º durante 2 horas. Retirar el matraz del autoclave, mantener la temperatura próxima a 55º y agregar
2,5 ml de Solución amortiguadora de acetato y agua suficiente para ajustar el peso total de la solución a 45 ± 1 g. Sumergir el
matraz en un baño de agua mantenido a 55 ± 1 ºy agregar 5 ml de Solución de glucoamilasa. Agitar el matraz por rotación
suave y de forma continua durante 2 horas para lograr la hidrólisis, pasar a través de un papel de filtro a un matraz volumétri-
co de 250 ml, lavar cuantitativamente con agua y recoger todos los lavados en el matraz. Diluir el contenido del matraz con
agua a volumen y mezclar. Transferir 1 ml de una alícuota que contenga entre 20-60 µg de o-glucosa a cada uno de cinco
tubos de ensayo. [NOTA 2-Para obtener el intervalo de concentración de glucosa en el hidrolizado, diluir cuantitativamente
con agua a volumen, si fuera necesario.] Agregar 2 ml de Solución Enzimática a cada uno de los cinco tubos de ensayo y colo-
carlos en la oscuridad a 37 ± 1 ºdurante exactamente 30 minutos para que se forme el color. Una vez transcurridos los 30 mi-
nutos, agregar 2 ml de Ácido sulfúrico 78 Na cada uno de los tubos de ensayo para detener la reacción y mezclar.
Solución control: Transferir una cantidad pesada con exactitud de aproximadamente 0,4 g de almidón a un matraz tara-
do previamente y proceder según se indica en Soluciones de prueba, comenzando donde dice "agregar 25 ml de agua y ajus-
tar el pH con ácido fosfórico".
Procedimiento: Determinar concomitantemente las absorbancias de las Soluciones estándar y las Soluciones de prueba a la
longitud de onda de absorbancia máxima aproximadamente a 540 nm, con un espectrofotómetro apropiado, utilizando la
Solución control como blanco para ajustar el instrumento. Graficar los valores de absorbancia de las Soluciones estándar en fun-
ción de la concentración, en µg/ml, de dextrosa, y trazar la línea recta que mejor se ajuste a los cinco puntos graficados. A
partir de la gráfica así obtenida, determinar la concentración, C, en µg/ml, de dextrosa en cada una de las Soluciones de Prueba
y calcular la concentración promedio, en µg/ml, de la solución en análisis. El porcentaje del contenido de almidón en el peso
de la muestra de prueba tomada se calcula por la fórmula:
(0,9C/10 6) x V1 x (250/Va)(l 00/E)(l 00/W) = 2,25CV1/VaEW

en donde E es el peso, en g, de la muestra de prueba tomada; Va es el volumen, en ml, de la alícuota tomada del matraz
volumétrico de 250 ml; W es el porcentaje de peso en seco de la muestra de prueba; y V1 es el volumen, en ml, si se realiza
una dilución adicional (ver Nota 2 en Soluciones de prueba). [NOTA-Va es 1,0 cuando no se realiza ninguna dilución adicional.]

Determinación de Aceite Volátil

Colocar un matraz de 1 L de fondo redondo y cuello corto en un manto de calentamiento sobre un mezclador magnético.
Introducir en el matraz una barra de agitación magnética de forma ovoide y acoplar un condensador de camisa fría por agua y
una trampa para aceite volátil apropiada del tipo que se ilustra (ver la Figura 7).
USP 40 Pruebas Químicas/ (561) Artículos de Origen Botánico 465

Graduado: Graduado -
0,1 mL - 0,1 mL

Para aceites más Para aceites más

livianos que el agua pesados que el agua

Figura 1 . Trampas para Aceite Volátil

Triturar en granos gruesos una cantidad suficiente del artículo para producir entre 1 y 3 mL de aceite volátil. Normalmente
no es necesario triturar semillas, frutos pequeños u hojas quebradas de hierbas. Se deben evitar los polvos muy finos. Si esto no
fuera posible, puede que sea necesario mezclarlos con serrín purificado o arena purificada. Colocar una cantidad adecuada del
artículo, pesada con exactitud, en un matraz y llenarlo con agua hasta la mitad. Acoplar el condensador y el separador adecua-
do. Calentar a ebullición el contenido del matraz, con una cantidad adecuada de calor para mantener una ebullición suave
durante 2 horas, o hasta que el aceite volátil se haya separado completamente del artículo y ya no se recoja en el tubo gradua-
do del separador.
Si se ha obtenido una cantidad adecuada de aceite volátil en el tubo graduado del separador, se puede leer en décimos de 1
mL, y se puede calcular el volumen de aceite volátil por cada 100 g del artículo usando el peso del artículo tomado para el
análisis. Las graduaciones en el separador "para aceites más pesados que el agua" se colocan de manera que el aceite perma-
nezca por debajo del condensado acuoso que fluye automáticamente de regreso al matraz.

Contenido de Agua

Para artículos sin moler o que no se presentan en polvo, preparar aproximadamente 1 Og de la Muestra de Laboratorio cor-
tando, granulando o desmenuzando de modo que las partes tengan aproximadamente 3 mm de grosor. Las semillas o los
frutos más pequeños de 3 mm deben partirse. Evitar el uso de molinos de alta velocidad para preparar la muestra. Procurar
que no se pierda una cantidad apreciable de humedad durante la preparación y que la porción tomada sea representativa de
la Muestra de Laboratorio. Determinar el contenido de agua según se indica en Procedimiento para Artículos de Origen Botánico
en Determinación de Agua (921 ), Método 111 (Gravimétrico).

PRUEBA DE AFLATOXINAS

[PRECAUCIÓN-Las aflatoxinas son muy peligrosas, por lo que se debe tener sumo cuidado cuando se manipulan materiales que
contienen aflatoxinas.]
Cuando la monografía individual requiere el cumplimiento con los límites de aflatoxinas, los límites son no más de 5 ng/g
para aflatoxina B, (AFB 1 ) y no más de 20 ng/g para la suma de aflatoxinas B, (AFB,), B2 (AFB 2 ), G, (AFG,) y G2 (AFG 2). Se puede
usar un enfoque basado en el riesgo de contaminación para determinar el alcance de la prueba. Al determinar el cumplimien-
to, se considera la presencia inesperada de aflatoxinas. Se proporcionan los siguientes procedimientos analíticos para determi-
nar el cumplimiento. A menos que se especifique algo diferente en la monografía individual, usar el Método l. Si la aptitud del
sistema no cumple con los requisitos, usar el Método 11 o el Método fil.

Método 1

La prueba de TLC se suministra para detectar la posible presencia de AFB,, AFB 2, AFG, y AFG 2 en cualquier material de origen
vegetal.

REACTIVO DE ACETATO DE CINC-CLORURO DE ALUMINIO

Disolver 20 g de acetato de cinc y 5 g de cloruro de aluminio en agua suficiente para obtener 100 ml.
466 (561) Artículos de Origen Botánico/ Pruebas Químicas USP 40

SOLUCIÓN DE CLORURO DE SODIO

Disolver 5 g de cloruro de sodio en 50 mL de agua.

SOLUCIÓN DE PRUEBA 1

Moler aproximadamente 200 g de material vegetal para formar un polvo fino. Transferir aproximadamente 50 g pesados
con exactitud de material en polvo a un matraz con tapón de vidrio. Agregar 200 mL de una mezcla de metanol y agua
(17:3). Agitar mecánicamente en forma vigorosa durante no menos de 30 minutos y filtrar. [NOTA-Si la solución contiene
pigmentos vegetales que interfieren, proceder según se indica para la Solución de Prueba 2.] Desechar los primeros 50 mL del
filtrado y recoger la porción siguiente de 40 ml. Transferir el filtrado a un embudo de separación. Agregar 40 mL de Solución
de Cloruro de Sodio y 25 mL de éter de petróleo y agitar durante 1 minuto. Dejar que las capas se separen y tran.sferir la capa
acuosa inferior a un segundo embudo de separación. Extraer dos veces la capa acuosa en el embudo de separación, cada vez
con 25 mL de cloruro de metileno, agitando durante 1 minuto. Dejar que las capas se separen cada vez, separar la capa orgá-
nica inferior y recoger las capas orgánicas combinadas en un matraz Erlenmeyer de 125 mL. Evaporar el disolvente orgánico en
un baño de agua. Transferir el extracto remanente a un tubo de muestra adecuado y evaporar hasta sequedad en un baño de
agua. Enfriar el residuo. Si existen interferencias con el residuo, proceder según se indica para Procedimiento de limpieza en
Solución de Prueba 2; de lo contrario, disolver el residuo obtenido anteriormente en 0,2 mL de una mezcla de cloroformo y
acetonitrilo (9,8:0,2) y agitar mecánicamente si fuera necesario.

SOLUCIÓN DE PRUEBA 2

Recoger 100 mL de filtrado del inicio del flujo y transferir a un vaso de precipitados de 250 ml. Agregar 20 mL de Reactivo
de Acetato de Cinc-Cloruro de Aluminio y 80 mL de agua. Mezclar y dejar en reposo durante 5 minutos. Agregar 5 g de un coad-
yuvante de filtración adecuado, como por ejemplo tierra de diatomeas, mezclar y filtrar. Desechar los primeros 50 mL del filtra-
do y recoger la porción siguiente de 80 ml. Proceder según se indica para la Solución de Prueba 7, comenzando donde dice
"Transferir el filtrado a un embudo de separación".
Procedimiento de limpieza: Colocar un disco de vidrio sinterizado de porosidad media o un tapón de lana de vidrio en el
fondo de un tubo cromatográfico de 1 O mm x 300 mm. Preparar una suspensión espesa de 2 g de gel de sílice con una mezc-
la de éter etílico y éter de petróleo (3:1 ), verter la suspensión espesa en la columna y lavar con 5 mL de la misma mezcla de
disolventes. Dejar que el absorbente sedimente y agregar a la parte superior de la columna una capa de 1,5 g de sulfato de
sodio anhidro. Disolver el residuo obtenido anteriormente en 3 mL de cloruro de metileno y transferir a la columna. Enjuagar
el matraz dos veces con porciones de 1 mL de cloruro de metileno, transferir los enjuagues a la columna y eluir a una veloci-
dad de no más de 1 mL/min. Agregar sucesivamente a la columna 3 mL de éter de petróleo, 3 mL de éter etílico y 3 mL de
cloruro de metileno, eluir a una velocidad de no más de 3 mL/min y desechar los eluatos. Agregar a la columna 6 mL de una
mezcla de cloruro de metileno y acetona (9:1) y eluir a una velocidad de no más de 1 mL/min, preferentemente sin la ayuda
de vacío. Recoger este eluato en un vial pequeño, agregar una perla de ebullición si fuera necesario y evaporar hasta sequedad
en un baño de agua. Disolver el residuo en 0,2 mL de una mezcla de cloroformo y acetonitrilo (9,8:0,2) y agitar mecánicamen-
te si fuera necesario.

SOLUCIÓN DE PRUEBA 3

Si existen interferencias con el residuo, proceder según se indica en Procedimiento de Limpieza con /AC en Solución de Prueba
en Método 11.

SOLUCIÓN DE AFLATOXINAS

[PRECAUCIÓN-Las aflatoxinas son muy tóxicas. Manipular con cuidado.]

Diluir el ER Aflatoxinas USP 1 :5 con acetonitrilo para obtener una solución con una concentración de 0,4 µg/mL de AFB, y
de AFG,, y O, 1 µg/mL de AFB 2 y de AFG 2 •

PROCEDIMIENTO

Aplicar por separado 2,5; 5; 7,5 y 1 O µL de la Solución de Aflatoxinas y tres aplicaciones de 1 O µL de la Solución de Prueba 7,
Solución de Prueba 2, o Solución de Prueba 3 a una placa adecuada para cromatografía en capa delgada (ver Cromatografía
(621 )) recubierta con una capa de mezcla de gel de sílice para cromatografía de 0,25 mm. Superponer 5 µL de la Solución de
Aflatoxinas a una de las tres aplicaciones de 1O µL de la Solución de Prueba. Dejar que se sequen las aplicaciones y desarrollar el
cromatograma en una cámara no saturada que contenga una fase móvil constituida por una mezcla de cloroformo, acetona y
alcohol isopropílico (85:10:5) hasta que el frente de la fase móvil haya recorrido no menos de 15 cm desde el origen. Retirar la
USP 40 Pruebas Químicas/ (561) Artículos de Origen Botánico 467

placa de la cámara de desarrollo, marcar el frente de la fase móvil y dejar que la placa se seque al aire. Localizar las manchas en
la placa bajo luz UV a 365 nm.

APTITUD DEL SISTEMA

Las cuatro aplicaciones de la Solución de Aflatoxinas aparecen como cuatro manchas azules fluorescentes separadas clara-
mente. Observar cualquier mancha obtenida de la Solución de Prueba que concide en tono y ubicación con aquéllas de la
Solución de Aflatoxinas. Cualquier mancha obtenida de la Solución de Prueba con la Solución de Aflatoxinas superpuesta no es de
menor intensidad que la de la Solución de Aflatoxinas correspondiente.

CRITERIOS DE ACEPTACIÓN

Ninguna mancha de las aplicaciones de la Solución de Prueba corresponde a las manchas obtenidas con las aplicaciones de la
Solución de Aflatoxinas. Si se obtiene alguna mancha de aflatoxinas en la Solución de Prueba, comparar la ubicación de cada
mancha fluorescente de la Solución de Prueba con las de la Solución de Aflatoxinas para identificar el tipo de aflatoxina presente.
La intensidad de la mancha de aflatoxina, si estuviera presente en la Solución de Prueba, cuando se compara con la de la aflato-
xina correspondiente en la Solución de Aflatoxinas representa la concentración aproximada de aflatoxina en la Solución de Prue-
ba. Cuando la monografía individual requiere el cumplimiento con los límites de aflatoxinas, los límites son no más de 5 ng/g
para AFB 1 y no más de 20 ng/g para la suma de AFB,, AFB 2, AFG, y AFGi- a menos que se especifique algo diferente.

Método 11

SOLUCIÓN DE CLORURO DE SODIO

Ver el Método l.

SOLUCIÓN SALINA AMORTIGUADA CON FOSFATO

Preparar una solución amortiguadora de fosfato 1 O mM que contenga cloruro de sodio 0, 138 M y cloruro de potasio 0,0027
M en agua, y ajustar con hidróxido de sodio 2 M a un pH de 7,4. 1

COLUMNA DE INMUNOAFINIDAD (IAC, POR SUS SIGLAS EN INGLÉS)

Antes de acondicionar, ajustar la IAC a temperatura ambiente. Para acondicionar, aplicar 1O mL de Solución Salina Amorti-
guada con Fosfato sobre la columna y dejar que fluya a través de la columna por gravedad a una velocidad de 2-3 mL/min.
Dejar 0,5 mL de la Solución Salina Amortiguada con Fosfato sobre la parte superior de la columna hasta que se aplique la Solu-
ción de Prueba.

SOLUCIÓN DE PRUEBA

Extracción de la muestra: Transferir aproximadamente 5 g de una muestra representativa en polvo, pesada con exacti-
tud, a un matraz con tapón de vidrio. Agregar 20 mL de una mezcla de metano! y agua (17:3). Agitar mecánicamente en
forma vigorosa durante no menos de 30 minutos y filtrar. Desechar los primeros 5 mL del filtrado y recoger la porción siguien-
te de 4 ml. Transferir el filtrado a un embudo de separación. Agregar 4 mL de Solución de Cloruro de Sodio y 2,5 mL de hexano
y agitar durante 1 minuto. Dejar que las capas se separen y transferir la capa acuosa inferior a un segundo embudo de separa-
ción. Extraer la capa acuosa en el embudo de separación dos veces, cada vez con 2,5 mL de cloruro de metileno, agitando
durante 1 minuto. Dejar que las capas se separen cada vez, separar la capa orgánica inferior, y recoger las capas orgánicas
combinadas en un matraz Erlenmeyer de 50 ml. Evaporar el disolvente orgánico en un baño de agua. Transferir el extracto
remanente a un tubo de muestra adecuado y evaporar hasta sequedad en un baño de agua. Enfriar el residuo. Si existen inter-
ferencias en el residuo, proceder según se indica en Procedimiento de Limpieza con IAC. De otra manera, disolver el residuo ob-
tenido anteriormente en 200 µL de acetonitrilo y agitar mecánicamente, si fuera necesario.
Procedimiento de limpieza con IAC: Disolver el residuo en 5 mL de una mezcla de metano! y agua (60:40) y luego diluir
con 5 mL de agua. Aplicar este extracto sobre una IAC acondicionada. Enjuagar la IAC dos veces con 1O mL de Solución Salina
Amortiguada con Fosfato y eluir lentamente con 2 mL de metano!. Evaporar el eluato con nitrógeno y disolver el residuo en 200
µL de acetonitrilo.

1 Se puede obtener una mezcla de polvo adecuada en Sigma como PBS P-3813.
468 (561) Artículos de Origen Botánico / Pruebas Químicas USP 40

SOLUCIÓN DE AFLATOXINAS

[PRECAUCIÓN-Las aflatoxinas son muy tóxicas. Manipular con cuidado.]

Diluir cuantitativamente el ER Aflatoxinas USP 1 :50 con acetonitrilo para obtener una solución que contenga 0,04 µg/mL de
AFB 1 y de AFG 1, y 0,01 µg/mL de AFB 2 y de AFG 2 •

ANÁLISIS

Aplicar por separado 5; 7,5 y 1O µL de Solución de Aflatoxinas y tres aplicaciones de 1O µL de la Solución de Prueba a un placa
para HPTLC adecuada (ver Cromatografía (621 )) recubierta con una capa de mezcla de gel de sílice para cromatografía de 200
µm. Superponer 5 µL de Solución de Aflatoxinas sobre una de las tres aplicaciones de 1O µL de la Solución de Prueba. Dejar que
las aplicaciones se sequen y desarrollar el cromatograma en una cámara saturada que contenga una fase móvil constituida por
una mezcla de cloroformo, acetona y agua (140:20:0,3) hasta que el frente de la fase móvil haya recorrido no menos de 72
mm desde el origen (80 mm del borde inferior de la placa). Retirar la placa de la cámara de desarrollo, marcar el frente de la
fase móvil y dejar que la placa se seque al aire durante 5 minutos. Localizar las manchas en la placa mediante el barrido de la
densidad de fluorescencia (> 400 nm) bajo luz UV a 366 nm. Comparar la ubicación de cada mancha fluorescente de la Solu-
ción de Prueba con las de la Solución de Aflatoxinas para identificar el tipo de aflatoxinas presente. La concentración de aflatoxi-
nas en la Solución de Prueba se puede calcular a partir de la curva de calibración obtenida de los datos de barrido con Solución
de Aflatoxinas.

APTITUD DEL SISTEMA

Las cuatro aplicaciones de Solución de Aflatoxinas aparecen como cuatro manchas azules fluorescentes separadas claramente.
Observar cualquier mancha obtenida de la Solución de Prueba que coincida en tono y ubicación con las de Solución de Aflatoxi-
nas. Cualquier mancha obtenida de la Solución de Prueba con la Solución de Aflatoxinas superpuesta no es de menor intensidad
que la de la Solución de Aflatoxinas correspondiente. La recuperación media de la cantidad agregada conocida de AFB 1 y AFG 1
es no menos de 70%.

CRITERIOS DE ACEPTACIÓN

Cuando la monografía individual requiere el cumplimiento con los límites de aflatoxinas, los límites son no más de 5 ng/g
para AFB 1 y no más de 20 ng/g para la suma de AFB 1, AFB 2 , AFG 1 y AFG 2 , a menos que especifique algo diferente.

Método 111

Se proporciona este método de prueba como un ejemplo para la detección de la presencia posible de AFB 1 y de aflatoxinas
totales (AF: suma de AFB 1, AFB 2, AFG 1 y AFG 2). Se ha demostrado que este método es adecuado para ginseng y jengibre en
polvo. Se debe demostrar su aptitud para otros artículos de origen botánico.

SOLUCIÓN AMORTIGUADORA DE FOSFATO O, 1 M

Disolver 8,69 g de fosfato disódico anhidro y 4,66 g de fosfato monosódico anhidro o 5,36 g de fosfato monosódico mo-
nohidrato en 800 mL de agua, ajustar con hidróxido de sodio 2 M a un pH de 7,4, agregar 1O mL de polisorbato 20, y diluir
hasta 1 L.

SOLUCIÓN SALINA AMORTIGUADA CON FOSFATO

Preparar según se indica en el Método//.

SOLUCIONES ESTÁNDAR DE TRABAJO DE AFLATOXINAS

Preparar seis soluciones en sendos matraces volumétricos de 1O mL según la Tabla 3. Diluir con una mezcla de metanol y
agua (1 :1, v/v) a volumen. Almacenar en un refrigerador y equilibrar a temperatura ambiente antes de su uso. Preparar las
soluciones en el día de su uso.
 USP 40 Pruebas Químicas/ (561) Artículos de Origen Botánico 469

Tabla 3. Preparación de Soluciones Estándar de Trabajo de Aflatoxinas

Concentración Final de Aflatoxinas
de la Solución Estándar de Trabajo de Aflatoxinas
Soluciones Estándar de Trabajo de ER Aflatoxinas USP (ng/ml)
Aflatoxinas (µL) AFB 1 AFB 7 AFG 1 AFG 2 LAF
1 o o o o o o
2 12,5 0,25 0,0625 0,25 0,0625 0,625
3 25 0,5 0,125 0,5 0,125 1,25
4 50 1 0,25 1 0,25 2,5
5 100 2 0,5 2 0,5 5
6 200 4 1 4 1 10

COLUMNA DE INMUNOAFINIDAD (1AC) 2

Usar una columna de inmunoafinidad que contenga anticuerpos monoclonales de reactividad cruzada con AFB 1, AFB 2, AFG 1
y AFG 2 • Las columnas de inmunoafinidad tienen una capacidad mínima de no menos de 100 ng de aflatoxinas totales y pro-
porcionan una recuperación de no menos de 80% para AFB 1, AFB 2 , AFG, y AFG 2 cuando se aplican 5 ng de AFB 1, de AFB 2 , de
AFG 1 y de AFG 2 en 1 O mL de metanol al 10% en Solución Salina Amortiguada con Fosfato (v/v).

SOLUCIÓN DE PRUEBA

Extracción: Pesar 5 g de una muestra de prueba representativa en un tubo de centrífuga de 50 ml. Agregar 1 g de cloru-
ro de sodio y 25 mL de una mezcla de metanol y bicarbonato de sodio al 0,5% (700:300). Mezclar en un mezclador de vórtice
hasta que las partículas de muestra y el disolvente de extracción se mezclen bien. Agitar a 400 rpm durante 1 O minutos. Cen-
trifugar durante 1 O minutos a 7000 rpm (valor g = 5323 mm/s 2 ) o a una velocidad que pueda producir un pellet de residuos
firme. Pipetear y transferir de inmediato 7 mL a un tubo de centrífuga de 50 mL, agregar 28 mL de Solución Amortiguadora de
Fosfato O, 7 M, mezclar y filtrar a través de papel de microfibra de vidrio. Recoger 25 mL del filtrado (equivalente a 1 g de la
muestra de prueba) en una probeta graduada de 25 mL y proceder inmediatamente con la cromatografía de IAC.
Limpieza de IAC: [NOTA-Para la limpieza de IAC, las columnas deben mantenerse a temperatura ambiente durante al
menos 15 minutos antes de su uso.] Retirar la tapa superior de la columna y conectarla con el reservorio de solvente. Retirar la
tapa inferior de la columna y acoplarla al colector de la columna (el ajuste debe ser hermético). Dejar que el líquido pase a
través de la columna hasta dejar aproximadamente 2-3 mm de líquido por encima del lecho de la columna. Transferir los 25
mL del filtrado, obtenido en Extracción, al reservorio de solvente. Dejar que el filtrado fluya a través de la columna por grave-
dad. Dejar que la columna se seque. Retirar la columna del colector para comenzar el flujo de nuevo con facilidad, agregar
aproximadamente 2 mL de Solución Salina Amortiguada con Fosfato a la columna, volver a acoplar la columna al reservorio de
solvente, lavar la columna con 3 mL adicionales de Solución Salina Amortiguada con Fosfato y luego con 5 mL de agua (se pue-
de agregar 5 mL de Solución Salina Amortiguada con Fosfato directamente al reservorio de solvente de la columna si se usan
otras técnicas para desprender las burbujas de aire en el extremo de la columna y para comenzar el flujo de nuevo con facili-
dad). Dejar que la columna se seque, luego forzar 3 mL de aire a través de la columna con una jeringa. Eluir con 1 mL de
metanol y recoger los analitos en un matraz volumétrico de 3 mL, dejando que el eluato gotee libremente. Dejar que la colum-
na se seque. Dejar en reposo durante 1 minuto, luego eluir con 1 mL adicional de metanol, y recoger en el mismo matraz
volumétrico. Dejar que la columna se seque y forzar 1O mL de aire a través de la columna. Diluir el eluato con agua a volumen.
Usar esta dilución como la Solución de Prueba y realizar el análisis de aflatoxinas de inmediato.

SOLUCIÓN DE APTITUD DEL SISTEMA

Preparar una muestra adicionada, agregando 5 mL de Solución Estándar de Trabajo de Aflatoxinas 5 a una muestra de 5 g,
repitiendo el procedimiento para la Solución de Prueba, usando 20 mL en lugar de 25 mL de la mezcla de metanol y bicarbona-
to de sodio al 0,5% (700:300).

SISTEMA CROMATOGRÁFICO

Velocidad de flujo: 0,8 mL/minuto

Detección: Detector de fluorescencia; ajustar la longitud de onda de excitación (Ex) a 362 nm y la longitud de onda de
emisión (Em) a 440 nm.
Columna: 4,6 mm x 15 cm; relleno L1 de 3 µm
Fase móvil: !socrática

2 Columna de AflaüchraTest (Gl 017; Vicam, Watertown, MA, USA) o equivalente. Las columnas de inmunoafinidad de Aflatoxina/OTA son adecuadas.
470 (561) Artículos de Origen Botánico/ Pruebas Químicas USP 40

Para derivatización post-columna con celda fotoquímica3-Agua, metanol y acetonitrilo (600:250:150)

Para derivatización post-columna con celda e/ectroquímica4 -Una solución preparada mezclando 1 L de una mezcla de agua,
metanol y acetonitrilo (600:250:150); 350 µL de ácido nítrico 4 M; y 120 mg de bromuro de potasio
Sistemas de derivatización post-columna (PCD, por sus siglas en inglés)
Celda PHRED-Celda fotoquímica para derivatización post-columna
Celda Kobra-Celda electroquímica, celda de bromación para derivatización post-columna.

ANÁLISIS

Derivatización post-columna para aflatoxinas: Usar una celda fotoquímica o electroquímica. Inyectar 50 µL de blanco
de reactivo (Solución Estándar de Trabajo de Aflatoxinas 1), las Soluciones Estándares de Trabajo de Aflatoxinas 2-6 o la Solución
de Prueba en la columna de HPLC. Identificar los picos de aflatoxinas en la Solución de Prueba comparando los tiempos de re-
tención con los de los estándares de trabajo. Las aflatoxinas eluyen en el orden AFG 2, AFG 1, AFB 2 y AFB 1 • Después de pasar a
través de la celda fotoquímica o electroquímica, AFG 1 y AFB 1 han derivatizado para formar AFG 2 • (derivado de AFG 1) y AFB 2•
(derivado de AFB 1). [NOTA-Las estructuras químicas de los derivados que resultan de bromación electroquímica y fotólisis no
son iguales. Las estructuras de los productos de fotólisis de AFB 1 y AFG 1 no se han definido.] Los tiempos de retención de AFG 2 ,
AFG 2., AFB 2 y AFB 2 • están entre aproximadamente 14 y 27 minutos usando la celda fotoquímica; los tiempos de retención
usando la celda electroquímica resultan en períodos de tiempo más breves. Los picos se deben resolver hasta la línea base.
Construir una curva estándar para cada aflatoxina. Determinar la concentración de cada aflatoxina en la Solución de Prueba a
partir de la curva de calibración.
Curvas de calibración de aflatoxinas: Se preparan las curvas de calibración para cada una de las aflatoxinas usando las
Soluciones Estándar de Trabajo de Aflatoxinas que contengan las cuatro aflatoxinas descritas. Estas soluciones abarcan el interva-
lo de 0,25-4 ng/mL para AFB 1 y AFG 1, y el intervalo de 0,0625-1 ng/mL para AFB 2 y AFG 2 • Construir las curvas de calibración
antes de su análisis según la Tabla 3 y verificar la linealidad de la gráfica. Si el área de respuesta de la porción de prueba se
encuentra fuera (más alto) del intervalo de la calibración, entonces la Solución de Prueba debe diluirse con una mezcla de meta-
no! y agua (1 :1; v/v) y volver a inyectarse en la columna de HPLC.
Cuantificación de Aflatoxinas: Se realiza la cuantificación de aflatoxinas midiendo las áreas de los picos a cada tiempo de
retención de aflatoxina y comparándolos con la curva de calibración correspondiente.

APTITUD DEL SISTEMA

La recuperación media de la cantidad agregada conocida de AFB 1 (2 µg/kg) y de aflatoxinas totales (5 µg/kg) es no menos
de 68% y 70%, respectivamente. La desviación estándar relativa (RSD, por sus siglas en inglés) es no más de 10% para AFB 1 y
para aflatoxinas totales.

CÁLCULOS

Graficar el área del pico (respuesta, eje y) de cada estándar de toxina en función de la concentración (ng/mL, eje x) y deter-
minar la pendiente (S) y la intersección con el eje y (a). Calcular el nivel de toxina en la muestra por la siguiente fórmula:

Toxina (µg/kg) = {[(R- a)/S] x V/l!\I} x F

en donde R es el área del pico de la Solución de Prueba; V es el volumen final de la Solución de Prueba inyectada (mL); y Fes el
factor de dilución. F = 1 cuando V= 3 ml. W es 1 g de la muestra de prueba pasada a través de la columna de inmunoafini-
dad. Las aflatoxinas totales son la suma de AFG 2, AFG 1, AFB 2 y AFB 1 •

CRITERIOS DE ACEPTACIÓN

Cuando la monografía individual requiera cumplimiento con los límites para aflatoxinas, los límites son no más de 5 ng/g
para AFB 1 y no más de 20 ng/g para la suma de AFB 1, AFB 2 , AFG 1 y AFG 2 , excepto cuando se indique algo diferente.

ANÁLISIS DE RESIDUOS DE PLAGUICIDAS

Definición

Siempre que se emplee en esta Farmacopea, la denominación de plaguicida se aplica a cualquier sustancia o mezcla de sus-
tancias destinadas a evitar, destruir o controlar plagas, especies de plantas no deseadas, hongos, o animales que provocan da-

3 Celda fotoquímica para derivatización post-columna, tipo PHRED'" Reactor Fotoquímico (AURA Industries, New York, NY, USA) o equivalente. Procurar no mirar
directamente la lámpara UV.
4 Celda electroquímica para derivatización post-columna, tipo Kobra'" (R-Biopharm lnc., Marshall, MI, USA) o equivalente. Ajustado a 100 mA. No prender la co-
rriente hasta que el bombeo de HPLC funcione para evitar el sobrecalentamiento de la membrana celular.
USP 40 Pruebas Químicas/ (561) Artículos de Origen Botánico 471

ños durante la producción, el procesamiento, el almacenamiento, el transporte o la comercialización de artículos puros, o que
interfieren de algún otro modo con estos procesos. La denominación incluye sustancias elaboradas para ser usadas como regu-
ladores de crecimiento, defoliantes o desecantes, y cualquier sustancia que se aplica a los cultivos antes o después de la cose-
cha para proteger el producto del deterioro durante el almacenamiento y el transporte.

Límites

Dentro de los Estados Unidos, muchos productos botánicos se tratan como suplementos dietéticos y por eso están sujetos a
las disposiciones reglamentarias que rigen sobre los alimentos pero no rigen sobre los medicamentos en la Ley Federal sobre
Alimentos, Medicamentos y Productos Cosméticos (Federal Food, Drug and Cosmetic Act). Los límites de plaguicidas en ali-
mentos están determinados por la Agencia de Protección Ambiental del los Estados Unidos (EPA - Environmental Protection
Agency) según se indica en el Reglamento sobre Alimentos y Medicamentos [Code of Federal Regulations (40 CFR Part 180)] o
el Diario Oficial (FR - Federal Register). Además, la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA - Food and Drug Admi-
nistration) establece niveles de acción para residuos inevitables de plaguicidas (21 CFR Part 109 y 21 CFR Part 509). Para pla-
guicidas químicos sin niveles de tolerancia establecidos por la EPA o niveles de acción de la FDA, los residuos deben estar por
debajo del límite de detección del método especificado. Los resultados con valores menores a los límites de detección de la
EPA se consideran cero. Por lo tanto, los límites aquí detallados no son válidos en los Estados Unidos cuando los artículos de
origen botánico están etiquetados para fines alimentarios. Sin embargo, los límites se pueden aplicar en otros países. A menos
que se especifique algo diferente en la monografía individual, el artículo a examinar debe cumplir con los límites provistos en
la Tabla 4. Los límites de plaguicidas, de los que se sospecha su presencia, que no se indican en la Tabla 4 deben cumplir las
reglamentaciones de la EPA. En casos en donde un plaguicida no se indica en la Tabla 4 ni en las reglamentaciones de la EPA,
calcular el límite por la fórmula:

Límite (mg/kg) = AM/l 008

en donde A es la ingesta diaria admisible (IDA), publicada por FAO-OMS, en mg/kg de peso corporal; Mes el peso corporal,
en kg (60 kg); y 8 es la dosis diaria del artículo, en kg.
Si el artículo está destinado para la preparación de extractos, tinturas o otras formas farmacéuticas de la cual el método de
preparación modifica el contenido de plaguicidas en el producto final, calcular los límites por la fórmula:

Límite (mg/kg) = AME/l 008

donde E es el factor de extracción de pesticida en el método de preparación, determinado experimentalmente como la rela-
ción entre el contenido original de plaguicida en el material botánico y el contenido final de plaguicida en la preparación; 8 es
la dosis diaria de la preparación en kg; y A y M se definen anteriormente.
Puede concederse una exención total o parcial de la prueba cuando se conoce toda la historia (naturaleza y cantidad de los
plaguicidas usados, la fecha de cada tratamiento durante el cultivo y después de cosechar) del tratamiento de la partida y se
puede verificar precisamente de acuerdo con las buenas prácticas agrícolas y de recolección (GACP, por sus siglas en inglés).
Tabla 4
Límite
Sustancia (mg/kg)
Acefato 0,1
Alaciar 0,05
Aldrina y die/drina (suma de) 0,05
Azi nfos-etílico 0,1
Azinfos-metílico 1
Bromuro inorgánico (calculado como ión bromuro) 125
Bromofos-etílico 0,05
Bromofos-metílico 0,05
Bromopropilato 3
Clordano (suma de cis-, trans- y oxiclordano) 0,05
Clorfenvinfos 0,5
Clorpirifos-etílico 0,2
Clorpirifos-metílico 0,1
Clortal-dimetílico 0,01
Ciflutrina (suma de) 0,1
/c-Cihalotrina 1
Cipermetrina e isómeros (suma de) 1
DDT (suma de o,p'-DDE, p,p'-DDE, o,p'-DDT, p,p'-DDT, o,p'-TDE y p,p'-TDE) 1
De/tametrina 0,5
472 (561) Artículos de Origen Botánico/ Pruebas Químicas USP 40

Tabla 4 (Continuación)
Límite
Sustancia (mg/kg)
Diazinón 0,5
Diclofluanida o, 1
Diclorvos 1
Dicofol 0,5
Dimetoato y ometoato (suma de) o, 1
Ditiocarbamatos (expresado como CS2) 2
Endosulfán (suma de isómeros y sulfato de endosulfano) 3
Endrina 0,05
Etión 2
Etrimfos 0,05
Fenclorofos (suma de fenclorofos y fenclorofos-oxón) o, 1
Fenitrotión 0,5
Fenpropatrina 0,03
Fensulfotión (suma de fensulfotión, fensulfotión-oxón, fensulfotión-oxón-sulfona y fensulfotión sulfona) 0,05
Fentión (suma de fentión, fentión-oxón, fentión-oxón-sulfona, fentión-oxón-sulfóxido, fentión sulfona y
fentión-sulfóxido) 0,05
Fenvalerato 1,5
Flucitrinato 0,05
c-Fluvalinato 0,05
Fonofos 0,05
Heptaclor (suma de heptaclor, cis-heptaclorepóxido y trans-heptaclorepóxido) 0,05
Hexaclorbenceno o, 1
Hexaclorociclohexano (suma de isómeros a-, j3 -, o- y E-) 0,3
Linda no (y-hexaclorociclohexano) 0,6
Malatión y malaoxón (suma de) 1
Mecarbam 0,05
Metacrifos 0,05
Metamidofos 0,05
Metidatión 0,2
Metoxiclor 0,05
Mirex 0,01
Monocrotofos o, 1
Paratión-etílico y Paraoxón-etílico (suma de) 0,5
Paratión-metílico y Paraoxón-metílico (suma de) 0,2
Pendimetalina o, 1
Pentacloranisol 0,01
Permetrina e isómeros (suma de) 1
Fosa lona o, 1
Fosmeto 0,05
Butóxido de piperonilo 3
Pirimifos-etílico 0,05
Pirimifos-metílico (suma de pirimifos-metílico y N-desetil-pirimifos-metílico) 4
Procimidona o, 1
Profenofos o, 1
Protiofos 0,05
Piretro (suma de cinerina 1, cinerina 11, jasmolina 1, jasmolina 11, piretrina 1y piretrina 11) 3
Quinalfos 0,05
Quintoceno (suma de quintoceno, pentacloroanilina y metil pentaclorofenil sulfuro) 1
S-421 0,02
Tecnaceno 0,05
Tetradifona 0,3
USP 40 Pruebas Químicas/ (563) Identificación de Artículos de Origen Botánico 473

Tabla 4 (Continuación)
Límite
Sustancia (mg/kg)
Vinclozolina 0,4

Análisis cualitativo y cuantitativo de residuos de plaguicidas: Emplear procedimientos analíticos validados, p.ej. de
acuerdo con la versión más actualizada de la guía de la UE sobre procedimientos analíticos de control de calidad y de valida-
ción para el análisis de residuos de plaguicidas [NOTA-La versión vigente del Documento Núm. SANC0/12571 /201 3, http://
ec.europa.eu/food/plant/resources/qualcontrol_en.pdf] o los principios de validación del método de la EPA (OPPTS 860.1340)
que cumplan con los siguientes criterios. El método, especialmente con respecto a los pasos de purificación, es adecuado para
la combinación de residuos de plaguicidas y la sustancia en análisis, y no es susceptible a interferencias de sustancias coextraí-
bles. El límite de cuantificación para cada combinación de matriz de plaguicidas que se va a analizar no debe exceder el límite
de tolerancia correspondiente: el método demuestra una recuperación de entre 70% y 120% de cada plaguicida con una re-
petibilidad de no menos de 20% de desviación estándar relativa [NOTA-en algunos casos, se pueden aceptar recuperaciones
más bajas conforme a lo tratado en el documento SANC0/12571 /2013]; y las concentraciones de las soluciones de prueba y
de referencia, y la calibración del aparato son tales que se obtiene una respuesta lineal del detector analítico.

LÍMITES DE IMPUREZAS ELEMENTALES

Los niveles de impurezas elementales deben restringirse conforme a lo indicado en la Tabla 5 a menos que se indique de
otro modo en la monografía individual. Ciertas monografías específicas pueden proveer diferentes límites para artículos que
por lo regular se usan en grandes cantidades.
Tabla 5. Límites de Impurezas Elementales
Límites
Elemento (µg/g)
Arsénico (inorgánico)ª 2
Cadmio 0,5
Plomo 5
Mercurio (total) 1
Metilmercurio (como Hg)b 0,2
ª El arsénico puede medirse usando un procedimiento sin especiación suponiendo que todo el arsénico contenido en el suplemento se encuentra en forma
inorgánica. Cuando se excede el límite al usar un procedimiento sin especiación, se deberá demostrar el cumplimiento con el límite para arsénico inorgánico
teniendo como fundamento un procedimiento con especiación.
b La determinación de metilmercurio no es necesaria cuando el contenido de mercurio total es menor que el límite para metilmercurio.

Los artículos se analizan de acuerdo con los procedimentos establecidos en Impurezas Elementales-Procedimientos (233).
Cuando se requiera especiación, se usan para el análisis los procedimientos del capítulo Contaminantes Elementales en Suple-
mentos Dietéticos (2232).

<563) IDENTIFICACIÓN DE ARTÍCULOS DE ORIGEN BOTÁNICO

INTRODUCCIÓN

La identificación de materias primas vegetales que se utilizan en la fabricación de medicamentos, excipientes, o suplementos
dietéticos se lleva a cabo examinando las características morfológicas e histológicas del artículo en análisis y realizando pruebas
de diagnóstico químicas. Las características botánicas y químicas obtenidas del examen del artículo de prueba se comparan
luego con las características botánicas y químicas conocidas de la especie vegetal. Se pueden especificar artículos de referencia
para ayudar a la adecuada identificación botánica y química de la planta y de las partes de la planta. Un artículo de referencia
puede ser un Material de Referencia Autenticado USP, que se puede utilizar tanto para la identificación química como botáni-
ca, o un Estándar de Referencia USP, que se usa sólo para la identificación química.

MATERIALES DE REFERENCIA AUTENTICADOS USP

Los Materiales de Referencia Autenticados USP son órganos o tejidos vegetales certificados por provenir de una planta identi-
ficada adecuadamente como perteneciente a la especie declarada en la etiqueta. La autenticación es realizada por especialistas
en taxonomía botánica, anatomía vegetal, fitoquímica u otros científicos especialistas en plantas contratados por la USP. Un
Material de Referencia Autenticado USP es habitualmente un órgano o tejido vegetal seco y pulverizado que se puede obtener
474 (563) Identificación de Artículos de Origen Botánico/ Pruebas Químicas USP 40

de la USP. Se archivan muestras de herbario de las plantas autenticadas, que pueden incluir raíces, tallos, hojas, flores, frutos y
semillas. Las muestras del archivo se pueden solicitar para su examen. Generalmente, una muestra de herbario estándar consis-
te en la planta adulta entera. Los Materiales de Referencia Autenticados USP se someten a las mismas pruebas de diagnóstico
botánico y químico que se aplican en el análisis de materias primas. Un artículo de prueba debe tener todas las características
botánicas y químicas especificadas que se encuentran en el Material de Referencia Autenticado USP. Para que sirva al propósito
al que está destinado, cada Material de Referencia Autenticado USP se debe almacenar, manipular y usar de manera apropia-
da. Por lo general, los Materiales de Referencia Autenticados USP se almacenan en sus envases originales en un ambiente fres-
co, seco y protegidos de la luz y de la infestación de insectos. Cuando se requieren condiciones de almacenamiento especiales,
las instrucciones se indican en la etiqueta. Por lo general, los principios activos y los compuestos marcadores se degradan con
el tiempo; por lo tanto, se asignan fechas de caducidad a los Materiales de Referencia Autenticados USP para su uso en identifi-
cación química. Los Materiales de Referencia Autenticados USP no están destinados para emplearse en la fabricación de pro-
ductos farmacéuticos, excipientes ni suplementos dietéticos.

IDENTIFICACIÓN BOTÁNICA

La identificación botánica de las materias primas vegetales que se emplean en la fabricación de productos farmacéuticos,
excipientes, o suplementos dietéticos consiste en determinar las características macroscópicas e histológicas (microscópicas) de
la parte de la planta, como por ejemplo, raíz, tallo, hoja, flor, fruto o semilla, que se utiliza en la fabricación del artículo. La
identificación puede incluir también la inspección de las características organolépticas del tejido vegetal, como la presencia o
ausencia de un olor característico. Las monografías oficiales individuales pueden incluir información botánica de posibles espe-
cies adulterantes para asegurar su ausencia en la materia prima. Para identificar adecuadamente la planta, el órgano o el tejido
vegetal, es necesario tener un conocimiento básico de anatomía vegetal.

Morfología y Anatomía Vegetal Diagnóstica

Esta sección trata exclusivamente las características morfológicas y anatómicas diagnósticas de plantas vasculares y de las
diversas partes de las plantas, tales como raíces, tallos, hojas, flores, frutos y semillas, a partir de las que se obtienen productos
farmacéuticos, excipientes o suplementos dietéticos. Las plantas vasculares comprenden las Pteridofitas (helechos y plantas re-
lacionadas con los helechos; por ejemplo, los géneros Aspidium, Equisetum y Lycopodium), las Gimnospermas (plantas de semi-
lla, en las que la semilla no está encerrada dentro del fruto; por ejemplo, los géneros Ephedra, Gingko y Pinus) y las Angiosper-
mas (plantas de semilla, donde la semilla está encerrada dentro del fruto; por ejemplo, los géneros Allium, Digitalis, Panax,
Matricaria y Rauwolfia). Algunas de las características anatómicas diagnósticas que se especifican en una monografía individual
(ver Características botánicas en monografías individuales) pueden incluir, entre otras, la presencia de un tejido particular en un
órgano; la disposición y el tipo de células de un tejido; la presencia y el tipo de canal secretor, la presencia de aceite, resina o
conductos laticíferos dentro de un órgano; el número de células epiteliales que rodea un canal secretor; y la presencia y tipo
de sustancias ergásticas como por ejemplo almidón, inulina, glóbulos de grasa, aceites esenciales, cristales de oxalato de cal-
cio, cistolitos, polifenoles, líquidos u otros materiales que se producen en el citoplasma, organelos, vacuolas, cavidades o pared
celular.

RAÍCES

Los tejidos presentes en raíces jóvenes, comenzando desde el tejido más externo, comprenden una epidermis con pelos radi-
culares, corteza, endodermis, periciclo, floema, xilema y, en algunas especies, médula. En algunas especies, la capa o capas
más externas de la corteza son diferentes de las capas internas, en cuyo caso se denominan hipodermis. En especies que pre-
sentan crecimiento secundario de la raíz, es habitual que se desprendan todos los tejidos externos al periciclo. Las raíces que
presentan crecimiento secundario tienen un peridermo o corteza, compuesto de súber (tejido suberoso), felógeno (cámbium
suberoso) y felodermo como el tejido más externo. Debajo del peridermo se pueden encontrar restos de floema primario, floe-
ma secundario, cámbium vascular, xilema primario y xilema secundario. Los tejidos vasculares secundarios tienen radios medu-
lares que separan en grupos a las principales células conductoras del floema (elementos cribosos o células cribosas) y a las prin-
cipales células conductoras del xilema (vasos y traqueidas). La mayoría de las especies de plantas que presentan crecimiento
secundario carecen de médula en la raíz. El tipo y la disposición de las células conductoras principales de los tejidos vasculares
puede permitir el diagnóstico de la especie. Las raíces de muchas especies se desarrollan como órganos de almacenamiento
alimenticio. Este tipo de raíces se caracteriza por la presencia de abundante parénquima y grandes cantidades de almidón u
otros polisacáridos. La presencia, el tipo y la disposición de fibras, esclereidas y otros tejidos, y la presencia y ubicación de ma-
terial ergástico también pueden ser características diagnósticas. Desde el punto de vista morfológico, las raíces se pueden dis-
tinguir de los rizomas (los tallos subterráneos) principalmente por la ausencia de nodos e internodos, que están presentes en
los rizomas.
USP40 Pruebas Químicas/ (563) Identificación de Artículos de Origen Botánico 475

TALLOS

Varias características macroscópicas externas de los tallos que pueden permitir el diagnóstico de la especie comprenden los
atributos de los nodos, internodos, cicatrices de las hojas, cicatrices de los haces vasculares, lenticelas y yemas; el patrón de
crecimiento de las yemas; la posición y disposición de las hojas a lo largo del tallo y la presencia de zarcillos, aguijones, púas o
espinas. Comenzando con el tejido más externo, la disposición interna de tejidos en los tallos jóvenes de la mayoría de las
especies es epidermis, corteza, un anillo concéntrico de haces vasculares separados entre sí por haces medulares parenquima-
tosos y médula. Según la especie, en la epidermis puede haber estomas o tricomas, o ambas estructuras. La corteza de algunas
especies puede incluir una hipodermis o una endodermis, o ambas. En muchas monocotiledóneas, la disposición de los haces
vasculares no es concéntrica, sino que los haces están esparcidos a través de toda una masa de tejido parenquimatoso en la
parte interior de la epidermis. Debido a esta disposición, no se puede distinguir la corteza, los haces medulares, ni la médula.
En los tallos de plantas leñosas que presentan crecimiento secundario, es habitual que la epidermis se desprenda y se reempla-
ce con un peridermo que consta de súber, felógeno y felodermo. Algunas especies se caracterizan por presentar múltiples peri-
dermos (ritidoma). En el peridermo puede haber lenticelas y sus atributos pueden servir como características diagnósticas. Por
debajo del peridermo están los restos de la corteza, el floema primario, el floema secundario, el cámbium vascular, el xilema
secundario, el xilema primario y la médula. También hay haces medulares. Igual que en la raíz, el tipo y la disposición de las
células conductoras principales de los tejidos vasculares, la presencia, el tipo y la disposición de fibras, esclereidas y otros teji-
dos, y la presencia y ubicación de material ergástico, también pueden ser características diagnósticas. Los rizomas pueden te-
ner algunas características morfológicas similares a las de las raíces y por lo tanto se pueden confundir con raíces. Sin embargo,
los rizomas se pueden identificar correctamente como tallos porque tienen nodos e internodos evidentes.

HOJAS

Algunas características macroscópicas de las hojas que pueden permitir el diagnóstico de la especie comprenden los atribu-
tos de las láminas foliares, el pecíolo, las estípulas y la filotaxia. El tejido más externo de la lámina foliar es la epidermis, seguida
por los tejidos mesófilo y vascular. Entre las características diagnósticas microscópicas de las células epidérmicas están el grosor
y las marcas de la cutícula, la forma y disposición de los estomas y las células guardianas, la disposición y tamaño de células
subsidiarias, el número de estomas (número de estomas por unidad de superficie) y el índice estomático (número de estomas
por número de unidades de células epidérmicas). Otras características útiles en la identificación de material foliar consisten en
los tipos y la disposición de los tricomas (pelos de los vegetales) presentes; el tipo y la disposición de los tejidos mesófilo y
vascular; la relación de mesófilo en empalizada; la presencia y el aspecto de tejidos accesorios tales como vainas de haces pa-
renquimatosos o esclerenquimatosos, mesófilo paraveinal, endodermis y tejido de transfusión; el tipo y la disposición de las
células conductoras principales de los tejidos vasculares, la presencia, el tipo y la disposición de fibras, esclereidas y otros teji-
dos; y la presencia, la ubicación y el aspecto físico del material ergástico.

FLORES

Las flores son las mejores características morfológicas diagnósticas de cualquier planta floral y la estructura floral es el criterio
principal que se usa en taxonomía vegetal. Las características diagnósticas de las flores comprenden el tipo de inflorescencia; la
presencia, el número y el aspecto de las partes florales principales (sépalos, pétalos, estambres y carpelos); el tipo de simetría
que presentan las partes florales; la posición relativa de los ovarios con respecto a las demás partes de la flor; el número de
óvulos por ovario; el tipo de placentación del ovario; el aspecto físico de los granos de polen; la presencia de nectarios, la pre-
sencia de recubrimientos o tricomas glandulares; y características físicas de estructuras accesorias, como el receptáculo y las
brácteas. Las características histológicas y la presencia de materiales ergásticos en los tejidos de las partes florales permiten
también el diagnóstico de la especie.

FRUTOS

La identificación de la especie vegetal a partir de la que se obtiene un fruto se puede determinar mediante la observación de
varios criterios macroscópicos. Estos criterios comprenden el número de pistilos que tiene el fruto; el número de carpelos den-
tro de cada pistilo; el número de semillas dentro de cada carpelo, la placentación del fruto; y si el fruto es dehiscente, indehis-
cente o carnoso. Algunas otras características diagnósticas son las referentes al número de suturas en un fruto dehiscente, la
determinación de si las semillas están unidas o no a la pared del pericarpio, las características físicas de las tres capas del peri-
carpio de los frutos carnosos (epicarpio, mesocarpio y endocarpio) y la presencia y el aspecto físico de tejidos accesorios como
el receptáculo y las brácteas. Las características histológicas de los tejidos del fruto pueden ayudar a la identificación. Las carac-
terísticas de las semillas dentro del fruto también son caracteres distintivos que permiten diagnosticar la especie.
476 (563) Identificación de Artículos de Origen Botánico/ Pruebas Químicas USP 40

SEMILLAS

Las características macroscópicas de las semillas que se utilizan en la identificación comprenden la forma y el tamaño de la
semilla; el aspecto de la superficie del recubrimiento de la semilla; la posición del hilio y del micrópilo; y la presencia de estruc-
turas accesorias del recubrimiento de la semilla, tales como los arilos, carúncula, o cuerpos oleosos. Las características físicas del
embrión, tales como su tamaño, forma, posición y el número y aspecto de los cotiledones, al igual que la presencia y el aspec-
to de tejidos nutritivos accesorios como los restos de un megagametofito (en Gimnospermas), perisperma (nucela) o endos-
perma, permiten también diagnosticar la especie. Las características histológicas del recubrimiento de la semilla y otras estruc-
turas y tejidos de la semilla también se pueden utilizar para identificar la especie.

Microtécnica

El análisis histológico de muestras botánicas se puede realizar en material vegetal entero o pulverizado. Puede ser necesario
el empleo de tinciones citológicas u otros reactivos para visualizar determinadas características histológicas. Se pueden emplear
polarizadores cruzados para detectar estructuras que rotan la luz polarizada plana. Estas estructuras comprenden granos de
almidón, cristales de oxalato de calcio, algunas fibras y granos de arena (presentes como un contaminante) que se pueden
observar como objetos brillantes contra un fondo oscuro. Generalmente se coloca un polarizador en el condensador o la fuen-
te de iluminación y el segundo polarizador se coloca en el ocular. La luz que entra al portaobjetos desde abajo es polarizada
plana, lo que permite que pasen solamente algunas ondas luminosas en un plano específico. El campo se torna brillante cuan-
do los dos polarizadores se alinean y cuando los dos polarizadores están cruzados, el campo se oscurece.

PROCEDIMIENTO PARA MONTAJES TEMPORALES Y MATERIAL PULVERIZADO

Procedimiento general: Las muestras vegetales se observan bajo el microscopio mediante el empleo de diferentes me-
dios de montaje, tinciones u otras soluciones que ayudan a la correcta identificación del artículo de prueba. Si se dispone de
un Material de Referencia Autenticado USP, se debe preparar con los mismos medios de montaje o soluciones reactivo utiliza-
dos para el artículo de prueba. Colocar 1 ó 2 gotas de agua, Solución de alcohol-glicerina, Solución de hidrato de cloral, u otra
solución reactivo en el centro de un portaobjetos limpio (ver Preparación y uso de soluciones reactivo, dispositivos ópticos y me-
dios de montaje). Transferir una pequeña sección de tejido vegetal o una porción de polvo de la planta al medio de montaje o
solución reactivo y cubrirla con un cubreobjetos limpio. (Para obtener más información sobre técnicas de preparación específi-
cas, ver Preparación de montajes temporales y cortes manuales, Maceración o Preparación de material pulverizado, según corres-
ponda). Para evitar la formación de burbujas de aire, el cubreobjetos se debe colocar cuidadosamente en un ángulo adecuado,
de tal manera que su borde entre primero en contacto con el portaobjetos y luego presionar hasta que cubra la muestra. Elimi-
nar el exceso de líquido del extremo del cubreobjetos con un trozo de papel de filtro. Las burbujas de aire se pueden eliminar
colocando el portaobjetos en un desecador de vacío. Cuando se emplea hidrato de cloral, las burbujas de aire se pueden elimi-
nar calentando la muestra a ebullición suave sobre una llama pequeña, como la de una lámpara de alcohol. Para reemplazar el
medio de montaje o solución reactivo, colocar gotas del nuevo medio de montaje o solución reactivo en un borde del cu-
breobjetos. Colocar una tira de papel de filtro en el extremo opuesto del cubreobjetos para eliminar el medio de montaje o
solución reactivo anterior y hacer que el nuevo medio de montaje o solución reactivo corra sobre el tejido o material pulveriza-
do. Los aceites vegetales también pueden ser arrastrados del tejido de esta manera, lavando el portaobjetos con éter de petró-
leo o acetona seguido luego por agua, y si fuera necesario, por Solución de hidrato de cloral. No usar Solución de hidrato de
cloral inmediatamente después de tratar el tejido vegetal con disolventes inflamables sin haber lavado minuciosamente el teji-
do con agua. De este modo se evita que el disolvente residual se inflame cuando el portaobjetos se coloque sobre una llama
pequeña para calentar el tejido a ebullición. Se debe tener cuidado al usar soluciones reactivo que sean volátiles o corrosivas
para el microscopio. Para evitar que las soluciones acuosas o de hidrato de cloral se sequen durante la observación, agregar al
portaobjetos una pequeña gota de glicerina. Observar la muestra montada bajo un microscopio óptico (ver Microscopía Óptica
(776)) y examinar las características histológicas.
Preparación y uso de soluciones reactivo, dispositivos ópticos y medios de montaje: Los siguientes reactivos, dispositi-
vos ópticos y medios de montaje se emplean en la identificación de células, tejidos, características estructurales y sustancias
ergásticas en el tejido o material pulverizado (ver la Tabla 1 y la Tabla 2).
Tabla 1. Uso de Soluciones Reactivo y Dispositivos Ópticos
Soluciones Reactivo y
Detección Dispositivos Ópticos
Concreción de Carbonato de calcio Ácido acético diluido
Cristales de oxalato de calcio Polarizadores cruzados
Solución de carmín-alumbre-verde de metilo
Ácido yodhídrico
Celulosa Solución de yodo-cloruro de cinc
Citoplasma Solución de ácido pícrico alcohólico
1,8-Dihidroxiantraquinonas Solución de hidróxido de potasio 1 M
USP 40 Pruebas Químicas/ (563) Identificación de Artículos de Origen Botánico 477

Tabla 1. Uso de Soluciones Reactivo y Dispositivos Ópticos (Continuación)

Soluciones Reactivo y
Detección Dispositivos Ópticos
Solución de tetróxido de osmio
Aceites esenciales Solución de sudán 111
lnulina Solución de nafto/-ácido sulfúrico
Solución de carmín-alumbre-verde de metilo
Solución de f/oroglucinol-ácido clorhídrico
Lignina Reactivo universal
Solución de carmín-alumbre-verde de metilo
Solución de tetróxido de osmio
Solución de sudán 111
Lípidos (cutina, ceras y suberina incluidas) Reactivo universal
Solución de rojo de rutenio
Solución de tionina
Pectina y mucílago Solución de azul de toluidina
Fitoglicógeno Solución de rojo de rutenio
Solución de ácido pícrico alcohólico
Cuerpos proteicos Solución de tetróxido de osmio
Mezcla de sangre-gelatina
Solución de yodo-glicerina
Saponina (confirmar mediante prueba con Mezcla de sangre-gelatina)
Po/arizadores cruzados
Solución de yodo
Almidón Reactivo universa/
Solución de cloruro férrico
Taninos y otros polifenoles Solución de tetróxido de osmio

Tabla 2. Agentes Blanqueadores y Clarlficantes y Medios de Montaje

Usar Medios de Montaje y Agentes
Agentes Blanqueadores Solución de hipoclorito de sodio
Solución de hidrato de cloral
Solución de lactocloral
Agentes Clarificantes Solución de lactofenol
Glicerina
Solución de glicerina-alcohol
Mezcla de glicerina-gelatina
Medios de Montaje Agua

Solución de ácido pícrico alcohólico-Preparar una solución de ácido pícrico al 1% en alcohol. El ácido pícrico es útil para
teñir células que tienen un citoplasma denso, como las células de aleurona en semillas. Colocar una pequeña cantidad del ma-
terial vegetal pulverizado en un tubo de ensayo y agitarla con aproximadamente 1 mL de éter de petróleo para eliminar acei-
tes vegetales que interferirían con la reacción. Centrifugar y desechar el éter de petróleo. Empapar el polvo vegetal en Solución
de ácido pícrico alcohólico durante aproximadamente 30 minutos. Transferir una porción del polvo a un portaobjetos y observar
al microscopio. El citoplasma y los cuerpos proteicos se tornan de un color amarillo brillante. [PRECAUCIÓN-El ácido pícrico es
explosivo cuando se seca. Manipular de manera adecuada.]
Mezcla de sangre-gelatina-Agregar 4,5 g de gelatina en polvo a 100 mL de una solución de cloruro de sodio al 0,9% y
dejar hinchar durante 30 minutos. Calentar el gel mezclándolo hasta aproximadamente 80º, en un baño de agua. Enfriar a 40º
y agregar 6 mL de sangre bovina desfibrinada. Calentar a 45º-50º y verter sobre un portaobjetos para microscopio en una
capa delgada de aproximadamente 1 mm manteniendo el portaobjetos en posición horizontal. Para evitar pérdidas de la
mezcla de sangre-gelatina por los lados del portaobjetos, sellar los bordes con cinta adhesiva de 1 cm de ancho para formar
una bandeja. Después de enfriarse y solidificarse, la mezcla está lista para usar. [NOTA-Almacenar en una cámara húmeda du-
rante no más de 1-2 días, a 3º--4º.] Para realizar la prueba de saponinas, colocar grupos pequeños del material vegetal en pol-
vo sobre la capa de sangre-gelatina, dejando una separación de algunos mm entre ellos, transferir a un humidificador durante
algunas horas y observar. Las partículas que contengan saponinas originarán zonas claras transparentes en la sangre-gelatina.
Solución de carmín-alumbre-verde de metilo-Calentar a ebullición 1,5 g de carmín durante 30 minutos en una solución de
sulfato de potasio y aluminio al 15%. Enfriar, filtrar y agregar mezclando 1O mL de una solución de verde de metilo al 0,75%.
Agregar de 1-2 gotas al material vegetal. La lignina y la suberina se tornan de color verde y la celulosa se torna de color violeta
rojizo.
Solución de hidrato de cloral-Usar hidrato de cloral SR. Cuando se use la solución como agente clarificante, agregar algunas
gotas al material vegetal y calentar a ebullición brevemente sobre una llama pequeña. El hidrato de cloral disuelve el contenido
celular y las sustancias intercelulares, y permite observar fácilmente las paredes y las formas celulares. Se puede utilizar para
478 (563) Identificación de Artículos de Origen Botánico/ Pruebas Químicas USP 40

ayudar a la identificación de súber, fibras, vasos, cristales de oxalato de calcio (con ayuda de polarizadores cruzados), tricomas,
estomas y polen.
Polarizadores cruzados-Este dispositivo óptico se emplea para detectar cristales de oxalato de calcio y granos de almidón
(amiloplastos). Bajo la luz polarizada, los cristales de oxalato de calcio y los granos de almidón aparecen como objetos brillan-
tes, birrefringentes, sobre un fondo oscuro. Los granos de almidón observados bajo la luz polarizada también presentan el
efecto de la cruz de Malta, cuyos brazos se cruzan en el hilio. En general, los cristales de oxalato de calcio se ven mejor des-
pués de clarificar la muestra con Solución de hidrato de cloral u otro agente clarificante.
Ácido acético diluido-Agregar de 1-2 gotas al material vegetal y observar inmediatamente al microscopio. Los depósitos de
carbonato de calcio se disuelven con efervescencia.
Solución de cloruro férrico-Diluir 1 mL de cloruro férrico SR con 9 mL de agua. Para la detección de grupos hidroxilo fenóli-
cos, como taninos y flavonoides, agregar la solución a la muestra acuosa desde la parte lateral del cubreobjetos. Los taninos y
otros polifenoles se tornan de color de negro azulado a verde.
Glicerina-Usar como medio de montaje para evitar que las soluciones acuosas y de hidrato de cloral se sequen.
Solución de glicerina-alcohol-Mezclar volúmenes iguales de glicerina y alcohol. Usar como medio de montaje.
Mezcla de glicerina-gelatina-Agregar 10,0 g de gelatina en polvo a 60 mL de agua. Dejar en reposo durante 2 horas y
agregar 70 mL de glicerina que contenga 1,5 g de fenol disuelto. Calentar en un baño de agua y filtrar a través de un embudo
precalentado que contenga lana de vidrio. La mezcla filtrada se licúa antes de usar y sirve como medio de montaje. Agregar
algunas gotas al material vegetal pulverizado o cortado y cubrir con un cubreobjetos calentado. Esta preparación se utiliza para
el almacenamiento a largo plazo de montajes de muestras. Los extremos del cubreobjetos se pueden sellar con bálsamo de
Canadá después de algunos meses de secado.
Ácido yodhídrico-Agregar de 1-2 gotas al material vegetal. Las paredes celulares de celulosa se tornan de color azul a viole-
ta azulado.
Solución de yodo-Agregar de 1-2 gotas de yodo O, l N SV al material vegetal. Las partículas de almidón se tornan de color
azul oscuro a violeta azulado; esta reacción es reversible si se calienta. [NOTA-Las proteínas, los lípidos y la celulosa se tornan
de amarillo a marrón. Las partículas de polvo de guayaco se tornan de verde a azul, pero este reactivo no se usa para la identi-
ficación diagnóstica de estas características.]
Solución de yodo-glicerina-Disolver 0,3 g de yodo y 1,0 g de yoduro de potasio en una pequeña cantidad de agua y agre-
gar 1 O mL de una mezcla de glicerina y agua (1 :1 ). Agregar 1-2 gotas al material vegetal en polvo. Las muestras que contie-
nen saponinas forman grumos o agregados de color amarillo. Si la prueba de una muestra diera un resultado positivo para
saponina, el resultado se debe confirmar realizando también una prueba a la muestra con la Mezcla de sangre-gelatina.
Solución de lactocloral-Disolver 50,0 g de hidrato de cloral en 50 mL de ácido láctico, calentando suavemente. Agregar
algunas gotas al material vegetal. Si fuera necesario, colocar el portaobjetos del microscopio en un pequeño desecador al vacío
para eliminar las burbujas de aire. La Solución de hidrato de cloral y la Solución de lactocloral se usan para el mismo tipo de iden-
tificación, excepto que la Solución de lactocloral es un agente clarificante más fuerte y se usa para el material vegetal que es
más difícil de clarificar.
Solución de lactofenol-Mezclar 20 g de ácido láctico, 40 g de glicerina y 20 mL de agua. Agregar 20 g de fenol y mezclar.
Éste es un agente clarificante fuerte adecuado para el examen de granos de polen.
Solución de naftol-ácido sulfúrico-Preparar una solución al 20% de 1-naftol en alcohol. Agregar al material vegetal 1 gota de
solución de 1-naftol y 1 gota de ácido sulfúrico. Los cristales de inulina se tornan de color rojo amarronado y luego se disuel-
ven.
Solución de tetróxido de osmio-Disolver O, l g de tetróxido de osmio en 5 mL de agua destilada. Agregar 1-2 gotas de la
solución así obtenida al material vegetal. Los aceites esenciales, los aceites grasos y otros lípidos, los taninos y los cuerpos pro-
teicos se tornan de color marrón a negro.
Solución de floroglucinol-ácido clorhídrico-Esta solución se utiliza para la identificación de la lignina y otros derivados de hi-
droxifenilpropano; tejidos lignificados como esclereidas, vasos, fibras y células pétreas; y parénquima lignificado. Humedecer el
polvo o la muestra cortada con floroglucinol SR y dejar que se seque durante 2-3 minutos antes de colocar el cubreobjetos.
Agregar algunas gotas de solución de ácido clorhídrico al 25% y cubrir con el cubreobjetos. Las paredes de las células lignifica-
das se tornan de color rojo carmín. [NOTA-Este colorante no es estable.] Las células que presentan derivados de hidroxifenil-
propano, como vainillina y ácido ferúlico, también se tornan de color rojo. Alternativamente, los derivados del hidroxifenilpro-
pano se pueden extraer del material vegetal y luego éste puede ser examinado. Para extraer los derivados del hidroxifenilpro-
pano, sumergir repetidamente en alcohol el material sin tratar, mezclar en un mezclador de vórtice, centrifugar y desechar el
alcohol entre los lavados. A continuación tratar el material vegetal según la especificación provista anteriormente, comenzando
con el agregado de floroglucinol SR.
Solución de hidróxido de potasio 7 M-Agregar 1 gota al material vegetal. Las células que contienen 1,8-dihidroxiantraquino-
nas se tiñen de rojo.
Solución de rojo de rutenio-Agregar algunas gotas de hidróxido de amonio a rojo de rutenio SR. [NOTA-Almacenar esta
solución protegiéndola de la luz.] Agregar 1-2 gotas al material vegetal. Las membranas celulares que contienen pectina, el
mucílago ácido y el fitoglicógeno se tornan de color rojo.
Solución de hipoclorito de sodio-Esta solución se usa para blanquear cortes con una coloración intensa. Sumergir el material
vegetal en la solución durante algunos minutos hasta que esté suficientemente blanqueado. Lavar el tejido con agua y montar
USP 40 Pruebas Químicas/ (563) Identificación de Artículos de Origen Botánico 479

con un agente de montaje adecuado. [NOTA-El hipoclorito de sodio extraerá la lignina; el tejido vegetal tratado de esta ma-
nera dará un resultado negativo para lignina.]
Solución de sudán ///-Disolver 0,5 g de sudán 111 en 50 mL de alcohol o alcohol isopropílico con ebullición a reflujo. Enfriar,
filtrar y agregar 50 mL de glicerina. Agregar de 1-2 gotas de esta solución al polvo vegetal. Los aceites esenciales, las ceras, la
cutina, la suberina, los aceites grasos y otros lípidos se combinan con este colorante lipofílico y se tornan de un color rojo ana-
ranjado a un color rojo después de un período corto.
Solución de tionina-Preparar una solución de acetato de tionina al 0,2% en alcohol al 25%. Sumergir la muestra seca en
esta solución. Después de aproximadamente 15 minutos, lavar el exceso de colorante con alcohol al 25%. El mucílago se ha-
brá hinchado formando glóbulos esféricos y se habrá tornado de color violeta rojizo, mientras que la celulosa, la pectina y los
tabiques lignificados se tornarán de color azul o violeta azulado.
Solución de azul de toluidina-Utilizando azul de toluidina, proceder según se indica en Solución de tionina.
Reactivo universal
SOLUCIÓN A: Diluir 20 mL de una solución de sudán 111 saturada con ácido láctico con 30 mL de ácido láctico.
SOLUCIÓN B: Disolver 0,55 g de sulfato de anilina en 35 mL de agua.
SOLUCIÓN C: Disolver 0,55 g de yoduro de potasio y 0,05 g de yodo en 5 mL de agua y agregar 5 mL de alcohol.
PROCEDIMIENTO: Combinar la Solución A, la Solución By la Solución C y agregar mezclando 2,5 mL de ácido clorhídrico.
[NOTA-La solución se usa sin filtrar.] Para identificación, agregar 2-3 gotas a la muestra y calentar a ebullición suave sobre una
llama pequeña. Si fuera necesario, se pueden agregar cantidades pequeñas de Reactivo universal durante la ebullición. Cubrir
con el cubreobjetos. Los elementos lignificados se tornan de color amarillo, la suberina de color marrón rojizo, los lípidos de
color rojo y el almidón de color violeta azulado.
Agua-Usar como medio de montaje. [NOTA-Todos los grados de agua son aceptables para este propósito.]
Solución de cloruro de cinc-yodo-Disolver 20,0 g de cloruro de cinc y 6,5 g de yoduro de potasio en 10,5 mL de agua.
Agregar 0,5 g de yodo O, l N SV y agitar durante 15 minutos. Filtrar si fuera necesario. Almacenar en recipientes de vidrio con
protección actínica. Agregar 1-2 gotas al material vegetal y dejar en reposo durante algunos minutos. Las paredes celulares de
celulosa se tiñen de color azul a violeta azulado.
Preparación de montajes temporales y cortes manuales: Cuando se use tejido vegetal seco, empapar o calentar a ebu-
llición suave en agua hasta que se ablande. No dejar que se ablande demasiado. El material se puede tratar entonces como
material vegetal fresco. Cuando corresponda, usar los medios de montaje o soluciones reactivo indicadas para usar con plantas
en polvo para ayudar a visualizar las características del tejido (ver Preparación y uso de soluciones reactivo, dispositivos ópticos y
medios de montaje).
Para sacar una película epidérmica de la hoja, pétalo, sépalo, bráctea u otro apéndice similar a la hoja, enrollar el tejido for-
mando un cilindro y hacer una muesca con una cuchilla afilada, revestida de teflón, que haya sido humedecida con agua. Con
una pinza tomar el trozo de tejido cortado y tirando hacia atrás, remover un corte transparente de la epidermis. Montar en
agua sobre un portaobjetos, colocar un cubreobjetos sobre el tejido, y examinarlo al microscopio
Si resulta difícil obtener una película epidérmica mediante el procedimiento anterior, proceder del siguiente modo. Empapar
el tejido en una solución de ácido nítrico al 40%- 60%, a 60º durante 3-4 minutos, o hasta que la epidermis se pueda pelar
con facilidad. La película epidérmica después se lava en agua de 3-5 veces para eliminar el exceso de ácido nítrico. Neutralizar
el tejido en una solución de hidróxido de potasio al 1% o una solución de hidróxido de sodio al 1%. Lavar nuevamente el
tejido con agua, montar en agua sobre un portaobjetos, colocar un cubreobjetos sobre el tejido, y examinarlo al microscopio.
Un método alternativo para preparar tejido foliar para el examen de la epidermis es calentar un fragmento de la hoja (apro-
ximadamente 5 mm x 5 mm) durante 15 minutos en Solución de hidrato de cloral en un baño de agua. Transferir el tejido a un
portaobjetos, agregar una gota de agua y cubrirlo con un cubreobjetos. Se pueden emplear estos procedimientos para deter-
minar el tipo, la distribución y el número de estomas, al igual que el índice estomático.
El número de estomas se determina contando el número de estomas por unidad de superficie de un campo microscópico.
Determinar el número de estomas en al menos 1O sitios diferentes de la muestra y calcular el valor medio. Registrar la superfi-
cie foliar que se está observando, si es abaxial o adaxial, ya que con frecuencia el número de estomas de las distintas superfi-
cies es muy diferente.
Para calcular el índice estomático, la muestra se observa al microscopio con poco aumento. El tamaño de la superficie se
define con un micrómetro ocular calibrado y se determina el número de estomas y el número de células epidérmicas para esa
superficie. El índice estomático se calcula:

Resultado = (100 x S)/(E + S)

S = número de estomas para una superficie determinada
E= número de células epidérmicas de la misma superficie
Determinar el índice estomático en al menos 1 O sitios diferentes de la muestra y calcular el valor medio. Nuevamente regis-
trar la superficie foliar que se está observando, si es abaxial o adaxial, ya que con frecuencia los índices estomáticos de las dis-
tintas superficies son muy diferentes
Para hacer un corte transversal de una hoja o raíces delgadas, tallos u otros apéndices delgados, poner el apéndice que se va
a cortar sobre un portaobjetos. Colocar otro portaobjetos sobre el apéndice con una porción del tejido expuesto. Con una
cuchilla afilada, revestida de teflón, humedecida, cortar derecho hacia abajo a lo largo del borde del portaobjetos superior. Sin
mover el portaobjetos superior, cortar de nuevo hacia abajo colocando la cuchilla en ángulo. Se puede necesitar cierta práctica
480 (563) Identificación de Artículos de Origen Botánico/ Pruebas Químicas USP 40

para poder obtener cortes lo suficientemente delgados, de modo que cuando se monten y se cubran con un cubreobjetos,
estos cortes se puedan utilizar para determinar la organización del tejido (por ejemplo, el número de capas en empalizada en
la hoja, el grosor de la cutícula, los tipos de tricomas, los tipos de haces vasculares y otros similares). Debido a que las cuchillas
se desafilan rápidamente, se deben reemplazar con frecuencia.
Usar el corte transversal del tejido foliar así obtenido para determinar la relación de mesófilo en empalizada. Alternativamen-
te, calentar a ebullición fragmentos de hoja de aproximadamente 2 mm 2 en Solución de hidrato de cloral, montar, cubrir con un
cubreobjetos y observar al microscopio. Identificar grupos de cuatro células epidérmicas adaxiales y contar las células de mesó-
filo en empalizada que se extiendan por debajo y estén cubiertas al menos en el 50% por las células epidérmicas. Este valor
dividido entre 4 es la relación de mesófilo en empalizada. Determinar la relación de mesófilo en empalizada de al menos
1O grupos de células epidérmicas y calcular el valor medio. La relación de mesófilo en empalizada también se puede determi-
nar en material foliar en polvo.
Para hacer un corte transversal de tallos o raíces gruesas, u otras partes de la planta, incluidos los tejidos leñosos, sostener el
tejido con una mano y utilizando una cuchilla afilada revestida de teflón, previamente humedecida con agua, rebanar un corte
transversal del apéndice. Montar en agua, otro medio o solución reactivo, colocar un cubreobjetos sobre el material y exami-
nar al microscopio. En general, con un poco de práctica se pueden hacer cortes que sean lo suficientemente delgados como
para determinar la organización del tejido vascular, el tipo de rayos, la distribución del parénquima, la presencia de cristales y
similares.
Maceración: Para la adecuada identificación del material vegetal, algunas veces es necesario macerar el tejido en sus célu-
las individuales antes del examen microscópico. Esta técnica puede ser particularmente útil para tejidos leñosos u otros tejidos
duros. El material se corta en pequeños trozos de aproximadamente 2 mm de grosor y 5 mm de largo o se rebana en trozos
de aproximadamente 1 mm de grosor. Según la naturaleza de la pared celular, se emplea uno de los métodos siguientes. Para
tejidos duros o muy lignificados, usar el Método l. Para tejidos que no están muy lignificados, usar el Método//.
Método I
SOLUCIÓN A: Usar solución de ácido nítrico 4 N.
SOLUCIÓN B: Preparar una mezcla de solución de trióxido de cromo 1,2 M y ácido sulfúrico (7:4).
PROCEDIMIENTO: Colocar el material vegetal en un tubo de ensayo que contenga aproximadamente 5 mL de una mezcla de
la Solución A y de la Solución B (1 :1 ). Calentar en un baño de agua durante 20 minutos. Lavar varias veces el tejido con agua y
transferir a un portaobjetos. Desmenuzar el tejido con una aguja de disección, agregar 1-2 gotas de medio de montaje, cubrir
con un cubreobjetos y examinar al microscopio. Si fuera necesario, las células se pueden separar más entre sí al presionar el
cubreobjetos con un movimiento suave y deslizante. El tejido macerado dará un resultado negativo en la prueba para lignina.
Método 11
PROCEDIMIENTO: Colocar el material vegetal en un tubo de ensayo que contenga aproximadamente 5 mL de una solución
de hidróxido de potasio 2 M. Calentar en un baño de agua durante 30 minutos. Lavar varias veces el tejido con agua y transfe-
rir a un portaobjetos. Agregar 1-2 gotas de medio de montaje. Colocar un cubreobjetos sobre el tejido, presionar hacia abajo,
aplastando el tejido y examinar al microscopio. El tejido macerado dará un resultado negativo en la prueba para lignina.
Preparación de materiales en polvo: Colocar 1 ó 2 gotas de agua, otro medio de montaje o una solución reactivo en el
centro de un portaobjetos limpio. Humedecer la punta de una aguja de disección con agua y sumergir en el polvo en análisis.
Transferir una pequeña cantidad de material que se adhiera a la aguja al líquido en el portaobjetos y mezclar minuciosamente
y con cuidado. Cubrir con un cubreobjetos limpio. Debido a que se ha destruido la organización de las estructuras del tejido
dentro del tejido vegetal, las características importantes a observar del material vegetal en polvo son las características físicas y
químicas de los tejidos y los tipos celulares, al igual que la presencia y las características químicas y físicas de sustancias ergásti-
cas. Los tejidos, células y sustancias ergásticas específicas que se van a examinar se especifican en la monografía individual.

PROCEDIMIENTO PARA MONTAJES PERMANENTES DELGADOS

Cuando sea necesario revelar características histológicas detalladas de una muestra vegetal, se deben obtener cortes delga-
dos del tejido. Los cortes deben ser lo suficientemente delgados para transmitir luz y se deben cortar en un plano que permita
exponer las características deseadas. El material vegetal se mata, fija y deshidrata en forma adecuada y se incluye en parafina u
otro medio de inclusión. El medio de inclusión se usa como una matriz de soporte sólido durante el corte del tejido. Después
de efectuar el corte y el montaje, frecuentemente se realiza la tinción de la muestra para ayudar a la diferenciación de determi-
nadas estructuras.[NOTA-EI proceso de fijación, deshidratación, inclusión y tinción se puede acelerar significativamente si se
utiliza un horno de microondas diseñado específicamente para trabajo histológico.]
Muerte y fijación: El primer paso en la preparación de material vegetal para corte es matar las células vivas y conservar el
tejido. Con mucha frecuencia, esto se hace mediante el empleo de un fijador químico. Un buen fijador de uso general para
material vegetal es una mezcla de formaldehído, ácido acético y alcohol (FAA).
Solución FAA-Mezclar 50 mL de alcohol, 5 mL de ácido acético glacial, 1O mL de solución de formaldehído y 35 mL de
agua. [NOTA-Preparar periódicamente una solución nueva, ya que con el almacenamiento pierde su eficacia.]
Procedimiento-Sumergir completamente el material vegetal en la Solución FAA. Dejar el material sumergido durante 18-24
horas a temperatura ambiente. El material vegetal se puede conservar indefinidamente en Solución FAA, siempre que el mismo
permanezca completamente sumergido y no se deje secar. Determinados tejidos pueden requerir infiltración al vacío para faci-
litar la penetración del fijador. La infiltración al vacío es necesaria si el tejido tuviera abundantes espacios de aire o pelos epidér-
USP 40 Pruebas Químicas/ (563) Identificación de Artículos de Origen Botánico 481

micos, o si flotara en la superficie de la solución de fijación. Colocar el tejido en un vial pequeño que contenga el fijador. Colo-
car el vial sin tapar en una campana de cristal o desecador que esté conectado a una fuente de vacío, preferentemente una
bomba de vacío con sello de aceite. Conectar la salida del sistema de vacío a una campana de extracción para evitar que los
vapores de fijación llenen la habitación. Encender lentamente el vacío. No usar un vacío fuerte porque el fijador puede comen-
zar a hervir y dañar el tejido. A medida que el aire residual es extraído del tejido, éste subirá a la superficie. Encender y apagar
durante varios ciclos de vacío hasta que el tejido quede en el fondo del recipiente durante un ciclo "encendido".
Deshidratación del tejido: La parafina y otros medios de inclusión son hidrófobos. Por lo tanto, se debe eliminar el agua
del tejido vegetal después de la fijación. Esto se lleva a cabo sumergiendo el tejido fijado en soluciones de deshidratación, sien-
do estas soluciones una serie de mezclas de alcohol y agua con concentraciones de alcohol en aumento. La solución final de la
serie es alcohol deshidratado. Comenzar lavando el tejido fijado una o dos veces con alcohol nuevo al 50% para eliminar trazas
de FAA. Eliminar esta solución y eliminar a continuación cualquier otra solución de deshidratación decantando la solución o
eliminándola con ayuda de una pipeta de vidrio. Agregar la primera solución de deshidratación (alcohol al 70%) al vial, sumer-
giendo el tejido completamente. La serie graduada alcohol-agua y los tiempos sugeridos para la inmersión del tejido se listan
en la Tabla 3.
Tabla 3
Solución de Deshidratación Tiempo (h)
Alcohol al 50% 1-2
Alcohol al 70% 1-2
Alcohol al 90% 1-2
Alcohol al 95% 1-2
Alcohol deshidratado con O, 1% de safranina O 2-4
Alcohol deshidratado 1

Se agrega safranina O a la penúltima solución de deshidratación de la serie para visualizar el tejido cuando ha quedado in-
cluido en parafina. Si el tejido que se va a cortar es duro o leñoso, es posible que el tiempo de cada uno de los pasos de la serie
se deba aumentar hasta 24 horas. Si fuera necesario, el tejido se puede almacenar durante varios días en alcohol al 70% o en
soluciones con concentraciones de alcohol aún más altas.
Inclusión
Preparación para inclusión
REMOCIÓN DE ALCOHOL: La parafina es el medio de inclusión más común, aunque se dispone de otros medios de inclusión.
Después de la deshidratación, el alcohol se elimina del tejido por medio de una serie graduada de soluciones de alcohol deshi-
dratado-xileno, debido a que la parafina no es soluble en alcohol. La serie graduada de alcohol deshidratado-xileno y los tiem-
pos sugeridos para la inmersión del tejido se listan en la Tabla 4.
Tabla 4
Solución de Remoción de Alcohol Tiempo (h)
Una mezcla de alcohol deshidratado y xileno (3:1) 1
Una mezcla de alcohol deshidratado y xileno (1 :1) 1
Una mezcla de alcohol deshidratado y xileno (1 :3) 1
Xileno 1
Xileno 1

REMOCIÓN DE XILENO: Una vez que el xileno haya reemplazado completamente al alcohol, agregar lentamente parafina pa-
ra infiltrar el tejido y eliminar el xileno. Proceder del siguiente modo:
1. Por cada mL de xileno, agregar aproximadamente 1 perla de parafina al vial del tejido, tapar y dejar en reposo a tempera-
tura ambiente durante 4 horas. Agregar más perlas de parafina hasta que no se disuelvan más perlas.
2. Colocar el tejido en un horno mantenido a 42º-45º. Agregar 2-3 perlas de parafina cada hora hasta que a esa temperatu-
ra no se disuelvan más perlas.
3. Verter un tercio del volumen y reemplazar con un volumen igual de parafina fundida. No tapar y transferir el vial a un
horno mantenido a 58º-60º.
4. Después que la parafina se vuelva a fundir (aproximadamente 4 horas más tarde), verter la mitad del volumen y reempla-
zar con un volumen igual de parafina fundida. Transferir el vial al horno mantenido a 58º-60º si la parafina comienza a
solidificarse.
5. Repetir el cuarto paso dos veces más, después verter todo el volumen de parafina-xileno. Reemplazar con parafina pura
fundida. Aproximadamente 4 horas más tarde, verter la parafina y reemplazarla con parafina pura fundida nueva. Volver a
verter y reemplazar 4 horas más tarde, y dejar en reposo durante toda la noche. [NOTA-Transferir el vial al horno mante-
nido a 58º-60º si la parafina comienza a solidificarse en algún momento.]
Procedimiento de inclusión-Verter el tejido con la parafina en un molde de inclusión. La parafina debe cubrir el tejido por
completo aproximadamente 3-5 mm. Colocar el molde de inclusión en una plataforma de calentamiento precalentada, dise-
ñada para trabajo histológico. Ajustar el tejido en el molde con la orientación adecuada para realizar el corte. Lentamente, en-
482 (563) Identificación de Artículos de Origen Botánico / Pruebas Químicas USP 40

friar la parafina deslizando el molde hacia abajo, hacia el lado frío de la plataforma, hasta que la parafina se solidifique. Sumer-
gir el bloque de parafina en agua helada para enfriarlo rápidamente y evitar que se formen cristales de parafina. Almacenar el
bloque de parafina a 4º.
Corte y montaje: Cortar el bloque de parafina en trozos, cada uno de los cuales debe contener una muestra de tejido.
Recortar el bloque de parafina lo más cerca posible de la masa de tejido, para formar un rectángulo o una forma casi trapezoi-
dal. Este recorte evitará problemas de corte debidos al exceso de parafina alrededor del tejido. Para hacer cortes transversales,
orientar el tejido en un ángulo recto respecto a un bloque de tejido de madera cuya superficie se haya empapado en parafina
fundida. Fijar el bloque de parafina a la superficie del bloque de tejido. Agregar una pequeña cantidad de parafina fundida a la
base del bloque de parafina para facilitar la formación de un sello más impermeable. Enfriar el bloque a 4º.
Montar y ajustar en forma apropiada el tejido y el bloque de parafina en un micrótomo. Usar una cuchilla de micrótomo de
acero inoxidable adecuadamente afilada. Ajustar el micrótomo para hacer cortes de 8-15 µm de grosor (1 O µm es el grosor
óptimo para la mayoría de los tejidos). Hacer cortes individuales o en serie. Preparar un portaobjetos para microscopio del si-
guiente modo. Se puede preparar un adhesivo en forma de solución con 1 % de gelatina y 0,5% de benzoato de sodio que se
calienta a 30º-35º para disolver la gelatina. Hacer un frotis de una película delgada del adhesivo así obtenido sobre el portaob-
jetos, dejar que se seque, enjuagar con una solución de formaldehído SR al 4% y agregar una pequeña cantidad de agua. Co-
locar al revés las secciones cortadas sobre el portaobjetos, de modo que floten en agua e inundar con una solución de formal-
dehído SR al 4%. Los cortes se extienden inmediatamente y desaparecen las arrugas.
Colocar el portaobjetos sobre una plataforma de calentamiento, mantenida a 42º, para que los cortes se expandan. Pipetear
y secar el exceso de agua y solución de formaldehído. Secar durante toda la noche en un horno a 42º para asegurar la adhe-
rencia del corte de tejido al portaobjetos.
Tinción
Preparación para tinción-Sumergir dos veces en xileno el portaobjetos con el tejido fijado, durante 10-15 minutos cada vez
para eliminar la parafina. Luego sumergir el portaobjetos en la siguiente secuencia de soluciones, dejándolo durante 5 minutos
en cada solución y teniendo cuidado de no sacar el tejido: una mezcla de alcohol deshidratado y xileno (1 :1 ), alcohol deshi-
dratado, alcohol y una solución de alcohol al 70%. El tejido se blanquea antes de la tinción si está opaco debido a la presencia
de taninos u otros materiales ergásticos. Para blanquear, sumergir el portaobjetos en una solución de permanganato de pota-
sio al 1 % durante 1 minuto, enjuagar con agua, sumergir en una solución de ácido oxálico al 5% durante 1 minuto y enjuagar
minuciosamente con agua. El material está ya listo para la tinción. Para la mayoría de los trabajos de identificación botánica se
recomienda usar uno de los dos procedimientos de tinción siguientes. El primer procedimiento de tinción emplea safranina O
contrastada con fast green. Un procedimiento alternativo emplea safranina O contrastada con anaranjado G.
Tinción de safranina 0-fast green
SOLUCIÓN DE TINCIÓN DE SAFRANINA O: Preparar una mezcla de metoxietanol, alcohol deshidratado, agua y solución de for-
maldehído (50:25:25:2). Agregar una cantidad suficiente de acetato de sodio para obtener una solución que contenga 1 % de
acetato de sodio y mezclar. Agregar una cantidad suficiente de safranina O para obtener una solución que contenga 1% de
safranina O y mezclar.
SOLUCIÓN DE TINCIÓN DE FAST GREEN: Preparar una mezcla de metoxietanol, alcohol deshidratado y salicilato de metilo
(1 :1 :1) que contenga 0,05% de fast green FCF.
PROCEDIMIENTO: Una vez que el tejido haya sido rehidratado con alcohol al 70% según se describe en Preparación para tin-
ción, sumergir durante 2-24 horas, dependiendo del tejido, en Solución de tinción de safranina O. Eliminar el exceso de coloran-
te sumergiendo varias veces el portaobjetos en agua. Transferir el portaobjetos a una solución de alcohol que contenga 0,5%
de ácido pícrico durante 2-1 O segundos para eliminar aún más el exceso de colorante del corte y ayudar a la diferenciación de
las estructuras del tejido. Para detener la acción del ácido pícrico, transferir el portaobjetos durante 1O segundos a 1 minuto a
una solución de alcohol que contenga 4 gotas de hidróxido de amonio por cada 100 mL de alcohol. Transferir el portaobjetos
al alcohol deshidratado durante 1O segundos. Inspeccionar visualmente al microscopio el tejido teñido para comprobar si es
necesaria una mayor decoloración con ácido pícrico. Contrastar durante 10-15 segundos en Solución de tinción de fast green.
Pasar el portaobjetos por dos cambios de una mezcla de salicilato de metilo, alcohol deshidratado y xileno (2:1 :1 ); cada cam-
bio dura 5-1 O segundos. Luego transferir el portaobjetos a una mezcla de xileno y alcohol deshidratado (95:5) durante 1 mi-
nuto. Pasar por dos cambios de xileno. Almacenar en xileno hasta que esté listo para montar el cubreobjetos. Los cromosomas,
los núcleos y las paredes celulares lignificadas, cutinizadas o suberizadas, se teñirán de color rojo. El citoplasma y las paredes
celulares de celulosa se teñirán de color verde a azul, dependiendo del pH del tejido.
Tinción de anaranjado G-safranina O
SOLUCIÓN DE TINCIÓN DE SAFRANINA O: Preparar una solución de safranina o al 0,004%.
SOLUCIÓN DE TINCIÓN DE ANARANJADO G: Disolver 2 g de anaranjado G, 5 g de ácido tánico y 4 gotas de ácido clorhídrico en
agua y diluir con agua hasta 100 mL.
PROCEDIMIENTO: Una vez que el tejido haya sido rehidratado con alcohol al 70%, según se describe en Preparación para
Tinción, transferir en forma secuencial el portaobjetos por la serie de soluciones en la Tabla 5.
Tabla 5
Solución Tiempo
Alcohol al 35% 5 min
Una solución filtrada de cloruro de cinc al 2% 1 min
USP 40 Pruebas Químicas/ (563) Identificación de Artículos de Origen Botánico 483

Tabla 5 (Continuación)
Solución Tiempo
Agua 5s
Solución de tinción de safranina O 5 min
Agua 5s
Solución de tinción de anaranjado G 1 min
Agua 5s
Una solución filtrada de ácido tánico al 5% 5 min
Agua 3s
Una solución de sulfato férrico amónico al 1% 2 min
Agua 15 s
Alcohol al 45% 1 os
Alcohol al 90% 10 s
Alcohol deshidratado 10 s
Una mezcla de alcohol deshidratado y xileno (1 :1) 1-2 min

Finalmente, almacenar en xileno hasta que esté listo para colocar el cubreobjetos. Las paredes celulares de celulosa se teñi-
rán de negro azulado, los núcleos de color amarillo, los granos de almidón de color negro y las paredes celulares lignificadas
de color rojo.
Montaje del cubreobjetos: El montaje del cubreobjetos sobre el tejido completa la preparación del portaobjetos. Como
adhesivo se puede usar bálsamo de Canadá, diluido con una pequeña porción de xileno. En el mercado existen otros medios
de montaje disponibles. Cuando se seca el medio de montaje, el portaobjetos puede examinarse al microscopio. Todo el pro-
ceso de preparación de extensiones permanentes sobre portaobjetos puede llevar 5 días o más.
Microscopía electrónica de barrido: Los productos botánicos comercializados por lo general se encuentran en forma de
polvo o en trozos, lo que dificulta y generalmente imposibilita la autenticación mediante un método rutinario de corte trans-
versal del artículo. Las estructuras tales como los vasos del xilema y las traqueidas se pueden partir en trozos más pequeños, lo
que dificulta y en ocasiones imposibilita la detección de puntuaciones y lignificaciones en las paredes usando un microscopio
óptico. Las estructuras que son resistentes a estos procesos son más útiles en la identificación. La microscopía electrónica de
barrido (SEM, por sus siglas en inglés) es útil para caracterizar el tamaño y la morfología de muestras microscópicas. Mediante
la SEM es posible observar e identificar las características diferenciales más detalladas en la estructura de los tricomas, elemen-
tos peculiares en la epidermis, junto con material granular superficial que contenga compuestos específicos, lo cual ayuda en la
identificación de especies particulares. La SEM se ha usado ampliamente para investigar la topología superficial de una extensa
variedad de materiales vegetales y puede desempeñar un papel vital en la autenticación de un producto botánico completo,
aquéllos en forma de polvo, distinguiendo entre especies estrechamente relacionadas, y se puede usar para examinar una
mezcla de polvos.
El capítulo general de USP Microscopía Electrónica de Barrido (1181) proporciona una introducción e información general
acerca de la SEM con respecto a su aplicación a artículos farmacopeicos.
La SEM produce una resolución más alta en comparación con la resolución obtenible usando un microscopio óptico y las
imágenes obtenidas son tridimensionales. La SEM tiene la ventaja de proporcionar imágenes con una gran profundidad de
campo, lo cual premite enfocar un espesor importante de la muestra de una sola vez. Asimismo, permite el análisis de mues-
tras de tamaños tan grandes como 50 mm, lo que permite producir micrografías electrónicas con los detalles topográficos de
un objeto claramente visibles para el ojo humano. La resolución máxima para la SEM (la distancia mínima por la cual se pue-
den separar y observar los dos objetos como objetos distintos) es de 10-20 nm en comparación con 200-300 nm para la mi-
croscopía óptica. El aumento típico de la SEM varía de xl O a x300 000. Los instrumentos comerciales SEM también están dis-
ponibles con aumentos tan bajos como x5 y tan altos como x2 000 000. En comparación, los microscopios ópticos modernos
típicos tienen un intervalo de aumento de xl O a x2000. A un aumento bajo, las imágenes obtenidas con la SEM proporcionan
más información que aquéllas obtenidas mediante microscopía óptica. La SEM puede producir imágenes cuyos constrastes se
basan en variaciones composicionales de las muestras.

IDENTIFICACIÓN QUÍMICA

Para tener la certeza de que se logra la autenticidad del artículo, se realiza la identificación química junto con la identifica-
ción botánica descrita anteriormente. La identificación química generalmente emplea procedimientos cromatográficos para
detectar la presencia de compuestos indicadores o marcadores especificados en la monografía individual. Se pueden emplear
perfiles espectroscópicos o cromatográficos para obtener la identificación química mediante la comparación de huellas dactila-
res o caracterizaciones con un estándar o muestra de referencia. Algunos ejemplos de métodos espectroscópicos son ultraviole-
ta (UV, por sus siglas en inglés), infrarrojo (IR) e IR por transformada de Fourier (ver Pruebas de Identificación Espectrofotométrica
(197)). Algunos ejemplos de métodos cromatográficos son cromatografía líquida de alta presión (HPLC, por sus siglas en in-
glés), cromatografía en capa delgada (TLC, por sus siglas en inglés), TLC bidimensional y cromatografía de gases (GC, por sus
484 (563) Identificación de Artículos de Origen Botánico / Pruebas Químicas USP 40

siglas en inglés) (ver Cromatografía (621 )). Los métodos analíticos utilizados para producir huellas dactilares deben ser capaces
de detectar tantos componentes químicos como sea posible. Puede resultar útil emplear huellas dactilares múltiples, tales co-
mo una combinación de métodos analíticos con principios de separación y condiciones de prueba diferentes. Además de los
métodos cromatográficos espectroscópicos, en la monografía individual también se pueden especificar métodos cualitativos de
química húmeda.

Quimiotaxonomía

La quimiotaxonomía es la clasificación de las plantas, basada en sus componentes químicos, y la misma puede resultar útil
para la identificación de artículos botánicos. Los compuestos metabólicos que se encuentran en los tejidos vegetales se pueden
dividir en dos amplias categorías, en base a sus funciones. La primera categoría comprende los metabolitos primarios-meta-
bolitos que participan en los procesos fisiológicos vegetales, que son absolutamente necesarios para la vida y están presentes
en todo el reino vegetal. Estos procesos comprenden la fotosíntesis, la respiración y el metabolismo de los ácidos nucleicos, las
proteínas, los carbohidratos y los lípidos. La segunda categoría comprende metabolitos secundarios-compuestos que no se
consideran absolutamente necesarios para los procesos vegetales, aunque pueden tener funciones importantes en las interac-
ciones de las plantas con otros organismos, como interacciones alelopáticas; en la defensa química contra herbívoros y patóge-
nos vegetales, y en las señales para atraer animales que polinizan y propagan las semillas. Se sabe que muchos metabolitos
secundarios tienen actividad farmacológica. También representan la base de la quimiotaxonomía vegetal. Los metabolitos se-
cundarios pertenecen a varias clases químicas diferentes, tales como aminoácidos no proteicos, flavonoides, xantonas, cumari-
nas, poliacetilenos, policétidos cíclicos, monoterpenos, sesquiterpenos, iridoides, triterpenos, esteroles, terpenos que contienen
nitrógeno y alcaloides. Estas clases químicas no se encuentran en todo el reino vegetal, sino que tienden a ser específicas para
determinadas clases, órdenes y familias botánicas. Por otra parte, muchas subclases químicas y compuestos secundarios parti-
culares son específicos para determinadas subfamilias, géneros o especies. Estas subclases químicas y compuestos particulares
son los que se pueden usar como compuestos marcadores para ayudar a la identificación adecuada del material vegetal.

Principios Activos y Compuestos Marcadores

Para la identificación química de artículos botánicos se preparan extractos. Dichos extractos son generalmente mezclas com-
plejas de varios componentes químicos. En la gran mayoría de los extractos botánicos no se conoce con certeza cuál de los
diferentes componentes es responsable del efecto farmacológico informado. En general, se cree que los distintos componentes
actúan en forma sinérgica para proporcionar el efecto informado. En el caso de artículos para los que existen monografías ofi-
ciales, se eligen determinados componentes químicos del artículo y se proporcionan procedimientos de pruebas cuantitativas
para determinar su contenido. La elección de dichos componentes, generalmente conocidos como compuestos marcadores,
se basa en ciertas consideraciones. Actualmente, en las monografías oficiales se especifican los siguientes tipos de compuestos
marcadores y pueden ser identificados en materias primas:

PRINCIPIOS ACTIVOS

Estos son componentes que han demostrado ser los responsables de la actividad clínica. Generalmente, en la monografía
individual se especifica un intervalo o contenido mínimo de los principios activos. Una determinación cuantitativa de los princi-
pios activos durante estudios de estabilidad de formas farmacéuticas botánicas provee la información necesaria para determi-
nar fechas de caducidad apropiadas.

MARCADORES ACTIVOS

Estos componentes tienen actividad farmacológica conocida que contribuye en cierto grado a la eficacia. Sin embargo, la
eficacia clínica de estos componentes puede no estar demostrada. Generalmente, en las monografías individuales se especifica
un contenido o intervalo mínimo de los marcadores activos. Una determinación cuantitativa de los marcadores activos durante
estudios de estabilidad de formas farmacéuticas botánicas provee la información necesaria para determinar fechas de caduci-
dad apropiadas.

MARCADORES ANALÍTICOS

Cuando no se conocen ni los principios activos ni los marcadores activos, se eligen otros componentes del extracto botánico
a los que se les puedan realizar determinaciones cuantitativas. Estos marcadores ayudan a la identificación positiva del artículo
en análisis. Además, mantener un contenido mínimo o un intervalo específico de los marcadores analíticos ayuda a lograr la
normalización del extracto vegetal y a determinar una fecha de caducidad apropiada durante los estudios de estabilidad.
USP 40 Pruebas Químicas/ (563) Identificación de Artículos de Origen Botánico 485

MARCADORES NEGATIVOS

Estos componentes pueden tener propiedades alergénicas o tóxicas. La presencia de estos componentes resulta indeseable
en el extracto botánico. Por ejemplo, los ácidos ginkgólicos del ginkgo pertenecen a esta categoría. Las monografías individua-
les pueden tener especificado un límite estricto para estos marcadores negativos.

Uso de Artículos de Referencia USP

Se usan artículos de referencia para ayudar a la identificación de compuestos marcadores dentro del artículo de prueba. Los
artículos de referencia son Materiales de Referencia Autenticados USP o Estándares de Referencia USP (ver Estándares de Refe-
rencia USP (11 )), según lo que especifique en la monografía individual. Los Estándares de Referencia USP utilizados para identi-
ficar compuestos indicadores o marcadores en los artículos de prueba pueden ser una entidad química purificada única, una
mezcla de entidades químicas purificadas o un extracto estandarizado preparado a partir del artículo vegetal autenticado. Ade-
más se pueden utilizar Estándares de Referencia USP para cuantificar compuestos marcadores, según se especifique en la mo-
nografía individual.
Se somete un artículo de prueba pulverizado a un procedimiento de extracción especificado (ver Métodos de Extracción en
Extractos Botánicos (565)) y se prepara para el análisis cromatográfico o de química húmeda. Cuando se dispone de un Mate-
rial de Referencia Autenticado USP, se somete al mismo procedimiento de extracción que al artículo de prueba. Luego se so-
meten la preparación de prueba y los artículos de referencia al mismo procedimiento cromatográfico o de química húmeda
especificado en la monografía individual. Se compara la respuesta de la preparación de prueba con la respuesta de los artículos
de referencia para determinar la presencia de los compuestos indicadores o marcadores en el artículo de prueba.

MÉTODOS BASADOS EN ADN PARA LA AUTENTIFICACIÓN DE ARTÍCULOS DE ORIGEN

BOTÁNICO
Debido a que a menudo resulta imposible la identificación morfológica cuando el material vegetal original consta de partes
de la planta secas, cortadas y modificadas o procesadas, o cuando el material consiste únicamente en una sola parte entera de
la planta sin caracteres taxonómicos, estos tipos de muestras por lo regular requieren métodos de identificación adicionales,
tales como identificación basada en ADN. Los métodos basados en ADN han demostrado ser eficientes para distinguir materia-
les vegetales genuinos de materiales adulterantes en matrices botánicas complejas y pueden complementar a los métodos de
identificación botánica tradicionales que se basan en características morfológicas o químicas. Además, los métodos basados en
ADN a menudo son más confiables que los métodos tradicionales, en especial cuando se aplican a muestras de un sólo órgano
que carecen de caracteres taxonómicos de diagnóstico, a materiales en polvo en los que ya no son apreciables las característi-
cas que los distinguen o cuando es difícil distinguir entre especies estrechamente relacionadas o morfológicamente similares.

Código de Barras de ADN (DNA Barcoding)

El código de barras de ADN es un método de identificación particular basado en secuenciación de ADN que emplea secuen-
cias específicas cortas de loci de ADN nuclear o de plástidos para la identificación de especies de plantas. Las pruebas se basan
en la comparación de las secuencias de nucleótidos de un tramo específico de ADN (secuencias de ADN o código de barras de
ADN) para realizar una identificación basada en secuencias del ADN. Asimismo, los métodos basados en ADN, tales como las
tecnologías de secuenciación de nueva generación (NGS, por sus siglas en inglés), son capaces de identificar múltiples especies
en una mezcla, incluyendo especies esperadas e inesperadas.

Identificación de Productos Botánicos Usando Secuenciación del ADN (Sanger)

El proceso de identificación de productos botánicos que usa secuenciación del ADN (Sanger) incluye selección de marcado-
res, extracción del ADN, cebadores y amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR), secuenciación del ADN y
comparación con materiales de referencia, tal como se describe en las secciones siguientes. Ver Técnicas Basadas en Ácidos Nu-
cleicos-Extracción, Detección y Secuenciación (1126), Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Amplificación (1127) y Técnicas Basa-
das en Ácidos Nucleicos-Genotipificación (1129) para información adicional.

SELECCIÓN DE MARCADORES

La secuencia seleccionada debe ser lo suficientemente específica para capturar cualquier especie primaria adulterante y po-
tencial en la muestra, pero también lo suficientemente universal para evitar reacciones de falsos negativos para especies estre-
chamente relacionadas. Por ejemplo, un cebador específico para una especie no es apropiado para la mayoría de los procedi-
mientos de identificación, debido a que no pueden detectarse los adulterantes y porque una falla en la amplificación puede ser
el resultado tanto de la ausencia de las especies o de la degradación del ADN. En muchos casos, un solo marcador puede ser
suficiente para la identificación, pero múltiples marcadores de diversas partes del genoma (p.ej. material nuclear o de los plás-
486 (563) Identificación de Artículos de Origen Botánico / Pruebas Químicas USP 40

tidos) aseguran la detección de los híbridos. Por lo regular, las regiones usadas para la identificación de secuencias de ADN
tienen una longitud de 100 a 1500 pares de bases. Los fragmentos de ADN más pequeños pueden ser menos susceptibles a la
degradación del ADN.

EXTRACCIÓN DEL ADN

Antes de que se pueda llevar a cabo la amplificación del marcador deseado, se debe extraer el ADN genómico en su totali-
dad. La aptitud de un procedimiento de extracción genómica depende del material inicial y de la pureza del ADN requerido
para las aplicaciones posteriores. Los procedimientos principales se describen a continuación, además de que se encuentran
disponibles diversos kits comerciales para ajustarse a diferentes tipos de muestras y aplicaciones.
Se debe extraer del material vegetal molido todo el ADN genómico. Los materiales vegetales pueden homogeneizarse ma-
nualmente usando un mortero y una mano de mortero, una moledora mecánica u otro aparato, dependiendo de la naturaleza
del material. La extracción y purificación de la totalidad del ADN genómico puede ser complicada debido a la abundancia de
metabolitos secundarios (polisacáridos, taninos, aceites esenciales, fenoles, alcaloides y ceras) en muchas especies de plantas
medicinales. Algunos metabolitos secundarios pueden coprecipitar con el ADN durante la extracción y pueden inhibir otras
reacciones enzimáticas, incluyendo la digestión por restricción y la PCR. En particular, grandes cantidades de polisacáridos
complejos pueden imposibilitar la extracción de ADN utilizable, volviendo la porción acuosa del extracto demasiado viscosa
como para permitir que el ADN se separe eficientemente de los polisacáridos contaminantes. Este tipo de contaminación pue-
de llevar a una escasa extracción de ADN y puede evitar el acceso de enzimas modificadoras.
Resultan apropiados numerosos métodos de extracción de ADN usados comúnmente para una amplia variedad de materia-
les vegetales frescos y secos, incluyendo bromuro de cetiltrimetilamonio, métodos basados en sílice y una variedad de kits dis-
ponibles comercialmente que emplean columnas de sílice o perlas magnéticas recubiertas con vidrio. Aunque muchos de estos
métodos funcionan bien en materiales frescos y secos y en cualquier parte de la planta, aquéllos que se degradan o que contie-
nen niveles significativos de compuestos secundarios u otros inhibidores de la PCR pueden requerir ajustes menores en los pro-
tocolos estándar de extracción.

CEBADORES Y AMPLIFICACIÓN POR PCR

Por lo regular, los cebadores para PCR tienen una longitud de 18 a 30 bases y amplifican una región con una longitud de
100 a 1500 pares de bases. Como se indicó anteriormente, los cebadores para PCR pueden ser universales, es decir, capaces
de amplificar cualquier organismo potencial presente en una muestra de prueba (incluyendo hongos, plantas y animales o un
subconjunto importante y predecible) o pueden ser específicos de taxón, lo que significa que han sido diseñados para amplifi-
car sólo organismos de un conjunto determinado (es decir, familia, géneros, especies o subespecies). Para la amplificación uni-
versal, se utilizan diversas regiones génicas nucleares, mitocondriales y de plástidos, incluyendo nrlTS, nrlTSl, nrlTS2, matK,
rbcL, espaciador intergénico psbA-trnH, cox3, COI (también conocido como coxl), espaciador externo transcrito, 18S, 5S, espa-
ciador intergénico trnL-trnF e intrón trnL. Los cebadores específicos de taxón pueden estar diseñados basándose en las proteí-
nas encontradas en grupos vegetales específicos (p.ej., el gen de lecitina de soja encontrado en la soja) u obteniendo secuen-
cias de cualquier región variable de ADN para el taxón determinado y cebadores diseñados para unirse única y específicamen-
te a las secuencias del taxón de interés.

SECUENCIACIÓN DEL ADN

Resulta más común llevar a cabo la secuenciación del ADN usando el protocolo de Sanger, que se ha modificado para usar
terminadores colorantes fluorescentes en un aparato de electroforesis capilar, aunque en este momento, se están abriendo pa-
so diversas tecnologías emergentes de secuenciación [p.ej., secuenciación de nueva generación (NGS)]. Una vez que el colo-
rante fluorescente se ha incorporado en el ADN amplificado, se identifican las bases mediante su emisión de luz a diferentes
longitudes de onda. Los datos resultantes son un cromatograma que se puede visualizar y analizar usando diversos programas
computarizados de análisis de secuencias.

COMPARACIÓN CON MATERIALES DE REFERENCIA

Las secuencias de ADN de los artículos de prueba se comparan con secuencias obtenidas de diversos materiales de referencia
en una matriz alineada (proceso comúnmente referido como alineación), lo cual permite examinar visualmente las secuencias
para identificar posiciones de nucleótidos diagnósticas. Aunque una buena cantidad de programas computarizados son capa-
ces de automatizar las comparaciones entre secuencias derivadas de artículos de prueba y secuencias de referencia, el desem-
peño varía considerablemente. Se recomienda que los investigadores verifiquen siempre de forma manual los resultados suge-
ridos por los programas computarizados para confirmar la identidad. Las identificaciones positivas no son posibles cuando las
secuencias de los artículos de prueba caen fuera del intervalo de variación conocido representado en las secuencias de referen-
cia. Si se ha utilizado un número suficientemente grande de materiales de referencia para desarrollar la prueba, la mayoría de
los materiales de prueba deberían identificarse sin ambigüedad basándose en los datos de secuencias de ADN.
USP 40 Pruebas Químicas/ (565) Extractos Botánicos 487

(565) EXTRACTOS BOTÁNICOS

En la práctica de extracción para artículos de origen botánico, los componentes de interés se separan total o parcialmente
de los otros componentes con ayuda de agua, alcohol, mezclas de alcohol y agua u otros disolventes adecuados. El proceso de
extracción implica la extracción de los componentes deseados de la materia de origen vegetal con disolventes adecuados, la
evaporación de todo o casi todo el disolvente y el ajuste de los líquidos, masas o polvos residuales a los estándares prescritos.
Se pueden agregar sustancias inertes adecuadas como vehículos o diluyentes para mejorar las características físicas. Se pueden
agregar agentes anti microbianos y otros conservantes adecuados para preservar la integridad. Los extractos pueden estar suje-
tos a procesos que aumentan el contenido de los componentes caracterizados, que disminuyan el contenido de componentes
no deseados, o ambos. Los extractos que no tienen sustancias inertes agregadas ni procesamientos más allá de la extracción se
llaman extractos naturales. En algunas preparaciones, la materia de origen vegetal puede tener un tratamiento previo median-
te la inactivación de enzimas y contaminantes microbianos, molienda, desengrasado o un procedimiento similar.
Los extractos se pueden definir como preparaciones con consistencia líquida, sólida o semisólida. Los productos obtenidos
mediante extracción son extractos líquidos, extractos en polvo, extractos semisólidos y tinturas.

MÉTODOS DE EXTRACCIÓN

Percolación

En la fabricación de extractos, la percolación es un método comúnmente usado. El material sin refinar a extraer se reduce a
trozos de un tamaño adecuado, si fuera necesario, luego se mezcla bien con una porción del disolvente especificado y se deja
en reposo durante aproximadamente 15 minutos. La mezcla se transfiere a un percolador, se agrega una cantidad suficiente
del disolvente especificado para cubrir toda la masa sólida y se deja percolar la mezcla lentamente (a una velocidad no mayor
de 1 mL por minuto por 1000 g de material), manteniendo la materia a extraer siempre recubierta con una capa de disolvente.
El residuo se puede prensar y el líquido obtenido se combina con el percolado. Los percolados totales se concentran, general-
mente por destilación a presión reducida, a fin de someter los contenidos de interés en el artículo bajo extracción al menor
calor posible.

Maceración

A menos que se especifique algo diferente, el material crudo a extraer se reduce a trozos del tamaño adecuado, se mezcla
bien con el disolvente de extracción especificado y se deja en reposo a temperatura ambiente en un recipiente cerrado durante
un tiempo adecuado, agitando frecuentemente hasta que la materia soluble se disuelva. La mezcla se filtra, la materia insoluble
se lava con el mismo disolvente usado para la maceración y los filtrados se combinan y concentran, por lo general a presión
reducida, hasta lograr la consistencia deseada.

PREPARACIONES

Extractos Líquidos

Los EXTRACTOS LÍQUIDOS son preparaciones de materia de origen vegetal que contienen alcohol como disolvente o como con-
servante, o ambos, y están hechos de forma que cada mL contiene los componentes extraídos de 1 g del material crudo que
representa, a menos que se especifique algo diferente en la monografía individual. Se pueden preparar a partir de extractos
adecuados y pueden contener conservantes antimicrobianos o de otro tipo que sean adecuados.
Los extractos líquidos farmacopeicos se producen por percolación, a menudo después de un período de maceración. El di-
solvente requerido se especifica en la monografía individual. El procedimiento de fabricación común incluye la concentración
de las porciones más diluidas de percolado por evaporación o destilación al vacío a temperaturas por debajo de 60º. El tiempo
de maceración y la velocidad de flujo durante la percolación se pueden modificar para ajustarlos a la cantidad y naturaleza del
material sin refinar que se extrae, siempre que la composición de los componentes de interés extraídos no se altere negativa-
mente.
La velocidad de flujo del percolado puede ser lenta, moderada o rápida. Con referencia a la extracción de 1000 g del mate-
rial inicial, a una velocidad lenta, no se produce más de 1 mL de percolado por minuto; a una velocidad moderada, se produ-
cen entre 1 y 3 mL por minuto; y a una velocidad rápida, se producen entre 3 y 5 mL por minuto. Los extractos líquidos que
tienden a depositar sedimentos se pueden dejar en reposo por un tiempo y luego filtrar, o se puede decantar la porción trans-
parente, siempre que el líquido transparente resultante cumpla con las normas de la Farmacopea.
488 (565) Extractos Botánicos/ Pruebas Químicas USP 40

Extractos en Polvo
Los EXTRACTOS EN POLVO son preparaciones sólidas que tienen una consistencia polvorienta obtenida por evaporación del di-
solvente usado para la extracción. Pueden contener sustancias adecuadas agregadas, como por ejemplo excipientes, estabili-
zantes y conservantes. Los extractos en polvo estandarizados se ajustan al contenido definido de componentes, usando mate-
riales inertes adecuados o un extracto en polvo de la materia de origen vegetal usada para la preparación. Cuando correspon-
da, se especifica un límite para el disolvente en la monografía individual.

Extractos Semisólidos
Los EXTRACTOS SEMISÓLIDOS, también conocidos como extractos blandos o extractos pilulares, son preparaciones que tienen
una consistencia entre la de los extractos líquidos y la de los extractos en polvo y se obtienen por evaporación parcial del disol-
vente, agua, alcohol o mezclas hidroalcohólicas usadas como disolventes de extracción. Pueden contener conservantes anti mi-
crobianos o de otro tipo que sean adecuados. Un extracto semisólido y un extracto en polvo obtenidos del mismo material son
intercambiables como fármacos o complementos, pero cada uno tiene sus propias ventajas.

Requisitos Farmacopeicos Generales

A menos que se especifique algo diferente en la monografía individual, los requisitos Farmacopeicos para los extractos líqui-
dos, extractos en polvo y extractos semisólidos son los siguientes.
Envasado y Almacenamiento-Almacenar en envases impermeables resistentes a la luz. [NOTA-Ver Conservación, Envasa-
do, Almacenamiento y Etiquetado en Advertencias y Requisitos Generales.]
Etiquetado-Etiquetar indicando el nombre de la parte de la planta usada, el nombre de los disolventes, con excepción de
los disolventes hidroalcohólicos, usados en la preparación, el contenido, en porcentaje, de los principios activos o compuestos
marcadores identificados en la monografía individual, y el nombre y la concentración de cualquier conservante antimicrobiano
o de otro tipo. Cuando se desconocen los principios activos, se declara la relación entre el material inicial y el producto final.
Para los extractos semisólidos y extractos en polvo, se indica la identidad y la cantidad de todos los excipientes agregados. En
tales casos, se puede declarar el porcentaje de extracto natural.
Residuo de Evaporación-Transferir rápidamente aproximadamente 2 mL, determinados con exactitud, de Extracto Líqui-
do, aproximadamente 0,5 g de Extracto en Polvo, o aproximadamente 2 g de Extracto Semisólido a un matraz de fondo re-
dondo tarado adecuado. Evaporar hasta sequedad en un baño de agua y secar el residuo entre 100º y 105º durante 3 horas.
Dejar que se enfríe en un desecador sobre pentóxido de fósforo y determinar el peso del residuo obtenido: no menos del 95%
de la muestra de Extracto en Polvo permanece como residuo; o no menos del 70% de la muestra de Extracto Semisólido per-
manece como residuo. [NOTA-Los límites para los Extractos Líquidos se especifican en las monografías individuales.]
Disolventes Residuales-Si se prepara con disolventes que no sean alcohol, agua o mezclas de alcohol y agua, cumplen
con los requisitos para Disolventes Residuales (467). [NOTA-Ver en el documento de la ICH Impurezas: Disolventes Residuales
para obtener información relacionada.]
Residuos de Plaguicidas-Los extractos botánicos, tinturas u otras formas farmacéuticas pueden contener residuos de pla-
guicidas a niveles elevados o bajos en comparación con su forma nativa como material botánico. A menos que se indique de
otro modo en la monografía individual, los límites para plaguicidas en extractos de artículos botánicos se calculan mediante la
siguiente fórmula:
Si E::". 1 O: Límite (mg/kg) =L x E

Si E> 1 O: Límite (mg/kg) = AM/l 008

donde Les el límite en el artículo original según se lista en la Tabla 4 (ver Análisis de Residuos de Plaguicidas en Artículos de
Origen Botánico (561 )), o la tolerancia admitida por la EPA o el nivel de acción aprobado por la FDA; E es la relación entre
material botánico y extracto (es decir, la relación entre la cantidad de artículo botánico usado en la fabricación del extracto y la
cantidad del extracto obtenido); A es la ingesta diaria admisible (IDA), conforme a lo publicado por la FAO-OMS, en mg/kg de
peso corporal; Mes el peso corporal, en kg (60 kg); y Bes la dosis diaria del extracto, en kg.
[NOTA-Se pueden justificar límites más altos de pesticidas para extractos usados como ingredientes botánicos si la ingesta o
dosis sugerida de extracto se reduce por un factor que sea mayor que E.]
Se puede otorgar una exención parcial o total de la prueba cuando se conoce el historial completo (naturaleza y cantidad de
pesticidas usados, fecha de cada tratamiento durante el cultivo y después de la cosecha) del tratamiento de la partida y éste
puede verificarse con precisión de acuerdo con las buenas prácticas agrícolas y de recolección (GACP, por sus siglas en inglés).
Determinación de Alcohol, Método/ (611) (si estuviera presente): Entre 90% y 110% de la cantidad declarada en la
etiqueta de C2 H5 0H se encuentra en Extracto Líquido y Extracto Semisólido.
USP 40 Pruebas Químicas/ (571) Valoración de Vitamina A 489

Tinturas
Las TINTURAS son preparaciones líquidas, por lo general preparadas por extracción de materia vegetal con alcohol o mezclas
hidroalcohólicas. Tradicionalmente, las tinturas de artículos potentes de origen botánico representan la actividad de 1O g del
fármaco en 100 mL de tintura, ajustándose la concentración después de la prueba para ajustar el contenido de principios acti-
vos o compuestos marcadores. La mayoría de las demás tinturas vegetales representan 20 g de la respectiva materia vegetal en
100 mL de tintura.
Las diferentes tinturas no siempre se diluyen para obtener la misma relación de materia vegetal inicial con la tintura final.
Esta relación depende de los requisitos indicados en las pruebas específicas para contenido de principios activos o de compues-
tos marcadores incluidos en las monografías individuales. A medida que se preparan las tinturas, se valoran de acuerdo con
estas pruebas de contenido. Utilizando los valores obtenidos a partir de tales valoraciones, la concentración final de una tintura
se ajusta agregando más disolvente o evaporándolo parcialmente.
A menos que se especifique algo diferente, las tinturas generalmente se preparan a partir de polvo grueso o cortes finos de
materia vegetal, ya sea mediante un proceso de percolado o un proceso de maceración.

PROCESO DE PERCOLACIÓN

Mezclar cuidadosamente la mezcla de ingredientes molidos con una cantidad suficiente del disolvente de extracción indica-
do para humedecerlo de forma completa y uniforme, dejar en reposo durante 15 minutos, trasladar la mezcla a un percolador
adecuado y compactar la masa con firmeza. Verter una cantidad suficiente del disolvente de extracción indicado para saturar el
material a extraer y cubrir la parte superior del percolador. Cuando el líquido esté a punto de gotear, cerrar el orificio inferior y
dejar macerar durante 24 horas o durante el tiempo especificado en la monografía. Si la monografía individual no requiere
prueba de contenido de principios activos o compuestos marcadores, dejar que la percolación proceda lentamente o a la velo-
cidad indicada (ver definiciones de velocidad de flujo en Extractos Líquidos), agregar gradualmente una cantidad suficiente de
disolvente para producir 1000 mL de tintura y mezclar. Si se requiere una prueba de principios activos o compuestos marcado-
res, recolectar sólo 950 mL del percolado, mezclar y analizar una porción según se indica en la monografía individual. Diluir el
resto del percolado con la cantidad de disolvente de extracción que indique la prueba de contenido que es necesaria para
producir una tintura que cumple con los requisitos y mezclar.

PROCESO DE MACERACIÓN

Macerar el material a extraer con 750 mL del disolvente de extracción indicado en un recipiente cerrado y colocar en un
lugar tibio. Agitarlo con frecuencia durante 3 días o hasta que el material soluble se disuelva. Transferir la mezcla a un filtro.
Cuando se haya filtrado la mayor parte del líquido, lavar el residuo sobre el filtro con una cantidad suficiente del disolvente de
extracción indicado, combinar los filtrados para producir 1000 mL de tintura y mezclar.

REQUISITOS FARMACOPEICOS GENERALES

A menos que se especifique algo diferente en las monografías individuales, los requisitos Farmacopeicos para las tinturas son
los siguientes.
Envasado y Almacenamiento-Almacenar en envases impermeables y resistentes a la luz y protegerlos de la exposición a
la luz solar directa y al calor excesivo. [NOTA-Ver Conservación, Envasado, Almacenamiento y Etiquetado en Advertencias y Requi-
sitos Generales.]
Etiquetado-Declarar en la etiqueta el nombre de la parte de la planta usada para la preparación, el nombre del disolvente
o de la mezcla disolvente usada para la extracción, el contenido de los componentes de interés y la relación entre el material
inicial y el producto final.

(571) VALORACIÓN DE VITAMINA A

VALORACIÓN
Métodos Químicos
• PROCEDIMIENTO 1
El siguiente procedimiento se utiliza para la determinación de vitamina A en ingredientes dietéticos o ingredientes farma-
céuticos. Cumple con el procedimiento adoptado en 1956 para uso internacional por la lnternational Union of Pure and
Applied Chemistry (Unión Internacional de Química Pura y Aplicada).
Realizar la valoración sin demora y tomar precauciones a lo largo del procedimiento para reducir al mínimo la exposición a
la luz actínica y al oxígeno atmosférico y otros agentes oxidantes, usando preferentemente material de vidrio con protec-
ción actínica y una atmósfera de gas inerte.
490 (571) Valoración de Vitamina A/ Pruebas Químicas USP 40

Para los artículos de prueba que contienen tocoferol, se debe usar un método cromatográfico apropiado.
Solución muestra: Pesar, contar o medir con exactitud una porción de la muestra de prueba, que se espera contenga el
equivalente a no menos de O, 15 mg de retinol, pero que no contenga más de 1 g de grasa. Si se presenta en forma de
cápsulas, tabletas u otro sólido, de modo que no se puede saponificar de manera eficiente según las instrucciones descri-
tas a continuación, someter a reflujo la porción tomada en 1O ml de agua en un baño de vapor durante aproximadamen-
te 1O minutos, triturar el sólido remanente con una varilla de vidrio de punta roma y entibiar durante aproximadamente 5
minutos más.
Transferir a un matraz de vidrio de borosilicato adecuado y agregar 30 ml de alcohol, seguidos por 3 ml de solución de
hidróxido de potasio (9 en 1O). Someter a reflujo en un aparato que sea completamente de vidrio de borosilicato duran-
te 30 minutos. Enfriar la solución, agregar 30 ml de agua y transferir a un separador cónico. Agregar 4 g de sulfato de
sodio decahidrato reducido a polvo fino. Extraer agitando con una porción de 150 ml de éter durante 2 minutos y lue-
go, si se forma una emulsión, con tres porciones de 25 ml de éter. Combinar los extractos etéreos, si fuera necesario, y
lavar agitando por rotación suave con 50 ml de agua. Repetir el lavado de manera más vigorosa con tres porciones adi-
cionales de 50 ml de agua. Transferir el extracto etéreo lavado a un matraz volumétrico de 250 ml, agregar éter a volu-
men y mezclar.
Evaporar una porción de 25,0 ml del extracto etéreo hasta aproximadamente 5 ml. Sin aplicar calor y con ayuda de una
corriente de gas inerte o vacío,continuar la evaporación hasta aproximadamente 3 ml. Disolver el residuo en un volumen
de alcohol isopropílico suficiente para obtener una concentración esperada equivalente a 3 µg-5 µg de vitamina A por
ml o para obtener una absorbancia en el intervalo de 0,5-0,8 a 325 nm.
Condiciones instrumentales
(Ver Espectroscopía Ultravioleta-Visible (857).)
Modo: UV
Longitudes de onda analíticas: 31 O; 325 y 334 nm
Celda: 1 cm
Blanco: Alcohol isopropílico
Análisis
Muestra: Solución muestra
Determinar las absorbancias de la Solución muestra a 31 O; 325 y 334 nm. Calcular la vitamina A, como contenido de
retinol (C 20 H30 0), en mg, en la porción de muestra tomada, usando una de las siguientes fórmulas:
Resultado= (0,549 x A325 )/(L x C)

o
Resultado = (0,549 x [A 325 ])/(L x C)

L =longitud de la celda de absorción (cm)

C = concentración en la solución final de alcohol isopropílico de la muestra de prueba (g/l 00 ml) o cápsulas o
tabletas (unidades/100 ml)
[A 325 ] = absorbancia corregida a 325 nm, calculada:
Resultado= (6,815 x A325 ) - (2,555 x A370 ) - (4,260 x A334 )

Cada mg de vitamina A, como retinol (C 20 H30 0), representa 3333 Unidades USP de vitamina A.
Usar la primera fórmula cuando A3251 la absorbancia observada a 325 nm, esté entre [A 325]/l ,030 y [A 325 ]/0,970. Usar la
segunda fórmula cuando [A 325 ] tenga un valor menor que A325 /1,030.
[NOTA-El intervalo de los límites de error para este procedimiento analítico, en el que se indica el grado de discrepancia
que se puede esperar en los resultados de diferentes laboratorios a P = 0,05, es aproximadamente ±8%.]
• PROCEDIMIENTO 2
Este procedimiento se usa para ingredientes dietéticos o ingredientes farmacéuticos en forma de ésteres de retinilo puro o
preparados a partir de ésteres de retinilo puro en un vehículo excipiente.
Solución muestra: Disolver 25-100 mg, pesados con exactitud, en 5 ml de pentano y diluir con alcohol isopropílico has-
ta obtener una concentración esperada equivalente a 3-4,5 µg/ml de retinol.
Condiciones instrumentales
(Ver Espectroscopía Ultravioleta-Visible (857).)
Modo: UV
Longitud de onda analítica: 326 nm
Celda: 1 cm
Blanco: Alcohol isopropílico
Análisis
Muestra: Solución muestra
Calcular la vitamina A, como contenido de retino! (C 20 H30 0), en mg, en la porción de muestra tomada:
Resultado= (0,570 x A326 )/(L x C)
 USP 40 Pruebas Químicas/ (571) Valoración de Vitamina A 491

A326 = absorbancia a 326 nm

L =longitud de la celda de absorción (cm)
C = concentración de la Solución muestra (g/100 ml)
Cada mg de vitamina A, como retinol (C 20 H30 0), representa 3333 Unidades USP de vitamina A.
Métodos Cromatográficos
Los siguientes procedimientos de cromatografía de líquidos se usan para la determinación de vitamina A como un ingrediente
farmacéutico activo, como un ingrediente de suplemento dietético o como un componente de suplementos dietéticos o de
medicamentos terminados.
A lo largo de estos procedimientos, proteger de la atmósfera y de la luz todas las soluciones que contienen y que se derivan de
la muestra de prueba y de los Estándares de Referencia, usando preferiblemente una atmósfera de gas inerte y material de
vidrio con protección actínica.
Cuando se especifique una forma de éster de vitamina A (acetato de retinilo o palmitato de retinilo) en el siguiente procedi-
miento, usar la forma química presente en la formulación y el Estándar de Referencia USP correspondiente.
• PROCEDIMIENTO 1
Éste es un procedimiento neutro que implica simplemente la disolución de la muestra directamente en hexano y su inyec-
ción en el cromatógrafo de líquidos o la extracción de la muestra disolviéndola primero en dimetil sulfóxido, seguida por
una extracción líquido-líquido de la vitamina A con hexano. Aunque su sistema cromatográfico puede separar los isóme-
ros 13-cis y todo trans de vitamina A, únicamente se usa el pico del isómero todo trans para la cuantificación de vitamina
A. El procedimiento se puede usar para determinar la vitamina A en una materia prima, en Tabletas de Vitaminas Oleoso-
lubles, en Cápsulas de Vitaminas Oleosolubles, en Tabletas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles, en Cápsulas de Vi-
taminas Oleosolubles e Hidrosolubles, en Tabletas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles con Minerales y en Cápsulas
de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles con Minerales.
A menos que se especifiquen en las monografías individuales, las Soluciones estándar, las Soluciones muestra y la Solución de
aptitud del sistema se preparan según se indica a continuación.
Fase móvil: n-Hexano
Solución estándar 1: 15 µg/ml de retino!, 1 a partir de ER Acetato de Retinilo USP en n-hexano
Solución estándar 2: 15 µg/ml de retinol,2 a partir de ER Palmitato de Retinilo USP en n-hexano
Solución de aptitud del sistema: Mezclar volúmenes iguales de Solución estándar 1 y de Solución estándar 2.
Solución muestra para materias primas: Transferir acetato de retinilo o palmitato de retinilo, pesados con exactitud,
equivalente a 15 mg de retinol, a un matraz volumétrico de 100 ml, disolver y diluir con n-hexano a volumen y mezclar.
Pipetear y transferir 5,0 ml de esta solución a un matraz volumétrico de 50 ml, diluir con n-hexano a volumen y mezclar.
Solución muestra para tabletas: Reducir a polvo fino no menos de 20 Tabletas. Transferir una porción del polvo, que no
exceda de 7,5 g, equivalente a no menos de 1 mg de vitamina A, como retinol (C 20 H30 0), a un tubo de centrífuga con
tapa de rosca con recubrimiento interno de teflón. Agregar aproximadamente 2 ml de dimetil sulfóxido y aproximada-
mente 3 ml de n-hexano por cada g de Tabletas reducidas a polvo y agitar durante 45 minutos en un agitador en un
baño de agua mantenido a 60º. [NOTA-Ajustar el agitador para asegurar que el contenido del recipiente se mezcle de
manera vigorosa y minuciosa.] Centrifugar a 3000 rpm durante 1O minutos y transferir la capa de hexano con una pipeta
a un matraz volumétrico. Agregar 3 ml de n-hexano por cada g de Tabletas reducidas a polvo a la capa de dimetil sulfó-
xido, agitar minuciosamente durante 5 minutos y transferir la capa de hexano con una pipeta al mismo matraz volumétri-
co. Repetir esta extracción con tres porciones adicionales de n-hexano. Diluir los extractos en el matraz volumétrico con
n-hexano a volumen. Diluir un volumen de esta solución con n-hexano hasta obtener una solución con una concentra-
ción nominal de 15 µg/ml de vitamina A, como retinol (C 20 H30 0). [NOTA-Podría no ser necesaria la dilución.]
Solución muestra para cápsulas: Transferir el contenido de no menos de 20 Cápsulas a un recipiente adecuado, mez-
clar y pesar. Transferir una porción de la mezcla, que no exceda de 7,5 g, equivalente a no menos de 1 mg de vitamina A,
como retinol (C 20 H30 0), a un tubo de centrífuga con tapa de rosca con recubrimiento interno de teflón.[NOTA-Para Cáp-
sulas de gelatina dura, retirar, tanto como sea posible, el contenido de no menos de 20 Cápsulas, cortando las cubiertas
de las Cápsulas para abrirlas, transfiriendo las cubiertas y su contenido a un recipiente adecuado, y triturando hasta for-
mar una masa homogénea. Transferir una porción de la masa, equivalente a no menos de 1 mg de vitamina A, como
retinol (C 20 H30 0), a un tubo de centrífuga con tapa de rosca con recubrimiento interno de teflón.] Agregar aproximada-
mente 2 ml de dimetil sulfóxido y aproximadamente 3 ml de n-hexano por cada g de contenido de las Cápsulas y agitar
durante 45 minutos en un agitador en un baño de agua mantenido a 60º. [NOTA-Ajustar el agitador para asegurar que
el contenido del recipiente se mezcle de manera vigorosa y minuciosa.] Centrifugar a 3000 rpm durante 1O minutos y
transferir la capa de hexano con una pipeta a un matraz volumétrico. Agregar 3 ml de n-hexano por cada g de contenido
de las Cápsulas a la capa de dimetil sulfóxido, agitar minuciosamente durante 5 minutos y transferir la capa de hexano
con una pipeta al mismo matraz volumétrico. Repetir esta extracción con tres porciones adicionales de n-hexano. Diluir
los extractos en el matraz volumétrico con n-hexano a volumen. Diluir un volumen de esta solución con n-hexano hasta
obtener una solución con una concentración nominal de 15 µg/ml de vitamina A, como retinol (C 20 H30 0). [NOTA-Podría
no ser necesaria la dilución.]

1 Usar el valor de 0,872 para convertir acetato de retinilo en su equivalente de retino!.

2 Usar el valor de 0,546 para convertir palmitato de retinilo en su equivalente de retino!.
492 (571) Valoración de Vitamina A/ Pruebas Químicas USP 40

Sistema cromatográfico
(Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
Detector: UV 325 nm
Columna: 4,6 mm x 15 cm; relleno L8 de 3 µm
Velocidad de flujo: 1 mL/min
Volumen de inyección: 40 µL
Aptitud del sistema
Muestras: Solución de aptitud del sistema y Solución estándar 1 o Solución estándar 2
Requisitos de aptitud
Resolución: No menos de 1O entre la forma todo trans de acetato de retinilo y la forma todo trans de palmitato de
retinilo, Solución de aptitud del sistema
Desviación estándar relativa: No más de 3,0%, Solución estándar 1 o Solución estándar 2
Análisis
Muestras: Solución estándar 1 o Solución estándar 2 y la Solución muestra correspondiente
Calcular el porcentaje de la cantidad declarada de vitamina A, como retinol (C 20 H30 0), en la porción de muestra tomada:
Resultado= (ruf r5) x (C5/Cu) x 100

ru = respuesta del pico de la forma todo trans de éster de retinilo de la Solución muestra correspondiente
r5 = respuesta del pico de la forma todo trans de éster de retinilo de la Solución estándar 1 o la Solución estándar
2
C5 = concentración de retinol (C 20 H300) en la Solución estándar 1 o la Solución estándar 2 (µg/mL)
Cu = concentración de vitamina A, como retinol (C 20 H30 0), en la Solución muestra (µg/mL)
• PROCEDIMIENTO 2
Este procedimiento emplea el tratamiento de la muestra con ácido sulfúrico metanólico, seguido por extracción con 2,2,4-
trimetilpentano. La preparación muestra se puede usar para la formulación que contiene vitaminas A, D y E. La aplicación
incluye Tabletas de Vitaminas Oleosolubles, Cápsulas de Vitaminas Oleosolubles, Tabletas de Vitaminas Oleosolubles e Hi-
drosolubles, Cápsulas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles, Tabletas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles con
Minerales y Cápsulas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles con Minerales.
A menos que se especifiquen en las monografías individuales, las Soluciones estándar, las Soluciones muestra, la Solución de
aptitud del sistema y las soluciones reactivo se preparan según se indica a continuación.
Fase móvil: n-Hexano y acetato de etilo (99,7: 0,3)
Solución de ácido sulfúrico metanólico 3 N: Agregar cuidadosamente 9 mL de ácido sulfúrico a 80 mL de metanol en
un matraz volumétrico de 100 ml. Enfriar y diluir con metanol a volumen.
Solución de ascorbato de sodio-pirogalol: Transferir 1O g de ascorbato de sodio y 5 g de pirogalol a un matraz volumé-
trico de 100 mL y agregar agua suficiente para disolver. Agregar 1,7 mL de ácido sulfúrico y diluir con agua a volumen.
Solución de lecitina: 5 mg/mL de lecitina en 2,2,4-trimetilpentano
Solución estándar 1: 15 µg/mL de retinol1, a partir de ER Acetato de Retinilo USP en 2,2,4-trimetilpentano
Solución estándar 2: 15 µg/mL de retinol 2, a partir de ER Palmitato de Retinilo USP en 2,2,4-trimetilpentano
Solución de aptitud del sistema: Mezclar volúmenes iguales de Solución estándar 1 y de Solución estándar 2.
Solución muestra para Tabletas: [NOTA-Esta preparación es adecuada para la determinación de vitamina A, vitamina D
y vitamina E, cuando se encuentran presentes en la formulación. La cantidad de muestra se puede ajustar dependiendo
de la presencia o ausencia de las vitaminas apropiadas.] Reducir a polvo fino no menos de 20 Tabletas. Usar una porción
del polvo nominalmente equivalente a una cantidad entre 0,4 mg y 2,5 mg retinol. Agregar 0,5 g de bicarbonato de so-
dio, 1,5 mL de Solución de lecitina y 12,5 mL de 2,2,4-trimetilpentano y dispersar en un mezclador de vórtice. Agregar 6
mL de Solución de ascorbato de sodio-pirogalo/, agitar lentamente y dejar que la solución se desgasifique. Continuar agi-
tando hasta que haya cesado la emisión de gases y luego agitar durante 12 minutos adicionales. Agregar 6 mL de dimetil
sulfóxido, mezclar en un mezclador de vórtice hasta formar una suspensión y agitar durante 12 minutos. Agregar 6 ml de
Solución de ácido sulfúrico metanólico 3 N, mezclar en un mezclador de vórtice hasta formar una suspensión y agitar duran-
te 12 minutos. Agregar 12,5 mL de 2,2,4-trimetilpentano, mezclar en un mezclador de vórtice hasta formar una suspen-
sión y agitar durante 1O minutos. Centrifugar durante 1O minutos para romper la emulsión y para que el sobrenadante se
torne transparente. Si fuera necesario, diluir cuantitativamente un volumen del sobrenadante con 2,2,4-trimetilpentano
hasta obtener una concentración cercana a la de la Solución estándar.
Solución muestra para Cápsulas: [NOTA-Esta preparación es adecuada para la determinación de vitamina A, vitamina
D y vitamina E, cuando se encuentran presentes en la formulación. La cantidad de muestra se puede ajustar dependiendo
de la presencia o ausencia de las vitaminas apropiadas.] Pesar no menos de 20 Cápsulas en un frasco de pesada tarado.
Usando una cuchilla afilada si fuera necesario, abrir cuidadosamente las Cápsulas, sin perder material de la cubierta, y
transferir el contenido a un vaso de precipitados de 100 ml. Retirar cualquier contenido adherido a las cubiertas de las
cápsulas vacías lavando con varias porciones de éter. Desechar los lavados y secar las cubiertas de las Cápsulas con ayuda
de una corriente de aire seco. Pesar las cubiertas de las Cápsulas vacías en un frasco de pesada tarado y calcular el peso
neto del contenido de las Cápsulas. Transferir una porción del contenido de las Cápsulas, equivalente a 2,5 mg de la can-
USP 40 Pruebas Químicas/ (571) Valoración de Vitamina A 493

tidad declarada de vitamina A, como retino!. Agregar 0,5 g de bicarbonato de sodio, 1,5 ml de Solución de lecitina y 12,5
ml de 2,2,4-trimetilpentano y dispersar en un mezclador de vórtice. Agregar 6 ml de Solución de ascorbato de sodio-piro-
galol, agitar lentamente y dejar que la solución se desgasifique. Continuar agitando hasta que haya cesado la emisión de
gases y luego agitar durante 12 minutos adicionales. Agregar 6 ml de dimetil sulfóxido, mezclar en un mezclador de vór-
tice hasta formar una suspensión y agitar durante 12 minutos. Agregar 6 ml de Solución de ácido sulfúrico metanólico 3 N,
mezclar en un mezclador de vórtice hasta formar una suspensión y agitar durante 12 minutos. Agregar 12,5 ml de
2,2,4-trimetilpentano, mezclar en un mezclador de vórtice hasta formar una suspensión y agitar durante 1 O minutos.
Centrifugar durante 1 O minutos para romper la emulsión y para que el sobrenadante se torne transparente. Si fuera nece-
sario, diluir cuantitativamente un volumen del sobrenadante con 2,2,4-trimetilpentano hasta obtener una concentración
cercana a la de la Solución estándar.
Sistema cromatográfico
(Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
Detector: UV 325 nm
Columna: 4,6 mm x 25 cm; relleno L24 de 5 µm
Velocidad de flujo: 1,5 ml/min
Volumen de inyección: 40 µL
Aptitud del sistema
Muestra: Solución de aptitud del sistema
Requisitos de aptitud
Resolución: No menos de 8,0 entre la forma todo trans de acetato de retinilo y la forma todo trans de palmitato de
retinilo
Desviación estándar relativa: No más de 3,0%
Análisis
Muestras: Solución estándar 7 o Solución estándar 2 y Solución muestra
Calcular el porcentaje de la cantidad declarada de vitamina A, como retinol (C 20 H30 0), en la porción de muestra tomada:
Resultado= Crufr5) x (C5/Cu) x 100

ru = respuesta del pico de la forma todo trans de éster de retinilo de la Solución muestra
r5 = respuesta del pico de la forma todo trans de éster de retinilo de la Solución estándar 7 o la Solución estándar
2
C5 = concentración de retinol (C 20 H300) en la Solución estándar 7 o la Solución estándar 2 (µg/ml)
Cu = concentración nominal de vitamina A, como retinol (C 20 H300), en la Solución muestra (µg/ml). [NOTA-
Usar 26,5 ml como el volumen final de la Solución muestra para calcular la concentración nominal.]
• PROCEDIMIENTO 3
Este procedimiento emplea la saponificación del estándar y de la muestra, seguida por una extracción líquido-líquido de
vitamina A a partir de la muestra con una mezcla de n-hexano y cloruro de metileno (3:1). Se pueden caracterizar y cuan-
tificar los isómeros 13-cis y todo trans de vitamina A. El procedimiento se puede usar para Tabletas de Vitaminas Oleosolu-
bles, Cápsulas de Vitaminas Oleosolubles, Tabletas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles, Cápsulas de Vitaminas
Oleosolubles e Hidrosolubles, Tabletas de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles con Minerales y Cápsulas de Vitaminas
Oleosolubles e Hidrosolubles con Minerales.
A menos que se especifiquen en las monografías individuales, la Solución estándar, las Soluciones muestra y las soluciones
reactivo se preparan según se indica a continuación.
Fase móvil: n-Hexano y alcohol isopropílico (92:8)
Disolvente de extracción: n-Hexano y cloruro de metileno (3: 1)
Solución de hidróxido de potasio: 800 mg/ml de hidróxido de potasio en agua. [NOTA-Agregar cuidadosamente el
hidróxido de potasio al agua. Mezclar y enfriar.]
Diluyente: 1O mg/ml de pirogalol en alcohol
Solución estándar: Diluir ER Acetato de Retinilo USP o ER Palmitato de Retinilo USP con Diluyente hasta obtener una con-
centración de 8,5 µg/ml de retinol1· 2 (C 20 H30 0). Transferir 10,0 ml de esta solución a un matraz de 125 ml con tapón y
agregar 5 ml de agua, 5 ml de Diluyente y 3 ml de Solución de hidróxido de potasio. Ajustar bien el tapón, agitar durante
15 minutos sobre un baño de agua mantenido a 60 ± 5º y enfriar a temperatura ambiente. Agregar 7 ml de agua y 25,0
ml de Disolvente de extracción. Ajustar bien el tapón y agitar vigorosamente durante 60 segundos. Enjuagar las paredes
del matraz con 60 ml de agua y dejar en reposo durante 1O minutos hasta que las capas se separen. Retirar una porción
de la capa orgánica para inyectarla en el cromatógrafo. Esta Solución estándar contiene 3,4 µg/ml de retino!.
Solución muestra para cápsulas: Pesar no menos de 20 Cápsulas en un frasco de pesada tarado. Abrir las Cápsulas, sin
perder material de la cubierta, y transferir el contenido a un vaso de precipitados de 100 mL Retirar cualquier contenido
adherido a las cubiertas de las cápsulas vacías lavando con varias porciones de éter. Desechar los lavados y secar las cu-
biertas de las Cápsulas con ayuda de una corriente de aire seco. Pesar las cubiertas de las Cápsulas vacías en un frasco de
pesada tarado y calcular el peso neto del contenido de las Cápsulas. Transferir una porción del contenido de las Cápsulas,
equivalente a 1,3 mg de retinol, a un matraz de 125 ml con tapón. Agregar 5 ml de agua, 15 ml de Diluyente y 3 ml de
494 (571) Valoración de Vitamina A/ Pruebas Químicas USP 40

Solución de hidróxido de potasio. Ajustar bien el tapón, agitar durante 15 minutos sobre un baño de agua mantenido a
60 ± 5º y enfriar a temperatura ambiente. Agregar 7 ml de agua y 25,0 ml de Disolvente de extracción. Ajustar bien el
tapón y agitar vigorosamente durante 60 segundos, o más si fuera necesario, para completar la extracción. Enjuagar las
paredes del matraz con 60 ml de agua y dejar en reposo durante 1 O minutos hasta que las capas se separen. [NOTA-No
agitar porque podría formarse una emulsión.] Retirar una porción de la capa orgánica y diluir cuantitativamente, y en di-
luciones sucesivas si fuera necesario, con Disolvente de extracción para obtener una concentración de 3,4 µg/ml de retinol.
Solución muestra para tabletas: Reducir a polvo fino un número contado de Tabletas. Transferir una porción del polvo,
equivalente a 1,3 mg de retinol, a un matraz de 125 ml con tapón. Agregar 5 ml de agua, 15 ml de Diluyente y 3 ml de
Solución de hidróxido de potasio. Tapar herméticamente, agitar durante 15 minutos sobre un baño de agua mantenido a
60 ± 5º y enfriar a temperatura ambiente. Agregar 7 ml de agua y 25,0 ml de Disolvente de extracción. Ajustar bien el
tapón y agitar vigorosamente durante 60 segundos, o más si fuera necesario, para completar la extracción. Enjuagar las
paredes del matraz con 60 ml de agua y dejar en reposo durante 1O minutos hasta que las capas se separen. [NOTA-No
agitar porque podría formarse una emulsión.] Retirar una porción de la capa orgánica y diluir con Disolvente de extracción
para obtener una concentración de 3,4 µg/ml de retinol.
Sistema cromatográfico
(Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
Detector: UV 335 nm
Columna: 6,2 mm x 8 cm; relleno L3
Temperatura de la columna: 40º
Velocidad de flujo: 4 ml/min
Volumen de inyección: 50 µL
Aptitud del sistema
Muestra: Solución estándar
Requisitos de aptitud
Desviación estándar relativa: No más de 3,0%
Análisis
Muestras: Solución estándar y Solución muestra
Calcular el porcentaje de la cantidad declarada de vitamina A, como retinol (C 20 H30 0), en la porción de muestra tomada:
Resultado= <rnlrd x (C5/Cu) x 100
rn =suma de las respuestas de los picos de la forma todo trans de éster de retinilo y 13-cis de éster de retinilo
de la Solución muestra
rT2 =suma de las respuestas de los picos de la forma todo trans de éster de retinilo y 13-cis de éster de retinilo
de la Solución estándar
C5 = concentración de retinol (C 20 H300) en la Solución estándar (µg/ml)
Cu = concentración nominal de vitamina A, como retinol (C 20 H300), en la Solución muestra (µg/ml)
• PROCEDIMIENTO 4
Este procedimiento emplea una extracción líquido-líquido de vitamina A a partir de la muestra con hexano, seguida por la
evaporación de hexano y la reconstitución del residuo en una mezcla de tetrahidrofurano y acetonitrilo (1 :1 ). Se puede
usar para la determinación de vitamina A en la Solución Oral de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles y la Solución Oral
de Vitaminas Oleosolubles e Hidrosolubles con Minerales.
A menos que se especifiquen en las monografías individuales, la Solución estándar, la Solución muestra y el Diluyente se pre-
paran según se indica a continuación.
Fase móvil: Metanol, acetonitrilo y n-hexano (46,5: 46,5: 7,0)
Diluyente: Tetrahidrofurano y acetonitrilo (1 :1)
Solución estándar: 0,33 mg/ml de retinol1, 2 (C 20 H300), a partir de ER Acetato de Retinilo USP o ER Palmitato de Retinilo
USP en Diluyente
Solución muestra para formas farmacéuticas líquidas: Transferir un volumen medido con exactitud de Solución Oral,
equivalente a 3,3 mg de retinol, a un embudo de separación de 500 ml que contenga 1 O ml de agua y 20 ml de alcohol
deshidratado. Agregar 150 ml de éter de petróleo, tapar y agitar durante 1 minuto. Agregar otros 150 ml de éter de
petróleo, tapar, agitar y dejar que las capas se separen. Desechar la capa acuosa y filtrar el extracto de éter de petróleo en
un matraz de fondo redondo de 500 ml a través de sulfato de sodio anhidro. Evaporar la solución hasta sequedad con
ayuda de un evaporador rotatorio sobre un baño de agua mantenido a aproximadamente 65º. Agregar inmediatamente
10,0 ml de Diluyente, agitar por rotación suave hasta disolver el residuo y filtrar.
Sistema cromatográfico
(Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
Detector: UV 265 nm
Columna: 4,6 mm x 50 cm (dos columnas concatenadas de 4,6 mm x 25 cm cada una); relleno L1
Temperatura de la columna: 40º
USP 40 Pruebas Químicas/ (580) Valoración de Vitamina C 495

Velocidad de flujo: 1,5 ml/min

Volumen de inyección: 20 µL
Aptitud del sistema
Muestra: Solución estándar
Requisitos de aptitud
Desviación estándar relativa: No más de 5,0%
Análisis
Muestras: Solución estándar y Solución muestra
Calcular el porcentaje de la cantidad declarada de vitamina A, como retinol (C 20 H30 0), en la porción de muestra tomada:
Resultado= <rulr5) x (C5/Cu) x 100
ru = respuesta del pico de la forma todo trans de éster de retinilo de la Solución muestra
r5 = respuesta del pico de la forma todo trans de éster de retinilo de la Solución estándar
C5 = concentración de retinol (C 20 H3a0) en la Solución estándar (µg/ml)
Cu =concentración nominal de vitamina A, como retinol (C 20 H300), en la Solución muestra (µg/ml)

REQUISITOS ADICIONALES
• Estándares de Referencia USP (11)
ER Acetato de Retinilo USP
ER Palmitato de Retinilo USP

(580) VALORACIÓN DE VITAMINA C

INTRODUCCIÓN
Los siguientes procedimientos se proveen para llevar a cabo el análisis de diferentes formas de vitamina C como ácido ascórbi-
co (C 6 H8 0 6 ), ascorbato de sodio (C 6 H 7 Na0 6) y ascorbato de calcio dihidrato (C 12 H14Ca0 12 • 2H 2 0) o sus mezclas en formas
farmacéuticas terminadas, tales como Cápsulas, Tabletas o Soluciones Orales.
MÉTODO 1-MÉTODO VOLUMÉTRICO
• PROCEDIMIENTO
A menos que se especifique de otro modo en la monografía individual, proceder según se indica a continuación.
Solución muestra para Cápsulas: Pesar no menos de 20 Cápsulas en un frasco de pesada tarado. Abrir las Cápsulas, sin
perder el material de la cubierta, y transferir el contenido a un vaso de precipitados de 100 ml. Retirar todo el contenido
adherido a las cubiertas de las Cápsulas vacías lavando, si fuera necesario, con varias porciones de éter. Desechar los lava-
dos y secar las cubiertas de las Cápsulas con ayuda de una corriente de aire seco hasta que deje de percibirse el olor a
éter. Pesar las cubiertas de las cápsulas vacías en el frasco de pesada tarado y calcular el peso neto promedio por Cápsula.
Transferir una porción del contenido de las Cápsulas, equivalente a 100 mg de ácido ascórbico, a un matraz volumétrico
de 200 ml y agregar 75 ml de ácido metafosfórico-ácido acético SR. Tapar el matraz y agitar mecánicamente durante 30
minutos. Diluir con agua a volumen.
Solución muestra para Soluciones Orales: Transferir un volumen de Solución Oral equivalente a 50 mg de ácido ascór-
bico, previamente diluido con agua si fuera necesario, a un matraz volumétrico de 100 ml. Agregar 20 ml de ácido me-
tafosfórico-ácido acético SR, diluir con agua a volumen y mezclar.
Solución muestra para Tabletas: Reducir a polvo fino no menos de 20 Tabletas. Transferir una porción del polvo, equi-
valente a 100 mg de ácido ascórbico, a un matraz volumétrico de 200 ml y agregar 75 ml de ácido metafosfórico-ácido
acético SR. Tapar el matraz y agitar mecánicamente durante 30 minutos. Diluir con agua a volumen.
Blanco: Una mezcla de 5,5 ml de ácido metafosfórico-ácido acético SR y 15 ml de agua
Sistema volumétrico
(Ver Volumetría (541 ).)
Modo: Valoración directa
Solución volumétrica: Solución estándar de diclorofenol-indofenol SV
Detección del punto final: Visual
Análisis: Transferir una porción de la Solución muestra a un tubo de centrífuga y centrifugar hasta obtener un sobrena-
dante transparente. Transferir un volumen de la Solución muestra, equivalente a 2 mg de ácido ascórbico a un matraz Er-
lenmeyer de 50 ml y agregar 5 ml de ácido metafosfórico-ácido acético SR. Valorar con Solución volumétrica hasta un
color rosáceo que persista durante al menos 5 segundos. Corregir por el volumen de Solución volumétrica consumido por
el Blanco.
Calcular el porcentaje de ácido ascórbico (C 6 H8 0 6 ) en la porción de muestra tomada:
Resultado= {[(V5 - V8) x F]!W} x 100

V5 =volumen de Solución volumétrica consumido por la Solución muestra (ml)

496 (580) Valoración de Vitamina C / Pruebas Químicas USP 40

V8 =volumen de Solución volumétrica consumido por el Blanco

F = concentración de Solución volumétrica en términos de su equivalente de ácido ascórbico (mg/ml)
W = cantidad nominal de ácido ascórbico tomada para el Análisis (mg)
MÉTODO U-MÉTODO CROMATOGRÁFICO
• PROCEDIMIENTO 1
A menos que se especifique de otro modo en las monografías individuales, preparar el Diluyente, la Solución estándar y las
Soluciones muestra según se indica a continuación.
[NOTA-Proteger las muestras del aire, de la luz y del calor.]
Solución amortiguadora: 2,04 g/L de fosfato monobásico de potasio en agua. Ajustar con ácido fosfórico a un pH de
3,0.
Fase móvil: Solución amortiguadora
Diluyente: 0,56 g de edetato disódico dihidrato y 2,04 g de fosfato monobásico de potasio por 1000 ml de agua. Ajus-
tar con ácido fosfórico a un pH de 3,0.
Solución estándar: 0,25 mg/ml de ER Ácido Ascórbico USP en Diluyente
Solución muestra para Cápsulas: Pesar no menos de 20 Cápsulas en un frasco de pesada tarado. Abrir las Cápsulas, sin
perder el material de la cubierta, y transferir el contenido a un vaso de precipitados de 100 ml. Retirar todo el contenido
adherido a las cubiertas de las Cápsulas vacías lavando, si fuera necesario, con varias porciones de éter. Desechar los lava-
dos y secar las cubiertas de las Cápsulas con ayuda de una corriente de aire seco hasta que deje de percibirse el olor a
éter. Pesar las cubiertas de las cápsulas vacías en el frasco de pesada tarado y calcular el peso neto promedio por Cápsula.
Transferir una porción del contenido de las Cápsulas, equivalente a aproximadamente 25 mg de ácido ascórbico, a un
matraz volumétrico de 100 ml. Agregar 60 ml de Diluyente, agitar mecánicamente durante 15 minutos, diluir con Dilu-
yente a volumen, mezclar bien y pasar a través de un filtro de membrana con un tamaño de poro de 0,45 µm, desechan-
do los primeros 4 ml.
Solución muestra para Soluciones Orales: Diluir un volumen medido con exactitud de Solución Oral con Diluyente has-
ta obtener una solución con una concentración de 0,25 mg/ml de ácido ascórbico. Mezclar con cuidado.
Solución muestra para Tabletas: Transferir a un matraz volumétrico de 100 ml una porción de no menos de 20 Table-
tas reducidas a polvo fino, que equivalga nominalmente a aproximadamente 25 mg de ácido ascórbico. Agregar 60 ml
de Diluyente, agitar mecánicamente durante 15 minutos, diluir con Diluyente a volumen, mezclar bien y pasar a través de
un filtro de membrana con un tamaño de poro de 0,45 µm, desechando los primeros 4 ml.
Sistema cromatográfico
(Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
Detector: UV 245 nm
Columna: 4,6 mm x 25 cm; relleno L1 de 5 µm
Velocidad de Flujo: 1,0 ml/min
Volumen de inyección: 5 µL
Aptitud del sistema
Muestra: Solución estándar
Requisitos de aptitud
Desviación estándar relativa: No más de 2,0%
Análisis
Muestras: Solución estándar y Solución muestra
Calcular el porcentaje de vitamina C, como ácido ascórbico (C 6 H8 0 6) en la porción de muestra tomada:
Resultado= (ruf r5) x (C5/Cu) x 100

ru = área del pico de ácido ascórbico de la Solución muestra

r5 = área del pico de ácido ascórbico de la Solución estándar
C5 =concentración de ER Ácido Ascórbico USP en la Solución estándar (mg/ml)
Cu =concentración nominal de ácido ascórbico en la Solución muestra (mg/ml)
• PROCEDIMIENTO 2
A menos que se especifique de otro modo en las monografías individuales, preparar el Diluyente, la Solución estándar y las
Soluciones muestra según se indica a continuación.
[NOTA-Proteger las muestras del aire, de la luz y del calor. Todas las muestras preparadas deben analizarse dentro de las 4
horas.]
Solución amortiguadora: 7,8 g/L de fosfato diácido de sodio dihidrato en agua. Ajustar con ácido fosfórico a un pH de
2,5.
Fase móvil: Solución amortiguadora y metano!. Ver la Tabla 7 para gradiente.
USP 40 Pruebas Químicas/ (580) Valoración de Vitamina C 497

Tabla 1
Tiempo Solución amortiguadora Metanol
(min) (%) (%)
o 100 o
3 100 o
5 o 100
6 50 50
7 100 o
10 100 o
Diluyente: Disolver 73 g de ácido metafosfórico en 800 ml de agua, agregar 84 ml de ácido acético glacial y diluir con
agua hasta 1000 ml.
Solución madre del estándar: 1 mg/ml de ER Ácido Ascórbico USP en Diluyente. [NOTA-Si fuera necesario, someter a
ultrasonido con agitación intermitente para facilitar la disolución. Preparar en el momento de su uso.]
Solución estándar: Diluir Solución madre del estándar con Diluyente hasta obtener una solución que contenga 0,05
mg/ml de ER Ácido Ascórbico USP.
Solución muestra para Cápsulas: Pesar no menos de 20 Cápsulas en un frasco de pesada tarado. Abrir las Cápsulas, sin
perder el material de la cubierta, y transferir el contenido a un vaso de precipitados de 100 ml. Retirar todo el contenido
adherido a las cubiertas de las Cápsulas vacías lavando, si fuera necesario, con varias porciones de éter. Desechar los lava-
dos y secar las cubiertas de las Cápsulas con ayuda de una corriente de aire seco hasta que deje de percibirse el olor a
éter. Pesar las cubiertas de las cápsulas vacías en el frasco de pesada tarado y calcular el peso neto promedio por Cápsula.
Transferir una porción del contenido de las Cápsulas, equivalente a aproximadamente 25 mg de ácido ascórbico, a un
tubo de centrífuga de 50 ml. Agregar 25,0 ml de Diluyente, someter a ultrasonido durante 15 minutos y centrifugar a
aproximadamente 2000 rpm durante 5 minutos. Diluir cuantitativamente el sobrenadante transparente con Diluyente has-
ta obtener una solución que contenga 0,05 mg/ml de ácido ascórbico. Mezclar y pasar la solución a través de un filtro de
membrana con un tamaño de poro de 0,45 µm.
Solución muestra para Soluciones Orales: Diluir un volumen medido con exactitud de Solución Oral con Diluyente has-
ta obtener una solución con una concentración de 0,05 mg/ml de ácido ascórbico. Mezclar con cuidado.
Solución muestra para Tabletas: Transferir una porción a partir de no menos de 20 Tabletas molidas, que equivalga no-
minalmente a aproximadamente 25 mg de ácido ascórbico, a un tubo de centrífuga de 50 ml. Agregar 25,0 ml de Dilu-
yente, someter a ultrasonido durante 15 minutos y centrifugar a aproximadamente 2000 rpm durante 5 minutos. Diluir
cuantitativamente el sobrenadante transparente con Diluyente hasta obtener una solución que contenga 0,05 mg/ml de
ácido ascórbico. Mezclar y pasar la solución a través de un filtro de membrana con un tamaño de poro de 0,45 µm.
Sistema cromatográfico
(Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
Detector: UV 245 nm
Columna: 4,6 mm x 15 cm; relleno L7 de 3,5 µm
Velocidad de Flujo: 0,8 ml/min
Volumen de inyección: 1O µL
Aptitud del sistema
Muestra: Solución estándar
Requisitos de aptitud
Desviación estándar relativa: No más de 2,0%
Análisis
Muestras: Solución estándar y Solución muestra
Calcular el porcentaje de vitamina C, como ácido ascórbico (C 6 H8 0 6 ) en la porción de muestra tomada:

Resultado= (ruf r5) x (C5/Cu) x 100

ru = área del pico de ácido ascórbico de la Solución muestra

r5 = área del pico de ácido ascórbico de la Solución estándar
C5 =concentración de ER Ácido Ascórbico USP en la Solución estándar (mg/ml)
Cu = concentración nominal de ácido ascórbico en la Solución muestra (mg/ml)
498 (580) Valoración de Vitamina C / Pruebas Químicas USP 40

REQUISITOS ADICIONALES
• ESTÁNDARES DE REFERENCIA USP (11)
ER Ácido Ascórbico USP

(581) VALORACIÓN DE VITAMINA D

VALORACIÓN
Métodos Cromatográficos
Los siguientes procedimientos de cromatografía de líquidos se usan para la determinación de vitamina D como ingrediente
farmacéutico activo, como ingrediente de suplemento dietético o como componente de formas farmacéuticas farmacopei-
cas.
Durante toda esta valoración, proteger de la atmósfera y la luz todas las soluciones que contengan la muestra de prueba y el
Estándar de Referencia y las que deriven de éstos, usando preferentemente una atmósfera de gas inerte y material de vidrio
con protección actínica.
Cuando se especifique vitamina D (colecalciferol o ergocalciferol) en el siguiente procedimiento, usar la forma química presen-
te en la formulación y el Estándar de Referencia USP pertinente.
• PROCEDIMIENTO 1
Este procedimiento usa una preparación de la muestra sin ajuste de pH y conlleva el uso de dimetil sulfóxido para disolver
los excipientes en la muestra, seguido por una extracción líquido-líquido de la vitamina D con hexano. La separación cro-
matográfica se logra usando modo de fase normal sobre una columna L8. Se puede usar para determinar vitamina D sola
o en combinación con otras vitaminas y minerales en formas farmacéuticas farmacopeicas.
A menos que se especifiquen en las monografías individuales, la Solución estándar, la Solución muestra y la Solución de apti-
tud del sistema se preparan según se indica a continuación.
Fase móvil: n-Hexano y alcohol isopropílico (99:1)
Solución estándar: 2 µg/mL de ER Colecalciferol USP o ER Ergocalciferol USP en n-hexano
Solución de aptitud del sistema: Calentar un volumen de Solución estándar a 60º durante 1 hora para isomerizar parcial-
mente la vitamina D (colecalciferol o ergocalciferol) a su precursor correspondiente.
Solución muestra para Tabletas: Reducir a polvo fino no menos de 20 Tabletas. Transferir una porción del polvo, que
no exceda de 7,5 g, equivalente a no menos de O, 1 mg de vitamina D como colecalciferol o ergocalciferol, a un tubo de
centrífuga con tapa de rosca con recubrimiento interno de teflón. Agregar aproximadamente 2 mL de dimetil sulfóxido y
aproximadamente 3 mL de n-hexano por cada g de Tabletas reducidas a polvo y agitar durante 45 minutos en un agita-
dor en un baño de agua mantenido a 60º. [NOTA-Ajustar el agitador para asegurar que el contenido del recipiente se
mezcle de manera vigorosa y minuciosa para lograr recuperaciones exactas.] Centrifugar a 3000 rpm durante 1O minutos
y transferir la capa de hexano con una pipeta a un matraz volumétrico. Agregar 3 mL de n-hexano por cada g de Tabletas
reducidas a polvo a la capa de dimetil sulfóxido, agitar minuciosamente durante 5 minutos y transferir la capa de hexano
con una pipeta al mismo matraz volumétrico. Repetir esta extracción con tres porciones adicionales de n-hexano. Diluir
los extractos en el matraz volumétrico con n-hexano a volumen. Diluir un volumen de esta solución con n-hexano hasta
obtener una solución con una concentración de 2 µg/mL de colecalciferol o ergocalciferol. [NOTA-Podría no ser necesa-
ria la dilución.]
Solución muestra para Cápsulas: Transferir el contenido de no menos de 20 Cápsulas a un recipiente adecuado, mezclar
y pesar. Transferir una porción de la mezcla, que no exceda de 7,5 g, equivalente a no menos de O, 1 mg de vitamina D,
como colecalciferol o ergocalciferol, a un tubo de centrífuga con tapa de rosca con recubrimiento interno de teflón.
[NOTA-Para Cápsulas de gelatina dura, retirar, tanto como sea posible, el contenido de no menos de 20 Cápsulas cortan-
do las cubiertas de las Cápsulas para abrirlas, transfiriendo las cubiertas y su contenido a un recipiente adecuado y tritu-
rando hasta formar una masa homogénea. Transferir una porción de la masa, equivalente a no menos de O, 1 mg de vita-
mina D, como colecalciferol o ergocalciferol, a un tubo de centrífuga con tapa de rosca con recubrimiento interno de
teflón.] Agregar aproximadamente 2 mL de dimetil sulfóxido y aproximadamente 3 mL de n-hexano por cada g de conte-
nido de las Cápsulas y agitar durante 45 minutos en un agitador en un baño de agua mantenido a 60º. [NOTA-Ajustar el
agitador para asegurar que el contenido del recipiente se mezcle de manera vigorosa y minuciosa para lograr recuperacio-
nes exactas.] Centrifugar a 3000 rpm durante 1O minutos y transferir la capa de hexano con una pipeta a un matraz volu-
métrico. Agregar 3 mL de n-hexano por cada g de contenido de las Cápsulas a la capa de dimetil sulfóxido, agitar minu-
ciosamente durante 5 minutos y transferir la capa de hexano con una pipeta al mismo matraz volumétrico. Repetir esta
extracción con tres porciones adicionales de n-hexano. Diluir los extractos en el matraz volumétrico con n-hexano a volu-
men. Diluir un volumen de esta solución con n-hexano hasta obtener una solución con una concentración de 2 µg/mL de
vitamina D como colecalciferol o ergocalciferol. [NOTA-Podría no ser necesaria la dilución.]
Sistema cromatográfico
(Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
Detector: UV 265 nm
USP 40 Pruebas Químicas/ (581) Valoración de Vitamina D 499

Columna: 4,6 mm x 15 cm; relleno L8 de 3 µm

Velocidad de flujo: 1 mL/min
Volumen de inyección: 100 µL
Aptitud del sistema
Muestras: Solución estándar y Solución de aptitud del sistema
Requisitos de aptitud
Resolución: No menos de 1O entre la forma presente de vitamina D y su precursor correspondiente, Solución de aptitud
del sistema
Desviación estándar relativa: No más de 3,0%, Solución estándar
Análisis
Muestras: Solución estándar y Solución muestra
Calcular el porcentaje de la cantidad declarada de colecalciferol (C 27 H4P) o ergocalciferol (C 28 H44 0) en la porción de
muestra tomada:
Resultado= (ruf r5) x (Csf Cu) x F x 100

ru = respuesta del pico de colecalciferol o ergocalciferol de la Solución muestra

r5 = respuesta del pico de colecalciferol o ergocalciferol de la Solución estándar
C5 =concentración de ER Colecalciferol USP o ER Ergocalciferol USP en la Solución estándar (µg/mL)
Cu = concentración nominal de colecalciferol o ergocalciferol en la Solución muestra (µg/mL)
F =factor de corrección que se debe tomar en cuenta para la cantidad promedio de previtamina D presente
en la Solución muestra, 1,09
• PROCEDIMIENTO 2
Este procedimiento emplea el tratamiento de la muestra con bicarbonato de sodio, una solución ácida antioxidante que
genera la emisión de gas; lecitina como surfactante; y dimetil sulfóxido, seguido por ácido sulfúrico metanólico para crear
una dispersión y extraer de manera eficiente la vitamina D de los componentes de la matriz en la fase de
2,2,4-trimetilpentano. La separación se logra en un modo de fase normal sobre una columna L24. La preparación muestra
y el Sistema cromatográfico usados en este procedimiento también son adecuados para determinar vitamina A y E cuando
se encuentran presentes en la formulación; los analistas deben realizar los ajustes correspondientes en el tamaño de la
muestra y longitud de onda de detección.
A menos que se especifiquen en las monografías individuales, la Solución estándar, la Solución muestra, la Solución de aptitud
del sistema y las soluciones reactivo se preparan según se indica a continuación.
Fase móvil: n-Hexano y alcohol butílico terciario (98,75: 1,25)
Solución de ácido sulfúrico metanólico 3 N: Agregar cuidadosamente 9 mL de ácido sulfúrico a 80 mL de metano! en
un matraz volumétrico de 100 mL. Enfriar y diluir con metano! a volumen.
Solución de ascorbato de sodio-pirogalol: Transferir 1Og de ascorbato de sodio y 5 g de pirogalol a un matraz volumé-
trico de 100 mL y agregar agua suficiente para disolver. Agregar 1,7 mL de ácido sulfúrico y diluir con agua a volumen.
Solución de lecitina: 5 mg/mL de lecitina en 2,2,4-trimetilpentano
Solución estándar: 1 µg/mL de ER Colecalciferol USP o ER Ergocalciferol USP en 2,2,4-trimetilpentano
Solución de aptitud del sistema: Calentar un volumen de Solución estándar a 60º durante 1 hora para isomerizar parcial-
mente la vitamina D (colecalciferol o ergocalciferol) a su precursor correspondiente.
Solución muestra para tabletas: [NOTA-Esta preparación es adecuada para la determinación de vitamina A, vitamina D
y vitamina E, cuando se encuentran presentes en la formulación. La cantidad de muestra se puede ajustar dependiendo
de la presencia o ausencia de las vitaminas apropiadas.] Reducir a polvo fino no menos de 20 Tabletas. Usar una porción
del polvo nominalmente equivalente a una cantidad de no menos de O, 1 mg de vitamina D. Agregar 0,5 g de bicarbona-
to de sodio, 1,5 mL de Solución de lecitina y 12,5 mL de 2,2,4-trimetilpentano y dispersar en un mezclador de vórtice.
Agregar 6 mL de Solución de ascorbato de sodio-pirogalol, agitar lentamente y dejar que la solución se desgasifique. Conti-
nuar agitando hasta que haya cesado la emisión de gases y luego agitar durante 12 minutos adicionales. Agregar 6 mL de
dimetil sulfóxido, mezclar en un mezclador de vórtice hasta formar una suspensión y agitar durante 12 minutos. Agregar
6 mL de Solución de ácido sulfúrico metanólico 3 N, mezclar en un mezclador de vórtice hasta formar una suspensión y
agitar durante 12 minutos. Agregar 12,5 mL de 2,2,4-trimetilpentano, mezclar en un mezclador de vórtice hasta formar
una suspensión y agitar durante 1O minutos. Centrifugar durante 1O minutos para romper la emulsión y para que el so-
brenadante se torne transparente. Si fuera necesario, diluir cuantitativamente un volumen del sobrenadante con
2,2,4-trimetilpentano hasta obtener una concentración cercana a la de la Solución estándar.
Solución muestra para cápsulas: [NOTA-Esta preparación es adecuada para la determinación de vitamina A, vitamina D
y vitamina E, cuando se encuentran presentes en la formulación. La cantidad de muestra se puede ajustar dependiendo
de la presencia o ausencia de las vitaminas apropiadas.] Pesar no menos de 20 Cápsulas en un frasco de pesada tarado.
Usando una cuchilla afilada si fuera necesario, abrir cuidadosamente las Cápsulas, sin perder material de la cubierta, y
transferir el contenido a un vaso de precipitados de 100 mL. Retirar cualquier contenido adherido a las cubiertas de las
cápsulas vacías lavando con varias porciones de éter. Desechar los lavados y secar las cubiertas de las Cápsulas con ayuda
de una corriente de aire seco. Pesar las cubiertas de las Cápsulas vacías en un frasco de pesada tarado y calcular el peso
neto del contenido de las Cápsulas. Transferir una porción del contenido de las Cápsulas, equivalente a no menos de O, 1
500 (581) Valoración de Vitamina D / Pruebas Químicas USP 40

mg de la cantidad declarada de vitamina D, como colecalciferol o ergocalciferol. Agregar 0,5 g de bicarbonato de sodio,
1,5 mL de Solución de lecitina y 12,5 mL de 2,2,4-trimetilpentano, y dispersar en un mezclador de vórtice. Agregar 6 mL
de Solución de ascorbato de sodio-pirogalol, agitar lentamente y dejar que la solución se desgasifique. Continuar agitando
hasta que haya cesado la emisión de gases y luego agitar durante 12 minutos adicionales. Agregar 6 mL de dimetil sulfó-
xido, mezclar en un mezclador de vórtice hasta formar una suspensión y agitar durante 12 minutos. Agregar 6 mL de
Solución de ácido sulfúrico metanólico 3 N, mezclar en un mezclador de vórtice hasta formar una suspensión y agitar duran-
te 12 minutos. Agregar 12,5 mL de 2,2,4-trimetilpentano, mezclar en un mezclador de vórtice hasta formar una suspen-
sión y agitar durante 1O minutos. Centrifugar durante 1O minutos para romper la emulsión y para que el sobrenadante se
torne transparente. Si fuera necesario, diluir cuantitativamente un volumen del sobrenadante con 2,2,4-trimetilpentano
hasta obtener una concentración cercana a la de la Solución estándar.
Sistema cromatográfico
(Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
Detector: UV 265 nm
Columna: 4,6 mm x 25 cm; relleno L24 de 5 µm
Velocidad de flujo: 1 mL/min
Volumen de inyección: 40 µL
Aptitud del sistema
Muestras: Solución estándar y Solución de aptitud del sistema
Requisitos de aptitud
Resolución: No menos de 4,0 entre la forma de vitamina D presente y su precursor correspondiente, Solución de apti-
tud del sistema
Desviación estándar relativa: No más de 3,0%, Solución estándar
Análisis
Muestras: Solución estándar y Solución muestra
Calcular el porcentaje de la cantidad declarada de colecalciferol (C 27 H44 0) o ergocalciferol (C 28 H44 0) en la porción de
muestra tomada:

Resultado= <rufr5) x (C5/Cu) x 100

ru = respuesta del pico de colecalciferol o ergocalciferol de la Solución muestra

r5 = respuesta del pico de colecalciferol o ergocalciferol de la Solución estándar
C5 = concentración de ER Colecalciferol USP o ER Ergocalciferol USP en la Solución estándar (µg/mL)
Cu = concentración nominal de colecalciferol o ergocalciferol en la Solución muestra (µg/mL)
• PROCEDIMIENTO 3
Este procedimiento es adecuado para matrices con excipientes que son solubles o degradables en condiciones alcalinas.
Emplea la saponificación de la solución muestra, seguida por una extracción líquido-líquido con hexano y una limpieza
por extracción en fase sólida (EFS) usando una mezcla de cloruro de metileno y alcohol isopropílico (99,8: 0,2) como elu-
yente. La Solución estándar se somete a un tratamiento similar para compensar pérdidas en la recuperación debidas a la
isomerización. Posteriormente, el eluato se evapora y el residuo se reconstituye en acetonitrilo antes de inyectarlo en el
cromatógrafo. La separación se logra en modo de fase reversa.
A menos que se especifiquen en las monografías individuales, la Solución estándar, la Solución muestra y las soluciones reac-
tivo se preparan según se indica a continuación.
Fase móvil: Acetonitrilo y metanol (91 :9)
Ácido acético diluido: Solución de ácido acético glacial (1 en 1O) en agua
Solución de fenolftaleína: 1O mg/mL de fenolftaleína en alcohol
Solución de hidróxido de potasio: Disolver lentamente 14 g de hidróxido de potasio en una mezcla de 31 mL de al-
cohol deshidratado y 5 mL de agua. Preparar en el día de su uso.
Disolvente de extracción: Cloruro de metileno y alcohol isopropílico (99,8:0,2)
Columna de extracción: Relleno de sílice con una relación entre la masa del sorbente y el volumen de la columna de 500
mg a 2,8 mL o equivalente. [NOTA-Acondicionar la columna lavándola inicialmente con 4,0 mL de una mezcla de cloru-
ro de metileno y alcohol isopropílico (4:1 ), seguida de 5,0 mL de Disolvente de extracción. No dejar que la columna se
seque.]
Solución madre del estándar: 0,2 mg/mL de ER Colecalciferol USP o ER Ergocalciferol USP en alcohol deshidratado.
[NOTA-Preparar cada 4 semanas. Almacenar en un congelador.]
Solución estándar: Diluir un volumen de Solución madre del estándar con alcohol deshidratado hasta obtener una con-
centración de 5 µg/mL de ER Colecalciferol USP o ER Ergocalciferol USP. Preparar esta solución en el día de su uso. Trans-
ferir 2,0 mL de esta solución a un matraz de 125 mL con tapón. Agregar 15,0 mL de agua y 15,0 mL de Solución de hidró-
xido de potasio, tapar y agitar durante 30 minutos en un baño de agua mantenido a 60º. Dejar que se enfríe a temperatu-
ra ambiente y transferir el contenido del matraz a un embudo de separación de 250 mL. Agregar 15,0 mL de agua al
matraz, tapar, agitar vigorosamente y transferir esta solución al embudo de separación. Enjuagar el matraz con 60 mL de
n-hexano y transferir el enjuague al embudo de separación. Tapar, agitar vigorosamente durante 90 segundos y dejar en
USP 40 Pruebas Químicas/ (581) Valoración de Vitamina D 501

reposo durante 15 minutos hasta que las capas se separen. Escurrir y desechar la capa acuosa. Agregar 15,0 ml de agua a
la capa de hexano en el embudo de separación, tapar y agitar vigorosamente. Dejar en reposo durante 1 O minutos hasta
que las capas se separen y desechar la capa acuosa. Agregar 1 gota de Solución de fenolftaleína y 15,0 ml de agua al em-
budo de separación. Agregar Ácido acético diluido, gota a gota, agitando, hasta que el lavado sea neutro. Dejar en reposo
durante 1O minutos hasta que las capas se separen. Escurrir y desechar la capa acuosa. Filtrar la capa de hexano a través
de sulfato de sodio anhidro, colocado sobre un pequeño trozo de algodón, en un matraz de fondo redondo de 100 ml.
Enjuagar el embudo y el sulfato de sodio con unos pocos ml de n-hexano y recoger los enjuagues en el mismo matraz.
Evaporar el hexano en el matraz en un evaporador rotatorio a 50º hasta sequedad. Agregar inmediatamente 2,0 ml de
Disolvente de extracción para disolver el residuo. Transferir esta solución a una Columna de extracción en fase sólida recien-
temente acondicionada, enjuagar el matraz de fondo redondo con 1,0 ml de Disolvente de extracción y transferir a la co-
lumna. Eluir la Columna de extracción con 2,0 ml de Disolvente de extracción y desechar esta fracción. Eluir la columna con
7,0 ml de Disolvente de extracción y recoger el eluato en un matraz adecuado. Colocar el matraz en un baño de agua tibia
mantenido a 42º y evaporar el disolvente con ayuda de una corriente de nitrógeno. Agregar inmediatamente 2,0 ml de
acetonitrilo al residuo y usar la solución para inyectarla en el cromatógrafo.
Solución muestra para tabletas: Reducir a polvo fino no menos de 20 Tabletas. Transferir una porción del polvo, equiva-
lente a 1O µg de colecalciferol o ergocalciferol, a un matraz de 125 ml con tapón. Agregar 15,0 ml de agua y 15,0 ml
de Solución de hidróxido de potasio, tapar y agitar durante 30 minutos en un baño de agua mantenido a 60º. Dejar que se
enfríe a temperatura ambiente y transferir el contenido del matraz a un embudo de separación de 250 mL. Agregar 15,0
ml de agua al matraz, tapar, agitar vigorosamente y transferir esta solución al embudo de separación. Enjuagar el matraz
con 60 ml de n-hexano y transferir el enjuague al embudo de separación. Tapar, agitar vigorosamente durante 90 segun-
dos y dejar en reposo durante 15 minutos hasta que las capas se separen. Escurrir y desechar la capa acuosa. Agregar 15,0
ml de agua a la capa de hexano en el embudo de separación, tapar y agitar vigorosamente. Dejar en reposo durante 1O
minutos hasta que las capas se separen y desechar la capa acuosa. Agregar 1 gota de Solución de fenolftaleína y 15,0 ml
de agua al embudo de separación. Agregar Ácido acético diluido, gota a gota, agitando, hasta que el lavado sea neutro.
Dejar en reposo durante 1O minutos hasta que las capas se separen. Escurrir y desechar la capa acuosa. Filtrar la capa de
hexano a través de sulfato de sodio anhidro, colocado sobre un pequeño trozo de algodón, en un matraz de fondo re-
dondo de 100 ml. Enjuagar el embudo y el sulfato de sodio con unos pocos ml de n-hexano y recoger los enjuagues en
el mismo matraz. Evaporar el hexano en el matraz en un evaporador rotatorio a 50º hasta sequedad. Agregar inmediata-
mente 2,0 ml de Disolvente de extracción para disolver el residuo. Transferir esta solución a una Columna de extracción en
fase sólida recientemente acondicionada, enjuagar el matraz de fondo redondo con 1,0 ml de Disolvente de extracción y
transferir a la columna. Eluir la Columna de extracción con 2,0 ml de Disolvente de extracción y desechar esta fracción. Eluir
la columna con 7,0 ml de Disolvente de extracción y recoger el eluato en un matraz adecuado. Colocar el matraz en un
baño de agua tibia mantenido a 42º y evaporar el disolvente con ayuda de una corriente de nitrógeno. Agregar inmedia-
tamente 2,0 ml de acetonitrilo al residuo y usar la solución para inyectarla en el cromatógrafo.
Solución muestra para cápsulas: Pesar no menos de 20 Cápsulas en un frasco de pesada tarado. Abrir las Cápsulas, sin
perder material de la cubierta, y transferir el contenido a un vaso de precipitados de 100 ml. Retirar cualquier contenido
adherido a las cubiertas de las cápsulas vacías lavando con varias porciones de éter. Desechar los lavados y secar las cu-
biertas de las Cápsulas con ayuda de una corriente de aire seco. Pesar las cubiertas de las Cápsulas vacías en un frasco de
pesada tarado y calcular el peso neto del contenido de las Cápsulas. Transferir una porción del contenido de las Cápsulas,
equivalente a 1 O µg de ergocalciferol o colecalciferol, a un matraz de 125 ml con tapón. Agregar 15,0 ml de agua y 15,0
ml de Solución de hidróxido de potasio, tapar y agitar durante 30 minutos en un baño de agua mantenido a 60º. Dejar que
se enfríe a temperatura ambiente y transferir el contenido del matraz a un embudo de separación de 250 ml. Agregar
15,0 ml de agua al matraz, tapar, agitar vigorosamente y transferir esta solución al embudo de separación. Enjuagar el
matraz con 60 ml de n-hexano y transferir el enjuague al embudo de separación. Tapar, agitar vigorosamente durante 90
segundos y dejar en reposo durante 15 minutos hasta que las capas se separen. Escurrir y desechar la capa acuosa. Agre-
gar 15,0 ml de agua a la capa de hexano en el embudo de separación, tapar y agitar vigorosamente. Dejar en reposo
durante 1O minutos hasta que las capas se separen y desechar la capa acuosa. Agregar 1 gota de Solución de fenolftaleína y
15,0 ml de agua al embudo de separación. Agregar Ácido acético diluido, gota a gota, agitando, hasta que el lavado sea
neutro. Dejar en reposo durante 1 O minutos hasta que las capas se separen. Escurrir y desechar la capa acuosa. Filtrar la
capa de hexano a través de sulfato de sodio anhidro, colocado sobre un pequeño trozo de algodón, en un matraz de
fondo redondo de 100 ml. Enjuagar el embudo y el sulfato de sodio con unos pocos ml de n-hexano y recoger los enjua-
gues en el mismo matraz. Evaporar el hexano en el matraz en un evaporador rotatorio a 50º hasta sequedad. Agregar
inmediatamente 2,0 ml de Disolvente de extracción para disolver el residuo. Transferir esta solución a una Columna de ex-
tracción en fase sólida recientemente acondicionada, enjuagar el matraz de fondo redondo con 1,0 ml de Disolvente de
extracción y transferir a la columna. Eluir la Columna de extracción con 2,0 ml de Disolvente de extracción y desechar esta
fracción. El uir la columna con 7,0 ml de Disolvente de extracción y recoger el eluato en un matraz adecuado. Colocar el
matraz en un baño de agua tibia mantenido a 42º y evaporar el disolvente con ayuda de una corriente de nitrógeno.
Agregar inmediatamente 2,0 ml de acetonitrilo al residuo y usar la solución para inyectarla en el cromatógrafo.
Sistema cromatográfico
(Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
502 (581) Valoración de Vitamina D /Pruebas Químicas USP 40

Detector: UV 265 nm
Columna: 4,6 mm x 25 cm; relleno L1 de 5 µm
Temperatura de la columna: 27º
Velocidad de flujo: 0,7 ml/min
Volumen de inyección: 15 µL
Aptitud del sistema
Muestra: Solución estándar
Requisitos de aptitud
Desviación estándar relativa: No más de 4,0%
Análisis
Muestras: Solución estándar y Solución muestra
Calcular el porcentaje de la cantidad declarada de colecalciferol (C 27 H4P) o ergocalciferol (C 28 H44 0) en la porción de
muestra tomada:

Resultado= (ru/r5) x (C5/Cu) x F x 100

ru = respuesta del pico de colecalciferol o ergocalciferol de la Solución muestra

r5 = respuesta del pico de colecalciferol o ergocalciferol de la Solución estándar
C5 = concentración de ER Colecalciferol USP o ER Ergocalciferol USP en la Solución estándar (µg/ml)
Cu = concentración nominal de colecalciferol o ergocalciferol en la Solución muestra (µg/ml)
F = factor de corrección que se debe tomar en cuenta para la cantidad promedio de previtamina D presente en la
Solución muestra, 1,09
• PROCEDIMIENTO 4
Este procedimiento se aplica a formas farmacéuticas líquidas. Emplea una extracción líquido-líquido de la muestra con he-
xano, seguida por la evaporación del hexano y la reconstitución del residuo en una mezcla de tetrahidrofurano y acetoni-
trilo (1 :1 ). La separación se logra en modo de fase reversa.
A menos que se especifiquen en las monografías individuales, la Solución estándar, la Solución muestra y el Diluyente se pre-
paran según se indica a continuación.
Fase móvil: Metanol, acetonitrilo y n-hexano (46,5: 46,5: 7,0)
Diluyente: Tetrahidrofurano y acetonitrilo (1 :1)
Solución estándar: 5 µg/ml de ER Colecalciferol USP o ER Ergocalciferol USP en Diluyente
Solución muestra: Transferir un volumen medido con exactitud de la muestra, equivalente a 50 µg de colecalciferol o
ergocalciferol, a un embudo de separación de 500 ml que contenga 1O ml de agua y 20 ml de alcohol deshidratado.
Agregar 150 ml de éter de petróleo, tapar y agitar durante 1 minuto. Agregar otros 150 ml de éter de petróleo, tapar,
agitar y dejar que las capas se separen. Desechar la capa acuosa. Escurrir el extracto de éter de petróleo en un matraz de
fondo redondo de 500 ml a través de sulfato de sodio anhidro. Evaporar la solución hasta sequedad con ayuda de un
evaporador rotatorio sobre un baño de agua mantenido a aproximadamente 65º. Agregar inmediatamente 10,0 ml de
Diluyente, agitar por rotación suave hasta disolver el residuo y filtrar.
Sistema cromatográfico
(Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
Detector: UV 265 nm
Columna: Dos columnas, 4,6 mm x 25 cm, conectadas en serie; ambas con relleno L1
Temperatura de la columna: 40º
Velocidad de flujo: 1,5 ml/min
Volumen de inyección: 20 µL
Aptitud del sistema
Muestra: Solución estándar
Requisitos de aptitud
Desviación estándar relativa: No más de 5,0%
Análisis
Muestras: Solución estándar y Solución muestra
Calcular el porcentaje de la cantidad declarada de colecalciferol (C 27 H4P) o ergocalciferol (C 28 H44 0) en la porción de
muestra tomada:

Resultado= (ruf r5) x (C5/Cu) x F x 100

ru = respuesta del pico de colecalciferol o ergocalciferol de la Solución muestra

r5 = respuesta del pico de colecalciferol o ergocalciferol de la Solución estándar
C5 = concentración de ER Colecalciferol USP o ER Ergocalciferol USP en la Solución estándar (µg/ml)
Cu = concentración nominal de colecalciferol o ergocalciferol en la Solución muestra (µg/ml)
USP 40 Pruebas Químicas/ (581) Valoración de Vitamina D 503

F =factor de corrección que se debe tomar en cuenta para la cantidad promedio de previtamina D presente
en la Solución muestra, 1,09
• PROCEDIMIENTO 5
Este procedimiento emplea la disolución de vitamina D en tolueno y la solución se inyecta en el cromatógrafo de líquidos.
Se puede aplicar a matrices simples tales como vitaminas puras e ingredientes que no requieren saponificación y que son
solubles en tolueno. La separación se logra en modo de fase normal.
A menos que se especifiquen en las monografías individuales, la Solución estándar, la Solución muestra y la Solución de apti-
tud del sistema se preparan según se indica a continuación.
Hexano deshidratado: Preparar una columna cromatográfica rellenando un tubo cromatográfico, de 8 cm x 60 cm, con
500 g de tierra silícea para cromatografía de 50 a 250 µm, activada mediante secado a 150º durante 4 horas. (Ver Croma-
tografía (621 ), Cromatografía en Columna.) Pasar 500 mL de hexano a través de la columna y recoger el eluato en un ma-
traz con tapón de vidrio.
Fase móvil: Alcohol n-amílico en Hexano deshidratado (3 en 1000)
Solución de aptitud del sistema: 250 mg de ER Aptitud del Sistema de Valoración de Vitamina D USP en 1O mL de una
mezcla de tolueno y Fase móvil (1 :1 ). Calentar esta solución a reflujo a 90º durante 45 minutos y enfriar. [NOTA-Esta solu-
ción contiene colecalciferol, precolecalciferol y trans-colecalciferol. Para las soluciones madre, seguir estos procedimientos:
usar material de vidrio con protección actínica, disolver las muestras sin calentar y preparar las soluciones en el día de su
uso.]
Solución madre del estándar: 0,6 mg/mL de ER Colecalciferol USP o ER Ergocalciferol USP en tolueno
Solución estándar: 120 µg/mL de ER Colecalciferol USP o ER Ergocalciferol USP en Fase móvil, preparada a partir de Solu-
ción madre del estándar
Solución madre de la muestra: 0,6 mg/mL de colecalciferol o ergocalciferol en tolueno
Solución muestra: 120 µg/mL de colecalciferol o ergocalciferol en Fase móvil, preparada a partir de Solución madre de Ja
muestra
Sistema cromatográfico
(Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
Detector: UV 254 nm
Columna: 4,6 mm x 25 cm; relleno L3
Temperatura de la columna: 40º
Velocidad de flujo: Se puede variar para cumplir con los Requisitos de aptitud del sistema
Volumen de inyección: 5-1 O µL
Aptitud del sistema
Muestra: Solución de aptitud del sistema
[NOTA-Los tiempos de retención relativos para precolecalciferol, trans-colecalciferol y colecalciferol son 0,4; 0,5 y 1,0,
respectivamente.]
Requisitos de aptitud
Resolución: No menos de 1,0 entre trans-colecalciferol y precolecalciferol
Desviación estándar relativa: No más de 2,0% para la respuesta del pico de colecalciferol
Análisis
Muestras: Solución estándar y Solución muestra
Calcular el porcentaje de la cantidad declarada de colecalciferol (C 27 H44 0) o ergocalciferol (C 28 H44 0) en la porción de
muestra tomada:
Resultado= (ruf r5) x (C5f Cu) x 100

ru = respuesta del pico de colecalciferol o ergocalciferol de la Solución muestra

r5 = respuesta del pico de colecalciferol o ergocalciferol de la Solución estándar
C5 = concentración de ER Colecalciferol USP o ER Ergocalciferol USP en la Solución estándar (µg/mL)
Cu =concentración nominal de colecalciferol o ergocalciferol en la Solución muestra (µg/mL)
• PROCEDIMIENTO 6
El procedimiento emplea la disolución de la muestra en Fase móvil y la solución se inyecta en el cromatógrafo de líquidos.
La aplicación incluye colecalciferol y ergocalciferol disueltos en aceite vegetal comestible, polisorbato 80 o propilenglicol,
ninguno de los cuales interferirá con el precursor correspondiente de modo que éste pueda cuantificarse. La separación se
logra en modo de fase normal sobre una columna L3 y la Aptitud del sistema requiere la separación de las formas trans de
los precursores de vitamina D.
A menos que se especifiquen en las monografías individuales, las Soluciones estándar y la Solución muestra se preparan se-
gún se indica a continuación.
Fase móvil: Hexano y pentanol (997:3)
Solución madre del estándar: Disolver ER Colecalciferol USP o ER Ergocalciferol USP en tolueno y diluir con Fase móvil
hasta 50 µg/ml. [NOTA-Preparar esta solución en el día de su uso.]
504 (581) Valoración de Vitamina D / Pruebas Químicas USP 40

Solución estándar A: 5 µg/ml, a partir de Solución madre del estándar en Fase móvil. [NOTA-Almacenar a una tempera-
tura que no exceda de Oº.]
Solución estándar B: Transferir 5,0 ml de Solución madre del estándar a un matraz de fondo redondo equipado con un
condensador de reflujo. Desplazar el aire con nitrógeno y someter a reflujo durante 1 hora en un baño de agua bajo una
atmósfera de nitrógeno para obtener una solución que contenga colecalciferol y precolecalciferol. Enfriar, transferir la so-
lución con ayuda de varias porciones de Fase móvil a un matraz volumétrico de 50 ml y diluir con Fase móvil a volumen.
Solución muestra: Equivalente a 5 µg/ml de colecalciferol o ergocalciferol en Fase móvil, a partir de un volumen de
muestra medido con exactitud
Sistema cromatográfico
(Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
Detector: UV 254 nm
Columna: 4,6 mm x 25 cm; relleno L3
Velocidad de flujo: 1-2 ml/min
Volumen de inyección: 10-20 µL
Aptitud del sistema
Muestra: Solución estándar B (ER Colecalciferol USP o ER Ergocalciferol USP)
[NOTA-Los tiempos de retención relativos para precolecalciferol y colecalciferol son aproximadamente 0,4 y 1,0, respectiva-
mente, y aproximadamente 0,8 y 1,0 para pre-ergocalciferol y ergocalciferol, respectivamente.]
Requisitos de aptitud
Resolución: No menos de 1,0 entre los picos de precolecalciferol y colecalciferol. No menos de 1,0 entre los picos de
pre-ergocalciferol y ergocalciferol
Desviación estándar relativa: No más de 2,0% para la respuesta del pico de colecalciferol o ergocalciferol
Análisis
Muestras: Solución estándar A, Solución estándar By Solución muestra
Factor de respuesta de colecalciferol o ergocalciferol
Calcular el factor de respuesta de colecalciferol o ergocalciferol, Fe:

Fe= C5/r5

C5 = concentración de ER Colecalciferol USP o ER Ergocalciferol USP en la Solución estándar A (µg/ml)

r5 = área del pico de colecalciferol o ergocalciferol de la Solución estándar A
Factor de respuesta de precolecalciferol o pre-ergocalciferol
Calcular la concentración, C' 5, en µg/ml, de colecalciferol o ergocalciferol en la Solución estándar B:

C's=Fexr's

Fe = factor de respuesta de colecalciferol o ergocalciferol

r' 5 = área del pico de colecalciferol o ergocalciferol de la Solución estándar B
Calcular la concentración, C'P'" en µg/ml, de precolecalciferol o pre-ergocalciferol:

C5 =concentración de ER Colecalciferol USP o ER Ergocalciferol USP en la Solución estándar A (µg/ml)

C' 5 = concentración de colecalciferol o ergocalciferol en la Solución estándar B (µg/ml)
Calcular el factor de respuesta, FP"' para precolecalciferol o pre-ergocalciferol:

C'pre = concentración de precolecalciferol o pre-ergocalciferol (µg/ml)

rP = respuesta del pico de precolecalciferol o pre-ergocalciferol de la Solución estándar B
Contenido de vitamina D
Calcular el porcentaje de la cantidad declarada de vitamina D como colecalciferol (C 27 H44 0) o como ergocalciferol
(C 28 H44 0) en la porción de muestra tomada:

Resultado= {[(Fe x re) + (Fpre x rpre)]/Cu} x 100

Fe = factor de respuesta de colecalciferol o ergocalciferol

re = área del pico de colecalciferol o ergocalciferol de la Solución muestra
Fpre = factor de respuesta de precolecalciferol o pre-ergocalciferol
rpre = área del pico de precolecalciferol o pre-ergocalciferol de la Solución muestra
Cu = concentración nominal de colecalciferol o ergocalciferol en la Solución muestra (µg/ml)
• PROCEDIMIENTO 7
Este procedimiento emplea la saponificación de la muestra, seguida por una extracción líquido-líquido con éter-éter de pe-
tróleo y por la evaporación del éter-éter de petróleo y la reconstitución del residuo en una mezcla de tolueno y Fase móvil
USP 40 Pruebas Químicas/ (581) Valoración de Vitamina D 505

(1 :4). Se aplica a soluciones en aceite y cápsulas que contengan soluciones de vitamina D en aceite, en las que el aceite no
interfiera con el precursor correspondiente de modo que éste pueda cuantificarse. La separación se logra en modo de fase
normal sobre una columna L3 y la Aptitud del sistema requiere la separación de las formas trans de los precursores de vita-
mina D.
A menos que se especifiquen en las monografías individuales, las Soluciones estándar, la Solución muestra y las soluciones
reactivo se preparan según se indica a continuación.
Hexano deshidratado: Preparar una columna cromatográfica rellenando un tubo cromatográfico, de 8 cm x 60 cm, con
500 g de tierra silícea para cromatografía de 50 a 250 µm, activada mediante secado a 150º durante 4 horas. (Ver Croma-
tografía (621 ), Cromatografía en Columna.) Pasar 500 mL de hexano a través de la columna y recoger el eluato en un ma-
traz con tapón de vidrio.
Fase móvil: Alcohol n-amílico en Hexano deshidratado (3 en 1000)
Solución de butil hidroxitolueno: 1O mg/mL de butil hidroxitolueno en hexano para cromatografía
Solución acuosa de hidróxido de potasio: 1 g/mL de hidróxido de potasio en agua recientemente calentada a ebulli-
ción. [NOTA-Preparar esta solución en el día de su uso.]
Solución alcohólica de hidróxido de potasio: 3 g de hidróxido de potasio en 50 mL de agua recientemente calentada a
ebullición. Agregar 1O mL de alcohol y diluir con agua recientemente calentada a ebullición hasta 100 mL. [NOTA-Prepa-
rar esta solución en el día de su uso.]
Solución de ascorbato de sodio: Disolver 175 mg/mL de ácido ascórbico en hidróxido de sodio 1 N. [NOTA-Preparar
en el día de su uso.]
Solución de sulfuro de sodio: 12 g de sulfuro de sodio en 20 mL de agua. Diluir con glicerina hasta 100 ml.
Solución madre del estándar: 0,5 mg/mL de ER Ergocalciferol USP o ER Colecalciferol USP en tolueno. [NOTA-Preparar
esta solución en el día de su uso.]
Solución estándar A: 20 µg/mL, a partir de Solución madre del estándar en Fase móvil. [NOTA-Almacenar esta solución a
una temperatura que no exceda de Oº.]
Solución estándar B: Pipetear y transferir 4 mL de Solución madre del estándar a un matraz de fondo redondo equipado
con un condensador de reflujo y agregar 2 ó 3 cristales de butil hidroxitolueno. Desplazar el aire con nitrógeno y calentar
en un baño de agua mantenido a una temperatura de 90º con luz tenue bajo una atmósfera de nitrógeno durante 45
minutos para obtener una solución que contenga vitamina D y pre-vitamina D. Enfriar, transferir con ayuda de varias por-
ciones de Fase móvil a un matraz volumétrico de 100 mL y diluir con Fase móvil a volumen.
Solución de aptitud del sistema: Agregar 100 mg de ER Aptitud del Sistema de Valoración de Vitamina D USP a un ma-
traz volumétrico de 1O mL. Agregar una mezcla (1 en 5) de tolueno y Fase móvil a volumen y mezclar. Calentar una por-
ción de esta solución a reflujo a 90º durante 45 minutos y enfriar.
Solución muestra: Someter a reflujo no menos de 1O Cápsulas con una mezcla de 1O mL de Solución de ascorbato de
sodio y 2 gotas de Solución de sulfuro de sodio en un baño de vapor durante 1O minutos, triturar los sólidos remanentes
con una varilla de vidrio de punta roma y continuar el calentamiento durante 5 minutos. Enfriar y agregar 25 mL de al-
cohol y 3 mL de Solución acuosa de hidróxido de potasio. Someter la mezcla a reflujo en un baño de vapor durante 30
minutos. Enfriar rápidamente bajo una corriente de agua y transferir la mezcla saponificada a un separador cónico, enjua-
gando el matraz de saponificación con dos porciones de 15 mL de agua, 1O mL de alcohol y dos porciones de 50 mL de
éter. [NOTA-Usar el éter dentro de las 24 horas después de abrir el envase.] Agitar vigorosamente la mezcla saponificada
y los enjuagues combinados durante 30 segundos y dejar en reposo hasta que ambas capas se tornen transparentes.
Transferir la fase acuosa a un segundo separador cónico, agregar una mezcla de 1O mL de alcohol y 50 mL de éter de
petróleo y agitar vigorosamente. Dejar que se separen, transferir la fase acuosa a un tercer separador cónico y transferir la
fase de éter de petróleo al primer separador, enjuagando el segundo separador con dos porciones de 1O mL de éter de
petróleo y agregando los enjuagues al primer separador. Agitar la fase acuosa en el tercer separador con 50 mL de éter de
petróleo y agregar la fase de éter de petróleo al primer separador. Lavar los extractos combinados de éter-éter de petró-
leo agitando vigorosamente con tres porciones de 50 mL de Solución alcohólica de hidróxido de potasio y lavar vigorosa-
mente con porciones de 50 mL de agua hasta que el último lavado sea neutro frente a la fenolftaleína. Escurrir las gotas
de agua remanentes de los extractos combinados de éter-éter de petróleo, agregar 2 láminas de papel de filtro de 9 cm
en tiras al separador y agitar. Transferir los extractos lavados de éter-éter de petróleo a un matraz de fondo redondo,
enjuagando el separador y el papel con éter de petróleo. Combinar los enjuagues de éter de petróleo con los extractos de
éter-éter de petróleo, agregar 100 µL de Solución de butil hidroxitolueno y mezclar. Evaporar hasta sequedad al vacío agi-
tando por rotación suave en un baño de agua mantenido a una temperatura no superior a 40º. Enfriar bajo una corriente
de agua e introducir nitrógeno suficiente para restaurar la presión atmosférica. Disolver y diluir el residuo sin demora en
un volumen medido con exactitud de una mezcla (1 en 5) de tolueno y Fase móvil, hasta que la concentración de vitami-
na D sea aproximadamente 25 µg/ml.
Sistema cromatográfico
(Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
Detector: UV 254 nm
Columna: 4,6 mm x 25 cm; relleno L3
Velocidad de flujo: 1-2 mL/min
506 (581) Valoración de Vitamina D / Pruebas Químicas USP 40

Volumen de inyección: 10-20 µL

Aptitud del sistema
Muestra: Solución de aptitud del sistema
[NOTA-Los tiempos de retención relativos para precolecalciferol, trans-colecalciferol y colecalciferol son 0,4; 0,5 y 1,0, respec-
tivamente.]
Requisitos de aptitud
Resolución: No menos de 1,0 entre trans-colecalciferol y precolecalciferol
Desviación estándar relativa: No más de 2,0% para la respuesta del pico de colecalciferol
Análisis
Muestras: Solución estándar A, Solución estándar 8 y Solución muestra
Factor de respuesta de colecalciferol o ergocalciferol
Calcular el factor de respuesta de colecalciferol o ergocalciferol, F0 :

Fo= Csf rs
C5 = concentración de ER Ergocalciferol USP en la Solución estándar A (µg/ml)
r5 = área del pico de colecalciferol o ergocalciferol de la Solución estándar A
Factor de respuesta de precolecalciferol o pre-ergocalciferol
Calcular la concentración, C 9 en µg/ml, de colecalciferol o ergocalciferol en la Solución estándar 8:

C's=Foxr's
F0 = factor de respuesta de colecalciferol o ergocalciferol
r' 5 = área del pico de colecalciferol o ergocalciferol de la Solución estándar 8
Calcular la concentración, Cpre, en µg/ml, para pre-ergocalciferol:

C5 = concentración de ER Ergocalciferol USP en la Solución estándar A (µg/ml)

C5 = concentración de colecalciferol o ergocalciferol en la Solución estándar 8 (µg/ml)
Calcular el factor de respuesta, Fpw para precolecalciferol o pre-ergocalciferol:

cpre =concentración de precolecalciferol o pre-ergocalciferol (µg/ml)

rP = respuesta del pico de precolecalciferol o pre-ergocalciferol de la Solución estándar 8
Contenido de vitamina D
Calcular el porcentaje de la cantidad declarada de vitamina D como ergocalciferol (C 28 H44 0) o como colecalciferol
(C 27 H44 0) en la porción de muestra tomada:

Resultado= {[(F0 x re) + (Fpre x r' pre)]/ Cu} x 100

F0 = factor de respuesta de colecalciferol o ergocalciferol

re = área del pico de colecalciferol o ergocalciferol de la Solución muestra
Fpre = factor de respuesta de precolecalciferol o pre-ergocalciferol
r' pre = área del pico de precolecalciferol o pre-ergocalciferol de la Solución muestra
Cu = concentración nominal de colecalciferol o ergocalciferol en la Solución muestra (µg/ml)
• PROCEDIMIENTO 8
Este procedimiento es adecuado para la determinación de colecalciferol en aceites y matrices grasas. Emplea dos sistemas
cromatográficos, uno para la limpieza de la muestra y el otro para la determinación de vitamina D. El estándar, estándar
interno y las soluciones muestra se someten a saponificación, seguida por una extracción líquido-líquido con una mezcla
de éter y hexano (1 :1 ). El extracto se evapora y reconstituye en la Solución de butil hidroxitolueno.
A menos que se especifiquen en las monografías individuales, la Solución estándar, las Soluciones muestra, la Solución de es-
tándar interno y las soluciones reactivo se preparan según se indica a continuación.
Solución A: Alcohol n-amílico y hexano deshidratado (3:997)
Solución B: Acetonitrilo, agua y ácido fosfórico (96: 3,8: 0,2)
Solución de butil hidroxitolueno: 1O mg/ml de butil hidroxitolueno en hexano para cromatografía
Solución acuosa de hidróxido de potasio: Disolver 800 mg de hidróxido de potasio en 1000 ml de agua recientemente
calentada a ebullición, mezclar y enfriar. [NOTA-Preparar esta solución en el día de su uso.]
Solución alcohólica de hidróxido de potasio: Disolver 3 g de hidróxido de potasio en 50 ml de agua recientemente
calentada a ebullición, agregar 1 O ml de alcohol y diluir con agua recientemente calentada a ebullición hasta 100 ml.
[NOTA-Preparar esta solución en el día de su uso.]
Solución de ácido ascórbico: 100 mg/ml de ácido ascórbico en agua. [NOTA-Preparar esta solución en el día de su
uso.]
Solución de estándar interno: 5 µg/ml de ER Ergocalciferol USP en alcohol
USP 40 Pruebas Químicas/ (581) Valoración de Vitamina D 507

Solución madre del estándar: 5 µg/mL de ER Colecalciferol USP en alcohol

Solución estándar: Transferir 2,0 mL de Solución madre del estándar y 2,0 mL de Solución de estándar interno a un matraz
de fondo redondo. Proceder según se indica en Solución muestra 1 comenzando donde dice "Agregar 5 mL de ... ".
Solución muestra 1: Transferir 4,00 g de aceite a un matraz de fondo redondo. Agregar 5 mL de Solución de ácido ascór-
bico, 100 mL de alcohol y 1O mL de Solución acuosa de hidróxido de potasio y mezclar. Someter la mezcla a reflujo en un
baño de vapor durante 30 minutos. Agregar 100 mL de una solución de cloruro de sodio de 1O mg/mL. Enfriar rápida-
mente bajo una corriente de agua y transferir la mezcla saponificada a un separador de 500 mL, enjuagando el matraz de
saponificación con 75 mL de una solución de cloruro de sodio de 1O mg/mL y luego con 150 mL de una mezcla de éter y
hexano (1 :1 ). Agitar vigorosamente la mezcla saponificada y los enjuagues combinados durante 30 segundos y dejar en
reposo hasta que ambas capas se tornen transparentes. Desechar la capa inferior. Lavar los extractos de éter y hexano
agitando vigorosamente con 50 mL de Solución alcohólica de hidróxido de potasio y luego lavando con tres porciones de
50 mL de una solución de cloruro de sodio de 1O mg/ml. Filtrar la capa superior a través de 5 g de sulfato de sodio anhi-
dro sobre un papel de filtración rápida en un matraz de 250 mL adecuado para un evaporador rotatorio. Lavar el filtro
con 1O mL de una mezcla de éter y hexano (1 :1 ), y combinar con el extracto. Evaporar el disolvente a presión reducida a
una temperatura que no exceda de 30º y llenar con nitrógeno cuando la evaporación se haya completado. Alternativa-
mente, evaporar el disolvente bajo una corriente suave de nitrógeno a una temperatura que no exceda de 30º. Disolver el
residuo en 1,5 mL de Solución de butil hidroxitolueno. [NOTA-Puede ser necesario calentar suavemente en un baño ultra-
sónico. Una fracción grande del residuo blanco es colesterol.]
Solución muestra 2: Agregar 2,0 mL de Solución de estándar interno a 4,00 g de aceite y proceder según se indica en
Solución muestra 1 comenzando donde dice "Agregar 5 mL de ... ".
Sistema cromatográfico de limpieza
(Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
Detector: UV 265 nm
Fase móvil: Solución A
Columna de limpieza: Acero inoxidable; de 4,6 mm x 25 cm; relleno L1O
Volumen de inyección: 350 µL
Análisis (limpieza)
Muestras: Solución estándar, Solución muestra 1 y Solución muestra 2
Recoger por separado los eluatos desde 2 minutos antes hasta 2 minutos después del tiempo de retención de colecalci-
ferol en un tubo de vidrio que contenga 1 mL de Solución de butil hidroxitolueno y equipado con un cierre hermético.
Evaporar cada tubo bajo una corriente de nitrógeno a una temperatura que no exceda de 30º. Disolver cada residuo en
1,5 mL de acetonitrilo e inyectar en el sistema cromatográfico analítico siguiente.
Sistema cromatográfico analítico
(Ver Cromatografía (621 ), Aptitud del Sistema.)
Modo: HPLC
Detector: UV 265 nm
Fase móvil: Solución B
Columna analítica: Acero inoxidable; de 4,6 mm x 15 cm; relleno L1 de 5 µm
Volumen de inyección: 200 µL
Aptitud del sistema
Muestra: Solución estándar (después de la limpieza)
Requisitos de aptitud
Resolución: No menos de 1,4 entre colecalciferol y ergocalciferol
Desviación estándar relativa: No más de 2,0% para el pico de colecalciferol, en inyecciones repetidas
Análisis
Muestras: Solución estándar, Solución muestra 1 y Solución muestra 2 (después de la limpieza)
Calcular el contenido de vitamina D, en µg/g, en la porción de muestra tomada:
Resultado= (RufR 5) x (C5f Cu)

R5 = respuesta del pico de colecalciferol con respecto al estándar interno de la Solución estándar
C5 =concentración de ER Colecalciferol USP en la Solución estándar (µg/mL)
Cu =concentración de aceite en la Solución muestra 2 (g/mL)
Ru = respuesta del pico de colecalciferol con respecto al estándar interno de la Solución estándar 2, según se calcula a
continuación:

Ru = rU2/[r152 - (r157 x ruzfru 1)]

[NOTA-Si r157 = O debido a que no se observa ningún pico en el sitio del estándar interno en el cromatograma de la
Solución muestra 1, entonces Ru = ruzl r152 .]
ru 2 = respuesta del pico de colecalciferol de la Solución muestra 2
r152 = respuesta del pico del estándar interno de la Solución muestra 2
508 (581) Valoración de Vitamina D /Pruebas Químicas USP 40

r151 = respuesta del pico del estándar interno de la Solución muestra 7

ru 1 = respuesta del pico de colecalciferol de la Solución muestra 7

REQUISITOS ADICIONALES
• Estándares de Referencia USP (11)
ER Colecalciferol USP
ER Ergocalciferol USP
ER Aptitud del Sistema de Valoración de Vitamina D USP

(591) DETERMINACIÓN DE CINC

La necesidad de establecer una determinación cuantitativa de cinc en las Preparaciones farmacopeicas de insulina refleja el
hecho de que este elemento es un componente esencial de los cristales de insulina-cinc. De la misma manera que el plomo, se
puede determinar el contenido de cinc por el método de la ditizona o mediante absorción atómica.

Método de Ditizona

Para esta prueba, seleccionar todos los reactivos que contengan el menor contenido posible de metales pesados. Si fuera
necesario, destilar el agua y otros disolventes en aparatos de vidrio duro o vidrio de borosilicato. Enjuagar bien todos los mate-
riales de vidrio con ácido nítrico diluido tibio (1 en 2) y luego con agua. Evitar el uso en el separador de cualquier lubricante
que se disuelva en cloroformo.
Soluciones y Disolventes Especiales-
SOLUCIÓN ALCALINA DE CITRATO DE AMONIO-Disolver 50 g de citrato dibásico de amonio en agua para obtener 100 ml. Agre-
gar 100 ml de hidróxido de amonio. Eliminar los metales pesados que podrían estar presentes, por extracción de la solución
con porciones de 20 ml de Solución de Extracción de Ditizona (ver Plomo (251)) hasta que la solución de ditizona retenga un
color verde transparente, luego extraer la ditizona remanente en la solución de citrato por agitación con cloroformo.
CLOROFORMO-Destilar el cloroformo en un aparato de vidrio duro o vidrio de borosilicato, recibiendo el destilado en sufi-
ciente alcohol deshidratado para obtener una concentración final de 1 ml de alcohol por cada 100 ml de destilado.
SOLUCIÓN DE DITIZONA-Emplear Solución Estándar de Ditizona (ver Plomo (251 )), preparada con el Cloroformo destilado.
SOLUCIÓN ESTÁNDAR DE CINC-Disolver 625 mg de óxido de cinc, pesados con exactitud y previamente incinerados suavemen-
te hasta peso constante, en 1O ml de ácido nítrico y agregar agua hasta obtener 500,0 ml. Esta solución contiene 1,0 mg de
cinc por ml.
SOLUCIÓN ESTÁNDAR DE CINC DILUIDA-Diluir 1 ml de Solución Estándar de Cinc, medido con exactitud, con 2 gotas de ácido
nítrico y suficiente agua para obtener 100,0 ml. Esta solución contiene 1 O µg de cinc por ml. Usar esta solución dentro del
periodo de 2 semanas.
SOLUCIÓN DE ÁCIDO TRICLOROACÉTICO-Disolver 1 00 g de ácido tricloroacético en agua hasta obtener 1000 ml.
Procedimiento-Transferir de 1 a 5 ml de la preparación a analizar, medidos con exactitud, a un tubo de centrífuga gra-
duado de 40 ml. Si fuera necesario, agregar ácido clorhídrico 0,25 N, gota a gota, hasta obtener una solución transparente.
Agregar 5 ml de Solución de Ácido Tricloroacético y suficiente agua para obtener 40,0 ml. Mezclar y centrifugar.
Transferir a un separador de vidrio duro un volumen exactamente medido del sobrenadante que, se supone, contiene de 5
µg a 20 µg de cinc y agregar agua hasta obtener aproximadamente 20 ml. Agregar 1,5 ml de Solución Alcalina de Citrato de
Amonio y 35 ml de Solución de Ditizona. Agitar vigorosamente 100 veces. Permitir que la fase clorofórmica se separe. Insertar
un trozo cilíndrico de algodón en el vástago del separador para extraer el agua que esté emulsionada en el cloroformo. Reco-
ger en un tubo de ensayo el extracto clorofórmico (descartando la primera porción que pase) y determinar la absorbancia a
530 nm, con un espectrofotómetro apropiado.
Calcular la cantidad de cinc contenida por referencia a una curva estándar de absorbancia-concentración obtenida utilizan-
do 0,5 ml, 1,0 ml, 1,5 ml y, si el contenido de cinc de la muestra extraída excede 15 µg, también 2,0 ml de la Solución
Estándar de Cinc Diluida. Corregir la curva estándar mediante una determinación concomitante de un blanco según se indica,
donde se usan todos los reactivos pero no se agrega cinc.
USP 40 Pruebas Físicas/ (601) Medicamentos Nasales y para Inhalación 509

Pruebas y Determinaciones Físicas

(601) MEDICAMENTOS NASALES Y PARA INHALACIÓN: PRUEBAS DE

CALIDAD DE DESEMPEÑO DE AEROSOLES, ATOMIZADORES Y
POLVOS

TABLA DE CONTENIDO

Introducción
A. Uniformidad de Dosis Liberada
A.1 Aerosoles Nasales y Atomizadores Nasales
A.1.1 Uniformidad de Dosis Liberada de Producto
A.1.1.1 Muestreo de la Dosis Liberada de Atomizadores Nasales
A.1.1.2 Muestreo de la Dosis Liberada de Aerosoles Nasales

A.2 Aerosoles para Inhalación y Atomizadores para Inhalación

A.2.1 Uniformidad de Dosis Liberada de Producto
A.2.1.1 Muestreo de la Dosis Liberada de Aerosoles para Inhalación y Atomizadores para Inhalación

A.3 Polvos Nasales

A.3.1 Uniformidad de Dosis Liberada de Producto
A.3.1.1 Muestreo de la Dosis Liberada de Polvos Nasales

A.4 Polvos para Inhalación

A.4.1 Uniformidad de Dosis Liberada de Producto
A.4.1.1 Muestreo de la Dosis Liberada de Polvos para Inhalación

B. Distribución del Tamaño de Gotitas/Partículas-Aerosoles, Atomizadores y Polvos Nasales

B.1 Medición del Tamaño de Partícula por Difracción de Láser

C. Distribución del Tamaño Aerodinámico-Aerosoles, Atomizadores y Polvos para Inhalación

C.1 Principios Generales de la Medición del Tamaño Aerodinámico de Partículas
C.1.1 Medición de Estación
C.1 .2 Pérdida de Fármaco entre Estaciones (Pérdidas en las Paredes)
C.1.3 Reingreso por Arrastre
C.1 .4 Balance de Masa

C.2 Aparato 1 para Aerosoles y Atomizadores para lnhalación-lmpactador Andersen (sin preseparador)
C.2.1 Diseño-Aparato 1
C.2.2 Procedimiento-Aparato 1

C.3 Aparato 2 para Polvos para lnhalación-lmpactador Marple-Miller

C.3.1 Diseño-Aparato 2
C.3.2 Procedimiento-Aparato 2

C.4 Aparato 3 para Polvos para lnhalación-lmpactador Andersen (con preseparador)

C.4.1 Diseño-Aparato 3
C.4.2 Procedimiento-Aparato 3

C.5 Aparato 4 para Polvos para lnhalación-lmpactador (lmpinger) Multiestación en Fase Líquida
51 O (601) Medicamentos Nasales y para Inhalación /Pruebas Físicas USP 40

C.5.1 Diseño-Aparato 4
C.5.2 Procedimiento-Aparato 4

C.6 Aparato 5 para Polvos para lnhalación-lmpactador de Nueva Generación (con preseparador)
C.6.1 Diseño-Aparato 5
C.6.2 Procedimiento-Aparato 5

C.7 Aparato 6 para Aerosoles y Atomizadores para lnhalación-lmpactador de Nueva Generación (con preseparador)
C.7.1 Diseño-Aparato 6
C.7.2 Procedimiento-Aparato 6

INTRODUCCIÓN
Las principales mediciones de desempeño para aerosoles, atomizadores y polvos nasales y para inhalación se relacionan con
la dosis liberada al paciente, incluyendo la uniformidad de la dosis liberada y las mediciones pertinentes de tamaño de partícu-
la (óptico o aerodinámico) dependiendo de la forma farmacéutica. Las secciones siguientes presentan descripciones de cada
una de éstas. El capítulo Medicamentos Nasales y para Inhalación-Información General y Pruebas de Calidad del Producto (5),
provee una tabla de nomenclatura de la que se pueden obtener los términos descriptivos para varias formas farmacéuticas.

A. UNIFORMIDAD DE DOSIS LIBERADA

A.1 Aerosoles Nasales y Atomizadores Nasales

La siguiente prueba se aplica a aerosoles y atomizadores nasales, formulados como suspensiones no acuosas o acuosas o
soluciones de fármacos que generalmente se presentan en envases multidosis y provistos de válvulas o bombas dosificadoras.
En todos los casos y para todas las pruebas, preparar y probar el atomizador según se indica en el etiquetado y en las instruc-
ciones de uso.

A.1 .1 UNIFORMIDAD DE DOSIS LIBERADA DE PRODUCTO

A menos que se indique algo diferente en la monografía individual, el contenido de fármaco de la dosis mínima liberada
recolectada al inicio de la vida de la unidad y al final de la vida de la misma, se determinará en 1 O envases distintos. Esto repre-
senta un total de 20 determinaciones. Estas mediciones deben realizarse después de cebar el sistema según se describe en el
etiquetado o en las instrucciones de uso. El número de dosis no debe exceder de 2 atomizaciones (es decir, un total de 20
determinaciones).
A.1.1.1 Muestreo de la dosis liberada de atomizadores nasales
Procedimiento-Para garantizar una recolección de dosis in vitro reproducible, se recomienda emplear un medio mecánico de
accionamiento del sistema dosificador o bomba para liberar las dosis que se van a recolectar. El procedimiento de acciona-
miento mecánico debe tener controles adecuados para los parámetros críticos de accionamiento mecánico (p.ej., fuerza de
accionamiento, velocidad de accionamiento, longitud del desplazamiento y periodos de descanso). La prueba debe realizarse
en unidades que hayan sido minuciosamente agitadas y cebadas de acuerdo con las instrucciones de uso para el paciente. La
unidad de prueba debe accionarse en una posición vertical o casi vertical con la válvula hacia arriba. La dosis recolectada al
inicio de cada uno de los 1 O envases de prueba debe ser la dosis inmediatamente posterior al cebado, y la dosis recolectada al
final de la vida de cada envase debe corresponder al último número de dosis declarado en la etiqueta del envase. Las dosis
entre las dos muestras de prueba secuenciales deben desecharse apropiadamente.
Para productos en suspensión, la dosis debe ser liberada en un envase adecuado (por ejemplo, un vial de centelleo) en el
cual se pueda lograr la transferencia cuantitativa desde el envase en análisis. Se utiliza un método analítico validado para deter-
minar la cantidad de fármaco en cada dosis liberada y los datos se informan como porcentaje de la cantidad declarada. Para
productos en solución, la dosis liberada se puede determinar gravimétricamente a partir del peso de la dosis liberada y de la
concentración y la densidad de la solución de llenado del producto en análisis.
A.1.1.2 Muestreo de la dosis liberada de aerosoles nasales: Ver A.2. 7. 7 Muestreo de la dosis liberada de aerosoles para inha-
lación y atomizadores para inhalación.
USP 40 Pruebas Físicas/ (601) Medicamentos Nasales y para Inhalación 511

A.2 Aerosoles para Inhalación y Atomizadores para Inhalación

Las siguientes pruebas se aplican a aerosoles para inhalación (comúnmente conocidos como inhaladores de dosis fija) y ato-
mizadores para inhalación. Los aerosoles para inhalación se formulan como suspensiones o soluciones de un fármaco en pro-
pelentes y posiblemente en otros excipientes adecuados, y se presentan como unidades multidosis. Los atomizadores para in-
halación son, por lo regular, formulaciones líquidas acuosas envasadas en un sistema compacto de envase-cierre que contiene
una bomba atomizadora integral. Consultar el capítulo (5) para información adicional. Los siguientes métodos de prueba son
específicos para estos productos y pueden requerir modificaciones cuando los analistas analizan tecnologías de inhalación al-
ternativas (por ejemplo, aerosoles para inhalación o atomizadores para inhalación activados por la respiración). No obstante,
los requisitos farmacopeicos para todas las formas farmacéuticas de dosis fija para inhalación requieren determinar la dosis libe-
rada y la distribución del tamaño aerodinámico. En todos los casos y para todas las pruebas, el producto debe ser preparado y
probado de acuerdo con las instrucciones de la etiqueta y las instrucciones de uso. Cuando el fabricante del producto no pro-
vea dichas instrucciones, se deben seguir las instrucciones de descarga de dosis precisas que se incluyen en las pruebas siguien-
tes.

A.2.1 UNIFORMIDAD DE DOSIS LIBERADA DE PRODUCTO

La prueba de Uniformidad de Dosis Liberada se requiere para aerosoles para inhalación y atomizadores para inhalación que
contienen formulaciones de fármacos (p.ej., solución o suspensión) en presentaciones con dosis medidas por el dispositivo o
con dosis premedidas o prefijadas. La prueba de Uniformidad de Dosis Liberada incluye la uniformidad de dosis durante toda la
vida de la unidad. (Para productos envasados en unidades de dosificación prefijadas/premedidas, consultar también el capítulo
Uniformidad de Unidades de Dosificación (905).) En esta prueba, una dosis se define como el número mínimo recomendado de
atomizaciones especificado en el etiquetado o en las instrucciones de uso del producto, pero no más de dos atomizaciones.
Para aerosoles para inhalación y atomizadores para inhalación, la dosis liberada esperada se especifica en la etiqueta, a menos
que se especifique algo distinto en la monografía individual. Su valor refleja el contenido medio de fármaco esperado para un
gran número de dosis liberadas recolectadas de muchas unidades del producto, empleando el método especificado en la mo-
nografía.
A menos que se indique algo diferente en la monografía individual, el contenido de fármaco de las dosis liberadas recolecta-
das al comienzo de la vida de la unidad (después de realizar el cebado según se describe en la etiqueta o en las instrucciones
de uso) y al final de la vida de la unidad declarada en la etiqueta, se determinará a partir de 1 O envases distintos (es decir, un
total de 20 determinaciones).
A.2.1.1 Muestreo de la dosis liberada de aerosoles para inhalación y atomizadores para inhalación
Procedimiento-Para determinar el contenido de ingrediente activo en la nube descargada de un aerosol para inhalación y de
un atomizador para inhalación, usar el Aparato A de muestreo (ver la Figura 7) descrito a continuación. Preparar el producto
para su uso de acuerdo con las instrucciones del etiquetado para agitar, cebar y disparar. A menos que se indique algo diferen-
te en la monografía individual, con la bomba de vacío en funcionamiento y asegurando una velocidad de flujo de aire a través
del dispositivo del producto de 28,3 L de aire por minuto (±5%), descargar en el aparato los accionamientos mínimos reco-
mendados a través del adaptador de boquilla, accionando el sistema de medición durante un tiempo suficiente para garantizar
que la dosis se haya descargado por completo. El volumen de aire muestreado no debe exceder de 2,0 L. La dosis recolectada
de cada uno de los 1 O envases de prueba debe ser la dosis inmediatamente posterior al cebado y la dosis recolectada al final
de la vida de cada envase debe ser la última dosis de acuerdo con lo declarado en la etiqueta. A menos que se indique algo
diferente en las instrucciones de uso para el paciente, agitar el producto durante 5 segundos y recolectar el primer acciona-
miento posterior al cebado. Esperar 5 segundos y recolectar el siguiente accionamiento, cuando se justifique. Las dosis entre
las dos muestras de prueba secuenciales (es decir, el comienzo y el final de la vida del envase) deben desecharse de manera
apropiada. Se debe tener en cuenta que, para los aerosoles para inhalación, la velocidad de las descargas (número de descar-
gas por unidad de tiempo) que se van a desechar no debe ocasionar un enfriamiento excesivo del envase. Después de las reco-
lecciones individuales del número mínimo de accionamientos de cada unidad en cada muestra de prueba secuencial, retirar el
producto del Aparato A (ver la Figura 7) y desconectar el vacío. Valorar por separado el contenido de fármaco en el aparato al
comienzo y al final de las muestras de prueba secuenciales después de enjuagar el filtro y el interior del aparato con un disol-
vente adecuado.
Aparato A-El aparato de muestreo (ver la Figura 7) consta de una base para soporte de filtro con un soporte de filtro de malla
abierta, como una criba de acero inoxidable, un tubo de recolección fijado o atornillado a la base para soporte de filtro y un
adaptador de boquilla para garantizar un sellado hermético entre el tubo de recolección y la boquilla. Usar un adaptador de
boquilla que garantice que la abertura de la boquilla del producto esté nivelada con la cara frontal o con el borde indentado
de 2,5 mm que está en el tubo de recolección de muestra, según sea apropiado. El conector de vacío está conectado a un
sistema compuesto por una fuente de vacío, un regulador de flujo y un caudalímetro. La fuente debe ser capaz de arrastrar aire
a través de todo el dispositivo, incluyendo el filtro y el producto a analizar, a la velocidad de flujo deseada. Durante las pruebas
de aerosoles para inhalación, el aire debe extraerse de forma continua a través del sistema de manera que se evite la pérdida
del medicamento por fuga al medio ambiente que lo rodea. La base para soporte de filtro está diseñada para soportar discos
de filtro de 25 mm de diámetro. Con el flujo de aire empleado, el tubo de recolección de muestra y el disco de filtro deben ser
capaces de recolectar cuantitativamente la dosis liberada. El disco de filtro y los restantes materiales utilizados en la construc-
512 (601) Medicamentos Nasales y para Inhalación / Pruebas Físicas USP 40

ción del aparato deben ser compatibles con el fármaco y los disolventes empleados para extraer el fármaco del filtro. Un extre-
mo del tubo de recolección está diseñado para sostener firmemente el filtro contra la base para soporte de filtro. Una vez mon-
tado, las uniones entre los componentes del aparato son herméticas, de forma que cuando se aplica vacío a la base del filtro,
todo el aire extraído a través del aparato de recolección pasa a través del dispositivo del producto.
Rosca Interna

4>38,1
4>26,7
4>35,5
4>32,8 4> 31,8
4>31,8
4>28,6
4>27,2
4>26,7
4>25,7
4>21,8
/¡}so 10,020 Tubo

ITT
Cotas de 103 89 5
¡
5
1 1

1
,\_u
1
1

Dimensión '
Rosca Externa

~t§:m:t~t li
Descanso de Rosca
'::~;;~;~
f 1 1
Conector de Vacío
Base para Soporte de Filtro

Tapa
Adaptadores de Boquilla

~
Tubo de recolección de Muestra

Tapa

Las dimensiones son en mm,

salvo que se especifique lo contrario. ~ lohalru!onl•
Dosis Fija

Figura 1. Aparato de muestreo para aerosoles y atomizadores para inhalación

A.3 Polvos Nasales

La siguiente prueba se aplica a polvos nasales presentados en unidades de dosis premedidas o medidas por el dispositivo. En
todos los casos y para todas las pruebas, preparar y probar el polvo según se indica en el etiquetado y en las instrucciones de
uso.

A.3.1 UNIFORMIDAD DE DOSIS LIBERADA DE PRODUCTO

A menos que se indique algo diferente en la monografía individual, el contenido de fármaco de las dosis mínimas liberadas
de 1O envases individuales se determinará al inicio de la vida de la unidad y nuevamente al número correspondiente de dosis
medidas declarado en la etiqueta. Esto representa un total de 20 determinaciones. Para polvos nasales envasados en unidades
monodosis, la Uniformidad de Dosis Liberada se puede aplicar a 1O unidades de dosificación.
A.3.1.1 Muestreo de la dosis liberada de polvos nasales: Para garantizar una recolección de dosis in vitro reproducible, se
recomienda emplear un medio adecuado de accionamiento del dispositivo para liberar las dosis a recolectar. Las unidades de
USP 40 Pruebas Físicas/ (601) Medicamentos Nasales y para Inhalación 513

prueba se deben accionar en posición vertical o casi vertical. Las dos dosis separadas recolectadas incluyen la primera dosis y la
dosis correspondiente a la última dosis declarada de cada una de 1 O unidades. Las dosis entre las dos muestras de prueba se-
cuenciales para cada unidad se deben desechar apropiadamente. Se emplea un método analítico validado para determinar la
cantidad de fármaco en cada dosis liberada y los datos se registran como porcentaje de la cantidad declarada en la etiqueta.
Para polvos nasales, se recomienda el aparato B (Figura 2).

A.4 Polvos para Inhalación

Las siguientes pruebas se aplican a polvos para inhalación (comúnmente conocidos como inhaladores de polvo seco) pre-
sentados como unidades de dosis premedidas o medidas por el dispositivo. Los requisitos farmacopeicos para todos estos me-
dicamentos requieren la determinación de la dosis liberada y de la distribución de tamaño aerodinámico. En todos los casos y
para todas las pruebas, preparar y probar el producto según se indica en el etiquetado y en las instrucciones de uso. Cuando el
fabricante del producto no provea dichas instrucciones, seguir las instrucciones de descarga de dosis precisas que se incluyen
en las pruebas siguientes.

A.4.1 UNIFORMIDAD DE DOSIS LIBERADA DE PRODUCTO

La prueba de Uniformidad de Dosis Liberada se requiere para polvos para inhalación en presentaciones con dosis medida por
el dispositivo y premedidas (incluyendo multidosis ordenadas) cuyo etiquetado indica que se deben usar con el sistema de li-
beración especificado. La prueba de Uniformidad de Dosis Liberada incluye la uniformidad de dosis durante toda la vida de la
unidad. (Para formulaciones envasadas en unidades de dosis premedidas, consultar también el capítulo (905).) Se debe tener
en cuenta que la dosis liberada esperada es el contenido medio de fármaco de un gran número de dosis liberadas recolectadas
de muchas unidades en condiciones experimentales definidas. En muchos casos, el valor esperado puede depender de la for-
ma en que se realice la prueba para la dosis liberada. Para polvos para inhalación, en los que la cantidad que se declara en la
etiqueta es usualmente la dosis premedida o medida del fármaco, la dosis liberada esperada se especifica en la monografía
individual y generalmente es menor que la cantidad que se declara en la etiqueta. Su valor refleja el contenido medio de fár-
maco esperado para un gran número de dosis liberadas recolectadas del producto, empleando el método especificado en la
monografía.
A menos que se indique algo diferente en la monografía individual, el contenido de fármaco de la dosis mínima liberada de
1 O envases individuales se determina de acuerdo con el procedimiento descrito a continuación.
La prueba de Uniformidad de Dosis Liberada durante toda la vida de la unidad se requiere para medicamentos envasados en
unidades de dosis medida por el dispositivo o unidades de dosis premedidas con dosis múltiples ordenadas que tienen una
secuencia de dosis predeterminada.
A menos que se indique algo diferente en la monografía individual, el contenido de fármaco de las dosis liberadas se recolec-
tará al inicio de la vida de la unidad y nuevamente al número de dosis declarado en la etiqueta. Se obtendrán dos determina-
ciones de 1 O unidades individuales de medicamento. Esto representa un total de 20 determinaciones.
Para polvos para inhalación envasados en unidades monodosis, la Uniformidad de Dosis Liberada se puede aplicar a 1 O unida-
des de dosificación.
A.4.1.1 Muestreo de la dosis liberada de polvos para inhalación: Emplear el Aparato B(ver la Figura 2) para determinar el
contenido del ingrediente activo emitido de la boquilla de un polvo para inhalación. Este aparato puede muestrear las dosis
emitidas a distintas velocidades de flujo de aire.
H
G Válvula de Control de Flujo

g
Temp_ ..____ . ~
\ Pl""- Adaptador de Boquilla
"'-..

e Filtro
E e Tubo de Recolección de Muestra
o
A

Figura 2. Aparato B: Aparato de muestreo para polvos para inhalación. (Ver la Tabla 7 para especificaciones de los componen-
tes.)
514 (601) Medicamentos Nasales y para Inhalación / Pruebas Físicas USP 40

Tabla 1. Especificaciones de Componentes para el Aparato B (ver la Figura 2)

Código Artículo Descripción Dimensiones
Tubo de recolección de
A muestraª Ver la Figura 2 34,85 mm de diámetro interno x 12 cm de longitud
B Filtrob Ver la Figura 2 Filtro de fibra de vidrio de 47 mm
(p.ej., acoplamiento corto
de metal con ramificación
c Conector a P3 de diámetro menor) :;,g mm de diámetro interno
(p.ej., tubería de silicona
con un diámetro externo
de 14 mm y un diámetro Un tubo de longitud adecuada de diámetro interno :;,g mm con un volu-
D Tubería de vacío interno de 8 mm) men interno de 25 mL ±5 ml.
Válvula solenoide de dos Válvula solenoide de 2 vías, 2 puertos, con un diámetro interno :;,8 mm y
E víasc Ver la Figura 2 un tiempo de respuesta de apertura de <::100 milisegundos.
La bomba debe ser capaz de extraer a la velocidad de flujo requerida a
través del aparato ensamblado con el polvo para inhalación en el adap-
tador de boquilla. Conectar la bomba a la válvula solenoide empleando
una tubería de vacío corta y ancha(:;, 1 O mm de diámetro interno) y co-
F Bomba de vacíod Ver la Figura 2 nectores para minimizar los requisitos de capacidad de la bomba.
El temporizador interrumpe o permite el paso de corriente a la válvula so-
G Temporizadorº Ver la Figura 2 lenoide durante el lapso de tiempo requerido.
2,2 mm de diámetro interno, 3, 1 mm de diámetro externo, a nivel con la
superficie interna del tubo de recolección de muestra, centrado y sin re-
babas, a 59 mm de su entrada. Las llaves de presión Pl, P2 y P3 no se
Pl Llave de paso de presión Ver la Figura 2 deben abrir al exterior durante la recolección de la dosis.
Pl, P2, P3 Mediciones de presión 1 - -

H Válvula de control de flujo9 Ver la Figura 2 Válvula reguladora ajustable con máximo Cv:;, 1 h.
ª A modo de ejemplo, un producto Millipore número XX4004700 (Millipore Corporation, 80 Ashby Road, Bedford, MA 01732), modificado de forma que el
tubo de salida tenga un diámetro interno de :;,8 mm, equipado con un producto Gelman número 61631.
b A/E (Gel man Sciences lnc., 600 South Wagner Road, Ann Arbor, MI 48106) o equivalente.
e Producto ASCO número 8030G1 3, Automatic Switch Company, 60 Hanover Road, Florham Park, NJ 07932.
d Producto Gast tipo 1023, 1423 ó 2565 (Gast Manufacturing !ne., PO Box 97, Benton Harbor, MI 49022) o equivalente.
e Producto Eaton número 45610-400 (Eaton Corporation, Automotive Products Division, 901, South 12th Street, Watertown, WI 53094) o equivalente.
1 A modo de ejemplo, un manómetro PDM 21 O (Air-Neotronics Ltd., Neotronics Technology ple, Parsonage Road, Takeley, Bishop's Stortford, CM226PU, Gran
Bretaña) o equivalente.
g Un producto Parker Hannifin tipo 8FV12LNSS (Parker Hannifin ple., Riverside Road, Barnstable, Devon EX31 1 NP, Gran Bretaña) o equivalente.
h Coeficiente de Flujo, según lo define la norma ISA S75.02 Control valve capacity test procedure en Standards and Recommended Practices for fnstrumentation
and Control, 1Orna. edición, Vol. 2; 1989. Publicada por lnstrument Society of America, 67 Alexander Drive, PO Box 1227, Research Triangle Park, NC 27709,
EE.UU.

Aparato 8-EI aparato es similar al que se describe en la Figura 7 para analizar los aerosoles para inhalación. Sin embargo, en
este caso el filtro y el tubo de recolección tienen un diámetro interno mayor para poder alojar discos de filtro de 47 mm de
diámetro. Esta característica permite la recolección de las dosis a mayores velocidades de flujo de aire-hasta 100 L de aire/
minuto-cuando resulta necesario. Un adaptador de boquilla garantiza un sellado hermético entre el tubo de recolección y la
boquilla del polvo para inhalación en análisis. El adaptador de boquilla debe garantizar que el extremo de la boquilla del pro-
ducto esté a nivel con el extremo abierto del tubo de recolección de la muestra. Los conectores de tubería, si se emplean,
deben tener un diámetro interno ;:>:8 mm para evitar que sus propios diámetros internos creen una resistencia significativa al
flujo de aire. Se debe seleccionar una bomba de vacío con un exceso de capacidad para extraer aire a la velocidad de flujo
volumétrico especificada a través del aparato de muestreo y del producto simultáneamente. Una válvula de dos vías, operada
mediante solenoide, de baja resistencia y controlada por un temporizador está interpuesta entre la bomba de vacío y la válvula
de control de flujo para controlar la duración del flujo. Este tipo de válvula permite que se extraigan 4,0 L de aire (±5%) desde
la boquilla del producto a la velocidad de flujo especificada. El control del flujo se logra asegurando que se produzca un flujo
crítico (sónico) en la válvula de control de flujo (la relación de presión absoluta P3/P2 es:-:; 0,5 en condiciones de flujo estacio-
nario).
Procedimiento-Operar el aparato a un flujo de aire que produzca una caída de presión de 4 kPa (40,8 cm de HzÜ) en el pro-
ducto a analizar y durante un lapso de tiempo que sea congruente con la extracción de 2,0 L de aire desde la boquilla del
producto. [NOTA-Si la velocidad de flujo y la duración se definieran de forma diferente en la monografía, ajustar el sistema
con una aproximación de 5% con respecto a esos valores.] El volumen del aire muestreado no debe exceder de 2,0 L. Deter-
minar la velocidad de flujo de prueba usando el Aparato B de la siguiente manera. Insertar el producto en el adaptador de
boquilla para asegurar un sellado hermético. En los casos en que el envase del medicamento modifique la resistencia del pro-
ducto al flujo de aire, usar un dispositivo con el envase cargado, sin el medicamento (con el envase previamente vaciado). En
los otros casos, usar un dispositivo sin carga (sin el medicamento). Conectar un puerto de un transductor de presión diferencial
a la llave de presión, Pl, y dejar el otro abierto a la atmósfera exterior. Encender la bomba y abrir la válvula solenoide de dos
vías. Ajustar la válvula de control de flujo hasta que la caída de presión a través del producto sea de 4,0 kPa (40,8 cm de HzÜ).
USP 40 Pruebas Físicas/ (601) Medicamentos Nasales y para Inhalación 515

Asegurarse de que se produzca un flujo crítico (sónico) en la válvula de control de flujo determinando los valores individuales
de presión absoluta P2 y P3 de manera que la relación P3/P2 sea ~0,5. Si no se logra la relación P3/P2, cambiar la bomba por
una más potente y medir nuevamente la velocidad de flujo. Las condiciones de flujo crítico (sónico) en la válvula de control de
flujo son necesarias para asegurar que el flujo volumétrico de aire extraído de la boquilla no se vea afectado por fluctuaciones
de la bomba y modificaciones de la resistencia al flujo de aire en el producto. Retirar el producto del adaptador de boquilla sin
alterar la válvula de control de flujo, medir la velocidad del flujo de aire extraído desde la boquilla, Q0 w conectando hermética-
mente un caudalímetro al adaptador de boquilla. Emplear un caudalímetro calibrado para medir el flujo volumétrico que sale
del medidor de manera hermética para determinar directamente Oout o, si tal medidor no se pudiera obtener, calcular el flujo
volumétrico que sale del medidor (Qout) empleando la ley de los gases ideales. Por ejemplo, para un medidor calibrado para el
flujo volumétrico de entrada (Q;0 ) calcular:

P0 = presión atmosférica
ti.P = caída de la presión en el medidor
Si la velocidad de flujo es> 100 L de aire/minuto, ajustar la válvula de control de flujo hasta que Oout sea igual a 100 L/minuto;
de lo contrario, registrar el valor de Oouti sin modificar la válvula de control de flujo. Definir la duración del flujo de prueba,
p.ej., a 60 L/minuto T = 120/Q0 w en segundos, de manera que un volumen de 2,0 L de aire (±5%) se extraiga del producto a
la velocidad de flujo de prueba Oout y ajustar de manera correspondiente el temporizador que controla la operación de la válvu-
la solenoide de dos vías. Cebar o cargar el dispositivo con polvo para inhalación conforme a las instrucciones que figuran en la
etiqueta. Con la bomba de vacío en funcionamiento y la válvula solenoide cerrada, insertar la boquilla del producto horizontal-
mente en el adaptador de boquilla. Descargar el polvo en el aparato de muestreo activando el temporizador que controla la
válvula solenoide y extrayendo 2,0 L de aire desde el producto a la velocidad de flujo previamente definida. Repetir la opera-
ción completan - 1 veces, comenzando donde dice "Cebar o cargar el dispositivo con polvo", en donde n es el número de
veces definido en el etiquetado como la dosis mínima recomendada. Desmontar el envase del dispositivo de polvo para inhala-
ción del aparato de muestreo y desconectar la tubería de vacío D. Valorar el contenido de fármaco en el aparato después de
enjuagar el filtro y el interior del aparato con un disolvente adecuado. Cuando se especifique en la monografía individual, reali-
zar esta prueba en condiciones de temperatura y humedad controladas.

B. DISTRIBUCIÓN DEL TAMAÑO DE GOTITAS/PARTÍCULAS-AEROSOLES, ATOMIZADORES V

POLVOS NASALES

En el caso de aerosoles, atomizadores y polvos nasales en suspensión y en solución, la distribución del tamaño de las gotitas/
partículas se debe determinar para la nube liberada subsiguiente a la descarga en condiciones experimentales especificadas. Si
se usa un método de difracción de láser (para más detalles, consultar la descripción de este método en la sección siguiente), la
distribución del tamaño de las gotitas se puede controlar en términos de intervalos para el 1Oº (0 10 ), 50º (0 50 ) y 90º (0 90 ) per-
centil de la distribución de tamaño acumulativa ponderada por volumen (masa), así como el alcance de la distribución, expre-
sado como [(0 90 - 0 10 )/ 0 50 ], y el porcentaje de gotitas de menos de 1O µm. Se debe tomar en cuenta que 0 50 es idéntico al
diámetro medio del volumen (masa) cuando la distribución es unimodal. Los procedimientos analíticos apropiados y validados
o calibrados para la determinación del tamaño de las gotitas/partículas emitidas deben describirse a detalle suficiente para per-
mitir una evaluación exacta y reproducible que incluya lo siguiente:
• información completa sobre el aparato y los accesorios
• modo teórico (aproximación de Lorenz-Mie o de Fraunhofer)
• la aplicación de la opción de desactivación para uno o más de los detectores más internos para mitigar los efectos del
direccionamiento del haz (sólo se aplica a aerosoles nasales)
• versión del software
• colocación de la muestra con respecto al banco óptico del difractómetro del láser
• intervalo de medición
• ancho del haz
• condición de accionamiento del láser con respecto al inicio y el término de la secuencia de medición
• límite inferior de detección (si no se usa el accionamiento del láser)
•y límite de obstrucción de luz (límite superior del intervalo de detección en términos de la concentración de partículas).

B.1 Medición del Tamaño de Partícula por Difracción de Láser

Los medicamentos nasales destinados para aplicación tópica en la cavidad nasal producen gotitas líquidas que a menudo
son mucho más grandes que el intervalo de operación de los impactadores inerciales multiestación. Por ende, la difracción de
láser (en ocasiones llamada dispersión de luz láser en ángulo bajo) es una alternativa aceptable para determinar la distribución
del tamaño debido a que no hay necesidad de relacionar la escala del tamaño con el diámetro aerodinámico.
La teoría y los principios operativos para la difracción de láser se encuentran adecuadamente descritos en la norma ISO
13320:2009. Estos sistemas usan el patrón de dispersión de luz producido por el paso de una nube de gotitas a través de la
516 (601) Medicamentos Nasales y para Inhalación /Pruebas Físicas USP 40

zona de medición para desarrollar la distribución de tamaño ponderada por volumen en un proceso iterativo en el que se usa
un modelo teórico (ya sea de Fraunhofer o de Lorenz-Mie) para interpretar los datos. El proceso se resume esquemáticamente
en la figura Figura 3. [NOTA-Si se selecciona la opción del modelo de Lorenz-Mie, será necesario ingresar valores para los
componentes reales (refracción) e imaginarios (absorción) del índice de refracción para el líquido que se está estudiando. Los
fabricantes de equipos de difracción de láser proveen esta información para medios líquidos comúnmente encontrados, a tra-
vés de su sitio Web o a solicitud.]

repetir mues ~ ve~s

1a3 - 1a4 Hz para acumulat datas
brutos

aplicar modelo para convertir la setial

de intensidad d,e dispérsi~n angular
a db}tribución por tamaño
ponderada por'voliJmen (v·l'SO)

Los procesos usados para derivar

la v-PSD son propiedad de cada
fabricante de instrumento.

Figura 3. Conversión de los datos de dispersión de luz en una distribución del tamaño de las gotitas por difractometría de
láser.

Se requiere un aparato que sea capaz de evaluar aerosoles o atomizadores. [NOTA-no todos los equipos de difracción de
láser disponibles comercialmente tienen dicha capacidad.] Configurar el sistema de medición de acuerdo con el procedimiento
descrito esquemáticamente en la Figura 4.

Figura 4. Configuración para difractometría de láser con un medicamento nasal.

Los atomizadores para medicamentos nasales por lo general se miden usando un arreglo de banco abierto con una configu-
ración de estación de accionamiento automático de manera que se pueda optimizar la reproducibilidad de la operación del
inhalador de un accionamiento al siguiente. Esta precaución es particularmente importante para mediciones más exactas con
bombas para atomizadores nasales. Verificar la alineación del inhalador con la configuración óptica del difractómetro de láser
usando las herramientas provistas por el fabricante para optimizar el banco óptico. Verificar que la obstrucción del haz de luz
esté dentro de los límites superior e inferior especificados por el fabricante, consultando el manual del operador para el sistema
de difracción de láser que se esté usando. Es necesaria la extracción de vacío para eliminar las gotitas de manera eficiente des-
pués de que pasan a través del láser. Se podría presentar un resultado no representativo si el ajuste de este valor es demasiado
bajo (por lo general <5%). Asimismo, ocurrirá un error no cuantificable debido a la dispersión múltiple si la obstrucción de la
luz está por encima del límite superior recomendado. [NOTA-Este límite varía entre fabricantes y además puede variar entre
los sistemas de difracción de láser del mismo fabricante.]
Realizar tantas determinaciones repetidas como sea necesario para lograr un conjunto de datos representativo. Inspeccionar
cada distribución de tamaño presentada, idealmente en formato diferencial ponderado por volumen o equivalente para eva-
USP 40 Pruebas Físicas/ (601) Medicamentos Nasales y para Inhalación 517

luar si es o no unimodal y simétrica. [NOTA-El siguiente análisis de datos asume el cumplimiento con estos criterios. En caso
contrario, puede ser necesario un análisis adicional que tome en cuenta la presencia de más de un modo en la distribución o
sesgo.]
Asumiendo que la densidad del líquido que se investiga es constante independientemente del tamaño de las gotitas, las dis-
tribuciones de tamaño ponderadas por volumen se pueden tratar como distribuciones de tamaño ponderadas por masa con el
propósito de interpretar los datos. A partir de los datos acumulativos de distribución del tamaño-volumen, calcular la media y
una desviación estándar para los tamaños que correspondan a fracciones de masa de menos del 10%, 50% y 90% de la distri-
bución (0 70 , 0 50 y 0 90 ).

Cambio en la redactlón:

C. DISTRIBUCIÓN DEL TAMAÑO AERODINÁMICO-AEROSOLES, ATOMIZADORES V POLVOS

PARA INHALACIÓN

C.1 Principios Generales de la Medición del Tamaño Aerodinámico de Partículas

La distribución del tamaño de partículas o gotitas en la nube descargada por los aerosoles y atomizadores para inhalación y
la distribución del tamaño de partículas en la nube descargada de los polvos para inhalación son parámetros importantes para
evaluar el desempeño del producto. Aunque se puede usar la medición del tamaño de partícula por microscopía para evaluar
el número de partículas grandes, de aglomerados y de partículas extrañas en las emisiones de los aerosoles y atomizadores
para inhalación, cuando sea posible, esta prueba debe reemplazarse con un método para determinar la distribución del tama-
ño aerodinámico del aerosol del fármaco que abandona el producto. El diámetro aerodinámico de una partícula de aerosol es
igual al diámetro de una esfera de densidad unitaria con la misma velocidad gravimétrica de asentamiento. La distribución de
tamaño aerodinámico define la forma en que un aerosol se deposita durante la inhalación. En la práctica, muchos inhaladores
descargan fármaco en forma de partículas o gotitas de gran tamaño (la fracción balística) que salen del inhalador a gran velo-
cidad e impactan quedando capturadas en las superficies húmedas de la boca y garganta. El remanente de la descarga del
inhalador es aerosol útil, una "fracción no balística" que se inhala en el resto del tracto respiratorio.
Los dispositivos de impacto en cascada clasifican las partículas y las gotas de los aerosoles de acuerdo con los diámetros ae-
rodinámicos. El principio de operación de estos dispositivos, mediante el cual las partículas y gotitas de aerosol se separan de la
corriente de aire en movimiento por su inercia, se muestra en la Figura 5. Debido a que las dimensiones del tubo de admisión
utilizado para conectar los productos a impactadores en cascada y a impactadores en fase líquida (que se muestran en los
Aparatos 1; 2; 3; 4; 5 y 6) también definen la masa del fármaco que ingresa en el dispositivo para clasificar el tamaño aerodiná-
mico, estas dimensiones se definen cuidadosamente y, cuando es posible, se mantienen constantes entre aparatos (ver las
Figuras 6; 7; 8; 9; 1O y 11).

C.1.1 MEDICIÓN DE ESTACIÓN

Los fabricantes de dispositivos de impacto en cascada proporcionan una calibración definitiva para las características de se-
paración de cada estación de impacto en términos de la relación entre la eficiencia de recolección a dicha estación y el diáme-
tro aerodinámico de las partículas y gotitas que la atraviesan en forma de aerosol. La calibración es una propiedad que depen-
de de la dimensión y la disposición espacial del chorro, de la superficie sobre la que se recoge, y de la velocidad del flujo de
aire que atraviesa. Debido a que los chorros pueden causar corrosión y desgaste a lo largo del tiempo, las dimensiones críticas
de cada estación, que definen la calibración de la estación de impacto, deben medirse periódicamente. Este proceso conocido
como medición de estación evita la necesidad de la calibración repetida usando aerosoles estándar y asegura que, en el análisis
de las emisiones de los productos, sólo se utilicen aquellos dispositivos que cumplen con las especificaciones. El proceso inclu-
ye la medición y el ajuste de las dimensiones críticas del instrumento.
518 (601) Medicamentos Nasales y para Inhalación / Pruebas Físicas USP 40

Partículas en aerosol

Estación inicial
de la descarga

Sello-------

Primera estación
de la descarga -

Placa colectora

Última estación
de la descarga ---.ii/

Placa colectora

Vacío

Figura 5. Representación esquemática del principio de operación de los impactadores en cascada. (Se muestra un solo cho-
rro por estación del impactador. Los impactadores con chorros múltiples en cada estación funcionan de la misma manera.)

C.1.2 PÉRDIDA DE FÁRMACO ENTRE ESTACIONES (PÉRDIDAS EN LAS PAREDES)

Cuando sean posibles variaciones en la metodología y no se especifique un aparato en la monografía, el procedimiento se-
leccionado debe asegurar que se pierda no más del 5% de la masa de fármaco total descargada del producto (dentro del im-
pactador) entre las superficies de recolección de muestra del dispositivo de impacto. En el caso de que se sepa que las pérdidas
de fármaco entre estaciones son >5%, se debe usar otro aparato alternativo o bien el procedimiento debe realizarse de tal for-
ma que las pérdidas en las paredes se incluyan junto con la recolección de la placa asociada. A modo de ejemplo, los siguien-
tes procedimientos descritos para los Aparatos 7 y 3 han sido redactados incluyendo las pérdidas en las paredes junto con la
placa de recolección asociada. No obstante, siempre que se sepa que tales pérdidas son :s;5% de la masa total de fármaco des-
cargada dentro del impactador y que no haya instrucciones contrarias en una monografía individual, el procedimiento puede
simplificarse valorando sólo el fármaco que está sobre las placas de recolección.

C.1.3 REINGRESO POR ARRASTRE

Cuando sea posible variar la metodología, el método seleccionado debe apuntar a minimizar el reingreso de partículas por
arrastre (desde una estación de impacto superior a una inferior) en las estaciones que contribuyan a fracciones del tamaño
definido en la monografía individual, especialmente cuando esto pueda alterar las cantidades recolectadas de fármaco. Mini-
mizar el número de dosis muestreadas, usar superficies de recolección de partículas recubiertas y probar que los procedimien-
tos para dosis múltiples producen resultados estadísticamente similares a los obtenidos a partir de un número de dosis menor
son métodos que se pueden emplear para este propósito. En el caso de que no se pueda evitar el reingreso por arrastre, se
deben normalizar el número de dosis recolectadas, el intervalo de tiempo entre dosis y la duración total del flujo de aire a
través del dispositivo de impacto en cascada. En estas circunstancias, la presentación de los datos de impacto no debe asumir
la validez de la calibración del impactador (es decir, los rangos de diámetros aerodinámicos no deben ser asignados a masas de
fármacos recolectadas en estaciones específicas).
Usando métodos de valoración apropiados y un dispositivo de impacto medido adecuado, los analistas pueden determinar
la distribución de tamaño aerodinámico de partículas de los fármacos que salen de las boquillas de los aerosoles y atomizado-
USP 40 Pruebas Físicas/ (601) Medicamentos Nasales y para Inhalación 519

res para inhalación o polvos para inhalación. Si los límites de temperatura o humedad para el uso del producto están indicados
en la etiqueta, puede ser necesario controlar la temperatura y la humedad del aire del entorno del dispositivo y del aire que lo
atraviesa para que se ajusten a esos límites. Se presumen las condiciones ambientales, salvo que se especifique algo diferente
en las monografías individuales.

C.1 .4 BALANCE DE MASA

Además de la distribución de tamaño, las buenas prácticas analíticas dictan que se debe lograr un balance de masa comple-
to para confirmar que toda la cantidad de fármaco descargada desde el producto y que se captura y se mide en el tubo de
admisión a través del filtro terminal del mpactador en cascada, esté comprendida en el intervalo aceptable con respecto a la
dosis liberada medida. El resultado para la masa recuperada se puede expresar en términos de cada accionamiento como por-
centaje de la dosis liberada declarada, la cual representa la dosis liberada desde la boquilla.
La masa total de fármaco recolectada en todos los componentes (balance de material) dividida por el número total de dosis
mínimas recomendadas descargadas es por lo regular no menos de 85% y no más de 115% de la cantidad declarada que se
espera liberar. Ésta no es una prueba del producto pero sirve para asegurar que los resultados de la prueba son válidos.
Procedimiento
Usar uno de los siguientes dispositivos de impacto multiestación, o uno equivalente, para determinar la distribución de ta-
maño aerodinámico de partículas de los fármacos que salen de las boquillas de aerosoles y atomizadores para inhalación o
polvos para inhalación. Los Aparatos 1 y 6 [Figuras 6 y 11 (sin preseparador), respectivamente] están destinados para su uso
con aerosoles y atomizadores para inhalación a una sola velocidad de flujo de aire. Los Aparatos 2, 3, 4 y 5 (Figuras 8, 9, 1Oy
11, respectivamente) están destinados para uso con polvos para inhalación a la velocidad de flujo de aire apropiada, Oouu de-
terminada anteriormente, siempre que el valor Oout esté comprendido en el intervalo de 30-100 L/minuto. [NOTA-Si Oout es
>100 L/minuto, la prueba debe ser realizada ajustando Oout a 100 L/minuto; si Oout es menor que 30 L/minuto, la prueba se
realiza con Oout a 30 L/minuto.]
La Tabla 2 indica el aparato usado para determinar el tamaño aerodinámico de partículas y los productos que se pueden
evaluar.
Tabla 2. Aparato para Tamaño Aerodinámico de Partícula:
Su Descripción y los Productos que se Pueden Evaluar
Aparato Descripción Producto
1 lmpactador (no viable de 8 estaciones) Andersen (sin preseparador) Aerosoles y atomizadores para inhalación
2 lmpactador Marple-Miller Polvos para inhalación
3 lmpactador (no viable de 8 estaciones) Andersen (con preseparador) Polvos para inhalación
4 lmpactador Multiestación en Fase Líquida Polvos para inhalación
5 lmpactador de Nueva Generación (con preseparador) Polvos para inhalación
6 lmpactador de Nueva Generación (sin preseparador) Aerosoles y atomizadores para inhalación

Tabla 3. Valores Límite para Todos los lmpactadores a Velocidades de Flujo Especificadas
a. Puntos de Corte para los Aparatos 1 y 3 con Configuración Estándar para Operación a 28,3 L/minuto en Comparación con
Configuraciones Especializadas para Uso a 60 L/minuto y 90 L/minuto
Estación 28,3 ml/minuto 60 L/minuto 90 L/minuto
-2 - - 8,0
-1 - 8,6 6,5

ºª1 9,0
5,8
6,5
4,4
5,2
3,5
2 4,7 3,2 2,6
3 3,3 1,9 1,7
4 2,1 1,2 1,0
5 1,1 0,55 0,22
6 0,7 0,26 -

7 0,4 - -

ª La versión de la estación O usada a 60 y 90 L/minuto presenta modificación externa que permite otra estación en lugar de equiparla con el cono adaptador de
admisión. Sus características y desempeño internos se mantienen sin cambios.
520 (601) Medicamentos Nasales y para Inhalación / Pruebas Físicas USP 40

b. Puntos de Corte (µm) para el Aparato 2 a 60 y 90 L/minuto

Velocidad de Flujo Velocidad de Flujo
Estación 60 L/mlnuto 90 L/minuto
1 10,0 8,1
2 5,0 4,0
3 2,5 2,0
4 1,25 1,0
5 0,63 0,5

c. Puntos de Corte (µm) para el Aparato 4 a 60 L/minuto

Velocidad de Flujo
Estación (60 L/minuto)
1 13,0
2 6,8
3 3,1
4 1,7

d. Puntos de Corte (µm) para el Aparato S y 6 a 30, 60 y 100 L/mlnuto

Velocidad de Flujo Velocidad de Flujo Velocidad de Flujo
Estación (30 L/minuto) (60 L/minuto) (100 L/mlnuto)
1 11,76 8,06 6,12
2 6,40 4,46 3,42
3 3,97 2,82 2,18
4 2,30 1,66 1,31
5 1,36 0,94 0,72
6 0,83 0,55 0,40
7 0,54 0,34 0,24
MOCª 0,36 0,14 0,07
ª MOC =colector con microorificios (MOC, por sus siglas en inglés). Los tamaños corresponden a una eficiencia de recolección del 80% para esta estación de
respaldo.

C.2 Aparato 1 para Aerosoles y Atomizadores para lnhalación-lmpactador Andersen (sin

preseparador)

Usar el Aparato 7 o un equivalente, a una velocidad de flujo de 28,3 L/minuto (±5%) conforme a lo especificado por el fabri-
cante del impactador en cascada.

C.2.1 DISEÑO-APARATO 1

El diseño y montaje de este aparato y del tubo de admisión para conectar el impactador a un producto se muestran en las
Figuras 6, 6a y 6b. 1

1 Se puede obtener un impactador en cascada adecuado como Modelo Mk 11 de Thermo-Electron, 27 Forge Parkway, Franklin, MA 02038. El impactador se usa sin
el preseparador. El producto se conecta al impactador a través del tubo de admisión, por encima del cono de ingreso que se muestra en la Figura 6. Si se emplea
un impactador equivalente, se debe utilizar el tubo de admisión de la Figura 60, aunque el cono de ingreso (Figura 6b) debe ser reemplazado por otro que se ajuste
al impactador en cuestión. Se debe tener en cuenta que las superficies internas del tubo de admisión (Figura 60) están diseñadas para ajustarse a nivel con sus
contrapartes en el cono de ingreso (Figura 6b). Este diseño evita la captura del aerosol en la junta entre los dos tubos.
USP 40 Pruebas Físicas/ (601) Medicamentos Nasales y para Inhalación 521

Boquilla del
..____Inhalador
Tubo de ~-----r-
Admisión-----.: 1-;::-=-c:;-:....L__-i:=-<--'
1 1
1 1
I_~
1 1
: _ _!
Cono de Ingreso ------...

Figura 6. Aparato 1: Montaje del tubo de admisión y del cono de ingreso sobre el impactador en cascada.

Tubo de adm1s1on para el Muestreador de Andersen Nueva medida para clarificar el punto
Vers1on de Boca Grande-Doble Estrecham1~nto~ donde cambia el estrechamiento

/ 97
// -- , -- _, ~~~)@l.~7'119~~~~~:"§'~==,rr--
Nota Usarla min1ma luz para
-. - - 19,0 31,8 38 10º± 1º 30º± 1º

atomillarlaparte1nferiory
permitirunaal1neac1ónprec1sa /
/
/
/
/
14,3 / La junta DEBE ser a prueba de fugas
/
28,6 /
/

/~
~5'tl' tornillo de cabeza roscada
Número 8-32 ó M-4--
/ Note
/ 1) El material puede ser aluminio, acero
/ inoxidable u otro material adecuado
2) Tornear a partir de una barra estándar de 38 mm (1,5*)
3) Hacerunor1ficiode 19mmenlabarra f
4) Cortar el tubo en un ángulo de 45º exactos como se muestra - - 1Oº± 1º
5) La parte interna de losorific1osyde losestrecham1entosdebeestarpul1da
La rugosidad de la superficie (Ra) es de aproximadamente
0,40m1crones(16micropulgadas)
6) Pulir las juntasen labarraparagenerarunsellosin fugas Vista isométrica del
para losliqu1dos
7) Montar un soporte para alinear el interior del orificio de 19 mm y
tubo de admisión
para taladrar las roscas M-4x0,7ó8-32yobturarlas.
Prácticamente no debe haberdefectosdeal1neac1ónentreel
intenordelosonficiosen la Junta

Figura 6a. Aparato 1: Vista expandida del tubo de admisión para uso con aerosoles y atomizadores para inhalación y polvos
para inhalación.
522 (601) Medicamentos Nasales y para Inhalación / Pruebas Físicas USP 40

• 6,4
+ns~~ Romper todos los bordes
+75,2 EXCEPTO este borde interno

+71
.. 31 ' 75+,00
1!1-----1f-'"'1i-r--- ,. -,05

Puerto de entrada del muestreador de Andersen

12,3 30.2

R9,5 ! !

Profundidad: 2,5 hasta el _ _ _~

fondo del estrechamiento
del agujero

Las medidas están en mm a menos que se indique algo diferente

Figura 6b. Aparato 1: Vista expandida del cono de ingreso para montar el tubo de admisión en el impactador en cascada
Andersen sin preseparador. El material puede ser aluminio, acero inoxidable u otro material adecuado. La rugosidad de la su-
perficie (R 0 ) debe ser aproximadamente de 0,4 µm.

Las dimensiones críticas de ingeniería de los fabricantes para las estaciones del Aparato 1 figuran en la Tabla 4. Durante el
uso, puede producirse la oclusión y bloqueo de las toberas de chorros y, por lo tanto, es necesario justificar las tolerancias de
medición durante el uso.
Tabla 4. Dimensiones Críticas para las Toberas de Chorro del Aparato 1
Número Diámetro de
Número de Estación de Chorros Tobera (mm)
o 96 2,55 ± 0,025
1 96 1,89 ± 0,025
2 400 0,914 ± 0,013
3 400 0,711 ± 0,013
4 400 0,533 ± 0,013
5 400 0,343 ± 0,013
6 400 0,254 ± 0,013
7 201 0,254 ± 0,013

C.2.2 PROCEDIMIENTO-APARATO 1

Ajustar el impactador en cascada de múltiples estaciones según se describe en las instrucciones del fabricante, con un filtro
terminal debajo de la última estación para capturar todas las partículas finas que de otra manera escaparían del dispositivo.
Para asegurar una captura eficiente de partículas, recubrir la superficie de recolección de partículas de cada estación con glice-
rol, aceite siliconado u otro líquido adecuado generalmente depositado a partir de un disolvente volátil, a menos que se haya
demostrado que esto es innecesario. Unir el tubo de admisión y el adaptador de boquilla de manera que se produzca un sella-
do hermético entre la boquilla del producto y el tubo de admisión según se muestra en la Figura 6. Emplear un adaptador de
boquilla que garantice que el extremo de la boquilla del producto está a nivel con el extremo abierto del tubo de admisión.
Asegurarse de que las diferentes estaciones del impactador en cascada están conectadas y selladas herméticamente para evitar
fugas. Encender la bomba de vacío para extraer el aire a través del impactador en cascada y calibrar el flujo de aire a través del
sistema con un caudalímetro apropiado unido al extremo abierto del tubo de admisión. Ajustar la válvula de control de flujo en
la bomba de vacío para lograr un flujo constante a través del sistema a la velocidad requerida y asegurarse de que el flujo de
USP 40 Pruebas Físicas/ (601) Medicamentos Nasales y para Inhalación 523

aire a través del sistema quede comprendido en un intervalo de ±5% con respecto a la velocidad de flujo especificada por el
fabricante. A menos que se indique algo diferente en las instrucciones de uso para el paciente, agitar el producto durante 5
segundos y accionar el disparador para desechar una descarga. Con la bomba de vacío en funcionamiento, insertar la boquilla
en su adaptador e inmediatamente pulsar para descargar la dosis mínima recomendada en el impactador en cascada. Mante-
ner la válvula presionada durante el tiempo suficiente para garantizar que la dosis se haya descargado por completo. Si se re-
quieren atomizaciones adicionales para recolectar la muestra, esperar 5 segundos antes de desmontar el producto del adapta-
dor de boquilla, agitar el producto, colocarlo nuevamente en el adaptador e inmediatamente pulsar para descargar la siguien-
te dosis mínima recomendada. Repetir hasta que se haya descargado el número de dosis requerido. El número de dosis míni-
mas recomendadas debe ser tal que permita una determinación exacta y precisa de la distribución de tamaño aerodinámico.
[NOTA-Usualmente, el número de dosis mínimas recomendadas no es> 1O.] Después de descargar la última dosis, retirar el
producto del adaptador de boquilla. Enjuagar el adaptador de boquilla y el tubo de admisión con un disolvente adecuado, y
diluir los enjuagues cuantitativamente hasta un volumen apropiado. Desmontar el impactador en cascada, colocar cada esta-
ción y su respectiva placa de recolección o filtro asociado en sendos recipientes y enjuagar para extraer el fármaco de cada uno
de éstos. [NOTA-Si se ha determinado que las pérdidas en las paredes del impactador son :<:;5%, entonces se necesita analizar
solamente el material recolectado en las placas.] Diluir cada uno cuantitativamente hasta un volumen apropiado. Empleando el
método de análisis especificado en la monografía individual, determinar la masa de fármaco recolectada en cada uno de los
componentes. Para analizar los datos, proceder según se indica en Análisis de Datos.

C.3 Aparato 2 para Polvos para lnhalación-lmpactador Marple-Miller

C.3.1 DISEÑO-APARATO 2

El diseño y el montaje del Aparato 2 y del tubo de admisión para conectar el impactador al producto se muestran en la
Figura 8. 2 [NOTA-El tubo de admisión se muestra en detalle en la Figura 6a.] El impactador tiene cinco estaciones de impacta-
ción y un filtro terminal. A una velocidad de flujo volumétrico de aire de 60 L/minuto (la velocidad del flujo nominal, On), los
diámetros aerodinámicos límite D5 o,on de las Estaciones 1-5 son 10; 5; 2,5; 1,25 y 0,625 µm, respectivamente. El filtro terminal
retiene eficazmente el fármaco suspendido en el aerosol en el rango de tamaño de partícula de hasta 0,625 µm. Colocar el
impactador en cascada multiestación con el sistema de control según se especifica en la Figura 7. Para asegurar una captura
eficiente de partículas, recubrir la superficie de recolección de partículas de cada estación con glicerol, aceite siliconado u otro
líquido adecuado generalmente depositado a partir de un disolvente volátil, a menos que se haya demostrado que esto es in-
necesario. Ensamblar el impactador, según se describe en las instrucciones del fabricante, con un filtro terminal por debajo de
la estación final para capturar todas las partículas finas que de otra manera escaparían del dispositivo. Unir el tubo de admisión
y el adaptador de boquilla, de manera que se produzca un sellado hermético entre la boquilla del producto y el tubo de admi-
sión. Emplear un adaptador de boquilla que garantice que el extremo de la boquilla del producto está a nivel con el extremo
abierto del tubo de admisión. Asegurarse de que las diferentes estaciones del impactador en cascada están conectadas y sella-
das herméticamente para evitar fugas.
Poner en marcha la bomba de vacío, abrir la válvula solenoide y calibrar el flujo de aire a través del sistema según se indica a
continuación. Conectar un caudalímetro al tubo de admisión. Emplear un caudalímetro calibrado para medir el flujo volumétri-
co que sale del medidor para determinar directamente Oour o, si tal medidor no se pudiera obtener, calcular el flujo volumétri-
co que sale del medidor (Oour) empleando la ley de los gases ideales. Por ejemplo, para un medidor calibrado para el flujo volu-
métrico de entrada (Q;n), calcular:

P0 = presión atmosférica
i'iP = caída de la presión en el medidor
Ajustar la válvula de control de flujo para lograr un flujo constante a través del sistema a la velocidad requerida, Q00 r, de mane-
ra que el valor de Q00 r está dentro del ±5% del valor determinado durante la prueba de Uniformidad de Dosis Liberada. Asegurar
que se produzca el flujo crítico en la válvula de control de flujo a la velocidad de flujo que se va a emplear durante la prueba,
empleando el siguiente procedimiento. Con el producto montado en su lugar y el flujo de aire deseado en circulación, medir
la presión absoluta a ambos lados de la válvula de control de flujo (P2 y P3 en la Figura 7). Una relación de P3/P2 :s;0,5 indica
flujo crítico. Si no se alcanza esta relación de P3/P2, cambiar la bomba por una más potente y medir nuevamente la velocidad
de flujo de prueba. Ajustar el temporizador que controla la operación de la válvula solenoide de dos vías, de manera que abra
esta válvula durante un lapso de •tie111po talque el volumen total muestreado sea corno mínimo 4 L.• ERR(Ol-dic-2015¡ Cebar o
cargar el polvo para inhalación conforme a las instrucciones que figuran en la etiqueta. Con la bomba de vacío en funciona-
miento y la válvula solenoide de dos vías cerrada, insertar la boquilla del producto en forma horizontal en el adaptador de
boquilla del tubo de admisión. Descargar el polvo dentro del aparato, abriendo la válvula solenoide de dos vías durante un
lapso de T segundos. Después de que la válvula solenoide de dos vías se haya cerrado, retirar el producto del adaptador de
boquilla. Si se requieren dosis adicionales para recolectar la muestra, recargar el producto según las instrucciones que figuran

2 Se puede obtener el impactador en cascada como Modelo 160 Marple-Miller Impactar en MSP Corporation, Minneapolis, MN. El producto debe conectarse al
impactador mediante el tubo de admisión que se muestra en la Figura 6a.
524 (601) Medicamentos Nasales y para Inhalación / Pruebas Físicas USP 40

en la etiqueta, reinsertar la boquilla en el adaptador de boquilla y repetir la operación hasta que el número de dosis requerido
haya sido descargado. Después de la descarga de la ultima dosis, apagar la bomba de vacío. Enjuagar el adaptador de boquilla
y el tubo de admisión con un disolvente adecuado y diluir los enjuagues cuantitativamente hasta un volumen apropiado. Des-
montar el impactador en cascada y colocar el filtro terminal en un recipiente aparte. Enjuagar para extraer el fármaco de cada
una de las estaciones y del filtro y diluir cuantitativamente cada uno hasta un volumen apropiado. Empleando el método de
análisis especificado en la monografía individual, determinar la masa de fármaco recolectada en cada uno de los componentes.

F Adaptador
Válvula de control de flujo de boquilla
E

Aparatos
2, 3ó4

Bomba
de vacío
P3 P2
D
de dos vías
e A B

Figura 7. Aparatos 2; 3, 4 ó 5: Equipos de control general. (Ver la Tabla 6 para especificaciones de los componentes.)

Recipiente de cubeta
recolectora de la

Figura 8. Aparato 2: Montaje del tubo de admisión, colector de estaciones y portafiltro. (lmpactador Marple-Miller, Modelo
160 con tubo de admisión USP.)

Tabla 5. Dimensiones Críticas para las Toberas de Chorro del Aparato 2

Número de Número de Diámetro de
Estación Chorros Tobera (mm)
1 1 16,8 ± 0,05
2 20 3,40 ± 0,03
3 40 1,70 ± 0,01
4 80 0,84 ± 0,01
5 160 0,41 ± 0,01
USP 40 Pruebas Físicas/ (601) Medicamentos Nasales y para Inhalación 525

C.3.2 PROCEDIMIENTO-APARATO 2

Realizar la prueba utilizando el Aparato 2 a la velocidad de flujo de aire, Oaut determinada anteriormente, durante la prueba
de Uniformidad de Dosis Liberada, siempre que Oaut sea :o:l 00 L/minuto. [NOTA-Si Oaut es> 100 L/minuto, utilizar una velocidad
de flujo de aire de 100 L/minuto.] Conectar el aparato al sistema de control de flujo basado en el flujo crítico (sónico) según se
especifica en la Figura 7 (ver también la Tabla 6).
Tabla 6. Especificaciones de los Componentes para la Figura 7
Código Artículo Descripción Dimensiones
p.ej., acoplamiento corto de metal con ra-
A Conector mificación a P3 de diámetro menor 28 mm de diámetro interno
p.ej., tubería de silicona con un diámetro
externo de 14 mm y un diámetro interno Un tubo de longitud adecuada de diámetro interno 28 mm
B Tubería de vacío de8mm con un volumen interno de 25 ml ± 5 ml
Válvula solenoide de 2 vías, 2 puertos, con un diámetro in-
Válvula solenoide de dos terno 28 mm y un tiempo de respuesta de apertura de
c víasª Ver la Figura 7 '.":l 00 milisegundos.
La bomba debe ser capaz de extraer a la velocidad de flujo
requerida a través del aparato ensamblado con el inhala-
dor de polvo seco en el adaptador de boquilla. Conectar
la bomba a la válvula solenoide empleando una tubería de
vacío corta y ancha (21 O mm de diámetro interno) y co-
nectores para minimizar los requisitos de capacidad de la
D Bomba de vacíob Ver la Figura 7 bomba.
El temporizador interrumpe o permite el paso de corriente
a la válvula solenoide durante el lapso de tiempo requerí-
E Temporizador< Ver la Figura 7 do.
Determinadas en condiciones de flujo estacionario con un
P2, P3 Mediciones de Presión transductor de presión absoluta.
F Válvula de control de flujod Ver la Figura 7 Válvula reguladora ajustable con Cv 21 máximo.
ª A modo de ejemplo, el producto ASCO número 8030G1 3 (Automatic Switch Company, 60 Hanover Road, Florham Park, NJ 07932) o equivalente. Ver tam-
bién la nota al pie h en la Tabla 1.
b Producto Gast tipo 1023, 1423 ó 2565 (Gast Manufacturing lnc., PO Box 97, Benton Harbor, MI 49022) o equivalente.
e A modo de ejemplo, el producto Eaton número 45610-400 (Eaton Corporation, Automotive Products Division, 901, South 12th Street, Watertown, WI 53094)
o equivalente.
d Producto Parker Hannifin tipo 8FV12LNSS o equivalente (Parker Hannifin ple, Riverside Road, Barnstable, Devon EX31 1NP, Gran Bretaña). Ver también la nota
al pie h en la Tabla 1.

En condiciones de flujo constante, a la velocidad de flujo de aire volumétrico apropiada a través de todo el aparato, asegu-
rarse de que se ocasione un flujo crítico (sónico) en la válvula de control de flujo determinando los valores de presión absoluta,
P2 y P3, de manera que la relación P3/P2 sea :o:0,5. Si no se alcanza esta relación de P3/P2, cambiar la bomba por una más
potente y medir nuevamente la velocidad de flujo de prueba. Recubrir la superficie de recolección de partículas de cada una de
las estaciones del impactador en cascada para asegurar que las partículas que hayan impactado en una estación dada no se
reintroduzcan por arrastre en la corriente de aire que fluye a menos que se haya demostrado que esto no es necesario. Analizar
los datos según se indica en Análisis de Datos.

C.4 Aparato 3 para Polvos para lnhalación-lmpactador Andersen (con preseparador)

C.4.1 DISEÑO-APARATO 3

El Aparato 3 es idéntico al Aparato 7 (Figura 6), excepto que el preseparador del fabricante se instala encima de la Estación O
para recolectar masas grandes de polvo no inhalable antes de que ingresen al impactador; y la conexión de salida, que se utili-
za para conexión al tubo de vacío B (Figura 7), se reemplaza por otra que tenga un diámetro interno ;::8 mm. Para conectar el
preseparador del impactador al tubo de admisión (Figura 6a), usar una pieza superior especialmente diseñada para el presepa-
rador. Esto se muestra en la Figura 93 • Por lo tanto, el impactador tiene ocho estaciones, un preseparador (para recolección de
partículas grandes) y un filtro terminal. Puede no requerirse un preseparador para ciertos polvos modificados por ingeniería, en
especial aquéllos con baja densidad aparente. Conectar el impactador en cascada al sistema de control especificado en la Figu-
ra 7. Omitir la Estación 6 y la Estación 7 del impactador si la velocidad de flujo de prueba, Q0 " 11 usada durante el análisis de
Uniformidad de Dosis Liberada fue ;::60 L/minuto. Para asegurar una captura eficiente de partículas, recubrir la superficie de re-
colección de partículas de cada estación con glicerol, aceite siliconado u otro líquido adecuado generalmente depositado a
partir de un disolvente volátil, a menos que se haya demostrado que esto es innecesario. Ensamblar el impactador, según se

3 El impactador en cascada está disponible como el producto Andersen 1ACFM Non-Viable Cascade Impactar (Mark 11) de Thermo-Electron, 27 Forge Parkway,
Franklin, MA 02038. El impactador se usa con el preseparador.
526 (601) Medicamentos Nasales y para Inhalación / Pruebas Físicas USP 40

describe en las instrucciones del fabricante, con un filtro terminal por debajo de la estación final para capturar todas las partí-
culas finas que de otra manera escaparían del dispositivo. Colocar un volumen adecuado (hasta 1O ml) de un disolvente apro-
piado en el preseparador o recubrir las superficies de recolección de partículas del preseparador para prevenir el reingreso de
las partículas impactadas por arrastre. [Precaución-Algunos disolventes pueden producir mezclas de aire-vapor inflamables que se
pueden incendiar durante su pasaje a través de Ja bomba de vacío. Tomar las precauciones correspondientes (disolventes alternati-
vos, uso de trampas de vapor, tiempos de operación de Ja bomba mínimos, etc.) para garantizar la protección del operador durante
Ja prueba.] Conectar un adaptador de boquilla moldeado al extremo del tubo de admisión de manera que se produzca un
sellado hermético entre la boquilla del producto y el tubo de admisión. Emplear un adaptador de boquilla que garantice que el
extremo de la boquilla del producto esté a nivel con el extremo abierto del tubo de admisión. Asegurarse de que las diferentes
estaciones del impactador en cascada estén conectadas y selladas herméticamente para evitar fugas.
Poner en marcha la bomba de vacío, abrir la válvula solenoide de dos vías y calibrar el flujo de aire a través del sistema según
se indica a continuación. Cebar o cargar el polvo para inhalación conforme a las instrucciones que figuran en la etiqueta. Con
la bomba de vacío en funcionamiento y la válvula solenoide de dos vías cerrada, insertar la boquilla del producto en forma
horizontal en el adaptador de boquilla del tubo de admisión. Una vez que el inhalador esté en posición, descargar el polvo
dentro del aparato activando el temporizador y abriendo la válvula solenoide de dos vías durante el lapso de tiempo requeri-
do, •de manera tal que el volumen total muestreado. sea .como mínimo 4 L.• ERR¡-01.{lic.2015> Después de que la válvula solenoide
de dos vías se haya cerrado, retirar el producto del adaptador de boquilla. Si se requieren dosis adicionales para la muestra,
recargar el polvo para inhalación según las instrucciones que figuran en la etiqueta, reinsertar la boquilla en el adaptador de
boquilla y repetir la operación hasta que el número de dosis requerido haya sido descargado. Después de la descarga de la
última dosis, retirar el inhalador del adaptador de boquilla y apagar la bomba de vacío.
Desmontar cuidadosamente el aparato. Usando un disolvente adecuado, enjuagar para extraer el fármaco del adaptador de
boquilla, el tubo de admisión y el preseparador, y diluir los enjuagues cuantitativamente hasta un volumen apropiado. Enjua-
gar para extraer el fármaco de cada estación y de la placa de impacto situada inmediatamente debajo y recoger los enjuagues
en matraces de tamaño apropiado. Diluir cuantitativamente cada matraz hasta un volumen apropiado. Empleando el método
de análisis especificado en la monografía individual, determinar la masa de fármaco recolectada en cada una de las muestras.
USP 40 Pruebas Físicas/ (601) Medicamentos Nasales y para Inhalación 527

Los radios se muestran en vista superior y en sección

44-1
38,3~-1
transversal para mayor claridad
Sección transversal
19~1
15-

13-1
14,4--

8--- --R15,87~%
K:./f-+--- R 14,4
Ranura para la

-R19 junta tórica

-R44

- R38,3"'.:,~
R6,70 ± ,03 -R6,70±,03
45º ± 3°

Excepto cuando se indique lo contrario,

Vista lateral
todos los bordes se deben romper y eliminar los
rebordes
Las superficies deben estar bien pulidas a máquina,
Junta tórica: Dimensiones nominales: DI= 29 mm,
DE = 32 mm, Ancho = 1,8 mm

Las medidas están en mm a menos que se indique

algo diferente
No romper este borde

Figura 9. Aparato 3: Vista expandida de la parte superior del preseparador Andersen adaptado al tubo de admisión USP. El
material puede ser aluminio, acero inoxidable u otro material adecuado; el interior debe estar pulido hasta una rugosidad de
superficie (R 0 ) de aproximadamente 0,4 µm.

C.4.2 PROCEDIMIENTO-APARATO 3

Proceder según se indica en el Procedimiento en Aparato 2, excepto que se debe utilizar el Aparato 3.

C.5 Aparato 4 para Polvos para lnhalación-lmpactador (lmpinger) Multiestación en Fase Líquida
[NOTA-El Aparato 4, un impactador multiestación en fase liquida, tiene un número reducido de estaciones y su uso está
ampliamente difundido fuera de los Estados Unidos. Se proporciona en este documento para beneficio de los usuarios de otros
países.]

C.5.1 DISEÑO-APARATO 4

El diseño y el montaje del Aparato 4 se muestran en las Figuras 1O, 1Oa y 1Ob. 4 El tubo de admisión, empleado para conectar
el impactador (impinger) multiestación en fase líquida a un producto, se muestra en la Figura 6a. El dispositivo es un impacta-
dor multiestación en fase líquida que consiste en las Estaciones de impacto 1; 2; 3 y 4 y un filtro terminal integrado (Estación
5). Las estaciones de recolección del impactador multiestación en fase líquida (ver la Figura 1O y la Tabla 7) se mantienen hú-
medas, a diferencia de los impactadores tradicionales, como por ejemplo los Aparatos 1; 2; 3; 5 y 6. Este humedecimiento pue-
de producir un efecto similar al recubrimiento de las estaciones de los Aparatos 2; 3; 5 y 6 a determinadas velocidades de flujo,
aunque esto debe confirmarse demostrando el control del reingreso por arrastre según se ha descrito previamente. Una esta-

4 El impactador en fase líquida de cinco estaciones está disponible en Copley lnstruments, ple, Nottingham, Gran Bretaña. El producto debe conectarse al impac-
tador mediante el tubo de admisión que se muestra en la Figura 8 y la Figura 60.
528 (601) Medicamentos Nasales y para Inhalación / Pruebas Físicas USP 40

ción de impacto comprende una pared divisoria metálica horizontal y superior (B) a través de la cual sobresale un tubo metáli-
co de entrada de chorro (A) con su placa de impacto (D); un cilindro de vidrio (E) con una abertura de muestreo (F), que
forma la pared vertical de la estación; y una pared divisoria metálica horizontal inferior (G) a través de la cual un tubo (H) se
conecta a la estación inferior. El tubo que entra en la estación 4 (U) termina en una disposición de chorros múltiples. La placa
de impacto (D) se asegura en un marco metálico (J), el cual se ajusta mediante dos alambres (K) a un manguito (L) asegurada
sobre el tubo de chorro (C). Para más detalles sobre el tubo de chorro y la placa de impacto, ver la Figura 1Oa. El plano hori-
zontal de la placa de recolección es perpendicular al eje del tubo de chorro y se alinea centralmente. La superficie superior de
la placa de impacto se eleva levemente por encima del borde del marco metálico. Un surco alrededor del perímetro de la pa-
red divisoria horizontal guía la posición del cilindro de vidrio. Los cilindros de vidrio se sellan con juntas (M) contra las paredes
divisorias horizontales y se sujetan mediante seis pernos (N). Las aberturas de muestreo se sellan con tapones. El fondo de la
pared divisoria inferior de la Estación 4, tiene una protuberancia concéntrica fijada con una junta tórica de goma (P) que la
sella contra el borde de un filtro colocado en el portafiltro. El portafiltro (R), es una cubeta con un hueco concéntrico en el que
se calza un soporte de filtro perforado (S). El portafiltro está diseñado para filtros de 76 mm de diámetro. El montaje completo
de la estación de impacto se ajusta al portafiltro mediante dos cierres de funcionamiento ultrarrápido (T). El impactador mul-
tiestación en fase líquida está equipado con un tubo de admisión (Figura 6a) que se ajusta al tubo de entrada de chorro de la
Estación 1. Una junta tórica de goma en el tubo de chorro proporciona un sellado hermético al tubo de admisión. Un adapta-
dor de boquilla elastomérico para insertar el producto en análisis proporciona un sellado hermético entre la boquilla del pro-
ducto y el tubo de admisión.
Asegurarse de que el Aparato 4 esté limpio y exento de solución del fármaco proveniente de pruebas anteriores. Colocar un
filtro de 76 mm de diámetro en la estación de filtro y montar el aparato. Usar un filtro de baja presión capaz de recolectar
cuantitativamente el aerosol del fármaco que lo atraviesa, que también permita una recuperación cuantitativa del fármaco re-
colectado. Armar el Aparato 4 empleando el sistema de control especificado en la Figura 7. Unir el tubo de admisión (Figura 6a)
y el adaptador de boquilla para que se produzca un sellado hermético entre la boquilla del producto y el tubo de admisión.
Emplear un adaptador de boquilla que garantice que el extremo de la boquilla del producto esté a nivel con el extremo abierto
del tubo de admisión. Asegurarse de que las diferentes estaciones del aparato estén conectadas herméticamente para evitar
fugas. Poner en marcha la bomba de vacío, abrir la válvula solenoide de dos vías y calibrar el flujo de aire a través del sistema
según se indica a continuación. Conectar al tubo de admisión un caudalímetro calibrado para medir la velocidad del flujo volu-
métrico que sale del medidor. Ajustar la válvula de control de flujo para lograr un flujo constante a través del sistema a la velo-
cidad requerida, Oauti de manera que el valor de Oaut esté dentro del ±5% del valor determinado durante la prueba de Uniformi-
dad de Dosis Liberada. Asegurar que se produzca el flujo crítico en la válvula de control de flujo al valor Oaut que se va a emplear
durante la prueba, empleando el siguiente procedimiento. Con el producto montado en su lugar y el flujo de aire deseado en
circulación, medir la presión absoluta a ambos lados de la válvula de control de flujo (P2 y P3 en la Figura 7). Una relación de
P3/P2 ::;0,5 indica flujo crítico. Si no se alcanza esta relación de P3/P2, cambiar la bomba por una más potente y medir nueva-
mente la velocidad de flujo de prueba. Ajustar el temporizador que controla la operación de la válvula solenoide de dos vías,
de manera que abra esta válvula durante el mismo lapso de tiempo, T, que el que se empleó durante la prueba de Uniformidad
de Dosis Liberada. Dispensar 20 mL de un disolvente capaz de disolver el fármaco dentro de cada una de las cuatro estaciones
superiores del Aparato 4 y colocar nuevamente los tapones. [Precaución-Algunos disolventes pueden producir mezclas de aire-
vapor inflamables que se pueden incendiar durante su pasaje a través de la bomba de vacío. Tomar las precauciones correspondien-
tes (disolventes alternativos, uso de trampas de vapor, tiempos de operación de la bomba mínimos, etc.) para garantizar la protec-
ción del operador durante la prueba.] Inclinar el aparato para humedecer los tapones y de esa forma neutralizar sus cargas elec-
troestáticas. Ajustar el temporizador que controla la operación de la válvula solenoide de dos vías, de manera que abra la vál-
vula durante •un lapso de tiempo tal que el volumen total muestreado sea como mínimo 4 l.• ERR¡oi-díc- 2015 > Cebar o cargar el
polvo para inhalación conforme a las instrucciones que figuran en la etiqueta. Con la bomba de vacío en funcionamiento y la
válvula solenoide de dos vías cerrada, insertar la boquilla del producto en forma horizontal en el adaptador de boquilla del
tubo de admisión. Descargar el polvo dentro del aparato, activando el temporizador y abriendo la válvula solenoide de dos
vías durante el lapso requerido, T ±5%. Después de que la válvula solenoide de dos vías se haya cerrado, retirar el producto del
adaptador de boquilla. Si se requieren dosis adicionales para la muestra, recargar el polvo para inhalación según las instruccio-
nes que figuran en la etiqueta, reinsertar la boquilla en el adaptador de boquilla y repetir la operación hasta que el número de
dosis requerido haya sido descargado. Después de descargar la ultima dosis, apagar la bomba de vacío.
Desarmar la estación de filtro del Aparato 4. Cuidadosamente retirar el filtro (Figura 7Ob) y extraer el fármaco con disolvente.
Enjuagar el adaptador de boquilla y el tubo de admisión con un disolvente adecuado y diluir los enjuagues cuantitativamente
hasta un volumen apropiado. Enjuagar el interior del tubo de chorro de entrada que va a la Estación 1 (Figura 1O), permitiendo
que el disolvente fluya dentro de la estación. Enjuagar para extraer el fármaco de las paredes internas y de la placa de recolec-
ción de cada una de las cuatro estaciones superiores del aparato y transferir a la solución de la estación respectiva, inclinando y
rotando el aparato, asegurándose de que no haya transferencia de líquido entre las estaciones. Empleando el método de análi-
sis especificado en la monografía individual, determinar la masa de fármaco recolectada en cada uno de los seis volúmenes de
disolvente. Asegurarse de que el método corrija la posible evaporación de disolvente durante la prueba. Esto puede involucrar
el uso de un estándar interno (de concentración original conocida en el disolvente y valorado al mismo tiempo que el fármaco)
o la transferencia cuantitativa del contenido líquido de cada una de las estaciones, seguida por una dilución hasta un volumen
conocido. Empleando el método de análisis especificado en la monografía individual, determinar la masa de fármaco recolec-
tada en cada una de las muestras.
USP 40 Pruebas Físicas/ (601) Medicamentos Nasales y para Inhalación 529

Q~~A
~~e
B

Estación 1

Estación 2

Estación 3
¡ - :- -(
1

Estación 4

Estación 5 (filtro)

V--+---.

Figura 1O. Aparato 4: Esquema del impactador multiestación en fase líquida. (Ver la Tabla 7 para especificaciones de los
componentes.)
Tabla 7. Unidades Componentes del lmpactador (lmpinger) Multiestación en Fase Líquida
(ver la Figura 7O, Ja Figura 7Oa y Ja Figura 7Ob)
Dimensiones
(en mm a menos que se
Código Artículo Descripción indique algo diferente)
Tubo de metal atornillado a una pared divisora se-
A, H Tubo de chorro liada por una junta (C), superficie interna pulida Ver la Figura 7Oa
B, G Pared divisoria Placa circular de metal, diámetro 120
Grosor Ver la Figura 7Oa
e junta p.ej., de PTFE Para adaptarse al tubo del chorro
D Placa de impacto Disco de vidrio sinterizado de porosidad O
Diámetro Ver la Figura 7Oa
E Cilindro de vidrio Tubo de vidrio cortado pulido plano
Altura, incluyendo juntas 46
Diámetro externo 100
Espesor de pared 3,5
Diámetro (F) de la abertura de muestreo 18
Tapón de la abertura de muestreo ISO 24/25
J Marco de metal Marco circular con perfil en L con ranura
Diámetro interno Para adaptarse a la placa de impacto
Altura 4
Grosor de la sección horizontal 0,5
Grosor de la sección vertical 2
530 (601) Medicamentos Nasales y para Inhalación / Pruebas Físicas USP 40

Tabla 7. Unidades Componentes del lmpactador (lmpinger) Multiestación en Fase Líquida

(ver la Figura 1O, la Figura 1Oa y la Figura 1Ob) (Continuación)
Dimensiones
(en mm a menos que se
Código Artículo Descripción indique algo diferente)
Alambre de acero que interconecta el marco de
K Alambre metal y el manguito (dos por cada marco)
Diámetro 1
Manguito metálico fijado al tubo de chorro me-
L Manguito diante tornillos
Diámetro interno Para adaptarse al tubo del chorro
Altura 6
Grosor 5
M Junta p.ej., de silicona Para adaptarse al cilindro de vidrio
N Perno Perno con tuerca de metal (seis pares), longitud 205
Diámetro 4
p Junta tórica Junta tórica de goma, diámetro x grosor 66,34 X 2,62
Q Junta tórica Junta tórica de goma, diámetro x grosor 29,1 X 1,6
R Portafiltro Bastidor de metal con pie y salida Ver la Figura 1Ob
s Soporte de filtro Lámina de metal perforada, diámetro 65
Diámetro de orificio 3
Distancia entre orificios (puntos centrales) 4
Cierres de funciona-
T miento ultrarrápido
Tubo de chorros Tubo de chorro (H) que termina en disposición de
u múltiples chorros múltiples Ver insertos en Figura 1Oa
V Salida Salida y tobera para conexión a vacío Diámetro interno 21 O (Figura 1Ob)

Centro de la estación ~

Figura 1Oa. Aparato 4: Detalles del tubo de chorro y la placa de impacto. Los insertos muestran el extremo del tubo de cho-
rros múltiples (U) que lleva a la Estación 4. (Ver la Tabla 8 para especificaciones de dimensiones.)

Tabla 8. Aparato 4-Dimensiones del lmpactador Multiestación en Fase Líquida.

Número de Tobe- Diámetro
Estación ras (mm)
Valor
Nominal Tolerancia (±)
1 1 25,0 O,P
2 1 14,0 o,ia
3 1 8,0 0,1ª
ª Cortesía de Copley Scientific Ltd,. Nottingham, Gran Bretaña.
USP 40 Pruebas Físicas/ (601) Medicamentos Nasales y para Inhalación 531

Tabla 8. Aparato 4--Dimensiones del lmpactador Multiestación en Fase Líquida. (Continuación)

Número de Tobe- Diámetro
Estación ras (mm)
1 Entrada 6,3ª 1 o,ia
4 1 Salida 7 2,7ª 1 0,05ª
ª Cortesía de Copley Scientific Ltd,. Nottingham, Gran Bretaña.

10mm
5mm

Figura 1Ob. Aparato 4: Vista expandida de la Estación 5. (Ver la Tabla 7 para especificaciones de los componentes.)

C.5.2 PROCEDIMIENTO-APARATO 4

Proceder según se indica en Procedimiento en Aparato 2, excepto que se debe utilizar el Aparato 4.

C.6 Aparato 5 para Polvos para lnhalación-lmpactador de Nueva Generación (con preseparador)

C.6.1 DISEÑO-APARATO 5

El diseño y montaje del Aparato 5 5 se muestran en las Figuras 7 7, 7 7a, 7 7b, 7 7e y 7 7d. El tubo de admisión, empleado para
conectar el impactador a un producto, se muestra en la Figura 6a. El dispositivo es un impactador en cascada con siete estacio-
nes y un colector con microorificios (MOC, por sus siglas en inglés). Las curvas de eficiencia de recolección para cada estación
son marcadas y minimizan la superposición entre estaciones. El material puede ser aluminio, acero inoxidable u otro material
adecuado.
El diseño del impactador presenta cubetas de impacto extraíbles con todas las cubetas en un mismo plano (Figuras 7 7-7 le).
El impactador tiene tres secciones principales: el marco inferior que aloja las cubetas de impacto, el cuerpo sellador que man-
tiene en su lugar los chorros y la tapa que contiene los pasajes entre estaciones (que se muestran en las Figuras 7 7-7 7b). Se
emplean múltiples toberas en todas las estaciones salvo en la primera (7 7e). El flujo pasa a través del impactador siguiendo un
patrón en forma de dientes de sierra.
La medición de la estación se realiza periódicamente junto con la confirmación de otras dimensiones críticas para el eficaz
funcionamiento del impactador. Las dimensiones críticas se proporcionan en la Tabla 9.
Tabla 9. Dimensiones Críticas para los Aparatos 5 y 6
Dimensiones
Descripción (mm)
Preseparador (ver la Dimensión a en la Figura 7 7d) 12,80 ± 0,05
Estación 1 ª -Diámetro de tobera 14,30 ± 0,05
Estación 2ª -Diámetro de tobera 4,88 ± 0,04
Estación 3ª -Diámetro de tobera 2,185 ± 0,02
Estación 4ª -Diámetro de tobera 1,207 ± 0,01
Estación 5ª -Diámetro de tobera 0,608 ± 0,01
Estación 6ª-Diámetro de tobera 0,323 ± 0,01
Estación 7ª-Diámetro de tobera 0,206 ± 0,01
MOCª Aproximadamente 0,070
Profundidad de cubeta opcional (ver la Dimensión ben la Figura 77b) 14,625 ± o, 1 o
ª Ver la Figura 11 c. MOC ~ colector con microorificios (MOC, por sus siglas en inglés).
b Ver la Figura 11 b.

5 El impactador en cascada puede obtenerse como Next Generation Pharmaceutical Impactar en MSP Corporation, Minneapolis, MN.
532 (601) Medicamentos Nasales y para Inhalación / Pruebas Físicas USP 40

Tabla 9. Dimensiones Críticas para los Aparatos 5 y 6 (Continuación)

Rugosidad de la superficie de la cubeta recolectora 0,5-2 µm
Estación 1-Distancia de la tobera al cuerpo sellador (ver la Dimensión c)b o± 1,18
Estación 2-Distancia de la tobera al cuerpo sellador (ver la Dimensión c)b 5,236 ± 0,736
Estación 3-Distancia de la tobera al cuerpo sellador (ver la Dimensión c)b 8,445 ± 0,41 o
Estación 4-Distancia de la tobera al cuerpo sellador (ver la Dimensión c)b 11,379 ± 0,237
Estación 5-Distancia de la tobera al cuerpo sellador (ver la Dimensión c)b 13,176 ± 0,341
Estación 6-Distancia de la tobera al cuerpo sellador (ver la Dimensión c)b 13,999 ± 0,071
Estación 7-Distancia de la tobera al cuerpo sellador (ver la Dimensión c)b 14,000 ± 0,071
Opcional: MOC-Distancia de la tobera al cuerpo selladorb 14,429 - 14,571
ª Ver la Figura 11 c. MOC = colector con microorificios (MOC, por sus siglas en inglés).
b Ver la Figura 11 b.

En las operaciones de rutina, el cuerpo sellador y la tapa se mantienen juntos entre sí como un solo dispositivo. Se tiene
acceso a las cubetas de impacto cuando se abre este equipo al final de una prueba de un producto. Las cubetas se mantienen
en una bandeja que hace de soporte, de manera que todas las cubetas se pueden sacar simultáneamente del impactador le-
vantando la bandeja.
Un tubo de admisión con dimensiones internas idénticas a las que se definen en la Figura 6a se conecta a la entrada del
impactador. Cuando sea necesario, con los polvos para inhalación, se puede agregar un preseparador para evitar sobrecargar
la primera estación. El preseparador se conecta entre el tubo de admisión y el impactador. Se emplea un adaptador de boqui-
lla adecuado para proporcionar un sellado hermético entre la boquilla del producto y el tubo de admisión.
El aparato contiene un colector con microorificios (MOC) terminal que, para la mayoría de las formulaciones, puede eliminar
la necesidad de un filtro final, según se determine mediante la validación del método. El MOC es la placa de toberas y cubeta
de recolección del impactador. La placa de toberas contiene, nominalmente, 4032 orificios, cada uno con un diámetro de
aproximadamente 70 µm. La mayoría de las partículas que no fueron capturadas en la Estación 7 del impactador serán captu-
radas en la superficie de la cubeta que está debajo del MOC. Para formulaciones con una fracción significativa de partículas no
capturadas por el MOC, hay un portafiltro opcional que puede reemplazar al MOC. Como alternativa se puede colocar un
filtro terminal (a menudo, la fibra de vidrio es adecuada) en un portafiltro externo al Aparato 5 y 6, que se ubica a continua-
ción del MOC.

Tubo de admisión

Cuerpo del impactador

Figura 11 . Aparato 5 (se muestra con el preseparador colocado en su lugar).

USP 40 Pruebas Físicas/ (601) Medicamentos Nasales y para Inhalación 533

Boquilla de estación 1 Conexión entre estaciones

Colector de micro-
orificios (MOC)

Tapa con sello

unida al cuerpo

Saliente de colocac1ón

Encaje para la saliente de

colocación

~ Marro inferior con la bandeja

para las cubetas montada

Figura 11 a. Componentes del Aparato 5.

Conexión a la siguiente Conexión a la estación

estación previa

Tapa

Sello del cuerpo

Bandeja de
cubetas
Marco inferior

Cubeta de recolección
Estación multi tobera

Figura 11 b. Disposición de los pasajes entre estaciones del Aparato 5.

estación 2 estación 4 estación 6 MOC

6 orificios 52 orificios 396 orificios 4032 orificios

estación 1 estación 3 estación 5 estación 7

1 orificio 24 orificios 152 orificios 630 orificios

Figura 11 c. Configuración de toberas del Aparato 5.

534 (601) Medicamentos Nasales y para Inhalación / Pruebas Físicas USP 40

Cuerpo del preseparador

r==:------==,,.,/ Diámetro de tobera

(dimensión a)

t ubeta central

t
n
~-~u---~-~ Inserto del preseparador
Base del preseparador

Figura 11 d. Disposición del preseparador para el Aparato 5.

C.6.2 PROCEDIMIENTO-APARATO 5

Ensamblar el aparato con el preseparador (Figura 11 d), a menos que se haya demostrado experimentalmente que su omisión
no da como resultado un incremento en la pérdida de fármaco entre estaciones (>5%) o en el reingreso de partículas por
arrastre, en cuyo caso se puede omitir el preseparador. Colocar las cubetas en las aberturas de la bandeja de cubetas. Para
asegurar una captura eficiente de partículas, recubrir la superficie de recolección de partículas de cada estación con glicerol,
aceite siliconado u otro líquido adecuado generalmente depositado a partir de un disolvente volátil, a menos que se haya de-
mostrado que esto es innecesario. Insertar la bandeja de cubetas en el marco inferior y bajarla para colocarla en su lugar. Ce-
rrar la tapa del impactador con el cuerpo sellador unido a ésta y operar la manija para cerrar ambas partes del impactador de
forma que el sistema sea hermético.
El preseparador puede prepararse del siguiente modo. Montar el inserto del preseparador en la base del preseparador; co-
nectar la base del preseparador a la entrada del impactador; agregar hasta aproximadamente 15 ml del disolvente empleado
para la recuperación de la muestra a la cubeta central del inserto del preseparador; colocar el cuerpo del preseparador encima
de este montaje; y cerrar las dos grampas sujetadoras. [Precaución-Algunos disolventes pueden producir mezclas de aire-vapor
inflamables que se pueden incendiar durante su pasaje a través de la bomba de vacío. Tomar las precauciones correspondientes
(p.ej., disolventes alternativos, uso de trampas de vapor, tiempos mínimos de operación de la bomba, etc.) para garantizar la protec-
ción del operador durante la prueba.]
Conectar un tubo de admisión con dimensiones internas según se definen en la Figura 6a a la entrada del impactador o a la
entrada del preseparador ubicado encima del impactador en cascada (Figura 11 d). Colocar en posición un adaptador de bo-
quilla adecuado al final del tubo de admisión de manera que el extremo final de la boquilla del producto, cuando se inserta,
esté alineado a lo largo del eje horizontal del tubo de admisión. La cara frontal de la boquilla del producto está a nivel con la
cara frontal del tubo de admisión, produciendo un sellado hermético. Cuando se une al adaptador de boquilla, el producto
debe colocarse en la misma orientación en la que está previsto que se use. Conectar el aparato al sistema de flujo conforme al
esquema especificado en la Figura 7.
A menos que se indique algo diferente, realizar la prueba a la velocidad de flujo empleada en la prueba para Uniformidad de
Dosis Liberada, extrayendo 4,0 L de aire desde la boquilla del producto a través del aparato. Conectar un caudalímetro al tubo
de admisión. Emplear un caudalímetro calibrado para medir el flujo volumétrico que sale del medidor o calcular el flujo volu-
métrico que sale del medidor (Oout) utilizando la ley de los gases ideales. Para un medidor calibrado para el flujo volumétrico
de entrada (Q;n), calcular:

P0 = presión atmosférica
!':.P = caída de la presión en el medidor
Ajustar la válvula de control de flujo para lograr un flujo estable a través del sistema a la velocidad requerida, Oout (±5%). Ase-
gurar que se produzca flujo crítico en la válvula de control de flujo mediante el Procedimiento descrito para el Aparato 2. Ajustar
el temporizador que controla la operación de la válvula solenoide de dos vías, de manera que abra la válvula durante •1.m
lapso de tiempó tal que e.1 volumen .totalmu~treado sea Cómo mír¡imo .4 L • t.~~ (01-0ic-2rr¡S)
Cebar o cargar el polvo para inhalación conforme a las instrucciones que figuran en la etiqueta. Con la bomba de vacío en
funcionamiento y la válvula solenoide de dos vías cerrada, insertar la boquilla del producto en forma horizontal en el adapta-
dor de boquilla del tubo de admisión. Descargar el polvo dentro del aparato, activando el temporizador y abriendo la válvula
solenoide de dos vías durante el lapso requerido, T (±5%). Después de que la válvula solenoide de dos vías se haya cerrado,
retirar el producto del adaptador de boquilla. Si se requieren dosis adicionales para la muestra, recargar el polvo para inhala-
ción según las instrucciones que figuran en la etiqueta, reinsertar la boquilla en el adaptador de boquilla y repetir la operación
hasta que el número de dosis requerido haya sido descargado. Después de descargar la última dosis, apagar la bomba de va-
cío.
USP 40 Pruebas Físicas/ (602) Propelentes 535

Desarmar el aparato y recuperar el fármaco a analizar de la siguiente manera. Retirar el tubo de admisión y el adaptador de
boquilla del preseparador y extraer el fármaco en una alícuota de disolvente; si se hubiera empleado el preseparador, retirarlo
del impactador sin derramar el disolvente dentro de éste último; y recuperar el ingrediente activo de todas las superficies inter-
nas. Abrir el impactador liberando el mecanismo de enganche y levantando la tapa. Retirar la bandeja de cubetas con las cube-
tas de recolección y recuperar el ingrediente activo de cada cubeta con una alícuota de disolvente. Empleando el método de
análisis especificado en la monografía individual, determinar la masa de fármaco contenida en cada alícuota de disolvente.

C.7 Aparato 6 para Aerosoles y Atomizadores para lnhalación-lmpactador de Nueva Generación

(sin preseparador)

C.7.1 DISEÑO-APARATO 6

El Aparato 6 es idéntico al Aparato 5 (Figuras 7 7-7 7d) excepto que no se utiliza el preseparador. Emplear este aparato a una
velocidad de flujo de 30 L/minuto (±5%), a menos que se indique algo diferente en la monografía individual.

C.7.2 PROCEDIMIENTO-APARATO 6

Montar el aparato sin el preseparador. Colocar las cubetas en las aberturas de la bandeja de cubetas. Para asegurar una cap-
tura eficiente de partículas, recubrir la superficie de recolección de partículas de cada estación con glicerol, aceite siliconado u
otro líquido adecuado generalmente depositado a partir de un disolvente volátil, a menos que se haya demostrado que esto es
innecesario. Insertar la bandeja de cubetas en el marco inferior y bajarla para colocarla en su lugar. Cerrar la tapa del impacta-
dor con el cuerpo sellador unido a ésta y operar la manija para cerrar ambas partes del impactador de forma que el sistema sea
hermético. Conectar a la entrada del impactador un tubo de admisión con las dimensiones internas que se definen en la Figura
6a. Emplear un adaptador de boquilla que garantice que el extremo de la boquilla del producto esté a nivel con el extremo
abierto del tubo de admisión. Encender la bomba de vacío para extraer el aire a través del impactador en cascada y calibrar el
flujo de aire a través del sistema con un caudalímetro apropiado unido al extremo abierto del tubo de admisión. Ajustar la
válvula de control de flujo de la bomba de vacío para lograr un flujo constante a través del sistema a la velocidad requerida, y
asegurarse de que el flujo de aire que recorre el sistema está dentro del ±5% de esa velocidad de flujo. A menos que se indique
algo diferente en las instrucciones de uso para el paciente, agitar el producto durante 5 segundos y accionar el disparador para
desechar una descarga. Con la bomba de vacío en funcionamiento, insertar la boquilla en su adaptador de boquilla e inmedia-
tamente disparar para descargar la dosis mínima recomendada en el impactador en cascada. Mantener la válvula presionada
durante el tiempo suficiente para garantizar que la dosis se haya descargado por completo. Si se requieren atomizaciones adi-
cionales para recolectar la muestra, agitar el producto, reinsertarlo en el adaptador de boquilla e inmediatamente pulsar para
descargar la siguiente dosis mínima recomendada.
Repetir hasta que se haya descargado el número de dosis requerido. El número de dosis mínimas recomendadas debe ser tal
que permita una determinación exacta y precisa de la Distribución de Tamaño Aerodinámico. [NOTA-Usualmente, el número de
dosis mínimas recomendadas no es> 1 O.] Después de que la última dosis haya sido descargada, retirar el producto del adapta-
dor de boquilla. Enjuagar el adaptador de boquilla y el tubo de admisión con un disolvente adecuado y diluir los enjuagues
cuantitativamente hasta un volumen apropiado.
Desarmar el aparato y recuperar el fármaco para su análisis de la siguiente manera. Retirar el tubo de admisión y el adapta-
dor de boquilla del aparato y recuperar el fármaco depositado en una alícuota de disolvente; abrir el impactador liberando el
mecanismo de enganche y levantando la tapa; retirar la bandeja de cubetas con las cubetas de recolección; y extraer el ingre-
diente activo de cada cubeta con una alícuota de disolvente. Empleando el método de análisis especificado en la monografía
individual, determinar la cantidad de ingrediente activo contenida en cada alícuota de disolvente.

(602) PROPELENTES

[Precaución-Los propelentes que son hidrocarburos son extremadamente inflamables y explosivos. Tomar las precauciones nece-
sarias y realizar el muestreo y las operaciones analíticas bajo una campana de extracción bien ventilada.]

PROCEDIMIENTO GENERAL DE MUESTREO

Este procedimiento se utiliza para obtener muestras de prueba de propelentes que son gases a aproximadamente 25º y que
se almacenan en cilindros presurizados. Emplear un cilindro para muestras de acero inoxidable equipado con una válvula de
acero inoxidable con una capacidad de no menos de 200 ml que soporte 240 psi o una presión mayor. Secar el cilindro con la
válvula abierta a 11 Oº durante 2 horas y vaciar el cilindro caliente hasta menos de 1 mm de mercurio. Cerrar la válvula, enfriar
y pesar. Conectar un extremo de una tubería de carga al envase del propelente ajustando bien y conectar sin ajustar el otro
536 (602) Propelentes / Pruebas Físicas USP 40

extremo al cilindro para muestras. Abrir con cuidado el envase del propelente y dejar que el propelente purgue la tubería de
carga y salga a través de la conexión sin ajustar. Evitar una purga excesiva, ya que esto provoca la congelación de humedad en
la tubería de carga y las conexiones. Ajustar la conexión del cilindro para muestras, abrir la válvula del cilindro para muestras y
dejar que el propelente fluya hacia el interior del cilindro vacío. Continuar el muestreo hasta que se obtenga la cantidad desea-
da de muestra, luego cerrar la válvula del envase del propelente y, finalmente, cerrar la válvula del cilindro para muestras.
[Precaución-No sobrecargar el cilindro para muestras. La expansión hidráulica ocasionada por Jos cambios de temperatura puede
causar la explosión de un cilindro sobrecargado.] Pesar nuevamente el cilindro para muestras cargado y calcular el peso de la
muestra.

TEMPERATURA DE EBULLICIÓN APROXIMADA

Transferir una muestra de 100 ml a un tubo de centrífuga tarado en forma de pera de 100 ml que contenga algunas pie-
dras de ebullición y pesar. Suspender un termómetro en el líquido y colocar el tubo en un medio mantenido a una temperatu-
ra de 32º por encima de la temperatura de ebullición esperada. Cuando la lectura del termómetro permanezca constante, re-
gistrar como temperatura de ebullición la lectura del termómetro después de que se haya destilado como mínimo el 5% de la
muestra. Conservar el resto de la muestra para la determinación de residuos de alto punto de ebullición.

RESIDUOS DE AL TO PUNTO DE EBULLICIÓN, MÉTODO 1

Dejar que destilen 85 ml de la muestra según se indica en la prueba para Temperatura de Ebullición Aproximada y transferir el
tubo de centrífuga que contiene los 15 ml remanentes de la muestra a un medio mantenido a una temperatura de 1Oº por
encima de la temperatura de ebullición. Después de 30 minutos, retirar el tubo del baño de agua, secarlo con material absor-
bente y pesar. Calcular el peso del residuo.

RESIDUOS DE AL TO PUNTO DE EBULLICIÓN, MÉTODO 11

Preparar una serpentina de enfriamiento con una tubería de cobre (de aproximadamente 6 mm de diámetro exterior x apro-
ximadamente 6, 1 m de largo) para que entre en un matraz con camisa al vacío. Sumergir la serpentina de enfriamiento en una
mezcla de hielo seco y acetona en el matraz con camisa al vacío y conectar un extremo de la tubería al cilindro para muestras
con propelente. Abrir cuidadosamente la válvula del cilindro para muestras, purgar la serpentina de enfriamiento con aproxi-
madamente 50 ml de propelente y desechar esta porción de propelente licuado. Continuar descargando el propelente licuado
desde la serpentina de enfriamiento y recogerlo en un cono de sedimentación de 1000 ml previamente enfriado hasta que el
cono se llene hasta la marca de 1000 ml. Dejar que el propelente se evapore, usando un baño de agua tibia mantenido a
aproximadamente 40º para reducir el tiempo de evaporación. Cuando todo el líquido se haya evaporado, enjuagar el cono de
sedimentación con dos porciones de 50 ml de pentano y combinar los enjuagues en una cápsula de evaporación tarada de
150 mL. Transferir 100 ml de pentano a una segunda cápsula de evaporación tarada de 150 ml, colocar ambas cápsulas de
evaporación en un baño de agua; evaporar hasta sequedad y calentar las cápsulas en una estufa a 100º durante 60 minutos.
Enfriar las cápsulas en un desecador y pesar. Repetir el calentamiento durante periodos de 15 minutos hasta que la variación
de peso entre pesadas sucesivas no sea más de O, 1 mg y calcular el peso del residuo obtenido a partir del propelente como la
diferencia entre los pesos de los residuos en las dos cápsulas de evaporación.

CONTENIDO DE AGUA

Proceder según se indica en el capítulo Determinación de Agua (921 ), con las siguientes modificaciones: (a) Utilizar un reci-
piente de sistema cerrado para volumetría con una abertura a través de la cual pasa un tubo de dispersión de gases de porosi-
dad gruesa conectado a un cilindro para muestreo. (b) Diluir el Reactivo con metanol anhidro hasta obtener un factor de equi-
valencia de agua de entre 0,2 y 1,0 mg/ml, y dejar reposar esta solución diluida durante no menos de 16 horas antes de la
estandarización. (c) Obtener una muestra de 100 g según se indica en Procedimiento General de Muestreo e introducir la mues-
tra en el vaso de valoración a través del tubo de dispersión de gases a una velocidad de aproximadamente 100 ml de gas por
minuto. Si fuera necesario, calentar suavemente el cilindro para muestras para mantener esta velocidad de flujo.

OTRAS DETERMINACIONES

Para los aerosoles que utilizan propelentes, realizar las pruebas que se especifican en las monografías individuales de prope-
lentes del NF.
USP 40 Pruebas Físicas/ (603) Aerosoles Tópicos 537

(603) AEROSOLES TÓPICOS

INTRODUCCIÓN

Los aerosoles tópicos contienen fármacos en solución o en suspensión, envasados a presión, que se liberan al activar un siste-
ma de válvulas apropiado. Los aerosoles tópicos deben seguir los requisitos de las pruebas de calidad descritos en los capítulos
de pruebas generales Medicamentos Nasales y para Inhalación-Información General y Pruebas de Calidad del Producto (5), Prue-
bas de Recuento Microbiano (61 ), Pruebas de Microorganismos Específicos (62), Llenado Mínimo (755) y Velocidad de Fuga (604).
Los aerosoles tópicos incluyen espumas y atomizadores dermatológicos. Las espumas de los aerosoles tópicos deben incluir la
apariencia física de la espuma y de la espuma colapsada.

VELOCIDAD DE DESCARGA V CANTIDAD DESCARGADA

Realizar estas pruebas exclusivamente en envases equipados con válvulas de descarga continua.
Velocidad de Descarga: Seleccionar no menos de cuatro envases de aerosol, agitar si la etiqueta incluye esta instrucción,
retirar las tapas y las cubiertas, y accionar cada válvula durante 2-3 segundos. Pesar cada envase con exactitud y sumergir en
un baño de temperatura constante hasta que la presión interna se equilibre a una temperatura de 25º, determinada por la
constancia de la presión interna, según se indica más adelante en Prueba de Presión. Retirar los envases del baño, eliminar el
exceso de humedad secando con una toalla de papel, agitar, si la etiqueta incluye esta instrucción, accionar cada válvula du-
rante 5,0 segundos (medidos con exactitud, empleando un cronómetro) y pesar nuevamente cada envase. Devolver los enva-
ses al baño de temperatura constante y repetir el procedimiento previo tres veces más para cada envase. Calcular el promedio
de Velocidad de Descarga, en g/s, para cada envase.
Cantidad Descargada: Devolver los envases al baño de temperatura constante, continuar descargando en accionamien-
tos de 5 segundos hasta vaciar los envases. [NOTA-Asegurar que pase suficiente tiempo entre los accionamientos para evitar
un enfriamiento significativo del envase.] Calcular la pérdida total de peso de cada envase. Ésta es la Cantidad Descargada.

PRUEBA DE PRESIÓN

Realizar esta prueba sólo en aerosoles tópicos equipados con válvulas de descarga continua.
Seleccionar no menos de cuatro envases de aerosol, retirar las tapas y las cubiertas, y sumergir en un baño de temperatura
constante hasta que la presión interna sea constante a una temperatura de 25º. Retirar los envases del baño, agitar y retirar el
disparador y el agua, si la hubiera, del vástago de la válvula. Colocar cada envase en posición vertical y determinar la presión
en cada envase colocando un manómetro calibrado sobre el vástago de la válvula, sosteniéndolo con firmeza y accionando la
válvula de manera que quede completamente abierta. El manómetro se calibra para presiones aproximadas a las esperadas y
está equipado con un adaptador apropiado para las dimensiones particulares del vástago de la válvula. Leer la presión directa-
mente del manómetro.

LLENADO MÍNIMO

Los aerosoles tópicos cumplen con los requisitos para aerosoles que figuran en Llenado Mínimo (755).

PRUEBA DE FUGA

Proceder según se indica en Velocidad de Fuga (604).

NÚMERO TOTAL DE DESCARGAS POR ENVASE

Realizar esta prueba sólo en aerosoles tópicos equipados con válvulas dosificadoras, simultáneamente con la prueba de Uni-
formidad de Dosis Liberada y en los mismos envases utilizados en dicha prueba. Determinar el número total de descargas o
entregas contando el número de descargas para cebado más las usadas para determinar el contenido del rocío y continuar
accionando el disparador hasta completar el número de descargas declarado en la etiqueta. Los requisitos se cumplen si todos
los envases o inhaladores analizados contienen un número de descargas que no sea menor al declarado en la etiqueta.

UNIFORMIDAD DE DOSIS LIBERADA

La prueba de Uniformidad de Dosis Liberada se requiere para aerosoles tópicos equipados con válvulas dosificadoras. Para re-
coger la dosis mínima, proceder según se indica en la prueba de Uniformidad de Dosis Liberada en Inhaladores de Dosis Fija e
Inhaladores de Polvo Seco, según se describe en el capítulo (601 ), excepto que se debe modificar el aparato de muestreo de
538 (603) Aerosoles Tópicos/ Pruebas Físicas USP 40

dosis de manera que sea capaz de capturar cuantitativamente la dosis descargada de la preparación que se está analizando. A
menos que se indique algo diferente en la monografía individual, aplicar los criterios de aceptación para Inhaladores de Dosis
Fija e Inhaladores de Polvo Seco según se describe en el capítulo (601 ).

(604) VELOCIDAD DE FUGA

Seleccionar 12 envases de aerosol y registrar la fecha y la hora con una aproximación de media hora. Pesar cada envase con
una aproximación de 1 mg y registrar el peso de cada uno, en mg, como W 1• Dejar en reposo los envases en posición vertical
a una temperatura de 25,0 ± 2,0º durante no menos de 3 días, y pesar nuevamente cada envase, registrar el peso de cada
uno, en mg, como W2 y registrar la fecha y la hora con una aproximación de media hora. Determinar el tiempo, T, en horas,
durante el que se analizaron los envases. Calcular la velocidad de fuga, en mg por año, de cada envase tomado, por la fórmu-
la: (365)(24/7)(W1 - W2 ).
Cuando se analizan envases de aerosol de vidrio recubiertos de plástico, secar los envases en un desecador durante 12-18
horas y dejarlos en reposo en una atmósfera de humedad constante durante 24 horas antes de determinar el peso inicial según
se indicó anteriormente. Realizar la prueba bajo las mismas condiciones de humedad constante. Vaciar el contenido de cada
envase analizado empleando una técnica segura (por ejemplo, enfriar para reducir la presión interna, retirar la válvula y verter).
Retirar el contenido residual enjuagando con disolventes adecuados y luego enjuagar con algunas porciones de metano!. Man-
tener el envase, la válvula y todas las partes relacionadas como una unidad, y calentar todo junto a 100º durante 5 minutos.
Enfriar, pesar, registrar el peso como W3 y determinar el peso neto de llenado (W 1 - W3) para cada envase analizado. [NOTA-Si
el peso neto de llenado promedio se ha determinado previamente, dicho valor puede emplearse en lugar del valor (W1 - W3)
mencionado anteriormente.] Los requisitos se cumplen si la velocidad de fuga promedio por año para los 12 envases no es
más de 3,5% del peso neto de llenado, y ninguno de los envases tiene fugas de más de 5,0% del peso neto de llenado por
año. Si 1 envase tiene fugas de más de 5,0% por año y si ninguno de los envases tiene fugas de más de 7,0% por año, deter-
minar la velocidad de fuga para 24 envases adicionales, según se indica en esta prueba. No más de 2 de los 36 envases tienen
fugas de más de 5,0% del peso neto de llenado por año y ninguno de los 36 envases tiene fugas de más de 7,0% del peso
neto de llenado por año. Cuando el peso neto de llenado es menos de 15 g y la etiqueta contiene una fecha de caducidad, los
requisitos se cumplen si la velocidad de fuga promedio de los 12 envases no es mayor de 525 mg por año y ninguno de los
envases tiene fugas mayores de 750 mg por año. Si 1 envase tiene fugas de más de 750 mg por año pero de no más de 1, 1 g
por año, determinar la velocidad de fuga sobre 24 envases adicionales, según se indica en esta prueba. No más de 2 de los 36
envases tiene fugas mayores de 750 mg por año y ninguno de los 36 envases tiene fugas mayores de 1, 1 g por año. Esta
prueba es adicional a la prueba de fuga habitual que se realiza en línea a cada envase.

(61 O) MÉTODOS DE MUESTREO MICROBIOLÓGICO ALTERNATIVOS

PARA PRODUCTOS NASALES E INHALADORES NO ESTÉRILES

INTRODUCCIÓN
El muestreo apropiado de productos no estériles susceptibles a la contaminación microbiana puede ser complicado, debido
a que estos productos a menudo se llenan en envases primarios especiales, diseñados para proteger al producto de la contami-
nación inadvertida durante su almacenamiento y uso. Estos diseños especiales pueden hacer más difícil la toma de muestras
asépticas de tamaño o volumen suficientes para el análisis microbiológico. A menos que se utilicen metodologías especiales,
puede resultar difícil realizar el muestreo de productos tales como formas farmacéuticas en polvo, líquidos nasales o para inha-
lación, sin exponerlos potencialmente a contaminación microbiana extraña. El presente capítulo de pruebas generales propor-
ciona tales metodologías especiales para el muestreo de formas farmacéuticas para inhalación o nasales de alto y bajo conteni-
do. Las metodologías de muestreo alternativas pueden ofrecer mejores maneras para muestrear envases de forma aséptica. To-
da metodología alternativa debe utilizar técnicas asépticas y se debe llevar a cabo en condiciones ambientales y de otro tipo,
apropiadas para el muestreo aséptico.

FORMAS FARMACÉUTICAS PARA INHALACIÓN V NASALES

Los productos farmacéuticos nasales e inhaladores de bajo contenido (en lo sucesivo, PFNI de bajo contenido) son produc-
tos que presentan un llenado esperado de menos de 100 mg de polvo o 1 mL de formulación líquida por unidad (envase
USP 40 Pruebas Físicas/ (610) Métodos de Muestreo Microbiológico Alternativos 539

primario). Ejemplos de estos productos incluyen polvos para inhalación previamente medidos, más comúnmente conocidos
como inhaladores de polvo seco, y atomizadores nasales monodosis.
Los PFNI de alto contenido son productos farmacéuticos multidosis que presentan un llenado esperado de más de 100 mg
de polvo o más de 1 mL de formulación liquida por unidad. Ejemplos de estos productos incluyen aerosoles para administra-
ción por inhalación y vía nasal, conocidos como inhaladores de dosis fija; polvos para inhalación con dosis medidas para dispo-
sitivos; y aerosoles nasales multidosis.
La cantidad o volumen apropiado de muestra debe basarse en la metodología de prueba, incluido cualquier capítulo de
pruebas generales pertinente, como los capítulos (61) Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Recuento Mi-
crobiano y (62) Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Microorganismos Específicos. El análisis se puede llevar
a cabo en el polvo seco a granel sin envasar, en la formulación líquida o en el producto terminado. Si el análisis se realiza sólo
en el material a granel, entonces se debe validar la capacidad del proceso para prevenir la contaminación microbiana desde el
lote a granel hasta el producto terminado. El análisis se debe llevar a cabo en el producto terminado cuando el proceso no esté
validado.

DETERMINACIÓN DEL TAMAÑO DE LA MUESTRA

Para cada prueba microbiológica, muestrear 1O envases o unidades del producto farmacéutico o un número de unidades
que sea representativo de la partida y que pueda proporcionar como mínimo 1 gramo de producto. Para tamaños de partida
menores de 200 unidades (p.ej., partidas usadas en ensayos clínicos), el tamaño de la muestra se puede reducir al 1% de las
unidades o a 1 unidad, lo que resulte mayor. Se puede combinar el contenido de envases individuales para el análisis.

Análisis del Granel para PFNI de Bajo Contenido

Es preferible el análisis de lote a granel para PFNI de bajo contenido en lugar del análisis del producto terminado, debido a
que permite tomar muestras de mayores tamaños que son representativas de la partida, sin incrementar indebidamente el ries-
go de contaminación microbiana inadvertida. El análisis del granel se puede llevar a cabo en polvos o en preparaciones líqui-
das justo antes del llenado. Cuando se realiza el análisis del granel en lugar del análisis del producto terminado, se debe validar
la capacidad de los procesos de fabricación posteriores al muestreo (p.ej., llenado y envasado) para prevenir contaminación
microbiana de conformidad con las buenas prácticas de fabricación vigentes (CGMP). Para pruebas de recuento microbiano,
se pueden muestrear al menos 1Og o 1O mL de material a granel o, para las pruebas de microorganismos específicos, se pue-
de muestrear 1 g o 1 mL de material de prueba. Para tamaños pequeños de partida (es decir, menos de 1000 g o 1000 mL), el
tamaño de muestra recomendado es 1% de la partida para las pruebas de recuento microbiano y de microorganismos específi-
cos.

MÉTODOS DE MUESTREO PARA PFNI DE ALTO CONTENIDO

Inhaladores de Polvo Seco

Los inhaladores de polvo seco tienen un reservorio interno que contiene una cantidad suficiente de formulación para dosis
múltiples que son dosificadas por el dispositivo durante la activación por parte del paciente. En estos casos, se deben emplear
procedimientos validados apropiados para muestrear un envase de producto farmacéutico no estéril.

Aerosoles para Inhalación

Tomar en cuenta las cuestiones de seguridad relacionadas con la inhalación del producto farmacéutico y el posible peligro
de inflamación. Evitar la contaminación de las muestras usando técnicas asépticas siempre que sea necesario.

MÉTODO DE ACCIONAMIENTO AUTOMÁTICO

El contenido de los envases de los aerosoles para inhalación se puede recolectar accionando automáticamente cada envase
de aerosol y recolectando la formulación liberada en un filtro estéril adecuado.

MÉTODO A TEMPERATURA AMBIENTE

Desinfectar la parte exterior de los envases de prueba con un desinfectante apropiado y dejar que los envases se sequen en
un ambiente controlado. Vaciar el contenido del envase de aerosol en un vaso estéril usando un dispositivo con aguja u otro
dispositivo similar (p.ej., el conducto de ingreso de agua de una máquina para hacer hielo). Si se ha demostrado que el prope-
lente no inhibe el crecimiento de microorganismos, se puede agregar el contenido del vaso estéril directamente a los medios
líquidos o a las soluciones amortiguadoras para la prueba. De otro modo, esperar a que el propelente se evapore del vaso,
dejando el vaso a temperatura ambiente durante varios minutos. Eliminar el propelente gaseoso residual inclinando ligeramen-
540 (61 O) Métodos de Muestreo Microbiológico Alternativos/ Pruebas Físicas USP 40

te el vaso o permitiendo el paso de una corriente lenta de gas estéril microbiológicamente inerte sobre la superficie del mismo.
En el caso de algunos propelentes menos volátiles, por ejemplo, combinaciones de clorofluorocarbono (CFC) 11 /12, se puede
calentar el vaso suavemente (a temperatura::; 45º) para ayudar a la evaporación. Una vez evaporado el propelente, agregar los
medios líquidos o las soluciones amortiguadoras y mezclar el contenido para preparar para el análisis.
La expulsión directa en los caldos de cultivo o las soluciones amortiguadoras puede ser factible siempre que se cuente con
un dispositivo con aguja que sea lo suficientemente fino y fuerte como para perforar el envase y permitir que el contenido
salga lentamente. En este caso, el contenido puede ser expulsado y mezclado en el medio acuoso. Existe la posibilidad de que
se formen capas de propelente y de medio acuoso, lo cual puede requerir un mayor periodo de espera y calentamiento suave
(que no exceda de 45º) para evaporar el propelente.

MÉTODO CON ENFRIAMIENTO

Colocar los envases de aerosol desinfectados en hielo seco o en una suspensión espesa de hielo seco (garantizar la calidad
microbiana del hielo seco y del líquido para formar la suspensión espesa), o en un criocongelador durante el periodo necesario
para licuar el contenido. Desinfectar la parte exterior de los envases de prueba con un desinfectante apropiado y dejar que los
envases se sequen en un ambiente aséptico. Abrir asépticamente los envases de aerosol usando una herramienta apropiada. Se
debe tener en cuenta que la congelación puede afectar la viabilidad de los microorganismos. Para productos basados en CFC,
verter el contenido de los envases en vasos estériles. Dejar que escape el propelente y combinar el residuo con un diluyente
adecuado para el producto farmacéutico. También se pueden emplear otros procedimientos específicos para el fármaco. Para
productos basados en hidrofluoroalcanos, verter el contenido de los envases en vasos estériles parcialmente sumergidos en va-
sos más grandes que contengan hielo seco. Expulsar el propelente, por ejemplo, evaporando el material hasta sequedad con
una corriente lenta de aire comprimido estéril, filtrado y libre de aceite. Combinar el residuo con un diluyente apropiado para
el producto farmacéutico. Un método alternativo para analizar todo el contenido de un envase previamente enfriado consiste
en verter el contenido del envase abierto en una unidad de filtración por membrana estéril, dejar que escape el propelente y
luego enjuagar con una cantidad adecuada de diluyente estéril.

Atomizadores Nasales Multidosis

Los envases de atomizadores nasales multidosis a menudo tienen una tapa de rosca, precintada, o de anclaje hermético. El
envase se puede abrir desenroscando la tapa, cortando el sello o usando una herramienta para retirar el precinto, con cuidado
de evitar la contaminación microbiana durante el proceso. Después de retirar la tapa, por lo general resulta apropiado el uso
de los métodos de muestreo tradicionales, como los descritos en los capítulos de pruebas generales (61) Examen Microbiológico
de Productos No Estériles: Pruebas de Recuento Microbiano y (62) Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Mi-
croorganismos Específicos.

(611) DETERMINACIÓN DE ALCOHOL

PROCEDIMIENTOS
Método 1-Método de Destilación
El método 1 se utiliza para la determinación de alcohol a menos que se especifique algo diferente en la monografía individual.
Es adecuado para examinar la mayoría de los extractos líquidos y las tinturas, siempre que la capacidad del matraz de desti-
lación sea suficiente (normalmente de dos a cuatro veces el volumen del líquido a calentar) y la velocidad de destilación sea
la necesaria para producir destilados transparentes. Los destilados turbios pueden clarificarse mediante agitación con talco o
con carbonato de calcio y filtración, después de lo cual la temperatura del filtrado se ajusta y el contenido de alcohol se
determina a partir del peso específico. Durante todas las manipulaciones, tomar precauciones para minimizar la pérdida de
alcohol por evaporación.
Tratar los líquidos que forman una cantidad inconveniente de espuma durante la destilación acidificándolos fuertemente con
ácidos fosfórico, sulfúrico o tánico, o tratarlos con un leve exceso de solución de cloruro de calcio o con una pequeña canti-
dad de parafina o aceite de silicona antes de comenzar la destilación.
Evitar las proyecciones durante la destilación agregando trozos de material poroso insoluble, como carburo de silicio, o perlas.
Para líquidos que se supone que contienen 30% de alcohol o menos: Con una pipeta, transferir a un aparato de desti-
lación adecuado no menos de 25 mL del líquido en el que se debe determinar el contenido de alcohol y observar la tempe-
ratura a la que se midió el volumen. Agregar un volumen igual de agua, destilar y recoger un volumen de destilado que sea
aproximadamente 2 mL menor que el volumen tomado de líquido de prueba original, ajustar a la temperatura a la cual se
midió el líquido de prueba original, agregar suficiente agua hasta medir con exactitud el volumen original del líquido de
prueba y mezclar. El destilado es transparente o no más que levemente turbio y no contiene más que trazas de sustancias
volátiles, además de alcohol y agua. Determinar el peso específico del líquido a 25º, según se indica en Peso Específico
(841 ), y usar este resultado para establecer el porcentaje, en volumen, de C2 H5 0H contenido en el líquido examinado por
referencia a la Tabla Alcoholimétrica en la sección Tablas de Referencia.
USP 40 Pruebas Físicas/ (611) Determinación de Alcohol 541

Para líquidos que se supone que contienen más de 30% de alcohol: Proceder según se indica en el párrafo anterior,
excepto que se debe hacer lo siguiente: diluir la muestra con aproximadamente el doble de su volumen en agua, recoger
un volumen de destilado que sea aproximadamente 2 mL menor que el doble del volumen del líquido de prueba original,
ajustar a la temperatura a la cual se midió el líquido de prueba original, agregar suficiente agua hasta medir con exactitud
el doble del volumen original del líquido de prueba, mezclar y determinar el peso específico. La proporción de C2 H5 0H, en
volumen, en este destilado, según se determina a partir de su peso específico, equivale a la mitad del C2 H5 0H contenido
en el líquido examinado.
Tratamiento Especial
Ácidos y bases volátiles: Acidificar levemente las preparaciones que contengan bases volátiles con ácido sulfúrico diluido
antes de destilar. Si hay ácidos volátiles presentes, alcalinizar levemente la preparación con hidróxido de sodio SR.
Glicerina: A los líquidos que contengan glicerina, agregar suficiente agua para que el residuo, después de la destilación,
contenga no menos de 50% de agua.
Yodo: Antes de la destilación, tratar todas las soluciones que contengan yodo libre con cinc en polvo o decolorar con una
cantidad apenas suficiente de solución de tiosulfato de sodio (1 en 1O), seguida de algunas gotas de hidróxido de sodio
SR.
Otras sustancias volátiles: Los alcoholados, elíxires, tinturas y preparaciones similares que contienen proporciones apre-
ciables de sustancias volátiles, además de alcohol y agua, tales como aceites volátiles, cloroformo, éter, alcanfor, etc., re-
quieren tratamiento especial, como se describe a continuación:
Para líquidos que se supone que contienen 50% de alcohol o menos: Mezclar en un separador 25 mL de la muestra
en análisis, medidos con exactitud, con aproximadamente el mismo volumen de agua. Saturar esta mezcla con cloruro
de sodio, luego agregar 25 mL de éter de petróleo y agitar la mezcla para extraer los ingredientes volátiles que interfie-
ran. Transferir la capa separada inferior a un segundo separador y repetir la extracción dos veces con dos porciones más
de 25 mL de éter de petróleo. Extraer las soluciones combinadas de éter de petróleo con tres porciones de 1O mL de una
solución saturada de cloruro de sodio. Combinar las soluciones salinas y destilar de la manera habitual, recogiendo un
volumen de destilado que presente un cociente simple en relación al volumen de la muestra original.
Para líquidos que se supone que contienen más de 50% de alcohol: Ajustar la muestra en análisis a una concentra-
ción de aproximadamente 25% de alcohol diluyendo con agua y luego proceder según se indica en Para líquidos que se
supone que contienen 50% de alcohol o menos, comenzando donde dice "Saturar esta mezcla con cloruro de sodio".
En la preparación de Colodión o Colodión Flexible para destilación, usar agua en lugar de la solución saturada de cloruro
de sodio que se indica anteriormente.
Si hay aceites volátiles presentes sólo en pequeñas proporciones y se obtiene un destilado turbio, y no se ha empleado el
tratamiento con éter de petróleo, se puede clarificar el destilado y adecuarlo para la determinación de peso específico
agitándolo con aproximadamente un quinto de su volumen de éter de petróleo o filtrándolo a través de una capa fina
de talco.
Método U-Método de Cromatografía de Gases
Usar el Método /la cuando el Método 11 se especifica en la monografía individual. Para obtener un análisis de los principios en
los que se basa, ver Cromatografía de Gases en Cromatografía (621 ).
• MÉTODO llA
Aparato: En condiciones típicas, usar un cromatógrafo de gases equipado con un detector de ionización a la llama y una
columna cromatográfica de vidrio de 4 mm x 1,8 m rellena con soporte S3 de malla 100 a 120, usando nitrógeno o helio
como gas transportador. Antes de usar, acondicionar la columna durante la noche a 235º con un flujo lento de gas trans-
portador. Mantener la temperatura de la columna a 120º y la temperatura del inyector y el detector a 21 Oº. Ajustar el
flujo del gas transportador y la temperatura de modo que el acetonitrilo, el estándar interno, eluya entre 5 y 1O minutos.
Soluciones
Preparación madre de prueba: Diluir la muestra en análisis en diluciones sucesivas con agua para obtener una solución
que contenga aproximadamente 2% (v/v) de alcohol.
Preparación de prueba: Pipetear 5 mL de la Preparación madre de prueba y de ER Determinación de Alcohol-Acetoni-
trilo USP [NOTA-Alternativamente, se puede usar una solución acuosa de acetonitrilo al 2% de calidad adecuada como
solución de estándar interno], transferir a un matraz volumétrico de 50 mL, diluir a volumen con agua y mezclar.
Preparación estándar: Pipetear 5 mL de ER Determinación de Alcohol-Alcohol USP y de ER Determinación de Al-
cohol-Acetonitrilo USP [NOTA-Alternativamente, se puede usar una solución acuosa de acetonitrilo al 2% de calidad
adecuada como solución de estándar interno], transferir a un matraz volumétrico de 50 mL, diluir a volumen con agua y
mezclar.
Procedimiento: Inyectar por duplicado en el cromatógrafo de gases aproximadamente 5 µL de la Preparación de prueba y
de la Preparación estándar, registrar los cromatogramas y determinar los cocientes entre las respuestas de los picos. Calcu-
lar el porcentaje de alcohol (v/v) en la muestra en análisis, por la fórmula:
Resultado= CD(Ru/R 5)

C = concentración declarada de ER Determinación de Alcohol-Alcohol USP

O =factor de dilución (cociente entre el volumen de la Preparación madre de prueba y el volumen de muestra tomado)
Ru = cocientes de respuesta entre los picos obtenidos de la Preparación de prueba
542 (611) Determinación de Alcohol/ Pruebas Físicas USP 40

R5 = cocientes de respuesta entre los picos obtenidos de la Preparación estándar

Prueba de aptitud del sistema: En un cromatograma adecuado, el factor de resolución, R, no es menor de 2; el factor
de asimetría del pico de alcohol no es mayor de 2,0; y seis inyecciones repetidas de la Preparación estándar presentan una
desviación estándar relativa de no más de 2,0% en el cociente entre los picos de alcohol y del estándar interno .
• MÉTODO llB
Aparato: Equipar un cromatógrafo de gases con un inyector partido con una relación de partición de 5 : 1, un detector
de ionización a la llama y una columna capilar de 0,53 mm x 30 m recubierta con una película de 3,0 µm de fase G43.
Usar helio como gas transportador a una velocidad de flujo de 34,0 cm por segundo. Programar el cromatógrafo para
mantener la temperatura de la columna a 50º durante 5 minutos, luego aumentar la temperatura a una velocidad de 1 Oº
por minuto hasta 200º, y mantener a esa temperatura durante 4 minutos. Mantener la temperatura del inyector a 21 Oº y
la del detector a 280º.
Soluciones
Preparación madre de prueba: Diluir la muestra en análisis en diluciones sucesivas con agua para obtener una solución
que contenga aproximadamente 2% (v/v) de alcohol.
Preparación de prueba: Pipetear 5 mL de la Preparación madre de prueba y de ER Determinación de Alcohol-Acetoni-
trilo USP [NOTA-Alternativamente, se puede usar una solución acuosa de acetonitrilo al 2% de calidad adecuada como
solución de estándar interno], y transferir a un matraz volumétrico de 25 mL, diluir a volumen con agua y mezclar.
Preparación estándar: Pipetear 5 mL de ER Determinación de Alcohol-Alcohol USP y de ER Determinación de Al-
cohol-Acetonitrilo USP [NOTA-Alternativamente, se puede usar una solución acuosa de acetonitrilo al 2% de calidad
adecuada como solución de estándar interno], y transferir a un matraz volumétrico de 25 mL, diluir a volumen con agua
y mezclar.
Procedimiento: Inyectar por duplicado en el cromatógrafo de gases aproximadamente de 0,2 a 0,5 µL de la Preparación
de prueba y de la Preparación estándar, registrar los cromatogramas y determinar los cocientes de respuesta de los picos.
Calcular el porcentaje de alcohol (v/v) en la muestra en análisis, por la fórmula:
Resultado = CD(Ruf R5)

C =concentración declarada de ER Determinación de Alcohol-Alcohol USP

O =factor de dilución (cociente entre el volumen de la Preparación madre de prueba y el volumen de muestra tomado)
Ru = cocientes de respuesta entre los picos obtenidos de la Preparación de prueba
R5 = cocientes de respuesta entre los picos obtenidos de la Preparación estándar
Prueba de aptitud del sistema: En un cromatograma adecuado, el factor de resolución, R, entre alcohol y el estándar
interno no es menor de 4; el factor de asimetría del pico de alcohol no es mayor de 2,0; y seis inyecciones repetidas de la
Preparación estándar presentan una desviación estándar de no más de 4,0% en el cociente entre los picos de alcohol y del
estándar interno.

REQUISITOS ADICIONALES
• ESTÁNDARES DE REFERENCIA USP (11)
ER Determinación de Alcohol-Acetonitrilo USP
ER Determinación de Alcohol-Alcohol USP

(616) DENSIDAD APARENTE Y DENSIDAD POR ASENTAMIENTO DE

LOS POLVOS

DENSIDAD APARENTE

Este capítulo general ha sido armonizado con los textos correspondientes de la Farmacopea Europea y/o la Farmacopea japo-
nesa. •La porción que no está armonizada se marca con los símbolos (..) para especificar este hecho .•
La densidad aparente de un polvo es la relación de la masa de una muestra de polvo sin asentar y su volumen, incluida la
contribución del volumen del espacio vacío entre las partículas. En consecuencia, la densidad aparente depende tanto de la
densidad de las partículas de polvo como de la distribución espacial de las partículas en el lecho de polvo. La densidad aparen-
te se expresa en gramos por mL (g/mL) aunque la unidad internacional es el kilogramo por metro cúbico (1 g/mL =
1000 kg/m 3) porque las mediciones se hacen usando probetas. También se puede expresar en gramos por centímetro cúbico
(g/cm 3). Las propiedades que determinan la densidad aparente de un polvo dependen de la preparación, el tratamiento y el
almacenamiento de la muestra, es decir la forma en que se manipuló. Las partículas se pueden compactar para que tengan un
intervalo variable de densidades aparentes; sin embargo, la más ligera perturbación del lecho de polvo puede producir un
cambio en la densidad aparente. Por lo tanto, a menudo es muy difícil medir la densidad aparente de un polvo con buena
reproducibilidad y, al informar los resultados, es fundamental especificar cómo se hizo la determinación. La densidad aparente
USP 40 Pruebas Físicas/ (616) Densidad Aparente y por Asentamiento 543

de un polvo se determina midiendo el volumen de una muestra de polvo de peso conocido, que puede haber sido pasada a
través de un tamiz, en una probeta graduada (Método /) o midiendo la masa de un volumen conocido de polvo que haya sido
pasado a través de un volúmetro a un vaso (Método JI) o un recipiente de medidas (Método 111).
Se prefieren el Método /y el Método fil.

Método 1-Medición en una Probeta Graduada

PROCEDI M1ENTO

Pasar una cantidad de material suficiente para completar la prueba a través de un tamiz con aperturas mayores o iguales a
1,0 mm, de ser necesario, para deshacer los aglomerados que pudieran haberse formado durante el almacenamiento; esto se
debe hacer cuidadosamente para evitar cambios en la naturaleza del material. Introducir sin compactar aproximadamente
100 g de la muestra de prueba, M, pesada con una exactitud de O, 1%, en una probeta graduada, seca, de 250 ml (legible
hasta 2 ml). Si fuera necesario, nivelar cuidadosamente el polvo, sin compactarlo, y tomar la lectura del volumen aparente sin
asentar (V0) con una aproximación a la unidad más cercana de la escala. Calcular la densidad aparente en g/ml por la fórmula
M/V0 • En general, se recomienda determinar esta propiedad efectuando mediciones repetidas. Si la densidad del polvo es de-
masiado baja o demasiado alta, de tal forma que la muestra de prueba tenga un volumen aparente sin asentamiento de más
de 250 ml o menos de 150 ml, no es posible usar una muestra de polvo de 100 g. Por lo tanto, se debe seleccionar una
cantidad diferente de polvo como muestra de prueba, de manera que su volumen aparente sin asentamiento sea de 150 a 250
ml (volumen aparente mayor o igual a 60% del volumen total de la probeta); el peso de la muestra de prueba se especifica en
la expresión de los resultados. Para muestras de prueba que tengan un volumen aparente entre 50 y 100 ml, se puede usar
una probeta de 100 ml, legible hasta 1 ml; el volumen de la probeta se especifica en la expresión de los resultados.

Método 11-Medición en un Volúmetro

APARATO

El aparato (Figura 7) consta de un embudo superior provisto de un tamiz de 1,0 mm. 1 El embudo está montado sobre una
caja deflectora que contiene cuatro placas deflectoras de vidrio sobre las que se desliza el polvo y rebota a medida que pasa. El
embudo que se encuentra en el fondo de la caja deflectora recoge el polvo y lo vierte en un vaso de capacidad especificada
colocado directamente debajo del embudo. El vaso puede ser cilíndrico (con una capacidad de 25,00 ± 0,05 ml y con un
diámetro interno de 30,00 ± 2,00 mm) o cúbico (con una capacidad de 16,39 ±0,20 ml cuyas dimensiones internas son de
25,400 ± 0,076 mm).

Embudo para polvos -

Caja deflectora

Vaso colector
de muestra

Figura 1.

PROCEDIMIENTO

Dejar que un exceso de polvo fluya a través del aparato y recogerlo en el vaso colector de la muestra hasta que éste se des-
borde, usando al menos 25 cm 3 de polvo con el vaso cúbico y 35 cm 3 de polvo con el vaso cilíndrico. Quitar cuidadosamente
el exceso de polvo de la parte superior del vaso pasando suavemente el filo de la hoja de una espátula ubicada en dirección
perpendicular a la superficie y apoyada en el borde superior del vaso, tomando las precauciones necesarias para que la espátu-

1 El aparato (Volúmetro de Scott) se ajusta a las dimensiones que aparecen en ASTM B329-06(2012).
544 (616) Densidad Aparente y por Asentamiento/ Pruebas Físicas USP 40

la esté siempre perpendicular y así evitar la compactación o la remoción del polvo del vaso. Limpiar el material que hubiera
podido quedar adherido a las paredes laterales del vaso y determinar el peso del polvo, M, con una aproximación de O, 1%.
Calcular la densidad aparente, en g/mL, por la fórmula:

en donde V0 es el volumen del vaso, en mL. Registrar el promedio de tres determinaciones usando tres muestras de polvo dife-
rentes.

Método 111-Medición en un Recipiente

APARATO

El aparato consta de un recipiente cilíndrico de acero inoxidable de 100 ml, con las dimensiones que se especifican en la
Figura 2.

2:0
t
D+---54,0-+ i
52,0

l ºf 1
[~:::~]---+

54.0
i
50,0

1
Figura 2.

PROCEDIMIENTO

Pasar una cantidad de polvo suficiente para completar la prueba a través de un tamiz de 1,0 mm, si fuera necesario, para
deshacer los aglomerados que pudieran haberse formado durante el almacenamiento y permitir que la muestra obtenida fluya
libremente hacia el recipiente de medición hasta que se desborde. Quitar cuidadosamente el exceso de polvo de la parte supe-
rior del recipiente como se describió para el Método//. Determinar el peso (M0) del polvo con una aproximación de O, 1%,
restando la masa, previamente determinada, del recipiente de medición vacío. Calcular la densidad aparente (g/mL) por la fór-
mula M 0 /l 00 y registrar el promedio de tres determinaciones, usando tres muestras de polvo diferentes.

DENSIDAD POR ASENTAMIENTO

La densidad por asentamiento es una densidad aparente aumentada, obtenida después de golpetear mecánicamente un re-
cipiente que contiene la muestra de polvo. La densidad por asentamiento se obtiene golpeteando mecánicamente una probe-
ta o un recipiente de medición graduado que contenga una muestra de polvo. Después de determinar el volumen o peso ini-
cial del polvo, se golpetea mecánicamente la probeta o recipiente de medición y se toman las lecturas de volumen o peso
hasta que sean prácticamente constantes. El asentamiento mecánico se obtiene levantando la probeta o recipiente y dejándolo
caer por su propio peso desde una altura especificada, por alguno de los tres métodos que se describen a continuación. Puede
ser preferible emplear dispositivos que rotan la probeta o recipiente durante el golpeteo a fin de reducir al mínimo la posibili-
dad de que la masa se separe durante el asentamiento.

Método 1

APARATO

El aparato (Figura 3) consta de lo siguiente:

• Una probeta graduada de 250 mL (legible hasta 2 mL, con una masa de 220 ± 44 g)
• Un aparato de asentamiento capaz de producir, en 1 minuto, nominalmente, 250 ± 15 golpes desde una altura de 3 ± 0,2
mm o, nominalmente, 300 ± 15 golpes desde una altura de 14 ± 2 mm. El soporte de la probeta graduada, con su disposi-
tivo de fijación, tiene una masa de 450 ± 1O g.
USP 40 Pruebas Físicas/ (616) Densidad Aparente y por Asentamiento 545

J_
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E E E
...:¡:_ o
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Q)
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Probeta graduada ---;;-

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-$- Ol E
o
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Soporte de la probeta t:'. e:
-r ctl
o..
lCD

¡" E E
ENE
(")o-

Yunque
Esta dimensión es tal que la
caída CD cumple con las
especificaciones y que, en el punto
j más bajo de la leva, el soporte de
la probeta se apoya libremente
sobre la parte superior del yunque.

Leva

Figura 3,

PROCEDIMIENTO

Proceder según se describió anteriormente para la determinación del volumen aparente (V0 ). Fijar la probeta en el soporte.
Realizar 1O, 500 y 1250 golpes en la misma muestra de polvo y leer los volúmenes correspondientes V10, V500 y V1250 con una
aproximación a la unidad más cercana de la escala. Si la diferencia entre V500 y V1250 es menor o igual a 2 ml, V1250 es el volu-
men por asentamiento. Si la diferencia entre V500 y V1250 excede de 2 ml, repetir en incrementos, por ejemplo, de 1250 golpes,
hasta que la diferencia entre las mediciones sucesivas sea menor o igual a 2 ml. Para algunos polvos, puede ser apropiado un
número menor de golpes, si se ha validado. Calcular la densidad por asentamiento (g/ml), usando la fórmula m/VF en donde
VF es el volumen final por asentamiento. En general, se recomienda determinar esta propiedad efectuando mediciones repeti-
das. Especificar la altura de caída con los resultados. Si no es posible utilizar una muestra de prueba de 100 g, usar una canti-
dad reducida y una probeta graduada apropiada de 100 ml (legible hasta 1 ml) que pese 130 ± 16 g y esté montada en un
soporte que pese 240 ± 12 g. Si la diferencia entre V500 y V1250 es menor o igual a 1 ml, V1250 es el volumen por asentamiento.
Si la diferencia entre V500 y V1250 excede de 1 ml, repetir en incrementos, por ejemplo, de 1250 golpes, hasta que la diferencia
entre las mediciones sucesivas sea menor o igual a 1 ml. Las condiciones de la prueba modificada se especifican en la expre-
sión de los resultados.

Método 11

APARATO Y PROCEDIMIENTO

Proceder según se indicó en Método/, excepto que el analizador mecánico proporciona una caída fija de 3 ± 0,2 mm a una
velocidad nominal de 250 golpes por minuto.
546 (616) Densidad Aparente y por Asentamiento/ Pruebas Físicas USP 40

Método 111

APARATO Y PROCEDIMIENTO

Proceder según se indicó en el Método ///-Medición en un Recipiente para medir la densidad aparente en un recipiente de
medición equipado con la tapa que se muestra en la Figura 2. El recipiente de medición con la tapa se levanta 50-60 veces por
minuto mediante un aparato medidor de densidad por asentamiento adecuado. Efectuar 200 golpes, retirar la tapa y quitar
cuidadosamente el exceso de polvo de la parte superior del recipiente de medición según se describe en el Método ///-Medi-
ción en un Recipiente para medir la densidad aparente. Repetir el procedimiento con 400 golpes. Si la diferencia entre las dos
masas obtenidas después de 200 y 400 golpes excede el 2%, realizar una prueba efectuando 200 golpes adicionales hasta que
la diferencia entre las mediciones sucesivas sea menos de 2%. Calcular la densidad por asentamiento (g/mL) usando la fórmula
MF/l 00, donde MF es la masa del polvo en el recipiente de medición. Registrar el promedio de tres determinaciones usando
tres muestras de polvo diferentes. Especificar las condiciones de la prueba en los resultados, incluyendo la altura de la caída.

MEDIDAS DE LA COMPRESIBILIDAD DE UN POLVO

Dado que las interacciones entre las partículas que afectan las propiedades que determinan la densidad aparente de un pol-
vo también afectan el flujo del polvo, una comparación entre la densidad aparente y la densidad por asentamiento puede pro-
porcionar una medida de la importancia relativa de estas interacciones en un polvo determinado. A menudo, este tipo de
comparación se usa como un índice de la capacidad de flujo del polvo, por ejemplo, el Índice de Compresibilidad o el Índice de
Hausner, según se describe a continuación.
El Índice de Compresibilidad y el Índice de Hausner son medidas que expresan la propensión de un polvo a la compresión,
según se describió antes. Como tales, son medidas de la capacidad de asentamiento de un polvo y permiten evaluar la impor-
tancia relativa de las interacciones entre partículas. En un polvo que fluye libremente, dichas interacciones son menos relevan-
tes, y la densidad aparente y la densidad por asentamiento tendrán valores más cercanos. En el caso de materiales de menor
fluidez, generalmente existen interacciones mayores entre las partículas y se observa una diferencia mayor entre la densidad
aparente y la densidad por asentamiento. El Índice de Compresibilidad y el Índice de Hausner reflejan estas diferencias.

ÍNDICE DE COMPRESIBILIDAD

Calcular por la fórmula:

Va= volumen aparente sin asentar

VF =volumen final asentado

ÍNDICE DE HAUSNER

Dependiendo del material, el índice de compresibilidad se puede determinar usando V1a en vez de Va. [NOTA-Si se usa V1a,
debe especificarse claramente en los resultados.]

(621) CROMATOGRAFÍA

INTRODUCCIÓN

Las técnicas de separación cromatográfica son métodos de separación de múltiples etapas en los que los componentes de
una muestra se distribuyen entre dos fases, una de las cuales es estacionaria y la otra móvil. La fase estacionaria puede ser un
sólido, un líquido absorbido sobre un sólido o un gel. La fase estacionaria puede estar empacada en una columna, extendida
como una capa, distribuida como película o aplicada mediante otras técnicas. La fase móvil puede ser gaseosa o líquida o un
fluido supercrítico. La separación puede basarse en adsorción, distribución de masa (partición) o intercambio iónico; o puede
basarse en diferencias entre las propiedades fisicoquímicas de las moléculas, tales como tamaño, masa o volumen. Este capítu-
lo contiene procedimientos generales, definiciones y cálculos de parámetros comunes y describe requisitos generales para apti-
tud del sistema. Los tipos de cromatografía útiles en el análisis cualitativo y cuantitativo que se emplean en los procedimientos
cromatográficos de la USP son: cromatografía en columna, de gases, en papel, en capa delgada (incluyendo la cromatografía
USP 40 Pruebas Físicas/ (621) Cromatografía 547

en capa delgada de alta resolución) y de líquidos presurizados (comúnmente llamada cromatografía líquida de alta presión o
alta resolución).

PROCEDIMIENTOS GENERALES
Esta sección describe los procedimientos básicos usados cuando se describe un método cromatográfico en una monografía.
Se deben seguir los siguientes procedimientos a menos que se indique algo distinto en la monografía individual.

Cromatografía en Papel

FASE ESTACIONARIA

La fase estacionaria es una hoja de papel de textura y espesor adecuados. El desarrollo puede ser ascendente, en cuyo caso
el disolvente se desplaza hacia arriba por el papel mediante fuerzas de capilaridad, o descendente, en cuyo caso el flujo del
disolvente se ve ayudado por la fuerza de gravedad. La orientación de las fibras del papel con respecto al flujo del disolvente se
debe mantener constante en una serie de cromatogramas. (Por lo general, el fabricante indica la dirección de máquina).

APARATO

El equipo esencial para cromatografía en papel comprende una cámara hermética al vapor provista de entradas para agregar
el disolvente y una gradilla de material resistente a la corrosión aproximadamente 5 cm más corta que la altura interior de la
cámara. La gradilla sirve como soporte para la cubeta de disolvente y para las varillas antisifón que, a su vez, sostienen las hojas
cromatográficas. El fondo de la cámara está cubierto con la mezcla de disolventes o fase móvil indicada. La saturación de la
cámara con el vapor del disolvente se facilita revistiendo las paredes del interior con un papel humedecido con la fase móvil
indicada.

SIEMBRA

La sustancia o sustancias a ser analizadas se disuelven en un disolvente adecuado. Se aplican volúmenes convenientes, medi-
dos con micropipetas adecuadas, de la solución resultante que contengan normalmente de 1-20 µg del compuesto, en zonas
de 6 a 1O mm de diámetro y con una separación de no menos de 3 cm.

PROCEDIMIENTO PARA CROMATOGRAFÍA DESCENDENTE EN PAPEL

1. Suspender la hoja cromatográfica sembrada en el aparato, usando la varilla antisifón para sostener el extremo superior de
la hoja en la cubeta de disolvente. [NOTA-Asegurar que la porción de la hoja que cuelga por debajo de las varillas esté
suspendida libremente en la cámara sin tocar la gradilla o las paredes de la cámara o el líquido que está en el interior de la
cámara.]
2. La cámara se sella para permitir su equilibrio (saturación) y el del papel con el vapor del disolvente. Liberar cualquier exce-
so de presión, si fuera necesario.
3. Después de equilibrar la cámara, la fase móvil previamente preparada se introduce en la cubeta a través de la entrada.
4. Cerrar la entrada y dejar que la fase móvil se desplace hacia abajo la distancia deseada sobre el papel.
5. Retirar la hoja de la cámara.
6. Marcar rápidamente la ubicación de la fase móvil y secar la hoja.
7. Observar el cromatograma y medir directamente o después del revelado adecuado para localizar las manchas del fármaco
o de los fármacos aislados.

PROCEDIMIENTO PARA CROMATOGRAFÍA ASCENDENTE EN PAPEL

1 . Agregar la fase móvil al fondo de la cámara.

2. La cámara se sella para permitir su equilibrio (saturación) y el del papel con el vapor del disolvente. Liberar cualquier exce-
so de presión, si fuera necesario.
3. Sumergir el borde inferior de la fase estacionaria en la fase móvil para permitir que la fase móvil ascienda en la hoja cro-
matográfica por capilaridad.
4. Cuando la fase móvil haya alcanzado la altura deseada, abrir la cámara, retirar la hoja, marcar rápidamente la ubicación
del frente de la fase móvil, y secar la hoja.
5. Observar el cromatograma y medir directamente o después del revelado adecuado para localizar las manchas del fármaco
o de los fármacos aislados.
548 (621) Cromatografía/ Pruebas Físicas USP 40

Cromatografía en Capa Delgada

FASE ESTACIONARIA

La fase estacionaria es una capa relativamente delgada y uniforme de material seco y reducido a polvo fino que se aplica
sobre una lámina o placa de vidrio, plástico o metal (generalmente conocida como la placa). La fase estacionaria para TLC
tiene un tamaño de partícula promedio de 10-15 µm, y la de TLC de alta resolución (HPTLC) tiene un tamaño de partícula
promedio de 5 µm. Se pueden usar placas disponibles comercialmente con una zona preadsorbente si se especifican en una
monografía. La muestra aplicada a la región preadsorbente se desarrolla en forma de bandas estrechas y definidas en la interfa-
se entre el preadsorbente y el sorbente. Las separaciones logradas pueden basarse en la adsorción, la partición o una combina-
ción de ambos efectos, según el tipo específico de fase estacionaria.

APARATO

Usar una cámara cromatográfica de material inerte y transparente con las siguientes especificaciones: una cubeta de fondo
plano o cubetas gemelas, una tapa que cierre herméticamente y un tamaño adecuado para las placas. Revestir como mínimo
una pared de la cámara cromatográfica con papel de filtro. Agregar una cantidad suficiente de fase móvil a la cámara cromato-
gráfica de modo que proporcione, después de impregnar el papel de filtro, un nivel de profundidad apropiado a la dimensión
de la placa utilizada. Cerrar la cámara cromatográfica y dejar que se equilibre. [NOTA-A menos que se indique algo diferente,
las separaciones se realizan en una cámara saturada.]

DETECCIÓN/VISUALIZACIÓN

A menudo se usa una fuente de luz ultravioleta (UV) adecuada para observaciones bajo luz UV de longitud de onda corta
(254 nm) y larga (365 nm), así como una variedad de soluciones reveladoras para visualizar las manchas.

SIEMBRA

Aplicar las soluciones en forma de zonas sobre la superficie de la fase estacionaria (placa) en el volumen prescrito en porcio-
nes lo suficientemente pequeñas para obtener manchas circulares de 2-5 mm de diámetro (1-2 mm sobre placas de HPTLC) o
bandas de 10-20 mm x 1-2 mm (5-1 O mm x 0,5-1 mm sobre placas de HPTLC) a una distancia adecuada del borde inferior y
de los bordes laterales de la placa. [NOTA-Durante el desarrollo, la posición de la aplicación debe estar por lo menos 5 mm
(TLC) o 3 mm (HPTLC) por encima del nivel de la fase móvil.] Aplicar las soluciones sobre una línea paralela al borde inferior
de la placa con una separación mínima de 1 O mm (5 mm en placas de HPTLC) entre los centros de las manchas o 4 mm (2
mm en placas de HPTLC) entre los bordes de las bandas y dejar que se sequen.

PROCEDIMIENTO

1 . Colocar la placa en la cámara, asegurando que las manchas o bandas estén por encima de la superficie de la fase móvil.
2. Cerrar la cámara.
3. Dejar que la fase móvil ascienda en la placa hasta que el frente de la fase móvil haya recorrido tres cuartos de la longitud
de la placa o la distancia indicada en la monografía.
4. Retirar la placa, marcar el frente de la fase móvil con un lápiz, y dejar que se seque.
5. Visualizar los cromatogramas según se indica.
6. Determinar los valores del factor de retardo cromatográfico (RF) para las manchas o zonas principales.
7. Se puede realizar una identificación presuntiva mediante la observación de las manchas o zonas con valores RF idénticos y
de magnitud similar, obtenidas respectivamente cromatografiando una muestra desconocida y un estándar en la misma
placa. Una comparación visual del tamaño o intensidad de las manchas o zonas puede servir para una estimación semi-
cuantitativa. La mediciones cuantitativas se pueden efectuar mediante densitometría (mediciones de absorbancia o fluo-
rescencia).

Cromatografía en Columna

SOPORTE SÓLIDO

Usar tierra silícea purificada para separación de fase normal. Usar tierra silícea cromatográfica silanizada para cromatografía
de partición en fase reversa.
USP 40 Pruebas Físicas/ (621) Cromatografía 549

FASE ESTACIONARIA

Modificar el soporte sólido agregando la fase estacionaria especificada en la monografía individual. Si se emplea una mezcla
de líquidos como fase estacionaria, mezclarlos antes de la introducción del soporte sólido.

FASE MÓVIL

La fase móvil se especifica en la monografía individual. Si la fase estacionaria es una solución acuosa, equilibrar con agua. Si
la fase estacionaria es un líquido orgánico polar, equilibrar con ese líquido.

APARATO

A menos que se especifique algo diferente en la monografía individual, el tubo cromatográfico tiene un diámetro interno de
aproximadamente 22 mm y una longitud de 200-300 mm. Acoplado al tubo cromatográfico se encuentra un tubo de salida
sin llave de paso con un diámetro interno de aproximadamente 4 mm y una longitud de aproximadamente 50 mm.
Preparación del aparato: Apisonar un trozo de lana de vidrio fina en la base del tubo. Combinar el volumen especificado
de fase estacionaria y la cantidad especificada de soporte sólido para producir una mezcla homogénea y liviana. Transferir esta
mezcla al tubo cromatográfico y apisonar empleando presión suave, hasta obtener una masa uniforme. Si la cantidad especifi-
cada de soporte sólido es más de 3 g, transferir la mezcla a la columna en porciones de aproximadamente 2 g y apisonar cada
porción. Si la valoración o la prueba requieren una columna multisegmentada, con una fase estacionaria diferente especificada
para cada segmento, apisonar después de la adición de cada segmento y agregar cada segmento directamente sobre el ante-
rior. Apisonar un trozo de lana de vidrio fina por encima del relleno de la columna. [NOTA-La fase móvil debe fluir a través de
una columna rellena adecuadamente como una corriente moderada o, si se lleva a cabo una cromatografía en fase reversa,
como un goteo lento.]
Si se incorpora la solución del analito en la fase estacionaria, completar la transferencia cuantitativa al tubo cromatográfico
raspando el vaso de precipitados usado para la preparación de la mezcla de prueba con una mezcla de aproximadamente 1 g
de Soporte Sólido y varias gotas del disolvente usado para preparar la solución muestra antes de agregar el trozo final de lana
de vidrio por encima del relleno.

PROCEDIMIENTO

1. Transferir la fase móvil al espacio de la columna por encima del relleno y dejar que fluya a través de la columna por acción
de la gravedad.
2. Enjuagar la punta de la columna cromatográfica con aproximadamente 1 mL de fase móvil antes de cada cambio en la
composición de la fase móvil y después de completar la elución.
3. Si se introduce el analito en la columna como una solución en la fase móvil, dejar que pase completamente al relleno de
la columna, luego agregar fase móvil en varias porciones pequeñas, dejando que cada porción drene completamente, an-
tes de agregar el grueso de la fase móvil.
4. Cuando el procedimiento indique el uso de múltiples columnas cromatográficas montadas en serie y se especifique la adi-
ción de fase móvil en porciones divididas, dejar que cada porción drene por completo a través de cada columna, y enjua-
gar la punta de la columna con fase móvil antes de la adición de cada porción sucesiva.

Cromatografía de Gases (GC)

FASE ESTACIONARIA LÍQUIDA

Este tipo de fase está disponible en columnas rellenas o capilares.

CROMATOGRAFÍA DE GASES EN COLUMNA RELLENA

La fase estacionaria líquida se deposita sobre un soporte sólido inerte finamente dividido, como por ejemplo tierra de diato-
meas, polímeros porosos, o carbono grafito, con el que se rellena la columna que por lo regular tiene un diámetro interno de
2-4 mm y una longitud de 1-3 m.

CROMATOGRAFÍA DE GASES EN COLUMNA CAPILAR

En las columnas capilares, las cuales no están rellenas con soporte sólido, la fase estacionaria líquida se deposita sobre la
superficie interna de la columna y puede unirse químicamente a ella.
550 (621) Cromatografía / Pruebas Físicas USP 40

FASE ESTACIONARIA SÓLIDA

Este tipo de fase está di3ponible únicamente en columnas rellenas. En estas columnas, la fase sólida es un adsorbente activo,
como por ejemplo alúmina, sílice o carbono, con el que se rellena una columna. Las resinas poliaromáticas porosas, que a ve-
ces se emplean en las columnas rellenas, no se recubren con una fase líquida. [NOTA-Las columnas capilares y rellenas deben
acondicionarse antes del uso, hasta que la línea base y otras características sean estables. Los distribuidores de columnas y ma-
teriales de relleno proveen instrucciones relativas al acondicionamiento recomendado.]

APARATO

Un cromatógrafo de gases consta de una fuente de gas transportador, un inyector, una columna, un detector y un dispositi-
vo registrador. El inyector, la columna y el detector tienen temperaturas controladas y se puede variar como parte del análisis.
Los gases transportadores típicos son helio, nitrógeno o hidrógeno, dependiendo de la columna y el detector en uso. El tipo de
detector que se usa depende de la naturaleza de los compuestos que se analizan y se especifica en la monografía individual. La
señal de salida de los detectores se registra como la respuesta del instrumento en función del tiempo y la medida del área o
altura del pico, es una función de la cantidad presente.

PROGRAMA DE TEMPERATURA

La longitud y la calidad de una separación por GC se pueden controlar alterando la temperatura de la columna cromatográ-
fica. Cuando sea necesario un programa de temperatura, la monografía individual indica las condiciones en formato de tabla.
La tabla indica la temperatura inicial, la velocidad de cambio de temperatura (rampa), la temperatura final y el tiempo de espe-
ra (hold time) a la temperatura final.

PROCEDIMIENTO

1 . Equilibrar la columna, el inyector y el detector con un flujo de gas transportador hasta obtener una señal constante.
2. Inyectar una muestra a través del septo del inyector, o usar un muestreador automático.
3. Comenzar el programa de temperatura.
4. Registrar el cromatograma.
5. Analizar según se indica en la monografía.

Cromatografía de Líquidos (HPLC)

El término cromatografía de líquidos, según se usa en los compendios, es sinónimo de cromatografía líquida de alta presión y
de cromatografía líquida de alta resolución. La cromatografía de líquidos es una técnica de separación basada en una fase esta-
cionaria sólida y una fase móvil líquida.

FASE ESTACIONARIA

Las separaciones se logran por procesos de partición, adsorción o intercambio iónico, según el tipo de fase estacionaria em-
pleada. Las fases estacionarias más comúnmente usadas son la sílice modificada o las microperlas de polímero. Las microperlas
se modifican agregando hidrocarburos de cadena larga. El tipo de relleno específico necesario para completar un análisis se
indica mediante la designación "L" en la monografía individual (ver también la sección Columnas Cromatográficas más adelan-
te). A menudo, el tamaño de las microperlas también se describe en la monografía. Los cambios en el tipo y tamaño de relleno
se analizan en la sección Aptitud del Sistema de este capítulo.

COLUMNA CROMATOGRÁFICA

El término columna incluye columnas de acero inoxidable, de acero inoxidable con recubrimiento interno y poliméricas, re-
llenas con una fase estacionaria. La longitud y el diámetro interno de la columna afectan la separación y, por lo tanto, las di-
mensiones típicas de la columna se incluyen en la monografía individual. Los cambios en las dimensiones de la columna se
analizan en la sección Aptitud del Sistema de este capítulo. Las monografías farmacopeicas no incluyen el nombre comercial de
las columnas apropiadas; esta omisión evita la interpretación de cualquier tipo de respaldo para un producto de un proveedor
y permite la adaptación a cambios normales en el mercado. Ver la sección Columnas Cromatográficas para más información.
En los procedimientos de HPLC, se puede usar una guarda columna siempre que se cumplan los siguientes requisitos, a me-
nos que se indique algo diferente en la monografía individual: (a) la longitud de la guarda columna debe ser no mayor de
15% de la longitud de la columna analítica, (b) el diámetro interno debe ser igual o menor que el de la columna analítica y (c)
el material de relleno debe ser el mismo que en la columna analítica (p.ej., sílice) y contener la misma fase ligada (p.ej., Cl 8).
USP 40 Pruebas Físicas/ (621) Cromatografía 551

En todo caso, se deben cumplir todos los requisitos de aptitud del sistema especificados en el procedimiento oficial con la
guarda columna instalada.

FASE MÓVIL

La fase móvil es un disolvente o mezcla de disolventes, según se define en la monografía individual.

APARATO

Un cromatógrafo de líquidos consta de un recipiente que contiene la fase móvil, una bomba para forzar el paso de la fase
móvil a través del sistema a alta presión, un inyector para introducir la muestra en la fase móvil, una columna cromatográfica,
un detector y un dispositivo de recolección de datos.

ELUCIÓN EN GRADIENTE

Se denomina elución en gradiente o programación del disolvente a la técnica de cambiar continuamente la composición del
disolvente durante la cromatografía. El perfil de elución en gradiente se presenta en la monografía individual como una tabla
de gradientes, que indica el tiempo y la composición proporcional de la fase móvil en el tiempo indicado.

PROCEDIMIENTO

1. Equilibrar la columna y el detector con fase móvil a la velocidad de flujo especificada hasta obtener una señal constante.
2. Inyectar una muestra a través del inyector o usar un muestreador automático.
3. Comenzar el programa de gradientes.
4. Registrar el cromatograma.
5. Analizar según se indica en la monografía.

COLUMNAS CROMATOGRÁFICAS
Una lista completa de rellenos (L), fases (G) y soportes (S) usados en las pruebas y valoraciones de USP-NF se encuentra en la
sección Reactivos, Indicadores y Soluciones-Columnas Cromatográficas de USP-NF y PF. Esta lista pretende ser una referencia útil
para el técnico en cromatografía en la identificación de la columna cromatográfica correspondiente especificada en la mono-
grafía individual.

DEFINICIONES E INTERPRETACIÓN DE CROMATOGRAMAS

Cromatograma: Un cromatograma es una representación gráfica de la respuesta del detector, concentración de analito
en el efluente u otra cantidad usada como una medida de concentración del efluente en función del volumen de efluente o del
tiempo. En la cromatografía planar se puede usar el término, cromatograma para referirse al papel o capa con las zonas separa-
das.
La Figura 1 representa una separación cromatográfica típica de dos sustancias, 1 y 2. tR 1 y tR2 son los tiempos de retención
respectivos; h es la altura, h/ 2 es la mitad de la altura y Wh12 es el ancho a la mitad de la altura, para el pico 1. W 1 y W2 son los
anchos de los picos 1 y 2, respectivamente, en la línea base. Los picos de aire son una característica de los cromatogramas de
gases y corresponden al frente de la fase móvil en la cromatografía de líquidos. El tiempo de retención de estos picos de aire o
componentes no retenidos se denomina tM.

o::
Pico del disolvente
~
ü
w
f-
w
o
....J
w Cola del disolvente
o
¡:;
(/)
w
::J
o..
(/)
w
o::
TIEMPO - - - - -

Figura 1 . Separación cromatográfica de las dos sustancias.

552 (621) Cromatografía/ Pruebas Físicas USP 40

Volumen de Residencia (D): El volumen de residencia (también conocido como volumen de demora en elución a gra-
diente) es el volumen entre el punto en el que se encuentran los eluyentes y la entrada de la columna.
Tiempo Muerto (tM): El tiempo muerto es el tiempo requerido para la elución de un componente no retenido (ver la
Figura 7, mostrado como un pico de aire o de componente no retenido, con la escala de la línea base en minutos).
Volumen Muerto (VM): El volumen muerto es el volumen de fase móvil requerido para eluir un componente no retenido.
Se puede calcular a partir del tiempo muerto y la velocidad de flujo F, en mL/min:

VM = tM X F
En la cromatografía de exclusión por tamaño, se usa el símbolo V0 •
Número de Platos Teóricos (N) 1 : N es una medida de eficiencia de la columna. Para los picos gaussianos, se calcula por
la ecuación:

en donde tR es el tiempo de retención de la sustancia y W es el ancho del pico en su base, que se obtiene extrapolando los
lados relativamente rectos del pico hasta la línea base. El valor de N depende de la sustancia cromatografiada así como de las
condiciones operativas, tales como la velocidad de flujo y la temperatura de la fase móvil o gas transportador, la calidad del
relleno, la uniformidad del relleno dentro de la columna, y, para columnas capilares, el espesor de la película de fase estaciona-
ria, el diámetro interno y la longitud de la columna.
Cuando se usan integradores electrónicos, puede ser conveniente determinar el número de platos teóricos por la ecuación:

N= 5,54[ ~R h12
]
2

donde Wh 12 es el ancho del pico a la mitad de la altura. Sin embargo, en caso de discrepancias, sólo se deben usar las ecuacio-
nes basadas en el ancho del pico en la línea base.
Pico: El pico es la porción del cromatograma que registra la respuesta del detector cuando un componente individual elu-
ye de la columna. Si la separación es incompleta, se puede registrar la elución de dos o más componentes como un pico no
resuelto.
Relación Pico/Valle (p/v): La p/v se pueden emplear como un criterio de aptitud del sistema en una prueba de sustancias
relacionadas cuando no se logra la separación entre dos picos en la línea base. La Figura 2 representa una separación incomple-
ta de dos sustancias, donde HP es la altura del pico menor por encima de la línea base extrapolada y Hv es la altura en el punto
más bajo de la curva que separa los picos menor y mayor por encima de la línea base extrapolada:

Figura 2. Determinación de la relación pico/valle.

1 Los parámetros k, N, r y re se desarrollaron para separaciones por GC isotérmicas y separaciones por HPLC isocráticas. Debido a que estos términos son
parámetros termodinámicos, son válidos únicamente para separaciones realizadas a temperatura, composición de la fase móvil y velocidad de flujo constantes. No
obstante, para separaciones realizadas con un programa de temperatura o gradiente de disolventes, estos parámetros se pueden usar simplemente como medio de
comparación para asegurar que existen las condiciones cromatográficas adecuadas para llevar a cabo los métodos según se indican en las monografías.
USP 40 Pruebas Físicas/ (621) Cromatografía 553

Retardo Relativo (R,.1): El retardo relativo es el cociente entre la distancia recorrida por el analito y la distancia recorrida
simultáneamente por un compuesto de referencia (ver la Figura 3) y se usa en una cromatografía planar.

Rret = b/c

Frente de Fase Móvil

•
-
_.
Muestra

.....
~
Referencia
a
b
e
Punto de Inicio (linea)
• •
Figura 3. Cromatografía planar típica.

Retención Relativa (r) 1 : Es el cociente entre el tiempo de retención ajustado de un componente y el de otro usado como
referencia obtenido en condiciones idénticas:

( = tR2 - tM/tRI - tM

donde tR2 es el tiempo de retención medido desde el punto de inyección del compuesto de interés; tR 1 es el tiempo de reten-
ción medido a partir del punto de inyección del compuesto usado como referencia; y tM es el tiempo de retención de un mar-
cador no retenido definido en el procedimiento, todos determinados en condiciones experimentales idénticas en la misma co-
lumna.
Tiempo de Retención Relativo (RR1): También conocido como tiempo relativo no ajustado. Las comparaciones en la
USP normalmente se realizan en términos de retención relativa no ajustada, a menos que se indique de otro modo.

RRT = tR2/tR1
El símbolo re también se usa para designar los valores de retención relativa no ajustados.
Desviación Estándar Relativa Porcentual

%RSD
1
= ~O ~;~1-
X
lf( X¡-x)211/
N-1
2

Factor de Retardo (RF): El factor de retardo es el cociente entre la distancia recorrida por el centro de la mancha y la
distancia recorrida simultáneamente por la fase móvil y se usa en cromatografía planar. Usando los símbolos de la Figura 3:

RF= b/a

Factor de Retención (k) 1 : El factor de retención también se conoce como el factor de capacidad (k'). Se define como:

k cantidad de sustancia en la fase estacionaria

cantidad de sustancia en la fase móvil

o
k= tiempo de la sustancia en la fase estacionaria
tiempo de la sustancia en la fase móvil

El factor de retención de un componente se puede determinar a partir del cromatograma:

k = (tR - tM)jtM
Tiempo de Retención (tR): En cromatografía líquida y cromatografía de gases, el tiempo de retención, tR, se define como
el tiempo transcurrido entre la inyección de la muestra y la aparición de la respuesta máxima. Se puede usar tR como un pará-
metro para identificación. Los tiempos de retención cromatográficos son característicos de los compuestos que representan,
pero no son únicos. La coincidencia de los tiempos de retención de una muestra y de una sustancia de referencia puede usarse
554 (621) Cromatografía / Pruebas Físicas USP 40

como un criterio parcial en la construcción de un perfil de identidad, pero es insuficiente por sí misma para establecer la identi-
dad. Los tiempos de retención absolutos de un compuesto dado varían de un cromatograma al siguiente.
Volumen de Retención (VR): El volumen de retención es el volumen de fase móvil requerido para la elución de un com-
ponente. Se puede calcular a partir del tiempo de retención y de la velocidad de flujo en mL/min:
VR = tR X F

Resolución (R5}: La resolución es la separación de dos componentes en una mezcla, calculada por:
R5 = 2 x (tR 2 - tR 1)/(W1 + W2)

donde tR2 y tR 1 son los tiempos de retención de los dos componentes; y W2 y W 1 son los anchos correspondientes en las bases
de los picos obtenidos extrapolando los lados relativamente rectos de los picos hasta la línea base.
Cuando se usan integradores electrónicos, puede ser conveniente determinar la resolución, mediante la ecuación:
Rs = 1, 18 X (tR2 - tR1)l(W1,h/2 + w2,h/2)
Factor de Separación (a): El factor de separación es la retención relativa calculada para dos picos adyacentes (por con-
vención, el valor del factor de separación siempre es> 1):
a= k2 /k 1

Factor de Simetría (A 5}2: El factor de simetría (también conocido como factor de asimetría) de un pico (ver la Figura 4) se
calcula por:
As= Wo,osl2f
donde W0,05 es el ancho del pico al 5% de la altura y fes la distancia del máximo del pico hasta el borde inicial del pico, mi-
diendo la distancia en un punto ubicado al 5% de la altura desde de la línea base.

Th

0,05h

Figura 4. Pico cromatográfico asimétrico.

Factor de Asimetría (7): Ver Factor de Simetría.

APTITUD DEL SISTEMA

Las pruebas de aptitud del sistema son una parte integral de los métodos de cromatografía de líquidos y de gases. Estas
pruebas se usan para verificar que el sistema cromatográfico sea adecuado para el análisis que se pretende efectuar.
Las pruebas se basan en el concepto de que el equipo, los sistemas electrónicos, las operaciones analíticas y las muestras
analizadas constituyen un sistema integral que se puede evaluar como tal.
Los factores que pueden afectar el comportamiento cromatográfico incluyen lo siguiente:
• Composición, fuerza iónica, temperatura y pH aparente de la fase móvil
•Velocidad de flujo, dimensiones de la columna, temperatura de la columna y presión
• Las características de la fase estacionaria, incluyendo el tipo de soporte cromatográfico (basado en partículas o monolíti-
co), tamaño de partícula, tamaño de poro y área superficial específica
• En fase reversa y otras modificaciones superficiales de las fases estacionarias, el grado de modificación química (según se
expresa mediante recubrimiento exhaustivo (end-capping), carga de carbono, etc.)
La resolución, R5, es una función del número de platos teóricos, N (también referido como eficiencia), el factor de separa-
ción, a, y el factor de capacidad, k. [NOTA-Todos los términos y símbolos se definen en la sección anterior Definiciones e Inter-
pretación de Cromatogramas.] Para una fase móvil y una fase estacionaria determinadas, se puede especificar N para asegurar
que los compuestos que eluyen muy cerca entre sí se resuelvan unos de otros, para establecer el poder de resolución general

2 Una práctica común consiste en medir el Factor de Asimetría como el cociente entre la distancia entre la línea vertical que conecta el ápice del pico con la línea
base interpolada y el frente del pico, y la distancia entre dicha línea y el pico medido a la inversa al 10% de la altura del pico (ver la Figura 4) sería (W0 10 - f0 10)/
f0,10 . No obstante, para los propósitos de la USP, únicamente es válida la fórmula (A 5) según se presenta en este capítulo. ' '
USP 40 Pruebas Físicas/ (621) Cromatografía 555

del sistema y para asegurar que el estándar interno se resuelva del fármaco. Este es un medio menos confiable para asegurar la
resolución que la medición directa de la misma. La eficiencia de la columna es, en parte, un reflejo de la agudeza del pico, que
es también importante para la detección de trazas de componentes.
Las inyecciones repetidas de una preparación estándar u otras soluciones estándar se comparan entre sí para determinar si se
cumplen los requisitos de precisión. A menos que se especifique de otro modo en la monografía individual, se usan los datos
de cinco inyecciones repetidas del analito para calcular la desviación estándar relativa, %RSD, si el requisito es 2,0% o menos;
se usan los datos de seis inyecciones repetidas si el requisito de desviación estándar relativa es más de 2,0%.
Para la Valoración en una monografía de un fármaco, donde el valor es 100% para la sustancia pura, y no se especifica una
desviación estándar relativa máxima, se calcula la %RSD máxima permitida para una serie de inyecciones de la solución de
referencia como:

%RSD = KB-{íilt90 %,n-i

donde K es una constante (0,349), obtenida a partir de la expresión K = (0,6l'Íl.) x (t90% 15 l\[6), en la que 0,61'5. representa la
desviación estándar relativa porcentual requerida después de seis inyecciones para B = 1,0; Bes el límite superior provisto en la
definición de la monografía individual menos 100%; n es el número de inyecciones repetidas de la solución de referencia (3
~n ~ 6); y t90%,n-i es el valor t de Student al 90% del nivel de probabilidad (dos colas) con n - 1 grados de libertad.
A menos que se indique de otro modo, la desviación estándar relativa máxima permitida no excede del valor apropiado pro-
visto en la tabla de requisitos de repetibilidad. Este requisito no se aplica a las pruebas para sustancias relacionadas.
Requisitos para Desviación Estándar Relativa
Número de Inyecciones Individuales
3 4 5 6
B (%) RSD Máxima Permitida
2,0 0,41 0,59 0,73 0,85
2,5 0,52 0,74 0,92 1,06
3,0 0,62 0,89 1,10 1,27

El factor de simetría, A51 una medición de la simetría del pico, la unidad es el valor que adquiere para picos perfectamente
simétricos; y su valor se incrementa conforme la asimetría se vuelve más pronunciada (ver la Figura 4). En algunos casos, pue-
den observarse valores menores a la unidad. A medida que la simetría del pico se aleja de valores de 1, la integración y por lo
tanto la precisión se tornan menos confiables.
La relación señal-ruido (SIN) es un parámetro útil de aptitud del sistema. La SIN se calcula según se indica a continuación:

SIN= 2Hlh
donde Hes la altura del pico medido a partir del ápice del pico hasta la línea base extrapolada sobre una distancia 25 veces el
ancho del pico a su altura media; y h es la diferencia entre el valor de ruido más grande y más pequeño observados sobre una
distancia 25 veces el ancho del pico a su altura media y, si fuera posible, igualmente distribuida a ambos lados del pico de
interés (ver la Figura 5).

Figura 5. Ruido y pico cromatográfico, componentes de la relación SIN.

Estas pruebas de aptitud del sistema se realizan recolectando datos a partir de inyecciones repetidas del estándar u otras
soluciones según se especifica en la monografía individual.
La especificación de parámetros definidos en una monografía no excluye el uso de otras condiciones de operación aptas.
Puede ser necesario realizar ajustes al sistema cromatográfico especificado para cumplir con los requisitos de aptitud del sis-
tema. Los ajustes realizados a los sistemas cromatográficos para cumplir con los requisitos de aptitud del sistema no deben
hacerse para compensar fallas en la columna o malfuncionamiento del sistema. Se permiten ajustes únicamente cuando se en-
cuentran disponibles estándares adecuados (incluyendo Estándares de Referencia) para todos los compuestos usados en la
prueba de aptitud; y los ajustes o el cambio de columna generan un cromatograma que cumple con todos los requisitos de
aptitud del sistema especificados en el procedimiento oficial.
556 (621) Cromatografía/ Pruebas Físicas USP 40

Si es necesario realizar ajustes a las condiciones operativas para cumplir con los requisitos de aptitud del sistema, cada uno
de los parámetros en la lista siguiente es la variación máxima que se puede considerar, a menos que se indique algo distinto en
la monografía; estos cambios pueden requerir datos de verificación adicionales. Para verificar la aptitud del método en estas
nuevas condiciones, evaluar las características de desempeño analítico pertinentes que sean potencialmente afectadas por el
cambio. Múltiples ajustes pueden tener un efecto acumulativo en el desempeño del sistema y deben considerarse cuidadosa-
mente antes de implementarlos. En algunas circunstancias, puede ser deseable usar una columna para HPLC con dimensiones
distintas a las prescritas en el procedimiento oficial (longitud, diámetro interno y/o tamaño de partícula diferentes). En todo
caso, los cambios en las características químicas (designación "L") de la fase estacionaria deberán considerarse como una mo-
dificación del método y requerirán validación completa. No se recomienda realizar ajustes a la composición de la fase móvil en
la elución en gradiente puesto que puede ocasionar cambios en la selectividad. Si se requieren ajustes, se permiten cambios en
el relleno de la columna (manteniendo las mismas propiedades químicas), en la duración del tiempo de espera isocrático inicial
(cuando se indique) y/o ajustes en el volumen de residencia. Las concesiones adicionales para el ajuste de gradientes se tratan
a continuación.
pH de la Fase Móvil (HPLC): El pH de la solución amortiguadora acuosa usada en la preparación de la fase móvil se pue-
de ajustar dentro de ±0,2 unidades del valor o intervalo especificado. Se aplica a las separaciones en gradiente e isocráticas.
Concentración de Sales en la Solución Amortiguadora (HPLC): La concentración de las sales usadas en la preparación
de la solución amortiguadora acuosa empleada en la fase móvil se puede ajustar dentro de ±10% siempre que se cumpla con
la variación del pH permitida (ver arriba). Se aplica a las separaciones en gradiente e isocráticas.
Relación de los Componentes en la Fase Móvil (HPLC): Los siguientes límites de ajuste aplican a componentes minori-
tarios de la fase móvil (especificados a 50% o menos). La cantidad de estos componentes se puede ajustar en un ±30% relati-
vo. Sin embargo, el cambio en cualquier componente no puede exceder de ± 10% absoluto (es decir, en relación a la fase
móvil total). Se puede ajustar un componente minoritario en una mezcla ternaria. A continuación se presentan ejemplos de
ajustes para mezclas binarias y ternarias.
Mezclas Binarias
RELACIÓN ESPECIFICADA DE 50:50: 30% de 50 es 15% absoluto, pero esto excede el cambio máximo permitido de ± 10% ab-
soluto en cada componente. Por lo tanto, sólo se puede ajustar la relación de la fase móvil dentro del intervalo de 40:60-
60:40.
RELACIÓN ESPECIFICADA DE 2:98: 30% de 2 es 0,6% absoluto. Por lo tanto, el ajuste máximo permitido se encuentra dentro
del intervalo de 1,4: 98,6-2,6: 97,4.
Mezclas Ternarias
RELACIÓN ESPECIFICADA DE 60:35:5: Para el segundo componente, 30% de 35 es 10,5% absoluto, que excede el cambio má-
ximo permitido de±10% absoluto en cualquier componente. Por lo tanto, el segundo componente sólo puede ajustarse den-
tro del intervalo de 25%-45% absoluto. Para el tercer componente, 30% de 5 es 1,5% absoluto. En todos los casos, usar una
cantidad suficiente del primer componente para obtener un total de 100%. Como consecuencia, los intervalos de mezclas de
50:45:5-70:25:5 ó 58,5: 35: 6,5-61,5: 35: 3,5 cumplirán con el requisito.
Longitud de Onda del Detector UV-Visible (HPLC): No están permitidas las desviaciones de las longitudes de onda es-
pecificadas en el procedimiento. Se usa el procedimiento especificado por el fabricante del detector, u otro procedimiento vali-
dado, para verificar que el error en la longitud de onda del detector sea, como máximo, ±3 nm.
Fase Estacionaria
LONGITUD DE LA COLUMNA (Ge): Se puede ajustar tanto como ±70%.
LONGITUD DE LA COLUMNA (HPLC): Ver Tamaño de Partícula (HPLC) más adelante.
DIÁMETRO INTERNO DE LA COLUMNA (HPLC): Se puede ajustar siempre que la velocidad lineal se mantenga constante. Ver Velo-
cidad de Flujo (HPLC) más adelante.
DIÁMETRO INTERNO DE LA COLUMNA (GC)-Se puede ajustar tanto como ±50%.
ESPESOR DE LA PELÍCULA (Ge CAPILAR)-Se puede ajustar tanto como -50% a 100%.
Tamaño de Partícula (HPLC): Para separaciones isocráticas, se puede modificar el tamaño de partícula y/o la longitud de
la columna siempre que la relación entre la longitud de la columna (L) y el tamaño de partícula (dp) permanezca constante o
dentro del intervalo entre -25% y +50% de la relación L/dp prescrita. Como alternativa (igual que para la aplicación del ajuste
de tamaño de partícula para partículas con superficies porosas), se pueden usar otras combinaciones de L y dp siempre que el
número de platos teóricos (N) esté dentro del intervalo -25% a +50%, con respecto a la columna prescrita. Se debe tener
cuidado cuando el ajuste resulte en un número mayor de platos teóricos pues esto genera volúmenes de pico menores y pue-
de requerir ajustes para minimizar el ensanchamiento de la banda extra columna originado por factores tales como la tubula-
dura del instrumento, el volumen de celda del detector y la velocidad de muestreo, y el volumen de inyección. Cuando no se
mencione el tamaño de partícula en la monografía, la relación se debe calcular usando el tamaño de partícula más grande
designado en la definición USP de la columna. Para separaciones en gradiente, no se permiten cambios en la longitud de la
columna, en el diámetro interno de la columna ni en el tamaño de partícula.
Tamaño de la Partícula (GC): Es aceptable cambiar la malla de un soporte para GC de un tamaño de partícula mayor a
uno menor o de uno menor a uno mayor siempre que la cromatografía cumpla con los requisitos de aptitud del sistema y se
mantenga la misma relación del intervalo de tamaño de partícula. La relación del intervalo del tamaño de partícula se define
como el diámetro de la partícula más grande dividida por el diámetro de la partícula más pequeña.
Velocidad de Flujo (GC): La velocidad de flujo se puede ajustar tanto como ±50%.
USP 40 Pruebas Físicas/ (621) Cromatografía 557

Velocidad de Flujo (HPLC): Cuando se modifica el tamaño de partícula, puede ser necesario ajustar la velocidad de flujo
debido a que las columnas con un tamaño de partícula menor requerirán de velocidades lineales más altas para el mismo de-
sempeño (medido por una reducción de la altura del plato). Los cambios en la velocidad de flujo para un cambio en el diáme-
tro de la columna y en el tamaño de partícula se pueden realizar mediante:

F2 = F1 x [(de} x dp 1)/(de12 x dp2 )]

donde F1 y F2 son las velocidades de flujo para las condiciones originales y modificadas, respectivamente; de 1 y de2 son los diá-
metros de columna respectivos; y dp 1 y dp2 son los tamaños de partícula.
Cuando se realiza un cambio de partículas de 2:3 µm a <3 µm en separaciones isocráticas, se puede justificar un aumento
adicional en la velocidad lineal (ajustando la velocidad de flujo), siempre que la eficiencia de la columna no caiga en más del
20%. De manera similar, un cambio de partículas de <3 µm a 2:3 µm puede requerir la reducción adicional de la velocidad
lineal (velocidad de flujo) para evitar una reducción en la eficiencia de la columna de más del 20%. No se permiten cambios
en F, de y dp para separaciones en gradiente.
Además, la velocidad de flujo se puede ajustar en ±50% (sólo en separación isocrática).
EJEMPLOS: Los ajustes en la longitud de la columna, el diámetro interno, el tamaño de partícula y la velocidad de flujo se
pueden usar de manera combinada para proveer condiciones equivalentes (mismo N), pero con diferencias en la presión y el
tiempo de corrida. La tabla siguiente lista algunas de las configuraciones de columna más populares para proveer una eficien-
cia equivalente (N) mediante el ajuste de estas variables.

Tamaño de Valores Relativos

Longitud Diámetro de la Partícula Tiempo de
(L, mm) Columna (de, mm) (dp, µm) L/dp F N Presión Corrida
250 4,6 10 25000 0,5 0,8 0,2 3,3
150 4,6 5 30000 1,0 1,0 1,0 1,0
150 2,1 5 30000 0,2 1,0 1,0 1,0
100 4,6 3,5 28600 1,4 1,0 1,9 0,5
100 2,1 3,5 28600 0,3 1,0 1,9 0,5
75 4,6 2,5 30000 2,0 1,0 4,0 0,3
75 2,1 2,5 30000 0,4 1,0 4,0 0,3
50 4,6 1,7 29400 2,9 1,0 8,5 0,1
50 2,1 1,7 29400 0,6 1,0 8,5 0,1

Por ejemplo, si una monografía especifica una columna de 150 mm x 4,6 mm, de 5 µm, operada a 1,5 mL/minuto, se pue-
de esperar la misma separación con una columna de 75 mm x 2, 1 mm, de 2,5 µm operada a 1,5 mL/minuto x 0,4 = 0,6 mL/
minuto, junto con un aumento en la presión de aproximadamente cuatro veces y una reducción en el tiempo de corrida hasta
aproximadamente 30% del original.
Volumen de Inyección (HPLC): El volumen de inyección se puede ajustar siempre que sea congruente con la precisión, la
linealidad y los límites de detección aceptados. Se debe tomar en cuenta que un volumen excesivo de inyección puede llevar a
un ensanchamiento inaceptable de la banda, ocasionando una reducción en N y en la resolución. Aplica a las separaciones en
gradiente e isocráticas.
Volumen de Inyección y Volumen de División (Split Volume) (GC): El volumen de inyección y el volumen de división
se pueden ajustar si la detección y la repetibilidad son satisfactorias.
Temperatura de la Columna (HPLC): La temperatura de la columna se puede ajustar tanto como ±1 Oº. Se recomienda la
termostatización de la columna para mejorar el control y la reproducibilidad del tiempo de retención. Se aplica a las separacio-
nes en gradiente e isocráticas.
Temperatura del Horno (GC): La temperatura del horno se puede ajustar tanto como± 10%.
Programa de Temperatura del Horno (GC): Se permiten ajustes de la temperatura según se especificó anteriormente.
Cuando la temperatura especificada se debe mantener o cuando la temperatura debe cambiarse de un valor a otro, se permite
un ajuste de hasta ±20%.
A menos de se indique algo distinto en la monografía, los parámetros de aptitud del sistema se determinan a partir del pico
del analito.
Los valores medidos de R, o RF o tR para la muestra no se desvían de los valores obtenidos para el compuesto o la mezcla de
referencia en más que los estimados de confiabilidad estadísticamente determinados en valoraciones repetidas del compuesto
de referencia. Los tiempos de retención relativos, si se proporcionan en las monografías, son con fines informativos únicamente
para facilitar la identificación de los picos. No existen criterios de aceptación pertinentes a los tiempos de retención relativos.
El sistema operativo final debe someterse a una prueba de aptitud para determinar su eficiencia. Realizar inyecciones de las
preparaciones apropiadas según se requiera para demostrar una adecuada Aptitud del sistema en toda la corrida (según se des-
cribe en la sección Sistema eromatográfico del procedimiento en una monografía).
La preparación puede ser una preparación estándar o una solución que contenga una cantidad conocida de analito y cual-
quier material adicional (por ejemplo, excipientes o impurezas) útiles para el control del sistema analítico. Siempre que haya
558 (621) Cromatografía/ Pruebas Físicas USP 40

un cambio significativo en el sistema cromatográfico (equipo, componentes de la fase móvil, u otros componentes) o en un
reactivo crítico, debería restablecerse la Aptitud del sistema. Ningún análisis de muestras es aceptable a menos que se haya de-
mostrado la aptitud del sistema.

CUANTIFICACIÓN
Durante la cuantificación, no tomar en cuenta los picos producidos por disolventes y reactivos o generados por la fase móvil
o la matriz de la muestra.
En el intervalo lineal, el área del pico y la altura del pico son generalmente proporcionales a la cantidad de compuesto elui-
do. Las áreas y las alturas de los picos se miden comúnmente mediante integradores electrónicos, pero se pueden determinar
de modos más clásicos. En general, se emplean las áreas de los picos pero pueden ser menos exactas si se producen interferen-
cias. Los componentes medidos se separan de cualquier componente interferente. Se deben minimizar las asimetrías tanto en
la parte anterior como en la posterior del pico y se debe evitar la medición de picos dentro de las colas de otros picos.
Aunque se prefiere la comparación de los picos de impurezas con los del cromatograma de un estándar de la impureza a
una concentración similar, las pruebas de impurezas pueden basarse en la medición de las respuestas de los pico debidos a
impurezas y expresarse como un porcentaje del área del pico del fármaco. El estándar puede ser el mismo fármaco a un nivel
correspondiente de impurezas, por ejemplo, a 0,5%, asumiendo respuestas idénticas de los picos. Cuando las impurezas de-
ben determinarse con una mayor certeza, usar un estándar de la misma impureza o aplicar un factor de corrección basado en
la respuesta de la impureza relativa a la del componente principal.

MÉTODO DE ESTÁNDAR EXTERNO

La concentración del componente cuantificado se determina comparando las respuestas obtenidas a partir de la solución
muestra con las respuestas obtenidas a partir de una solución estándar.

MÉTODO DEL ESTÁNDAR INTERNO

Se introducen cantidades iguales del estándar interno en la solución muestra y en una solución estándar. El estándar interno
se selecciona de modo que no reaccione con el material de prueba, se resuelva de los componentes cuantificados (analitos), y
no contenga impurezas con el mismo tiempo de retención que los analitos. Las concentraciones de los analitos se determinan
comparando los cocientes entre las áreas de sus picos o las alturas de sus picos y el estándar interno en la solución muestra,
con los cocientes entre las áreas o alturas de sus picos y el estándar interno en la solución estándar.

PROCEDIMIENTO DE NORMALIZACIÓN

El contenido porcentual de un componente del material de prueba se calcula determinando el área del pico correspondiente
como un porcentaje del área total de todos los picos, excluyendo aquellos debidos a disolventes o reactivos o que surgen de la
fase móvil o de la matriz de la muestra y aquellos por debajo del límite en el que pueden descartarse.

PROCEDIMIENTO DE CALIBRACIÓN

Se determina la relación entre la señal medida o evaluada y y la cantidad de la sustancia x (por ejemplo, concentración, ma-
sa) y se calcula la función de calibración. Los resultados analíticos se calculan a partir de la señal del analito medida o evaluada
y su posición en la curva de calibración.
En las pruebas para impurezas tanto para el Método del Estándar Externo, cuando se usa una dilución de la solución muestra
para comparación, como para el Procedimiento de Normalización, se aplica cualquier factor de corrección indicado en la mono-
grafía (por ejemplo, cuando el factor de respuesta relativa está fuera del intervalo de 0,8-1,2).
Cuando la prueba de impurezas indica el total de impurezas o cuando existe una determinación cuantitativa de una impure-
za, es importante seleccionar un ajuste de umbral apropiado y condiciones apropiadas para la integración de las áreas de los
picos. En tales pruebas, el límite en el cual, o por debajo del cual se descarta un pico, es generalmente 0,05%. De esta forma,
el ajuste de umbral del sistema de recolección de datos corresponde al menos a la mitad de este límite. Integrar el área del
pico de cualquier impureza que no se separe por completo del pico principal, preferiblemente mediante extrapolación valle a
valle de la línea base (extrapolación tangencial).
USP 40 Pruebas Físicas/ (631) Color y Acromatismo 559

(631) COLOR Y ACROMATISMO

DEFINICIÓN
A los efectos de este capítulo, el color se puede definir como la percepción o la respuesta subjetiva de un observador al estí-
mulo objetivo de energía radiante en el espectro visible que se extiende en el intervalo de longitudes de onda de 400 nm a
700 nm. El color percibido es una función de tres variables: las propiedades espectrales del objeto, tanto absorbentes como
reflectantes; las propiedades espectrales de la fuente de iluminación; y las características visuales del observador.
Se dice que dos objetos poseen colores iguales para una fuente específica de iluminación cuando un observador no puede
detectar una diferencia de color. Cuando un par de objetos presenta colores iguales, con una fuente de iluminación y no con
otra, constituyen un par metamérico. El color de dos objetos es igual para todas las fuentes de iluminación si los espectros de
absorción y de reflectancia de los dos objetos son idénticos.
El acromatismo o falta de color es un extremo de cualquier escala de color para la transmisión de luz. Esto implica la ausen-
cia completa de color y, en consecuencia, el espectro visible del objeto carece de absorbancias. A efectos prácticos, el observa-
dor en este caso percibe poca o ninguna absorción en el espectro visible.

ATRIBUTOS DEL COLOR

Como la sensación de color tiene un componente subjetivo y otro objetivo, el color no puede describirse exclusivamente en
términos espectrofotométricos. Por lo tanto, los atributos comunes del color no pueden corresponder uno a uno con la termi-
nología espectral.
Por lo general se utilizan tres atributos para identificar un color. (1) el matiz, o la cualidad según la cual una familia de colo-
res se distingue de otra, como por ejemplo rojo, amarillo, azul, verde y términos intermedios; (2) el valor, o la cualidad que
distingue un color claro de uno oscuro; y (3) la cromaticidad, o la cualidad que distingue un color fuerte de uno débil, o el
grado en el cual un color difiere de un gris del mismo valor.
Los tres atributos del color se pueden utilizar para definir un espacio de color tridimensional, en el cual se ubica cualquier
color por sus coordenadas. El espacio de color elegido es visualmente uniforme si la distancia geométrica entre dos colores en
el espacio de color es directamente una medida de la distancia del color entre ellos. A menudo se eligen coordenadas cilíndri-
cas por conveniencia. Los puntos a lo largo del eje longitudinal representan valores del oscuro al claro o del negro al blanco y
poseen un matiz indeterminado y ninguna cromaticidad. Centrándose en una sección transversal perpendicular al eje del va-
lor, el matiz se determina por el ángulo con respecto al eje longitudinal y la cromaticidad se determina por la distancia desde
el eje longitudinal. Los matices rojos, amarillos, verdes, azules, morados e intermedios están dados por diferentes ángulos. Los
colores a lo largo de un radio de una sección transversal tienen el mismo matiz, que se convierte en un matiz más intenso a
medida que se aleja. Por ejemplo, el agua incolora o acromática tiene un matiz intermedio, valor alto y ninguna cromaticidad.
Si se agrega un soluto de color, el agua adopta un matiz específico. A medida que se agrega más soluto, el color se torna más
oscuro, más intenso, o más profundo; es decir, generalmente la cromaticidad aumenta y el valor disminuye. Sin embargo si el
soluto es de color neutro, es decir, gris, el valor disminuye, no se observa un aumento en la cromaticidad y el matiz permanece
indeterminado.
Las mediciones espectroscópicas de laboratorio pueden convertirse en mediciones de los tres atributos de color. Los resulta-
dos espectroscópicos para tres luces o estímulos elegidos se ponderan mediante tres funciones de distribución para producir
los valores tricromáticos, X, Y, Z (ver Color-Medición Instrumental (1061 )). Las funciones de distribución se determinaron en
experimentos de comparación de color con sujetos humanos.
Los valores tricromáticos no son coordenadas en un espacio de color visualmente uniforme; sin embargo, se han propuesto
varias transformaciones que son cercanas a la uniformidad, una de las cuales se describe en el capítulo citado (1061) Color-
Medición Instrumental. El valor es a menudo una función solamente del valor de Y. La obtención de uniformidad en el subespa-
cio de matiz y cromatismo ha sido menos satisfactoria. En un sentido práctico, esto significa que en una comparación visual de
colores, cuando dos objetos difieren significativamente en matiz, resulta difícil decidir cuál tiene mayor cromaticidad. Esto se-
ñala la importancia de elegir un estándar de comparación lo más parecido posible al color de la muestra, especialmente para
los atributos de matiz y cromaticidad.

DETERMINACIÓN DE COLOR Y ESTÁNDARES

La percepción del color y de la igualdad de colores depende de las condiciones de observación e iluminación. Las determi-
naciones deben hacerse usando iluminación difusa y uniforme bajo condiciones que reduzcan al mínimo las sombras y la re-
flectancia no espectral. La superficie de los polvos debe alisarse con presión suave para que puedan presentar una superficie
plana sin irregularidades. Los líquidos deben compararse en tubos para comparación de color iguales, contra un fondo blanco.
Si se descubre que los resultados varían con la iluminación, se considerarán correctos los valores obtenidos con luz de día natu-
ral o artificial. En lugar de la determinación visual debe emplearse un método instrumental apropiado.
560 (631) Color y Acromatismo/ Pruebas Físicas USP 40

Los colores de los estándares deben ser lo más parecidos posibles a los de las muestras de prueba para cuantificar las diferen-
cias de color. Los estándares para materiales opacos están disponibles como conjuntos de muestras indicadoras de color que se
disponen en un espacio visualmente uniforme.* Estándares para comparaciones de color de líquidos, identificados mediante
una letra, se pueden preparar según la tabla adjunta. Para preparar el líquido de comparación requerido, pipetear y transferir
los volúmenes prescritos de las soluciones de prueba calorimétricas [ver en Soluciones Calorimétricas (SC) en la sección Reacti-
vos, Indicadores, y Soluciones] y agua en uno de los recipientes para comparación y mezclar la solución en el recipiente. Hacer
la comparación según se indica en la monografía individual, bajo las condiciones de observación previamente descritas. Los
líquidos de comparación u otras combinaciones de las soluciones calorimétricas pueden emplearse en concentraciones muy
bajas para medir desviaciones del acromatismo.
Líquidos de Comparación
Partes de Partes de
Líquido de Compara- Partes de Cloruro Sulfato
clón Cloruro Cobaltoso SC Férrico SC Cúprico SC Partes de Agua
A o, 1 0,4 0,1 4,4
B 0,3 0,9 0,3 3,5
e o, 1 0,6 0,1 4,2
D 0,3 0,6 0,4 3,7
E 0,4 1,2 0,3 3, 1
F 0,3 1,2 0,0 3,5
G 0,5 1,2 0,2 3, 1
H 0,2 1,5 0,0 3,3
1 0,4 2,2 0,1 2,3
J 0,4 3,5 o, 1 1,0
K 0,5 4,5 0,0 0,0
L 0,8 3,8 0,1 0,3
M o, 1 2,0 o, 1 2,8
N 0,0 4,9 o, 1 0,0
o o, 1 4,8 o, 1 0,0
p 0,2 0,4 0,1 4,3
Q 0,2 0,3 0,1 4,4
R 0,3 0,4 0,2 4, 1
s 0,2 0,1 0,0 4,7
T 0,5 0,5 0,4 3,6

(641) TOTALIDAD DE LA DISOLUCIÓN

Colocar la cantidad de la sustancia especificada en la monografía individual en una probeta de vidrio de 1O mL, de aproxi-
madamente 1 3 mm x 125 mm de tamaño, con tapón de vidrio, meticulosamente limpia. Utilizando el disolvente especificado
en la monografía o en la etiqueta del producto, llenar la probeta casi hasta el estrechamiento del cuello. Agitar suavemente
para disolver: La solución no es menos transparente que un volumen igual del mismo disolvente contenido en un recipiente
similar y examinado de modo similar.

(643) CARBONO ORGÁNICO TOTAL

El carbono orgánico total (COT) es una medida indirecta de las moléculas orgánicas presentes en las aguas para uso farmacéu-
tico, determinadas como carbono. Las moléculas orgánicas se introducen en el agua junto con el agua original, desde los
materiales del sistema de purificación y distribución, desde biopelículas que se desarrollan en el sistema y desde los envases
de agua estéril y de agua no estéril. El COT también puede emplearse como un atributo de control del proceso, para moni-
torear el funcionamiento de las operaciones unitarias que conforman el sistema de purificación y distribución. Una medición

* Las colecciones de muestras de color, ordenadas según matiz, valor y cromatismo en un espacio visualmente uniforme y apropiado para su uso en la designación
de colores de muestras por comparación visual están disponibles en GretagMacbeth LLC, 61 7 Little Britain Road, New Windsor, NY 12553-6148.
USP 40 Pruebas Físicas/ (643) Carbono Orgánico Total 561

de COT no es un reemplazo de la prueba de control microbiológico o de endotoxinas. Aunque puede haber una relación
cualitativa entre el COT y la actividad microbiológica, no existe una correlación numérica directa.
Existen varios métodos aceptables para analizar el COT. Este capítulo no respalda, limita ni impide el empleo de tecnologías
alternativas, sino que ofrece una orientación para calificar estas tecnologías analíticas para su uso, así como también una
guía para interpretar los resultados de los instrumentos para emplearlos como una prueba de límite.
Los aparatos que se usan comúnmente para determinar el COT en aguas para uso farmacéutico comparten el objetivo de oxi-
dar las moléculas orgánicas del agua para producir dióxido de carbono, seguido de la medición de la cantidad de dióxido de
carbono producido. Posteriormente, la cantidad determinada de C0 2 producido se usa para calcular la concentración de
carbono orgánico en el agua.
Todas las tecnologías deben distinguir entre el carbono inorgánico, que puede estar presente en el agua proveniente de fuen-
tes como C0 2 y bicarbonato disueltos, y el C0 2 generado por la oxidación de moléculas orgánicas en la muestra. La distin-
ción se puede lograr determinando el carbono inorgánico y restándolo del carbono total (que es la suma de carbono orgáni-
co y carbono inorgánico), o eliminando el carbono inorgánico de la muestra antes de oxidarla. Aunque el paso de elimina-
ción también puede eliminar moléculas orgánicas, este carbono orgánico eliminable se encuentra presente en cantidades
inapreciables en las aguas para uso farmacéutico.

PROCEDIMIENTOS
• AGUA A GRANEL
Las siguientes secciones se aplican a las pruebas para Agua Purificada, Agua para Inyección, Agua para Hemodiálisis y el con-
densado de Vapor Puro a granel.
Requisitos del Aparato: Este método de prueba se lleva a cabo como una prueba en línea (on-line test) o como una prue-
ba de laboratorio fuera de la línea de producción (off-line test), empleando un instrumento calibrado. La aptitud del apara-
to debe demostrarse periódicamente, según se describe a continuación. Además, debe tener especificado un límite de de-
tección, establecido por el fabricante, de 0,05 mg/L (0,05 ppm) de carbono o menor.
Cuando se analiza agua para propósitos de control de calidad, se debe asegurar que el instrumento y sus datos estén bajo
un control apropiado y que los métodos y lugares de muestreo tanto de las mediciones en línea como de las mediciones
fuera de línea sean representativos de la calidad del agua usada. Se debe tomar en cuenta el carácter de la producción,
distribución y uso del agua al momento de seleccionar una medición en línea o fuera de línea.
Agua Reactivo: Emplear agua con un nivel de COT de no más de O, 1 O mg/L. [NOTA-Puede ser necesa~io establecer un
requisito de conductividad para asegurar la confiabilidad del método.]
Preparación de Envases: La contaminación orgánica de los envases da lugar a valores de COT más altos. Por lo tanto, se
deben usar materiales de laboratorio y envases que hayan sido meticulosamente limpiados para eliminar los residuos orgá-
nicos. Se puede emplear cualquier método eficaz para eliminar la materia orgánica (ver Limpieza de Material de Vidrio
(1051) ). Utilizar Agua Reactivo para el enjuague final.
Solución Estándar: A menos que se indique algo diferente en la monografía individual, disolver en el Agua Reactivo una
cantidad, pesada con exactitud, de ER Sacarosa USP, para obtener una solución con una concentración de 1, 19 mg/L de
sacarosa (0,50 mg/L de carbono).
Solución de Aptitud del Sistema: Disolver en Agua Reactivo una cantidad pesada con exactitud de ER 1,4-Benzoquinona
USP para obtener una solución con una concentración de 0,75 mg/L (0,50 mg/L de carbono).
Control de Agua Reactivo: Usar una cantidad adecuada de Agua Reactivo obtenida al mismo tiempo que la utilizada en la
preparación de la Solución Estándar y de la Solución de Aptitud del Sistema.
Muestra de Agua: Obtener una muestra en línea o fuera de línea que refleje de manera apta la calidad del agua usada.
Otras Soluciones de Control: Preparar soluciones apropiadas de blanco de reactivos u otras soluciones especificadas nece-
sarias para establecer la línea de base del aparato o para realizar ajustes en la calibración siguiendo las instrucciones del
fabricante, y correr los blancos apropiados para ajustar a cero el instrumento, si fuera necesario.
Aptitud del Sistema: Analizar el Control de Agua Reactivo en el aparato y registrar la respuesta, rw. Repetir la prueba utili-
zando la Solución Estándar y registrar la respuesta, r5• Calcular la respuesta corregida de la Solución Estándar, que es también
la respuesta límite, restando la respuesta del Control de Agua Reactivo de la respuesta de la Solución Estándar. El límite teóri-
co de 0,50 mg/L de carbono es igual a la respuesta corregida de la Solución Estándar, r 5 - rw. Analizar la Solución de Aptitud
del Sistema en el aparato y registrar la respuesta, r 55 • Calcular la respuesta corregida de la Solución de Aptitud del Sistema,
restando la respuesta del Control de Agua Reactivo de la respuesta de la Solución de Aptitud del Sistema, r 55 - rw. Calcular la
eficiencia de la respuesta porcentual de la Solución de Aptitud del Sistema:
eficiencia de la respuesta%= 1OO[(r55 - rw)l(r5 - rw)]

r 55 = es la respuesta del instrumento para la Solución de Aptitud del Sistema

rw =es la respuesta del instrumento para el Control de Agua Reactivo
r5 = es la respuesta del instrumento para la Solución Estándar
El sistema es apto si la eficiencia de la respuesta porcentual no es menos de 85% ni más de 115%.
Procedimiento: Realizar la prueba usando la Muestra de Agua y registrar la respuesta, ru. La Muestra de Agua cumple con
los requisitos si runo es mayor que la respuesta límite, r 5 - rw. Este método se puede realizar usando instrumental en línea o
fuera de línea que cumpla con los Requisitos del Aparato.
562 (643) Carbono Orgánico Total / Pruebas Físicas USP 40

• AGUA ESTÉRIL
Las siguientes secciones se aplican a las pruebas para Agua Estéril para Inyección, Agua Estéril Purificada, Agua Estéril para Irri-
gación y Agua Estéril para Inhalación.
Seguir los requisitos en Agua a Granel, con las siguientes excepciones.
Requisitos del Aparato: Además de cumplir con los Requisitos del Aparato en Agua a Granel, el aparato debe tener un lími-
te de detección especificado por el fabricante de O, 1O mg/L (O, 1O ppm) de carbono o menor.
Control de Agua Reactivo: Emplear agua con un nivel de COT de no más de 0,50 mg/L. [NOTA-Puede ser necesario es-
tablecer un requisito de conductividad para asegurar la confiabilidad del método.]
Solución Estándar: A menos que se indique algo diferente en la monografía individual, disolver en el Agua Reactivo una
cantidad, pesada con exactitud, de ER Sacarosa USP, para obtener una solución con una concentración de 19,0 mg/L de
sacarosa (8,0 mg/L de carbono).
Solución de Aptitud del Sistema: Disolver en Agua Reactivo una cantidad, pesada con exactitud, de ER 1,4-Benzoquinona
USP para obtener una solución con una concentración de 12,0 mg/L (8,0 mg/L de carbono).
Muestra de Agua: Obtener una muestra que refleje de manera apta la calidad del agua usada. Antes de abrir, agitar vigo-
rosamente el envase para homogeneizar la muestra de agua. Puede que se requieran varios envases para contar con sufi-
ciente agua para analizar.
Aptitud del Sistema: Analizar el Control de Agua Reactivo en el aparato y registrar la respuesta, rw. Repetir la prueba utili-
zando la Solución Estándar y registrar la respuesta, r5 • Calcular la respuesta corregida de la Solución Estándar, que es también
la respuesta límite, restando la respuesta del Control de Agua Reactivo de la respuesta de la Solución Estándar. El límite teóri-
co de 8,0 mg/L de carbono es igual a la respuesta corregida de la Solución Estándar, r5 - rw. Analizar la Solución de Aptitud
del Sistema en el aparato y registrar la respuesta, r55 • Calcular la respuesta corregida de la Solución de Aptitud del Sistema,
restando la respuesta del Control de Agua Reactivo de la respuesta de la Solución de Aptitud del Sistema, r55 - rw. Calcular la
eficiencia de la respuesta porcentual de la Solución de Aptitud del Sistema:

eficiencia de la respuesta%= 1OO[(r55 - rw)l(r5 - rw)]

r55 = es la respuesta del instrumento para la Solución de Aptitud del Sistema

rw =es la respuesta del instrumento para el Control de Agua Reactivo
r5 = es la respuesta del instrumento para la Solución Estándar
El sistema es apto si la eficiencia de la respuesta porcentual es no menos de 85% ni más de 115%.
Procedimiento: Realizar la prueba usando la Muestra de Agua y registrar la respuesta, ru. La Muestra de Agua cumple con
los requisitos si runo es mayor que la respuesta límite, r5 - rw, determinada en los requisitos de Aptitud del Sistema, en Agua
Estéril

REQUISITOS ADICIONALES
• ESTÁNDARES DE REFERENCIA USP (11)
ER 1,4-Benzoquinona USP
ER Sacarosa USP

(645) CONDUCTIVIDAD DEL AGUA

INTRODUCCIÓN
La conductividad eléctrica del agua es una medida del flujo de electrones facilitado con iones. Las moléculas de agua se diso-
cian en iones en función del pH y la temperatura, produciéndose una conductividad fácil de predecir. Algunos gases, especial-
mente el dióxido de carbono, se disuelven fácilmente en el agua e interactúan para formar iones, lo que también afecta la
conductividad en forma predecible. Para los fines de este capítulo, estos iones y la conductividad resultante se pueden conside-
rar como intrínsecos al agua.
La presencia de iones extraños también afecta la conductividad del agua. Los iones extraños usados para determinar las es-
pecificaciones de conductividad que se describen a continuación son los iones cloruro y amonio. En cuanto al nivel de impure-
zas iónicas permitidas en el agua, la mayor proporción corresponde a la conductividad del ión cloruro ubicuo (en una concen-
tración teórica final de 0,47 ppm cuando el cloruro constituía una prueba de calidad requerida en la USP 22 y en versiones
anteriores) y al ión amonio (con un límite de 0,3 ppm). Para mantener la electroneutralidad el nivel de impurezas permitido
incluye una cantidad balanceada de aniones (tales como cloruro, para contrarrestar el ión amonio) y cationes (tales como so-
dio, para contrarrestar el ión cloruro). Los iones extraños como los mencionados, pueden tener un efecto significativo en la
pureza química del agua y en la aptitud para su uso en aplicaciones farmacéuticas.
El procedimiento en la sección Agua a Granel está especificado para medir la conductividad de aguas como el Agua Purifica-
da, el Agua para Inyección, el Agua para Hemodiálisis y el condensado de Vapor Puro. El procedimiento en la sección Agua Estéril
USP 40 Pruebas Físicas/ (645) Conductividad del Agua 563

está especificado para medir la conductividad de aguas como el Agua Purificada Estéril, Agua Estéril para Inyección, Agua Estéril
para Inhalación y Agua Estéril para Irrigación.
Los procedimientos siguientes se deben realizar usando instrumental que haya sido calibrado, cuyas constantes de celda del
sensor de conductividad hayan sido determinadas con exactitud y cuya función de compensación de temperatura haya sido
desactivada para la Etapa 1 del análisis de Agua a Granel. Para las mediciones en línea y fuera de línea, la aptitud del instrumen-
to para las pruebas de control de calidad depende también de los sitios de muestreo en el sistema del agua. Los sitios seleccio-
nados para el instrumento de muestreo deben reflejar la calidad del agua empleada.

ESPECIFICACIONES DEL INSTRUMENTO V PARÁMETROS DE FUNCIONAMIENTO

La conductividad del agua debe medirse con exactitud usando instrumentos calibrados. Una medición de la conductividad
eléctrica consiste en la determinación de la conductancia, G (o su inversa, la resistencia, R), del fluido entre y alrededor de los
electrodos. La conductancia (1 IR) se ve directamente afectada por las propiedades geométricas de los electrodos; es decir, la
conductancia es inversamente proporcional a la distancia (d) entre los electrodos y proporcional al área (A) de los mismos. Esta
relación geométrica (d/A) se conoce como constante de celda, 0. Por consiguiente, la conductancia medida se normaliza para
la constante de celda a fin de determinar la conductividad, K, de acuerdo con la siguiente ecuación:
conductividad, K (S/cm) = 0 (cm- 1)/R (n)
Si fuera necesario, se deben ajustar y verificar la constante de celda y la medida de resistencia.

Constante de Celda

La constante de celda debe conocerse con una aproximación de ±2%. La constante de celda puede ser verificada directa-
mente, usando una solución de conductividad conocida o rastreable, o indirectamente, comparando la lectura del instrumento
obtenida con el sensor de conductividad en cuestión con las lecturas obtenidas con un sensor de conductividad con constante
de celda conocida o rastreable. Si fuera necesario, ajustar la constante de celda siguiendo el protocolo del instrumento provisto
por el fabricante del mismo. La frecuencia de la verificación/calibración se determina en función del diseño del sensor.

Medición de Resistencia

La calibración (o verificación) de la medición de resistencia se logra reemplazando los electrodos del sensor de conductivi-
dad con resistores de precisión que tengan estándares rastreables al NIST o a autoridades nacionales equivalentes en otros paí-
ses (con una exactitud que no se aleje en más de ±0, l % del valor declarado) para obtener una respuesta de conductividad
prevista del instrumento. La exactitud de la medición de resistencia es aceptable si la conductividad medida con el resistor
rastreable se encuentra dentro de ±0, 1 µS/cm del valor calculado, de acuerdo con la ecuación anterior. Por ejemplo, el resistor
rastreable es 50 kn y la constante de celda, 0, es O, l O cm- 1 . El valor calculado es 2,0 x 10-6 S/cm ó 2,0 µS/cm. El valor medido
debe ser 2,0±O,1 µS/cm. El instrumento debe tener una resolución mínima de O, 1 µS/cm en el intervalo más bajo.
Los valores de conductividad deseados deben basarse en el tipo de agua que se va a analizar y deben ser iguales o menores
que el límite de conductividad del agua para dicho tipo de agua. Se pueden incluir múltiples circuitos de medición en el medi-
dor o el sensor y cada circuito puede requerir de verificación o calibración independiente antes del uso. La frecuencia de la
recalibración se determina en función del diseño del instrumento.

Verificación del Sistema

La constante de celda del sensor del usuario se puede determinar con el sistema de medición de resistencia del usuario, o la
constante de celda se puede determinar con un sistema de medición de resistencia independiente. Si la constante de celda se
determina con un sistema de medición de resistencia independiente, se recomienda que el usuario verifique que el sensor ha
sido apropiadamente conectado al sistema de medición de resistencia para asegurar un funcionamiento adecuado. La verifica-
ción puede hacerse comparando los valores de conductividad (o resistividad) presentados en la pantalla del equipo de medi-
ción, con los de un dispositivo externo calibrado medidor de conductividad. Los dos valores de conductividad (o resistividad)
no compensados por temperatura deben ser equivalentes entre sí o tener una aproximación de ±5%, o bien deben tener una
diferencia que sea aceptable con respecto a la criticidad del agua producida y/o a los intervalos de conductividad del agua en
los que se realizaron las mediciones. Los dos sensores de conductividad se deben posicionar lo suficientemente juntos para
medir la misma muestra de agua a la misma temperatura y calidad del agua.

Compensación de Temperatura y Mediciones de Temperatura

Debido a que la temperatura tiene un efecto sustancial sobre las lecturas de conductividad de las muestras a temperaturas
altas y bajas, muchos instrumentos corrigen automáticamente la lectura real para mostrar el valor que teóricamente se obser-
varía a la temperatura nominal de 25º. Normalmente, la corrección se efectúa mediante un sensor de temperatura incluido
564 (645) Conductividad del Agua / Pruebas Físicas USP 40

junto con el sensor de conductividad y un algoritmo informático incluido en el instrumento. Este algoritmo de compensación
de temperatura puede no ser exacto para los distintos tipos de agua e impurezas. Por esta razón, los valores de conductividad
usados en la prueba de la Etapa 1 para Agua a Granel son mediciones no compensadas por temperatura. Otras pruebas de
conductividad que se especifican para la medición a 25º pueden usar mediciones compensadas por temperatura o mediciones
no compensadas por temperatura.
Se requiere una medición de temperatura para la prueba de la Etapa 1 o para las otras pruebas a 25º. Ésta puede realizarse
usando el sensor de temperatura incluido en el sensor de la celda de conductividad. También es aceptable un sensor de tem-
peratura externo colocado cerca del sensor de conductividad. La exactitud de las mediciones de temperatura debe ser de ±2º.

AGUA A GRANEL

El procedimiento y los límites de prueba en esta sección están destinados para Agua Purificada, Agua para Inyección, Agua
para Hemodiálisis, el condensado de Vapor Puro y cualquier otra monografía que especifique esta sección.
Se trata de un método de prueba de tres etapas para realizar el análisis en línea o fuera de línea. La prueba de conductividad
en línea proporciona mediciones en tiempo real y oportunidades para controlar, tomar decisiones e intervenir en el proceso en
tiempo real. Se deben tomar las precauciones necesarias en la recolección de muestras de agua para las mediciones de con-
ductividad fuera de línea. El método de muestreo, el envase de muestreo y los factores ambientales, tales como la concentra-
ción ambiental de dióxido de carbono y los vapores orgánicos pueden afectar la muestra. El procedimiento se puede iniciar en
la Etapa 2 si se prefiere el análisis fuera de línea.

Procedimiento

ETAPA 1

La Etapa 1 está destinada para la medición en línea o puede realizarse fuera de línea en un recipiente apropiado.
1. Determinar la temperatura y la conductividad del agua usando una lectura de conductividad que no haya sido compensa-
da por temperatura.
2. Mediante la Tabla 1, determinar el valor de temperatura que no sea mayor que la temperatura medida, es decir, la tem-
peratura inmediatamente inferior. El valor de conductividad correspondiente en esta tabla es el límite. [NOTA-No interpolar.]
3. Si la conductividad medida no es mayor que el valor especificado en la tabla determinado en la etapa 2, el agua cumple
con los requisitos de la prueba de conductividad. Si la conductividad es mayor que el valor especificado en la tabla, pasar a la
Etapa 2.
Tabla 1. Etapa 1-Requisitos de Temperatura y Conductividad
(sólo para mediciones de conductividad no compensadas por temperatura)
Temperatura Requisito de Conductividad (µS/cm)
o 0,6
5 0,8
10 0,9
15 1,0
20 1, 1
25 1,3
30 1,4
35 1,5
40 1,7
45 1,8
50 1,9
55 2,1
60 2,2
65 2,4
70 2,5
75 2,7
80 2,7
85 2,7
90 2,7
95 2,9
100 3, 1
USP 40 Pruebas Físicas/ (645) Conductividad del Agua 565

ETAPA 2

4. Transferir una cantidad de agua suficiente a un recipiente adecuado y mezclar la muestra de prueba. Ajustar la temperatu-
ra, si fuera necesario, y mientras se mantiene a 25 ± 1º, comenzar a agitar la muestra de prueba vigorosamente mientras se
observa la conductividad de manera periódica. Cuando el cambio neto en la conductividad (producido por la absorción de
dióxido de carbono atmosférico) es menos de O, 1 µS/cm por 5 minutos, registrar la conductividad. [NOTA-Las mediciones de
conductividad en esta etapa pueden ser compensadas por temperatura a 25º o no compensadas por temperatura.]
5. Si la conductividad no es mayor de 2, 1 µS/cm, el agua cumple con los requisitos de la prueba de conductividad. Si la
conductividad es mayor de 2, 1 µS/cm, pasar a la Etapa 3.

ETAPA 3

6. Efectuar esta prueba dentro de los 5 minutos aproximadamente de haber efectuado la determinación de conductividad
en el paso 5, manteniendo la temperatura de la muestra a 25 ± 1º. Agregar una solución saturada de cloruro de potasio a la
misma muestra de agua (0,3 mL por cada 100 mL de la muestra de prueba) y determinar el pH con una aproximación de O, 1
unidades de pH según se indica en pH (791 ).
7. Empleando la Tabla 2, determinar el límite de conductividad en el valor de pH medido. Si la conductividad medida en el
paso 4 no es mayor que el valor especificado en la tabla determinado en el paso 6, el agua cumple con los requisitos de la
prueba de conductividad. Si la conductividad medida es mayor que este valor o si el pH está fuera del intervalo de 5,0-7,0, el
agua no cumple con los requisitos de la prueba de conductividad.
Tabla 2. Etapa 3-Requisitos de pH y Conductividad
(sólo para muestras equilibradas con la temperatura y la atmósfera)
pH Requisito de Conductividad (µS/cm)
5,0 4,7
5, 1 4, 1
5,2 3,6
5,3 3,3
5,4 3,0
5,5 2,8
5,6 2,6
5,7 2,5
5,8 2,4
5,9 2,4
6,0 2,4
6, 1 2,4
6,2 2,5
6,3 2,4
6,4 2,3
6,5 2,2
6,6 2, 1
6,7 2,6
6,8 3, 1
6,9 3,8
7,0 4,6

AGUA ESTÉRIL

El procedimiento y los límites de prueba están destinados para Agua Purificada Estéril, Agua Estéril para Inyección, Agua Estéril
para Inhalación y Agua Estéril para Irrigación y cualquier otra monografía que especifique esta sección. Las aguas estériles proce-
den de Agua Purificada o Agua para Inyección y por lo tanto se ha determinado que cumplen con los requisitos para Agua a
Granel antes de ser envasadas. La especificación proporcionada representa el valor máximo de conductividad permitido, to-
mando en cuenta la limitación del método de medición y una razonable lixiviación (leaching) del envase. La elección de la
especificación y del volumen de muestreo se debe definir y validar de acuerdo con el propósito previsto del agua.
566 (645) Conductividad del Agua/ Pruebas Físicas USP 40

Procedimiento

Obtener una muestra que refleje de manera adecuada la calidad del agua usada. Antes de abrir, agitar vigorosamente el
envase para homogeneizar la muestra de agua. Se pueden requerir varios envases para recolectar suficiente agua para el análi-
sis.
Transferir una cantidad de agua suficiente a un recipiente adecuado y mezclar la muestra de prueba. Ajustar la temperatura,
si fuera necesario, y mientras se mantiene a 25±1 º, comenzar a agitar la muestra de prueba vigorosamente mientras se obser-
va la conductividad de manera periódica. Cuando el cambio neto en la conductividad (producido por la absorción de dióxido
de carbono atmosférico) es menos de O, 1 µS/cm por 5 minutos, registrar la conductividad.
Para envases con un volumen nominal de 1O mL o menos, si la conductividad no es mayor que 25 µS/cm, el agua cumple
con los requisitos. En envases con un volumen nominal mayor que 1O mL, si la conductividad no es mayor que 5 µS/cm, el
agua cumple con los requisitos.

(651) TEMPERATURA DE SOLIDIFICACIÓN

La temperatura a la cual una sustancia pasa del estado líquido al sólido cuando se enfría es un índice útil de su pureza si se
libera calor al producirse la solidificación, siempre que toda impureza presente se disuelva sólo en el líquido y no en el sólido.
Las sustancias puras tienen un punto de congelación bien definido, pero generalmente las mezclas se congelan a diferentes
temperaturas. Para muchas mezclas, la temperatura de solidificación, determinada siguiendo estrictamente los siguientes mé-
todos empíricos, es un índice útil de su pureza. El método para determinar las temperaturas de solidificación que se describe
en este documento se aplica a sustancias que funden entre -20º y 150º, que es el intervalo del termómetro usado en el baño.
La temperatura de solidificación es el punto máximo (o en caso de no existir un máximo, el punto de inflexión) en la curva de
temperatura-tiempo.

APARATO

Ensamblar un aparato similar al ilustrado, donde el recipiente para la sustancia es un tubo de ensayo de 25 x 100 mm en el
que se coloca un termómetro adecuado de intervalo corto, suspendido en el centro y un mezclador de alambre, aproximada-
mente de 30 cm de largo, que se dobla en su extremo inferior en un anillo horizontal que rodea el termómetro. Emplear un
termómetro con un intervalo que no exceda de 30º, graduado en divisiones de O, 1ºy calibrado para una inmersión a 76 mm
pero no usado a esa profundidad. La serie ASTM El 89C a 96C es una serie disponible y adecuada de termómetros, que abar-
can un intervalo desde -20º hasta+ 150º. Se pueden usar otros aparatos para medir temperaturas siempre y cuando estén vali-
dados para este procedimiento (ver Advertencias y Requisitos Generales, 6.80.30. Dispositivos de Medición de Temperatura). Las
dimensiones deben estar comprendidas entre± 20% con respecto a las que se muestran en la figura.
El recipiente para la muestra se encuentra sostenido, mediante un corcho, dentro de un cilindro adecuado, impermeable al
agua, con un diámetro interno de aproximadamente 50 mm y 11 cm de longitud. A su vez, el cilindro se apoya en un baño
con una altura suficiente como para proporcionar una capa de no menos de 37 mm alrededor de los lados y del fondo del
cilindro. El baño externo tiene un termómetro apropiado.

PROCEDIMIENTO

Fundir la sustancia, si es un sólido, a una temperatura que no exceda de 20º por encima del punto de solidificación esperado
y verterla en el tubo de ensayo hasta una altura de 50 mm a 57 mm. Armar el aparato con el bulbo del termómetro del tubo
de ensayo inmerso en un punto medio entre la parte superior e inferior de la muestra en el tubo de ensayo. Llenar el baño
hasta aproximadamente 12 mm desde la parte superior del tubo con un líquido apropiado a una temperatura de 4º a 5º por
debajo del punto de solidificación esperado.
En caso de que la sustancia sea un líquido a temperatura ambiente, llevar a cabo la determinación empleando un baño a
una temperatura de aproximadamente 15º por debajo del punto de solidificación esperado.
Cuando la muestra de prueba esté enfriada aproximadamente a 5º por encima del punto de solidificación esperado, ajustar
el baño a una temperatura de 7° a 8º por debajo del punto de congelación esperado. Revolver continuamente la muestra has-
ta terminar la prueba moviendo el agitador de alambre hacia arriba y hacia abajo entre la parte superior e inferior de la mues-
tra, a una velocidad constante de 20 ciclos completos por minuto.
USP 40 Pruebas Físicas/ (651) Temperatura de Solidificación 567

E E
10cm
.,.,u .,.,u
"! "!
1,85
cm --- ----l
Nivel de llenado

5cm
15 cm

--- 0.9'J
_______ _j _____ _

+- 3,75 cm 1,25cm 3,75cm

3,75 cm

Aparato de Temperatura de Solidificación

Frecuentemente, la congelación puede inducirse frotando las paredes internas del tubo de ensayo con el termómetro, o in-
troduciendo un fragmento pequeño de la sustancia previamente solidificada. Un sobreenfriamiento pronunciado puede causar
una desviación respecto del patrón normal de cambios de temperatura. Si esto último ocurre, repetir la prueba, introduciendo
partículas pequeñas del material en análisis en forma sólida a intervalos de 1 º a medida que la temperatura se acerca al punto
de solidificación esperado.
Registrar la lectura del termómetro del tubo de ensayo cada 30 segundos. Continuar revolviendo sólo mientras baje gradual-
mente la temperatura; dejar de revolver cuando la temperatura se vuelva constante o comience a subir levemente. Continuar
registrando la temperatura en el tubo de ensayo cada 30 segundos, al menos durante 3 minutos, después de que la tempera-
tura comience a caer nuevamente después de haber permanecido constante.
El promedio de no menos de cuatro lecturas consecutivas comprendidas dentro de un intervalo de 0,2º constituye la tempe-
ratura de solidificación. Estas lecturas se encuentran cerca de un punto de inflexión o un máximo, en la curva de temperatura-
-tiempo, que se produce después de que la temperatura se vuelva constante o comience a subir y antes de que empiece a
bajar nuevamente. El promedio de las lecturas con una aproximación de O, 1 º constituye la temperatura de solidificación.
568 (659) Requisitos de Envasado y Almacenamiento/ Pruebas Físicas USP 40

(659) REQUISITOS DE ENVASADO Y ALMACENAMIENTO

(Una parte de la sección Componentes Relacionados de este capítulo será oficial a partir del 1º de mayo de 2019, según
se indica.)

Cambio en la redacción:

•INTRODUCCIÓN
El propósito de este capítulo es proveer definiciones de envasado, información auxiliar sobre envasado y definiciones sobre
condiciones de almacenamiento relevantes para el almacenamiento y la distribución de ingredientes activos, excipientes y pro-
ductos médicos, tales como productos farmacéuticos, dispositivos, productos de combinación (p. ej., esténts liberadores de
fármacos) y suplementos dietéticos.

ENVASADO!líT

Los materiales de envasado no deben interactuar física o químicamente con un artículo envasado de manera que ocasione el
incumplimiento de sus requisitos de seguridad, ideotidadr contenido, calidad o pureza. Todos los materiales plásticos usados
para construir un Sistema de envase debe cumplir .con los requisitos aplicables del capítulo Materiales Plásticos de Construcción
(66 l .1 ). Todos los Sistemas de envase deben cumplir cori los requisitos aplicables. especificados en Envases-Vidrio (660), Siste-
mas de Envases Plásticos para Uso Farmatéuticó (661.2) y Envases-Componentes Auxiliares (670). Todos los cierres elastoméricos
deben cumplir con los requisitos aplié:ables en Tapones 13/astométítos para Inyectables {381 ).
Todas las monografías de USP~NF deben incluir requisitos de e1wasado y almacenamiento. En este capítulo se proporcionan
los envases de elección para la declaración correspondiente al envasado. Para los ingredientes farmacéuticos activos (API, por
sus siglas en inglés), el envase de elección sería impermeable, bien cerrado o, sí fuera necesario, resistente a la luz. Para los
excipientes, dado que generalmente se manejan en grandes volúmenes (Sistemas de envase que pueden ser desde tambores a
vagones cisterna), un envase bien cerrado es, por defecté>, el envase apropiado. Cuando no se proporcionen instrucciones o
limitaciones específicas, los artículos deben protegerse de la humedad, congelación y calor excesivo (ver Definiciones Genera-
les).
Los requisitos farmacopeicos para el uso de envases especificados t&mbién se aplican a artículos envasados por Dispensado-
res, Reenvasadores u otros individuos, a menos que la monografía individual del medicamento indique algo diferente.

LEY DE ENVASADO PARA. LA. PREVENC•óN DE ENVENENAMIENTO (POISON PREVENTION

PACKAGING. ACT O PPPA)
Esta ley, que es administrada por la United States Consumer Product Safety Commission (Comisión de Seguridad de Produc-
tos para el Consumidor de los .EE.lJUi o CPS<:)1 exige el uso. de envases especiales para la mayoría de los medicamentos de
administración por vía oral para humanos d.e venta bajo receta, medicamentos controlados de administración oral, aJgunos
medicamentos de administracióf:i no-oraf de vent¡.¡ bajo recefa médica;. algunos suplementos dietéticos y para muchas prepara-
cioneSfarmacéuticas de i.renta libre para proteger al público de lesiones o enfermedades causadas por el uso incorrecto de es-
tas preparaciones (16 CFR§l 700~ 14)~
El envase primario para sustancias reglamentadas por la Ley de Envasado. para la Prevención de Envenenamiento debe cum-
plir con· 1as normas pata: envases especíáles.(16 CFR §.1 700.1 S)1 las <:t.iales rigen para todos los tipos de envases, induldos los
rece.rrables (que pueden volver~ ce:rrarse u.na vez abiertos), los no recerrables y los de dosis única.
No s~requieren envases especiales para.los medicamentos que se dispensan en hospitales a pacientes hospitalizados. Asimis-
mo, los fabricantes o envasadores .de medicamentos a granel de venta bajo receta no. necesitan usar envases especiales si el
medicamento ha de ser reenvasado por el farmacéutico .. Los medicamentos de venta bajo receta reglamentados por la Ley de
Envasado para la Prevención de Envenenamiento se pueden dispensar en envases que no sean Seguros para niños si el compra-
dor así lo solicita o sí t1na receta válida así lo indica (15 use §1473).
Los fabricantes o envasadores de preparaciones farmacéuticas de venta libre reglamentados por la Ley de Envasado para la
Preven.ción de Envenenamiento están autorizados a envasar un tamaño de producto en envases que no sean Seguros para ni-
ños siempre que también provean envases especiales de tamaño habitual. Los envases que no sean Seguros para nifíos requie-
ren un etiquetado especial (16 CFR §1700.5).

NT ES IMPORTANTE DESTACAR QUE LAS OPERACIONES REFERIDAS AL "ENVASADO" INCLUYEN EL ENVASADO PRIMARIO PROPIAMENTE DICHO, ASÍ COMO LAS
OPERACIONES DE EMPACADO {ENVASADO SECUNDARIO) Y EMBALAJE (ENVASADO TERCIARIO PARA EL TRANSPORTE).
USP 40 Pruebas Físicas/ (659) Requisitos de Envasado y Almacenamiento 569

TEMPERATURA Y ALMACENAMIENTO
En algunas monograffas se establecen instrucciones específicas con respecto a las condiciones de almacenamiento (p. ej., la
temperatura o humedad) a las que se debe almacenar y transportar el artículo. Estas condiciones se aplican excepto cuando la
etiqueta del artículo indica condiciones de almacenamiento diferentes que se basan en estudios de estábllidad. Cuando no se
proporcionan instrucciones o limitaciones específicas en el etiquetado del artículo, los artículos deben protegerse de la hume-
dad, la congelación y el calor excesivo y, si fuera necesario, de la luz durante su transporte y distribución. Los fármacos están
exentos de esta norma.

DEFINICIONES GENERALES
Definiciones de Envasado

Sistema de envase (también referido como Sistema de envase-cierre): Se refiere al conjunto de los Compcmentes de los enva-
ses y materiales que contienen y protegen el artículo, e incluye los Componentes·de Jos envases primarios y los Componentes de
los envases secundarios, cuando tales componentes son requeridos para ofrecer protección adicion.al.
Envase: Recipiente que contiene un compuesto intermedio, ingrediente farmacéutico activo, excipiente o forma farmacéuti·
ca, y que está en contacto directo con el artículo (p. ej., ampollas, viales, fraséos, jeringas e inyectores tipo bolígrafo).
Cierre: Material que sella un espacio abierto de un Envase y provee protección para el contenido. También provee acceso al
contenido del Envase (p. ej., tapas de rosca y tapones).
Componente del envase: Cualquier parte del Envase o Sistema de envase-dette, incluidos: el Envase (p. ej., ampo/(as, jerfn~
gas, viales y frascos); Cierres (p. ej., tapas de rosca y tapones); casquillos y sobresellos; recubrimientos internos del Cierre (p. ej.,
recubrimientos internos de cartuchos tubulares); sellos internos; puertos de administración; envoltorios; accesorios de adminis·
tración; etiquetas; cajas de cartón y envoltorio plástico.
Componente de los envases primarios: Componente del envase que está en contacto directo o que puede entrar én contac-
to directo con el artículo.
Componente de los envases secundarios (empaque): Componente del envase que está en contacto directo con un Compo-
nente de los envases primarios y que puede proveer protección adicional para el artículo.
Componente del envase terciario (embalaje): Componente del envase que está en contacto directo con un Componente de
los envases secundarios y que puede proveer protección adicional para elartículo durante el transporte y/o almacenamiento.
Componente auxiliar: Componente o entidad que puede entrar en contacto con un Componente deí envase terciario durante
la distribución, almacenamiento y/o transporte del artículo envasado (p. ej., palés, tarimas y envoltorio plástico).
Componente asociado: Componente del envase que por lo general está destinádo la administración del medicamento al pa-
ciente pero que no se almacena en contacto con el artículo durante la totalidad de su vida útil (p. ej., cucharas, Dosífícadoty
jeringas de dosificación).
Materiales de construcción: Se refiere a los materiales {p. ej., vidrio, plástico, elastómeros y metal) usados para fabricar un
Componente del envase.
Inyecciones de pequeño volumen (Parenterales de pequeño volumen): Una forma farmacéutica inyectable que se envasa
en Envases con un contenido declarado de 100 mL o menos.
Inyecciones de gran volumen (Parenterales de gran volumen): Una forma farmacéutica inyectable que se envasa en Envases
con un contenido declarado de más de 100 ml.
Envases seguros para niños: Sistemas de envase diseñados o construidos para cumplir con las normas de la Consumer Pro-
duct Safety Commission (Comisión de Seguridad para el Consumidor) relacionadas con la apertura de envases por parte de
niños (16 CFR §1700.20 y subsiguientes y 16 CFR §1700.15).
Envases adecuados para la tercera edad: Sistemas de envase diseñados o construidos para cumplir con las normas de la
Consumer Product Safety Commission (Comisión de Seguridad para el Consumidor) relacionadas con la apertura de envases
por parte de adultos de la tercera edad (16 CFR §1700.15 y 16 CFR §1700.20).
Sistema de entrega restringida: Sistema de envase diseñado o construido para restringir (controlar) la cantidad del medica-
mento que puede administrarse para limitar el acceso no intencionado por parte de niños u otras poblaciones vulnerables simi-
lares. Los Sistemas de entrega restringida deben cumplir y pueden exceder las normas de la Consumer Product Safety Commis-
sion (Comisión de Seguridad para el Consumidor) para envases especiales[ Envases seguros para niños y Envases adecuados para
la tercera edad (16 CFR §1700.15 y subsiguientes)]. Para líquidos medicinales orales, varían las características de las superficies
y de flujo. Es responsabilidad del fabricante asegurar que todos los componentes del Sistema de entrega restringida proveen la
protección de seguridad esperada. Un componente del Sistema de entrega restringido es el restrictor de flujo, que es un Compo-
nente del envase que restringe el flujo del líquido. El restrictor de flujo puede ser usado como parte de un Sistema de entrego
restringida o como un adaptador para facilitar el uso de un dispositivo de medición para líquidos medicinales orales. Un restric-
tor de flujo no debe comprometer fas normas de la Consumer Product Safety Comrnission {Comisión de Seguridad para el
Consumidor) para envases especiales [Envases seguros para niños y Envases adecuados para la tercera edad (16 CFR §1700.15 y
subsiguientes)].
Envases que evidencian su alteración intencional: Sistemas de envase que no pueden ser abiertos sin la destrucción eviden-
te del sello o de alguna parte del Sistema de envase. El Envase que evidencia su alteración intencional debe usarse para medica-
570 (659) Requisitos de Envasado y Almacenamiento/ Pruebas Físicas USP 40

mentos estériles destinados para uso oftálmico O ótico, .excepto cuando ,se trata de una preparación magistral extemporánea
para su dispensación inmediata según receta médica.. Los medicamentos destinados a la venta sin receta médica también de-
ben cumplir, cuando correspqoda, c:on l(ls.tequisitos. de la fDA relativos a J;;nvases que évidencían su alteración intencíoryal y al
etiquetádo (41 CfR§221.132J.~1.En~aseprirnariQy/o e! empaque o. Envasesecµndario(l externo, o el.embalaje protector.usa-
dó po.r. fabricantes o dis~rlbtiidores pára.todas fas ~ormas farmacéuticás, salvo. e~cepciónés específicas, .se diseña p~eferer:lte·
mente para evidenc:iar cualquier alteración en el. cónteni.do.
Envase recerrables: .. Envase que, después de haber sido abierto, puede volver él cerrarse con un grado similar.de.seguridad y
se puede usar un número de veces sufíciente para dispensar el contenido total sin la pérdida de seguridad. El Envase recerrable
puede también ser seguro para niños.
Envase no recerrables: Envase o parte de un envase que no puede ser cerrado de nuevo después de que todo o parte del
contenido ha sido retirado. Los ejemplos de Envases no tecerrables son blísteres, sachets, tiras, y otros Envase unitarios. Los
Envases no recerrables pueden incluir blísteres laminados m(Jlticap<'!s formados en frío, tiras laminadas y blísteres laminados
multicapa que combinan PVC/Adar® que se forman por calor o por frío. Los Envases no recerrables pueden ser seguros para
niños dependiendo.del uso.previst9 y del lugar de uso. Los envases domésticos. no recerrables están sujetos a la Ley de Envasa-
do para 1-a Preyención de E!Jvenenamlentoseg~n.J0 definldo en el. jítulo 16 del QFR.§1700 ..J4.
Envases herméticos: .Sistemas de eny.e1.~...:Cferie q1.1e impiden. I& penetración del aire p cualquier otro gas. en. las. tondkJones
habito¡¡les o u.suales de. manejo, tran.spprt;e,. &Jn:iacen&mierito p distrib.llc;ióh.
Envases impermeabl~ .· $istemas <,l.é envase...:Cl~r:rn que proteg~nel contenido de .~a tontaminacion por líquido$, sol.i<los o va·
p0res extraños; de la pén;iida del ártí('.ol();y <fe efrórescencia, deUcuescencia o eyapoi'acloo en c;oridiciQ{les habitqil.les o usuales
de manejo, transporte, almacenamiento. y distribución, pudiéndose volver a cerrar de forma ímperme&ble uri<l vez abiertoS:
Cuando se especifique un envase impermeable, éste puede sustituir$e.coli un. envase herm~tico para tina sola dosis de on artf·
culo. (NóTA-'""Cuart1do en una moriográfía.iridividual se especifique .el eryvasado. y almac;eoa!iliento en un el'tvase. impermeabfe
o bien cerrado, elenvase usado para dispé!'lsar ·e1 artítulo prescrito cumple c<:>n los réquisítos en fnitase5:.....::Prueb(Jjs de /)esempe;
ño{671 >.J
Envases bien cerrados:. Sistemas de envase;-ciel'l'é'que pn~tegenel conienido de la cqntantinación por sólidos extraños y de la
pérdida del· artículo en condiciones haoitúalés o usUales dé manejo, transporte, almacenamiento y distribudon. Ver el catilttiío
<671).
Envases resistentes a la luz: Sistemas (je erh-;ase:-'Cierr:e que protegen él contenido dé los efectos de la. luz por ~qio cié l.(ls
propiedad~s específicas del materi¡:it que tos .cpmpc;;>ne, in'cluyent'Jo los re<::ubrimientós apUca<Jos sqb:ré l<:>s mismos. \J.ti envas(;l
transparente e lncolOr(l O ttansl@ido pl,lede setcpí:tyertid() en (Jnenyasé tesisténÍe a l(l Íl.ÍZ mediánte ul1q cubierta exteri<:>r opa-
ca o. mt'!dfonte el. uso de ün envase secµr}dario, en l'.;.uyo caso. la etiqueta del ehv~se debe. indi.car, que es i(l\prestíndlble e! uso
de la q1bierta exteri1:>r. opac<'! o que.se ·1équ~ere: el envase se~lind11.~io hastíil. que el .(lrl(cut(l. se h(lya usado. o administr~do~ <;;:uan~
do eo una monogrtifí..:iJndlvidüal se indique "prntegé( .de la lu~1', se entiende que t'!lartícülo se debe c.onservar en uri env&se
resistente a.la .IUz:Yer Envas~s:---"Pr:uepas de Oe~IT!.perto {67.l/, Tra.nsmislón~wectrqJ.
o
Sistema de envase-dette equtvalénte:. Sistémá ae envase,.;.cíerre que brinda una protección igual m<'!y9r. q\jé el Sistema .i:Je
envase priginal delfªb.ricMte coo resp~cto a la.velQcid&d de transmisión de hl!medad·vapor, transn:iisión de óxJg~n!), transmí~
sión de. luz y compatibilidad. La équiVálérida del sistema se extíénde a cualquier material protectotespetial, como los de los
sellos o desecantes rela~ionados C(l.n E!I Sistema de envase original.
Tabla 1. Definiciones de Sistema de Envase: Inyectable venlls No ln~able
Inyectable No. inyectable
Multidosís Unidades múltiples
Moriodosis Utli~rfo
~
Dosis única
- !Jnid¡¡cl de uso
Envase a granel para farm.ac!as -
Envase a granel para agentes de ci;mtraste -
SistemélS de Envases de Inyectables
Envase multidosis (o de Dosis múltiple):. Sistema de envaskierte ql.ie contiene un medicament<:> estéril para administración
parenteral(inyectable o irifusión).que ha cumplido ét>n lós tequisítos de análisis de éfü::acía· antimietobiana o es~á exent(l de
dichos requisitos de análisis :por teglámentac:ión de la· f DA.. Envase multidosisi:iestinad<> a ·cónl:enerrnás de uná dosis. de un
rnediéamento. Cual'tdo haya espado disponible, un Ei'lvilse multido.sís .se etiqüeta c:Qrn.O tal. Por lo gene.ral~ se espeta que tos
Envases multidosis contengan 30 mL o menos de medicamento. La fecha límite de u.So para un• Envasé multidosís ábierto o per-
forado (p. e);; perforado con ag\jjaJ e~ de 28 días a menos que el fabricante lo específique de otro modo en· la etiqueta. Un vial
es un ejemplo de un Envase mtdtiaosls.
Envases monodosis: Sistema cíe envaie.:.tierre que <::ontiene un medicamento e.stéril para administración parenteral (inyección
o infusión) que no está sujeto a cumplir con los requisitos de análisis de eficacia antimkrobiana. Un Envase monodosis está dise"'
 USP 40 Pruebas Físicas/ (659) Requisitos de Envasado y Almacenamiento 571

ñado para su uso en un paciente individual como una inyección/infusión individual. 1 Cuando haya espacio disponible, un En·
vase monodosis se etiqueta como tal y debe incluir instrucciones de desecho apropiadas en la etiqueta. Los viales, ampollas y
jeringas prellenadas son ejemplos de Envases monodosis.
Envase a granel para farmacias: Sistema de envase-cierre de una preparación estéril para uso parenteral qµe. conti~e mµ-
chas monodosis. El contenido está destinado.para su uso en programas de preparación de mezclas en far:madas y está restrin~
gido a. la preparación de mezclas para infusión o al llenado de jeringas estériles vacías con un dispositivo de transferenci~ esté-
ril. El Cierre debe ser penetrado solo una vez después de lc;i reconstitucíón, si fuera necesario, usando un dispos~tivo de tn1nsfe-
rend.a estéril adecuado o equipo dispensador. que permita la dosificación medida del contenido. El Envase a grqnel .para farma-
cias solo se empleará en un área de trabajo adecuada, por ejemplo, una campana de flujo laminar {o un. área equjvalente de
aire limpio para preparación. magistral). La nomenclatura Envase a granel para farmacias se limi.ta a las formas farmacévticas
denominadas inyección, para inyección o emulsión inyectable1 según se establece en el capítulo N.omenclqtura.(l 12l)1 Formos
Generales de Nomenclatura.
El Envase a granel .para farmacias, aunque.contenga más de una monodosis,.está exento dél límite de volumen de 30 ml
para Envases multidosis y del requisito de contener una .sustancia adecuada o mezcla de sustandas adecuada par~ prevenir E!I
credmiento de microorganismos. Para requisitos de etiquetado, ver el capítulo Cl.).
Envase a granel para agentes de contraste: Envase. de una preparación estéril. para uso parenteral que contiene muchas
monodosis de un agente de contraste (producto farmacéutico para diagnóstico por imágenes) para uso cO;n un dispositivo de
diagnóstico por contraste de imágenes. El contenido se restringe para usar directamente con un dispositivo que permita miti*
gar el riesgo de contaminación cruzada (es decir, un sistema de inyección automatizado de agente dE! {'.Ontraste o.tin.sjstem~
de manejo de agente de contraste aprobado o probado para uso con un Envase a granel para agentes de contraste)• la garantia
de esterilidad del contenido del Envase a granel para ager:rtes de contraste depende en parte del sistema de. inyec;:ción .automati-
zado de agente de contraste o del sistema de manejo del agente de contraste.
El Envase a granel para agentes de contraste se debe usar únicamente en un cuarto designado para procedimientos radiológi-
cos que implican la administración intravascular de un agente de contraste. Mediante una técnica aséptica, se debe penetrar el
cierre del Envase a granel para agentes de contraste solo una vez con un componente estéril adecuado del sistema de inyección
automatizado de agente de contraste o del sistema de manejo de agente de contraste. Si no es posible garantizar la integridad
del Envase a granel para agentes de contraste y del. sistema .de administración meqiante supervisión directa continua, se deben
desechar el Envase a granel para agentes de contraste y todos los. elementos desechables asodados para el .sistema qe ínye~dón
automatizado.de agente de contraste o del sistema de manejo decagente de contra~tif!.
La nomenclatura Envase a granel para agentes de contraste se limita a. las form&s ~a1macéuticas denQrninadas inyei:dór:}, p<t@
inyección o emulsión inyectable, según se establece en el capítulo Nomenclatura (1121 );. Formas Generales de Nomenclatut6.
Los Envases a granel para agentes de contraste, aunque contengan más de una monodosis, estár:i exentos d~l límite de volumen
de 30 mL para envases multidosjs. El contenido del Envase.a grané/para agentes de contraste debe tener la capacidad .ciemos·
trada de limitar el crecimiento de microorganismos durante el período de uso declarado en el etiquetado.
Cuando un envase se ofrezca como Envase a granel para agentes de contraste, la etiqueta debe (1) declarar de manera promi-
nente que es un "Envase A Granel para Agentes de Contraste"y, en yuxtaposición con dicha declarai:ión, incluir la s.igL¡iente
declaración de uso: "Solo para uso con un sistema de inyección.automati,zado de agente de contraste o sistema de m~nejo de
agente de contraste aprol:)ado o probado para uso con este agente de contraste en este Envase A Granel para Agentes de.tol1-
traste"; (2) presentar una declaración que limite el periodo en el que el envase puede ser usado una v~z qLle ha sido perforado,
siempre que se mantenga en las condiciones de almacenamiento declaradas en el etiquetado; y. (3) presentar lii declaraciótj,
"Ver el etiquetado del medicamento y del dispositivo para información sobre los dispositivos indicados para uso con este Enva-
se A Granel para Agentes de Contraste y las técnicas. para ayudar a garantizar el uso seguro".

Sistema de Envase para Productos No Inyectables

Envase de unidades múltiples: Sistema de envase-cierre que permite retirar porciones sucesiva.s de un artículo no inyectal:)le
sin alterar la seguridad, la concentracipn o la potencia, la calidad o la pureza de la porción remanente (p. ej., frasco de cápsu-
las, tabletas y líquidos orales o tópicos).
Envase unitarios: Sistema de envase-cierre que contiene una cantidad de un artículo no inyectable destinado para adminis-
tración como dosis única o como un dispositivo terminado individual destinado para ser utilizado inmediatamente luego de la
apertura del Sistema de envase.
Envase de dosis única: Sistema de envase-cierre unitario para un artículo destinado para administración como dosis única por
una vía que no sea la parenteral.
Envase de unidad de uso: Sistema de envase-cierre que contiene una cantidad específica de un artículo que está destinado.a
dispensarse como tal, sin ninguna modificación posterior, excepto la adición de un etiquetado adecuado (ver Etiquetado (7)).
No está permitido reenvasar los Envases de unidad de uso para su venta.

1 Pueden considerarse excepciones, solo en las condiciones descritas en Preparación Magístra!-Prepáracianes Estériles (797).
572 (659) Requisitos de Envasado y Almacenamiento/ Pruebas Físicas USP 40

Otras Deflniciones

ENVASADO DE INYECTABLES
USP 40 Pruebas Físicas/ (659) Requisitos de Envasado y Almacenamiento 573

extraíble de un Sistema de envase monodosis con una jeringa y aguja hipodérmicas, se extraerá el contenido en la forma más
completa posible con una jeringa hipodérmica seca, de una capacidad nominal que no exceda de tres veces el volumen a. ex-
traer, y equipada con una aguja de calibre 21 de una longitud no menor de 2,5 cm {1 pulgada). Procurar expeler las burbujas
de aire, y el contenido se descarga posteriormente en un Envase para dilución y valoración.

ENVASADO DE GASES MmlCINALES

Cilindro de gas: Sistema de envase metálico construido de acero o aluminio y diseñado para contener gases medicinales a
presión; estos gases pueden incluir: Dióxido de Carbono USP, Helio USP, Aire Medicinal USP, óxido nítrico1 Óxido Nitroso USP,
Nitrógeno NF y Oxígeno USP. Como medida de seguridad, se recomienda el Sistema de Seguridad de encaje pareado "Pin-
lndex" para dióxido de carbono, helio, aire medicinal, óxido nitroso y oxígeno en cilindros de Tamaño E o menor~
Cambio en la redacción:

COMPONENTES RELACIONADOS
Muchos Componentes relacionados se gradúan para la medición y administración de dosis. Los Componentes refqcionados
pueden envasarse con el medicamento o venderse y comprarse por separad<;>. Es responsabilidad del f(lbricante garanfü::ar que
se provea la medición y componente de dosificación apropiados o que se especifique un componente pata propósitos genera-
les, como los descritos en esta sección, para la administración de la cantidad/dosis apropiada con la exactitud prevista. Las
preparaciones líquidas tienen características superficiales y de flujo únicas. Por consiguiente, el volumen administrado por un
componente de medición/dosificación puede variar para cada preparación.
Los Componentes relacionados graduados descritos en esta sección son para uso general y deben estar compuestos de mate-
riales seguros. Las marcas de graduación deben ser legibles, indelebles y deben estar sobre una superficie que no tenga con-
tacto con la boca ni con el producto.
•Las marcas de volumen relacionadas deben estar en unidades métricas únicamente y limitarse a una sola escala de medi-
ción que corresponda con las instrucciones de dosificación en la etiqueta del envase para venta libre o para venta con receta
médica (ver Etiquetado de Envases de Medicamentos de Venta Bajo Receta (1 7)). En las condiciones esperadas de uso, el error de
volumen en el que se incurre al medir líquidos para la administración de dosis individuales por medio de dichos componentes
graduados no debe exceder de 10% de la cantidad indicada de la preparación líquida con la que se usará el componente gra-
duado. e (Oficial 01-may-2019)
Dosificador: Dispositivo de medición que consiste en un vaso pequeño que puede incluirse con el envase de los artículos
líquidos orales.
Cuchara dosificadora: Dispositivo de medición que consiste en una parte cóncava con mango que puede incluirse con el
envase de los artículos líquidos orales. El mango puede ser un tubo graduado.
Gotero para medicamentos: Dispositivo de medición que consiste en un cuerpo o tubo transparente o translúcido que ge-
neralmente está equipado con un bulbo depresible. Puede incluirse con el envase de los artículos líquidos orales.
jeringa para administración oral: Dispositivo de medición que consiste en un cuerpo y un émbolo fabri.cados con material
de plástico transparente o translúcido y que tiene un sello en el extremo. Puede incluirse con el envase de los artículos líquidos
orales. La jeringa debe administrar una cantidad medida de un medicamento líquido.

DEFINICIONES DE TEMPERATURA Y ALMACENAMIENTO

Congelador: Es un lugar con una temperatura controlada entre -25º y -1 Oº (-13º y 14º F). Tener en ~uenta que, en algunas
instancias, los artículos pueden tener condiciones recomendadas de almacenamiento por debajo de -20º (-4º F). En d.ichos
casos, la temperatura del lugar de almacenamiento debe controlarse a ±1Oº.
Refrigerador: Es un lugar frío con una temperatura controlada entre 2º y 8º (36º y 46º F).
Frío: Toda temperatura que no exceda de 8° (46º F).
Fresco: Toda temperatura entre 8º y 15º (46º y 59º F). [NOTA-Cuando se indique que un artículo debe almacenarse en un
lugar fresco, puede almacenarse o transportarse, alternativamente, refrigerado, a menos que se especifique algo diferente en la
monografía individual.]
Temperatura ambiente: La temperatura predominante en un entorno de trabajo.
Temperatura ambiente controlada: La temperatura mantenida termostáticamente que abarca la prevalente en el ambiente
usual de trabajo de 20º-25º (68º-77° F). También se deben cumplir las siguientes condiciones.
La temperatura cinética media no debe exceder de 25º. Se permiten variaciones entre 15º y 30ª (59º y 86º F) experimenta-
das en farmacias, hospitales y depósitos, y durante el transporte. Siempre que la temperatura cinética media no exceda de 25º,
se permiten elevaciones pasajeras de temperatura no superiores a 40º siempre que no duren más de 24 horas. Sólo se permi-
ten elevaciones superiores a 40º cuando el fabricante así lo instruye.
Los artículos pueden etiquetarse para almacenamiento a "temperatura ambiente controlada" o a "20º-25º", o se puede usar
otra descripción basándose en la temperatura cinética media [ver también Buenas Prácticas de Almacenamiento y Distribución
para Medicamentos <1079), Sistema de Gestión de Calidad, Cálculo de la Temperatura Cinética Media].
574 (659) Requisitos de Envasado y Almacenamiento/ Pruebas Físicas USP 40

Un artículo para el que se indique almac:;enar:niento a Temperatura ambiente controlada puede almacenarse o distribuirse al~
ternativamente en un lugar fresco o refrigerado, a menos que se especifique algo diferente eri la mono.grafía indhridual o en la
etiqueta.
Cálido (tibio): Toda ter:nperatura entre 3Qº y 40°(f!6° y 104~ F).
Calor excesivo: Toda ter:nperatura púr encima de 40º (104º F).
Lugar seco: Sitio con una humedad reli!ltiva próme~io que .ti(> e)(ceda de 40% á 200 (68º F) o de la presión de vapor de agua
equivalente a otras temperaturas. La deterr:nináción puede hacerse por r:nedición directa en el lugar. La deterr:ninación se basa
en nQ menús de 12 medici9nes espa~iadas equitativamente y.reali,zadasya sea durante vna estación del año, durante.un.afio,
o si lús registros los demostrasen; d1;.1rante. el perie)do.de almacenamiento del artículo. Puede t¡aber valores de hasta 45% de
humedad relativa siempre que ~t vialor. pl'.Omedio np exceda .de 4Q%. Se considera almacenamiento en· un Lugar seco .al. alma~
cenamiento de un. Envase que háya sido validado.para proteger al artículo del vapor de agua, incluyendo el almaceflamientp a
granel.
Protección de la congelación: La etiqueta del Envase presentará una instrucción apropiada para proteger el artículo de .la
congelación para casos en los que la congelación expone un artículo a la pérdida de contenido o potencia, o la alteración
destructiva de sus características. Estos riesgos SE!presentan además del riesgo de que el Envase puede romperse si se expone a
temperaturas de. congelación.
Proteger de ta luz: Cu;:indo la luz. pueda o~asíonar la. pérdida dec.ontenido o potencia de un artículo,· o la alteración .destruc-
tiva de sus caraderísti~as1<laetiqueta deJ Envase.indfcl). las.instn.¡cciones apropiadas para proteger al artículo de la ·luz. El artícu•
lo debe envasarse .en un Envas« resistente a la lllz: 4usrr40

(660) ENVASES-VIDRIO

DESCRIPCIÓN

Los envases de vidrio para uso farr:nacéutico están destinados a entrar en contacto directo con los productos farr:nacéuticos.
El vidrio usado para los envases farmacéuticos es de borosilicato (neutro) o de soda, cal y sílice. El vidrio de borosilicato contie-
ne cantidades significativas de óxido bórico, óxido de alur:ninio y óxidos alcalinos y/o alcalino térreos en el entramado vítreo.
Debido a su cor:nposición quír:nica, el vidrio de borosilicato presenta una alta resistencia hidrolítica y una alta resistencia al im-
pacto térr:nico; está clasificado como vidrio Tipo l. El vidrio de soda, cal y sílice es un vidrio de sílice que contiene óxidos de
metales alcalinos, principalr:nente óxido de sodio y óxidos alcalino térreos, principalr:nente óxido de calcio en el entramado ví-
treo. Debido a su composición química, el vidrio de soda, cal y sílice presenta una resistencia hidrolítica moderada; está clasifi-
cado cor:no vidrio Tipo 111. El tratar:niento adecuado de la superficie interna de los envases de vidrio de soda, cal y sílice Tipo 111
aumentará su resistencia hidrolítica de un grado moderado a alto, car:nbiando así la clasificación del vidrio a Tipo 11.
A continuación, se presentan recor:nendaciones con respecto a la aptitud del tipo de vidrio para envases de productos farr:na-
céuticos, basadas en las pruebas de resistencia hidrolítica. Los envases de vidrio Tipo 1 son adecuados para la r:nayoría de los
productos para uso parenteral y no parenteral. Los envases de vidrio Tipo 11 son adecuados para la mayoría de los productos
acuosos ácidos y neutros para uso parenteral y no parenteral. Los envases de vidrio Tipo 11 se pueden usar para productos pa-
renterales alcalinos siempre que se demuestre su aptitud r:nediante datos de estabilidad. Los envases de vidrio Tipo 111 por lo
general no se usan para productos parenterales ni para polvos para uso parenteral, excepto cuando se cuenta con datos de
pruebas de estabilidad adecuados que indican que el vidrio Tipo 111 es satisfactorio.
Se puede tratar la superficie interna de los envases de vidrio para r:nejorar su resistencia hidrolítica. Asir:nismo, se puede tratar
la superficie externa de los envases de vidrio para reducir la fricción o para proteger de la abrasión o rotura. El tratamiento de
la superficie externa se realiza de manera que no contamine la superficie interna del envase.
El capítulo Envases de Vidrio-Evaluación de Ja Durabilidad de Ja Superficie Interna (1660) proporciona inforr:nación sobre la
cor:nposición quír:nica de los tipos de vidrio, la forr:nación de los envases de vidrio y los factores que afectan la durabilidad de la
superficie interna de los envases de vidrio. Este capítulo tar:nbién contiene metodología recor:nendada para evaluar el potencial
que tiene un medicamento para ocasionar la forr:nación de partículas de vidrio y descamación.
El vidrio se puede colorear para que ofrezca protección de la luz mediante la adición de pequeñas cantidades de óxidos de
metales y se analiza según se indica en Transmisión Espectral para Envases de Vidrio Coloreado. Un envase transparente e incolo-
ro que se convierte en un envase resistente a la luz mediante una envoltura opaca (ver el capítulo Requisitos de Envasado y
Almacenamiento (659), Envases Resistentes a la Luz) está exento de los requisitos de transmisión espectral.

PRUEBAS ESPECÍFICAS

La Prueba de Vidrio Granulado en cor:nbinación con la Prueba de Vidrio Superficial para resistencia hidrolítica determina el tipo
de vidrio. La resistencia hidrolítica se deterr:nina por la cantidad de álcali que libera el vidrio en las condiciones especificadas.
Dicha cantidad de álcali es extrer:nadar:nente pequeña en el caso de los vidrios r:nás resistentes, por lo que es muy importante
USP 40 Pruebas Físicas/ (660) Envases-Vidrio 575

prestar la debida atención a todos los detalles de las pruebas y utilizar aparatos de alta calidad y precisión. La utilización de
material de referencia estándar (SRM, por sus siglas en inglés) de vidrio en forma rutinaria al realizar estas pruebas, ayuda a
asegurar la exactitud del método. Los materiales de referencia para vidrio de borosilicato (SRM 623) y vidrio de soda, cal y
sílice (SRM 622) están disponibles en el Instituto Nacional de Normas y Tecnología del gobierno de EE.UU. (National lnstitute
of Standards and Technology, NIST). Estas pruebas deben realizarse en un área relativamente exenta de humos y polvo excesi-
vo. La selección de la prueba se presenta en la Tabla 7 y la Tabla 2.
Tabla 1. Determinación de Tipos de Vidrio
Tipo de Envase Prueba Propósito
Prueba de Vidrio Distingue el vidrio de borosilicato Tipo 1del vi-
1, 11, 111 Granulado drio de soda, cal y sílice Tipos 11 y 111

La superficie interna de los envases de vidrio es la superficie de contacto para las preparaciones farmacéuticas, y la calidad de
esta superficie se determina mediante la Prueba de Vidrio Superficial para resistencia hidrolítica. La Prueba de Atacado de Superfi-
cie se puede usar para determinar si la alta resistencia hidrolítica se debe a la composición química o al tratamiento de la super-
ficie. Como alternativa, la comparación de los datos de la Prueba de Vidrio Granulado y la Prueba de Vidrio Superficial se puede
usar en la Tabla 2.
Tabla 2. Determinación de la Resistencia Hidrolítica
de la Superficie Interna
Tipo de Envase Prueba Propósito
Determina la resistencia hidrolítica de la superfi-
cie interna; distingue entre envases Tipo I y Ti-
Prueba de Vidrio po 11 con alta resistencia hidrolítica, y envases
1, 11, 111 Superficial Tipo fil con resistencia hidrolítica moderada
Cuando resulta necesario, determina si la alta
Prueba de Atacado de Superficie o comparación de resistencia hidrolítica se debe al tratamiento de
los datos de la Prueba de Vidrio Granulado y la la superficie interna o a la composición quími-
1, 11 Prueba de Vidrio Superficial ca de los envases de vidrio

Los envases de vidrio deben cumplir con sus especificaciones respectivas de identidad y resistencia hidrolítica superficial para
ser clasificados como vidrio Tipo 1, 11 o 111. Los envases Tipo 1 o Tipo 11 para productos parenterales acuosos se analizan para
determinar la presencia de arsénico extraíble.

Resistencia Hidrolítica

APARATO

Autoclave: Para estas pruebas, usar un autoclave capaz de mantener una temperatura de 121 ± 1º, equipado con un termó-
metro, o un termopar calibrado que permita una medición de la temperatura independente del sistema de autoclave; un regis-
trador adecuado; un manómetro, una válvula de ventilación y una bandeja con suficiente capacidad para acomodar el número
de envases requeridos para llevar a cabo la prueba por encima del nivel del agua. Limpiar el autoclave y demás aparatos minu-
ciosamente con Agua Purificada antes de usar.
Mortero y mano de mortero: Usar un mortero y una mano de mortero de acero endurecido, construidos de acuerdo con
las especificaciones de la Figura 7.
576 (660) Envases-Vidrio/ Pruebas Físicas USP 40

40

c/¡48
cp50

35
60

cp75
Figura 1. Mortero y mano de mortero para pulverizar vidrio.

Otros aparatos: También se requiere un juego de tres tamices enmarcados, de malla cuadrangular de acero inoxidable Nº
25, 40 y 50, según la numeración de EE.UU. (ver Estimación de Ja Distribución del Tamaño de Partícula por Tamizado Analítico
(786), Tabla 1. Tamaños de las Series de Tamices Estándar según el Intervalo de Interés); un agitador mecánico para tamices o
una máquina de tamizado que pueda usarse para tamizar los granos; un martillo magnético de acero templado; un imán per-
manente; frascos de pesada; tapones; lámina metálica (p.ej. aluminio, acero inoxidable); un horno de aire caliente con capaci-
dad de mantener una temperatura de 140 ± 5º; una balanza capaz de pesar hasta 500 g con una exactitud de 0,005 g; un
desecador y un baño ultrasónico.

REACTIVOS

Agua exenta de dióxido de carbono: Se trata de Agua Purificada que se ha calentado a ebullición vigorosa durante 5 minu-
tos o más y se ha dejado enfriar protegiéndola de la absorción de dióxido de carbono de la atmósfera, o Agua Purificada con
una resistividad no menor de 18 Mohm-cm.
Solución de rojo de metilo: Disolver 50 mg de rojo de metilo en 1,86 mL de hidróxido de sodio O, 1 M y 50 mL de etanol
(96%), y diluir con Agua Purificada hasta 100 ml. Para analizar la sensibilidad, agregar 100 mL de agua exenta de dióxido de
carbono y 0,05 mL de ácido clorhídrico 0,02 M a O, 1 mL de la solución de rojo de metilo. La solución resultante debe ser roja.
No se requieren más de O, 1 mL de hidróxido de sodio 0,02 M para cambiar el color a amarillo. El cambio de color de rojo a
amarillo corresponde a un cambio en el pH de 4,4 (rojo) a 6,0 (amarillo).

Prueba de Vidrio Granulado

La Prueba de Vidrio Granulado se puede realizar sobre los envases o sobre las cañas que se usan para fabricar envases tubula-
res de vidrio.

PREPARACIÓN DE LA MUESTRA

Enjuagar los envases a analizar con Agua Purificada y secar en el horno. Envolver al menos tres de los artículos de vidrio en
papel limpio y triturar hasta obtener dos muestras de aproximadamente 100 g cada una en trozos con un tamaño de no más
de 30 mm. Colocar en el mortero 30-40 g de las piezas con un tamaño de entre 1 O y 30 mm tomadas de una de las muestras,
insertar la mano del mortero y golpearla firmemente con el martillo una sola vez. Como alternativa, transferir las muestras a un
molino de bolas, agregar las bolas y triturar el vidrio. Transferir el contenido del mortero o del molino de bolas al tamiz más
grueso (Nº 25) de los tamices. Repetir la operación hasta que todos los fragmentos hayan sido transferidos al tamiz. Agitar
manualmente los tamices durante un periodo breve y retirar el vidrio remanente en los tamices Nº 25 y Nº 40. Triturar de
nuevo estas porciones, repitiendo la operación hasta que queden aproximadamente 1Og de vidrio en el tamiz Nº 25. Dese-
char esta porción y la porción que pase a través del tamiz Nº 50. Volver a montar los tamices y agitar durante 5 minutos.
Transferir a un frasco de pesada los granos de vidrio que pasaron a través del tamiz Nº 40 y que quedaron retenidos en el
tamiz Nº 50. Repetir el procedimiento de triturado y tamizado con la segunda muestra de vidrio hasta obtener dos muestras
de granos, cada una con un peso mayor de 1O g.
USP 40 Pruebas Físicas/ (660) Envases-Vidrio 577

Extender cada muestra sobre una pieza de papel satinado limpio y extraer las partículas de hierro pasándo el imán sobre
ellas. Transferir cada muestra a un vaso de precipitados para limpiarlas. Agregar 30 ml de acetona a los granos en cada vaso
de precipitados y frotar los granos usando medios adecuados, como por ejemplo, una varilla de vidrio con punta de goma o
recubierta de plástico. Después de frotar los granos, dejar que sedimenten y decantar la mayor cantidad de acetona posible.
Agregar 30 ml adicionales de acetona, agitar por rotación suave, decantar y agregar una nueva porción de acetona. Llenar el
vaso del baño ultrasónico con agua a temperatura ambiente, luego colocar el vaso de precipitados en la gradilla y sumergirlo
hasta que el nivel de acetona esté al mismo nivel que el agua; aplicar ultrasonido durante 1 minuto. Agitar por rotación suave
el vaso de precipitados, dejar que sedimente y decantar la mayor cantidad de acetona posible; luego repetir la operación de
limpieza ultrasónica. Si persiste una leve turbidez, repetir la limpieza ultrasónica y el lavado con acetona hasta que la solución
permanezca transparente. Agitar por rotación suave y decantar la acetona. Secar los granos colocando el vaso de precipitados
primero sobre una placa tibia y luego calentando a 140º durante 20 minutos en un horno de secado. Transferir los granos
secos de cada vaso de precipitados a sendos frascos de pesada, tapar y enfriar en un desecador.

MÉTODO

Llenado y calentamiento: Pesar 10,00 g de los granos limpios y secos en dos matraces Erlenmeyer diferentes. Pipetear y
transferir 50 ml de Agua Purificada exenta de dióxido de carbono a cada uno de los matraces Erlenmeyer (soluciones de prue-
ba). Pipetear y transferir 50 ml de Agua Purificada exenta de dióxido de carbono a un tercer matraz Erlenmeyer que servirá
como blanco. Distribuir los granos de manera uniforme sobre las bases planas de los matraces agitando suavemente. Cubrir los
matraces con placas de vidrio neutro o papel aluminio enjuagados con Agua Purificada o con vasos de precipitados invertidos
de modo tal que las superficies internas de los vasos de precipitados se ajusten fácilmente a los bordes superiores de los matra-
ces. Colocar los tres matraces en el autoclave que contiene el agua a temperatura ambiente y asegurar que se mantengan suje-
tos por encima del nivel del agua en el vaso. Realizar las siguientes operaciones:
1. Insertar el extremo de un dispositivo termométrico calibrado en un envase lleno a través de un agujero de aproximada-
mente el diámetro del termopar y conectarlo a un dispositivo de medición externo. Si el envase es demasiado pequeño
para insertar un termopar, aplicar un termopar en un envase similar adecuado. Como alternativa, usar el termómetro in-
terno del autoclave.
2. Cerrar firmemente la puerta o la tapa del autoclave, dejando la válvula de venteo abierta.
3. Iniciar el registro automático de la temperatura en función del tiempo y calentar el autoclave a una velocidad regular tal
que se libere vapor vigorosamente por la válvula de venteo después de 20-30 minutos, y se mantenga la liberación vigo-
rosa de vapor durante 1O minutos adicionales. Para los autoclaves que usan un generador de vapor, no es necesario man-
tener la temperatura durante 1O minutos a 100º.
4. Cerrar la válvula de venteo y aumentar la temperatura de 100º a 121 ºa una velocidad de 1º /min durante 20-22 minutos.
5. Mantener la temperatura a 121 ± 1º durante 30 ± 1 minutos, desde el momento en que se alcanza la temperatura de es-
pera.
6. Enfriar hasta 100º a una velocidad de 0,5º /min, ventilando para evitar la formación de vacío, durante 40-44 minutos.
7. No abrir el autoclave hasta que se haya enfriado hasta 95º.
8. Retirar las muestras calientes del autoclave tomando las precauciones de seguridad apropiadas y enfriar las muestras con
cuidado a temperatura ambiente durante 30 minutos, evitando el impacto térmico.
Valoración: Agregar 0,05 ml de Solución de rojo de metilo a cada uno de los tres matraces. Valorar la solución blanco inme-
diatamente con ácido clorhídrico 0,02 M, luego valorar las soluciones de prueba hasta que el color sea idéntico al obtenido
con la solución blanco. Restar el volumen de valoración para la solución blanco del volumen de valoración de las soluciones de
prueba. Calcular el valor medio de los resultados, en ml, de ácido clorhídrico 0,02 M por gramo de la muestra. Repetir la
prueba si los valores más altos y más bajos observados difieren en más del intervalo permisible provisto en la Tabla 3.
Tabla 3. Intervalo Permisible de los Valores Obtenidos
Media de los Valores Obtenidos para el Consumo de Solución de Ácido
Clorhídrico por gramo de Granos de Vidrio (ml/g) Intervalo Permisible de los Valores Obtenidos
No más de O, 1O 25% de la media
0,10-0,20 20% de la media
No menos de 0,20 10% de la media

[NOTA-Cuando se necesite obtener un punto final bien definido, decantar la solución transparente en un matraz diferente
de 250 ml. Enjuagar los granos agitando por rotación suave con tres porciones de 15 ml de agua exenta de dióxido de carbo-
no y agregar los lavados a la solución principal. Agregar 0,05 ml de la Solución de rojo de metilo. Valorar y calcular según se
indicó anteriormente. En este caso, agregar también 45 ml de Agua Purificada exenta de dióxido de carbono y 0,05 ml de
Solución de rojo de metilo a la solución blanco.]

LÍMITES

El volumen no excede los valores indicados en la Tabla 4.

578 (660) Envases-Vidrio/ Pruebas Físicas USP 40

Tabla 4. Límites de Prueba para la Prueba de Vidrio Granulado

Volumen Máximo de HCI 0,02 M por g de Vidrio de Prueba (ml)
Volumen de Llenado (ml) Tipol 1 Tipos 11 y 111
Todos 0,1 1 0,85

Prueba de Vidrio Superficial

DETERMINACIÓN DEL VOLUMEN DE LLENADO

El volumen de llenado es el volumen de Agua Purificada que se debe agregar al envase para los fines de la prueba. Para
viales, frascos, cartuchos y jeringas, el volumen de llenado es 90% de la capacidad de desbordamiento. Para ampollas, se refie-
re al volumen hasta la altura del hombro.
Viales y frascos: Seleccionar seis viales o frascos secos del lote de muestra, o tres si su capacidad excede de 100 mL, y elimi-
nar toda suciedad o residuo. Pesar los envases vacíos con una exactitud de O, 1 g. Colocar los envases sobre una superficie
horizontal y llenarlos con Agua Purificada hasta aproximadamente el borde superior, evitando el desbordamiento y la introduc-
ción de burbujas de aire. Ajustar los niveles de líquido hasta la línea de desbordamiento. Pesar los envases llenos para obtener
la masa de agua expresada con dos decimales para envases con un volumen nominal menor o igual a 30 mL, y expresada con
un decimal para envases con un volumen nominal mayor de 30 ml. Calcular el valor medio de la capacidad de desbordamien-
to en mL y multiplicarlo por 0,9. Este volumen, expresado con un decimal, es el volumen de llenado para el lote de envases
particular.
Cartuchos y jeringas: Seleccionar seis jeringas o cartuchos secos y sellar la pequeña abertura (la boca de los cartuchos; el
cierre Luer o la aguja insertada de las jeringas), usando un material inerte. Determinar la capacidad de desbordamiento media
y el volumen de llenado de acuerdo con Viales y frascos.
Ampollas: Colocar al menos seis ampollas secas sobre una superficie horizontal plana y llenarlas con Agua Purificada usando
una bureta hasta que el agua alcance el punto A, donde el cuerpo de la ampolla comienza a estrecharse para formar el hom-
bro de la ampolla (ver la Figura 2). Leer las capacidades, expresadas con dos decimales y calcular el valor medio. Este volumen,
expresado con un decimal, es el volumen de llenado para el lote de ampollas particular. El volumen de llenado se puede deter-
minar también por peso.

Figura 2. Volúmenes de llenado de ampollas hasta el punto A.

PRUEBA

La determinación se lleva a cabo en envases sin usar. Los volúmenes de la solución de prueba requeridos para la determina-
ción final se presentan en la Tabla 5.
Tabla 5. Volumen de Solución de Prueba y
Número de Valoraciones
Volumen de Solución de Prueba
Volumen de Llenado para Una Valoración
(ml) (ml) Número de Valoraciones
No más de 3 25,0 1
3-30 50,0 2
30-100 100,0 2
No menos de 100 100,0 3
USP 40 Pruebas Físicas/ (660) Envases-Vidrio 579

MÉTODO

Limpieza: Eliminar cualquier residuo o polvo. Poco antes de la prueba, enjuagar cada envase cuidadosamente al menos dos
veces con Agua Purificada, llenar con Agua Purificada y dejar en reposo hasta su análisis. Inmediatamente antes del análisis,
vaciar los envases; enjuagarlos una vez con Agua Purificada, luego con agua exenta de dióxido de carbono y dejar que escu-
rran. Completar el procedimiento de limpieza dentro de los 20-30 minutos desde el momento del primer enjuage. Las ampo-
llas cerradas se pueden entibiar en un baño de agua o en una estufa de aire a no más de 40º durante aproximadamente 2
minutos antes de abrirlas para evitar el aumento de presión en el envase. No enjuagar antes de analizar.
Llenado y calentamiento: Llenar los envases con agua exenta de dióxido de carbono hasta el volumen de llenado. Cerrar los
envases en forma de cartucho o jeringas prellenables de manera adecuada con material que no interfiera con la prueba. Se
debe cerrar holgadamente cada envase, incluidas las ampollas, con un material inerte, como por ejemplo, una tapa de vidrio
neutro o papel aluminio previamente enjuagados con Agua Purificada. Colocar los envases en la bandeja del autoclave, el cual
contiene una cantidad de agua tal que la bandeja permanece por encima del agua. Cerrar el autoclave y realizar los pasos 1-8
del procedimiento de autoclavado según se indica en la Prueba de Vidrio Granulado, excepto que la temperatura debe mante-
nerse a 121 ± 1ºdurante 60 ± 1 minutos. Si se usa un baño de agua para enfriar las muestras, procurar que el agua no entre en
contacto con las cubiertas de papel aluminio que las cubren sin ajustar, para evitar la contaminación de la solución de extrac-
ción. Las soluciones de extracción se analizan valorando de acuerdo con el método descrito a continuación.
Valoración: Llevar a cabo la valoración dentro de la primera hora después de retirar los envases del autoclave. Combinar los
líquidos obtenidos de los envases y mezclar. Introducir el volumen prescrito (ver la Tabla 5) en un matraz Erlenmeyer. Transfe-
rir el mismo volumen de agua exenta de dióxido de carbono a un segundo matraz similar para usarlo como blanco. Agregar a
cada matraz 0,05 mL de Solución de rojo de metilo por cada 25 mL de líquido. Valorar el blanco con ácido clorhídrico 0,01 M.
Valorar la solución de prueba con el mismo ácido hasta que el color de la solución resultante sea igual que el obtenido para el
blanco. Restar el valor encontrado para la valoración con el blanco, del encontrado para la solución de prueba y expresar los
resultados en mL de ácido clorhídrico 0,01 M por 100 mL de solución de prueba. Expresar los valores de la valoración menores
de 1,0 mL con dos decimales; expresar los valores de la valoración mayores o iguales a 1,0 mL con un decimal.

LÍMITES

Los resultados, o el promedio de los resultados si se realiza más de una valoración, no exceden los valores declarados en la
Tabla 6.
Tabla 6. Valores Límite para la Prueba de Vidrio Superficial
Volumen Máximo de HCI 0,01 M por 100 ml de Solución de Prueba
Volumen de Llenado (ml)
(ml) Tipos 1y11 Tipolll
No más de 1 2,0 20,0
1-2 1,8 17,6
2-3 1,6 16, 1
3-5 1,3 13,2
5-10 1,0 10,2
10-20 0,80 8, 1
20-50 0,60 6, 1
50-100 0,50 4,8
100-200 0,40 3,8
200-500 0,30 2,9
No menos de 500 0,20 2,2

Prueba de Atacado de Superficie

La Prueba de Atacado de Superficie se usa de manera adicional a la Prueba de Vidrio Superficial cuando es necesario determinar
si se ha tratado la superficie de un envase y/o para distinguir entre envases de vidrio Tipo 1y Tipo 11. Como alternativa, se
puede usar la Prueba de Vidrio Granulado y la Prueba de Vidrio Superficial. La Prueba de Atacado de Superficie puede realizarse con
muestras sin usar o con muestras usadas en la Prueba de Vidrio Superficial.

MÉTODO

Viales y frascos: Los volúmenes de solución de prueba requeridos se presentan en la Tabla 5. Enjuagar los envases dos veces
con Agua Purificada, llenar hasta el punto de desbordamiento con una mezcla de un volumen de ácido fluorhídrico y nueve
volúmenes de ácido clorhídrico, y dejar en reposo durante 1O minutos. Vaciar los envases y enjuagar cuidadosamente cinco
580 (660) Envases-Vidrio/ Pruebas Físicas USP 40

veces con Agua Purificada. Inmediatamente antes de la prueba, enjuagar una vez más con Agua Purificada. Someter estos en-
vases al mismo procedimiento de esterilización en autoclave y determinación según se indica en la Prueba de Vidrio Superficial.
Si los resultados son considerablemente más altos que los obtenidos de las superficies originales (por un factor de aproximada-
mente 5-1 O), significa que la superficie de las muestras ha sido tratada. [Precaución-El ácido fluorhídrico es extremadamente
agresivo. Incluso en cantidades pequeñas puede ocasionar lesiones que ponen en riesgo la vida.]
Ampollas, cartuchos y jeringas: Aplicar el método de prueba según se indica en Viales y frascos. Si la superficie de las ampo-
llas, cartuchos y jeringas no ha sido tratada, entonces los valores obtenidos serán ligeramente más bajos que los obtenidos en
las pruebas previas. [NOTA-La superficie interna de las ampollas, cartuchos y jeringas fabricadas con tubos de vidrio Tipo 1
normalmente no se somete a tratamiento.]

DISTINCIÓN ENTRE ENVASES DE VIDRIO TIPO 1 Y TIPO 11

Los resultados obtenidos de la Prueba de Atacado de Superficie se comparan con los obtenidos de la Prueba de Vidrio Superfi-
cial. Para envases de vidrio Tipo 1, los valores obtenidos son cercanos a los obtenidos en la Prueba de Vidrio Superficial. Para
envases de vidrio Tipo 11, los valores obtenidos exceden en gran medida a los obtenidos en la Prueba de Vidrio Superficial; y son
similares pero no mayores que los obtenidos para envases de vidrio Tipo 111 con el mismo volumen de llenado.

IMPUREZAS

Arsénico (211)

Usar como Preparación de Prueba 35 mL de agua de un envase de vidrio Tipo 1o Tipo 11, o para envases más pequeños, 35
mL del contenido combinado de varios envases de vidrio Tipo 1 o Tipo 11, preparados según se indica en la Prueba de Vidrio
Superficial. El límite no excede de O, 1 µg/g.

FUNCIONALIDAD

Transmisión Espectral para Envases de Vidrio Coloreado

APARATO

Un espectrofotómetro UV-Vis, equipado con un detector de fotodiodos o un tubo fotomultiplicador acoplado con una esfera
de integración.

PREPARACIÓN DE LA MUESTRA

Romper el envase de vidrio o cortarlo con una sierra circular equipada con un disco abrasivo en húmedo, como por ejemplo,
un disco de carborundo o diamante. Seleccionar las secciones representativas del espesor de la pared y cortarlas de un tamaño
adecuado para montarlas en un espectrofotómetro. Después de cortar, lavar y secar cada muestra, procurando no rayar las
superficies. Si la muestra es demasiado pequeña para cubrir la abertura del portamuestras, cubrir la porción descubierta de la
abertura con cinta o papel opaco, siempre que la longitud de la muestra sea mayor que la de la abertura. Antes de colocar en
el portamuestras, lavar, secar y limpiar la muestra con un paño para lentes. Montar la muestra con ayuda de cera u otros me-
dios adecuados, procurando no dejar huellas dactilares u otras marcas.

MÉTODO

Colocar la muestra en el espectrofotómetro con su eje cilíndrico paralelo a la abertura y de tal manera que el haz de luz sea
perpendicular a la superficie de la sección y que las pérdidas por reflexión sean mínimas. Medir la transmisión de la muestra
con respecto al aire en la región espectral 290-450 nm, de manera continua o en intervalos de 20 nm.

LÍMITES

La transmisión espectral observada para envases de vidrio coloreado para productos no parenterales no excede del 10% a
cualquier longitud de onda en el intervalo 290-450 nm, independientemente del tipo y capacidad del envase de vidrio. La
transmisión espectral observada en los envases de vidrio coloreado para productos parenterales no excede los límites provistos
en la Tabla 1.
USP 40 Pruebas Físicas/ (661) Sistemas de Envases Plásticos 581

Tabla 7. Límites de Transmisión Espectral para Envases de Vidrio Coloreado para Productos Parenterales
Percentaje Máximo de Transmisión Espectral a Cualquier Longitud de Onda entre
Volumen Nominal 290 nm y 450 nm
(mL) Envases Sellados a la Llama Envases con Cierres
No más de 1 50 25
1-2 45 20
2-5 40 15
5-10 35 13
10-20 30 12
No menos de 20 25 10

(661 >SISTEMAS DE ENVASES PLÁSTICOS Y SUS MATERIALES DE

CONSTRUCCIÓN

INTRODUCCIÓN

El capítulo Requisitos de Envasado y Almacenamiento (659) considera y define los sistemas, y sus materiales y componentes de
construcción asociados, que se usan para envasar productos terapéuticos (farmacéuticos, productos biológicos, suplementos
dietéticos y dispositivos). Dichos sistemas pueden construirse con materiales y componentes plásticos. Los plásticos usados en
los sistemas de envases están compuestos por polímeros homólogos con una variedad de pesos moleculares y contienen aditi-
vos tales como antioxidantes, estabilizantes, lubricantes, plastificantes, colorantes, entre otros. La naturaleza y la cantidad de
aditivos en los plásticos usados para los sistemas de envases son dictadas por el tipo de polímero, el uso del polímero y el pro-
ceso usado para convertir el polímero en componentes, envases o sistemas de envase.
Los productos terapéuticos entran en contacto directo con los sistemas de envases y sus materiales plásticos de construcción
a medida que el producto es fabricado, almacenado y administrado. Dicho contacto puede resultar en una interacción entre
los productos terapéuticos y los sistemas de envase y sus materiales o componentes de construcción. Estas interacciones deben
ser de tal manera que la aptitud de uso (incluyendo su seguridad y eficacia) del producto terapéutico y de los sistemas de
envases no se vea afectada de manera adversa por la interacción. Aunque la aptitud de uso incluye varios aspectos relaciona-
dos con la calidad del medicamento envasado y su desempeño, la aptitud de uso tratada en este capítulo es la seguridad del
paciente. La obtención de un resultado necesario y deseable se facilita mediante el uso de materiales plásticos de construcción
bien caracterizados en componentes, envases y sistemas de envases, y mediante el análisis apropiado de los sistemas de enva-
se.

ALCANCE

El establecimiento de la aptitud de sistemas de envases plásticos para productos terapéuticos implica múltiples pruebas y
procedimientos de análisis, tal como se describe brevemente a continuación:
• Evaluación del material: Caracterización de los materiales de construcción de un sistema de envase para evaluar los ingre-
dientes como posibles sustancias extraíbles y potenciales sustancias lixiviables. Dicha caracterización facilita la identifica-
ción de materiales que son adecuados para su uso en sistemas de envases.
• Estudio de extracción controlada (simulación): Estudio de extracción controlada (simulación) en las condiciones más exi-
gentes para determinar el grado en el que las sustancias extraíbles pueden convertirse en probables sustancias lixiviables
(para información adicional, ver el capítulo Evaluación de Sustancias Extraíbles Relacionadas con Envases Farmacéuticos y Sis-
temas de Administración (1663)).
• Evaluación del producto: Medición en circunstancias reales de las sustancias lixiviables confirmadas en el producto tera-
péutico en el envase farmacéutico y el sistema de administración destinado para la comercialización (para información
adicional, ver el capítulo Evaluación de Sustancias Lixiviables en Medicamentos Relacionadas con Envases Farmacéuticos y Sis-
temas de Administración (1664)).
Además, la información provista por el proveedor de los sistemas de envase plásticos y sus materiales relacionados o compo-
nentes de construcción pueden facilitar las evaluaciones de aptitud, puesto que dicha información puede representar adiciones
apropiadas o sustitutos de los resultados obtenidos al realizar las pruebas citadas anteriormente.
El proceso de fabricación de un producto terapéutico envasado es complejo. Considerando específicamente el sistema de
envase, los sistemas de envases por lo regular constan de componentes que se fabrican de manera individual a partir de mate-
riales plásticos de construcción. Estos materiales plásticos de construcción individuales inicialmente se generan a partir de reac-
tivos que se hacen reaccionar para producir un polímero base, que posteriormente se mezcla con diversos aditivos para produ-
cir una resina base. Las resinas base individuales son por sí mismos materiales de construcción o pueden combinarse con aditi-
582 (661) Sistemas de Envases Plásticos/ Pruebas Físicas USP 40

vos adicionales y coadyuvantes de procesamiento para formar un material plástico de construcción. El análisis de estos materia-
les plásticos de construcción para establecer que han sido bien caracterizados y que son adecuados para su uso, específica-
mente considerando la seguridad, en sistemas de envases está dentro del alcance de esta serie de capítulos y se trata en el
capítulo Materiales Plásticos de Construcción (661.1 ).
Los materiales plásticos de construcción individuales se combinan para formar componentes del sistema de envase. El siste-
ma de envase se completa ensamblando sus diversos componentes para obtener la forma final. El análisis de los sistemas de
envase para establecer que son adecuados para sus usos pretendidos, específicamente en lo que concierne a la seguridad, está
dentro del alcance de esta serie de capítulos y se trata en el capítulo Sistemas de Envases Plásticos para Uso Farmacéutico
(661.2).
Los sistemas de envases ensamblados se llenan con el producto terapéutico mediante diversos métodos y en varios puntos
en el proceso de fabricación del sistema de envase, con lo que se genera el producto terapéutico envasado. El análisis de los
productos terapéuticos envasados para establecer que son adecuados para su uso pretendido se trata en las monografías far-
macopeicas pertinentes al producto terapéutico específico y está fuera del alcance de esta serie de capítulos.
Para mayor información sobre el alcance, la aplicabilidad y otros temas relacionados con el conjunto de capítulos generales
(661 ), ver el capítulo Evaluación de Sistemas de Envases Plásticos y sus Materiales de Construcción con Respecto a su Impacto sobre
la Seguridad del Usuario (1661 ).

(661.1) MATERIALES PLÁSTICOS DE CONSTRUCCIÓN

INTRODUCCIÓN

El uso de materiales bien caracterizados para construir sistemas de envases es una de las principales formas para asegurar
que el sistema de envase sea apto para su uso previsto. Los materiales se caracterizan de modo tal que sus propiedades y ca-
racterísticas puedan coincidir con los requisitos del sistema de envase, con lo que se facilita la selección intencional de materia-
les apropiados. Para los propósitos de este capítulo, se considera que un material plástico de construcción está bien caracteri-
zado para su uso previsto si se han establecido de manera adecuada las siguientes características: su identidad, biocompatibili-
dad (reactividad biológica), propiedades fisicoquímicas generales y composición (es decir, aditivos y metales extraíbles que pu-
dieran estar presentes).
Establecer el efecto potencial que tiene un material de construcción sobre la seguridad no puede basarse en una sola estrate-
gia de análisis individual, debido a que una sola estrategia de análisis no puede abarcar todos los atributos del material que
pueden tener un impacto potencial sobre la seguridad. El análisis químico prescrito en el capítulo es ortogonal en el sentido de
que las secciones de Pruebas Fisicoquímicas proveen una perspectiva general de las sustancias extraídas, las secciones Metales
Extraíbles tratan las fuentes potenciales de impurezas elementales; y la información provista por las pruebas de Aditivos Plásticos
tratan las potenciales sustancias extraíbles orgánicas. Debido a que el análisis químico por sí solo puede no ser adecuado para
establecer la aptitud de uso de un material, el análisis químico se complementa con el enfoque ortogonal de establecer la reac-
tividad biológica.

ALCANCE

El propósito de este capítulo es proveer métodos y especificaciones de prueba para materiales plásticos de construcción usa-
dos en sistemas de envases. Este capítulo se aplica únicamente a materiales plásticos individuales y no debe aplicarse a sistemas
de envases o componentes que consten de múltiples materiales plásticos individuales. El análisis y la calificación de los sistemas
de envases plásticos y sus componentes para uso farmacéutico se tratan en el capítulo Sistemas de Envases Plásticos para Uso
Farmacéutico (661.2).
Este capítulo contiene pruebas, métodos y especificaciones para los siguientes materiales: olefinas cíclicas, polietileno, poli-
propileno, tereftalato de polietileno, tereftalato G de polietileno y cloruro de polivinilo plastificado. Se pueden usar otros mate-
riales plásticos en los sistemas de envases si se establece su aptitud de uso mediante análisis consistentes con los procedimien-
tos y especificaciones generales provistos en este capítulo para los materiales mencionados previamente. Como alternativa, los
materiales plásticos individuales de construcción se consideran bien caracterizados y apropiados para su uso siempre que se
utilicen en un sistema de envase que cumpla con los requisitos del capítulo (661.2) o si el sistema de envase ha sido considera-
do apropiado para uso farmacéutico por la autoridad reglamentaria apropiada. Dicha conclusión sólo es válida para el sistema
de envase específico que cumple con los requisitos del capítulo (661.2) y no puede extenderse a otros sistemas de envases
usando el mismo material (o materiales) de construcción. Si se usa el mismo material de construcción en otro sistema de enva-
se, entonces se deberá establecer su aptitud de uso en dicho sistema de envase.
Debido a la amplia variedad de materiales y sistemas de envases disponibles, y al potencial de nuevos desarrollos en el cam-
po de materiales y sistemas de envases, es posible que los sistemas de envases se construyan con materiales no abordados
específicamente en este capítulo. Los materiales de construcción que no se tratan específicamente en este capítulo se denomi-
USP 40 Pruebas Físicas/ (661.1) Materiales Plásticos de Construcción 583

nan "materiales no abordados". Para que un material no abordado pueda considerarse en cumplimiento con este capítulo,
deberá ser caracterizado usando métodos que sean comparables a los usados para los materiales indicados en este capítulo.
Específicamente, el material de construcción no abordado debe ser identificado mediante metodología apropiada y analizado
con respecto a la biocompatibilidad, propiedades fisicoquímicas, aditivos y metales extraídos relevantes.
Se deben establecer especificaciones para los materiales no abordados, las cuales deberán ser uniformes con las especifica-
ciones para los materiales tratados en este capítulo. Por ejemplo, los materiales no abordados cuyos extractos acuosos se so-
metan al análisis de niveles de carbono orgánico total deberán tener especificaciones para carbono orgánico total que sean
uniformes con las especificaciones en cuestión para los materiales tratados en este capítulo. Como alternativa, los materiales no
abordados pueden, en circunstancias justificadas, cumplir con otras especificaciones, siempre que así lo autorice la autoridad
reglamentaria apropiada.
Los métodos de prueba de este capítulo son apropiados para su propósito, tal como lo demuestra su uso bien establecido y,
por consiguiente, reflejan prácticas aceptables. Sin embargo, otros métodos y procedimientos pueden ser igualmente adecua-
dos. Por lo tanto, se pueden usar métodos y procedimientos de prueba alternativos aunque deben ser adecuados, validados y
equivalentes o mejores que los métodos farmacopeicos.
La Tabla 1 provee guías sobre la aplicación apropiada de las pruebas químicas y las pruebas de reactividad biológica para
formas farmacéuticas orales y tópicas, las cuales incluyen tabletas orales, cápsulas de gelatina blanda y dura orales, polvos ora-
les, soluciones y suspensiones, polvos tópicos y soluciones y suspensiones tópicas acuosas. La Tabla 2 provee guías sobre la
aplicación apropiada de las pruebas químicas y las pruebas de reactividad biológica para todas las demás formas farmacéuti-
cas. [NOTA-Para medicamentos orales acuosos que contienen codisolventes (o si, por alguna razón, se puede esperar la ex-
tracción de cantidades mayores de sustancias derivadas de los componentes plásticos de los envases que de agua), podría ser
necesaria información adicional sobre sustancias extraíbles para tratar problemas de seguridad. Si se requiere información adi-
cional, realizar las pruebas de Metales Extraíbles y de Aditivos Plásticos según se indica en la Tabla 2.]
Tabla 1. Guías para la Aplicación de Pruebas para Formas Farmacéuticas Orales y Tópicas
Pruebas de Reactividad Biológica Pruebas Químicas
• Realizar las pruebas de Identificación, Fisicoquímicas y de Metales Ex-
traíbles
• Proveer referencias apropiadas a las reglamentaciones sobre lndi-
rect Food Additive (Aditivos Alimentarios Indirectos) en el Título 21
del CFR 1 74-186, específicamente a aquellas que tratan los crite-
• Realizar las Pruebas de Reactividad Biológica, In Vitro (87) ríos de pureza y las limitaciones con respecto al uso
• Los materiales que cumplan con los requisitos de esta prueba no • Los materiales que no cumplen con estos requisitos no son adecua-
requieren ser sometidos a las pruebas descritas en el capítulo Prue- dos para el envasado de estas formas farmacéuticas a menos que
bas de Reactividad Biológica, In Vivo (88) se establezca que el material es adecuado mediante otros medios
• Los materiales que no cumplan con los requisitos de la prueba in previamente aprobados por una autoridad reglamentaria apropia-
vitro no son adecuados para estas formas farmacéuticas da

Tabla 2. Guías para la Aplicación de Pruebas para Todas las Demás Formas Farmacéuticas
Pruebas de Reactividad Biológica Pruebas Químicas
• Realizar las Pruebas de Reactividad Biológica, In Vitro (87) • Realizar las pruebas de Identificación, Fisicoquímicas, de Metales Ex-
• Realizar las Pruebas de Reactividad Biológica, In Vivo (88) para obte- traíbles y de Aditivos Plásticos
ner la Clasificación de Plásticos apropiada • Los materiales que no cumplen con estos requisitos no son adecua-
• Los materiales que no cumplen con los requisitos de la prueba in dos para envases de estas formas farmacéuticas a menos que se es-
vivo o in vitro no son adecuados para envases de estas formas far- tablezca que el material es adecuado mediante otros medios pre-
macéuticas viamente aprobados por una autoridad reglamentaria apropiada

ESPECIFICACIONES

Polietileno

IDENTIFICACIÓN

Polietileno de baja densidad

Espectrofotometría en el infrarrojo-Determinar el espectro infrarrojo desde 3800 cm-1 hasta 650 cm-1 (2,6-15 µm). La muestra
presenta un espectro de absorción que es sustancialmente equivalente al del ER Polietileno de Baja Densidad USP. La equiva-
lencia sustancial, al contrario de la exacta, permite diferencias espectrales menores que surgen de la variación natural de la
composición y/o física entre polímeros de esta clase. La equivalencia sustancial se logra cuando todas las diferencias entre los
espectros de la muestra y del Estándar de Referencia pueden ser explicadas en el contexto de dichas variaciones naturales de la
composición y/o físicas.
Calorimetría de barrido diferencial-El termograma de la muestra es similar al termograma del ER Polietileno de Baja Densidad
USP y la temperatura de transición (T9 ) obtenida a partir del termograma de la muestra no difiere de aquella del Estándar de
Referencia en más de 8,0º.
584 (661.1) Materiales Plásticos de Construcción / Pruebas Físicas USP 40

Polietileno de alta densidad

Espectrofotometría en el Infrarrojo-Determinar el espectro infrarrojo desde 3800 cm- 1 hasta 650 cm- 1 (2,6-15 µm). La muestra
presenta un espectro de absorción que es sustancialmente equivalente al del ER Polietileno de Alta Densidad USP. La equiva-
lencia sustancial, al contrario de la exacta, permite diferencias espectrales menores que surgen de la variación natural de la
composición y/o variación física entre polímeros de esta clase. La equivalencia sustancial se logra cuando todas las diferencias
entre los espectros de la muestra y del Estándar de Referencia pueden ser explicadas en el contexto de dichas variaciones natu-
rales de la composición y/o variaciones físicas.
Calorimetría de barrido diferencial-El termograma de la muestra es similar al termograma del ER Polietileno de Alta Densidad
USP y la temperatura de transición (T9 ) obtenida a partir del termograma de la muestra no difiere de aquella del Estándar de
Referencia en más de 6,0º.

PRUEBAS FISICOQUÍMICAS

Absorbancia: La absorbancia máxima es 0,2.

Acidez o alcalinidad: Se requieren no más de 1,5 mL de hidróxido de sodio 0,01 N para cambiar el color del indicador a
azul. Se requiere no más de 1,0 mL de ácido clorhídrico 0,01 N para alcanzar el inicio del cambio de color del indicador de
amarillo a anaranjado.
Carbono orgánico total: La diferencia entre las concentraciones de carbono orgánico total de la muestra y el blanco es no
más de 5 mg/L.

METALES EXTRAÍBLES

Aluminio: La Solución S3 (ver la Tabla 3) contiene no más de 0,4 mg/L (ppm), correspondientes a 1 µg/g.
Arsénico, cadmio, plomo, mercurio, cobalto y níquel: Informar el valor medido en la Solución S3 de valores por encima de
0,01 mg/L (ppm), correspondientes a 0,025 µg/g. Si los valores medidos están por debajo de estos valores, informar el resulta-
do como menos de 0,01 mg/L (ppm), correspondientes a menos de 0,025 µg/g.
Cromo: La Solución S3 contiene no más de 0,02 mg/L (ppm), correspondientes a 0,05 µg/g.
Titanio: La Solución S3 contiene no más de 0,4 mg/L (ppm), correspondientes a 1 µg/g.
Vanadio: La Solución S3 contiene no más de 0,04 mg/L (ppm), correspondientes a O, 1 µg/g.
Cinc: La Solución S3 contiene no más de 0,4 mg/L (ppm), correspondientes a 1 µg/g.
Circonio: La Solución S3 contiene no más de 0,04 mg/L (ppm), correspondientes a 0, 1 µg/g.
Los resultados de prueba para metales extraíbles relevantes adicionales se informan de manera similar.

ADITIVOS PLÁSTICOS, ANTIOXIDANTES FENÓLICOS, ANTIOXIDANTES NO FENÓLICOS, COPOLÍMERO DE SUCCINATO DE

DIMETILO Y (4-HIDROXl-2,2,6,6-TETRAMETILPIPERIDIN-1-IL)ETANOL, AMIDAS Y ESTEARATOS

Se deben informar los resultados de prueba de estos análisis.

Olefinas Cíclicas

IDENTIFICACIÓN

Espectrofotometría en el infrarrojo: Determinar el espectro infrarrojo desde 3800 cm- 1 hasta 650 cm- 1 (2,6-15 µm). La
muestra presenta un espectro de absorción que es sustancialmente equivalente al del ER Polímero de Olefina Cíclica USP o al
ER Copolímero de Olefina Cíclica USP. La equivalencia sustancial, al contrario de la exacta, permite diferencias espectrales me-
nores que surgen de la variación natural de la composición y/o variación física entre polímeros de esta clase. La equivalencia
sustancial se logra cuando todas las diferencias entre los espectros de la muestra y del Estándar de Referencia pueden ser expli-
cadas en el contexto de dichas variaciones naturales de la composición y/o variaciones físicas.
Calorimetría de barrido diferencial: Debido a la naturaleza amorfa de estos polímeros y a su variedad en su composición,
se pueden anticipar variaciones entre materiales en la temperatura de transición (T9). Por ende, no se recomienda ni se requie-
re realizar una calorimetría de barrido diferencial.

PRUEBAS FISICOQUÍMICAS

Absorbancia: La absorbancia máxima es 0,2.

Acidez o alcalinidad: Se requieren no más de 1,5 mL de hidróxido de sodio 0,01 N para cambiar el color del indicador a
azul. Se requiere no más de 1,0 mL de ácido clorhídrico 0,01 N para alcanzar el inicio del cambio de color del indicador de
amarillo a anaranjado.
Carbono orgánico total: La diferencia entre las concentraciones de carbono orgánico total de la muestra y el blanco es no
más de 5 mg/L.
USP 40 Pruebas Físicas / (661 .1) Materiales Plásticos de Construcción 585

METALES EXTRAÍBLES

Aluminio: La Solución S3 (ver la Tabla 3) contiene no más de 0,4 mg/L (ppm), correspondientes a 1 µg/g.
Arsénico, cadmio, plomo, mercurio, cobalto, níquel y vanadio: Informar el valor medido en la Solución S3 de valores por
encima de 0,01 mg/L (ppm), correspondientes a 0,025 µg/g. Si los valores medidos están por debajo de estos valores, infor-
mar el resultado como menos de 0,01 mg/L (ppm), correspondientes a menos de 0,025 µg/g.
Titanio: La Solución S3 contiene no más de 0,4 mg/L (ppm), correspondientes a 1 µg/g.
Cinc: La Solución S3 contiene no más de 0,4 mg/L (ppm), correspondientes a 1 µg/g.
Los resultados de prueba para metales extraíbles relevantes adicionales se informan de manera similar.

ADITIVOS PLÁSTICOS, ANTIOXIDANTES FENÓLICOS, ANTIOXIDANTES NO FENÓLICOS, COPOLÍMERO DE SUCCINATO DE

DI METILO Y ( 4-HIDROXl-2,2,6,6-TETRAMETILPIPERIDIN-1-IL)ETANOL, AMIDAS Y ESTEARATOS

Se deben informar los resultados de prueba de estos análisis.

Polipropileno

IDENTIFICACIÓN

Espectrofotometría en el infrarrojo: Determinar el espectro infrarrojo desde 3800 cm- 1 hasta 650 cm- 1 (2,6-15 µm). La
muestra presenta un espectro de absorción que es sustancialmente equivalente al del ER Polipropileno Homopolímero USP. La
equivalencia sustancial, al contrario de la exacta, permite diferencias espectrales menores que surgen de la variación natural de
la composición y/o variación física entre polímeros de esta clase. La equivalencia sustancial se logra cuando todas las diferen-
cias entre los espectros de la muestra y del Estándar de Referencia pueden ser explicadas en el contexto de dichas variaciones
naturales de la composición y/o variaciones físicas.
Calorimetría de barrido diferencial: La temperatura de transición (T9) en el termograma no difiere de aquella del ER Poli-
propileno Homopolímero USP en más de 12,0º.

PRUEBAS FISICOQUÍMICAS

Absorbancia: La absorbancia máxima es 0,2.

Acidez o alcalinidad: Se requieren no más de 1,5 mL de hidróxido de sodio 0,01 N para cambiar el color del indicador a
azul. Se requiere no más de 1,0 mL de ácido clorhídrico 0,01 N para alcanzar el inicio del cambio de color del indicador de
amarillo a anaranjado.
Carbono orgánico total: La diferencia entre las concentraciones de carbono orgánico total de la muestra y el blanco es no
más de 5 mg/L.

METALES EXTRAÍBLES

Aluminio: La Solución S3 (ver la Tabla 3) contiene no más de 0,4 mg/L (ppm), correspondientes a 1 µg/g.
Arsénico, cadmio, plomo, mercurio, cobalto, níquel y vanadio: Informar el valor medido en la Solución S3 de valores por
encima de 0,01 mg/L (ppm), correspondientes a 0,025 µg/g. Si los valores medidos están por debajo de estos valores, infor-
mar el resultado como menos de 0,01 mg/L (ppm), correspondientes a menos de 0,025 µg/g.
Cromo: La Solución S3 contiene no más de 0,02 mg/L (ppm), correspondientes a 0,05 µg/g.
Titanio: La Solución S3 contiene no más de 0,4 mg/L (ppm), correspondientes a 1 µg/g.
Cinc: La Solución S3 contiene no más de 0,4 mg/L (ppm), correspondientes a 1 µg/g.
Los resultados de prueba para metales extraíbles relevantes adicionales se informan de manera similar.

ADITIVOS PLÁSTICOS, ANTIOXIDANTES FENÓLICOS, ANTIOXIDANTES NO FENÓLICOS, AMIDAS Y ESTEARATOS

Se deben informar los resultados de prueba de estos análisis.

Tereftalato de Polietileno y Tereftalato G de Polietileno

IDENTIFICACIÓN

Espectrofotometría en el infrarrojo: Determinar el espectro infrarrojo desde 3800 cm- 1 hasta 650 cm- 1 (2,6-15 µm). La
muestra presenta un espectro de absorción que es sustancialmente equivalente al del ER Tereftalato de Polietileno USP o del ER
Tereftalato G de Polietileno USP. La equivalencia sustancial, al contrario de la exacta, permite diferencias espectrales menores
que surgen de la variación natural de la composición y/o variación física entre polímeros de esta clase. La equivalencia sustan-
586 (661.1) Materiales Plásticos de Construcción/ Pruebas Físicas USP 40

cial se logra cuando todas las diferencias entre los espectros de la muestra y del Estándar de Referencia pueden ser explicadas
en el contexto de dichas variaciones naturales de la composición y/o variaciones físicas.
Calorimetría de barrido diferencial
Terefta/ato de polietileno-EI termograma de la muestra es similar al termograma del ER Tereftalato de Polietileno USP. La tem-
peratura de transición vítrea (T9) obtenida a partir del termograma de la muestra no difiere de aquella del Estándar de Referen-
cia en más de 4,0º.
Tereftalato G de polietileno-EI termograma de la muestra es similar al termograma del ER Tereftalato G de Polietileno USP. La
temperatura de transición vítrea (T9) obtenida a partir del termograma de la muestra no difiere de aquella del Estándar de Re-
ferencia en más de 6,0º.

PRUEBAS FISICOQUÍMICAS

Absorbancia: Las absorbancia máxima es 0,2 para la Solución S7 y 0,05 para la Solución SS. Para el tereftalato de polietileno
con color, la absorbancia máxima entre 400 y 800 nm es 0,05 para la Solución S7.
Acidez o alcalinidad: Se requieren no más de 0,5 mL de hidróxido de sodio 0,01 N para cambiar el color del indicador a
azul. Se requieren no más de 0,5 mL de ácido clorhídrico 0,01 N para alcanzar el inicio del cambio de color del indicador de
amarillo a anaranjado.
Carbono orgánico total: La diferencia entre las concentraciones de carbono orgánico total de la muestra y el blanco es no
más de 5 mg/L.

METALES EXTRAÍBLES

Aluminio: La Solución S3 (ver la Tabla 3) contiene no más de 0,4 mg/L (ppm), correspondientes a 1 µg/g.
Antimonio: La Solución S4 contiene no más de 0,4 mg/L (ppm), correspondientes a 1 µg/g.
Arsénico, cadmio, plomo, mercurio, cobalto, níquel y vanadio: Informar el valor medido en la Solución S3 de valores por
encima de 0,01 mg/L (ppm), correspondientes a 0,025 µg/g. Si los valores medidos están por debajo de estos valores, infor-
mar el resultado como menos de 0,01 mg/L (ppm), correspondientes a menos de 0,025 µg/g.
Bario: La Solución S3 contiene no más de 0,4 mg/L (ppm), correspondientes a 1 µg/g.
Germanio: La Solución S4 contiene no más de 0,4 mg/L (ppm), correspondientes a 1 µg/g.
Manganeso: La Solución S3 contiene no más de 0,4 mg/L (ppm), correspondientes a 1 µg/g.
Titanio: La Solución S3 contiene no más de 0,4 mg/L (ppm), correspondientes a 1 µg/g.
Cinc: La Solución S3 contiene no más de 0,4 mg/L (ppm), correspondientes a 1 µg/g.
Los resultados de prueba para metales extraíbles relevantes adicionales se informan de manera similar.

Cloruro de Polivinilo Plastificado

IDENTIFICACIÓN

Espectrofotometría en el infrarrojo: Determinar el espectro infrarrojo desde 3800 cm- 1 hasta 600 cm- 1 (2,6-16 µm). La
muestra presenta un espectro de absorción que es sustancialmente equivalente al del ER Cloruro de Polivinilo Plastificado USP.
La equivalencia sustancial, al contrario de la exacta, permite diferencias espectrales menores que surgen de la variación natural
de la composición y/o variación física entre polímeros de esta clase. La equivalencia sustancial se logra cuando todas las dife-
rencias entre los espectros de la muestra y del Estándar de Referencia pueden ser explicadas en el contexto de dichas variacio-
nes naturales de la composición y/o variaciones físicas.
Calorimetría de barrido diferencial: El termograma de la muestra es similar al termograma del ER Cloruro de Polivinilo Plas-
tificado USP y la temperatura de transición (T9 ) obtenida a partir del termograma de la muestra no difiere de aquella del Están-
dar de Referencia en más de 8,0º. Tener en cuenta que los resultados del análisis por calorimetría de barrido diferencial depen-
den en gran medida de la cantidad de plastificante en el artículo de prueba.

PRUEBAS FISICOQUÍMICAS

Absorbancia: No más de 0,25 para la Solución S7

Acidez o alcalinidad: Se requieren no más de 1,5 mL de hidróxido de sodio 0,01 N para cambiar el color del indicador a
azul. Se requiere no más de 1,0 mL de ácido clorhídrico 0,01 N para alcanzar el inicio del cambio de color del indicador de
amarillo a anaranjado.
Carbono orgánico total: La diferencia entre las concentraciones de carbono orgánico total de la muestra y el blanco es no
más de 5 mg/L.
USP 40 Pruebas Físicas/ (661.1) Materiales Plásticos de Construcción 587

METALES EXTRAÍBLES

Arsénico, cadmio, plomo, mercurio, cobalto, níquel y vanadio: Informar el valor medido en la Solución S3 de valores por
encima de 0,01 mg/L (ppm), correspondientes a 0,025 µg/g. Si los valores medidos están por debajo de estos valores, infor-
mar el resultado como menos de 0,01 mg/L (ppm), correspondientes a menos de 0,025 µg/g.
Bario: La Solución S3 (ver la Tabla 3) contiene no más de 0,25 mg/L (ppm), correspondientes a 5 µg/g.
Calcio: La Solución S3 contiene no más de 35 mg/L (ppm), correspondientes a 0,07 % en peso.
Estaño: La Solución S3 contiene no más de 1 mg/L (ppm), correspondientes a 20 µg/g.
Cinc: La Solución S3 contiene no más de 100 mg/L (ppm), correspondientes a 0,2 % en peso.
Los resultados de prueba para metales extraíbles relevantes adicionales se informan de manera similar.

ADITIVOS PLÁSTICOS

Di(2-etilhexil)ftalato: El residuo es no más de 40 mg.

N'N"-Diaciletilenediaminas: El residuo es no más de 20 mg.
Aceite de soja epoxidado: La diferencia entre las masas de ambos residuos es no más de 1 O mg.
Aceite de linaza epoxidado: La diferencia entre las masas de ambos residuos es no más de 1 O mg.
Cloruro de vinilo: No más de 1 ppm. Tener en cuenta que el cloruro de vinilo no es un aditivo, pero se monitorea como
monómero residual.

MÉTODOS DE PRUEBA

Identificación

La prueba de identificación descrita en este capítulo es requerida para todos los materiales de construcción usados en los
sistemas de envases. La prueba de identificación debe realizarse usando los procedimientos indicados en este capítulo (espec-
trofotometría en el infrarrojo y análisis térmico). Si estos procedimientos no son aplicables para un material particular, entonces
se puede usar un procedimiento alternativo. El procedimiento alternativo debe establecer la identidad en base a la obtención
de resultados sustancialmente equivalentes para el artículo de prueba y su Estándar de Referencia USP apropiado.
Se deben establecer especificaciones para materiales que no estén indicados en este capítulo, las cuales deben ser consisten-
tes con las especificaciones establecidas para los materiales especificados en este capítulo. Por ejemplo, una especificación de
calorimetría de barrido diferencial para un material que no se encuentre listado en este capítulo debe ser consistente, en lo que
respecta a lenguaje y rigor, con una especificación de calorimetría de barrido diferencial para un material que esté listado en
este capítulo [por ejemplo, el índice de concordancia de la temperatura de transición (T9 ) entre la muestra y el material de
referencia].
Las identidades de los materiales de construcción sólo necesitan ser establecidas mediante un procedimiento de prueba.

Espectrofotometría en el Infrarrojo

Aparato: Usar un espectrofotómetro infrarrojo capaz de corregir por el espectro del blanco y capaz de medir en modo de
transmisión o equipado con un accesorio de reflectancia interno y una placa de reflectancia interna apropiada.
Preparación de la muestra
Modo de transmisión-Preparar una muestra con un espesor apropiado (aproximadamente 250 µm para polietileno; aproxima-
damente 100 µm para polipropileno) sin defectos visibles (grietas u orificios). Las muestras pueden compactarse para formar
una película delgada y uniforme mediante exposición a temperaturas y presiones elevadas (2000 psi o más). Las temperaturas
a las que se generan las películas delgadas representan un compromiso entre producir un fundido (lo cual lo dicta la tempera-
tura necesaria más baja) y degradar la muestra (lo cual lo dicta la temperatura más alta permitida). En último caso, las tempe-
raturas que se usan son apropiadas si la película producida es conductiva para el análisis IR.
Modo de reflectancia interna-Preparar una sección plana y cortarla según sea necesario para obtener un segmento que sea
conveniente para el montaje en el accesorio de reflectancia interna. Limpiar la muestra con papel seco o, si fuera necesario,
con un trapo suave empapado con metanol, teniendo cuidado de no rayar las superficies, y dejar que éstas se sequen. Antes
de montar la muestra en la placa, compactarla para formar una película uniforme exponiéndola a temperaturas elevadas bajo
alta presión (2000 psi o más). Posteriormente, asegurar la muestra sobre la placa de reflexión interna asegurando el contacto
adecuado con la superficie.
Procedimiento: Colocar los cortes de muestra montados en el compartimiento de la muestra del espectrofotómetro infrarro-
jo o en el accesorio de reflectancia interna, y colocar el montaje en el haz de la muestra del espectrofotómetro infrarrojo. Para
reflectancia interna, ajustar la posición de la muestra y los espejos dentro del accesorio para permitir la máxima transmisión de
luz del haz de referencia sin atenuar. (Para un instrumento de doble haz, atenuar el haz de referencia después de completar el
ajuste en el accesorio para permitir la deflexión a escala completa durante el barrido de la muestra.)
588 (661.1) Materiales Plásticos de Construcción /Pruebas Físicas USP 40

Análisis Térmico
Referirse al capítulo Análisis Térmico (891 ).
Preparación de la muestra: Colocar aproximadamente 12 mg de muestra en la bandeja colectora de muestra. [NOTA-El
contacto íntimo entre la bandeja colectora y el termopar es esencial para obtener resultados reproducibles.] Determinar el ter-
mograma bajo nitrógeno, usando condiciones de calentamiento/enfriamiento especificadas para el tipo de polímero y usando
equipo capaz de realizar determinaciones según lo descrito en el capítulo (891 ). Los termogramas se obtienen para los mate-
riales de prueba y sus Estándares de Referencia USP asociados.
Procedimiento
Polietileno-Determinar el termograma bajo nitrógeno a temperaturas de entre 40º y 200º a un intervalo de calentamiento de
entre 2º y 1Oº /minuto, seguido por enfriamiento, a una velocidad de entre 2º y 1Oº /minuto, hasta 40º.
Tereftalato de polietileno-Calentar la muestra desde temperatura ambiente hasta 280º a una velocidad de calentamiento de
aproximadamente 20º/minuto. Mantener la muestra a 280º durante 1 minuto. Enfriar rápidamente la muestra hasta tempera-
tura ambiente y volver a calentarla a 280º a una velocidad de calentamiento de 5° /minuto.
Tereftalato G de polietileno-Calentar la muestra desde temperatura ambiente hasta 120º a una velocidad de calentamiento de
aproximadamente 20º/minuto. Mantener la muestra a 120º durante 1 minuto. Enfriar rápidamente la muestra hasta tempera-
tura ambiente y volver a calentarla a 120º a una velocidad de calentamiento de 1Oº /minuto.
Olefina cíclica-Determinar el termograma bajo nitrógeno a temperaturas que vayan desde temperatura ambiente hasta 30º
por arriba del punto de fusión. Mantener la temperatura durante 1O minutos, luego enfriar a 50º por debajo del pico de la
temperatura de cristalización a una velocidad de 1Oº a 20º /minuto.
Polipropileno-Determinar el termograma bajo nitrógeno a temperaturas que vayan desde temperatura ambiente hasta 30º por
arriba del punto de fusión. Mantener la temperatura durante 1O minutos, luego enfriar a 50º por debajo del pico de la tempe-
ratura de cristalización a una velocidad de 1Oº a 20º/minuto.
Cloruro de polivinilo plastificado-Calentar la muestra desde -20º hasta 120º a una velocidad de calentamiento de aproximada-
mente 1Oº /minuto. Enfriar rápidamente la muestra a temperatura ambiente.
Otros materiales-Las muestras deben calentarse y enfriarse de una manera apropiada para el material de prueba y que facilite
la generación un termograma utilizable.

Extracciones
El análisis fisicoquímico del material plástico requiere la extracción o disolución del mismo. Se proveen diversas pruebas ba-
sadas en varios métodos de extracción. La Tabla 3 describe los extractos que se generan y las pruebas que se realizan a dichos
extractos. Las secciones subsiguientes tratan sobre métodos para producir los extractos. Se debe tener en cuenta que estos
extractos pueden usarse para otras pruebas distintas a las pruebas fisicoquímicas.
Tabla 3. Extracciones Realizadas para Varias Pruebas Químicas
Pruebas Realizadas en Plásticos Usando la Solución de Extracción Especificada
Tereftalato de
Polietileno, Polletileno y
Olefina Cíclica y Tereftalato G de Cloruro de Polivinilo
Extracción Solución de Extracción Poli pro pilen o Polietileno Plastificado
Absorbancia Absorbancia Absorbanciaª
Acidez/alcalinidad Acidez/alcalinidad Acidez/alcalinidad
57 Agua Carbono orgánico total Carbono orgánico total Carbono orgánico total
Antioxidantes fenólicos, anti-
oxidantes no fenólicos,
52 Tolueno amidas y estearatos N/A N/A
Metales extraíbles: •At, As,
Metales extraíbles: Al, As, Sa, Cd, Co, Metales extraíbles: As, Ba, Ca,
Cd, Co, Crb, Hg, Ni, Pb, Ti, é .~RR(01·abr·2016) Hg, Mn, Cd, Co, Hg, Ni, Pb, Sn, V y
53 Ácido v, Zn y zr= Ni, Pb, Ti, V y Zn Zn
54 Álcali N/A Metales extraíbles: Sb y Ge N/A
55 Alcohol N/A Absorbancia N/A
ª Aunque este extracto es adecuado para su uso con estos métodos para ingredientes específicos, dicho extracto puede ser útil para otras pruebas diseñadas a
establecer la composición de un material.
b •Para polietileno únicamente.• ERR (01-abr.JcÓ.16)
e No aplicable para olefinas cíclicas.

EXTRACCIÓN CON AGUA, SOLUCIÓN SI

Polietileno, olefinas cíclicas y polipropileno: Colocar 25 g del material de prueba en un matraz de vidrio de borosilicato
con cuello de vidrio esmerilado. Agregar 500 mL de Agua Purificada y calentar a ebullición en condiciones de reflujo durante 5
USP 40 Pruebas Físicas / ( 661 .1) Materiales Plásticos de Construcción 589

horas. Dejar que se enfríe y filtrar la solución de extracción a través de un filtro de vidrio sinterizado. Recolectar el filtrado en
un matraz volumétrico de 500 mL y diluir con Agua Purificada a volumen; la solución diluida se denomina Solución S7. Usar la
Solución S7 dentro de las 4 horas de su preparación.
Tereftalato de polietileno y tereftalato G de polietileno: Colocar 1O g del material de prueba en un matraz de vidrio de
borosilicato con cuello de vidrio esmerilado. Agregar 200 mL de Agua Purificada y calentar a 50 durante 5 horas. Dejar que se
enfríe, decantar la solución en un matraz volumétrico de 200 mL y diluir con Agua Purificada a volumen; la muestra diluida se
denomina Solución S7. Usar la Solución S7 dentro de las 4 horas de su preparación.
Cloruro de polivinilo plastificado-Colocar 25 g del material de prueba en un matraz de vidrio de borosilicato. Agregar 500 mL
de Agua Purificada, tapar el cuello del matraz con papel aluminio o un vaso de precipitados de borosilicato y calentar en un
autoclave a 121 ± 2º durante 20 minutos. Dejar que la solución se enfríe y que los sólidos sedimenten, decantar la solución en
un matraz volumétrico de 500 mL y diluir con Agua Purificada a volumen; la solución diluida se denomina Solución S7.

EXTRACCIÓN CON TOLUENO, SOLUCIÓN S2

Polietileno, olefinas cíclicas y polipropileno: Colocar 2,0 g del material de prueba en un matraz de vidrio de borosilicato de
250 mL con cuello de vidrio esmerilado. Agregar 80 mL de tolueno y calentar a ebullición en un condensador de reflujo duran-
te 1,5 horas, mezclando constantemente. Dejar que se enfríe a 60º y agregar, mezclando continuamente, 120 mL de metanol.
Pasar la solución resultante a través de un filtro de vidrio sinterizado. Enjuagar el matraz y el filtro con 25 mL de una mezcla de
40 mL de tolueno y 60 mL de metanol, agregar los enjuagues al filtrado y diluir hasta 250 mL con la misma mezcla de disol-
ventes para producir la Solución S2. Preparar una solución blanco.

EXTRACCIÓN CON ÁCIDO, SOLUCIÓN S3

Polietileno, olefinas cíclicas y polipropileno: Colocar 100 g del material de prueba en un matraz de vidrio de borosilicato
con un cuello de vidrio esmerilado. Agregar 250 mL de ácido clorhídrico O, 1 N y calentar a ebullición en un condensador de
reflujo durante 1 hora mezclando constantemente. Dejar que se enfríe, decantar la solución en un matraz volumétrico de 250
mL y diluir con ácido clorhídrico O, 1 N a volumen; la solución diluida se denomina Solución S3.
Tereftalato de polietileno y tereftalato G de polietileno: Colocar 20 g del material de prueba en un matraz de vidrio de
borosilicato con cuello de vidrio esmerilado. Agregar 50 mL de ácido clorhídrico O, 1 N y calentar a 50º durante 5 horas. Dejar
que se enfríe, decantar la solución en un matraz volumétrico de 50 mL y diluir con ácido clorhídrico O, 1 N a volumen; la solu-
ción diluida se denomina Solución S3. Usar la Solución S3 dentro de las 4 horas de su preparación.
Cloruro de polivinilo plastificado: Colocar 5 g en un matraz de vidrio de borosilicato con un cuello de vidrio esmerilado.
Agregar 100 mL de ácido clorhídrico O, 1 N y calentar a ebullición en un condensador de reflujo durante 1 hora mezclando
constantemente. Dejar que se enfríe y que los sólidos sedimenten, decantar la solución en un matraz volumétrico de 100 mL y
diluir con ácido clorhídrico O, 1 N a volumen; la solución diluida se denomina Solución S3.

EXTRACCIÓN CON ÁLCALI, SOLUCIÓN S4

Tereftalato de polietileno y tereftalato G de polietileno: Colocar 20 g del material de prueba en un matraz de vidrio de
borosilicato con cuello de vidrio esmerilado. Agregar 50 mL de hidróxido de sodio 0,01 N y calentar a 50º durante 5 horas.
Dejar que se enfríe y que los sólidos sedimenten, decantar la solución en un matraz volumétrico de 50 mL y diluir con hidróxi-
do de sodio 0,01 N a volumen; la solución diluida se denomina Solución S4. Usar la Solución S4 dentro de las 4 horas de su
preparación.

EXTRACCIÓN CON ALCOHOL, SOLUCIÓN SS

Tereftalato de polietileno y tereftalato G de polietileno: Colocar 1O g del material de prueba en un matraz de vidrio de
borosilicato con cuello de vidrio esmerilado. Agregar 100 mL de alcohol absoluto, y calentar a 50 durante 5 horas. Dejar que
se enfríe y que los sólidos sedimenten, luego decantar la solución para producir la Solución SS. Usar la Solución SS dentro de las
4 horas de su preparación.

Pruebas Fisicoquímicas

ABSORBANCIA

Referirse al capítulo Espectroscopía Ultravioleta-Visible (857).

Polietileno, olefinas cíclicas y polipropileno: Determinar el espectro entre 220 y 340 nm en la Solución S7.
Tereftalato de polietileno y tereftalato G de polietileno: Determinar el espectro entre 220 y 340 nm en la Solución S7.
Para tereftalato de polietileno de color, determinar el espectro entre 400 y 800 nm en la Solución S7. Para tereftalato de polieti-
leno de color y sin color, determinar el espectro entre 400 y 800 nm en la Solución SS.
590 (661.1) Materiales Plásticos de Construcción/ Pruebas Físicas USP 40

Cloruro de polivinilo plastificado: Evaporar 100 mL de Solución S7 hasta sequedad. Disolver el residuo resultante en 5 mL
de hexano para producir la muestra de hexano. Pasar la muestra de hexano, si fuera necesario, a través de un filtro previamen-
te enjuagado con hexano. Determinar el espectro entre 250 y 31 O nm en la muestra de hexano.•• ERfÍ(oJ:ati1:2¡¡1 ~í

ACIDEZ O ALCALINIDAD

Solución indicadora de BRP: 1,0 mg/mL de azul de bromofenol, 0,2 mg/mL de rojo de metilo y 0,2 mg/mL de fenolftaleína
en alcohol. Filtrar la solución resultante.
Solución de anaranjado de metilo: Disolver 100 mg de anaranjado de metilo en 80 mL de Agua Purificada y diluir con al-
cohol R hasta 100 ml. Prueba de sensibilidad: Agregar O, 1 mL de Solución de anaranjado de metilo a 100 mL de Agua Purifica-
da exenta de dióxido de carbono. Se requiere no más de O, 1 mL de ácido clorhídrico 1 N para cambiar el color de amarillo a
rojo.
Polietileno, olefinas cíclicas y polipropileno: Agregar O, 15 mL de Solución indicadora de BRP a 100 mL de Solución S1. De-
terminar el volumen consumido de hidróxido de sodio 0,01 N requerido para cambiar el color del indicador a azul. Agregar
0,2 mL de Solución de anaranjado de metilo a una porción separada de 100 mL de Solución S7. Determinar el volumen consu-
mido de ácido clorhídrico 0,01 N para alcanzar el inicio del cambio de color del indicador de amarillo a anaranjado.
Tereftalato de polietileno y tereftalato G de polietileno: Agregar O, 15 mL de Solución indicadora de BRP a 50 mL de Solu-
ción S7. Determinar el volumen consumido de hidróxido de sodio 0,01 N requerido para cambiar el color del indicador a azul.
Agregar 0,2 mL de Solución de anaranjado de metilo a una porción separada de 50 mL de Solución S7. Determinar el volumen
consumido de ácido clorhídrico 0,01 N para alcanzar el inicio del cambio de color del indicador de amarillo a anaranjado.
Cloruro de polivinilo plastificado: Agregar O, 15 mL de Solución indicadora de BRP a 100 mL de Solución S1. Determinar el
volumen consumido de hidróxido de sodio 0,01 N requerido para cambiar el color del indicador a azul. Agregar 0,2 mL de
Solución de anaranjado de metilo a 100 mL de Solución S7. Determinar el volumen consumido de ácido clorhídrico 0,01 N para
alcanzar el inicio del cambio de color del indicador de amarillo a anaranjado.

CARBONO ORGÁNICO TOTAL

El contenido de carbono orgánico total de la Solución S7 se mide de acuerdo con las metodologías generales descritas en el
capítulo Carbono Orgánico Total (643). Sin embargo, aunque el capítulo (643) está diseñado para el análisis de agua de alta
pureza con valores bajos de carbono orgánico total, los extractos de materiales pueden tener valores de carbono orgánico to-
tal que son superiores a los del agua purificada debido a las sustancias orgánicas extraídas. Por consiguiente, el método usado
para realizar los análisis de carbono orgánico total debe tener un límite de detección de 0,2 mg/L (ppm) y debe tener un inter-
valo dinámico lineal demostrado de 0,2 a 20 mg/L (el cual abarque el límite de carbono orgánico total). Se puede usar un
intervalo lineal con una concentración superior siempre que se establezca la linealidad. Si los extractos de la muestra exceden
este intervalo lineal superior, deben ser diluidos apropiadamente para el análisis.

Metales Extraíbles

El análisis de Metales Extraíbles descrito en este capítulo es requerido para todos los materiales plásticos de construcción usa-
dos en sistemas de envases, independientemente de si el material está especificado en este capítulo. Específicamente, todos los
materiales deben ser analizados para detectar aquellos metales listados en la Tabla 3 y cualquier otro metal que sea relevante
en el sentido de que se conoce o se puede anticipar razonablemente su presencia en el material de prueba.

PROCEDIMIENTO DE EXTRACCIÓN

Los materiales plásticos usados en sistemas de envases para artículos médicos no se disuelven en condiciones de uso, sino
que las sustancias derivadas de los sistemas de envase se acumulan en los artículos envasados a través del proceso de lixivia-
ción (extracción). Por consiguiente, el proceso de preparación de muestras apropiado y pertinente para evaluar metales en los
materiales de construcción de un sistema de envase es la extracción del material de plástico, al contrario de la digestión com-
pleta. La Solución S3 (extracción con ácido) y la Solución S4 (extracción con álcali) preparadas para las Pruebas Fisicoquímicas
(Tabla 2) son los extractos de material que se analizan para determinar la presencia de metales extraíbles.

PROCEDIMIENTO PARA ANÁLISIS DE LOS EXTRACTOS

El instrumental y los métodos son los indicados en el capítulo Impurezas Elementales-Procedimientos (233) e incluyen un es-
pectrómetro de emisión atómica de plasma inductivamente acoplado y un espectrómetro de masas de plasma inductivamente
acoplado (ver Espectroscopía de Absorción Atómica (852)), según se indica.
USP 40 Pruebas Físicas/ (661.1) Materiales Plásticos de Construcción 591

Aditivos Plásticos

POLIETILENO, OLEFINAS CÍCLICAS Y POLIPROPILENO

Estas pruebas deberán llevarse a cabo de manera total o parcial según se requiera, basándose en la composición declarada
del material.
•ANTIOXIDANTES FENÓLICOS
Mezcla de disolventes: Acetonitrilo y tetrahidrofurano (50:50, v/v)
Solución muestra S7: Evaporar 50 mL de Solución S2 hasta sequedad al vacío a 45º. Disolver el residuo resultante con 5,0
mL de Mezcla de disolventes para producir la Solución muestra S7. Preparar una solución blanco a partir de la solución blanco
correspondiente a la Solución S2.
Solución muestra SS: Evaporar 50 mL de Solución S2 hasta sequedad al vacío a 45º. Disolver el residuo con 5,0 mL de clo-
ruro de metileno para producir la Solución muestra SB. Preparar una solución blanco a partir de la solución blanco correspon-
diente a la Solución S2.
Solución muestra S9 (olefinas cíclicas únicamente): Evaporar 50 mL de Solución S2 hasta sequedad al vacío a 45º. Disol-
ver el residuo en 5,0 mL de una mezcla de volúmenes iguales de acetonitrilo y una solución de 1Og/L de hidroxiperóxido de
terc-butilo en tetrahidrofurano. Cerrar el matraz y dejar en reposo durante 1 hora. La solución resultante es la Solución muestra
S9. Preparar una solución blanco usando el blanco de la Solución S2.
Soluciones de referencia
De las siguientes soluciones de referencia, preparar únicamente aquellas que sean necesarias para el análisis de los antioxi-
dantes fenólicos declarados en la composición de la sustancia a examinar.
Solución de referencia A: O, 1 mg/mL de ER Butil Hidroxitolueno USP y 0,24 mg/mL de ER Aditivo Plástico 01 USP, prepa-
rada en la Mezcla de disolventes
Solución de referencia B: 0,24 mg/mL de ER Aditivo Plástico 02 USP y 0,24 mg/mL de ER Aditivo Plástico 03 USP, prepa-
rada en la Mezcla de disolventes
Solución de referencia C: 0,24 mg/mL de ER Aditivo Plástico 04 USP y 0,24 mg/mL de ER Aditivo Plástico 05 USP, prepa-
rada en cloruro de metileno
Solución de referencia D: O, 1 mg/mL de ER Butil Hidroxitolueno USP, preparada en la Mezcla de disolventes
Solución de referencia E: 0,24 mg/mL de ER Aditivo Plástico 01 USP, preparada en la Mezcla de disolventes
Solución de referencia F: 0,24 mg/mL de ER Aditivo Plástico 06 USP, preparada en la Mezcla de disolventes
Solución de referencia G: 0,24 mg/mL de ER Aditivo Plástico 02 USP, preparada en la Mezcla de disolventes
Solución de referencia H: 0,24 mg/mL de ER Aditivo Plástico 03 USP, preparada en la Mezcla de disolventes
Solución de referencia 1: 0,24 mg/mL de ER Aditivo Plástico 04 USP, preparada en cloruro de metileno
Solución de referencia J: 0,24 mg/mL de ER Aditivo Plástico 05 USP, preparada en cloruro de metileno
Prueba A: Si la sustancia a examinar contiene butil hidroxitolueno y/o el aditivo bis[3,3-bis[3-(l, 1-dimetiletil)-4-hidroxife-
nil]butanoato] de etileno.
Sistema cromatográfico
(Ver Cromatografía (621 ), Cromatografía de Líquidos.)
Columna: 4,6 mm x 25 cm; relleno L1 de 5 µm
Fase móvil: Acetonitrilo y Agua Purificada (70:30, v/v)
Velocidad de flujo: 2 mL/min
Volumen de inyección: 20 µL de Solución muestra S7, solución blanco correspondiente, Solución de referencia A y Solu-
ción de referencia O, Solución de referencia E, o ambas
Detector: UV 280 nm
Tiempo de corrida: 30 min
Aptitud del sistema
Resolución: Mínimo 8,0 entre los picos del aditivo butil hidroxitolueno y del aditivo bis[3,3-bis[3-(1, 1-dimetiletil)-4-hi-
droxifenil]butanoato] de etileno, Solución de referencia A
La Solución muestra S7 sólo presenta picos ocasionados por los antioxidantes declarados en la composición y picos menores
que también corresponden a la solución blanco.
Análisis: Las áreas de los picos de la Solución muestra S7 son menores que las áreas de los picos correspondientes de la
Solución de referencia O o de la Solución de referencia E.
Prueba B: Si la sustancia a examinar contiene uno o más de los siguientes antioxidantes: tetrakis[3-(3,5-di-terc-butil-4-hidro-
xifen il)propionato de pentaeritritilo; 2,2' ,2",6,6',6"-hexa-terc-butil-4,4',4"-[(2,4,6-tri metil-1, 3,5-bencen-triil)trismetilen ]trifenol;
octadecil 3-(3,5-di-terc-butil-4-hidroxifeni l)propionato; fosfato de tris(2,4-di-terc-butilfenilo ); 1, 3,5-tris(3,5-di-tec-butil-4-hidro-
xibencil)-s-triazina-2,4 ,6(1 H,3H,5H)-triona
Sistema cromatográfico: Realizar la prueba según se describe en Prueba A con las siguientes modificaciones.
Fase móvil: Acetonitrilo, tetrahidrofurano y Agua Purificada (60:30:1 O, v/v/v)
Velocidad de flujo: 1,5 mL/min
Volumen de Inyección: 20 µL de Solución muestra S7, solución blanco correspondiente, Solución de referencia By cual-
quiera de las Soluciones de referencia de los antioxidantes listados anteriormente que se declaran en la composición.
592 (661.1) Materiales Plásticos de Construcción/ Pruebas Físicas USP 40

Detector: UV 280 nm
Aptitud del sistema
Resolución: Mínimo 2,0 entre los picos del aditivo tetrakis[3-(3,5-di-terc-butil-4-hidroxifenil)propionato de pentaeritritilo
y del aditivo 2,2',2",6,6',6"-hexa-terc-butil-4,4',4"-[(2,4,6-trimetil-1,3,5-benceno-triil)trismetilen]trifenol, Solución de referencia B
La Solución muestra S7 sólo presenta picos ocasionados por antioxidantes declarados en la composición y picos menores que
también corresponden a la solución blanco.
Análisis: Las áreas de los picos de la Solución muestra S7 son menores que las áreas correspondientes de las Soluciones de
referencia de los antioxidantes listados anteriormente y que se declaran en la composición.
Prueba C: Si la sustancia a examinar contiene el aditivo octadecil-3-(3,5-di-terc-butil-4-hidroxifenil)propionato y/o el aditivo
fosfito de tris(2,4-di-terc-butilfenilo.
Sistema cromatográfico: Realizar la prueba según se describe en Prueba A con las siguientes modificaciones.
Fase móvil: Metano!, 2-propanol y Agua Purificada (55:45:5, v/v/v)
Velocidad de flujo: 1,5 mL/min
Volumen de Inyección: 20 µL de Solución muestra 58, solución blanco correspondiente, Solución de referencia C y Solu-
ción de referencia I o Solución de referencia j
Detector: UV 280 nm
Aptitud del sistema
Resolución: Mínimo 2,0 entre los picos del aditivo octadecil-3-(3,5-di-terc-butil-4-hidroxifenil)propionato y del aditivo
fosfito de tris(2,4-di-terc-butilfenilo, Solución de referencia C
La Solución muestra S8 sólo presenta picos debidos a los antioxidantes declarados en la composición y picos menores que
también corresponden a la solución blanco.
Análisis: Las áreas de los picos de la Solución muestra S8 son menores que las áreas de los picos correspondientes de la
Solución de referencia I o la Solución de referencia f.
•ANTIOXIDANTES No FENÓLICOS
Cloruro de metileno acidificado: Agregar 1O mL de ácido clorhídrico a 100 mL de cloruro de metileno, agitar, dejar en
reposo y separar las dos capas. Usar la capa inferior.
Solución muestra SlO: Evaporar 100 mL de Solución S2 hasta sequedad al vacío a 45º. Disolver el residuo resultante con 2
mL de Cloruro de metileno acidificado.
Solución de referencia M: 6,0 mg/mL de ER Aditivo Plástico 08 USP, preparada en cloruro de metileno. Diluir 2 mL de la
solución con Cloruro de metileno, acidificado hasta 1O ml.
Solución de referencia N: 6,0 mg/mL de ER Aditivo Plástico 09 USP, preparada en cloruro de metileno. Diluir 2 mL de la
solución con Cloruro de metileno acidificado hasta 1O ml.
Solución de referencia O: 6,0 mg/mL de ER Aditivo Plástico 1O USP, preparada en cloruro de metileno. Diluir 2 mL de la
solución con Cloruro de metileno acidificado hasta 1O mL.
Solución de referencia P: 6,0 mg/mL de ER Aditivo Plástico 1O USP y 6,0 mg/mL de ER Aditivo Plástico 09 USP, preparada
en cloruro de metileno. Diluir 2 mL de la solución con Cloruro de metileno acidificado hasta 1O ml.
Sistema cromatográfico
(Ver Cromatografía (621 ), Cromatografía en Capa Delgada.)
Placa: Gel de sílice para cromatografía en capa delgada GF 254
Fase móvil A: Hexano
Fase móvil B: Cloruro de metileno
Aplicación: 20 µL de Solución muestra S7 O, solución de referencia (o) y las soluciones de referencia correspondientes a to-
dos los antioxidantes fenólicos y no fenólicos que se espera estén presentes en el material de prueba.
Desarrollo A: Recorrido de la Fase móvil A de 18 cm; secar al aire.
Desarrollo B: Recorrido de la Fase móvil B de 1 7 cm; secar al aire.
Detector: UV 254 nm; rociar con solución alcohólica de yodo y examinar después de 10-15 minutos.
Aptitud del sistema
Resolución: El cromatograma presenta dos manchas claramente separadas, Solución de referencia P.
Análisis: Ninguna mancha en el cromatograma de la Solución muestra S 7O es más intensa que las manchas en las mismas
posiciones en los cromatogramas de las Soluciones de referencia.
• COPOLÍMERO DE SUCCINATO DE DIMETILO Y (4-HIDROXl-2,2,6,6-TETRAMETILPIPERIDIN-1-IL)ETANOL (OLEFINAS CÍCLICAS ÚNICAMENTE)
Mezcla de disolventes: Hexano y etanol anhidro (89:11, v/v)
Solución muestra Sl 1: Evaporar 25 mL de Solución S2 hasta sequedad al vacío a 45º. Disolver el residuo con 1O mL de
tolueno y 1O mL de una solución de 1O g/L de hidróxido de tetrabutilamonio en una mezcla de 35 volúmenes de tolueno y 65
volúmenes de etanol anhidro. Calentar a ebullición en un condensador de reflujo durante 3 horas. Dejar que se enfríe y filtrar,
si fuera necesario, para producir la Solución muestra S1 7.
Solución de referencia Q: 6,0 mg/mL de ER Aditivo Plástico 11 USP, preparada en tolueno. Agregar 1 mL de esta solución
a 25 mL de la solución blanco correspondiente a la Solución S2 y evaporar hasta sequedad al vacío a 45º. Preparar una solución
blanco a partir de la solución blanco correspondiente a la Solución S2. Disolver el residuo con 1O mL de tolueno y 1O mL de
una solución de 1O g/L de hidróxido de tetrabutilamonio en una mezcla de 35 volúmenes de tolueno y 65 volúmenes de eta-
nol anhidro. Calentar a ebullición en un condensador de reflujo durante 3 horas. Dejar que se enfríe y filtrar, si fuera necesario.
USP 40 Pruebas Físicas/ (661.1) Materiales Plásticos de Construcción 593

Sistema cromatográfico
(Ver Cromatografía (621 ), Cromatografía de Líquidos.)
Columna: 4,6 mm x 25 cm; relleno L8 de 5 µm
Fase móvil: Hexano y etanol anhidro (89:11, v/v)
Velocidad de flujo: 2 mL/min
Volumen de Inyección: 20 µL de Solución muestra S7 7, la solución blanco correspondiente y Solución de referencia Q
Detector: UV 227 nm
Aptitud del sistema
Resolución: Mínimo 7 entre los picos del componente diol y los diluyentes de la Solución de referencia Q
Análisis: El área del pico del componente diol en la Solución muestra S7 7 es menor que las áreas de los picos correspondien-
tes de la Solución de referencia Q.
•AMIDAS Y ESTEARATOS
Solución muestra: Usar la Solución S1 O descrita en Antioxidantes No Fenólicos.
Solución de referencia R: 2,0 mg/mL de ER Ácido Esteárico USP, preparada en cloruro de metileno
Solución de referencia S: 2,0 mg/mL de ER Aditivo Plástico 12 USP, preparada en cloruro de metileno
Solución de referencia T: 2,0 mg/mL de ER Aditivo Plástico 13 USP, preparada en cloruro de metileno
Prueba A
Sistema cromatográfico
(Ver Cromatografía (621 ), Cromatografía en Capa Delgada.)
Placa: Gel de sílice para cromatografía en capa delgada GF 254
Fase móvil: Trimetilpentano deshidratado y alcohol (75:25, v/v)
Aplicación: 1O µL de Solución muestra S7 Oy Solución de referencia R
Desarrollo: Recorrido de Fase móvil de 1O cm; secar al aire.
Detector: Rociar con una solución de 2 g/L de 2,6-diclorofenol-indofenol sódico en alcohol deshidratado y calentar en
un horno a 120º durante unos pocos minutos para intensificar las manchas.
Análisis: Cualquier mancha correspondiente al aditivo ácido esteárico en la Solución muestra S7O es idéntica en posición (RF
aproximadamente 0,5) pero no es más intensa que la mancha en la misma posición en la Solución de referencia R.
Prueba B
Fase móvil A: Hexano
Fase móvil B: Cloruro de metileno y metanol (95:5, v/v)
Aplicación: 1O µL de Solución muestra S7 Oy Solución de referencia S y Solución de referencia T
Desarrollo A: Sobre una longitud de 1 3 cm con Fase móvil A; secar al aire.
Desarrollo B: Recorrido de Fase móvil B de 1 O cm; secar al aire.
Detector: Rociar con una solución de 40 g/L de ácido fosfomolíbdico en alcohol deshidratado y calentar en un horno a
120º hasta que aparezcan manchas.
Análisis: Cualquier mancha correspondiente a los aditivos oleamida o erucamida en la Solución muestra S1 O son idénticas
en posición (RF aproximadamente 0,2) pero no son más intensas que las manchas correspondientes en la Solución de referencia
S y la Solución de referencia T.

CLORURO DE POLIVINILO PLASTIFICADO

• CLORURO DE POLIVINILO PLASTIFICADO

Los aditivos son ftalato de di(2-etilhexilo), N'N"-diaciletilendiaminas, aceite de soja epoxidado y aceite de linaza epoxidado.
También se monitorea el monómero de cloruro de vinilo (VCM, por sus siglas en inglés) aunque es un monómero residual y
no un aditivo.
Solución A 1: Agregar 2,0 g del material de prueba a 200 mL de éter exento de peróxido y calentar en un condensador de
reflujo durante 8 horas. Separar el residuo resultante B y la solución de extracción A mediante filtración. Evaporar la solución
de extracción A hasta sequedad bajo presión reducida en un baño de agua a 30º para producir el residuo C. Disolver el residuo
C en 1 O mL de tolueno para producir la Solución A 7.
Precipitado B2: Disolver el residuo B en 60 mL de cloruro de etileno calentando en un baño de agua en un condensador
de reflujo para producir la solución D. Filtrar la solución D resultante. Agregar la solución D filtrada gota a gota a gota y agitan-
do vigorosamente a 600 mL de heptanos calentados casi hasta ebullición. Separar el coágulo Bl y la solución orgánica E me-
diante filtración en caliente. Dejar que la solución E se enfríe; separar el precipitado B2 que se forma al enfriarse y pasarlo a
través de un filtro de vidrio sinterizado tarado (tamaño de poro de 16-40 µm).
Soluciones de referencia: Soluciones de O, 1 mg/mL de ER Aditivo Plástico 14 USP, de ER Aditivo Plástico 15 USP y de ER
Aditivo Plástico 16 USP, respectivamente, en tolueno
Sistema cromatográfico
(Ver Cromatografía (621 ), Cromatografía en Capa Delgada.)
Placa: Gel de sílice para cromatografía en capa delgada GF 254 (1 mm de espesor)
Método: Aplicar 0,5 mL de Solución A 7 a la placa como una banda de 30 mm x 3 mm. Aplicar 5 µL de cada Solución de
referencia a la placa. Desarrollar la placa con un recorrido de 15 cm usando tolueno. Secar la placa con cuidado.
594 (661.1) Materiales Plásticos de Construcción/ Pruebas Físicas USP 40

Aditivo Ftalato de di(2-etilhexilo): UV 254 nm; localizar la zona correspondiente al aditivo ftalato de di(2-etilhexilo) (R 1
aproximadamente 0,4). Retirar el área del gel de sílice correspondiente a esta zona, mezclar con 40 mL de éter etílico y agitar
durante 1 minuto. Filtrar, enjuagar con dos cantidades de éter etílico, cada una de 1O mL, agregar los enjuagues al filtrado y
evaporar hasta sequedad. El residuo pesa no más de 40 mg.
Aditivo Aceite de soja epoxidado y aditivo aceite de linaza epoxidado: Exponer la placa a vapor de yodo durante 5 mi-
nutos. Observar el cromatograma y localizar la banda correspondiente al aditivo aceite de soja epoxidado y al aditivo aceite de
linaza epoxidado (R 1 = O). Retirar el área del gel de sílice correspondiente a esta banda. De manera similar, retirar un área co-
rrespondiente del gel de sílice como blanco de referencia. Mezclar por separado ambas muestras con porciones separadas de
40 mL de metano!, agitando durante 15 minutos. Filtrar, enjuagar el filtro con dos volúmenes de 1O mL de metano!, agregar
los enjuagues al filtrado y evaporar hasta sequedad. La diferencia entre las masas de ambos residuos es no más de 1O mg.
Aditivo N,N'-diaciletilendiaminas: Lavar el precipitado B2 con alcohol absoluto. Secar hasta peso constante sobre pentóxi-
do de difósforo y pesar el filtro. El precipitado pesa no más de 20 mg.
• CLORURO DE VINILO
Solución de estándar interno: Usando una microjeringa, inyectar 1O µL de éter etílico en 20,0 mL de N,N-dimetilacetami-
da, sumergiendo la punta de la aguja en el disolvente. Inmediatamente antes de su uso, diluir la solución hasta 1000 veces su
volumen con N,N-dimetilacetamida.
Solución muestra: Colocar 1,0 g del material de prueba en un vial de 50 mL vial, y agregar 10,0 mL de Solución de están-
dar interno. Cerrar el vial y asegurar con un tapón. Agitar, evitando el contacto entre el tapón y el líquido. Colocar el vial en un
baño de agua a 60 ± 1º durante 2 horas.
Solución primaria de cloruro de vinilo: [NOTA-Preparar en una campana ventilada.] Colocar 50,0 mL de N,N-dimetilace-
tamida en un vial de 50 mL, tapar el vial, asegurar el tapón y pesar con una aproximación de O, l mg. Llenar una jeringa de
polietileno o polipropileno de 50 mL con cloruro de vinilo gaseoso, dejar que el gas permanezca en contacto con la jeringa
durante aproximadamente 3 minutos, vaciar la jeringa y llenar nuevamente con 50 mL de cloruro de vinilo gaseoso. Equipar la
jeringa con una aguja hipodérmica y reducir el volumen de gas en la jeringa de 50 a 25 ml. Inyectar los 25 mL remanentes de
cloruro de vinilo lentamente en el vial, agitando suavemente y evitando el contacto entre el líquido y la aguja. Pesar el vial
nuevamente; el aumento en el peso es de aproximadamente 60 mg (1 µL de la solución obtenida contiene aproximadamente
1,2 µg de cloruro de vinilo). Dejar en reposo durante 2 horas. Almacenar la solución primara en un refrigerador.
Solución estándar de cloruro de vinilo: Agregar 3 volúmenes de N,N-dimetilacetamida a 1 volumen de Solución primaria
de cloruro de vinilo.
Soluciones de referencia: Colocar 10,0 mL de Solución de estándar interno en cada uno de seis viales de 50 ml. Cerrar los
viales y asegurar los tapones. Inyectar 1; 2; 3; 5 y 1O µL, respectivamente, de Solución estándar de cloruro de vinilo en cinco de
los viales. Por consiguiente, las seis soluciones obtenidas contienen, respectivamente, O; 0,3; 0,6; 0,9; 1,5 y 3 µg de cloruro de
vinilo. Agitar, evitando el contacto entre el tapón y el líquido. Colocar los viales en un baño de agua a 60±1 ºdurante 2 horas.
Sistema cromatográfico
(Ver Cromatografía (621 ), Cromatografía de Gases.)
Columna: Acero inoxidable de 3 m x 3 mm rellena con tierra diatomácea silanizada para cromatógrafo de gases impreg-
nada con 5% m/m de dimetilestearilamida y 5% m/m de polietilenglicol 400
Gas transportador: Nitrógeno para cromatografía
Velocidad de flujo: 30 mL/min
Temperaturas
Columna: 45º
Inyector: 100º
Detector: 150º
Análisis
Muestra: Inyectar 1 mL de la fase gaseosa de cada vial que contiene la Solución muestra y las Soluciones de referencia.
Calcular la cantidad de cloruro de vinilo en la Solución muestra comparando el resultado de prueba de la Solución muestra con
los resultados de las Soluciones de referencia. Calcular la cantidad de cloruro de vinilo en el material de prueba dividiendo la
cantidad de cloruro de vinilo en la Solución muestra por 1,0 g, produciendo un resultado en µg/g o ppm.
• Estándares de Referencia USP (11)
ER Butil Hidroxitolueno USP
ER Polímero de Olefina Cíclica USP
ER Copolímero de Olefina Cíclica USP
ER Polietileno de Alta Densidad USP
ER Homopolímero de Polipropileno USP
ER Polietileno de Baja Densidad USP
ER Aditivo Plástico 01 USP
Bis[3,3-bis[3-(l, l-dimetiletil)-4-hidroxifenil]butanoato] de etileno.
ER Aditivo Plástico 02 USP
Tetrakis[3-(3,5-di-terc-butil-4-hidroxifen il)propionato] de pentaeritritilo.
ER Aditivo Plástico 03 USP
2,2' ,2", 6,6', 6" -Hexa-terc-butil-4,4' ,4" -[ (2,4, 6-trimetil-l, 3,5-bencenotriil)trismetileno ]trifenol.
USP 40 Pruebas Físicas/ (661.2) Sistemas de Envases Plásticos 595

ER Aditivo Plástico 04 USP

3-(3,5-di-terc-butil-4-hidroxifenil)propionato de octadecilo.
ER Aditivo Plástico 05 USP
Fosfato de tris(2,4-di-terc-butilfenilo).
ER Aditivo Plástico 06 USP
l, 3,5-T ris(3,5-di-terc-butil-4-h idroxibencil)-s-triazina-2,4,6(1 H, 3H,5 H)-triona.
ER Aditivo Plástico 08 USP
Disulfuro de dioctadecilo.
ER Aditivo Plástico 09 USP
3,3'-Tiodipropionato de didodecilo.
ER Aditivo Plástico 1O USP
3,3'-Tiodipropionato de dioctadecilo.
ER Aditivo Plástico 11 USP
Copolímero de succinato de dimetilo y (4-hidroxi-2,2,6,6-tetrametilpiperidin-1-il)etanol.
ER Aditivo Plástico 12 USP
Olea mida.
ER Aditivo Plástico 13 USP
Erucamida.
ER Aditivo Plástico 14 USP
Ftalato de di(2-etilhexilo).
ER Aditivo Plástico 15 USP
Aceite de soja epoxidado.
ER Aditivo Plástico 16 USP
Aceite de linaza epoxidado.
ER Tereftalato de Polietileno USP
ER Tereftalato G de Polietileno USP
ER Cloruro de Polivinilo Plastificado USP
ER Ácido Esteárico USP

(661.2) SISTEMAS DE ENVASES PLÁSTICOS PARA USO FARMACÉUTICO

INTRODUCCIÓN
Un sistema de envase, según se define en el capítulo Requisitos de Envasado y Almacenamiento (659), contiene o está destina-
do a contener un artículo médico tal como un medicamento. Como tal, un sistema de envase provee los medios para fabricar,
distribuir y almacenar dichos artículos y productos, y potencialmente para la administración de medicamentos. Un sistema de
envase plástico está compuesto en su totalidad, o en un porcentaje significativo, por materiales plásticos. El término "sistema
de envase plástico" se refiere a la suma de los componentes de envase que en conjunto contienen el producto farmacéutico,
incluidos los cierres. La suma de los componentes de los envases incluye: 1) componentes de los envases primarios, que son
aquellos que están en contacto directo con el producto farmacéutico en algún momento durante la fabricación, distribución,
almacenamiento o uso del producto; y 2) componentes de los envases secundarios, que son aquellos que pueden interactuar
con el producto farmacéutico durante la fabricación, distribución, almacenamiento y uso del producto, aunque el componente
no entre en contacto directo con el producto farmacéutico.

ALCANCE
Los sistemas de envases plásticos para uso farmacéutico incluyen, entre otros, bolsas, frascos, viales, ampollas, cartuchos, in-
haladores de polvo seco y de dosis fija, jeringas prellenadas, blísteres, bolsas (pouches), así como sus cierres y componentes
secundarios asociados tales como etiquetas y sobrebolsas para impresión. Los materiales plásticos que se usan comúnmente en
los sistemas de envase incluyen polietileno, polipropileno, olefinas cíclicas, tereftalato de polietileno, tereftalato G de polietile-
no y cloruro de polivinilo plastificado, entre otros.
Los medicamentos pueden presentar una interacción química con sus sistemas de envases asociados y/o con los materiales
plásticos del sistema y los componentes de construcción durante la fabricación, el transporte, el almacenamiento y la adminis-
tración del producto. La magnitud de estas interacciones no debe afectar de manera adversa la aptitud de uso del medicamen-
to o el sistema de envase. Aunque la aptitud de uso incluye diversos aspectos relacionados con la calidad del medicamento
envasado y su desempeño, el aspecto de la aptitud de uso específicamente tratado en este capítulo es la seguridad del pacien-
te.
596 (661.2) Sistemas de Envases Plásticos/ Pruebas Físicas USP 40

El solicitante que garantice y obtenga la aprobación reglamentaria de un sistema de envase o medicamento envasado es
responsable de establecer que el sistema de envase del producto cumpla con estas expectativas y, por ende, que sea adecuado
para su uso previsto asegurando que el mismo sistema de envase y/o el producto farmacéutico envasado hayan sido apropia-
damente analizado y que los resultados de prueba hayan sido evaluados de manera apropiada. Un sistema de envase es quími-
camente adecuado para su uso previsto con respecto a la seguridad siempre que:
• El sistema de envase se fabrique a partir de materiales bien caracterizados que hayan sido seleccionados intencionalmente
para el uso establecido mediante el análisis descrito en el capítulo Materiales Plásticos de Construcción (661 .1 ).
• Se hayan establecido las propiedades fisicoquímicas generales del sistema de envase.
• Se haya establecido de manera apropiada la biocompatibilidad del sistema de envase (reactividad biológica).
• Se haya establecido que el sistema de envase es seguro mediante el análisis químico apropiado, tal como perfil de sustan-
cias extraíbles o lixiviables y evaluación toxicológica de los datos de prueba. Esta combinación de análisis químico y de
evaluación toxicológica se denomina "evaluación de seguridad química".
Este capítulo se aplica específicamente a los sistemas de envases plásticos y no debe aplicarse a los materiales a partir de los
que se construyen dichos sistemas. El análisis y la calificación de materiales de construcción usados en los sistemas de envases
se tratan en el capítulo (661.1 ). Según lo considere apropiado el solicitante que garantice y obtenga la aprobación reglamenta-
ria de un sistema de envase o medicamento envasado, los componentes de los sistemas de envases pueden analizarse usando
los métodos y sujetándose a las especificaciones provistas en este capítulo.
Los métodos de prueba y las especificaciones contenidas dentro de este capítulo han sido desarrollados para su aplicación
general a los sistemas de envases plásticos. En vista de la amplia variedad de materiales de construcción y sistemas de envases
disponibles y reconociendo la posibilidad de nuevos avances en materiales y sistemas de envases, la publicación de un método
de prueba y su especificación no excluye el uso, en circunstancias justificadas, de sistemas de envase que hayan sido analizadas
con métodos diferentes o que cumplan con otras especificaciones, estando sujetos a la aprobación por parte de la autoridad
reglamentaria apropiada.

MÉTODOS DE PRUEBA

Reactividad Biológica

Las pruebas biológicas in vitro se realizan en los sistemas de envases de acuerdo con los procedimientos de prueba descritos
en el capítulo Pruebas de Reactividad Biológica, In Vitro (87). Los sistemas de envases que cumplen con los requisitos de las prue-
bas in vitro no están obligados a someterse a análisis in vivo adicionales. Asimismo, el análisis in vivo descrito en el capítulo
Pruebas de Reactividad Biológica, In Vivo (88) no es obligatorio para sistemas de envases que se usan con ciertas formas farma-
céuticas (productos orales y tópicos). Los sistemas de envases que no cumplen con los requisitos de las pruebas de reactividad
biológica ((87) y (88), cuando sea apropiado) no son adecuados como sistemas de envases para uso farmacéutico. Cuando se
requiera la designación de una clase de plástico (clases 1-VI), los analistas deben realizar las pruebas in vivo apropiadas especifi-
cadas en el capítulo (88). La información sobre las clases de plásticos apropiadas que deben seleccionarse se provee en el capí-
tulo Biocompatibilidad de los Materiales Usados en Envases de Medicamentos, Dispositivos Médicos e Implantes (1031 ).

Pruebas Fisicoquímicas

EXTRACCIÓN DE AGUA

Solución Cl: Llenar el sistema de envase hasta su capacidad nominal con Agua Purificada y cerrarlo, de ser posible, usando el
medio de cierre normal. De otro modo, cerrar con un cierre inerte. Calentar en un autoclave hasta alcanzar una temperatura
de 121 ± 2º (por lo regular en 20-30 minutos) y mantener a esta temperatura durante 30 minutos. Si el calentamiento a 121 º
conlleva al deterioro del envase, calentar a 1 00 ± 2º durante 2 horas o a 70 ± 2º durante 24 ± 2 horas. Enfriar el sistema de
envase lleno y vaciar el contenido. El contenido vaciado será la Solución CJ. Usar la Solución CJ dentro de las 4 horas de su
preparación. Preparar un blanco calentando Agua Purificada en un matraz de vidrio de borosilicato cerrado con un cierre iner-
te; calentar el matraz a la misma temperatura y durante el mismo tiempo que con la preparación de la Solución CJ.
Absorbancia: Determinar el espectro de la Solución CJ entre 230 y 360 nm, usando el blanco de la Solución CJ como líquido
de compensación.
Acidez o alcalinidad: Realizar la prueba de Acidez o alcalinidad únicamente cuando los sistemas de envases estén destinados a
contener un producto líquido o un producto que se disuelva en su envase antes de su uso.
Agregar O, 1 mL de fenolftaleína SR a 20 mL de Solución CJ obtenida ya sea como una porción de la solución de llenado o
combinando la solución de llenado de distintos envases; tener en cuenta el color de la solución. Agregar 0,4 mL de hidróxido
de sodio 0,01 N; tener en cuenta el color de la solución. Agregar 0,8 mL de ácido clorhídrico 0,01 N y O, 1 mL de rojo de
metilo SR 2; tener en cuenta el color de la solución.
Rojo de Metilo SR 2: Prueba de sensibilidad: Agregar O, 1 mL de solución de rojo de metilo a 100 mL de Agua Purificada exenta
de dióxido de carbono y 0,05 mL de ácido clorhídrico 0,02 N. Se requiere no más de O, 1 mL de ácido clorhídrico 0,02 N para
cambiar el color de rojo a amarillo.
USP 40 Pruebas Físicas/ (661.2) Sistemas de Envases Plásticos 597

CARBONO ORGÁNICO TOTAL

Referirse al capítulo Carbono Orgánico Total (643).

El contenido de carbono orgánico total (TOC, por sus siglas en inglés) de la Solución C1 se mide de acuerdo al capítulo
(643). Sin embargo, el capítulo (643) está diseñado para analizar agua de alta pureza con valores bajos de carbono orgánico
total. Debido a las sustancias orgánicas extraídas, los extractos de materiales pueden tener valores de carbono orgánico total
mucho más altos que los del Agua Purificada. Por ende, los análisis de carbono orgánico total realizados tienen un límite de
detección de 0,2 mg/L (ppm) y tienen un intervalo dinámico lineal demostrado de 0,2-20 mg/L (que abarca el límite de car-
bono orgánico total). Se puede usar un intervalo lineal con una concentración superior más alta siempre que se establezca la
linealidad. Si los extractos de la muestra exceden este intervalo lineal superior, entonces deben diluirse apropiadamente para
su análisis.

SUBUNIDADES TEREFTALOÍLO TOTALES EN SISTEMAS DE ENVASES DE TEREFTALATO DE POLIETILENO Y DE TEREFTALATO G

DE POLIETILENO

Preparaciones
Medios de extracción de tereftalato de polietileno: Alcohol al 50% (diluir 125 mL de alcohol R deshidratado con Agua Purificada
hasta 238 mL y mezclar), n-heptano y Agua Purificada. Para cada medio de extracción, llenar un número suficiente de sistemas
de envases de prueba hasta el 90% de su capacidad nominal para obtener no menos de 30 mL. Llenar un número correspon-
diente de frascos de vidrio con cada medio de extracción para usarlos como blancos. Equipar los frascos con sellos impermea-
bles tales como papel de aluminio y colocar los cierres. Incubar los sistemas de envases de prueba y los frascos de vidrio a 49º
durante 1O días. Retirar los sistemas de prueba y los frascos de vidrio y almacenar a temperatura ambiente. No transferir las
muestras de medio de extracción a vasos de almacenamiento alternativos.
Medios de extracción de tereftalato G de polietileno: Alcohol al 25% (diluir 125 mL de alcohol al 50% con Agua Purificada hasta
250 mL y mezclar), n-heptano y Agua Purificada. Proceder según se indica en Medios de extracción de tereftalato de polietileno.
Procedimiento: Determinar la absorbancia de los extractos de alcohol al 50% o alcohol al 25% en una celda de 1 cm a la
longitud de onda de absorbancia máxima a aproximadamente 244 nm (ver Espectroscopía Ultravioleta-Visible (857)). Para el
blanco, usar el blanco de medio de extracción correspondiente.
Determinar la absorbancia del extracto de n-heptano en una celda de 1 cm a la longitud de onda de absorbancia máxima a
aproximadamente 240 nm (ver el capítulo (857)). Para el blanco, usar el medio de extracción de n-heptano.

ETILENGLICOL EN SISTEMAS DE ENVASES DE TEREFTALATO DE POLIETILENO Y DE TEREFTALATO G DE POLIETILENO

Preparaciones
Solución de ácido peryódico: Disolver 125 mg de ácido peryódico en 1O mL de Agua Purificada.
Ácido sulfúrico diluido: Agregar lentamente y mezclando constantemente 50 mL de ácido sulfúrico a 50 mL de Agua Purifica-
da y dejar que se enfríe a temperatura ambiente.
Solución de bisulfito de sodio: Disolver O, 1 g de bisulfito de sodio en 1O mL de agua. Usar esta solución dentro de los 7 días.
Solución de cromotropato disódico: Disolver 100 mg la sal disódica del ácido cromotrópico R en 100 mL de ácido sulfúrico.
Proteger esta solución de la luz y usar dentro de los 7 días.
Solución estándar: Disolver una cantidad pesada con exactitud de etilenglicol en Agua Purificada y diluir cuantitativamente y
en diluciones sucesivas si fuera necesario hasta obtener una solución con una concentración conocida de aproximadamente 1
µg/ml.
Solución muestra: Usar el extracto de Agua Purificada de Subunidades Tereftaloílo Totales en Sistemas de Envases de Tereftalato
de Polietileno y de Tereftalato G de Polietileno.
Procedimiento: Transferir 1,0 mL de Solución estándar a un matraz volumétrico de 1O mL. Transferir 1,0 mL de Solución mues-
tra a un segundo matraz volumétrico de 1O mL. Transferir 1,0 mL de medio de extracción de Agua Purificada a un tercer ma-
traz volumétrico de 1O mL que sirva como blanco del método. Agregar 100 µL de Solución de ácido peryódico a cada uno de los
tres matraces, agitar por rotación suave hasta mezclar y dejar en reposo durante 60 minutos. Agregar 1,0 mL de Solución de
bisulfito de sodio a cada matraz y mezclar. Agregar 100 µL de Solución de cromotropato disódico a cada matraz y mezclar.
[NOTA-Todas las soluciones deben analizarse dentro de la primera hora posterior a la adición de la Solución de cromotropato
disódico.] Agregar cuidadosamente 6 mL de ácido sulfúrico a cada matraz, mezclar y dejar que las soluciones se enfríen a tem-
peratura ambiente.
[PRECAUCIÓN-La dilución del ácido sulfúrico produce calor significativo y puede ocasionar que la solución hierva. Realizar dicha
adición con cuidado. Se emitirán gases de dióxido de azufre. Se recomienda usar una campana de extracción.]
Diluir cada solución con Ácido sulfúrico diluido a volumen y mezclar. Determinar concomitantemente las absorbancias de las
soluciones a partir de la Solución estándar y de la Solución muestra en celdas de 1 cm a la longitud de onda de absorbancia
máxima a aproximadamente 575 nm (ver el capítulo (857)), usando como blanco del método el medio la solución de extrac-
ción de Agua Purificada.
598 (661.2) Sistemas de Envases Plásticos/ Pruebas Físicas USP 40

Evaluación de Seguridad Química

Se debe establecer la seguridad del sistema de envase con fundamento en el análisis químico relevante y apropiado 1) del
sistema de envase, 2) de sus materiales de construcción, 3) de sus componentes de construcción, según corresponda, o 4) del
medicamento envasado. El análisis químico apropiado de materiales de construcción se especifica en el capítulo (661.1) y pue-
de incluir la demostración de cumplimiento con las secciones apropiadas de las reglamentaciones del Título 21 del CFR sobre
Aditivos Alimentarios Indirectos (lndirect Food Additives). Con respecto al análisis del sistema de envase (y/o sus componentes
de construcción según corresponda) y al medicamento envasado, una evaluación de seguridad química rigurosa incluiría el
análisis de sustancias extraíbles del sistema de envase y el análisis de lixiviables del medicamento envasado. Se espera que el
diseño del estudio de sustancias extraíbles y lixiviables se base en principios científicos rigurosos y justificables, y que los estu-
dios mismos sean uniformes con respecto a 1) la naturaleza del sistema de envase y del medicamento envasado, 2) al uso clíni-
co del medicamento envasado y 3) al riesgo de seguridad percibido, asociado con el sistema de envase y la forma farmacéuti-
ca. Aunque ninguna forma farmacéutica está exenta de este requisito de análisis, se anticipa que el carácter y el grado del
análisis dependerían de la forma farmacéutica y sería congruente con un enfoque basado en riesgos. En vista de la considera-
ble diversidad de los sistemas de envases, de las formas farmacéuticas y de los medicamentos envasados, no es posible proveer
condiciones de prueba específicas para realizar los estudios de sustancias extraíbles y lixiviables. Sin embargo, se pueden en-
contrar principios básicos generales y recomendaciones sobre las mejores prácticas demostradas para estudios de sustancias
extraíbles y lixiviables en los capítulos Evaluación de Sustancias Extraíbles Relacionadas con Envases Farmacéuticos y Sistemas de
Administración (1663) y Evaluación de Sustancias Lixiviables en Medicamentos Relacionadas con Envases Farmacéuticos y Sistemas
de Administración (1664), respectivamente. Estos capítulos pueden servir como recursos útiles para el diseño y la justificación
de estudios rigurosos y apropiados.
Pueden ser apropiadas estrategias alternativas de análisis para la evaluación de seguridad química en circunstancias justifica-
das, las cuales están sujetas a un convenio con la autoridad reglamentaria apropiada.

ESPECIFICACIONES

Reactividad Biológica

Los resultados de la prueba son consistentes con los capítulos pertinentes ((87) u (88)).

Pruebas Fisicoquímicas

Apariencia de la solución: La Solución C7 es transparente e incolora.

Absorbancia: No más de 0,20
Acidez o alcalinidad: La solución es incolora después de la adición de solución de fenolftaleína, rosada después de la adición
de hidróxido de sodio 0,01 N y roja anaranjada o roja después de la adición de ácido clorhídrico 0,01 N y de 0, 1 mL de solu-
ción de rojo de metilo.
Contenido orgánico total: La diferencia en las concentraciones de carbono orgánico total entre la Solución C7 y el blanco
adecuado es no más de 8 mg/L.
Etilenglicol en sistemas de envases de tereftalato de polietileno y de tereftalato G de polietileno: La absorbancia de la
solución a partir de la Solución muestra no excede la de la solución a partir de la Solución estándar, correspondiente a no más
de 1 ppm de etilenglicol.
Subunidades tereftaloílo totales en sistemas de envases de tereftalato de polietileno y de tereftalato G de polietileno:
La absorbancia de los extractos de alcohol al 50%, del alcohol al 25% y de n-heptano no exceden de O, 150, correspondiente a
no más de 1 ppm de subunidades tereftaloílo totales.

Evaluación de Seguridad Química

Los datos y la información obtenida en la Evaluación de Seguridad Química deben interpretarse en el contexto de establecer
los riesgos para la seguridad del paciente relacionados con el uso del sistema de envase y la administración del medicamento
envasado. Por lo regular, dicha interpretación de los datos químicos implica la evaluación de los datos de seguridad toxicológi-
ca de sustancias extraíbles y lixiviables, sustentados, según corresponda, por otros análisis pertinentes. En este caso, la evalua-
ción de seguridad toxicológica debe realizarse para cada componente individual relevante del perfil de sustancias extraíbles del
sistema de envase (o cada componente relevante del perfil de sustancias lixiviables del producto, según corresponda). La eva-
luación debe demostrar que el riesgo para la seguridad del usuario relacionado con cada sustancia lixiviable individual relevan-
te (o sustancia extraíble como lixiviable en el peor de los casos) sea aceptable y que el riesgo probable de seguridad represen-
tado por todas las sustancias lixiviables (o sustancias extraíbles como sustancias lixiviables en el peor de los casos), considera-
das de manera individual, esté dentro de los parámetros aceptables. El término "sustancias extraíbles o lixiviables relevantes"
se refiere a aquellas sustancias extraíbles que están presentes en el sistema de envase y aquellas sustancias lixiviables que están
presentes en un medicamento envasado en niveles lo suficientemente altos como para considerar que tienen un impacto po-
USP 40 Pruebas Físicas/ (670) Envases-Componentes Auxiliares 599

tencial en la seguridad, basándose, por ejemplo, en una comparación de los niveles de sustancias extraíbles o lixiviables con un
umbral de alerta de seguridad reconocido y bien establecido. Establecer y justificar los parámetros aceptables usados para eva-
luar el impacto en la seguridad es responsabilidad del solicitante que procura y obtiene la aprobación reglamentaria de un
sistema de envase o medicamento envasado; dichos parámetros aceptables deben basarse y derivarse de la aplicación rigurosa
de principios establecidos de evaluación de seguridad toxicológica.
Para sustancias lixiviables que también son impurezas elementales, tener en cuenta que los límites para impurezas elementa-
les en medicamentos comercializados (pero no específicamente para sistemas de envases) pueden encontrarse en el capítulo
Impurezas Elementales-Límites (232).
Pueden ser apropiadas especificaciones alternativas de evaluación de seguridad química en circunstancias justificadas, las
cuales están sujetas a un convenio con la autoridad reglamentaria apropiada.

(670) ENVASES-COMPONENTES AUXILIARES

Los componentes auxiliares de los envases son artículos que se usan para respaldar o mejorar los sistemas de envase-cierre.
Estos artículos incluyen, entre otros, torunda farmacéutica (pharmaceutical coil) y desecantes para envases. Los componen-
tes que se describen en este capítulo deben cumplir con los requisitos aplicables aquí provistos y los requisitos aplicables
adicionales provistos en otros capítulos especificados.

Cambio en la ,.daccl6n:.
TORUNDA FARMACÉUTICA
La torunda farmacéutica se usa como material de relleno en envases de unidades múltiples para formas farmacéuticas sólidas
orales a fin de evitar la ruptura de tabletas o cápsulas durante el transporte. El material de relleno se debe desechar una vez
que se ha abierto el frasco.
• SOLUCIONES
Solución yodada de cloruro de cinc: Disolver 20 g de cloruro de cinc y 6,5 g de yoduro de potasio en 10,5 mL de Agua
Purificada. Agregar 0,5 g de yodo y agitar durante 15 minutos. Filtrar si fuera necesario. Proteger de la luz.
Solución de cloruro de cinc-ácido fórmico: Disolver 20 g de cloruro de cinc en 80 g de una solución de 850 g/L de áci-
do fórmico anhidro.
Solución al 1% de Colorante Nº 4 para Identificación de Fibras DuPont1 : Disolver 3,8 g de colorante en polvo en
378,5 mL de agua desionizada.
• TORUNDA FARMACÉUTICA DE ALGODÓN
El algodón purificado es el pelo de la semilla de las variedades cultivadas de Gossypium hirsutum L. u otras especies de
Gossypium (Fam. Malvaceae). Se elimina la materia grasa y se blanquea, y no contiene más que trazas de residuo de hojas,
pericarpio, recubrimiento de la semilla u otras impurezas. La torunda farmacéutica de algodón se usa en frascos de formas
farmacéuticas sólidas orales para evitar la ruptura.
Identificación
A. Cuando se examinan al microscopio, se observa que cada fibra consiste en una célula individual, de hasta aproxima-
damente 4 cm de longitud y 40 µm de ancho, en forma de un tubo aplanado con paredes gruesas y redondeadas que
están a menudo retorcidas.
B. Cuando se tratan con Solución yodada de cloruro de cinc, las fibras se tornan de color violeta.
C. Agregar 1 O mL de Solución de cloruro de cinc-ácido fórmico a O, 1 g de fibras, calentar a 40º y dejar en reposo durante
2 horas, agitando ocasionalmente: las fibras no se disuelven.
D. Pesar aproximadamente 5 g de fibras, humedecer con agua y exprimir el exceso. Agregar las fibras a 100 mL de
Solución al 7% de Colorante Nº 4 para Identificación de Fibras DuPont en ebullición y calentar a ebullición suave durante al
menos 1 minuto. Retirar las fibras, enjuagar bien en agua fría y exprimir el exceso de líquido: las fibras se tornan de color
verde.
Acidez o alcalinidad: Sumergir aproximadamente 1 O g de fibras en 100 mL de Agua Purificada recientemente calentada
a ebullición y enfriada, y dejar que se macere durante 2 horas. Decantar en dos cápsulas sendas porciones de 25 mL del
agua con ayuda de una varilla de vidrio. Agregar a una porción 3 gotas de fenolftaleína SR y agregar a la otra porción
1 gota de anaranjado de metilo SR. Ninguna porción se presenta de color rosa cuando se observa contra un fondo blan-
co.
Fluorescencia: Examinar una capa de aproximadamente 5 mm de espesor bajo luz UV a 365 nm. Presenta solamente una
ligera fluorescencia de color violeta amarronado y unas pocas partículas de color amarillo. No presenta una fluorescencia
de color azul intenso, excepto por la que pueden presentar unas pocas fibras aisladas.
Concentración de peróxido de hidrógeno residual: Colocar 1 g de fibras en un vaso de precipitados que contenga 30
mL de Agua Purificada y mezclar durante 3 minutos con una varilla de vidrio. Verter el contenido en otro recipiente limpio

1 El Colorante Nº 4 para Identificación de Fibras DuPont está disponible en Pylam Products Co., 2175 East Cedar Street, Tempe, AZ 85281; www.pylamdyes.com
600 (670) Envases-Componentes Auxiliares/ Pruebas Físicas USP 40

(no exprimir la muestra), o como alternativa, retirar las fibras de la solución con tenacillas limpias. Retirar una tira de prue-
ba analítica de peróxido2 de su envase y sumergir el extremo de prueba en el líquido de muestra durante 2 segundos.
Agitar para eliminar el exceso de líquido, insertar inmediatamente la tira de prueba en un instrumento de reflectometría
adecuado y registrar la lectura en mg/kg (ppm), y calcular la concentración de peróxido de hidrógeno residual en ppm.
Como método alternativo, colocar 20 g en un vaso de precipitados, agregar 400 mL de Agua Purificada, mezclar, agregar
20 mL de ácido sulfúrico al 20% y mezclar el contenido. Valorar con solución de permanganato de potasio O, 100 N
hasta un color rosado pálido que permanezca durante 30 segundos. Registrar la cantidad de contenido y calcular la con-
centración en ppm.
Se encuentra no más de 50 ppm usando cualquiera de los métodos.
Pérdida por Secado (731)
Análisis: Secar 5 g de fibras en un horno a 105º hasta peso constante.
Criterios de aceptación: No más de 8,0%
Residuo de Incineración (281)
Análisis: Colocar 5 g de fibras en una cápsula de porcelana o platino y humedecer con ácido sulfúrico 2 N. Calentar sua-
vemente el algodón hasta que se carbonice, luego incinerar con mayor intensidad hasta que el carbono se haya consu-
mido completamente.
Criterios de aceptación: No más de 0,20%
Sustancias solubles en agua: Colocar 1Og de fibras en un vaso de precipitados que contenga 1000 mL de Agua Purifica-
da y calentar a ebullición suave durante 30 minutos, agregando agua según se requiera para mantener el volumen. Verter
el agua a través de un embudo en otro vaso y exprimir el exceso de agua del algodón con una varilla de vidrio. Lavar el
algodón en el embudo con dos porciones de 250 mL de agua en ebullición, presionando el algodón después de cada
lavado. Filtrar el extracto y los lavados combinados y lavar el filtro minuciosamente con agua caliente. Evaporar el extracto
y los lavados combinados hasta un volumen pequeño, transferir a una cápsula de porcelana o platino tarada, evaporar
hasta sequedad, y secar el residuo a 105º hasta peso constante. El residuo pesa no más de 0,35%.
Materia grasa: Compactar 1O g de fibras en un extractor Soxhlet equipado con un receptor tarado y extraer con éter
etílico durante 4 horas a una velocidad tal que permita que el éter se descargue por sifón no menos de 4 veces por hora.
La solución de éter etílico en el matraz no presenta trazas de color azul, verde o marrón. Evaporar el extracto hasta seque-
dad y secar a 105º durante 1 hora. El peso del residuo no excede de 0,7%.
Colorantes: Compactar aproximadamente 1Og de fibras en un percolador estrecho y extraer lentamente con alcohol
hasta que el percolado alcance 50 mL. Cuando se observa hacia abajo a través de una columna de 20 cm de profundidad,
el percolado puede presentar un color amarillento, pero no una coloración azul o verde.
Otra materia extraña: Al inspeccionar visualmente los pequeños trozos de algodón no contienen manchas de aceite o
partículas metálicas.
•TORUNDA FARMACÉUTICA DE RAYÓN
La torunda farmacéutica de rayón es una forma fibrosa de celulosa regenerada blanqueada que se usa como relleno en fras-
cos de formas farmacéuticas sólidas orales para evitar la ruptura. Consiste exclusivamente en fibras de rayón excepto por
unas pocas fibras extrañas aisladas que pueden estar presentes. [NOTA-Se ha demostrado que la torunda farmacéutica de
rayón es una fuente potencial de problemas de disolución para cápsulas de gelatina o tabletas recubiertas de gelatina que
resultan del entrecruzamiento de la gelatina.]
Identificación
A. Cuando se tratan con Solución yodada de cloruro de cinc, las fibras se tornan de color violeta.
B. Agregar 1 O mL de Solución de cloruro de cinc-ácido fórmico a O, 1 g de fibras, calentar a 40º y dejar en reposo durante
2 horas, agitando ocasionalmente: las fibras se disuelven por completo, excepto por las fibras de rayón mate en las que
permanecen partículas de titanio.
C. Pesar aproximadamente 5 g de fibras, humedecer con agua y exprimir el exceso. Agregar las fibras a 100 mL de solu-
ción al 7% de Colorante Nº 4 para Identificación de Fibras DuPont en ebullición y calentar a ebullición suave durante al
menos 1 minuto. Retirar las fibras, enjuagar bien en agua fría y exprimir el exceso de líquido: las fibras se tornan de color
azul verdoso.
Acidez o alcalinidad, Fluorescencia, Materia grasa, Colorantes y Otra materia extraña: Proceder según se indica en
Torunda Farmacéutica de Algodón, excepto que se debe usar torunda farmacéutica de rayón. El peso de la muestra para
materia grasa es 5 g y el peso del residuo no excede de 0,5%.
Pérdida por Secado (731)
Análisis: Secar 5 g de fibras en un horno a 105º hasta peso constante.
Criterios de aceptación: No más de 11,0%
Residuo de Incineración (281 ): No más de 1,50%, determinado en una muestra de prueba de 5 g
Cenizas insolubles en ácido: Agregar 25 mL de ácido clorhídrico 3 N al residuo obtenido en la prueba de Residuo de
Incineración y calentar a ebullición durante 5 minutos. Recoger la materia insoluble en un crisol de filtración tarado, lavar
con agua caliente, incinerar y pesar: el residuo pesa no más de 1,25%.

2Un sistema de análisis adecuado que consiste en tiras de prueba de peróxido Reflectoquant® y un instrumento de reflectometría RQflex® se puede obtener de
EMD Chemicals lnc., 480 S. Democrat Road, Gibbstown, N) 08027: www.emdchemicals.com.
USP 40 Pruebas Físicas/ (670) Envases-Componentes Auxiliares 601

Sustancias solubles en agua: Proceder según se indica en Torunda Farmacéutica de Algodón, excepto que se debe usar
torunda farmacéutica de rayón. El residuo pesa no más de 1,0%.
•TORUNDA FARMACÉUTICA DE POLIÉSTER
La torunda farmacéutica de poliéster es un material blanco e inodoro que se usa como relleno en frascos de formas farma-
céuticas sólidas orales para evitar la ruptura.
Identificación
A. Proceder según se indica en Espectroscopía infrarroja en la sección de Métodos de Prueba. Determinar el espectro IR de
4000 a 650 cm- 1 (2,5 a 15 µm). El espectro obtenido de la muestra presenta bandas de absorción principales solo a las
mismas longitudes de onda que el espectro de ER Tereftalato de Polietileno USP.
B. Pesar aproximadamente 5 g de fibras, humedecer con agua y exprimir el exceso. Agregar fibras a 1 00 mL de Solución
al 7% de Colorante Nº 4 para Identificación de Fibras DuPont en ebullición y calentar a ebullición suave durante al menos 1
minuto. Retirar las fibras, enjuagar bien en agua fría, y exprimir el exceso de líquido: las fibras se tornan de color anaran-
jado pálido.
Acidez o alcalinidad: Proceder según se indica en Torunda Farmacéutica de Algodón, excepto que se debe usar torunda
farmacéutica de poliéster.
Pérdida por Secado (731)
Análisis: Secar 5 g de fibras en un horno a 105º hasta peso constante.
Criterios de aceptación: No más de 1,0%
Residuo de Incineración (281): No más de 0,5%, determinado en una muestra de prueba de 5 g
Acabado sobre fibras: El acabado sobre las fibras usado para el procesamiento debe cumplir con los reglamentos de la
FDA para el contacto con alimentos.
• MÉTODOS DE PRUEBA
Espectroscopía infrarroja3
Aparato: FTIR o un espectrofotómetro de doble haz capaz de barrer de 4000 a 650 cm- 1 (2,5-15 µm).
Preparación de la muestra: •ta técnica de reflectancia total átenuada(ATR, por sus siglas en inglés) {197A) puede usar~
se eomo método alternativo cüando los espectros del Estándar de Referencia se obtengan· de manera similar.• usr4 o
Método 1 (disco de bromuro de potasio): Usar tijeras para cortar las fibras de poliéster (1-3 mg) en longitudes cortas
(menos de 1 mm de longitud), mezclar con 200 mg de bromuro de potasio en polvo y moler en un molino de bolas
durante 1-2 minutos. Transferir a una matriz para discos de bromuro de potasio y formar un disco.
Método 2 (película fundida): Generar una película presionando fibras de poliéster entre láminas de TFE-fluorocarbono
y colocar entre placas calientes.

Cambio en fo redacción;

DESECANTES
Los desecantes se usan para eliminar la humedad del aire en los envases con el fin de proteger los medicamentos, particular-
mente las formas farmacéuticas sólidas orales. Se proveen en diversos materiales de envasado que incluyen algodón, papel
Kraft, bolsas de tela de rayón y poliéster, plástico perforado, películas de polímero, contenedor pequeño de polímero o
Tyvek®. Los tipos más comunes de desecantes comerciales son bentonita, cloruro de calcio, óxido de calcio, tamices mole-
culares y gel de sílice. Otros tipos de desecantes deben someterse a un análisis apropiado para asegurar su aptitud para la
aplicación prevista.
Cuando los desecantes se incorporan directamente en la pared o tapa de los envases, o están contenidos en un material porta-
dor usar un desecante no incorporado en los métodos de prueba. Para los desecantes que se cargan con un contenido de
humedad predeterminado, realizar el análisis antes de que se cargue la humedad o después de que el desecante se haya
regenerado.
• BENTONITA
La arcilla de bentonita (también denominada arcilla de montmorillonita) es un silicato de aluminio hidratado coloidal natu-
ral.
Aspecto: Polvo o pellets de color blanco grisáceo con un tinte amarillento o rosado
Identificación-Difracción de Rayos X (941): Para la Preparación muestra A, el pico más grande corresponde a un valor d
entre 15,0 y 17,2 A. El pico principal en la región entre 1,48 y 1,54 A a partir del patrón de la Preparación muestra B está
entre 1,492 y 1,504 A.
Identificación-precipitación: Se forma un precipitado gelatinoso de color blanco.
Impurezas inorgánicas
Arsénico: No más de 1 O mg/kg
Plomo: No más de 1 5 mg/kg
Pruebas específicas
pH (791 ): 4,5-10,5. Dispersar 4,0 g en 200 mL de agua, mezclar vigorosamente para facilitar la humectación.

3 Se puede encontrar información adicional sobre métodos de identificación para fibras en "Standard Test Methods tor ldentification of Fibers in Textiles" (Méto.
dos de Prueba Estándar para Identificación de Fibras en Textiles). Versión actual del Método D276 de ASTM, publicada por ASTM lnternational, 100 Barr Harbor
Drive, P.O. Box C700, West Conchohocken, PA 19428-2959. www.astm.org.
602 (670) Envases-Componentes Auxiliares/ Pruebas Físicas USP 40

Pérdida por Secado (731 ): Secar una muestra de 5-1 Og a 11 Oº hasta peso constante: pierde no más de 3,0%.
[NOTA-Realizar la valoración inmediatamente después de abrir el envase original.]
Capacidad de adsorción de humedad
No menos de 1 3% a 40% ± 5% humedad relativa (HR) y 25 ± 2º
No menos de 23% a 80% ± 5% HR y 25 ± 2º
Métodos de prueba
Identificación-Difracción de rayos X
Preparación muestra A: Agregar 2 g en pequeñas porciones a 100 ml de agua, agitando intensamente. Dejar en re-
poso durante 12 horas para asegurar una hidratación completa. Colocar 2 ml de la muestra así obtenida en un porta-
objetos de vidrio adecuado y dejar que se seque al aire a temperatura ambiente para producir una película orientada.
Colocar el portaobjetos en un desecador de vacío sobre una superficie libre de etilenglicol. Aplicar vacío al desecador y
cerrar la llave de paso de modo que el etilenglicol sature la cámara del desecador. Dejar el portaobjetos en reposo du-
rante 12 horas.
Preparación muestra B: Preparar una muestra aleatoria de polvo.
Análisis: Preparación muestra A y Preparación muestra B. Registrar el patrón de difracción de rayos X de las muestras y
determinar los valores d.
Identificación-precipitación
Muestra: 5 g
Análisis: Agregar 1 g de nitrato de potasio y 3 g de carbonato de sodio anhidro a la Muestra contenida en un crisol de
metal, calentar hasta que la mezcla funda y dejar que se enfríe. Agregar al residuo 20 ml de agua en ebullición, mez-
clar, filtrar y lavar el residuo con 50 ml de agua. Agregar al residuo 1 ml de ácido clorhídrico y 5 ml de agua, y filtrar.
Agregar al filtrado 1 ml de hidróxido de sodio 1 O N, filtrar y agregar 3 ml de cloruro de amonio 2 M.
Arsénico
Solución muestra: Transferir 8,0 g de muestra seca a un vaso de precipitados de 250 ml que contenga 100 ml de
ácido clorhídrico diluido (1 en 25), mezclar y cubrir con un vidrio de reloj. Calentar a ebullición suave, mezclando oca-
sionalmente, durante 15 minutos evitando la formación excesiva de espuma. Pasar el sobrenadante líquido caliente a
través de un papel de filtro de flujo rápido a un matraz volumétrico de 200 ml y lavar el filtro con cuatro porciones de
25 ml de ácido clorhídrico diluido (1 en 25) caliente, recogiendo los lavados en el matraz volumétrico. Enfriar los filtra-
dos combinados a temperatura ambiente, agregar ácido clorhídrico diluido (1 en 25) a volumen y mezclar.
Solución madre de trióxido de arsénico: Pesar con exactitud 1 32,0 mg de trióxido de arsénico, previamente secados
a 105º durante 1 hora, y disolver en 5 ml de solución de hidróxido de sodio (1 en 5) en un matraz volumétrico de
1000 ml. Neutralizar la solución con ácido sulfúrico 2 N, agregar 1 O ml adicionales de ácido sulfúrico 2 N y llevar a
volumen con agua recientemente calentada a ebullición y enfriada, y mezclar.
Solución estándar de arsénico: Diluir Solución madre de trióxido de arsénico hasta obtener soluciones con concentra-
ciones adecuadas, adaptables al intervalo lineal o de trabajo del instrumento. Mantener en un recipiente que sea total-
mente de vidrio y usar dentro de los 3 días.
Análisis: Proceder según se indica en Impurezas Elementales-Procedimientos (233).
Plomo
Solución muestra: Transferir 3,75 g de muestra a un vaso de precipitados de 250 ml que contenga 100 ml de ácido
clorhídrico diluido (1 en 25), mezclar y cubrir con un vidrio de reloj. Calentar a ebullición durante 15 minutos, luego
enfriar a temperatura ambiente y pasar a través de un papel de filtro de flujo rápido a un vaso de precipitados de 400
ml. Lavar el filtro con cuatro porciones de 25 ml de agua caliente, recogiendo los lavados en el vaso de precipitados
de 400 ml. Concentrar los extractos combinados, calentando a ebullición suave, hasta aproximadamente 20 ml. Si se
forma precipitado, agregar 2-3 gotas de ácido nítrico, calentar a ebullición y enfriar a temperatura ambiente. Pasar los
extractos concentrados a través de un papel de filtro de flujo rápido a un matraz volumétrico de 50 ml. Transferir el
contenido remanente del vaso de precipitados de 400 ml a través del papel de filtro al matraz con agua. Diluir con
agua a volumen.
Solución madre de nitrato de plomo: Disolver 159,8 mg de nitrato de plomo en 100 ml de agua, a la que se ha
agregado 1 ml de ácido nítrico, luego diluir con agua hasta 1000 ml. Preparar y almacenar esta solución en recipien-
tes de vidrio libres de sales de plomo solubles.
Solución estándar de plomo: En el día de su uso, diluir la Solución madre de nitrato de plomo hasta obtener soluciones
con concentraciones adecuadas, adaptables al intervalo lineal o de trabajo del instrumento.
Análisis: Proceder según se indica en (233).
Capacidad de adsorción de humedad
Equipo: Cámaras de humedad y temperatura capaces de mantener una humedad controlada de 40% ± 5% HR y 80%
± 5% HR a 25 ± 2º o un desecador que contenga sales saturadas con agua que provea un %HR al nivel requerido y un
horno capaz de mantener una temperatura de 25 ± 2º.
Método: 5-1 O g. Retirar la muestra del material de envasado. Cuando los adsorbentes se incorporan directamente en
la pared o tapa de los envases, usar un desecante no incorporado. Agregar la muestra a la cámara de humedad o al
desecador y medir la ganancia de peso hasta que se alcance el equilibrio cuando dos pesadas consecutivas no difieran
en más de 3 mg/g de sustancia tomada y la segunda pesada se realiza después de un periodo adicional de 3 ± 1 horas
USP 40 Pruebas Físicas/ (670) Envases-Componentes Auxiliares 603

de almacenamiento en las condiciones requeridas de temperatura y humedad. Calcular la capacidad de adsorción co-
mo porcentaje de la ganancia de peso en relación con el peso inicial de la muestra. Cuando se empaca una combina-
ción de dos adsorbentes, la especificación de capacidad de adsorción de humedad debe calcularse en proporción a la
mezcla. Por ejemplo, para una mezcla de 60% de tamiz molecular y 40% de gel de sílice, la capacidad de adsorción de
humedad sería no menos de 16,6% (9,0% + 7,6%) cuando las condiciones de prueba son 40% ± 5% HR y 25 ± 2º y las
capacidades de adsorción de humedad se toman con respecto a las especificaciones mínimas.
Cálculos
Tamiz molecular: 60% en peso x 15% de capacidad de adsorción de humedad = no menos de 9,0% de capacidad
de adsorción de humedad
Gel de sílice: 40% en peso x 19% de capacidad de adsorción de humedad = no menos de 7,6% de capacidad de
adsorción de humedad
• CLORURO DE CALCIO ANHIDRO
Identificación-calcio: Cumple con las pruebas.
Identificación-cloruros: Cumple con las pruebas.
Valoración: No menos de 93,0% y no más de 100,5% de cloruro de calcio (CaCl 2 )
Impurezas inorgánicas
Arsénico: No más de 3 ppm
Fluoruro: No más de 0,004%
Plomo: No más de 5 ppm
Magnesio y sales alcalinas: No más de 25 mg de residuo (no más de 5,0%)
Pruebas específicas
pH (791 ): 4,5-11,0 (1 :20 solución acuosa)
Capacidad de adsorción de humedad: No menos de 28% a 80% ± 5% HR y 25 ± 2º
Métodos de prueba
Identificación-calcio
Solución muestra-100 mg/ml: Las soluciones de sales de calcio forman oxalatos insolubles cuando se tratan de la
siguiente manera. Usando 2 gotas de rojo de metilo SR como indicador, neutralizar una solución 1:20 de una sal de
calcio con amoníaco 6 N, luego agregar ácido clorhídrico 2,7 N, gota a gota, hasta que la solución se torne ácida. Se
forma un precipitado blanco de oxalato de calcio al agregar oxalato de amonio SR. Este precipitado es insoluble en
ácido acético pero se disuelve en ácido clorhídrico.
Identificación-cloruros
Solución muestra-100 mg/mL: Las soluciones de cloruros con nitrato de plata SR producen un precipitado blanco
grumoso que es insoluble en ácido nítrico pero soluble en un ligero exceso de amoníaco 6 N.
Valoración
Muestra: 1,5 g
Análisis: Transferir la Muestra a un matraz volumétrico de 250 mL, disolverla en una mezcla de 100 mL de agua y 5 mL
de ácido clorhídrico 2,7 N, diluir con agua a volumen y mezclar. Transferir 50 mL de esta solución a un recipiente ade-
cuado y agregar 50 mL de agua. Mientras se mezcla, preferiblemente con un agitador magnético, agregar aproxima-
damente 30 mL de EDTA disódico 0,05 M desde una bureta de 50 ml. Luego, agregar 15 mL de hidróxido de sodio
1 N y 300 mg de indicador azul de hidroxinaftol. Continuar la valoración volumétrica hasta un punto final azul. Cada
mL de EDTA disódico 0,05 M equivale a 5,55 mg de cloruro de calcio (CaCl 2 ).
Arsénico
Solución muestra: 1 g en 1 O mL
Solución madre de trióxido de arsénico y Solución estándar de arsénico: Proceder según se indica en Bentonita.
Análisis: Proceder según se indica en Bentonita.
Fluoruro
Solución de fluoruro de sodio"-5 µg/mL:.iusMo Transferir 2,21 O g de fluoruro de sodio, previamente secados a 200º
durante 4 horas y pesados con exactitud, a un vaso de precipitados de plástico de 400 mL, agregar 200 mL de agua y
mezclar hasta disolver. Transferir cuantitativamente esta solución a un matraz volumétrico de 1000 mL con ayuda de
agua, diluir con agua a volumen y mezclar. Almacenar esta solución madre en un frasco de plástico. En el día de su
uso, transferir 5,0 mL de solución madre a un matraz volumétrico de 1000 mL, diluir con agua a volumen y mezclar.
Curva de calibración: Transferir 1,0; 2,0; 3,0; 5,0; 10,0 y 15,0 mL de Solución de fluoruro de sodio a sendos vasos de
precipitados de plástico de 250 mL. Agregar a cada vaso de precipitados 50 mL de agua, 5 mL de ácido clorhídrico
1 N, 1O mL de citrato de sodio 1 M y 1O mL de EDTA disódico 0,2 M, y mezclar. Transferir cada solución a sendos
matraces volumétricos de 100 mL, diluir con agua a volumen y mezclar. Transferir una porción de 50 mL de cada solu-
ción a sendos vasos de precipitados de plástico de 125 mL y medir el potencial de cada solución con un aparato que
incluye un electrodo selectivo para iones adecuado (como Orion Modelo N 94-09 con una membrana de estado sóli-
do), usando un electrodo de referencia adecuado (como Orion Modelo N 90-01 de junta simple). Graficar la curva de
calibración de µg de F por 100 mL de solución en la escala logarítmica, usando papel semilogarítmico de dos ciclos
(como K & ENº 465130), una calculadora científica graficadora adecuada, o un programa de hoja de cálculo.
604 (670) Envases-Componentes Auxiliares/ Pruebas Físicas USP 40

Análisis: Transferir 1,00 g de muestra a un vaso de precipitados de vidrio de 150 mL, agregar 1O mL de agua y, mez-
clando de manera continua, agregar lentamente 20 mL de ácido clorhídrico 1 N hasta disolver la muestra. Calentar a
ebullición rápidamente durante 1 minuto, luego transferir a un vaso de precipitados de plástico de 250 mL y enfriar
rápidamente en agua helada. Agregar 15 mL de citrato de sodio 1 M y 1O mL de EDTA disódico 0,2 M, y mezclar.
Ajustar el pH a 5,5 ± O, l con ácido clorhídrico 1 N o hidróxido de sodio 1 N, si fuera necesario. Transferir a un matraz
volumétrico de 100 mL, diluir con agua a volumen y mezclar. Transferir una porción de 50 mL de esta solución a un
vaso de precipitados de plástico de 125 mL y medir el potencial de la solución usando el aparato descrito en Curva de
calibración. Determinar el contenido de fluoruro, en µg, en la muestra, a partir de la Curva de calibración. Determinar el
porcentaje de fluoruro en la muestra tomada:
Resultado= (C/WS) x F x 100
c = contenido de fluoruro (µg)
WS = peso de la muestra (g)
F =factor para convertir µg en g, 0,000001
Plomo
Solución muestra: 1 g en 20 mL
Solución madre de nitrato de plomo y Solución estándar de plomo: Proceder según se indica en Bentonita.
Análisis: Proceder según se indica en Bentonita.
Magnesio y sales alcalinas
Muestra: 1 g
Análisis: Disolver la Muestra en 50 mL de agua, agregar 500 mg de cloruro de amonio, mezclar y calentar a ebullición
durante 1 minuto. Agregar rápidamente 40 mL de ácido oxálico SR y mezclar vigorosamente hasta completar la preci-
pitación. Agregar de inmediato 2 gotas de rojo de metilo SR. Luego agregar hidróxido de amonio 6 N, gota a gota,
hasta que la mezcla se torne alcalina y enfriar. Transferir la mezcla a una probeta graduada de 100 mL, diluir con agua
hasta 100 mL y dejar en reposo durante 4 horas o durante toda la noche. Decantar el líquido sobrenadante transparen-
te a través de un papel de filtro seco y transferir 50 mL del filtrado transparente a una cápsula de platino. Agregar 0,5
mL de ácido sulfúrico a la cápsula y evaporar la mezcla en un baño de vapor hasta un volumen pequeño. Evaporar
cuidadosamente el líquido remanente hasta sequedad sobre una llama directa y continuar calentando hasta completar
la descomposición y volatilización de las sales de amonio. Finalmente, incinerar el residuo hasta peso constante.
Capacidad de adsorción de humedad: Proceder según se indica en Bentonita.
• ÓXIDO DE CALCIO
Identificación-calcio: Cumple con las pruebas.
Valoración: No menos de 95,0% y no más de 100,5% de óxido de calcio (CaO), con respecto a la sustancia incinerada
Impurezas inorgánicas
Sustancias insolubles en ácido: No más de 1%
Arsénico: No más de 3 ppm
Fluoruro: No más de 0,015%
Plomo: No más de 2 mg/kg
Magnesio y sales alcalinas: No más de 3,6%
Pruebas específicas
Pérdida por incineración: No más de 10,0%
Capacidad de adsorción de humedad: No menos de 28% a 80% ± 5% HR y 25 ± 2º
Métodos de prueba
Identificación-calcio
Solución muestra: Agitar 1 g de muestra con 20 mL de agua y agregar ácido acético glacial hasta que la muestra se
disuelva.
Análisis: Proceder según se indica en Cloruro de Calcio Anhidro.
Valoración
Muestra: 1 g de muestra incinerada hasta peso constante (ver Perdida por incineración a continuación.)
Análisis: Disolver la Muestra en 20 mL de ácido clorhídrico 2,7 N. Enfriar la solución, diluir con agua hasta 500,0 mL y
mezclar. Pipetear y transferir 50,0 mL de esta solución a un recipiente adecuado y agregar 50 mL de agua. Mientras
se mezcla, preferiblemente con un agitador magnético, agregar aproximadamente 30 mL de EDTA disódico 0,05 M
desde una bureta de 50 ml. Luego, agregar 15 mL de hidróxido de sodio 1 N y 300 mg de indicador azul de hidroxi-
naftol. Continuar la valoración volumétrica con EDTA disódico hasta un punto final azul. Cada mL de EDTA disódico
0,05 M equivale a 2,804 mg de óxido de calcio (CaO).
Arsénico
Solución muestra: 1 gen 15 mL de ácido clorhídrico 2,7 N
Solución madre de trióxido de arsénico y Solución estándar de arsénico: Proceder según se indica en Bentonita.
Análisis: Proceder según se indica en Bentonita.
Fluoruro
Muestra: 1,0 g
USP 40 Pruebas Físicas/ (670) Envases-Componentes Auxiliares 605

Análisis: Proceder según se indica en Cloruro de Calcio Anhidro.

Plomo
Solución muestra: 1 gen 15 mL de ácido clorhídrico 2,7 N
Solución madre de nitrato de plomo y Solución estándar de plomo: Proceder según se indica en Bentonita.
Análisis: Proceder según se indica en Bentonita.
Sustancias insolubles en ácido
Solución muestra: Agitar 5 g de muestra y luego mezclarla con 100 mL de agua y suficiente ácido clorhídrico, agrega-
do gota a gota, para disolverla.
Análisis: Calentar a ebullición la Solución muestra, enfriar, agregar ácido clorhídrico, si fuera necesario, para obtener
una solución netamente ácida y pasar a través de un crisol de filtración tarado de vidrio. Lavar el residuo con agua has-
ta que esté exento de cloruros, secar a 105º durante 1 hora, enfriar y pesar.
Magnesio y sales alcalinas
Muestra: 500 mg
Análisis: Disolver la Muestra en 30 mL de agua y 15 mL de ácido clorhídrico 2,7 N. Calentar la solución, calentar a
ebullición durante 1 minuto, agregar rápidamente 40 mL de ácido oxálico SR y mezclar vigorosamente. Agregar 2 go-
tas de rojo de metilo SR y neutralizar la solución con hidróxido de amonio 6 N para precipitar el calcio completamente.
Calentar la mezcla en un baño de vapor durante 1 hora y dejar que se enfrié. Diluir la mezcla con agua hasta 100 mL,
mezclar bien y filtrar. Agregar 0,5 mL de ácido sulfúrico a 50 mL de filtrado. Luego evaporar hasta sequedad e incinerar
hasta peso constante en un crisol de platino tarado a 800 ± 25º.
Pérdida por incineración
Muestra: 1 g
Análisis: Incinerar la Muestra hasta peso constante en un crisol de platino tarado a 1100 ± 50º.
Capacidad de adsorción de humedad: Proceder según se indica en Bentonita.
• TAMICES MOLECULARES
Los tamices moleculares son aluminosilicatos de metales alcalinos sintéticos porosos y cristalinos en forma de perla con ta-
maños de poro estrictamente controlados. Los tamices moleculares usados más comúnmente como desecantes son los
tipos descritos como 3A, 4A, 5A y 1 3X con un rango de tamaño de poro de aproximadamente 3-1 O A.
Identificación A: La gota de agua desarrolla turbidez.
Identificación B: Cumple con las pruebas.
Impurezas inorgánicas
Plomo: No más de 5 ppm
Pruebas específicas
pH (791): 6,5-12 (200 mg/mL en agua exenta de dióxido de carbono)
Pérdida por Secado (731 ): Secar una muestra de 5-1 O g a 575 ± 25º hasta peso constante: pierde no más de 4,5%.
[NOTA-Realizar la valoración inmediatamente después de abrir el envase original.]
Capacidad de adsorción de humedad
No menos de 15,0% en peso a 40% ± 5% HR y 25 ± 2º
No menos de 16,5% en peso a 80% ± 5% HR y 25 ± 2º
Métodos de prueba
Identificación A
Muestra: 500 mg
Análisis: Mezclar la Muestra con 2,5 g de carbonato de potasio anhidro y calentar la mezcla en un crisol de platino o
níquel hasta que funda completamente. Enfriar, agregar 5 mL de agua y dejar en reposo durante 3 minutos. Calentar
suavemente el fondo del crisol, desprender la sustancia fundida y transferirla a un vaso de precipitados con ayuda de
aproximadamente 50 mL de agua. Agregar gradualmente ácido clorhídrico hasta que no se observe efervescencia,
agregar 1O mL de ácido adicionales y evaporar hasta sequedad en un baño de vapor. Enfriar, agregar 20 mL de agua,
calentar a ebullición y pasar a través de papel de filtro sin cenizas. Se obtiene un residuo insoluble de sílice. [NOTA-
Conservar el filtrado para Identificación B.] Transferir el residuo gelatinoso a una cápsula de platino y agregar cuidadosa-
mente 5 mL de ácido fluorhídrico. [PRECAUCIÓN-Manipular el ácido fluorhídrico en una campana de extracción to-
mando las precauciones apropiadas.] El precipitado se disuelve. (Si no se disuelve, repetir el tratamiento con ácido
fluorhídrico). Calentar la solución e introducir en los vapores resultantes una varilla mezcladora de vidrio que tenga en
la punta una gota de agua.
Identificación B-aluminio
Muestra: Usar 2 porciones del filtrado obtenido en Identificación A.
Análisis: Una solución de la primera porción del filtrado obtenido en Identificación A produce un precipitado gelatinoso
de color blanco con amoníaco 6 N que es insoluble en un exceso de este reactivo. Una solución de la segunda porción
del filtrado obtenido en la prueba de Identificación A produce un precipitado de color blanco con hidróxido de sodio
1 N que se disuelve en un exceso de este reactivo.
Plomo
Solución muestra: Transferir 10,0 g de muestra a un vaso de precipitados de 250 mL, agregar 50 mL de ácido clorhí-
drico 0,5 N, cubrir con un vidrio de reloj y calentar lentamente a ebullición. Calentar a ebullición suave durante 15
606 (670) Envases-Componentes Auxiliares/ Pruebas Físicas USP 40

minutos, enfriar y dejar que el material no disuelto sedimente. Decantar el sobrenadante líquido a través de papel de
filtro Whatman Nº 4 o equivalente, en un matraz volumétrico de 100 mL, conservando tanto material insoluble en el
vaso de precipitados como sea posible. Lavar la suspensión espesa y el vaso de precipitados con tres porciones de 1O
mL de agua caliente, decantando cada lavado a través del filtro en el matraz. Finalmente, lavar el papel de filtro con 15
mL de agua caliente, enfriar el filtrado a temperatura ambiente, diluir con agua a volumen y mezclar.
Solución madre de nitrato de plomo y Solución estándar de plomo: Proceder según se indica en Bentonita.
Análisis: Proceder según se indica en Bentonita.
Capacidad de adsorción de humedad: Proceder según se indica en Bentonita.
• GEL DE SÍLICE
El gel de sílice es dióxido de silicio (Si0 2 • Hp) que se fabrica agregando solución de silicato de sodio a un mineral ácido
para producir un precipitado gelatinoso el cual se lava y luego se deshidrata para producir un gel de sílice incoloro en
forma de perla, gránulo o micronizado en diversos tamaños de malla.
Aspecto: Una perla o gránulo de color blanco o translúcido
Identificación A: Se produce un color amarillo intenso.
Identificación B: Se desarrolla una mancha de color azul verdoso.
Valoración: No menos de 94,0% de dióxido de silicio (Si0 2 ) con respecto a la sustancia incinerada
Impurezas inorgánicas
Plomo: No más de 5 ppm
Sales solubles ionizables (como NaS0 3): La conductancia producida por la muestra es no mayor que la producida por
la solución control (equivalente a no más de 5,0%).
Pruebas específicas
pH (791 ): 4-8 en una suspensión espesa (1 en 20)
Pérdida por Secado (731): Secar una muestra de 5-lOg a 145º durante 3 horas: pierde no más de 3,0% de su peso.
[NOTA-Realizar la valoración inmediatamente después de abrir el envase original.]
Capacidad de adsorción de humedad
No menos de 19% en peso a 40% ± 5% HR y 25 ± 2º
No menos de 27% en peso a 80% ± 5% HR y 25 ± 2º
Métodos de prueba
Identificación A
Muestra: 5 mg
Análisis: Colocar en un crisol de platino, mezclar con 200 mg de carbonato de potasio anhidro e incinerar sobre un
quemador al rojo vivo durante aproximadamente 1O minutos. Enfriar, disolver la sustancia fundida en 2 mL de agua
recientemente destilada, entibiando si fuera necesario, y agregar lentamente 2 mL de molibdato de amonio SR.
Identificación B-aluminio
Muestra: Solución remanente de la Identificación A
Análisis: Colocar 1 gota de la Muestra de la Identificación A sobre un papel de filtro y evaporar el disolvente. Agregar
1 gota de una solución saturada de o-tolidina en ácido acético glacial y colocar el papel sobre hidróxido de amonio.
[NOTA-Evitar el contacto con la o-tolidina al realizar esta prueba y llevar a cabo la prueba en una campana bien venti-
lada.]
Valoración
Muestra: 1 g, previamente secada
Análisis: Transferir la Muestra a un crisol de platino tarado, incinerar a 1000 ± 25º hasta peso constante, enfriar en un
desecador y pesar para obtener el peso de la muestra incinerada (Wl). Humedecer el residuo con unas pocas gotas de
alcohol, agregar 3 gotas de ácido sulfúrico, luego agregar suficiente ácido fluorhídrico para cubrir la muestra humede-
cida. [PRECAUCIÓN-Manipular el ácido fluorhídrico en una campana de extracción bien ventilada tomando las precau-
ciones apropiadas.] Evaporar hasta sequedad en una placa de calentamiento, usando calor moderado (95º-105º), lue-
go agregar unos pocos mL de ácido fluorhídrico, suficiente para cubrir la Muestra, agitar cuidadosamente la cápsula
por rotación suave para lavar las paredes y evaporar nuevamente hasta sequedad, asegurándose de que la Muestra no
salpique a medida que se seca. Calentar el crisol al rojo vivo usando un quemador Meker, un soplete de propano o en
una mufla. Incinerar el residuo a 1000 ± 25º durante 30 minutos, enfriar en un desecador y pesar para obtener el peso
final (W2). Si queda un residuo repetir el Análisis, comenzado con la adición de ácido fluorhídrico hasta obtener un
peso constante. La diferencia entre el peso de la muestra incinerada y el peso final (W7 - W2) representa el peso, en g,
de dióxido de silicio (Si0 2) en la muestra incinerada inicialmente. Expresar el resultado como un porcentaje de la sus-
tancia incinerada inicialmente.
Plomo
Solución muestra: Transferir 5,0 g de muestra a un vaso de precipitados de 250 mL, agregar 50 mL de ácido clorhídri-
co 0,5 N, cubrir con un vidrio de reloj y calentar lentamente a ebullición. Calentar a ebullición suave durante 15 minu-
tos, enfriar y dejar que el material no disuelto sedimente. Decantar el sobrenadante líquido a través de papel de filtro
Whatman Nº 3 o equivalente, en un matraz volumétrico de 100 mL, manteniendo tanto material insoluble en el vaso
de precipitados como sea posible. Lavar la suspensión espesa y el vaso de precipitados con tres porciones de 1O mL de
USP 40 Pruebas Físicas/ (671) Envases-Pruebas de Desempeño 607

agua caliente, decantando cada lavado a través del filtro en el matraz. Finalmente, lavar el papel de filtro con 15 mL de
agua caliente, enfriar el filtrado a temperatura ambiente, diluir con agua a volumen y mezclar.
Solución madre de nitrato de plomo y Solución estándar de plomo: Proceder según se indica en Bentonita.
Análisis: Proceder según se indica en Bentonita.
Sales solubles ionizables (como Na 2 S0 4 )
Muestra: 5 g, previamente secada
Solución control: 250 mL de una solución de sulfato de sodio anhidro de 1 mg/mL
Análisis: Mezclar la Muestra con 150 mL de agua durante al menos 5 minutos en un mezclador de alta velocidad. Fil-
trar usando succión y lavar el mezclador y el filtro con 100 mL de agua en porciones divididas, agregando los lavados
al filtrado. Diluir el filtrado con agua hasta 250 ml. Determinar las conductancias del filtrado diluido y la Solución con-
trol con un puente de conductividad adecuado.
Capacidad de adsorción de humedad: Proceder según se indica en Bentonita.
Reactivos-soluciones de prueba
Molibdato de amonio SR: Disolver 6,5 g de ácido molíbdico reducido a polvo fino en una mezcla de 14 mL de agua y
14,5 mL de hidróxido de amonio. Enfriar la solución y agregarla lentamente, mientras se mezcla, a una solución bien
enfriada de 32 mL de ácido nítrico y 40 mL de agua. Dejar en reposo durante 48 horas y filtrar a través de un crisol de
vidrio sinterizado de porosidad fina. Esta solución se deteriora durante el reposo y no es apta para su uso si al agregar 2
mL de fosfato dibásico de sodio SR a 5 mL de solución, no se forma inmediatamente o después de entibiar levemente
un precipitado abundante de color amarillo. Almacenar en la oscuridad. Si se forma precipitado durante el almacena-
miento, usar únicamente el sobrenadante transparente.
Ácido oxálico SR: Disolver 6,3 g de ácido oxálico en agua hasta obtener 100 ml.

(671) ENVASES-PRUEBAS DE DESEMPEÑO

INTRODUCCIÓN

El propósito de este capítulo es proporcionar normas para las propiedades funcionales de los sistemas de envases que se
usan para formas farmacéuticas orales sólidas y líquidas para medicamentos y suplementos dietéticos. Las definiciones aplica-
bles a este capítulo se encuentran en el capítulo Requisitos de Envasado y Almacenamiento (659). Las siguientes pruebas sirven
para determinar la velocidad de transmisión de vapor de agua (velocidad de permeabilidad al vapor de agua) y la transmisión
espectral de los envases de plástico.
Los métodos de prueba para medir las velocidades de transmisión de vapor de agua que se detallan en este capítulo pueden
ser útiles para los fabricantes de medicamentos y de suplementos dietéticos para determinar el nivel de protección provisto por
los sistemas de envases de formas farmacéuticas orales sólidas. Además, se proveen métodos adicionales para determinar la
clasificación de sistemas de envases para formas farmacéuticas orales sólidas y líquidas que se reenvasan en envases unitarios y
envases de unidades múltiples (Tabla 7), ya sea por organizaciones o por farmacéuticos al momento de la dispensación de
acuerdo con lo indicado en la receta médica. Pueden existir otros sistemas de envases a los que podrían aplicarse los métodos
de prueba de esta sección; sin embargo, se debe describir cualquier tipo de desviación. Si se usan otros métodos para medir la
velocidad de transmisión de vapor de agua, deben describirse con suficiente detalle para justificar su uso.
Tabla 1. Métodos de Prueba de Transmisión de Vapor de Agua en Sistemas de Envases
Formas Farmacéuticas Formas Farmacéuticas
Orales Sólidas Orales Líquidas
Clasificación para En- Clasificación para Envases de Uni-
Determinación del Nivel de Clasificación para Envases vases Unitarios_y En- ~ades Múltiples y Envase de Dosis
Título de la Sección Barrera de Protección de Unidades Múltiples vase de Dosis Unica Unica
Envases de unidades múlti- Envases de unidades múlti-
ples con sello intacto o da- ples con cierre aplicado y Envases unitarios y de
ñado y envases unitarios y sello en estado intacto o dosis única en esta- Envases de unidades múltiples y
Aplicación de dosis única dañado do sellado unitarios
Fabricantes Fabricantes Fabricantes
Envasadores Envasadores Envasadores
Reenvasadores Reenvasadores Reenvasadores
Usuarios Fabricantes Farmacias Farmacias Farmacias
 608 (671) Envases-Pruebas de Desempeño/ Pruebas Físicas USP 40

Cambio en la redacción:

TRANSMISIÓN DE VAPOR DE AGUA

Determinación de la Barrera de Protección para Sistemas de Envases para Formas Farmacéuticas

Orales Sólidas

Esta sección describe los métodos de prueba de transmisión de vapor de agua para envases de unidades múltiples (Método
7), envase unitarios y de dosis única de alta barrera (Método 2) y envases unitarios y de dosis única de baja barrera (Método 3)
usados por los fabricantes de formas farmacéuticas orales sólidas. El propósito de este método es obtener velocidades de trans-
misión de vapor de agua confiables y específicas que se puedan usar para diferenciar entre el desempeño de la barrera de los
sistemas de envases usados para artículos reglamentados; el método se basa en el método ASTM 07709.1
Este método presenta las siguientes características:
a. Informa un valor de transmisión de vapor de agua específico para un envase en lugar de una clasificación
b. Provee sensibilidad y precisión suficientes para permitir diferenciar el desempeño de la barrera entre los envases
c. Las condiciones de uso para analizar estos sistemas de envases son las mismas que las usadas para el análisis de estabilidad
acelerado del envase primario de artículos reglamentados (por lo regular, humedad relativa de 75% a 40º).

EQUIPO

Se debe contar con los siguientes elementos:

• Una balanza de capacidad suficiente para pesar las muestras de prueba durante todo el periodo de la prueba (ver Pesada
en una Balanza Analítica (1251) ). La balanza debe tener una sensibilidad adecuada para detectar las pequeñas diferencias
de peso que se producen entre tiempos de análisis consecutivos. La incertidumbre de la pesada deberá ser menor que el
5% de la ganancia en peso de un tiempo de muestreo al siguiente. La incertidumbre de la pesada es por lo regular tres
veces la resolución/sensibilidad de la balanza. Por ejemplo, una balanza con una resolución de O, 1 mg es aceptable para
sistemas de envases cuya ganancia en peso por intervalo de tiempo sea mayor o igual a 6 mg [(O, 1 x 3)/5%], que es 60
veces la sensibilidad de la balanza.
• Una cámara capaz de mantener una temperatura de 40 ± 2º y una humedad relativa de 75 ± 5%.

DESECANTE

Método 1: El desecante es cloruro de calcio anhidro en forma de gránulos. Pueden resultar adecuados otros desecantes, tales
como el tamiz molecular o el gel de sílice. Si se usa cloruro de calcio anhidro, presecar a 215 ± 5° durante 71/4 ± 1/4 horas para
asegurar que todo hexahidrato presente se convierta completamente a la forma anhidra. Enfriar el desecante en un desecador
durante al menos 2 horas antes de su uso.
Métodos 2 y 3: El desecante es gel de sílice moldeado de tal forma que se ajuste al tamaño y forma de la cavidad de blíster
usada. Pueden resultar adecuados otros desecantes, por ejemplo, un tamiz molecular. Si se usa gel de sílice, presecarlo en una
estufa con circulación de aire forzado usando una de las siguientes condiciones: 155 ± 5º durante 31/4 ± 1/4 horas ó 150 ± 5º
durante 4 1/4 ± 1/4 horas. Si se usa un tamiz molecular, presecarlo en una mufla a 595 ± 25º. Secar los tamices 4Á y 3Á durante
31/4 ± 1/4 horas; secar el tamiz 13X durante 5 1/4 ± 1/4 horas. Enfriar el desecante en un desecador durante al menos 2 horas antes
de su uso. [NOTA-Se ha demostrado 2 que el cloruro de calcio anhidro puede contener calcio hexahidrato, que pierde agua
sólo cuando la temperatura alcanza los 200º.]

PROCEDIMIENTO

Método 1: Usar 15 envases de unidades múltiples y 15 cierres que sean representativos del sistema a analizar. Preparar las
muestras de prueba llenando cada envase de unidades múltiples hasta dos tercios de su capacidad con desecante y luego, para
cierres de rosca, cerrar usando el torque especificado en la Tabla 2. Para otros tipos de cierre, aplicar de acuerdo con el méto-
do de incumbencia. Asegurar que se haya aplicado la membrana correcta en el área de colocación del acabado del frasco,
logrando el sellado apropiado. Identificar cada envase de unidades múltiples con tinta indeleble. No usar etiquetas. Si hay ne-
cesidad de incrementar la precisión del método, el usuario puede probar el sistema sin el cierre siempre que un sello imper-
meable permanezca en el envase.
Si se desea, pesar cada envase de unidades múltiples a temperatura y humedad relativa ambientales. Registrar este peso para
el tiempo cero, pero no usarlo en el cálculo de la permeación. Colocar todos los envases en la cámara de prueba (humedad
relativa de 75% a 40º) dentro de la primera hora de la pesada. Pesar todos los envases de unidades múltiples en intervalos de

1 ASTM D7709. Standard Test Methods for Measuring Water Vapor Transmission Rate (WVTR) of Pharmaceutical Bottles and Blisters published by ASTM lnterna-
tional, 100 Barr Harbor Drive, P.O. Box C700, West Conshohocken, PA 19428-2959.
2 Determination of water vapor transmission rate (WVTR) of HDPE bottles for pharmaceutical products. Chen, Yisheng and Yanxia Li, lnternational )ournal of Phar-
maceutics, 358 (2008) 1 37-143.
USP 40 Pruebas Físicas/ (671) Envases-Pruebas de Desempeño 609

tiempo de 7 días± 1 hora. Pesar los envases de unidades múltiples en los días 7; 14; 21; 28 y 35 para obtener los datos en
estado estacionario. (El intervalo de tiempo inicial desde el tiempo O hasta el día 7 es el periodo para lograr el equilibrio.) Antes
de pesar los envases en cada intervalo de tiempo, equilibrar los envases durante aproximadamente 30 minutos a la temperatu-
ra y humedad relativa de pesada. Limitar el tiempo fuera de la cámara a menos de 2 horas. Registrar los pesos de manera
apropiada para luego calcular la línea de regresión.
Tabla 2. Torque aplicable al Envase con Tapa de Rosca
Intervalo de Ajuste Intervalo de Ajuste
Sugerido con Sugerido con
Diámetro del Torque Aplicado Torque Aplicado
Cierreª Manualmenteb Manualmenteb
(mm) (pulgada-libras) (Newton-metros)
8 5 0,56
10 6 0,68
13 8 0,90
15 5-9 0,56-1,02
18 7-10 0,79-1,13
20 8-12 0,90-1,36
22 9-14 1,02-1,58
24 10-18 1,13-2,03
28 12-21 1,36-2,37
30 13-23 1,47-2,60
33 15-25 1,69-2,82
38 17-26 1,92-2,94
43 17-27 1,92-3,05
48 19-30 2, 15-3,39
53 21-36 2,37-4,07
58 23-40 2,60-4,52
63 25-43 2,82-4,86
66 26-45 2,94-5,08
70 28-50 3, 16-5,65
83 32-65 3,62-7,35
86 40-65 4,52-7,35
89 40-70 4,52-7,91
100 45-70 5,09-7,91
110 45-70 5,09-7,91
120 55-95 6,22-10,74
132 60-95 6,78-10,74
ª Para probrar envases con diámetros de cierre intermedios, usar el torque asignado al diámetro de cierre de mayor tamaño siguiente.
b Un aparato adecuado se encuentra disponible en SecurePak, PO Box 905, Maumee, Ohio 43552-0905; www.secure-pak.com. El Modelo MRA con indicadores
en ambos lados de retiro y aplicación está disponible con los siguientes intervalos: 1) 0-25 pulgada por libras, lectura en incrementos de 1 pulgada por libra, 2)
0-50 pulgada por libras, lectura en incrementos de 2 pulgadas por libra y 3) 0-1 00 pulgada por libra, lectura en incrementos de 5 pulgadas por libra. Para más
detalles sobre las instrucciones, se puede consultar el documento "Standard Test Method for Application and Removal Torque of Threaded or Lug-Style Closu-
res" ASTM Method 03198, publicado por la ASTM lnternational, 100 Barr Harbor Orive, P.O. Box C700, West Conshohocken, PA 19428-2959.

Método 2: Usar 1 O unidades de prueba para este método. Proveer un mínimo de 1O cavidades de blíster por cada unidad de
prueba. Si la tira contiene menos de 1 O cavidades, agrupar suficientes tiras para formar una unidad de prueba que contenga al
menos 1 O cavidades. Esto es necesario para proveer una ganancia en peso suficiente en cada intervalo de tiempo. Llenar con
un desecante previamente secado y sellar los blísteres en un equipo capaz de llenar y sellar correctamente el blíster. El dese-
cante debe llenar la cavidad. El peso total del desecante debe ser la cantidad suficiente para cumplir con el requisito de evitar
la saturación parcial del desecante antes de completar la prueba. Llenar los blísteres en una atmósfera de humedad baja (lo
más baja posible, pero con una humedad relativa de no más de 50%). No exponer los desecantes a la humedad ambiental por
más de 30 minutos antes de sellar. Identificar cada muestra de prueba con tinta indeleble; no usar etiquetas. Una unidad de
prueba constará de una o más muestras de prueba. Agrupar las muestras de prueba en unidades de prueba.
Pesar cada unidad de prueba a temperatura y humedad relativa ambientales. Registrar este peso para el tiempo cero. Colo-
car todas las unidades de prueba en la cámara de prueba (humedad relativa de 75% a 40º) dentro de la primera hora de la
pesada. Pesar todas las unidades de prueba en intervalos de tiempo de 7días±1 hora. Pesar las unidades de prueba en los días
7; 14; 21; 28 y 35 para obtener 5 datos en estado estacionario. (El intervalo de tiempo inicial desde el tiempo O hasta el día 7
es el periodo para lograr el equilibrio.) Antes de pesar a cada intervalo de tiempo, equilibrar los envases durante 30 ± 5 minu-
61 O (671) Envases-Pruebas de Desempeño/ Pruebas Físicas USP 40

tos a la temperatura y humedad relativa de pesada controladas. Limitar el tiempo fuera de la cámara a menos de 2 horas.
Registrar los pesos de manera apropiada para luego calcular la línea de regresión.
Puede ser que no se consiga alcanzar toda la precisión y sensibilidad que este método puede proveer al medir los blísteres
de barrera ultra alta. Para blísteres de barrera ultra alta, las unidades de prueba deben tener no menos de 1 O cavidades, pero
no más de 30. Los ejemplos incluyen blísteres de aluminio-aluminio o blísteres muy pequeños hechos de otros materiales. Al-
ternativamente, se puede duplicar o triplicar el tiempo de los intervalos de pesada para lograr una ganancia en peso de la
muestra de prueba de al menos 6 mg por intervalo.
Método 3: Preparar las unidades de prueba según se indica en el Método 2. Colocar todas las unidades de prueba en la cá-
mara de prueba (humedad relativa de 75% a 40º) dentro de la primera hora de la pesada. Pesar las unidades de prueba luego
de 2 días (48 ±1 hora). En ese momento, la diferencia en peso (la ganancia en peso) se divide por el número de blísteres y días
(2) en cada unidad de prueba y esto se toma como la velocidad de transmisión de vapor de agua en mg/blíster/día. El número
de blísteres analizados depende de las características del material de barrera, del tamaño del blíster y de la sensibilidad de la
balanza usada en la prueba. Para este método, se puede obviar el requisito de cinco pesadas consecutivas debido a que el
desecante se satura rápidamente cuando se envasa en un envase de barrera baja y se almacena a una humedad relativa de
75% a 40º. [NOTA-Para envases unitarios y de dosis única de barrera baja, la ganancia en peso después del segundo día
muestra un perfil curvilíneo típico de la cercanía a la saturación del desecante. Obtener cinco pesadas dentro de los 2 días no
es viable y podría aumentar la variabilidad. Los Métodos 2 y 3 pueden requerir el uso de múltiples tiras de blísteres agrupadas
para obtener ganancias en peso con una magnitud suficiente para usar la sensibilidad de la balanza que se usa. Al agruparlas,
estas tiras o muestras de prueba se denominan unidades de prueba. La ganancia en peso en cada periodo de pesada deberá
ser 20 veces la sensibilidad de la balanza y la sensibilidad de la balanza es 3 veces la precisión de la balanza. En otras palabras,
la ganancia en peso mínima por intervalo de tiempo debe ser al menos 60 veces la precisión de la balanza.]

CÁLCULOS

Para los Métodos 1 y 2, realizar el análisis de regresión para cada unidad de prueba. Por lo regular, el punto de datos inicial
(en el día O) no se incluye en el ajuste de la línea de regresión. La pendiente de la línea de regresión es la velocidad de transmi-
sión de vapor de agua de cada unidad de prueba. Para el Método 1, la pendiente es la velocidad de transmisión de vapor de
agua para el envase de unidades múltiples correspondiente. Para el Método 2, la velocidad de transmisión de vapor de agua de
cada cavidad de blíster se calcula dividiendo la pendiente por el número de cavidades en cada unidad de prueba.
Para el Método 3, calcular la ganancia en peso en mg/día desde el día O hasta el día 2 usando las 1O unidades de prueba. La
velocidad de transmisión de vapor de agua de cada blíster se calcula dividiendo la ganancia en peso por 2 (para 2 días) y el
número de blísteres en cada unidad de prueba.
Ecuación de regresión:
W= I + MT

Cálculos:
N _ _ N _

Pendiente(M}= L[(W¡-W}(T¡-T}]/L(T¡-T) 2
i=1 i=1

Intersección (/) = W - MT
donde
M = pendiente de la línea de regresión
N =número de datos (cada dato consta de un peso y un tiempo)
W = peso medido
W = media del peso total
T =tiempo de muestreo
T = media del tiempo de muestreo total
I = ordenada al origen de la línea de regresión (punto en el que la línea de regresión se intersecta con el eje vertical)
N - -
L[(W¡-W)(T¡-T)]
i~1

igual a la suma de productos cruzados (por ejemplo, para cada uno de los puntos de datos N, restar la media del peso total del
valor en peso y la media del tiempo total del valor de tiempo y multiplicar las dos diferencias para obtener un producto cruza-
do. Posteriormente, sumar todos los productos cruzados N).
N -
I(T -T)2
i~1
USP 40 Pruebas Físicas/ (671) Envases-Pruebas de Desempeño 611

igual a la suma de las desviaciones al cuadrado (por ejemplo, para cada uno de los puntos de datos N, restar el tiempo medio
total del valor de tiempo y elevar al cuadrado la diferencia. Posteriormente, sumar todas las N diferencias al cuadrado).

RESULTADOS

Método 1: Informar la velocidad de transmisión de vapor de agua como el valor promedio, en mg/día por envase, y la des-
viación estándar de las 15 pendientes. Describir apropiadamente el sistema de envase cierre analizado.
Método 2: Informar la velocidad de transmisión de vapor de agua como el valor promedio, en mg/día por cavidad, y la des-
viación estándar de las 1O pendientes de unidad de prueba. Describir apropiadamente el sistema de envase cierre analizado.
Método 3: Informar la velocidad de transmisión de vapor de agua como el valor promedio desde el día O hasta el día 2, en
mg/día por blíster, y la desviación estándar de las 1O pendientes de unidad de prueba. Describir apropiadamente el sistema de
envase cierre analizado.

Clasificación para Sistemas de Envases para Envases de Unidades Múltiples para Formas
Farmacéuticas Orales Sólidas

El procedimiento y esquema de clasificación siguientes se proveen para evaluar las características de transmisión de vapor de
agua de envases de unidades múltiples. La información recopilada debe usarse para tomar una decisión informada con respec-
to a la aptitud del sistema de envase para formas farmacéuticas orales sólidas.

DESECANTE

Colocar una cantidad de cloruro de calcio anhidro de malla 4 a 8 3 en un recipiente poco profundo, procurando excluir el
polvo fino, secar a 11 Oº durante 1 hora y enfriar en un desecador.

PROCEDIMIENTO

Seleccionar 12 envases de tamaño y tipo uniformes, limpiar las superficies de sellado con un paño libre de pelusa y cerrar y
abrir cada envase 30 veces. Cerrar el envase firme y uniformemente cada vez. Cerrar los envases con tapa de rosca con un
torque dentro del intervalo especificado en la Tabla 2. Agregar Desecante a 1O de los envases, designados como envases de
prueba, llenando cada uno hasta 13 mm por debajo del cierre si el volumen del envase es 20 mL o más, o llenando cada uno
hasta dos tercios de su capacidad si el volumen del envase es menos de 20 ml. Si el interior del envase tiene más de 63 mm
de profundidad, puede colocarse un relleno inerte o un espaciador en el fondo para minimizar el peso total del envase y Dese-
cante; la capa de Desecante en dicho envase no debe ser de menos de 5 cm de profundidad. Cerrar cada envase inmediata-
mente después de agregar el Desecante, aplicando el torque especificado en la Tabla 2 cuando se cierran envases con tapa de
rosca. A cada uno de los 2 envases restantes, designados como controles, agregar un número suficiente de perlas de vidrio para
lograr un peso aproximadamente igual al de cada uno de los envases de prueba y cerrarlos, aplicando el torque especificado en
la Tabla 2 cuando se cierran envases con tapa de rosca. Registrar el peso de los envases individuales así preparados con una
aproximación de O, 1 mg si el volumen del envase es menos de 20 mL, con una aproximación de 1 mg si el volumen del enva-
se es mayor o igual a 20 mL pero menos de 200 mL, o con una aproximación de 1 centigramo (1 O mg) si el volumen del
envase es mayor o igual a 200 mL y almacenar a una humedad relativa de 75 ± 3% y a una temperatura de 23 ± 2º. [NOTA-
Un sistema saturado de 35 g de cloruro de sodio por cada 100 mL de agua colocado en el fondo de un desecador mantiene la
humedad especificada. Se pueden emplear otros métodos para mantener estas condiciones.] Después de 336 ± 1 hora (14
días), registrar el peso de los envases individuales de la misma manera. Llenar completamente cinco envases vacíos del mismo
tipo y tamaño que los envases en análisis con agua o con un sólido no compresible y de libre fluidez, como perlas de vidrio
pequeñas bien apisonadas, hasta el nivel indicado por la superficie del cierre cuando está colocado en su lugar. Transferir el
contenido de cada envase a una probeta graduada y determinar el volumen promedio de los envases, en mL. Calcular la velo-
cidad de transmisión de vapor de agua, en mg/día/L:

(1000/14 V)[(TF - T,) - (CF - C,)]

V= volumen del envase (mL)
TF = peso final de cada envase de prueba (mg)
T; = peso inicial de cada envase de prueba (mg)
CF = peso promedio final de los dos controles (mg)
C; = peso promedio inicial de los dos controles (mg)

3 Cloruro de calcio anhidro de malla 4 a 8 adecuado está disponible comercialmente como el Artículo ]Tl 313-1 en VWR lnternational (www.vwr.com; teléfono
1-800-952-5000).
 612 (671) Envases-Pruebas de Desempeño/ Pruebas Físicas USP 40

Clasificación: Los sistemas de envases son impermeables si no más de 1 de los 1O envases de prueba excede 100 mg/día/L en
la transmisión de vapor de agua, y ninguno excede 200 mg/día/L. Los sistemas de envases son bien cerrados si no más de 1 de
los 1 O envases de prueba excede 2000 mg/día/L en la transmisión de vapor de agua, y ninguno excede 3000 mg/día/L.

ENVASES DE POLIETILENO Y POLIPROPILENO

Sellar los envases con sellos impermeables mediante sellado térmico de un laminado de aluminio-polietileno, u otro sello
apropiado. 4 Analizar según se indica en la sección Procedimiento.
Clasificación: Los envases de polietileno de alta densidad analizados cumplen con los requisitos si la transmisión de vapor de
agua excede de 1O mg/día/L en no más de 1 de los 1O envases de prueba y ninguno excede de 25 mg/día/L. Los envases de
polietileno de baja densidad analizados cumplen con los requisitos si la transmisión de vapor de agua excede de 20 mg/día/L
en no más de 1 de los 1O envases de prueba y ninguno excede de 30 mg/día/L.
Los envases de polipropileno analizados cumplen con los requisitos si la transmisión de vapor de agua no excede de 15
mg/día/L en más de 1 de los 1O envases de prueba y ninguno excede de 25 mg/día/L.

Clasificación para Sistemas de Envases para Envases de Unitarios y Envases de Dosis Única para
Formas Farmacéuticas Orales Sólidas

El procedimiento y esquema de clasificación siguientes se proveen para evaluar las características de transmisión de vapor de
agua de envases unitarios y envases de dosis única. La información obtenida debe usarse para tomar una decisión informada
con respecto a la aptitud del sistema de envase para formas farmacéuticas orales sólidas.

DESECANTE

Secar pellets de desecante adecuado 5 a 11 Oº durante 1 hora antes de su uso y enfriar en un desecador. Usar pellets que
pesen aproximadamente 400 mg cada uno y con un diámetro de aproximadamente 8 mm. [NOTA-Si fuera necesario, debido
al tamaño limitado de los envases de dosis única, se pueden usar pellets que pesen menos de 400 mg cada uno y que tengan
un diámetro menor de 8 mm.]

PROCEDIMIENTO

Método 1: Sellar no menos de 1O envases de dosis única con un pellet en cada uno y sellar 1O envases de dosis única vacíos
adicionales que servirán de control, usando dedales o pinzas con extremos acolchados para manipular los envases sellados.
Enumerar los envases y registrar los pesos individuales6 con una aproximación de 1 mg. Pesar los controles de la misma unidad
y dividir el peso total por el número de controles para obtener el promedio. Almacenar todos los envases a una humedad rela-
tiva de 75 ± 3% y a una temperatura de 23 ± 2º. [NOTA-Un sistema saturado de 35 g de cloruro de sodio por cada 100 mL de
agua colocado en el fondo de un desecador mantiene la humedad especificada. Se pueden emplear otros métodos para man-
tener estas condiciones.] Después de un intervalo de 24 horas, y a cada intervalo múltiplo de éste (ver Clasificación), retirar los
envases de la cámara y permitir que se equilibren durante 15 a 60 minutos en el área de pesada. Registrar nuevamente el peso
de los envases individuales y de los controles combinados de la misma manera. [NOTA-Si algún pellet indicador se torna de
color rosado durante este procedimiento, o si el aumento de peso del gránulo excede de 10%, terminar la prueba y considerar
válidas sólo las determinaciones anteriores.] Devolver los envases a la cámara de humedad. Calcular, con dos cifras significati-
vas, la velocidad de transmisión de vapor de agua, en mg/día, de cada envase tomado:

N =número de días transcurridos en el periodo de prueba (comenzando con el periodo de equilibrio inicial de 24 horas)
WF = peso final de cada envase de prueba (mg)
W; = peso inicial de cada envase de prueba (mg)
CF = peso promedio final de los controles (mg)
C; = peso promedio inicial de los controles (mg)

4 Un laminado adecuado para sellado tiene una capa de polietileno como capa de contacto con el envase de no menos de 0,025 mm (0,001 pulgadas) y una
segunda capa de papel de aluminio de no menos de 0,018 mm (0,0007 pulgadas), con capas adicionales de materiales de refuerzo adecuados. Se puede obtener
también un sellado apropiado mediante el empleo de placas de vidrio y una cera para sellado constituida por 60% de cera amorfa refinada y 40% de cera de
parafina cristalina refinada.
5 Los pellets de desecante indicadores de humedad adecuados se encuentran disponibles comercialmente en fuentes tales como Unit Dose Supply, P.O. Box 104,
Ringoes, N) 08551-01 04 (www.unitdose.net; telephone 609-31 0-1456), como lndicating Desiccant Pellets (Pellets de Desecante Indicadores), Artículo Nº
TK-1002.
6 Las comparaciones exactas de envases Clase A pueden requerir periodos de prueba de más de 28 días si las pesadas se realizan en una balanza para preparar
medicamentos recetados Clase A (ver •Balanzas para Prescripciones y Aparatos Volumétricos Usados en Preparaciones Magistrales (1176)• (AF 01 _may-201 7)). El uso de
una balanza analítica que permita registrar los pesos con una sensibilidad de décima o centésima de miligramo lleva a una caracterización más precisa entre enva-
ses y/o períodos de prueba más cortos.
USP 40 Pruebas Físicas/ (671) Envases-Pruebas de Desempeño 613

[NOTA-Cuando las velocidades de transmisión de vapor de agua son menores de 5 mg/día y cuando se observa que los con-
troles Llegan a un estado de equilibrio dentro de los 7 días, las velocidades individuales de transmisión de vapor de agua pue-
den determinarse con mayor exactitud empleando en el cálculo los valores obtenidos a los 7 días para los pesos del envase de
prueba y del envase de control como W1 y C1, respectivamente. En tal caso, un intervalo de prueba adecuado para la Clase A
(ver Clasificación) sería no menos de 28 días después del periodo de equilibrio inicial de 7 días (un total de 35 días).]
Método 2: Usar este procedimiento para empaques (por ejemplo, tarjetas de blísteres) que incorporen varios envases de do-
sis única o blísteres sellados por separado. Sellar un número suficiente de empaques, de modo que se sometan a la prueba no
menos de cuatro empaques y un total de no menos de 1 O envases de dosis única o blísteres llenados con un pellet en cada
unidad. Sellar el mismo número de empaques vacíos, de los que cada uno contenga el mismo número de envases de dosis
única o blísteres que los usados en los empaques de prueba, para utilizarlos como control. Almacenar todos los envases a una
humedad relativa de 75 ± 3% y a una temperatura de 23 ± 2º. [NOTA-Un sistema saturado de 35 g de cloruro de sodio por
cada 100 mL de agua colocado en el fondo de un desecador mantiene la humedad especificada. Se pueden emplear otros
métodos para mantener estas condiciones.] Después de un intervalo de 24 horas, y a cada intervalo múltiplo de éste (ver
Clasificación), retirar los empaques de la cámara y dejar que se equilibren durante aproximadamente 45 minutos. Registrar los
pesos de los empaques individuales y devolverlos a la cámara. Pesar los empaques control como una sola unidad y dividir el
peso total por el número de empaques control para obtener el peso promedio del empaque vacío. [NOTA-Si algún pellet indi-
cador se torna de color rosado durante este procedimiento, o si el aumento de peso promedio del pellet en cualquiera de los
empaques excede de 10%, terminar la prueba y considerar válidas sólo las determinaciones anteriores.] Calcular, con dos cifras
significativas, la velocidad promedio de transmisión de vapor de agua, en mg/día, para cada envase de dosis única o blíster en
cada empaque tomado:
[1 /(N X X)][(WF - W¡) - (CF - C¡)]

N =número de días transcurridos en el periodo de prueba (comenzando con el periodo de equilibrio inicial de 24 horas)
X= número de unidades por empaque selladas por separado
WF = peso final de cada empaque de prueba (mg)
W1 = peso inicial de cada empaque de prueba (mg)
CF = peso final de los empaques de control (mg)
C1 = peso inicial de los empaques de control (mg)
Usando el Desecante indicado para el Método 7 y el Método 2, pesar los envases o empaques de prueba y de control después
de cada 24 horas y después de los intervalos de prueba adecuados para las pesadas finales. WF y CF son según se indica a conti-
nuación: 24 horas para la Clase D; 48 horas para la Clase C; 7 días para la Clase B; y no menos de 28 días para la Clase A.
Clasificación: Los envases de dosis única individuales analizados según el Método 7 se designan de la siguiente manera: Clase
A si no más de 1 de 1 O envases analizados excede de 0,5 mg/día en la velocidad de transmisión de vapor de agua y ninguno
excede de 1 mg/día; Clase B si no más de 1 de 1 O envases analizados excede de 5 mg/día y ninguno excede de 1 O mg/día;
Clase C si no más de 1 de 1 O envases analizados excede de 20 mg/día y ninguno excede de 40 mg/día; y Clase D si los envases
analizados no cumplen con ninguno de los requisitos de velocidad de transmisión de vapor de agua.
Los envases analizados según el Método 2 se designan de la siguiente manera: Clase A si ningún envase analizado excede de
0,5 mg/día en la velocidad de transmisión de vapor de agua promedio para blíster; Clase B si ningún envase analizado excede
de 5 mg/día en la velocidad de transmisión de vapor de agua promedio para blíster; Clase C si ningún envase analizado excede
de 20 mg/día en la velocidad de transmisión de vapor de agua promedio para blíster; y Clase D si los envases analizados no
cumplen con ninguno de los requisitos de velocidad de transmisión de vapor de agua promedio para blíster.

Clasificación para Siste!:llas de Envases para Envases de Unidades Múltiples y Envases de Dosis
Unica para Formas Farmacéuticas Orales Líquidas

El procedimiento y esquema de clasificación siguientes se proveen para evaluar las características de transmisión de vapor de
agua de envases de unidades múltiples. La información recopilada debe usarse para tomar una decisión informada con respec-
to a la aptitud del sistema de envase para formas farmacéuticas líquidas orales. [NOTA-Determinar los pesos de los sistemas de
envase-cierre individuales (frasco, sello interno, si se usa, y cierre), tanto el peso de tara como el peso de llenado, con una
aproximación de O, 1 mg si la capacidad del frasco es menos de 200 mL; con una aproximación de 1 mg si la capacidad del
frasco es 200 mL o más, pero menos de 1000 mL; o al centigramo más cercano (1 O mg) si la capacidad del frasco es 1000 mL
o más.]

PROCEDIMIENTO

Seleccionar 12 frascos de tamaño y tipo uniformes y limpiar las superficies de sellado con un paño libre de pelusa. Acondi-
cionar cada frasco con un cierre, recubrimiento interno del cierre (si corresponde) y un sello. Numerar cada sistema de envase-
cierre y registrar el peso de tara.
Retirar los cierres y, usando una pipeta, llenar 1 O frascos con agua hasta la capacidad de llenado. Llenar dos envases con
perlas de vidrio hasta el mismo peso de los envases de prueba llenos. Si se emplean cierres de rosca, aplicar una fuerza de
 614 (671) Envases-Pruebas de Desempeño/ Pruebas Físicas USP 40

torsión que esté dentro del intervalo especificado en la Tabla 2 y almacenar los envases sellados a una temperatura de 25 ± 2º y
una humedad relativa de 40 ± 2%. Después de 336 ± 1 horas (14 días), registrar el peso de los envases individuales y calcular la
velocidad de pérdida de peso en agua, en porcentaje por año, para cada frasco tomado:
[(W 7; - Wr) - (W74 ; - Wr) - (W0 - Wm)J x 365 x •100/{W¡¡ - Wr) x 14• ERJ\(Pl.abr-lOl$)

W7; = peso inicial de cada frasco individual (1)

Wr =peso de tara
W74 ; = peso de cada frasco individual (1) a los 14 días
W0 = peso inicial del envase de control en el día 1
Wm = peso del envase de control a los 14 días

CLASIFICACIÓN

El sistema de envase cumple con los requisitos para ser impermeable si el porcentaje de pérdida de peso en agua no excede
de 2,5% por año en no más de 1 de los 1O envases de prueba y ninguno excede de 5,0% por año.

TRANSMISIÓN ESPECTRAL

Aparato 1

Utilizar un espectrofotómetro de sensibilidad y exactitud adecuadas, adaptado para medir la cantidad de luz transmitida a
través de los materiales plásticos usados en los envases farmacéuticos. Además, el espectrofotómetro tiene la capacidad de me-
dir y registrar la luz transmitida tanto en rayos difusos como en paralelos.

Procedimiento

Seleccionar trozos que representen el promedio del espesor de la pared. Cortar secciones circulares de dos o más áreas del
envase y recortarlas, según sea necesario, para obtener segmentos de un tamaño adecuado para montarlos en el espectrofotó-
metro. Después de cortarlas, lavar y secar cada muestra, procurando no rayar las superficies. Si la muestra fuera demasiado
pequeña para abarcar la abertura del portamuestras, tapar el espacio sobrante de la abertura con un papel opaco o una cinta
adhesiva, siempre y cuando la longitud de la muestra exceda la de la ranura del espectrofotómetro. Limpiar la muestra inme-
diatamente antes de montarla en el portamuestras con papel para limpiar objetivos. Montar la muestra con ayuda de una cera
adherente, o empleando otro medio adecuado, y tomar las precauciones necesarias para evitar dejar huellas digitales u otras
marcas en las superficies a través de las cuales debe pasar la luz. Colocar la sección en el espectrofotómetro con su eje cilíndri-
co paralelo al plano de la ranura y aproximadamente centrado en relación a la ranura. Cuando está correctamente colocada, el
haz de luz es normal en relación a la superficie de la sección y las pérdidas por reflexión son mínimas.
Medir continuamente la transmitancia de la sección en relación al aire en la región espectral de interés con un instrumento
de registro o en intervalos de aproximadamente 20 nm con un instrumento manual, en la región de 290-450 nm.

Límites

La transmisión espectral observada no excede los límites que se proporcionan en la Tabla 3 para envases destinados para uso
parenteral. La transmisión espectral observada para envases de plástico para productos destinados a la administración oral o
tópica no excede de 10% a cualquier longitud de onda en el intervalo de 290-450 nm.
Tabla 3. Límites para Plásticos de Clases 1 a VI
Porcentaje Máximo de Transmisión Espectral
a Cualquier Longitud
Tamaño Nominal de Onda
(en ml) entre 290 y 450 nm
1 50
2 45
5 40
10 35
20 30
50 15

7 Para más detalles sobre el aparato y los procedimientos, se pueden consultar las siguientes publicaciones de la ASTM lnternational, 100 Barr Harbor Orive, West
Conshohocken, PA 19428-2959: "Standard Test Method of Test for Haze and Luminous Transmittance of Transparent Plastics", ASTM Method Dl 003-11 el;
"Standard Practice for Computing the Colors of Objects by Using the CIE System", ASTM Method E308-08.
USP 40 Pruebas Físicas/ (691) Algodón 615

[NOTA-Ningún envase con un tamaño intermedio a los listados anteriormente presenta una transmisión espectral mayor que
la del envase de tamaño inmediatamente superior listado en la Tabla 3. Para envases con tamaños superiores a 50 ml, se apli-
can los límites establecidos para envases de 50 mL.]

GLOSARIO

Blíster: Domo de plástico o laminado, moldeado, tapado y sellado que contiene la cápsula o la tableta (por lo general, en
un envase unitario o de dosis única).
Blíster de barrera baja: Blísteres hechos con materiales de baja protección (a la humedad), moldeados y sellados de tal
manera que la velocidad de transmisión de vapor de agua al analizarla a 40º /75% de humedad relativa (HR) sea mayor de 1,0
mg/cavidad-día.
Blíster de barrera alta: Blísteres hechos con materiales de alta protección (a la humedad), moldeados y sellados de tal
manera que la velocidad de transmisión de vapor de agua al analizarla a 40º /75% de humedad relativa sea menor de 1,0 mg/
cavidad-día.
Blíster de barrera ultra alta: Blísteres hechos con materiales de ultra alta protección (a la humedad), moldeados y sella-
dos de tal manera que la velocidad de transmisión de vapor de agua al analizarla a 40º/75% de humedad relativa sea menor
de 0,01 mg/cavidad-día.
Tira de blísteres: Grupo contiguo de blísteres moldeados y sellados con una tapa. El número de blísteres por tira por lo
regular va de uno a diez, pero puede tener un número mayor. En ocasiones, se puede hacer referencia a la tira de blísteres
como un sistema de envase.
Cavidad o burbuja: Domo de plástico o laminado, moldeado, tapado y sellado (ver Blíster).
Velocidad de transmisión de vapor de agua: Es la transmisión de vapor de agua por unidad de tiempo a través de un
sistema de envase, en estado estacionario y en condiciones específicas de temperatura y humedad. Estos métodos de prueba
emplean medición gravimétrica para determinar la velocidad de ganancia en peso como resultado de la transmisión de vapor
de agua hacia el interior del sistema de envase y la captación subsiguiente mediante un desecante dentro del sistema de enva-
se.
Muestra de prueba (o muestra): Para envases de unidades múltiples, el frasco es la muestra de prueba; mientras que
para envases unitarios o de dosis única, la tira de blíster que contiene múltiples cavidades es la muestra de prueba. Cuando se
prueban blísteres, se pueden agrupar varias tiras (es decir, varias muestras) en una unidad de prueba para realizar la prueba.
Unidad de prueba: Para envases de unidades múltiples, el frasco es tanto la unidad de prueba como la muestra de prue-
ba, y para envases unitarios o monodosis, la unidad de prueba es un grupo de muestras de prueba (tiras de blísteres) que se
procesan juntas para medir su exposición a la temperatura y humedad y para pesarlas en cada tiempo de muestreo. El propósi-
to de la unidad de prueba para envases unitarios o monodosis es sacar ventaja de la ganancia de peso aditiva que resulta de
una mayor cantidad de cavidades que las presentes en una sola tira. Cuando se habla de la unidad de prueba, en el caso de los
frascos, se hace para mantener la congruencia en la denominación de los tres métodos de prueba.

(691) ALGODÓN

Antes de determinar la absorbencia y la longitud de la fibra, extraer el Algodón de su envoltorio y acondicionarlo durante no
menos de 4 horas en una atmósfera estándar a una humedad relativa de 65 ± 2% a 21 ± 1, 1º(70±2ºF).

PRUEBA DE ABSORBENCIA

Procedimiento

Preparar una canastilla de prueba usando alambre de cobre de aproximadamente 0,4 mm de diámetro (Nº 26 B. & S.) que
no pese más de 3 g, con forma de cilindro de aproximadamente 5 cm de diámetro y 8 cm de profundidad y con espacios de
aproximadamente 2 cm entre cada alambre. Tomar porciones de algodón purificado que pesen 1 ± 0,05 g de cinco partes di-
ferentes del paquete, tirando pero sin cortar. Colocar las porciones combinadas en la canastilla y pesar. Sostener la canastilla
por uno de los lados aproximadamente a 12 mm por encima de la superficie del agua a 25 ± 1 ºy, luego, dejarla caer en el
agua. Determinar, preferentemente mediante el uso de un cronómetro, el tiempo requerido en segundos hasta que la canasti-
lla se sumerja completamente.
Retirar la canastilla del agua, dejar que se escurra durante 1O segundos en la misma posición horizontal; luego colocarla de
inmediato en un recipiente tarado cubierto y pesarla. Restar el peso de la canastilla de prueba y del algodón purificado para
determinar el peso del agua absorbida.
616 (691) Algodón / Pruebas Físicas USP 40

LONGITUD DE FIBRA

Para determinar la longitud y la distribución de la longitud de las fibras de algodón en el algodón purificado emplear el si-
guiente método:
Llevar a cabo todas las operaciones asociadas con la determinación de la longitud de fibra del algodón purificado en una
atmósfera estable de humedad relativa de 65 ± 2% a 21 ± 1, 1 º (70 ± 2ºF).
Estas instrucciones describen la modalidad de procedimiento que se adecúa bien al clasificador* de mayor uso en la actuali-
dad en los Estados Unidos.

Aparato

El clasificador (ver ilustración)consta de dos bancos de peines rígidamente montados uno al lado del otro sobre una base
común. Cada banco de peines consta de por lo menos 12 peines individuales, separados 3,2 mm uno detrás de otro y monta-
dos en ranuras para que a medida que se acercan durante el proceso de fraccionamiento y cuando ya no sean necesarios,
puedan descender debajo del plano de trabajo. Cada peine individual tiene una sola fila de dientes puntiagudos de 12 mm de
largo exactamente alineados, que son agujas de 0,38 mm de diámetro. Los dientes están espaciados a una distancia de 62 a
25 mm entre sí a lo largo de una extensión de aproximadamente 50 mm.

Clasificador Doble de Fibra de Algodón

El equipo accesorio consta de pinzas para clasificar las fibras, una rejilla para comprimir la fibra, una placa lisa para compri-
mir la fibra y placas recubiertas de terciopelo. Las pinzas clasificadoras constan de dos piezas de latón de aproximadamente 75
mm de largo unidas en uno de sus extremos y ligeramente curvadas en forma de pico en el otro para agarrar las fibras que
sobresalgan cerca de la superficie de los peines. Por lo general, uno de los bordes sujetadores posee un almohadillado de cuero
o de otro material fibroso. El borde por el que se toman las fibras tiene un ancho de aproximadamente 19 mm.
La rejilla que comprime las fibras consta de una serie de varillas de latón separadas a una distancia de 3,2 mm entre sí para
que puedan colocarse entre los peines a fin de apretar las fibras entre los dientes. La placa lisa para comprimir las fibras consta
de una placa pulida de latón de aproximadamente 25 x 50 mm con una perilla o mango en la superficie superior, mediante el
cual la placa puede pasarse sobre las fibras cuando éstas se colocan en la superficie de las placas recubiertas de terciopelo. Las
placas recubiertas de terciopelo, sobre las cuales se pueden distribuir las fibras, son láminas de aluminio de aproximadamente
1 00 mm x 225 mm x 2,4 mm de espesor, recubiertas sobre ambos lados con terciopelo de alta calidad, preferentemente de
color negro.

Selección del Algodón

Después de desenrollar el algodón, preparar una muestra de prueba representativa tomando, de un paquete que contenga
de 8 a 16 onzas, 32 trozos pequeños (de aproximadamente 75 mg cada uno) bien distribuidos en todo el volumen del rollo,
tomando 16 trozos representativos de cada mitad longitudinal del rollo. Evitar los extremos cortados del rollo y tener la pre-
caución de tomar porciones de todo el espesor del rollo. Para evitar que se seleccionen sólo las fibras largas o las cortas, extraer
todas las fibras tomadas del grupo cuidando que no se resbalen entre los dedos.
De los paquetes de no más de 4 onzas de peso, tomar 8 trozos y de los envases de más de 4 onzas pero no más de 8 onzas,
tomar 1 6 trozos, en forma bien distribuida.
Mezclar muy bien los trozos en pares y combinar cada par tirando y enrollando suavemente entre los dedos. Luego fraccio-
nar cada par combinado dividiéndolos longitudinalmente en dos partes aproximadamente iguales y utilizar una parte en el
mezclado adicional. (La otra parte puede descartarse o reservarse para cualquier prueba o control adicional.)
Repetir el proceso descrito en el párrafo anterior con las sucesivas mitades de la serie bifurcada hasta que sólo se obtenga un
trozo: la porción de prueba final integrada. Enderezar suavemente y colocar en forma paralela las fibras de la porción de prue-
ba final integrada extrayéndolas y enrollándolas entre los dedos. Tomar la precaución de retener todas las fibras, en lo posible

* [NOTA-El método aquí descrito se adapta especialmente al aparato clasificador Suter-Webb Duplex Cotton Fiber, pero introduciendo alteraciones más o menos
obvias en el procedimiento, también se puede llevar a cabo con dos clasificadores Baer dispuestos en serie, o con un aparato johannsen u otro aparato similar.]
USP 40 Pruebas Físicas/ (695) Cristalinidad 617

incluyendo aquellas que forman botones (partículas de fibras enmarañadas) y lanillas (masas apelmazadas de fibras), desechan-
do sólo las motas (fragmentos de semillas inmaduras con fibras) y todo material extraño que no sea fibra, como por ejemplo
tallos, hojas y fragmentos de las cáscaras de las semillas.
De la porción final integrada descrita en el párrafo anterior, separar longitudinalmente una porción de prueba de 75 ± 2 mg,
pesada con exactitud. Retener el residuo para cualquier prueba de control que pudiera ser necesaria.

Procedimiento

Con la rejilla para comprimir las fibras, insertar cuidadosamente la porción de prueba pesada en un banco de peines del
clasificador de algodón de modo tal de que se extienda a través de los peines en ángulos aproximadamente rectos.
Con las pinzas clasificadoras, tomar por los extremos libres una porción pequeña de las fibras extendiéndolas a través de los
dientes del peine más cercano al operador. En forma suave y pareja, halar las fibras para que emerjan de los peines hacia ade-
lante y transferirlas a las puntas de los dientes en el segundo banco de peines; colocarlas en forma paralela entre sí y en un
ángulo aproximadamente recto con respecto a las caras de los peines, liberando los extremos sujetos tan cerca de la cara del
peine frontal como sea posible. Con la rejilla para comprimir las fibras, apretar cuidadosamente las fibras transferidas a los
dientes de los peines. Continuar la operación hasta que se hayan transferido todas las fibras al segundo banco de peines. Du-
rante esta transferencia de las fibras, soltar en forma sucesiva los peines del primer banco una vez que todas las fibras sobresa-
lientes hayan sido retiradas.
Girar la máquina a 180º y transferir las fibras de algodón nuevamente al primer banco de peines de la manera descrita en el
párrafo anterior.
Asegurarse bien de emparejar los extremos de las fibras durante las dos transferencias anteriores, acomodándolas lo más cer-
ca posible a la superficie frontal del peine próximo. Este emparejamiento de las puntas de las fibras sobresalientes también
puede incluir la extracción de fibras desparejas del frente o de la parte de atrás de los bancos de peines, para volver a colocar-
las dentro o sobre el manojo principal de algodón en los peines.
Girar nuevamente la máquina a 180º. Soltar en forma sucesiva los peines, si fuera necesario, para exponer los extremos de
las fibras más largas. Puede ser necesario volver a depositar algunas fibras desparejas. Con las pinzas extraer las pocas fibras
que más sobresalgan. Continuar extrayendo de esta manera las fibras sobresalientes que queden en la parte opuesta a la cara
frontal del peine más próximo. Soltar este peine y repetir la serie de operaciones de la misma manera hasta que se hayan ex-
traído todas las fibras. Para no alterar excesivamente la porción de prueba y de ese modo viciar el fraccionamiento de longitu-
des en grupos, hacer varias tracciones (8 a 1 O) entre cada par de peines.
Colocar las tracciones sobre las placas recubiertas con terciopelo una al lado de la otra, tan derechas como sea posible, con
los extremos lo mejor definidos que sea posible y con los extremos distales colocados en una línea recta. Presionar luego hacia
abajo suavemente y en forma homogénea con la placa para comprimir fibras antes de liberar la tracción de las pinzas. Emplear
no menos de 50 y no más de 100 tracciones para fraccionar la porción de prueba.
Agrupar todas las fibras que midan 12,5 mm (aproximadamente media pulgada) o más de longitud y pesar el grupo con
una aproximación de 0,3 mg. De la misma manera, agrupar todas las fibras de 6,25 mm (aproximadamente 1/4 de pulgada) o
menos de longitud y pesar de la misma manera. Finalmente, agrupar las fibras restantes de longitudes intermedias y pesarlas.
La suma de los tres pesos no difiere del peso inicial de la porción de prueba en más de 3 mg. Dividir el peso de cada uno de
los dos primeros grupos por el peso de la porción de prueba para obtener el porcentaje, en peso, de fibra en los dos intervalos
de longitud.

(695) CRISTALINIDAD

Esta prueba se realiza para determinar el cumplimiento con los requisitos de cristalinidad establecidos en la monografía indi-
vidual de un fármaco.

PROCEDIMIENTO

En Microscopía Óptica (776) se describe un detallado procedimiento de la prueba.

618 (696) Sólidos Cristalinos/ Pruebas Físicas USP 40

(696) CARACTERIZACIÓN DE SÓLIDOS CRISTALINOS POR

MICROCALORIMETRÍA Y CALORIMETRÍA DE DISOLUCIÓN

Para los propósitos de este capítulo, los materiales cristalinos, parcialmente cristalinos y amorfos se consideran sólidos.

INTRODUCCIÓN-EL CONCEPTO DE CRISTALINIDAD

Una retícula cristalina perfectamente ordenada, donde cada molécula ocupa su lugar esperado en la retícula es un ideal que
casi nunca se logra. El otro extremo es el estado amorfo, en el que un sólido contiene la mayor densidad posible de imperfec-
ciones (defectos de diversas dimensionalidades), donde se pierde todo el orden de largo alcance y donde sólo permanece el
orden de corto alcance, impuesto por las moléculas adyacentes más cercanas. Los cristales reales están en algún punto entre
estos dos extremos. La posición de un cristal en una escala delimitada por estos dos extremos se denomina cristalinidad.
Todos los cristales reales, incluso los que están en estado puro, poseen algunas imperfecciones o defectos en su retícula, que
incrementan tanto la energía (entalpía en condiciones de presión atmosférica constante) como el desorden (expresado como
la entropía) de su retícula cristalina. Se dice que un cristal es altamente cristalino cuando posee una densidad relativamente
baja de imperfecciones y una cristalinidad alta. Por el contrario, una partícula con una densidad de imperfecciones relativa-
mente alta se dice que es parcialmente amorfa y que posee una baja cristalinidad. En términos ideales, a una partícula total-
mente amorfa le corresponde una cristalinidad de cero. Las partículas amorfas pueden contener dominios ordenados de algu-
na manera que pueden actuar como núcleos para la cristalización; de tales partículas denominadas amorfas se dice que poseen
una cristalinidad de bajo nivel pero finita.
La capacidad de detectar y cuantificar la cantidad de material amorfo dentro de una sustancia altamente cristalina es de
gran importancia durante el desarrollo y la fabricación subsiguiente de una preparación farmacéutica.
En realidad, un polvo probablemente contiene partículas con diferentes grados de cristalinidad, así como puede contener
partículas con formas y tamaños variados. Cuanto más baja es la cristalinidad de un sólido, mayor es su entalpía y su entropía.
El aumento de la entalpía nunca se compensa totalmente con el incremento en la entropía; por lo tanto, la energía libre de
Gibbs, que refleja el equilibrio entre ambas, tiene un aumento neto. Así, cuanto más baja es la cristalinidad de un material
(polvo), y consecuentemente, cuanto mayor es su carácter amorfo, mayor es su solubilidad intrínseca aparente y su velocidad
de disolución, pero menor es su estabilidad termodinámica. Debido a la gran relevancia de estas propiedades, la cristalinidad
es asimismo una propiedad importante y es necesario medirla mediante un método adecuado.
En este capítulo, la cristalinidad o el contenido de partes amorfas de un polvo se miden mediante métodos de calorimetría,
tales como microcalorimetría o calorimetría de disolución, aunque se pueden emplear otros métodos (p.ej., ver el capítulo ge-
neral Caracterización de Sólidos Cristalinos y Parcialmente Cristalinos por Difracción de Rayos X Sobre Polvo (DRXP) (941) ).
Muchas sustancias son capaces de cristalizar en más de un tipo de retícula cristalina, lo que se conoce como polimorfismo.
Cuando se incorpora agua o un disolvente en la retícula cristalina, a los cristales se les denomina hidratos o solvatos. Debido al
diferente orden cristalino y/o conformación molecular y energía de la retícula, las distintas formas cristalinas a menudo presen-
tan distintas propiedades físicas. Por cuestiones de simplicidad, las mediciones de calorimetría para determinar el grado de cris-
talinidad discutida en este capítulo asumen una forma cristalina sólida que se halla presente sólo en el material de interés. La
teoría y técnica experimental se pueden expandir fácilmente a sistemas polimórficos tomando las consideraciones adecuadas
de las diferencias de entalpía entre los polimorfos.

MÉTODO 1-MICROCALORIMETRÍA (DETERMINACIÓN DE CONTENIDO AMORFO)

La mayoría de los procesos químicos, físicos y biológicos tienen un intercambio de calor asociado. La microcalorimetría es
una técnica altamente sensible para monitorear y cuantificar los cambios exotérmicos (que producen de calor) y endotérmicos
(que absorben calor) asociados con tales procesos. La técnica permite determinar la velocidad y extensión de las reacciones
químicas, los cambios de fase o los cambios de estructura.
Se pueden observar eventos térmicos que producen únicamente una fracción de un microvatio usando microcalorimetría.
Esto significa que se deben detectar diferencias de temperatura menores de 10-6 K. La microcalorimetría por lo regular emplea
el principio de flujo de calor (pérdida de calor), donde, en un vaso definido térmicamente, el calor producido (o absorbido)
fluye desde (o hacia dentro del) vaso en un esfuerzo por restablecer el equilibrio térmico con su entorno. La estabilidad térmica
excepcional con sus alrededores debe obtenerse mediante un aislador de calor (heat sink) o un entorno regulado electrónica-
mente.
La energía térmica de una muestra activa en el vaso de reacción se canaliza generalmente a través de elementos Peltier; di-
chos elementos actúan como generadores termoeléctricos usando el efecto Seebeck. La energía térmica se convierte en una
señal de voltaje proporcional al flujo de calor.
Por lo general, los resultados se presentan como una medición de la energía térmica producida por unidad de tiempo (ya-
tio) en función del tiempo.
USP 40 Pruebas Físicas/ (696) Sólidos Cristalinos 619

Aparato

Los microcalorímetros a menudo se diseñan como sistemas gemelos con un vaso de medición y un vaso de referencia. Los
vasos generalmente están hechos de vidrio o acero inoxidable. Para ciertas aplicaciones, se pueden usar vasos especialmente
diseñados que permiten la adición de un material gaseoso, líquido o sólido.

Calibración

El microcalorímetro se calibra para el flujo de calor (energía por unidad de tiempo) usando fuentes de calor eléctrico exter-
nas o internas o una reacción estándar adecuada.

Sensibilidad

La sensibilidad del método micocalorimétrico se puede evaluar con respecto a una muestra estándar apropiada, que se anali-
za de acuerdo con el método correspondiente en conjunto con la determinación del ruido de la línea base del instrumento.

Procedimiento

Pesar una cantidad apropiada del material en un vaso adecuado. Cerrar el vaso cuidadosamente para evitar cualquier evapo-
ración de disolventes y colocar los vasos en el portamuestras. Si resulta apropiado, permitir que el vaso se equilibre a la tempe-
ratura de la medición antes de colocarlo en la posición de medición.
Comenzar el análisis y registrar el flujo de calor con el tiempo sobre la abscisa y el flujo de calor sobre la ordenada (especifi-
car la dirección del flujo de calor exotérmico o endotérmico).

Detección y Cuantificación de Contenido Amorfo en Polvos

El estado amorfo es metaestable con respecto al estado cristalino; por consiguiente, puede producirse recristalización. La
medición del calor de recristalización permite determinar el contenido amorfo mediante el área del pico de recristalización.
Resulta posible cuantificar el contenido amorfo de la muestra relacionando el resultado del microcalorímetro para una muestra
con el obtenido a partir de un estándar amorfo. El intervalo de contenido amorfo abarcado por este método depende de la
sustancia individual que se va a analizar. En casos favorables, se pueden alcanzar límites de detección por debajo de 1%.
Es posible iniciar la recristalización sometiendo la muestra a una humedad relativa más alta o a una atmósfera que contenga
vapor orgánico. La muestra generalmente se coloca en una ampolla que también contiene un pequeño tubo de ensayo que a
su vez contiene una solución salina acuosa saturada, un disolvente orgánico o una mezcla de disolventes.
El calor de recristalización por lo regular se mide usando una masa de muestra fija colocada en un vaso de vidrio o acero. Al
seleccionar el tubo de ensayo que contiene la solución salina saturada o el disolvente orgánico se debe optar por un tubo lo
suficientemente largo para permitir una saturación total de la atmósfera sobre la muestra. La masa de la muestra y la naturale-
za de la atmósfera de vapor sobre la muestra deben permitir que la recristalización ocurra de tal forma que se observe un pico
definido, claramente separado de los eventos térmicos iniciales ocasionados por la introducción de la muestra.
Las condiciones en las que ocurra la transición de la fase amorfa a un estado cristalino termodinámicamente más estable
tendrán un impacto significativo sobre el tiempo de recristalización. En particular, las mezclas físicas de material puramente
amorfo y cristalino se comportarán de forma diferente a un material parcialmente cristalino. Estos efectos se deben tomar en
cuenta al desarrollar un método.
La Figura 7 muestra una respuesta típica para la recristalización de un material mayoritariamente amorfo. La primera parte de
la curva representa diversos procesos concurrentes que ocurren de manera simultánea, tales como la absorción de vapor de
agua en las partes amorfas del polvo y por la generación de vapor de agua a partir del tubo de ensayo. Después de esta res-
puesta inicial, se presenta una gran respuesta exotérmica ocasionada por la recristalización del material amorfo. También in-
cluida, aunque inobservable, está la expulsión del exceso de agua de las partes recristalizadas y su condensación. Por consi-
guiente, el área bajo esta respuesta de recristalización exotérmica es proporcional al calor de recristalización.
620 (696) Sólidos Cristalinos/ Pruebas Físicas USP 40

2,5
11

§'
2: 1,5
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Q)
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0,5

o
o 1 2 3
Tiempo (Horas)

Figura 1. Resultado microcalorimétrico típico de energía (en µW) en función del tiempo (en horas): pico de colapso amorfo
(1) y pico de recristalización (11) para lactosa mayoritariamente amorfa a 25º y a una humedad relativa de 75%.

MÉTODO 2-CALORIMETRÍA DE DISOLUCIÓN (DETERMINACIÓN DE CRISTALINIDAD)

La calorimetría de disolución proporciona un medio para determinar la entalpía de disolución (es decir, el calor de disolución
a presión atmosférica constante) de una sustancia. La entalpía de disolución se define como la entalpía de la sustancia disuelta
en la solución a una concentración definida, menos la entalpía de la sustancia original. El disolvente para el proceso de disolu-
ción debe ser tal que la masa del sólido se disuelva dentro de un intervalo de tiempo que corresponda con el tiempo de res-
puesta del calorímetro, según se analiza a continuación. La entalpía de una disolución es proporcional a la cantidad de sólido
que se disuelve. Esta cantidad se puede definir como un mol para la entalpía molar o un gramo para la entalpía específica. Si la
sustancia posee una pureza adecuada (según se determina mediante el grado de exactitud requerida) y se conoce su masa
molecular, se prefiere la entalpía molar; en caso contrario, se emplea la entalpía específica. La entalpía de disolución depende
levemente tanto de la temperatura, que generalmente es de 25,0º, como de la concentración final del soluto disuelto.
Por lo general, se prefiere expresar la cristalinidad, P" de una sustancia en una escala porcentual. Este procedimiento requie-
re de dos estándares de referencia, a saber, una muestra altamente cristalina para la que se asume una cristalinidad de 100% y
que posea una entalpía de disolución medida de t-,,Hs" y una muestra amorfa para la que se asume una cristalinidad de 0% y
que posea una entalpía de disolución medida de t-,,Hs 0 • A partir de estos valores y de la entalpía, t-,,Hs51 la disolución medida del
sólido en análisis, se puede calcular la cristalinidad porcentual del sólido, P" según se indica a continuación:

Resulta claro que la cristalinidad expresada en una escala porcentual depende de tres valores medidos y que las entalpías de
disolución se pueden reemplazar por otras cantidades físicas correspondientes que dependan de la cristalinidad. Sin embargo,
el valor de la cristalinidad porcentual de una muestra depende no sólo de la naturaleza y del método de preparación de los dos
estándares de referencia, sino también de la elección de la cantidad física que se mide.
La entalpía de la disolución se mide ya sea mediante un calorímetro de disolución isoperibólico (con perímetro constante, es
decir, camisa) o mediante un calorímetro de disolución isotérmico (con temperatura constante). Por lo general, se realizan co-
mo mínimo tres mediciones con cada muestra. Posteriormente, se calcula la media aritmética de estos tres valores. Los requisi-
tos exactos dependerán de la capacidad del equipo y del grado de exactitud requerido.

Calorimetría de Disolución lsoperibólica

En el calorímetro de disolución isoperibólico, el cambio de temperatura durante el proceso de disolución ocasiona un cam-
bio correspondiente en la temperatura del sistema disolvente-soluto (es decir, en la solución). Este cambio de temperatura se
mide con un sensor de temperatura, que está conectado a un circuito eléctrico que registra una señal eléctrica que correspon-
de al cambio de temperatura. Por lo regular, este cambio de temperatura en forma electrónica se mide a intervalos de tiempo
definidos con precisión para proporcionar datos de temperatura-tiempo que una computadora recoge, analiza y posterior-
mente grafica. Una corrida con un blanco sin la adición del soluto sólido al disolvente normalmente no muestra un cambio
discernible en la pendiente de la gráfica de temperatura-tiempo.
Para los calorímetros de disolución isoperibólicos, la respuesta es lo suficientemente rápida, pero se deben hacer correccio-
nes por cualquier pérdida o ganancia de calor originada a partir del baño. Por lo tanto los calorímetros de disolución isoperibó-
licos tienen más ventajas que los calorímetros de disolución isotérmica cuando el proceso de disolución es relativamente rápi-
do. Para todas las mediciones de la entalpía de la disolución empleando calorímetros de disolución isoperibólicos, la elección
USP 40 Pruebas Físicas/ (697) Contenido en Envases para Inyectables 621

del disolvente es un paso crítico. La naturaleza y la masa del disolvente y la masa de la muestra se eligen de forma que el
cambio de calor total correspondiente a la disolución total del sólido se complete en el plazo de cinco minutos agitando vigo-
rosamente a una velocidad de rotación constante dentro del intervalo de 400-600 revoluciones/minuto.
Se determina la capacidad de calor efectiva de la celda del calorímetro y su contenido para cada corrida del calorímetro. Esta
determinación se logra mediante el calentamiento eléctrico del contenido de la celda del calorímetro. La capacidad térmica
efectiva se determina de acuerdo con uno de dos protocolos-realizando una determinación después del rompimiento de la
ampolla o realizando una determinación antes y una segunda determinación después del rompimiento de la ampolla, y poste-
riormente promediando los dos resultados. La exactitud y confiabilidad del calentamiento eléctrico se establecen mediante la
exactitud y confiabilidad de las calibraciones químicas anteriormente mencionadas.

Calorimetría de Disolución Isotérmica

En el calorímetro de disolución isotérmico (temperatura constante), el cambio de temperatura durante el proceso de disolu-
ción se compensa mediante un cambio de energía igual pero opuesto, de tal manera que la temperatura del sistema disolven-
te-soluto (es decir, en la solución) se mantenga esencialmente constante. Este cambio igual pero opuesto de energía se mide
y, cuando se invierte su signo, proporciona la entalpía de disolución. Para calorímetros isotérmicos, la respuesta es relativamen-
te lenta, pero el proceso de compensación elimina el efecto de pérdidas o ganancias de calor causadas por el baño. Por lo
tanto, los calorímetros de disolución isotérmicos son más ventajosos que los calorímetros de disolución isoperibólicos cuando
el proceso de disolución es relativamente lento.

Solución de Calibración del Calorímetro

Para asegurar la exactitud del calorímetro, se deben realizar calibraciones químicas regularmente. Para una disolución endo-
térmica, la calibración del calorímetro se verifica midiendo el calor absorbido durante la disolución de cloruro de potasio en
agua destilada a 298, 15 K (25,0º). El cambio de entalpía establecido en este proceso endotérmico es 235,5 J/g (17,56 kj/mol).
Para una disolución exotérmica, el calorímetro se verifica midiendo el calor producido durante la disolución de 5 g/L de trome-
tamina [tris(hidroximetil)aminometano, THAM] en una solución acuosa de ácido clorhídrico O, 1 M a 298, 15 K (25,0º). El calor
establecido para el proceso mencionado anteriormente es de -246,0 J/g (-29,80 kj/mol).

Manejo de la Muestra

La estabilidad química y física de los sólidos puede verse reducida al disminuir la cristalinidad. En particular, los sólidos de
baja cristalinidad, especialmente los sólidos amorfos, tienden a absorber vapor de agua de la atmósfera, lo que provoca cristali-
zación y un aumento correspondiente en la cristalinidad. Por estos motivos, las muestras anhidras cuya cristalinidad se va a
determinar, deben almacenarse en condiciones de cero humedad o a niveles inferiores a la humedad crítica en cámaras sella-
das que contengan un desecante que preferentemente contenga un indicador de eficacia. Cuando se van a llevar a cabo estu-
dios de cristalinidad-humedad, la muestra se almacena en una cámara sellada que contenga una solución salina saturada para
proporcionar una humedad relativa definida.

(697) CONTENIDO EN ENVASES PARA INYECTABLES

Cada envase de inyección debe contener un exceso suficiente que permita extraer del mismo la cantidad declarada de fár-
maco (ver Formas Farmacéuticas (1151 ), Exceso de Volumen en Inyectables). Dicha extracción se debe realizar de acuerdo a las
instrucciones del etiquetado, cuando se provean.

DETERMINACIÓN DEL VOLUMEN DE INYECCIÓN EN LOS ENVASES

Esta sección está armonizada con los textos correspondientes de la Farmacopea Europea y/o la Farmacopea japonesa. Estas
farmacopeas se han comprometido a no realizar ningún cambio unilateral a esta sección armonizada. Una porción del presen-
te texto (ver más adelante) es texto USP nacional, y, por lo tanto, no forma parte del texto armonizado; está marcada con
símbolos (..) para especificar este hecho.
Las suspensiones y emulsiones deben agitarse antes de extraer el contenido y antes de determinar la densidad. Las prepara-
ciones viscosas y oleosas pueden entibiarse siguiendo las instrucciones de la etiqueta, si fuera necesario, y agitar minuciosa-
mente justo antes de extraer el contenido. Luego, el contenido se enfría a una temperatura de 20º-25º antes de medir el volu-
men. •Las formulaciones de sólidos estériles se deben reconstituir de acuerdo a las instrucciones del etiquetado antes de retirar
su contenido. Luego se debe medir el contenido siguiendo los procedimientos para suspensiones, emulsiones o soluciones, se-
gún sea apropiado .•
622 (697) Contenido en Envases para Inyectables/ Pruebas Físicas USP 40

Envases Monodosis

Seleccionar 1 envase si el volumen del envase es de 1O ml o más, 3 envases si el volumen nominal es más de 3 ml y menos
de 1O ml, o 5 envases si el volumen nominal es 3 ml o menos. Tomar individualmente el contenido total de cada envase
seleccionado con una jeringa seca de una capacidad que no exceda de tres veces el volumen a medir y provista con una aguja
de calibre 21 con una longitud de no menos de 2,5 cm (1 pulgada). Expulsar cualquier burbuja de aire de la jeringa y la aguja,
y luego descargar el contenido de la jeringa, sin vaciar la aguja, en una probeta calibrada y seca (calibrada para contener más
que para verter los volúmenes marcados) de un tamaño tal que el volumen que se va a medir ocupe al menos el 40% de su
volumen graduado. Como alternativa, el volumen del contenido, en ml, puede calcularse como la masa, en g, dividida por la
densidad. Para envases con un volumen nominal de 2 ml o menos, el contenido de una cantidad suficiente de envases puede
combinarse para obtener el volumen requerido para la medición, siempre que, para cada envase, se emplee un conjunto dife-
rente y seco de jeringa y aguja. El contenido de los envases de 1O ml o más se puede determinar abriéndolos y vaciando el
contenido directamente en una probeta graduada o un vaso de precipitados tarado.
El volumen no es menor que el volumen nominal en el caso de envases examinados individualmente o, en el caso de enva-
ses con un volumen nominal de 2 ml o menos, no es menor que la suma de los volúmenes nominales de los envases tomados
colectivamente.

Envases Multidosis

Para Inyecciones en envases multidosis que declaran rendir un número específico de dosis de un volumen determinado, se-
leccionar 1 envase y proceder según se indica para los envases monodosis, empleando el mismo número de conjuntos diferen-
tes de jeringa y aguja que el de dosis especificadas. El volumen es tal que cada jeringa no descarga menos de la dosis indicada.

Inyecciones en Cartuchos o Jeringas Prellenadas

Seleccionar 1 envase si el volumen es 1 O ml o más, 3 envases si el volumen nominal es más de 3 ml y menos de 1 O ml, o 5
envases si el volumen nominal es 3 ml o menos. Si fuera necesario, equipar los envases con los accesorios requeridos para su
uso (aguja, émbolo, jeringa) y transferir a un vaso de precipitados tarado y seco todo el contenido de cada envase sin vaciar la
aguja, empujando el émbolo en forma lenta y continua. Determinar el volumen, en ml, calculado como la masa, en g, divida
por la densidad.
El volumen medido de cada envase no es menor que el volumen nominal.

Soluciones Intravenosas de Gran Volumen

Para soluciones intravenosas, seleccionar 1 envase. Transferir el contenido a una probeta graduada seca, de una capacidad
tal que el volumen que se va a medir ocupe al menos el 40% del volumen nominal de la probeta. Medir el volumen transferi-
do.
El volumen no es menor que el volumen nominal.

(698) VOLUMEN DE ENTREGA

PROPÓSITO
Las siguientes pruebas están diseñadas para garantizar que las preparaciones líquidas orales, cuando se transfieren desde su
envase original, entreguen el volumen de la forma farmacéutica que se declara en la etiqueta del artículo.

ALCANCE
Estas pruebas se aplican a productos que se dispensan vertiendo desde el envase. Estas pruebas se aplican a productos que
se suministran como preparaciones líquidas o como preparaciones líquidas reconstituidas a partir de sólidos mediante el agre-
gado del volumen determinado del diluyente especificado. Estas pruebas no son obligatorias para los artículos envasados en
envases unitarios cuando la monografía incluye la prueba de Uniformidad de Unidades de Dosificación (905).

DETERMINACIÓN DE DENSIDAD
Debido a la tendencia de las preparaciones líquidas orales a atrapar aire al ser agitadas o transferidas, determinar primero la
masa entregada resulta un método más exacto de determinación del volumen entregado, usando luego la densidad del mate-
USP 40 Pruebas Físicas/ (698) Volumen de Entrega 623

rial para convertir la masa en volumen entregado. Para usar este método, se requiere una determinación de la densidad del
material. A continuación se indica un método para determinar la densidad:
1. Tarar un matraz volumétrico de 100 ml que contenga 50,0 ml de agua.
2. Agregar aproximadamente 25 g de producto bien agitado, agitando el contenido por rotación suave hasta mezclar.
3. Volver a pesar el matraz.
4. Agregar desde una bureta, una cantidad de agua medida con exactitud hasta llevar el contenido del matraz a volumen,
mientras se agita por rotación suave. Registrar el volumen agregado desde la bureta.
5. Calcular la densidad de la muestra:
W!V
en donde W es el peso, en g, del material tomado; y V es 50,0 ml menos el volumen de agua necesario para ajustar el conte-
nido del matraz a volumen, en ml. Se pueden usar otros métodos para determinar la densidad, dependiendo de la formula-
ción (p.ej., formulaciones sustancialmente no acuosas).

PREPARACIONES DE PRUEBA

Para determinar el volumen de entrega, seleccionar no menos de 30 envases y proceder del siguiente modo para la forma
farmacéutica correspondiente.
Soluciones Orales y Suspensiones Orales-Agitar individualmente el contenido de 1 O envases.
Polvos Cuyas Etiquetas Declaran el Volumen de la Preparación Líquida Oral que Resulta cuando el Polvo se
Reconstituye con el Volumen de Diluyente Declarado en el Etiquetado-Reconstituir 1O envases con el volumen de dilu-
yente declarado en el etiquetado, medido con exactitud, y agitar individualmente.

PROCEDIMIENTO

El volumen de entrega se puede determinar por peso, según se indica a continuación:

1. Vaciar el contenido del envase en un recipiente tarado adecuado (dejando que escurra durante no más de 5 segundos
para envases unitarios, y no más de 1O minutos para envases de unidades múltiples).
2. Determinar la masa del contenido.
3. Calcular el volumen usando la densidad .
Como alternativa, se puede usar el siguiente procedimiento por volumen:
1. De acuerdo con las condiciones de uso, o según se indique en el etiquetado, vaciar cuidadosamente el contenido de cada
envase en sendas probetas individuales, graduadas y secas, con una capacidad marcada que no exceda de dos veces y
media el volumen a medir, y calibradas "para contener" (ver Aparatos Volumétricos (31) ). Se debe tener cuidado de evitar
que se formen burbujas de aire durante el proceso. Si el etiquetado carece de instrucciones, sujetar los envases en un án-
gulo de aproximadamente 30º con respecto a la horizontal y vaciar, cuidadosamente, el contenido en la probeta gradua-
da.
2. Dejar escurrir cada envase durante un periodo que no exceda de 1O minutos para envases de unidades múltiples y 5 se-
gundos para envases unitarios, a menos que se especifique de otra manera en la monografía.
3. Cuando no haya burbujas, medir el volumen de cada mezcla.

CRITERIOS DE ACEPTACIÓN

Usar los siguientes criterios para determinar el cumplimiento de esta prueba.

Para Envases de Unidades Múltiples (ver la Figura 1)

El volumen promedio de líquido obtenido a partir de los 1O envases es no menos de 100% y el volumen de ningún envase
es menos de 95% del volumen declarado en el etiquetado. Realizar la prueba en 20 envases adicionales si A, el volumen pro-
medio es menos de 100% del declarado en el etiquetado pero el volumen de ningún envase es menos de 95% de la cantidad
declarada, o si B, el volumen promedio es no menos de 100% y el volumen de no más de 1 envase es menos de 95%, pero es
no menos del 90% del volumen declarado. El volumen promedio de líquido obtenido de los 30 envases es no menos de 100%
del volumen declarado en el etiquetado; y el volumen de líquido obtenido de no más de 1 de los 30 envases es menos de
95%, pero no menos de 90% del volumen declarado en el etiquetado.
624 (698) Volumen de Entrega / Pruebas Físicas USP 40

Menos de 100% del V decl. No menos de 100% del V decl.

El volumen de 1 envase El volumen de ningún El volumen de 1 o más El volumen de ningún

es menos de envase es menos de envases es menos de envase es menos de
95% del V decl. 95% del V decl. 95% del V decl. 95% del V decl.

No cumple Cumple
con la prueba El volumen de no más El volumen de con la prueba
de 1 envase es menos más de 1 envase
de 95% del V decl. es menos de
pero no menos de 95% del V decl.
90% del V decl.

A B
No cumple
con la prueba
Analizar 20 envases más

Menos de 100% del V decl. No menos de 100% del V decl.

No cumple
con la prueba El volumen de no más
El volumen de
más de 1 envase de 1 envase es menos
es menos de de 95% del V decl.
95% del V decl. pero no menos de
90% del V decl.

No cumple Cumple
con la prueba con la prueba

Figura 1. Esquema de decisión para envases de unidades múltiples. (V= Volumen promedio. V decl. =Volumen declarado)

Para Envases Unitarios (ver la Figura 2)

El volumen promedio de líquido obtenido a partir de los 1O envases es no menos de 100% y el volumen de cada uno de los
1 O envases se encuentra dentro del intervalo de 95%-110% del volumen declarado en el etiquetado. Realizar la prueba en 20
envases adicionales si A, el volumen promedio es menos de 100% del declarado en el etiquetado, pero el volumen de ningún
envase se encuentra fuera del intervalo de 95%-110%, o si B, el volumen promedio es no menos de 100% y el volumen de no
más de 1 envase se encuentra fuera del intervalo de 95%-110%, pero dentro del intervalo de 90%-115%. El volumen prome-
dio de líquido obtenido de los 30 envases es no menos de 100% del volumen declarado en el etiquetado y el volumen obteni-
do de no más de 1 de los 30 envases se encuentra fuera del intervalo de 95%-11 0% pero dentro del intervalo de 90%-115%
del volumen declarado en el etiquetado.
USP 40 Pruebas Físicas/ (699) Densidad de Sólidos 625

Menos de 100% del V decl. No menos de 100% del V decl.

El volumen de 1 o más El volumen de ningún El volumen de 1 o más El volumen de cada uno de

envases cae afuera del envase cae afuera del envases cae afuera del los envases cae afuera del
intervalo de 95% a 110% intervalo de 95% a 110% intervalo de 95% a 110% intervalo de 95% a 110%
del V decl. del V decl. del V decl. del V decl.

No cumple El volumen de no más Cumple

El volumen de con la prueba
con la prueba de 1 envase cae afuera más de 1 envase
del intervalo de 95% a cae afuera del
110% del V decl. pero intervalo de 95% a
dentro del intervalo 110% del V decl.
de90%a 115%

A B

No cumple
con la prueba
Analizar 20 envases más

Menos de 100% del V decl. No menos de 100% del V decl.

No cumple
con la prueba El volumen de no más
El volumen de más
de 1 envase cae afuera
de 1 envase
del intervalo de 95% a
cae afuera del
110% del V decl. pero
intervalo de 95% a
dentro del intervalo
110% del V decl.
de 90% a 115%

No cumple Cumple
con la prueba con la prueba

Figura 2. Esquema de decisión para envases unitarios. (V= Volumen promedio. V decl. =Volumen declarado)

(699) DENSIDAD DE SÓLIDOS

TÉRMINOS Y DEFINICIONES
El término densidad se refiere a la distribución espacial promedio de la masa en un material. La densidad de los sólidos típi-
camente se expresa en g por cm 3, mientras que en los líquidos la densidad se expresa generalmente en g por mL a una tempe-
ratura de referencia establecida.
La densidad de una partícula sólida puede tomar diferentes valores según el método empleado para medir el volumen de la
partícula. Es importante distinguir entre tres posibilidades diferentes.
La densidad verdadera de una sustancia es la masa promedio por unidad de volumen, excluyendo todos los espacios vacíos
que no son parte fundamental de la disposición tridimensional molecular. Es una propiedad de cada material particular y, por
lo tanto, debe ser independiente del método de determinación. La densidad verdadera de un cristal perfecto puede determi-
narse a partir del tamaño y la composición de la unidad celular.
La densidad picnométrica, medida por picnometría de gases, es una medición de la densidad conveniente para polvos farma-
céuticos. En un picnómetro de gases, el volumen ocupado por una masa conocida de polvo se determina mediante la medi-
ción del volumen de gas desplazado por el polvo. El cociente entre la masa y el volumen de gas desplazado es la densidad
picnométrica. La densidad picnométrica equivale a la densidad verdadera a menos que el material contenga espacios vacíos
impenetrables, o poros cerrados que sean inaccesibles al gas empleado en el picnómetro.
La densidad granular incluye las contribuciones al volumen de la partícula de poros abiertos que son más pequeños que un
tamaño límite, que depende del método de medición. Una técnica común de medición es la porosimetría de mercurio, donde
626 (699) Densidad de Sólidos/ Pruebas Físicas USP 40

el tamaño límite del poro depende de la presión máxima de penetración. Debido a la contribución adicional del volumen de
poro, la densidad granular nunca será mayor que la densidad verdadera. Un concepto relacionado es la densidad aerodinámica,
que es la densidad de la partícula con un volumen definido por la envoltura aerodinámica de la partícula en una corriente de
flujo. Tanto los poros cerrados como los abiertos contribuyen a este volumen, pero los poros abiertos se llenan con el líquido
impregnante. Por lo tanto, si la partícula es porosa, la densidad aerodinámica depende de la densidad del líquido utilizado en
la prueba.
En síntesis, tanto la densidad picnométrica como la densidad verdadera se denominan "densidad". Si es necesario, se pue-
den distinguir estas cantidades según el método de medición.
La densidad de un material depende de la cohesión molecular. En el caso de los gases y los líquidos, la densidad depende de
la temperatura y la presión. En el caso de los sólidos, la densidad también variaría según la estructura del cristal y el grado de
cristalinidad. Si los sólidos son amorfos, la densidad también puede depender de los antecedentes de preparación y tratamien-
to de esta sustancia. En consecuencia, a diferencia de los líquidos, las densidades de dos sólidos químicamente equivalentes
pueden ser diferentes debido a una diferencia en la estructura del estado sólido. La densidad de las partículas constitutivas es
una característica física importante de los polvos farmacéuticos.
Más allá de estas definiciones sobre densidad de la partícula, la densidad aparente de un polvo incluye la contribución al vo-
lumen del espacio vacío entre las partículas. En consecuencia, la densidad aparente depende tanto de la densidad como de la
compactación de las partículas de polvo.

PICNOMETRÍA DE GASES PARA LA MEDICIÓN DE DENSIDAD

La picnometría de gases es un método conveniente y apropiado para la medición de la densidad de partículas de polvo. En
la Figura 1 se muestra un diagrama sencillo de un tipo de picnómetro de gases.

v, = Volumen de referencia
Ve= Volumen de celda
V5 = Volumen de muestra
M = Manómetro

Fig. 1. Esquema de Picnómetro de Gases.

La muestra, con una masa w y un volumen V5, se coloca dentro de una celda de prueba sellada que tiene un volumen de
celda sin contenido de Ve La presión de referencia del sistema, P, se determina en el manómetro mientras la válvula que co-
necta el volumen de referencia con la celda de prueba está abierta. Se cierra la válvula para separar el volumen de referencia,
V,, de la celda de prueba. La celda de la prueba se presuriza con el gas de medición a una presión inicial, P;. Luego, se abre la
válvula para conectar el volumen de referencia, V,, con la celda de la prueba y la presión desciende a la presión final, P1• Si el
gas de medición se comporta idealmente en las condiciones de medición, el volumen de la muestra, V5, se calcula mediante la
siguiente expresión:

V8 =Ve -[ P-P
Vr
1

pf -Pr
r
l
-J
(1)

La densidad, p, se calcula por la ecuación:

p=~(2)
v,
Los detalles del diseño instrumental pueden diferir, pero todos los picnómetros de gases dependen de la medición de los cam-
bios de presión a medida que se agrega o se elimina un volumen de referencia de la celda de prueba.
La densidad medida es una media ponderada por volumen de las densidades de las partículas individuales que constituyen
el polvo. La densidad será errónea si el gas de la prueba se adsorbe o se absorbe en el polvo o si se producen contaminantes
volátiles a partir del polvo durante la medición. La adsorción o absorción se evitan mediante una elección apropiada del gas de
prueba. Normalmente se elige helio. Los contaminantes volátiles del polvo se eliminan mediante la desgasificación del polvo a
través de una purga constante con helio antes de la medición. Ocasionalmente, los polvos pueden desgasificarse al vacío. Si los
USP 40 Pruebas Físicas/ (701 > Desintegración 627

contaminantes volátiles no interfieren con la medición, los volúmenes de muestra proporcionados por dos lecturas consecuti-
vas no difieren en más del 0,2%. Debido a que se pueden producir contaminantes volátiles durante la medición, el peso de la
muestra debe tomarse después de la medición picnométrica del volumen.

Método

Asegurarse de que el volumen de referencia y el volumen de calibración se hayan determinado para el picnómetro de gases
mediante un procedimiento apropiado de calibración. El gas a utilizar en la prueba debe ser helio, a menos que se especifique
otro gas en la monografía individual correspondiente. La temperatura del picnómetro de gases debe estar entre 15º y 30º y no
debe variar en más de 2º durante el curso de la medición. Cargar la celda de prueba con la sustancia en análisis que se ha
preparado según la monografía individual correspondiente. Secar la sustancia en análisis, cuando se indica (699D), según se
describe en Pérdida por secado en la monografía correspondiente, a menos que se especifiquen otras condiciones de secado en
la prueba de Densidad de sólidos de la monografía. Cuando se indica (699U), la sustancia en análisis se emplea sin secar. Em-
plear una cantidad de polvo recomendada en el manual operativo para el picnómetro. Sellar la celda de prueba del picnóme-
tro y purgar el sistema del picnómetro con el gas de prueba según el procedimiento indicado en las instrucciones de funciona-
miento del fabricante. Si la muestra debe desgasificarse al vacío, seguir las recomendaciones de las monografías individuales
correspondientes y las instrucciones del manual operativo del picnómetro.
La secuencia de medición anterior describe el procedimiento para el picnómetro de gases que aparece en la Figura 7. Si el
picnómetro tiene una operación o construcción diferentes, del que se muestra en la Figura 7, seguir el procedimiento operativo
indicado en el manual de uso del picnómetro.
Repetir la secuencia de medición para la misma muestra de polvo hasta que las mediciones consecutivas del volumen de
muestra, V,, no difieran en más del 0,2%. Descargar la celda de la prueba y medir el peso final de polvo, w. Calcular la densi-
dad picnométrica, p, de la muestra según la Ecuación 2.

(701) DESINTEGRACIÓN

Este capítulo general está armonizado con los textos correspondientes de la Farmacopea Europea y/o la Farmacopea japonesa.
Los textos de estas farmacopeas son por lo tanto intercambiables y en lugar de este capítulo general, se pueden usar los méto-
dos de la Farmacopea Europea y/o la Farmacopea japonesa para demostrar el cumplimiento de los requisitos. Estas farmacopeas
se han comprometido a no realizar ningún cambio unilateral a este capítulo armonizado.
Las partes del texto de este capítulo general que son texto USP nacional y, por lo tanto, no forman parte del texto armoniza-
do, están indicadas con símbolos (..) para especificar este hecho.
Esta prueba sirve para determinar si las tabletas o cápsulas se desintegran dentro del tiempo establecido cuando se las colo-
ca en un medio líquido en las condiciones experimentales que se presentan a continuación. •Se requiere el cumplimiento con
los límites de Desintegración establecidos en las monografías individuales excepto cuando la etiqueta indica que las tabletas o
cápsulas están destinadas para su uso como trociscos (troches) o para ser masticadas o están diseñadas como formas farma-
céuticas de liberación prolongada o formas farmacéuticas de liberación retardada. Determinar el tipo de unidades en análisis
según lo que indique el etiquetado o por observación y aplicar el procedimiento correspondiente a 6 o más unidades de dosifi-
cación .•
A los efectos de esta prueba, la desintegración no implica la disolución completa de la unidad ni de su ingrediente activo. Se
define como desintegración completa al estado en el cual los residuos de la unidad, excepto la cubierta insoluble de una cáp-
sula o los fragmentos del recubrimiento insoluble, que permanezcan en el tamiz del aparato de prueba o se adhieran a la su-
perficie inferior del disco, constituyen una masa blanda sin un núcleo firme y palpable.

APARATO

El aparato consta de un montaje de canastilla-gradilla, un vaso de precipitados bajo de 1000 mL, con una altura entre 138
mm y 160 mm y con un diámetro interno de 97 mm a 115 mm para el líquido de inmersión, una disposición termostática
para calentar el líquido entre 35º y 39º y un dispositivo para elevar y sumergir la canastilla en el líquido de inmersión a una
frecuencia constante entre 29 y 32 ciclos por minuto recorriendo una distancia de no menos de 53 mm y no más de 57 mm.
El volumen del líquido en el recipiente es tal que en el punto más alto del recorrido ascendente, la malla de alambre permane-
ce al menos 15 mm por debajo de la superficie del líquido y desciende a no menos de 25 mm desde el fondo del recipiente en
el recorrido descendente. En ningún momento debe quedar sumergida la parte superior del montaje de canastilla-gradilla. El
tiempo requerido para el recorrido ascendente es igual al tiempo del recorrido descendente y el cambio de sentido se produce
en una transición suave y no con un movimiento abrupto. El montaje de canastilla-gradilla se mueve verticalmente a lo largo
de su eje. No hay un movimiento horizontal significativo ni un movimiento del eje que no sea vertical.
628 (701) Desintegración / Pruebas Físicas USP 40

Montaje de Canastilla-Gradilla

El montaje de canastilla-gradilla consiste en seis tubos transparentes abiertos en sus extremos, de 77,5 ± 2,5 mm de longitud
cada uno, con un diámetro interno de aproximadamente 20,7 mm a 23 mm y una pared de 1,0 mm a 2,8 mm de espesor; los
tubos están sostenidos en posición vertical por dos placas, de 88 mm a 92 mm de diámetro y de 5 mm a 8,5 mm de espesor
cada una, con seis orificios de 22 mm a 26 mm de diámetro cada uno, equidistantes del centro de la placa y equidistantes
entre sí. Debajo de la superficie de la placa inferior, se fija una tela de alambre de acero inoxidable tramado que posee una
trama cuadrada simple con aberturas de 1,8 mm a 2,2 mm y con un diámetro de alambre de 0,57 mm a 0,66 mm. Las piezas
del aparato se arman y se sostienen rígidamente por medio de tres pernos que pasan a través de las dos placas. Se proporciona
un medio adecuado para suspender el montaje de canastilla-gradilla del dispositivo de ascenso y descenso, utilizando un pun-
to de su eje.
El diseño del montaje de canastilla-gradilla se puede variar de alguna forma, siempre que se mantengan las especificaciones
para los tubos de vidrio y el tamaño del tamiz de la malla. El montaje de canastilla-gradilla se ajusta a las dimensiones que se
encuentran en la Figura 7.

Discos

El uso de discos está permitido exclusivamente cuando está especificado o autorizado •en la monografía. Si se especifica en
la monografía individual,. cada tubo presenta un disco cilíndrico de 9,5 ±O, 15 mm de espesor y 20,7±O,15 mm de diámetro.
El disco está hecho de un material plástico transparente adecuado, con un peso específico entre 1, 18 y 1,20. Cinco orificios
paralelos de 2±O,1 mm se extienden entre los extremos del cilindro. Uno de los orificios está centrado en el eje cilíndrico. Los
otros orificios están centrados a 6 ± 0,2 mm del eje en líneas imaginarias perpendiculares al eje y paralelas entre sí. Se cortan
cuatro planos idénticos de forma trapezoidal en la pared del cilindro, casi perpendiculares a los extremos del cilindro. La forma
trapezoidal es simétrica; sus lados paralelos coinciden con los extremos del cilindro y son paralelos a una línea imaginaria que
conecta los centros de dos orificios adyacentes de 6 mm desde el eje cilíndrico. El lado paralelo del trapezoide en la parte infe-
rior del cilindro tiene un largo de 1,6 ± O, 1 mm y sus bordes inferiores se encuentran a una profundidad de 1,5 a 1,8 mm de la
circunferencia del cilindro. El lado paralelo del trapezoide en la parte superior del cilindro tiene un largo de 9,4 ± 0,2 mm y su
centro se encuentra a una profundidad de 2,6±O,1 mm de la circunferencia del cilindro. Todas las superficies del disco son
lisas. Si se especifica el uso de discos •en la monografía individual,. agregar un disco a cada tubo y hacer funcionar el aparato
según se indica en el Procedimiento. Los discos se ajustan a las dimensiones que se encuentran en la Figura 71 •

1 El uso de detección automática empleando discos modificados está permitido cuando se especifica o se autoriza el uso de discos. Tales discos deben cumplir con
los requisitos de densidad y dimensión que se proporcionan en este capítulo.
USP 40 Pruebas Físicas/ (701) Desintegración 629

Disco
Montaje de
Canastilla-Gradilla
2~1r~q~
~ Vista
~ <:::.; superior

~
+I
9,4~ ~
LO
N'
+I

~~-~{v·ta
LO
!'-:'
f'-. +I
11 : : 11 IS
: :: ' ' :: \ lateral

~¡
LO
al
20,7±0,15

Vista
inferior

Figura 1. Aparato de desintegración. (Todas las dimensiones están expresadas en mm.)

PROCEDIMIENTO

•Tabletas Sin Cubierta

.Colocar 1 unidad de dosificación en cada uno de los seis tubos de la canastilla y, si se indica, agregar un disco. Hacer fun-
cionar el aparato, usando •aguaº• el medio especificado como el líquido de inmersión; mantener a 37 ± 2º. Al final del tiempo
especificado •en la monografía,+ levantar la canastilla del líquido y observar las tabletas: todas las tabletas se han desintegrado
completamente. Si 1 ó 2 tabletas no se desintegran completamente, repetir la prueba con 12 tabletas adicionales. El requisito
se cumple si se desintegran no menos de 16 tabletas del total de 18 tabletas analizadas.

•Tabletas Con Cubierta Simple

Aplicar la prueba de Tabletas Sin Cubierta, Tabletas Sin Cubierta, haciendo funcionar el aparato durante el tiempo especifica-
do en la monografía individual.

Tabletas de Liberación Retardada (Recubrimiento Entérico)

Colocar 1 tableta en cada uno de los seis tubos de la canastilla y, si la tableta tiene una cubierta externa de azúcar soluble,
sumergir la canastilla en agua a temperatura ambiente durante 5 minutos. Poner el aparato en funcionamiento utilizando flui-
do gástrico simulado SR a 37 ± 2º como el líquido de inmersión. Al cabo de 1 hora de inmersión en el fluido gástrico simulado
SR, levantar la canastilla y observar las tabletas: las tabletas no muestran signos de desintegración, resquebrajamiento o ablan-
630 (701) Desintegración / Pruebas Físicas USP 40

damiento. Poner el aparato en funcionamiento utilizando fluido intestinal simulado SR a 37 ± 2º como líquido de inmersión,
durante el tiempo especificado en la monografía. Sacar la canastilla del líquido y observar las tabletas: todas las tabletas se
desintegran completamente. Si 1 ó 2 tabletas no se desintegran completamente, repetir la prueba con 12 tabletas adicionales:
no menos de 16 del total de 18 tabletas analizadas se desintegran completamente.

Tabletas Bucales

Aplicar la prueba para Tabletas Sin Cubierta. Después de 4 horas, sacar la canastilla del líquido y observar las tabletas: todas
las tabletas se han desintegrado. Si 1 ó 2 tabletas no se desintegran completamente, repetir la prueba con 1 2 tabletas adicio-
nales: no menos de 16 del total de 18 tabletas analizadas se desintegran completamente.

Tabletas Sublinguales

Aplicar la prueba para Tabletas Sin Cubierta. Tabletas Sin Cubierta. Al final del tiempo especificado en la monografía indivi-
dual: todas las tabletas se han desintegrado. Si 1 ó 2 tabletas no se desintegran completamente, repetir la prueba con 12 ta-
bletas adicionales: no menos de 16 del total de 18 tabletas analizadas se desintegran completamente.

Cápsulas de Gelatina Dura

Aplicar la prueba para Tabletas Sin Cubierta. Fijar a la superficie de la placa superior del montaje de canastilla-gradilla, una
tela de alambre que se pueda desprender, que tenga una trama cuadrada simple con aberturas de 1,8 mm a 2,2 mm y con un
diámetro de alambre de 0,60 mm a 0,655 mm, según se describe en Montaje de Canastilla-Gradilla. Observar las cápsulas den-
tro del tiempo especificado en la monografía individual: todas las cápsulas se han desintegrado excepto los fragmentos de las
cubiertas. Si 1 ó 2 cápsulas no se desintegran completamente, repetir la prueba con 12 cápsulas adicionales: no menos de 16
del total de 18 cápsulas analizadas se desintegran completamente.

Cápsulas de Gelatina Blanda

Proceder según se indica en Cápsulas de Gelatina Dura .•

(705) ATRIBUTOS DE CALIDAD PARA TABLETAS CUYO ETIQUETADO

INDICA RANURADO FUNCIONAL

PROPÓSITO
Este capítulo provee atributos de calidad para productos cuyo etiquetado aprobado indica que las tabletas se pueden partir
para producir múltiples porciones que tienen una dosis fraccionada (cuyo etiquetado indica ranurado funcional) exacta. La
cantidad declarada en la etiqueta de las porciones partidas debe ser una fracción simple de la cantidad declarada para la table-
ta intacta basándose en el número de ranuras y el tamaño de la porción partida (p.ej., una mitad, un tercio o un cuarto). Al
momento de partirlas, las tabletas intactas deben cumplir con la especificación de la monografía. Con excepción de la dosis, se
espera que cada porción partida de las tabletas cuyo etiquetado indica ranurado funcional cumpla con los atributos de calidad
de las tabletas enteras. Las porciones partidas que resultan de subdividir una tableta ranurada funcionalmente deben cumplir
con las pruebas de Partición de las Tabletas con Ranurado Funcional y Disolución o Desintegración provistas en este capítulo.

ALCANCE

Este capítulo se aplica a tabletas cuyo etiquetado indica ranurado funcional y a las porciones partidas que representan cual-
quier fracción declarada de la dosis completa de la tableta ranurada funcionalmente. Las tabletas deben partirse como parte
del procedimiento de prueba y se deben definir las condiciones de almacenamiento de las porciones partidas como parte de
dicho procedimiento. Para las pruebas de Disolución o Desintegración, los analistas deben usar sólo las porciones partidas de las
tabletas que se consideran aceptables mediante la prueba de Partición de las Tabletas con Ranurado Funcional.
USP 40 Pruebas Físicas/ (705) Tabletas con Ranurado Funcional 631

PARTICIÓN DE LAS TABLETAS CON RANURADO FUNCIONAL

Procedimiento de Prueba

1. Tomar una muestra aleatoria de 30 tabletas intactas y proceder según se indica a continuación.
2. Pesar con exactitud cada tableta y registrar su peso.
3. Para cada tableta intacta, determinar el peso esperado de las porciones partidas dividiendo el peso de la tableta entera
por el número designado de porciones partidas indicado en el etiquetado.
4. Partir manualmente cada tableta (sin ayuda mecánica) en el número designado de porciones partidas y pesar cada por-
ción partida.
5. Para cada tableta, determinar el porcentaje del peso esperado en cada porción partida.
Una tableta aceptable se parte en el número designado de porciones y cada porción partida tiene no menos de 75% y no
más de 125% del peso esperado para la porción de tableta partida. [NOTA-Separar las porciones de tableta partida obtenidas
de las tabletas aceptables para someterlas al análisis subsiguiente de disolución o desintegración.]
Criterios de aceptación: No menos de 28 de las 30 tabletas son aceptables.

DISOLUCIÓN

Usar porciones partidas de las tabletas que son aceptables de acuerdo con la prueba de Partición de las Tabletas con Ranura-
do Funcional.

Tabletas de Liberación Inmediata

La disolución para tabletas de liberación inmediata se realiza en la etapa S2 (ver Disolución (711 )). Analizar 12 porciones de
tableta partida de acuerdo con las especificaciones para Medio, Aparato, Tiempos y Análisis. El promedio de los 12 resultados es
no menor que Q y ningún resultado es menor que Q - 15%.

Tabletas de Liberación Prolongada

Realizar el análisis de disolución de porciones de tableta partida a partir de tabletas de liberación prolongada usando uno de
los dos procedimientos alternativos. La monografía especifica el procedimiento que se debe usar.
Procedimiento 1 (Procedimiento para Formas Farmacéuticas de Liberación Prolongada, Disolución (711) ): Analizar individual-
mente 12 porciones de tableta partida y 12 tabletas intactas.
Medio, Aparato y Análisis: Proceder según se indica en la monografía siguiendo la prueba apropiada que se indica en el
etiquetado. Los tiempos de muestreo de la prueba del perfil de disolución se determinan según se indica a continuación. Usar
los tiempos de muestreo provistos en la prueba de disolución apropiada de la monografía. Como mínimo, usar tres tiempos de
muestreo, de modo que no más de uno de ellos exceda el 85% disuelto.
Calcular el factor de similitud (f2) para los resultados de las tabletas intactas y los resultados de la porción partida de tableta:

R1 = porcentaje acumulativo del fármaco disuelto con respecto a la cantidad declarada para las tabletas intactas en cada uno
de los tiempos de muestreo n seleccionados
T1 = porcentaje acumulativo del fármaco disuelto con respecto a la cantidad declarada para las porciones de tableta partida
en cada uno de los tiempos de muestreo n seleccionados
Criterios de aceptación: El valor calculado f2 es no menos de 50 (intervalo aceptable: 50-100).
Procedimiento 2 (Procedimiento para Formas Farmacéuticas de Liberación Prolongada, Disolución (711 )): Usar una porción par-
tida de tableta como la unidad de dosificación. Analizar individualmente 12 unidades de dosificación.
Medio, Aparato, Tiempos y Análisis: Conforme a lo provisto en la monografía siguiendo el número de prueba apropiado
que se indica en el etiquetado.
Criterios de aceptación: Las cantidades liberadas, como porcentajes de la cantidad declarada, en los tiempos especificados,
cumplen con los criterios de aceptación para el nivel L2 de la Tabla de Aceptación 2 del capítulo (711 ).

DESINTEGRACIÓN

La prueba de desintegración sólo es necesaria cuando se usa como sustituta de la prueba de disolución conforme a lo espe-
cificado en la monografía. Seguir el procedimiento usando porciones de las tabletas partidas que sean aceptables de acuerdo
con la prueba de Partición de las Tabletas con Ranurado Funcional como la unidad de dosificación (ver Desintegración (701 )).
632 (711) Disolución / Pruebas Físicas USP 40

(711) DISOLUCIÓN

El capítulo general Disolución (711) está siendo armonizado con los textos correspondientes de la Farmacopea Europea y/o la
Farmacopea japonesa. Estas farmacopeas se han comprometido a no realizar ningún cambio unilateral a este capítulo armoni-
zado.
Las partes del texto de este capítulo general que son texto USP nacional y, por lo tanto, no forman parte del texto armoniza-
do, están indicadas con símbolos (..) para especificar este hecho.
Esta prueba se realiza para determinar el cumplimiento de los requisitos de disolución •si estuvieran indicados en la mono-
grafía individual. de las formas farmacéuticas administradas oralmente. Para los fines de este capítulo general, una unidad de
dosificación está definida como 1 tableta, 1 cápsula o la cantidad que se especifique. •De los tipos de aparatos que se descri-
ben en este capítulo, utilizar el que se especifica en la monografía individual. Cuando la etiqueta indica que el artículo tiene
recubrimiento entérico, y cuando la monografía individual incluye una prueba de disolución o desintegración sin establecer
específicamente que se aplica a artículos de liberación retardada, emplear el procedimiento y la interpretación indicados para
Formas Farmacéuticas de Liberación Retardada a menos que se especifique algo diferente en la monografía individual.

PARA FORMAS FARMACÉUTICAS QUE CONTIENEN O ESTÁN RECUBIERTAS CON GELATINA

Si la forma farmacéutica que contiene gelatina no cumple con los criterios de la Tabla de Aceptación correspondiente (ver
Interpretación, Formas Farmacéuticas de Liberación Inmediata, Formas Farmacéuticas de Liberación Prolongada o Formas Farmacéu-
ticas de Liberación Retardada) debido a que existe evidencia de entrecruzamiento, el procedimiento de disolución debe repetir-
se agregando enzimas al medio, según se describe a continuación, y los resultados de la disolución deben evaluarse comen-
zando por la primera etapa de la Tabla de Aceptación correspondiente. No es necesario continuar el análisis hasta la última
etapa (hasta 24 unidades) cuando los criterios no se cumplen durante la primera etapa del análisis y se observa evidencia de
entrecruzamiento.
La gelatina puede experimentar entrecruzamiento en presencia de ciertos compuestos y/o en ciertas condiciones de almace-
namiento, incluidas entre otras, temperatura y humedad elevadas. Puede formarse una película en la superficie externa y/o
interna de la cubierta de la cápsula de gelatina o en la forma farmacéutica que impida la liberación del fármaco durante la
prueba de disolución (para más información ver Cápsulas-Pruebas de Disolución y Atributos de Calidad Relacionados (1094)).
[NOTA-Todas las referencias a capítulos con números superiores a (1000) se proveen únicamente para propósitos informati-
vos que se pueden usar como recursos útiles. Estos capítulos no son obligatorios a menos que se exija explícitamente su aplica-
ción.]

Medio de Disolución de pH ::;4,0

Enzima: Pepsina, cuya actividad ha sido determinada mediante el procedimiento en pepsina purificada de la sección Espe-
cificaciones de Reactivos
Cantidad: Una cantidad de pepsina que resulta en una actividad de no más de 750 000 Unidades/L de medio de disolu-
ción.

Medio de Disolución de pH >4,0 y <6,8

Enzimas: Papaína, cuya actividad ha sido determinada mediante la prueba de Valoración en la monografía de Papaína; o
bromelina, cuya actividad ha sido determinada mediante el procedimiento en bromelina de la sección Especificaciones de
Reactivos.
Cantidad: Una cantidad de papaína que resulta en una actividad de no más de 550 000 Unidades/L de medio de disolu-
ción, o una cantidad de bromelina que resulta en una actividad de no más de 30 unidades de digestión de gelatina (GDU,
por sus siglas en inglés)/L de medio de disolución.

Medio de Disolución de pH 2':6,8

Enzima: Pancreatina, cuya actividad de proteasa ha sido determinada mediante el procedimiento de Valoración de activi-
dad de proteasa (Poder de digestión de caseína) en la monografía de Pancreatina
Cantidad: Una cantidad de pancreatina que resulta en una actividad de no más de 2000 Unidades/L de proteasa en el
medio de disolución
USP 40 Pruebas Físicas/ (711) Disolución 633

Medios de Disolución que Contienen Agentes Tensoactivos u Otros Ingredientes que

Desnaturalizan las Enzimas

Si el medio de disolución contiene agentes tensoactivos u otros ingredientes que desnaturalizan la enzima usada, se puede
implementar una etapa de pretratamiento en la prueba de disolución de la forma farmacéutica. Esta etapa de pretratamiento
se realiza usando el medio de disolución especificado sin el agente tensoactivo o ingrediente y agregando la cantidad apropia-
da de enzima según el pH del medio. La cantidad de enzima agregada es apropiada para el volumen de medio de disolución
usado en el pretratamiento. Para obtener el volumen de medio especificado para la prueba de disolución final, la etapa de
pretratamiento se puede realizar con un volumen más pequeño de medio sin el ingrediente, de manera que el volumen final
se obtenga al agregar el ingrediente al final de la etapa de pretratamiento. Todas las demás condiciones de prueba (aparato,
rotación o velocidad de flujo) deben mantenerse conforme a lo descrito en el método o la monografía. Típicamente, la dura-
ción de la etapa de pretratamiento es no mayor de 15 minutos. El tiempo requerido de pretratamiento debe evaluarse para
cada caso en particular y justificarse con bases científicas. Este tiempo debe incluirse en el tiempo total de la prueba. Por ejem-
plo, si el tiempo total de la prueba es 45 minutos y 15 minutos se usan para la etapa de pretratamiento, la prueba continuará
durante 30 minutos después de agregar el ingrediente.

APARATO

Aparato 1 (Aparato con Canastilla)

El aparato consta de: un vaso, con o sin tapa, de vidrio u otro material inerte y transparente; 1 un motor; un eje propulsor
metálico y una canastilla cilíndrica. El vaso está parcialmente sumergido en un baño de agua adecuado de cualquier dimensión
conveniente o recibe calor de un dispositivo adecuado, como por ejemplo una camisa de calentamiento. Durante el transcurso
de la prueba, el baño de agua o el dispositivo de calentamiento mantienen la temperatura en el interior del vaso a 37 ± 0,5º y
garantizan que el fluido del baño se mantenga en movimiento suave y constante. Ninguna parte del equipo, ni el entorno en
el cual está colocado, aumenta significativamente el movimiento, agitación o vibración, por encima de los producidos por el
elemento de agitación que gira con suavidad. Es preferible emplear un aparato que permita observar la muestra y el elemento
de agitación durante la prueba. El vaso es cilíndrico y de fondo semiesférico •con las siguientes dimensiones y capacidades:.
para 1 L de capacidad •nominal., la altura es de 160-21 O mm y el diámetro interno es de 98-106 mm; •para 2 L de capacidad
nominal, la altura es de 280-300 mm y el diámetro interno es de 98-106 mm; y para 4 L de capacidad nominal, la altura es de
280-300 mm y el diámetro interno es de 145-155 mm •. Las paredes del vaso cilíndrico tienen un reborde en el extremo supe-
rior. Se puede utilizar una tapa para retardar la evaporación. 2 Colocar el eje propulsor de forma tal que su eje central guarde
una distancia máxima de 2 mm con respecto a cualquier punto del eje vertical del vaso y rote suavemente sin fluctuaciones
significativas que pudieran afectar los resultados. Emplear un dispositivo para regular la velocidad con el objeto de seleccionar
y mantener la velocidad de rotación del eje propulsor a la velocidad especificada •en la monografía individual. con una aproxi-
mación de ±4%.
Los componentes del eje y de la canastilla del elemento de agitación son de acero inoxidable tipo 316 o de otro material
inerte, según las especificaciones de la Figura 1. Se puede emplear una canastilla con un recubrimiento de oro de aproximada-
mente 0,0001 pulgadas (2,5 µm) de espesor. La unidad de dosificación se coloca en una canastilla seca al comienzo de cada
prueba. La distancia entre el fondo interno del vaso y el fondo de la canastilla se mantiene a 25 ± 2 mm durante la prueba.

1 Los materiales deben ser tales que no produzcan sorción, reacciones ni interferencias con la muestra en análisis.
2 Si se usa una tapa, verificar que cuenta con orificios para insertar fácilmente un termómetro y para retirar las muestras.
634 (711) Disolución / Pruebas Físicas USP 40

6,3 a 6,5 ó
9,4 a 10,1 mm
Orificio de ventilación

2,0 ± 0,5 mm de diámetro

Seguro de retención con

3 lengüetas radiales a 120º éntre sí 5,1±0,5 mm
~
Abertura libre
20,2 ±1,0 mm
~~l~l!~lP-
- - - - - - - - - - _ _ : _ f+----J------<

Tamiz O.O.
22,2 ± 1,0 mm
1 t
27,0
37,0± ± 1,0mm Tamiz con entramado soldado:
3,0mm malla
0,22-0,31 mm de diámetro del alambre
con aberturas en el alambre de
0,36-0,44 mm.
[Nota-La malla podría alterarse
ligeramente después de soldarla.]
[Nota- La máxima desviación permisible
en "A" es ± 1, Omm cuando la parte
se gira sobre un eje lineal central con
la cantastilla montada.]

25,0 ± 3,0 mm

Figura 1. Elemento de agitación de canastilla

Aparato 2 (Aparato con Paleta)

Emplear el Aparato 1, excepto que se usa una paleta compuesta por un aspa y un eje como elemento de agitación. Colocar
el eje propulsor de forma tal que su eje central guarde una distancia máxima de 2 mm con respecto a cualquier punto del eje
vertical del vaso y rote suavemente sin fluctuaciones significativas que pudieran afectar los resultados. La línea central vertical
del aspa está alineada con el eje propulsor de forma tal que el extremo inferior del aspa está nivelado con el extremo inferior
del eje propulsor. La paleta cumple con las especificaciones que se indican en la Figura 2. La distancia entre el fondo interno
del vaso y el borde inferior del aspa se mantiene a 25 ± 2 mm durante la prueba. El aspa y el eje rígidos, metálicos o de otro
material inerte adecuado forman una sola unidad. En algunos casos, se puede usar un dispositivo desmontable de dos partes
adecuado, siempre y cuando las partes permanezcan firmemente ajustadas durante la prueba. El eje y el aspa de la paleta pue-
den estar recubiertos con un material inerte adecuado. Dejar que la unidad de dosificación se hunda hasta el fondo del vaso
antes de empezar a rotar el aspa. A las unidades de dosificación se les puede agregar una pieza pequeña, suelta, de algún
material no reactivo, como por ejemplo un par de vueltas de alambre, para evitar que floten. La Figura 2a ilustra un dispositivo
de sumersión alternativo. También se pueden emplear otros dispositivos de sumersión validados.
USP 40 Pruebas Físicas/ (711) Disolución 635

Diámetro de
9,4 a 10,1 mm

NOTAS
(1) Las dimensiones A y B
no deben variar en más
de 0,5 mm cuando esta
pieza se gira sobre el e¡e
lineal central.
(2) Las tolerancias son de
± 1,0 mm, a menos que
se indique lo contrario.

________J_,
A
j,,r:.,
35,Bmm

±0,5mm

--~~1--~-- l_
!.-- 42,0,mm ---...J
4,0±1,0mm

.--~-7-4-,0-.m~,.s.-o-m_m
l_I __ -.:¡ ::::!=
- _'-_-----....

Figura 2. Elemento de agitación de paleta

t
3,5-4,of= I3.s-4,o
• •
12,0±0,2
A: Tapa de alambre resistente a los ácidos
B: Soporte de alambre resistente a los ácidos

Figura 2a. Dispositivo de sumersión alternativo. Todas las dimensiones están expresadas en mm.

Aparato 3 (Cilindro Oscilante)

NO ACEPTADO POR LA FARMACOPEA JAPONESA

El equipo se compone de un grupo de vasos cilíndricos de vidrio de fondo plano, un grupo de cilindros oscilantes de vidrio,
accesorios de un material inerte (de acero inoxidable tipo 316 o de otro material adecuado) y mallas de un material adecuado
no absorbente ni reactivo, que se fijan a la parte superior e inferior de los cilindros oscilantes; un motor y una transmisión que
hacen oscilar los cilindros en sentido vertical dentro de los vasos y, de ser necesario, traslada los cilindros oscilantes en sentido
horizontal hacia otra hilera de vasos. Los vasos están parcialmente sumergidos en un baño de agua adecuado de un tamaño
conveniente que permita mantener la temperatura a 37 ± 0,5º durante la prueba. Ninguna parte del equipo, ni el entorno en
el cual el equipo está colocado, produce una cantidad importante de movimiento, agitación o vibración, que exceda la oscila-
ción vertical suave del cilindro oscilante. Se usa un dispositivo que permite elegir la velocidad de oscilación y mantenerla a la
velocidad de inmersión •especificada en la monografía individual,. dentro de ±5%. Es preferible emplear un aparato que per-
mita observar las muestras y los cilindros oscilantes. Los vasos cuentan con una tapa de evaporación que permanece colocada
durante la prueba. Los componentes se ajustan a las dimensiones que se indican en la Figura 3 a menos que se especifique
algo diferente •en la monografía individual •.
636 (711) Disolución / Pruebas Físicas USP 40

Orificios para aire

Diámetro 3,9 ± O, 1

~-- -rl ·-¡

1 1
+I 1 1 Tapa para evaporación
CXl
1
¡g :
1 1
1

+I
8
~

Cilindro de oscilación
vertical de vidrio

'--+--...+--- 47 ± 1,4

+I
o
<D

Vaso de vidrio

1
1
1
L--- - - ..J

Figura 3. Aparato 3 (cilindro oscilante)

Aparato 4 (Celda de Flujo)

El equipo se compone de un depósito y una bomba para el Medio de disolución, una celda de flujo y un baño de agua que
mantiene el Medio de disolución a 37 ± 0,5º. Usar la celda del tamaño especificado •en la monografía individual •.
La bomba desplaza el Medio de disolución a través de la celda de flujo en dirección ascendente. La bomba tiene un intervalo
de operación de 240 a 960 mL/h y las velocidades de flujo estándares son de 4 mL, 8 mL y 16 mL/min. La bomba debe sumi-
nistrar un flujo constante (±5% de la velocidad de flujo nominal); el perfil del flujo es sinusoidal con una pulsación de 120 ± 1O
pulsos por minuto. Se puede usar también una bomba no pulsátil. Los procedimientos de la prueba de disolución en los que se
usa una celda de flujo deben estar caracterizados con respecto a la velocidad y a las pulsaciones.
La celda de flujo (ver Figura 4 y Figura 5) de un material transparente e inerte, está montada verticalmente con un sistema de
filtro (especificado en la monografía individual) que impide que se escapen partículas no disueltas de la parte superior de la
celda; el diámetro estándar de la celda se ubica entre 12 mm y 22,6 mm; la base cónica de la celda está generalmente llena de
pequeñas perlas de vidrio de aproximadamente 1 mm de diámetro y una de esas perlas, de aproximadamente 5 mm, está
ubicada en el ápice para proteger el tubo de entrada del fluido; se dispone de un portatabletas (ver Figura 4 y Figura 5) para
colocar formas farmacéuticas especiales, p.ej., tabletas estratificadas. La celda se sumerge en un baño de agua y se mantiene la
temperatura a 37 ± 0,5º.
USP40 Pruebas Físicas/ (711) Disolución 637

Cámara del filtro

Tamiz con malla Nº 40

Diámetro del alambre = 0,2
Apertura= 0,45
1.020±0,2.1
L()
1
c5 022,6±0,2
+I
L()
·--1-
'--...
~ Muesca para el soporte
de tabletas

(03)
1
- ___ L_,
min3

t __J__ 0 0,8 ± 0,05

0 =Diámetro

~I

24,0±0,5

Figura 4: Celda grande para tabletas y cápsulas (arriba) y portatabletas para la celda grande (abajo) del Aparato 4. (Todas las
dimensiones están expresadas en mm a menos que se indique algo diferente.)
638 (711) Disolución / Pruebas Físicas USP 40

Cámara del filtro

-.-~- ~.v~~~~~~I!.--- Tamiz con malla Nº 40

Diámetro del alambre =0,2
Apertura =0,45
"l.
o
+I
"'o+I "'
,,;
o
"'
012 !0·2 .........._Muesca pare el soporte
· de tabletas

0 =Diámetro

13,5 ± 0,5

Figura 5: Celda pequeña para tabletas y cápsulas (arriba) y portatabletas para celda pequeña (abajo) del Aparato 4. (Todas
las dimensiones están expresadas en mm a menos que se indique algo diferente.)

El aparato emplea un mecanismo de abrazadera y dos juntas tipo anillo (0-rings) para fijar la celda. La bomba está separada
de la unidad de disolución a fin de proteger a esta última de las vibraciones que pueda originar la bomba. La bomba no debe
estar colocada en un nivel superior al de los recipientes de depósito. Las conexiones entre tubos son lo más cortas posible.
Emplear tuberías de material inerte adecuado, como por ejemplo teflón de aproximadamente 1,6 mm de diámetro interno y
conexiones con terminaciones aplanadas químicamente inertes.

APTITUD DEL APARATO

La determinación de la aptitud del aparato que se utilizará en la prueba de disolución debe incluir el cumplimiento de las
dimensiones y tolerancias indicadas anteriormente. Además, los parámetros de prueba cruciales que es necesario controlar pe-
riódicamente mientras se usa el aparato incluyen el volumen y la temperatura del Medio de disolución, la velocidad de rotación
(Aparato 7 y Aparato 2), la velocidad de inmersión (Aparato 3) y la velocidad de flujo del medio (Aparato 4).
Controlar periódicamente que el desempeño del equipo de disolución sea aceptable. •Comprobar la aptitud de un aparato
individual mediante la Prueba de verificación del desempeño.
Estándares de Referencia USP (11 ): ER Tabletas de Prednisona USP
 USP 40 Pruebas Físicas/ (711) Disolución 639

Prueba de verificación del desempeño, Aparato 1 y Aparato 2: Analizar el ER Tabletas de Prednisona USP, de acuerdo
con las condiciones operativas especificadas. El aparato es apto si los resultados obtenidos están dentro del intervalo aceptable
que se indica en la hoja de datos técnicos específica para el lote usado y el aparato analizado.
Prueba de verificación del desempeño, Aparato 3: [Se incluirá más adelante.]
Prueba de verificación del desempeño, Aparato 4: [Se incluirá más adelante.].

PROCEDIMIENTO

Aparato 1 y Aparato 2

FORMAS FARMACÉUTICAS DE LIBERACIÓN INMEDIATA

Colocar el volumen indicado de Medio de disolución(± 1%) en el vaso del aparato indicado •en la monografía individual.,
ensamblar el aparato, equilibrar el Medio de disolución a 37 ± 0,5º y retirar el termómetro. Colocar 1 unidad de dosificación en
el aparato, verificando que no queden burbujas de aire en su superficie y poner el aparato en funcionamiento inmediatamente
a la velocidad indicada •en la monografía individual •. Dentro del intervalo de tiempo especificado, o a cada tiempo especifica-
do, retirar una muestra de una zona equidistante entre la superficie del Medio de disolución y la parte superior de la canastilla o
aspa rotatoria que no esté a menos de 1 cm de la pared del vaso. [NOTA-Si se indica tomar más de una muestra, usar volúme-
nes iguales de Medio de disolución nuevo a 37º en lugar de las alícuotas tomadas para el análisis o, si se demuestra que no es
necesario reemplazar el medio, corregir el cálculo por el cambio de volumen. Mantener el vaso cubierto durante el transcurso
de la prueba y verificar la temperatura de la mezcla en análisis con una frecuencia adecuada.] Realizar el análisis •según se indi-
ca en la monografía individual. empleando un método de valoración adecuado. 3 Repetir la prueba con otras unidades de la
forma farmacéutica.
Si se emplean equipos automáticos para muestreo o si se introducen otras modificaciones en el aparato, es necesario verifi-
car que los resultados obtenidos con el aparato modificado son equivalentes a los obtenidos con el aparato estándar descrito
en este capítulo general.
Medio de disolución: Emplear un medio de disolución adecuado. Emplear el disolvente especificado •en la monografía
individual •. El volumen especificado se refiere a mediciones realizadas entre 20º y 25º. Si el Medio de disolución es una solución
amortiguada, ajustar el pH al valor indicado con una aproximación de 0,05 unidades con respecto al pH indicado •en la mono-
grafía individual.. [NOTA-Los gases disueltos pueden causar la formación de burbujas que pueden alterar los resultados de la
prueba. Si los gases disueltos interfieren en los resultados de la disolución, eliminarlos antes de iniciar las pruebas. 4 ]
Tiempo: Cuando se especifica un solo tiempo, la prueba se puede concluir en un período más corto, siempre y cuando se
cumpla el requisito de cantidad mínima disuelta. Tomar las muestras sólo en los tiempos indicados con una tolerancia de ±2%.
•Procedimiento para una muestra combinada para formas farmacéuticas de liberación inmediata: Usar este procedi-
miento cuando se especifica un Procedimiento para una Muestra Combinada en la monografía individual. Proceder según se in-
dica en Procedimiento para Aparato 1 y Aparato 2 en Formas Farmacéuticas de Liberación Inmediata. Combinar volúmenes iguales
de soluciones filtradas de las seis o doce muestras individuales tomadas y emplear la muestra combinada como la muestra de
prueba. Determinar la cantidad promedio del ingrediente activo disuelto en la muestra combinada .•

FORMAS FARMACÉUTICAS DE LIBERACIÓN PROLONGADA

Proceder según se indica en Formas Farmacéuticas de Liberación Inmediata.

Medio de disolución: Proceder según se indica en Formas Farmacéuticas de Liberación Inmediata.
Tiempo: Los tiempos de prueba, que generalmente son tres, se expresan en horas.

FORMAS FARMACÉUTICAS DE LIBERACIÓN RETARDADA, NO ACEPTADO POR LA FARMACOPEA JAPONESA

Emplear el Método A o el Método By el aparato especificado •en la monografía individual •. Todos los tiempos de prueba
especificados deben cumplirse con una tolerancia de ±2%, a menos que se especifique algo diferente.

3 Filtrar las muestras de prueba inmediatamente después de tomarlas, salvo que se demuestre que la filtración no es necesaria. Usar un filtro inerte que no adsorba
el ingrediente activo y que no contenga sustancias extraíbles que pudieran interferir en el análisis.
4 Un método para eliminar los gases es el siguiente: Calentar el medio, mezclando suavemente, hasta aproximadamente 41º; inmediatamente filtrar al vacío utili-
zando un filtro con un tamaño de poro de 0,45 µm o menor, mezclando vigorosamente y continuar mezclando al vacío durante aproximadamente 5 minutos.
También se puede emplear otra técnica de desgasificación validada para eliminar los gases disueltos.
640 (711) Disolución / Pruebas Físicas USP 40

Método A Procedimiento •(a menos que se indique algo diferente en la monografía individual).

ETAPA ÁCIDA

Colocar 750 mL de ácido clorhídrico O, 1 N en el vaso y ensamblar el aparato. Dejar que el medio se equilibre a una tempe-
ratura de 37 ± 0,5º. Colocar 1 unidad de dosificación en el aparato, cubrir el vaso y poner en funcionamiento el aparato a la
velocidad especificada •en la monografía •.
Después de funcionar 2 horas con ácido clorhídrico O, l N, retirar una alícuota del líquido y proceder de inmediato según se
indica para la Etapa Amortiguada.
Realizar un análisis de la alícuota empleando un método de valoración adecuado. •El procedimiento se especifica en la mo-
nografía individual •.

ETAPA AMORTIGUADA

[NOTA-Completar la adición de la solución amortiguadora y ajuste de pH dentro de los 5 minutos.] Con el aparato en fun-
cionamiento a la velocidad indicada •en la monografía., agregar 250 mL de fosfato tribásico de sodio 0,20 M previamente
equilibrado a 37 ± 0,5º al líquido del vaso. Ajustar, si fuera necesario, con ácido clorhídrico 2 N o hidróxido de sodio 2 N a un
pH de 6,8 ± 0,05. Dejar el aparato funcionando durante 45 minutos o durante el tiempo especificado •en la monografía indivi-
dual •. Al finalizar ese período, retirar una alícuota del líquido y efectuar el análisis empleando un método de valoración adecua-
do. •El procedimiento se especifica en la monografía individual. La prueba puede concluir en un período más corto que el es-
pecificado para la Etapa Amortiguada si el requisito de cantidad mínima disuelta se cumple antes de lo previsto .•

Método B Procedimiento •(a menos que se indique algo diferente en la monografía individual).

ETAPA ÁCIDA

Colocar 1000 mL de ácido clorhídrico 0, 1 N en el vaso y ensamblar el aparato. Dejar que el medio se equilibre a una tempe-
ratura de 37 ± 0,5º. Colocar 1 unidad de dosificación en el aparato, cubrir el vaso y poner en funcionamiento el aparato a la
velocidad especificada •en la monografía •. Después de funcionar 2 horas con ácido clorhídrico O, 1 N, retirar una alícuota del
líquido y proceder de inmediato según se indica para la Etapa Amortiguada.
Realizar un análisis de la alícuota empleando un método de valoración adecuado. •El procedimiento se especifica en la mo-
nografía individual •.

ETAPA AMORTIGUADA

[NOTA-Para esta etapa del procedimiento, emplear una solución amortiguadora previamente equilibrada a una temperatura
de 37 ± 0,5º.] Escurrir el ácido del vaso y agregarle 1000 mL de una solución amortiguadora de fosfato de pH 6,8, preparada
mezclando ácido clorhídrico O, 1 N con fosfato tribásico de sodio 0,20 M (3:1) y ajustando, si fuera necesario, con ácido clorhí-
drico 2 N o con hidróxido de sodio 2 N a un pH de 6,8 ± 0,05. [NOTA-Este paso también puede llevarse a cabo retirando del
aparato el vaso que contiene el ácido, reemplazándolo con otro vaso que contenga la solución amortiguadora y transfiriendo
la unidad de dosificación al vaso que contiene la solución amortiguadora.]
Dejar funcionar el aparato durante 45 minutos o durante el tiempo especificado •en la monografía individual •. Al cabo de
ese período, retirar una alícuota del líquido y analizarla empleando un método de valoración adecuado. •El procedimiento se
especifica en la monografía individual. La prueba puede concluir en un período más corto que el especificado para la Etapa
Amortiguada si el requisito de cantidad mínima disuelta se cumple antes de lo previsto .•

Aparato 3 (Cilindro Oscilante)

FORMAS FARMACÉUTICAS DE LIBERACIÓN INMEDIATA, NO ACEPTADO POR LA FARMACOPEA JAPONESA

Colocar el volumen indicado del Medio de disolución en cada vaso del aparato, ensamblar el aparato, equilibrar el Medio de
disolución a 37 ± 0,5º y retirar el termómetro. Colocar 1 unidad de la forma farmacéutica en cada uno de los seis cilindros osci-
lantes, procurando eliminar las burbujas de aire de la superficie de cada unidad de dosificación y poner en funcionamiento el
aparato inmediatamente, según se especifica •en la monografía individual •. Durante el recorrido ascendente y descendente, los
cilindros oscilantes recorren una distancia total de 9,9-10, 1 cm. Dentro del intervalo de tiempo especificado, o en cada tiempo
especificado, elevar los cilindros oscilantes y retirar una porción de la solución en análisis de una zona equidistante entre la
superficie del Medio de disolución y el fondo de cada vaso. Efectuar el análisis según se indica •en la monografía individual •. Si
fuera necesario, repetir la prueba con otras unidades de forma farmacéutica.
Medio de disolución: Proceder según se indica en Formas Farmacéuticas de Liberación Inmediata en Aparato 7 y Aparato 2.
Tiempo: Proceder según se indica en Formas Farmacéuticas de Liberación Inmediata en Aparato 7 y Aparato 2.
USP 40 Pruebas Físicas/ (711) Disolución 641

FORMAS FARMACÉUTICAS DE LIBERACIÓN PROLONGADA

Proceder según se indica en Formas Farmacéuticas de Liberación Inmediata en Aparato 3.

Medio de disolución: Proceder según se indica en Formas Farmacéuticas de Liberación Prolongada en Aparato 7 y Aparato
2.
Tiempo: Proceder según se indica en Formas Farmacéuticas de Liberación Prolongada en Aparato 7 y Aparato 2.

FORMAS FARMACÉUTICAS DE LIBERACIÓN RETARDADA

Proceder según se indica en Formas Farmacéuticas de Liberación Retardada, Método B en Aparato 7 y Aparato 2 usando una fila
de vasos para los medios de la etapa ácida y la siguiente fila de vasos para los medios de la etapa amortiguada, y usando los
volúmenes de medio especificados (generalmente 300 ml).
Tiempo: Proceder según se indica en Formas Farmacéuticas de Liberación Inmediata en Aparato 7 y Aparato 2.

Aparato 4 (Celda de Flujo)

FORMAS FARMACÉUTICAS DE LIBERACIÓN INMEDIATA

Colocar las perlas de vidrio en la celda especificada •en la monografía •. Colocar 1 unidad de dosificación sobre las perlas o, si
así se especifica •en la monografía,. sobre un soporte de alambre. Ensamblar la tapa del filtro y unir las partes mediante una
abrazadera adecuada. Introducir con la bomba el Medio de disolución entibiado a 37 ± 0,5º a través del extremo inferior de la
celda a fin de obtener la velocidad de flujo especificada •en la monografía individual. y medida con una exactitud del 5%.
Recoger el eluato en fracciones en cada tiempo indicado. Efectuar el análisis según se indica •en la monografía individual •. Re-
petir la prueba con otras unidades de forma farmacéutica.
Medio de disolución: Proceder según se indica en Formas Farmacéuticas de Liberación Inmediata en Aparato 7 y Aparato 2.
Tiempo: Proceder según se indica en Formas Farmacéuticas de Liberación Inmediata en Aparato 7 y Aparato 2.

FORMAS FARMACÉUTICAS DE LIBERACIÓN PROLONGADA

Proceder según se indica en Formas Farmacéuticas de Liberación Inmediata en Aparato 4.

Medio de disolución: Proceder según se indica en Formas Farmacéuticas de Liberación Inmediata en Aparato 4.
Tiempo: Proceder según se indica en Formas Farmacéuticas de Liberación Inmediata en Aparato 4.

FORMAS FARMACÉUTICAS DE LIBERACIÓN RETARDADA

Proceder según se indica en Formas Farmacéuticas de Liberación Retardada en Aparato 7 y Aparato 2 empleando los medios
indicados.
Tiempo-Proceder según se indica en Formas Farmacéuticas de Liberación Retardada en Aparato 7 y Aparato 2.

INTERPRETACIÓN

Formas Farmacéuticas de Liberación Inmediata

A menos que se especifique algo diferente •en la monografía individual,. se cumplen los requisitos si las cantidades de ingre-
diente activo disuelto a partir de las unidades de dosificación analizadas se ajustan a la Tabla de Aceptación 7. Continuar con las
tres etapas de prueba a menos que los resultados se ajusten a 51 o 52 • La cantidad, Q, es la cantidad de ingrediente activo
disuelto •especificada en la monografía individual,. expresada como un porcentaje del contenido declarado de la unidad de
dosificación; los valores de 5%, 15% y 25% en la Tabla de Aceptación 7 son los porcentajes del contenido declarado de forma
que estos valores y Q están expresados en unidades equivalentes.
Tabla de Aceptación 1
Nº de
Unidades Anali-
Etapa zadas Criterios de Aceptación
5, 6 Ninguna unidad es menor que Q + 5%.
52 6 El promedio de 12 unidades (5 7 + 5,) es 2Q, y ninguna unidad es <Q- 15%.
El promedio de 24 unidades (5 7 + 52 +53 ) es 2Q, no más de 2 unidades son <Q - 15%, y ninguna unidad
53 12 es <Q- 25%.
642 (711) Disolución / Pruebas Físicas USP 40

•Muestra Combinada para Formas Farmacéuticas de Liberación Inmediata

A menos que se especifique algo diferente en la monografía individual, se cumple con los requisitos si las cantidades de in-
grediente activo disuelto a partir de la muestra combinada se ajustan a la Tabla de Aceptación para una Muestra Combinada
adjunta. Continuar con las tres etapas de prueba a menos que los resultados se ajusten a 51 o 52• La cantidad, Q, es la cantidad
de ingrediente activo disuelto especificada en la monografía individual, expresada como un porcentaje del contenido declara-
do.
Tabla de Aceptación para una Muestra Combinada
Nº de
Unidades Anall- Criterios de
Etapa zadas Aceptación
s, 6 La cantidad disuelta promedio no es menor que Q + 10%.
S2 6 La cantidad disuelta promedio (5 1 + 57) es ?:Q + 5%.
53 12 La cantidad disuelta promedio (5 1 + 52 + S,) es ?:Q.

Formas Farmacéuticas de Liberación Prolongada

A menos que se especifique algo diferente •en la monografía individual., se cumplen los requisitos si las cantidades de ingre-
diente activo disuelto a partir de las unidades de dosificación analizadas se ajustan a la Tabla de Aceptación 2. Continuar con los
tres niveles de prueba a menos que los resultados se ajusten a L1 o L2 • Los límites de la cantidad de ingrediente activo disuelto
se expresan como porcentajes del contenido declarado. Los límites comprenden cada valor de Q;, que representa la cantidad
disuelta en cada intervalo fracciona! de dosificación especificado. Si se especifica más de un intervalo •en la monografía indivi-
dual., los criterios de aceptación se aplican por separado a cada intervalo.
Tabla de Aceptación 2
Nº de
Unidades Anali-
Nivel zadas Criterios
Ningún valor individual se encuentra fuera de los intervalos especificados y, en el momento final de la
L, 6 prueba, ningún valor individual es menor que la cantidad especificada.
El valor promedio de las 12 unidades (L 1 + L2 ) se encuentra dentro de cada intervalo especificado y no es
menor que la cantidad especificada en el momento final de la prueba; ningún valor representa > del
10%, del contenido declarado, fuera de los intervalos especificados; y ningún valor representa > del
10%, del contenido declarado, por debajo de la cantidad especificada en el momento final de la prue-
L, 6 ba.
El valor promedio de las 24 unidades (L 1 + L2 + L3) se encuentra dentro de los intervalos especificados y
no es menor que la cantidad especificada en el momento final de la prueba; no más de 2 de las 24
unidades presentan más del 10%, del contenido declarado, fuera de los intervalos especificados; no
más de 2 de las 24 unidades presentan > del 10%, del contenido declarado, por debajo de la cantidad
especificada en el momento final de la prueba; y ninguna de las unidades presenta> del 20% del con-
tenido declarado fuera de cada uno de los intervalos especificados ni presenta> del 20% del contenido
L3 12 declarado por debajo de la cantidad especificada en el momento final de la prueba.

Formas Farmacéuticas de Liberación Retardada

NO ACEPTADO POR LA FARMACOPEA JAPONESA

Etapa ácida: A menos que se especifique algo diferente •en la monografía individual., se cumplen los requisitos de esta
parte de la prueba si las cantidades, basadas en el porcentaje de contenido declarado, de ingrediente activo disuelto a partir
de las unidades analizadas, se ajustan a la Tabla de Aceptación 3. Continuar con todos los niveles de prueba a menos que los
resultados de la Etapa ácida y la Etapa amortiguada se ajusten en un nivel previo.
Tabla de Aceptación 3
Nº de
Unidades Anali-
Nivel zadas Criterios
A, 6 Ningún valor individual de la cantidad disuelta excede el 10%.
El promedio de la cantidad disuelta de las 12 unidades (A 1 + A2 ) no es más del 10% y ninguna unidad
Az 6 individual se disuelve > del 25%.
El promedio de la cantidad disuelta de las 24 unidades (A 1 + A2 + A3) no es más del 10% y ninguna
A, 12 unidad individual se disuelve> del 25%.
USP 40 Pruebas Físicas/ (721) Intervalo de Destilación 643

Etapa amortiguada: A menos que se especifique algo diferente •en la monografía individual., se cumplen los requisitos si
las cantidades de ingrediente activo disuelto a partir de las unidades analizadas se ajustan a la Tabla de Aceptación 4. Continuar
con los tres niveles de prueba a menos que los resultados de las dos etapas se ajusten antes de lo previsto. El valor de Q en la
Tabla de Aceptación 4 es el 75% disuelto a menos que se especifique algo diferente •en la monografía individual •. La cantidad,
Q, •especificada en la monografía individual., representa la cantidad total de ingrediente activo disuelto en la Etapas acida y la
Etapa amortiguada, expresada como un porcentaje del contenido declarado. Los valores de 5%, 15% y 25% que aparecen en
la Tabla de Aceptación 4 son los porcentajes del contenido declarado de forma que estos valores y Q estén expresados en los
mismos términos.
Tabla de Aceptación 4
Nº de
Unidades Anali-
Nivel zadas Criterios
81 6 Cada unidad no es menor que Q + 5%.
82 6 El promedio de 12 unidades (8 1 + 8,) es ?:Q y ninguna unidad es <Q- 15%.
El promedio de 24 unidades (8 1 + 82 + 83) es ?:Q, no más de 2 unidades son <Q- 15%, y ninguna uni-
83 12 dad es <Q - 25%.

(721) INTERVALO DE DESTILACIÓN

Para determinar el intervalo de temperaturas dentro del cual se destila un líquido oficial, o el porcentaje de material que se
destila entre dos temperaturas especificadas, emplear el Método 1 o el Método 11 según se indica en la monografía individual.
El límite inferior del intervalo es la temperatura indicada por el termómetro cuando la primera gota del condensado deja la pun-
ta del condensador y el límite superior es el Punto Seco, es decir, la temperatura a la cual la última gota de líquido se evapora
del fondo del matraz de destilación, sin tener en cuenta el líquido que pueda quedar en las paredes del matraz, o la tempera-
tura observada al recogerse la proporción especificada en la monografía individual.
[NOTA-Enfriar todos los líquidos que destilan por debajo de 80º a entre 1Oº y 15º antes de medir la muestra a destilar.]

MÉTODO 1

Aparato

Emplear un aparato similar al especificado para el Método 11, excepto que se debe usar un matraz de destilación que tenga
una capacidad de 50 a 60 mL y que tenga un cuello de 1O a 12 cm de largo y 14 a 16 mm de diámetro interno. La perfora-
ción de la placa aislante superior, si se emplea una, debe ser tal que cuando el matraz se fija en ella, la porción del matraz que
queda por debajo de la superficie superior del material aislante tenga una capacidad de 3 a 4 ml.

Procedimiento

Proceder según se indica en el Método 11, pero colocar en el matraz sólo 25 mL del líquido a analizar.

MÉTODO 11

Aparato

Emplear un aparato que conste de las siguientes partes:

MATRAZ DE DESTILACIÓN

Un matraz de destilación de fondo redondo, de vidrio resistente al calor, de 200 mL de capacidad y con una longitud total
de 17 a 19 cm y un cuello de 20 a 22 mm de diámetro interno. A media distancia del cuello, aproximadamente a 12 cm del
fondo del matraz, tiene conectado un brazo lateral de 1O a 12 cm de largo y 5 mm de diámetro interno, que forma un ángulo
de 70º a 75º con la parte inferior del cuello.
644 (721) Intervalo de Destilación / Pruebas Físicas USP 40

CONDENSADOR

Un condensador recto de vidrio de 55 a 60 cm de largo con una camisa de agua de aproximadamente 40 cm de largo, o un
condensador de otro diseño con una capacidad de condensación equivalente. El extremo inferior del condensador puede ser
curvo para que actúe como tubo de salida, o puede conectarse a un adaptador acodado que cumpla con el mismo propósito.

PLACAS AISLANTES

Dos piezas de placas aislantes cuadradas de 5 a 7 mm de espesor y de 14 a 16 cm de lado, apropiadas para concentrar el
calor en la parte inferior del matraz. Cada placa tiene un orificio en el centro y las dos placas difieren sólo en el diámetro del
orificio, es decir, los diámetros son 4 cm y 1O cm, respectivamente. Cuando se utilizan, las placas se colocan una sobre la otra
en un trípode u otro soporte adecuado, con la placa que tiene el orificio más grande colocada sobre la otra.

RECEPTOR

Una probeta graduada de 100 mL con subdivisiones de 1 ml.

TERMÓMETRO

Para evitar la necesidad de corrección por vástago emergente, se recomienda un termómetro exactamente normalizado, de
inmersión parcial con subdivisiones lo más pequeñas posibles (no más de 0,2º). Los termómetros adecuados están disponibles
como series ASTM E-1 de 37C a 41Cyde102C a 107C (ver Advertencias y Requisitos Generales, 6.80.30. Dispositivos de Medi-
ción de Temperatura). Cuando se coloca en posición, el vástago queda ubicado en el centro del cuello y la parte superior de la
cámara de contracción (o bulbo, si se emplea uno de 37C o 38C) está a la altura del borde inferior de la salida del brazo late-
ral.

FUENTE DE CALOR

Un mechero Bunsen pequeño, o un calentador o manto eléctricos con una capacidad de ajuste comparable a la de un me-
chero Bunsen.

Procedimiento

Ensamblar el aparato y colocar en el matraz 100 mL del líquido a analizar, evitando que penetre líquido por el brazo lateral.
Insertar el termómetro, proteger todo el ensamble de mechero y matraz de las corrientes de aire externas y aplicar calor, regu-
lándolo para que transcurran entre 5 y 1 O minutos hasta que la primera gota del destilado caiga del condensador. Continuar la
destilación a una velocidad de 4 a 5 mL de destilado por minuto, recogiendo el destilado en el receptor. Observar la tempera-
tura cuando la primera gota del destilado caiga del condensador y nuevamente cuando la última gota de líquido se evapora
del fondo del matraz o cuando el porcentaje especificado haya destilado. A menos que se especifique algo diferente en la mo-
nografía individual, aplicar la corrección por vástago emergente cuando sea necesario e informar las temperaturas ajustando la
presión barométrica por la siguiente fórmula:

t = t 0 + [(t0 10-4 + 0,033)(760 - p)]

en donde tes la temperatura de ebullición corregida, en la escala Celsius; t 0 es la temperatura de ebullición medida, en la
escala Celsius; y pes la presión barométrica al momento de la medición, en mm Hg.

(724) LIBERACIÓN DE FÁRMACOS

ALCANCE

Esta prueba se provee para determinar el cumplimiento con los requisitos de liberación o disolución de fármacos cuando se
declara en las monografías individuales para sistemas transdérmicos (STD) y otras formas farmacéuticas. A partir de los tipos de
aparatos aquí descritos, usar el especificado en la monografía individual.
USP 40 Pruebas Físicas/ (724) Liberación de Fármacos 645

NORMAS GENERALES DE LIBERACIÓN DE FÁRMACOS

Aparato 5 (Paleta sobre Disco)

APARATO

Usar la paleta y el vaso del Aparato 2 según se describe en Disolución (711 ), agregando un dispositivo en forma de disco
diseñado para mantener el STD en el fondo del vaso. El dispositivo en forma de disco está diseñado para minimizar todo volu-
men "muerto" entre el disco y el fondo del vaso. El dispositivo en forma de disco mantiene el STD plano y se coloca de tal
manera que la superficie de liberación sea paralela a la parte inferior del aspa de la paleta (ver la Figura 7a, la Figura 7by la
Figura 7e). Se mantiene una distancia de 25 ± 2 mm entre el aspa de la paleta y la superficie del dispositivo en forma de disco
durante la prueba. Se pueden usar otros dispositivos adecuados (ver la Figura 2), siempre que no adsorban o absorban, reac-
cionen o interfieran con la muestra en análisis.

Vaso de disolución

-+------+--Paleta

Dispositivo en forma
de disco

Dispositivo en forma
de disco

Figura 1a. Paleta sobre disco.

(Todas las mediciones se expresan en mm a menos que se indique de otro modo.)
646 (724) Liberación de Fármacos/ Pruebas Físicas USP 40

Tamiz de malla 17
090mm Paleta
/ (Ver <711>)

Vidrio de reloj 090mm

Figura 1b. Paleta sobre disco (malla y vidrio de reloj).

508mm

~ 0,76mm x 45º

-~ ~1

0,76mm x 45º
de perímetro
813mm

Material:
PVDF _

Figura 1c. Broche para sujetar la malla y el vidrio de reloj.

Figura 2. Malla de alambre de sujeción.

USP 40 Pruebas Físicas/ (724) Liberación de Fármacos 647

APTITUD DEL APARATO

Proceder según se indica en Aparato 2 en Disolución (711 ), Aptitud del Aparato, Prueba de Verificación del Desempeño, Aparatos
1 y 2.

MEDIO

Proceder según se indica en Medio de Disolución en Disolución (711 ), Procedimiento, Aparato 1 y Aparato 2, Formas Farmacéuti-
cas de Liberación Inmediata.

PROCEDI M 1ENTO

Colocar el volumen declarado de Medio en el vaso y equilibrar a 32 ± 0,5º.

Aplicar el STD al dispositivo en forma de disco, asegurándose de que la superficie de liberación esté lo más lisa posible y que
el STD esté completamente sujeto al disco con firmeza. El STD con la superficie de liberación hacia arriba puede sujetarse al
disco usando un procedimiento apropiado y validado tal como un adhesivo, una cinta adhesiva de doble cara, una malla o una
membrana. Se debe tener cuidado de evitar la presencia de burbujas de aire entre la membrana, si se usa, y el STD, o la pre-
sencia de arrugas en la superficie del STD. Retirar con cuidado la capa protectora del STD sin dañar la superficie de éste último.
Colocar el dispositivo en forma de disco de forma plana en el fondo del vaso con la superficie de liberación hacia arriba y
paralela borde del aspa de la paleta y de la superficie del Medio. Asegurarse de que la superficie del STD esté libre de burbujas
de aire. El borde inferior de la paleta está a 25 ± 2 mm de la superficie del dispositivo en forma de disco. Se puede cubrir el
vaso durante la prueba para minimizar la evaporación.
Poner en funcionamiento inmediatamente el aparato a la velocidad especificada en la monografía.
En cada intervalo de muestreo, retirar una muestra de una zona intermedia entre la superficie del Medio y la parte superior
del aspa, y a no menos de 1 cm de la pared del vaso.
Realizar el análisis en cada alícuota de muestra según se indica en la monografía individual, corrigiendo por cualquier pérdi-
da de volumen, según sea necesario. Repetir esta prueba con tantos STD adicionales como sean necesarios.

TIEMPO

Los tiempos de muestreo de prueba, al menos tres, se expresan en horas. Las muestras se deben retirar dentro de una tole-
rancia de±15 minutos o ±2% del tiempo indicado, seleccionando la tolerancia que resulte en el intervalo de tiempo más cor-
to.

INTERPRETACIÓN

A menos que se indique de otro modo en la monografía individual, los requisitos se cumplen si las cantidades de ingrediente
activo liberado del sistema se ajustan a la Tabla de Aceptación 1 siguiente. Continuar analizando a lo largo de los tres niveles a
menos que los resultados se ajusten a L1 o L2 •
Tabla de Aceptación 1
Número de Unidades
Nivel Analizadas Criterios
L1 6 Ningún valor individual se encuentra fuera del intervalo especificado.
El valor promedio de las 12 unidades (L1 + L2 ) se encuentra dentro del intervalo especifi-
cado. Ningún valor individual se encuentra fuera del intervalo especificado en más de
L, 6 10% del promedio del intervalo especificado.
El valor promedio de las 24 unidades (L 1 + L2 + L3) se encuentra dentro del intervalo es-
pecificado. No más de 2 de las 24 unidades se encuentran fuera del intervalo especifica-
do en más de 10% del promedio del intervalo especificado; y ninguna de las unidades
se encuentra fuera del intervalo especificado en más de 20% del promedio del intervalo
L, 12 especificado.

Aparato 6 (Cilindro)

APARATO

Usar el vaso según se describe en Disolución (711 ), Aparato, Aparato 1 (Aparato con Canastilla), excepto que se debe reempla-
zar la canastilla y el eje con un elemento mezclador cilíndrico de acero inoxidable con las especificaciones mostradas en la
Figura 3. Este elemento mezclador cilíndrico consta de dos partes, una comprende el eje y el cilindro superior, y la otra es la
extensión del cilindro. Puesto que ambas partes se enumeran en serie, se recomienda mantenerlas pareadas, debido a que el
648 (724) Liberación de Fármacos/ Pruebas Físicas USP 40

ajuste de fricción se realiza de manera individual para cada cilindro, lo que permite un calce muy ajustado. La distancia entre la
parte inferior interna del vaso y el cilindro se mantiene a 25 ± 2 mm durante la prueba.

sobre el perímetro de un
círculo centrado de 2,54 ±
O, 02 cm de diámetro y a un
ángulo de 63,4º ± 0,5º con la
superficie.

Radío máximo
0,300

Tolerancias:
±0,0127
..._4,064± 0,051 -
Terminación: Esta sección del
Todas las superficies adaptador se debe
deben tener 32 micropulgadas usar para sistemas

-¡
en promedio geométrico. grandes.
Desengrasar antes del
ensamblaje final de la varilla
y del cilindro. 9,390
Material:
Acero inoxidable 316L
5,740

~11
--4,45±0,02-

Figura 3. Elemento mezclador cilíndrico.

(Todas las medidas se expresan en cm a menos que se indique de otro modo.)

MEDIO

Ver Medio de Disolución en Disolución (711 ), Procedimiento, Aparato 7 y Aparato 2, Formas Farmacéuticas de Liberación Inmedia-
ta.

PROCEDIMIENTO

Colocar el volumen indicado de Medio en el vaso y equilibrar a 32 ± 0,5º.

Aplicar el STO al cilindro, asegurándose de que la superficie de liberación esté lo más lisa posible y que el STO esté completa-
mente sujeto al cilindro con firmeza. El STO con la superficie de liberación hacia el Medio puede sujetarse al cilindro usando un
procedimiento apropiado y validado tal como un adhesivo, una cinta adhesiva de doble cara, una membrana o una red de
nailon. Se debe tener cuidado de evitar la presencia de burbujas de aire entre la membrana, si se usa, y el STO, o la presencia
de arrugas en la superficie del STO. Retirar con cuidado la capa protectora del STO sin dañar la superficie. Si se requiere refor-
zar más la sujeción del STO al cilindro, se puede usar un alambre de metal inerte o un anillo de polímero.
Colocar el cilindro en el aparato y hacer rotar inmediatamente a la velocidad especificada en la monografía individual. Se
puede cubrir el vaso durante la prueba para minimizar la evaporación.
USP 40 Pruebas Físicas/ (724) Liberación de Fármacos 649

En cada intervalo de tiempo de muestreo, retirar una muestra de una zona intermedia entre la superficie del Medio y la parte
superior del cilindro rotatorio, y a no menos de 1 cm de la pared del vaso.
Realizar el análisis en cada alícuota de muestra según se indica en la monografía individual, corrigiendo por cualquier pérdi-
da de volumen, según sea necesario. Repetir esta prueba con tantos STD adicionales como sean necesarios.

TIEMPO

Los tiempos de muestreo de prueba, al menos tres, se expresan en horas. Las muestras deben retirarse dentro de una tole-
rancia de ±15 minutos o ±2% del tiempo indicado, seleccionando la tolerancia que resulte en el intervalo de tiempo más cor-
to.

INTERPRETACIÓN

A menos que se indique de otro modo en la monografía individual, los requisitos se cumplen si las cantidades de ingrediente
activo liberado del sistema se ajustan a la Tabla de Aceptación 7 anterior. Continuar analizando a lo largo de los tres niveles a
menos que los resultados se ajusten a L1 o L2 •

Aparato 7 (Soporte Oscilante)

APARATO

El ensamblaje consta de (1) un grupo de recipientes para soluciones volumétricamente calibrados o tarados hechos de vidrio
o de otro material inerte adecuado que no deben adsorber o absorber, reaccionar ni interferir con la muestra que se está anali-
zando; (2) un motor y una transmisión que hacen oscilar el sistema en sentido vertical y que, si se desea, trasladan automática-
mente el sistema en sentido horizontal hacia otra hilera de vasos; y (3) un grupo de portamuestras adecuados (ver la Figura 4 y
las Figuras Sa, Sb, Se y Sd).

Radio 0,1143
Diámetro 0,3175 - Presionar para ajustar el cabezal

e (Dibujo típico - el diseño o la forma puede variar)

Las dimensiones están indicadas en centímetros

CABEZAL VARILLA ARGOLLA

Sistemaª A (Diámetro) 8 e Materialb o Materialc (no se muestra)

1,6 cm 2 1,428 0,9525 0,4750 SSNT 30,48 SS/P Parker 2-113-V884-75
2,5 cm 2 1,778 0,9525 0,4750 SSNT 30,48 SS/P Parker 2-016-V884-75
5cm 2 2,6924 0,7620 0,3810 SSNT 8,890 SS/P Parker 2-022-V884-75
7cm 2 3,1750 0,7620 0,3810 SSNT 30,48 SS/P Parker 2-124-V884-75
10cm2 5,0292 0,6350 0,3505 SSNT 31,01 SS/P Parker 2-225-V884-75

a Medidas de sistemas típicos

=
b SSNT acero inoxidable (SS) o TeflÓn virgen (VT)
e SS/P = acero inoxidable (SS) o Plexiglás (P)

Figura 4. Disco oscilante portamuestras.

650 (724) Liberación de Fármacos/ Pruebas Físicas USP 40

Argolla Parker
Placa 1,98 0 usar junta tipo anillo 2-225-V884-75
o
Placa 1,42 0 usar junta tipo anillo 2-218-V884-75

Tubo de acero inoxidable

12" X 3/16" 0

" = diámetro
Figura 5a, Portamuestras de sistemas transdérmicos-disco angular,

Cilindro de Teflón virgen 3 518" X 1 3/8" 0

I
Varilla de acero inoxidable
8" X 1/8" 0
Junta tipo anillo Parker 2-026-V884-75

" = diámetro
Figura 5b. Portamuestras de sistemas transdérmicos-cilindro.

Varilla de acrílico 12" x 1/8" 0

e
/
0 =diámetro

Figura Se. Portatabletas para tabletas orales de liberación prolongada-varilla, puntiaguda para encolado.

Tubo de acero inoxidable

Resorte de acero inoxidable 11" X 1/8" 0

Dimensiones del resorte

de acero inoxidable
A B
1,45 ,580
1,40 ,310
,96 ,330
,60 ,250

0 = diámetro

Figura 5d. Portatabletas para tabletas orales de liberación prolongada-soporte de resorte.

Durante la prueba, los recipientes para soluciones se sumergen parcialmente en un baño de agua adecuado de cualquier
tamaño conveniente que permite mantener la temperatura dentro de los recipientes a 32 ± 0,5º para STO o a 37 ± 0,5º para
otras formas farmacéuticas.
USP 40 Pruebas Físicas/ (724) Liberación de Fármacos 651

Ninguna parte del equipo, incluyendo el entorno en el que éste se coloca, contribuye con movimiento, agitación o vibración
importante más allá de la debida al movimiento oscilante suave y vertical del portamuestras.
Se prefiere un aparato que permita la observación del sistema y del portamuestras durante la prueba.
Usar un portamuestras y recipiente del tamaño especificado en la monografía individual.

MEDIO

Ver Medio de Disolución en Disolución (711 ), Procedimiento, Aparato 7 y Aparato 2, Formas Farmacéuticas de Liberación Inmedia-
ta.

PREPARACIÓN DE LA MUESTRA A (PARA TABLETAS DE BOMBA OSMÓTICA)

Sujetar cada unidad a analizar a un portamuestras adecuado usando un procedimiento apropiado y validado tal como el uso
de un adhesivo para adherir el borde de la tableta al portamuestras (p.ej., Figura Se), al soporte de resorte (Figura 5d), a una
pequeña bolsa de red de nailon o a una membrana.

PREPARACIÓN DE LA MUESTRA B (PARA STD)

Aplicar el STD al portamuestras adecuado, asegurándose de que la superficie de liberación esté lo más lisa posible y que el
STD esté completamente sujeto al portamuestras con firmeza. El STD puede sujetarse al portamuestras con la superficie de
liberación contra el Medio usando un procedimiento apropiado y validado tal como un adhesivo, una cinta adhesiva de doble
cara, una membrana o una red de nailon. Se debe tener cuidado de evitar la presencia de burbujas de aire entre la membrana,
si se usa, y el STD, o la presencia de arrugas en la superficie del STD. Retirar con cuidado la capa protectora del STD sin dañar
la superficie de éste último. Si se requiere reforzar más la sujeción del STD al portamuestras, se puede usar un alambre de me-
tal inerte o un anillo de polímero.

PREPARACIÓN DE LA MUESTRA ( (PARA OTRAS FORMAS FARMACÉUTICAS)

Sujetar cada forma farmacéutica a analizar al portamuestras adecuado.

PROCEDIMIENTO

Colocar el volumen declarado de Medio en los recipientes para soluciones y equilibrar a la temperatura de prueba.
Suspender cada portamuestras preparado en un agitador de oscilación vertical de modo que cada sistema se sumerja conti-
nuamente en Medio durante toda la prueba.
Hacerlos oscilar a una frecuencia de aproximadamente 30 ciclos/minuto con una amplitud de aproximadamente 2 cm, o
conforme se especifique en la monografía individual, durante el tiempo especificado.
En cada intervalo de tiempo de muestreo, retirar los recipientes para solución del baño, enfriar a temperatura ambiente y
agregar suficiente disolvente (es decir, agua, en la mayoría de los casos) para corregir por pérdidas por evaporación.
Realizar el análisis en cada muestra según se indica en la monografía individual. Repetir esta prueba con tantos sistemas
transdérmicos adicionales como sean necesarios.

TIEMPO

Los tiempos de muestreo de prueba, al menos tres, se expresan en horas. Las muestras deben retirarse dentro de una tole-
rancia de±15 minutos o ±2% del tiempo indicado, seleccionando la tolerancia que resulte en el intervalo de tiempo más cor-
to.

INTERPRETACIÓN

A menos que se indique de otro modo en la monografía individual, los requisitos se cumplen si las cantidades de ingrediente
activo liberado del STD se ajustan a la Tabla de Aceptación 7 anterior o a la tabla de aceptación apropiada en Disolución (711)
para las demás formas farmacéuticas. Continuar analizando a lo largo de los tres niveles a menos que los resultados se ajusten
a L1 o L2 •
652 (729) Distribución del Tamaño de Glóbulos/ Pruebas Físicas USP 40

(729) DISTRIBUCIÓN DEL TAMAÑO DE GLÓBULOS EN EMULSIONES

INYECTABLES DE LÍPIDOS

INTRODUCCIÓN

Las emulsiones inyectables para administración intravenosa, que se utilizan en la terapia de nutrición parenteral total (TPN,
por sus siglas en inglés), son emulsiones estériles de aceite de soja en agua utilizadas para proveer un suministro amplio de
ácidos grasos esenciales, linoleico y linolénico, que se dispersan con la ayuda de un agente emulsionante en Agua para Inyec-
ción. Como alternativa, se puede mezclar el aceite de soja con otros aceites adecuados (triglicéridos neutros), como el aceite
de cártamo, triglicéridos de cadena media (MCT, por sus siglas en inglés) derivados de aceites de coco o de semilla de palma,
aceite de oliva o un aceite marino como el de arenque. El tamaño de las gotitas de lípidos es crítico: debido a la filtración
mecánica, los glóbulos de grasa de mayor tamaño (>5 µm) pueden quedar atrapados en los pulmones. Las características
esenciales del tamaño de una emulsión inyectable de lípidos para uso intravenoso incluyen el diámetro medio de las gotitas de
lípidos y el intervalo de los distintos diámetros de gotitas que se distribuyen alrededor del diámetro medio, lo que se expresa
como la desviación estándar. Específicamente, las cantidades de glóbulos de grasa que constituyen la cola de la curva de distri-
bución correspondiente al mayor tamaño de glóbulos son particularmente importantes con respecto a la seguridad de la infu-
sión. Se debe controlar que estas dos regiones de la distribución del tamaño de glóbulos (el tamaño medio de las gotitas y la
cola de la curva de distribución correspondiente al mayor tamaño de gotitas) se mantengan dentro de los límites especifica-
dos.
Para la determinación del diámetro medio de las gotitas de lípidos y la distribución de los tamaños de glóbulos de mayor
diámetro en las emulsiones inyectables de lípidos se utilizan los dos métodos que se describen a continuación. El Método/ y el
Método 11 deben ser validados. Los métodos que se describen a continuación para evaluar la calidad de las emulsiones inyecta-
bles de lípidos se deben realizar en dos etapas.

MÉTODO 1-MÉTODO DE DISPERSIÓN DE LA LUZ

Para la determinación del tamaño medio de las gotitas de las emulsiones inyectables de lípidos, puede usarse una de las dos
técnicas de dispersión de la luz más comunes: (1) dispersión dinámica de la luz (DDL), conocida también como espectroscopía
de correlación fotónica (ECF) o (2) dispersión clásica de la luz, basada en la teoría de dispersión de Mie. La técnica DDL o ECF
se basa en el análisis de las fluctuaciones temporales rápidas en la intensidad de la luz dispersada que se producen debido al
movimiento Browniano aleatorio, o difusión, de cualquier partícula, incluidas las gotitas de lípidos, suspendidas en un líquido.
La intensidad se mide a un ángulo determinado (por lo general 90º) por medio de un detector adecuado (p.ej., un tubo foto-
multiplicador) capaz de medir la intensidad de la luz dispersada, que fluctúa rápidamente, producida por las gotitas en difu-
sión, suspendidas. Generalmente, estos datos de intensidad de luz dispersada se utilizan para calcular la función de autocorre-
lación de intensidad, que es una función de decaimiento exponencial simple en función del tiempo para gotitas de tamaño
uniforme. La distribución de los tamaños de las gotitas se expresa por funciones exponenciales de distintos tiempos de decai-
miento. La función de autocorrelación que generan los datos de intensidad de luz dispersada obtenidos a partir de una emul-
sión dada puede ser "invertida" por medio de un algoritmo adecuado de deconvolución para obtener la distribución aproxi-
mada de coeficientes de difusión ponderados por intensidad. A partir de ésta, se calcula la distribución de gotitas de diámetro
pequeño, mediante la ecuación de Stokes-Einstein y las reglas de la dispersión clásica de la luz (Mie).
Por el contrario, la dispersión clásica de la luz basada en la teoría de Mie analiza la variación espacial, no la temporal, de la
intensidad de la luz dispersada al medir a la última como una función del ángulo de dispersión, típicamente a lo largo de un
gran intervalo de ángulos detectados. Las fluctuaciones temporales en la intensidad de dispersión debidas al movimiento
Browniano se promedian en el tiempo para cada medición angular. Esta variación angular se produce como consecuencia de
la interferencia mutua de las ondas individuales dispersadas que llegan al detector con fases distintas desde puntos diferentes
dentro de una gotita de lípidos dada así como desde otras partículas. La amplitud de la variación angular es significativa toda
vez que el diámetro de la gotita no sea pequeño en comparación con la longitud de onda de la luz láser (típicamente, 635
nm). Las gotitas de un tamaño e índice de refracción determinados producen una curva única de intensidad de dispersión en
función del ángulo de dispersión. La distribución de los tamaños de gotitas origina una dependencia angular final que repre-
senta la superposición o suma de las curvas individuales (distintas) de intensidad en función del ángulo. La dependencia angu-
lar medida de la intensidad de dispersión obtenida a partir de una muestra de emulsión dada puede ser invertida por medio de
un algoritmo adecuado de deconvolución y la teoría de dispersión de Mie para obtener la distribución aproximada del tamaño
de gotitas.
Así, la dispersión de la luz, mediante la dispersión dinámica de la luz (es decir, fluctuaciones temporales debidas a la difusión
de las gotitas) o la dispersión clásica de la luz/teoría de Mie (es decir, intensidad promedio en función del ángulo), puede pro-
porcionar resultados aceptables para el diámetro medio y la desviación estándar de la distribución del tamaño de las gotitas.
Para ilustrar el método usado en el Método /, se describe una técnica de dispersión dinámica de la luz. Para una guía sobre los
USP 40 Pruebas Físicas/ (729) Distribución del Tamaño de Glóbulos 653

instrumentos que utilizan la dispersión clásica de la luz - teoría de Mie, ver Medición del Tamaño de Partícula por Difracción de
Luz (429).

Aparato

Un instrumento DDL/ECF adecuado, con o sin la capacidad de dilución automática de muestra, y controlado por un softwa-
re validado, se utiliza para llevar a cabo la medición con el ángulo de dispersión generalmente ajustado a 90º. Se informan los
resultados ponderados por intensidad (diámetro medio y desviación estándar), siempre que se indique claramente cuáles son
los valores que se proveen y que también se den los valores de los parámetros necesarios para los cálculos requeridos.

Agua

Pasar agua destilada a través de un filtro con un tamaño de poro de 0,2 µm y desgasificar por ultrasonido o usar Agua Estéril
para Inyección almacenada en un envase de vidrio.

Preparación Estándar

Agregar una cantidad adecuada de suspensión concentrada, conteniendo partículas estándar de látex de poliestireno ras-
treables al NIST u otras nanoesferas adecuadas, a un volumen preestablecido de Agua. Mezclar suavemente los líquidos para
obtener una suspensión homogénea. La suspensión diluida tendrá un aspecto levemente turbio. Si el instrumento DDL/ECF
está equipado con un sistema de dilución automático, se puede analizar la muestra concentrada inicial por inyección directa
en el instrumento con una jeringa, produciéndose automáticamente una dilución adicional para optimizar la concentración de
gotitas para el análisis. Alternativamente, la muestra requeriría una dilución manual mayor con Agua (típicamente por un factor
de 1O, por lo menos, sobre la primera dilución) y su instilación posterior en una celda de goteo. Las especificaciones del instru-
mento determinarán el esquema óptimo de dilución que logre la intensidad de dispersión adecuada para el análisis por celda.
Así, se debe optimizar la concentración de látex en la muestra final para el instrumento DDL/ECF utilizado. Esto se deberá lle-
var a cabo separadamente para tres estándares de tamaño distintos de aproximadamente 100 nm, 250 nm y 400 nm (análisis
triplicado por tamaño) y los resultados correspondientes del diámetro medio ponderado por intensidad y la desviación están-
dar deben coincidir con los valores esperados dentro de errores aceptables.

Preparación de Prueba

Agregar un volumen adecuado de muestra de la emulsión inyectable de lípidos a un volumen preestablecido de agua. Mez-
clar suavemente los líquidos para obtener una suspensión homogénea. La suspensión diluida tendrá un aspecto levemente tur-
bio. Si el instrumento DDL/ECF está equipado con un sistema de dilución automático, se puede analizar la muestra concentra-
da inicial por inyección directa en el instrumento con una jeringa. Automáticamente se producirá una dilución adicional de la
muestra para optimizar la concentración de gotitas para el análisis, lo que asegura que no se produzcan artefactos debidos a la
dispersión múltiple o las interacciones entre las gotitas. Alternativamente, la muestra podría requerir una dilución manual ma-
yor con Agua (típicamente por un factor de 1 O, por lo menos, sobre la primera dilución) y su instilación posterior en una celda
"de goteo". Las especificaciones del instrumento determinarán el esquema óptimo de dilución que logre la intensidad de dis-
persión adecuada para el análisis por celda. Así, se debe optimizar la concentración de la emulsión inyectable de lípidos en la
muestra final para el instrumento DDL/ECF utilizado.

Aptitud del Sistema

Usando la Preparación Estándar, medir el diámetro medio de partículas ponderado por intensidad y la desviación estándar
correspondiente. El sistema es apto una vez que la temperatura de la muestra alcanza el equilibrio y los resultados se han esta-
bilizado y se obtienen por triplicado las mediciones del diámetro medio de las gotitas. El coeficiente de variación (CV) no debe
superar el 10% del diámetro medio de las gotitas rastreables al NIST. Un valor mayor de CV indica que las microesferas de
látex no son aptas como estándar porque carecen inherentemente de uniformidad o se han aglomerado a un nivel inacepta-
ble. En este caso, se debe seleccionar y probar otra suspensión látex estándar.

Procedimiento e Interpretación

Si el instrumento DDL/ECF está equipado con un sistema de dilución automático, usar una jeringa desechable para cargar la
Preparación Estándar o la Preparación de Prueba. Si no se utiliza un sistema de dilución automático, transferir la preparación
adecuadamente diluida a una celda y colocarla en el espectrómetro. Dejar que la muestra se equilibre a una temperatura con-
trolada preestablecida cercana a la temperatura ambiente (entre 20º y 25º, como en la definición de la USP que se encuentra
en Requisitos de Envasado y Almacenamiento (659)). Ajustar el ángulo de dispersión del instrumento a 90º y llevar a cabo las
mediciones. En tanto que la bondad del ajuste chi cuadrado (x 2 ) se mantenga aceptablemente bajo (de acuerdo con las espe-
654 (729) Distribución del Tamaño de Glóbulos/ Pruebas Físicas USP 40

cificaciones del instrumento), los resultados para la Preparación de Prueba son aceptables. Los valores excesivos del parámetro
x2 sugieren que la distribución de gotitas no es normal y pueden indicar una emulsión inestable. El diámetro medio de las
gotitas ponderado por intensidad (MDD) para las emulsiones inyectables de lípidos debe ser inferior a 500 nm o 0,5 µm, inde-
pendientemente de la concentración de la fase lípida dispersa.

MÉTODO 11-MEDICIÓN DEL CONTENIDO DE GLÓBULOS GRANDES POR EL MÉTODO DE

OBSTRUCCIÓN O EXTINCIÓN DE LUZ
Para la determinación de la extensión de la cola de la curva de distribución correspondiente al mayor tamaño de gotita (>5
µm) de las emulsiones inyectables de lípidos se usa un método de obstrucción de la luz (LO, por sus siglas en inglés) o extin-
ción de la luz (LE, por sus siglas en inglés) que emplea la técnica de determinación óptica del tamaño de partículas individuales
(glóbulos) (SPOS, por sus siglas en inglés). Durante la aplicación de la técnica LE/SPOS, el pasaje de una gotita a través de una
zona estrecha de detección óptica causa el bloqueo de una porción del haz de luz incidente, lo que provoca la reducción mo-
mentánea de la intensidad de la luz que alcanza al detector de "extinción". Idealmente, la magnitud de esta reducción en la
señal es proporcional al área de sección transversal de la gotita (considerada más pequeña que el espesor de la zona de detec-
ción), es decir, al cuadrado del diámetro de la gotita. Durante la optimización del instrumento LE/SPOS para una muestra de
emulsión determinada, debe probarse una serie de diluciones para lograr uniformidad entre las muestras. El objetivo es la iden-
tificación de un intervalo estándar de diluciones que produzcan datos uniformes y sean las más adecuadas para la formulación
evaluada. Idealmente, cuando se comparan emulsiones distintas, se utiliza el mismo número aproximado de glóbulos en cada
determinación de tamaño y una vez que se alcanza un estándar, se lo incorpora al plan de muestreo de rutina para las pruebas
de validación. Siempre que la concentración de glóbulos de grasa esté por debajo del "límite de coincidencia" del sensor (de-
terminado por la celda de flujo y el diseño óptico), sólo pasará un glóbulo, como máximo, a través de la zona de detección en
un momento determinado, lo que permite que se lo cuente y se mida con exactitud (con menos de 1% de eventos de coinci-
dencia). Es necesario conocer el límite de coincidencia y la velocidad óptima del flujo para el sensor LE/SPOS usado. Además,
es prudente que se realicen las mediciones de diámetro grande a una concentración reducida de la emulsión para que la con-
centración mensurable de gotitas desde un umbral de detección (p.ej., >1,8 µm) hasta un límite superior (p.ej., 50 µm) sólo
sea aproximadamente un tercio del límite nominal de coincidencia para el sensor usado. Las alturas resultantes de los pulsos
individuales se convierten en diámetros de gotitas mediante una curva de calibración estándar construida previamente a partir
de microesferas de poliestireno de tamaño uniforme rastreables al NIST con diámetros conocidos. Para una guía adicional en el
uso de la metodología de obstrucción de la luz, consultar el capítulo general Partículas en Inyectables (788).

Aparato

Para la medición se usa un instrumento de obstrucción de la luz adecuado, con o sin capacidad de dilución automática de la
muestra y controlado por un ordenador personal (PC). Se informan los datos de distribución del tamaño de partículas ponde-
rado por número y volumen, siempre que se indique claramente cuáles son los valores que se proveen y que también se den
los valores de los parámetros necesarios para todos los cálculos requeridos.

Agua

Pasar agua destilada a través de un filtro con un tamaño de poro de 0,2 µm o usar Agua Estéril para Inyección almacenada en
un envase de vidrio.

Preparación Estándar

Agregar una cantidad adecuada de suspensión concentrada, conteniendo partículas estándar de látex de poliestireno ras-
treables al NIST u otras microesferas adecuadas, a un volumen preestablecido de Agua. Mezclar suavemente los líquidos para
obtener una suspensión homogénea. Si el instrumento de obstrucción de la luz está equipado con un sistema de dilución au-
tomático, se puede analizar la muestra concentrada inicial por inyección directa en el instrumento con una jeringa o una línea
de muestreo de Teflón. Luego, se produce automáticamente una dilución adicional de la muestra para optimizar la concentra-
ción de partículas para el análisis. Alternativamente, la muestra requeriría una dilución manual mayor con agua (típicamente
por un factor de 1 O, por lo menos, sobre la primera dilución). La muestra diluida resultante se instila luego en un recipiente
limpio y adecuado, como un recipiente de vidrio estéril Tipo 1, antes de pasarla por el sensor. En cualquiera de los casos, la
concentración final de partículas debe estar por debajo del límite de coincidencia del sensor. Se debe obtener la exactitud de
la determinación de tamaño y recuento del instrumento de obstrucción de la luz mediante dos estándares de tamaño distintos
de aproximadamente 5 µm y 1O µm (análisis triplicado por tamaño). Para los estándares después de la calibración del sistema,
ajustar el umbral de detección del instrumento a 1,8 µm, extendido a un límite superior de 50 µm. Los resultados correspon-
dientes del diámetro medio deben coincidir con los valores esperados, dentro de 10% de la desviación estándar relativa y una
exactitud de tamaño de 90%-110%. Además, el número de recuento de partículas obtenido por mL también debe coincidir
USP 40 Pruebas Físicas/ (730) Espectroquímica de Plasma 655

dentro de ±10% con los valores de concentración certificados en la documentación provista con cada estándar de tamaño
rastreable al NIST.

Preparación de Prueba

Agregar un volumen adecuado de muestra de la emulsión inyectable de lípidos (análisis triplicado por muestra) a un volu-
men preestablecido de Agua. Mezclar suavemente los líquidos para obtener una suspensión homogénea. La emulsión diluida
tendrá un aspecto levemente turbio. Si el instrumento de obstrucción de la luz está equipado con un sistema de dilución auto-
mático, se puede analizar la muestra concentrada inicial por inyección directa en el instrumento con una jeringa o línea de
muestreo de Teflón no reactiva*. Luego, se produce automáticamente una dilución adicional de la muestra para optimizar la
concentración de gotitas/glóbulos para el análisis. Alternativamente, la muestra requeriría una dilución manual mayor con
agua (típicamente por un factor de por lo menos 1O sobre la primera dilución). La muestra diluida resultante se instila en un
recipiente limpio y adecuado, como un recipiente de vidrio estéril Tipo l. En cualquiera de los casos, la concentración final de
gotitas/glóbulos debe estar por debajo del límite de coincidencia del sensor.

Aptitud del Sistema

Realizar antes del procedimiento de prueba, usando la Preparación Estándar de partículas de 5 y de 1O µm rastreables al
NIST. Medir por triplicado el diámetro de partícula ponderado por número y los conteos/mL del estándar. El sistema es ade-
cuado cuando las mediciones por triplicado del diámetro medio de partícula ponderado por número están dentro de 10% del
valor estipulado, tanto en términos de repetibilidad (CV) como de la cercanía al tamaño certificado en la etiqueta del estándar
rastreable al NIST.

Procedimiento e Interpretación

Si el instrumento de obstrucción de la luz está equipado con un sistema de dilución automático, usar una jeringa o línea de
muestreo de Teflón desechable para cargar la Preparación Estándar o la Preparación de Prueba. Si no se utiliza un sistema de
dilución automática, transferir la muestra a un recipiente limpio y adecuado, de gran volumen, como un vaso de vidrio estéril
Tipo 1 conteniendo un volumen adecuado de agua. Dejar que la muestra y el agua se mezclen bien para obtener una suspen-
sión homogénea. Ajustar el umbral de detección del instrumento a 1,8 µm, extendido a un límite superior de 50 µm, y variar
la concentración y/o los tiempos de la recolección de datos de tal manera que haya al menos un factor de dos en la diferencia
del número total de glóbulos que miden >5 µm entre al menos dos corridas de la muestra. En cualquier caso, el número de
glóbulos que miden >5 µm debe ser lo suficientemente grande para representar un número de glóbulos adecuado que sea
estadísticamente representativo de la población de diámetro mayor de la cola de la curva de distribución correspondiente a la
emulsión nativa. Los límites de la fase dispersa para los glóbulos de grasa de diámetro mayor ponderado por volumen, expre-
sados como el porcentaje de grasa en glóbulos mayores de 5 µm (PFAT5) para una emulsión inyectable de lípidos dada, no
deben exceder de 0,05%.

(730) ESPECTROQUÍMICA DE PLASMA

INTRODUCCIÓN
Las técnicas instrumentales basadas en plasma que son útiles en el análisis farmacéutico se clasifican en dos grandes grupos:
a) las técnicas que se basan en plasma inductivamente acoplado y b) las técnicas en las que el plasma se genera en la superfi-
cie de la muestra o cerca de ella. El plasma inductivamente acoplado (ICP, por sus siglas en inglés) es una fuente de excitación
de alta temperatura que desolvata, vaporiza y atomiza muestras aerosolizadas e ioniza los átomos resultantes. Estos iones y
átomos excitados pueden detectarse posteriormente mediante la observación de sus líneas de emisión, un método denomina-
do espectroscopía de emisión óptica de plasma inductivamente acoplado (ICP-OES, por sus siglas en inglés), que también se
conoce como espectroscopía de emisión atómica de plasma inductivamente acoplado (ICP-AES, por sus siglas en inglés), o
los iones excitados o en estado fundamental pueden determinarse mediante una técnica que se denomina espectrometría de
masas de plasma inductivamente acoplado (ICP-MS, por sus siglas en inglés). La ICP-OES y la ICP-MS son técnicas que permi-
ten analizar uno o varios elementos y se usan tanto en análisis secuenciales como para análisis simultáneos, con buena sensibi-
lidad en un amplio intervalo lineal.

• El cloruro de polivinilo (PVC, por sus siglas en inglés) con dietilhexilftalato (DEHP, por sus siglas en inglés) demostró inducir el rompimiento de las emulsiones
inyectables de lípidos (Sistema de Presentación de Informes sobre Problemas con Productos Farmacéuticos. Acceso a Archivo No. 111 73 de la USP, el 15 de mayo,
1991).
656 (730) Espectroquímica de Plasma / Pruebas Físicas USP 40

Para mayor información sobre la teoría y los principios de mediciones, ver el capítulo Espectroquímica de Plasma-Teoría y
Práctica (1730).

CALIFICACIÓN DE ESPECTRÓMETROS DE PLASMA

La calificación de los ICP-OES o de los ICP-MS se puede dividir en tres elementos: calificación de la instalación (IQ, por sus
siglas en inglés), calificación operativa (OQ, por sus siglas en inglés) y calificación del desempeño (PQ, por sus siglas en in-
glés)-ver también el capítulo general Calificación de Instrumentos Analíticos (1058).

Calificación de la Instalación

Los requisitos de calificación de la instalación proveen pruebas de que el hardware y el software se han instalado de manera
apropiada en el lugar deseado, y de que el ambiente en el que se usará el instrumento es adecuado.

Calificación Operativa

El propósito de la calificación operativa es demostrar que el desempeño del instrumento es adecuado. En la calificación ope-
rativa, se caracteriza el desempeño de un instrumento usando estándares con propiedades espectrales conocidas para verificar
que el sistema opera dentro de las especificaciones esperadas. La calificación operativa es una verificación de los parámetros
operativos clave que se lleva a cabo después de la instalación, de reparaciones y/o de mantenimiento. Los proveedores de ins-
trumentos a menudo tienen disponibles muestras y parámetros de pruebas como parte del paquete de calificación de la insta-
lación/calificación operativa.

Calificación del Desempeño

La calificación del desempeño determina si el instrumento es capaz de cumplir con los requisitos del usuario para todos los
parámetros que pueden afectar la calidad de la medición. Dependiendo del uso típico, las especificaciones de calificación del
desempeño pueden ser diferentes a las especificaciones del fabricante. Para métodos validados, se pueden usar pruebas de ca-
lificación del desempeño específicas, también conocidas como pruebas de aptitud del sistema, en lugar de los requisitos de
calificación del desempeño. Se debe volver a valorar una solución usada para trazar la curva estándar inicial de un instrumento
ICP-OES o ICP-MS a modo de verificación a intervalos apropiados prestablecidos durante el análisis de todo el conjunto de
muestras.
Para los análisis ICP-OES de un único elemento, con longitudes de onda analíticas comprendidas entre 200 y 500 nm o con
concentraciones de > 1 µg/mL, el estándar revalorado debe concordar con su valor esperado con una aproximación de ± 10%,
o según lo especificado en una monografía individual. Para los análisis ICP-OES de múltiples elementos, con longitudes de on-
da analíticas de <200 o >500 nm o con concentraciones de <1 µg/mL, el estándar revalorado debe concordar con su valor
teórico con una aproximación de ±20%, o según lo especificado en una monografía individual. Para los análisis ICP-MS de un
único elemento, con masas analíticas exentas de interferencias y con concentraciones de> 1 ng/mL, el estándar revalorado de-
be concordar con su valor esperado con una aproximación de ± 10%, o según lo especificado en una monografía individual.
Para los análisis ICP-MS de múltiples elementos, o con concentraciones de <1 ng/mL, o para análisis de un solo elemento en
los que pudieran presentarse interferencias, el estándar revalorado debe concordar con su valor esperado con una aproxima-
ción de ±20%, o según lo especificado en una monografía individual.
Si la monografía individual proporciona pautas diferentes con respecto al estándar de verificación revalorado para ICP-OES o
ICP-MS, deberán cumplirse los requisitos de la monografía. Los procedimientos específicos, criterios de aceptación e intervalos
de tiempo para la caracterización del desempeño de la ICP-OES o ICP-MS dependen del instrumento y de la aplicación previs-
ta.

PROCEDIMIENTO
Los usuarios deben evaluar y seleccionar el tipo de material de construcción, el tratamiento previo y la limpieza del material
de laboratorio analítico empleado en los análisis ICP-OES e ICP-MS. El material debe ser inerte y, dependiendo de la aplicación
específica, resistente a sustancias cáusticas, ácidos y/o disolventes orgánicos. En algunos análisis, se debe proceder con la dili-
gencia debida para prevenir la adsorción de analitos sobre la superficie de un recipiente; la contaminación de las soluciones
muestra a partir de metales e iones presentes en el envase puede llevar a resultados inexactos. Para el análisis de un elemento
ubicuo, a menudo es necesario usar el grado más puro de reactivo o disolvente disponible. Se debe verificar la presencia de
contaminación elemental en todas las soluciones antes de usarlas en un análisis.
USP 40 Pruebas Físicas/ (730) Espectroquímica de Plasma 657

Solución Estándar

Las soluciones estándar se usan para estandarizar el instrumento en el momento de su uso; estas soluciones deben preparar-
se según se indica en la monografía individual. [NOTA-Se pueden usar soluciones de elementos individuales o de múltiples
elementos disponibles comercialmente, rastreables al NIST o a una organización metrológica nacional, en la preparación de
soluciones estándar.] Las soluciones estándar, especialmente aquellas empleadas en los análisis a nivel de ultratraza, pueden
tener una vida útil limitada. La estabilidad de las soluciones estándar puede variar dependiendo de la concentración, del anali-
to de interés, del tipo de recipiente de almacenamiento y de las condiciones de almacenamiento. Por estas razones, las solucio-
nes estándar con concentraciones <1 O ppm (p/v) no deben conservarse por más de 24 horas, a menos que se demuestre su
estabilidad por la vía experimental.
El método de estándar agregado puede emplearse para la estandarización del instrumento. Este método implica agregar a la
muestra una concentración conocida del elemento analito a no menos de dos niveles de concentración en comparación con
una preparación de la muestra sin el agregado de cantidades conocidas. La respuesta del instrumento se grafica en función de
la concentración del elemento analito agregado y se traza la recta de regresión lineal correspondiente a los datos. El valor ab-
soluto de la intersección x multiplicado por cualquier factor de dilución es la concentración del analito en la muestra; muchos
instrumentos realizarán el cálculo del analito automáticamente. Una vez que el método se ha desarrollado y se emplea de for-
ma rutinaria, el instrumento se puede calibrar con un blanco y un único estándar. Es apropiado emplear la calibración de un
único punto en las pruebas de límite de materiales de producción y productos finales si la metodología se ha validado de for-
ma rigurosa en cuanto a su suficiente especificidad, sensibilidad, linealidad, exactitud, precisión, tolerancia y robustez.

Solución Muestra

Aunque se pueden analizar muestras sólidas o semisólidas, por lo general es necesario preparar las soluciones de las muestras
para análisis según lo indicado en la monografía individual. Las muestras pueden disolverse en cualquier disolvente, incluyendo
disolventes orgánicos o ácidos/bases, que sean compatibles con el sistema instrumental. Las muestras que no son solubles en
un disolvente requieren digestión. Se pueden usar diversas técnicas de digestión para disolver una muestra, las cuales incluyen
digestiones en placa caliente y digestiones asistidas por microondas, con métodos de recipiente abierto o de recipiente cerra-
do. Debe tenerse en cuenta que no se recomienda la digestión en recipientes abiertos en los análisis de metales volátiles; por
ejemplo, selenio y mercurio.

Análisis

El instrumento debe estandarizarse para cuantificación al momento de su uso, siguiendo el procedimiento indicado en la
monografía individual para los parámetros instrumentales. La respuesta de las soluciones estándar que abarcan los extremos de
concentración esperada de un analito en una muestra se determina en función de un blanco apropiado. La respuesta del de-
tector se grafica como una función de la concentración de analito. Al realizar un análisis en o cerca del límite de detección, el
analista no siempre puede usar un estándar que abarque los extremos de concentración. En tal caso, se debe correr por tripli-
cado un estándar preparado en o cerca (con una aproximación de± 10%) del límite de detección, con un criterio de acepta-
ción de ± 10% del valor teórico del estándar en el caso de estándares de elementos individuales, y de ±20% del valor teórico
del estándar en el caso de estándares de elementos múltiples.
Para demostrar la estabilidad de la estandarización inicial del sistema, el analista debe volver a valorar una solución usada
para trazar la curva estándar inicial como un estándar de verificación a intervalos apropiados previamente establecidos durante
el análisis de todo el conjunto de muestras. A menos que se indique de otro modo en la monografía individual, el estándar
revalorado debe cumplir con los mismos criterios de aceptación que los descritos en la sección de calificación del desempeño
detallada anteriormente. Las concentraciones de la muestra se calculan en función de la curva de trabajo que se obtiene grafi-
cando la respuesta del detector en función de la concentración del analito en las soluciones estándar. Muchos instrumentos
realizan este cálculo automáticamente.

VALIDACIÓN Y VERIFICACIÓN

Validación

La validación es necesaria cuando el método de ICP-OES o ICP-MS está destinado para uso como una alternativa al procedi-
miento farmacopeico para el análisis de un artículo oficial. El objetivo de la validación mediante el procedimiento de ICP-OES
o ICP-MS es demostrar que la medición es adecuada para el propósito previsto, incluida la determinación cuantitativa del
componente principal en un fármaco o en un medicamento (valoraciones de Categoría 1), determinación cuantitativa de im-
purezas o límites de prueba (Categoría 11), y pruebas de identificación (Categoría IV). [NOTA-Para definiciones sobre distintas
categorías, ver Validación de Procedimientos Farmacopeicos (1225).] Dependiendo de la categoría de la prueba, la validación del
procedimiento analítico para ICP-OES o ICP-MS requiere un análisis de linealidad, intervalo, exactitud, especificidad, precisión,
658 (730) Espectroquímica de Plasma / Pruebas Físicas USP 40

límite de detección, límite de cuantificación y robustez. Estas características de desempeño analítico se aplican a métodos con
calibración externa y al método de estándar agregado.
El capítulo general (1225) provee definiciones y pautas generales sobre los procedimientos para validación analítica sin indi-
car criterios de validación específicos para cada característica. La intención de las siguientes secciones es proveer al usuario cri-
terios de validación específicos que representan las expectativas mínimas para esta tecnología.

EXACTITUD

Para las valoraciones de Categoría 1o las pruebas de Categoría 11, la exactitud puede determinarse realizando estudios de
recuperación con la matriz apropiada adicionando concentraciones conocidas de los elementos. Asimismo, se considera una
práctica aceptable comparar los resultados obtenidos usando el procedimiento ICP-OES o ICP-MS que se está validando con
los de un procedimiento analítico establecido. En los métodos de estándar agregado, las evaluaciones de exactitud se basan en
la concentración final en la intersección, no en la recuperación calculada a partir de adiciones de estándar individuales.
Criterios de validación: Una recuperación media de 95,0%-105,0% para la valoración, y una recuperación media de
70,0%-150,0% para el análisis de impurezas. Estos criterios aplican en todo el intervalo previsto.

Precisión

REPETIBILIDAD

El procedimiento analítico se evalúa midiendo las concentraciones de seis soluciones muestras preparadas de forma indepen-
diente al 100% de la concentración de prueba de la valoración.
Criterios de validación: La desviación estándar relativa es no más de 5,0% para la valoración del fármaco, no más de 5,0%
para la valoración del medicamento y no más de 20% para el análisis de impurezas.

PRECISIÓN INTERMEDIA

Se debe establecer el efecto de los eventos aleatorios sobre la precisión analítica del procedimiento. Las variables típicas in-
cluyen realizar los análisis en días distintos, usando instrumentos diferentes o que el método sea realizado por dos o más analis-
tas. Como mínimo, cualquier combinación de estos factores que totalice tres experimentos proveerá una estimación de la pre-
cisión intermedia. Por ejemplo, esta combinación puede ser un analista en 3 días diferentes, o un analista usando dos sets de
equipos en dos días diferentes, uno para cada instrumento; o tres analistas podrían trabajar con el mismo equipo.
Criterios de validación: La desviación estándar relativa es no más de 8,0% para la valoración del fármaco, no más de 8,0%
para la valoración del medicamento y no más de 25,0% para el análisis de impurezas.

ESPECIFICIDAD

El procedimiento debe ser capaz de evaluar inequívocamente cada elemento analito en presencia de componentes que se
espera estarán presentes, incluido cualquier componente de la matriz.
Criterios de validación: Se demuestran mediante el cumplimiento del requisito de exactitud.

LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN

El límite de cuantificación (QL, por sus siglas en inglés) se estima calculando la desviación estándar de no menos de 1O de-
terminaciones repetidas de una solución blanco y multiplicando por 1O. Al validar un procedimiento usando el método de es-
tándar agregado, se usa la pendiente de estándares aplicados a una solución del material de prueba. Se pueden usar otros
enfoques adecuados (ver el capítulo (1225)).
Para confirmar la exactitud se debe realizar la medición de una solución de prueba preparada a partir de una matriz de
muestra representativa con cantidades agregadas conocidas a la concentración del límite de cuantificación estimado. Al validar
un procedimiento usando el método de estándar agregado, los criterios de validación se aplican al resultado experimental fi-
nal, no a la recuperación de cantidades agregadas conocidas en cada nivel de adición del estándar.
Criterios de validación: El procedimiento analítico debe ser capaz de determinar el analito con precisión y exactitud a un
nivel equivalente al 50% de la especificación.

LINEALIDAD

Preparar una curva de respuesta entre la concentración de analito y absorbancia a partir de no menos de dos soluciones
estándar y un blanco (para un total de tres puntos de datos), a concentraciones que abarquen la concentración anticipada de
la solución de prueba. Posteriormente, evaluar la curva estándar usando métodos estadísticos apropiados, tales como la regre-
sión de mínimos cuadrados.
USP 40 Pruebas Físicas/ (731) Pérdida por Secado 659

Para experimentos que no producen una relación lineal entre la concentración de analito y la respuesta del ICP-OES o ICP-
MS, se deben aplicar métodos estadísticos apropiados para describir la respuesta analítica.
Criterios de validación: El coeficiente de correlación (R), es no menos de 0,995 para valoraciones de Categoría 1y no menos
de 0,99 para pruebas cuantitativas de Categoría 11.

INTERVALO

El intervalo se refiere al intervalo entre las concentraciones (cantidades) superior e inferior de analito en la muestra (incluyen-
do esas concentraciones) para las que se ha demostrado que el procedimiento analítico tiene un nivel adecuado de precisión,
exactitud y linealidad que se demuestra cumpliendo con los requisitos de precisión, exactitud y linealidad.
Criterios de validación: Para pruebas de Categoría 1, el intervalo de validación para criterios de aceptación centrados en
100,0% es 80,0%-120,0%. Para criterios de aceptación no centrados, el intervalo de validación es 10,0% por debajo del límite
inferior hasta 10,0% por encima del límite superior. Para uniformidad de contenido, el intervalo de validación es 70,0%-
130,0%. Para las pruebas de Categoría 11, el intervalo de validación abarca 70,0%-130,0% de los criterios de aceptación.

ROBUSTEZ

La confiabilidad de la medición analítica se demuestra mediante cambios deliberados en los parámetros experimentales. De-
bido a que ciertos cambios en los parámetros experimentales pueden resultar en problemas potenciales de seguridad o daños
en el equipo, la robustez se demuestra cumpliendo con los requisitos de precisión intermedia establecidos anteriormente.

Verificación

Las reglamentaciones sobre las Buenas Prácticas de Fabricación Vigentes en los EE.UU. [Título 21 del CFR 21 l .194(a)(2)] in-
dican que los usuarios de los procedimientos analíticos, según se indica en el compendio USP-NF, no están obligados a validar
estos procedimientos siempre que se provean en una monografía. En su lugar, los usuarios simplemente deben verificar su ap-
titud en las condiciones reales de uso.
El objetivo de la verificación del procedimiento de ICP-OES o ICP-MS es demostrar que el procedimiento, según lo descrito
en la monografía, debe ser realizado por el usuario con la exactitud, especificidad y precisión adecuadas, usando los instru-
mentos, analistas y matrices de muestra disponibles. De acuerdo con el capítulo Verificación de Procedimientos Farmacopeicos
(1226), si la verificación del procedimiento farmacopeico siguiendo la monografía no es exitosa, el procedimiento podría no
ser adecuado para su uso con el artículo en análisis. Puede ser necesario desarrollar y validar un procedimiento alternativo con-
forme a lo permitido en las Advertencias y Requisitos Generales 6.30.
La verificación de métodos farmacopeicos ICP-OES o ICP-MS debe, como mínimo, incluir la ejecución de los parámetros de
validación sobre especificidad, exactitud, precisión, linealidad y límite de cuantificación, cuando resulte apropiado, según se
indica en Validación.

(731) PÉRDIDA POR SECADO

El procedimiento que se establece en este capítulo determina la cantidad de materia volátil de cualquier tipo que se elimina
en las condiciones especificadas. Para sustancias que parecen contener agua como único constituyente volátil, es apropiado
aplicar el procedimiento que se indica en el capítulo Determinación de Agua (921) y así se especifica en la monografía indivi-
dual.
A menos que se especifique algo diferente en la monografía individual, realizar la determinación en una muestra de prueba
de 1 a 2 g. Mezclar la sustancia a examinar y, si estuviera en forma de partículas grandes, reducir el tamaño de las partículas
aproximadamente a 2 mm, triturando rápidamente la muestra antes de pesarla. Tarar un frasco para pesada adecuado, de po-
ca profundidad, con tapón de vidrio que se haya secado durante aproximadamente 30 minutos bajo las mismas condiciones
que deben emplearse en la determinación y enfriado a temperatura ambiente en un desecador. Colocar la muestra a analizar
en el frasco, volver a colocar el tapón y pesar con exactitud el frasco y el contenido. Distribuir la muestra a analizar tan unifor-
memente como sea posible, agitando suavemente hacia los lados, hasta lograr una profundidad de aproximadamente 5 mm
por lo general, y no más de 1O mm en caso de materiales voluminosos. Colocar el frasco cargado en la cámara de secado,
retirando el tapón y dejándolo también en la cámara. Secar la muestra de prueba a la temperatura y durante el tiempo especi-
ficado en la monografía. [NOTA-La temperatura especificada en la monografía debe considerarse comprendida en el intervalo
de ±2º de la cifra especificada.] Cuando en una monografía se especifica "secar hasta peso constante", el secado deberá conti-
nuarse hasta que dos pesadas consecutivas no difieran en más de 0,50 mg por g de sustancia tomada, realizando la segunda
pesada después de una hora adicional de secado. Al abrir la cámara, cerrar rápidamente el frasco, permitiendo que llegue a
temperatura ambiente en un desecador antes de pesarlo.
660 (731) Pérdida por Secado / Pruebas Físicas USP 40

Si la sustancia se funde a una temperatura inferior a la que se especifica para la determinación de la Pérdida por Secado, man-
tener el frasco y su contenido durante 1 a 2 horas a una temperatura de 5º a 1Oº inferior a la temperatura de fusión y luego
secar a la temperatura especificada.
Si se van a analizar cápsulas, utilizar una porción del contenido mezclado de no menos de 4 cápsulas.
Si se van a analizar tabletas, utilizar el polvo de no menos de 4 tabletas.
En caso de que la monografía individual indique que la pérdida por secado debe determinarse mediante análisis termogravi-
métrico, utilizar una electrobalanza sensible.
En el caso de que la monografía individual indique secado al vacío sobre un desecador, utilizar un desecador al vacío, una
pistola de secado al vacío u otro aparato de secado al vacío adecuado.
En el caso de que se especifique secado en un desecador, debe tenerse especial cuidado para asegurarse de que el desecante
se mantenga siempre completamente eficaz mediante su recambio frecuente.
En caso de que la monografía individual indique secar en un frasco con tapón con perforación capilar 1 al vacío, utilizar un
frasco o tubo con un tapón con un capilar de 225 ± 25 µm de diámetro y mantener la cámara de calentamiento a una presión
de 5 mm de mercurio o menor. Al final del periodo de calentamiento, dejar entrar aire seco a la cámara de calentamiento,
retirar el frasco y con el tapón con perforación capilar todavía en su sitio, permitir que se enfríe a temperatura ambiente en un
desecador antes de pesar.

(733) PÉRDIDA POR INCINERACIÓN

Este procedimiento tiene como objeto determinar el porcentaje del material de prueba que se volatiliza y se elimina en las
condiciones especificadas. El procedimiento, tal como se aplica generalmente, no es destructivo para la sustancia que se anali-
za; sin embargo, la sustancia puede transformarse, por ejemplo, produciendo un anhídrido.
Realizar la prueba sobre material finamente pulverizado y deshacer los grumos, si fuera necesario, con ayuda de un mortero
antes de pesar la muestra. Pesar la muestra a analizar sin aplicar más tratamientos, a menos que se especifique un secado preli-
minar a una temperatura inferior u otro pretratamiento especial en la monografía individual. A menos que se especifique otro
equipo en la monografía individual, efectuar la incineración en una mufla o un horno adecuado que pueda mantener la tem-
peratura dentro de los 25º de variación con respecto a la temperatura requerida para la prueba, y emplear un crisol adecuado,
completo con su tapa, previamente incinerado durante 1 hora a la temperatura especificada para la prueba, enfriado en un
desecador y pesado con exactitud.
A menos que se especifique algo diferente en la monografía individual, transferir al crisol tarado una cantidad pesada con
exactitud, en g, de la sustancia que se va a analizar, aproximadamente igual a la calculada por la fórmula:

1O/L
en donde Les el límite (o el valor de la media de los límites) para la Pérdida por incineración, en porcentaje. Incinerar el crisol
destapado cargado y cubrir a la temperatura (±25º) y durante el periodo de tiempo indicado en la monografía individual. Inci-
nerar durante periodos sucesivos de 1 hora cuando se indique incineración hasta peso constante. Una vez completada cada
incineración, cubrir el crisol y dejar enfriar en un desecador hasta temperatura ambiente antes de pesar.

(735) ESPECTROMETRÍA DE FLUORESCENCIA DE RAYOS X

INTRODUCCIÓN

La espectrometría de fluorescencia de rayos X (XRF, por sus siglas en inglés) es un método instrumental basado en la medi-
ción de fotones de rayos X característicos originados por excitación de electrones de las capas internas atómicas mediante una
fuente primaria de rayos X. El método de XRF se puede usar para análisis cualitativos y cuantitativos de líquidos, polvos y mate-
riales sólidos. Los rayos X producidos por un tubo de rayos X incluyen líneas características que corresponden al material del
ánodo y un continuo conocido como radiación de frenado (bremsstrahlung). Se pueden usar ambos tipos de rayos X para
excitar átomos e inducir así los rayos X. El instrumental para XRF se puede dividir en dos categorías: Fluorescencia de Rayos X
Dispersiva de Longitud de Onda (WDXRF, por sus siglas en inglés) y Fluorescencia de Rayos X Dispersiva de Energía (EDXRF,
por sus siglas en inglés). El factor principal que distingue a estas tecnologías es el método usado para separar el espectro emiti-
do por los átomos en la muestra. La energía de los fotones de rayos X es característica para una transición electrónica dada en

1 Disponible como "antibiotic moisture content flask" de Kimble-Kontes, 1022 Spruce St., Vineland, NJ 08362-1502.
USP 40 Pruebas Físicas/ (735) Espectrometría de Fluorescencia de Rayos X 661

un átomo y es de carácter cualitativo. La intensidad de la radiación emitida indica el número de átomos excitados en la muestra
y constituye el carácter cuantitativo del método.

CALIFICACIÓN DE ESPECTRÓMETROS PARA XRF

Calificación de la Instalación

Ver el capítulo general USP Calificación de Instrumentos Analíticos (1058).

Calificación Operativa

El propósito de la calificación operativa (OQ, por sus siglas en inglés) es verificar que el sistema opere dentro de las toleran-
cias esperadas usando muestras apropiadas con propiedades espectrales conocidas. La calificación operativa es una verificación
de los parámetros críticos de operación y debe realizarse después de llevar a cabo la instalación, reparaciones o mantenimien-
tos importantes que pudiera afectar el desempeño de los instrumentos. Es importante tomar en cuenta que todas las muestras
de calibración deben manejarse con guantes de algodón o nitrilo y deben almacenarse en envases plásticos sellados. Alternati-
vamente, pueden estar integradas en el instrumento.
Las pruebas y especificaciones de calificación operativa en las secciones siguientes representan únicamente ejemplos típicos
(ver las Tablas 7 y 3). Se pueden usar otras pruebas y estándares para establecer tolerancias para estos propósitos. El proveedor
del instrumento a menudo pone a disposición muestras y parámetros de prueba como parte del paquete de calificación de la
instalación.
Tabla 1. Especificaciones de Calificación Operativa para EDXRF
Criterios de
Prueba Procedimiento Aceptación
El espectro debe tener un conteo de al menos 3000 en
los máximos de los picos de Al Ka y Cu Ka. La energía
Adquirir un espectro de energía de una muestra de cali- correspondiente a los picos de Al Ka y Cu Ka no debe
Posición del pico bración de Al-Cu. diferir en más de O, 1% de los valores tabulados.
Calcular la resolución (ancho total a la mitad de su altu-
ra máxima) a la misma energía y a la misma velocidad El valor de resolución no debe cambiar en más de 10%
Resolución del detector de conteo usada para la calificación de la instalación. del valor determinado en la calificación de la instalación.
Medir la velocidad de recuento en las líneas de Al y Cu Cambia <10% con respecto a las mediciones iniciales en
Velocidad de recuento Ka de la muestra de calibración de energía. la calificación de la instalación en cada pico.

Para propósitos de calibración de espectrómetros EDXRF se ha seleccionado una muestra de calibración de energía que con-
siste en un disco de aleación Al-Cu (EN AW-AICu6BiPb; Alloy (Aleación) 2011, ASTM B211 ). Esta aleación por lo general se
encuentra disponible, es resistente a la corrosión y provee intensidades adecuadas tanto para Al Ka como para Cu Ka. Estas
líneas características abarcan las energías típicas usadas para los análisis de XRF. Asimismo, se puede obtener información sufi-
ciente de los espectros registrados en este material para evaluar la resolución del detector. La Tabla 2 proporciona una especifi-
cación más completa sobre la composición de esta muestra de calibración.
Tabla 2. Especificación de la Concentración de los Elementos de la Aleación Al-Cu (el balance remanente es aluminio)
Límites de Concentración
Elemento (en % en peso)
Cu 5-6
Zn 0,3 máximo
Fe 0,7 máximo
Bi 0,2-0,6
Pb 0,2-0,6
Si 0,4 máximo

Cuando el intervalo de energía de las líneas analíticas para las que se usará el espectrómetro incluya energías superiores a
50 keV, se deberá usar tungsteno metálico puro W (99,5% mínimo) en lugar de la aleación Al-Cu. Este metal es estable, está
fácilmente disponible y provee líneas características bien definidas a 8,40 keV (línea L) y 59,3 keV (línea K).
Tabla 3. Especificaciones de Calificación Operativa para WDXRF
Criterios de
Prueba Procedimiento Aceptación
El ángulo correspondiente al pico máximo no debe diferir en
Llevar a cabo de acuerdo con el procedimiento del fabri- más de O, 1O grados 28 del ángulo medido en la calificación
Ángulo del pico cante. Repetir para cada cristal. de la instalación.
662 (735) Espectrometría de Fluorescencia de Rayos X / Pruebas Físicas USP 40

Tabla 3. Especificaciones de Calificación Operativa para WDXRF (Continuación)

Criterios de
Prueba Procedimiento Aceptación
Ancho total a la mitad de su altura máxima a longitudes de
onda especificadas a las mismas condiciones de medición
que al momento de la calificación de la instalación. Repe-
Resolución del detector tir para cada detector disponible. No cambia más de 20%
Medir la velocidad de conteo en la muestra de monitoreo
específica a una longitud de onda especificada a las mis-
mas condiciones de medición que al momento de la cali-
ficación de la instalación. Repetir para cada detector dis- Cambia <10% con respecto a las mediciones iniciales en la
Velocidad de recuento ponible. calificación de la instalación

Usar lnconel 625 (Special Metals Corporation, New Hartford, NY) como una muestra para espectrómetros de WDXRF. Otras
designaciones para esta aleación son UNS N06625, DIN 2.4856, ASTM B443, ASME SB-443 y AMS 5599. Se trata de una alea-
ción basada en níquel que incluye cromo, molibdeno y niobio como los elementos más importantes de la aleación. La Tabla 4
proporciona una especificación más completa sobre la composición.
Tabla 4. Concentraciones Elementales del lnconel 625
Límites de Concentración
Elemento (en% en Peso)
Ni 58,0 mínimo
Cr 20,0-23,0
Fe 5,0 máximo
Mo 8,0-10,0
Nbª 3,15-4,15
ª Éste puede incluir Ta.

Una pieza pulida de lnconel 625 jamás debería requerir trabajo de superficie siempre que se almacene y use apropiadamen-
te.
Todos los detectores usados en la WDXRF secuencial, sin importar si se trata de detectores de flujo proporcional, de gas se-
llado o de centelleo, pueden detectar las características de radiación del níquel. En combinación con la radiación Mo K (y L),
las pruebas relacionadas con la posición del pico y la respuesta del detector de los espectrómetros de WDXRF pueden comple-
tarse fácilmente. La Tabla 5 incluye las longitudes de onda o energías típicas que se usan en el análisis de XRF.
Tabla 5. Energías y Longitudes de Ondaª para Al, Ni, Cu, Mo y W
Al NI Cu Mo w
Transición de la línea Ka 1 K-L 7 , K-L 7 , K-L7 , K-L, K-L3
Energía de Ka 1 ( eV) 1487 7473 8041 17479 59310
Longitud de onda de Ka 1
(Á) 8,340 1,659 1,542 0,709 0,209
Transición de la línea La 1 N/Ab N/A N/A L3-Ms LrMs
Energía de La 1 (eV) N/A N/A N/A 2293,2 8398,2
Longitud de onda de La 1
(Á) N/A N/A N/A 5,4066 1,47632
ª Obtenido de: Deslattes RD, Kessler EG, lndelicato P, et al. X-ray transition energies: new approach to a comprehensive evaluation. (Energías de transición de
rayos X: nuevo enfoque para una evaluación integral) Rev Mod Phys. 2003;75(1 ):35-99. Para Al, Ni y Cu, las energías Ka 1 y Ka 2 de la Tabla V se promediaron
con la ponderación 2:1. La conversión de longitud de onda usa el valor he/E de la página 94. Los valores para Mo y W se toman de la Tabla VI.
b N/A = no aplica.

Calificación del Desempeño

El propósito de la calificación del desempeño (PQ, por sus siglas en inglés) es determinar que el instrumento es capaz de
cumplir con los requisitos del usuario para todas las mediciones críticas que impacten en la calidad.
Dependiendo del uso típico, las especificaciones para la calificación de desempeño pueden ser diferentes de las especifica-
ciones del fabricante. Se pueden usar pruebas de calificación de desempeño específicas para cada método, también conocidas
como pruebas de aptitud del sistema, en lugar de los requisitos de calificación de desempeño para métodos validados.
Los procedimientos específicos, criterios de aceptación e intervalos de tiempo para caracterizar el desempeño de la XRF de-
penden del instrumento y de la aplicación que se va a usar. La demostración de un desempeño estable del instrumento duran-
te periodos prolongados provee cierta garantía de que pueden obtenerse mediciones confiables a partir de los espectros de
muestra, usando experimentos de XRF previamente validados.
USP 40 Pruebas Físicas/ (735) Espectrometría de Fluorescencia de Rayos X 663

PROCEDIMIENTO

Recomendaciones Generales

Los analistas deben verificar la aptitud de todos los reactivos y materiales con respecto a la posibilidad de contaminación
antes de usarlos dependiendo del método usado. El análisis de un elemento ubicuo a menudo requiere el uso del grado más
puro de reactivo o material disponible. Los porta muestras y las ventanas de soporte deben ser apropiadas para el análisis y la
configuración del instrumento. Los analistas deben evaluar la limpieza del equipo usado para preparar muestras para análisis
de XRF a fin de evitar la contaminación cruzada de las muestras.

MUESTRAS

Líquidos: Las muestras líquidas pueden introducirse directamente en el espectrómetro XRF siempre y cuando la solución
conste de una sola fase y su volatilidad sea suficientemente baja. El análisis de muestras líquidas requiere el uso de un porta-
muestras especial para líquidos y de una ventana de soporte disponible comercialmente compuesta por una película de polí-
mero adecuado. Alternativamente, las muestras líquidas pueden transferirse a la superficie de un disco y secarse antes de su
análisis. Por lo general, el experimento se lleva a cabo usando un gas para purga. Se pueden agregar cantidades conocidas de
estándares en solución directamente a la muestra líquida en concentraciones apropiadas para facilitar la exactitud, la precisión
y las pruebas de especificidad según se requiera para la validación del método.
Polvos: Los polvos preparados pueden medirse directamente en un portamuestras para líquidos. Alternativamente, se
pueden comprimir en forma de pellets. Si el polvo tiene propiedades autoaglutinantes deficientes, puede ser necesario un
aglutinante tal como una cera o etilcelulosa.
Asimismo, los polvos pueden prepararse para análisis de XRF fundiendo el material de muestra en un vidrio usando un fun-
dente, por lo general tetraborato de sodio, tetraborato de litio y metaborato de litio. Debido a que las temperaturas requeridas
para fundir el fundente y disolver la muestra son relativamente elevadas (800º-1300º), este procedimiento no es adecuado
para el análisis de elementos volátiles tales como mercurio y arsénico.
Las muestras de polvos se pueden mezclar con cantidades apropiadas de un material estándar de referencia certificado para
mejorar la exactitud, la precisión y las pruebas de especificidad según se requiera para la validación del método. Alternativa-
mente, se pueden agregar cantidades conocidas apropiadas de estándares en solución a las muestras en polvo y posteriormen-
te secarlas, molerlas si fuera necesario y mezclarlas minuciosamente antes del análisis. Las adiciones de estándares se pueden
usar en los casos en que las propiedades físicas o químicas del polvo pueden introducir un sesgo en la respuesta del analito.

Estándares

Se pueden usar materiales de referencia apropiados que sean rastreables al National lnstitute of Standards and Technology
(Instituto Nacional de Normas y Tecnología) o equivalentes en la preparación de estándares de XRF.

Análisis

Para los parámetros instrumentales (si fuera aplicable) seguir el procedimiento de la monografía individual. Debido a las dife-
rencias entre fabricantes con respecto a las configuraciones de los equipos, los analistas pueden usar las condiciones predeter-
minadas sugeridas por el fabricante. Al momento de su uso, el instrumento debe estandarizarse para el uso pretendido. Los
analistas deben usar estándares de calibración que abarquen el intervalo esperado de concentraciones típicas de analito. Al lle-
var a cabo un análisis en o cerca del límite de detección, los analistas no siempre pueden usar un estándar que abarque todo el
intervalo, lo cual es aceptable para prueba de límites. Los analistas deberían usar análisis de regresión de la gráfica estándar
para evaluar la linealidad de la respuesta del detector, mientras que las monografías individuales pueden establecer criterios
para el error residual de la línea de regresión.
Para demostrar la estabilidad de la estandarización inicial del sistema, los analistas deben volver a valorar el estándar de cali-
bración usado en la curva estándar inicial como estándar de verificación a intervalos apropiados durante el análisis de la totali-
dad de un conjunto de muestras. También resulta aceptable el uso de un estándar preparado de manera independiente. A
menos que se indique de otro modo en la monografía individual, el estándar revalorado debe coincidir con su valor esperado
con una aproximación de ±2% para la Valoración o de ±20% para un análisis de impurezas.
Las concentraciones de muestra se calculan en función de la curva de trabajo que se genera al graficar la respuesta del ins-
trumento en función de la concentración del analito en las soluciones estándar.

VALIDACIÓN Y VERIFICACIÓN

Las normativas de las Buenas Prácticas de Fabricación Vigentes [Título 21 del CFR 21 l .194(a)(2)] indican que los usuarios de
los métodos analíticos descritos en la USP-NF no están obligados a validar la exactitud y confiabilidad de dichos métodos, sino
que deben verificar su aptitud en condiciones reales de uso. En este contexto, y de acuerdo con dichas normativas, se requiere
664 (735) Espectrometría de Fluorescencia de Rayos X / Pruebas Físicas USP 40

de validación cuando se usa un procedimiento de XRF para analizar un artículo no oficial y cuando dicho procedimiento se usa
como una alternativa al procedimiento oficial para analizar un artículo oficial (ver las Advertencias Generales 6.30 de la USP-NF).
Por otra parte, la verificación se debe realizar la primera vez que se analiza un artículo oficial usando un procedimiento USP
(para fines informativos únicamente, referirse al capítulo Verificación de Procedimientos Farmacopeicos (1226)).

Validación

El objetivo de la validación de un método de XRF es demostrar que el procedimiento de medición sea adecuado para su
propósito esperado, incluyendo la determinación cuantitativa del componente principal en un fármaco o forma farmacéutica
(valoraciones de Categoría 1), la determinación cuantitativa de impurezas o límites de prueba (Categoría 11) y las pruebas de
identificación (Categoría IV). Dependiendo de la categoría de la prueba (ver la Tabla 2 en el capítulo Validación de Procedimien-
tos Farmacopeicos (1225)), el proceso de validación del método analítico para XRF requiere el análisis de linealidad, intervalo,
exactitud, especificidad, precisión, límite de cuantificación y robustez.
Las características de desempeño que demuestran la aptitud de un método de XRF son similares a las requeridas para cual-
quier procedimiento analítico. El capítulo (1225) trata los principios generales aplicables. Los criterios de aceptación específicos
para cada parámetro de validación deben ser congruentes con el uso pretendido del método. Las muestras para validación
deben ser independientes del conjunto de calibración.

EXACTITUD

Para valoraciones de Categoría 1o pruebas de Categoría 11, los analistas pueden determinar la exactitud realizando estudios
de recuperación mediante el uso de la matriz apropiada que tenga concentraciones conocidas agregadas de elementos. Asi-
mismo, se puede usar un material estándar certificado apropiado provisto por la USP. Además, se considera una práctica acep-
table comparar los resultados de la valoración obtenidos usando el método XRF que se está validando con aquéllos obtenidos
de un método analítico establecido. Cuando los analistas usan el método de estándar agregado, las evaluaciones de exactitud
se basan en la concentración calculada a partir de la intersección de la curva, con el eje de concentración a ordenada cero, no
en la recuperación calculada a partir de las adiciones de estándares individuales.
Criterios de aceptación: Recuperación de 98,0%-102,0% para valoración de fármacos y formas farmacéuticas, recupera-
ción del 70,0%-150,0% para análisis de impurezas. Estos criterios de aceptación deben cumplirse en todo el intervalo valida-
do.

PRECISIÓN

Repetibilidad: Los analistas deben evaluar el método analítico midiendo las concentraciones de seis estándares distintos al
100% de la concentración de prueba de la valoración. Alternativamente, los analistas pueden medir las concentraciones de
tres determinaciones repetidas de tres muestras distintas a diferentes concentraciones. Las tres concentraciones deben ser lo
suficientemente cercanas de modo que la repetibilidad sea constante en todo el intervalo de concentración. En este caso, se
combina la repetibilidad a las tres concentraciones para compararla con los criterios de aceptación.
Criterios de aceptación: La desviación estándar relativa es no más de 1,0% para la valoración de fármacos, no más de 2,0%
para la valoración de formas farmacéuticas y no más de 20,0% para el análisis de impurezas.
Precisión intermedia: Los analistas deben establecer el efecto de eventos aleatorios sobre la precisión analítica del méto-
do. Las variables típicas incluyen realizar el análisis en días distintos, usando diferentes instrumentos, o que dos o más analistas
realicen el método. Como mínimo, cualquier combinación de al menos dos de estos factores para totalizar seis experimentos
proveerá una estimación de la precisión intermedia.
Criterios de aceptación: La desviación estándar relativa es no más de 1,0% para la valoración de fármacos, no más de 3,0%
para la valoración de formas farmacéuticas y no más de 25,0% para el análisis de impurezas.

ESPECIFICIDAD

El procedimiento debe poder determinar de manera inequívoca cada analito elemental en presencia de otros componentes
que se esperan encontrar, incluyendo cualquier componente de la matriz.
Criterios de aceptación: Se demuestra cumpliendo el requisito de Exactitud.

LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN

El límite de cuantificación (LOQ, por sus siglas en inglés) se puede estimar calculando la desviación estándar de no menos de
6 mediciones repetidas de un blanco y multiplicando por 1O. Se pueden usar otros enfoques adecuados (ver (1225)). Para con-
firmar la exactitud, se debe realizar una medición de una muestra de prueba preparada a partir de una matriz de muestra re-
presentativa y a la que se le agregan cantidades conocidas de tal manera que la concentración sea similar a la concentración
de límite de cuantificación.
USP 40 Pruebas Físicas/ (736) Espectrometría de Masas 665

Criterios de aceptación: El procedimiento analítico debe ser capaz de determinar de manera precisa y exacta al analito
en un nivel equivalente al 50% de la especificación.

LINEALIDAD

Los analistas deben demostrar una relación lineal entre la concentración del analito y la respuesta de XRF corregida prepa-
rando no menos de cinco estándares a concentraciones que abarquen la concentración anticipada de la muestra de prueba.
Posteriormente, la curva estándar debe evaluarse usando métodos estadísticos apropiados tales como la regresión de cuadra-
dos mínimos. Se deben determinar el coeficiente de correlación (R), la ordenada al origen y la pendiente de la línea de regre-
sión.
Para experimentos que no tienen una relación lineal entre la concentración de analito y la respuesta de XRF, se deben aplicar
métodos estadísticos apropiados para describir la respuesta analítica.
Criterios de aceptación: Res no menos de 0,995 para valoraciones de Categoría 1y no menos de 0,99 para pruebas
cuantitativas de Categoría 11.

INTERVALO

El intervalo se define como el intervalo entre la concentración superior e inferior (cantidades) de analito en la muestra (inclu-
yendo concentraciones superior e inferior) para el que se ha demostrado que el procedimiento analítico tiene un nivel adecua-
do de precisión, exactitud y linealidad. El intervalo se demuestra cumpliendo con los requisitos de linealidad y exactitud.
Criterios de aceptación: Para criterios de aceptación centrados en 100,0%: 80,0%-120,0%. Para criterios de aceptación
no centrados: 10% por debajo del límite inferior de la especificación hasta 10% por encima del límite superior de la especifica-
ción. Para uniformidad de contenido: 70,0-130,0%. Para la Categoría 11 los requisitos del intervalo son 50,0%-120,0% de los
criterios de aceptación.

ROBUSTEZ

La confiabilidad de una medición analítica se debe demostrar realizando cambios deliberados a los parámetros experimenta-
les. Para la XRF esto puede incluir la medición de la estabilidad del analito en condiciones de almacenamiento especificadas.
Criterios de aceptación: La medición de la respuesta de un estándar o de una muestra después de un cambio en los pa-
rámetros experimentales no debe diferir de la medida obtenida con el mismo estándar usando parámetros establecidos en más
de ±2,0% para una valoración de una forma farmacéutica y no más de ±20,0% para un análisis de impurezas.

Verificación

El objetivo de una verificación de un método XRF es demostrar que el procedimiento descrito en la monografía específica, se
está llevando a cabo con una exactitud, sensibilidad y precisión adecuadas. De acuerdo con el capítulo (1226), si no se consi-
gue verificar el procedimiento farmacopeico de acuerdo con la monografía, el procedimiento puede no ser adecuado para su
uso con el artículo en análisis. Puede ser necesario desarrollar y validar un procedimiento alternativo conforme a lo permitido
en las Advertencias Generales 6.30 de la USP-NF.
Aunque no se requiere la revalidación completa de un método de XRF farmacopeico, la verificación de métodos de XRF far-
macopeicos debe incluir por lo menos la ejecución de los parámetros de validación para especificidad, exactitud, precisión y
límite de cuantificación, cuando resulte apropiado, según se indica en la sección Validación (anterior).

(736) ESPECTROMETRÍA DE MASAS

INTRODUCCIÓN
La espectrometría de masas (MS, por sus siglas en inglés) es una técnica analítica basada en la medición de la relación masa/
carga de especies iónicas relacionadas con el analito que se está investigando. La MS se puede usar para determinar la masa
molecular y la composición elemental de un analito, así como para elucidar en detalle la estructura del analito.
Además de ser reconocida como una poderosa herramienta de elucidación estructural, la MS también se usa ampliamente
para mediciones cuantitativas. Para información adicional, ver el capítulo de información general Aplicaciones de la Espectrome-
tría de Masas (1 736), el cual provee una discusión detallada sobre MS.
El instrumental para MS disponible actualmente ofrece múltiples capacidades para análisis cualitativo y cuantitativo, lo que
resulta en una amplia variedad de enfoques experimentales disponibles para cada necesidad analítica. Debido a la diversidad
666 (736) Espectrometría de Masas / Pruebas Físicas USP 40

de enfoques, este capítulo no presenta procedimientos específicos, sino que provee información sobre el diseño experimental
y sobre la aptitud del sistema para los procedimientos de MS.

ANÁLISIS CUALITATIVO

La MS es una técnica sensible y altamente específica para la identificación de analitos. La identificación o verificación de es-
tructuras (es decir, la comparación contra un estándar auténtico) mediante MS es particularmente potente cuando se usa jun-
to con una técnica de separación tal como cromatografía de gases (GC, por sus siglas en inglés) o cromatografía de líquidos de
alta resolución (HPLC, por sus siglas en inglés). Se puede obtener mayor especificidad en el análisis usando espectrometría de
masas en tándem (MS/MS, por sus siglas en inglés) o espectrometría de masas de alta resolución (HRMS, por sus siglas en
inglés). Además, utilizando HRMS se puede cumplir con requerimientos más estrictos en cuanto a la exactitud de la masa de-
terminada.

Parámetros Experimentales

Se deben definir los siguientes parámetros experimentales de MS para un procedimiento cualitativo (p.ej., identificación).

RESOLUCIÓN DE MASAS

La resolución de masa unitaria es suficiente para la mayoría de las pruebas de identificación. Cuando se requiere mayor reso-
lución, ésta se especifica en el procedimiento y la demostración de la resolución adecuada se incluye en las pruebas de aptitud
del sistema para el procedimiento.

EXACTITUD DE MASAS

Una exactitud o concordancia de masas de ±0,50 unidades de masa para iones con una sola carga con un estándar conoci-
do debería ser suficiente para la mayoría de las aplicaciones. En las pruebas de identificación, una exactitud o concordancia de
masas de ±0,05% con un estándar conocido debería ser suficiente para la identificación de moléculas grandes (mayores de
miz 2000) cuando se utilizan iones con cargas múltiples.
Cuando se requiere una exactitud de masas mayor, la exactitud de masas se especifica en el procedimiento. Posteriormente,
se incluye una demostración de este requerimiento en las pruebas de aptitud del sistema para el procedimiento o como parte
del protocolo establecido para la calificación del desempeño del instrumento (PQ, por sus siglas en inglés) tema que se trata
más adelante en este capítulo.

INTERVALO DE MASAS

El intervalo de masas que se va a barrer también se presenta en el procedimiento. El intervalo de masas debe abarcar todos
los iones usados como parte de la confirmación de la identificación.

Aptitud del Sistema

La aptitud del sistema para el procedimiento de MS debe incluir la demostración del desempeño adecuado para los siguien-
tes atributos experimentales.

RESOLUCIÓN DE MASAS

Se incluye una demostración de la resolución apropiada en las pruebas de aptitud del sistema para un procedimiento. La
prueba de desempeño establecida en el protocolo de calificación del desempeño del instrumento que se realiza diariamente o
previo al procedimiento, puede ser suficiente. Cuando se requieren resoluciones mayores a las de masa unitaria para un proce-
dimiento, la prueba de aptitud del sistema incluye la demostración de una resolución adecuada junto con sus criterios de acep-
tación.

EXACTITUD DE MASAS

Las pruebas de aptitud del sistema del procedimiento incluyen una demostración de la exactitud de masas, o alternativa-
mente, ésta forma parte del protocolo de calificación del desempeño del instrumento. Una exactitud o concordancia de ±0,50
unidades de masa para iones con una sola carga respecto a un estándar conocido debería ser suficiente para la mayoría de las
aplicaciones. Cuando se requiera una mayor exactitud de masas para un procedimiento dado, se deben especificar los criterios
de aceptación apropiados.
USP 40 Pruebas Físicas/ (736) Espectrometría de Masas 667

Instrucciones para la Interpretación

Un experimento de identificación o verificación implica la comparación del compuesto de interés con un estándar auténtico
(p.ej., un Estándar de Referencia USP). Para esta forma de identificación o verificación, el estándar y la muestra se analizan en
condiciones idénticas y deben presentar resultados que estén dentro del error experimental aceptable para el procedimiento.
Las aplicaciones de la MS para propósitos de identificación en una monografía oficial pueden incorporar los datos de los espec-
tros de masa únicamente, o pueden combinar esta información con el tiempo de retención cromatográfico si las necesidades
de identificación de una monografía en particular indican una mayor especificidad.
Además, el procedimiento debe incluir los criterios establecidos para considerar que existe una correpondencia entre el es-
pectro de masas del compuesto y del estándar auténtico. Si el procedimiento representa la única prueba de identificación es-
pectroscópica o si ninguna otra prueba de identificación (p.ej., mapeo de péptidos o análisis de aminoácidos) provee informa-
ción estructural, el espectro del estándar debe tener una alta similitud con el de la muestra y se debe usar para la comparación
un mínimo de tres iones estructuralmente relevantes, de preferencia uno de los cuales sea un ión que represente la masa mole-
cular del analito. Cuando sólo se produzca el ión que representa la molécula intacta, se puede usar la masa exacta o el espec-
tro MS/MS del ión molecular para fortalecer la identificación. En caso de que también se lleven a cabo otras pruebas de identi-
ficación pertinentes desde el punto de vista estructural, la comparación se puede realizar con menos iones, siempre y cuando
uno de ellos represente la masa molecular del analito. Por ejemplo, la prueba de identificación por MS para una proteína pue-
de examinar sólo un ión que represente la masa molecular si se realizan otras pruebas para confirmar la estructura de la proteí-
na.

ANÁLISIS CUANTITATIVO

La sensibilidad y especificidad de la MS también la vuelve una herramienta analítica adecuada para la cuantificación de anali-
tos. La cuantificación es particularmente potente cuando se usa junto con una técnica de separación tal como GC o HPLC. Se
puede obtener mayor especificidad en el análisis usando MS/MS o HRMS.

Parámetros Experimentales

Los siguientes parámetros experimentales deben definirse dentro de un procedimiento cuantitativo de MS (p.ej., identifica-
ción).

RESOLUCIÓN DE MASAS

La resolución de masa unitaria es suficiente para la mayoría de las pruebas cuantitativas. Cuando se requiere una resolución
mayor, ésta se especifica en el procedimiento y se incluye una demostración de la exactitud de masas en las pruebas de apti-
tud del sistema para el procedimiento.

EXACTITUD DE MASAS

Las exactitudes de masas citadas en la sección de análisis cualitativo anterior deberían ser suficientes para la mayoría de las
aplicaciones cuantitativas. Cuando se requiere una exactitud de masas mayor, ésta se especifica en el procedimiento. Se inclu-
ye una demostración de la exactitud de masas en las pruebas de aptitud del sistema para el procedimiento o como parte del
protocolo establecido para la calificación del desempeño del instrumento.

SELECCIÓN DE MASAS

Las masas que se van a monitorear (p.ej., intervalo de masas, masas individuales o transiciones MS/MS) se detallan en el
procedimiento.

Aptitud del Sistema

La aptitud del sistema para el procedimiento de MS debe incluir una demostración del desempeño adecuado para los si-
guientes atributos experimentales, según sea lo apropiado para el procedimiento.

RESOLUCIÓN DE MASAS

Se incluye una demostración de la resolución apropiada para el procedimiento en las pruebas de aptitud del sistema o como
parte del protocolo establecido para la calificación del desempeño del instrumento. Cuando se requieran resoluciones mayores
que la masa unitaria para un procedimiento, la prueba de aptitud del sistema incluye la demostración de la resolución adecua-
da junto con sus criterios de aceptación.
668 (736) Espectrometría de Masas / Pruebas Físicas USP 40

EXACTITUD DE MASAS

Las pruebas de aptitud del sistema del procedimiento incluyen una demostración de la exactitud de masas, o alternativa-
mente ésta forma parte del protocolo de calificación del desempeño del instrumento. Una exactitud o concordancia de ±0,50
unidades de masa para iones con una sola carga de un estándar conocido debería ser suficiente para la mayoría de las aplica-
ciones. Si se requiere una exactitud de masas mayor para un procedimiento dado, se deben especificar los criterios de acepta-
ción apropiados.

PRECISIÓN

La aptitud del sistema incluye una demostración de precisión adecuada. Ver la Tabla 7 para límites máximos de precisión.
Por lo regular, los límites de aptitud del sistema se ajustan a límites más estrictos que los empleados para asegurar la precisión
adecuada para los experimentos de validación. (Ver también la sección sobre Validación y Verificación de Procedimientos Analíti-
cos de Espectrometría de Masas.)

LINEALIDAD

La aptitud del sistema incluye una demostración de la linealidad adecuada. Ver la Tabla 7 para límites de linealidad apropia-
dos. (Ver también la sección sobre Validación y Verificación de Procedimientos Analíticos de Espectrometría de Masas.)

EXACTITUD

En ciertos casos, las muestras de control de calidad (o de verificación) también pueden ser apropiadas para incluirse en el
procedimiento para asegurar la calidad de la medición. Normalmente, estas muestras de control de calidad tienen una con-
centración de analito conocida y se preparan de manera idéntica a las muestras de prueba. En caso de utilizarse, las muestras
de control de calidad (o de verificación) se preparan también como forma de verificación de la exactitud del método en el
momento de su realización. El procedimiento especifica el número u orden del análisis de las muestras de control de calidad (o
de verificación) requeridas. Los criterios de aceptación de los resultados de las muestras de control de calidad (o de verifica-
ción) deben alinearse con los requisitos de la validación según el tipo de aplicación (es decir, Categoría 1o11) como se describe
en la Tabla 7.

LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN

En ciertas aplicaciones (p.ej., pruebas de límites), puede ser necesario incluir una demostración de la capacidad para detec-
tar el analito a un nivel establecido. Para estas aplicaciones, el procedimiento especifica el límite y los criterios de aceptación
(p.ej., relación señal-ruido).

CALIFICACIÓN DE INSTRUMENTOS DE ESPECTROMETRÍA DE MASAS

La calificación de un instrumento de MS se puede dividir en tres elementos: calificación de la instalación (IQ, por sus siglas
en inglés), calificación operativa (OQ, por sus siglas en inglés) y calificación del desempeño (PQ, por sus siglas en inglés). Para
información adicional, ver el capítulo Calificación de Instrumentos Analíticos (1058), que puede ser un recurso útil, aunque no
obligatorio.

Calificación de la Instalación

La calificación de la instalación provee evidencia de que los aparatos y el software se instalan de manera tal que se garantice
el uso seguro y efectivo del instrumento en la ubicación deseada.

Calificación Operativa

En la calificación operativa, se caracteriza el desempeño de un instrumento usando estándares para verificar que el sistema
opera dentro de las especificaciones deseadas. El propósito de la calificación operativa es demostrar que el desempeño del ins-
trumento es adecuado para una aplicación dada. Dado que existe una gran variedad de estrategias para la medición de los
espectros de MS, se recomienda la calificación operativa mediante estándares con propiedades espectrales conocidas. Debido
a la diversidad del instrumental de MS, de las interfases y de los enfoques experimentales, los instrumentos de MS deben califi-
carse en función de las especificaciones deseadas para la aplicación de interés, no sólo respecto a las especificaciones provistas
por el fabricante.
USP 40 Pruebas Físicas / (736) Espectrometría de Masas 669

Calificación del Desempeño

La calificación del desempeño ayuda a determinar la capacidad del instrumento para cumplir con los requisitos del usuario
para todas las mediciones críticas. La documentación sobre calificación del desempeño debe describir lo siguiente:
• la definición de los criterios de desempeño específicos y los procedimientos de prueba detallados, incluyendo muestras de
prueba y parámetros instrumentales;
• los elementos que se medirán para evaluar los criterios y las especificaciones predefinidas;
• el intervalo de prueba, que pueden ser mediciones diarias o en el momento de su utilización;
• el uso de muestras para enmarcar la muestra problema o grupos de muestras; y
• acciones correctivas a implementar si el espectrómetro no cumple con las especificaciones.
La calificación periódica del desempeño debe incluir un subconjunto de las pruebas de calificación operativa para asegurar
que el desempeño del instrumento esté a un nivel en el que produzca datos que sean adecuados para el uso pretendido. De-
pendiendo del uso típico del instrumento, las especificaciones para la calificación del desempeño pueden ser superiores o infe-
riores a las especificaciones de instalación provistas por el fabricante. Se pueden usar pruebas de calificación del desempeño
específicas para el método, también conocidas como pruebas de aptitud del sistema, en lugar de los requisitos de calificación
del desempeño para procedimientos validados.
Debido a la diversidad de las configuraciones instrumentales y a las estrategias experimentales de la MS, podría no estar dis-
ponible una muestra o experimento estándar para todas las evaluaciones de calificación del desempeño. Por ende, a menudo
se necesitan pruebas de calificación del desempeño específicas para el método o pruebas de aptitud del sistema. El diseño ex-
perimental de la calificación del desempeño debe ser lo suficientemente robusto para asegurar el desempeño adecuado del
instrumento para la aplicación pretendida, incluyendo las especificaciones asociadas con la medición. Como mínimo, los expe-
rimentos de calificación del desempeño deben incluir lo siguiente.
• Para aplicaciones cualitativas, el experimento de calificación del desempeño incluye una verificación de la exactitud de
masas obtenida con el instrumento. Una exactitud o concordancia de ±0,50 unidades de masa para iones con una sola
carga respecto a un estándar conocido debería ser suficiente para la mayoría de las aplicaciones.
• Para aplicaciones cuantitativas, el experimento de calificación del desempeño incluye verificaciones de exactitud de masas
y precisión. Una exactitud o concordancia de ±0,50 unidades de masa para iones con una sola carga respecto a un están-
dar conocido debería ser suficiente para la mayoría de las aplicaciones. Los criterios de aceptación para la precisión se
establecen considerando la capacidad del instrumento y del método, y proveen controles suficientes con respecto a las
especificaciones de la medición en cuestión.

Caracterización del Desempeño del Instrumento

Los procedimientos específicos, los criterios de aceptación y los intervalos de tiempo para la caracterización del desempeño
del espectrómetro de masas dependen del instrumento y de las aplicaciones pretendidas. Muchas aplicaciones de MS emplean
experimentos previamente validados que relacionan los espectros de masas con una propiedad química de interés. Típicamen-
te se busca demostrar un desempeño estable del instrumento durante periodos prolongados. Esta práctica provee cierta garan-
tía de que se pueden tomar mediciones confiables de los espectros de muestra usando experimentos de MS previamente vali-
dados.

VALIDACIÓN V VERIFICACIÓN DE PROCEDIMIENTOS ANALÍTICOS DE ESPECTROMETRÍA DE

MASAS
La validación se requiere únicamente cuando un procedimiento de MS es una alternativa al procedimiento oficial para anali-
zar un artículo oficial.
El objetivo de validar un procedimiento de MS es demostrar que la medición es adecuada para su propósito, incluyendo la
determinación cuantitativa del componente principal en un fármaco o en un medicamento (valoraciones de Categoría 1), de-
terminación cuantitativa de impurezas (Categoría 11) y pruebas de identificación (Categoría IV). [NOTA-Para información adi-
cional sobre las diferentes definiciones de categorías, ver el capítulo Validación de Procedimientos Farmacopeicos (1225).] De-
pendiendo de la categoría de la prueba, la validación del procedimiento analítico requiere un análisis de linealidad, intervalo,
exactitud, especificidad, precisión, límite de cuantificación y robustez. Estas características de desempeño analítico se aplican a
métodos con estándar externo y al método de estándar agregado.
El capítulo (1225) provee definiciones y pautas generales sobre la validación de procedimientos analíticos sin indicar criterios
específicos de validación para cada característica. La intención de las siguientes secciones es proveer al usuario criterios especí-
ficos de validación que representen las expectativas mínimas para esta tecnología. Para cada aplicación particular, pueden re-
querirse criterios más estrictos para demostrar la aptitud para el uso pretendido.
670 (736) Espectrometría de Masas / Pruebas Físicas USP 40

Categorías de Medición para Procedimientos Analíticos de Espectrometría de Masas

Las características de desempeño requeridas para la validación de un procedimiento analítico de MS, asumiendo las especifi-
caciones de la USP típicas para la Categoría 1de 98,0%-102,0% para fármacos y 95,0%-105,0% para medicamentos, se listan
en la Tabla 7. Las características reales de desempeño de la validación dependerán de las especificaciones empleadas y deberán
proveer evidencia suficiente de que la capacidad de medición es suficiente para dichas especificaciones. Un protocolo de vali-
dación del procedimiento debe especificar los experimentos de validación y los criterios de validación requeridos. Estos crite-
rios se determinan de acuerdo con el propósito del procedimiento analítico.
Tabla 1. Requisitos para Mediciones Analíticas
Características del
Desempeño Categoría 11
Analítico Categoría 1 Cuantitativa
Se asegura usando un estándar de referencia, cuando resulte posible, y por una ausencia demostrable de interfe-
Especificidad rencia de otros componentes
Linealidad Coeficiente de correlación, (R), no menos de 0,995 Coeficiente de correlación, (R), no menos de 0,99
Para criterios de aceptación centrados en 100,0%:
80,0%-120,0%.
Para criterios de aceptación no centrados: 10,0%
por debajo del límite inferior hasta
10,0% por encima del límite superior.
Para uniformidad de contenido:
Intervalo 70,0%-130,0% 50%-120%
98,0%-102,0% (fármaco)
Exactitud 95,0%-105,0% (medicamento) 80,0%-120,0%
No más de 1,0% (fármaco)
Repetibilidad No más de 2,0% (medicamento) No más de 20,0%
No más de 1,0% (fármaco)
Precisión intermedia No más de 3,0% (medicamento) No más de 25,0%
El procedimiento analítico debe ser capaz de determinar el
analito con precisión y de manera exacta a un nivel equi-
Límite de cuantificación - valente al 50% de la especificación.
La confiabilidad de una medición analítica debe demostrarse mediante cambios deliberados en los parámetros ex-
Robustez peri mentales.

Validación del Procedimiento Analítico

El objetivo de la validación del procedimiento analítico es demostrar que éste es adecuado para su propósito mediante la
realización de experimentos y obteniendo resultados que cumplan con los criterios de aceptación predefinidos. Los procedi-
mientos analíticos de MS pueden incluir pruebas cuantitativas para componentes principales y contenido de impurezas, prue-
bas de límite para la presencia de impurezas, cuantificación de un componente en un producto o formulación o pruebas de
identificación.

PARÁMETROS DE VALIDACIÓN

Las características de desempeño que demuestran la aptitud de un procedimiento analítico son similares a las requeridas pa-
ra cualquier procedimiento analítico. Para información adicional sobre los principios generales aplicables, ver el capítulo
(1225). Los criterios de aceptación específicos para cada parámetro de validación deben ser congruentes con el uso pretendido
del procedimiento analítico.
La Tabla 7 provee las características de desempeño que se requieren como parte de una validación para cada categoría de
procedimientos analíticos.
Especificidad: El propósito de una prueba de especificidad es demostrar que las mediciones de las señales pretendidas del
analito están libres de interferencia de componentes e impurezas en el material de prueba. Se pueden realizar pruebas de es-
pecificidad para comparar los espectros de los componentes y de las impurezas que se conocen a partir de procesos sintéticos,
formulaciones y preparaciones de prueba. La especificidad también debe demostrarse para cualquier material agregado como
parte del procedimiento (p.ej., especificidad frente a estándares internos marcados con isótopos).
Para procedimientos analíticos de identificación por MS (Categorías 1y 11), los experimentos de validación pueden incluir
experimentos de MS multidimensionales a fin de validar las asignaciones correctas de la estructura u origen de los iones.
Linealidad: La concentración de analito y la respuesta del instrumento presentan una relación lineal. Ésta se demuestra
midiendo las respuestas del analito a partir de no menos de cinco soluciones estándar a concentraciones que abarquen el in-
tervalo de concentración anticipado de los analitos en la solución de prueba. Para la Categoría 1, las soluciones estándar pue-
den prepararse a partir de materiales de referencia en disolventes apropiados. Para la Categoría 11 (procedimientos analíticos de
MS que se usan para cuantificar impurezas), las muestras para demostrar linealidad se preparan fortificando muestras de prue-
USP 40 Pruebas Físicas/ (736) Espectrometría de Masas 671

ba (que contengan bajas concentraciones de analito) con cantidades conocidas de analito, o fortificando muestras de la matriz
a concentraciones en el rango esperado. Posteriormente, se construye la curva de calibración usando procedimientos analíticos
estadísticos apropiados tales como regresión de cuadrados mínimos. Luego, se determinan el coeficiente de correlación (R), la
ordenada al origen y, la pendiente de la línea de regresión y el valor cuadrático medio de los residuos. Los valores absolutos
determinados para estos factores son apropiados para el procedimiento que se está validando.
Intervalo: El intervalo entre las concentraciones alta y baja de analito está dado por el procedimiento analítico de MS
cuantitativo. Éste por lo regular se basa en las especificaciones del artículo de prueba de la monografía de la USP. Se trata del
intervalo dentro del cual el procedimiento analítico puede demostrar un grado aceptable de linealidad, exactitud y precisión, y
se puede obtener a partir de una evaluación de dicho procedimiento analítico.
Los intervalos recomendados para los diversos procedimientos analíticos de MS son los siguientes.
• Para la Categoría !-valoración de un fármaco (o producto terminado): 80%-120% de la concentración de prueba;
• Para la Categoría !-uniformidad de contenido: un mínimo de 70%-130% de la concentración de prueba;
• Para la Categoría 11-determinación de una impureza: 50%-120% de los criterios de aceptación;
Exactitud: La exactitud de un procedimiento analítico de MS cuantitativo se determina para todo el intervalo analítico re-
querido. Por lo regular, los niveles de concentraciones se evalúan usando preparaciones por triplicado en cada nivel.
Preparación de muestras para exactitud: Para valoraciones de fármacos (Categoría 1), la exactitud se determina analizando
un estándar de referencia de pureza conocida. Para valoraciones de medicamentos (Categoría 1), se debe usar una muestra
compuesta de un estándar de referencia u otros componentes en un producto farmacéutico terminado para la validación del
procedimiento analítico. Los resultados de la valoración se comparan con el valor teórico del estándar de referencia para esti-
mar errores o recuperación porcentual. Para la cuantificación de impurezas (Categoría 11), la exactitud del procedimiento analí-
tico se puede determinar realizando estudios con fármacos o productos fortificados con cantidades conocidas del analito en
estudio.
Los resultados de la valoración obtenidos del procedimiento analítico que se está validando pueden compararse con los de
un procedimiento analítico alternativo establecido.
Precisión:
Repetibilidad: El procedimiento analítico se evalúa midiendo las concentraciones de tres determinaciones repetidas de solu-
ciones estándar en tres concentraciones distintas que abarcan el intervalo analítico. Como alternativa, se pueden medir las
concentraciones de seis soluciones estándar distintas al 100% de la concentración de prueba. Posteriormente, se evalúa la des-
viación estándar relativa a partir de las mediciones de las determinaciones repetidas para determinar si las soluciones cumplen
con los criterios de aceptación.
Precisión intermedia: Se debe establecer el efecto de eventos aleatorios sobre la precisión analítica del procedimiento analí-
tico. Las variables típicas incluyen realizar el análisis en días distintos, usando diferentes instrumentos que sean adecuados con-
forme a lo especificado en el procedimiento analítico, o siendo dos o más los analistas que lleven a cabo el procedimiento
analítico.
Límite de cuantificación: El límite de cuantificación se valida midiendo seis determinaciones repetidas de muestras de
prueba con cantidades agregadas conocidas de analito al 50% de la especificación.
A partir de estas determinaciones repetidas, se pueden determinar la exactitud y la precisión. Los ejemplos de especificacio-
nes para determinaciones cuantitativas de Categoría 11 consisten en que la concentración medida esté dentro del 70%-130%
de la concentración de las cantidades agregadas conocidas y la desviación estándar relativa sea no más de 15%.
Robustez: La confiabilidad de una medición analítica se demuestra mediante cambios deliberados en los parámetros ex-
perimentales críticos. Estos pueden incluir la medición de la estabilidad del analito en condiciones de almacenamiento, croma-
tográficas y de ionización específicas.

Verificación del Procedimiento Analítico

La Buenas Prácticas de Fabricación Vigentes de los EE.UU. [Título 21 del CFR 211.194(a)(2)] indican que los usuarios de los
procedimientos analíticos descritos en los compendios USP-NF no necesitan validar los procedimientos que se provean en una
monografía. En su lugar, simplemente deben verificar la aptitud de los procedimientos en condiciones reales de uso.
El objetivo de una verificación de un procedimiento de MS es demostrar que el procedimiento tal como se especifica en una
monografía específica puede ser realizado por el usuario con una exactitud, especificidad y precisión adecuadas usando los
instrumentos, analistas y matrices de muestra disponibles. De acuerdo con el capítulo de información general Validación de
Procedimientos Farmacopeicos (1226), si la verificación del procedimiento farmacopeico siguiendo la monografía no es exitosa,
el procedimiento puede no ser adecuado para su uso con el artículo en análisis. Puede ser necesario desarrollar y validar un
procedimiento alternativo conforme a lo permitido en las Advertencias y Requisitos Generales 6.30.
La verificación de un procedimiento farmacopeico de MS incluye como mínimo la ejecución de los parámetros de validación
para especificidad, exactitud, precisión y límite de cuantificación, cuando resulte apropiado, conforme lo indicado en la sec-
ción Validación y Verificación de Procedimientos Analíticos de Espectrometría de Masas del presente capítulo.
672 (741) Intervalo o Temperatura de Fusión/ Pruebas Físicas USP 40

(741) INTERVALO O TEMPERATURA DE FUSIÓN

Para fines Farmacopeicos, el intervalo de fusión, la temperatura de fusión o el punto de fusión se definen como los puntos
de temperatura entre los cuales o el punto en el que se detecta la primera fase líquida detectable hasta la temperatura en la
cual no hay fase sólida aparente, excepto para las Clases 11y111, según se aclara más adelante. Una transición de fusión puede
ser instantánea para un material altamente puro, pero por lo general se observa un intervalo desde el comienzo hasta el final
del proceso. Los factores que influyen en esta transición incluyen el tamaño de la muestra, el tamaño de las partículas, la efica-
cia de la difusión del calor y la velocidad de calentamiento, entre otras variables, que se controlan a través de instrucciones del
procedimiento. Se deben aplicar las siguientes condiciones para lograr uniformidad y repetibilidad durante las determinaciones
del punto de fusión. Usar material secado, que ha sido reducido a polvo cuidadosamente e introducido en un tubo capilar
hasta una altura nominal de 3 mm, y realizar la determinación del punto de fusión a una velocidad de calentamiento de 1º /
min. En algunos artículos, el proceso de fusión va acompañado por descomposición simultánea, la cual se evidencia visualmen-
te como un efecto secundario como oscurecimiento del material, carbonización, burbujeo u otro incidente. El impacto visual
de esta reacción secundaria con frecuencia oscurece el final del proceso de fusión, por lo cual puede ser imposible determinar-
lo con exactitud. En esas circunstancias, sólo el comienzo de la fusión se puede establecer con exactitud y se debe informar
como la temperatura de fusión. La exactitud del aparato usado según se describe a continuación debe verificarse a intervalos
adecuados mediante el uso de uno o más de los Estándares de Referencia de Punto de Fusión USP disponibles, preferentemen-
te aquéllos que fundan a temperaturas lo más cercanas posible a las temperaturas de fusión de los compuestos en análisis (ver
Estándares de Referencia USP (11 )). Los Estándares de Referencia de Punto de Fusión USP están destinados para verificar la exac-
titud del dispositivo y no son adecuados para la calibración.
A continuación se describen ocho procedimientos para la determinación del intervalo o temperatura de fusión, los cuales
varían según la naturaleza de la sustancia. Cuando no se designa ninguna clase en la monografía, emplear el procedimiento
para la Clase la para sustancias cristalinas o amorfas y el procedimiento para la Clase 11 para sustancias cerosas.
El procedimiento conocido como determinación del punto de fusión de mezcla, en el cual el intervalo o temperatura de
fusión de un sólido en análisis se compara con el de una mezcla íntima de partes iguales del sólido y de una muestra auténtica
del mismo, p.ej., el Estándar de Referencia USP correspondiente, si estuviera disponible, puede emplearse como una prueba de
identificación confirmatoria. La coincidencia de las observaciones del original y de la mezcla constituye una evidencia confiable
de identidad química.

APARATOS
Se pueden usar aparatos con cámaras u otro equipo computarizado que proporcionen ventajas en cuanto a exactitud, sensi-
bilidad o precisión siempre que hayan sido debidamente calificados.

Aparato 1

Un ejemplo de Aparato I adecuado para la determinación del intervalo de fusión consiste en un recipiente de vidrio para un
baño de líquido transparente, un dispositivo mezclador apropiado, un termómetro exacto y una fuente controlada de calor. El
líquido del baño se selecciona de acuerdo con la temperatura requerida pero, por lo general, se utiliza parafina líquida liviana y
ciertas siliconas líquidas que se adaptan bien a intervalos más altos de temperatura. El líquido del baño tiene la suficiente pro-
fundidad para permitir la inmersión del termómetro a la profundidad especificada de manera que el bulbo quede aproximada-
mente a 2 cm del fondo del baño. El calor puede ser suministrado por una llama abierta o eléctricamente. El tubo capilar tiene
aproximadamente 1O cm de largo y 0,8-1,2 mm de diámetro interno, con paredes de 0,2-0,3 mm de espesor.

Aparato 11

Se puede emplear un instrumento en los procedimientos para las Clases 1, la y lb. Un ejemplo de Aparato 11 adecuado para la
determinación del intervalo de fusión consiste en un bloque de metal que puede calentarse a velocidad controlada, con su
temperatura monitoreada mediante un sensor. El bloque permite alojar el tubo capilar que contiene la sustancia de prueba y
controlar el proceso de fusión, normalmente por medio de un haz de luz y un detector. Se puede procesar la señal del detec-
tor a través de una microcomputadora para determinar y mostrar el punto o intervalo de fusión, o bien la señal del detector se
puede graficar para permitir el cálculo visual del punto o intervalo de fusión.

PROCEDIMIENTOS

Procedimiento para la Clase 1, Aparato 1

Reducir la sustancia en análisis a un polvo muy fino y, a menos que se indique algo diferente, deshidratar la sustancia secán-
dola a la temperatura especificada en la monografía correspondiente cuando contiene agua de hidratación. Si la sustancia no
USP 40 Pruebas Físicas/ (741) Intervalo o Temperatura de Fusión 673

contiene agua de hidratación, secarla sobre un desecante apropiado durante no menos de 16 horas (o en las condiciones indi-
cadas en Pérdida por Secado (731 ), si fuera apropiado).
Cargar un tubo capilar de vidrio con un extremo cerrado con suficiente polvo seco para que forme una columna en el fondo
del tubo que tenga 3 mm de altura al compactarla tanto como sea posible golpeteando suavemente sobre una superficie sóli-
da. El fabricante del instrumento puede especificar variaciones en el tamaño de las muestras en función del diseño del mismo.
Calentar el baño hasta que la temperatura esté aproximadamente a 1Oº por debajo del punto de fusión esperado. Retirar el
termómetro y acoplar rápidamente el tubo capilar al termómetro mojando ambos con una gota del líquido del baño o de
alguna otra manera y ajustar su altura para que el material en el capilar quede al nivel del bulbo del termómetro. Colocar el
termómetro nuevamente en el baño y continuar el calentamiento, mezclando constantemente, de manera que la temperatura
ascienda a una velocidad de aproximadamente 3º/min. Cuando la temperatura esté aproximadamente a 3º por debajo del
límite inferior del intervalo de fusión esperado, reducir el calentamiento para que la temperatura ascienda a una velocidad de
aproximadamente 1º/min. Continuar el calentamiento hasta que se complete la fusión.
La temperatura a la cual la columna de la sustancia en análisis se colapsa claramente contra las paredes del tubo en cualquier
punto indica el comienzo de la fusión y la temperatura a la cual la sustancia de prueba se torna completamente líquida corres-
ponde al final de la fusión o punto de fusión. Las dos temperaturas caen dentro de los límites del intervalo de fusión. Si la
fusión ocurre con descomposición, la temperatura de fusión correspondiente al comienzo de la fusión está dentro del intervalo
especificado.

Procedimiento para la Clase la, Aparato 1

Preparar la sustancia de prueba y cargar el capilar según se indica en Procedimiento para la Clase 1, Aparato l. Calentar el
baño hasta que la temperatura esté aproximadamente a 1Oº por debajo del punto de fusión esperado y aumente a una veloci-
dad de aproximadamente 1º/min. Insertar el capilar según se indica en Procedimiento para Clase 1, Aparato I cuando la tempe-
ratura esté aproximadamente a 5º por debajo del límite inferior del intervalo de fusión esperado y continuar el calentamiento
hasta completar la fusión. Registrar el intervalo de fusión según se indica en Procedimiento para la Clase 1, Aparato l.

Procedimiento para la Clase lb, Aparato 1

Colocar la sustancia de prueba en un recipiente cerrado y enfriarla a una temperatura de 1Oº o menor, durante al menos 2
horas. Sin reducir a polvo previamente, cargar el material enfriado en el tubo capilar según se indica en Procedimiento para la
Clase 1, Aparato l. Luego, colocar inmediatamente el tubo capilar cargado en un desecador al vacío y secar a una presión que
no exceda de 20 mm de mercurio durante 3 horas. Inmediatamente después de retirar del desecador, sellar a la llama el extre-
mo abierto del tubo y, tan pronto como sea practicable, proceder con la determinación del intervalo de fusión según se indica
a continuación. Calentar el baño hasta que la temperatura esté aproximadamente a 1Oº por debajo del intervalo de fusión
esperado. Luego, introducir el tubo cargado y calentar a una velocidad de ascenso de aproximadamente 1º/min hasta comple-
tar la fusión. Registrar el intervalo de fusión según se indica en Procedimiento para la Clase 1, Aparato l.
Si el tamaño de partícula del material es demasiado grande para el tubo capilar, enfriar previamente la sustancia de prueba
según se indicó anteriormente. Luego, aplicando la menor presión posible, triturar cuidadosamente las partículas hasta un ta-
maño adecuado para que entren en el tubo capilar y cargar de inmediato el tubo.

Procedimiento para la Clase 1, Aparato 11

Preparar la sustancia en análisis y cargar el tubo capilar según se indica en Procedimiento para la Clase 1, Aparato l. Operar el
aparato según las indicaciones del fabricante. Calentar el bloque hasta que la temperatura esté aproximadamente a 1Oº por
debajo del punto de fusión esperado. Insertar el tubo capilar en el bloque de calentamiento y continuar el calentamiento a una
velocidad de ascenso de temperatura de aproximadamente 1º/min hasta completar la fusión.
La temperatura a la cual la señal del detector se desvía por primera vez de su valor inicial indica el comienzo de la fusión y la
temperatura a la cual la señal del detector alcanza su valor definitivo corresponde al final de la fusión o punto de fusión. Las
dos temperaturas caen dentro de los límites del intervalo de fusión. Si la fusión ocurre con descomposición, la temperatura de
fusión correspondiente al comienzo de la fusión está dentro del intervalo especificado.

Procedimiento para la Clase la, Aparato 11

Preparar la sustancia de prueba y cargar el tubo capilar según se indica en Procedimiento para la Clase 1, Aparato l. Operar el
aparato según las indicaciones del fabricante. Calentar el bloque hasta que la temperatura esté aproximadamente a 1Oº por
debajo del punto de fusión esperado y aumente a una velocidad de aproximadamente 1º/min. Insertar el tubo capilar según se
indica en Procedimiento para la Clase 1, Aparato I cuando la temperatura esté aproximadamente a 5º por debajo del límite infe-
rior del intervalo de fusión esperado y continuar calentando hasta completar la fusión. Registrar el intervalo de fusión según se
indica en Procedimiento para la Clase 1, Aparato l. Si la fusión ocurre con descomposición, la temperatura de fusión correspon-
diente al comienzo de la fusión está dentro del intervalo especificado.
674 (741) Intervalo o Temperatura de Fusión / Pruebas Físicas USP 40

Procedimiento para la Clase lb, Aparato 11

Colocar la sustancia de prueba en un recipiente cerrado y enfriarla a una temperatura de 1Oº, o menor, durante al menos 2
horas. Sin reducir a polvo previamente, cargar el material enfriado en el tubo capilar según se indica en Procedimiento para Ja
Clase /, Aparato l. Luego, colocar inmediatamente el tubo capilar cargado en un desecador al vacío y secar a una presión que
no exceda de 20 mm de mercurio durante 3 horas. Inmediatamente después de retirar del desecador, sellar a la llama el extre-
mo abierto del tubo, y tan pronto como sea practicable, proceder con la determinación del intervalo de fusión según se indica
a continuación. Operar el aparato según las indicaciones del fabricante. Calentar el bloque hasta que la temperatura esté apro-
ximadamente a 1Oº por debajo del intervalo de fusión esperado. Luego, introducir el tubo cargado y calentar a una velocidad
de ascenso de aproximadamente 1º /min hasta completar la fusión. Registrar el intervalo de fusión según se indica en Procedi-
miento para la Clase /, Aparato /.
Si el tamaño de partícula del material es demasiado grande para el tubo capilar, enfriar previamente la sustancia de prueba
según se indicó anteriormente. Luego, aplicando la menor presión posible, triturar cuidadosamente las partículas hasta un ta-
maño adecuado para que entren en el tubo capilar y cargar de inmediato el tubo.

Procedimiento para la Clase 11

Fundir cuidadosamente el material que se desea probar a la menor temperatura posible y colocarlo en un tubo capilar con
ambos extremos abiertos, a una profundidad de aproximadamente 1O mm. Enfriar el tubo cargado a 1Oº o menos durante 24
horas, o mantenerlo en contacto con hielo durante no menos de 2 horas. Luego unir el tubo capilar al termómetro por medios
adecuados, ajustarlo en un baño de agua de manera que el borde superior del material quede 1O mm por debajo del nivel del
agua y calentar según se indica en Procedimiento para la Clase 1, Aparato I excepto que se debe regular la velocidad de ascenso
de temperatura a razón de aproximadamente 1,0º/min, dentro de los 5º de la temperatura de fusión esperada. La temperatura
a la cual el material comienza a subir en el tubo capilar es la temperatura de fusión.

Procedimiento para la Clase 111

Fundir lentamente una cantidad de la sustancia de prueba, mientras se mezcla, hasta que alcance una temperatura de 90º-
92º. Retirar la fuente del calor y dejar que la sustancia fundida se enfríe a una temperatura de 8º-1 Oº por encima del punto de
fusión esperado. Enfriar el bulbo de un termómetro adecuado a 5º, secarlo y mientras todavía esté frío colocarlo en la sustancia
fundida hasta que quede sumergida aproximadamente la mitad inferior del bulbo. Retirarlo de inmediato y mantenerlo en po-
sición vertical lejos del calor hasta que se opaque la superficie de la cera. Luego, sumergirlo durante 5 minutos en un baño de
agua con una temperatura que no exceda de 16º.
Fijar el termómetro firmemente a un tubo de ensayo de manera que el punto inferior quede 15 mm por encima del fondo
del tubo de ensayo. Suspender el tubo de ensayo en un baño de agua ajustado a aproximadamente 16º y aumentar la tempe-
ratura del baño a una velocidad de aproximadamente 2º/min hasta 30º. Luego, cambiar a una velocidad de aproximadamente
1º/min y observar la temperatura a la cual se desprende del termómetro la primera gota de sustancia fundida. Repetir la deter-
minación dos veces con una porción recién fundida de la sustancia de prueba. Si la variación de las tres determinaciones es de
menos de 1º, tomar el promedio de las tres como punto de fusión. Si la variación de las tres determinaciones es 1º o mayor de
1º, hacer dos determinaciones adicionales y tomar el promedio de las cinco.

(755) LLENADO MÍNIMO

ALCANCE

Las siguientes pruebas y especificaciones se aplican a artículos tales como cremas, geles, lociones, ungüentos, pastas, polvos,
aerosoles y atomizadores envasados. Para minimizar el impacto del aire atrapado en los productos donde el contenido declara-
do se expresa en volumen, la determinación del llenado se lleva a cabo usando el peso a partir del cual se calcula el volumen
usando la densidad de la preparación.

PROPÓSITO
La prueba de llenado mínimo asegura que la cantidad de material llenado en el producto cumple con la cantidad declarada.
USP 40 Pruebas Físicas/ (755) Llenado Mínimo 675

PROCEDIMIENTO PARA FORMAS FARMACÉUTICAS DIFERENTES DE AEROSOLES

Para Envases Donde el Contenido Declarado Se Expresa En Peso

Seleccionar una muestra de 1O envases llenos y quitar todas las etiquetas cuyo peso pueda variar cuando se extrae el conte-
nido del envase. Limpiar a fondo y secar minuciosamente la parte externa de los envases con un medio apropiado y pesar
individualmente. Extraer cuantitativamente el contenido de cada envase, cortándolo de manera tal que quede abierto y laván-
dolo con un disolvente apropiado, si fuera necesario, teniendo cuidado de retener el cierre y las otras partes de cada envase
que estuvieron presentes durante el pesaje inicial. Secar y volver a pesar cada uno de los envases vacíos junto con sus partes
correspondientes. Determinar el peso neto del contenido del envase mediante la diferencia.

Para Envases Donde el Contenido Declarado Se Expresa En Volumen

Proceder según se indica anteriormente para envases donde el contenido declarado se expresa en peso, pero convertir el
peso en volumen usando la densidad de la preparación. A continuación se presenta un procedimiento para determinar la den-
sidad de los materiales:
1. Tarar un matraz volumétrico de 100 mL que contenga 50,0 mL de líquido que sea miscible con la formulación.
2. Agregar aproximadamente 25 mL de una muestra representativa del producto y mezclar agitando por rotación suave el
contenido de la mezcla.
3. Volver a pesar el matraz.
4. Desde una bureta, agregar una cantidad medida con exactitud del líquido miscible para llevar el contenido del matraz a
volumen mientras se agita suavemente por rotación suave. Registrar el volumen tomado de la bureta.
5. Calcular la densidad de la muestra:

W/V
W = peso del material tomado (g)
V= 50,0 mL menos el volumen, en mL, del líquido miscible necesario para ajustar el contenido del matraz a 100 mL
Se pueden emplear otros métodos para determinar la densidad dependiendo de la formulación (p.ej., formulaciones sustan-
cialmente no acuosas). De manera similar, si el contenido del envase es de menos de 25 mL, se pueden usar vasos graduados
más pequeños, ajustando las cantidades de líquido miscible de manera correspondiente.
Como alternativa, verter el contenido de 1O envases en 1O probetas graduadas adecuadas y dejar que escurra por completo.
Registrar el volumen del contenido de cada uno de los 1O envases.

Criterios de Aceptación

Esta prueba cumple con los criterios de aceptación en la Etapa 7 o la Etapa 2:

Etapa 1:
1. El contenido neto promedio de los 1O envases es no menor que la cantidad declarada y el contenido neto de cual-
quier envase individual es no menos de 90% de la cantidad declarada cuando la cantidad declarada es 60 g o 60 mL
o menos, o no menos de 95% de la cantidad declarada en la que la cantidad declarada es más de 60 g o 60 mL. Si
no se cumplen estos criterios y el contenido neto de no más de 1 envase es menos de 90% de la cantidad declarada
cuando la cantidad declarada es 60 g o 60 mL o menos, o 95% de la cantidad declarada cuando la cantidad declara-
da es más de 60 g o 60 mL, proceder con la Etapa 2.
Etapa 2:
1. Determinar el contenido de 20 envases adicionales.
2. El contenido promedio de los 30 envases es no menor que la cantidad declarada y el contenido neto de no más de 1
de los 30 envases es menos de 90% de la cantidad declarada cuando la cantidad declarada es 60 g o 60 mL o me-
nos, o menos de 95% de la cantidad declarada cuando la cantidad declarada es más de 60 g o 60 mL.

PROCEDIMIENTO PARA AEROSOLES Y ATOMIZADORES

Seleccionar una muestra de 1O envases llenos y quitar cualquier etiquetado cuyo peso podría variar durante la remoción del
contenido del envase. Limpiar a fondo y secar minuciosamente la parte externa de los envases con medios apropiados y pesar
individualmente. Retirar el contenido de cada envase empleando una técnica segura (por ejemplo, enfriar para reducir la pre-
sión interna, retirar la válvula y verter). Retirar el contenido residual con disolventes apropiados y luego enjuagar con unas po-
cas porciones de metanol. Retener el envase, la válvula y todas las partes del mismo como una unidad y calentarlas a 100º
durante 5 minutos. Enfriar y volver a pesar cada uno de los envases junto con sus partes correspondientes. La diferencia entre
el peso original y el peso del envase vacío es el peso neto de llenado. Determinar el peso neto de llenado para cada envase
analizado.
676 (755) Llenado Mínimo/ Pruebas Físicas USP 40

Criterios de Aceptación

Los requisitos se cumplen si el peso neto del contenido de cada uno de los 1O envases es no menor que la cantidad declara-
da.

(761) ESPECTROSCOPÍA DE RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR

INTRODUCCIÓN
La espectroscopía de resonancia magnética nuclear (RMN) es un método analítico basado en las propiedades magnéticas de
ciertos núcleos atómicos. Al igual que con otros tipos de espectroscopía, la absorción o emisión de energía electromagnética a
frecuencias características proporciona información sobre la estructura. La RMN difiere de otros tipos de espectroscopía en que
los niveles discretos de energía entre los que ocurren las transiciones se presentan sólo cuando el núcleo se somete a un campo
magnético.
Aunque se la reconoce ampliamente como una de las más poderosas herramientas de elucidación de estructuras químicas
disponibles, también se la puede usar para mediciones cualitativas y cuantitativas exactas, siempre que se use un diseño expe-
rimental apropiado. Consultar el capítulo de información general (1761) Aplicaciones de la Espectroscopía de Resonancia Magné-
tica Nuclear. [NOTA-Los capítulos con números superiores a 1000 se proveen únicamente para fines informativos.]

CALIFICACIÓN DE INSTRUMENTOS DE RMN

La calificación de un instrumento de RMN se puede dividir en tres etapas: Calificación de Instalación (IQ, por sus siglas en
inglés), Calificación Operativa (OQ, por sus siglas en inglés) y Calificación de Desempeño (PQ, por sus siglas en inglés). Para
un análisis más detallado, ver el capítulo de información general Calificación de Instrumentos Analíticos (1058).

Calificación de Instalación

Los requisitos de Calificación de Instalación proveen evidencia de una instalación adecuada de hardware y software para el
instrumento de manera segura y efectiva en la ubicación deseada.

Calificación Operativa

En la Calificación Operativa se caracteriza el desempeño del instrumento usando estándares para verificar que el sistema
opera de acuerdo con las especificaciones esperadas. El propósito de la Calificación Operativa es demostrar que el desempeño
del instrumento es apto para una aplicación determinada. Debido a que se encuentran disponibles una gran cantidad de mo-
dos distintos para medir espectros de RMN, se recomienda usar estándares con propiedades espectrales conocidas durante la
Calificación Operativa. Por lo general, se encuentran disponibles estándares de referencia en tubos para RMN sellados para
determinar la relación señal-ruido y la forma de la línea espectral.

Calificación de Desempeño

La Calificación de Desempeño ayuda a determinar que el instrumento sea capaz de cumplir con los requisitos del usuario
para todas las mediciones críticas para la calidad. La documentación de la Calificación del Desempeño debe describir lo si-
guiente:
1. Criterios de desempeño específicos definidos y procedimientos de prueba detallados, incluyendo muestras de prueba y
parámetros del instrumento.
2. Los elementos a medir para evaluar los criterios y las especificaciones definidas a priori para dichos criterios.
3. El intervalo de prueba, que puede ser al momento de usar.
4. El uso de muestras extremas (bracketing) o de un grupo de varias muestras.
5. Una lista definida de las acciones correctivas que podrían implementarse si el espectrómetro no cumpliera con las especifi-
caciones.
La Calificación de Desempeño periódica debe incluir un subconjunto de pruebas de Calificación Operativa para asegurar que
el instrumento se desempeña produciendo datos adecuados para el uso que se le intenta dar. Dependiendo del uso típico, las
especificaciones de la Calificación de Desempeño pueden ser más o menos estrictas que las especificaciones de instalación del
fabricante. Las mediciones críticas para la calidad de los espectros incluyen una medición de la relación señal-ruido y pruebas
de resolución para todos los núcleos de interés. Las pruebas de Calificación de Desempeño específicas para un método, tam-
USP 40 Pruebas Físicas/ (761) Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear 677

bién conocidas como pruebas de aptitud del sistema, se pueden usar como requisitos de Calificación de Desempeño en el caso
de procedimientos validados.
Las pruebas y muestras para la Calificación de Desempeño citadas en las secciones siguientes son sólo ejemplos típicos. Se
pueden usar otras pruebas y muestras para establecer especificaciones para propósitos específicos. Los proveedores de instru-
mentos a menudo suministran muestras y parámetros de prueba que se pueden usar como parte del paquete de Calificación
de Desempeño.

MEDICIÓN DE LA RESOLUCIÓN y DE LA FORMA DE LA LÍNEA-RMN DE 1 H (ver la Figura 1)

Muestra: Cloroformo al 1% en acetona-d 6 (z 500 MHz), cloroformo al 3% en acetona-d 6, desgasificada y sellada

Ancho del espectro: < 1 KHz
Tiempo de adquisición de datos: No menos de 1O segundos
Ángulo de deflexión: 90º
Tiempo de relajación: 60 segundos
Velocidad de giro: Estática ó 20 Hz
Secuencia de pulso: Espera-pulso-adquisición sin desacoplamiento
Procesamiento: Sin ensanchamiento de línea, completado de ceros hasta 128 k

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* SatéÚte de 13C ''
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Figura 1. Espectro de RMN de 1 H de cloroformo en acetona-d 6 obtenido a 400 MHz. El ancho de la línea medido a 0,55% y
a 0, 11 % de los satélites 13 C fue 2,7 y 5,5 Hz, respectivamente.

Compensar el magneto con especial atención a las compensaciones fuera de eje, obtener una sola adquisición, someter a
corrección de fase para obtener una absorción pura y medir el ancho de la línea a 50%, 0,55% y 0, 11 % de la intensidad máxi-
ma. El ancho de la línea debe cumplir con las especificaciones para estas alturas y, además, la forma de la línea debe ser lorent-
ziana. Con frecuencia, en los espectrómetros de RMN modernos, la forma de la línea se obtiene en muestras sin girar, puesto
que es posible compensar muy bien fuera de eje, tanto que no existe ninguna diferencia fundamental entre los espectros obte-
nidos girando la muestra y con la muestra sin girar. Además, los espectros bidimensionales se deben obtener sobre muestras
estáticas.

MEDICIONES DE RELACIÓN SEÑAL-RUIDO-RMN DE 1 H (ver la Figura 2)

Muestra: Etilbenceno al O, l % en cloroformo-d, etilbenceno al 1% en cloroformo-d (< 200 MHz) desgasificado y sellado
Ancho del espectro: 1O ppm
Tiempo de adquisición de datos: 400 milisegundos
Ángulo de deflexión: 90º
Tiempo de espera para relajación: 60 segundos
Velocidad de giro: O ó aproximadamente 20 Hz
678 (761) Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear / Pruebas Físicas USP 40

Secuencia de pulso: Espera-pulso-adquisición sin desacoplamiento

Procesamiento: Exponencial con un ensanchamiento de la línea de 1 Hz
Referencia: Tetrametilsilano (TMS) = 0,0 ppm o el centro del cuarteto = 2,65 ppm

i:-
6
...

2,3,4
.º-

1 ' '! ~ r· t' l " 'T r~-- r "1' y- ..•.,. 1 '" "f --· f "'·'!-- "'"

6 5 4

6 5 4 2 1 [pprn)

Figura 2. Espectro de RMN de 1 H de etilbenceno al O, 1%obtenidoa400 MHz con una relación señal-ruido de 550:1

Se debe elegir la concentración de etilbenceno para lograr mediciones de relación señal-ruido especificadas en el intervalo
de 20-1000. Las concentraciones que generalmente resultan en mediciones fuera de dicho intervalo tienen una utilidad limita-
da para la evaluación del desempeño del instrumento. Sin embargo, convencionalmente se utilizan soluciones estándar esta-
blecidas. Se debe compensar el magneto lo mejor posible. Idealmente, esta prueba debe realizarse inmediatamente después
de la prueba de la forma de la línea puesto que la mayoría de las compensaciones estarán casi maximizadas. Obtener una sola
adquisición, someter el espectro a corrección de fase en el modo de absorción pura y medir la relación señal-ruido del cuarteto
de etilbenceno. Este experimento se puede realizar girando la muestra o con la muestra estática. Si las compensaciones fuera
de eje están bien ajustadas, el valor de la relación señal-ruido medido sobre muestras giradas sólo debe ser aproximadamente
10% mayor que el obtenido con muestras estáticas. Una relación mayor indica que se puede lograr una compensación fuera
de eje adicional.
Los espectrómetros modernos tienen un software que lleva a cabo la medición de la relación señal-ruido una vez que el ope-
rador ha identificado las regiones de la señal y del ruido. Los cálculos también pueden realizarse manualmente. Medir la ampli-
tud (A) desde el centro de la línea base hasta el pico de la más alta de las dos líneas centrales en el cuarteto. Medir la altura del
ruido entre picos (H) desde el pico de ruido inferior hasta el pico de ruido superior en la región de 3-5 ppm. El ruido puede
multiplicarse verticalmente por un factor para obtener una medición exacta de los espectros con relación señal-ruido alta. Cal-
cular la relación señal-ruido según se indica a continuación:

S/N=kx2,5xA/H [1]
donde k es el factor de expansión vertical de la región de ruido usada. El factor de 2,5 convierte la relación señal-ruido entre
picos en la media cuadrática (rms, por sus siglas en inglés) del ruido, que es la convención estándar para informar la señal-
ruido en la espectroscopía de RMN. Se pueden usar cálculos de señal-ruido computarizados siempre que las especificaciones se
establezcan y analicen usando el mismo procedimiento. El uso de un valor de relación señal- ruido menor que el especificado
por el fabricante es permisible, a discreción del espectroscopista, siempre y cuando se determine que dicho valor es suficiente
para la aplicación en uso.

MEDICIONES DE RELACIÓN SEÑAL-RUIDO DE RMN DE 13 C (ver la Figura 3)

Muestra: p-Dioxano al 40% en benceno-d 6 (v/v) (desgasificada y sellada)

Ancho del espectro: Aproximadamente 200 ppm
Ángulo de deflexión: 90º
Tiempo de espera para relajación: 300 segundos
Velocidad de giro: Aproximadamente 20 Hz
USP 40 Pruebas Físicas/ (761) Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear 679

Secuencia de pulso: Espera-pulso-adquisición sin desacoplamiento

Procesamiento: Exponencial con un ensanchamiento de línea de 3,5 Hz, completado de ceros hasta 32k
Referencia: TMS = 0,0 ppm o el centro del triplete del benceno= 128,4 ppm

bt-o SIN =WJ 11)/2(],()4

Benceno- d6 .

¡
120 100 80

140 120 100 80 60 [ppm)

Figura 3. Espectro de RMN de 13 ( del estándar ASTM de p-dioxano al 40% en benceno-d 6 (v/v) obtenido a 100,6 MHz, con
una relación señal-ruido de 140:1

Usando un magneto bien compensado, obtener una sola adquisición después de un tiempo de espera mínimo de 300 se-
gundos, colocar el espectro en fase de absorción pura y medir la altura del triplete del benceno a aproximadamente 128,4
ppm desde el centro de la línea base. El ruido entre picos se puede medir según se indicó anteriormente con una expansión
vertical apropiada a 80-120 ppm. Los cálculos de la relación señal-ruido se pueden realizar tal como indica la Ecuación 7 o
mediante cálculo computarizado.
El triplete del benceno-d 6 no se intensifica por efecto nuclear de Overhauser (NOE, por sus siglas en inglés). Por consiguien-
te, esta prueba verifica sólo el desempeño del canal 13(.

DESEMPEÑO DE LOS CANALES 13 ( y 1 H (ver la Figura 4)

Muestra: Etilbenceno hasta al 10% en cloroformo-d (desgasificada y sellada)

Ancho del espectro: 200 ppm
Duración de la adquisición de datos: 64k puntos
Ángulo de deflexión: 90º
Tiempo de espera para relajación: 300 segundos
Velocidad de giro: Aproximadamente 20 Hz
Secuencia de pulso: Espera-pulso-adquisición con desacoplamiento de pulso compuesto ajustado al centro del espectro
de 1 H
Procesamiento: Exponencial con ensanchamiento de línea de 0,3 Hz
Referencia: TMS = 0,0 ppm o el centro del triplete del cloroformo-d = 77,23 ppm
680 (761) Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear /Pruebas Físicas USP 40

2,3

t,_ .
1 6 ~
~-~

f
l ..
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¡-..--r--.--~-.,-~ ¡
12'0 100 90 ~
_ __...__ _._..__ _ _ _ _ _ _ _ _ _......__..._~~-o

..r·-·"-·r· -··-·r-·---r--""r-"'-t""-·¡--~·----r---,~--·-~-r ·-~,----r--·-i----r--T· ··--T- -· -.·~· ···- 1- ~-·-¡-··-¡-··.,..-·· · ·~r-·

140 l:llO 100 IO llO tO :.O (PPllll

Figura 4. Espectro de RMN de 13 C de etilbenceno al 10% obtenido con una sonda dual 1 H/ 13 C enfriada criogénicamente a
150,9 MHz, con una relación señal-ruido de 640:1

La compensación debe ser suficiente para cumplir con las pruebas de resolución y de forma de la línea descritas anterior-
mente. La medición de la relación señal-ruido se realiza a partir de la altura del pico de la mayor de las dos resonancias cerca-
nas a 128 ppm. El ruido se mide según se indicó anteriormente en la región de 80-120 ppm, con una expansión vertical apro-
piada. La relación señal-ruido es calculada por la computadora o conforme a la Ecuación 7.

MEDICIONES DE RELAXOMETRÍA-RMN DE CAMPO BAJO

La Calificación de Desempeño debe realizarse antes de la recolección de datos experimentales.

Disolver una cantidad pesada con exactitud de cloruro de manganeso (11) tetrahidrato (peso molecular 197,91) en agua y
diluir cuantitativamente con agua para obtener soluciones de comprobación con concentraciones conocidas de 0,9; 2,7 y 4,5
mM.
Colocar una porción de cada una de las soluciones en portamuestras adecuados para el modelo de espectrómetro de RMN
de campo bajo en uso. Entibiar a 40º durante no menos de 1 O minutos y medir el tiempo de relajación espín-entorno (T1 ) del
agua. El promedio T1 para mediciones repetidas debe estar dentro del 5% de 156; 52 y 32 ms para las soluciones de 0,9; 2,7 y
4,5 mM, respectivamente.

Caracterización del Desempeño del Instrumento

Los procedimientos específicos, criterios de aceptación e intervalos de tiempo para caracterizar el desempeño del espectró-
metro de RMN dependen del instrumento y del uso que se pretende dar. Muchas aplicaciones de RMN emplean experimentos
previamente validados que relacionan los espectros de RMN con una propiedad física o química de interés. Se debe demostrar
el desempeño estable del instrumento durante periodos prolongados. Esta práctica ofrece cierta garantía sobre la confiabilidad
de las mediciones de muestra tomadas a partir de espectros usando experimentos de RMN previamente validados.

ANÁLISIS DE RMN CUALITATIVO V CUANTITATIVO

La espectroscopía de RMN se ha utilizado en un amplio rango de aplicaciones tales como elucidación de estructuras, estu-
dios termodinámicos, cinéticos y mecanísticos, y análisis cuantitativo. Algunas de estas aplicaciones están más allá del alcance
de los métodos farmacopeicos.
Todas las características de las señales-desplazamiento químico, multiplicidad, ancho de línea, constantes de acoplamiento,
intensidad relativa y tiempo de relajación- proveen información analítica.
USP 40 Pruebas Físicas/ (761) Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear 681

Aplicaciones Cualitativas

La comparación de un espectro existente en la bibliografía o de un estándar auténtico con el de una muestra de prueba
puede usarse para confirmar la identidad de un compuesto y detectar la presencia de impurezas que generan señales extrañas.
Los espectros de RMN con estructuras simples pueden describirse adecuadamente mediante el uso de los valores numéricos
para los desplazamientos químicos y las constantes de acoplamiento, y mediante el número relativo de núcleos representados
por la integral de cada señal. (Los instrumentos modernos cuentan con software que genera espectros simulados con estos
datos). También deben proporcionarse detalles experimentales, como por ejemplo el disolvente usado y la referencia para el
desplazamiento químico.
Para muestras desconocidas, el análisis de RMN, usualmente combinado con otras técnicas analíticas, es una herramienta
poderosa para la elucidación de estructuras. Los desplazamientos químicos proporcionan información del entorno químico de
los núcleos. Existe una amplia bibliografía de referencia con tablas y reglas de correlación para predecir los desplazamientos
químicos. La multiplicidad de las señales proporciona información estructural importante. La magnitud de la constante de aco-
plamiento escalar, j, entre protones residuales en estructuras aromáticas, olefínicas o cicloalquílicas sustituidas se usa para iden-
tificar la posición relativa de los sustituyentes. Los espectros de rutina de 13 C se obtienen en condiciones de desacoplamiento
protónico, lo que anula todos los acoplamientos heteronucleares 13 C- 1 H. Como resultado de este desacoplamiento, las señales
de carbono aparecen como singuletes, a menos que estén presentes otros núcleos no desacoplados (p.ej., 19 F, 31 P).
El intercambio químico es un ejemplo del efecto de la velocidad de los procesos intermoleculares e intramoleculares en los
espectros de RMN. Si un protón puede experimentar diferentes ambientes en virtud de tal proceso (tautomerismo, rotación en
torno a un enlace, equilibrios de intercambio, inversión de anillo, etc.), la apariencia del espectro será una función de la veloci-
dad del proceso. Los procesos lentos (en una escala de tiempo de RMN) proporcionan más de una señal de las especies que se
interconvierten, los procesos rápidos promedian estas señales en una línea, y los procesos intermedios producen señales an-
chas, que en ocasiones son difíciles de encontrar en los espectros.
Los programas de los espectrómetros modernos de RMN por Transformada de Fourier toman en cuenta secuencias de pul-
sos mucho más complejas que la acumulación repetitiva de transientes descrita anteriormente. Tales experimentos incluyen
análisis multidimensionales homonucleares o heteronucleares que determinan la correlación de acoplamientos y pueden simpli-
ficar la interpretación de espectros complejos.
Ver el capítulo (1 761) para descripciones detalladas de los experimentos bidimensionales más comunes.

Aplicaciones Cuantitativas

l. Consideraciones generales de la RMN cuantitativa: ver el capítulo (1761 ).

11. El alcance de esta sección se limita a la cuantificación mediante RMN unidimensional. Aunque se puede usar cualquier
núcleo activo de RMN para obtener datos cuantitativos, la información de este capítulo se limita al 1 H. Existen dos tipos
de cuantificación mediante RMN: relativa y absoluta.
(A) La cuantificación relativa implica medir cantidades relativas de las especies en una muestra basándose en la integra-
ción de picos debidos a cada una de las especies medidas. Las integrales se normalizan mediante el factor N, es decir,
la integral se divide por el número de núcleos equivalentes representados por dicho pico para proporcionar la con-
centración molar relativa de cada componente.
(B) La cuantificación absoluta es la medición directa de la cantidad real de analito independiente de otros componen-
tes contenidos en dicha muestra. Existen dos métodos básicos de cuantificación absoluta basados en el tipo de están-
dar de referencia usados para calibrar la señal de RMN.
(1) Estándar de referencia interno:
(a) Definición: El estándar de referencia se disuelve conjuntamente con el analito en la solución de prueba.
(b) Procedimiento
Preparación de la solución típica para RMN: Una solución para RMN se prepara con pesos exactos
del analito y del estándar de referencia. La fuente de error más grande en este método de RMN cuanti-
tativo se deriva del pesaje, por lo que se recomienda usar pesos más grandes para minimizar errores.
Este método cuantitativo se basa en una comparación del estándar de referencia y los picos de RMN
del analito y sus respectivas concentraciones. Debido a que el analito y el estándar de referencia se en-
cuentran en la misma solución, el volumen donde el analito y el estándar de referencia están conteni-
dos es el mismo, por lo que únicamente se comparan sus masas. Por lo tanto, no es necesario un volu-
men exacto. Por lo general, las soluciones se preparan por triplicado como mínimo.
Adquisición de datos: Los datos se adquieren en condiciones cuantitativas, ver el capítulo
(1761 ). Por ejemplo, se debe esperar al menos 5 veces el T1 más largo cuando se usa un pulso de
90º antes de repetir el pulso.
Procesamiento de datos: Procesar los datos, usando completado de ceros si fuera necesario, de
modo que haya un número suficiente de puntos para definir un pico. Por ejemplo, la experiencia
ha demostrado que se necesitan al menos 16 puntos para obtener una buena representación
cuantitativa de un pico.
682 (761) Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear / Pruebas Físicas USP 40

Análisis: Integrar los picos apropiados. Por ejemplo, evitar el uso de picos superpuestos o los que
se deban a hidrógenos susceptibles de intercambio. La determinación de la cantidad de analito se
deriva de la proporcionalidad básica entre la intensidad del pico y la concentración del soluto.

[A]1H = [RS] 1H
[2]
IA/NA IRS / NRS
donde I = integral; N =factor de normalización; y [ ]lH = 1H concentración molar relativa y los
subíndices A y RS representan el analito y el estándar de referencia, respectivamente.
Por consiguiente, la masa del analito se calcula de acuerdo con la siguiente ecuación.
I N MM
M _ _¿_x~x--A-xM xP [3]
A - ,RS NA MMRS RS

donde MA = masa del analito, MM= masa molar y P = pureza del estándar de referencia.
(c) Una aplicación común de la cuantificación absoluta es la determinación de la pureza de una muestra. La
pureza porcentual en peso se calcula mediante

M
pureza % en peso =____Ax 100% [4]
Ms
donde M5 es la masa total de la muestra con contribuciones del analito más cualquier contaminante que
pudiera estar presente en la muestra como por ejemplo agua y sales. Al combinar las Ecuaciones 3 y 4, la
pureza porcentual en peso se calcula mediante

(2) Estándar de referencia externo

(a) Definición: El método clásico de estándar de referencia externo consiste en soluciones de un estándar de
referencia y un analito que se encuentran en tubos para RMN separados. Una variación del método del es-
tándar de referencia externo es insertar la solución de prueba del estándar contenida en un tubo coaxial en
la solución de prueba del analito contenida en un tubo para RMN. Otra variación consiste en la introduc-
ción de una señal generada por computadora en el espectro de una solución estándar de referencia de con-
centración conocida para calibrar la respuesta de la señal (intensidad por concentración molar 1 H, en el ca-
so de la RMN de 1 H), seguida por la inserción de una señal calibrada generada por computadora en el es-
pectro de una solución de prueba del analito. Esta sección tratará el uso de una referencia externa en el
sentido clásico.
(b) Procedimiento
Preparación de la solución para RMN: Las soluciones para RMN con concentraciones conocidas de
analito y de estándar de referencia se preparan usando pesos y volúmenes exactos. Nuevamente, se
recomienda el uso de pesos más grandes para minimizar el error de pesaje. Por lo regular, se preparan
soluciones repetidas del analito y del estándar de referencia. El analito y el estándar de referencia de-
ben prepararse usando el mismo disolvente para minimizar las diferencias de ajuste.
Adquisición y procesamiento de datos: Igual que en 11.B.1.b, estándar de referencia interno. Aplicar
los mismos parámetros de adquisición y procesamiento a los espectros del analito y del estándar de
referencia.
Análisis: Integrar los picos apropiados en los espectros del analito y del estándar de referencia. La can-
tidad de analito se calcula de acuerdo con la siguiente ecuación:

MA =~x NRs x~x MMA x MRsxP [6]

IRS NA VRS MMRS
donde V= volumen.
Aplicación a la pureza porcentual en peso: Los valores de pureza porcentual en peso se pueden calcu-
lar de manera similar a la indicada en la Ecuación 5.
(C) Los métodos de estándar de referencia interno y externo tienen cada uno sus propias ventajas y desventajas.
(1) Interacciones químicas: La preparación del estándar de referencia y del material de prueba en soluciones sepa-
radas previene interacciones químicas entre la muestra de prueba y el estándar de referencia que de otro modo
podrían ocurrir con un estándar de referencia interno.
(2) Superposición de espectros: El uso de un estándar de referencia externo también previene la superposición po-
tencial entre los picos del estándar de referencia y de la muestra de prueba que puede ocurrir con un estándar
interno.
USP 40 Pruebas Físicas/ (761) Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear 683

(3) Calibración: Una vez que se ha calibrado la respuesta de RMN con soluciones de estándares de referencia exter-
nos, dicha calibración puede aplicarse a cualquier otra muestra en el mismo disolvente siempre que i) se haya
demostrado la estabilidad del instrumento durante el tiempo entre el que se lleva a cabo la calibración y el mo-
mento en que se adquieren los datos en el material de prueba, ii) se haya establecido la aptitud del sistema en el
día en que se realiza la medición del material de prueba y iii) se comparen las integrales absolutas. Para los es-
tándares de referencia internos, la medición del estándar de referencia y de la muestra de prueba se lleva a cabo
en condiciones absolutamente idénticas.
(4) Exactitud y precisión: Se pueden preparar soluciones múltiples de estándares de referencia para promediar los
errores en las mediciones de masa y volumen durante la preparación de la muestra, con lo que se mejora la
exactitud de la respuesta de RMN calibrada. Para los estándares de referencia internos, se realizan mediciones
individuales del estándar de referencia y del analito para cada solución de prueba duplicada. Los errores combi-
nados que se derivan de las mediciones de masa del estándar de referencia y de la muestra de prueba, así como
las variaciones electrónicas de los instrumentos determinan la desviación estándar del promedio MA o de los va-
lores de pureza porcentual en peso.

VALIDACIÓN V VERIFICACIÓN DE PROCEDIMIENTOS ANALÍTICOS DE RMN

Cuando se proporciona un procedimiento de RMN en una monografía, es necesario verificar su aptitud en las condiciones
reales de uso (ver el capítulo (1226)). La validación es necesaria únicamente cuando un método de RMN se presenta como
alternativa al procedimiento oficial para el análisis de un artículo oficial. El objetivo de la validación de un procedimiento de
RMN es demostrar que la medición es adecuada para su propósito deseado, incluyendo lo siguiente: determinación cuantitati-
va del componente principal en un fármaco o producto farmacéutico (valoraciones de Categoría 1), determinación cuantitativa
de impurezas (valoraciones de Categoría 11) y pruebas de identificación (valoraciones de Categoría IV). [NOTA-Para definicio-
nes sobre las diferentes categorías, consultar el capítulo (1225) Validación de Procedimientos Farmacopeicos.] Dependiendo de la
categoría de la prueba, la validación del procedimiento analítico requerirá el análisis de la especificidad, linealidad, intervalo,
exactitud, precisión, límite de cuantificación y robustez. Dichas características de desempeño analítico se aplican a métodos
estandarizados externamente y los métodos de estándares agregados.
El capítulo (1225) ofrece definiciones y pautas generales sobre la validación de procedimientos analíticos sin indicar criterios
de validación específicos para cada característica. La intención de las secciones siguientes es proveer al usuario de criterios de
validación específicos que representan las expectativas mínimas para esta tecnología. Podrían requerirse criterios de aceptación
más rigurosos para cada aplicación particular a fin de demostrar la aptitud para el uso deseado.

Validación de Procedimientos Analíticos

El objetivo de la validación de un procedimiento analítico es demostrar que dicho procedimiento es adecuado para el propó-
sito al que está destinado, mediante la realización de experimentos y que los resultados obtenidos a partir de ellos cumplan
con criterios de aceptación predefinidos. Los procedimientos analíticos de RMN pueden incluir lo siguiente: pruebas cuantitati-
vas para componentes principales y contenido de impurezas, pruebas de límite para detectar la presencia de impurezas, cuan-
tificación de componentes en un producto o formulación y/o pruebas de identificación.
Las características de desempeño que demuestran la aptitud de un procedimiento analítico son similares a las requeridas pa-
ra cualquier procedimiento analítico. El capítulo (1225) presenta una discusión sobre los principios generales aplicables. Los
criterios de aceptación específicos para cada parámetro de validación deben ser congruentes con el uso pretendido del proce-
dimiento analítico.
A continuación se proporcionan las características de desempeño requeridas como parte de una validación para cada una de
las categorías de procedimientos analíticos.

ESPECIFICIDAD

El propósito de una prueba de especificidad es demostrar que las mediciones de las señales del analito a medir están exentas
de interferencia proveniente de los componentes e impurezas en el material de prueba. La especificidad se puede aplicar a
todas las categorías y es un requisito de la Categoría IV. Como prueba de especificidad se pueden comparar los espectros de
RMN del analito con los de otros componentes de las formulaciones y las preparaciones de prueba, así como los de impurezas
conocidas derivadas de los procesos sintéticos. Para un procedimiento analítico de identificación por RMN (Categoría IV), las
pruebas de validación pueden incluir experimentos de RMN multidimensionales para validar las correctas asignaciones de los
desplazamientos químicos y así confirmar la estructura del analito.
Criterios de validación: La especificidad se asegura mediante el uso de un estándar de referencia, siempre que sea posi-
ble, así como la demostración de la ausencia de interferencias procedentes de otros componentes.
684 (761) Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear /Pruebas Físicas USP 40

LINEALIDAD

La relación de linealidad es aquélla exhibida entre la concentración de analito y la respuesta del instrumento, la cual se debe
demostrar midiendo las respuestas del analito de no menos de cinco soluciones estándar a concentraciones que abarquen el
intervalo de concentración anticipado de analitos de la solución de prueba. Para la Categoría 1, las soluciones estándar se pue-
den preparar a partir de materiales de referencia en un disolvente para RMN apropiado. Para la Categoría 11, en procedimien-
tos analíticos de RMN que se usan para cuantificar impurezas, se pueden preparar muestras de linealidad agregando cantida-
des conocidas de muestras de prueba adecuadas que contengan bajas cantidades de analito o agregando cantidades conoci-
das de una matriz conteniendo el analito en concentraciones incluidas en el intervalo esperado. Posteriormente, se debe cons-
truir la curva estándar usando procedimientos analíticos y estadísticos adecuados tales como la regresión de cuadrados míni-
mos. Asimismo, se debe determinar el coeficiente de correlación (R), la ordenada al origen y la pendiente de la línea de regre-
sión. Los valores absolutos determinados para dichos factores deben ser apropiados para el procedimiento que se está validan-
do.
Criterios de validación: El coeficiente de correlación (R) debe ser no menos de 0,995 para las valoraciones de Categoría 1,
y no menos de 0,99 para las pruebas cuantitativas de Categoría 11.

INTERVALO

El intervalo entre las concentraciones alta y baja de analito se proporciona mediante el procedimiento analítico de RMN
cuantitativa. Por lo regular, éste se basa en las especificaciones del artículo de prueba de la monografía USP. Se trata del inter-
valo dentro del cual el procedimiento analítico puede demostrar un grado aceptable de linealidad, exactitud y precisión, obte-
niendo de este modo un valor confiable de dicho procedimiento analítico. A continuación se proporcionan intervalos reco-
mendados para varios procedimientos analíticos de RMN.
Criterios de validación: Para pruebas de Categoría 1, cuando los criterios de aceptación está centrados en 1 00,0%, el in-
tervalo de validación es 80,0%-120,0%. Para criterios de aceptación no centrados, el intervalo de validación comprende desde
10,0% por debajo del límite inferior hasta 10,0% por encima del límite superior. Para uniformidad de contenido, el intervalo es
70,0%-130,0%. Para las pruebas cuantitativas de Categoría 11, el intervalo de validación abarca 50,0%-120,0% de los criterios
de aceptación.

EXACTITUD

La exactitud de un procedimiento analítico de RMN cuantitativo se debe determinar a través del intervalo analítico requeri-
do. Por lo general, se evalúan tres niveles de concentración usando preparaciones por triplicado en cada nivel.
Para valoraciones de fármacos (Categoría 1), la exactitud se puede determinar analizando un estándar de referencia de pure-
za conocida. Para productos farmacéuticos (Categoría 1), se debe usar una muestra compuesta de estándar de referencia y de
otros componentes de un producto farmacéutico terminado para la validación del procedimiento analítico. Los resultados de
la valoración se comparan con el valor teórico del estándar de referencia para estimar errores o recuperación porcentual. Para
la cuantificación de impurezas (Categoría 11), la exactitud del procedimiento analítico se puede determinar mediante estudios
con fármacos o productos con cantidades agregadas y concentraciones conocidas del analito en análisis. También resulta
aceptable comparar los resultados de valoración del procedimiento analítico que se está validando con los de un procedimien-
to analítico alternativo ya establecido.
Criterios de validación: 98,0%-102,0% de recuperación para fármacos, 95,0%-105,0% de recuperación para valoración
de productos farmacéuticos terminados preparados magistralmente y 80,0%-120,0% de recuperación para los análisis cuanti-
tativos de impurezas. Estos criterios deben cumplirse durante todo el intervalo pretendido.

PRECISIÓN

Repetibilidad: El procedimiento analítico debe ser evaluado midiendo las concentraciones de seis soluciones estándar dis-
tintas al 100% de la concentración de prueba. Se debe evaluar el cumplimiento de la desviación estándar relativa de las deter-
minaciones repetidas con los criterios de aceptación. Como alternativa, es posible medir las concentraciones de tres determi-
naciones repetidas de tres soluciones muestra distintas a diferentes concentraciones. Las tres concentraciones deben ser lo sufi-
cientemente cercanas para que la repetibilidad sea constante en todo el intervalo de concentración. Si esto se lleva a cabo, se
combina la repetibilidad de las tres concentraciones para compararla con los criterios de aceptación.
Criterios de validación: La desviación estándar relativa es no más de 1,0% para fármacos, no más de 2,0% para productos
farmacéuticos terminados preparados magistralmente y no más de 20,0% para los análisis cuantitativos de impurezas.
Precisión intermedia: Se debe establecer el efecto que tienen los eventos aleatorios sobre la precisión analítica del proce-
dimiento analítico. Las variables típicas incluyen llevar a cabo el análisis en diferentes días usando diferentes instrumentos que
sean adecuados de acuerdo con lo especificado en el método analítico y/o que dos o más analistas realicen el procedimiento
analítico. Como mínimo, cualquier combinación de al menos dos de estos factores para un total de seis experimentos ofrece-
rán una estimación de la precisión intermedia.
USP 40 Pruebas Físicas/ (761) Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear 685

Criterios de validación: La desviación estándar relativa es no más de 1,0% para fármacos, no más de 3,0% para productos
farmacéuticos terminados preparados magistralmente y no más de 25,0% para análisis cuantitativos de impurezas.

LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN (QL, POR SUS SIGLAS EN INGLÉS)

El límite de cuantificación se puede validar midiendo seis determinaciones repetidas de muestras de prueba con cantidades
agregadas conocidas de analito al 50% de la especificación.
A partir de estas determinaciones repetidas es posible determinar la exactitud y la precisión. Algunos ejemplos de especifica-
ciones para las determinaciones cuantitativas de Categoría 11 son que la concentración medida está dentro del 70,0%-130,0%
de la concentración agregada conocida y la desviación estándar relativa es no más de 15%.

ROBUSTEZ

La confiabilidad de una medición analítica se debe demostrar mediante cambios deliberados en parámetros experimentales
críticos. Esto puede incluir la medición de la estabilidad del analito en condiciones de almacenamiento especificadas, retraso
entre pulsos con una ligera variación, temperatura de la sonda y posibles muestras interferentes, por citar algunos ejemplos. La
robustez es necesaria para los métodos cuantitativos de Categoría 1y Categoría 11.

Verificación de Procedimientos Analíticos

Los reglamentos de las Buenas Prácticas de Fabricación Vigentes de los EE.UU. [Título 21 del CFR 211.194(a)(2)] indican que
los usuarios de procedimientos analíticos descritos en los compendios USP-NF no requieren validar dichos procedimientos
cuando se proporcionen en una monografía, sino que simplemente deben verificar su aptitud ante condiciones reales de uso.
El objetivo de la verificación de un procedimiento de RMN es demostrar que éste, conforme a lo descrito en una monografía
específica, puede ser realizado por el usuario con una exactitud, especificidad y precisión adecuadas usando los instrumentos,
analistas y matrices de muestras disponibles. De acuerdo con el capítulo de información general (1226) Verificación de Procedi-
mientos Farmacopeicos, cuando falla la verificación del procedimiento farmacopeico siguiendo la monografía, el procedimiento
podría no ser adecuado para su uso con el artículo de prueba. Puede ser necesario desarrollar y validar un procedimiento alter-
nativo según lo permitido por las Advertencias y Requisitos Generales 6.30.
La verificación de un procedimiento de RMN farmacopeico debe como mínimo incluir la ejecución de los parámetros de
validación para especificidad, exactitud, precisión y límite de cuantificación, cuando resulte apropiado, según se indica en esta
sección.

GLOSARIO

Estándar interno: Un estándar interno (IS, por sus siglas en inglés) es una sustancia que se agrega a una solución muestra en
una concentración conocida. Se debe seleccionar un estándar interno que presente al menos una resonancia de RMN que no
se superponga con las del analito. El cociente entre las áreas de los picos de un estándar interno específico y un analito se usa
para determinar la concentración del analito. Se debe conocer el número de núcleos correspondiente a los picos integrados en
el estándar interno y los espectros de analito.
Referencia de RMN: Una referencia de RMN, también conocida como referencia de desplazamiento de RMN, es una sustan-
cia agregada a una muestra y a partir de la cual se establece el desplazamiento químico para la escala 8. Los ejemplos comunes
de análisis de protones y de carbono por RMN incluyen tetrametilsilano (TMS) para su uso en disolventes orgánicos y la sal
sódica del ácido 2,2-dimetil-2-silapentan-5-sulfónico (DSS) o 3-trimetilsililpropionato de sodio (TMSP) para su uso en medios
acuosos. En ambos casos, el desplazamiento químico de los picos de metilo se define como 0,0 ppm.
Estándar de referencia: Un estándar de referencia es una sustancia cuya estructura química específica se confirma por me-
dios experimentales. En la espectroscopía de RMN, un estándar de referencia generalmente se usa para los análisis cualitativos
de un material de prueba. La estructura se puede confirmar al comparar directamente los desplazamientos químicos y las mul-
tiplicidades de los picos en el espectro de RMN del material de prueba contra el espectro del estándar de referencia adquirido
en condiciones experimentales comparables.
686 (771) Productos Oftálmicos / Pruebas Físicas USP 40

(771) PRODUCTOS OFTÁLMICOS-PRUEBAS DE CALIDAD

INTRODUCCIÓN
Los productos oftálmicos son productos estériles que están destinados a la aplicación en cualquier estructura ocular, inclu-
yendo los espacios adyacentes a una estructura ocular y espacios circundantes inmediatos.
Las vías de administración de los productos oftálmicos se dividen en tres categorías generales: tópicos, inyecciones intraocu-
lares e inyecciones extraoculares. Los medicamentos tópicos están destinados a la administración en un componente de la su-
perficie ocular, tal como el párpado, la conjuntiva o la córnea y pueden producir efectos sistémicos o locales. Las inyecciones
intraoculares y las extraoculares se administran a través del tejido conjuntivo externo. Las vías oftálmicas de administración in-
cluyen, entre otras: las vías tópica, subconjuntival, subtenoniana, subretiniana, subcoroidal, intracorneal, intraescleral, supraco-
roidal, intravítrea, intracameral, yuxtaescleral y retrobulbar (ver la Figura 1). Los productos oftálmicos se administran en el ojo
mediante una amplia variedad de formas farmacéuticas, incluyendo, entre otras: soluciones, suspensiones, ungüentos, geles,
emulsiones, tiras, inyecciones, insertos e implantes.

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Vía retrobulbar

Figura 1. Algunas vías de administración en el ojo.

Este capítulo provee listas de los requisitos de pruebas de calidad de productos comunes y consolidadas en un formato
coherente y conciso. Este capítulo es aplicable, en parte o en su totalidad, cuando se haga referencia al mismo en una mono-
grafía de un medicamento (ver Advertencias Generales, 3.1 OAplicabilidad de las Normas). El capítulo incluye las pruebas de cali-
dad para la vía de administración específica. Las pruebas de calidad listadas pueden ser usadas por los fabricantes, según co-
rresponda, en el desarrollo de nuevas monografías para medicamentos que se van a presentar ante la USP-NF.
[NOTA-Todas las referencias a los capítulos superiores a (1000) son únicamente para propósitos informativos y pueden usar-
se como un recurso útil. Estos capítulos no son de cumplimiento obligatorio a menos que se exija su aplicación explícitamen-
te.]

FORMAS FARMACÉUTICAS OFTÁLMICAS

Este capítulo trata las características específicas de las formas farmacéuticas que se administran a cualquier estructura en el
ojo. Ver el capítulo Formas Farmacéuticas (1151) para información adicional sobre la descripción y la fabricación de formas far-
macéuticas.
Los productos oftálmicos tienen requisitos idénticos o similares a los productos inyectables e implantes. Para mayor informa-
ción sobre los requisitos de estas formas farmacéuticas, ver el capítulo Medicamentos Inyectables y en Implantes (1 ).
Dependiendo de la formulación, el sistema de envase-cierre y el proceso de esterilización, pueden ocurrir cambios por de-
gradación y/o cambios morfológicos durante la etapa de esterilización del proceso de fabricación, los cuales deben minimizar-
se. Las temperaturas requeridas para la esterilización por autoclave pueden ocasionar daños irreversibles a ciertas formas farma-
céuticas, tales como suspensiones, semisólidos, emulsiones, entre otras, mientras que la filtración es aplicable solo a formula-
ciones que contienen partículas con tamaños de partículas <0,2 µm. Una alternativa es fabricar el producto a partir de ingre-
dientes estériles en un ambiente aséptico.
Para productos multidosis, se requiere un conservante antimicrobiano adecuado y se debe demostrar su efectividad durante
la vida útil del producto.

Soluciones

[NOTA-En esta sección se incluyen aquellos productos sólidos que, al reconstituirlos de acuerdo con las instrucciones en la
etiqueta, dan lugar a una solución.]
USP 40 Pruebas Físicas/ (771) Productos Oftálmicos 687

El tiempo de contacto de las soluciones oftálmicas tópicas con la córnea se incrementa con la viscosidad de las formulacio-
nes. Diversos polímeros sintéticos, incluidos, entre otros, el alcohol polivinílico, la polivinilpirrolidona, el polietilenglicol, el áci-
do poliacrílico y muchos derivados de celulosa, tales como la hipromelosa y la hidroxietilcelulosa se usan comúnmente como
mejoradores de la viscosidad debido a su compatibilidad fisiológica y a sus propiedades fisicoquímicas satisfactorias.
Otra forma de incrementar el tiempo de contacto con la córnea implica el uso de polímeros que proveen a la formulación
líquida una consistencia semisólida sólo cuando se coloca en el área conjuntiva o en la córnea. De esta forma, a la instilación
simple de la solución le sigue una permanencia prolongada como resultado de las propiedades viscoelásticas del hidrogel for-
mado. El "hidrogel" o los "geles de base acuosa" son redes tridimensionales de cadenas de polímeros que contienen agua
dentro de la red. La red puede ser una estructura entrecruzada física o químicamente (un enlace covalente) entre cadenas de
polímeros. El contenido de agua de los hidrogeles puede ajustarse modulando la composición y la conformación de los polí-
meros, tales como el balance hidrofílico/hidrofóbico de las cadenas de polímeros y los grupos laterales y el grado de entrecru-
zamiento. El fenómeno de gelificación in situ es ocasionado por un cambio en la conformación de los polímeros que puede ser
desencadenado por estímulos externos, tales como la temperatura, el pH, el contenido iónico y el fluido lagrimal al momento
de la administración en el ojo. Además, algunos polímeros pueden interactuar, mediante enlaces no covalentes, con la mucina
conjuntiva! y mantener la formulación en contacto con los tejidos de la córnea.
Las soluciones pueden inyectarse no sólo por la vía intravítrea, sino también por otras vías, tales como las vías subconjunti-
val, subtenoniana, retrobulbar, supracoroidal y subretiniana.

Suspensiones

[NOTA-En esta sección se incluyen aquellos productos sólidos que, al reconstituirlos de acuerdo con las instrucciones en la
etiqueta, dan lugar a una suspensión.]
Se puede considerar el uso de suspensiones acuosas u oleosas por una variedad de razones, tales como las siguientes: 1)
medicamentos poco solubles en agua; 2) medicamentos con baja estabilidad acuosa; y 3) en casos en los que es necesario
incrementar el tiempo de contacto con el ojo e incrementar la humectación del ojo. El tamaño de partícula del medicamento a
menudo se reduce a niveles <1 O µm en un intento por evitar la producción excesiva de lágrimas.
Después de la instilación tópica, se espera que las partículas se mantengan en el fondo de saco y que el fármaco se disuelva
o se libere lentamente a partir de las estructuras poliméricas mediante difusión, disolución, degradación polimérica o intercam-
bio iónico.
Las suspensiones pueden inyectarse no sólo por la vía intravítrea, sino también por otras vías, tales como subconjuntival,
subtenoniana, retrobulbar, supracoroidal y subretiniana.

Ungüentos

Los ungüentos oftálmicos son productos semisólidos que por lo general están destinados a aplicación en la conjuntiva, la
córnea o el párpado. Tienen un mayor tiempo de contacto en comparación con muchas soluciones. Una base para ungüento
oftálmico adecuada no provoca irritación en el ojo y permite la difusión del fármaco a través de las secreciones que bañan el
ojo.
La mayoría de las bases oleosas y exentas de agua para ungüento oftálmico están compuestas de petrolato blanco y petrola-
to líquido (aceite mineral) o la base para ungüento oftálmico es una modificación de la fórmula a base de petrolato. Están
diseñadas para fundirse a la temperatura corporal. También se pueden usar otros tipos de bases lipofílicas para ungüento. Un
vehículo anhidro puede presentar ventajas para los medicamentos sensibles a la humedad.

Geles

Los productos semisólidos de tipo gel son una alternativa a los ungüentos tradicionales y se basan en el efecto de incremen-
tar la viscosidad para prolongar la retención del fármaco en el ojo. Se pueden usar varios tipos de agentes gelificantes, tales
como derivados del ácido poliacrílico, carbómero e hipromelosa.

Emulsiones

Las emulsiones oftálmicas tópicas por lo general se preparan disolviendo o dispersando el fármaco en una fase oleosa, agre-
gando agentes emulsionantes y de suspensión adecuados, y mezclando con agua vigorosamente para formar una emulsión
uniforme de aceite en agua. Cada fase por lo general se esteriliza antes o durante la carga en el vaso de mezclado. Se puede
usar homogenización de alto corte para reducir el tamaño de las gotitas de aceite a tamaños submicrónicos, lo cual puede
mejorar la estabilidad física de las micelas de aceite evitando que se fusionen. La forma farmacéutica resultante debe contener
gotitas de aceite pequeñas suspendidas de manera uniforme.
La justificación más común para desarrollar una emulsión oftálmica es la limitada solubilidad en agua de los fármacos. Los
fármacos pueden agregarse a la fase en la que sean solubles al inicio del proceso de fabricación, o el fármaco puede ser agre-
gado después de preparar la emulsión mediante un proceso adecuado de dispersión.
688 (771) Productos Oftálmicos / Pruebas Físicas USP 40

La estabilidad física de la emulsión puede medirse mediante técnicas de dispersión de luz que caracterizan la distribución del
tamaño de glóbulos en la fase oleosa. Se pueden agregar surfactantes adecuados para mejorar la estabilidad de la emulsión.

Tiras

Las tiras oftálmicas pueden tener diferentes usos oftálmicos que incluyen, entre otros, el uso como una herramienta de diag-
nóstico para visualizar defectos o aberraciones en el epitelio de la córnea o para medir la cantidad de producción de lágrimas.
Se fabrican con papel de filtro y pueden contener compuestos, tales como fluoresceína sódica. Se envasan de forma individual
para preservar la esterilidad hasta el momento de su uso.

Inyectables

Aunque los inyectables se consideran una forma farmacéutica para propósitos de nomenclatura, no se tratan como tales en
este capítulo. Referirse a las formas físicas apropiadas, tales como solución, suspensión u otras, para obtener información gene-
ral.

Insertos

Los insertos oftálmicos y los sistemas oculares son formas farmacéuticas sólidas de tamaño y forma apropiados que se colo-
can en el fondo del saco conjuntiva!, en el punto lagrimal (Figura 2) o en la córnea. Los insertos a menudo pueden retirarse, si
se presentan efectos adversos y proveer la liberación prolongada del fármaco durante cierto periodo. Los insertos pueden ser
erosionables (solubles) o no erosionables (insolubles). La liberación de fármacos a partir de los insertos solubles implica dos
etapas: 1) la liberación rápida de una porción del fármaco a medida que el fluido lagrimal penetra en el sistema; y 2) la libera-
ción lenta a medida que se forma una capa de gel en la superficie del inserto. Los escudos de colágeno fabricados a partir de
colágeno de la esclerótica porcina o de tejido dérmico bovino-y los dispositivos obtenidos por moldeo, extrusión o compre-
sión (minitabletas) de polímeros gelificantes-pertenecen a esta categoría de insertos solubles. Los polímeros bioerosionables
(p.ej., derivados de gelatina entrecruzada y poliésteres) pueden usarse para preparar insertos erosionables; estas matrices ac-
túan como depósitos o interactúan con las moléculas del fármaco a través de enlaces lábiles.

Figura 2. Punto lagrimal.

Los insertos solubles pueden tener el fármaco incorporado en matrices erosionables, tales como hidroxipropilcelulosa, ácido
hialurónico, carbómero o ácido poliacrílico. Los insertos solubles pueden colocarse en el fondo de saco inferior y por lo general
se disuelven dentro de las 12-24 horas. Los productos poliméricos erosionables se disuelven gradualmente mientras liberan el
fármaco y por lo tanto el paciente no tiene que retirar el inserto polimérico erosionable después de usarlo.
Los insertos insolubles pueden tener una estructura de matriz o un depósito. Su mecanismo de acción se basa en la difusión
de un fluido en el dispositivo, disolviendo el medicamento y la creación de una solución saturada que se libera al medio desde
el inserto mediante difusión. Estos insertos insolubles deben ser retirados después de cierto periodo.

Implantes

Los implantes se inyectan o implantan en el segmento anterior (intracameral, subconjuntival, subtenoniano u otras partes
del segmento anterior) o en las cavidades intravítreas, y los implantes pueden presentarse en diversas formas, tales como un
disco o una varilla delgada. Los implantes pueden fabricarse con polímeros no biodegradables o biodegradables.
Entre los tipos de implantes (polímero) sólidos no biodegradables se encuentran los implantes de tipo depósito que se an-
clan a la esclerótica, en los que el fármaco es liberado a través de un polímero semipermeable no biodegradable. Los implantes
tipo depósito pueden fabricarse a partir de una variedad de materiales, incluido el alcohol polivinílico-etilenvinilacetato. Los
polímeros biodegradables pueden usarse para formar implantes sólidos inyectables.
USP 40 Pruebas Físicas/ (771) Productos Oftálmicos 689

Productos de Combinación de Medicamento-Dispositivo

Una combinación de medicamento oftálmico-dispositivo es un producto que en la mayoría de los casos está constituido por
dos componentes. Uno es una forma farmacéutica que contiene los fármacos y el otro es un dispositivo que activará o facilitará
la penetración de los fármacos a partir de la forma farmacéutica en una región particular del ojo. Algunos ejemplos de los dis-
positivos son aquellos que generan ondas (calor o luz).
Este capítulo se aplica sólo al componente de la forma farmacéutica del producto de combinación de medicamento oftálmi-
co-dispositivo. Las reglamentaciones apropiadas de la FDA con respecto a los dispositivos médicos deben usarse para el com-
ponente del dispositivo.

CALIDAD DEL MEDICAMENTO

Los procedimientos y los criterios de aceptación para el análisis de productos oftálmicos se dividen en dos categorías: 1)
aquellos que evalúan los atributos generales de calidad, p.ej., identificación, potencia, pureza (e impurezas), esterilidad y partí-
culas; y 2) aquellos que evalúan el desempeño in vitro del producto, es decir, disolución o liberación de los fármacos a partir
del producto. Las pruebas de calidad evalúan la integridad de la forma farmacéutica, mientras que las pruebas de desempeño
evalúan la liberación de fármacos y otros atributos que se relacionan con el desempeño in vivo. En conjunto, las pruebas de
calidad y de desempeño aseguran la identidad, contenido, calidad, pureza y eficacia del medicamento. Este capítulo trata las
pruebas de calidad para productos oftálmicos. Las pruebas de desempeño (disolución/liberación de fármacos) se tratan en el
capítulo Productos Oftálmicos-Pruebas de Desempeño (1 771 ).

Pruebas Universales

En este capítulo, la división de las pruebas de calidad del producto en pruebas universales y en pruebas específicas no sigue
de manera estricta la guía de la ICH Q6A Specifications: Test Procedures and Acceptance Criterio far New Drug Substances and
New Drug Products: Chemical Substances (disponible en inglés en www.ich.org). En este capítulo, pruebas universales se refiere
a las pruebas que son aplicables a todos los productos oftálmicos, independientemente del tipo de forma farmacéutica.

DESCRIPCIÓN

Se debe proveer una descripción cualitativa del medicamento. Los criterios de aceptación deben contener la apariencia final
aceptable, que incluya la transparencia y el color de la forma farmacéutica y del envasado. Si el color cambia durante el alma-
cenamiento, puede ser apropiado un procedimiento cuantitativo. Esta no es una prueba farmacopeica, aunque forma parte de
la especificación del fabricante del medicamento.

IDENTIFICACIÓN

Las pruebas de identificación se tratan en las Advertencias y Requisitos Generales 5.40. Las pruebas de identificación deben
establecer la identidad del fármaco o fármacos presentes en el artículo y deben discriminar entre compuestos con estructuras
estrechamente relacionadas potencialmente presentes. Las pruebas de identidad deben ser específicas para los fármacos [p.ej.,
espectroscopía en el infrarrojo (IR, por sus siglas en inglés)]. Los métodos espectrofotométricos en el infrarrojo cercano (NIR,
por sus siglas en inglés) o Raman pueden ser aceptables para la identificación del medicamento. Los procedimientos de identi-
ficación de uso más amplio para fármacos contenidos en formas farmacéuticas son los procedimientos cromatográficos que
incluyen una comparación con los estándares apropiados (ver los capítulos Cromatografía (621) y Prueba de Identificación por
Cromatografía en Capa Delgada (201 )). La identificación mediante un solo tiempo de retención cromatográfico no constituye
una prueba específica.

VALORACIÓN

Se debe usar una prueba específica e indicadora de la estabilidad para determinar la concentración (contenido) del medica-
mento. Para casos en los que se justifique el uso de una valoración no específica, se deben usar otros procedimientos analíticos
para lograr la especificidad general. Se debe usar un procedimiento específico cuando exista evidencia de interferencia de exci-
pientes con la prueba de valoración no específica. Se encuentra disponible información adicional sobre valoraciones específicas
en los capítulos Antibióticos-Valoraciones Microbiológicas (81 ), (621) y Cromatografía fónica (1065).

IMPUREZAS

Pueden estar presentes impurezas del proceso, subproductos sintéticos y otras impurezas orgánicas e inorgánicas en el fár-
maco y en los excipientes usados en la fabricación del medicamento. Estas impurezas son controladas por las monografías de
fármacos y excipientes. Se deben monitorear las impurezas orgánicas que surgen de la degradación del fármaco en el medica-
690 (771) Productos Oftálmicos / Pruebas Físicas USP 40

mento y aquellas impurezas que surgen durante el proceso de fabricación del medicamento. Todos los artículos cumplen con
los requisitos de los capítulos Impurezas Elementales-Límites (232) y Disolventes Residuales (467).

PH
Ver el capítulo pH (791 ). Las lágrimas normales tienen un pH de aproximadamente 7,4. El ojo puede tolerar productos en un
intervalo de valores de pH desde aproximadamente 3,0 hasta aproximadamente 8,6, dependiendo de la capacidad de amorti-
guación de la formulación. El valor de pH de la formulación debe ser aquél en el que el producto sea más estable. Las formula-
ciones que se centran en los extremos del intervalo de pH aceptable tendrán una mejor aceptación por parte del paciente si las
formulaciones tienen una baja capacidad de amortiguación.

OSMOLARIDAD

Ver el capítulo Osmolalidad y Osmolaridad (785). Los productos oftálmicos pueden ser tolerados en un intervalo bastante
amplio de tonicidad (cloruro de sodio al 0,5%-5%, equivalente a aproximadamente 171-1711 mOsm/kg). Las soluciones hi-
potónicas se toleran mejor que las soluciones hipertónicas. Se deben tomar precauciones para asegurar que el producto man-
tiene su osmolaridad durante la vida útil. Se debe tener en cuenta cualquier posible contribución o interferencia del sistema de
envase.

PARTÍCULAS Y MATERIA EXTRAÑA

Todos los productos oftálmicos deben ser inspeccionados con respecto a la integridad del envase y, en la medida de lo posi-
ble, para determinar la presencia de partículas extrañas y observables (partículas visibles). Estas partículas indeseables surgen
de dos fuentes: extrínsecas (es decir, materia extraña); e intrínsecas o materia relacionada con el producto. La materia extrínse-
ca no puede asociarse con el producto o el proceso. La incorporación de partículas intrínsecas ocurre durante el montaje del
producto o resulta de cambios con el paso del tiempo. Una tercera categoría, la materia inherente, describe un estado físico o
partículas que son un atributo esperado del producto.
Se requiere una inspección del cien por ciento para los productos inyectables en envases transparentes a fin de eliminar los
envases finales con partículas visibles. Cuando sea difícil realizar una inspección del 100% del producto inyectable en el envase
final, como en el caso de los envases opacos, se pueden usar métodos alternativos para determinar la aceptabilidad. El capítulo
Partículas Visibles en Inyectables (790) provee guías adicionales para los métodos de inspección general y una definición de
"esencialmente exento de partículas visibles" para el cumplimiento de las partidas.
Son dos las categorías aplicables para la administración de productos en tejidos oculares. La administración intraocular inclu-
ye a todos los productos oftálmicos que atraviesan (penetran) el tejido conjuntivo, tales como la córnea y la esclerótica. La
administración extraocular de productos oftálmicos incluye a todos los demás componentes y espacios. Para el contenido de
partículas subvisibles, se deben seguir las guías de la USP. Los productos para uso intraocular deben cumplir con el capítulo
Partículas en Soluciones Oftálmicas (789). Los productos para uso extraocular deben cumplir con el capítulo Partículas en Inyec-
tables (788). Los aspectos a tener en cuenta para la evaluación del producto y los antecedentes para ambos métodos subvisi-
bles se encuentran en el capítulo Métodos para la Determinación de Partículas en Inyectables y Soluciones Oftálmicas (1 788).

ESTERILIDAD

Las formas farmacéuticas oftálmicas deben cumplir con los requisitos del capítulo Pruebas de Esterilidad (71 ). Si los ingredien-
tes específicos usados en la formulación no se prestan para las técnicas de esterilización de rutina, se pueden usar ingredientes
que cumplen con los requisitos de esterilidad descritos en el capítulo (71) usando una técnica de fabricación aséptica. El enva-
se primario para los productos oftálmicos deberá ser estéril al momento de llenado y de cierre. Es obligatorio que los envases
primarios para los productos oftálmicos estén sellados y que sean a prueba de alteración intencional de modo que se asegure
la esterilidad al momento del primer uso.

CONSERVANTES ANTIMICROBIANOS

Se deben agregar agentes anti microbianos a los productos que se envasan en envases que permiten retirar o administrar
dosis múltiples, a menos que prevalezca una de las siguientes condiciones: 1) se proveen instrucciones distintas en la mono-
grafía individual; 2) la sustancia contiene un radionucleído con una media vida física de <24 horas; y 3) el medicamento, sin
agentes adicionales, tiene la suficiente capacidad microbicida para cumplir con los requisitos del capítulo Pruebas de Eficacia
Antimicrobiana (51 ). Las sustancias deben cumplir con los requisitos de los capítulos (51) y Agentes Antimicrobianos-Contenido
(341 ). Se deben establecer criterios de aceptación para el contenido de conservantes antimicrobianos en productos de unida-
des múltiples.
USP 40 Pruebas Físicas/ (771) Productos Oftálmicos 691

ENDOTOXINAS BACTERIANAS

Todos los medicamentos oftálmicos inyectados deben prepararse de manera que minimicen las endotoxinas bacterianas se-
gún se definen en el capítulo Prueba de Endotoxinas Bacterianas (85). Los límites son no más de 0,5 UE/mL para los productos
de irrigación oftálmica y no más de 2,0 UE/dosis/ojo para los medicamentos inyectados o implantados. Por lo general, esta
prueba no es requerida para los productos oftálmicos de aplicación tópica. Este capítulo no trata los límites de endotoxina para
los dispositivos que se inyectan o implantan.

UNIFORMIDAD DE UNIDADES DE DOSIFICACIÓN

Esta prueba es aplicable a las formas farmacéuticas envasadas en envases unitarios. Incluye tanto la masa de la forma farma-
céutica y el contenido del fármaco en la forma farmacéutica. La prueba puede realizarse mediante uniformidad de contenido o
variación de peso (ver el capítulo Uniformidad de Unidades de Dosificación (905)).

CONTENIDO DE LOS ENVASES

Se debe determinar el contenido de los envases de los productos oftálmicos (ver el capítulo Llenado Mínimo (755)).

SUSTANCIAS LIXIVIABLES Y SUSTANCIAS EXTRAÍBLES

El sistema de envase no debe interactuar física ni químicamente con el producto de ninguna manera que altere el conteni-
do, la calidad o la pureza del medicamento. El sistema de envase debe cumplir con los requisitos de los capítulos Tapones E/as-
toméricos para Inyectables (381 ), Envases-Vidrio (660), Materiales Plásticos de Construcción (661.1) y Sistemas de Envases Plásti-
cos para Uso Farmacéutico (661.2). Se puede encontrar información adicional sobre los sistemas de envase en los capítulos
Evaluación de Sustancias Extraíbles Relacionadas con Envases Farmacéuticos y Sistemas de Administración (1663) y Evaluación de
Sustancias Lixiviables Relacionadas con Envases Farmacéuticos y Sistemas de Administración (1664). La evaluación de posibles sus-
tancias lixiviables y sustancias extraíbles, y el establecimiento de criterios de aceptación para estos compuestos deben tener en
cuenta la evaluación de riesgos del producto, su indicación y su sistema de envase.
Además, se debe tener en cuenta que una evaluación de riesgos del impacto de las sustancias extraíbles/sustancias lixivia-
bles, en una vía de administración tópica o intraocular es una actividad desafiante. Las evaluaciones toxicológicas o de seguri-
dad de las sustancias lixiviables o de las sustancias extraíbles en los componentes de envases primarios o secundarios por lo
regular no están disponibles para vías de administración oftálmicas. Una evaluación de riesgos puede incluir la evaluación de la
toxicología y la seguridad a partir de otras vías de administración y una evaluación de la lngesta Diaria Total de las sustancias
extraíbles/sustancias lixiviables que se están evaluando. La preponderancia de dichas evaluaciones conlleva a una estimación
del riesgo de las sustancias extraíbles/sustancias lixiviables mediante la administración ocular al paciente.

INTEGRIDAD DEL ENVASE-CIERRE

El sistema de envase debe cerrarse o sellarse de manera tal que se prevenga la contaminación o la pérdida de contenidos y
debe demostrar que es a prueba de alteración intencional. La validación de la integridad del envase debe demostrar la ausen-
cia de penetración de contaminación microbiana o de impurezas químicas o físicas (ver el capítulo Evaluación de la Integridad
del Envase-Productos Estériles (1207)).

Pruebas Específicas

VISCOSIDAD

Un incremento en la viscosidad aumenta el tiempo de residencia en el ojo. Sin embargo, la difusión del fármaco desde la
formulación hacia el ojo podría verse inhibida debido a la alta viscosidad del producto. Los ungüentos oftálmicos están diseña-
dos para tener una viscosidad muy alta a fin de prolongar el tiempo de residencia en el ojo. La inclusión de la evaluación de la
viscosidad en la especificación del producto debe basarse en el tipo de forma farmacéutica y en si los cambios en la viscosidad
del producto afectarán su desempeño. Esta no es una prueba farmacopeica, aunque forma parte de la especificación del fabri-
cante del medicamento. Ver los capítulos Viscosidad-Métodos Capilares (911 ), Viscosidad-Métodos Rotatorios (912) y Viscosi-
dad-Método de Bola Rodante (913).

CONTENIDO DE ANTIOXIDANTES

Si el medicamento presenta antioxidantes, se deben establecer pruebas para determinar el contenido de los mismos, a me-
nos que se pueda detectar la degradación por oxidación usando otro método de prueba, tal como un análisis de impurezas. Se
692 (771) Productos Oftálmicos/ Pruebas Físicas USP 40

deben establecer criterios de aceptación para el contenido de antioxidantes, los cuales deben basarse en los niveles de antioxi-
dantes necesarios para mantener la estabilidad del producto en todas las etapas a lo largo del uso propuesto y de su vida útil.

CAPACIDAD DE RESUSPENSIÓN/CAPACIDAD DE REDISPERSIÓN

Se debe tener en consideración el establecimiento de una buena estabilidad física de una suspensión. Si las partículas sedi-
mentan y eventualmente producen un residuo en la parte inferior del envase, deben ser redispersadas rápidamente al momen-
to de su uso para lograr la uniformidad de la dosificación.

TAMAÑO DE PARTÍCULA Y DISTRIBUCIÓN DEL TAMAÑO DE LA PARTÍCULA

Se debe evaluar el potencial de cualquier cambio en el tamaño de la partícula de las suspensiones y de las emulsiones oftál-
micas mediante el análisis de estabilidad (ver el capítulo Medición del Tamaño de Partícula por Difracción de Luz (429)).

TAMAÑO DE LAS GOTAS

Para los medicamentos oftálmicos dispensados como gotas, los tamaños de las gotas por lo general están entre 20 y 70 µL.
El tamaño de las gotas puede controlarse por peso o por volumen y por lo regular se evalúa durante el desarrollo del producto.

SUSTANCIAS AGREGADAS

Se pueden agregar sustancias adecuadas a los ungüentos oftálmicos para aumentar su estabilidad, a menos que se prohíba
su uso en la monografía individual correspondiente, y siempre y cuando sean inocuas en las cantidades administradas y no
interfieran con la eficacia terapéutica o con las respuestas a las valoraciones y las pruebas especificadas. Por lo regular, deben
evaluarse durante el desarrollo del producto. Se prohíbe el uso de ingredientes cuyo único objetivo sea otorgar color, olor o
sabor.

(776) MICROSCOPÍA ÓPTICA

La microscopía óptica para la caracterización de partículas por lo general es una técnica adecuada para partículas con un
tamaño de 1 µm o mayor. El límite inferior está determinado por la resolución del microscopio. El límite superior es menos
estricto y está determinado por las dificultades que presenta para caracterizar partículas de mayor tamaño. Además de la mi-
croscopía óptica, existen diversas técnicas alternativas para la caracterización de partículas. La microscopía óptica es una técni-
ca sumamente recomendable para caracterizar partículas que no son esféricas, método que también puede constituir la base
de otros métodos de calibración más rutinarios y más rápidos.

APARATO

Emplear un microscopio estable y protegido de vibraciones. Es necesario que el aumento del microscopio (resultado del au-
mento del objetivo, ocular y de otros componentes adicionales) sea suficiente para caracterizar adecuadamente hasta la partí-
cula más pequeña de la muestra en análisis. Buscar para cada intervalo de aumento, el mayor valor de apertura numérica del
objetivo. En algunos casos, se recomienda usar los filtros polarizadores con analizadores y placas de retardo adecuadas. Con
objetivos acromáticos se recomienda emplear un filtro cromático de poca transmisión espectral, de preferencia apocromáticos,
y son necesarios para obtener los colores que correspondan en la microfotografía. Con la lámpara y los accesorios colocados
debajo de la platina del microscopio se deben emplear condensadores corregidos al menos por aberración esférica. La apertura
real del diafragma del condensador y la presencia de aceites de inmersión afectan la apertura numérica del condensador de los
accesorios ubicados por debajo de la platina y es necesario que ésta coincida con la del objetivo en las condiciones de uso.

AJUSTE

Es de suma importancia que todos los elementos del sistema óptico estén alineados con precisión y que el enfoque sea el
adecuado. Enfocar los elementos según las recomendaciones del fabricante del microscopio. Se recomienda alinear el eje con
precisión.
USP 40 Pruebas Físicas/ (776) Microscopía Óptica 693

ILUMINACIÓN

Para que la iluminación sea adecuada, es necesario que la intensidad de la luz sea uniforme y regulable en todo el campo
visual. Se recomienda emplear la iluminación de Kohler. Si se trabaja con partículas coloreadas, elegir el color de los filtros para
controlar el contraste y el detalle de la imagen.

CARACTERIZACIÓN VISUAL

Es necesario que el aumento y la apertura numérica sean suficientes para permitir la correcta resolución de las imágenes de
las partículas a caracterizar. Determinar el aumento real con un micrómetro de objetivo calibrado para ajustar un micrómetro
ocular. Una forma de reducir los errores al mínimo es trabajar con un aumento suficiente para que la imagen de la partícula
sea de al menos 1O divisiones del ocular. Calibrar cada objetivo por separado. Para calibrar la escala del ocular, verificar que la
escala del micrómetro del objetivo y la escala del ocular estén alineadas. De esta forma, se puede determinar con precisión la
distancia entre las divisiones del ocular del portaobjeto. En algunos casos, es necesario emplear distintos aumentos para carac-
terizar materiales con una amplia distribución de tamaños.

CARACTERIZACIÓN FOTOGRÁFICA

Si se emplean métodos fotográficos para determinar el tamaño de las partículas, tomar las precauciones necesarias para que
el objetivo esté bien enfocado en el plano de la emulsión fotográfica. Fotografiar un micrómetro de objetivo calibrado con una
película fotográfica de velocidad, resolución y contraste adecuados para determinar el aumento real. La exposición y el proce-
samiento deben ser idénticos para las fotografías de la muestra de prueba y para la determinación del aumento. Tanto la reso-
lución del microscopio como la exposición y los procesos de revelado e impresión influyen en el tamaño aparente de la ima-
gen fotográfica.

PREPARACIÓN DEL MEDIO DE MONTAJE

El medio de montaje se selecciona según las propiedades físicas de la muestra de prueba. Para ver los detalles de los bordes
de la muestra, es necesario un contraste adecuado, aunque no excesivo, entre la muestra y el medio de montaje. Para distin-
guir las partículas individuales en estudio, es necesario que estén dispuestas en un mismo plano y con la dispersión adecuada.
Además, es necesario que las partículas sean representativas de la distribución del tamaño de las partículas y que no sufran
ninguna alteración durante la preparación del medio de montaje. Tomar las precauciones necesarias para que se cumpla este
importante requisito. Para seleccionar el medio de montaje adecuado, considerar la solubilidad del analito.

CARACTERIZACIÓN DE LA CRISTALINIDAD

Si la monografía individual de un fármaco indica caracterizar la cristalinidad, se puede determinar por microscopía óptica.
Montar algunas partículas de la muestra en aceite mineral y colocar el preparado sobre un portaobjetos de vidrio limpio, a
menos que la monografía individual especifique algo diferente. Analizar el preparado con un microscopio de luz polarizada: al
girar la platina del microscopio, las partículas presentan birrefringencia (interferencia de colores) y posiciones de extinción.

PRUEBA DE LÍMITE DEL TAMAÑO DE PARTÍCULAS POR MICROSCOPÍA

Pesar una cantidad adecuada del polvo a analizar (entre 1Omgy100 mg, por ejemplo) y suspenderla en 1O mL de un me-
dio adecuado, en el que el polvo no se disuelva y agregar, si fuera necesario, un agente humectante. Suspender las partículas
en un medio de densidad igual o similar y agitar para mantener la homogeneidad de la suspensión de partículas. Introducir
una porción de la suspensión homogénea en una celda de conteo adecuada, observar en un área del microscopio que corres-
ponda a no menos de 1O µg del polvo a analizar. Contar las partículas cuya dimensión máxima supera el límite de tamaño
indicado. El límite de tamaño y el número máximo de partículas que exceden el límite se definen para cada sustancia.

CARACTERIZACIÓN DEL TAMAÑO DE PARTÍCULAS

La complejidad de la medición del tamaño de las partículas varía según la forma de la partícula, y el número de partículas
caracterizadas debe ser suficiente para garantizar un grado de incertidumbre aceptable en los parámetros de medición. La nor-
ma ISO 9276, por ejemplo, proporciona información adicional sobre la medición del tamaño de las partículas, tamaño de la
muestra y análisis de los datos. Si se trata de partículas esféricas, el tamaño está definido por el diámetro. Si se trata de partícu-
las irregulares, hay distintas definiciones del tamaño de partícula. En general, para partículas de forma irregular, la caracteriza-
ción del tamaño debe incluir información sobre el tipo de diámetro medido y sobre la forma de la partícula. A continuación se
describen varias medidas usadas comúnmente para el tamaño de partículas (ver la Figura 7):
694 (776) Microscopía Óptica/ Pruebas Físicas USP 40

\ Diámetro de Feret

Diámetro de Martin
Diámetro del área proyectada
Intercepción máxima horizontal

Figura 1: Medidas comúnmente usadas para el tamaño de partículas.

Diámetro de Feret-EI diámetro de la partícula en el punto en el que divide una partícula orientada de forma aleatoria en
dos áreas proyectadas iguales.
Diámetro de Martin-EI diámetro de la partícula en el punto en el que divide una partícula orientada de forma aleatoria en
dos áreas proyectadas iguales.
Diámetro del Área Proyectada-El diámetro de un círculo cuya área proyectada es la misma que la de la partícula.
Longitud-La medida más larga tomada de extremo a extremo de la partícula orientada en paralelo a la escala del ocular.
Ancho-La medida más larga de la partícula tomada en ángulo recto a la longitud.

CARACTERIZACIÓN DE LA FORMA DE LA PARTÍCULA

Si se trata de partículas de forma irregular, la caracterización del tamaño debe incluir información sobre la forma de la partí-
cula. Verificar la homogeneidad del polvo usando el aumento que corresponda. A continuación se describen algunos de los
descriptores usados comúnmente para la forma de la partícula (ver la Figura 2):

º---ª
Cubos o Esferas
g--=7-J
~¡/
Placa
Escama

~~
~
_____ ........ ,L.--- ---
Columnar

Figura 2: Medidas usadas comúnmente para la forma de la partícula.

Acicular-Partícula fina, en forma de aguja, de ancho y espesor similares.

Columnar-Partícula larga y fina, de ancho y espesor superiores a los de una partícula acicular.
Escama-Partícula fina y plana, de longitud y ancho similares.
Placa-Partículas planas de longitud y ancho similares pero de mayor espesor que las escamas.
Listón-Partícula larga y fina en forma de hoja.
Cubos o esferas-Partículas cúbicas o esféricas, de largo, ancho y espesor de dimensiones similares.
 USP 40 Pruebas Físicas/ (781) Rotación Óptica 695

CONSIDERACIONES GENERALES

La partícula se considera, en general, la unidad discreta más pequeña. Una partícula puede estar en estado de gotita líquida
o semisólida, un cristal único o policristalina, en estado amorfo o como aglomerado. En algunos casos, las partículas están aso-
ciadas. El grado de asociación se puede describir en los siguientes términos:
Laminar-Placas superpuestas.
Agregado-Masa de partículas adheridas.
Aglomerado-Partículas amalgamadas o cementadas.
Conglomerado-Mezcla de dos o más tipos de partículas.
Esferulita-Grupo con estructura radial.
Drusa-Partícula recubierta de pequeñísimas partículas.
La partícula se puede describir en los siguientes términos:
Bordes-Angulares, redondeados, lisos, filosos o fragmentados.
Óptico-Color (usando filtros de compensación del color apropiados), transparente, translúcida, opaca.
Defectos-Oclusiones, inclusiones.
Las características de la superficie se pueden describir en los siguientes términos:
Resquebrajada-División parcial, rotura o fisura.
Lisa-Sin irregularidades, proyecciones ni áreas rugosas.
Porosa-Con orificios o canales.
Áspera-No lisa, con protuberancias o dispareja.
Punteada-Con pequeñas hendiduras.

(781) ROTACIÓN ÓPTICA

INTRODUCCIÓN

Muchas sustancias farmacéuticas son ópticamente activas dado que rotan el plano incidente de la luz polarizada de manera
que la luz transmitida emerge en un ángulo cuantificable con respecto al plano de la luz incidente. Esta propiedad es caracte-
rística de algunos cristales y de muchos líquidos o soluciones de sólidos de uso farmacéutico. En aquellos casos en que un líqui-
do o un soluto en solución posea esta propiedad, por lo general se debe a la presencia de uno o varios centros asimétricos,
normalmente un átomo de carbono con cuatro sustituyentes diferentes. El número de isómeros ópticos es 2n, en donde n es el
número de centros asimétricos. La polarimetría, medición de la rotación óptica de un artículo farmacéutico, puede ser el único
medio conveniente para distinguir entre sí isómeros ópticamente activos y, por lo tanto, es un criterio importante de identidad
y pureza.
Las sustancias que poseen la capacidad de mostrar propiedades ópticas rotatorias son quirales. Aquéllas que rotan la luz en el
sentido de las agujas del reloj, observando hacia la fuente de iluminación, son dextrógiras, o isómeros ópticos (+), y aquéllas que
rotan la luz en el sentido contrario a las agujas del reloj se llaman levógiras o isómeros ópticos (-). (Los símbolos d- y 1- que
anteriormente se empleaban para indicar isómeros dextro- y levógiros ya no se utilizan, debido a la confusión con los símbolos
D- y L-, que se refieren a las configuraciones relacionadas con el D-gliceraldehído. Los símbolos R y S así como a y fJ también
se emplean para indicar la configuración, es decir, el ordenamiento de los átomos o grupos de átomos en el espacio.)
Las propiedades físicoquímicas de las sustancias quirales no superponibles que rotan el plano de la luz polarizada la misma
cantidad de grados pero en direcciones opuestas, llamadas enantiómeros, son idénticas, salvo por esta propiedad y por sus
reacciones con otras sustancias quirales. Los enantiómeros presentan a menudo diferencias profundas en sus características far-
macológicas y toxicológicas, debido al hecho de que los receptores biológicos y las enzimas son quirales. Muchos artículos de
origen natural, como por ejemplo los aminoácidos, las proteínas, los alcaloides, los antibióticos, los glicósidos y los azúcares,
existen como compuestos quirales. La síntesis de estos compuestos a partir de materiales no quirales usualmente resulta en
cantidades iguales de enantiómeros, es decir, los racematos. Los racematos tienen una rotación óptica neta nula y sus propie-
dades físicas pueden diferir de las de los enantiómeros que los componen. Para obtener los isómeros ópticos individuales pue-
den emplearse métodos de síntesis estereoselectivos o estereoespecíficos o de separación de mezclas racémicas.
La medición de la rotación óptica se realiza empleando un polarímetro. 1 La ecuación general usada en polarimetría es:

[a]' = 1OOa
} le

1 Pueden encontrarse calibradores adecuados disponibles en la Office of Standard Reference Materials, National lnstitute of Standards and Technology, NIST (Ofi-
cina de Materiales de Referencia Estándar, Instituto Nacional de Normas y Tecnología), Gaithersburg, MD 20899, como lotes vigentes de Materiales de Referencia
Estándar, Dextrosa y Sacarosa. Como alternativa, la calibración puede controlarse empleando un Estándar de Referencia de Polarización, que consiste en una placa
de cuarzo montada sobre un soporte perpendicular al paso de la luz. Estos estándares, normalizados respecto a estándares del NIST, se encuentran disponibles en
Rudolph Research Analytical, ubicado en 55 Newburgh Road, Hackettstown, NJ 07840, EE.UU.
696 (781) Rotación Óptica / Pruebas Físicas USP 40

en donde [a] es la rotación específica a la longitud de onda A., tes la temperatura, a es la rotación observada en grados (º), I es
la longitud de paso en decímetros y e es la concentración del analito en g por 100 ml. Por lo tanto, [a] es 100 veces el valor
medido, en grados(º), para una solución que contiene 1 g en 100 mL, medido en una celda con una longitud de paso de 1,0
decímetro en determinadas condiciones de longitud de onda de luz incidente y temperatura. Para algunos artículos Farmaco-
peicos, especialmente los líquidos, tales como los aceites esenciales, el requisito de rotación óptica se expresa en función de la
rotación observada a, medida en las condiciones definidas en la monografía correspondiente.
Históricamente, la polarimetría se realizaba empleando un instrumento en el cual se estimaba el grado de rotación óptica al
igualar visualmente la intensidad de los campos divididos. Por este motivo, se empleaba con mayor frecuencia la línea D de la
lámpara de sodio a la longitud de onda de 589 nm en el espectro visible.2 La rotación específica determinada en la línea D se
expresa con el símbolo:

y gran parte de los datos disponibles se expresan de esta forma. El empleo de longitudes de onda menores, como por ejemplo
las obtenibles con las líneas de la lámpara de mercurio, aisladas a través de filtros de máxima transmitancia, aproximadamente
a 546; 436; 405; 365 y 325 nm en un polarímetro fotoeléctrico, ha demostrado proporcionar ventajas en sensibilidad con una
reducción consiguiente de la concentración del compuesto de prueba. En general, la rotación óptica observada a 436 nm es
aproximadamente el doble y a 365 nm aproximadamente tres veces la observada a 589 nm. 2 La reducción de la concentra-
ción del soluto requerida para la medición a veces puede lograrse mediante la conversión de la sustancia en análisis en una
sustancia que tenga una rotación óptica significativamente mayor. La rotación óptica también resulta afectada por el disolven-
te empleado para la medición y esto debe especificarse en todos los casos.
En la actualidad, es práctica común emplear otras fuentes de luz, tales como lámparas de xenón o halógenas de tungsteno,
con filtros apropiados, puesto que éstas pueden ser menos costosas, además de ser de larga duración y tener un amplio rango
de longitudes de onda de emisión con respecto a las fuentes de luz tradicionales.

PROCEDIMIENTOS

Rotación Específica

La referencia Rotación Específica (781 S) en una monografía significa que esa rotación específica se calculará a partir de las
rotaciones ópticas observadas en la Solución de prueba o Solución muestra, obtenidas según se indica en ese mismo texto. A
menos que se indique de otro modo, las mediciones de rotación óptica se realizan en un tubo de 1,0 dm a 589 nm y a 25º C. 2
Cuando se emplea un polarímetro fotoeléctrico, se hace una sola medición corregida por el blanco de disolvente. Cuando se
emplea un polarímetro visual, se utiliza el promedio de no menos de cinco determinaciones, corregidas por la lectura del mis-
mo tubo con un blanco de disolvente. La temperatura, que se aplica a la solución o al líquido en análisis, debe mantenerse con
una aproximación de 0,5º del valor establecido. Emplear la misma celda para la muestra y el blanco. Mantener la misma orien-
tación angular de la celda en cada lectura. Colocar la celda de tal manera que la luz la atraviese en la misma dirección cada
vez. La rotación específica, a menos que se especifique algo diferente, se calcula con respecto a la sustancia seca cuando se
especifica Pérdida por Secado en la monografía correspondiente o con respecto a la sustancia anhidra cuando se especifica
Determinación de Agua.
La rotación óptica de las soluciones se debe determinar dentro de los 30 minutos posteriores a la preparación. En el caso de
sustancias que puedan sufrir racemización o mutarotación, se deben tomar precauciones para estandarizar el tiempo entre la
adición del soluto al disolvente y la introducción de la solución en el tubo polarimétrico.

Rotación Angular

A menos que se indique de otro modo, la referencia Rotación Angular (781 A) en una monografía significa que la rotación
óptica del líquido sin diluir se mide en un tubo de 1,0 dm a 589 nm y a 25º C, corregida por la lectura del tubo vacío y seco. 2

2 Todas las referencias a longitudes de onda son en vacío. La línea D de sodio es 589,44 en vacío y 589,3 en aire.
USP 40 Pruebas Físicas/ (782) Espectroscopía de Dicroísmo Circular 697

(782) ESPECTROSCOPÍA DE DICROÍSMO CIRCULAR VIBRACIONAL

1. INTRODUCCIÓN
2. CALIFICACIÓN DE ESPECTRÓMETROS DE DICROISMO CIRCULAR VIBRACIONAL
2.1 Calificación de la Instalación
2.2 Calificación Operacional
2.3 Calificación de Desempeño
3. PROCEDIMIENTO
3.1 Muestra
3.2 Estándar
3.3 Análisis
4. VALIDACIÓN Y VERIFICACIÓN
4.1 Validación
4.2 Precisión
4.3 Verificación

1. INTRODUCCIÓN
El dicroísmo circular vibracional (VCD, por sus siglas en inglés) es una forma de espectroscopía óptica quiral en la cual las
moléculas quirales tienen espectros distintos de cero con intensidades que son idénticas para los pares de imágenes especula-
res (enantiómeros) de las moléculas quirales, pero con signos opuestas con respecto a la intensidad cero. Para una sustancia
con moléculas quirales, dos propiedades importantes son 1) la configuración absoluta (AC, por sus siglas en inglés), que indica
cuál de las dos formas de imágenes especulares está presente; y 2) exceso enantiomérico (EE, por sus siglas en inglés, también
denominado pureza enantiomérica), el exceso fracciona! de un enantiómero de una molécula quiral sobre su enantiómero de
imagen especular. El capítulo principal en la USP-NF que trata la quiralidad molecular es Rotación Óptica (781 ). La rotación
óptica (OR, por sus siglas en inglés) y el dicroísmo circular electrónico (ECD, por sus siglas en inglés) son las formas tradiciona-
les de espectroscopía óptica quiral, mientras que el dicroísmo circular vibracional es una forma más nueva de espectroscopía
óptica quiral que contiene más información sobre la estructura molecular y, recientemente, se ha adoptado de forma más am-
plia para uso en la industria farmacéutica.
En este capítulo, la metodología requerida para el uso del dicroísmo circular vibracional se describe en términos de la califi-
cación del instrumento; de la calibración de la señal y la intensidad; de los procedimientos, la validación y la verificación de la
medición del dicroísmo circular vibracional; del cálculo y del análisis estadístico requeridos para la determinación de la configu-
ración absoluta y el exceso enantiomérico de los medicamentos quirales. El dicroísmo circular vibracional es la extensión del
dicroísmo circular electrónico desde la región de las transiciones electrónicas en las regiones UV y visible del espectro hacia las
transiciones vibracionales en la región del infrarrojo (IR).
El dicroísmo circular vibracional se define como:

LIA =diferencia en la absorbancia IR

AL = absorbancia de la muestra para radiación polarizada circular izquierda (LCP, por sus siglas en inglés)
AR = absorbancia de la muestra para radiación polarizada circular derecha (RCP, por sus siglas en inglés)
La intensidad IR no polarizada se define como el promedio de las intensidades de radiación polarizada circular izquierda y
radiación polarizada circular derecha:

A = absorbancia IR
AL = absorbancia de la muestra para radiación polarizada circular izquierda (LCP, por sus siglas en inglés)
AR = absorbancia de la muestra para radiación polarizada circular derecha (RCP, por sus siglas en inglés)
Las intensidades IR de enantiómeros son idénticas, mientras que los enantiómeros tienen intensidades de dicroísmo circular
vibracional iguales y con señales opuestas.
Para información sobre la teoría y los principios de las mediciones de dicroísmo circular vibracional, así como una explica-
ción más detallada de la aplicación del dicroísmo circular vibracional a los problemas de interés farmacéutico, ver Espectrosco-
pía de Dicroísmo Circular Vibracional-Teoría y Práctica (1782).

2. CALIFICACIÓN DE ESPECTRÓMETROS DE DICROISMO CIRCULAR VIBRACIONAL

Esta sección sobre calificación se divide en tres subsecciones: 2. 7 Calificación de la Instalación (IQ, por sus siglas en inglés),
2.2 Calificación Operacional (OQ, por sus siglas en inglés) y 2.3 Calificación de Desempeño (PQ, por sus siglas en inglés) de un
instrumento de dicroísmo circular vibracional por transformada de Fourier [(FT)-VCD]. Aunque un instrumento de dicroísmo
698 (782) Espectroscopía de Dicroísmo Circular / Pruebas Físicas USP 40

circular vibracional puede estar basado en un espectrómetro dispersivo de barrido, no existe un espectrómetro de dicroísmo
circular vibracional de tal tipo disponible comercialmente, por lo que no se tendrá en consideración. Se pueden encontrar de-
talles adicionales sobre la calificación de instrumentos en Calificación de Instrumentos Analíticos (1058).

2.1 Calificación de la Instalación

Los requisitos de calificación de la instalación proveen evidencia de que el hardware y el software han sido instalados de
forma correcta en la ubicación deseada. Un instrumento FT-VCD es un espectrómetro infrarrojo por transformada de Fourier
(FT-IR), sensible, y que mide la diferencia de polarización circular. Su instalación requiere una superficie de mesada estable,
acceso a aire o nitrógeno secos para purgar el vapor de agua y salidas eléctricas estándar. La evidencia de la calificación de la
instalación implica asegurar que el interferómetro IR está barriendo, que sus moduladores fotoelásticos [PEM, por sus siglas en
inglés] están operando y que el hardware electrónico está interactuando tanto con el aparato principal de FT-IR como con los
moduladores fotoelásticos. La evidencia final para la calificación de la instalación es que el software para adquisición de un
espectro de dicroísmo circular vibracional indica que está listo para ser usado por el operador.

2.2 Calificación Operacional

En la calificación operacional, se caracteriza el desempeño de un instrumento usando un estándar de calificación con propie-
dades espectrales conocidas para verificar que el sistema opera dentro de las especificaciones indicadas. El propósito de la cali-
ficación operacional es demostrar que el desempeño del instrumento es adecuado. La calificación operacional es una verifica-
ción de los parámetros operacionales clave y debe realizarse después de la instalación y después de efectuar reparaciones y/o
mantenimiento.
Las pruebas de calificación operacional descritas en las siguientes secciones representan únicamente ejemplos típicos. Se
pueden usar otras pruebas y muestras para establecer las especificaciones para la calificación operacional. Los vendedores de
instrumentos a menudo cuentan con muestras y parámetros de prueba disponibles como parte del paquete de calificación de
la instalación/calificación operacional. Los criterios de aceptación provistos en esta sección son aplicables al uso general, mien-
tras que las especificaciones para instrumentos y aplicaciones particulares puede variar, dependiendo de los métodos analíticos
usados y de la exactitud del resultado final deseada.

CARACTERIZACIÓN DEL DESEMPEÑO DEL INSTRUMENTO

Los espectrómetros FT-VCD miden de forma simultánea el espectro de dicroísmo circular vibracional y el espectro IR original.
El espectro de dicroísmo circular vibracional se obtiene de un interferograma que se genera a partir de la combinación de la
modulación de la polarización dependiente de moduladores fotoelásticos de alta frecuencia con las frecuencias de Fourier,
mientras que el espectro IR original proviene del interferograma FT-IR convencional basado únicamente en las frecuencias de
Fourier del instrumento. Parte del desempeño del instrumento se deriva de la operación FT-IR subyacente, mientras que la par-
te remanente del desempeño del instrumento se deriva de aquellos componentes que se asocian únicamente con la operación
FT-VCD. Los criterios combinados de FT-IR y FT-VCD son la exactitud del número de onda y linealidad de la absorbancia,
mientras que aquellos asociados de forma única con la operación VCD son la calibración de la señal y la intensidad de dicroís-
mo circular vibracional, la exactitud de la línea base del haz vacío, las desviaciones de la línea base asociadas con la muestra y
los niveles de artefactos, la estabilidad de la línea base y la reproducibilidad espectral, y la relación señal-ruido. Según se descri-
be en (1782), se usan comúnmente dos muestras estándar para especificar el desempeño de dicroísmo circular vibracional.
Para la calibración de la señal y la intensidad, se usa a-pineno puro como estándar de validación, mientras que para las carac-
terísticas de la línea base, se usa una solución de alcanfor en tetracloruro de carbono (CCl 4 ) como el estándar de calificación.
Los espectros de dicroísmo circular vibracional presentados en el capítulo (1782) sirven como ejemplos de las características de
desempeño de los espectros típicos para la calibración de la señal e intensidad del dicroísmo circular vibracional, estabilidad de
la línea base y relación señal-ruido.

EXACTITUD DEL NÚMERO DE ONDA

La exactitud del número de onda de los instrumentos FT-VCD se basa en la exactitud del número de onda correspondiente
de la operación FT-IR original. Esta exactitud se determina mediante el conteo de franja del láser visible que opera junto con el
interferómetro FT-IR. La calibración de la frecuencia es exacta dentro de la resolución espectral del instrumento y no requiere
estándar de calibración. La exactitud de la frecuencia del número de onda debe verificarse midiendo el espectro IR de una
película de poliestireno de 35 µm de espesor, según se describe en el capítulo de la USP-NF sobre espectroscopía en el infra-
rrojo medio, Espectroscopía en el Infrarrojo Medio (854), con información adicional disponible en Espectroscopía en el Infrarrojo
Medio-Teoría y Práctica (1854). Debido a que los espectros FT-VCD y FT-IR se miden de forma simultánea por la acción del
mismo interferómetro, la exactitud del número de onda del espectro de dicroísmo circular vibracional es la misma que la de la
operación FT-IR del instrumento.
USP 40 Pruebas Físicas/ (782) Espectroscopía de Dicroísmo Circular 699

LINEALIDAD Y ESTABILIDAD

Los instrumentos FT-IR comerciales tienen una linealidad excelente, siempre que el detector infrarrojo no esté saturado. Los
espectros FT-IR son particularmente propensos a la saturación del detector, debido a que la intensidad del espectro completo
está presente de forma simultánea en el detector. La saturación del detector se puede evitar mediante el uso de un filtro de
paso de longitud de onda o ajuste apropiado de la ganancia del preamplificador para asegurar que el máximo del interferogra-
ma FT-IR cae dentro del intervalo de la capacidad de voltaje del preamplificador. La marca distintiva del inicio de la falta de
linealidad es la distorsión del interferograma FT-IR que puede llevar a valores de absorbancia FT-IR negativos en la frecuencia
final del rango espectral, lo cual es claramente incorrecto para una muestra absorbente. La reducción de la apertura, la inser-
ción de pantallas o los filtros de densidad neutra se pueden usar para evitar la saturación del detector.
Estas mismas consideraciones aplican a la linealidad de las mediciones FT-VCD. La linealidad del dicroísmo circular vibracio-
nal es más sensible al inicio de la saturación del detector que el espectro IR original. Los espectros de dicroísmo circular vibra-
cional son inestables y están distorsionados cuando el espectro FT-IR original presenta saturación y en algunos casos la lineali-
dad en el dicroísmo circular vibracional no se reestablece hasta que la intensidad FT-IR esté muy por debajo de la saturación.
La saturación puede ser analizada variando el rendimiento del instrumento cambiando la longitud de paso óptico de la mues-
tra y asegurándose de que todos los puntos a través del espectro sean cambiados por el mismo factor, es decir, no se presen-
tan cambios de forma relativos en el espectro. Estos cambios relativos en la forma deben ser menores que el nivel de ruido
aparente o, como máximo, 2% (1,00 ± 0,02), dependiendo de la exactitud requerida para las mediciones de dicroísmo circu-
lar vibracional.

CORRECCIÓN DE FASE, CALIBRACIÓN DE LA SEÑAL Y DE LA INTENSIDAD

El espectro de dicroísmo circular vibracional sin procesar se mide como el cociente entre la transformada de Fourier del in-
terferograma de dicroísmo circular vibracional y la transformada de Fourier del interferograma IR. Ambos interferogramas de-
ben someterse a corrección de fase antes de realizar la transformada de Fourier. La corrección de fase para el IR es simple, pero
la corrección de fase para el interferograma de dicroísmo circular vibracional requiere transferir un archivo de fase de un inter-
ferograma de dicroísmo circular vibracional que represente sólo intensidades positivas. La mayoría de los instrumentos FT-VCD
comerciales proveen dichos archivos de fase para la medición de dicroísmo circular vibracional.
Posteriormente, el espectro medido sin procesar de dicroísmo circular vibracional debe calibrarse de tal modo que se pro-
duzcan los espectros de dicroísmo circular vibracional con las señales e intensidades correctas. Las señales pueden determinar-
se midiendo el estándar de calificación de (-)-alcanfor o (+)-alcanfor en solución de tetracloruro de carbono y comparándolo
con un espectro de dicroísmo circular vibracional estándar previamente publicado de esta molécula, tal como el provisto en el
capítulo (1 782). Cuando todas las señales concuerdan estamos en el caso donde el signo se ha establecido correctamente. Si
todas las señales son opuestas estamos en el caso donde la fase de la detección sincrónica de dicroísmo circular vibracional
(amplificador sincrónico o lock-in, o procesamiento numérico) debe cambiarse 180º para revertir las señales de todas las ban-
das de dicroísmo circular vibracional, de positivas a negativas y de negativas a positivas.
La calibración de intensidades de dicroísmo circular vibracional se lleva a cabo dividiendo el dicroísmo circular vibracional sin
procesar por una curva de calibración que representa la magnitud de la intensidad del dicroísmo circular vibracional unitario
para el espectrómetro VCD. La forma de la curva de calibración sigue una función Bessel de primer orden, que a su vez depen-
de de las configuraciones del modulador fotoelástico que genera radiación polarizada circular izquierda y polarizada circular
derecha. El máximo de la curva de calibración corresponde al valor de número de onda máximo establecido en el control del
modulador fotoelástico. La curva de calibración para una configuración de modulador fotoelástico dada se puede obtener a
partir de los puntos de corte de curvas generadas colocando una lámina de onda múltiple seguida por un polarizador en lugar
de la muestra y midiendo el espectro de dicroísmo circular vibracional como usualmente se hace. Los instrumentos para di-
croísmo circular vibracional comerciales proveen tales curvas, y la curva de calibración correcta debe usarse para cada configu-
ración de número de onda del modulador fotoelástico. Para un ejemplo de una curva de calibración para la configuración del
modulador fotoelástico a 1200 cm- 1, ver el capítulo (1782).
Después de la calibración de las intensidades del instrumento de dicroísmo circular vibracional, una medición de una solu-
ción de 0,9 M de ( +)-R-alcanfor en tetracloruro de carbono medida en una celda de longitud de paso de 100 µm debe ser
aproximadamente 2 x 1 0- 4 • Después de sustraer la línea base, según se describe más adelante y en el capítulo (1782), esta dife-
rencia debe ser un valor de pico positivo LIA de+ 1 x 10-4 unidades de absorbancia a 1240 cm- 1 y un valor de pico negativo LIA
de -1x10- 4 a 1040 cm- 1 •

CARACTERÍSTICAS DE LA LÍNEA BASE DEL HAZ VACÍO

Para evitar niveles significativos de desviaciones de la línea base a partir de las características de una muestra, la línea base
del haz vacío para un instrumento VCD debe ser lo más cercana posible al cero real de la medición. Un estándar mínimo para
los espectrómetros FT-VCD es contar con líneas base del haz vacío lo suficientemente cercanas a cero de modo que las desvia-
ciones del cero real sean <25% del intervalo de intensidad de absorbancia máxima positiva a negativa de una solución de 0,9
M de (+)-R-alcanfor en tetracloruro de carbono, medida en una celda de longitud de paso de 100 µm. Esta magnitud, citada
anteriormente, es aproximadamente 2 x 10-4 , según se determina a partir de un valor de pico positivo de+ 1 x 10-4 a 1240
700 (782) Espectroscopía de Dicroísmo Circular / Pruebas Físicas USP 40

cm- 1 y un valor de pico negativo de -1 x 10-4 a 1040 cm- 1 • El valor de 25% de este intervalo de intensidad es aproximadamen-
te 5 x 10-5 • Las desviaciones de la línea base del haz vació de dicroísmo circular vibracional (máximo a mínimo), a lo largo del
intervalo en el IR medio de 900 a 1800 cm- 1 , no deben exceder ±5 x 10-4 y no deben desviarse más de +5 x 10-4 o -5 x 10-4
del cero de la intensidad de dicroísmo circular vibracional a lo largo de este intervalo de longitud de onda.

LÍNEAS BASE DE LA MUESTRA Y ARTEFACTOS DE ABSORCIÓN

Una prueba importante para una medición de dicroísmo circular vibracional es el espectro de dicroísmo circular vibracional
de una muestra racémica con respecto al de la línea base del instrumento vacío o el espectro de dicroísmo circular vibracional
de un disolvente no quiral, tal como tetracloruro de carbono. A causa de los posibles cambios en la línea base debidos a la
celda de la muestra, es preferible comparar el dicroísmo circular vibracional del disolvente con el de una solución de la muestra
racémica de la molécula quiral en el mismo disolvente. Ambos deben tener un dicroísmo circular vibracional cero, pero la solu-
ción racémica puede presentar artefactos (desviaciones) de la línea base en la ubicación de las bandas de absorción. Las ban-
das de absorción cambian el índice de refracción de la muestra y pueden ocasionar desviaciones de la línea base que son espe-
cíficas de la molécula de la muestra. Si dichos artefactos de absorción están presentes, la única forma de recuperar el espectro
de dicroísmo circular vibracional libre de artefactos es sustrayendo la mezcla racémica (cantidades iguales de ambos enantió-
meros) de la del espectro de dicroísmo circular vibracional medido. Como alternativa, la sustracción del espectro de dicroísmo
circular vibracional del enantiómero opuesto se divide por 2, debido a que la intensidad del dicroísmo circular vibracional se
duplica si el espectro del dicroísmo circular vibracional de un enantiómero se sustrae de aquél del otro. El estándar de califica-
ción usado para medir la línea base del dicroísmo circular vibracional con una muestra absorbente presente es alcanfor racémi-
co en una solución de tetracloruro de carbono contra el espectro de dicroísmo circular vibracional de tetracloruro de carbono
puro en el intervalo de 900-1800 cm-1, donde solo se presentan bandas de absorción de alcanfor y ninguna de tetracloruro de
carbono. Ambas muestras deben tener un dicroísmo circular vibracional cero y una línea base que sea uniforme con respecto a
las bandas de absorción de alcanfor.

RELACIÓN SEÑAL-RUIDO

La relación señal-ruido de una medición de dicroísmo circular vibracional puede determinarse a partir de la curva de ruido
generada por la sustracción de una mitad de los barridos de la transformada de Fourier de una medición a la otra mitad, can-
celando así la señal y exponiendo el nivel de ruido. El nivel de ruido varía a lo largo del espectro y se incrementa cuando el
nivel de luz que alcanza el detector se reduce, ya sea debido al desempeño general del instrumento en una región espectral
particular o directamente dentro de las bandas de absorción de la muestra. El nivel de ruido en la curva de ruido se puede
reducir incrementando el tiempo de medición del espectro. El nivel de ruido es inversamente proporcional a la raíz cuadrada
del tiempo de medición. Esto se ilustra con un ejemplo particular en las Figuras 9 y 7O del capítulo (1782).
Suavizar un espectro de dicroísmo circular vibracional sin incrementar el tiempo de medición reducirá el tamaño de las des-
viaciones por ruido entre picos, pero no reducirá la exactitud general de una medición de dicroísmo circular vibracional, debi-
do a que la línea base del dicroísmo circular vibracional, y por ende la intensidad del dicroísmo circular vibracional relativa a la
línea base cero, experimentará el mismo nivel de variaciones, aunque el espectro de dicroísmo circular vibracional parezca pre-
sentar menos ruido después del suavizado. Para conocer el verdadero nivel del ruido y, por ende, el nivel de incertidumbre de
un espectro de dicroísmo circular vibracional, todas las funciones de suavizado, si las hubiera, deberán deshabilitarse. El ruido
puede reducirse legítimamente reduciendo la resolución espectral. Al evaluar el nivel de ruido de la medición de dicroísmo
circular vibracional, se deben especificar la resolución y la apodización del interferograma.

2.3 Calificación de Desempeño

La calificación de desempeño determina si un instrumento es capaz de cumplir con los requisitos del usuario para todos los
parámetros que pueden afectar la calidad de la medición. Dependiendo del uso típico, las especificaciones para calificación del
desempeño pueden ser diferentes de las especificaciones de calificación operacional del fabricante; sin embargo, para el uso
general en un rango de moléculas quirales y condiciones de muestreo típicas, las especificaciones para la calificación operacio-
nal serán las mismas que las requeridas para la calificación de desempeño. Para métodos validados, se pueden usar pruebas de
control de desempeño específicas, también conocidas como pruebas de aptitud del sistema, en lugar de los requisitos de califi-
cación de desempeño.
Los procedimientos específicos, criterios de aceptación e intervalos de tiempo para caracterizar el desempeño dependen del
instrumento y de la aplicación prevista. Demostrar el desempeño estable del instrumento durante periodos extensos provee
cierta garantía de que se pueden tomar mediciones confiables a partir de los espectros de la muestra de prueba.
Las pruebas de estabilidad a largo plazo particulares que pueden llevarse a cabo para la evaluación de la calificación de de-
sempeño más allá de las realizadas para la calificación de la instalación o la calificación operacional son las siguientes. Se reco-
mienda realizar una medición de 60 minutos de una solución de 0,9 M de (+)-R-alcanfor en tetracloruro de carbono, medida
en una celda de longitud de paso de 100 µm, entre diferentes aplicaciones del espectrómetro VCD para asegurar que se man-
tengan las señales, las intensidades y la relación señal-ruido del espectro de dicroísmo circular vibracional establecidas como
USP 40 Pruebas Físicas/ (782) Espectroscopía de Dicroísmo Circular 701

prueba de calificación durante la calificación operacional. Esto es particularmente importante en caso de interrupción en el su-
ministro eléctrico o un plazo de inactividad largo entre mediciones.
Si se promedia durante periodos largos, por ejemplo toda la noche, es importante que la estabilidad de la línea base del
dicroísmo circular vibracional y del espectro de dicroísmo circular vibracional de la muestra sean estables con el paso del tiem-
po y que la relación señal-ruido mejore según lo esperado con la raíz cuadrada del tiempo de medición o número de barridos
del interferómetro, según se ilustra en el ejemplo del capítulo (1 782). En general, la estabilidad debe mantenerse dentro del
nivel de ruido de la medición de dicroísmo circular vibracional. Debido a que las intensidades del dicroísmo circular vibracional
son por lo general de tres a cuatro órdenes de magnitud más pequeñas que la intensidad IR original, la estabilidad del instru-
mento para el desempeño FT-IR del mismo es por lo general mayor con el paso del tiempo con respecto al nivel de ruido del
espectro de dicroísmo circular vibracional.

3. PROCEDIMIENTO

La medición del espectro de dicroísmo circular vibracional de una muestra sigue las mismas reglas generales que la medición
de un espectro IR en lo que respecta a la espectroscopía en el IR medio descrita en el capítulo (854).

3.1 Muestra

Se puede medir un espectro de dicroísmo circular vibracional en todos los tipos de celdas de transmisión IR estándar, ya sea
para líquidos puros o soluciones. Para sólidos dispersos en comprimidos de bromuro de potasio (KBr), pastas o películas finas,
se recomienda realizar etapas adicionales para asegurarse de que no se presenten artefactos que surgen de la birrefringencia
lineal de la muestra según se describe en el capítulo (1 782 ) para métodos avanzados de instrumentación, tales como la modu-
lación dual del modulador fotoelástico o las celdas de muestra rotatorias.
Debido a la importancia del control de ruido en una medición de dicroísmo circular vibracional, la absorbancia de una
muestra no debe exceder A= 1,0 en la región de interés de la medición. Para la absorbancia >1,0, no se presentan suficiente
radiación en el detector y el ruido domina el espectro de dicroísmo circular vibracional. El nivel óptimo de absorbancia con
respecto a la referencia de la muestra (haz vacío o disolvente) es aproximadamente 0,4. Se debe ajustar la longitud de paso
y/o la concentración de la muestra de modo que la absorbancia promedio sea aproximadamente 0,4-0,5 en la región de inte-
rés, con límites de O, 1-1,0. Para muestras con un intervalo amplio de absorbancia, se puede realizar más de una medición con
valores de absorbancia promedio diferentes para asegurar que se obtiene un espectro de dicroísmo circular vibracional de cali-
dad adecuada en todo el intervalo de interés.
Para realizar una medición de dicroísmo circular vibracional en solución, se debe encontrar primero un disolvente que disuel-
va una cantidad adecuada de soluto para conseguir un nivel de absorbancia deseado. Los disolventes sin enlaces CH son los
preferidos para este propósito; estos incluyen tetracloruro de carbono, cloroformo deuterado (CDCl 3) o dimetil sulfóxido deu-
terado (DMSO-d 6 ). La celda IR debe tener ventanas transparentes en la región del IR medio, con niveles generalmente bajos de
birrefringencia lineal. Los materiales comúnmente usados son fluoruro de bario (BaF 2 ), que tiene una buena transmisión hasta
800 cm- 1 y fluoruro de calcio (CaF 2 ), que se usa si se requiere cobertura únicamente hasta 1100-1200 cm-1, como en el caso
de soluciones acuosas.

3.2 Estándar
Para asegurar que el analista puede usar una celda IR para una medición de transmisión de una solución, se recomienda
llevar a cabo una medición de calificación operacional estándar de una solución de 0,9 M de (+)-R-alcanfor en tetracloruro de
carbono usando una celda de fluoruro de bario de 100 µm. Para diferentes opciones de concentración o longitud de paso, se
puede usar la dependencia lineal de estas cantidades de la LIA medida para asegurar que se ha logrado una medición exacta
con las señales e intensidades correctas.

3.3 Análisis

Los espectros de dicroísmo circular vibracional, una vez medidos, pueden ser analizados de diversas formas, dependiendo de
la aplicación prevista. La aplicación principal del dicroísmo circular vibracional en la industria farmacéutica es la determinación
de la configuración absoluta junto con un cálculo de dicroísmo circular vibracional usando un paquete de software computa-
cional para química cuántica. Una segunda aplicación es la determinación del exceso enantiomérico de una muestra, ya sea
con el propósito de determinar el exceso enantiomérico de una muestra o para monitorear el exceso enantiomérico de una o
más especies durante el curso de una reacción química que implique especies quirales. Lograr el nivel más alto de exactitud en
la determinación del exceso enantiomérico requiere el uso de un paquete de software quimiométrico que emplee el rango
completo del espectro de dicroísmo circular vibracional, por oposición a usar la frecuencia de una sola banda o número de
onda. Otras aplicaciones del dicroísmo circular vibracional consisten en usarlo con una base de datos estándar de espectros de
dicroísmo circular vibracional y de IR para asegurar de forma simultánea la identidad, la configuración absoluta y el exceso
enantiomérico correctos de una sustancia quiral, por ejemplo, como una identificación de la materia prima quiral. El dicroísmo
702 (782) Espectroscopía de Dicroísmo Circular / Pruebas Físicas USP 40

circular vibracional también puede usarse para especificar la configuración absoluta y el exceso enantiomérico de un medica-
mento en presencia de excipientes aquirales o quirales, tales como carbohidratos. Estas aplicaciones se describen con mayor
detalle en el capítulo (1782).

4. VALIDACIÓN Y VERIFICACIÓN

4.1 Validación

El objetivo de la validación de un procedimiento de dicroísmo circular vibracional, al igual que con la validación de cualquier
proceso analítico, es demostrar que la medición es adecuada para el propósito previsto. La aplicación de espectroscopía VCD
es un tanto distinta a las técnicas espectroscópicas vibracionales convencionales debido a que no es una técnica primaria. Más
bien, es la espectroscopía de diferencia de polarización de la espectroscopía IR original, que es la que ha sido usada por si sola
durante décadas como técnica de identificación y cuantificación primaria según se describe para la espectroscopía en el IR me-
dio en el capítulo (854). El espectro de dicroísmo circular vibracional diferencial complementa el espectro IR original con un
nuevo conjunto de intensidades en cada posición de una banda de absorción IR. El nuevo conjunto de intensidades posterior-
mente revela las propiedades estereoespecíficas de las moléculas de la muestra que deben ser quirales para tener un espectro
de dicroísmo circular vibracional distinto de cero. Existen dos propiedades primarias de una muestra de una molécula quiral:
una es la configuración absoluta de la especie quiral dominante (enantiómero dominante); y la segunda es el exceso enantio-
mérico (EE) del enantiómero dominante sobre su enantiómero menor (imagen especular). Asimismo, el espectro de dicroísmo
circular vibracional contiene información adicional sobre la conformación en solución, o la distribución conformacional de la
molécula, información de la cual se podría disponer en menor detalle, si la hubiere, utilizando solamente el espectro IR origi-
nal. También existen aplicaciones que requieren validación para el uso de espectroscopía VCD para el uso combinado de la
medición del dicroísmo circular vibracional de una sustancia para la que existe un espectro de referencia con configuración
absoluta y exceso enantiomérico conocidos. Cualquier medición subsiguiente del espectro de dicroísmo circular vibracional,
junto con la medición simultánea de su espectro IR original, confirma en una medición la identidad molecular de la muestra así
como la configuración absoluta y el exceso enantiomérico. Dichas aplicaciones son útiles, por ejemplo, para la identificación
de la configuración absoluta y el exceso enantiomérico de materia prima quiral, para la cual no existe actualmente una meto-
dología establecida con una única medición. El dicroísmo circular vibracional también puede confirmar, en una única medi-
ción, la configuración absoluta y el exceso enantiomérico de un medicamento final, incluyendo la quiralidad (si la hubiere) de
los excipientes.
Antes de la validación del dicroísmo circular vibracional para la determinación de la configuración absoluta, se debe llevar a
cabo una validación general del instrumento midiendo el espectro de dicroísmo circular vibracional de (-)-5-a-pineno o (+)-R-
a-pineno puro usando una celda de 75 µm. El espectro de dicroísmo circular vibracional calibrado y corregido por línea base
debe generar un máximo de pico positivo de LlA igual a aproximadamente +5 x 10-4 unidades de absorbancia a 1220 cm- 1 y
un valor de pico negativo de aproximadamente -4 x 10-4 a 1130 cm- 1 • El nivel de ruido debe ser comparable con el estableci-
do para el instrumento durante la fase de control operativo de la calificación del instrumento descrita anteriormente. Debido a
que el espectro de dicroísmo circular vibracional de a-pineno es relativamente amplio, una recolección de 20 minutos provee
una relación señal-ruido suficiente para verificar que el instrumento opera con los niveles de intensidad, señal y ruido de di-
croísmo circular vibracional correctos para las aplicaciones de dicroísmo circular vibracional que se describen a continuación.
La validación para la determinación de la configuración absoluta mediante dicroísmo circular vibracional se puede lograr
mediante la comparación exitosa del espectro de dicroísmo circular vibracional medido del estándar de validación, (-)-5-a-
pineno puro, con su espectro de dicroísmo circular vibracional calculado mediante química cuántica. El éxito se logra midien-
do el espectro de dicroísmo circular vibracional corregido por línea base con suficiente relación señal-ruido para que las seña-
les, frecuencias e intensidades relativas de las bandas principales de dicroísmo circular vibracional puedan compararse clara-
mente con las señales, frecuencias e intensidades relativas de dicroísmo circular vibracional correspondientes del espectro de
dicroísmo circular vibracional calculado. Si las señales, frecuencias e intensidades relativas concuerdan, entonces la configura-
ción absoluta de la muestra medida de (-)-a-pineno es la misma que para el modelo de 5-a-pineno que ha sido construido
para calcular esta molécula estándar. Si las frecuencias e intensidades relativas de dicroísmo circular vibracional son opuestas
después de la calibración de la señal del instrumento, entonces la configuración absoluta de la muestra es opuesta (la imagen
especular) a la del enantiómero usado para la calibración. Una comparación exitosa requiere el pretratamiento de los datos de
dicroísmo circular vibracional para la sustracción de la línea base y la calibración de la intensidad. También requiere un proce-
dimiento computacional que sea exacto en el cálculo de espectros de dicroísmo circular vibracional. Finalmente, se debe usar
un programa para evaluar de forma imparcial el grado de concordancia entre los espectros de dicroísmo circular vibracional
medidos y calculados de modo que uno se base en algo más que en la evaluación visual por parte del analista de la concor-
dancia, o la falta de concordancia, entre un espectro medido y un espectro calculado. Un ejemplo de este procedimiento está
disponible en el capítulo (1 782) así como en las referencias citadas en el capítulo (1782).
La validación de la espectroscopía VCD para la determinación de exceso enantiomérico se logra graficando el exceso enan-
tiomérico predicho por el dicroísmo circular vibracional en función del exceso enantiomérico para una muestra de (-)-5-a-pi-
neno puro para una serie de muestras con distintos valores de exceso enantiomérico porcentual (%EE) en el intervalo de un EE
de 100% hasta un EE de 0% . El exceso enantiomérico predicho por el dicroísmo circular vibracional implica la medición de los
espectros de dicroísmo circular vibracional a una resolución espectral y tiempo de recolección seleccionados para lograr el ni-
USP 40 Pruebas Físicas/ (782) Espectroscopía de Dicroísmo Circular 703

vel deseado de relación señal-ruido, seguida por un pretratamiento de los espectros de dicroísmo circular vibracional medidos,
mediante la sustracción de la línea de base. La predicción del exceso enantiomérico puede basarse en el tamaño de una sola
banda de dicroísmo circular vibracional para las muestras con dicroísmo circular vibracional distinto, normalizado por la inten-
sidad IR constante; aunque, de forma más general y con mejor exactitud, se usa para cada espectro el rango completo de las
bandas de dicroísmo circular vibracional a lo largo del espectro mediante un paquete de software quimiométrico. La validación
se acompaña de una medición de la exactitud del exceso enantiomérico porcentual mediante un análisis de correlación entre-
cruzada, generando la raíz cuadrática media (RMS, por sus siglas en inglés). Se provee un ejemplo de dicha determinación del
exceso enantiomérico porcentual mediante dicroísmo circular vibracional para (-)-5-a-pineno puro, junto con referencias bi-
bliográficas, en el capítulo (1782).
De forma más general, se requiere validación cuando un método está destinado para uso como alternativa al procedimiento
oficial para el análisis de un artículo oficial. El objetivo es demostrar que la medición de dicroísmo circular vibracional es ade-
cuada para el propósito previsto; para ejemplos de los diversos tipos de mediciones, ver Validación de Procedimientos Farmaco-
peicos (1225). Para la determinación del exceso enantiomérico porcentual, la creación de una gráfica lineal de valores reales
contra valores de exceso enantiomérico porcentual predichos por dicroísmo circular vibracional, establece que la magnitud de
los espectros de dicroísmo circular vibracional normalizados por IR, según se evalúa con quimiometría, presentan una lineali-
dad, rango, exactitud, especificidad, precisión, límite de detección, límite de cuantificación y robustez suficientes con respecto
a la detección del exceso enantiomérico porcentual.
El capítulo (1225) provee definiciones y guías generales sobre la validación de los procedimientos analíticos sin indicar los
criterios de validación específicos para cada característica. La intención de las siguientes secciones es proveer al usuario con
criterios de validación específicos que representan las expectativas mínimas para la tecnología de dicroísmo circular vibracio-
nal. Para cada aplicación particular, podrían ser necesarios criterios más estrictos para demostrar la aptitud para el uso previsto.

EXACTITUD

La exactitud puede ser determinada mediante la medición de un espectro de dicroísmo circular vibracional del estándar de
validación establecido de (-)-a-pineno o (+)-a-pineno puro, según se presenta, por ejemplo, en el capítulo (1782), y verifican-
do que los signos e intensidades medidas del espectro de dicroísmo circular vibracional concuerdan con el espectro de dicroís-
mo circular vibracional estándar con una aproximación al nivel de ruido de la medición. En particular, el espectro de dicroísmo
circular vibracional debe generar un máximo de pico positivo de LIA igual a aproximadamente +5 x 10-4 unidades de absorban-
cia a 1220 cm- 1 y un valor de pico negativo de aproximadamente -4 x 10-4 a 1130 cm- 1 • Esta validación asegura la calibración
exacta del espectrómetro VCD y que este tenga los signos correctos para las bandas de dicroísmo circular vibracional.

4.2 Precisión

REPETIBILIDAD

Criterios de validación: La medición de los espectros de dicroísmo circular vibracional de la muestra estándar de validación,
(+)-a-pineno o (-)-a-pineno puro, en bloques de 20 minutos con variaciones en los espectros de dicroísmo circular vibracional
a, o por debajo del nivel de ruido de cada bloque de 20 minutos que es aproximadamente LIA igual o menor que 1 x 1 o-s.

PRECISIÓN INTERMEDIA

Se debe establecer el efecto de eventos aleatorios en la precisión analítica de los criterios de validación de la medición de
dicroísmo circular vibracional. Las variables típicas incluyen realizar el análisis en días distintos, usando instrumentos distintos o
que dos analistas o más lleven a cabo el método. Como mínimo, cualquier combinación de al menos dos de estos factores
para totalizar seis experimentos proveerá una estimación de la precisión intermedia. (Por ejemplo, esto podría ser dos analistas
en cada uno de 3 días, o dos analistas o dos conjuntos de equipos en 2 días para cada combinación de analista-equipo.)
Criterios de validación: Los Criterios de validación son los mismos que los de Repetibilidad.

ESPECIFICIDAD

La especificidad no es una métrica requerida para la determinación de la configuración absoluta. Para la medición de exceso
enantiomérico para más de una especie quiral en un solo conjunto de mediciones, el procedimiento analítico, incluyendo el
análisis quimiométrico, debe ser capaz de evaluar de forma inequívoca el exceso enantiomérico de especies quirales en la pre-
sencia de otros componentes esperados, es decir, el disolvente y otras especies no quirales.
Criterios de validación: Los Criterios de validación se demuestran cumpliendo el requisito de Exactitud.
704 (782) Espectroscopía de Dicroísmo Circular/ Pruebas Físicas USP 40

LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN

Para la determinación de la configuración absoluta, no hay límite de cuantificación (QL, por sus siglas en inglés). El límite de
cuantificación para el exceso enantiomérico puede determinarse llevando a cabo una determinación de la cuantificación del
exceso enantiomérico porcentual para el estándar de validación de dicroísmo circular vibracional de a-pineno puro para una
serie de valores de exceso enantiomérico, llevando a cabo un análisis quimiométrico de valores de exceso enantiomérico de
dicroísmo circular vibracional predicho y realizando una determinación del error cuadrático medio, según se ilustra, por ejem-
plo, en el capítulo (1 782).
Criterios de validación: El procedimiento analítico debe ser capaz de determinar el analito con precisión y exactitud a un
nivel equivalente a aproximadamente el 1% de exceso enantiomérico para a-pineno puro.

LINEALIDAD

Se debe demostrar una relación lineal entre la concentración y la respuesta del analito, preparando no menos de 5 solucio-
nes estándar con concentraciones que abarquen la concentración anticipada de la solución de prueba. Posteriormente, se de-
be evaluar la curva estándar usando métodos estadísticos apropiados, tales como regresión de mínimos cuadrados, para el
área o la altura del pico de una banda de dicroísmo circular vibracional seleccionada o para todo el espectro, usando análisis
quimiométrico tal como la regresión de mínimos cuadrados parciales. Para experimentos que no generan una relación lineal
entre la concentración y la respuesta del analito, se deben aplicar métodos estadísticos apropiados para describir la respuesta
analítica.
Criterios de validación: Los Criterios de validación aceptan el coeficiente de correlación por encima de 0,95 para una gráfica
lineal de exceso enantiomérico real en función del exceso enantiomérico predicho por dicroísmo circular vibracional.

ROBUSTEZ

La confiabilidad de un método analítico debe demostrarse mediante cambios deliberados en parámetros experimentales, ta-
les como cambios en la resolución espectral, concentración o longitud de paso para la medición de dicroísmo circular vibracio-
nal.

4.3 Verificación

La reglamentaciones sobre Buenas Prácticas de Fabricación Vigentes de los EE.UU. [Título 21 del CFR 21 l .194(a)(2)] indican
que los usuarios de los procedimientos analíticos, según se describe en la USP-NF, no están obligados a validar dichos procedi-
mientos cuando se proveen en una monografía. En vez de esto, los usuarios simplemente deben verificar la aptitud en condi-
ciones reales de uso.
El objetivo de una verificación de procedimiento es demostrar que el procedimiento, según se prescribe en una monografía
específica, puede ser llevado a cabo por los analistas con exactitud, especificidad y precisión adecuadas usando los instrumen-
tos y las soluciones muestra de moléculas quirales disponibles. Si la verificación del procedimiento farmacopeico siguiendo la
monografía no es exitosa, el procedimiento podría no ser adecuado para el uso con el artículo en análisis (para información
adicional, ver Verificación de Procedimientos Farmacopeicos (1226)). Podría ser necesario desarrollar y validar un procedimiento
alternativo según lo permitido por las Advertencias Generales, 6.30 Métodos y Procedimientos Alternativos y Armonizados.
La verificación de los métodos farmacopeicos debe incluir, como mínimo, la realización de los parámetros de validación para
especificidad, exactitud, precisión y límite de cuantificación, cuando resulte apropiado, según se indica en 4.1 Validación.

(785) OSMOLALIDAD Y OSMOLARIDAD

INTRODUCCIÓN

La presión osmótica tiene una importancia fundamental en todos los procesos biológicos donde hay difusión de solutos o
transferencia de líquidos a través de membranas. La ósmosis sucede cuando un disolvente, pero no las moléculas de soluto,
pasa a través de una membrana semipermeable desde regiones de menor a mayor concentración para llegar al equilibrio. Es
muy importante para los profesionales conocer las presiones osmóticas para poder determinar si una solución parenteral es
hipoosmótica, isoosmótica o hiperosmótica. Una medición cuantitativa de la presión osmótica facilita la dilución requerida pa-
ra producir una solución isoosmótica con respecto a la sangre entera.
USP 40 Pruebas Físicas/ (785) Osmolalidad y Osmolaridad 705

PRESIÓN OSMÓTICA
La presión osmótica de una solución depende del número de partículas en la solución y, por lo tanto, se la considera como
una propiedad coligativa. Una partícula puede ser una molécula o un ión o una especie agregada (por ejemplo, un dímero)
que puede existir en forma diferenciada en solución. Una solución presenta un comportamiento ideal cuando no hay interac-
ción entre los solutos y el disolvente, excepto cuando las moléculas del disolvente están unidas a los solutos mediante enlaces
de hidrógeno o enlaces covalentes coordinados. En el caso de tales soluciones que contienen un soluto no disociado, la pre-
sión osmótica (n) es directamente proporcional a su molalidad (el número de moles de soluto por kilogramo de disolvente):
n = (pRT/1 OOO)m
en donde pes la densidad del disolvente a la temperatura T (en la escala absoluta); Res la constante universal del gases; y mes
la molalidad de la solución. Para el caso de una solución real que contiene más de un soluto, la presión osmótica se calcula por
la fórmula:

en donde v¡ es el número de partículas formadas por la disociación de una molécula del iésimo soluto (el número ordinal del
soluto); v¡ = 1 para solutos no iónicos (que no se disocian); m¡ es la molalidad del iésimo soluto (el número ordinal del soluto);
y <Dm,i es el coeficiente osmótico molal del iésimo soluto. El coeficiente osmótico molal tiene en cuenta la desviación de una
solución con respecto al comportamiento ideal. Su valor depende de la concentración del soluto o los solutos en la solución,
de sus propiedades químicas y de sus características iónicas. El valor del coeficiente osmótico molal de un soluto se puede de-
terminar experimentalmente midiendo el descenso del punto de congelación a diferentes concentraciones molales. A concen-
traciones de interés farmacéutico, el valor del coeficiente osmótico molal es menos de uno. El coeficiente osmótico molal dis-
minuye al aumentar la concentración del soluto (Tabla 7).

OSMOLALIDAD
La osmolalidad de una solución Sm se representa mediante la fórmula

La osmolalidad de una solución real se corresponde con la molalidad de la solución ideal que contiene solutos que no se diso-
cian y se expresa en osmoles o miliosmoles por kilogramo de disolvente (Osmol por kg o mOsmol por kg, respectivamente),
una unidad que es similar a la molalidad de una solución. Así, la osmolalidad es la medida de la presión osmótica ejercida por
una solución real a cada lado de una membrana semipermeable. Al igual que la presión osmótica, otras propiedades coligati-
vas de la solución, tales como la disminución de la presión de vapor, la elevación del punto de ebullición y el descenso del
punto de congelación, también están directamente relacionadas con la osmolalidad de la solución. Así, la osmolalidad de una
solución se determina típicamente con la mayor exactitud y conveniencia midiendo el descenso del punto de congelación
(ti T1):

ti Tf = k1Sm

en donde k1 es la constante crioscópica molal, que es una propiedad del disolvente. Para el agua, el valor de k1 es 1,860º por
Osmol. Es decir, 1 Osmol de un soluto agregado a 1 kg de agua hace descender el punto de congelación en 1,860º.

OSMOLARIDAD
La osmolaridad de una solución es una cantidad teórica expresada en osmoles por L (Osmol por L) de una solución y se usa
ampliamente en la práctica clínica porque expresa los osmoles en función del volumen. La osmolaridad no se puede medir
pero se calcula teóricamente a partir del valor de osmolalidad medido experimentalmente.
A veces, la osmolaridad (s) se calcula teóricamente a partir de las concentraciones molares:

en donde v¡ es la que se define anteriormente y C¡ es la concentración molar del iésimo soluto (el número ordinal del soluto) en
solución. Por ejemplo, la osmolaridad de una solución que se prepara disolviendo 1 g de vancomicina en 100 mL de solución
de cloruro de sodio al 0,9% se puede calcular de la siguiente manera:
[3 x 1O g/L/1449,25(peso mol. de vancomicina) + 2 x 9 g/L/58,44(peso mol. de cloruro de sodio)] x 1000 = 329 mOsmol/L
El resultado sugiere que la solución es ligeramente hiperosmótica dado que la osmolalidad de la sangre está entre 285 y 31 O
mOsmol por kg. Sin embargo, la solución ha resultado ser hipoosmótica y tiene una osmolalidad determinada experimental-
mente de 255 müsmol por kg. 1 El ejemplo ilustra que los valores de osmolaridad calculados teóricamente a partir de la con-

1 Kastango, E.S. y Hadaway, L. lnternational fournal of Pharmaceutical Compounding 5, (2001) 465-469.

 706 (785) Osmolalidad y Osmolaridad / Pruebas Físicas USP 40

centración de una solución se deben interpretar con cautela y este valor puede no representar las propiedades osmóticas de las
soluciones de infusión.
La discrepancia entre los resultados teóricos (osmolaridad) y los experimentales (osmolalidad) se debe, en parte, al hecho de
que la presión osmótica está relacionada con la osmolalidad y no con la osmolaridad. Más significativamente, la discrepancia
entre los resultados experimentales y los cálculos teóricos se debe a que la presión osmótica de una solución real es menor que
la de una solución ideal debido a las interacciones entre las moléculas del soluto o entre las moléculas del soluto y del disolven-
te en una solución. Estas interacciones reducen la presión que ejercen las moléculas del soluto sobre la membrana semiper-
meable, lo que reduce los valores experimentales de la osmolalidad en comparación con los valores teóricos. Esta diferencia
está relacionada con el coeficiente osmótico molal (<Dm;). El ejemplo también ilustra la importancia de determinar experimen-
talmente la osmolalidad de una solución, en vez de cai'cular el valor teóricamente.

MEDICIÓN DE LA OSMOLALIDAD

Normalmente, el valor de osmolalidad de una solución se determina midiendo el descenso del punto de congelación de una
solución.

Aparato

El aparato, un osmómetro para medir el descenso del punto de congelación, consiste en lo siguiente: un medio para enfriar
el recipiente utilizado para la medición; un resistor sensible a la temperatura (termistor), con un dispositivo adecuado para me-
dir la diferencia de potencial o de corriente y que puede graduarse en función de cambios de temperatura o en osmolalidad; y
un mecanismo para mezclar la muestra.
Los osmómetros que miden la presión de vapor de las soluciones se emplean con menor frecuencia. Requieren un volumen
de muestra más pequeño (generalmente aproximadamente 5 µL), aunque la exactitud y precisión de los resultados de las de-
terminaciones de osmolalidad son comparables a las obtenidas mediante el uso de osmómetros que dependen de la observa-
ción del punto de congelación de las soluciones.

Soluciones Estándar

Preparar las Soluciones Estándar como se indica en la Tabla 7, según sea necesario. 2
Tabla 1. Soluciones Estándar para Calibración del Osmómetro*
Soluciones Estándar Osmolalidad Coeficiente Descenso del
(Peso en g de cloruro de sodio (mOsmol/kg) Osmótico Molal Punto de Congelación (º)
por kg de agua) (~m) (<l>m Nac1) fl.Tr

3,087 100 0,9463 O, 186

6,260 200 0,9337 0,372
9,463 300 0,9264 0,558
12,684 400 0,9215 0,744
15,916 500 0,9180 0,930
19,147 600 0,9157 1, 116
22,380 700 0,9140 1,302
* Adaptado de la Farmacopea Europea, 4a Edición, 2002, pg. 50.

Solución de Prueba

En el caso de un sólido para inyección, reconstituir con el diluyente apropiado según se indica en las instrucciones del eti-
quetado. En el caso de soluciones, usar la muestra tal como se encuentra. [NOTA-Se puede diluir una solución para que quede
dentro del intervalo de medición del osmómetro, si fuera necesario, pero el resultado se deberá expresar como el resultado de
la solución diluida y NO se debe multiplicar por un factor de dilución para calcular la osmolalidad de la solución original, a
menos que se especifique algo diferente en la monografía. El coeficiente osmótico molal es una función de la concentración.
Por lo tanto, cambia con la dilución.]

2 Se pueden usar soluciones comercialmente disponibles para calibración de osmómetros, con osmolalidades iguales o diferentes a las que se listan en la Tabla 7 y
estandarizadas con métodos rastreables al NIST.
USP 40 Pruebas Físicas/ (786) Estimación de la Distribución del Tamaño de Partícula 707

Procedimiento

Primero, calibrar el instrumento según las instrucciones del fabricante. Confirmar la calibración del instrumento con, por lo
menos, una solución de la Tabla 7 de manera que la osmolalidad de la Solución Estándar se encuentre dentro de 50
müsmol/kg del valor esperado de la Solución de Prueba o en el centro del intervalo esperado de osmolalidad de la Solución de
Prueba. La lectura del instrumento debe estar dentro de ±4 müsmol por kg de la Solución Estándar. Introducir un volumen
adecuado de cada Solución Estándar en la celda de medición conforme a las instrucciones del fabricante y poner en marcha el
sistema de enfriamiento. En general, el dispositivo de mezcla se programa para que opere a una temperatura inferior a la tem-
peratura más baja esperada de descenso del punto de congelación. El aparato indica cuando se ha logrado el equilibrio. Si
fuera necesario, calibrar el osmómetro utilizando un dispositivo de ajuste adecuado de modo que la lectura corresponda a la
osmolalidad o al valor de descenso del punto de congelación de la Solución Estándar que aparece en la Tabla 7. [NOTA-Si la
lectura del instrumento indica el descenso del punto de congelación, la osmolalidad se puede derivar usando la fórmula apro-
piada en Osmolalidad.] Repetir el procedimiento con cada Solución de Prueba. Leer la osmolalidad de la Solución de Prueba
directamente o calcularla a partir del valor obtenido para el descenso del punto de congelación.
Suponiendo que el valor del coeficiente osmótico es esencialmente el mismo ya sea que la concentración se exprese en mo-
lalidad o molaridad, la osmolalidad de una solución determinada experimentalmente se puede convertir en osmolaridad de la
misma manera que la concentración de una solución se convierte de molalidad a molaridad. A menos que una solución esté
muy concentrada, la osmolaridad de una solución (se) se puede calcular a partir de su osmolalidad determinada experimental-
mente (sm):
Se= 1OOOsm / (1000 / p + LW;v;)
donde W; es el peso en g; y v; es el volumen específico parcial, en mL por g, del iésimo soluto (el número ordinal del soluto). El
volumen específico parcial de un soluto es el cambio en volumen de una solución cuando se disuelve 1 g adicional de soluto
en la solución. Este volumen se puede determinar midiendo las densidades de la solución antes y después de agregar el soluto.
Los volúmenes específicos parciales de las sales son generalmente muy pequeños, alrededor de O, 1 mL por g. Sin embargo, los
otros solutos son generalmente mayores. Por ejemplo, los volúmenes específicos parciales de los aminoácidos están entre 0,6
mL y 0,9 mL por g. Se puede demostrar por la ecuación anterior que correlaciona la osmolaridad con la osmolalidad que,

donde pes la densidad de la solución y e es la concentración de soluto total, ambas expresadas en g por mL. Por lo tanto,
alternativamente, la osmolaridad puede calcularse también a partir de la osmolalidad determinada experimentalmente a partir
de la medición de la densidad de la solución mediante un método adecuado y el peso total del soluto, después de la correc-
ción por contenido de agua, disuelto por mL de la solución.

(786) ESTIMACIÓN DE LA DISTRIBUCIÓN DEL TAMAÑO DE

PARTÍCULA POR TAMIZADO ANALÍTICO

El tamizado es uno de los métodos más antiguos para clasificar los polvos y los gránulos según la distribución del tamaño de
partícula. El tamizado utilizando un lienzo tejido como tamiz, consiste básicamente en clasificar las partículas según su tamaño
intermedio (es decir, según su ancho o amplitud). Se recomienda el tamizado mecánico si la mayoría de las partículas superan
los 75 µm aproximadamente. Si se trata de partículas más pequeñas, durante el tamizado se observa que su escaso peso no
ejerce la fuerza suficiente para contrarrestar las fuerzas de adhesión y cohesión superficial, que hacen que las partículas se aglu-
tinen unas con otras y al tamiz. Por este motivo, las partículas que se esperaría que pasaran por el tamiz, en realidad no lo
hacen. Para este tipo de materiales se recomienda emplear otros métodos de agitación, como por ejemplo el tamizado con un
chorro de aire o el tamizado sónico. No obstante, el tamizado se puede emplear en algunos casos para algunos polvos o grá-
nulos cuya mediana de tamaño de partícula sea inferior a 75 µm, siempre que el método se pueda validar. En términos farma-
céuticos, el tamizado es el método de preferencia para clasificar polvos o gránulos sin mezclas más gruesos. El método es espe-
cialmente atractivo ya que tanto los polvos como los gránulos se clasifican solamente en función del tamaño de partícula y en
la mayoría de los casos el análisis se puede efectuar con el material seco.
Entre los factores limitantes que presenta el método se encuentran la necesidad de contar con una cantidad de muestra
apreciable (según sea la densidad del polvo o de los gránulos y el diámetro de los orificios del tamiz, generalmente como míni-
mo 25 g) y la dificultad que presentan polvos o gránulos oleosos o cohesivos que obstruyen los orificios del tamiz. En esencia,
el método estima el tamaño en dos dimensiones ya que el pasaje a través del orificio del tamiz a menudo presenta mayor
dependencia del ancho y del espesor máximos que del largo.
Este método está destinado a estimar la distribución del tamaño de partícula total de un material sin mezclar. No está dise-
ñado para determinar la proporción de partículas que pasan o que se retienen por uno o dos tamices.
708 (786) Estimación de la Distribución del Tamaño de Partícula / Pruebas Físicas USP 40

A menos que la monografía individual especifique algo diferente, estimar la distribución del tamaño de partícula según se
describe en Método de Tamizado en Seco. Si se presentan dificultades para alcanzar el punto final (es decir, el material no pasa
fácilmente por los tamices) o si fuera necesario emplear los tamices con los orificios más pequeños del intervalo de tamizado
(de menos de 75 µm), se debe evaluar si no sería conveniente emplear otro método para determinar el tamaño de partícula.
Se debe tamizar en condiciones tales que no generen ni pérdida ni aumento del contenido de humedad de la muestra. Con-
trolar la humedad relativa ambiente del lugar donde se efectúa el tamizado de forma de impedir que la muestra absorba o
pierda humedad. El tamizado analítico de prueba normalmente se realiza en condiciones de humedad ambiente salvo que hu-
biera pruebas que indicaran lo contrario. Cualquier condición especial aplicable al material en cuestión debe estar detallada en
la monografía individual.

PRINCIPIOS DEL TAMIZADO ANALÍTICO

Los tamices analíticos constan de una malla de alambre, de tejido simple, que se asume deja aberturas casi cuadrangulares y
que está sellada en la base de un recipiente cilíndrico abierto. El método analítico de base consiste en apilar los tamices uno
sobre el otro, encimándolos en orden ascendente de tamaño de orificio y luego colocar el polvo de muestra en el tamiz supe-
rior.
Someter a agitación el grupo de tamices apilados durante un tiempo normalizado y luego determinar con exactitud el peso
del material retenido en cada tamiz. Por este método se calcula el porcentaje, en peso, del polvo retenido en cada uno de los
tamices utilizados.
El procedimiento para estimar la distribución del tamaño de partícula de un único polvo farmacéutico está diseñado, en ge-
neral, para trabajar con polvos en los que al menos el 80% de las partículas supera los 75 µm. El parámetro dimensional que se
emplea para determinar la distribución del tamaño de partícula por tamizado analítico es el largo de uno de los lados del orifi-
cio cuadrangular más pequeño a través del cual pasará la partícula.

TAMICES ANALÍTICOS

Los tamices analíticos adecuados para efectuar las pruebas farmacopeicas cumplen con las especificaciones contenidas en la
versión más actualizada de la Norma ISO 3310-1 de la Organización Internacional de Normalización: Tamices Analíticos-Re-
quisitos Técnicos y Pruebas (ver la Tabla 1). A menos que la monografía especifique algo diferente, emplear los tamices ISO
que se enumeran como tamaño principal en la Tabla 7. A menos que la monografía especifique algo diferente, emplear los
tamices ISO que figuran en la Tabla 7 según la recomendación indicada para ese tamiz.
Tabla 1. Tamaños de las Series de Tamices Estándar según el Intervalo de Interés
Abertura Nominal ISO
Tamaños Tamices USP Tamiz Tamiz
Principales Tamaños Adicionales Tamiz No. Recomendados Europeo Japonés
R20/3 R20 R40/3 EE.UU. (micrones) No. No.
ll,20mm ll,20mm 11,20 mm 11200
10,00 mm
9,50 mm
9,00 mm
8,00 mm 8,00 mm 8,00 mm
7,10 mm
6,70 mm
6,30 mm
5,60 mm 5,60 mm 5,60 mm 5600 3,5
5,00 mm
4,75 mm 4
4,50 mm
4,00 mm 4,00 mm 4,00 mm 5 4000 4000 4,7
3,55 mm
3,35 mm 6 5,5
3,15 mm
2,80 mm 2,80 mm 2,80 mm 7 2800 2800 6,5
2,50 mm
2,36 mm 8 7,5
2,24 mm
2,00 mm 2,00 mm 2,00 mm 10 2000 2000 8,6
USP 40 Pruebas Físicas/ (786) Estimación de la Distribución del Tamaño de Partícula 709

Tabla 1. Tamaños de las Series de Tamices Estándar según el Intervalo de Interés (Continuación)
Abertura Nominal ISO
Tamaños Tamices USP Tamiz Tamiz
Principales Tamaños Adicionales Tamiz No. Recomendados Europeo Japonés
R20/3 R 20 R40/3 EE.UU. (micrones) No. No.
1,80 mm
1,70 mm 12 10
l,60mm
1,40 mm 1,40 mm 1,40mm 14 1400 1400 12
1,25 mm
l,18mm 16 14
l,12mm
1,00mm l,OOmm l,OOmm 18 1000 1000 16
900 µm
850 µm 20 18
800 µm
710 µm 710 µm 710 µm 25 710 710 22
630 µm
600 µm 30 26
560 µm
500 µm 500 µm 500 µm 35 500 500 30
450 µm
425 µm 40 36
400 µm
355 µm 355 µm 355 µm 45 355 355 42
315 µm
300 µm 50 50
280 µm
250 µm 250 µm 250 µm 60 250 250 60
224 µm
212 µm 70 70
200 µm
180 µm 180 µm 180 µm 80 180 180 83
160 µm
150 µm 100 100
140 µm
125 µm 125 µm 125 µm 120 125 125 119
112 µm
106 µm 140 140
100 µm
90 µm 90 µm 90 µm 170 90 90 166
80 µm
75 µm 200 200
71 µm
63 µm 63 µm 63 µm 230 63 63 235
56 µm
53 µm 270 282
50 µm
45 µm 45 µm 45 µm 325 45 45 330
40 µm
38 µm 38 391

Seleccionar los tamices de forma que todos los tamaños de partícula de la muestra de prueba estén comprendidos en el
intervalo. Se recomienda emplear un grupo de tamices encajados con una progresión de "2 del área de los orificios del tamiz.
Encajar los tamices de forma que la malla con orificios más grandes quede en el extremo superior y la que tenga los orificios
más pequeños en el extremo inferior. Clasificar los orificios del tamiz asignándoles un valor en micrómetros o en milímetros.
71 O (786) Estimación de la Distribución del Tamaño de Partícula / Pruebas Físicas USP 40

[NOTA-Los números de malla que figuran en la tabla se proporcionan exclusivamente para realizar conversiones.] Los tamices
analíticos son preferentemente de acero inoxidable o, en su defecto, de bronce o de otro alambre no reactivo adecuado.
Tanto la primera calibración del tamiz analítico como las subsiguientes se realizan según lo dispuesto en la versión más ac-
tualizada de la norma ISO 3310-1. Antes de emplear un tamiz, examinarlo cuidadosamente en busca de fracturas y distorsio-
nes considerables, sobre todo en las juntas de la malla y el cilindro. En algunos casos, se pueden emplear métodos ópticos para
calibrar el tamiz, estimando el tamaño promedio del orificio y la variabilidad que pudieran presentar los orificios de la malla.
Alternativamente también se pueden emplear Esferas de Vidrio Estándar para medir los orificios reales de los tamices analíticos
en el intervalo de 212 µm a 850 µm. A menos que la monografía individual especifique algo diferente, analizar el tamiz con
temperatura ambiente controlada y en condiciones de humedad relativa ambiente.

Limpieza de los Tamices Analíticos

En condiciones ideales se recomienda limpiar los tamices solamente con un chorro de aire o con un chorro de líquido. Si
después del chorro de líquido o de aire, todavía se observan orificios obstruidos por partículas del material en estudio, emplear
un cepillo como último recurso pasándolo suavemente y tomando las precauciones necesarias para no dañar el tamiz.

Muestra de Prueba

Si la monografía del material en estudio no indica el peso de la muestra de prueba, emplear una muestra de prueba de 25 g
a 100 g, dependiendo de la densidad aparente, y tamices analíticos de 200 mm de diámetro. Para tamices de 76 mm calcular
la cantidad de material adecuada considerando que es aproximadamente 1 /7 de la cantidad que puede colocarse en un tamiz
de 200 mm. Determinar el peso más apropiado para un material dado, tamizando muestras de distintos tamaños pesadas con
exactitud, por ejemplo 25 g, 50 g y 100 g colocadas en un agitador mecánico durante el mismo periodo de tiempo. [NOTA-Si
los resultados obtenidos con las muestras de 25 g y 50 g son similares, pero el porcentaje obtenido en el tamiz de orificios más
pequeños con la muestra de 100 g es menor, la muestra de 100 g es demasiado grande.] Si sólo se dispone de una muestra de
1 Og a 25 g, se pueden emplear tamices analíticos de menor diámetro que cumplan con las mismas especificaciones de la ma-
lla. En este caso, volver a determinar el punto final. En algunos casos, puede ser necesario emplear muestras con una masa
menor (por ejemplo, hasta 5 g). Para materiales con densidad de partículas aparente baja, o de materiales compuestos princi-
palmente por partículas de forma muy isodiamétrica, puede ser necesario emplear una muestra de menos de 5 g en un tamiz
de 200 mm, para así evitar la obstrucción excesiva de los orificios del tamiz. En la validación de un método de tamizado analí-
tico en particular, se asume que el problema de la obstrucción de los orificios se tomó en consideración.
Si el material en estudio es propenso a absorber o a perder cantidades de agua considerables con las variaciones de hume-
dad, efectuar la prueba en un ambiente controlado apropiado. De forma análoga, si se sabe que el material en estudio genera
carga electrostática, tomar las precauciones necesarias para garantizar que esa carga no altere los resultados del análisis. En
algunos casos, se recomienda agregar un 0,5 por ciento (m/m) de un agente anti-estático, como un dióxido de silicio coloidal
u óxido de aluminio, para reducir el efecto a un mínimo. Si no se puede eliminar la carga estática ni la absorción o pérdida de
agua, es necesario emplear otra técnica para determinar el tamaño de partícula.

Métodos de Agitación

Todos los distintos tipos de dispositivos de agitación para tamices y polvos están disponibles comercialmente y son adecua-
dos para el tamizado analítico. Sin embargo, las distintas fuerzas y las diferencias de magnitud de estas fuerzas sobre las partí-
culas en estudio que emplean los distintos métodos de agitación producirán resultados distintos y tendrán puntos finales dis-
tintos. Algunos métodos emplean la agitación mecánica o electromagnética que induce un cierto grado de oscilación vertical o
de movimiento circular en el plano horizontal o golpes suaves o una combinación de golpes suaves y de movimiento circular
en el plano horizontal. Otro método consiste en arrastrar las partículas en un chorro de aire. Es necesario indicar en los resulta-
dos qué método de agitación se empleó y con qué parámetros (si están sujetos a variación), ya que los cambios en las condi-
ciones de agitación generan cambios en los resultados del tamizado analítico y en la determinación del punto final y en algu-
nos casos la variación es lo suficientemente amplia como para dar resultados que no cumplan con los requisitos en ciertas cir-
cunstancias.

Determinación del Punto Final

El tamizado analítico se da por concluido cuando el peso de cualquiera de los tamices no presenta variaciones de más de 5%
o de 0, 1 g (10% si se emplean tamices de 76 mm) del peso previo obtenido en ese mismo tamiz. Si en cualquiera de los
tamices hay menos del 5% del total de la muestra, aumentar el punto final para ese tamiz hasta un cambio de peso de no más
de 20% del peso previo obtenido en ese tamiz.
Si se encuentra más del 50% del peso total de la muestra en cualquiera de los tamices, a menos que esta circunstancia esté
indicada en la monografía, repetir la prueba agregando a ese conjunto de tamices un tamiz con orificios más grandes, de ta-
USP 40 Pruebas Físicas / (786) Estimación de la Distribución del Tamaño de Partícula 711

maño intermedio entre el tamaño del tamiz que contiene el exceso de peso y el siguiente tamiz en el orden del grupo original,
es decir, agregando el tamiz de la serie ISO omitido en el conjunto de tamices.

MÉTODOS DE TAMIZADO

Agitación Mecánica

MÉTODO DE TAMIZADO EN SECO

Tarar cada tamiz con una aproximación de O, l g. Colocar una cantidad de la muestra de prueba pesada con exactitud en el
tamiz superior (el de orificios más grandes) y tapar. Agitar el conjunto de tamices durante 5 minutos. A continuación desmon-
tar cuidadosamente cada tamiz del conjunto de tamices sin que haya pérdida de material. Volver a pesar cada tamiz y determi-
nar el peso del material en cada uno de ellos. Determinar el peso del material utilizando una bandeja recolectora u otro admi-
nículo similar para recolectar el material. Volver a montar el conjunto de tamices y agitar durante 5 minutos. Desmontar y
pesar cada uno de los tamices como se describió anteriormente. Repetir los pasos hasta obtener los resultados del punto final
(ver Determinación del Punto Final en Tamices Analíticos) Una vez completado el análisis, conciliar los pesos del material. Las
pérdidas totales no exceden de 5% del peso de la muestra original.
Repetir el análisis con una muestra nueva, pero usando un solo tiempo de tamizado igual a la sumatoria de los tiempos men-
cionados anteriormente. Confirmar que este tiempo de tamizado cumple con los requisitos de la determinación de punto final.
Una vez validado el punto final para un material específico, ese tiempo único de tamizado fijado se puede usar en los próximos
análisis, siempre y cuando la distribución del tamaño de partícula esté comprendida dentro de los límites de la variación nor-
mal.
Si se observara que' las partículas retenidas en uno cualquiera de los tamices están en forma de agregados y no de partículas
individuales, es poco probable que el tamizado mecánico en seco proporcione una buena reproducibilidad. En ese caso se de-
be emplear otro método de análisis del tamaño de partícula.

Métodos de Arrastre por Aire

TAMIZADO CON UN CHORRO DE AIRE O TAMIZADO SÓNICO

Hay disponibles comercialmente varios tipos distintos de equipos para tamizar que utilizan una corriente de aire circulante.
El sistema que emplea un único tamiz por vez se denomina tamizado por chorro de aire. En líneas generales, la metodología es
similar a la descrita para el Método de Tamizado en Seco con un chorro de aire normalizado en lugar del mecanismo de agita-
ción descrito. La distribución del tamaño de partícula se obtiene mediante análisis secuenciales en tamices individuales comen-
zando por el tamiz con orificios más pequeños. A menudo, el tamizado por chorro de aire se realiza con tamices de orificios
más pequeños que los empleados en el tamizado en seco. La técnica resulta más adecuada si sólo es necesario cuantificar las
fracciones que estén por encima o por debajo de un límite de tamaño.
El método de tamizado sónico emplea un conjunto de tamices y la muestra circula en un columna de aire que oscila vertical-
mente y eleva la muestra y la devuelve a los orificios de la malla a un cierto número de pulsos por minuto. En algunos casos, si
se emplea el tamizado sónico es necesario disminuir el tamaño de la muestra a 5 g.
Los métodos de tamizado por chorro de aire y sónico pueden ser útiles para polvos o gránulos con los que no se obtienen
un análisis significativo empleando las técnicas de tamizado mecánico.
Estos métodos dependen en gran medida de que la dispersión del polvo en la corriente de aire sea apropiada. Puede ocurrir
que se encuentren dificultades para cumplir con este requisito si el método se emplea con los tamices en el extremo inferior
del intervalo (es decir, de menos de 75 µm), cuando las partículas tienden a tener mayor cohesión y en particular si el material
presenta una tendencia a cargarse electrostáticamente. Los motivos expuestos subrayan la importancia de la determinación del
punto final y que es crucial confirmar que el material cuyo tamaño excede el previsto está compuesto de partículas aisladas y
no de agregados.

INTERPRETACIÓN
Los datos sin procesar deben incluir el peso de la muestra en análisis, el tiempo total de tamizado y la descripción precisa de
la metodología de tamizado empleada así como los valores fijados para todo parámetro variable, además de los pesos del ma-
terial retenido en cada tamiz individual y del peso en la bandeja. En algunos casos se recomienda convertir estos datos en una
distribución acumulativa del peso y, si se desea expresar la distribución en términos del peso acumulado de partículas de tama-
ño inferior al esperado, el intervalo de tamices empleados debe incluir un tamiz por cuyos orificios pasa todo el material. Si se
observan indicios de que el material retenido en los tamices está compuesto por agregados formados durante el proceso de
tamizado, el análisis no es válido.
 712 (787) Partículas Subvisibles en Inyectables / Pruebas Físicas USP 40

(787) PARTÍCULAS SUBVISIBLES EN INYECTABLES DE PROTEÍNAS

TERAPÉUTICAS

Este capítulo se puede usar como alternativa al capítulo general Partculas en Inyectables (788) de la USP. Este capítulo trata
específicamente de inyectables de proteínas terapéuticas y preparaciones relacionadas, lo cual permite el uso de volúmenes de
los productos y alícuotas de prueba más pequeñas para determinar el contenido de partículas, con instrucciones para la mani-
pulación de las muestras que toman en cuenta las cuestiones asociadas con el análisis de estos materiales. Aunque la metodo-
logía y los límites presentados en este capítulo son los preferidos para inyectables de proteínas terapéuticas, se considera acep-
table el uso de métodos analíticos alternativos aceptados por las autoridades reglamentarias con límites de partículas subvisi-
bles adecuadamente desarrollados.
Los inyectables de proteínas terapéuticas son productos de proteínas o péptidos, obtenidos por biotecnología, así como
otros inyectables de proteínas terapéuticas tales como proteínas terapéuticas obtenidas de fuentes naturales, incluyendo sus
preparaciones finales para infusión. No se incluyen en este capítulo ciertas preparaciones que no se pueden adaptar a estas
pruebas, tales como las vacunas profilácticas.
Las partículas en inyectables de proteínas terapéuticas son sustancias móviles no disueltas que pueden originarse de diversas
fuentes. Las partículas pueden ser (a) verdaderamente extrañas o "extrínsecas", p.ej., material extraño inesperado, tal como
celulosa; (b) "intrínsecas" resultantes del proceso de fabricación, mediante incorporación o por limpieza deficiente, tales como
metales o juntas del tanque, lubricantes, equipo de llenado, o que resultan de la inestabilidad, p.ej., cambios por el paso del
tiempo, tales como formas salinas insolubles de fármacos o degradación del empaque; y (c) "inherentes", tales como partícu-
las de la proteína o de los componentes de la formulación. Todos estos tipos de partículas se pueden detectar y contar usando
el método de prueba descrito en este capítulo. Asimismo, para los métodos de obstrucción de luz (OL), las burbujas de gas por
lo regular se cuentan durante el análisis de partículas y se consideran artefactos del recuento. Para la determinación de partícu-
las subvisibles en inyectables de proteínas terapéuticas, el método preferido es la Prueba de Conteo de Partículas por Obstrucción
de Luz. La Prueba de Conteo Microscópico de Partículas similar a la descrita en el capítulo (788) puede ser útil para casos en los
que las partículas que se están analizando sean en su mayoría no proteináceas, o para casos en los que pudiera considerarse
importante examinar las características de las partículas. Los resultados de esta prueba no son equivalentes a los de la prueba
de OL.
No todos los inyectables de proteínas terapéuticas pueden examinarse directamente para determinar la presencia de partícu-
las subvisibles con el método de OL. Cuando el método de prueba no se puede aplicar de forma directa a muestras de prueba
específicas, según se determine por cualquier problemática con la verificación del método (reproducibilidad, linealidad), se
puede realizar una dilución cuantitativa con un diluyente apropiado para permitir el análisis mediante obstrucción de luz. La
verificación del método puede ser necesaria para garantizar la idoneidad de los procedimientos de manejo de la muestra y el
desempeño del método para cada medicamento.
En las pruebas descritas a continuación, los resultados obtenidos al examinar una unidad discreta o grupo de unidades para
determinar la presencia de partículas no pueden extrapolarse con certeza a otras unidades que aún no han sido analizadas. Por
consiguiente, se deben desarrollar planes de muestreo basándose en factores operativos conocidos para sustentar inferencias
válidas derivadas de los datos observados a fin de caracterizar el nivel de partículas en un grupo grande de unidades. Los pla-
nes de muestreo se deben basar considerando el volumen de producto, número de partículas históricamente encontradas en
comparación con los límites, distribución del tamaño de partícula y variabilidad de los recuentos de partículas entre unidades.
Los productos que se usan con un filtro final durante su administración (en línea) están exentos de estos requisitos, siempre
que se cuente con datos científicos para justificar la exención.

PRUEBA DE CONTEO DE PARTÍCULAS POR OBSTRUCCIÓN DE LUZ

Los analistas deben usar un instrumento adecuado que se base en el principio de bloqueo de luz y que permita una determi-
nación automática del tamaño y del número de partículas.
El sensor seleccionado debe ser apropiado para el intervalo de tamaño de partícula que se quiere determinar y el número de
partículas esperado. Diversas etapas de estandarización, tales como exactitud del volumen de muestra, velocidad de flujo de la
muestra, resolución del sensor, calibración y exactitud del recuento de partículas, resultan importantes para la operación apro-
piada del aparato y se discuten con mayor detalle en el capítulo de información general Métodos para la Determinación de Par-
tículas en Inyectables y Soluciones Oftálmicas (1 788). 1
Para propósitos de calibración del equipo, usar estándares de tamaño de partícula rastreables al NIST o estándares rastrea-
bles equivalentes; ver el capítulo (1788). Estos estándares por lo general son de entre 2 y 100 µm. Los analistas deberían verifi-
car el desempeño del aparato usando el ER Recuento de Partículas USP dispersado en agua exenta de partículas usando un
volumen apropiado. Se debe tener cuidado de evitar la aglomeración de partículas durante la dispersión en el proceso de cali-
bración. La definición de Agua Exenta de Partículas se encuentra en la sección introductoria de Reactivos, Indicadores y Solucio-
nes.

1 Sólo para propósitos de información, los analistas pueden referirse al capítulo (1788), el cual puede ser útil, aunque no obligatorio.
USP 40 Pruebas Físicas/ (787) Partículas Subvisibles en Inyectables 713

Precauciones Generales

Llevar a cabo la prueba en condiciones que limiten el ingreso de partículas, de preferencia en una cabina de flujo laminar. Se
debe limpiar y manipular adecuadamente todo el material de vidrio y el equipo usado para evitar la introducción de partículas.
Se debe tener cuidado de minimizar la agitación y demás situaciones de estrés para las preparaciones (para líquidos o polvos
reconstituidos) y de prevenir la introducción de burbujas de aire en la preparación en análisis. Esto último es de particular im-
portancia al combinar o transferir las preparaciones al recipiente en el que se llevará a cabo la determinación.

Etapas Preparatorias

El material de vidrio seleccionado para el método debe ser adecuado para el volumen de las alícuotas de blanco y de mues-
tra, permitir un mezclado fácil y una limpieza repetitiva a fin de prevenir cualquier contribución significativa a los recuentos de
partículas. Por lo regular, se utilizan vasos dedicados única y exclusivamente para esta prueba. La limpieza y enjuague del ma-
terial de vidrio del método debe realizarse en una zona contigua al área del recuento.
El área de trabajo y el equipo deben estar separados del tráfico general del laboratorio. Debe disponerse de un buen sumi-
nistro de agua filtrada (que cumpla con el requisito de Agua Exenta de Partículas) y de un equipo de soporte mantenido en
buenas condiciones para el trabajo de rutina. Consultar el capítulo de información general (1788). 1
Se recomiendan dos tipos de controles del sistema: una Prueba Blanco y una Verificación de la Aptitud del Sistema.
1. La Prueba Blanco involucra lo siguiente:
a. La que se realiza al inicio del día o del análisis para asegurar que se ha tenido especial cuidado durante la preparación
del sitio y del aparato que se va a usar (Blanco Ambiental).
b. Todos los blancos adicionales que se realizan durante el día (por ejemplo entre familias de productos) también deben
cumplir con los requisitos de la Prueba Blanco (Blanco de Procedimiento).
2. La Verificación de la Aptitud del Sistema se realiza para verificar el recuento/mL apropiado y la relación con respecto al ER
Recuento de Partículas USP vigente o el estándar comercial equivalente. Ver el capítulo de información general (1788). 1

Prueba Blanco

La siguiente prueba se lleva a cabo para verificar que (a) el ambiente es adecuado para la prueba, (b) el material de vidrio se
ha limpiado apropiadamente y que (c) el agua o disolvente adecuado que se va a usar se encuentra exento de partículas (by c
constituyen el "blanco"). Determinar el recuento en cinco alícuotas de agua exenta de partículas o disolvente adecuado desga-
sificados, que sean representativas del volumen de prueba del producto (pero no menos de 1 mL). Si el número de partículas
con un tamaño de 1O µm o mayor excede de 1 partícula por mL para el volumen combinado de las alícuotas, entonces no han
sido suficientes las precauciones tomadas para la prueba. Repetir las etapas preparatorias hasta que el entorno, el material de
vidrio y el agua sean adecuados para la determinación de la prueba. En principio, la Prueba Blanco debe realizarse cada día
(entorno) y se recomienda durante toda la rutina diaria, en especial entre familias de productos (procedimiento).

Verificación de la Aptitud del Sistema

Para verificar la aptitud del sistema, el Agua Exenta de Partículas y el ER Recuento de Partículas USP o la suspensión acuosa
estándar comercial equivalente se analizan en el mismo tipo de envase, o similar a los de las muestras de producto, se desgasi-
fican de la misma manera y, por lo general, se manipulan de la misma manera que el artículo de prueba. Asegurar que el siste-
ma puede cumplir con el requisito de la Prueba Blanco. Determinar las partículas en una muestra del ER Recuento de Partículas
USP que corresponda al volumen de prueba del producto, de acuerdo con el método descrito a continuación. Los resultados
obtenidos de la Preparación estándar deben caer dentro de las especificaciones establecidas del Estándar de Referencia.

Método

Las muestras de producto se analizan de la manera que represente la entrega lo más adecuadamente posible (p.ej., el conte-
nido descargado de una jeringa). Para productos parenterales con un volumen suficiente (es decir, un volumen lo suficiente-
mente grande para facilitar el análisis), el análisis de unidades individuales tiene a menudo un carácter diagnóstico. Para pro-
ductos parenterales que no cuentan con un volumen suficiente, mezclar con cuidado y de manera minuciosa cada unidad,
luego combinar el contenido de un número adecuado de unidades en un recipiente distinto para obtener el volumen requeri-
do para una sola prueba (por lo general, 0,2-5,0 mL). Si se lleva a cabo una dilución, asegurar que el recipiente del blanco
tenga un volumen suficiente para el producto y los diluyentes y que se introduzca el menor número de partículas posible du-
rante el proceso. Abrir cada unidad con cuidado, retirar el cierre sellante y evitar la contaminación del contenido antes del
muestreo, de la dilución o, si fuera necesario, de la combinación.
Cuando se especifique un disolvente del producto, p.ej., para sólidos liofilizados o polvos para uso parenteral, la reconstitu-
ción o dilución debe realizarse con la cantidad apropiada de disolvente especificado. En este caso, se puede analizar el disol-
714 (787) Partículas Subvisibles en Inyectables / Pruebas Físicas USP 40

vente mismo para asegurar que no representa una fuente significativa de partículas. No se permite restar el recuento de partí-
culas del disolvente al recuento total.
La eliminación de burbujas de gas es un paso clave, en especial para productos proteináceos que atrapan gas fácilmente. Se
recomiendan dos métodos: dejar en reposo el fluido del producto bajo presión ambiental o aplicando un vacío suave (p.ej., 75
Torr). Se pueden usar otros métodos siempre que se demuestre su idoneidad. Se debe evitar el uso de ultrasonido.
Una vez que las muestras han sido desgasificadas, se deben volver a mezclar suavemente para suspender todas las partículas,
mezclando suavemente, pero de manera minuciosa, el contenido de la muestra usando medios adecuados, tal como la agita-
ción manual del envase por rotación suave y lenta. No es recomendable mezclar el fluido del producto mediante inversión en
ningún momento.
Inmediatamente después de mezclar, retirar no menos de cuatro alícuotas, cada una con un volumen apropiado para la ca-
pacidad del instrumento (por lo general, 0,2-5,0 mL). Contar el número de partículas que están por encima del intervalo de
tamaño seleccionado, incluyendo las partículas con tamaños iguales o mayores de 1 O y 25 µm. No tomar en cuenta el resulta-
do obtenido para la primera alícuota y calcular el número promedio de partículas en cada intervalo de tamaño para las alícuo-
tas remanentes de la preparación en análisis. Asimismo, se puede aplicar un volumen de tara para controlar el muestreo que
debe ser representativo del intervalo dinámico del sensor y del volumen de la aguja.

Consideraciones Generales

Se permite diluir siempre que se demuestre que el diluyente y los métodos son apropiados y que se utilice el menor nivel de
dilución que permita un análisis reproducible. En ciertas circunstancias, puede ser necesario diluir las muestras para obtener
resultados confiables. Éste puede ser el caso de productos con altas concentraciones y/o productos de alta viscosidad que no
se puedan retirar para su transferencia apropiada al instrumento; productos que ocasionen la saturación del sensor del instru-
mento debido a recuentos elevados, en especial para los intervalos de tamaño menores de 1 O µm; y en casos en los que la alta
concentración resulte en diferencias muy pequeñas en el índice de refracción entre la solución y los agregados proteicos, entre
otros. En situaciones en las que se lleve a cabo la dilución de la muestra, se debe demostrar que la dilución y la aptitud del
esquema de dilución seleccionado, incluida la selección del diluyente, están justificadas. La aptitud del esquema de dilución y
del diluyente se puede evaluar demostrando la uniformidad de los resultados a lo largo de un intervalo de dilución. Se deben
considerar estudios que relacionen el recuento de partículas con y sin dilución en los intervalos de tamaño esperados. Asimis-
mo, se deberían realizar estudios que exploren el impacto de la dilución sobre la reducción del número de agregados o el in-
cremento de las partículas debidas a los cambios en la proporción de proteína con respecto a los excipientes. Se puede verifi-
car el impacto de la dilución usando una técnica ortogonal para justificar la aptitud del método.

Evaluación

Los valores siguientes se derivan históricamente de los capítulos generales (788) y (789). Si las especificaciones son distintas
a las establecidas a continuación, se indicarán en las monografías individuales siempre que estuvieran disponibles.
Para productos parenterales que son inyectables de proteínas terapéuticas para infusión o inyección provistos en envases con
un contenido nominal menor o igual a 100 mL:
El número promedio de partículas con un tamaño igual o mayor de 1O µm presentes en las unidades analizadas no debe exceder de 6000 por envase,
y las de tamaño igual o mayor de 25 µm no debe exceder de 600.

Para inyectables de proteínas terapéuticas provistos en envases con un contenido nominal de más de 100 mL, y preparacio-
nes o inyectables para infusión parenteral con un contenido nominal de más de 100 mL:
El número promedio de partículas con un tamaño igual o mayor de 1O µm presentes en las unidades analizadas no debe exceder de 25/ml, y las de
tamaño igual o mayor de 25 µm no debe exceder de 3/ml. Asimismo, la carga total de partículas con un tamaño igual o mayor de 1O µm no debe
exceder de 6000 por envase y las de tamaño igual o mayor de 25 µm no debe exceder de 600 por envase.

Los productos que se usan con un filtro final durante su administración (en línea) están exentos de estos requisitos, siempre
que se cuente con datos científicos para justificar la exención. No obstante, se espera que los filtrados cumplan con este capí-
tulo. Para productos que se proveen en <100 mL o que se reconstituyen primero en <100 mL y luego se diluyen para infusión
en un volumen > 100 mL, se debe evaluar el contenido de partículas antes y después de la dilución, y evaluarse según su volu-
men final.

PRUEBA DE RECUENTO MICROSCÓPICO DE PARTÍCULAS

Como se indicó anteriormente, el método de obstrucción de luz es el método preferido para inyectables de proteínas tera-
péuticas e infusiones parenterales. No obstante, se puede usar el método microscópico cuando resulte necesario, como en el
caso de la determinación exclusiva de partículas de tipo extrínseco e intrínseco. Sin embargo, al utilizar este método, se debe
demostrar que también se están contando otras clases de partículas (p.ej., inherentes). Para la determinación de la aceptabili-
dad del producto, aplicar los límites para la prueba microscópica con membrana del capítulo general (788). Debido a la inter-
ferencia de algunas partículas de proteínas y de sus características físicas (frágiles o translúcidas), los resultados de la Prueba de
USP 40 Pruebas Físicas/ (788) Partículas en Inyectables 715

Conteo Microscópico de Partículas no son equivalentes a los de la Prueba de Conteo de Partículas por Obstrucción de Luz, y dichos
métodos no pueden considerarse intercambiables.

(788) PARTÍCULAS EN INYECTABLES

Este capítulo general está armonizado con los textos correspondientes de la Farmacopea Europea y/o la Farmacopea japonesa.
Estas farmacopeas se han comprometido a no realizar ningún cambio unilateral a este capítulo armonizado. Las partes del tex-
to de este capítulo general que son texto USP nacional y, por lo tanto, no forman parte del texto armonizado, están indicadas
con símbolos (..) para especificar este hecho.
Las partículas en inyectables e infusiones parenterales consisten en partículas no disueltas móviles extrañas, que no son bur-
bujas gaseosas, accidentalmente presentes en las soluciones.
•Según se indica en Medicamentos Inyectables y en Implantes (1 ), las soluciones para inyección que se administran por vía
intramuscular o subcutánea deben cumplir con los requisitos de Partículas en Inyectables (788). Este requisito ha sido pospuesto
indefinidamente para productos de uso veterinario. Las preparaciones parenterales envasadas y etiquetadas exclusivamente pa-
ra usar como soluciones de irrigación están exentas de los requisitos de Partículas en Inyectables (788). Las preparaciones radio-
farmacéuticas están exentas de los requisitos de Partículas en Inyectables (788). Los productos parenterales cuyo etiquetado es-
pecifica el uso de un filtro final antes de la administración están exentos de los requisitos de Partículas en Inyectables (788),
siempre que se disponga de datos científicos que justifiquen dicha exención .•
Para la determinación de las partículas, se especifican a continuación dos procedimientos, el Método 7 (Prueba de Conteo de
Partículas por Obstrucción de Luz) y el Método 2 (Prueba de Conteo Microscópico de Partículas). Cuando se examinan inyecciones
e infusiones parenterales para detectar la presencia de partículas subvisibles, es preferible aplicar el Método 7. Sin embargo,
puede ser necesario analizar algunas preparaciones mediante la Prueba de Conteo de Partículas por Obstrucción de Luz seguida
de la Prueba de Conteo Microscópico de Partículas para determinar en forma concluyente si cumple con los requisitos.
No todas las preparaciones parenterales se pueden examinar con uno de estos métodos o con ambos para detectar la pre-
sencia de partículas subvisibles. Cuando el Método 7 no es aplicable, p.ej., en el caso de preparaciones que presenten una
transparencia reducida o una viscosidad aumentada, se debe llevar a cabo la prueba según el Método 2. Las emulsiones, coloi-
des y preparaciones liposomales son algunos ejemplos. De la misma manera, los productos que producen burbujas de aire u
otro gas cuando se aspiran dentro del sensor también pueden requerir un análisis de conteo microscópico de partículas. Si la
viscosidad de la preparación a analizar es lo suficientemente alta como para impedir el análisis por cualquiera de los dos méto-
dos, se puede realizar una dilución cuantitativa con un diluyente adecuado para reducir su viscosidad, según sea necesario, y
así permitir la realización del análisis.
Los resultados obtenidos al analizar una unidad discreta o un grupo de unidades para detectar la presencia de partículas no
pueden extrapolarse con certeza a otras unidades que no fueron examinadas. Por lo tanto, si se desean realizar inferencias váli-
das a partir de los datos observados para caracterizar el nivel de partículas en un grupo grande de unidades, se deben desarro-
llar planes de muestreo estadísticamente confiables.
•A los fines de este capítulo, preparación parenteral de pequeño volumen es sinónimo de inyección de pequeño volumen, y
preparación parenteral de gran volumen es sinónimo de inyección de gran volumen .•

MÉTODO 1 PRUEBA DE CONTEO DE PARTÍCULAS POR OBSTRUCCIÓN DE LUZ

Usar un aparato adecuado basado en el principio de bloqueo de la luz que permita una determinación automática del tama-
ño de las partículas y el número de partículas según el tamaño. La definición de agua exenta de partículas se proporciona en
Especificaciones de Reactivos-Reactivos, Indicadores y Soluciones.
Calibrar el aparato usando dispersiones que contengan partículas esféricas de tamaños conocidos entre 1 O µm y 25 µm. Dis-
persar el estándar de partículas en agua exenta de partículas. Se deben tomar las precauciones necesarias para evitar el agrega-
do de partículas durante la dispersión. •La aptitud del sistema puede verificarse usando el ER Partículas para Conteo USP.•

Precauciones Generales

Llevar a cabo la prueba en condiciones que limiten la presencia de partículas, preferentemente en un gabinete con flujo de
aire laminar.
Lavar muy cuidadosamente el material de vidrio y equipo de filtración usados, excepto los filtros de membrana, con una
solución de detergente tibia, y enjuagar con cantidades abundantes de agua para eliminar todo rastro de detergente. Inmedia-
tamente antes de usar, enjuagar el equipo desde arriba hacia abajo, por afuera y luego por adentro, con agua exenta de partí-
culas.
Procurar no introducir burbujas de aire en la preparación a analizar, especialmente cuando se transfieren porciones de la
preparación al recipiente en el cual se llevará a cabo la determinación.
716 (788) Partículas en Inyectables/ Pruebas Físicas USP 40

Para verificar que el ambiente es adecuado para la prueba, que el material de vidrio se ha limpiado correctamente y que el
agua a usar se encuentra exenta de partículas, llevar a cabo la siguiente prueba: determinar la presencia de partículas en cinco
muestras de agua exenta de partículas de 5 mL cada una, según el método que se describe más adelante. Si el número de
partículas con un tamaño igual o mayor de 1O µm excede de 25 para la muestra combinada de 25 mL, las precauciones toma-
das para la prueba no son suficientes. Se deben repetir las etapas preparatorias hasta que el ambiente, material de vidrio y
agua sean adecuados para la prueba.

Método
Mezclar el contenido de la muestra invirtiendo el envase lentamente 20 veces sucesivas. Si fuera necesario, quitar cuidadosa-
mente el cierre de sellado. Limpiar la superficie exterior de la apertura del envase empleando un chorro de agua exenta de
partículas y quitar el cierre, evitando la contaminación del contenido. Eliminar las burbujas gaseosas mediante las medidas
apropiadas tales como dejar en reposo durante 2 minutos o someter a ultrasonido.
Para preparaciones parenterales de gran volumen, se analizan unidades individuales. Para preparaciones parenterales de pe-
queño volumen de menos de 25 mL, combinar el contenido de 1O o más unidades en un recipiente limpio para obtener un
volumen de no menos de 25 mL; la solución de prueba puede prepararse mezclando el contenido de un número adecuado de
viales y diluyéndolo hasta 25 mL con agua exenta de partículas o con un disolvente exento de partículas adecuado cuando el
agua exenta de partículas no es adecuada. Las preparaciones parenterales de pequeño volumen con un volumen de 25 mL o
más pueden analizarse individualmente.
Reconstituir los polvos para uso parenteral con agua exenta de partículas o con un disolvente exento de partículas apropiado
cuando el agua exenta de partículas no es adecuada.
•En el caso de envases a granel para farmacias para uso parenteral etiquetados con la leyenda "No Destinado para Infusión
Directa", proceder según se indica para preparaciones parenterales de pequeño volumen cuando el volumen sea 25 mL o más.
Calcular el resultado de la prueba en una porción que sea equivalente a la dosis máxima provista en el etiquetado. Por ejem-
plo, si el volumen total del envase a granel es 100 mL y el volumen de dosis máxima es 1O mL, entonces el conteo promedio
de partículas por mL se multiplicaría por 1O para obtener el resultado de prueba basándose en la dosis máxima de 1O ml.
[NOTA-Para los cálculos de los resultados de la prueba, considerar esta porción de dosis máxima equivalente al contenido de
un envase lleno.]
Los productos envasados con compartimentos duales diseñados para contener un producto farmacéutico y un disolvente
deben ser preparados y analizados según se indica para preparaciones parenterales de gran volumen o preparaciones parente-
rales de pequeño volumen, dependiendo del volumen del envase. Mezclar cada unidad según se indica en el etiquetado, acti-
vando y agitando para asegurar el mezclado minucioso de los componentes individuales y la disolución del medicamento .•
El número de muestras de prueba debe ser suficiente para proporcionar una evaluación estadísticamente válida. Para prepa-
raciones parenterales de gran volumen o de pequeño volumen con un volumen de 25 mL o más, se pueden analizar menos de
1O unidades, empleando un plan de muestreo adecuado.
Tomar cuatro porciones, de no menos de 5 mL cada una, y contar el número de partículas iguales o mayores de 1O µm y 25
µm. No tomar en cuenta el resultado obtenido para la primera porción y calcular el número medio de partículas para la prepa-
ración a examinar.

Evaluación

Para preparaciones suministradas en envases con un volumen nominal de más de 100 mL, aplicar los criterios de la Prueba
1.A.
Para preparaciones suministradas en envases con un volumen nominal de menos de 100 mL, aplicar los criterios de la Prueba
1.B.
Para preparaciones suministradas en envases con un volumen nominal de 100 mL, aplicar los criterios de la Prueba 7.B.
[NOTA-La Farmacopea japonesa usa la Prueba 7.A.]

PRUEBA 1.A

Soluciones para infusión parenteral o soluciones para inyección suministradas en envases con un contenido nominal de
más de 100 mL: La preparación cumple con la prueba si el número promedio de partículas presentes en las unidades anali-
zadas no excede de 25 partículas iguales o mayores de 1O µm por mL y no excede de 3 partículas iguales o mayores de 25 µm
por ml.

PRUEBA 1.B

Soluciones para infusión parenteral o soluciones para inyección suministradas en envases con un contenido nominal de
menos de 100 mL: La preparación cumple con la prueba si el número promedio de partículas presentes en las unidades ana-
USP 40 Pruebas Físicas/ <788) Partículas en Inyectables 71 7

lizadas no excede de 6000 partículas iguales o mayores de 1 O µm por envase y no excede de 600 partículas iguales o mayores
de 25 µm por envase.
Si el número promedio de partículas excede los límites, analizar la preparación mediante la Prueba de Conteo Microscópico de
Partículas.

MÉTODO 2 PRUEBA DE CONTEO MICROSCÓPICO DE PARTÍCULAS

Usar un microscopio binocular adecuado, un dispositivo de filtración para retener partículas y un filtro de membrana para el
análisis.
Ajustar el microscopio con aumentos de 100 ± 1 Ox y equiparlo con un micrómetro ocular calibrado con un micrómetro ob-
jetivo, una platina mecánica capaz de sostener y recorrer toda la superficie de filtración del filtro de membrana y dos ilumina-
dores adecuados para proporcionar iluminación episcópica además de la iluminación oblicua.
El micrómetro ocular es una retícula circular para la medición del diámetro de partículas (ver la Figura 1)

O••e

Cruce de filamentos
- - señaladores

O• •O

Escala lineal
O••e /

1111111111t1111111111111111111t111111111t1111¡1111t111111ni¡1111¡1111t1111¡1111111111111111111111111
o ~ m w ~ ~ w m ~ w ~

Fig. 1. Retícula circular para la medición del diámetro de partículas. El círculo grande que está dividido por filamentos en
cuadrantes se denomina campo reticular (GFOV, por sus siglas en inglés). Los círculos transparentes y de color negro, con diá-
metros de 1 O µm y 25 µm en 1OOx, se proporcionan como elementos de comparación para clasificar las partículas por tama-
ño.

y consiste en un círculo grande que tiene filamentos señaladores que lo dividen en cuadrantes, círculos de referencia transpa-
rentes y de color negro, con diámetros de 1O µm y 25 µm en aumentos de 1OOx, y una escala lineal con graduaciones en
incrementos de 1O µm. Calibrar empleando un micrómetro de platina, certificado por una institución de normalización nacio-
nal o internacional. Un error relativo de la escala lineal de la retícula dentro de ±2% es aceptable. El círculo grande se denomi-
na campo reticular (GFOV, por sus siglas en inglés).
Se requieren dos iluminadores. Uno es un iluminador episcópico interno de campo brillante, el otro es un auxiliar externo de
foco regulable para dar iluminación oblicua reflejada en un ángulo de incidencia de 10º-20º.
El dispositivo de filtración para retener las partículas consiste en un soporte de filtro, de vidrio u otro material adecuado,
provisto de una fuente de vacío y un filtro de membrana adecuado.
El filtro de membrana tiene un tamaño adecuado, de color negro o gris oscuro, reticulado o no y con un tamaño nominal
de poro de 1,0 µm o menor.

Precauciones Generales

Llevar a cabo la prueba en condiciones que limiten la presencia de partículas, preferentemente en un gabinete con flujo de
aire laminar.
Lavar muy cuidadosamente el material de vidrio y de ensamblaje para filtración usados, excepto los filtros de membrana,
con una solución de detergente tibia, y enjuagar con cantidades abundantes de agua para eliminar todo rastro de detergente.
Inmediatamente antes de usar, enjuagar ambos lados del filtro de membrana y el equipo desde arriba hacia abajo, por afuera y
luego por adentro, con agua exenta de partículas.
Para verificar que el ambiente es adecuado para la prueba, que el material de vidrio y el filtro de membrana se han limpiado
correctamente y que el agua a usar se encuentra exenta de partículas, llevar a cabo la siguiente prueba: determinar la presen-
cia de partículas en 50 mL de agua exenta de partículas, según el método que se describe más adelante. Si más de 20 partículas
con un tamaño igual o mayor de 1O µm o si más de cinco partículas con un tamaño igual o mayor de 25 µm están presentes
718 (788) Partículas en Inyectables / Pruebas Físicas USP 40

dentro del área de filtración, las precauciones tomadas para la prueba no son suficientes. Se deben repetir las etapas prepara-
torias hasta que el ambiente, material de vidrio, filtro de membrana y agua sean adecuados para la prueba.

Método
Mezclar el contenido de las muestras invirtiendo el envase lentamente 20 veces sucesivas. Si fuera necesario, quitar cuidado-
samente el cierre de sellado. Limpiar la superficie exterior de la apertura del envase empleando un chorro de agua exenta de
partículas y quitar el cierre, evitando la contaminación del contenido.
Para preparaciones parenterales de gran volumen, se analizan unidades individuales. Para preparaciones parenterales de pe-
queño volumen de menos de 25 mL, combinar el contenido de 1O o más unidades en un recipiente limpio; la solución de
prueba puede prepararse mezclando el contenido de un número adecuado de viales y diluyéndolo hasta 25 mL con agua exen-
ta de partículas o con un disolvente exento de partículas apropiado cuando el agua exenta de partículas no es adecuada. Las
preparaciones parenterales de pequeño volumen con un volumen de 25 mL o más pueden analizarse individualmente.
Reconstituir los polvos para uso parenteral con agua exenta de partículas o con un disolvente exento de partículas adecuado
cuando el agua exenta de partículas no es adecuada.
El número de muestras de prueba debe ser suficiente para proporcionar una evaluación estadísticamente válida. Para prepa-
raciones parenterales de gran volumen o de pequeño volumen con un volumen de 25 mL o más, se pueden analizar menos de
1O unidades, empleando un plan de muestreo adecuado.
Humedecer con varios mL de agua exenta de partículas el interior del soporte de filtro provisto con el filtro de membrana.
Transferir al embudo de filtración el volumen total de una solución combinada o una unidad individual y aplicar vacío. Si fuera
necesario, agregar gradualmente porciones de la solución hasta filtrar todo el volumen. Después de la última adición de solu-
ción, empezar a enjuagar las paredes internas del soporte de filtro empleando un chorro de agua exenta de partículas. Mante-
ner el vacío hasta que la superficie del filtro de membrana se encuentre exenta de líquidos. Colocar el filtro de membrana en
una placa de Petri y dejarlo secar al aire con la tapa ligeramente abierta. Después de que el filtro de membrana se haya secado,
colocar la placa de Petri en la platina del microscopio, recorrer todo el filtro de membrana bajo la luz reflejada por un dispositi-
vo de iluminación y contar el número de partículas mayores o iguales a 1O µm y el número de partículas mayores o iguales a
25 µm. Como alternativa, se permite el conteo parcial del filtro de membrana y la determinación del conteo total del filtro por
cálculos. Calcular el número medio de partículas para la preparación que se va a analizar.
El proceso de medición del tamaño de partículas usando la retícula circular se lleva a cabo estimando el diámetro equivalen-
te de la partícula en comparación con los círculos de referencia de 1O µm y 25 µm de la retícula. De esta forma, no se mueven
las partículas de sus lugares originales dentro del campo reticular y no se superponen en los círculos de referencia para la com-
paración. El diámetro interno de los círculos de referencia transparentes de la retícula se usa para medir las partículas blancas y
transparentes, mientras que el diámetro externo de los círculos de referencia negro opaco de la retícula se usa para medir el
tamaño de las partículas oscuras.
Cuando se realiza la Prueba de Conteo Microscópico de Partículas, no se debe intentar la medición o el conteo de materiales
amorfos, semi líquidos, o morfológicamente indiferenciados y que tengan la apariencia de una mancha o decoloración en el
filtro de membrana. Estos materiales muestran poco o ningún relieve y presentan un aspecto gelatinoso o similar al de una
película. En tales casos, puede facilitarse la interpretación del conteo analizando una muestra de la solución mediante la Prueba
de Conteo de Partículas por Obstrucción de Luz.

Evaluación

Para preparaciones suministradas en envases con un volumen nominal de más de 100 mL, aplicar los criterios de la Prueba
2.A.
Para preparaciones suministradas en envases con un volumen nominal de menos de 100 mL, aplicar los criterios de la Prueba
2.B.
Para preparaciones suministradas en envases con un volumen nominal de 100 mL, aplicar los criterios de la Prueba 2.8.
[NOTA-La Farmacopea japonesa usa la Prueba 2.A.]

PRUEBA 2.A

Soluciones para infusión parenteral o soluciones para inyección suministradas en envases con un contenido nominal de
más de 100 ml: La preparación cumple con la prueba si el número promedio de partículas presente en las unidades analiza-
das no excede de 12 partículas iguales o mayores de 1O µm por mL y no excede de 2 partículas iguales o mayores de 25 µm
por mL.

PRUEBA 2.B

Soluciones para infusión parenteral o soluciones para inyección suministradas en envases con un contenido nominal de
menos de 100 mL: La preparación cumple con la prueba si el número promedio de partículas presente en las unidades anali-
USP 40 Pruebas Físicas/ (789) Partículas en Soluciones Oftálmicas 719

zadas no excede de 3000 partículas iguales o mayores de 1 O µm por envase y no excede de 300 partículas iguales o mayores
de 25 µm por envase.

(789) PARTÍCULAS EN SOLUCIONES OFTÁLMICAS

Las partículas están formadas por sustancias extrañas, móviles, de diversos orígenes, que no son burbujas de gas, que no
pueden cuantificarse por medio de un análisis químico debido a la pequeña cantidad de material que representan y debido a
su composición heterogénea. Las soluciones oftálmicas deben estar esencialmente exentas de partículas que se puedan obser-
var en una inspección visual. Las pruebas aquí descritas son pruebas físicas desarrolladas con el propósito de contar las partícu-
las extrañas dentro de intervalos específicos de tamaño.
Cada solución oftálmica está sujeta a los límites de partículas establecidos para la prueba que se esté aplicando, a menos que
se especifique algo diferente en la monografía individual. Cuando sean adecuados límites más altos, éstos estarán especificados
en la monografía individual. Las preparaciones oftálmicas que sean suspensiones, emulsiones o geles están exentas de estos
requisitos, al igual que lo están los dispositivos médicos. Consultar la monografía específica cuando surja alguna duda sobre la
aplicación de la prueba.
Los procedimientos de obstrucción de luz y microscópico para la determinación de partículas en soluciones oftálmicas son
idénticos a los de las inyecciones; por lo tanto, cuando corresponda, habrá una referencia cruzada con Partículas en Inyectables
(788). Este capítulo describe un método de prueba consistente en dos etapas. En primer lugar, la solución oftálmica se analiza
por medio del procedimiento de obstrucción la luz (etapa 1). Si no cumple con los límites establecidos, se debe pasar a la
prueba microscópica (etapa 2) con sus límites propios. Cuando por razones técnicas la solución oftálmica no pueda ser analiza-
da por obstrucción de luz, se podrá utilizar la prueba microscópica exclusivamente. Se requiere documentación que demuestre
que no se puede analizar la solución oftálmica por el procedimiento de obstrucción de luz, o que éste produce resultados invá-
lidos.
Se espera que la mayoría de los artículos cumplan con los requisitos usando simplemente la prueba de obstrucción de luz;
sin embargo podría ser necesario someter algunos artículos a la prueba de obstrucción de luz seguida de la prueba microscópi-
ca para determinar en forma concluyente si se cumple con los requisitos. Todo producto que no sea una solución pura y que
tenga una transparencia y viscosidad que se aproximen a las del agua puede proporcionar datos erróneos cuando se lo analiza
con el método de conteo por obstrucción de luz. Estos materiales pueden analizarse por medio del método de conteo micros-
cópico. En ciertos casos, la viscosidad de un material a analizar puede ser lo suficientemente alta como para impedir el análisis
por cualquiera de los dos métodos de prueba. En este caso, se puede realizar una dilución cuantitativa con un diluyente ade-
cuado para reducir la viscosidad lo necesario y permitir la realización del análisis.
En las pruebas descritas a continuación, los resultados obtenidos al examinar una unidad discreta o un grupo de unidades
para detectar la presencia de partículas no pueden extrapolarse con certeza a otras unidades que no fueron examinadas. Por lo
tanto, si se desean realizar inferencias válidas a partir de los datos observados para caracterizar el nivel de partículas en un gru-
po grande de unidades, se deben desarrollar planes de muestreo estadísticamente confiables basados en factores de operación
conocidos. Los planes de muestreo deben basarse en el volumen de producto, el número de partículas encontrado histórica-
mente en comparación con los límites, la distribución de tamaños de partículas presentes y la variabilidad del conteo de partí-
culas entre unidades.

PRUEBA DE CONTEO DE PARTÍCULAS POR OBSTRUCCIÓN DE LUZ

Esta prueba se aplica a las soluciones oftálmicas, incluidas las soluciones que han sido reconstituidas a partir de sólidos estéri-
les, para los cuales se especifica una prueba de detección de Partículas en la monografía individual. La prueba cuenta las partí-
culas sólidas o líquidas en suspensión.

Aparato de Prueba, Normalización del Instrumento, Entorno de Prueba, Procedimiento de Prueba

y Cálculos
Proceder como se indica en la Prueba de Conteo de Partículas por Obstrucción de Luz en Partículas en Inyectables (788).

1nterpretación

La solución oftálmica cumple con los requisitos de la prueba si el número promedio de partículas presente en las unidades
analizadas no excede del valor adecuado que se indica en la Tabla 7. Si el número promedio de partículas excede del límite,
analizar el artículo mediante la Prueba de Conteo de Partículas Microscópicas.
720 (789) Partículas en Soluciones Oftálmicas / Pruebas Físicas USP 40

Tabla 1. Prueba de Conteo de Partículas por Obstrucción de Luz

Diámetro
210 µm 1 250 µm
Número de partículas 50 por ml 1 2/ml

PRUEBA DE CONTEO MICROSCÓPICO DE PARTÍCULAS

Algunos artículos no pueden analizarse en forma satisfactoria con el método de obstrucción de luz. En dichos casos, las mo-
nografías individuales especifican claramente que sólo se debe realizar un recuento microscópico de partículas. La prueba de
recuento de partículas microscópicas enumera partículas subvisibles, esencialmente sólidas, en soluciones oftálmicas, luego de
recogerlas sobre un filtro de membrana microporosa. Algunas soluciones oftálmicas, tales como soluciones que no se filtran
fácilmente debido a su alta viscosidad, pueden quedar exentas de análisis utilizando la prueba microscópica.
Cuando se realiza la prueba microscópica, no se debe intentar la medición o el conteo de materiales amorfos, semilíquidos o
morfológicamente indiferenciados de algún otro modo y que tengan la apariencia de una mancha o coloración en la superficie
de la membrana. Estos materiales muestran poco o ningún relieve en la superficie y presentan un aspecto gelatinoso o similar
al de una película. Debido a que este material en solución consiste en unidades en el orden de 1 µm o menores, que se pue-
den contar sólo después de la agregación o deformación en una membrana analítica, puede facilitarse la interpretación del
recuento analizando una muestra de la solución por medio del método de recuento de partículas por obstrucción de luz.

Aparato de Prueba, Entorno de Prueba, Procedimiento de Prueba y Enumeración de Partículas

Proceder según se indica para la Prueba de Conteo de Partículas Microscópicas en Partículas en Inyectables (788).

1nterpretación

La solución oftálmica cumple con los requisitos de la prueba si el número promedio de partículas presente en las unidades
analizadas no excede del valor adecuado que se indica en la Tabla 2.
Tabla 2. Conteo de Partículas por Método Microscópico
Diámetro
210 µm J 22Sµm J 2SOµm
Número de partículas 50 por ml J 5 por mL J 2 por ml

(790) PARTÍCULAS VISIBLES EN INYECTABLES

INTRODUCCIÓN
Todos los productos destinados para administración parenteral deben inspeccionarse visualmente para determinar la presen-
cia de partículas conforme a lo especificado en el capítulo Medicamentos Inyectables y en Implantes (1 ). Los sólidos secos, a
partir de los cuales se preparan las soluciones reconstituidas para inyección, cumplen con los requisitos para Totalidad y trans-
parencia de soluciones en Medicamentos Inyectables y en Implantes (1) cuando se preparan justo antes de su uso. A lo largo de
este capítulo, el término esencialmente libre de significa que, cuando los medicamentos inyectables se inspeccionan conforme a
lo descrito en este capítulo, no se observan partículas visibles en un número de unidades mayor al especificado. Las partículas
se definen en el capítulo Partículas en Inyectables (788) como partículas extrañas móviles no disueltas, que no son burbujas de
gases, involuntariamente presentes en las soluciones. Ver Partículas Subvisibles en Inyectables de Proteínas Terapéuticas (787)
para información adicional sobre partículas inherentes, intrínsecas y extrínsecas. Entre los ejemplos de dichas partículas se in-
cluye, entre otros, fibras, vidrio, metal, materiales elastoméricos y precipitados. No obstante, algunos productos pueden conte-
ner partículas inherentes o aglomerados; en tales casos, los requisitos para estas específicas partículas visibles se especifican en
la monografía individual o en la solicitud reglamentaria aprobada pero son aplicables los criterios de control y aceptación para
partículas extrañas que se describen en este capítulo.
Cuando las características del contenido o del sistema de envase-cierre limita la capacidad de inspección del contenido to-
tal, se debe inspeccionar una muestra de los envases de la partida como complemento de la inspección al 1 00%, mediante la
inspección del contenido reconstituido o retirado de los envases (polvos secos, envases ámbar oscuros, suspensiones, o líqui-
dos con colores intensos) de una muestra de los envases de la partida. Las características destructivas de estas pruebas requiere
USP 40 Pruebas Físicas/ (791) pH 721

el uso de una muestra más pequeña 1 que el muestreo aceptable tradicionalmente utilizado en pruebas no destructivas luego
de la inspección al 100%. Aunque las pruebas descritas en este capítulo pueden ser útiles durante la realización de estudios
para examinar la estabilidad del producto, este capítulo no pretende establecer requisitos nuevos de análisis para estudios de
estabilidad.

PROCEDIMIENTO DE INSPECCIÓN
Cuando se usa junto con una inspección al 100% durante el proceso de fabricación, este procedimiento resulta suficiente
para demostrar que la partida está esencialmente exenta de partículas visibles. No obstante, un programa completo para el
control y monitoreo de partículas continúa siendo un prerrequisito esencial.
Las unidades inspeccionadas deben estar exentas de partículas visibles cuando se examinan sin aumento (excepto la correc-
ción óptica, según se requiera para establecer una visión normal) contra un fondo negro y contra un fondo blanco. La ilumina-
ción en el punto de inspección se mantiene a una intensidad mínima de entre 2000 y 3750 lux, lo cual se puede lograr me-
diante el uso de dos lámparas fluorescentes de 13 W ó 15 W (p.ej., Fl 3/T5 ó Fl 5/T8). Se recomienda el uso de un balastro de
alta frecuencia para reducir el parpadeo de las lámparas fluorescentes. Asimismo, son aceptables las fuentes de luz alternativas
(p.ej., incandescentes, diodo emisor de luz o LED, por sus siglas en inglés) que proveen iluminación en el punto de inspección
dentro del intervalo de intensidad mínimo especificado. Se recomienda una intensidad de iluminación mayor para examinar
soluciones coloreadas o productos en envases de materiales diferentes al vidrio transparente.
Antes de realizar la inspección, retirar cualquier etiqueta adherida al envase, y lavar y secar el exterior del mismo. La unidad
que se va a inspeccionar debe agitarse por rotación suave y/o invertirse, asegurando que no se produzcan burbujas de aire, e
inspeccionarse durante aproximadamente 5 segundos contra cada fondo. Se debe registrar la presencia de cualquier partícula.

Muestreo para la Liberación de Partidas (a Continuación de la Inspección al 100% de la

Fabricación)

Muestrear e inspeccionar la partida usando las normas ANSl/ASQ Zl .4 (ó ISO 2859-1 ). Inspección General de Nivel 11, planes
de muestreo individual para inspección normal con un límite de calidad de aceptación (AQL, por sus siglas en inglés) de
0,65%. Resultan aceptables los planes de muestreo alternativos con una protección equivalente o mejor. No más que el núme-
ro de unidades especificadas contiene partículas visibles.

Producto en Distribución 2

Si fuese necesario evaluar el producto que se ha enviado a los clientes (p.ej., debido a una queja o interés reglamentario),
muestrear e inspeccionar 20 unidades. Si no se observan partículas en la muestra, la partida se considera esencialmente libre
de partículas visibles. Si se encuentran disponibles, pueden examinarse unidades adicionales para obtener mayor información
sobre el riesgo de presencia de partículas en la partida.

(791) pH

INTRODUCCIÓN
Para propósitos farmacopeicos, el pH se define como el valor dado por un sensor potenciométrico adecuado, apropiada-
mente calibrado y un sistema de medición. [NOTA-El sistema de medición comúnmente recibe el nombre de "medidor de
pH." Aunque el medidor de pH aún es de uso común, el sistema de medición también puede incluirse dentro del sensor de pH
y la señal de pH se puede transmitir de manera digital a un dispositivo externo tal como una computadora, Controlador Lógi-
co Programable (PLC, por sus siglas en inglés), Sistema de Control Distribuido (DCS, por sus siglas en inglés), sistema de ad-
quisición de datos, terminal u otro dispositivo controlado por microprocesador.] Por definición, el pH es igual a -log 10 [aH +],
donde aH+ es la actividad del ion hidrógeno (H+) o del ion hidronio (Hp+) y la actividad de iones de hidrógeno se aproxima de
manera muy cercana a la concentración de iones de hidrógeno.
La escala práctica del pH se define de la siguiente manera:

pH = pH 5 +[(E - E5 )/k]

1 Los planes de muestreo con niveles especiales descritos en las normas ANSl/ASQ Z1 .4-2008 o ISO 2859 son apropiados para su uso como guías en la selección
del tamaño de la muestra y de los criterios de aceptación para este propósito.
2 El análisis descrito en Producto en Distribución es permisible únicamente si el Muestreo para la Liberación de Partidas (A Continuación de la Inspección al 700% de la
Fabricación) se ha realizado exitosamente.
722 (791) pH / Pruebas Físicas USP 40

E = potencial medido cuando la celda galvánica contiene la solución en análisis (pH)

E5 =potencial medido cuando la celda galvánica contiene la solución amortiguadora de calibración apropiada (pH 5)
k =cambio en el potencial/cambio de unidad en el pH y se deriva de la ecuación de Nernst (según se indica a continua-
ción)

k = log.(1 O) x (RT/nF)

R = 8, 314 j/mol/ºK
T = temperatura (ºK)
n = moles/reacción media
F = constante de Faraday, 96485 C/mol
La ecuación resultante es [0,05916 + 0,0001984(T - 25º)] voltios a la temperatura T. Los valores de k de 15º-35º se proveen
en la Tabla 7.
Tabla 1. Valores de k para Diversas Temperaturas
Temperatura k
(ºC) (V)
15,00 0,05718
20,00 0,05817
25,00 0,05916
30,00 0,06016
35,00 0,06115

Los valores de k a otras temperaturas pueden determinarse a partir de la ecuación anterior. Para propósitos prácticos, los
valores de k se determinan a partir de la calibración del sensor de pH.

SISTEMA DE MEDICIÓN DE PH
El sistema de medición consta de: (1) un electrodo de medición sensible a la actividad de iones de hidrógeno, por lo regular
un electrodo de vidrio, aunque son posibles otros tipos de electrodos, (2) un electrodo de referencia adecuado, por ejemplo,
un electrodo de plata-cloruro de plata y (3) un sistema de medición de voltaje con una resistencia de entrada capaz de medir
a una impedancia de entrada alta del sensor de pH. El electrodo de medición y de referencia pueden estar separados o combi-
nados. El sistema de medición de voltaje puede estar separado del sensor de pH o integrado en el sensor. Para la mayoría de
las aplicaciones, será necesaria una medición de la temperatura para compensar la influencia de la temperatura descrita ante-
riormente en la ecuación de Nernst. Se puede incluir un dispositivo de temperatura en el sensor de pH, o se puede usar un
dispositivo de temperatura externo.

REQUISITOS INSTRUMENTALES
El sistema de medición debe ser capaz de llevar a cabo una calibración del pH de dos puntos (o más) (ver más adelante). La
exactitud del sistema de medición de pH se describe en la sección Calibración. La resolución del sistema de medición de pH
debe ser al menos un pH de 0,01. El instrumento deberá ser capaz de compensar la temperatura en la medición del sensor de
pH para convertir la señal de milivoltios en unidades de pH a cualquier temperatura, ya sea de forma automática usando un
dispositivo de temperatura incorporado en el sistema del sensor o mediante el ingreso manual de la temperatura de la muestra
en el sistema de medición. La exactitud del sistema de medición de la temperatura deberá ser± 1º. La resolución del sistema de
medición de la temperatura deberá ser de al menos 0, 1º. Las mediciones de pH realizadas en los laboratorios por lo regular se
realizan a 25 ± 2º, a menos que se especifique algo diferente en la monografía individual o en este capítulo. No obstante, resul-
tan aceptables temperaturas fuera de este intervalo si la preparación de las muestras es más conveniente a temperaturas alter-
nativas. Los ejemplos de mediciones no realizadas en los laboratorios incluyen muestras de prueba del interior de las tuberías
del proceso, vasos y tanques, así como otras condiciones de procesamiento no estándar. [NOTA-Las definiciones de pH, de la
escala de pH y de los valores asignados a las soluciones amortiguadoras de calibración se proveen con el propósito de estable-
cer un sistema práctico y operativo, de modo que los resultados puedan compararse entre laboratorios. Los valores de pH me-
didos no necesariamente corresponden de manera exacta con los obtenidos por la definición, pH = -log aH+, sino que los valo-
res obtenidos están estrechamente relacionados con la actividad del ion hidrógeno en soluciones acuosas.] [NOTA-Cuando un
sistema de medición de pH se calibra usando una solución amortiguadora acuosa y luego se usa para medir el "pH" desiste-
mas no acuosos, se presentan cambios en la constante de ionización del ácido o de la base, la constante dieléctrica del medio,
el potencial de unión líquida (que puede originar errores de aproximadamente 1 unidad de pH), así como en la respuesta del
ion hidrógeno del electrodo de vidrio. Por estas razones, los valores así obtenidos con soluciones que solo son de naturaleza
parcialmente acuosa se pueden considerar únicamente como valores aparentes de pH.]
USP 40 Pruebas Físicas/ (791) pH 723

SOLUCIONES AMORTIGUADORAS DE CALIBRACIÓN DEL SISTEMA DE MEDICIÓN DE PH

Las soluciones amortiguadoras de calibración se preparan conforme a lo indicado en la Tabla 2. 1 Las sales de pureza requeri-
da para preparar soluciones amortiguadoras se pueden obtener del Instituto Nacional de Normas y Tecnología, de otras auto-
ridades nacionales o de otros proveedores. Las soluciones amortiguadoras deben almacenarse en envases apropiados que ase-
guren la estabilidad del pH hasta la fecha de caducidad y que estén equipados con un cierre hermético. Para soluciones amor-
tiguadoras con valores superiores a 11, el almacenamiento debe realizarse en envases que sean resistentes al dióxido de carbo-
no o que minimicen su intrusión, ya que esto podría disminuir el pH de la solución amortiguadora. En el caso de soluciones
amortiguadoras con valores menores de 11, por lo regular deben prepararse en intervalos que no excedan de 3 meses. Las
soluciones amortiguadoras con valores superiores a 11, comúnmente deben prepararse y usarse en el momento a menos que
se restrinja el ingreso de dióxido de carbono. Todas las soluciones amortiguadoras deben prepararse usando Agua Purificada.
La Tabla 2 indica el pH de las soluciones amortiguadores como una función de la temperatura. Las instrucciones presentadas
en este capítulo están destinadas a la preparación de soluciones con las concentraciones molales (m) designadas. Sin embargo,
para facilitar su preparación, las instrucciones se proveen en molaridad. La diferencia entre la concentración de preparaciones
molales y molares para estas soluciones amortiguadoras es menos de 1% y la diferencia de pH es inapreciable. La calibración
usando soluciones amortiguadoras debe realizarse en el intervalo de temperatura de las soluciones amortiguadoras listadas en
la Tabla 2. [NOTA-La compensación de temperatura en la ecuación de Nernst corrige únicamente el cambio que produce la
temperatura en los milivoltios de salida del electrodo, no el cambio real del pH de la solución amortiguadora con la temperatu-
ra, el cual es único para cada solución amortiguadora.] Se encuentran disponibles características tales como reconocimiento
automático de solución amortiguadora o corrección del pH-temperatura de la solución amortiguadora que proveen conve-
niencia al acomodar la influencia de la temperatura sobre las soluciones amortiguadoras. La respuesta de pH-temperatura se
puede determinar a partir de los valores en la Tabla 2.
Tabla 2. Valores de pH de Soluciones Amortiguadoras de Calibración
Carbona-
to de
Fosfato Sodio,
Diácido de 0,025 M
Potasio, y Hidróxi-
Tartrato 0,0087 My Tetra Bicarbo- do
Tetra Ácido Citrato Fosfato Fosfato Borato nato de Cal-
Tempera- oxalato de Potasio, Dlácido Biftalato Equimo- Ácido de- de So- cio,
tura de Potasio, Saturado de Potasio, de Potasio, lal, Disódico, Sodio, dio, Saturado
(ºC) 0,05 m a 25º 0,05M 0,05 m 0,05m 0,0303 M 0,01 m 0,025 M a 25º
10 1,67 - - 4,00 6,92 - 9,33 - 13,00
15 1,67 - 3,80 4,00 6,90 7,45 9,28 10,12 12,81
20 1,68 - 3,79 4,00 6,88 7,43 9,23 10,06 12,63
25 1,68 3,56 3,78 4,01 6,86 7,41 9,18 10,01 12,45
30 1,68 3,55 3,77 4,02 6,85 7,40 9,14 9,97 12,29
35 1,69 3,55 3,76 4,02 6,84 7,39 9,10 9,93 12, 13
40 1,69 - - 4,04 6,84 - 9,07 - 11,98
45 1,70 - - 4,05 6,83 - 9,04 - 11,84
50 1,71 - - 4,06 6,83 - 9,01 - 11,71
55 1,72 - - 4,08 6,83 - 8,99 - 11,57
60 1,72 - - 4,09 6,84 - 8,96 - 11,45
t.pH/ t.ºC 0,0010 -0,0014 -0,0022 0,0018 -0,0016 -0,0028 -0,0074 -0,0096 -0,0310

La preparación de volúmenes alternativos a las mismas concentraciones que las indicadas más adelante es aceptable.
Tetraoxalato de potasio, 0,05 m: Disolver 12,61 g de KH 3 (CzÜ 4 ) 2 • 2Hp y diluir con agua hasta obtener 1000,0 ml.
Tartrato ácido de potasio, saturado a 25º: Agregar C4 HsK0 6 a agua hasta exceder la saturación a 25º. Posteriormente,
filtrar o decantar.
Citrato diácido de potasio, 0,05 M: Disolver 11,41 g de C6 H7 K0 4 y diluir con agua hasta obtener 1000,0 mL.
Biftalato de potasio, 0,05 m: Disolver 1O,12 g de KHC 8 H4 0 4 , previamente secados a 11 Oº durante 1 hora y diluir con
agua hasta obtener 1000,0 mL.
Fosfato equimolal, 0,05 m: Disolver 3,53 g de fosfato ácido disódico (Na 2 HP04 ) y 3,39 g de fosfato diácido de potasio
(KH 2 P0 4 ), cada uno previamente secado a 120º durante 2 horas y diluir con agua hasta obtener 1000,0 ml.

1 Se pueden usar soluciones amortiguadoras disponibles comercialmente para el sistema de medición de pH, calibradas mediante métodos rastreables al Instituto
Nacional de Normas y Tecnología (NIST, por sus siglas en inglés) u otras autoridades nacionales, cuya etiqueta indique un valor de pH con una exactitud de 0,02
unidades de pH. Se pueden usar soluciones preparadas a partir de los materiales de grado reactivo de la ACS u otros materiales adecuados, siempre y cuando el pH
de la solución resultante sea el mismo que el de la solución preparada a partir del material certificado del NIST (u otras autoridades nacionales). Las soluciones
amortiguadoras con valores superiores a 12 deben usarse inmediatamente o se deben preparar usando agua recientemente calentada a ebullición y almacenarse
en condiciones que minimicen la absorción y el ingreso de dióxido de carbono.
724 (791) pH / Pruebas Físicas USP 40

Fosfato diácido de potasio, 0,0087 M y fosfato ácido disódico, 0,0303 M: Disolver 1, 18 g de KH 2 P04 y 4,30 g de
Na2 HP0 4 , ambos secados durante 2 horas a 120 ± 2º, y diluir con agua hasta obtener 1000,0 ml.
Tetraborato de sodio, 0,01 m: Disolver 3,80 g de Na 2 B4 0 7 • 1 OH 2 0 y diluir con agua hasta obtener 1000,0 ml. Proteger
de la absorción de dióxido de carbono.
Carbonato de sodio, 0,025 M y bicarbonato de sodio, 0,025 M: Disolver 2,64 g de carbonato de sodio (Na 2 C0 3) y 2,09
g de bicarbonato de sodio (NaHC0 3) y diluir con agua hasta obtener 1000,0 ml.
Hidróxido de calcio, saturado a 25º: Agregar Ca(OH) 2 a agua hasta exceder la saturación a 25º. Usar agua recientemente
calentada a ebullición y protegida de la atmósfera para limitar la absorción de dióxido de carbono. Posteriormente, filtrar o
decantar.

CALIBRACIÓN

Debido a las variaciones en la naturaleza y operación de los sistemas de medición de pH disponibles, resulta poco práctico
proveer instrucciones universales para la calibración del sistema de medición. Sin embargo, los párrafos siguientes establecen
los principios generales a seguir. Examinar los electrodos, especialmente el electrodo de referencia y el nivel de electrólito,
cuando se usa un electrólito líquido. Si fuera necesario, volver a llenar el suministro de electrólito y tomar las demás precaucio-
nes indicadas por los fabricantes del instrumento y el electrodo.
La calibración o verificación del sistema de medición de pH debe realizarse periódicamente. El desempeño histórico del siste-
ma de medición, la criticidad de la medición de pH, el mantenimiento del sensor de pH y la frecuencia de la operación de
medición se usan para determinar la frecuencia de la calibración/verificación. Además del proceso de calibración de dos puntos
que se describe a continuación, pueden estar disponibles otros métodos de puntos múltiples, los cuales son aceptables si se
cumple con los criterios de pendiente y de desplazamiento del sensor de pH (ver el paso 1O), así como con la exactitud de la
calibración (ver el paso 14).
Si el pH de la solución amortiguadora es sensible al dióxido de carbono ambiental, entonces usar Agua Purificada que se
haya calentado a ebullición recientemente y que se haya almacenado posteriormente en un envase diseñado para minimizar el
ingreso de dióxido de carbono.
1. Para calibrar el sistema de medición de pH, seleccionar tres soluciones amortiguadoras de calibración, de preferencia las
provistas en la Tabla 2, de modo que el pH esperado del material en análisis caiga dentro de su intervalo. Se usan dos de
las soluciones amortiguadoras para el proceso de calibración, y la tercera solución amortiguadora se usa para la verifica-
ción. El valor de la solución amortiguadora de verificación deberá estar entre dos de los valores de las soluciones amorti-
guadoras de calibración. Si el intervalo operativo del sensor de pH está fuera del intervalo de pH de las soluciones amorti-
guadoras en la Tabla 2, entonces 1) seleccionar dos soluciones amortiguadoras en la Tabla 2 con pH cercano o 2) selec-
cionar una de la Tabla 2 y otra solución amortiguadora preparada y documentada que esté fuera del intervalo.
2. Enjuagar el sensor de pH varias veces con agua y luego con la primera solución amortiguadora.
3. Sumergir el sensor de pH en la primera solución amortiguadora a una temperatura dentro del intervalo de la Tabla 2.
4. Si la medición de temperatura y la compensación automáticas no se incluyen en el sistema de medición, ingresar manual-
mente en el instrumento la temperatura de la solución amortiguadora y el valor de pH de la solución amortiguadora a
dicha temperatura. Para las temperaturas que no se encuentren listadas en la Tabla 2, usar interpolación lineal para deter-
minar el valor de pH como una función de temperatura.
5. Iniciar la secuencia de calibración de dos puntos con la primera solución amortiguadora de acuerdo con las instrucciones
del fabricante.
6. Retirar el sensor de pH de la primera solución amortiguadora y enjuagar los electrodos con agua y luego con la segunda
solución amortiguadora.
7. Sumergir el sensor de pH en la segunda solución amortiguadora a una temperatura dentro del intervalo de la Tabla 2.
8. Si la medición de temperatura y la compensación automáticas no se incluyen en el sistema de medición, ingresar manual-
mente en el instrumento la temperatura de la solución amortiguadora y el valor de pH de la solución amortiguadora a
dicha temperatura.
9. Continuar la secuencia de calibración de dos puntos con la segunda solución amortiguadora de acuerdo con las instruc-
ciones del fabricante.
1O. Después de completar el proceso de calibración de dos puntos, verificar que la pendiente y el desplazamiento de pH es-
tén dentro de los parámetros aceptables. Los parámetros típicos aceptables son una pendiente de 90%-105% y un des-
plazamiento de O± 30 mV (0,5 unidades de pH a 25º C). Dependiendo del instrumental de pH, la pendiente y el despla-
zamiento de pH se pueden determinar mediante software o métodos manuales. Si se usan métodos manuales, seguir las
instrucciones del proveedor para calcular la pendiente/desplazamiento del sensor de pH. Si estos parámetros no están
dentro de los parámetros aceptables, se debe limpiar el sensor apropiadamente, volver a llenarlo, realizar un servicio de
mantenimiento o reemplazarlo, y se debe repetir el proceso de calibración de dos puntos.
11. Retirar el sensor de pH de la segunda solución amortiguadora y enjuagar minuciosamente con agua y, posteriormente,
con la solución amortiguadora de verificación.
12. Sumergir el sensor de pH en la solución amortiguadora de verificación a una temperatura dentro del intervalo de la Tabla
2.
USP 40 Pruebas Físicas/ (795) Preparación Magistral-Preparaciones No Estériles 725

13. Si la medición de temperatura y la compensación automáticas no se incluyen en el sistema de medición, ingresar manual-
mente en el instrumento la temperatura de la solución amortiguadora y el valor de pH de la solución amortiguadora a
dicha temperatura.
14. La lectura de pH deberá estar dentro de ±0,05 unidades de pH del valor en la Tabla 2 a la temperatura de la solución
amortiguadora.

OPERACIÓN

Todas las muestras de prueba deben prepararse usando Agua Purificada, a menos que se especifique algo diferente en la
monografía. Todas las mediciones de prueba deben usar compensación de temperatura en la ecuación de Nernst manual o
automática.
1. Preparar el material de prueba de acuerdo con los requisitos en la monografía o de acuerdo con procedimientos específi-
cos. Si el pH de la muestra de prueba es sensible al dióxido de carbono ambiental, entonces usar Agua Purificada que se
haya calentado a ebullición recientemente y que se haya almacenado posteriormente en un envase diseñado para minimi-
zar el ingreso de dióxido de carbono.
2. Enjuagar el sensor de pH con agua, luego con algunas porciones del material de prueba.
3. Sumergir el sensor de pH en el material de prueba y registrar el valor de pH y la temperatura.
En todas las mediciones de pH, permitir un tiempo suficiente para la estabilización de la temperatura y la medición de pH.
Las funciones de diagnóstico tales como la medición de la resistencia del electrodo de vidrio o de referencia pueden estar
disponibles para determinar las deficiencias del equipo. Consultar con el proveedor del electrodo para información sobre he-
rramientas de diagnóstico para asegurar la función apropiada del electrodo.
Cuando sean suficientes los valores de pH aproximados, pueden ser adecuados los indicadores y papeles de prueba (ver
Indicadores y Papeles Indicadores y de Prueba).
Para información sobre soluciones amortiguadoras y sobre la composición de las soluciones amortiguadoras estándar reque-
ridas en las pruebas y valoraciones farmacopeicas, ver Soluciones Amortiguadoras en la sección Soluciones. Esta sección referida
no tiene el propósito de reemplazar el uso de las soluciones amortiguadoras de calibración de pH listadas en la Tabla 2.

(795) PREPARACIÓN MAGISTRAL-PREPARACIONES NO ESTÉRILES

INTRODUCCIÓN

El propósito de este capítulo es proporcionar a los preparadores pautas sobre la aplicación de buenas prácticas de prepara-
ción magistral para la preparación magistral de formulaciones no estériles para su dispensación y/o administración en huma-
nos o animales. La preparación magistral es una parte integral de la práctica farmacéutica y es esencial para brindar atención
médica. Este capítulo y las monografías aplicables sobre formulación ayudan a definir las buenas prácticas de preparación ma-
gistral. Asimismo, este capítulo proporciona información general para mejorar la capacidad del preparador en las instalaciones
de preparación magistral para que elabore preparaciones magistrales extemporáneas de contenido, calidad y pureza acepta-
bles. Los farmacéuticos, profesionales de la salud y demás personas implicadas en la preparación magistral de medicamentos
deben cumplir con las legislaciones, reglamentaciones y pautas estatales y federales sobre preparación magistral.

CATEGORÍAS DE LA PREPARACIÓN MAGISTRAL

Cada una de las tres categorías generales de preparaciones no estériles descritas en esta sección está asociada con diferentes
niveles de experiencia, capacitación e instalaciones físicas.
Los criterios usados para determinar la clasificación general incluyen:
• grado de dificultad o complejidad del proceso de preparación magistral
• información y advertencias sobre la estabilidad
• requisitos de envasado y almacenamiento
• formas farmacéuticas
• complejidad de los cálculos
• disposición biológica local contra sistémica
• nivel de riesgo para el preparador
• potencial de riesgo de daños al paciente
Ver Preparación Magistral-Preparaciones Estériles (797) para niveles de riesgo relacionados con preparaciones estériles. Las
áreas de especialidad tales como la de preparados radiofarmacéuticos requieren de capacitación especial y sobrepasan el alcan-
ce del presente capítulo. Los preparadores deberán adquirir y mantener conocimientos y habilidades en todas las áreas (p.ej.,
formas farmacéuticas, población de pacientes y especialidad médica) para las que elaboran preparaciones.
726 (795) Preparación Magistral-Preparaciones No Estériles/ Pruebas Físicas USP 40

Descripción de las Categorías

SIMPLE

Elaboración de una preparación que cuenta con una monografía de preparación magistral en la Farmacopea de los Estados
Unidos de América (USP) o que se presenta en un artículo de una publicación de referencia que contiene cantidades específicas
de todos los componentes, un procedimiento y equipo de preparación magistral y datos de estabilidad para dicha formulación
con las FLU apropiadas; o reconstitución o manipulación de productos comerciales que puedan requerir el agregado de uno o
más ingredientes según lo indicado por el fabricante. Entre los ejemplos se incluye Captopril, Solución Oral, lndometacina, Gel
Tópico y Bromuro de Potasio, Solución Oral para Uso Veterinario.

MODERADA

Elaboración de una preparación que requiere de cálculos o procedimientos especiales (tales como calibración de cavidades
en moldes de unidades de dosificación) para determinar las cantidades de los componentes por cada preparación o por cada
unidad de dosificación individualizada; o elaborar una preparación que carece de datos de estabilidad para su formulación es-
pecífica. Entre los ejemplos se incluye Sulfato de Morfina, Supositorios, trociscos de clorhidrato de difenhidramina y mezcla de
dos o más cremas fabricadas cuando no se conoce la estabilidad de la mezcla.

COMPLEJA

Elaboración de una preparación que requiere de capacitación, entorno de trabajo, instalaciones, equipo y procedimientos
especiales para asegurar resultados terapéuticos apropiados. Entre los ejemplos de posibles tipos de preparaciones complejas
se incluyen formas farmacéuticas transdérmicas, preparaciones de liberación modificada y algunos insertos y supositorios para
efectos sistémicos.

Cambio en la redacción:

RESPONSABILIDADES DEL PREPARADOR

La responsabilidad del preparador es obtener preparaciones magistrales de contenido, calidad y pureza aceptables de con-
formidad con la receta u orden de medicación. Además, es responsabilidad del preparador dispensar la preparación terminada,
con el envasado y etiquetado apropiados y conforme a los requisitos establecidos por las agencias estatales, consejos de farma-
cia estatales, legislaciones federales y demás agencias reglamentarias aplicables, cuando corresponda. Los individuos que parti-
cipen en la preparación magistral de medicamentos o suplementos dietéticos deberán tener la competencia necesaria en pre-
paración magistral y deberán expandir sus conocimientos continuamente sobre la preparación magistral participando en semi-
narios y/o estudiando la literatura apropiada. Además, deberán tener conocimiento sobre el contenido de este capítulo y estar
familiarizados con los capítulos (797), Formas Farmacéuticas (1151 ), •Cálculos .en fa Práctica Farmacéutica (1160)• (Af 01 .may-w17i,
Garantía de Calidad en la Preparación Magistral (1163),•Balanzas para Prescripciones y Aparatos Volumétricos Usados en Prepara-
ciones Magistrales (1176)• (AFOl-may-w17), (1191 ), Información Escrita de los Medicamentos Recetados-Guías (1265) y demás legis-
laciones, pautas y normas sobre preparación magistral aplicables.
Para asegurar la calidad de las preparaciones magistrales, los preparadores deberán apegarse a los siguientes principios ge-
nerales (se proporciona información adicional sobre estos principios generales en la sección siguiente).

Principios Generales de Preparación Magistral

1. El personal está capacitado de manera apropiada y tiene la competencia y calificaciones necesarias para realizar las tareas
asignadas. Dicha capacitación debe estar documentada.
2. Los ingredientes para la preparación magistral tienen la identidad, pureza y calidad apropiadas, se adquieren de fuentes
confiables, y se almacenan de manera apropiada de acuerdo con las especificaciones del fabricante o las normas USP.
3. Los envases de componentes a granel cuentan con las etiquetas apropiadas de comunicación de riesgo de la Occupatio-
nal Safety and Health Administration (OSHA) (ver www.OSHA.gov) y las Hojas de Datos de Seguridad de los Materiales
(MSDS, por sus siglas en inglés) para todos los fármacos y químicos usados en la preparación están disponibles para el
personal de preparación magistral.
4. Todo el equipo usado en la preparación magistral se conserva limpio, recibe el mantenimiento apropiado y se usa de ma-
nera apropiada.
5. El ambiente de preparación magistral es adecuado para su propósito previsto; y se implementan procedimientos para pre-
venir la contaminación cruzada, especialmente cuando se elaboran preparaciones con fármacos (p.ej., fármacos peligro-
sos y alérgenos conocidos como la penicilina) que requieren de precauciones especiales.
6. Sólo se permite personal autorizado en las inmediaciones de las operaciones de preparación magistral.
USP 40 Pruebas Físicas/ (795) Preparación Magistral-Preparaciones No Estériles 727

7. Existe garantía de que los procesos siempre se llevan a cabo según se especifica o en la forma prevista y que son reprodu-
cibles.
8. Las condiciones de la preparación magistral son adecuadas a fin de prevenir errores.
9. Todos los aspectos de la preparación magistral se documentan de manera apropiada.
1O. Existen procedimientos y registros adecuados para investigar y corregir fallas o problemas en la preparación magistral, el
análisis o la preparación misma.

PROCESO DE PREPARACIÓN MAGISTRAL

El preparador es responsable de asegurar que cada preparación magistral individual cumpla con los criterios provistos en
esta sección (se proporciona información adicional sobre estos criterios en las secciones siguientes).

Criterios para la Elaboración de una Preparación Magistral para Cada Fármaco

1. Se ha evaluado la aptitud de la dosis, la seguridad y el uso previsto de la preparación o dispositivo en términos de:
• las propiedades químicas y físicas de los componentes
• forma farmacéutica
• aptitud terapéutica y vía de administración, incluyendo la disposición biológica local y sistémica
• limitaciones legales, si las hubiera.
2. Se debe crear un Registro Maestro de Formulación antes de elaborar la preparación por primera vez. Este registro deberá
seguirse cada vez que se elabore dicha preparación. Además, debe completarse un Registro de Preparación Magistral cada
vez que se elabore una preparación.
3. Los ingredientes usados en la formulación deberán tener la identidad, calidad y pureza esperadas. Si la formulación es
para uso en humanos, los ingredientes no deberán estar incluidos en la lista de fármacos o medicamentos específicos re-
conocidos en instancias federales que hayan sido retirados o extraídos del mercado por razones de seguridad o eficacia
(ver www.FDA.gov). Si la formulación es para animales con los que se producen alimentos, los ingredientes no deberán
estar incluidos en una lista de componentes prohibidos para su uso en animales con los que se producen alimentos. Se
han consultado los Certificados de Análisis, cuando sea aplicable, y las MSDS para todos los ingredientes usados.
4. La preparación magistral se elabora en un área limpia y sanitizada de manera apropiada, dedicada a esta actividad (ver la
sección Instalaciones de Preparación MagistraD.
5. Se elabora únicamente una preparación a la vez en un espacio de trabajo específico.
6. Se ha seleccionado el equipo de preparación magistral apropiado y se ha inspeccionado su limpieza y funcionamiento
correcto, y se usa de manera apropiada.
7. Se establece una FLU confiable para asegurar que la preparación terminada tiene su potencia, pureza, calidad y caracterís-
ticas aceptadas, al menos hasta la FLU indicada en el etiquetado.
8. El personal que participa en la preparación magistral mantiene una buena higiene de manos y usa vestimenta limpia,
apropiada para el tipo de preparación magistral que se elabora (p.ej., protectores para el cabello, chaquetas, batas, guan-
tes, máscaras faciales, zapatos, delantales u otros artículos) según sea necesario para proteger al personal de la exposición
a sustancias químicas y para prevenir la contaminación de los fármacos.
9. La preparación se elabora de acuerdo con este capítulo, otras normas oficiales referidas en este capítulo, e información y
datos científicos pertinentes.
1O. El preparador verifica los procesos críticos (incluyendo, entre otros, pesaje, medición y mezclado) para asegurar que los
procedimientos, cuando se usen, darán constantemente como resultado la calidad esperada de la preparación terminada.
11. La preparación final se evalúa usando factores tales como peso, aptitud de mezclado, claridad, olor, color, consistencia,
pH y análisis analítico, según sea apropiado; y esta información se registra en el Registro de Preparación Magistral (ver
(1163)).
12. La preparación se envasa según se recomienda en la sección Envasado y Envases de Preparaciones Magistrales de este capí-
tulo.
13. El envase de la preparación se etiqueta de conformidad con todas las legislaciones estatales y federales aplicables. El eti-
quetado deberá incluir la FLU y la información de almacenamiento y manipulación. El etiquetado debe indicar que "ésta
es una preparación magistral".
14. El preparador ha revisado el Registro Maestro de Formulación y el Registro de Preparación Magistral para asegurarse que
no hayan ocurrido errores en el proceso de preparación magistral y que la preparación es adecuada para su uso.
15. La preparación se entrega al paciente o al proveedor de cuidados con la consulta apropiada.

INSTALACIONES DE PREPARACIÓN MAGISTRAL

Las instalaciones de preparación magistral deberán tener un espacio adecuado específicamente diseñado para preparar las
prescripciones. Este espacio deberá mantener la colocación ordenada del equipo y materiales para prevenir confusiones entre
ingredientes, envases, etiquetas, materiales en proceso y preparaciones terminadas; asimismo, su diseño, disposición y uso se
728 (795) Preparación Magistral-Preparaciones No Estériles/ Pruebas Físicas USP 40

enfoca en prevenir contaminación cruzada accidental. Las áreas destinadas a las preparaciones estériles deberán estar separa-
das y ser distintas de las usadas para las preparaciones no estériles (ver Preparación Magistral-Preparaciones Estériles (797), Cali-
dad y Control Ambienta/).
Se debe proveer agua potable para el lavado de manos y equipo. Esta agua cumple con normas establecidas en National
Primary Drinking Water Regulations (Reglamentaciones Básicas sobre Agua Potable) de la Environmental Protection Agency
(Agencia de Protección Ambiental) (40 CFR Parte 141 ). Se deberá usar Agua Purificada (ver la monografía de Agua Purificada)
para elaborar preparaciones de medicamentos no estériles cuando las formulaciones indiquen el uso de agua. Se debe usar
Agua Purificada para enjuagar el equipo y los utensilios. Cuando se usa agua para elaborar una preparación estéril, se deben
seguir las monografías y los capítulos generales apropiados (ver Agua para Uso Farmacéutico (1231 )).
El sistema de cañerías deberá estar libre de defectos que pudieran contribuir a la contaminación de las preparaciones magis-
trales. Se debe contar con acceso fácil a instalaciones de lavado de manos y equipo en las áreas de preparación magistral. Di-
chas instalaciones deberán incluir, entre otros, agua caliente y fría, jabón o detergente y secadores de aire o toallas desecha-
bles o de un solo uso. Las áreas usadas para la preparación magistral deberán mantenerse limpias, ordenadas y en condiciones
sanitarias, y deberán mantenerse en buenas condiciones de mantenimiento. La basura debe depositarse y desecharse de ma-
nera sanitaria y oportuna y de conformidad con las pautas locales, estatales y federales.
Toda el área de preparación magistral y de almacenamiento debe mantenerse bien iluminada. Hay que controlar los siste-
mas de calefacción, de ventilación y de aire acondicionado para evitar la descomposición y contaminación de los productos
químicos (ver Requisitos de Envasado y Almacenamiento (659) y las condiciones de almacenamiento dispuestas por el fabrican-
te). Se debe mantener un monitoreo adecuado de temperatura y humedad según se requiera para ciertos componentes y for-
mas farmacéuticas preparadas. Todos los componentes, equipos y envases deben almacenarse alejados del piso a fin de preve-
nir la contaminación y permitir la inspección y limpieza del área de elaboración y almacenamiento de la preparación magistral.
Los fármacos peligrosos deben ser almacenados, preparados y manipulados por personal adecuadamente capacitado en
condiciones que protejan a los trabajadores del cuidado de la salud y demás personal. A continuación se presentan referencias
para la manipulación segura de fármacos antineoplásticos y peligrosos en instalaciones de cuidados de la salud:
• OSHA Technical Manual (Manual Técnico de OSHA)-Sección VI: Capítulo 2, Controlling Occupational Exposure to Hazar-
dous Orugs (Control de Exposición Ocupacional a Fármacos Peligrosos)
• NIOSH Alert (Alerta de NIOSH): Preventing Occupational Exposure to Antineoplastic and Other Hazardous Drugs in Health
Care Settings(Prevención de Exposición Ocupacional a Fármacos Antineoplásticos y Otros Fármacos Peligrosos en Instala-
ciones de Cuidados de la Salud) [DHHS (NIOSH) Publicación No. 2004-165] y actualizaciones.
La eliminación de todos los fármacos peligrosos debe cumplir con todas las reglamentaciones federales y estatales corres-
pondientes. Todo el personal que lleve a cabo la eliminación de desechos y actividades de limpieza rutinaria en las áreas de
almacenamiento y preparación de fármacos peligrosos deberá estar capacitado en los procedimientos adecuados para prote-
gerse a sí mismos y prevenir la contaminación.

EQUIPO PARA ELABORAR LA PREPARACIÓN MAGISTRAL

El equipo y los utensilios usados para elaborar la preparación magistral de un medicamento deberán tener un diseño y capa-
cidad apropiados. Para no afectar ni alterar la pureza de las preparaciones, la composición del equipo deberá ser adecuada, de
modo que las superficies que entran en contacto con los componentes no reaccionen, no provoquen adiciones, ni los adsor-
ban. El tipo y las dimensiones del equipo dependen de las formas farmacéuticas y las cantidades que se preparen (ver (1176) y
los manuales de instrucciones suministrados por el fabricante del equipo).
El equipo deberá almacenarse para protegerlo de la contaminación y deberá estar ubicado de forma tal que se facilite su
uso, mantenimiento y limpieza. El equipo automatizado, mecánico, electrónico y de otros tipos usado en la elaboración o aná-
lisis de preparaciones magistrales deberá inspeccionarse de manera rutinaria, calibrarse según sea necesario, y verificarse para
asegurar el desempeño adecuado. El preparador deberá inspeccionar el equipo para determinar su aptitud de uso inmediata-
mente antes de realizar las operaciones de preparación magistral. El equipo deberá limpiarse apropiadamente después de su
uso.
Se debe tener extremo cuidado al limpiar el equipo usado en la elaboración de preparaciones magistrales que requieran de
precauciones especiales (p.ej., antibióticos, materiales citotóxicos y otros materiales peligrosos). Cuando sea posible, se debe
destinar equipo especial para tal propósito, o cuando se use el mismo equipo para todos los productos farmacéuticos, se debe
contar con procedimientos adecuados para permitir la limpieza meticulosa del equipo antes de usarlo con otros medicamen-
tos. Cuando sea posible, se debe usar equipo desechable para reducir la probabilidad de biocarga o contaminación cruzada.

SELECCIÓN, MANIPULACIÓN V ALMACENAMIENTO DE COMPONENTES

Las siguientes pautas se deben seguir al seleccionar, manipular y almacenar componentes para las preparaciones magistra-
les.
1. Se recomienda una sustancia de calidad Farmacopea de los Estados Unidos de América (USP), Formulario Nacional (NF) o
Food Chemicals Codex (FCC) como fuente de ingredientes para elaborar todas las preparaciones.
2. Los preparadores deben intentar primero usar componentes fabricados en una instalación registrada con la FDA. Cuando
no sea posible obtener componentes de una instalación registrada con la FDA, los preparadores deben usar su criterio
USP 40 Pruebas Físicas/ (795) Preparación Magistral-Preparaciones No Estériles 729

profesional al seleccionar una fuente aceptable y confiable y deben establecer la pureza y la seguridad mediante métodos
razonables, los cuales deben incluir un Certificado de Análisis, reputación del fabricante y confiabilidad de la fuente.
3. Las preparaciones magistrales oficiales se elaboran a partir de ingredientes individuales que cumplen con los requisitos de
la monografía oficial para los ingredientes que cuentan con monografía. Estas preparaciones se pueden etiquetar con las
siglas USP o NF, según corresponda.
4. Cuando no sea posible obtener componentes de calidad farmacopeica, se pueden usar componentes de alta calidad tales
como aquéllos que son químicamente puros, de grado reactivo analítico o certificados por la American Chemical Society.
No obstante, estos componentes se deben usar con cuidado puesto que los estándares para reactivos analíticos o los ma-
teriales de grado certificado por la American Chemical Society no consideran si una impureza presente implica riesgos de
seguridad para humanos o animales.
5. Para componentes en envases con una fecha de caducidad proporcionada por el fabricante o distribuidor, el material pue-
de usarse en la preparación magistral antes de dicha fecha de caducidad (a) cuando el material se almacene en su envase
original en condiciones que eviten la descomposición de las sustancias químicas (ver (1191) y (659), a menos que se citen
otras condiciones en la etiqueta), (b) cuando exista una exposición mínima del material remanente cada vez que se extrae
material del envase y (c) cuando cualquier extracción del envase es llevada a cabo por personal capacitado en la manipu-
lación adecuada del material. Si el componente ha sido transferido a un envase distinto, dicho envase deberá identificarse
con el nombre del componente, proveedor original, lote o número de control, fecha de transferencia y fecha de caduci-
dad, y deberá ofrecer una integridad equivalente o mejor que la del envase original.
6. Para componentes que no tienen fechas de caducidad asignadas por el fabricante o el proveedor, el preparador deberá
etiquetar el envase con la fecha de recepción y asignar una fecha de caducidad prudente al componente que no exceda
de tres años a partir de la fecha de recepción (ver Fecha de Caducidad y Fecha Límite de Uso en Etiquetado en Conservación,
Envasado, Almacenamiento y Etiquetado en Advertencias y Requisitos Generales) basándose en la naturaleza del componente
y su mecanismo de degradación, el envase en el que está envasado y las condiciones de almacenamiento.
7. Cuando se usa un medicamento fabricado como fuente del ingrediente activo, el medicamento deberá haber sido fabrica-
do en una instalación registrada con la FDA y el envase del producto provisto por el fabricante deberá estar etiquetado
con un número de control de partida y una fecha de caducidad. Cuando se elaboran preparaciones magistrales con medi-
camentos fabricados, el preparador debe considerar todos los ingredientes, incluidos los excipientes presentes en el medi-
camento con respecto al uso previsto de la preparación magistral, así como el efecto que tendrá la manipulación del me-
dicamento sobre la aptitud terapéutica y la estabilidad de los componentes.
8. Cuando la preparación esté destinada para su uso como suplemento dietético o nutricional, el preparador deberá respetar
este capítulo y deberá cumplir con todos los requisitos federales y estatales. En general, los suplementos dietéticos se pre-
paran con ingredientes que cumplen con las normas USP, FCC o NF. Cuando no existan tales estándares, se pueden usar
sustancias con una calidad de grado alimenticio comprobada usando otros procedimientos adecuados.
9. Cuando un componente se deriva de animales rumiantes (p.ej., bovinos, caprinos, ovinos), el proveedor deberá propor-
cionar garantía por escrito de que el componente cumple con todas las leyes federales que rigen los requisitos de procesa-
miento, uso e importación para estos materiales.
1 O. Cuando se elaboran preparaciones magistrales para humanos, el preparador deberá consultar la lista de componentes que
han sido retirados o extraídos del mercado por la FDA por razones de seguridad o eficacia (ver www.FDA.gov). Cuando se
elaboran preparaciones magistrales para animales con los que se producen alimentos, el preparador debe consultar la lista
de componentes prohibidos para su uso en animales con los que se producen alimentos.
11. Todos los componentes usados en la elaboración de preparaciones magistrales deben almacenarse según las instrucciones
del fabricante o de acuerdo con los requisitos de la monografía USP, NF o FCC, en un área limpia y en condiciones de
temperatura y humedad apropiadas (temperatura ambiente controlada, refrigerador o congelador). Todos los componen-
tes deben almacenarse alejados del piso, manipularse y almacenarse para prevenir contaminación, y rotarse de modo que
se use primero el componente más antiguo. Todos los envases deben etiquetarse apropiadamente.

CRITERIOS DE ESTABILIDAD V DETERMINACIÓN DE LA FECHA LÍMITE DE USO

La FLU es la fecha después de la cual la preparación magistral no debe usarse y se determina a partir de la fecha de elabora-
ción de la preparación. Debido a que las preparaciones magistrales están destinadas a administrarse inmediatamente o luego
de un período de almacenamiento corto, las fechas límite de uso pueden determinarse en función de criterios distintos a los
utilizados para determinar las fechas de caducidad de los medicamentos fabricados.
Las FLU deben fijarse de manera conservadora. Para determinar la FLU, los preparadores deben consultar y aplicar la infor-
mación disponible en la documentación y literatura sobre la estabilidad en general y la del fármaco en particular, y deben con-
siderar:
• la naturaleza del fármaco y su mecanismo de degradación
• la forma farmacéutica y sus componentes
• el potencial de proliferación microbiana en la preparación
• el envase en el que está envasado
• las condiciones de almacenamiento esperadas
730 (795) Preparación Magistral-Preparaciones No Estériles/ Pruebas Físicas USP 40

• la duración prevista de la terapia (ver Fecha de Caducidad y Fecha Límite de Uso en Etiquetado en Conservación, Envasado,
Almacenamiento y Etiquetado en Advertencias y Requisitos Generales).
Cuando se usa un producto fabricado como fuente del ingrediente activo farmacéutico para una preparación magistral no
estéril, la fecha de caducidad del producto no podrá usarse como único elemento para fijar una FLU para la preparación magis-
tral, sino que el preparador deberá referirse a la información de estabilidad provista por el fabricante y a la literatura para obte-
ner información aplicable sobre estabilidad, compatibilidad y degradación de ingredientes, además de considerar los factores
de estabilidad presentados en (1191 ); asimismo, deberá usar sus conocimientos de preparación magistral y experiencia. Todos
los datos de estabilidad deben ser cuidadosamente interpretados en función de la formulación preparada real.
Es necesario que el preparador observe el medicamento preparado para detectar signos de inestabilidad durante todas las
etapas del proceso de preparación, dispensación y almacenamiento. En (1191 ), Consideraciones sobre Estabilidad en la Práctica
de Dispensación, se encuentran detalles más específicos sobre algunos signos de deterioro físico comunes. Sin embargo, la de-
gradación química excesiva y otras pérdidas de concentración del fármaco ocasionadas por reacciones suelen ser invisibles.

Pautas Generales Para Fijar la Fecha Límite de Uso

Ante la ausencia de información de estabilidad del fármaco y de la preparación específicos, la siguiente tabla presenta las
fechas límite de uso máximas recomendadas para preparaciones magistrales de fármacos no estériles que se envasan en enva-
ses impermeables y resistentes a la luz y se almacenan a temperatura ambiente controlada, a menos que se indique algo distin-
to (ver (659)). Los fármacos o químicos que tienden a descomponerse requerirán de FLU más cortas.

FLU por Tipo de Formulaciónª

Para Formulaciones No Acuosas-La FLU no deberá ser mayor al tiempo restante hasta la fecha de caducidad más cercana de cualquier ingrediente
activo farmacéutico o 6 meses, lo que ocurra primero.
Para Formulaciones Orales que Contienen Agua-La FLU no deberá ser mayor de 14 días cuando se almacenan a temperaturas frías controladas.
Para Formulaciones Líquidas o Semisólidas que Contienen Agua, de aplicación Tópica/Dérmica o sobre Mucosas-La FLU no deberá ser mayor
de 30 días.
ª Las siguientes FLU máximas se recomiendan para preparaciones magistrales de medicamentos no estériles cuando no se cuenta con información de estabilidad
del fármaco o la preparación específicos. La FLU no deberá ser mayor a la fecha de caducidad indicada en el envase de cualquier componente.

Las preparaciones susceptibles deben contener agentes antimicrobianos adecuados que las protejan de la contaminación
por bacterias, levaduras y hongos introducidos inadvertidamente durante o después del proceso de preparación magistral.
Cuando existe una contraindicación para conservantes antimicrobianos en estas preparaciones magistrales, será necesario al-
macenar la preparación a temperatura fría controlada; para asegurar el almacenamiento y la manipulación adecuados de tales
preparaciones magistrales por parte del paciente o el proveedor de cuidados, resulta esencial instruir y ofrecer consulta apro-
piada al paciente. No se deben usar conservantes antimicrobianos como sustitutos de las buenas prácticas de preparación ma-
gistral.
Para información sobre asignación de FLU para medicamentos reenvasados para dispensación o administración, ver Fecha de
Caducidad y Fecha Límite de Uso en Etiquetado en Conservación, Envasado, Almacenamiento y Etiquetado en Advertencias y Requi-
sitos Generales y Envasado y Reenvasado-Envases Unitarios (11 36).
Es obligatorio garantizar la esterilidad de una preparación magistral estéril. La preparación y el envasado de medicamentos
estériles, (incluidas las preparaciones oftálmicas) requieren un cumplimiento estricto de las pautas contenidas en (797) y en las
instrucciones de etiquetado del fabricante.

ENVASADO V ENVASES DE PREPARACIONES MAGISTRALES

El preparador debe asegurar que los envases y cierres de envases usados en el envasado de preparaciones magistrales cum-
plen con los requisitos de USP (ver (659); Envases-Vidrio (660); Sistemas de Envases Plásticos y sus Materiales de Construcción
(661 ); Materiales Plásticos de Construcción (661.1 ); Sistemas de Envases Plásticos para Uso Farmacéutico (661.2); Envases-Prue-
bas de Desempeño (671 ); (1136)); y cuando estén disponibles, las monografías de preparación magistral. No se espera que los
preparadores realicen las pruebas descritas en los capítulos mencionados, pero deben tener conocimiento acerca de las nor-
mas en ellos descritas. Los proveedores de envases deben proporcionar, cuando se les solicite, la verificación del cumplimiento
del envase con USP. Los envases y cierres de envases destinados para la elaboración de preparaciones magistrales estériles de-
ben manipularse según se indica en (797).
Los envases y cierres deberán estar fabricados con material limpio y adecuado a fin de no alterar la calidad, contenido o
pureza de la preparación magistral. Utilizar un envase seleccionado según las propiedades físicas y químicas de la preparación
magistral. Se debe considerar la interacción envase-fármaco para sustancias con propiedades adsortivas o de lixiviación.
Los envases y cierres deben almacenarse alejados del piso, manipularse y almacenarse para prevenir contaminación, y rotarse
de modo que se usen primero los más antiguos. Los envases y cierres de envases deben almacenarse de modo que se permita
la inspección y limpieza del área de almacenamiento.
USP 40 Pruebas Físicas/ (795) Preparación Magistral-Preparaciones No Estériles 731

DOCUMENTACIÓN SOBRE PREPARACIÓN MAGISTRAL

La documentación, escrita o electrónica, permite al preparador rastrear, evaluar y repetir sistemáticamente los pasos inclui-
dos en todo el proceso de elaboración de una preparación magistral, siempre que lo necesite. Todos los preparadores que dis-
pensan recetas deben cumplir con los requisitos de manutención de registros de sus consejos estatales de farmacia. No se re-
quiere documentación adicional cuando el preparador elabora una preparación magistral de acuerdo con las instrucciones del
etiquetado provistas por el fabricante. Todas las demás preparaciones magistrales requerirán de documentación adicional se-
gún se describe en esta sección.
El período de conservación de los registros es idéntico al período dispuesto por la legislación estatal para cualquier receta
médica. El registro puede ser una copia de la prescripción, escrita o en forma de registro electrónico, que incluya el Registro
Maestro de Formulación y el Registro de Preparación Magistral.

Registro Maestro de Formulación

Este registro deberá incluir:

• nombre oficial o asignado, contenido y forma farmacéutica de la preparación
• cálculos requeridos para determinar y verificar cantidades de componentes y dosis de ingredientes farmacéuticos activos
• descripción de todos los ingredientes y sus cantidades
• información sobre compatibilidad y estabilidad, incluyendo referencias cuando estén disponibles
• equipo necesario para elaborar la preparación, cuando corresponda
• instrucciones de mezclado que deberán incluir:
1 . orden de mezclado
2. temperaturas de mezclado u otros controles ambientales
3. duración del mezclado
4. otros factores pertinentes a la reproducción de la preparación a medida que se elabora.
• información de etiquetado de la muestra, que deberá contener, además de la información legalmente requerida:
1 . nombre genérico y cantidad o concentración de cada ingrediente activo
2. FLU asignada
3. condiciones de almacenamiento
4. número de prescripción o de control, según corresponda.
• envase usado para la dispensación
• requisitos de envasado y almacenamiento
• descripción de la preparación final
• procedimientos de control de calidad y resultados esperados.

Registro de Preparación Magistral

El Registro de Preparación Magistral deberá contener:

• el nombre oficial o asignado, contenido y dosis de la preparación
• referencia al Registro Maestro de Formulación para la preparación
• nombres y cantidades de todos los componentes
•fuentes, números de lote y fechas de caducidad de los componentes
• cantidad total preparada
• nombre de la persona que elaboró la preparación, nombre de la persona que llevó a cabo los procedimientos de control
de calidad y nombre del preparador que aprobó la preparación
• fecha de preparación
• número de control o prescripción asignado
• FLU asignada
• doble etiqueta según se describe en el Registro Maestro de Formulación
• descripción de la preparación final
• resultados de los procedimientos de control de calidad (p.ej., intervalo de peso de las cápsulas llenadas, pH de líquidos
acuosos)
• documentación de cualquier problema de control de calidad y cualquier reacción adversa o problema de la preparación
informados por el paciente o el proveedor de cuidados.

Procedimientos Operativos Estándar

Todos los procedimientos significativos realizados en el área de preparación magistral deben estar cubiertos por procedi-
mientos operativos estándar (POE) escritos. Deben desarrollarse procedimientos para instalaciones, equipo, personal, prepara-
ción, envasado y almacenamiento de preparaciones magistrales para asegurar la confiabilidad, exactitud, calidad, seguridad y
732 (795) Preparación Magistral-Preparaciones No Estériles / Pruebas Físicas USP 40

uniformidad de la preparación magistral. La aplicación de POE establece una uniformidad en los procedimientos, además de
proveer referencias para la orientación y capacitación del personal.

Archivos de Hojas de Datos de Seguridad de los Materiales

Las Hojas de Datos de Seguridad de los Materiales (MSDS, por sus siglas en inglés) deben ser de fácil acceso para todos los
empleados que trabajan con medicamentos o productos químicos a granel ubicados en las instalaciones de preparación ma-
gistral. Debe instruirse a los empleados acerca de cómo conseguir e interpretar la información necesaria.

CONTROL DE CALIDAD

La seguridad, la calidad y el desempeño de las preparaciones magistrales dependen de una correcta utilización de los ingre-
dientes, cálculos bien hechos, mediciones precisas y exactas, condiciones y procedimientos de formulación adecuados y el
ejercicio prudente del criterio farmacéutico. El preparador deberá realizar una última verificación de cada procedimiento utili-
zado en el proceso de preparación magistral. El preparador, con el fin de asegurar la exactitud y la integridad, deberá observar
la preparación terminada para determinar que su apariencia es la esperada y deberá investigar cualquier discrepancia, adop-
tando las medidas necesarias para corregirlas antes de dispensar la receta médica al paciente.

Controles para la Preparación Magistral

1. Es necesario seguir el Registro Maestro de Formulación, el Registro de Preparación Magistral, y los procedimientos escritos
relacionados durante la ejecución del proceso de preparación magistral. Cualquier desviación en los procedimientos debe
ser documentada.
2. El preparador deberá realizar una verificación y posteriormente volver a verificar cada procedimiento en cada etapa del
proceso. Cuando sea posible, una segunda persona capacitada debe verificar cada etapa crítica del proceso de prepara-
ción.
3. El preparador deberá contar con procedimientos establecidos por escrito que describan las pruebas o exámenes realizados
a la preparación magistral (p.ej., el grado de variación de peso entre cápsulas) para asegurar su uniformidad e integridad.
4. Se deben establecer procedimientos de control adecuados para monitorear los resultados y para verificar el desempeño
de los procesos de preparación y equipos que pudieran ser responsables de las variaciones en las preparaciones magistra-
les finales.
5. Para más información y pautas sobre los procesos de control de calidad recomendados, ver (1163).

CONSEJOS AL PACIENTE

Al momento de dispensar la receta, se debe aconsejar al paciente o al representante del paciente sobre el uso, almacena-
miento, manipulación y desecho apropiados de la preparación. Además, se debe instruir al paciente o al representante del pa-
ciente para que informe sobre cualquier evento adverso y para que observe e informe al preparador sobre cualquier cambio en
las características físicas de la preparación magistral (ver (1191 ), Responsabilidad del Farmacéutico). El preparador deberá investi-
gar y documentar cualquier problema informado que se relacione con una preparación magistral, y deberá tomar las medidas
correctivas.

CAPACITACIÓN

Todo el personal implicado en la preparación, evaluación, envasado y dispensación de preparaciones magistrales deberá re-
cibir capacitación adecuada para el tipo de preparación magistral realizada. Es responsabilidad del preparador asegurar la im-
plementación de un programa de capacitación y que éste se aplique de manera continua. El personal de preparación magistral
debe ser evaluado por lo menos una vez al año. Las etapas en el proceso de capacitación incluyen lo siguiente:
•Todos los empleados implicados en la preparación magistral farmacéutica deberán leer y familiarizarse con este capítulo.
Además, deben estar familiarizados con el contenido de la USP Pharmacists' Pharmacopeia y demás publicaciones perti-
nentes, lo cual incluye cómo leer e interpretar las MSDS.
•Todos los empleados deberán leer y familiarizarse con cada uno de los procedimientos relacionados con la preparación
magistral, incluyendo aquéllos que involucren las instalaciones, equipo, personal, preparación magistral en sí misma, eva-
luación, envasado, almacenamiento y dispensación.
•Todo el personal que elabore preparaciones magistrales de fármacos peligrosos deberá estar totalmente capacitado en al-
macenamiento, manipulación y desecho de estos fármacos. Esta capacitación se debe dar antes de preparar o manipular
fármacos peligrosos. Para información sobre capacitación de personal que elabora preparaciones magistrales de fármacos
peligrosos, ver las referencias en la sección Instalaciones de Preparación Magistral de este capítulo.
USP 40 Pruebas Físicas/ (795) Preparación Magistral-Preparaciones No Estériles 733

•Todas las actividades de capacitación deberán quedar documentadas. El preparador deberá reunirse con los empleados
para revisar su trabajo y responder cualquier pregunta de los empleados en relación con los procedimientos de prepara-
ción magistral.
• El preparador deberá hacer una demostración de los procedimientos para el empleado y deberá observar y guiar al em-
pleado durante todo el proceso de capacitación. Posteriormente, el empleado repetirá el procedimiento sin recibir ayuda
alguna por parte del preparador pero bajo su supervisión directa.
• Cuando el empleado haya demostrado al preparador un conocimiento verbal y funcional del procedimiento se le permiti-
rá realizar el procedimiento sin supervisión directa. No obstante, el preparador deberá estar presente físicamente y deberá
aprobar todos los ingredientes y sus cantidades, así como la preparación final.
• Cuando el preparador esté satisfecho con el conocimiento y competencia del empleado, el preparador deberá firmar los
registros de documentación para demostrar que el empleado ha recibido la capacitación adecuada.
• El preparador deberá monitorear continuamente el trabajo del empleado y asegurar que los cálculos y el trabajo del em-
pleado sean exactos y se realicen de manera adecuada.
• El preparador es el único responsable de la preparación terminada.

PREPARACIONES MAGISTRALES PARA PACIENTES ANIMALES

La responsabilidad del preparador para proporcionar preparaciones magistrales de alta calidad a los pacientes se extiende
más allá de los seres humanos. Todas las partes de este capítulo se aplican a preparaciones magistrales formuladas para pacien-
tes animales. Se deberá determinar antes de realizar la preparación magistral si la misma está destinada al uso de un paciente
animal (p.ej., de compañía, de competición, para alimento).
Debido a que el alimento derivado de pacientes animales puede ser consumido por seres humanos, se debe tener cuidado
para prevenir que los residuos del fármaco ingresen en la cadena alimenticia humana cuando se elaboran preparaciones ma-
gistrales para su uso en pacientes animales. Por esta razón, todos los preparadores que preparan formulaciones para animales
deben tener conocimientos funcionales sobre regulación y aplicación de fármacos en pacientes animales. Por ley, los veterina-
rios están obligados a proporcionar a los cuidadores de animales con los que se producen alimentos un periodo de retención
de los tejidos de animales tratados (p.ej. carne, leche, huevo) antes de introducirlos en el suministro alimenticio humano. Este
periodo se denomina tiempo de retiro (WDT, por sus siglas en inglés) y, por ley, también se debe incluir en la etiqueta de
dispensación de cada prescripción preparada para especies que se usan en la producción de alimentos.
El uso de fármacos en cualquier animal de competición está estrictamente regulado por los gobiernos federal y estatales,
además de los órganos que rigen cada una de las disciplinas específicas. Las penas por infringir dichas reglas pueden ser seve-
ras para todos los que contribuyan con la falta, incluidos veterinarios, farmacéuticos y cuidadores.
El farmacéutico deberá estar apercibido de las limitantes para las especies específicas en su capacidad fisiológica y metabóli-
ca que pudieran resultar en toxicidad cuando se usan ciertos fármacos o excipientes en las preparaciones magistrales. Por esta
razón, los preparadores que elaboran preparaciones para animales deben usar, cuando sea posible, formulaciones desarrolla-
das específicamente para pacientes animales. Cuando dichas formulaciones no estén disponibles, el preparador deberá revisar
la literatura para determinar si un componente específico de la fórmula es tóxico para las especies a tratar. La extrapolación de
formulaciones que se preparan magistralmente destinadas para su uso en humanos puede no ser adecuada para especies ani-
males y puede ocasionar resultados negativos.
Los veterinarios y farmacéuticos que elaboran preparaciones para pacientes animales deben estar familiarizados con todas las
legislaciones estatales y federales relacionadas con el uso de fármacos en animales, incluyendo, entre otras, la Food, Drug, and
Cosmetic Act (Ley de Alimentos, Fármacos y Cosméticos); la Animal Drug Amendment (Enmienda sobre Fármacos en Anima-
les); la Animal Medicinal Drug Use Clarification Act (Ley de Aclaración del Uso Medicinal de Fármacos en Animales); y la Com-
pliance Policy Guideline for Compounding of Drugs for Use in Animal Patients (Guía sobre las Políticas de Preparación Magis-
tral de Fármacos para su Uso en Pacientes Animales) de la FDA.

GLOSARIO

Ingrediente Farmacéutico Activo (API, por sus siglas en inglés): Cualquier sustancia o mezcla de sustancias destinadas a
su uso en una preparación magistral de medicamentos, convirtiéndose así en el ingrediente activo de dicha preparación y que
proporciona una actividad farmacopeica u otro efecto directo en el diagnóstico, cura, mitigación, tratamiento o prevención de
enfermedades en humanos y animales o que afecta la estructura y función del cuerpo.
Sustancias Agregadas: Son ingredientes necesarios para elaborar una preparación pero sin la intención ni la expectativa
de causar una respuesta farmacológica si se administran aisladamente en la cantidad o concentración contenida en una dosis
única de la preparación magistral. El término se usa como sinónimo con los términos ingredientes inactivos, excipientes e ingre-
dientes farmacéuticos.
Fecha Límite de Uso (FLU): Es la fecha después de la cual no debe usarse una preparación magistral y se determina a
partir de la fecha de elaboración de la preparación.
Componente: Cualquier ingrediente usado en la elaboración de una preparación magistral de fármacos, incluyendo cual-
quier ingrediente activo o sustancia agregada que se usa en su preparación.
 734 (795) Preparación Magistral-Preparaciones No Estériles/ Pruebas Físicas USP 40

Preparador: Profesional autorizado por la jurisdicción apropiada para elaborar preparaciones magistrales de acuerdo con
una receta u orden de medicación de un prescriptor autorizado.
Preparación magistral: La preparación, mezcla, reconstitución, alteración, envasado y etiquetado de un medicamento,
dispositivo de administración del medicamento o dispositivo de acuerdo con la prescripción, orden de medicación o iniciativa
de un profesional autorizado basado en la relación entre el profesional, el paciente, el farmacéutico y el preparador en el curso
de una práctica profesional. La preparación magistral incluye lo siguiente:
• La preparación de formas farmacéuticas para pacientes humanos y animales
• La preparación de medicamentos o dispositivos anticipando recetas de medicamentos basadas en patrones rutinarios de
prescripción observados con regularidad
• La reconstitución o manipulación de productos comerciales que puedan requerir el agregado de uno o más ingredientes
• La preparación de medicamentos o dispositivos con el propósito de investigación (clínica o académica), enseñanza o aná-
lisis químico, o como resultado incidental de los mismos
• La preparación de medicamentos y dispositivos para uso en el lugar de trabajo del prescriptor cuando así lo permita la
legislación federal y estatal
Fármaco Peligroso: Cualquier fármaco identificado por al menos uno de los seis criterios siguientes:
• Carcinogenicidad
• Teratogenicidad o toxicidad en el desarrollo
•Toxicidad reproductiva en humanos
•Toxicidad en órganos a dosis bajas en humanos o animales
• Genotoxicidad
• Nuevos fármacos que reproduzcan fármacos peligrosos en su estructura o toxicidad [se pueden encontrar ejemplos en las
publicaciones vigentes del National lnstitute for Occupational Safety and Health (NIOSH)]
Fabricación: La producción, propagación, conversión o procesamiento de un fármaco o dispositivo médico, ya sea directa
o indirectamente, mediante extracción del fármaco de sustancias de origen natural o mediante síntesis química o biológica. La
fabricación también puede incluir cualquier envasado o reenvasado de las sustancias o etiquetado o reetiquetado de envases
para su reventa en farmacias, por parte de profesionales u otras personas.
Preparación: A los efectos de este capítulo, se refiere a una forma farmacéutica o suplemento dietético elaborado por pre-
paración magistral o un dispositivo en el que el preparador ha introducido un fármaco. Este término se usará para describir
formulaciones preparadas magistralmente; el término producto se usará para describir formas farmacéuticas fabricadas. (Para
las definiciones de sustancia oficial y productos oficiales, ver Advertencias y Requisitos Generales.)
Estabilidad: Se define como la conservación, dentro de ciertos límites específicos y durante todo el periodo de almacena-
miento y utilización, de las mismas propiedades y características que poseía la preparación cuando se elaboró (ver en Conside-
raciones sobre Estabilidad en la Práctica de Dispensación (1191 ), la tabla Criterios de Niveles Aceptables de Estabilidad).
Vehículo: Componente de uso interno o externo empleado como portador o diluyente en el que se suspenden o disuel-
ven líquidos, semisólidos o sólidos. Ejemplos de vehículos incluyen, entre otros, agua, jarabes, elíxires, líquidos oleaginosos,
portadores sólidos y semisólidos y productos de propiedad exclusiva.

(797) PREPARACIÓN MAGISTRAL-PREPARACIONES ESTÉRILES

INTRODUCCIÓN
El objetivo de este capítulo es describir las condiciones y prácticas para evitar lesiones, e incluso la muerte de pacientes como
resultado de (1) contaminación microbiana (no esterilidad), (2) endotoxinas bacterianas en exceso, (3) variabilidad en la con-
centración pretendida de los ingredientes correctos, que exceda bien sea los límites de la monografía para artículos oficiales
(ver "Oficial" y "Artículos Oficiales" en las Advertencias y Requisitos Generales) o 10% para los artículos no oficiales, (4) contami-
nantes químicos y físicos no esperados, y (5) ingredientes de calidad inadecuada en las preparaciones magistrales estériles
(PME). Las PME contaminadas son potencialmente más riesgosas para los pacientes cuando se administran en cavidades cor-
porales, los sistemas nervioso y vascular, los ojos y las articulaciones y cuando se usan como baños para órganos y tejidos vi-
vos. Cuando las PME contienen endotoxinas bacterianas en exceso (ver Prueba de Endotoxinas Bacterianas (85)) son potencial-
mente más riesgosas para los pacientes cuando se administran dentro del sistema nervioso central.
A pesar de la exhaustiva atención dedicada en este capítulo a la provisión, mantenimiento y evaluación de la calidad de aire,
resulta fundamental evitar la contaminación directa o por contacto físico. Por lo general, se reconoce que el contacto físico o
directo de sitios críticos de las PME con contaminantes, especialmente fuentes microbianas, representa la más alta probabilidad
de riesgo para los pacientes. Por lo tanto, el personal que trabaja en las preparaciones magistrales debe ser meticulosamente
cuidadoso en evitar la contaminación por contacto de las PME, tanto dentro de las áreas ISO Clase 5 (ver Tabla 7), como fuera
de ellas.
Con el fin de conseguir las cinco condiciones y prácticas descritas anteriormente, este capítulo proporciona las normas míni-
mas de práctica y calidad para las PME de fármacos y nutrientes, basadas en la información científica actual, así como en las
USP 40 Pruebas Físicas/ (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles 735

mejores prácticas para preparaciones magistrales estériles. El uso de tecnologías, técnicas, materiales y procedimientos distin-
tos de los descritos en este capítulo no está prohibido mientras se pruebe que son equivalentes o superiores, con significación
estadística, a los descritos aquí. Las normas de este capítulo no se refieren a la administración clínica de PME a pacientes me-
diante aplicación, implantación, infusión, inhalación, inyección, inserción, instilación e irrigación, que son las rutas de adminis-
tración. En este capítulo se describen cuatro categorías específicas de PME: nivel de riesgo bajo, nivel de riesgo mediano y nivel
de riesgo alto, y uso inmediato. La preparación magistral estéril difiere de la preparación no estéril (ver Preparación Magistral-
Preparaciones No Estériles (795)) principalmente al requerir el mantenimiento de la esterilidad cuando se preparan exclusiva-
mente con ingredientes y componentes estériles (es decir, PME de uso inmediato, PME de nivel de riesgo bajo y PME de nivel
de riesgo mediano) y la consecución de esterilidad al prepararlas con ingredientes y componentes no estériles (es decir, PME
de nivel de riesgo alto). Algunas diferencias entre las normas para la preparación magistral estéril en este capítulo y aquellas de
las preparaciones magistrales no estériles en Preparación Magistral-Preparaciones No Estériles (795) incluyen, entre otras, am-
bientes de aire con clasificación ISO (ver Tabla 7); vestimenta y guantes del personal; capacitación del personal y pruebas so-
bre principios y prácticas de manipulaciones asépticas y esterilización; especificaciones de calidad ambiental y monitoreos; y
desinfección de guantes y superficies de fuentes ISO Clase 5 (ver Tabla 7).
Tabla 1. Clasificación ISO de Partículas en el Aire Ambiental (los límites se expresan en partículas mayores o iguales a 0,5 µm por metro cúbico
[ISO actual] y pie cúbico [anteriormente Norma Federal Nº 209E, y en lo sucesivo FS 209E (siglas en inglés)])*
Nombre de la Clase Recuento de Partículas
Clase ISO FS 209E de EE.UU. ISO, m 3 FS 209E, pie3
3 Clase 1 35,2 1
4 Clase 1 O 352 10
5 Clase 100 3520 100
6 Clase 1000 35200 1000
7 Clase 10 000 352 000 10000
8 Clase 100 000 3 520 000 100000
* Adaptado de la FS Nº 209E, Administración de Servicios Generales, Washington, DC, 20407 (11 de septiembre de 1992) y de ISO 14644-1 :1999, Cleanrooms
and associated controlled environments-Part 1: Classification of air cleanliness. Por ejemplo, 3520 partículas mayores o iguales a 0,5 fLm por m3 (ISO Clase 5)
equivalen a 100 partículas por pie 3 (Clase 100) (1 m 3 = 35,2 pies 3).

Las normas en este capítulo están destinadas a todas las personas que elaboren PME y todos los sitios donde se preparen
PME (p.ej., hospitales y otras instituciones de salud, clínicas de tratamiento de pacientes, farmacias, instituciones de práctica
médica y otras instalaciones y sitios en donde se preparen, almacenen y transporten PME). Entre las personas que hacen las
preparaciones magistrales estériles se cuentan farmacéuticos, enfermeras, técnicos de farmacia y médicos. Estos términos reco-
nocen que la mayoría de las preparaciones magistrales estériles las realizan o supervisan farmacéuticos en farmacias y también
que este capítulo aplica a todo el personal de salud que prepara, almacena y transporta PME. A los efectos de este capítulo,
PME incluye cualquiera de las siguientes:
(1) Preparaciones magistrales de productos biológicos, de diagnóstico, fármacos, nutrientes y productos radiofarmacéuticos,
incluyendo, entre otras, a las siguientes formas farmacéuticas que deben estar estériles cuando se administran a pacientes:
inhalaciones bronquiales y nasales acuosas, baños y soluciones para órganos y tejidos vivos, inyecciones (p.ej., dispersio-
nes coloidales, emulsiones, soluciones, suspensiones), irrigaciones para heridas y cavidades corporales, gotas y ungüentos
oftálmicos e implantes tisulares.
(2) Productos estériles fabricados, que se preparan estrictamente de acuerdo con las instrucciones que aparecen en el etique-
tado aprobado del fabricante (prospectos adjuntos del producto) o se preparan en forma diferente a lo publicado en di-
cho etiquetado. [NOTA-La FDA estipula que "la Preparación Magistral no incluye mezclado, reconstitución o acciones si-
milares que se efectúen de acuerdo con las instrucciones contenidas en el etiquetado aprobado suministrado por el fabri-
cante del producto, así como otras instrucciones del fabricante que concuerden con el etiquetado" [21 USC 321 (k) y
(m)]. Sin embargo, el etiquetado aprobado por la FDA (prospecto adjunto del producto) rara vez describe la calidad am-
biental (p.ej., designación de Clase ISO del aire, la duración de la exposición a aire no clasificado por ISO, la vestimenta y
guantes del personal, ni otras precauciones asépticas bajo las cuales se preparan los productos estériles para administra-
ción). La fecha o el tiempo límite de uso y almacenamiento (ver Advertencias y Requisitos Generales y Preparación Magis-
tral-Preparaciones No Estériles (795)) para productos estériles que han sido abiertos o preparados para administración no
se especifican en todos los prospectos adjuntos de todos los productos estériles. Además, cuando se especifican, tales du-
raciones pueden referirse a la estabilidad química y no necesariamente a la pureza o seguridad microbiológicas.]

ORGANIZACIÓN DE ESTE CAPÍTULO

Las secciones de este capítulo están organizadas para facilitar a los profesionales de salud la comprensión de las prácticas
fundamentales relativas a la exactitud y calidad requeridas para preparar las PME. Proporcionan la base para el desarrollo e
implementación de procedimientos esenciales para la elaboración segura de PME de niveles de riesgo bajo, mediano y alto, y
PME de uso inmediato, las cuales se clasifican según el potencial de contaminación microbiana, química y física. El capítulo se
divide en las siguientes secciones principales:
736 (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles / Pruebas Físicas USP 40

• Responsabilidad del Personal de Preparación Magistral

• Niveles de Riesgo de Contaminación Microbiana en las PME
• Capacitación y Evaluación del Personal en Técnicas de Manipulación Aséptica
• PME de Uso Inmediato
• Envases Monodosis y Multidosis
• Fármacos Peligrosos como PME
• Preparados Radiofarmacéuticos como PME
• Extractos de Alérgenos como PME
• Verificación de la Exactitud y Esterilidad de la Preparación Magistral
• Calidad y Control Ambiental
• Procedimientos Operativos Estándares (POE) Sugeridos
• Elementos de Control de Calidad
•Verificación de Dispositivos Automatizados de Preparación Magistral (DAP) para Nutrición Parenteral
• Controles y Pruebas de Liberación de las Preparaciones Terminadas
•Almacenamiento y Fechado de Límite de Uso
• Mantenimiento de la Esterilidad, Pureza y Estabilidad de las PME Dispensadas y Distribuidas.
• Capacitación del Paciente o Persona Encargada de Su Cuidado
• Monitoreo del Paciente e Informe de Eventos Adversos
• Programa de Garantía de Calidad (QA)
• Abreviaturas y Acrónimos
•Glosario
• Apéndices 1-V
Los requisitos y recomendaciones en este capítulo se resumen en el Apéndice/. Al final del texto principal, antes de los Apén-
dices, se incluye una lista de abreviaturas y acrónimos.
Todo el personal que participa en la elaboración de PME tiene la responsabilidad de comprender estas prácticas y precaucio-
nes fundamentales, para desarrollar e implementar los procedimientos apropiados y evaluar en forma constante dichos proce-
dimientos y la calidad de la PME final para evitar daños.

RESPONSABILIDAD DEL PERSONAL DE PREPARACIÓN MAGISTRAL

El personal de preparación magistral tiene la responsabilidad de asegurar que las PME estén debidamente identificadas, me-
didas, diluidas y mezcladas, y correctamente purificadas, esterilizadas, envasadas, selladas, etiquetadas, almacenadas, dispensa-
das y distribuidas. Estas responsabilidades incluyen el mantenimiento de condiciones higiénicas apropiadas y el suministro de
etiquetado e instrucciones suplementarias para la administración clínica correcta de las PME.
Los supervisores de preparación magistral deben asegurar, ya sea mediante la evaluación directa o a través de fuentes de
información apropiadas, que cada PME mantiene el contenido declarado hasta su FLU dentro de los límites de la monografía
correspondiente de USP, o dentro de un 10% de variación en los casos no especificados. Todas las PME deben prepararse de
manera tal que se mantenga la esterilidad y se reduzca al mínimo la introducción de partículas.
Todo procedimiento escrito de garantía de calidad debe incluir los siguientes controles de proceso, los cuales deberán apli-
carse, según corresponda, a las PME específicas: exactitud y precisión de la medición y pesado; requisitos de esterilidad; méto-
dos de esterilización y purificación; intervalos y límites seguros de concentración de ingredientes, endotoxinas bacterianas y
partículas; pH; totalidad y exactitud de la información incluida en el etiquetado; asignación de la FLU; y requisitos de empaque
y almacenamiento. El dispensador deberá, cuando corresponda y sea factible, obtener y evaluar los resultados de las pruebas
de identidad, contenido, pureza y esterilidad antes de dispensar una PME. Los profesionales de la salud, calificados y autoriza-
do, a cargo de supervisar la preparación magistral y la dispensación de las PME deberán asegurar que se cumplan los siguien-
tes objetivos:
1. El personal de preparación magistral debe contar con las habilidades, educación, instrucción y capacitación apropiadas
para realizar y documentar correctamente las siguientes actividades relacionadas con sus responsabilidades en la prepara-
ción estéril:
a. realizar la limpieza antiséptica de manos y desinfección de las superficies de preparación no estériles;
b. seleccionar y colocarse la vestimenta en forma apropiada;
c. mantener o conseguir la esterilidad de las PME en dispositivos CIP, ISO Clase 5 (ver Tabla 7) y proteger al personal y
a los ambientes de preparación magistral de la contaminación por fármacos radioactivos, citotóxicos y quimiotóxicos
(ver Fármacos Peligrosos como PME y Preparados Radiofarmacéuticos como PME);
d. identificar, pesar y medir los ingredientes; y
e. manipular los productos estériles en forma aséptica, esterilizar las PME de nivel de riesgo alto y etiquetar e inspeccio-
nar la calidad de las PME.
2. Los ingredientes deben tener la identidad, calidad y pureza correctas.
3. Los envases de ingredientes abiertos o parcialmente usados que se van a emplear posteriormente en PME deben almace-
narse apropiadamente bajo condiciones de acceso restringido en las instalaciones donde se realiza la preparación magis-
tral. Dichos envases no podrán utilizarse cuando se detecte en una inspección visual que hay roturas no autorizadas en el
USP 40 Pruebas Físicas/ (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles 737

envase, cierre y sello; cuando el contenido no posea el aspecto, aroma y textura esperados; cuando el contenido no pase
las pruebas de identificación especificadas por la institución responsable de la preparación magistral, y cuando haya exce-
dido la FLU o fecha de caducidad.
4. Las PME que contienen agua y que son no estériles durante cualquier fase del procedimiento de preparación deben esteri-
lizarse dentro de las 6 horas posteriores a la finalización de la preparación, para reducir al mínimo la generación de endo-
toxinas bacterianas.
5. Los métodos de esterilización deben lograr la esterilidad de las PME, manteniendo el contenido declarado de los ingre-
dientes activos y la integridad física del envase.
6. Los dispositivos utilizados para medición, mezclado, esterilización y purificación deben estar limpios y ser apropiadamente
exactos y eficaces para los usos a los que están destinados.
7. Se debe evaluar cuidadosamente el daño potencial relacionado con las sustancias agregadas, y las diferencias en el grado
y la velocidad de biodisponibilidad de los ingredientes activos para las vías de administración no oral antes de dispensar y
administrar dichas PME.
8. El envase seleccionado para las PME debe ser apropiado para conservar la esterilidad y el contenido hasta la FLU.
9. Durante su uso, el entorno de preparación magistral debe mantener la esterilidad o la pureza previa a la esterilización de
la PME, según corresponda.
1 O. Las etiquetas de las PME deben indicar los nombres y las cantidades o concentraciones de los ingredientes activos; y las
etiquetas o etiquetado de inyecciones (ver Conservación, Envasado, Almacenamiento y Etiquetado en las Advertencias y Re-
quisitos Generales) enumeran los nombres y las cantidades o concentraciones de todos los ingredientes (ver Etiquetado
(7)). Antes de su dispensación o administración, debe verificarse visualmente la transparencia de las soluciones y, además,
deben revisarse la identidad y la cantidad de los ingredientes, los procedimientos de preparación y esterilización de las
PME y los criterios de liberación específicos para asegurarse de que sean exactos y completos.
11 . Las FLU deben asignarse basándose en pruebas directas o por extrapolación de publicaciones de referencia y otra docu-
mentación confiables (ver Criterios de Estabilidad y Fecha Límite de Uso en Preparación Magistral-Preparaciones No Estériles
(795)).
12. Los procedimientos para medir, mezclar, diluir, purificar, esterilizar, envasar y etiquetar deben ajustarse a la secuencia co-
rrecta y al nivel de calidad establecido para cada PME en particular.
13. Las deficiencias en la preparación magistral, etiquetado, envasado y pruebas e inspección de calidad deben poder detec-
tarse y corregirse rápidamente.
14. Cuando el tiempo y la disponibilidad de personal lo permitan, las manipulaciones y los procedimientos de preparación
magistral deben estar separados de la inspección y revisión de calidad postpreparación que se llevan a cabo antes de la
dispensación de las PME.
Este capítulo enfatiza la necesidad de mantener estándares elevados de calidad y control en relación con los procesos, com-
ponentes y ambientes de preparación, y en relación con las habilidades y los conocimientos del personal a cargo de la elabora-
ción de las PME. El rigor de los controles de calidad durante el proceso, de la inspección y pruebas de calidad posteriores a la
preparación, aumenta en forma proporcional al nivel de riesgo potencial que supone la vía de administración. Por ejemplo, la
falta de esterilidad, la contaminación excesiva con endotoxinas bacterianas, los errores significativos en la concentración de los
ingredientes y el uso de ingredientes incorrectos en las PME son potencialmente más peligrosos para los pacientes cuando és-
tas se administran en el sistema vascular y en el sistema nervioso central que cuando se lo hace a través de las otras vías.

NIVELES DE RIESGO DE CONTAMINACIÓN MICROBIANA EN LAS PME

Las tres categorías de contaminación descritas para PME en esta sección se asignan principalmente de acuerdo con el poten-
cial de contaminación microbiana durante la preparación magistral de PME de nivel de riesgo bajo y nivel de riesgo mediano o
el potencial que representa la falta de esterilización de las PME de nivel de riesgo alto, en donde cualesquiera de éstas podría
ocasionar daños, o incluso la muerte del paciente. Las PME de nivel de riesgo alto se deben esterilizar antes de administrarlas a
los pacientes. Para asignar a una PME el nivel de riesgo correspondiente-bajo, mediano o alto-deben tenerse en cuenta las
probabilidades de que ésta sufra (1) contaminación microbiana (p.ej., microorganismos, esporas y endotoxinas) y (2) contami-
nación química y física (p.ej., sustancias químicas y materias físicas extrañas). Las fuentes potenciales de contaminación inclu-
yen, entre otras, sustancias sólidas y líquidas provenientes del personal y los objetos utilizados en la preparación magistral;
componentes no estériles empleados e incorporados antes de la esterilización terminal; las condiciones inapropiadas dentro del
ambiente controlado de preparación; los procedimientos de preesterilización prolongados en el caso de preparaciones acuo-
sas; y formas farmacéuticas no estériles usadas en la elaboración de las PME.
Las características que se describen a continuación para PME de nivel de riesgo bajo, mediano y alto deben considerarse
como una guía sobre el grado y rigor de cuidado necesario en la preparación magistral, pero no es exhaustiva ni prescriptiva.
Los profesionales de la salud autorizados, a cargo de supervisar las preparaciones magistrales tienen la responsabilidad de de-
terminar las prácticas de calidad de los procedimientos y del ambiente, y los atributos necesarios para el nivel de riesgo asigna-
do a cada PME.
Estos niveles de riesgo se aplican a la calidad de las PME inmediatamente después del mezclado o llenado asépticos finales o
inmediatamente después de la esterilización final, a menos que lo impidan las características específicas de la preparación. Des-
pués del almacenamiento y transporte de las PME recién terminadas, debe esperarse un aumento en los riesgos de degrada-
738 (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles/ Pruebas Físicas USP 40

ción química de los ingredientes, contaminación por daños físicos en los envases y permeabilidad de los envases de plástico y
elastoméricos. En estos casos, el personal de preparación magistral tiene la responsabilidad de considerar los riesgos adiciona-
les potenciales para la integridad de las PME al momento de asignar las FLU. La duración del almacenamiento previo a la admi-
nistración y los límites de temperatura especificados en las siguientes subsecciones se aplican cuando no existan resultados di-
rectos de pruebas de esterilidad que justifiquen límites diferentes para las PME específicas.

PME de Nivel de Riesgo Bajo

Las PME preparadas en las siguientes condiciones tienen un riesgo bajo de contaminación.
Condiciones de Riesgo Bajo-
1. Las PME se preparan mediante manipulación aséptica y en un ambiente con una calidad de aire ISO Clase 5 (ver Tabla 7)
o una calidad de aire superior usando únicamente ingredientes, productos, componentes y dispositivos estériles.
2. La preparación magistral sólo incluye manipulaciones de transferencia, medición y mezclado usando no más de tres em-
paques de productos estériles fabricados comercialmente y no más de dos ingresos en cualquier envase estéril o empaque
(p.ej., bolsa, vial) del producto estéril o envase/dispositivo de administración para preparar la PME.
3. Las manipulaciones se limitan a la apertura aséptica de ampollas, la penetración de tapones desinfectados de viales con
agujas y jeringas estériles, y la transferencia de líquidos estériles en jeringas estériles a dispositivos de administración esté-
ril, envases de otros productos estériles y envases para almacenamiento y dispensación.
4. En el caso de preparaciones de nivel de riesgo bajo, cuando no se someten a una prueba de esterilidad (ver Pruebas de
Esterilidad (71 )), los períodos de almacenamiento no pueden superar los siguientes tiempos: antes de su administración,
las PME deben almacenarse de forma apropiada y exponerse durante no más de 48 horas a temperatura ambiente con-
trolada (ver Advertencias y Requisitos Generales), durante no más de 14 días a temperatura fría (ver Advertencias y Requisitos
Generales) y durante 45 días en estado sólido de congelación entre -25º y -1 Oº.
Ejemplos de Preparación Magistral de Riesgo Bajo-
1. Transferencias únicas de formas farmacéuticas estériles desde ampollas, frascos, bolsas y viales, usando jeringas estériles
con agujas estériles, otros dispositivos de administración y otros envases estériles. El contenido de la solución de las ampo-
llas debe pasarse a través de un filtro estéril para retirar cualquier partícula.
2. Medición y transferencia aséptica simple con no más de tres empaques de productos estériles fabricados comercialmente,
incluyendo una solución para infusión o diluyente para elaborar las mezclas de fármacos y soluciones nutricionales.
PME de Nivel de Riesgo Bajo con FLU de 12 Horas o Menos-Si el CIP es un CAi o un CACI que no cumple con los
requisitos descritos en Colocación de Controles de Ingeniería Primarios o es una cabina de flujo laminar (CFL) o una cabina de
seguridad biológica (CSB) que no puede ubicarse dentro de una zona amortiguadora ISO Clase 7 (ver Tabla 7), entonces sólo
se pueden preparar PME no peligrosas y preparados radiofarmacéuticos de nivel de riesgo bajo, según las órdenes de un médi-
co para un paciente específico y la administración de tales PME debe comenzar dentro de las 12 horas de la preparación o
según lo recomendado en el prospecto adjunto del fabricante, cualquiera que sea menor. Las PME de nivel de riesgo bajo y
con FLU de 12 horas o menos deben cumplir con los cuatro criterios siguientes:
1. Los CIP (CFL, CSB, CAi, CACI) deben certificarse y mantenerse como ISO Clase 5 (ver Tabla 7) según se describe en Diseño
de la Instalación y Controles Ambientales para la exposición de sitios críticos y deben estar en un área segregada de prepa-
ración magistral y restringida a actividades de preparación estéril que minimicen el riesgo de contaminación de la PME.
2. El área segregada de preparación magistral no debe estar en una instalación que tenga ventanas o puertas sin sellar que
conecten con el exterior o que tenga un flujo de tráfico alto, o que esté adyacente a sitios de construcción, almacena-
miento o preparación de alimentos. Se debe tener en cuenta que ésta no pretende ser una lista exhaustiva.
3. El personal debe seguir los procedimientos descritos en Limpieza y Vestimenta del Personal y Requisitos Adicionales del Perso-
nal antes de la preparación magistral. Los lavabos no deben estar ubicados adyacentes al CIP de ISO Clase 5 (ver Tabla 7).
Los lavabos deben estar separados del área inmediata del dispositivo de CIP de ISO Clase 5 (ver Tabla 1).
4. Según se describe en el capítulo, se deben seguir las especificaciones de Limpieza y Desinfección de las Áreas de Preparación
Magistral Estéril, Capacitación del Personal y Evaluación de la Competencia en Vestimenta, Prácticas Asépticas de Trabajo y Pro-
cedimientos de Limpieza y Desinfección, así como Pruebas de Muestreo Ambienta/ (MA) para Partículas Viables y No Viables.
El personal de preparación magistral debe reconocer que la ausencia de una zona amortiguadora ISO Clase 7 (ver Tabla 7)
en un ambiente general no controlado aumenta la probabilidad de contaminación microbiana, y que la duración de la admi-
nistración de PME contaminadas con microbios que exceda de unas cuantas horas aumenta el potencial de colonización mi-
crobiana clínicamente significativa y por lo tanto de daño para el paciente, especialmente si se trata de pacientes críticamente
enfermos o inmunocomprometidos.
Garantía de Calidad-Las prácticas de garantía de calidad incluyen, entre otras, las siguientes:
1. Desinfección rutinaria y pruebas de calidad del aire del entorno de preparación directo para reducir al mínimo la contami-
nación microbiana de las superficies y mantener una calidad de aire ISO Clase 5 (ver Tabla 7).
2. Verificación visual de que el personal de preparación magistral está usando correctamente los elementos y los tipos de
vestimenta protectora apropiados, incluyendo gafas y máscaras.
3. Revisión de todas las órdenes y envases de ingredientes para asegurar que la identidad y cantidad de los ingredientes in-
corporados en la preparación magistral fueron los correctos.
USP 40 Pruebas Físicas/ (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles 739

4. Inspección visual de las PME para asegurar la ausencia de partículas en las soluciones, la ausencia de fugas en los viales y
bolsas y la información exacta y completa del etiquetado.
Procedimiento de Prueba de Llenado de Medios-Esta prueba, u otra equivalente, debe ser efectuada al menos una vez
al año por cada persona autorizada para realizar una preparación en un entorno de nivel de riesgo bajo, en condiciones que
simulen las situaciones más difíciles o extremas que se encuentran durante la elaboración de PME de nivel de riesgo bajo. Una
vez iniciada, esta prueba debe completarse sin interrupciones. Ejemplo de procedimiento de prueba: dentro de un entorno de
calidad de aire ISO Clase 5 (ver Tabla 1), transferir tres series de cuatro alícuotas de 5 mL de Medio de Digerido de Caseína y
Soja estéril (también conocido como caldo tripticasa de soja o agar tripticasa de soja [TSA]), con la misma combinación de
jeringa de 1 O mL y aguja con venteo estériles, a viales separados de 30 mL, transparentes, vacíos, sellados y estériles (es decir,
cuatro alícuotas de 5 mL a cada uno de los tres viales de 30 mL). Fijar asépticamente sellos adhesivos estériles a los tapones de
goma de los tres viales llenados y luego incubar los viales entre 20º y 25º o entre 30º y 35º durante un mínimo de 14 días. Si
se usan dos temperaturas para la incubación de muestras de llenado de medios, entonces tales envases llenos deberán incubar-
se durante al menos 7 días a cada temperatura (ver Control Microbiológico y Monitoreo de Ambientes de Procesamiento Aséptico
(1116)). Inspeccionar los viales durante 14 días para detectar cualquier crecimiento microbiano, según se describe en la sec-
ción Capacitación del Personal y Evaluación de la Competencia en Vestimenta, Prácticas Asépticas de Trabajo y Procedimientos de
Limpieza y Desinfección.

PME de Nivel de Riesgo Mediano

Cuando las PME se preparan asépticamente bajo Condiciones de Riesgo Bajo, y existe una o más de las siguientes condiciones,
dichas PME tienen un riesgo mediano de contaminación.
Condiciones de Riesgo Mediano-
1. Se combinan o agrupan múltiples dosis individuales o pequeñas de productos estériles para preparar una PME que se ad-
ministrará a varios pacientes o a un solo paciente en varias ocasiones.
2. El proceso de preparación magistral incluye manipulaciones asépticas complejas, aparte de la transferencia de volumen
única.
3. El proceso de preparación magistral tiene una duración inusualmente prolongada, como la requerida para completar la
disolución o el mezclado homogéneo.
4. En el caso de preparaciones de nivel de riesgo mediano, cuando no se someten a una prueba de esterilidad (ver Pruebas
de Esterilidad (71 )), los períodos de almacenamiento no pueden superar los siguientes tiempos: antes de su administra-
ción, las PME deben almacenarse de forma apropiada y exponerse durante no más de 30 horas a temperatura ambiente
controlada (ver Advertencias y Requisitos Generales), durante no más de 9 días a temperatura fría (ver Advertencias y Requi-
sitos Generales) y durante 45 días en estado sólido de congelación entre -25º y -1 Oº.
Ejemplos de Preparación Magistral de Riesgo Mediano-
1. Preparación magistral de líquidos para nutrición parenteral total usando dispositivos manuales o automatizados durante la
que se realizan varias inyecciones, desconexiones y conexiones de los productos que se usan como fuente de nutrientes al
dispositivo o máquina para suministrar todos los componentes nutricionales a un envase estéril final.
2. Llenado de los reservorios de dispositivos de inyección e infusión con más de tres productos farmacéuticos estériles y eva-
cuación del aire presente en dichos reservorios antes de dispensar el dispositivo llenado.
3. Transferencia de volúmenes de múltiples ampollas o viales a uno o más envases estériles finales.
Garantía de Calidad-Los procedimientos para garantizar la calidad de las PME de riesgo mediano incluyen los mismos
procedimientos utilizados para las PME de riesgo bajo y, además, una prueba de llenado de medios más exigente, que debe
realizarse en forma anual o con mayor frecuencia.
Procedimiento de Prueba de Llenado de Medios-Esta prueba, u otra equivalente, debe realizarse al menos anualmente
en condiciones que simulen las situaciones más difíciles o extremas que se encuentran durante la elaboración de preparaciones
magistrales. Una vez iniciada, esta prueba debe completarse sin interrupciones. Ejemplo de procedimiento de prueba: dentro de
un entorno de calidad de aire ISO Clase 5 (ver Tabla 1), transferir asépticamente por gravedad seis alícuotas de 100 mL de
Medio Digerido de Caseína y Soja estéril a través de tubuladuras separadas, a sendos recipientes estériles evacuados. A conti-
nuación, distribuir los seis recipientes en tres pares y usar una combinación estéril de jeringa de 1 O mL y aguja de calibre 18
para intercambiar dos alícuotas de 5 mL de medio de un recipiente al otro del par. Por ejemplo, después de agregar una alí-
cuota de 5 mL del primer recipiente al segundo recipiente del par, agitar este último durante 1 O segundos, tomar una alícuota
de 5 mL y volver a colocarla en el primer recipiente del par. Luego, agitar el primer recipiente durante 1 O segundos y transferir
la siguiente alícuota de 5 mL de vuelta al segundo recipiente del par. Después de los dos intercambios de alícuotas de 5 mL en
cada par de recipientes, inyectar asépticamente una alícuota de 5 mL de medio de cada recipiente en un vial de 1 O mL, trans-
parente, vacío, sellado y estéril, usando una jeringa de 1 O mL y una aguja con venteo estériles. Fijar asépticamente sellos adhe-
sivos estériles a los tapones de goma de los tres viales llenados y luego incubar los viales entre 20º y 25º o entre 30º y 35º por
un mínimo de 14 días. Si se usan dos temperaturas para la incubación de las muestras de llenado de medios, entonces tales
envases llenos deberán incubarse durante al menos 7 días a cada temperatura (ver Control Microbiológico y Monitoreo de Am-
bientes de Procesamiento Aséptico (1116)). Inspeccionar los viales durante 14 días para detectar cualquier crecimiento microbia-
no, según se describe en la sección Capacitación del Personal y Evaluación de la Competencia en Vestimenta, Prácticas Asépticas de
Trabajo y Procedimientos de Limpieza y Desinfección.
740 (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles/ Pruebas Físicas USP 40

PME de Nivel de Riesgo Alto

Las PME elaboradas bajo cualquiera de las condiciones indicadas a continuación están contaminadas o tienen un riesgo alto
de contaminarse.
Condiciones de Riesgo Alto-
1. Se incorporan ingredientes no estériles, incluyendo productos fabricados comercialmente que no están destinados para
vías de administración estériles (p.ej., oral) o se emplea un dispositivo no estéril antes de la esterilización terminal.
2. Cualquiera de los siguientes elementos se exponen a calidad de aire inferior a ISO Clase 5 (ver Tabla 7) durante más de 1
hora (ver PME de Uso Inmediato):
• contenido estéril de productos fabricados comercialmente,
• PME que carecen de conservantes antimicrobianos eficaces, y
• superficies estériles de dispositivos y envases para la preparación, transferencia, esterilización y envasado de PME.
3. El personal de preparación magistral tiene vestimenta y guantes inapropiados (ver Limpieza del Personal y Uso de Equipo
Protector de Barrera).
4. Las preparaciones no estériles que contienen agua se almacenan durante más de 6 horas antes de su esterilización.
5. Se presume, sin verificar el etiquetado y la documentación de los proveedores o sin determinación directa, que la pureza
química y el contenido de los ingredientes cumplen con sus especificaciones originales o farmacopeicas en envases no
abiertos o abiertos de ingredientes a granel (ver Selección de Ingredientes en Preparación Magistral-Preparaciones No Estéri-
les (795)).
Si las preparaciones esterilizadas de nivel de riesgo alto no han pasado una prueba de esterilidad, los períodos de almacena-
miento no pueden superar los siguientes tiempos: antes de su administración, las PME deben almacenarse de forma apropiada
y exponerse durante no más de 24 horas a temperatura ambiente controlada (ver Advertencias y Requisitos Generales), durante
no más de 3 días a temperatura fría (ver Advertencias y Requisitos Generales) y durante 45 días en estado sólido de congelación
entre -25º y -1 Oº. [NOTA-No se requieren pruebas de esterilidad para PME esterilizadas en autoclave, a menos que se prepa-
ren en lotes de más de 25 unidades.]
Todos los dispositivos de medición, mezclado y purificación no estériles deben enjuagarse bien con agua estéril apirógena y
luego deben escurrirse o secarse en su totalidad inmediatamente antes de utilizarlos para realizar preparaciones magistrales de
riesgo alto. Todas las soluciones PME de nivel de riesgo alto sometidas a esterilización terminal deben prefiltrarse, pasándolas
por un filtro con un tamaño de poro nominal de no más de 1,2 µm, antes o durante el llenado de los envases finales, con el fin
de retirar las partículas. La esterilización por filtración de las PME de nivel de riesgo alto debe realizarse con un filtro estéril de
tamaño de poro nominal de 0,2 µm o 0,22 µm, totalmente en un entorno con calidad de aire ISO Clase 5 (ver Tabla 7) o
superior.
Ejemplos de Condiciones de Riesgo Alto-
1. Disolución de polvos de fármacos y nutrientes a granel no estériles para preparar soluciones que se esterilizarán en forma
terminal.
2. Exposición de los ingredientes y componentes estériles usados para preparar y envasar PME en una calidad de aire inferior
a ISO Clase 5 (ver Tabla 7) durante más de 1 hora (ver PME de Uso Inmediato).
3. Medición y mezclado de ingredientes estériles en dispositivos no estériles antes de su esterilización.
4. Se supone, sin evidencia apropiada ni determinación directa, que los envases de ingredientes a granel contienen al menos
un 95% en peso de su parte química activa y que no se han contaminado ni adulterado entre un uso y otro.
Garantía de Calidad-Los procedimientos para garantizar la calidad de las PME de riesgo alto incluyen los mismos procedi-
mientos que para las PME de riesgo bajo. Además, cada persona autorizada para elaborar PME de riesgo alto, debe realizar
semestralmente una prueba de llenado de medios que represente una preparación magistral de nivel de riesgo alto.
Procedimiento de Llenado de Medios para PME Esterilizadas por Filtración-Esta prueba, u otra equivalente, debe reali-
zarse en condiciones que simulen las situaciones más difíciles o extremas que se encuentran durante la elaboración de prepara-
ciones magistrales de nivel de riesgo alto. Una vez iniciada, esta prueba debe completarse sin interrupciones. Ejemplo del proce-
dimiento de prueba (en la siguiente secuencia):
1. Disolver en 100 mL de agua no bacteriostática 3 g de Medio de Digerido de Caseína y Soja no estéril disponible comer-
cialmente para preparar una solución no estéril al 3%.
2. Extraer 25 mL del medio en tres jeringas estériles de 30 ml. Transferir 5 mL de cada jeringa a sendos viales de 1 O mL
estériles. Estos viales son los controles positivos para generar un crecimiento microbiano exponencial, el cual se evidencia
por una turbidez visible después de su incubación.
3. Bajo condiciones asépticas y utilizando técnicas asépticas, fijar a cada jeringa una unidad de filtración estéril con un tama-
ño de poro nominal de 0,2 µm o 0,22 µm y una aguja de calibre 20. Inyectar los siguientes 1 O mL de cada jeringa en tres
viales de 1 O mL estériles. Repetir el proceso en tres viales más. Etiquetar todos los viales, fijar sellos adhesivos estériles al
cierre de los nueve viales e incubarlos a una temperatura de 20º a 25º o de 30º a 35º durante un mínimo de 14 días. Si se
usan dos temperaturas para la incubación de muestras de llenado de medios, entonces tales envases llenos deberán incu-
barse durante al menos 7 días a cada temperatura (ver Control Microbiológico y Monitoreo de Ambientes de Procesamiento
Aséptico (1116)). Inspeccionar los viales durante 14 días para detectar cualquier crecimiento microbiano, según se descri-
be en la sección Capacitación del Personal y Evaluación de la Competencia en Vestimenta, Prácticas Asépticas de Trabajo y
Procedimientos de Limpieza y Desinfección.
USP 40 Pruebas Físicas/ (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles 741

CAPACITACIÓN V EVALUACIÓN DEL PERSONAL EN TÉCNICAS DE MANIPULACIÓN ASÉPTICA

El personal encargado de la preparación de las PME deberá recibir capacitación competente y a conciencia por parte de per-
sonal experto, con ayuda de instrucción audiovisual y publicaciones profesionales, sobre los principios teóricos y los conoci-
mientos prácticos en las manipulaciones asépticas, así como en la forma de conseguir y mantener condiciones ambientales ISO
Clase 5 (ver Tabla 1) antes de empezar a preparar las PME. Inicialmente, el personal de preparación magistral deberá realizar
una revisión didáctica y pasar pruebas escritas y de llenado de medios para evaluar la destreza en la manipulación aséptica; en
adelante, se someterán a dichas pruebas al menos una vez al año, en el caso de preparaciones magistrales de niveles de riesgo
bajo y mediano, y semestralmente, en el caso de preparaciones de nivel de riesgo alto. El personal de preparación magistral
que no pase las pruebas escritas o cuyos viales de prueba de llenado de medios produzcan una colonización microbiana profu-
sa, deberá recibir de inmediato una nueva capacitación y someterse a una nueva evaluación a cargo de personal experto en
preparación magistral, para asegurarse de que hayan corregido todas sus deficiencias en materia de práctica aséptica.
Prueba de Desafío de Llenado de Medios-La destreza del personal para preparar PME asépticamente se puede evaluar
usando una verificación de llenado de medios de cultivos bacterianos líquidos y estériles 1 (es decir, transferencia de un medio
de cultivo bacteriano estéril a través de una jeringa y aguja estériles). La prueba de llenado de medios se utiliza para evaluar la
práctica aséptica del personal de preparación magistral. Las pruebas de llenado de medios representan las condiciones más
exigentes o difíciles con las que el personal en proceso de evaluación puede encontrarse durante la elaboración de PME de un
determinado nivel de riesgo y durante la esterilización de PME de nivel de riesgo alto. Las pruebas de desafío de llenado de
medios que simulan la elaboración de PME de nivel de riesgo alto se usan también para verificar la capacidad del ambiente y
del proceso de preparación magistral para producir una preparación estéril.
Los medios líquidos de cultivo estériles disponibles comercialmente, como el Medio de Digerido de Caseína y Soja (ver Prue-
bas de Esterilidad (71 )), deberán promover la colonización exponencial de las bacterias que el personal de preparación magis-
tral y el entorno suelen transmitir a las PME. Los viales llenados con medios deben incubarse a una temperatura de 20º a 25º o
de 30º a 35º durante 14 días como mínimo. Si se usan dos temperaturas para la incubación de muestras de llenado de medios,
entonces tales envases llenos deberán incubarse durante al menos 7 días a cada temperatura (ver Control Microbiológico y Mo-
nitoreo de Ambientes de Procesamiento Aséptico (1116)). Si el medio desarrolla una turbidez visible dentro de los 14 días, signifi-
ca que no se ha pasado la prueba.

PME DE USO INMEDIATO

La provisión de uso inmediato está destinada sólo a aquellas situaciones en las cuales es necesario administrar de emergencia
o en forma inmediata una PME a un paciente. Dichas situaciones pueden incluir reanimación cardiopulmonar, tratamiento en
sala de emergencias, preparación de agentes de diagnóstico, o terapia crítica donde la preparación de la PME bajo las condi-
ciones descritas para PME de Nivel de Riesgo Bajo somete al paciente a un riesgo adicional debido a las demoras en la terapia.
Las PME de uso inmediato no están destinadas a almacenamiento para necesidades anticipadas o preparación magistral de
lotes. Las preparaciones magistrales que tienen nivel de riesgo mediano y nivel de riesgo alto no deben prepararse como PME
de uso inmediato.
Las PME de uso inmediato están eximidas de los requisitos descritos para PME de Nivel de Riesgo Bajo, sólo cuando se cum-
plen todos los criterios siguientes:
1. El proceso de preparación magistral incluye la transferencia simple de no más de tres empaques fabricados comercialmen-
te de productos estériles no peligrosos o productos radiofarmacéuticos de diagnóstico desde los envases originales del fa-
bricante, y no más de dos ingresos dentro de cualquier envase estéril o empaque individual (p.ej., bolsa, vial) de solución
estéril para infusión o envase/dispositivo de administración. Por ejemplo, los antineoplásticos no deben prepararse como
PME de uso inmediato porque son fármacos peligrosos.
2. A menos que la preparación lo requiera, el procedimiento de preparación magistral es un proceso continuo que no debe
exceder 1 hora.
3. Durante la preparación, se sigue una técnica aséptica y, de no administrarse inmediatamente, la PME terminada permane-
ce bajo supervisión continua para minimizar el potencial de contacto con superficies no estériles, la introducción de partí-
culas o líquidos biológicos, la mezcla con otras PME y el contacto directo de las superficies externas.
4. La administración comienza a más tardar una hora después de haber comenzado la preparación de la PME.
5. A menos que el prepador administre inmediata y completamente la PME, o el preparador vigile la administración inme-
diata y completa de la misma, la PME debe llevar una etiqueta que indica la información de identificación del paciente, los
nombres y las cantidades de todos los ingredientes, el nombre o iniciales de la persona que preparó la PME, así como la
FLU de 1 hora y la hora exactas.
6. Si la administración no ha comenzado dentro de 1 hora de haberse iniciado la preparación de la PME, ésta debe descar-
tarse de inmediato en forma segura y adecuada.
La preparación en condiciones inferiores a ISO Clase 5 (ver Tabla 1) aumenta la probabilidad de contaminación microbiana,
y la duración de la administración de PME contaminadas con microbios cuando excede de unas cuantas horas aumenta el po-

1 U.S. Food and Drug Administration, Guidance for lndustry, Sterife Drug Products Produced by Aseptic Processing-Current Good Manufacturing Practice, septiembre
de 2004.
 742 (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles/ Pruebas Físicas USP 40

tencial de colonización microbiana clínicamente significativa y por lo tanto de daño para el paciente, especialmente si se trata
de pacientes críticamente enfermos o inmunocomprometidos.

ENVASES MONODOSIS Y MULTI DOSIS

Los envases monodosis abiertos o perforados con aguja, tales como bolsas, frascos, jeringas y viales de productos estériles y
PME se deben usar dentro de 1 hora si se abren en aire de calidad inferior a ISO Clase 5 (ver Tabla 7) (ver PME de Uso Inmedia-
to) y desechar cualquier contenido restante. Los viales monodosis expuestos a aire ISO Clase 5 (ver Tabla 7) o más limpio se
pueden usar hasta 6 horas después de la perforación inicial con la aguja. Las ampollas monodosis abiertas no se deben almace-
nar por ningún período. Los envases multidosis (p.ej., viales) están formulados para retirar porciones en múltiples ocasiones,
porque generalmente contienen conservantes antimicrobianos. La FLU después de abrir o perforar (p.ej., con aguja) envases
multidosis es de 28 días (ver Pruebas de Eficacia Antimicrobiana (51 )), a menos que el fabricante especifique algo distinto.

FÁRMACOS PELIGROSOS COMO PME

Aunque los beneficios terapéuticos potenciales de las preparaciones magistrales estériles de fármacos peligrosos por lo gene-
ral sobrepasan los riesgos de sus efectos adversos en pacientes enfermos, los profesionales de la salud expuestos se arriesgan a
efectos adversos similares, sin ningún beneficio terapéutico. La exposición ocupacional a fármacos peligrosos pueden llevar a
(1) efectos agudos, como erupciones cutáneas; (2) efectos crónicos, incluso eventos adversos reproductivos; y (3) posiblemen-
te cáncer (ver Apéndice A de NIOSH Publication Nº 2004-165).
Los fármacos peligrosos se deben preparar para administración sólo bajo condiciones que protejan a los profesionales de la
salud y a otro personal en las áreas de preparación y almacenamiento. Los fármacos peligrosos se deben almacenar separados
de otro inventario, de manera que se evite la contaminación y la exposición del personal. Muchos fármacos peligrosos tienen
presiones de vapor suficientes que permiten la volatilización a temperatura ambiente; por lo tanto, se prefiere el almacena-
miento dentro de un área de contención, tal como un cuarto de presión negativa. El área de almacenamiento debe tener sufi-
ciente ventilación general de salida, con al menos 12 cambios de aire por hora (CAPH) 2 para diluir y retirar cualquier contami-
nante aéreo.
Los fármacos peligrosos se deben manejar con precaución en todo momento, usando guantes apropiados para quimiotera-
pia durante la recepción, distribución, aprovisionamiento, inventariado, preparación para administración y eliminación. Los fár-
macos peligrosos deben prepararse en un ambiente ISO Clase 5 (ver Tabla 1), con controles de ingeniería protectores y si-
guiendo las prácticas asépticas especificadas para los niveles de riesgo de contaminación apropiados definidos en este capítulo.
Se debe limitar el acceso a las áreas donde se almacenen y elaboren preparaciones de fármacos para proteger a las personas
que no están involucradas en tal proceso.
Todos los fármacos peligrosos se deben preparar en una CSB3 o un CACI que cumple o excede los estándares para CACI en
este capítulo. Las CSB o los CACI ISO Clase 5 (ver Tabla 7) deben ubicarse en un área ISO Clase 7 (ver Tabla 1) que esté física-
mente separada (es decir, un área diferente de las áreas de preparación) y que tenga óptimamente una presión negativa de no
menos de 0,01 pulgadas de columna de agua con respecto a las antesalas adyacentes de presión positiva ISO Clase 7 (ver
Tabla 1) o mejor, proporcionando así un flujo hacia adentro para contener cualquier partícula de fármaco presente en el aire.
Se debe instalar un indicador de presión en el que pueda consultarse fácilmente la correcta presurización del cuarto. Las CSB y
los CACI deben estar óptimamente ventilados en un 100% al exterior a través de filtración HEPA.
Si un CACI que cumple los requisitos de este capítulo se usa fuera de una zona amortiguadora, el área de preparación ma-
gistral debe mantener una presión negativa mínima de 0,01 pulgadas de columna de agua y tener un mínimo de 12 CAPH.
Cuando se usan dispositivos de sistema cerrado para transferencia de vial (CSTD, por sus siglas en inglés) (es decir, sistemas
de transferencia del vial que no permiten ventilación ni exposición de la sustancia peligrosa al ambiente), deben estar dentro
del ambiente ISO Clase 5 (ver Tabla 1) de una CSB o un CACI. Se prefiere el uso de un CSTD debido a su proceso de sistema
cerrado inherente. En instalaciones que preparan un volumen bajo de fármacos peligrosos, se acepta el uso de dos niveles de
contención (p.ej., un CSTD dentro de una CSB o un CACI que esté ubicado en un cuarto de presión no negativa).
Cuando se usan CSTD y se realiza una preparación magistral en una CSB o un CACI, debe usarse equipo protector para el
personal (EPP) apropiado. El EPP debe incluir batas, máscaras, gafas protectoras, gorras, cubrecalzado o calzado destinado a
ese propósito, doble enguantado con guantes estériles similares a los usados en quimioterapia y el cumplimiento con las reco-
mendaciones del fabricante al usar un CACI.
Todo el personal que elabora preparaciones con fármacos peligrosos debe capacitarse ampliamente en el almacenamiento,
manipulación y eliminación de estos fármacos. La capacitación debe ocurrir antes de preparar o manipular PME peligrosas y su
eficacia debe ser verificada probando técnicas específicas de preparación para fármacos peligrosos. Dicha verificación debe ser
documentada para cada persona al menos anualmente. Esta capacitación debe incluir el repaso didáctico de los fármacos peli-
grosos, incluyendo las propiedades mutagénicas, teratogénicas y carcinogénicas, y debe incluir capacitación continua para ca-
da nuevo fármaco peligroso que entre al mercado. El personal de preparación magistral que esté en edad reproductiva debe

2 Guidelines for Environmental lnfection Control in Health-Care Facilities, Recommendations of CDC and the Healthcare lnfection Control Practices Advisory Com-
mittee (HICPAC), MMWR, vol. 52, no. RR-1 O, junio 6, 2003, figura 3, pág. 12.
3 NSF/ANSI 49.
USP 40 Pruebas Físicas/ (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles 743

confirmar por escrito que entiende los riesgos de manipular los fármacos peligrosos. La capacitación debe incluir al menos los
siguientes puntos: (1) prácticas de manipulación aséptica segura; (2) técnicas de presión negativa cuando se utiliza una CSB o
un CACI; (3) uso correcto de dispositivos CSTC; (4) procedimientos de contención, limpieza y eliminación en caso de rupturas
y derramamientos; y (5) tratamiento del personal en caso de exposición por contacto o inhalación.
NOTA-Dado que las normas de valoración y las cantidades inaceptables de contaminación de cada fármaco no han sido estable-
cidos en Ja literatura, el siguiente párrafo es sólo una recomendación. A medida que se desarrollen y prueben estos métodos de ensa-
yo se adoptarán las normas apropiadas.
Con el fin de garantizar la contención, especialmente en operaciones de preparación que involucren grandes volúmenes de
fármacos peligrosos, se deben tomar muestras ambientales rutinariamente para detectar fármacos peligrosos no contenidos
(p.ej., inicialmente como punto de referencia y al menos cada 6 meses o más a menudo según sea necesario para verificar la
contención). Este muestreo ambiental debe incluir la obtención de muestras con paños (wipe sampling) de la superficie del
área de trabajo de una CSB y un CACI; mostradores donde se colocan las preparaciones terminadas; áreas adyacentes a una
CSB y un CACI, incluso el piso directamente debajo del área de trabajo; y áreas de administración a pacientes. Los marcadores
comunes de fármacos peligrosos que se pueden analizar incluyen ciclofosfamida, ifosfamida, metotrexato y fluorouracilo. Si se
encuentra alguna contaminación mensurable (se ha visto que concentraciones de ciclofosfamida mayores que 1,00 ng por cm 2
causan captación del fármaco en humanos) por cualquiera de estos procedimientos de garantía de calidad, los profesionales
de salud deben tomar la decisión de identificar, documentar y contener la causa de la contaminación. Tal acción puede incluir
la recapacitación, limpieza cuidadosa (utilizando un jabón de pH elevado y agua) y mejora de los controles de ingeniería. Algu-
nos ejemplos de formas de mejorar los controles de ingeniería incluyen (1) ventilar la CSB o el CACI 100% hacia el exterior; (2)
implementar un CSTD; o (3) reevaluar los tipos de CSB o CACI.
La eliminación de desechos de fármacos peligrosos debe cumplir con todas las reglamentaciones federales y estatales. Todo
el personal que efectúa las actividades rutinarias de eliminación de desechos y limpieza en las áreas de almacenamiento y pre-
paración con fármacos peligrosos debe recibir capacitación en los procedimientos apropiados para protegerse y prevenir la
contaminación.

PREPARADOS RADIOFARMACÉUTICOS COMO PME

En el caso de la producción de preparados radiofarmacéuticos para tomografía por emisión de positrones (PET), el capítulo
Preparados Radiofarmacéuticos para Tomografía por Emisión de Positrones-Preparación Magistral (823) reemplaza este capítulo.
Después de la liberación de un preparado radiofarmacéutico para PET como producto farmacéutico terminado de una instala-
ción de producción, el posterior manejo, manipulación o uso del producto será considerado como preparación magistral y el
contenido de esta sección y capítulo es aplicable.
A los efectos de este capítulo, los preparados radiofarmacéuticos magistrales elaborados a partir de componentes estériles en
envases estériles cerrados y con un volumen de 100 mL o menos para una inyección monodosis o no más de 30 mL tomados
de un envase multidosis (ver Requisitos de Envasado y Almacenamiento (659)) se deben nombrar según las normas para PME de
Nivel de Riesgo Bajo y cumplir con ellas.
Al preparar magistralmente estos productos radiofarmacéuticos, se deben usar jeringas y viales apropiadamente blindados
dentro de un CIP que funcione adecuadamente y que esté certificado como ISO Clase 5 (ver Tabla 1), localizado en un am-
biente de aire ISO Clase 8 (ver Tabla 7) o más limpio, que permita el cumplimiento con los requisitos especiales de manipula-
ción, protección y flujo de aire negativo.
Los viales de productos radiofarmacéuticos destinados a múltiples usos, preparados magistralmente con tecnecio 99m, ex-
puestos a un ambiente ISO Clase 5 (ver Tabla 7) y perforados por agujas sin contaminación por contacto directo, pueden usar-
se hasta la fecha indicada en las recomendaciones del fabricante. El almacenamiento y transporte de los viales adecuadamente
blindados de PME radiofarmacéuticas puede ocurrir en un ambiente de acceso limitado sin una designación especifica de clase
ISO.
Los sistemas generadores de tecnecio 99m/molibdeno 99 deben almacenarse y eluirse (manejarse) bajo las condiciones re-
comendadas por el fabricante y las reglamentaciones estatales y federales aplicables. Dichos sistemas generadores deben eluir-
se en un ambiente de aire ISO Clase 8 (ver Tabla 7) o más limpio que permita cumplir con los requisitos especiales de manipu-
lación, protección y flujo de aire. Para limitar la exposición aguda y crónica del personal de inspección a un nivel de radiación
tan bajo como sea razonablemente posible (ALARA), se debe efectuar la inspección visual directa, de acuerdo con ALARA, de
las PME radiofarmacéuticas que contengan concentraciones altas de dosis de radioactividad.
Los preparados radiofarmacéuticos elaborados como PME de Nivel de Riesgo Bajo con FLU de 72 Horas o Menos se deben pre-
parar en un área segregada. Se debe fijar una línea de demarcación que defina el área de preparación magistral segregada. Los
materiales y la vestimenta expuestos en el área de atención y tratamiento del paciente no deben cruzar una línea de demarca-
ción dentro del área de preparación magistral segregada.

EXTRACTOS DE ALÉRGENOS COMO PME

Los extractos de alérgenos como PME son inyecciones monodosis y multidosis para uso intradérmico o subcutáneo, prepara-
dos por médicos especialmente capacitados y el personal bajo su supervisión directa. Los extractos de alérgenos como PME
744 (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles/ Pruebas Físicas USP 40

quedan exentos de los requisitos indicados para el personal, ambiente y almacenamiento de todos los Niveles de Riesgo de Con-
taminación Microbiana en las PME descritos en este capítulo, sólo cuando se cumplen todos los criterios siguientes:
1. El proceso de preparación magistral involucra la transferencia simple por medio de agujas y jeringas de productos estériles
comerciales de alérgenos y sustancias estériles apropiadas agregadas (p.ej., glicerina, fenol y cloruro de sodio para inyec-
ción).
2. Todos los extractos de alérgenos como PME deben contener sustancias apropiadas en concentraciones eficaces para pre-
venir el crecimiento de microorganismos. Los extractos de alérgenos no conservados deben cumplir con los requisitos
apropiados de nivel de riesgo para PME en este capítulo.
3. Antes de comenzar las actividades de preparación magistral, el personal sigue un procedimiento cuidadoso de lavado de
manos para quitar los detritos bajo las uñas con un limpiador de uñas bajo agua tibia corriente, seguido por un lavado
vigoroso de manos y brazos hasta el codo, durante al menos 30 segundos, con un jabón antimicrobiano o no antimicro-
biano y agua.
4. El personal de preparación magistral se coloca gorras, mascarillas que cubran el vello facial, batas y máscaras.
5. El personal de preparación magistral realiza el lavado antiséptico de manos con un exfoliante quirúrgico a base de alcohol
con actividad persistente.
6. El personal de preparación magistral utiliza guantes estériles exentos de polvo que sean compatibles con alcohol isopropí-
lico al 70% (IPA) antes de comenzar las manipulaciones de la preparación magistral.
7. El personal de preparación magistral desinfecta los guantes intermitentemente con IPA estéril al 70% cuando prepara
múltiples extractos de alérgenos como PME.
8. Los cuellos de las ampollas y los tapones de viales en los envases de ingredientes estériles fabricados comercialmente se
desinfectan frotándolos cuidadosamente con hisopos empapados en IPA estéril al 70% para garantizar que los sitios críti-
cos estén húmedos durante al menos 1O segundos y se dejen secar antes de usarlos para la preparación de extractos de
alérgenos como PME.
9. Las manipulaciones asépticas de las preparaciones magistrales minimizan la contaminación directa por contacto (p.ej., de
las puntas de los dedos de los guantes, sangre, secreciones orales y nasales, piel y cosméticos descamados, otros materia-
les no estériles) con sitios críticos (p.ej., agujas, ampollas abiertas, tapones de viales).
1 O. La etiqueta de cada vial multidosis (VMD) de extractos de alérgenos como PME incluye el nombre de un paciente específi-
co así como la FLU y el intervalo de temperatura de almacenamiento que se asignan basándose en las recomendaciones
del fabricante o publicaciones de referencia.
11. Las ampollas monodosis de extractos de alérgenos como PME no se deben almacenar para uso adicional subsiguiente.
El personal que prepara extractos de alérgenos como PME debe ser consciente del mayor riesgo potencial de contaminación
microbiana y con materia extraña cuando los extractos de alérgenos como PME se preparan cumpliendo con criterios anterio-
res en vez de seguir las normas más rigurosas de este capítulo para Niveles de Riesgo de Contaminación Microbiana en las PME.
Aunque los extractos de alérgenos como PME pueden representar riesgos para la salud de los pacientes cuando se inyectan
intradérmica o subcutáneamente, estos riesgos son sustancialmente mayores si el extracto se inyecta por vía intravenosa inadver-
tidamente.

Cambio en la redacción:

VERIFICACIÓN DE LA EXACTITUD Y ESTERILIDAD DE LA PREPARACIÓN MAGISTRAL

Los procedimientos de preparación magistral y los métodos de esterilización de PME deben corresponder con los especifica-
dos en la documentación escrita, debidamente confeccionada y verificada por la institución responsable de la preparación ma-
gistral. La verificación requiere pruebas planificadas, monitoreo y documentación que permitan demostrar el cumplimiento de
los requisitos de calidad ambiental, las prácticas del personal y los procedimientos críticos para conseguir y mantener la esterili-
dad, exactitud y pureza de las PME terminadas. Por ejemplo, pueden realizarse pruebas de esterilidad (ver Prueba de Esterilidad
para el Producto a Examinar en Pruebas de Esterilidad (71 )) con muestras de PME de riesgo bajo y mediano, y deben agregarse
indicadores biológicos (IB) estándar autocontenidos a muestras no dispensables de PME de nivel de riesgo alto antes de su
esterilización terminal para determinar en la evaluación posterior si el ciclo de esterilización fue adecuado (ver •Indicadores Bio-
lógicos para Esterilización (1229.5).• (AF01-may-w17¡). Las PME envasadas y etiquetadas deben inspeccionarse visualmente para veri-
ficar su integridad física y aspecto esperado, incluyendo la cantidad de llenado final. La exactitud de las identidades, concen-
traciones, cantidades y purezas de los ingredientes de las PME se deben confirmar revisando las etiquetas en los envases, ob-
servando y documentando las mediciones correctas con los dispositivos aprobados y correctamente estandarizados, y revisan-
do la información en el etiquetado y en los certificados de análisis proporcionados por los proveedores. Cuando no se pueda
confirmar la identidad, la pureza, el contenido y la esterilidad correctas de los ingredientes y componentes de las PME (por
ejemplo, en caso de jeringas sin etiquetado, ampollas abiertas, tapones de viales y bolsas perforados, envases de ingredientes
con etiquetado incompleto), dichos ingredientes y componentes se deben desechar de inmediato.
Algunos ingredientes individuales, como fármacos a granel, no se etiquetan con las fechas de caducidad cuando se mantie-
nen estables indefinidamente en sus empaques comerciales, bajo las condiciones de almacenamiento declaradas. Sin embargo,
a pesar de conservar estabilidad química completa, dichos ingredientes pueden ganar o perder humedad durante el almacena-
miento y uso. Los cambios en el contenido de humedad pueden requerir pruebas (ver Pérdida por Secado (731 )) para determi-
USP 40 Pruebas Físicas/ (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles 745

nar la cantidad correcta que se debe pesar para obtener el contenido exacto de las partes químicas activas en las PME (ver •
Cálculos en la Práctica Farmacéutica (1160)• (AF 01 .may.20171 ).
Aunque no se requiere, se recomienda realizar un ensayo químico cuantitativo indicador de estabilidad para garantizar la
exactitud de la preparación de las PME, especialmente de aquellas que contienen ingredientes farmacéuticos con un estrecho
intervalo de concentración terapéutica en plasma.

Métodos de Esterilización

Los profesionales de la salud autorizados que están a cargo de supervisar las preparaciones magistrales son responsables de
asegurar que el método de esterilización seleccionado (ver Métodos de Esterilización en Esterilización y Garantía de Esterilidad de
Artículos Farmacopeicos (1211 )) esterilice y mantenga el contenido, pureza, calidad e integridad del envase de las PME. El pro-
ceso de esterilización seleccionado se obtiene a partir de la experiencia y de las fuentes de información apropiadas (p.ej., ver
Esterilización y Garantía de Esterilidad de Artículos Farmacopeicos (1211 )) y, preferentemente, se verifica hasta donde sea posible
para conseguir la esterilidad de las PME específicas. Éstas son algunas guías generales para asignar un método de esterilización
apropiado a una PME y sus componentes:
1. Debe comprobarse que las PME se mantienen física y químicamente estables cuando se las somete al método de esterili-
zación seleccionado.
2. Los dispositivos de vidrio y metal pueden cubrirse herméticamente con papel de aluminio y luego exponerse a calor seco
en un horno a una temperatura media de 250º durante 30 minutos para lograr la esterilidad y despirogenización (ver
Esterilización por Calor Seco en Esterilización y Garantía de Esterilidad de Artículos Farmacopeicos (1211 )) y Prueba de Endoto-
xinas Bacterianas (85)). Dichos artículos deben usarse de inmediato o almacenarse hasta su uso en un ambiente adecuado
para la elaboración de las PME de Nivel de Riesgo Bajo y Mediano.
3. El personal debe determinar, a partir de fuentes de referencia apropiadas, si el filtro de membrana microporosa estéril usa-
do para esterilizar las soluciones de PME, ya sea durante su preparación magistral o su administración, es química y física-
mente compatible con la PME.

ESTERILIZACIÓN DE PME DE NIVEL DE RIESGO ALTO POR FILTRACIÓN

Los filtros estériles disponibles comercialmente deben estar aprobados para la esterilización de líquidos farmacéuticos de uso
en seres humanos. Los filtros estériles usados para esterilizar las PME deben estar exentos de pirógenos y tener un tamaño no-
minal de poro de 0,2 ó 0,22 µm. El fabricante debe certificar que retienen al menos 10 7 microorganismos de una cepa de
Brevundimonas (Pseudomonas) diminuta en cada centímetro cuadrado del área superficial de la cara superior del filtro en condi-
ciones similares a las que se utilizarán para esterilizar las PME (ver Condiciones de Alto Riesgo en PME de Nivel de Riesgo Alto).
El supervisor de preparación magistral debe asegurar, en forma directa o a partir de documentación apropiada, que los fil-
tros sean química y físicamente estables en las condiciones de presión y temperatura que se utilizarán, que tengan capacidad
suficiente para filtrar los volúmenes requeridos y que logren la esterilidad y mantengan la calidad farmacéutica previa a la filtra-
ción, incluida la concentración de ingredientes de la PME específica. Las dimensiones del filtro y el líquido a esterilizar deben
permitir que el proceso de esterilización se complete rápidamente sin reemplazar el filtro durante el proceso. Cuando se sabe
que la PME contiene una cantidad excesiva de partículas, debe colocarse un prefiltro de membrana con un tamaño nominal de
poro mayor, antes del filtro de esterilización, para eliminar las partículas contaminantes grandes y aumentar al máximo la efica-
cia del filtro de esterilización.
Las unidades de filtración usadas para esterilizar las PME también deben someterse a las pruebas de integridad recomenda-
das por el fabricante, como la prueba de punto de burbuja.
El personal de preparación magistral debe verificar que los filtros seleccionados logren la esterilización de las PME que se
están esterilizando. Las desviaciones significativas respecto de las propiedades químicas y físicas normales o esperadas de las
PME (p.ej., alcoholes miscibles en agua) podrían causar daños no detectables en la integridad del filtro y la reducción de los
microorganismos a un tamaño más pequeño que el de los poros del filtro.

ESTERILIZACIÓN DE PME DE NIVEL DE RIESGO ALTO POR VAPOR

El proceso de esterilización térmica utilizando vapor saturado bajo presión, o esterilización en autoclave, es el método prefe-
rido para la esterilización terminal de preparaciones acuosas que, según se ha verificado, mantienen su estabilidad química y
física bajo las condiciones empleadas (ver Esterilización por Vapor en Esterilización y Garantía de Esterilidad de Artículos Farmaco-
peicos (1211 )). Para lograr la esterilidad, todos los materiales deben exponerse al vapor a una temperatura de 121 º, bajo una
presión de aproximadamente 1 atmósfera o 15 psi, durante un tiempo que, según se haya verificado mediante pruebas, logre
la esterilidad de los artículos. Por lo general, este tiempo es de 20 a 60 minutos en el caso de las PME. Debe contemplarse el
tiempo requerido para que el material alcance los 121 ºantes de medir la duración de la exposición de esterilización.
Si no se exponen directamente los artículos a vapor presurizado, pueden sobrevivir algunos microorganismos y esporas. An-
tes de su esterilización, los dispositivos de plástico, vidrio y metal deben envolverse herméticamente en un papel o tela de bajo
desprendimiento de partículas o sellarse en sobres que impidan la penetración microbiana después de su esterilización. lnme-
746 (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles/ Pruebas Físicas USP 40

diatamente antes de llenar las ampollas y viales que se esterilizarán con vapor, las soluciones deben pasarse por un filtro con
un tamaño nominal de poro de no más de 1,2 µm para eliminar las partículas. Los envases sellados deben poder generar vapor
internamente; en consecuencia, los viales vacíos con tapón y precintados deben contener una pequeña cantidad de humedad
para generar vapor.
La descripción de las condiciones y duración de la esterilización por vapor para cada PME debe estar documentada por escri-
to en la institución responsable de la preparación magistral. La eficacia de la esterilización con vapor debe verificarse utilizando
1B apropiados de Bacillus stearothermophilus (ver •Indicadores Biológicos para Esterilización (1229 .5) • (AF 01 .may-2017)) y otros méto-
dos de verificación, como los dispositivos sensores de temperatura (ver Esterilización y Garantía de Esterilidad de Artículos Farma-
copeicos (1211) y Pruebas de Esterilidad (71 )).

ESTERILIZACIÓN DE PME DE NIVEL DE RIESGO ALTO POR CALOR SECO

La esterilización por calor seco se realiza por lo general como un proceso por lotes en un horno destinado a esterilización. El
aire caliente filtrado debe distribuirse uniformemente a través de la cámara, por medio de un dispositivo ventilador. El horno
debe equiparse con un sistema para controlar la temperatura y el tiempo de exposición. La esterilización por calor seco requie-
re temperaturas más altas y tiempos de exposición más prolongados que la esterilización por vapor. El calor seco se debe usar
sólo para aquellos materiales que no se puedan esterilizar por vapor, cuando la humedad daña el material o éste es impermea-
ble. Durante la esterilización se debe dejar suficiente espacio entre los materiales para permitir una buena circulación del aire
caliente. La descripción de las condiciones y duración de la esterilización por calor seco para cada PME debe estar documenta-
da por escrito en la institución responsable de la preparación magistral. La eficacia de la esterilización por calor seco debe veri-
ficarse utilizando IB apropiados de Bacillus subtilis (ver •Indicadores Biológicos para Esterílización (1229.5)• (AFoi-may.20 17)) y otros
métodos de verificación, como los dispositivos sensores de temperatura (ver Esterilización y Garantía de Esterilidad de Artículos
Farmacopeicos (1211) y Pruebas de Esterilidad (71 )). [NOTA-La esterilización por calor seco se puede efectuar a una temperatu-
ra más baja de la que podría ser eficaz para la despirogenización].

Despirogenización por Calor Seco

La despirogenización por calor seco se debe usar para eliminar los pirógenos y los microbios viables de los materiales o enva-
ses de vidrio, como los viales. Un ciclo típico sería de 30 minutos a 250º. La descripción del ciclo de despirogenización por
calor seco y su duración para artículos de una carga específica debe estar documentada por escrito en la institución responsa-
ble de la preparación magistral. La eficacia del ciclo de despirogenización por calor seco se debe verificar usando viales para
desafío de endotoxinas (VDE). La prueba de endotoxinas bacterianas se debe efectuar en los VDE para verificar que el ciclo es
capaz de conseguir una reducción de 3 lag en endotoxinas (ver Esterilización y Garantía de Esterilidad de Artículos Farmacopeicos
(1211) y Prueba de Endotoxinas Bacterianas (85)).

CALIDAD Y CONTROL AMBIENTAL

Lograr y mantener la esterilidad y la ausencia total de contaminación de una PME depende de la calidad de los componen-
tes incorporados, del proceso utilizado, del desempeño del personal y de las condiciones ambientales en las que se realiza el
proceso. Los niveles de exigencia requeridos en relación con las condiciones ambientales dependen del grado de exposición
esperado de la PME al entorno inmediato durante su procesamiento. En esta sección se describen la calidad y el control de las
condiciones ambientales para cada nivel de riesgo de operación. Además, las operaciones que utilizan componentes no estéri-
les requieren el uso de un método de preparación diseñado para obtener una preparación estéril.

Exposición de Sitios Críticos

Mantener la esterilidad y la limpieza (es decir, ausencia de materia extraña estéril) de los sitios críticos es una salvaguarda
importante para las PME. Los sitios críticos son aquellos que incluyen cualquier componente o superficie de recorrido de líqui-
dos (p.ej., septos de viales, puertos de inyección, vasos de precipitados) o aberturas (p.ej., ampollas abiertas, conos conectores
de agujas) expuestos y en riesgo de contacto directo con el aire (p.ej., ambiental o filtrado por HEPA), humedad (p.ej., secre-
ciones orales o mucosas), o contaminación por contacto. El riesgo o probabilidad de que los sitios críticos se contaminen con
microorganismos y materia extraña se incrementa con el aumento del área expuesta de los sitios críticos, la densidad o con-
centración de los contaminantes y la duración de la exposición a una calidad de aire inferior a ISO Clase 5 (ver Tabla 7). Los
ejemplos incluyen una ampolla abierta o un tapón en un vial de 1 O mL o de mayor volumen o un puerto de inyección en un
envase de solución intravenosa que tiene un área más grande que la punta de la aguja o de una jeringa.
Las características del sitio crítico también influyen en el grado de riesgo de contaminación. Después de frotarla con una
gasa embebida en IPA estéril al 70%, la superficie relativamente áspera y permeable de un tapón elastomérico retiene microor-
ganismos y otros contaminantes con más facilidad que la superficie de vidrio más lisa del cuello de una ampolla. En conse-
cuencia, puede esperarse que la desinfección de la superficie sea más eficaz en el caso de una ampolla.
USP 40 Pruebas Físicas/ (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles 747

En la práctica de preparación magistral estéril, se debe dar la más alta prioridad a la protección de los sitios críticos, evitando
el contacto físico y los contaminantes aéreos. Los contaminantes aéreos, especialmente aquellos generados por el personal de
preparación magistral estéril, tienen muchas más probabilidades de llegar a los sitios críticos que los contaminantes que están
adheridos al piso o a otras superficies por debajo del nivel de trabajo. Más aún, las partículas grandes y de alta densidad que se
generan e introducen mediante las manipulaciones de la preparación magistral y el personal tienen el potencial de asentarse
en los sitios críticos incluso cuando dichos sitios están expuestos a aire ISO Clase 5 (ver Tabla 1).

Fuentes de Aire ISO Clase 5, Zonas Amortiguadoras y Antesalas

Las fuentes más comunes de aire de calidad ISO Clase 5 (ver Tabla 1) para exposición de sitios críticos son CFL horizontales y
verticales, CAi y CACI. Un cuarto limpio (ver Control Microbiológico y Monitoreo de Ambientes de Procesamiento Aséptico (1116))
es un ambiente para preparaciones magistrales provisto con HEPA o aire filtrado con HEPA, el cual cumple con ISO Clase 7 (ver
Tabla 1), y cuyo acceso está limitado al personal capacitado y autorizado para realizar la preparación magistral estéril y la lim-
pieza de las instalaciones. Una zona amortiguadora es un área provista con aire de calidad ISO Clase 7 (ver Tabla 7) como
mínimo.
La Figura 7 es una representación conceptual de la colocación de un CIP ISO Clase 5 (ver Tabla 1) en un área de preparación
magistral segregada, usada para PME de nivel de riesgo bajo con FLU de 12 horas o menos. Este plano muestra el área de
operación más crítica localizada dentro del CIP en un área designada (ver definición de Área de Preparación Magistral Segrega-
da) separada de las actividades no esenciales para la preparación de las PME. La colocación de dispositivos (p.ej., computado-
ras, impresoras) y objetos (p.ej., carros, gabinetes) que no son esenciales para la preparación magistral en el área segregada
debe estar restringida o limitada, dependiendo de su efecto sobre la calidad del aire en el CIP ISO Clase 5 (ver Tabla 7).

Representación conceptual de los

requisitos de las instalaciones del
Capítulo <797> de la USP

Figura 1. Representación conceptual de la colocación de un CIP ISO Clase 5 en un área de preparación magistral segregada,
usada para PME de nivel de riesgo bajo con FLU de 12 horas o menos.

La "type="figure">Figura 2 es una representación conceptual de la distribución de una instalación para la preparación de

PME clasificadas como de nivel de riesgo bajo, mediano y alto. La calidad del aire ambiental aumenta con el movimiento des-
de el límite externo hacia el área directa de preparación magistral (ADP). La colocación de dispositivos en las antesalas y las
zonas amortiguadoras está dictada por su efecto sobre la calidad ambiental designada de las atmósferas y superficies, que de-
be ser verificada por monitoreo (ver Pruebas de Muestreo Ambienta/ (MA) de Partículas Viables y No Viables). Cada instalación de
preparación magistral tiene la responsabilidad de garantizar que las fuentes de ambientes ISO Clase 5 (ver Tabla 7) para expo-
sición de sitios críticos y esterilización por filtración estén adecuadamente ubicadas, manejadas, mantenidas, supervisadas y ve-
rificadas.
748 (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles/ Pruebas Físicas USP 40

Representación conceptual delos

requisitos de lasinstalac1ones
del Capítulo <797> de la USP

Figura 2. Representación conceptual de la distribución de una instalación para la preparación de PME clasificadas como de
riesgo bajo, mediano y alto.

La colocación de los dispositivos (p.ej., computadoras, impresoras) y objetos (p.ej., carros, gabinetes) que no son esenciales
para la preparación magistral en las antesalas y las zonas amortiguadoras está dictada por su efecto sobre la calidad ambiental
requerida para las atmósferas y superficies, que debe ser verificada por monitoreo (ver Pruebas de Muestreo Ambiental (MA) de
Partículas Viables y No Viables). Cada instalación de preparación magistral tiene la responsabilidad de garantizar que las fuentes
de ambientes ISO Clase 5 (ver Tabla 7) para exposición de sitios críticos y esterilización por filtración estén adecuadamente
ubicadas, manejadas, mantenidas, supervisadas y verificadas.

Diseño de la Instalación y Controles Ambientales

Las instalaciones de preparación magistral están físicamente diseñadas y ambientalmente controladas para minimizar el con-
tacto de la contaminación aérea con los sitios críticos. Estas instalaciones deben proporcionar también un ambiente de trabajo
cómodo y bien iluminado, por lo general con una temperatura de 20º o menos, para brindar condiciones de comodidad al
personal de preparación magistral para que se desempeñe correctamente mientras está ataviado con la vestimenta requerida
para la preparación magistral aséptica. Los CIP por lo general incluyen, entre otros, CFL, CSB, CAi y CACI, los cuales brindan
un ambiente ISO Clase 5 (ver Tabla 7) para la exposición de sitios críticos. Los CIP deben mantener las condiciones ISO Clase 5
(ver Tabla 7) o mejores para las partículas de 0,5 µm (condiciones dinámicas de funcionamiento) mientras se preparan PME.
Los controles de ingeniería secundarios, tales como zonas amortiguadoras y antesalas, por lo general sirven como centro para
la ubicación del CIP. Las zonas amortiguadoras están diseñadas para mantener condiciones ISO Clase 7 (ver Tabla 7) como
mínimo, para partículas de 0,5 µm bajo condiciones dinámicas, y condiciones ISO Clase 8 (ver Tabla 7) para partículas iguales
o mayores de 0,5 µm bajo condiciones dinámicas para las antesalas. El control de contaminación aérea se logra en el CIP por
medio de filtros HEPA. El flujo de aire en el CIP debe ser unidireccional (flujo laminar) y debido a la eficiencia de recolección de
partículas del filtro, cuando se trata de preparación magistral aséptica, el "primer aire" en la cara del filtro está libre de conta-
minación por partículas aéreas. El aire filtrado por HEPA debe suministrarse en las áreas críticas (ISO Clase 5, ver Tabla 7) a una
velocidad suficiente para arrastrar las partículas lejos del área de preparación magistral y mantener el flujo de aire unidireccio-
nal durante las operaciones. El diseño y control apropiados evitan la turbulencia y el aire estancado en el área crítica. En el área
crítica se debe realizar un análisis del patrón de aire in situ por medio de estudios con humo para demostrar el flujo unidirec-
cional del aire y la acción de arrastre sobre el producto bajo condiciones dinámicas.
Los principios del flujo unidireccional de aire filtrado por HEPA en el ambiente de trabajo se deben comprender y practicar
en el proceso de preparación magistral, con el fin de conseguir las condiciones ambientales deseadas. Las políticas y procedi-
mientos para el mantenimiento y trabajo dentro del área del CIP se deben poner por escrito y cumplir. Las políticas y procedi-
mientos estarán determinados por el alcance y niveles de riesgo de las actividades de preparación magistral aséptica utilizadas
durante la preparación de las PME. El ambiente de trabajo de la PME está diseñado para tener las superficies de trabajo más
limpias (CIP) localizadas en una zona amortiguadora. La zona amortiguadora deberá mantener condiciones ISO Clase 7 (ver
Tabla 7) como mínimo, para las partículas iguales o mayores de 0,5 µm bajo condiciones de operación dinámicas. El cuarto
debe estar segregado de los espacios circundantes no clasificados, para reducir el riesgo de que se soplen, arrastren o introduz-
can de otra manera contaminantes dentro del ambiente de flujo unidireccional de aire filtrado y tal segregación debe monito-
rearse en forma constante. Para cuartos que proporcionan una separación física por medio de paredes, puertas y cabinas de
transferencia de materiales (pass-throughs), se requiere una presión positiva diferencial mínima de 0,02 a 0,05 pulgadas de
columna de agua. Para zonas amortiguadoras no físicamente separadas de las antesalas, se debe emplear el principio de des-
plazamiento del flujo de aire. Este concepto utiliza un principio de baja presión diferencial y alto flujo de aire. El uso de despla-
zamiento del flujo de aire requiere por lo general una velocidad de aire igual o mayor a 40 pies por minuto desde la zona
amortiguadora, pasando por la línea de demarcación hacia la antesala.
USP 40 Pruebas Físicas/ (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles 749

El concepto de desplazamiento no debe usarse para preparación magistral de alto riesgo. 4 El CIP debe estar ubicado dentro
de una zona amortiguadora de tal manera que se eviten condiciones que podrían afectar adversamente su funcionamiento.
Por ejemplo, las corrientes de aire fuertes provenientes de las puertas abiertas, el tráfico del personal o los flujos de aire prove-
nientes de los sistemas de HVAC pueden alterar el flujo de aire unidireccional en cabinas de frente abierto. Los operadores tam-
bién pueden producir alteraciones en el flujo de aire con sus propios movimientos y al colocar objetos sobre la superficie de
trabajo. El CIP debe ubicarse fuera del flujo de tráfico y de manera que el sistema de HVAC y las corrientes de aire del cuarto
no causen perturbaciones. Los intercambios de aire del cuarto por lo general se expresan como CAPH. Se necesita un adecua-
do flujo de aire filtrado por HEPA y suministrado a la zona amortiguadora y a la antesala, con el fin de mantener la clasificación
de limpieza durante la actividad operativa a través de los CAPH. Los factores que deben considerarse al determinar los requisi-
tos de cambio de aire incluyen la cantidad de personas que trabajan en el cuarto y los procesos de preparación magistral que
generan partículas, así como los efectos de la temperatura. Una zona amortiguadora y una antesala ISO Clase 7 (ver Tabla 1)
provistas de aire filtrado por HEPA deben recibir no menos de 30 CAPH. El CIP es una buena forma de incrementar los cambios
de aire en el suministro de aire de un área, pero no puede ser la única fuente de aire filtrado por HEPA. Cuando el área cuenta
con un dispositivo de recirculación ISO Clase 5 (ver Tabla 7) se considera adecuado un mínimo de 15 CAPH a través de los
filtros HEPA que abastecen el área, siempre y cuando los CAPH combinados no sean menores de 30. Se pueden requerir más
intercambios de aire, dependiendo de la cantidad de personas y procesos. El suministro de aire filtrado por HEPA se debe intro-
ducir por el cielo raso y los retornos se deben montar a un nivel bajo en la pared, creandose así una dilución general, de arriba
hacia abajo, del aire del área con el aire filtrado por HEPA. No se recomienda ubicar los retornos en el cielo raso. Debe probar-
se la eficacia de todos los filtros HEPA, usando el tamaño de partícula más penetrante y deben probarse por fugas en la fábrica
y de nuevo in situ después de la instalación. 5
Las actividades y tareas desarrolladas dentro de la zona amortiguadora deben limitarse a aquellas necesarias cuando se tra-
baja en un ambiente controlado. Sólo pueden llevarse a este cuarto los muebles, equipos, suministros y otros materiales reque-
ridos para realizar las actividades de preparación magistral y éstos deben ser impermeables, lavables, resistentes a los desinfec-
tantes y no desprender partículas. Cada vez que se lleva alguno de estos elementos al cuarto, primero se lo debe limpiar y
desinfectar. Siempre que sea posible, los equipos y otros elementos usados en la zona amortiguadora no deben retirarse del
cuarto, salvo para su calibración, reparación u otras actividades asociadas con el mantenimiento correcto del equipo.
Las superficies de los cielos rasos, paredes, pisos, artefactos, estantes, mostradores y gabinetes en la zona amortiguadora de-
ben ser lisos e impermeables, no deben tener grietas y no deben desprender partículas para facilitar su limpieza y reducir al
mínimo los espacios en los que podrían acumularse microorganismos y otros contaminantes. Las superficies deben ser resisten-
tes a los daños causados por agentes desinfectantes. Las uniones de los cielos rasos con las paredes deben ser abovedadas o
enmasilladas para evitar la formación de grietas donde pueda acumularse polvo. Si los cielos rasos constan de paneles incrusta-
dos, éstos se deben impregnar con un polímero para hacerlos impermeables e hidrófobos y, además, se debe enmasillar todo
su perímetro para sellar la unión con el armazón que hace de soporte. Las paredes pueden ser de material flexible (p.ej., polí-
mero de alta densidad), paneles unidos entre sí y sellados o placas de yeso con revestimiento epóxico. Preferentemente, los
pisos deben cubrirse con planchas anchas de revestimiento vinílico, térmicamente soldadas y arqueadas hacia los zócalos. De-
be evitarse la presencia de elementos salientes que junten polvo, como las tuberías de servicios que pasan por el cielo raso o
las repisas de las ventanas. La superficie externa de los artefactos de iluminación embutidos en el cielo raso debe ser lisa y estar
sellada y al ras del cielo raso. Cualquier otro elemento que penetre en el cielo raso o las paredes debe estar sellado. La zona
amortiguadora no debe contener fuentes de agua (lavabos) ni drenajes en el piso. Las superficies de trabajo deben estar cons-
truidas con materiales lisos impermeables, como acero inoxidable o plástico moldeado, para que puedan limpiarse y desinfec-
tarse fácilmente. Los carros deben ser de alambre de acero inoxidable, plástico no poroso o planchas metálicas, con ruedas de
buena calidad y fáciles de limpiar para facilitar su movilidad. Los estantes de almacenamiento, mostradores y gabinetes deben
ser lisos, de material impermeable y fáciles de limpiar y desinfectar y, además deben estar libres de grietas y no desprender
partículas; la cantidad, el diseño, y la forma de instalación deben ser tales que faciliten una limpieza y sanitización eficaces.

Colocación de los Controles de Ingeniería Primarios

Los CIP (CFL, CSB, CAi y CACI) deben ubicarse dentro de una zona amortiguadora ISO Clase 7 (ver Tabla 1) de acceso res-
tringido (ver Figura 7), con las siguientes excepciones para CAl/CACI:
• Sólo el personal autorizado y los materiales requeridos para la preparación magistral y la limpieza deben permitirse en la
zona amortiguadora.
• Los procedimientos de preesterilización para las PME de alto riesgo, como por ejemplo pesar y mezclar, se deben comple-
tar en un ambiente no inferior a ISO Clase 8 (ver Tabla 7).
• Los CIP deben ubicarse fuera de las vías de tráfico y lejos de las corrientes de aire del cuarto que pudieran perturbar los
patrones de flujo de aire deseados.

4 ISO 14644-4:2001 Cleanrooms and associated controlled environments-Design, construction, and start-up, Case Posta/e 56, CH-1211 Geneve 20, Switzerland,

tel. +41227490111.
5 Por definición (IEST RP CC 0001 .4), los filtros HEPA tienen como mínimo una eficacia de 99,97% cuando se prueban usando un fotómetro y partículas de 0,3
µm generadas termalmente o clasificadas según el tamaño de partícula más penetrante, usando un contador de partículas.
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Los CAi y los CACI deben ubicarse dentro de una zona amortiguadora ISO Clase 7 (ver Tabla 7) a menos que cumplan con
todas las condiciones siguientes:
• El aislador debe proporcionar aislamiento del cuarto y mantener la ISO Clase 5 (ver Tabla 7) durante las condiciones diná-
micas de operación, incluso la transferencia de ingredientes, componentes y dispositivos dentro y fuera del aislador y du-
rante la preparación de PME.
• Los recuentos de partículas de muestras tomadas aproximadamente 6 a 12 pulgadas más arriba del sitio de exposición
crítica deben mantener niveles ISO Clase 5 (ver Tabla 7) durante la preparación magistral.
• No se deben contar más de 3520 partículas (0,5 µm y más grandes) por m3 durante la transferencia de material, con la
sonda del contador de partículas ubicada tan cerca de la puerta de transferencia como sea posible, sin obstruir la transfe-
rencia.6
El personal de preparación magistral tiene la responsabilidad de obtener del fabricante la documentación indicando que los
CAl/CACI cumplirán con esta norma cuando se ubiquen en ambientes donde los recuentos de partículas excedan ISO Clase 8
(ver Tabla 7) para partículas iguales o mayores de 0,5 µm. Cuando se usen aisladores para la preparación magistral estéril, el
tiempo de recuperación para alcanzar la calidad de aire ISO Clase 5 (ver Tabla 7) se debe documentar y se deben desarrollar
los procedimientos internos para garantizar que deje transcurrir el tiempo de recuperación adecuado después de transferir los
materiales, antes y durante las operaciones de preparación magistral.
Si el CIP es un CAi o un CACI que no cumple con los requisitos arriba mencionados o es una CFL o una CSB que no se
puede ubicar dentro de una zona amortiguadora ISO Clase 7 (ver Tabla 7), entonces sólo se pueden preparar PME no peligro-
sas y radiofarmacéuticas de nivel de riesgo bajo, según las órdenes de un médico, para un paciente específico, y la administra-
ción de tales PME debe comenzar dentro de las 12 horas de la preparación o según lo recomendado en el prospecto del em-
paque del fabricante, cualquiera que sea menor.

Pruebas de Muestreo Ambiental (MA) de Partículas Viables y No Viables

El programa de muestreo ambiental debe proporcionar información al personal y a los directivos para demostrar que el CIP
mantiene un ambiente dentro del área de preparación magistral, que garantiza en forma constante niveles de partículas via-
bles y no viables aceptablemente bajas. El área de preparación magistral incluye los CIP ISO Clase 5 (ver Tabla 7) (CFL, CSB,
CAi y CACI), las zonas amortiguadoras, las antesalas y las áreas segregadas de preparación magistral.
El muestreo ambiental se debe tomar como parte de un programa integral de gestión de la calidad y se llevará a cabo, como
mínimo, bajo cualquiera de las siguientes condiciones:
• como parte de la puesta en servicio y certificación de nuevas instalaciones y equipo;
• después de cualquier reparación de las instalaciones y equipos;
•como parte de la recertificación de las instalaciones y equipos (es decir, cada 6 meses);
• en respuesta a problemas identificados en los productos terminados o técnicas del personal; o
• en respuesta a problemas con las PME, prácticas de trabajo observadas del personal de preparación magistral o infeccio-
nes relacionadas con el paciente (donde la PME se considera una fuente potencial de la infección).

PROGRAMA DE PRUEBAS PARA PARTÍCULAS AMBIENTALES NO VIABLES

Un programa de muestras de partículas aéreas no viables difiere del de partículas viables en que está planeado para que
mida directamente el desempeño de los controles de ingeniería usados para crear los diversos niveles de limpieza de aire, por
ejemplo, ISO Clase 5, 7, u 8 (ver Tabla 7).
Verificación del Desempeño de los Controles de Ingeniería-Los CIP (CFL, CSB, CAi y CACI) y los controles de ingeniería
secundarios (zonas amortiguadoras y antesalas) son componentes esenciales de la estrategia de control general de contamina-
ción para la preparación magistral aséptica. Por lo tanto, es fundamental que funcionen tal como están diseñados y que los
niveles de contaminación resultantes estén dentro de límites aceptables. Los procedimientos de certificación, como aquellos
señalados en Certification Cuide for Sterile Compounding Facilities (CAG-003-2006)7 deben ser efectuados por una persona califi-
cada, por lo menos cada 6 meses y siempre que el dispositivo o cuarto se reubique o altere o se haga una reparación mayor en
las instalaciones.
Recuento Total de Partículas-La certificación que cada área con clasificación ISO, por ejemplo, ISO Clase 5, 7 y 8 (ver
Tabla 7) está dentro de las normas establecidas, se debe realizar al menos cada 6 meses y siempre que la CFL, la CSB, el CAi o
el CACI se reubiquen o la estructura física de la zona amortiguadora o de la antesala se alteren. Las pruebas deben ser efectua-
das por operadores calificados, usando equipo electrónico de última tecnología con los siguientes resultados:
• ISO Clase 5: no más de 3520 partículas iguales o mayores de 0,5 µm por metro cúbico de aire para cualquier CFL, CSB,
CAi y CACI;
• ISO Clase 7: no más de 352 000 partículas iguales o mayores de 0,5 µm por metro cúbico de aire para cualquier zona
amortiguadora;

6 Los procedimientos de muestreo se detallan en CETA Applications Guide CAG-002-2006, sección 2.09.
7 Controlled Environment Testing Association, 1500 Sunday Drive, Ste. 102, Raleigh, NC 27607; www.CETAinternational.org.
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• ISO Clase 8: no más de 3 520 000 partículas iguales o mayores de 0,5 µm por metro cúbico de aire para cualquier antesa-
la.
El personal de supervisión u otros empleados designados deben mantener y revisar todos los registros de certificación para
garantizar que los ambientes controlados cumplan con la limpieza de aire, las presiones del cuarto y CAPH apropiados.

MONITOREO DE LA PRESIÓN DIFERENCIAL

Se debe instalar un manómetro o velocímetro para supervisar el diferencial de presión o flujo de aire entre la zona amorti-
guadora y la antesala y entre la antesala y el ambiente general fuera de la zona de preparación magistral. Los resultados debe-
rán revisarse y documentarse en un cuaderno de bitácora por lo menos en cada cambio de turno (la frecuencia mínima debe
ser diariamente) o mediante un dispositivo de grabación continua. La presión entre el área ISO Clase 7 (ver Tabla 7) y el área
general de farmacia no debe ser menor que 5 Pa (0,02 pulgadas de columna de agua). En instalaciones donde se preparan
PME de nivel de riesgo bajo y mediano, el flujo de aire diferencial debe mantener una velocidad mínima de 0,2 metros por
segundo (40 pies por minuto) entre la zona amortiguadora y la antesala.

PROGRAMA DE PRUEBAS PARA PARTÍCULAS AÉREAS AMBIENTALES VIABLES

El riesgo de contaminar una PME preparada en condiciones de nivel de riesgo bajo y mediano depende en gran medida de
la higiene de las manos y de las prácticas de vestuario apropiadas, de la técnica aséptica del personal de preparación magistral
y de la presencia de contaminación superficial, asumiendo que todo el trabajo se desempeña en un CIP ISO Clase 5 (ver Tabla
7) y controles de ingeniería secundarios, zona amortiguadora ISO Clase 7 (ver Tabla 7) y antesala ISO Clase 8 (ver Tabla 7),
certificados y que funcionen de manera adecuada. Las PME de nivel de riesgo alto presentan el mayor peligro para los pacien-
tes porque el personal de preparación magistral se enfrenta a la tarea de procesar los componentes y dispositivos no estériles
con el fin de conseguir la esterilidad.
Un programa de muestreo junto con una auditoría de observación están diseñados para evaluar la competencia de las prác-
ticas de trabajo del personal de preparación magistral, permitiendo la implementación de las acciones correctivas de manera
continua (ver Capacitación del Personal y Evaluación de la Competencia en Vestimenta, Prácticas Asépticas de Trabajo y Procedi-
mientos de Limpieza y Desinfección).
Plan de Muestreo-Se debe desarrollar un plan de muestreo ambiental apropiado para las partículas aéreas viables, basado
en la evaluación de riesgo de las actividades de preparación magistral efectuadas.
Los sitios de muestreo seleccionados deben incluir lugares dentro de cada ambiente ISO Clase 5 (ver Tabla 7) y en las zonas
ISO Clase 7 y 8 (ver Tabla 7), así como en las zonas segregadas de preparación magistral con más alto riesgo de contamina-
ción (p.ej., zonas de trabajo cerca del ambiente ISO Clase 5 [ver Tabla 7], mostradores cercanos a las puertas, cabinas de trans-
ferencia de materiales (pass-through boxes)). El plan debe incluir: ubicación de la muestra, método de recolección, frecuencia
de muestreo, volumen de aire muestreado y hora del día, en lo que respecta a la actividad de la zona de preparación magistral
y los niveles de acción.
La revisión de los datos generados durante un muestreo puede detectar cantidades elevadas de biocarga microbiana aérea;
dichos cambios pueden ser indicio de cambios adversos en el ambiente. Se recomienda que el personal de preparación magis-
tral se remita a Control Microbiológico y Monitoreo de Ambientes de Procesamiento Aséptico (1116) y a las "Guidelines for Environ-
mental lnfection Control in Healthcare Facilities, 2003", de los CDC (Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades)
para más información.
Medio de Crecimiento-Para facilitar el crecimiento bacteriano se debe utilizar un medio de crecimiento microbiológico
general, como el Medio de Digerido de Caseína y Soja. En los ambientes de preparación magistral con nivel de riesgo alto se
debe usar un agar con extracto de malta u otro medio que facilite el crecimiento de hongos. Los medios usados para el mues-
treo de superficies deben complementarse con aditivos para neutralizar los efectos de los agentes desinfectantes (p.ej., TSA
con lecitina y polisorbato 80).
Muestreo de Partículas Aéreas Viables-La evaluación de microorganismos aéreos usando métodos volumétricos de reco-
lección en los ambientes de aire controlado (CFL, CAi, cuarto limpio o zonas amortiguadoras y antesalas) debe efectuarla per-
sonal capacitado para todos los niveles de riesgo de las preparaciones magistrales.
El método de impacto debe ser el método preferido de muestreo volumétrico de aire. El uso de placas de sedimentación
para muestreo cualitativo de aire puede no ser capaz de determinar adecuadamente la calidad del aire en el ambiente contro-
lado. La sedimentación de partículas por gravedad en placas de cultivo depende del tamaño de la partícula y puede estar in-
fluenciada por el movimiento del aire. Por consiguiente, la cantidad de unidades formadoras de colonias (ufc) en una placa de
sedimentación puede no siempre estar relacionada con las concentraciones de las partículas viables en el ambiente muestrea-
do.
Para preparaciones magistrales de nivel de riesgo bajo, mediano y alto, el muestreo de aire se debe efectuar en lugares pro-
pensos a la contaminación, durante las actividades de preparación magistral y otras actividades como clasificación de compo-
nentes, etiquetado, vestimenta y limpieza. Los lugares de muestreo deben incluir zonas de turbulencia de reflujo de aire dentro
de la CFL y otras áreas donde la turbulencia de reflujo de aire puede ingresar a la zona de preparación magistral (puertas de
entrada, dentro y alrededor del CIP y ambientes ISO Clase 5 [ver Tabla 7]). Debe considerarse el efecto general que el método
de muestreo escogido tendrá sobre el flujo de aire unidireccional dentro de un ambiente de preparación magistral.
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Para PME de nivel de riesgo bajo con FLU de 12 horas o menos, preparada en un CIP (CFL, CSB, CAi) que mantiene una ISO
Clase 5 (ver Tabla 7), el muestreo del aire se debe efectuar en lugares dentro del ambiente ISO Clase 5 y otras áreas (ver Tabla
7) que estén muy cerca del ambiente ISO Clase 5 (ver Tabla 7) durante la certificación del CIP.
Dispositivos de Muestreo de Aire-Existe una gran cantidad de fabricantes de equipos electrónicos para muestreo de aire.
Es importante que el personal consulte los procedimientos recomendados por el fabricante al usar un equipo para efectuar el
muestreo volumétrico de aire. Se deben seguir las instrucciones en el manual del usuario provisto por el fabricante en lo que
respecta a la verificación y uso de muestreadores eléctricos de aire que recolectan activamente volúmenes de aire para análisis.
Se debe evaluar un volumen suficiente de aire (400 a 1000 litros) en cada lugar seleccionado, con el fin de maximizar la sensi-
bilidad. Los dispositivos volumétricos para muestreo de aire tienen que calibrarse y repararse según lo recomendado por el
fabricante.
Se recomienda que el personal de preparación magistral se remita también a Metodología e Instrumenta/ para Cuantificación
de Microorganismos Viables Transportados por el Aire en Control Microbiológico y Monitoreo de Ambientes de Procesamiento Asépti-
co (1116), que proporciona más información sobre el uso de muestreadores volumétricos de aire y el volumen de aire que se
debe recolectar para detectar variaciones de la biocarga ambiental.
Proceso y Frecuencia de Muestreo del Aire-Como parte de la recertificación de instalaciones y equipos, el muestreo del
aire se debe efectuar al menos dos veces al año (es decir, cada 6 meses). Si la preparación magistral se realiza en múltiples
ubicaciones dentro de una institución (p.ej., farmacia principal, satélites), se requiere el muestreo ambiental para cada área de
preparación individual. Se debe tomar un volumen suficiente de aire y seguir las normas del fabricante para el uso de equipo
electrónico para muestreo de aire. Cualquier actividad de construcción o de reparación de equipos dentro de una instalación
puede requerir que se tomen muestras de aire durante esas actividades.
Período de Incubación-Al final del período de muestreo o exposición indicado para la toma de muestras de aire se recu-
peran las placas de medio de crecimiento microbiano, se aseguran sus tapas (p.ej., con cinta) y luego se invierten e incuban a
una temperatura y por un tiempo que conduzca a la multiplicación de microorganismos. El TSA se debe incubar a una tempe-
ratura de 30º a 35º durante un período de 48 a 72 horas. El agar con extracto de malta u otro medio apto para hongos se
debe incubar entre 26º y 30º durante 5 a 7 días. Se debe contar e informar la cantidad de colonias discretas de microorganis-
mos como unidades formadoras de colonias (ufc) en un formulario de muestreo ambiental. Los recuentos de las muestras de
aire se deben transformar en ufc por metro cúbico de aire y evaluar las tendencias adversas.
Niveles de Acción, Documentación y Evaluación de Datos-El muestreo microbiano viable del aire en el ambiente de
preparación magistral adquiere valor cuando los datos se usan para identificar y corregir una situación inaceptable. Los datos
de muestreo se deben recolectar y revisar en forma periódica como una manera de evaluar el control general del ambiente de
preparación magistral. Si una actividad muestra sistemáticamente niveles elevados de crecimiento microbiano, se debe consul-
tar al personal competente de microbiología.
Cualquier recuento de ufc que exceda su respectivo nivel de acción (ver Tabla 2) debe dar lugar a una reevaluación de la
aptitud de las prácticas de trabajo del personal, los procedimientos de limpieza, los procedimientos operativos y la eficacia de
la filtración de aire dentro de las instalaciones de preparación magistral aséptica. Se debe investigar la fuente de la contamina-
ción. Las posibles fuentes incluyen los sistemas de HVAC, filtros HEPA dañados y cambios en la vestimenta o prácticas de traba-
jo del personal. Se debe eliminar la fuente del problema, limpiar el área afectada y tomar nuevas muestras.
Los recuentos de ufc se usan como una medida aproximada de la biocarga microbiana ambiental. Los niveles de acción se
determinan de acuerdo con los datos de ufc recolectados en cada sitio de muestreo y se establece la tendencia en el tiempo.
Las cifras en la Tabla 2 deben usarse sólo como guía. Sin importar la cantidad de ufc identificadas en la farmacia, las acciones
correctivas futuras se tomarán de acuerdo con la identificación de los microorganismos recuperados (al menos el género) he-
cha por un laboratorio acreditado sobre cualquier biocarga microbiana capturada como una ufc, usando un muestreador de
aire por impacto. Los microorganismos altamente patógenos (p.ej., bacilos gramnegativos, estafilococos coagulasa positivo,
hongos filamentosos y levaduras) pueden ser potencialmente letales para los pacientes que reciben PME y deben ser elimina-
dos de inmediato, independientemente del recuento de ufc, con la ayuda de un microbiólogo competente, un profesional de
control de infecciones o un higienista industrial.
Tabla 2. Niveles de Acción Recomendados para Contaminación Microbiana*
t(ufc por metro cúbico [1000 litros] de aire por placa)
Clasificación Muestra de Airet
ISO Clase 5 > 1
ISO Clase 7 >10
ISO Clase 8 o menor calidad > 100
* Guidance far lndustry-Sterile Drug Products Produced by Aseptic Processing-Current Good Manufacturing Practice-US HHS, FDA, septiembre de 2004.

Requisitos Adicionales para el Personal

Los alimentos, bebidas y materiales expuestos en áreas de cuidado y tratamiento de pacientes no deben introducirse en an-
tesalas, zonas amortiguadoras o áreas segregadas para preparación magistral en las que haya componentes e ingredientes de
PME. Cuando las actividades de preparación magistral requieran la manipulación de materiales derivados de la sangre del pa-
ciente u otros materiales biológicos (p.ej., marcado radioactivo de leucocitos de un paciente o donante), las manipulaciones
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deben hacerse claramente aparte de los procedimientos de rutina para manejo de material y equipo usado en las actividades
de preparación de PME y deben controlarse por medio de POE específicos con el fin de evitar contaminaciones cruzadas. Los
suministros y componentes empacados para preparación magistral, como agujas, jeringas, sets de tubos y soluciones parente-
rales de pequeño y gran volumen deben sacarse de las cajas y frotarse con un desinfectante que no deje residuo (p.ej., IPA
estéril al 70%) de ser posible en una antesala de calidad de aire ISO Clase 8 (ver Tabla 7), antes de pasarlos a las zonas amorti-
guadoras. La higiene de manos y los procedimientos de vestimenta del personal se efectúan también en la antesala, la cual
puede contener un lavabo que se pueda accionar sin usar las manos y un sistema cerrado dispensador de jabón para minimizar
el riesgo de contaminación extrínseca. Deberá existir algún tipo de demarcación que separe la antesala de la zona amortigua-
dora. Después de entrar a la zona amortiguadora deben tomarse las medidas adecuadas para efectuar la limpieza antiséptica
de manos usando un exfoliante quirúrgico a base de alcohol con actividad persistente, seguido del uso de guantes estériles.

Limpieza y Desinfección del Área de Preparación Magistral

El contacto ambiental es una fuente importante de contaminación microbiana de las PME. Por consiguiente, se requiere
atención escrupulosa en la limpieza y desinfección de las áreas de preparación magistral estéril para minimizar dicha fuente de
contaminación de las PME.
Las prácticas de limpieza y desinfección, así como las frecuencias mencionadas en esta sección aplican a las zonas de prepa-
ración magistral ISO Clase 5 (ver Tabla 7) para exposición de sitios críticos, así como a las zonas amortiguadoras, antesalas y
zonas segregadas de preparación magistral. El personal de preparación magistral es responsable de garantizar que la frecuen-
cia de limpieza esté de acuerdo con los requisitos estipulados en la Tabla 3 y determinar los productos para limpieza y desin-
fección que se van a usar (ver Apéndice 11). El personal de preparación magistral debe tener en cuenta toda política organizacio-
nal o institucional relacionada con la selección de desinfectantes. Todas las prácticas y políticas de limpieza y desinfección para
la preparación de PME se deben incluir por escrito en los POE y las debe seguir todo el personal de preparación magistral.
Tabla 3. Frecuencia Mínima de Limpieza y Desinfección de las Zonas de Preparación Magistral
Lugar Frecuencia Mínima
Control de Ingeniería Primario ISO Clase 5 (ver Tabla 1) Al comenzar cada turno, antes de cada lote, a más tardar 30 minutos después de la de-
(p.ej., CFL, CSB, CAi, CACI) sinfección previa de la superficie cuando se están llevando a cabo actividades de prepa-
ración magistral, después de derramamientos y cuando se sepa o sospeche que la su-
perficie está contaminada
Mostradores y superficies de trabajo fácilmente limpiables Diariamente
Pisos Diariamente
Paredes Mensualmente
Cielos rasos Mensualmente
Estantes de almacenamiento Mensualmente

La selección y uso de desinfectantes en instituciones de salud está dictada por varias propiedades, tales como actividad mi-
crobicida, inactivación por materia orgánica, residuos y vida útil (ver Apéndice 11). En general, los desinfectantes altamente tóxi-
cos, como el glutaraldehído no se usan sobre las superficies del ambiente (p.ej., pisos, mostradores). Muchos desinfectantes
registrados por la EPA son de un solo paso. Esto significa que el desinfectante está formulado para ser eficaz en presencia de
suciedad leve a moderada, sin un paso previo de limpieza.
Las superficies en CFL, CSB, CAi y CACI, a las que están expuestos los sitios críticos, requieren desinfección más frecuente
que las superficies del ambiente como paredes y cielos rasos. La desinfección de zonas de preparación magistral estéril debe
hacerse de manera periódica con los intervalos mencionados en la Tabla 3 cuando ocurren derramamientos, cuando las super-
ficies están visiblemente sucias y cuando se sabe o se sospecha que se ha introducido contaminación microbiana en las zonas
de preparación magistral.
Cuando la superficie que se va a desinfectar está muy sucia, se recomienda una limpieza antes de la aplicación del desinfec-
tante. El personal de preparación magistral capacitado es responsable de desarrollar, implementar y poner en práctica los pro-
cedimientos de limpieza y desinfección del área directa de preparación magistral (ADP) escritos en los POE. La limpieza y de-
sinfección deben hacerse antes de la preparación magistral. Para hacer la limpieza, se deben quitar todos los artículos y limpiar
las superficies, retirando el material suelto y los residuos de derramamientos; por ejemplo, los residuos sólidos solubles en agua
se quitan con agua estéril (para inyección o irrigación) y paños que no desprendan partículas. Luego se pasa un paño con un
agente desinfectante que no deje residuos, como IPA al 70%, el cual se deja secar antes de comenzar la preparación magistral.
Las prácticas más críticas antes de la preparación de las PME son la limpieza y desinfección de las superficies en CFL, CSB,
CAi y CACI. Por consiguiente, dichas superficies se deben limpiar y desinfectar con frecuencia: al comenzar cada turno de tra-
bajo, antes de la preparación de cada lote, cada 30 minutos durante los períodos continuos de preparación de PME individua-
les, cuando haya derramamientos y cuando se sepa o sospeche que la superficie está contaminada debido a fallas procedimen-
tales.
Las superficies de trabajo en las zonas amortiguadoras ISO Clase 7 (ver Tabla 7) y las antesalas ISO Clase 8 (ver Tabla 7), así
como las zonas segregadas de preparación magistral se deben limpiar y desinfectar por lo menos diariamente, y el polvo y los
detritos se deben retirar cuando sea necesario de los sitios de almacenamiento de ingredientes y suministros de preparación
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magistral, usando un método que no degrade la calidad de aire ISO Clase 7 u 8 (ver Tabla 1) (ver Desinfectantes y Antisépticos
(1072)).
Los pisos en la zona amortiguadora o limpia, antesala y zona de preparación magistral segregada se friegan con un agente
limpiador y desinfectante una vez al día, a una hora en que no se esté realizando ninguna operación aséptica. La limpieza del
suelo debe ser realizada por personal capacitado, usando los agentes y procedimientos aprobados que se describen en los POE
escritos. El personal de preparación magistral tiene la responsabilidad de garantizar que dicha limpieza se haga apropiadamen-
te. En la zona amortiguadora o limpia, antesala y zona segregada de preparación magistral, se deben limpiar y desinfectar
mensualmente las paredes, cielos rasos y estanterías. Sólo deben utilizarse agentes de limpieza y desinfección aprobados te-
niendo en cuenta su compatibilidad, eficacia y la generación de residuos inapropiados o tóxicos (ver Apéndice 11). Sus crono-
gramas de uso y métodos de aplicación deben concordar con los POE escritos y el personal de apoyo y el de preparación ma-
gistral deben cumplirlos.
Todos los materiales de limpieza, como paños, esponjas y trapeadores, no deben desprender partículas, y deben estar com-
puestos preferentemente por microfibras sintéticas y destinados al uso en las zonas amortiguadoras o limpias, antesalas y áreas
segregadas de preparación magistral, de las cuales no deben retirarse a menos que sea para desecharlos. Pueden usarse tra-
peadores, tanto en la zona amortiguadora o cuarto limpio como en la antesala, pero únicamente en ese orden. Lo ideal sería
que todas los enseres de limpieza se descartaran después de un uso, recolectándolos en bolsas plásticas apropiadas y retirándo-
los del lugar con la mínima agitación. Si los materiales de limpieza (p.ej., trapeadores) se reutilizan, se deben desarrollar proce-
dimientos (basándose en las recomendaciones de los fabricantes) que garanticen que la eficacia del dispositivo de limpieza se
mantiene y el uso repetido no incrementa la biocarga del área que se está limpiando.
Los suministros y equipos retirados de su embalaje original se deben limpiar con un agente desinfectante apropiado (p.ej.,
IPA estéril al 70%), empleando un frasco rociador u otro método de aplicación adecuado. Después de rociar o limpiar con el
desinfectante la superficie a desinfectar, ésta se debe dejar secar y durante este tiempo el artículo no se debe usar para la pre-
paración magistral.
Para desinfectar puntos de entrada de bolsas y viales, es preferible limpiar con hisopos pequeños estériles impregnados en
IPA al 70%, los cuales se consiguen comercialmente en envases laminados sellados individuales (o un método comparable),
dejando secar el IPA antes de perforar los tapones con agujas estériles y de romper los cuellos de las ampollas. La superficie de
los hisopos estériles con IPA al 70% usados para desinfectar puntos de entrada de envases y dispositivos estériles no debe en-
trar en contacto con ningún otro objeto antes de tocar la superficie del punto de entrada. No se deben utilizar compresas de
gasa empapadas en IPA estéril al 70% ni otros materiales que desprendan partículas para desinfectar los puntos de entrada
estériles de envases y dispositivos.
Cuando se reciben suministros estériles en bolsas selladas destinadas a conservarlos estériles hasta el momento de abrirlos,
los suministros estériles se pueden retirar de las bolsas que los recubren cuando se introducen en el CIP (CFL, CSB, CAi, CACI)
ISO Clase 5 (ver Tabla 1) sin que sea necesario desinfectar los artículos individuales del suministro estéril. No se pueden llevar
cajas de embalaje ni otros envases externos a la zona amortiguadora o limpia ni al área segregada de preparación magistral.

Limpieza y Vestimenta del Personal

La cuidadosa limpieza de manos y brazos y el uso correcto del adecuado equipo protector para el personal (EPP) por parte
del personal de preparación magistral constituye el primer paso más importante en la prevención de contaminación microbia-
na de las PME. Además, el personal debe ser completamente competente y estar muy motivado para realizar manipulaciones
asépticas impecables con ingredientes, dispositivos y componentes de las PME. Del cuerpo humano normalmente se despren-
den células escamosas a una velocidad de 10 6 o más por hora y esas partículas de la piel están cargadas de microorganismos.s, 9
Cuando los individuos tienen prurito, quemaduras de sol, úlceras exudantes, conjuntivitis, infección respiratoria activa o usan
cosméticos, estas partículas se desprenden incluso a mayor velocidad, Las partículas desprendidas por el personal de prepara-
ción magistral representan un incremento en el riesgo de contaminación microbiana de los sitios críticos de PME. Por lo tanto,
el personal de preparación magistral que presenta alguna de las afecciones antes mencionadas debe ser excluido del trabajo
en zonas de preparación magistral ISO Clase 5 (ver Tabla 1) e ISO Clase 7 (ver Tabla 1), hasta que dichas afecciones desaparez-
can.
Antes de ingresar en una zona amortiguadora o en una zona segregada de preparación magistral (ver PME de Nivel de Riesgo
Bajo con FLU de 12 Horas o Menos), el personal de preparación magistral debe quitarse las prendas personales exteriores (p,ej.,
bandanas, abrigos, sombreros, chaquetas, bufandas, suéteres, chalecos), todos los cosméticos, porque desprenden escamas y
partículas, y todas las joyas de las manos y muñecas, así como otras joyas y accesorios visibles (p.ej., aretes, pendientes para
labios o cejas (pirsins)) que puedan interferir con la eficacia del EPP (p.ej., ajuste de guantes y puños de mangas). El uso de
uñas postizas o prolongaciones está prohibido mientras se trabaja en el ambiente estéril de preparación magistral. Las uñas
naturales se deben mantener limpias y recortadas.
El personal debe usar el siguiente EPP en un orden que vaya de las actividades consideradas más sucias hasta las más limpias.
Las actividades de vestimenta consideradas más sucias incluyen el calzado de zapatos destinados a la preparación magistral o
cubrecalzado, gorras y mascarillas que cubran el vello facial (p.ej., cubiertas para la barba, además de máscaras), máscaras pro-

8 Agalloco ], Akers JE. Aseptic Processing: A Vision of the Future. Pharmaceutical Technology, 2005. Aseptic Processing supplement, sl 6.
9 Eaton T. Microbial Risk Assessment for Aseptically Prepared Products. Am Pharm Rev. 2005; 8 (5, Sep/Oct): 46-51.
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tectoras para la cara y ojos. Los protectores para los ojos son opcionales, a menos que se trabaje con irritantes como agentes
germicidas desinfectantes o se elaboren preparaciones con fármacos peligrosos.
Después de ponerse el calzado especial o cubrecalzado, gorras y mascarillas que cubran el vello facial, y máscaras, se debe
realizar un procedimiento de limpieza de manos para retirar los detritos debajo de las uñas con un limpiador de uñas, bajo
agua tibia corriente, seguido de una limpieza meticulosa de las manos. Las manos y los antebrazos se deben lavar hasta los
codos con agua y jabón (bien sea antimicrobiano o no), durante 30 segundos al menos, mientras se está en la antesala. No se
recomienda el uso de cepillos antimicrobianos porque causan irritación y lesiones cutáneas. Se secan las manos y los antebra-
zos completamente hasta los codos, bien sea con toallas desechables sin pelusas o con un secador de manos electrónico. Des-
pués de completar el lavado de manos, se viste una bata con mangas que no desprenda partículas, que ajuste de manera có-
moda alrededor de las muñecas y cierre en el cuello. Se deben usar batas destinadas para la zona amortiguadora, que sean de
preferencia desechables. Si se visten batas reutilizables, se deben lavar apropiadamente para uso en la zona amortiguadora.
Una vez dentro de la zona amortiguadora o del área segregada de preparación magistral (ver PME de Nivel de Riesgo Bajo con
FLU de 72 Horas o Menos) y antes de calzar guantes estériles sin talco, se debe efectuar una limpieza antiséptica de manos con
un exfoliante quirúrgico para manos exento de agua, a base de alcohol y con actividad persistente 10, siguiendo las recomenda-
ciones del fabricante. Las manos se deben dejar secar completamente antes de calzar los guantes estériles.
Los guantes estériles deben ser el último artículo puesto antes de comenzar la preparación magistral. Los guantes se conta-
minan cuando entran en contacto con superficies no estériles durante las actividades de preparación magistral. La desinfección
de las manos enguantadas se debe hacer frotando o untando IPA estéril al 70% en todas las superficies de contacto de los
guantes y dejando secar completamente las manos enguantadas. Usar sólo guantes cuya compatibilidad con la desinfección
con alcohol haya sido probada por el fabricante. Durante todo el procedimiento de preparación magistral se debe aplicar IPA
estéril al 70% en forma rutinaria, al igual que siempre que se toquen superficies no estériles (p.ej., viales, mostradores, sillas,
carros). Los guantes se deben inspeccionar rutinariamente, durante el uso, en busca de orificios, pinchazos o rasgones, reem-
plazándolos de inmediato si éstos se detectan. La limpieza antiséptica de manos se debe efectuar como se indicó anteriormen-
te. Se debe capacitar y evaluar al personal de preparación magistral sobre cómo evitar el contacto con los sitios críticos.
Cuando el personal de preparación magistral sale del área de preparación durante un turno de trabajo, se debe quitar la
bata exterior, conservándola en el área de preparación magistral si no está visiblemente sucia, para volvérsela a poner durante
ese mismo turno únicamente. Sin embargo, los cubrecalzado, las mascarillas que cubran el vello facial y gorras, máscaras pro-
tectoras para la cara y ojos, así como los guantes se deben reemplazar por otros nuevos antes de volver a entrar al área de
preparación magistral y se debe efectuar de nuevo la higiene de las manos.
Durante las actividades de preparación magistral de alto riesgo que preceden a la esterilización terminal, como son el pesa-
do y mezclado de ingredientes no estériles, el personal de preparación magistral debe estar vestido y enguantado igual que si
estuviera realizando una preparación magistral en un ambiente ISO Clase 5 (ver Tabla 7). El personal de preparación magistral
adecuadamente vestido y enguantado que se exponga a un aire cuya calidad se sepa o sospeche inferior a ISO Clase 7 (ver
Tabla 7) debe cambiar EPP, además de lavarse las manos apropiadamente, efectuando limpieza antiséptica de la manos con un
exfoliante quirúrgico a base de alcohol, sin agua, y calzar guantes estériles al volver a ingresar a la zona amortiguadora ISO
Clase 7 (ver Tabla 7). Cuando las fuentes del ambiente ISO Clase 5 (ver Tabla 7) son CAi o CACI, los requisitos de vestimenta y
guantes para el personal de preparación magistral deben ser iguales a los descritos anteriormente, a menos que el fabricante
del aislador pueda proporcionar documentación por escrito, basada en pruebas ambientales validadas, de que no se requiere
algún componente del EPP o de la limpieza del personal.

Capacitación del Personal y Evaluación de la Competencia en Vestimenta, Prácticas Asépticas de

Trabajo y Procedimientos de Limpieza y Desinfección

El personal encargado de la preparación de las PME deberá recibir capacitación competente y a conciencia por parte de per-
sonal experto, con ayuda de instrucción multimedia y publicaciones profesionales, sobre los principios teóricos y los conoci-
mientos prácticos de los procedimientos de vestimenta, prácticas asépticas de trabajo, así como en la forma de conseguir y
mantener condiciones ambientales ISO Clase 5 (ver Tabla 7) y procedimientos de limpieza y desinfección. Esta capacitación se
debe completar y documentar antes de que cualquier miembro del personal comience la elaboración de PME. El personal de
preparación magistral debe completar la capacitación didáctica, aprobar las evaluaciones escritas de competencia, someterse a
evaluaciones de destreza usando herramientas de auditoría de observación y pruebas de llenado de medios (ver Apéndices///-
\!).
Las pruebas de las destrezas para el trabajo aséptico mediante el llenado de medios se efectúan inicialmente antes de co-
menzar a preparar PME y luego anualmente, al menos, para preparaciones magistrales de nivel de riesgo bajo y mediano y
semestralmente para preparaciones magistrales de nivel de riesgo alto.
El personal de preparación magistral que no pase las pruebas escritas o las auditorías de observación o cuyos viales de prue-
ba de llenado de medios tengan una o más unidades que muestren contaminación microbiana visible deberá recibir de inme-
diato una nueva capacitación y someterse a una nueva evaluación a cargo de personal experto en preparación magistral, para
asegurarse de que hayan corregido todas sus deficiencias en materia de práctica aséptica. El personal de preparación magistral

10 Guideline far Hand Hygiene in Hea/th care Settings, MMWR, el 25 de octubre de 2002, vol. 51, Nº RR-16 disponible en Internet en http://www.cdc.gov/handhy-
giene/.
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debe aprobar todas las evaluaciones antes de reiniciar la práctica de preparación magistral estéril. Además de la evaluación
didáctica y llenado aséptico de medios, el personal de preparación magistral debe demostrar competencia en la higiene apro-
piada de las manos, vestimenta y procedimientos de limpieza.
En caso de que el personal de apoyo (p.ej., personal de limpieza/mantenimiento y servicios ambientales institucionales) efec-
túe también procedimientos de limpieza y desinfección, un experto calificado en preparación magistral aséptica debe capaci-
tarlos en la higiene de las manos, vestimenta y procedimientos de limpieza y desinfección. Después de terminar la capacita-
ción, el personal de apoyo debe someterse rutinariamente a una evaluación de desempeño en la higiene apropiada de las ma-
nos, vestimenta y todos los procedimientos de limpieza y desinfección, que llevará a cabo un experto calificado en preparación
magistral aséptica.

EVALUACIÓN DE COMPETENCIA EN VESTIMENTA Y PRÁCTICAS ASÉPTICAS DE TRABAJO

El riesgo de contaminar una PME preparada en condiciones de nivel de riesgo bajo y mediano depende en gran medida de
la higiene de las manos y de las prácticas de vestuario apropiadas; de la técnica aséptica del personal de preparación magistral
y de la presencia de contaminación superficial, asumiendo que todo el trabajo se realiza en un CIP ISO Clase 5 (ver Tabla 1) y
controles de ingeniería secundarios, zona amortiguadora ISO Clase 7 (ver Tabla 1) y antesala ISO Clase 8 (ver Tabla 7), certifi-
cados y que funcionen de manera adecuada. Las PME de nivel de riesgo alto presentan el mayor peligro para los pacientes
porque el personal de preparación magistral se enfrenta a la tarea de procesar los componentes y dispositivos no estériles con
el fin de conseguir la esterilidad. El personal de preparación magistral debe ser evaluado inicialmente antes de comenzar la
elaboración de PME y siempre que se efectúe un llenado de medios aséptico, usando un formulario como el Formulario de
Muestra para Evaluación de la Higiene de las Manos y Prácticas Relacionadas con la Vestimenta del Personal de Preparación Magis-
tral (ver Apéndice 111) y el procedimiento de muestreo de las puntas de los dedos enguantados del personal, según se indica a
continuación.
Evaluación de la Práctica Aséptica de Trabajo por Medio del Muestreo de las Puntas de los Dedos Enguantados del
Personal-El muestreo de las puntas de los dedos enguantados del personal de preparación magistral se debe realizar en la
elaboración de PME de todos los niveles de riesgo, dado que la contaminación por contacto directo es la fuente más probable
de introducción de microorganismos en las PME preparadas por seres humanos. El muestreo de las puntas de los dedos en-
guantados se debe usar para evaluar la competencia del personal en los procedimientos de higiene de las manos y vestimenta,
así como para educar al personal de preparación magistral en las prácticas de trabajo apropiadas, las cuales incluyen desinfec-
ción frecuente y repetida de guantes, usando IPA estéril al 70% durante la preparación de las PME. Todo el personal debe
demostrar competencia en los procedimientos adecuados de higiene de las manos y vestimenta, así como en las prácticas
asépticas de trabajo (p.ej., desinfección de las superficies de los componentes, desinfección rutinaria de manos enguantadas,
etc.).
Se deben usar placas estériles de contacto con agar para tomar las muestras de las puntas de los dedos enguantados del
personal de preparación magistral después de vestirse, con el fin de evaluar la competencia en el uso de vestimenta, y después
de completar la preparación de llenado de medios (sin aplicar IPA estéril al 70%) con el fin de evaluar si las prácticas asépticas
de trabajo son adecuadas, antes de que se les permita comenzar a elaborar PME para uso humano y para que el personal más
experimentado mantenga su calificación en el proceso mencionado.
Evaluación de Competencia en Uso de Vestimenta y Guantes-El personal de preparación magistral debe ser inspeccio-
nado visualmente durante los procedimientos de higiene de las manos y uso de vestimenta (ver Limpieza y Vestimenta del Per-
sonal en Capacitación y Evaluación del Personal en Técnicas de Manipulación Aséptica, arriba). La inspección visual debe docu-
mentarse en un formulario como el Formulario de Muestra para Evaluación de Ja Higiene de las Manos y Prácticas Relacionadas
con la Vestimenta del Personal de Preparación Magistral (ver Apéndice 111) y mantenerse para tener un registro permanente y eva-
luación a largo plazo de la competencia del personal.
Muestreo de las Puntas de los Dedos Enguantados-Todo el personal de preparación magistral debe completar exitosa-
mente una evaluación inicial de competencia y un procedimiento de muestreo de las puntas de los dedos enguantados (cero
ufc) no menos de tres veces antes de que se le permita comenzar a elaborar PME para uso humano. Inmediatamente después
de que el empleado de preparación magistral complete la higiene de las manos y el procedimiento de vestimenta (p.ej., calza-
do de guantes estériles antes de cualquier desinfección con IPA estéril al 70%), el evaluador recolectará una muestra de las
puntas de los dedos y pulgares enguantados de ambas manos del empleado en placas de agar apropiadas, presionando ligera-
mente el agar con cada dedo. Las placas se incubarán durante un período de incubación apropiado a la temperatura adecuada
(ver Período de Incubación). Después de completar la evaluación inicial de competencia en el uso de vestimenta y guantes, una
vez al año, como mínimo, se debe hacer una reevaluación de la competencia de todo el personal de preparación magistral que
elabore PME de nivel de riesgo bajo y mediano, y semestralmente al personal que elabore PME de nivel de riesgo alto, usando
una o más muestras recolectadas durante cualquier procedimiento de prueba de llenado de medios, antes de que se les permi-
ta continuar elaborando PME para uso humano.
No se deben desinfectar los guantes con IPA estéril al 70% inmediatamente antes de la toma de muestras. La desinfección
de los guantes inmediatamente antes de la toma de muestras proporcionará resultados falsos negativos. Cuando se tomen
muestras de las puntas de los dedos del personal se usarán placas que contengan agar nutritivo con agentes neutralizantes
como lecitina y polisorbato 80. El personal debe "tocar" el agar con las puntas de los dedos de ambas manos en placas separa-
das, de manera que se cree una ligera impresión en el agar. Después de la toma de muestras, los guantes se deben desechar
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de inmediato y efectuar la higiene apropiada de las manos. Las placas con agar nutritivo se deben incubar como se estipula a
continuación (ver Período de Incubación). Los resultados se deben informar por separado como la cantidad de ufc por emplea-
do por mano (mano izquierda, mano derecha). El nivel de acción de ufc para las manos enguantadas estará basado en la canti-
dad total de ufc en ambos guantes, no por cada mano.
Período de Incubación-Al final del período de muestreo indicado para las actividades de evaluación de la competencia
del personal de preparación magistral (superficie o personal), se recuperan las placas de agar, se aseguran sus tapas y luego se
invierten e incuban a una temperatura y por un tiempo que conduzca a la multiplicación de microorganismos. El TSA con leci-
tina y polisorbato 80 se debe incubar a una temperatura de 30º a 35º durante un período de 48 a 72 horas.
Evaluación de la Competencia en Manipulación Aséptica-Después de completar exitosamente una Evaluación de Com-
petencia en Higiene de las Manos y Vestimenta, todo el personal de preparación magistral debe someterse una evaluación de
su competencia en la técnica aséptica y prácticas relacionadas, inicialmente durante el Procedimiento de Prueba de Llenado de
Medios y en los subsiguientes Procedimientos de Prueba de Llenado de Medios, anual o semestralmente. Los registros de estas
evaluaciones se mantendrán usando un formulario como el Formulario de Muestra para Evaluación de Técnicas Asépticas y Prácti-
cas Relacionadas del Personal de Preparación Magistral (ver Apéndice IV) y se conservarán para tener un registro permanente de
la evaluación a largo plazo de la competencia del personal.
Procedimiento de Prueba de Llenado de Medios-La destreza del personal para preparar PME asépticamente se debe evaluar
usando la verificación de llenado de medios de cultivos bacterianos líquidos y estériles (es decir, transferencia de un medio de
cultivo bacteriano estéril por medio de una jeringa y aguja estériles). La prueba de llenado de medios se utiliza para evaluar la
práctica aséptica del personal de preparación magistral. Las pruebas de llenado de medios deben representar las condiciones
más exigentes o difíciles con las que el personal puede encontrarse durante la elaboración de PME de nivel de riesgo bajo y
mediano y durante la esterilización de PME de nivel de riesgo alto. Las pruebas de desafío de llenado de medios se usan tam-
bién para verificar la aptitud del ambiente de preparación magistral y de los procesos para producir una preparación estéril.
Por lo general, se usa un medio líquido de cultivo estéril disponible comercialmente, como el Medio de Digerido de Caseína
y Soja (ver Pruebas de Esterilidad (71 )), que sea capaz de promover la colonización exponencial de las bacterias que el personal
de preparación magistral y el entorno suelen transmitir a las PME. Para PME de nivel de riesgo alto se puede usar un Medio de
Digerido de Caseína y Soja no estéril, disponible comercialmente, para preparar una solución al 3%. Se deben imitar los pasos
de procesamiento normales, incluyendo la esterilización por filtración. Los viales llenados con medios deben incubarse a una
temperatura de 20º a 25º o de 30º a 35º durante 14 días como mínimo. Si se usan dos temperaturas para la incubación de
muestras de llenado de medios, entonces tales envases llenos deberán incubarse durante al menos 7 días a cada temperatura
(ver Control Microbiológico y Monitoreo de Ambientes de Procesamiento Aséptico (1116)). Si cualquiera de las unidades llenas de
medio desarrolla una turbidez visible dentro de los 14 días, significa que no se ha pasado la prueba. Se pueden considerar
otros métodos recomendados por un microbiólogo competente para mejorar el tiempo de recuperación y la sensibilidad para
detectar contaminación microbiana (ver ejemplos de procedimientos de llenado de medios en Niveles de Riesgo de Contamina-
ción Microbiana en las PME).

MUESTREO Y EVALUACIÓN DE LIMPIEZA Y DESINFECCIÓN DE SUPERFICIES

La toma de muestras de superficies es un componente importante del mantenimiento de un ambiente microbiológicamente

controlado para elaboración de PME, especialmente si se considera que la transferencia de contaminación microbiana a partir
del contacto inadvertido por parte del personal de preparación magistral con superficies desinfectadas inadecuadamente, pue-
de ser una fuente potencial de contaminación para las PME. Además, se considera útil para evaluar los procedimientos de lim-
pieza y desinfección de las instalaciones y superficies de trabajo, así como la competencia de los empleados en las prácticas de
trabajo como la desinfección de superificies de componentes/viales. En todas las áreas ISO se deben tomar muestras de las
superficies en forma periódica. Los muestreos se pueden hacer usando placas de contacto o hisopos y se deben realizar al ter-
minar la preparación magistral. Se deben definir los lugares en donde se van a tomar muestras en un plan o formulario de
muestreo. El tamaño de la placa que se va a usar para cada lugar muestreado tiene, por lo general, entre 24 y 30 cm 2 • Las
placas de contacto se llenan con medio agar sólido de crecimiento general y agentes neutralizantes por encima del borde de la
placa y se usan para tomar muestras de superficies parejas o planas. Se pueden usar hisopos para tomar muestras de superfi-
cies irregulares, especialmente para equipos (ver Control Microbiológico y Monitoreo de Ambientes de Procesamiento Aséptico
(1116)).
Evaluación de Competencia en Limpieza y Desinfección-Se debe inspeccionar visualmente al personal de preparación
magistral y demás personal responsable de la limpieza durante la realización de los procedimientos de limpieza y desinfección,
durante la capacitación inicial del personal en los procedimientos de limpieza, durante los cambios de personal de limpieza y
después de la terminación de cualquier procedimiento de prueba de llenado de medios (ver Limpieza y Desinfección del Área de
Preparación Magistra0.
La inspección visual debe documentarse en un formulario como el Formulario de Muestra para Evaluación de Procedimientos
de Limpieza y Desinfección (ver Apéndice V) y conservarse para tener un registro permanente y la evaluación a largo plazo de la
competencia del personal.
Métodos de Recolección en la Superficie-Para tomar muestras usando una placa de contacto, se debe tocar suavemente
el área de muestreo con la superficie del agar y deslizar la placa sobre la superficie a muestrear. La placa de contacto dejará un
758 (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles/ Pruebas Físicas USP 40

residuo de medio de crecimiento; por lo tanto, inmediatamente después de tomar la muestra con la placa de contacto, el área
muestreada se debe limpiar cuidadosamente con un paño que no desprenda partículas, empapado en IPA estéril al 70%.
Si se toma una muestra con el método del hisopo, la recolección de la muestra se hace con los procedimientos apropiados
que determinen un área superficial equivalente a la de la placa de contacto. Después de pasar los hisopos por la superficie
muestreada, los hisopos se colocan en un diluyente apropiado y una alícuota se siembra en el agar nutritivo especificado. Los
resultados se deben informar como ufc por unidad de área superficial.

Niveles de Acción, Documentación y Evaluación de Datos

El monitoreo microbiano viable de las puntas de los dedos enguantados y de las superficies de los componentes, así como
del ambiente de preparación magistral adquieren valor cuando los datos se usan para identificar y corregir una práctica de
trabajo inaceptable. Los datos de muestreo se deben recolectar y revisar en forma periódica como una manera de evaluar el
control general del ambiente de preparación magistral. Si una actividad muestra sistemáticamente niveles elevados de creci-
miento microbiano, se debe consultar al personal competente de microbiología.
Cualquier recuento de ufc que exceda su respectivo nivel de acción (ver Tabla 4) debe dar lugar a una reevaluación de la
aptitud de las prácticas de trabajo del personal, los procedimientos de limpieza, los procedimientos operativos y la eficacia de
la filtración de aire dentro de las instalaciones de preparación magistral aséptica. Se debe investigar la fuente de la contamina-
ción. Las posibles fuentes de contaminación incluyen los sistemas de HVAC, filtros HEPA dañados y cambios en la vestimenta o
prácticas de trabajo del personal. Se debe eliminar la fuente del problema, limpiar el área afectada y tomar nuevas muestras.
Cuando los resultados de la muestra de las puntas de los dedos enguantados exceden los niveles de acción después de la
incubación apropiada, se debe efectuar y documentar una revisión de los procedimientos de higiene de las manos y de vesti-
menta, así como de los procedimientos de desinfección de guantes y superficies y prácticas de trabajo. Puede ser necesario
capacitar al empleado para corregir la fuente del problema.
Los recuentos de ufc se usan como una medida aproximada de la biocarga microbiana ambiental. Los niveles de acción se
determinan de acuerdo con los datos de ufc recolectados en cada sitio de muestreo y se establece la tendencia en el tiempo.
Las cifras en la Tabla 4 deben usarse sólo como guía. Sin importar la cantidad de ufc identificadas en la instalación de prepara-
ción magistral, las acciones correctivas futuras se tomarán de acuerdo con la identificación de los microorganismos recupera-
dos (al menos el género), hecha por un laboratorio acreditado sobre cualquier biocarga microbiana capturada como una ufc,
usando un muestreador de aire por impacto. Los microorganismos altamente patógenos (p.ej., bacilos gramnegativos, estafilo-
cocos coagulasa positivo, hongos filamentosos y levaduras) pueden ser potencialmente letales para los pacientes que reciben
PME y deben ser eliminados de inmediato, independientemente del recuento de ufc, con la ayuda de un microbiólogo compe-
tente, un profesional de control de infecciones o un higienista industrial.
Tabla 4. Niveles de Acción Recomendados para Contaminación Microbiana*
Muestra de las Puntas Muestra de Superficie (Placa de Contacto)
Clasificación de los Dedos (ufc por placa)
ISO Clase 5 >3 >3
ISO Clase 7 N/D >5
ISO Clase 8 o menor calidad N/D > 100
* Pharmaceutical lnspection Co-operation Scheme (PIC/S) Guide to Good Manufacturing Practice for Medicinal Products Annexes PE 009-6, 5 de abril de 2007.

PROCEDIMIENTOS OPERATIVOS ESTÁNDARES (POE) SUGERIDOS

La instalación de preparación magistral debe tener POE escritos y debidamente aprobados, diseñados para asegurar la cali-
dad del entorno en el que se elabora la PME. Se recomienda adoptar los siguientes procedimientos:
1. Restringir el acceso a la zona amortiguadora a personal calificado con responsabilidades específicas o tareas asignadas en
el área de preparación magistral.
2. Descontaminar en el área todos los materiales empacados, retirándolos de sus cajas y limpiándolos o rociándolos con un
agente desinfectante que no deje residuos, mientras se los transfiere a un carro limpio y adecuadamente desinfectado o a
otro medio de transporte para su introducción en la zona amortiguadora. Se seguirán las instrucciones del fabricante o los
datos publicados para el tiempo mínimo de contacto. No es necesario limpiar los materiales que vienen en bolsas indivi-
duales estériles, ya que las bolsas pueden retirarse a medida que se introducen los materiales en la zona amortiguadora.
3. Los suministros requeridos con frecuencia o que deben tenerse a mano pero que no son necesarios para las operaciones
programadas en un determinado turno deben descontaminarse y almacenarse en los estantes de la antesala.
4. Los carros usados para llevar materiales desde la sala de almacenamiento no pueden desplazarse más allá de la línea de
demarcación de la antesala y aquellos usados en la zona amortiguadora no pueden llevarse más allá de la línea de demar-
cación a menos que se limpien y desinfecten antes de volverlos a introducir.
5. Por lo general, los materiales requeridos para las operaciones programadas en cada turno deben limpiarse con un agente
desinfectante apropiado y llevarse a la zona amortiguadora, preferiblemente en uno o más carros móviles. Los materiales
de reserva o de uso general para las operaciones pueden almacenarse en el estante designado en la zona amortiguadora,
pero debe evitarse la acumulación excesiva de materiales.
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6. Los objetos no esenciales que desprendan partículas no pueden llevarse a la zona amortiguadora, incluyendo lápices, cajas
de cartón, toallas de papel y artículos de algodón (p.ej., compresas de gasa).
7. Los productos esenciales a base de papel (p.ej., envolturas de papel de las jeringas, registros de trabajo guardados en una
funda protectora), se deben limpiar con un agente desinfectante apropiado antes de llevarlos a la zona amortiguadora.
8. Debe reducirse al mínimo el flujo de tráfico hacia y desde la zona amortiguadora.
9. El personal que se prepara para entrar a la zona amortiguadora debe retirarse todas las prendas personales externas, cos-
méticos (porque desprenden escamas y partículas) y todas las joyas de manos y muñecas, así como otras joyas y acceso-
rios visibles que puedan interferir con la eficacia del EPP.
1O. El personal que entra en la antesala debe vestir la ropa descrita en Limpieza y Vestimenta del Personal y Capacitación del
Personal y Evaluación de la Competencia en Vestimenta, Prácticas Asépticas de Trabajo y Procedimientos de Limpieza y Desin-
fección.
11. El personal deberá luego lavarse cuidadosamente las manos y los antebrazos hasta el codo con agua y jabón, por lo me-
nos durante 30 segundos. Después de lavarse, se debe usar un secador de aire o toallas desechables que no desprendan
partículas para secarse las manos y los antebrazos.
12. El personal que entra en la zona amortiguadora debe efectuar la limpieza antiséptica de manos con un exfoliante quirúrgi-
co exento de agua, a base de alcohol y con actividad persistente, antes de calzarse guantes estériles.
13. No se puede ingresar con goma de mascar, bebidas, golosinas ni ningún tipo de alimentos a la zona amortiguadora ni a
la antesala. Los materiales expuestos en áreas de cuidado y tratamiento de pacientes nunca deben introducirse en áreas
en las que hayan presentes componentes e ingredientes para la elaboración de PME.
14. Al comienzo de cada sesión de preparación magistral, y siempre que se derrame un líquido, las superficies del ambiente
directo de preparación magistral deben limpiarse primero con Agua Purificada USP para eliminar los residuos hidrosolu-
bles. Inmediatamente después, se desinfectan las mismas superficies con un agente que no deje residuos, usando un paño
que no suelte pelusa.
15. Los controles de ingeniería primarios deben estar en funcionamiento continuo durante la actividad de preparación magis-
tral. Cuando el sistema ventilador está apagado, y antes de que ingrese otro personal para realizar actividades de prepara-
ción magistral, sólo una persona debe ingresar en la zona amortiguadora a los efectos de encender el ventilador (durante
al menos 30 minutos) y desinfectar las superficies de trabajo.
16. El tráfico en el área directa de preparación magistral (ADP) debe reducirse al mínimo y controlarse.
17. Se deben juntar los materiales a usar en el ADP para los procedimientos planificados y luego descontaminarse limpiando o
rociando la superficie externa de los mismos con solución de IPA al 70% o retirando el envoltorio externo en el límite del
ADP a medida que se introduce el artículo en el área aséptica de trabajo.
18. Los materiales deben disponerse en el ADP de manera tal que se evite su acumulación y que se logre el flujo de trabajo
más eficiente y ordenado posible.
19. Después de introducir en forma correcta en el ADP únicamente los materiales requeridos para las operaciones asignadas,
deben organizarse de manera tal que un flujo ininterrumpido transparente de aire filtrado por HEPA bañe todos los sitios
críticos en todo momento durante los procedimientos planificados. Es decir, no se debe colocar ningún objeto entre el
primer aire de los filtros HEPA y un sitio crítico expuesto.
20. Todos los procedimientos deben realizarse de manera tal de reducir al mínimo el riesgo de contaminación por contacto.
Los guantes deben desinfectarse con la frecuencia necesaria con un desinfectante aprobado, como IPA estéril al 70%.
21. Todos los tapones de goma de los viales y frascos y el cuello de las ampollas se desinfectan pasándoles un paño con IPA
estéril al 70% durante al menos 1O segundos antes de usarlos para preparar PME.
22. Después de la preparación de cada PME, el contenido del envase se debe mezclar bien y luego inspeccionar para asegu-
rarse de que no tenga partículas, signos de incompatibilidad u otros defectos.
23. Una vez finalizados los procedimientos, se retiran las jeringas, frascos, viales y otros materiales utilizados, pero con un mí-
nimo de salidas y entradas al ADP para reducir al mínimo las probabilidades de introducir contaminación en el espacio
aséptico de trabajo.

ELEMENTOS DE CONTROL DE CALIDAD

En cada centro debe desarrollarse una descripción por escrito del programa de capacitación específica y de evaluación del
desempeño para todo el personal que utiliza técnicas asépticas en la preparación de productos estériles. Este programa debe
preparar al personal otorgándole los conocimientos apropiados y la instrucción necesarias en el desarrollo de las habilidades
requeridas para realizar las tareas asignadas. Cada una de las personas asignadas al área aséptica para la preparación de pro-
ductos estériles debe completar con éxito un curso de capacitación especializado en técnicas asépticas y prácticas del área
aséptica antes de poder elaborar PME (ver la sección Capacitación y Evaluación del Personal en Técnicas de Manipulación Aséptica
y Capacitación del Personal y Evaluación de la Competencia en Vestimenta, Prácticas Asépticas de Trabajo y Procedimientos de Lim-
pieza y Desinfección).
760 (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles/ Pruebas Físicas USP 40

Ingredientes y Dispositivos
El personal de preparación magistral debe establecer que los ingredientes utilizados en la elaboración de las PME tengan la
identidad y calidad correctas, utilizando la siguiente información: etiquetas del proveedor, etiquetado del producto, certifica-
dos de análisis, análisis químico directo y conocimiento de las condiciones de almacenamiento de las instalaciones de prepara-
ción.

INGREDIENTES Y DISPOSITIVOS ESTÉRILES

Los productos farmacéuticos estériles disponibles comercialmente y los envases y dispositivos estériles listos para usar son
ejemplos de componentes estériles. Debe seguirse un procedimiento escrito para la inspección física de cada unidad antes de
su uso para asegurarse de que estos componentes sean estériles, estén libres de defectos y sean adecuados para el uso al que
están destinados.

INGREDIENTES Y DISPOSITIVOS NO ESTÉRILES

Si se usan componentes no estériles, incluyendo envases e ingredientes, para elaborar una PME, dicha PME debe ser de alto
riesgo. Los ingredientes activos y sustancias agregadas o excipientes no estériles utilizados en la elaboración de PME deben ser
preferentemente artículos que cumplan con las normas oficiales de la USP o NF. Cuando se utilizan ingredientes no oficiales,
deben estar acompañados por certificados de análisis de sus proveedores para que el personal de preparación magistral pueda
evaluar su identidad, calidad y pureza en relación con el uso que se les dará en cada PME. Es necesario realizar una inspección
física del envase de los ingredientes para asegurarse de que no tenga roturas, tapas o cierres flojos y que el contenido no tenga
ninguna desviación en relación con el aspecto, aroma y textura esperados.
Las sustancias farmacéuticas a granel, o no formuladas, y las sustancias agregadas o excipientes deben almacenarse en enva-
ses herméticamente cerrados bajo las condiciones de temperatura, humedad e iluminación indicadas en las monografías oficia-
les o aprobadas por los proveedores. La fecha de recepción en la instalación de preparación magistral debe estar clara e indele-
blemente marcada en cada envase del ingrediente. Una vez recibidos por la institución responsable de la preparación magis-
tral, los envases de ingredientes que no tienen una fecha de caducidad del proveedor no podrán utilizarse después de transcu-
rrido un año, a menos que una inspección o análisis apropiado indique que el ingrediente ha conservado su pureza y calidad
para su uso en la elaboración de PME.
Deberán considerarse y evaluarse cuidadosamente las fuentes de ingredientes no estériles, especialmente cuando la PME ha
de administrarse en el sistema vascular, en el sistema nervioso central o en los ojos.
La persona a cargo de la preparación magistral debe realizar una inspección visual de cada lote de fármaco o excipiente a
granel recibido que se utilizará en la elaboración de las PME para detectar cualquier deterioro, otras características de calidad
inaceptable o identificación errónea. La inspección visual de la sustancia farmacéutica o excipiente a granel debe realizarse pe-
riódicamente según se describe en el protocolo escrito correspondiente.

Equipos

Es necesario que los equipos, aparatos y dispositivos utilizados en la preparación magistral de una PME funcionen correcta-
mente en todo momento y dentro de los límites de tolerancia aceptables. Deben establecerse por escrito, y seguirse, los proce-
dimientos de calibración del equipo, mantenimiento anual, monitoreo de funcionamiento correcto, y procedimientos controla-
dos para el uso del equipo, así como las frecuencias específicas para todas estas actividades. En estos POE se deben describir el
mantenimiento de rutina y las frecuencias. Los resultados de la calibración de los equipos, informes de mantenimiento anual y
mantenimiento de rutina deben conservarse en los archivos durante toda la vida útil del equipo. Se prepara al personal me-
diante una combinación apropiada de capacitación específica y experiencia, para hacer funcionar o manipular cualquier equi-
po, aparato o dispositivo que pudieran tener que usar para la elaboración de PME. La capacitación debe incluir los conocimien-
tos necesarios para determinar si un equipo determinado está funcionando correctamente o si tiene algún desperfecto.

VERIFICACIÓN DE DISPOSITIVOS AUTOMATl~ADOS DE PREPARACIÓN MAGISTRAL (DAP)

PARA NUTRICION PARENTERAL

Los DAP para la preparación de mezclas para nutrición parenteral son ampliamente utilizados por los farmacéuticos en hos-
pitales y otros ámbitos de atención de la salud. Están diseñados para agilizar los procesos más engorrosos requeridos para la
preparación magistral de estas formulaciones de varios componentes, administrando automáticamente los componentes nutri-
cionales individuales en una secuencia predeterminada bajo control computarizado. Por lo general, las mezclas para nutrición
parenteral contienen 20 o más aditivos individuales que representan hasta 50 o más componentes individuales (p.ej., 15 a 20
aminoácidos cristalinos, dextrosa monohidrato y lípidos; 1O a 12 sales electrolíticas; 5 a 7 oligominerales y 12 vitaminas). En
consecuencia, los DAP pueden mejorar la exactitud y precisión del proceso de preparación magistral en comparación con los
métodos de preparación magistral manuales tradicionales.
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Exactitud

La exactitud de un DAP puede determinarse de varias maneras para asegurar que se suministren las cantidades correctas de
nutrientes, electrólitos u otros componentes nutricionales al envase de infusión final. Inicialmente, debe evaluarse el DAP para
verificar la exactitud del volumen y peso. Para verificar la exactitud del volumen, debe programarse el DAP para administrar un
volumen adecuado de Agua Estéril para Inyección USP, que represente un volumen típico de aditivo (p.ej., 40 mL para un
intervalo de volumen pequeño de 1 a 100 mL; o 300 mL para un intervalo de volumen grande de 100 a 1000 mL) y adminis-
trarse al recipiente volumétrico apropiado. Luego, el personal de preparación magistral debe consultar en la sección Aparatos
Volumétricos (31) los parámetros apropiados para evaluar el desempeño volumétrico del DAP. Para verificar la exactitud gravi-
métrica, debe evaluarse la balanza utilizada junto con el DAP, usando diferentes tamaños de pesas que representen las cantida-
des normalmente usadas para administrar los diferentes aditivos. El personal de preparación magistral debe consultar en la sec-
ción Balanzas (41) las tolerancias aceptables de las pesas usadas. Además, debe pesarse posteriormente el mismo volumen de
Agua Estéril para Inyección usado para evaluar la exactitud volumétrica en la balanza usada con el DAP. Por ejemplo, si se utili-
zaron 40 mL de agua en la evaluación volumétrica, su peso correspondiente debería ser de aproximadamente 40 g (suponien-
do que la densidad relativa del agua es de 1,0). Además, durante el uso del DAP, también pueden probarse ciertos aditivos,
como cloruro de potasio (corregido según las diferencias de densidad) como si fuera una prueba realizada durante el proceso.
Por último, pueden realizarse pruebas adicionales de exactitud para determinar el contenido de ciertos ingredientes en el
volumen final de la mezcla para nutrición parenteral. Por lo general, los departamentos de una farmacia no tienen la capacidad
para realizar en forma rutinaria análisis químicos, como análisis de concentraciones de dextrosa o electrólitos. En consecuencia,
es posible que los laboratorios de los hospitales o instituciones deban encargarse de realizar estas pruebas de garantía de cali-
dad. No obstante, los métodos utilizados por dichos laboratorios suelen estar diseñados para sistemas biológicos, no farmacéu-
ticos. En consecuencia, debe verificarse que sus procedimientos de prueba cumplan con los requisitos USP especificados en la
monografía individual correspondiente al componente que se desea analizar. Por ejemplo, en Dextrosa, Inyección, se especifica
lo siguiente: Contiene no menos de 95,0% y no más de 105,0% de la cantidad declarada de C6 H12 0 6 • H2 0. Los laboratorios
de química de la institución u hospital pertinente deben validar sus métodos para aplicarlos a este intervalo y corregirlos según
su medición típica de dextrosa anhidra en relación con dextrosa monohidrato. Existen intervalos y cuestiones similares, por
ejemplo, para las inyecciones de gluconato de calcio, sulfato de magnesio y cloruro de potasio. El punto crítico es el uso de
referencias USP y posibles diferencias de procedimiento entre laboratorios.

Precisión

La precisión intermedia del DAP puede determinarse teniendo en cuenta las variaciones diarias en los resultados de las medi-
ciones de exactitud. En consecuencia, el personal de preparación magistral debe llevar un registro diario de las evaluaciones de
exactitud antes descritas y revisar los resultados a lo largo del tiempo. Esta revisión debe realizarse al menos cada semana para
evitar errores acumulativos clínicamente significativos con el tiempo, especialmente en el caso de aditivos con un índice tera-
péutico estrecho, como el cloruro de potasio.

CONTROLES V PRUEBAS DE LIBERACIÓN DE LAS PREPARACIONES TERMINADAS

Las siguientes mediciones de calidad se deben efectuar para todas las PME antes de dispensarlas o administrarlas.

Inspección de Formas Farmacéuticas en Solución y Revisión de los Procedimientos de Preparación

Magistral

Todas las PME que se preparan como soluciones deben examinarse visualmente para asegurarse de que no contengan partí-
culas y, en caso afirmativo, no deben administrarse ni dispensarse. Antes de administrar o dispensar las PME de cualquier nivel
de riesgo de contaminación, se deben inspeccionar las recetas, los procedimientos escritos de preparación magistral, los regis-
tros de preparación y los materiales usados en su elaboración, para verificar las identidades y cantidades correctas de sus ingre-
dientes, el mezclado aséptico y esterilización, el envasado, etiquetado y aspecto físico esperado.

INSPECCIÓN FÍSICA

Después de su preparación magistral, las PME terminadas deben inspeccionarse en forma individual, según los procedimien-
tos por escrito. Si no se distribuyen de inmediato, estas PME deben inspeccionarse en forma individual justo antes del momen-
to en que abandonan el área de almacenamiento. Las PME que no se distribuyen de inmediato deben almacenarse en un lugar
apropiado según se describe en los procedimientos escritos. Inmediatamente después de su preparación magistral y como
condición para su liberación, se debe inspeccionar cada unidad de PME, siempre que sea posible, contra un fondo blanco o
negro iluminado, o ambos, para asegurarse de que no contenga partículas visibles ni otras materias extrañas. La inspección
previa a la liberación también incluye la inspección de la integridad del sistema de envase-cierre y cualquier otro defecto visual
evidente. Las PME que presenten defectos deben desecharse de inmediato o marcarse y aislarse de los productos aceptables de
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manera que evite su administración. Cuando las PME no se distribuyan de inmediato después de su preparación, debe realizar-
se una inspección previa a la distribución para asegurarse de que una PME con defectos como precipitado, turbidez y pérdidas,
que pueden desarrollarse entre el momento de su liberación y su distribución, no sea liberada.

Controles de Exactitud de la Preparación Magistral

Deben seguirse los procedimientos por escrito para verificar la exactitud de la preparación magistral de cada PME durante su
preparación e inmediatamente antes de su liberación. El sistema de doble verificación debe cumplir con las reglamentaciones
estatales e incluir la exactitud de la información incluida en la etiqueta y de la adición de todos los productos farmacéuticos o
ingredientes usados para preparar el producto terminado, así como sus volúmenes o cantidades. Los envases de los aditivos
usados y, en el caso de aditivos para los que no se consumió la totalidad del envase, las jeringas usadas para medir el aditivo
deben dejarse en cuarentena con los productos finales hasta haber terminado el control del producto final. El personal de pre-
paración magistral debe confirmar visualmente que los ingredientes medidos en las jeringas coincidan con los indicados en la
receta escrita que se está preparando. Preferentemente, una persona que no sea la que realizó la preparación magistral debe
verificar que se hayan medido correctamente los volúmenes de ingredientes utilizados en la elaboración de cada PME. Por
ejemplo, el personal de preparación magistral debería colocar de nuevo el émbolo de la jeringa en el volumen medido.
En aquellos casos en que sea factible, debe confirmarse la exactitud de las mediciones, pesando un volumen del líquido me-
dido y calculando luego ese volumen, dividiendo el peso por el valor exacto de la densidad, o peso específico, del líquido me-
dido. Debe confirmarse que los valores de densidad o peso específico programados en los DAP, que miden según el peso
usando el cociente del volumen programado dividido por la densidad o peso específico, sean exactos antes y después de ad-
ministrar los volúmenes de los líquidos asignados a cada canal o puerto. Estos controles de exactitud del volumen y los siguien-
tes controles adicionales de seguridad y exactitud que se describen en esta sección deben incluirse en el manual de POE de la
institución responsable de la elaboración de PME.

Pruebas de Esterilidad

Todas las PME de nivel de riesgo alto que se preparan en grupos de más de 25 envases individuales monodosis idénticos
(p.ej., ampollas, bolsas, jeringas, viales) o en viales multidosis (VMD) para administración a múltiples pacientes o que están
expuestos por más de 12 horas a temperaturas entre 2º y 8º y por más de 6 horas a temperaturas superiores a 8º antes de ser
esterilizados deben cumplir con la prueba de esterilidad (ver Prueba de Esterilidad (71 )) antes de ser dispensadas o administra-
das. El método de Filtración por Membrana es el método preferido en los casos en que sea factible (p.ej., cuando los compo-
nentes son compatibles con la membrana). Puede usarse un método no descrito en la USP si los resultados de la verificación
demuestran que la alternativa es al menos tan eficaz y confiable como el método de Filtración por Membrana USP o el método
de Inoculación Directa del Medio de Cultivo USP cuando el método de Filtración por Membrana no es factible.
Cuando las PME de nivel de riesgo alto se dispensan antes de que los resultados de sus pruebas de esterilidad estén disponi-
bles, debe haber un procedimiento escrito que exija la observación diaria de las muestras de prueba en incubación y el retiro
inmediato de la PME dispensada cuando exista evidencia de crecimiento microbiano en las muestras de prueba. Además, el
paciente al que se pudo haber administrado una PME contaminada, y su médico, deben ser notificados acerca del riesgo po-
tencial. Si los resultados de la prueba de esterilidad son positivos, debe realizarse una investigación inmediata y sistemática de
la técnica aséptica, control ambiental y otros controles de garantía de esterilidad para identificar las fuentes de contaminación
y solucionar los problemas existentes en los métodos o procesos.

Prueba de Endotoxinas Bacterianas (Pirógenos)

Todas las PME de nivel de riesgo alto, excepto las destinadas a inhalación o administración oftálmica, que se preparan en
grupos de más de 25 envases individuales monodosis idénticos (p.ej., ampollas, bolsas, jeringas, viales) o en viales multidosis
(VMD) para administración a múltiples pacientes o que están expuestos por más de 12 horas a temperaturas entre 2º y 8º y
por más de 6 horas a temperaturas superiores a 8º antes de ser esterilizados deben examinarse para garantizar que no contie-
nen endotoxinas bacterianas en exceso (ver Prueba de Endotoxinas Bacterianas (85) y Prueba de Pirógenos (151 )). En caso de
que no se indique un límite de endotoxinas bacterianas en la monografía oficial o en otra fuente de la formulación de la PME,
aquel no deberá exceder la cantidad de Unidades USP de Endotoxinas (Unidades por hora por kg de peso corporal o metros
cuadrado de superficie corporal) especificadas en Prueba de Endotoxinas Bacterianas (85), mencionada anteriormente, según la
vía de administración apropiada.

Verificación de la Identidad y Concentración de los Ingredientes

La institución responsable de la elaboración de preparaciones magistrales debe contar como mínimo con los siguientes pro-
cedimientos escritos para verificar la identidad y calidad de las PME antes de dispensarlas y administrarlas:
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1. Que las etiquetas de las PME tengan los nombres y cantidades o concentraciones de ingredientes correctos, el volumen
total, la FLU, las vías de administración apropiadas, las condiciones de almacenamiento y otra información para su uso
seguro.
2. Que las identidades, purezas y cantidades de ingredientes sean correctas, comparando la receta original con el registro de
preparación magistral escrito de la PME.
3. Que se han obtenido los volúmenes de llenado correctos en las PME y las cantidades correctas de unidades llenadas de las
PME. Cuando no se puede confirmar que el contenido de las PME terminadas es exacto, según las tres inspecciones que
se describen más arriba, las PME deben valorarse utilizando métodos específicos para los ingredientes activos.

Cambio en la r~acción:

ALMACENAMIENTO V FECHADO DE LÍMITE DE USO

Por lo general, las FLU para preparaciones magistrales se asignan basándose en la experiencia profesional, que debería incluir
la cuidadosa interpretación de las fuentes de información apropiadas para las mismas formulaciones u otras formulaciones si-
milares (ver Criterio de Estabilidad y Fechado de Límite de Uso en Preparación Magistral-Preparaciones No Estériles (795)). Las
fechas límite de uso de las PME rara vez se basan en los resultados de valoraciones químicas específicas a cada preparación, las
cuales se usan con la ecuación de Arrhenius para determinar las fechas de caducidad (ver Advertencias y Requisitos Generales)
de productos fabricados. La mayoría de las PME son soluciones acuosas en las que la reacción de degradación química más
común es la hidrólisis de los ingredientes disueltos. El grado de hidrólisis y otras reacciones de degradación catalizadas por
calor en cualquier momento en particular de la vida útil de una PME representan la suma termodinámica de las temperaturas y
duraciones de exposición. Dicha exposición de la estabilidad de la vida útil del producto está representada en el cálculo de la
temperatura cinética media (ver •cálculos en la Práctica farmacéutica {1160)• (AFoi.máy'291n)· Las velocidades de hidrólisis de los
fármacos aumentan en forma exponencial con el aumento aritmético de la temperatura; en consecuencia, la exposición de
una solución de un antibiótico beta-lactámico durante un día a temperatura ambiente controlada (ver Advertencias y Requisitos
Generales) tendrá un efecto equivalente sobre el grado de hidrólisis de aproximadamente 3 a 5 días a temperaturas frías (ver
Advertencias y Requisitos Generales).
El personal a cargo de preparar, dispensar y administrar las PME debe almacenarlas estrictamente conforme a las condicio-
nes especificadas en la etiqueta de los ingredientes y PME terminadas. Cuando se sabe que las PME han estado expuestas a
temperaturas superiores al límite declarado o a temperaturas por encima de 40º (ver Advertencias y Requisitos Generales) duran-
te más de 4 horas, dichas PME deberían desecharse a menos que se verifique su estabilidad a través de la documentación apro-
piada o una valoración directa.

Determinación de las Fechas Límite de Uso

Las fechas límite de uso y fecha de caducidad no son lo mismo (ver Advertencias y Requisitos Generales). Las fechas de caduci-
dad para la estabilidad química y física de los productos estériles fabricados comercialmente se determinan a partir de los resul-
tados de rigurosas pruebas analíticas y de desempeño y son específicas de una formulación en particular en su envase y a las
condiciones de exposición indicadas de iluminación y temperatura. Cuando las PME se desvían de las condiciones indicadas en
el etiquetado aprobado de los productos fabricados contenidos en las PME, el personal de preparación magistral puede solici-
tar al fabricante del producto en cuestión asesoramiento sobre la asignación de FLU basada en parámetros de estabilidad quí-
mica y física. Las FLU de las PME que se preparan estrictamente conforme al etiquetado del producto del fabricante deben ser
las especificadas en dicho etiquetado o deben basarse en la literatura apropiada o en pruebas directas. Las FLU para las PME
que carecen de justificación proveniente de fuentes de literatura apropiadas o de pruebas directas se deben asignar según se
describe en Criterios de Estabilidad y Fechas Límite de Uso en Preparación Magistral-Preparaciones No Estériles (795).
El personal de preparación magistral podrá también consultar las publicaciones pertinentes para obtener información acerca
de la estabilidad, compatibilidad y degradación del fármaco o de fármacos similares. Al asignar una fecha límite de uso, el per-
sonal de preparación magistral debería consultar la documentación y literatura específicas sobre la estabilidad en general y la
del fármaco en particular en aquellos casos en que se cuente con ellas, y debería considerar la naturaleza del fármaco y su
mecanismo de degradación, el envase en el que está contenido, las condiciones de almacenamiento esperadas y la duración
prevista de la terapia (ver Fecha de Caducidad y Fecha Límite de Uso en Etiquetado en las Advertencias y Requisitos Generales). La
información de estabilidad debe interpretarse cuidadosamente en relación con la formulación preparada y sus condiciones de
almacenamiento y uso. Las predicciones basadas en otra evidencia como publicaciones, cuadros, tablas sólo permiten obtener
fechas límite de uso teóricas. El fechado de límite de uso estimado en forma teórica está sujeto a diferentes grados de hipótesis
y, en consecuencia, a una probabilidad de error o al menos de inexactitud. El grado de error o inexactitud dependería del
grado de las diferencias entre las características de la PME (p.ej., composición, concentración de ingredientes, volumen de lle-
nado o tipo y material del envase) y las características de los productos de los que deben extrapolarse los datos o información
de estabilidad. Cuanto mayor sea la duda respecto de la exactitud de las fechas límite de uso estimadas en forma teórica, ma-
yor será la necesidad de determinar el fechado de períodos en forma experimental. Las fechas límite de uso estimadas en for-
ma teórica deberían considerarse con cuidado para las PME preparadas a partir de ingredientes activos a granel no estériles
que tienen actividad terapéutica, especialmente en aquellos casos en que se prevé que la preparación de la PME se realizará en
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forma rutinaria. Cuando las PME son para distribución y administración en domicilios particulares y no en centros de salud, al
asignar las FLU debe tenerse en cuenta el efecto de las condiciones de temperatura potencialmente no controladas y no vigila-
das. Debe establecerse que las PME no estén expuestas a temperaturas cálidas (ver Advertencias y Requisitos Generales) a menos
que la institución responsable de la preparación magistral tenga evidencia que justifique la estabilidad de las PME a esas tem-
peraturas.
Debe reconocerse que la única evidencia válida de estabilidad para predecir el fechado de límite de uso puede obtenerse
solamente a través de estudios experimentales específicos con cada producto. Los procedimientos semicuantitativos, como
una cromatografía en capa delgada (TLC), pueden ser aceptables para muchas PME. No obstante, los ensayos cuantitativos
indicadores de estabilidad, como las valoraciones por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), serían más apropiados
para ciertas PME, como por ejemplo aquellas con un índice terapéutico reducido, en las que se requiere un monitoreo ovalo-
ración estrictos de las dosis para asegurar su eficacia terapéutica y evitar la toxicidad; aquellas en que el período de fechado de
límite de uso estimado en forma teórica sólo es avalado por evidencia marginal, o en aquellos casos en que no se puede verifi-
car un margen significativo de seguridad para el período de fechado de límite de uso propuesto. En síntesis, debido a que los
períodos de fechado de límite de uso establecidos a partir de datos específicos de un producto obtenidos mediante análisis
con instrumental apropiado son sin duda más confiables que los determinados en forma teórica, se recomienda enfáticamente
utilizar el primer enfoque para avalar los períodos que superen los 30 días.
Para asegurar prácticas constantes en la determinación y asignación de fechas límite de uso, la instalación de preparación
magistral debe contar con normas y procedimientos escritos para la determinación de las fechas límite de uso para todos los
productos preparados magistralmente. Cuando se intente predecir una fecha límite de uso teórica, un producto preparado o
mezclado magistralmente debe considerarse como un sistema único que tiene propiedades físicas y químicas y características
de estabilidad que difieren de las de sus componentes. Por ejemplo, las propiedades antioxidantes, de amortiguación o antimi-
crobianas de un vial estéril para inyección (VEI) pueden perderse al diluirlo y podrían afectar seriamente la estabilidad química
del ingrediente activo del VEI o la estabilidad física o microbiológica de la formulación de dicho vial. En consecuencia, por lo
general no puede esperarse que las propiedades estabilizadas en la formulación del VEI se trasladen al producto preparado o
mezclado magistralmente. Se prefieren los protocolos de evaluación de datos de estabilidad determinados en forma experi-
mental para cada preparación, en lugar de la información sobre estabilidad publicada.
Cuando se carece de resultados de valoraciones químicas directas, el personal de preparación magistral que asigna fechas
límite de uso a PME debe interpretar y evaluar en forma crítica las fuentes de información disponibles más apropiadas para
determinar una FLU conservadora y segura. El manual de POE de la institución responsable de la preparación magistral y los
registros de formulación de cada PME deben describir los fundamentos generales sobre los que debe basarse la asignación de
la FLU y las condiciones de almacenamiento.
Cuando se usan viales multidosis (ver Envases Multidosis en Conservación, Envasado, Almacenamiento y Etiquetado en las Ad-
vertencias y Requisitos Generales) de ingredientes estériles fabricados comercialmente en la elaboración de PME, se inspecciona
la integridad física de los tapones de los VMD y se desinfectan frotándolos con un hisopo empapado en IPA estéril al 70%
antes de cada penetración con un dispositivo estéril para retirar el contenido. Cuando se sospechan u observan contaminantes
o propiedades anormales en un VMD, éste deberá descartarse. La FLU después de abrir o perforar (p.ej., con aguja) envases
multidosis es de 28 días (ver Pruebas de Eficacia Antimicrobiana (51 )), a menos que el fabricante especifique algo distinto.

Sistemas de Bolsas y Viales de Propiedad Exclusiva

Las fechas límites de uso para la estabilidad, esterilidad y almacenamiento de pares de envases de productos farmacéuticos
para administración intravascular (p.ej., ADD-Vantage®, Mini Bag Plus®) conectados y activados (activado significa que se pro-
dujo el contacto entre el diluyente y el fármaco que estaban separados previamente) se deben aplicar según lo indica el fabri-
cante. Es decir, se deben seguir las instrucciones del fabricante para manipular y almacenar los productos ADD-Vantage®, Mini
Bag Plus®, Add A Vial®, Add-Ease® y cualquier otro.

Monitoreo de Áreas de Almacenamiento Controladas

Para asegurarse de que el producto conserva su potencia hasta la fecha de caducidad indicada por el fabricante en la etique-
ta, el personal de preparación magistral debe monitorear las áreas de almacenamiento de fármacos dentro de las instalaciones
de preparación magistral. Las áreas de temperatura controlada en las instalaciones de preparación magistral incluyen tempera-
tura ambiente controlada, entre 20º y 25º con temperatura cinética media de 25º; temperatura fría controlada, entre 2º y 8º
con temperatura cinética media de 8º; temperatura fría, entre 2º y 8º; temperatura de congelación, entre -25º y -1 Oº (ver
Advertencias y Requisitos Generales) si se necesita alcanzar la congelación, y el intervalo de temperatura específico del medio
para medios de cultivo microbianos. Un área de temperatura controlada se debe monitorear al menos una vez al día, docu-
mentando los resultados en una bitácora de temperatura. Asimismo, el personal de preparación magistral debe observar la
temperatura de almacenamiento al colocar el producto en la unidad de almacenamiento o al retirarlo de ella a fin de controlar
cualquier desvío en la temperatura. Los dispositivos de registro de temperatura adecuados pueden incluir un dispositivo de
registro continuo calibrado o un termómetro calibrado según las normas del National lnstitute of Standards and Technology
(Instituto Nacional de Normas y Tecnología, NIST) que tenga una exactitud y sensibilidad satisfactorias para el propósito al
que está destinado y sea calibrado correctamente a intervalos adecuados. Si la instalación de preparación magistral usa un dis-
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positivo continuo de registro de la temperatura, el personal debe verificar al menos una vez al día que dicho dispositivo esté
funcionando correctamente.
Los mecanismos detectores de temperatura deben colocarse en forma adecuada en el área de almacenamiento de tempera-
tura controlada para que reflejen de forma exacta su temperatura real. Asimismo, la instalación de preparación magistral debe
seguir procedimientos apropiados para todas las áreas de almacenamiento controlado, para asegurar que dichos espacios no
estén sometidos a fluctuaciones de temperatura significativamente prolongadas como las que podrían ocurrir, por ejemplo, al
dejar la puerta de un refrigerador abierta demasiado tiempo.

MANTENIMIENTO DE LA ESTERILIDAD, PUREZA Y ESTABILIDAD DE LAS PME DISPENSADAS Y

DISTRIBUIDAS

Esta sección resume las responsabilidades de las instalaciones de preparación magistral para mantener la calidad y el control
de las PME que se dispensan y administran dentro de sus organizaciones matrices de salud.
El personal de preparación magistral debe garantizar el adecuado almacenamiento y la seguridad de las PME preparadas o
dispensadas por la instalación de preparación magistral hasta que se alcance su FLU o sean administradas a los pacientes. Co-
mo parte de esta responsabilidad general, la instalación de preparación magistral es responsable del envasado, manipulación,
transporte y almacenamiento correctos de las PME que prepara o dispensa, incluyendo la enseñanza, capacitación y supervi-
sión apropiadas del personal de preparación magistral asignado a dichas funciones. La instalación de preparación magistral de-
bería colaborar en la enseñanza y capacitación del personal ajeno a la preparación magistral responsable de llevar a cabo cual-
quier aspecto de estas funciones.
La instalación de preparación magistral también tiene la responsabilidad de establecer, mantener y asegurar el cumplimiento
de las políticas y procedimientos escritos relacionados con dichas responsabilidades. Cuando se asigna personal que no es de
preparación magistral a tareas que involucran cualquiera de estas responsabilidades, las políticas y procedimientos que abarcan
estas tareas deben ser desarrolladas por los supervisores de preparación magistral. Las actividades de calidad y control relacio-
nadas con la distribución de las PME se resumen en las cinco subsecciones siguientes. Las actividades o asuntos que debe aten-
der la instalación de preparación magistral como parte de dichas responsabilidades son los que se indican a continuación.

Envasado, Manipulación y Transporte

Los procesos o técnicas inapropiados relacionados con el envasado, manipulación y transporte pueden afectar adversamente
la calidad y la integridad del envase de las PME. Aunque el personal de preparación magistral realiza en forma rutinaria muchas
de las tareas asociadas con estas funciones, algunas de ellas, como el transporte, manipulación y almacenamiento, pueden rea-
lizarlas personal ajeno a la preparación magistral que no se encuentra bajo el control administrativo directo de la instalación de
preparación magistral. En estos casos, la instalación de preparación magistral deberá establecer POE apropiados, en colabora-
ción con los departamentos o servicios cuyo personal sea responsable de llevar a cabo las tareas relacionadas con las PME en
las que la instalación de preparación magistral tiene un interés directo. Se debe controlar el desempeño del personal ajeno a la
preparación magistral para asegurarse de que cumpla con las políticas y procedimientos establecidos.
Los requisitos fundamentales que son exclusivos de las PME y necesarios para asegurar la calidad de la PME y la integridad
del envase se deben tratar por escrito en POE. Por ejemplo, deberían especificarse técnicas para evitar el empuje de los émbo-
los de las jeringas o que las puntas de las jeringas se salgan durante su manipulación y transporte. Además, debe evitarse la
desconexión de los componentes de un sistema (p.ej., cuando las PME se dispensan con equipos de administración conecta-
dos a estas) hasta la FLU de la PME. Los insertos o rellenos de espuma resultan particularmente útiles cuando las PME deben
transportarse mediante sistemas de tubos neumáticos. Independientemente de los métodos usados, la instalación de prepara-
ción magistral debe evaluar la eficacia y la confiabilidad de la protección utilizada. La evaluación debería ser continua, por
ejemplo, mediante un sistema de vigilancia, incluyendo un sistema de reporte de problemas a la instalación de preparación
magistral.
El transporte y la manipulación inapropiados pueden afectar adversamente la calidad de ciertas PME que tienen requisitos de
estabilidad únicos. Por ejemplo, la agitación física que puede tener lugar durante el transporte mediante tubo neumático, o la
exposición indebida al calor o a la luz, debe tratarse en cada preparación de forma específica. Podrían ser necesarios modos de
transporte alternativos o medidas de embalaje adicionales para asegurar debidamente la calidad de estas PME. El uso de cierres
y sellos que evidencian alteración intencional en los puertos de las PME puede ser una medida adicional de seguridad para
asegurar la integridad del producto independientemente del método de transporte usado.
Las PME quimiotóxicas u otras PME peligrosas requieren salvaguardas para mantener su integridad y reducir al mínimo el
potencial de exposición de estos productos al entorno y al personal que podría entrar en contacto con ellos. El transporte por
tubo neumático no es recomendable debido a posibles roturas y contaminación. Los requisitos especiales asociados con el en-
vasado, transporte y manipulación de estos agentes incluyen la prevención de exposición o derrame accidentales y la capacita-
ción del personal en caso de una exposición o derrame. Otros ejemplos de requisitos especiales para estos agentes incluyen las
estrategias de reducción de la exposición, como el uso de jeringas con cierre Luer y conexiones, tapas para jeringas, tapas en
los puertos de los envases, bolsas plásticas selladas, envases resistentes a los impactos y etiquetas con las precauciones perti-
nentes.
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Uso y Almacenamiento
La instalación de preparación magistral es responsable de asegurar que las PME que se encuentran en el entorno en que se
prestan cuidados al paciente mantengan su calidad hasta el momento de su administración. El etiquetado inmediato del enva-
se de la PME debe mostrar en forma prominente y clara los requisitos para su almacenamiento correcto y su fecha de caduci-
dad. El personal de suministro y del entorno de cuidado del paciente debe estar debidamente capacitado para colocar la PME
en el lugar de almacenamiento apropiado. Las PME vencidas y no utilizadas deben devolverse a la instalación de preparación
magistral para su eliminación.
Debe contarse con POE para asegurar que las condiciones de almacenamiento en el entorno en que se prestan cuidados al
paciente sean adecuadas para los requisitos específicos de cada PME. Estos procedimientos incluyen la supervisión y documen-
tación diaria de los refrigeradores de almacenamiento de las preparaciones de fármacos para asegurarse de que mantienen una
temperatura entre 2º y 8º y la inspección mensual de todos los lugares de almacenamiento de preparaciones de fármacos por
el personal de preparación magistral. Las inspecciones deben confirmar el cumplimiento de las condiciones de almacenamien-
to apropiadas, la separación de fármacos y alimentos, el uso correcto de VMD y que no se usen productos monodosis como
VMD. Las PME, así como todos los demás productos farmacéuticos, deben almacenarse en el área en donde se prestan cuida-
dos al paciente de tal manera que el personal no autorizado, los visitantes y los pacientes no tengan acceso a ellos.

Preparación para Administración

Los procedimientos esenciales para asegurar la calidad general del producto, especialmente su esterilidad, al preparar una
PME para su posterior administración, incluyen el lavado apropiado de las manos, el uso de técnica aséptica, el cuidado del
sitio y el cambio de los equipos de administración. También pueden ser fundamentales otros procedimientos adicionales para
ciertas PME, dispositivos o técnicas, por ejemplo, en la filtración en línea, la operación de dispositivos de control de infusión
automáticos y la reposición de PME en los reservorios de bombas de infusión implantables o portátiles. Cuando es probable
que las PME se expongan a temperaturas superiores a 30º por más de 1 hora durante su administración a pacientes, se debe
confirmar que mantengan su esterilidad y estabilidad, bien sea por medio de fuentes confiables y relevantes o por pruebas
directas.

Redispensación de PM E

La instalación de preparación magistral debe tener toda la autoridad de determinar cuándo se pueden volver a dispensar las
PME devueltas, sin abrir. Las PME devueltas pueden volverse a dispensar sólo cuando el personal responsable de la preparación
magistral estéril pueda garantizar que dichas PME son estériles, puras y estables (contienen la concentración de ingredientes
declarada). Puede considerarse que una PME brinda dicha garantía si: la PME se mantuvo bajo refrigeración continua y prote-
gida de la luz, de ser necesario, y no presenta evidencia de alteración intencional ni de ninguna preparación para el uso fuera
de la instalación de preparación magistral. La asignación de nuevas fechas de almacenamiento y fechas límites de uso que ex-
cedan las fechas originales para las PME devueltas se permite tan sólo cuando existe evidencia de respaldo proveniente de
pruebas de esterilidad y valoración cuantitativa de los ingredientes. En consecuencia, la preparación inicial y los tiempos de
descongelación deben documentarse y realizarse mediciones confiables para evitar y detectar cualquier alteración intencional.
El cumplimiento con todos los procedimientos asociados con el mantenimiento de la calidad del producto es fundamental. Las
PME no deben volver a dispensarse si no puede asegurarse de manera satisfactoria que se mantuvieron en forma continua la
calidad de la preparación y la integridad del envase (incluyendo las conexiones de los dispositivos, cuando corresponda) entre
el momento en que la PME egresó de la instalación de preparación magistral y el momento en que volvió a ella. Asimismo, las
PME no deben volver a dispensarse si la redispensación no puede respaldarse con la FLU originalmente asignada.

Educación y Capacitación
La garantía de calidad de la PME y de la integridad del envasado depende en gran medida de que todo el personal cumpla
con los POE pertinentes. El personal de preparación magistral debe diseñar, implementar y mantener un programa formal de
enseñanza, capacitación y evaluación de competencia que cubra todas las funciones y tareas descritas en las secciones anterio-
res y que incluya a todo el personal al que se asignen dichas funciones y tareas. Este programa incluye la evaluación y docu-
mentación de incumplimientos del procedimiento, errores de administración, efectos colaterales, reacciones alérgicas y com-
plicaciones asociadas con la dosificación o administración, como la extravasación. Este programa debe coordinarse con los pro-
gramas de informe de eventos adversos e incidentes de la institución responsable.

Envase y Transporte de PME

Las siguientes secciones describen cómo mantener la esterilidad y estabilidad de las PME hasta que sean entregadas en los
sitios de atención del paciente para su administración.
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EMBALAJE DE PME PARA SU TRANSPORTE

Cuando las PME se distribuyen a lugares fuera de las instalaciones en las que se preparan, el personal de preparación magis-
tral debe seleccionar envases y materiales de embalaje que mantengan la integridad física, esterilidad y estabilidad de las PME
durante su transporte. Debe seleccionarse un embalaje que proteja las PME contra daños, pérdidas, contaminación y degrada-
ción y, al mismo tiempo, que proteja de posibles lesiones al personal a cargo de transportarlas. El manual de POE de la institu-
ción responsable de la preparación magistral describe específicamente los envases de embalaje y los materiales de aislamiento
y relleno apropiados, según las especificaciones del producto, la información de los proveedores y la experiencia del personal
de preparación magistral. Se proporcionan instrucciones escritas a los pacientes y otros destinatarios que explican claramente
cómo abrir en forma segura los envases de las PME embaladas.

TRANSPORTE DE PME

Las instituciones responsables de la preparación magistral que envían PME a otros lugares deben seleccionar modos de
transporte que permitan entregarlas debidamente embaladas sin que sufran daños, y en condiciones estériles y estables a sus
destinatarios.
El personal de preparación magistral debe verificar que las temperaturas de las PME durante el transporte por el medio selec-
cionado no excedan las temperaturas más altas especificadas en el intervalo de temperatura de almacenamiento indicado en
las etiquetas de las PME. Se recomienda que el personal de preparación magistral se comunique directamente con la empresa
de transporte para conocer la duración del transporte y las condiciones de exposición que pueden encontrar las PME.
El personal de preparación magistral debe incluir instrucciones de manipulación y exposición específicas en la parte externa
de los embalajes que contienen las PME que se deben transportar, y debe obtener una garantía razonable de cumplimiento de
dichas condiciones por parte de los transportistas. El personal de preparación magistral debe evaluar periódicamente el desem-
peño de las empresas de transporte para verificar que las PME se están transportando en forma eficiente y apropiada.

Almacenamiento en Sitios Fuera de las Instalaciones de Preparación Magistral

Las instituciones responsables de la preparación magistral que envían PME a pacientes y otros destinatarios que se encuen-
tran en otros lugares deben verificar o garantizar, según sea apropiado, lo siguiente:
1. Las etiquetas y etiquetado accesorio de las PME incluyen en forma claramente legible las FLU, instrucciones de almacena-
miento e instrucciones de eliminación para las unidades vencidas.
2. Los pacientes u otros destinatarios pueden almacenar las PME en forma correcta, incluyendo el uso de un refrigerador y
congelador que funcionen adecuadamente si el etiquetado indica que las PME necesitan dicho tipo de almacenamiento.

CAPACITACIÓN DEL PACIENTE O PERSONA ENCARGADA DE SU CUIDADO

Debe proporcionarse un programa de capacitación formal a fin de que el paciente o la persona encargada de su cuidado
pueda entender y cumplir con las numerosas responsabilidades especiales y complejas que tiene en cuanto al almacenamiento,
manipulación y administración de PME. Los objetivos instructivos del programa de capacitación incluyen todas las responsabili-
dades del cuidado domiciliario de la PME que se espera que asuma el paciente o la persona encargada del cuidado de éste y
deben especificarse en términos de competencias del paciente o de la persona encargada de su cuidado.
Al terminar el programa de capacitación, el paciente o la persona encargada de su cuidado debería estar en condiciones de
hacer lo siguiente, en forma correcta y consistente:
1. Describir la terapia en cuestión, incluyendo la enfermedad o trastorno para la que se receta la PME, los objetivos de la
terapia, el resultado terapéutico esperado y los efectos colaterales potenciales de la PME.
2. Inspeccionar todos los productos farmacéuticos, PME, dispositivos, equipos y materiales en el momento de recibirlos para
asegurarse de que se han mantenido las temperaturas correctas durante el transporte y que los artículos recibidos no pre-
sentan evidencia de deterioro o defectos.
3. Manipular, almacenar y controlar todos los productos farmacéuticos, PME y materiales y equipos relacionados en la casa,
incluyendo todos los requisitos especiales relacionados con ellos.
4. Inspeccionar visualmente todos los productos farmacéuticos, PME, dispositivos y otros elementos que el paciente o la per-
sona encargada de su cuidado debe utilizar inmediatamente antes de la administración, en una forma que garantice que
todos los elementos estén en condiciones de ser utilizados. Por ejemplo, las PME deben estar libres de pérdidas, grietas en
los envases, partículas, precipitado, turbidez, decoloración u otras desviaciones respecto de su aspecto normal esperado y
los envases inmediatos de los dispositivos estériles deben estar completamente sellados sin que haya evidencia de deterio-
ro de la integridad del envase.
5. Verificar las etiquetas inmediatamente antes de su administración para asegurar que se trate del medicamento, la dosis, el
paciente y el momento de administración correctos.
6. Limpiar el área de preparación en el domicilio, lavar y refregar las manos, usar la técnica aséptica apropiada y manipular
todos los envases, equipos, aparatos, dispositivos y materiales usados para la administración.
768 (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles/ Pruebas Físicas USP 40

7. Emplear todas las técnicas y precauciones asociadas con la administración de PME, por ejemplo, preparación de materia-
les y equipos, manipulación de dispositivos, preparación de las tuberías e interrupción de una infusión.
8. Cuidar los catéteres, cambiar vendajes y mantener la patencia del sitio según lo indicado.
9. Monitorear y detectar las ocurrencias de complicaciones terapéuticas, tales como infecciones, flebitis, desequilibrio elec-
trolítico y mala colocación del catéter.
1 O. Responder de inmediato a situaciones de emergencia o críticas, como rotura o salida de su lugar del catéter, desconexión
de una tubería, formación de coágulos, bloqueo del flujo y mal funcionamiento de equipos.
11. Saber cuándo y cómo recurrir a servicios de emergencia profesional o asesoramiento profesional.
12. Manipular, contener y eliminar el material desechado, como agujas, jeringas, dispositivos, derrames o residuos que consti-
tuyan un riesgo biológico y sustancias infecciosas.
Los programas de capacitación deben incluir demostraciones prácticas y la práctica con elementos reales que el paciente o la
persona encargada de su cuidado deberán utilizar, como envases de PME, dispositivos y equipos. El paciente o la persona en-
cargada de su cuidado debe practicar las técnicas asépticas y de inyección bajo la observación directa del profesional de la
salud.
La instalación de preparación magistral, junto con el personal de enfermería o médico, es responsable de asegurar inicial-
mente y en forma continua que el paciente o la persona encargada de su cuidado comprenda, domine y esté en condiciones y
dispuesto a cumplir con todas estas responsabilidades relacionadas con el cuidado domiciliario. Esto se logra a través de un
programa de evaluación formal por escrito. Todas las competencias especificadas en el programa de capacitación del paciente
o la persona encargada de su cuidado deben evaluarse de manera formal. El paciente o la persona encargada de su cuidado
debe demostrar al personal pertinente del cuidado de la salud su dominio de las actividades asignadas antes de que se le per-
mita administrar la PME sin la supervisión de un profesional de la salud.
El material impreso, como listas de control o instrucciones proporcionadas durante la capacitación, pueden servir como re-
fuerzo del aprendizaje después de la capacitación o como recordatorio de las responsabilidades específicas del paciente o la
persona encargada de su cuidado. También puede utilizarse periódicamente el asesoramiento oral después de la capacitación,
según sea apropiado, para reforzar la capacitación y asegurar el cumplimiento correcto y completo de las responsabilidades.

MONITOREO DEL PACIENTE E INFORME DE EVENTOS ADVERSOS

Las instituciones responsables de la preparación magistral deben monitorear clínicamente a los pacientes tratados con PME
según las reglamentaciones y guías establecidas por las juntas reguladoras del ejercicio de la medicina de su respectivo estado
o las normas de práctica aceptadas. Las instituciones responsables de la preparación magistral deben proporcionar a los pa-
cientes y otros destinatarios de PME alguna manera de obtener respuestas a sus preguntas e informar cualquier inquietud que
pudieran tener en relación con las PME y sus dispositivos de administración.
Los manuales de POE de la institución responsable de la preparación magistral deben describir las instrucciones específicas
para recibir, acusar recibo y fechar los informes recibidos, y para registrar, o archivar, y evaluar los informes de eventos adver-
sos y de la calidad de la preparación asociada con las PME. Los informes de eventos adversos con PME deben ser analizados de
inmediato y a fondo por los supervisores de preparación magistral para tomar medidas correctivas y evitar que se vuelvan a
repetir en el futuro. Se recomienda al personal de preparación magistral que participe en los programas de informe de eventos
adversos y defectos de productos de la FDA y la USP.

PROGRAMA DE GARANTÍA DE CALIDAD

Un proveedor de PME debe implementar un programa formal de garantía de calidad destinado a ofrecer un mecanismo pa-
ra monitorear, evaluar, corregir y mejorar las actividades y procesos descritos en este capítulo. El énfasis del programa de ga-
rantía de calidad debe centrarse en mantener y mejorar la calidad de los sistemas y la provisión de cuidados al paciente. Ade-
más, el programa de garantía de calidad asegura que cualquier plan enfocado a corregir los problemas identificados incluya
también el seguimiento apropiado para garantizar que se tomaron las acciones correctivas eficaces. 11
Un plan de garantía de calidad debe incluir las siguientes características:
1. Formalización por escrito;
2. Consideración de todos los aspectos de las preparaciones y dispensación de los productos según se describe en este capí-
tulo, incluyendo las pruebas ambientales y los resultados de la verificación;
3. Descripción de las actividades específicas de monitoreo y evaluación;
4. Especificación de cómo se deben informar y evaluar los resultados;
5. Identificación de los mecanismos de seguimiento apropiados cuando se exceden los límites o umbrales de acción; y
6. Descripción de las personas responsables de cada aspecto del programa de garantía de calidad.
Al desarrollar un plan específico, debe ponerse énfasis en establecer indicadores objetivos y mensurables para las actividades
de monitoreo y los procesos considerados de alto riesgo, de volumen elevado o propensos a problemas. En general, la selec-
ción de indicadores y la eficacia del programa de garantía de calidad deben reevaluarse anualmente.

11 El uso de recursos adicionales, tales como el Accreditation Manual for Home Care de la ]oint Commission on Accreditation of Healthcare Organizations, pueden
resultar útiles en el desarrollo de un plan de garantía de calidad.
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ABREVIATURAS V ACRÓNIMOS

ADP área directa de preparación magistral

IPA alcohol isopropílico
ALARA tan bajo como sea razonablemente posible
ASHRAE American Society of Heating, Refrigerating and Air-Conditioning Engineers
CACI aislador aséptico de contención para preparación magistral
CAi aislador aséptico para preparación magistral
CAPH cambios de aire por hora
CDC Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades
CETA Controlled Environment Testing Association
CFL cabina de flujo laminar
CIP control de ingeniería primario
CSB cabina de seguridad biológica
CSTD dispositivo de sistema cerrado para transferencia de
vial
HVAC calefacción, ventilación y aire acondicionado
DAP dispositivo automatizado de preparación magistral
EPP equipo protector para el personal
FDA Food and Drug Administration (Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos)
FLU fecha límite de uso
HEPA alta eficiencia para partículas aéreas
HICPAC Healthcare lnfection Control Practices Advisory Committee
IB indicador biológico
ISO lnternational Organization far Standardization (Organización Internacional para la Normalización)
MMWR Morbidity and Mortality Weekly Report
NIOSH Instituto Nacional para la Seguridad y Salud Ocupacional
NIST National lnstitute of Standards and Technology (Instituto Nacional de Normas y Tecnología)
PME preparación magistral estéril
psi libras por pulgada cuadrada
QA garantía de calidad
POE procedimiento operativo estándar
PET tomografía por emisión de positrones
TSA agar tripticasa de soja
UE Unidad de Endotoxina
ufc unidad( es) formadora(s) de colonias
USP Farmacopea de los Estados Unidos de América (United States Pharmacopeia)
VDE vial para desafío de endotoxinas
VEI vial estéril para inyección
VMD viales multidosis

GLOSARIO

Aislador Aséptico de Contención para Preparación Magistral {CACI, por sus siglas en inglés): Un aislador aséptico pa-
ra preparación magistral (CAi, por sus siglas en inglés) diseñado para proteger al trabajador de la exposición a concentraciones
indeseables de fármacos dispersados en el aire durante los procesos de preparación y transferencia del material y para propor-
cionar un ambiente aséptico para la elaboración de preparaciones magistrales estériles. No debe ocurrir intercambio de aire
con el medio que lo rodea, a menos que el aire pase primero a través de un sistema de filtro de retención microbiana (HEPA,
como mínimo) capaz de retener las concentraciones de partículas aéreas del tamaño y estado físico del fármaco que se está
preparando magistralmente. Cuando se trabaja con fármacos volátiles peligrosos, el aire de salida del aislador se debe extraer a
través de una ventilación debidamente diseñada en el edificio.
Aislador Aséptico para Preparación Magistral (CAi, por sus siglas en inglés): Una forma de aislador específicamente
diseñado para la elaboración magistral de ingredientes o preparaciones farmacéuticas. Está diseñado para mantener un am-
biente aséptico de preparación dentro del aislador, durante los procesos de preparación magistral y transferencia de material.
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No debe ocurrir intercambio de aire entre el aislador y el medio que lo rodea, a menos que el aire haya pasado primero a
través de un filtro de retención microbiana (HEPA, como mínimo). 12
Antesala-Una sala ISO Clase 8 (ver Tabla 1) o mejor, donde el personal efectúa procedimientos de higiene de manos y
vestimenta, clasificación de componentes, ingreso de órdenes, etiquetado de PME y otras actividades que producen gran can-
tidad de partículas. Es también un área de transición que (1) brinda la garantía de que las relaciones de presión se mantienen
constantemente de forma que el aire fluya de las zonas limpias a las sucias y (2) reduce la necesidad de que el control del
sistema de calefacción, ventilación y aire acondicionado (HVAC) responda a perturbaciones grandes. 13
Área Crítica: Un ambiente ISO Clase 5 (ver Tabla 7).
Área Directa de Preparación Magistral (ADP): Un área crítica dentro de un control de ingeniería primario (CIP) ISO Cla-
se 5 (ver Tabla 1) donde los sitios críticos se exponen a aire unidireccional filtrado por HEPA, conocido también como primer
aire.
Área Segregada para Elaboración de Preparaciones Magistrales: Un espacio reservado, bien sea un área demarcada o
un cuarto, que se restringe a la preparación de PME de nivel de riesgo bajo con FLU de 12 horas o menos. Dicha área debe
contener un dispositivo que proporcione flujo de aire unidireccional de calidad ISO Clase 5 (ver Tabla 7) para la elaboración de
PME y no debe destinarse a actividades ni contener materiales que sean extraños a la preparación magistral estéril.
Cabina de Seguridad Biológica (CSB): Una cabina ventilada para protección ambiental, de la PME, del personal y del
producto, que tiene un frente abierto, con flujo de aire hacia el interior para protección del personal, flujo de aire laminar des-
cendente con filtración de alta eficiencia para partículas aéreas (HEPA, por sus siglas en inglés) para protección del producto y
salida de aire con filtración HEPA para protección ambiental.
Control de Ingeniería Primario (CIP): Un dispositivo o cuarto que brinda un ambiente ISO Clase 5 (ver Tabla 1) para la
exposición de sitios críticos cuando se elaboran las PME. Dichos dispositivos incluyen, entre otros, cabinas de flujo laminar
(CFL), cabinas de seguridad biológica (CSB), aisladores asépticos para preparación magistral (CAi) y aisladores asépticos de
contención para preparación magistral (CACI).
Cuarto de Presión Negativa: Un cuarto que está a presión más baja que los espacios adyacentes; por lo tanto, el flujo
neto de aire es hacia el cuarto. 2
Cuarto de Presión Positiva: Un cuarto que está a presión más alta que los espacios adyacentes; por lo tanto, el flujo neto
de aire es hacia afuera del cuarto.2
Cuarto Limpio: (ver Control Microbiológico y Monitoreo de Ambientes de Procesamiento Aséptico (1116) y también la defini-
ción de Zona Amortiguadora) Un cuarto en el que se controla la concentración de partículas en el aire para que cumpla con
una clasificación de limpieza especificada de partículas aéreas. Se monitorean los microorganismos en el ambiente para que la
concentración microbiana en el aire, las superficies y el atuendo del personal no exceda el límite de limpieza especificado.
Desinfectante: Un agente, generalmente un agente químico pero en ocasiones físico, que libra de la infección y destruye
los patógenos causantes de enfermedad u otros microorganismos peligrosos, pero que no necesariamente elimina esporas
bacterianas o fúngicas. Se refiere a sustancias aplicadas a objetos inanimados.
Empaque a Granel para Farmacias: (ver (659)) Un envase de una preparación estéril para uso parenteral que contiene
muchas dosis únicas. El contenido está destinado para su uso en un programa de mezclas de farmacia y está restringido a la
preparación de mezclas para infusión o, a través de un dispositivo de transferencia estéril, para el llenado de jeringas estériles
vacías. El cierre se perforará sólo una vez después de la reconstitución, usando un dispositivo de transferencia o set de dispen-
sación estéril y adecuado que permita la distribución medida del contenido. El empaque a granel para farmacias sólo se em-
pleará en un área de trabajo adecuada, como por ejemplo una campana de flujo de aire laminar (o un área equivalente de
preparación magistral de aire limpio).
Cuando se ofrezca un envase como empaque a granel para farmacias, la etiqueta debe (a) indicar en forma visible "Empa-
que a Granel para Farmacias, No Usar para Infusión Directa," (b) contener o referir a información sobre las técnicas apropiadas
para ayudar a garantizar el uso seguro del producto, y (c) llevar una leyenda que limite el plazo dentro del cual se puede utili-
zar el envase una vez que ha sido perforado, siempre y cuando se mantenga bajo las condiciones de almacenamiento declara-
das.
Envase Monodosis: (ver Advertencias y Requisitos Generales y (659)) Un envase monodosis es un envase unitario para artí-
culos (ver Advertencias y Requisitos Generales) o preparaciones destinadas solamente a la administración por vía parenteral. Está
destinado a un solo uso. Debe estar etiquetado como envase monodosis. Ejemplos de envases monodosis son: jeringas prelle-
nadas, cartuchos, envases sellados por fusión y envases con cierres sellados, cuando se los etiquete como tales.
Envase Multidosis: (ver Advertencias y Requisitos Generales y (659)) Un envase de unidades múltiples para artículos o pre-
paraciones destinadas a administración parenteral solamente y que por lo general contiene conservantes antimicrobianos. La
fecha límite de uso (FLU) para un envase multidosis abierto o perforado (p.ej., perforado con aguja), que tiene conservantes
antimicrobianos, es de 28 días (ver Pruebas de Eficacia Antimicrobiana (51) ), a menos que el fabricante especifique algo distinto.
Esterilización por Filtración: Paso de un líquido o solución a través de una membrana de grado de esterilización para
producir un efluente estéril.

12 CETA Applications Cuide for the Use of Compounding lsolators in Compounding Sterile Preparations in Healthcare Facilities, CAG-001-2005, Controlled Environment
Testing Association (CETA), 8 de noviembre de 2005.
13 Ver Laboratory Design Cuide (Guía de diseño del laboratorio) de la American Society of Heating, Refrigerating and Air-Conditioning Engineers, /ne. (ASHRAE).
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Esterilización Terminal: Aplicación de un proceso letal (p.ej., vapor bajo presión o autoclavado) a los envases sellados,
con el fin de conseguir un nivel de garantía de esterilidad predeterminado, generalmente menor que 10-6 , o una probabilidad
de menos de uno en un millón de que haya una unidad no estéril. 3
Etiquetado: [ver Advertencias y Requisitos Generales y 21 USC 321 (k) y (m)] Término que se refiere a todas las etiquetas o
marbetes y demás materiales escritos, impresos o gráficos que aparezcan directamente sobre el envase primario de un artículo
o preparación, sobre o dentro de cualquier empaque o envoltorio en que esté incluido, con excepción de los embalajes exter-
nos destinados al transporte. El término "etiqueta" designa la parte del etiquetado que se encuentra sobre el envase primario.
Fármacos Peligrosos: Los fármacos se clasifican como peligrosos si los estudios en animales o humanos indican que la
exposición a ellos tiene potencial para causar cáncer, toxicidad reproductiva o del desarrollo, o daños a los órganos. (Ver la
publicación actual de NIOSH).
Fecha Límite de Uso (FLU): (ver Advertencias y Requisitos Generales y Preparación Magistral-Preparaciones No Estériles
(795)) A los efectos de este capítulo, la fecha u hora después de la cual no se debe almacenar o transportar una PME. Esta
fecha se determina a partir de la fecha u hora de preparación.
Flujo Unidireccional: (ver nota 3 al pie de página) Un flujo de aire que se mueve en una sola dirección de una forma
robusta y uniforme y a una velocidad suficiente como para barrer las partículas lejos del área crítica de prueba o procesamien-
to, en forma reproducible.
Membranas de Grado de Esterilización: Membranas para las que se ha documentado que retienen 100% de un cultivo
de 10 7 microorganismos de una cepa de Brevundimonas (Pseudomonas) diminuta por centímetro cuadrado de superficie de
membrana bajo una presión de no menos de 30 psi (2,0 bar). Dichas membranas de filtro tienen tamaño de poro nominal de
0,22 µm o 0,2 µm, dependiendo de la práctica utilizada por el fabricante.
Preparación: Una preparación, o una PME, que es un medicamento o nutriente estéril preparado magistralmente en una
farmacia autorizada u otra institución relacionada con la salud, de acuerdo con la orden de un prescriptor autorizado; el artícu-
lo puede contener productos estériles o no.
Primer Aire: El aire que sale del filtro HEPA en una corriente unidireccional que carece prácticamente de partículas.
Procesamiento Aséptico: (ver Control Microbiológico y Monitoreo de Ambientes de Procesamiento Aséptico (1116)) Una mo-
dalidad de procesar productos farmacéuticos y médicos que involucra la esterilización por separado del producto y del empa-
que (envases y cierres o material de empaque para dispositivos médicos) y la transferencia del producto al envase y su cierre en
condiciones ISO Clase 5 (ver Tabla 1) como mínimo.
Producto: Un medicamento o nutriente estéril fabricado comercialmente, cuya seguridad y eficacia han sido evaluadas
por la FDA. Los productos van acompañados de información completa para prescribir, la cual se conoce comúnmente como el
etiquetado del fabricante aprobado por la FDA o prospecto adjunto del producto.
Prueba de Llenado de Medios: (ver Control Microbiológico y Monitoreo de Ambientes de Procesamiento Aséptico (1116))
Una prueba utilizada para calificar los procesos o la técnica aséptica del personal que elabora la preparación magistral, y con el
fin de garantizar que con los procesos usados se puedan elaborar productos estériles sin contaminación microbiana. Durante
esta prueba, se sustituye el producto farmacéutico real con un medio de crecimiento microbiano, como el Medio de Digerido
de Caseína y Soja, para simular la mezcla de la preparación magistral. 1 Los puntos que se deben considerar en el desarrollo de
la prueba de llenado de medios son: procedimientos de llenado de medios, selección de medios, volumen de llenado, incuba-
ción, tiempo y temperatura, inspección de las unidades llenas, documentación, interpretación de los resultados y posibles ac-
ciones correctivas requeridas.
Sitio Crítico: Un sitio que incluye cualquier componente o superficies de recorrido de líquidos (p.ej., septos de viales,
puertos de inyección, vasos de precipitados) o aberturas (p.ej., ampollas abiertas, conos conectores de agujas) expuestos y en
riesgo de contacto directo con el aire (p.ej., ambiental o filtrado por HEPA), humedad (p.ej., secreciones orales o mucosas) o
contaminación por contacto. En el sitio crítico, el riesgo de contaminación microbiana por partículas aumenta con el tamaño
de las aberturas y el tiempo de exposición.
Zona Amortiguadora: El sitio donde está localizado físicamente el control de ingeniería primario (CIP). Las actividades
que ocurren en esta área incluyen la preparación y clasificación de componentes y suministros usados al preparar la PME.
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APÉNDICES

Apéndice l. Competencias Principales, Condiciones, Prácticas y Garantías de Calidad

que se requieren (t "deben") y se recomiendan (:1: "debieran") en el Capítulo (797) de la USP
NOTA-Este apéndice tabular resume y condensa selectivamente el texto completo del capítulo (797) sólo para referencia rápida. El personal de prepa-
ración magistral es responsable de leer, comprender y cumplir con el texto completo y toda la terminología, contenido y condiciones oficiales de Ja
USP.
INTRODUCCIÓN
:j: El propósito del capítulo consiste en evitar daños y muerte a pacientes tratados con PM E.
t El capítulo se refiere a Ja preparación, el almacenamiento y el transporte de PME, mas no a su administración.
t Personal e instituciones a las cuales se aplica el (797); por Jo tanto, para quién y para las cuáles puede ser ejecutable por las autoridades reglamenta-
rias y de acreditación.
t Los tipos de preparaciones diseñadas como PME según sus formas físicas y Jos sitios y rutas de administración a Jos pacientes.
t El personal que trabaja en las preparaciones magistrales debe ser meticulosamente cuidadoso en evitar Ja contaminación por contacto de las PME,
tanto dentro como fuera de las áreas ISO Clase 5.
ORGANIZACIÓN
t Todo el personal que participa en la elaboración de PME tiene la responsabilidad de comprender las prácticas y precauciones fundamentales que se
encuentran en el capítulo (797) de la USP, para desarrollar e implementar los procedimientos apropiados y evaluar en forma constante dichos proce-
dimientos y la calidad de la PME final para evitar daños.
RESPONSABILIDAD DEL PERSONAL DE PREPARACIÓN MAGISTRAL
t Las prácticas y garantías de calidad requeridas para preparar, almacenar y transportar PME que son estériles y aceptablemente precisas, puras y esta-
bles.
NIVELES DE RIESGO DE CONTAMINACIÓN MICROBIANA EN LAS PME
t La capacitación apropiada y la evaluación del personal, la limpieza y vestimenta adecuada del personal, la limpieza y desinfección adecuada de los
ambientes de trabajo de preparación magistral y el mantenimiento y monitoreo apropiados de las instalaciones de ambiente controlado (todas las
cuales se detallan en sus respectivas secciones).
PME de Nivel de Riesgo Bajo
t Manipulaciones asépticas dentro de un ambiente ISO Clase 5 usando tres, o menos de tres, productos estériles y entradas en cualquier envase.
t En ausencia de pruebas de esterilidad, almacenar no más de 48 horas a temperatura ambiente controlada, 14 días a temperatura fría y 45 días en
estado congelado sólido entre -25º y -1 Oº o más frío.
t Prueba de llenado de medios al menos anualmente, hecha por el personal de preparación magistral.
PME de Nivel de Riesgo Bajo con FLU de 12 Horas o Menos
t Cumplir totalmente con los cuatro criterios específicos.
:j: Los lavabos no deben estar ubicados adyacentes al CIP ISO Clase 5.
:j: Los lavabos deben estar separados del área inmediata del CIP ISO Clase 5.
PME de Nivel de Riesgo Mediano
t Manipulaciones asépticas dentro de un ambiente ISO Clase 5, usando mezclado y transferencia prolongados y complejos, más de tres productos
estériles y entradas dentro de cualquier envase, y combinación de ingredientes de múltiples productos estériles para preparar múltiples PME.
t En ausencia de pruebas de esterilidad, almacenar no más de 30 horas a temperatura ambiente controlada, 9 días a temperatura fría y 45 días en
estado congelado sólido entre -25º y -1 Oº o más frío.
t Prueba de llenado de medios al menos anualmente, hecha por el personal de preparación magistral.
PME de Nivel de Riesgo Alto
t Presencia confirmada de ingredientes y dispositivos no estériles, o exposición confirmada o sospechada de ingredientes estériles por más de una
hora a calidad de aire inferior a ISO Clase 5 antes de la esterilización final.
t Método de esterilización verificado para conseguir la esterilidad para la cantidad y tipo de envases.
t Cumplir los límites permisibles para endotoxinas bacterianas.
t Mantener la concentración y pureza aceptables de los ingredientes y la integridad de los envases involucrados después de la esterilización.
t En ausencia de pruebas de esterilidad, almacenar no más de 24 horas a temperatura ambiente controlada, 3 días a temperatura fría y 45 días en
estado congelado sólido entre -25º y -1 Oº o más frío.
t Prueba de llenado de medios al menos semestralmente, hecha por el personal de preparación magistral.
CAPACITACIÓN Y EVALUACIÓN DEL PERSONAL EN TÉCNICAS DE MANIPULACIÓN ASÉPTICA
t Inicialmente, aprobar la evaluación didáctica y práctica de destrezas y llenado de medios, seguida por una evaluación anual para preparación magis-
tral de nivel de riesgo bajo y mediano, y semestral para preparación magistral de nivel de riesgo alto.
t El personal de preparación magistral que no pase las pruebas escritas o cuyos viales de prueba de llenado de medios produzcan una colonización
microbiana profusa, deberá recibir de inmediato una nueva capacitación y someterse a una nueva evaluación a cargo de personal experto en prepa-
ración magistral, para asegurarse de que hayan corregido todas sus deficiencias en materia de práctica aséptica.
PME DE USO INMEDIATO
t Cumplir totalmente con los seis criterios especificados.
USP 40 Pruebas Físicas/ (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles 773

Apéndice l. Competencias Principales, Condiciones, Prácticas y Garantías de Calidad

que se requieren (t "deben") y se recomiendan (:j: "debieran") en el Capítulo (797) de la USP (Continuación)
ENVASES MONODOSIS Y MULTIDOSIS
t Fecha límite de uso de 28 días, a menos que el fabricante especifique lo contrario, para envases multidosis de cierre sellado, después de la apertura o
entrada inicial.
t Fecha límite de uso de 6 horas, a menos que el fabricante especifique lo contrario, para envases monodosis de cierre sellado en aire ISO Clase 5 o
más limpio, después de la apertura o entrada inicial.
t Fecha límite de uso de 1 hora para envases monodosis de cierre sellado después de su apertura o entrada bajo un aire de calidad inferior a ISO Clase
5.
t No se permite el almacenamiento de ampollas monodosis abiertas.
FÁRMACOS PELIGROSOS COMO PME
t Equipo protector apropiado para el personal.
t Los controles de ingeniería primarios apropiados (CSB y CACI) se usan para la protección simultánea del personal y la exposición de sitios críticos.
t Los fármacos peligrosos se deben almacenar separados de otro inventario, de manera que se evite la contaminación y la exposición del personal.
t Presión negativa al menos de 0,01 pulgadas de columna de agua y 12 cambios de aire por hora en cuartos no limpios en donde se ubiquen los
CACI.
t Los fármacos peligrosos se deben manejar con precaución en todo momento, usando guantes apropiados para quimioterapia durante la recepción,
distribución, aprovisionamiento, inventariado, preparación para administración y eliminación.
t Los fármacos peligrosos deben prepararse en un ambiente ISO Clase 5, con controles de ingeniería protectores y siguiendo las prácticas asépticas
especificadas para los niveles de riesgo de contaminación apropiados.
t El acceso a áreas de elaboración de preparaciones de fármacos debe estar limitado al personal autorizado.
t Se debe instalar un indicador de presión que pueda monitorear fácilmente la presurización del cuarto, que se documenta diariamente.
t Documentación anual para la capacitación completa del personal en lo que respecta a almacenamiento, manipulación y eliminación de fármacos
peligrosos.
t Si se usa un CSTD, éste se empleará en un dispositivo de control de ingeniería primario ISO Clase 5.
t Se requiere presión negativa de al menos 0,01 pulgadas de columna de agua para la preparación magistral de fármacos peligrosos.
:j: La zona amortiguadora de presión negativa no se requiere para preparaciones magistrales de bajo volumen cuando se usa un CSTD en una CSB o
un CACI.
t El personal de preparación magistral que esté en edad reproductiva debe confirmar por escrito que entiende los riesgos de manipular los fármacos
peligrosos.
t La eliminación de todos los desechos de fármacos peligrosos debe cumplir con todas las reglamentaciones federales y estatales.
:j: Salida externa total de los controles de ingeniería primarios.
:j: Ensayo de muestras de frotación de superficies cada 6 meses.
PREPARADOS RADIOFARMACÉUTICOS COMO PME
t Tomografía de Emisión de Positrones se rige por el capítulo (823) de la USP.
t Controles de ingeniería primarios apropiados y contención y blindaje de radioactividad.
t Los preparados radiofarmacéuticos elaborados a partir de componentes estériles en recipientes estériles cerrados y con un volumen de 100 mL o
menos para inyección monodosis, o no más de 30 mL tomados de envases multidosis se deben nombrar según las normas para PME de nivel de
riesgo bajo y cumplir con ellos.
t Los viales de preparados radiofarmacéuticos destinados a múltiples usos, preparados con tecnecio 99m, expuestos a ambiente ISO Clase 5 y perfora-
dos por agujas, sin contaminación directa, pueden usarse hasta la fecha indicada en las recomendaciones del fabricante.
t Ubicación de controles de ingeniería primarios permitidos en un ambiente controlado ISO Clase 8.
t Generadores de Tecnecio 99m/Molibdeno 99 usados de acuerdo con los requisitos federales, estatales y del fabricante.
t Los preparados radiofarmacéuticos como PME de nivel de riesgo bajo, con fecha límite de uso de 12 horas o menos se deben preparar en un área
segregada.
t Los materiales y la vestimenta expuestos en el área de atención y tratamiento del paciente no deben cruzar una línea de demarcación dentro del
área de preparación magistral segregada.
t Los generadores de Tecnecio 99m/Molibdeno 99 se deben eluir en condiciones ISO Clase 8.
t El área de preparación magistral segregada se indicará con una línea de demarcación.
:j: El almacenamiento y transporte de los viales debidamente blindados de PME radiofarmacéuticas puede ocurrir en un ambiente de acceso limitado
sin una designación específica de clase ISO.
EXTRACTOS DE ALÉRGENOS COMO PME
t Los extractos de alérgenos como PME no están sujetos a los requisitos descritos para personal, ambiente y almacenamiento de PME de todos los
Niveles de Riesgo de Contaminación Microbiana cuando se cumplen ciertos criterios.
VERIFICACIÓN DE LA EXACTITUD Y ESTERILIDAD DE LA PREPARACIÓN MAGISTRAL
t Revisar etiquetas y documentar las mediciones, manipulaciones asépticas y procedimientos de esterilización correctos para confirmar la identidad,
pureza, concentración de ingredientes y esterilidad de la PME.
:j: Valorar las PME terminadas para confirmar la identidad correcta y/o concentración de ingredientes.
:j: Prueba de esterilidad para PME terminadas.
774 (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles/ Pruebas Físicas USP 40

Apéndice l. Competencias Principales, Condiciones, Prácticas y Garantías de Calidad

que se requieren (t "deben") y se recomiendan (:j: "debieran") en el Capítulo (797) de la USP (Continuación)
Métodos de Esterilización
t Verificar que los métodos permiten lograr la esterilidad a la vez que mantienen el contenido, pureza, calidad e integridad del envase apropiados.
+Probar la eficacia según el capítulo (71) de la USP, o mediante pruebas de esterilidad equivalentes o superiores.
Esterilización de PME de Nivel de Riesgo Alto por Filtración
t Membranas estériles de tamaño nominal de poro de 0,2 µm que sean química y físicamente compatibles con la PME.
t Completar rápidamente sin reemplazar el filtro.
t Someter el filtro a la prueba de integridad recomendada por el fabricante (p.ej., prueba del punto de burbuja) después de filtrar la PME.
Esterilización de PME de Nivel de Riesgo Alto por Vapor
t Probar hasta verificar que todos los envases que se van a esterilizar queden estériles después del tiempo de exposición seleccionado en el autoclave
particular.
t Garantizar que el vapor vivo entre en contacto con todos los ingredientes y superficies que se van a esterilizar.
t Pasar las soluciones a través de un filtro de tamaño nominal de poro de 1,2 µm o menor a los envases finales para retirar las partículas antes de la
esterilización.
t El aire caliente filtrado debe distribuirse uniformemente a través de la cámara, por medio de un ventilador.
t El calor seco se debe usar sólo para aquellos materiales que no se puedan esterilizar por vapor, cuando la humedad daña el material o éste es imper-
meable.
t Se debe dejar suficiente espacio entre los materiales para permitir una buena circulación del aire caliente.
t La descripción de las condiciones y duración de la esterilización por calor seco para cada PME debe estar documentada por escrito en la institución
responsable de la preparación magistral. La eficacia de la esterilización por calor seco se debe verificar usando los indicadores biológicos apropiados y
otros métodos de confirmación.
+El horno debe equiparse con un sistema para controlar la temperatura y el tiempo de exposición.
Despirogenización por Calor Seco
t La despirogenización por calor seco se debe usar para eliminar los pirógenos y los microbios viables de los artículos o envases de vidrio, como viales.
t La descripción del ciclo de despirogenización por calor seco y su duración para una carga específica de artículos debe estar documentada por escrito
en la institución responsable de la preparación magistral.
t La eficacia del ciclo de despirogenización por calor seco se debe verificar usando viales para desafío de endotoxinas (VDE).
t La prueba de endotoxinas bacterianas debe efectuarse en los VDE con el fin de verificar si el ciclo es capaz de conseguir una reducción de 3 log en
endotoxinas.
CALIDAD Y CONTROL AMBIENTAL
Exposición de Sitios Críticos
t Aire ISO Clase 5 o mejor.
t Evitar la contaminación por contacto directo (p.ej., tacto y secreciones).
Fuentes de Aire ISO Clase 5, Zonas Amortiguadoras y Antesalas
t Una zona amortiguadora es un área provista con aire de calidad ISO Clase 7 como mínimo.
t Nuevas representaciones de la distribución de la instalación.
t Toda instalación de preparación magistral debe garantizar que cada fuente de ambiente ISO Clase 5 para exposición de sitios críticos y esterilización
por filtración esté adecuadamente ubicada, manejada, mantenida, supervisada y verificada.
t Los dispositivos (p.ej., computadoras e impresoras) y objetos (p.ej., carros y gabinetes) se pueden ubicar en zonas amortiguadoras y deben verificar-
se mediante pruebas o monitoreo.
Pruebas de Muestreo Ambiental (MA) de Partículas Viables y No Viables
t El muestreo ambiental se debe realizar como parte de un programa integral de gestión de la calidad y deberá ocurrir como mínimo cuando existan
varias condiciones.
+El programa de muestreo ambiental debe proporcionar información al personal y directivos para demostrar que los controles de ingeniería mantie-
nen un ambiente dentro del área de preparación magistral que garantiza en forma constante concentraciones de partículas viables y no viables acep-
tablemente bajas.
Programa de Pruebas para Partículas Ambientales No Viables
t La certificación y pruebas de los controles de ingeniería primarios (CFL, CSB, CAi y CACI) y secundarios (zonas amortiguadoras y antesalas) las debe
efectuar una persona calificada por lo menos cada seis meses y siempre que el dispositivo o cuarto se reubique, altere o se haga una reparación
importante a la instalación. Se deben usar los procedimientos de certificación, como aquellos señalados en Certification Guide for Sterile Compoun-
ding Facilities (CAG-003-2006) de CETA.
Recuento Total de Partículas
t La certificación por medio de la cual se certifica que cada área con clasificación ISO, (p.ej., ISO Clase 5, 6, 7 y 8) está dentro de las normas estableci-
das, se debe hacer por lo menos cada 6 meses y siempre que la CFL, la CSB, el CAi o el CACI se reubiquen o la estructura física de la zona amortigua-
dora o de la antesala se alteren.
t Las pruebas las deben efectuar operadores calificados, usando equipo electrónico de última tecnología con resultados que cumplan con ISO Clase 5,
7 u 8, dependiendo de los requisitos de la zona.
t El personal de supervisión y otros empleados designados deben mantener y revisar todos los registros de certificación para garantizar que los am-
bientes controlados cumplan con la limpieza de aire, presiones del cuarto y CAPH apropiados.
USP 40 Pruebas Físicas/ (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles 775

Apéndice l. Competencias Principales, Condiciones, Prácticas y Garantías de Calidad

que se requieren (t "deben") y se recomiendan (:f: "debieran") en el Capítulo (797) de la USP (Continuación)
Monitoreo de la Presión Diferencial
t Se debe instalar un manómetro o velocímetro para supervisar el diferencial de presión o flujo de aire entre la zona amortiguadora y la antesala y
entre la antesala y el ambiente general fuera de la zona de preparación magistral.
t Los resultados deberán revisarse y documentarse en un cuaderno de bitácora por lo menos en cada cambio de turno (la frecuencia mínima debe ser
diaria) o en un dispositivo de grabación continua.
t La presión entre el área ISO Clase 7 y la zona general de farmacia no debe ser menor que 5 Pa (0,02 pulgadas de columna de agua (w.c.)).
t En instalaciones donde se preparan PME de nivel de riesgo bajo y mediano, el flujo de aire diferencial debe mantener una velocidad mínima de 0,2
metros por segundo (40 pies por minuto) entre la zona amortiguadora y la antesala.
Programa de Pruebas para Partículas Aéreas Ambientales Viables-Plan de Muestreo
t Se debe desarrollar un plan de muestreo ambiental apropiado para las partículas aéreas viables, basado en la evaluación de riesgo de las actividades
de preparación magistral efectuadas.
t Los sitios de muestreo seleccionados deben incluir lugares dentro de cada ambiente ISO Clase 5 y en las zonas ISO Clase 7 y 8, así como en las zonas
segregadas de preparación magistral con más alto riesgo de contaminación (p.ej., zonas de trabajo cerca del ambiente ISO Clase 5, mostradores
cerca de las puertas, cabinas de transferencia de materiales (pass-through boxes)).
t El plan debe incluir: ubicación de la muestra, método de recolección, frecuencia de muestreo, volumen de aire muestreado y hora del día, relativa a
la actividad de la zona de preparación magistral, y niveles de acción.
t Se recomienda que el personal de preparación magistral consulte el Capítulo Control Microbiológico y Monitoreo de Ambientes de Procesamiento Asépti-
co (1116) de la USP y las Guidelines for Environmental lnfection Control in Healthcare Facilities-2003 de los CDC para más información.
Medio de Crecimiento
t Se debe utilizar un medio de crecimiento microbiano como el Medio de Digerido de Caseína y Soja (también conocido como caldo (TSB) o agar
(TSA) tripticasa de soja) para propiciar el crecimiento de bacterias.
t En los ambientes de preparación magistral con nivel de riesgo alto se debe usar un agar con extracto de malta (MEA) u otro medio que facilite el
crecimiento de hongos.
t Los medios usados para el muestreo de superficies deben suplementarse con aditivos para neutralizar los efectos de los agentes desinfectantes (p.ej.,
TSA con lecitina y polisorbato 80).
Muestreo de Partículas Aéreas Viables
t La evaluación de microorganismos aéreos usando métodos volumétricos de recolección en los ambientes de aire controlado debe efectuarla perso-
nal capacitado para todos los niveles de riesgo de las preparaciones magistrales.
t El método de impacto debe ser el método preferido de muestreo volumétrico de aire.
t Para preparaciones magistrales de nivel de riesgo bajo, mediano y alto, el muestreo de aire se debe efectuar en lugares propensos a la contamina-
ción durante actividades de preparación magistral y otras actividades como preparación, etiquetado, vestimenta y limpieza.
t Los lugares de muestreo deben incluir zonas de turbulencia de reflujo de aire dentro de la cabina de flujo laminar y otras áreas en donde la turbulen-
cia de reflujo de aire pueda ingresar en el área de preparación magistral.
t Para PME de nivel de riesgo bajo con FLU de 12 horas o menos, el muestreo de aire se debe hacer en sitios dentro del ambiente ISO Clase 5 y otras
áreas que estén muy cerca del ambiente ISO Clase 5, durante la certificación del control de ingeniería primario.
t Debe considerarse el efecto general que el método de muestreo escogido tendrá sobre el flujo de aire unidireccional dentro de un ambiente de
preparación magistral.
Dispositivos de Muestreo de Aire
t Se deben seguir las instrucciones en el manual de usuario del fabricante en lo que respecta a la verificación y uso de muestreadores eléctricos de aire
que recolectan activamente volúmenes de aire para evaluación.
t Se debe evaluar un volumen suficiente de aire (400 a 1000 litros) en cada lugar de muestreo, con el fin de maximizar la sensibilidad.
t Se recomienda que el personal de preparación magistral consulte también el Capítulo USP (1116) que puede proporcionar más información sobre el
uso de muestreadores volumétricos de aire y el volumen de aire que debe tomarse para detectar variaciones en la biocarga ambiental.
Proceso y Frecuencia de Muestreo del Aire
t Como parte de la recertificación de instalaciones y equipos, se debe efectuar el muestreo del aire al menos dos veces al año (es decir, cada 6 meses)
en el área donde estén ubicados los controles de ingeniería primarios.
t Se debe tomar un volumen suficiente de aire y seguir las normas del fabricante para el uso de equipo electrónico para muestreo de aire.
t Cualquier construcción o reparación de equipo en una instalación puede requerir que se tomen muestras de aire durante esas actividades.
Período de Incubación
t Las placas de medio para crecimiento microbiano usadas para recolectar muestreos ambientales se recuperan, se aseguran las tapas (p.ej., con cin-
ta), se invierten e incuban a una temperatura y por un tiempo que conduzca a la multiplicación de microorganismos.
t Se debe contar e informar el número de colonias discretas de microorganismos como unidades formadoras de colonias (ufc) en un formulario de
monitoreo ambiental. Los recuentos de las muestras de aire se deben transformar en ufc por metro cúbico de aire y evaluar las tendencias adversas.
t El TSA se debe incubar a una temperatura de 35º ±2 ºdurante un período de 2 a 3 días.
t MEA u otro medio apto para hongos se debe incubar a 28º ± 2 ºdurante 5 a 7 días.
Niveles de Acción, Documentación y Evaluación de Datos
t Los datos de muestreo se deben recolectar y revisar en forma periódica como una manera de evaluar el control general del ambiente de preparación
magistral.
t Si una actividad muestra sistemáticamente niveles elevados de crecimiento microbiano, se debe consultar al personal competente de microbiología.
776 (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles/ Pruebas Físicas USP 40

Apéndice l. Competencias Principales, Condiciones, Prácticas y Garantías de Calidad

que se requieren (t "deben") y se recomiendan <*
"debieran") en el Capítulo (797) de la USP (Continuación)
t Se debe investigar la fuente de la contaminación.
:j: Cualquier recuento de ufc que exceda su respectivo nivel de acción debe dar lugar a una reevaluación de la idoneidad de las prácticas de trabajo del
personal, los procedimientos de limpieza y operativos y la eficacia de la filtración de aire dentro de la instalación de preparación magistral aséptica.
:j: La tabla titulada Niveles de Acción Recomendados para Contaminación Microbiana se debe usar sólo como guía.
Diseño de la Instalación y Controles Ambientales
t Las instalaciones de preparación magistral están físicamente diseñadas y ambientalmente controladas para minimizar el contacto de la contamina-
ción aérea con los sitios críticos.
t Las instalaciones de preparación magistral deben proporcionar un ambiente de trabajo cómodo y bien iluminado, por lo general con una tempera-
tura de 20º o menos, para brindar condiciones de comodidad al personal de preparación magistral mientras está ataviado con la vestimenta requeri-
da para la preparación magistral aséptica.
t Los controles de ingeniería primarios proporcionan aire HEPA unidireccional (es decir, laminar) a una velocidad suficiente para prevenir el contacto
de partículas aéreas con los sitios críticos.
t En el área crítica se debe realizar un análisis del patrón de aire in situ por medio de estudios de humo para demostrar el flujo unidireccional del aire y
la acción de barrido sobre el producto bajo condiciones dinámicas.
t Las políticas y procedimientos para mantener y trabajar dentro del área de control de ingeniería primario se deben poner por escrito y cumplir. Las
políticas y procedimientos estarán determinados por el alcance y niveles de riesgo de las actividades de preparación magistral aséptica utilizadas du-
rante la preparación de las PME.
t Los principios del flujo unidireccional de aire filtrado por HEPA en el ambiente de trabajo se deben comprender y practicar en el proceso de prepara-
ción magistral, con el fin de conseguir las condiciones ambientales deseadas.
t Los cuartos limpios para PME no peligrosas y no radioactivas se suministran con HEPA que entra desde el cielo raso, con ventilaciones de retorno en
la parte baja de las paredes, y proporciona no menos de 30 cambios de aire por hora.
t Las zonas amortiguadoras mantienen una presión positiva de 0,02 a 0,05 pulgadas de columna de agua y no contienen lavabos ni drenajes.
t La velocidad de aire de las zonas o cuartos amortiguadores a las antesalas es al menos 40 pies/minuto.
t El control de ingeniería primario debe estar ubicado dentro de una zona amortiguadora, de tal manera que se eviten condiciones que podrían afec-
tar adversamente su funcionamiento.
t El control de ingeniería primario debe ubicarse fuera del flujo de tráfico y de manera que el sistema de HVAC y las corrientes de aire del cuarto no
causen perturbaciones.
t El suministro de aire filtrado por HEPA se debe introducir por el cielo raso.
t Debe probarse la eficacia de todos los filtros HEPA, usando el tamaño de partícula más penetrante y someterlos a pruebas contra fugas en la fábrica,
y nuevamente in situ después de la instalación.
t Las actividades y tareas desarrolladas dentro de la zona amortiguadora deben limitarse a aquellas necesarias cuando se trabaja en un ambiente con-
trolado.
t Al cuarto sólo se deben llevar los muebles, equipos, suministros y otros materiales requeridos para las actividades de preparación magistral que se
van a desempeñar.
t Las superficies y el amoblado esencial en los cuartos o zonas amortiguadoras y en los cuartos limpios deben ser lisos, impermeables, limpiables,
resistentes a desinfectantes y no ser porosos ni desprender partículas.
t Las superficies de los cielos rasos, paredes, pisos, artefactos, estantes, mostradores y gabinetes en la zona amortiguadora deben ser lisos e impermea-
bles, no deben tener grietas o rajaduras, y no deben desprender partículas para facilitar su limpieza y reducir al mínimo los espacios en los que po-
drían acumularse microorganismos y otros contaminantes.
t Las superficies deben ser resistentes a los daños causados por agentes desinfectantes.
t Las uniones de los cielos rasos con las paredes deben ser abovedadas o enmasilladas para evitar la formación de grietas donde pueda acumularse
polvo.
t Los paneles del cielo raso se deben enmasillar en todo su perímetro para sellarlas al armazón de soporte.
t La superficie externa de los artefactos de iluminación embutidos en el cielo raso debe ser lisa y estar sellada y al ras del cielo raso.
t Cualquier otro elemento que penetre en el cielo raso o las paredes debe estar sellado.
t La zona amortiguadora no debe contener fuentes de agua (lavabos) ni drenajes en el piso. Las superficies de trabajo deben estar construidas con
materiales lisos impermeables, como acero inoxidable o plástico moldeado, para que puedan limpiarse y desinfectarse fácilmente.
t Los carros deben ser de alambre de acero inoxidable, plástico no poroso o planchas metálicas, con ruedas de buena calidad y fáciles de limpiar para
facilitar su movilidad.
t Los estantes de almacenamiento, mostradores y gabinetes deben ser lisos, de material impermeable y fáciles de limpiar y desinfectar y, además de-
ben estar libres de grietas y no desprender partículas.
t La cantidad, el diseño y la forma de instalación de los artículos antes mencionados debe facilitar la limpieza y desinfección eficaces.
:j: Si los cielos rasos tienen paneles incrustados, éstos deben impregnarse con un polímero para hacerlos impermeables e hidrófobos.
:j: Debe evitarse la presencia de elementos salientes que junten polvo, como las tuberías de servicio que pasan por el techo o las repisas de las venta-
nas.
:j: Los retornos de aire deben estar instalados en la parte inferior de la pared para crear una dilución general de arriba hacia abajo del aire ambiental
con el aire filtrado por HEPA.
USP 40 Pruebas Físicas/ (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles 777

Apéndice l. Competencias Principales, Condiciones, Prácticas y Garantías de Calidad

que se requieren (t "deben") y se recomiendan (:j: "debieran") en el Capítulo (797) de la USP (Continuación)
Colocación de los Controles de Ingeniería Primario dentro de Zonas Amortiguadoras ISO Clase 7
t Los controles de ingeniería primarios para PME no peligrosas y no radiactivas se colocan en las zonas amortiguadoras, excepto en el caso de CAi que
prueben mantener aire ISO Clase 5 cuando los recuentos de partículas se hacen entre 6 y 12 pulgadas más arriba de las áreas de exposición del sitio
crítico durante la realización de la transferencia normal de materiales hacia adentro y afuera, y durante manipulaciones de preparación magistral,
cuando dichos CAi se ubican bajo un aire de calidad inferior a ISO Clase 7.
t Los procedimientos de preesterilización para las PME de alto riesgo, como el pesado y mezclado, se deben completar en un ambiente no inferior a
ISO Clase 8.
t Los controles de ingeniería primarios deben ubicarse fuera de las vías de tráfico y lejos de corrientes de aire que pudieran perturbar los patrones de
flujo de aire deseados del cuarto.
t Cuando se usen aisladores para la preparación magistral estéril, el tiempo de recuperación para alcanzar la calidad de aire ISO Clase 5 se debe docu-
mentar y desarrollar los procedimientos internos para garantizar que se permita el tiempo de recuperación adecuado después de la transferencia de
materiales, antes y durante las operaciones de preparación magistral.
t Cuando las actividades de preparación magistral requieran la manipulación de materiales derivados de la sangre del paciente u otros materiales bio-
lógicos (p.ej., marcado radioactivo de leucocitos de un paciente o donante), las manipulaciones deben hacerse claramente aparte de los procedi-
mientos de rutina para manejo de material y equipos usados en las actividades de preparación de PME y deben controlarse por medio de POE especí-
ficos con el fin de evitar contaminaciones cruzadas.
t Alimentos, bebidas y artículos expuestos en las zonas de atención de paciente, así como desempacar suministros a granel y actividades de aseo y
vestimenta del personal están prohibidos en los cuartos o zonas amortiguadores.
t Designación de demarcación entre cuartos o zonas amortiguadoras y antesalas.
t Limpieza antiséptica de manos y guantes estériles en los cuartos o zonas amortiguadoras.
:j: Los suministros y componentes empacados para preparación magistral, como agujas, jeringas, conjuntos de tubos y soluciones parenterales de pe-
queño y gran volumen deben sacarse de las cajas y frotarse con un desinfectante que no deje residuo (p.ej., IPA estéril al 70%) de ser posible en una
antesala de calidad de aire ISO Clase 8, antes de pasarlos a las zonas amortiguadoras.
Limpieza y Desinfección del Área de Preparación Magistral Estéril
t El personal capacitado escribe los procedimientos detallados que incluyen limpiadores, desinfectantes y materiales para refregar y trapear que no
desprenden partículas.
t Las superficies de la CFL, la CSB, el CAi y el CACI se deben limpiar y desinfectar con frecuencia, incluyendo: al comenzar cada turno de trabajo, antes
de la preparación de cada lote, cada 30 minutos durante los períodos continuos de preparación de PME individuales, cuando haya derramamientos y
cuando se sepa o sospeche que la superficie está contaminada debido a fallas procedimentales.
t El personal de preparación magistral capacitado es responsable de desarrollar, implementar y poner en práctica los procedimientos de limpieza y
desinfección del área directa de preparación (ADP) escritos en los POE.
t La limpieza y desinfección deben hacerse antes de la preparación magistral. Se deben quitar todos los artículos de las áreas a limpiar y a continua-
ción limpiar las superficies, retirando el material suelto y los residuos de derramamientos; por ejemplo, los residuos sólidos solubles en agua se quitan
con Agua Estéril (para Inyección o Irrigación) y paños que no desprendan partículas. Luego se pasa un paño con un agente desinfectante que no deje
residuos, como IPA estéril al 70%, el cual se deja secar antes de comenzar la preparación magistral.
t Las superficies de trabajo en zonas ISO Clase 7 y 8 y en las zonas de preparación magistral segregadas se limpian al menos una vez al día.
t El polvo y los detritos se deben retirar cuando sea necesario de los sitios de almacenamiento de ingredientes y suministros de preparación magistral,
con un método que no degrade la calidad de aire ISO Clase 7 u 8.
t Los pisos en las áreas ISO Clase 7 y 8 se limpian diariamente cuando no hay preparación magistral en proceso.
t El IPA (alcohol isopropílico al 70%) permanece en las superficies que se van a desinfectar al menos durante 30 segundos antes de que se usen para
elaborar PME.
t Los estantes vacíos, las paredes y los cielos rasos en las antesalas se limpian y desinfectan al menos una vez al mes.
t La limpieza del suelo debe ser realizada por personal capacitado, usando los agentes y procedimientos aprobados que se describen en los POE escri-
tos.
t Los agentes limpiadores y desinfectantes, sus cronogramas de uso y métodos de aplicación deben concordar con los POE escritos y el personal de
apoyo y/o el de preparación magistral debe cumplirlos.
t Todos los materiales de limpieza, como paños, esponjas y trapeadores deben ser del tipo que no desprenda partículas, de preferencia compuestos
por microfibras sintéticas y destinados al uso en las zonas amortiguadoras, antesalas y áreas segregadas de preparación magistral, de las cuales no
deben retirarse a menos que sea para desecharlos.
t Si los materiales de limpieza (p.ej., trapeadores) se reutilizan, se deben desarrollar procedimientos (basándose en las recomendaciones del fabrican-
te) que garanticen que la eficacia del dispositivo de limpieza se mantiene y que el uso repetido no incrementa la biocarga del área que se está lim-
piando.
t Los suministros y equipos retirados de su embalaje original se deben limpiar con un agente desinfectante apropiado (p.ej., IPA estéril al 70%), aplica-
do con un frasco rociador u otro método de aplicación adecuado.
t Después de rociar o limpiar con el desinfectante la superficie a desinfectar, se debe dejar secar y durante este tiempo el artículo no se debe usar para
preparación magistral.
t Las compresas de gasa empapadas en IPA estéril al 70% u otro material que desprenda partículas no se deben usar para desinfectar los puntos de
entrada estériles de paquetes y dispositivos.
Limpieza y Vestimenta del Personal
t El personal debe ser también competente y estar muy motivado para desempeñar manipulaciones asépticas impecables con ingredientes, dispositi-
vos y componentes de las PME.
778 (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles/ Pruebas Físicas USP 40

Apéndice l. Competencias Principales, Condiciones, Prácticas y Garantías de Calidad

que se requieren (t "deben") y se recomiendan (:1: "debieran") en el Capítulo (797) de la USP (Continuación)
t El personal con prurito, quemaduras de sol, úlceras exudantes, conjuntivitis, infección respiratoria activa y cosméticos tiene prohibido preparar PME.
t El personal de preparación magistral debe retirarse los atuendos personales exteriores, cosméticos, uñas postizas, joyas de las manos, muñecas y
cuerpo que puedan interferir con el uso de batas y guantes; también debe retirarse los pirsins visibles por encima del cuello.
t Orden para asearse y vestir atuendo de preparación magistral en la antesala: zapatos y cubrecalzado, gorras y mascarillas que cubran la barba, más-
caras, limpieza de uñas, lavado y secado de manos y antebrazos, bata que no desprende partículas.
t Orden para asearse y calzarse los guantes en el cuarto o zona amortiguadora: lavado de manos con un producto de actividad persistente a base de
alcohol, dejar secar las manos, calzar guantes estériles.
t Desinfectar rutinariamente los guantes con IPA estéril al 70% después de tocar objetos no estériles.
t Inspeccionar los guantes para determinar que no estén agujereados y reemplazarlos cuando se detecten fallas.
t El personal repite los procedimientos apropiados después de exponerse a contaminación por contacto directo o aire inferior a ISO Clase 8.
t De estos requisitos están eximidos las PME de uso inmediato y los CAi para los cuales los fabricantes proporcionan documentación escrita, basada en
pruebas validadas, de que dichas prácticas no son necesarias para mantener la esterilidad en las PME.
Capacitación del Personal y Evaluación de la Competencia en Vestimenta, Prácticas Asépticas de Trabajo y Procedimientos de Limpieza y De-
sinfección
t El personal encargado de la preparación de las PME deberá recibir capacitación competente y a conciencia por parte de personal experto, con ayuda
de instrucción multimedia y publicaciones profesionales, sobre los principios teóricos y los conocimientos prácticos de los procedimientos de vesti-
menta, prácticas asépticas de trabajo, así como en la forma de conseguir y mantener condiciones ambientales ISO Clase 5 y procedimientos de lim-
pieza y desinfección.
t Esta capacitación se debe completar y documentar antes de que ningún miembro del personal comience a elaborar PME.
t El personal de preparación magistral debe completar la capacitación didáctica, aprobar las evaluaciones escritas de competencia, someterse a eva-
luaciones de destreza usando herramientas de auditoría de observación y pruebas de llenado de medios.
t Las pruebas de las destrezas asépticas de trabajo mediante el llenado de medios se efectúan inicialmente antes de comenzar a preparar PME y al
menos anualmente, en adelante, para preparaciones magistrales de nivel de riesgo bajo y mediano y semestralmente para preparaciones magistrales
de nivel de riesgo alto.
t El personal de preparación magistral que no pase las pruebas escritas o las auditorías de observación o cuyos viales de prueba de llenado de medios
tengan una o más unidades que muestren contaminación microbiana visible deberá recibir de inmediato una nueva capacitación y someterse a una
nueva evaluación a cargo de personal experto en preparación magistral, para asegurarse de que hayan corregido todas sus deficiencias en prácticas
asépticas de trabajo.
t El personal de preparación magistral debe pasar todas las evaluaciones antes de reiniciar la práctica de preparación magistral estéril.
t Además de la evaluación didáctica y llenado aséptico de medios, el personal de preparación magistral debe demostrar competencia en higiene apro-
piada de las manos, vestimenta y procedimientos de limpieza congruentes.
t Cuando los procedimientos de limpieza y desinfección los efectúa personal de apoyo, éste debe recibir de un experto calificado en preparación
magistral aséptica, capacitación cuidadosa en procedimientos apropiados de higiene de las manos, vestimenta, limpieza y desinfección.
t El personal de apoyo debe someterse rutinariamente a una evaluación de desempeño en la apropiada higiene de las manos, vestimenta y todos los
procedimientos de limpieza y desinfección, la que llevará a cab.o un experto calificado en preparación magistral aséptica.
Evaluación de Competencia en Vestimenta y Prácticas Asépticas de Trabajo
t El personal de preparación magistral debe ser evaluado inicialmente antes de comenzar la elaboración de PME y siempre que se efectúe un llenado
de medios aséptico, usando un Formulario para Evaluación de la Higiene de las Manos y Prácticas Relacionadas con la Vestimenta del Personal de
Preparación Magistral y los procedimientos de muestreo de las puntas de los dedos enguantados del personal.
Evaluación de la Práctica Aséptica de Trabajo por Medio de Muestreo de las Puntas de los Dedos Enguantados del Personal
t El monitoreo de las puntas de los dedos enguantados del personal de preparación magistral se debe efectuar para todos los niveles de riesgo de
elaboración de PME.
t El muestreo de las puntas de los dedos enguantados se debe utilizar para evaluar la competencia del personal en los procedimientos de higiene de
las manos y vestimenta, así como para educar al personal de preparación magistral en las prácticas de trabajo apropiadas.
t Todo el personal debe demostrar competencia en procedimientos apropiados de higiene de las manos y vestimenta, además de las prácticas asépti-
cas de trabajo.
t Las placas estériles de contacto con agar se deben usar para tomar las muestras de las puntas de los dedos enguantados del personal de preparación
magistral después de vestirse para evaluar la competencia en el uso de vestimenta y después de completar la preparación de llenado de medios.
t Los guantes no se deben desinfectar con IPA estéril al 70% inmediatamente antes de la toma de muestras.
Evaluación de Competencia en Uso de Vestimenta y Guantes
t El personal de preparación magistral debe ser inspeccionado visualmente durante el proceso de higiene de las manos y uso de vestimenta.
t La inspección visual debe documentarse en un Formulario para Evaluación de la Higiene de las Manos y Prácticas Relacionadas con la Vestimenta del
Personal de Preparación Magistral y conservarse para tener un registro permanente y una evaluación a largo plazo de la competencia del personal.
Muestreo de las Puntas de los Dedos Enguantados
t Inmediatamente después de que el preparador magistral completa el procedimiento de higiene de las manos y vestimenta, el evaluador debe reco-
lectar una muestra de la punta de los dedos y pulgar enguantados de ambas manos del preparador en placas de agar apropiadas, presionando lige-
ramente el agar con cada dedo.
t Las placas se deben incubar durante un período de incubación apropiado a la temperatura adecuada.
t Todos los empleados deben completar exitosamente una evaluación inicial de competencia y un procedimiento de muestreo de las puntas de los
dedos enguantados (cero ufc) no menos de tres veces antes de que se les permita comenzar a elaborar PME para uso humano.
USP 40 Pruebas Físicas/ (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles 779

Apéndice l. Competencias Principales, Condiciones, Prácticas y Garantías de Calidad

que se requieren (t "deben") y se recomiendan (:j: "debieran") en el Capítulo (797) de la USP (Continuación)
t Después de completar la evaluación inicial de competencia en el uso de vestimenta y guantes, se debe hacer una reevaluación de todo el personal
de preparación magistral al menos anualmente para PME de nivel de riesgo bajo y mediano y semestralmente para PME de nivel de riesgo alto antes
de permitírsele continuar elaborando PME.
t Los guantes no se deben desinfectar con IPA estéril al 70% antes de la prueba.
t Después de la toma de muestras, los guantes se deben desechar de inmediato y efectuar la higiene apropiada de las manos. Las placas con agar
nutritivo se deben incubar como se estipula más adelante.
t El nivel de acción de ufc para las manos enguantadas estará basado en la cantidad total de ufc en ambos guantes, no por cada mano.
:j: Los resultados se deben informar por separado como la cantidad de ufc por empleado por mano (mano izquierda, mano derecha).
Período de Incubación
t Al final del período de muestreo designado, las placas de agar se recuperan, se aseguran las tapas, se invierten e incuban a una temperatura y por un
tiempo que conduzca a la multiplicación de microorganismos. El agar tripticasa de soja (TSA) con lecitina y polisorbato 80 se debe incubar a 35º ± 2º
por 2 a 3 días.
Evaluación de la Competencia en Manipulación Aséptica
t Todo el personal de preparación magistral deberá someterse a la evaluación de su competencia en técnicas asépticas y prácticas relacionadas, inicial-
mente durante el procedimiento de prueba de llenado de medios, así como en los subsiguientes procedimientos de prueba de llenado de medios
anuales o semestrales, mediante el Formulario para Evaluación de Técnicas Asépticas y Prácticas relacionadas del Personal de Preparación Magistral.
Procedimiento de Prueba de Llenado de Medios
t La destreza del personal en la elaboración aséptica de PME se debe evaluar por medio de una verificación de llenado de medios líquidos de cultivo
bacteriano estéril.
t Los viales llenos de medio se deben incubar a 35º ± 2º durante un período de 14 días.
Muestreo y Evaluación de Limpieza y Desinfección de Superficies
t La toma de muestras de superficies se debe hacer en todas las áreas clasificadas ISO en forma periódica y por medio de placas de contacto y/o
hisopos, al momento de terminar la preparación magistral.
t Se deben definir los lugares donde se van a tomar muestras en un plano o formulario de muestreo.
Evaluación de Competencia en Limpieza y Desinfección
t Se debe inspeccionar visualmente al personal de preparación magistral y demás personal responsable de la limpieza durante el proceso de limpieza y
desinfección, durante la capacitación inicial del personal en los procedimientos de limpieza, durante los cambios de personal de limpieza y al termi-
nar cualquier Procedimiento de Prueba de Llenado de Medios.
t La inspección visual debe documentarse en un Formulario para Evaluación de Procedimientos de Limpieza y Desinfección y conservarse para tener
un registro permanente y una evaluación a largo plazo de la competencia del personal.
Métodos de Recolección en la Superficie
t Inmediatamente después de tomar la muestra de una superficie con la placa de contacto, el área muestreada se debe frotar cuidadosamente con un
paño que no desprenda partículas, empapado en IPA estéril al 70%.
:j: Los resultados se deben informar como ufc por unidad de área superficial.
Niveles de Acción, Documentación y Evaluación de Datos
t Los datos de muestreo ambiental se deben recolectar y revisar en forma periódica como una manera de evaluar el control general del ambiente de
preparación magistral.
t Si una actividad muestra sistemáticamente niveles elevados de crecimiento microbiano, se debe consultar el personal competente de microbiología.
t Se debe investigar la fuente de la contaminación.
t Cuando los resultados de la muestra de las puntas de los dedos enguantados exceden los niveles de acción después de la incubación apropiada, se
debe efectuar y documentar una revisión de los procedimientos de higiene de las manos y uso de vestimenta, así como de los procedimientos de
desinfección de guantes y superficies y las prácticas de trabajo.
:j: Cualquier recuento de ufc que exceda su respectivo nivel de acción debe dar lugar a una reevaluación de la idoneidad de las prácticas de trabajo del
personal, los procedimientos de limpieza y operativos y la eficacia de la filtración de aire dentro de las instalaciones en las que se elaboran preparacio-
nes magistrales asépticas.
PROCEDIMIENTOS OPERATIVOS ESTÁNDAR SUGERIDOS
t Todas las instalaciones deben contar con los mismos y los procedimientos deben incluir al menos los puntos enumerados en esta sección.
CONTROLES Y PRUEBAS DE LIBERACIÓN DE LAS PREPARACIONES TERMINADAS
Inspección de Formas Farmacéuticas en Solución y Revisión de los Procedimientos de Preparación Magistral
t Revisar procedimientos y documentos para garantizar la esterilidad, pureza, identidades y cantidades de ingredientes correctas, y estabilidad.
t Inspeccionar visualmente para determinar que no tenga partículas y color anormales, y que los envases y sellos estén intactos.
Pruebas de Esterilidad
t PME de nivel de riesgo alto preparadas en lotes de más de 25 envases idénticos o expuestas por más de 12 horas entre 2º y 8º y 6 horas a más de 8º
antes de ser esterilizadas.
Prueba de Endotoxinas Bacterianas (Pirógenos)
t PME de nivel de riesgo alto, excluyendo aquellas para administración oftálmica o inhalación, preparadas en lotes de más de 25 envases idénticos o
expuestas por más de 12 horas entre 2º y 8º y 6 horas a más de 8º antes de ser esterilizadas.
780 (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles/ Pruebas Físicas USP 40

Apéndice l. Competencias Principales, Condiciones, Prácticas y Garantías de Calidad

que se requieren (t "deben") y se recomiendan (:1: "debieran") en el Capítulo (797) de la USP (Continuación)
Verificación de la Identidad y Concentración de los Ingredientes
t Procedimientos escritos para verificar la identidad, calidad, cantidad y pureza correctas de los ingredientes usados en PME.
t Procedimientos escritos para garantizar que las etiquetas de las PME contengan los nombres correctos y las cantidades o concentraciones de ingre-
dientes, volúmenes totales, fechas límite de uso, condiciones de almacenamiento y vías de administración.
ALMACENAMIENTO Y FECHADO DE LÍMITE DE USO
Determinación de la Fecha Límite de Uso
t Usar los criterios generales del capítulo (795) de la USP en ausencia de ensayos directos indicadores de estabilidad o literatura autorizada que respal-
de la duración más prolongada.
MANTENIMIENTO DE LA ESTERILIDAD, PUREZA Y ESTABILIDAD DE LAS PME DISPENSADAS Y DISTRIBUIDAS.
t Procedimientos escritos para envasado, almacenamiento y condiciones de transporte apropiados para mantener la esterilidad, calidad, pureza y con-
tenido de las PME.
Redispensación de PME
t Cuando se pueden garantizar la esterilidad, pureza, contenido y calidad aceptables.
t La asignación de tiempos de almacenamiento en esterilidad y fechas límite de uso en estabilidad posteriores a las de las PME originalmente dispensa-
das debe basarse en resultados de pruebas de esterilidad y valoración cuantitativa de ingredientes.
Envase y Transporte de las PME
t El envase mantiene la integridad física, esterilidad, estabilidad y pureza de las PME.
t Modos de transporte que mantienen las temperaturas apropiadas y evitan daños a las PME.
CAPACITACIÓN DEL PACIENTE O PERSONA ENCARGADA DE SU CUIDADO
t Programa formal de capacitación en múltiples componentes para garantizar que los pacientes y las personas encargadas de su cuidado entienden el
almacenamiento, manipulación, uso y eliminación apropiados para las PME.
MONITOREO DEL PACIENTE E INFORME DE EVENTOS ADVERSOS
t Los procedimientos estándar escritos describen la manera en que los pacientes pueden preguntar e informar inquietudes y eventos adversos relacio-
nados con PME y, en el caso de los supervisores de preparación magistral, la forma de corregir y prevenir futuros problemas.
:j: Los eventos adversos y los defectos de las PME se informan a los programas MedWatch de la FDA y a MEDMARX de la USP.
GLOSARIO
t Se definen veintiocho términos que forman parte integral del cumplimiento con el capítulo (797) de la USP.

Apéndice 11. Desinfectantes Comunes Usados en la Atención de Salud para Superficies Inanimadas
y Dispositivos no Críticos y su Actividad Microbiana y Propiedades 1
Categoría Química del Desinfectante

Amonio
Cuaterna-
rlo (p.ej.,
Peróxido cloruro de Cloro Yodóforos
de dodecll di- (p.ej., hipo- (p.ej., po-
Alcohol hidrógeno metil amo- Fenóli- clorito de vi dona-yo-
lsopropíllco acelerado nio) cos sodio) do)
Concentra-
clón 0,4-1,6º/o 0,4- 100-5000 30-50
Usada 60-95% 0,5°/o 3 aq 1,60/oaq ppm ppm
Bacterias + + + + + +
Virus lipofílicos + + + + + +
In activación Virus hidrofílicos ± + ± ± + ±
Microbiana2 M. tuberculosis + + ± + + ±
Agentes micóticos (hongos) + + + + + ±
Esporas Bacterianas - - - - + -
1 Modificado de World Health Organization, Laboratory Bio Safety Manual 1983 y Rutala WA, "Antisepsis, disinfection and sterilization in the hospital and rela-
ted institutions," Manual of Clínica/ Microbiology, American Society far Microbiology, Washington, DC, 1995, páginas 227-245.
2 La inactivación de los microorganismos más comunes (es decir, bacterias) ocurre con un tiempo de contacto de $1 minuto; la inactivación de esporas requiere
tiempos de contacto más prolongados (p.ej., 5 a 1 O minutos para solución de cloro a 5000 ppm contra esporas de C. difficile). Referencia: Perez ], Springthorpe
VS, Sattar SA, "Activity of selected oxidizing microbicides against the spores of Clostridium difficile: Relevance to environmental control", American journal of lnfection
Control, August 2005, páginas 320-325.
3 El peróxido de hidrógeno acelerado pertenece a una nueva generación de germicidas basados en peróxido de hidrógeno en los cuales la potencia y el desem-
peño del ingrediente activo se ha mejorado y acelerado por medio del uso de ácidos y detergentes apropiados.
USP 40 Pruebas Físicas/ (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles 781

Apéndice 11. Desinfectantes Comunes Usados en la Atención de Salud para Superficies Inanimadas
y Dispositivos no Críticos y su Actividad Microbiana y Propiedades 1 (Continuación)
Categoría Química del Desinfectante

Amonio
Cuaterna-
rio (p.ej.,
Peróxido cloruro de Cloro Vodóforos
de dodecil di- (p.ej., hipo- (p.ej., po-
Alcohol hidrógeno metll amo- Fenóll- clorlto de vi dona-yo-
isopropílico acelerado nio) cos sodio) do)
Concentra-
clón 0,4-1,6°/o 0,4- 100-5000 30-50
Usada 60-95% 0,5°/o 3 aq 1,6°/o aq ppm ppm
Vida útil >1 semana + + + + + +
Efectos corrosivos o perjudiciales ± - - - ± ±
Residuo no evaporable - - + + - +
Propiedades
Físicas & lnactivado por materia orgánica + ± + ± + +
Químicas Irritante cutáneo ± - + + + ±
Importantes
Irritante ocular + - + + + +
Irritante respiratorio - - - - + -
Toxicidad sistémica + - + + + +
Clave para las abreviaturas y símbolos: aq =diluido en agua; ppm = partes por millón; +=sí; - = no; ± = resultados variables.
1 Modificado de World Health Organization, Laboratory Bio Safety Manual 1983 y Rutala WA, "Antisepsis, disinfection and sterilization in the hospital and rela-
ted institutions," Manual of Clinical Microbiology, American Society for Microbiology, Washington, DC, 1995, páginas 227-245.
2 La inactivación de los microorganismos más comunes (es decir, bacterias) ocurre con un tiempo de contacto de <::1 minuto; la inactivación de esporas requiere
tiempos de contacto más prolongados (p.ej., 5 a 1O minutos para solución de cloro a 5000 ppm contra esporas de C. diffici/e). Referencia: Perez f, Springthorpe
VS, Sattar SA, "Activity of selected oxidizing microbicides against the spores of Clostridium difficile: Relevance to environmental control", American fournal of lnfection
Control, August 2005, páginas 320-325.
3 El peróxido de hidrógeno acelerado pertenece a una nueva generación de germicidas basados en peróxido de hidrógeno en los cuales la potencia y el desem-
peño del ingrediente activo se ha mejorado y acelerado por medio del uso de ácidos y detergentes apropiados.

Apéndice 111. Formulario de Muestra para Evaluación de la Higiene de las Manos

y Prácticas Relacionadas con la Vestimenta del Personal de Preparación Magistral

Nombre en letras de imprenta y cargo o título de la persona evaluada: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ __

Nombre de la institución o instalación:

Higiene de las Manos y Prácticas de la Vestimenta: El evaluador calificado pondrá una marca de visto bueno en cada espacio en el que la persona
evaluada ha completado aceptablemente la actividad descrita, anotará N/A si la actividad no es aplicable a la sesión de evaluación o N/O si la activi-
dad no se observó.*

Se presenta aseado y con ropa limpia apropiada.

No usa cosméticos ni joyas (reloj, anillos, aretes, etc., incluidos pirsins) al entrar en las antesalas.
No lleva ni conserva alimentos o bebidas en las antesalas o zonas amortiguadoras.
Está consciente de la línea de demarcación que separa los lados limpios y sucios y observa las actividades requeridas.
Se pone el cubrecalzado o los zapatos destinados al área limpia, uno a la vez, colocando el pie cubierto o calzado en el lado limpio de la
línea de demarcación, según sea apropiado.
Utiliza mascarillas para cubrir la barba, de ser necesario.
Usa gorra y se asegura de que todo el cabello esté cubierto.
Se pone máscara para cubrir el puente de la nariz e incluir la barbilla.
Efectúa el procedimiento de higiene de manos humedeciendo las manos y antebrazos y lavándolos con agua tibia y jabón durante 30
segundos por lo menos.
Se seca las manos y los antebrazos con una toalla que no suelte pelusa o con un secador de manos.
Selecciona la bata de talla apropiada y revisa que no tenga agujeros, rasgones u otros defectos.
Se pone la bata y se asegura de que esté bien cerrada.
Se desinfecta las manos de nuevo con un exfoliante quirúrgico a base de alcohol, sin agua, y con actividad persistente, y las deja secar
completamente antes de ponerse los guantes estériles.
Calza guantes estériles del tamaño apropiado, asegurándose que queden bien ajustados y no sobre material del guante en las puntas de
los dedos.
782 (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles/ Pruebas Físicas USP 40

Apéndice 111. Formularlo de Muestra para Evaluación de la Higiene de las Manos

y Prácticas Relacionadas con la Vestimenta del Personal de Preparación Magistral (Continuación)
Examina los guantes, verificando que no tengan defectos, agujeros o rasgones.
Mientras desempeña actividades de preparación magistral estéril, desinfecta periódicamente los guantes con IPA estéril al 70% antes de
trabajar en el área directa de preparación magistral (ADP) y después de tocar artículos o superficies que podrían contaminar los guan-
tes.
Se quita el EPP en el lado limpio de la antesala.
Se quita los guantes y se higieniza las manos.
Se quita la bata y la descarta o la cuelga en un gancho si la va a reutilizar el mismo día de trabajo.
Se quita y descarta la máscara, gorra y mascarilla que protege la barba (si la usa).
Se quita el cubrecalzado o los zapatos, uno a la vez, asegurándose de colocar el pie descubierto en el lado sucio de la línea de demarca-
ción y se higieniza las manos nuevamente. (Se quita y desecha los cubrecalzado todas las veces que sale del área de preparación ma-
gistral).

*Se informa de inmediato a la persona evaluada todas las actividades inaceptables (es decir, los espacios donde falta el visto bueno, N/A o
N/O) y se le muestran e informan las correcciones específicas.

Firma de la Persona Evaluada Nombre en letra de imprenta Fecha

Firma del Evaluador Calificado Nombre en letra de imprenta Fecha

Apéndice IV. Formulario de Muestra para Evaluación de las Técnicas Asépticas

y Prácticas Relacionadas del Personal de Preparación Magistral

Nombre en letras de imprenta y cargo o título de la persona evaluada: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ __

Nombre de la institución o instalación:
------------------
Técnica Aséptica, Seguridad y Prácticas de Garantía de Calidad: El evaluador calificado pondrá una marca de visto bueno en cada espacio en el
que la persona evaluada ha completado aceptablemente la actividad descrita, anotará N/A si la actividad no es aplicable a la sesión de evaluación o
N/O si la actividad no se observó.*

Completa el Formulario de Evaluación de Competencia en Higiene de Manos y Procedimientos de Vestimenta.

Efectúa los procedimientos apropiados de higiene de manos, vestimenta y enguantado de acuerdo con los POE.
Desinfecta las superficies de los dispositivos ISO Clase 5 con un agente apropiado.
Desinfecta los componentes/viales con un agente apropiado antes de colocarlos en áreas de trabajo ISO Clase 5.
Introduce sólo los materiales esenciales en un orden apropiado en el área de trabajo ISO Clase 5.
No interrumpe, obstaculiza o desvía el flujo de primer aire a los sitios críticos.
Se asegura de que las jeringas, agujas y tubos permanezcan en su empaque individual y sólo se abran en un área de trabajo ISO Clase 5.
Efectúa las manipulaciones sólo en el ADP apropiada del dispositivo ISO Clase 5.
No expone los sitios críticos a contaminación por contacto o aire de calidad infeior a ISO Clase 5.
Desinfecta los tapones, los puertos de inyección y los cuellos de las ampollas, frotándolos con IPA estéril al 70% y los deja secar durante
el tiempo suficiente.
Fija las agujas a las jeringas sin contaminación por contacto.
Perfora los tapones de viales y conecta los puertos de infusión sin contaminación por contacto.
Etiqueta las preparaciones correctamente.
Desinfecta los guantes estériles en forma periódica, frotándolos con IPA estéril al 70% durante manipulaciones de preparación magistral
prolongadas.
Limpia, gradúa y calibra el dispositivo automatizado de preparación magistral (p.ej., "preparador magistral de NPT") de acuerdo con las
instrucciones del fabricante.
Desecha los elementos cortantes y desperdicios de acuerdo con las políticas institucionales o las guías reconocidas.

*Se informa de inmediato a la persona evaluada todas las actividades inaceptables (es decir, los espacios donde falta el visto bueno, N/A o
N/0) y se le muestran e informan las correcciones específicas.

Firma de la Persona Evaluada Nombre en letra de imprenta Fecha

USP 40 Pruebas Físicas/ (797) Preparación Magistral-Preparaciones Estériles 783

Apéndice IV. Formularlo de Muestra para Evaluación de las Técnicas Asépticas

y Prácticas Relacionadas del Personal de Preparación Magistral (Continuación)
Firma del Evaluador Calificado Nombre en letra de imprenta Fecha

Apéndice V. Formularlo de Muestra para Evaluación de Procedimientos de Limpieza y Desinfección

Nombre en letras de imprenta y cargo o título de la persona evaluada: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ __

Nombre de la institución o instalación:
------------------
Prácticas de Limpieza y Desinfección: El evaluador calificado pondrá una marca de visto bueno en cada espacio en el que la persona evaluada ha
completado aceptablemente la actividad descrita, anotará N/A si la actividad no es aplicable a la sesión de evaluación o N/0 si la actividad no se
observó.*

Tareas Diarias:
Prepara la concentración correcta de solución desinfectante de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Usa un envase apropiadamente etiquetado para el tipo de superficie que va a limpiar (piso, pared, tolvas de producción, etc.).
Documenta la preparación de solución desinfectante.
Sigue los procedimientos de vestimenta cuando efectúa cualquier actividad de limpieza.
Al comienzo de cada turno, limpia todos los dispositivos ISO Clase 5 antes de la preparación magistral, en el siguiente orden: paredes,
barra IV, preparadores magistrales automatizados y superficies de trabajo.
Utiliza un paño que no suelte pelusa, empapado en IPA estéril al 70% u otra solución desinfectante aprobada y deja secar por comple-
to.
Al final de cada turno, retira todos los componentes del preparador y limpia todas las áreas ISO Clase 5 como se especificó anteriormen-
te.
Limpia todos los mostradores y superficies de trabajo fácilmente limpiables.
Friega pisos, usando los trapeadores etiquetados como "pisos", comenzando en la pared opuesta a la puerta de entrada del cuarto, con
movimientos uniformes del trapeador, hacia el operador. Mueve los carros según sea necesario para limpiar toda la superficie del piso.
El uso de un sistema de limpieza de microfibra es una alternativa aceptable a los trapeadores.
En la antesala, limpia los lavabos y todas las superficies de contacto; limpia el piso con una solución desinfectante o usa un sistema de
limpieza de microfibra.

Tareas Mensuales:
Efectúa la limpieza mensual en un día designado. Prepara una solución desinfectante según se especificó en las tareas diarias, que es
apropiada para las superficies que se van a limpiar.
Limpia el cielo raso de las zonas amortiguadoras y las antesalas, las paredes y los estantes de almacenamiento con una solución desin-
fectante y un trapeador o un sistema de limpieza de microfibra.
Una vez que el área ISO Clase 5 está limpia, limpia el cielo raso del cuarto de preparación magistral, seguido de las paredes y por último
el piso. Usa los trapeadores o el sistema de limpieza de microfibra debidamente etiquetados.
Limpia todas las cajas y los estantes de almacenamiento de la zona amortiguadora, retirando el contenido y, usando un paño que no
suelte pelusa, empapado en detergente germicida, limpia las superficies internas de la caja y luego toda la superficie externa. Deja
secar las cajas. Antes de volver a poner el contenido dentro de las mismas, las frota con IPA estéril al 70% para quitar el residuo de
desinfectante. Usa paños nuevos de ser necesario.
Limpia todos los carros de la zona amortiguadora, retirando el contenido y usando paños que no suelten pelusa empapados en deter-
gente germicida, limpia todos los carros, comenzando desde el estante superior y la parte superior de la barra, avanzando hacia abajo,
hasta las ruedas. Limpia la parte de abajo de los estantes de la misma manera. Usa un paño nuevo para cada carro. Deja secar. Frota
los carros con un paño que no suelte pelusa, empapado en IPA estéril al 70% para quitar cualquier residuo de desinfectante. Usa paños
nuevos de ser necesario.
Limpia las sillas de la zona amortiguadora, el interior y exterior de los recipientes de basura, usando un paño que no suelte pelusa, em-
papado en solución desinfectante.
Documenta todas las actividades de limpieza anotando quién las efectuó, con fecha y hora.

*La persona evaluada es informada de inmediato de todas las actividades inaceptables (es decir, los espacios donde falta el visto bueno, N/A
o N/O) y se le muestran e informan las correcciones específicas.

Firma de la Persona Evaluada Nombre en letras de imprenta Fecha

Firma del Evaluador Calificado Nombre en letra de imprenta Fecha

784 (800) Fármacos Peligrosos-Manipulación / Pruebas Físicas USP 40

(800) FÁRMACOS PELIGROSOS-MANIPULACIÓN EN INSTALACIONES

DE CUIDADOS DE LA SALUD

(Este capítulo será oficial a partir del 1ºde julio de 201 B.)

1. INTRODUCCIÓN V ALCANCE

Este capítulo describe la práctica y las normas de calidad para la manipulación de fármacos peligrosos (HD, por sus siglas en
inglés) con el fin de promover la seguridad de pacientes, la seguridad de trabajadores y la protección ambiental. La manipula-
ción de HD incluye, entre otros aspectos, la recepción, el almacenamiento, la preparación magistral, la dispensación, la admi-
nistración y la eliminación de preparaciones y productos estériles y no estériles.
Este capítulo es aplicable a todo el personal de cuidados de la salud que manipula preparaciones de fármacos peligrosos y a
todas las entidades que almacenan, preparan, transportan o administran HD (p.ej., farmacias, hospitales y demás instituciones
de cuidados de la salud, clínicas de tratamiento de pacientes, consultorios médicos o consultorios veterinarios). El personal que
pudiera estar potencialmente expuesto a HD incluye, entre otros: farmacéuticos, técnicos de farmacias, personal de enferme-
ría, médicos, asistentes médicos, trabajadores de cuidados de la salud en el hogar, veterinarios y técnicos veterinarios.
Las entidades que manipulan HD deben incorporar las normas de este capítulo en su plan de seguridad laboral. El sistema
de gestión de salud y seguridad de la entidad debe incluir, como mínimo:
• Una lista de HD
• Controles de las instalaciones y de ingeniería
• Personal competente
• Prácticas de trabajo seguro
• Uso apropiado de Equipo de Protección Personal (PPE, por sus siglas en inglés)
• Políticas de aislamiento y eliminación de desechos de HD
Este capítulo se divide en las siguientes secciones principales:
1. Introducción y Alcance
2. Lista de Fármacos Peligrosos
3. Tipos de Exposición
4. Responsabilidades del Personal Que Manipula Fármacos Peligrosos
5. Controles de las Instalaciones y de Ingeniería
6. Calidad y Control Ambiental
7. Equipo de Protección Personal
8. Programa de Comunicación de Peligros
9. Capacitación del Personal
1O. Recepción
11. Etiquetado, Envasado, Transporte y Eliminación
12. Dispensación de Formas Farmacéuticas Finales
13. Preparación Magistral
14. Administración
15. lnactivación, Descontaminación, Limpieza y Desinfección
16. Control de Derrames
17. Documentación y Procedimientos Operativos Estándar
18. Vigilancia Médica
Glosario
Apéndices
Apéndice 1: Acrónimos en inglés usados en este capítulo
Apéndice 2: Ejemplos de Diseños de Áreas de Preparación Magistral de Fármacos Peligrosos
Apéndice 3: Tipos de Cabinas de Seguridad Biológica
Referencias

2. LISTA DE FÁRMACOS PELIGROSOS

El National lnstitute for Occupational Safety and Health (Instituto Nacional para la Seguridad y Salud Ocupacional o NIOSH,
por sus siglas en inglés) tiene una lista de antineoplásicos y otros HD usados en los cuidados de la salud. Toda entidad debe
mantener una lista de HD, la cual debe incluir todos los artículos en la lista NIOSH vigente que se manipulen en la entidad. La
lista de la entidad debe ser revisada como mínimo cada 12 meses. Siempre que se use un nuevo agente o forma farmacéutica,
éste deberá ser corroborado con la lista de la entidad.
USP 40 Pruebas Físicas/ (800) Fármacos Peligrosos-Manipulación 785

La lista NIOSH de antineoplásicos y otros HD provee los criterios usados para identificar HD. Estos criterios deben usarse para
identificar HD que ingresen al mercado luego de la versión más reciente de la lista NIOSH, o que sean manipulados en la enti-
dad como fármacos de investigación. Si se considera que la información disponible sobre un fármaco es insuficiente para to-
mar una decisión informada, el fármaco deberá considerarse peligroso hasta que se cuente con más información.
Casilla 1: Requisitos de Contención
• Los fármacos en la lista NIOSH que deben seguir los requisitos de este capítulo incluyen:
- Todos los ingredientes farmacéuticos activos de medicamentos peligrosos (HD API, por sus siglas en inglés)
- Todos los antineoplásicos que requieran manipulación como HD
• Los fármacos en la lista NIOSH que no tienen que cumplir con todos los requisitos de contención de este capítulo siempre que se realice e
implemente una evaluación de riesgos incluyen:
- Formas farmacéuticas finales de preparaciones magistrales de HD y productos de HD fabricados de manera convencional, incluidas las
formas farmacéuticas de antineoplásicos que no requieren ninguna manipulación adicional diferente al conteo o reenvasado (a menos
que así lo requiera el fabricante)
• Para las formas farmacéuticas de otros HD que se encuentran en la lista NIOSH, la entidad puede llevar a cabo una evaluación de riesgos para
determinar estrategias de contención y prácticas laborales alternativas

Algunas formas farmacéuticas de fármacos definidos como peligrosos pueden no significar un riesgo de exposición directa
en el lugar de trabajo debido a su formulación farmacéutica (p.ej., tabletas o cápsulas-sólidas, medicamentos intactos que se
administran a pacientes sin modificar la formulación). Sin embargo, el polvo de tabletas y cápsulas puede presentar un riesgo
de exposición por contacto con la piel y/o inhalación. Se puede llevar a cabo una evaluación de riesgos en estas formas farma-
céuticas para determinar estrategias de contención y/o prácticas laborales alternativas. Cuando no se lleve a cabo una evalua-
ción de riesgos, todos los HD deben manipularse usando todas las estrategias de contención definidas en este capítulo.
La evaluación de riesgos debe, como mínimo, tener en cuenta lo siguiente:
•Tipo de HD (p.ej., antineoplásico, no antineoplásico, únicamente de riesgo reproductivo)
• Forma farmacéutica
• Riesgo de exposición
•Envasado
• Manipulación
Si se adopta un enfoque de evaluación de riesgos, la entidad debe documentar las estrategias de contención y/o prácticas
laborales alternativas en uso para formas farmacéuticas específicas a fin de minimizar la exposición en el lugar de trabajo.
Cuando se utilice, la evaluación de riegos deberá ser revisada al menos cada 12 meses y dicha revisión deberá documentarse.

3. TIPOS DE EXPOSICIÓN
Las vías de ingreso no intencionales de HD al cuerpo incluyen absorción dérmica y por mucosas, inhalatoria, inyectable y por
ingestión (p.ej., alimentos contaminados, derrames o contacto bucal con manos contaminadas). Envases de HD que muestran
contaminación al momento de recibirlos. El personal clínico y no clínico puede estar expuesto a HD al manipular HD o superfi-
cies de contacto contaminadas. La Tabla 7 presenta ejemplos de vías potenciales de exposición basadas en el tipo de actividad.
Tabla 1. Ejemplos de Oportunidades Potenciales de Exposición Basadas en el tipo de Actividad
Actividad Oportunidad Potencial de Exposición
• Contacto con residuos de HD presentes en envases de medicamentos, unidades de dosificación individuales, en-
Recepción vases externos, superficies de trabajo o pisos
Dispensación • Conteo o reenvasado de tabletas y cápsulas
• Triturado o fraccionamiento de tabletas o apertura de cápsulas
• Vertido de líquidos orales o tópicos de un envase a otro
• Pesada o mezclado de componentes
• Constitución o reconstitución de HD en polvo o liofilizados
• Retiro o dilución de HD inyectables de envases parenterales
• Expulsión de aire o HD de jeringas
• Contacto con residuo de HD presentes en el PPE u otras vestimentas
• lnactivación, descontaminación, limpieza y desinfección de áreas contaminadas o que se sospecha están canta-
Preparación magistral y minadas con HD
otras manipulaciones • Actividades de mantenimiento para equipos y dispositivos potencialmente contaminados
• Generación de aerosoles durante la administración de HD por diversas vías (p.ej., inyección, irrigación, oral, inha-
lación o aplicación tópica)
• Realizar ciertos procedimientos especializados (p.ej., inyección intraperitoneal intraoperatoria o instilación vesi-
cal)
Administración • Cebado de un set de administración intravenosa (IV, por sus siglas en inglés)
Actividades de cuidado del • Manipulación de fluidos corporales (p.ej., orina, heces, sudor o vómito) o vestimenta, vendajes, ropa blanca y
paciente otros materiales contaminados con fluidos corporales
Derrames • Generación, manejo y eliminación de derrames
Transporte • Transporte de HD dentro de un establecimiento de cuidados de la salud
Desechos • Recolección y eliminación de desechos peligrosos y rastreo de desechos contaminados
786 (800) Fármacos Peligrosos-Manipulación / Pruebas Físicas USP 40

4. RESPONSABILIDADES DEL PERSONAL QUE MANIPULA FÁRMACOS PELIGROSOS

Todas las entidades deben tener una persona designada que esté calificada y capacitada para que sea responsable del desa-
rrollo y la implementación de procedimientos apropiados; de supervisar en la entidad el cumplimiento de este capítulo u otras
leyes, reglamentaciones y normas aplicables; de asegurar la competencia del personal; y de asegurar el control ambiental de
las áreas de almacenamiento y preparación magistral. La persona designada deberá entender cabalmente los fundamentos de
las políticas de prevención de riesgos, los riesgos para sí mismo y para los demás, los riesgos derivados de incumplimientos que
pueden comprometer la seguridad, así como la responsabilidad de informar al equipo directivo sobre cualquier situación po-
tencialmente peligrosa. La persona designada también debe ser responsable de supervisar el monitoreo de las instalaciones y
generar informes sobre los análisis/muestreos realizados en las mismas, y de tomar medidas dependiendo de los resultados.
Todo el personal que manipula HD es responsable de entender las prácticas y precauciones fundamentales, así como de la
evaluación continua de dichos procedimientos y de la calidad de los HD finales para prevenir daños a los pacientes, minimizar
la exposición del personal y minimizar la contaminación del ambiente en el lugar de trabajo y donde se proveen cuidados a los
pacientes.

Cambio en la redacción:

5. INSTALACIONES Y CONTROLES DE INGENIERÍA

Los HD deben manipularse en condiciones que promuevan la seguridad del paciente, la seguridad del trabajador y la protec-
ción ambiental. Debe haber suficientes señalizaciones que especifiquen los peligros de manera prominente antes del ingreso a
las áreas de manipulación de HD. El acceso a las áreas en las que se manipulan HD debe estar restringido únicamente al perso-
nal autorizado a fin de proteger a las personas no implicadas en la manipulación de HD. Las áreas de manipulación de HD
deben estar alejadas de las áreas de descanso y de comida del personal, pacientes o visitantes a fin de reducir el riesgo de
exposición.
Se debe contar con áreas designadas para:
• Recepción y desempacado
•Almacenamiento de HD
• Preparación magistral de HD no estériles (si se realiza en la entidad)
• Preparación magistral de HD estériles (si se realiza en la entidad)
Se requiere que algunas áreas tengan presión negativa con respecto a las áreas aledañas para contener HD y minimizar el
riesgo de exposición. Se debe considerar la disponibilidad de fuentes de energía ininterrumpida (UPS, por sus siglas en inglés)
para que los sistemas de ventilación mantengan la presión negativa en caso de pérdida de energía.

5.1 Recepción

Los HD antineoplásicos y todos los ingredientes farmacéuticos activos (API, por sus siglas en inglés) de HD deben ser desem-
pacados (es decir, retirados de los envases externos de transporte) en un área neutra/normal o con presión negativa con res-
pecto a las áreas aledañas. Los HD no deben desempacarse de sus envases de transporte externos en áreas de preparación
magistral estéril o en áreas con presión positiva.

5.2 Almacenamiento

Los HD deben almacenarse de forma tal que se eviten derrames o ruptura en casos de caída de los envases. No se deben
almacenar HD en el piso. En las áreas propensas a tipos específicos de desastres naturales (p.ej., terremotos) la forma de alma-
cenamiento debe cumplir con las precauciones de seguridad aplicables, tales como estantes fijos con bordes frontales eleva-
dos.
Los HD antineoplásicos que requieren una manipulación distinta al conteo o reenvasado de formas farmacéuticas finales y
cualquier API de HD peligrosos deben almacenarse separados de fármacos no peligrosos de modo tal que se prevenga la con-
taminación y la exposición del personal. Estos HD deben almacenarse en un cuarto con presión negativa y ventilación externa
con al menos 12 cambios de aire por hora (ACPH, por sus siglas en inglés). Los HD no anti neoplásicos, los que presentan úni-
camente riesgo reproductivo y las formas farmacéuticas finales de HD anti neoplásicos pueden almacenarse con otros artículos
cuando así lo permita la política de la entidad.
Los HD estériles y no estériles pueden almacenarse juntos, pero los HD usados en la preparación magistral no estéril no de-
ben almacenarse en áreas designadas para preparación magistral estéril a fin de minimizar el tráfico en el área de preparación
magistral estéril.
Los HD antineoplásicos refrigerados deben almacenarse en un refrigerador destinado para ese fin en un área con presión
negativa con al menos 12 ACPH [p.ej., cuarto de almacenamiento, zona amortiguadora o área de contención segregada para
elaboración de preparaciones magistrales (C-SCA, por sus siglas en inglés)]. Si un refrigerador se coloca en una zona amorti-
guadora con presión negativa, se debe considerar el uso de un escape ubicado al lado del compresor del refrigerador y detrás
del refrigerador.
USP 40 Pruebas Físicas/ (800) Fármacos Peligrosos-Manipulación 787

5.3 Preparación Magistral

Se requieren controles de ingeniería para proteger la preparación de contaminación cruzada y de contaminación microbiana
(si la preparación está destinada a ser estéril) durante todas las fases del proceso de preparación magistral. Los controles de
ingeniería para contención se dividen en tres categorías que representan los niveles de control primario, secundario y suple-
mentario. Un control de ingeniería primario de contención (C-PEC, por sus siglas en inglés) es un dispositivo ventilado diseña-
do para minimizar la exposición del trabajador y del ambiente a HD durante la manipulación directa de los mismos. El control
de ingeniería secundario de contención (C-SEC, por sus siglas en inglés) es el cuarto en el que se coloca el C-PEC. Los controles
de ingeniería suplementarios [p.ej., dispositivo para transferencia de fármacos de sistema cerrado (CSTD, por sus siglas en in-
glés)] son controles auxiliares que ofrecen niveles adicionales de protección. El Apéndice 2 provee ejemplos de diseños de áreas
de preparación magistral de HD.
La preparación magistral de HD estériles y no estériles debe realizarse dentro de un C-PEC localizado dentro de un C-SEC. El
C-SEC usado para la preparación magistral estéril y no estéril debe:
•Contar con ventilación externaflii~R~(oJ2J¿1''2.l!it>l
• Estar separado físicamente (es decir, en un cuarto diferente de las otras áreas de preparación)
• Contar con un intercambio de aire apropiado (p.ej., ACPH)
•Tener una presión negativa de entre 0,01 y 0,03 pulgadas de columna de agua con respecto a las áreas adyacentes
El C-PEC debe operar continuamente cuando provee presión negativa de manera parcial o total al C-SEC, o si se usa para la
preparación magistral estéril. Si se presenta una pérdida de energía en el C-PEC, o si se requiere una reparación o mudanza, se
deben suspender de inmediato todas las actividades que se lleven a cabo en el C-PEC. En caso necesario, se debe proteger la
unidad cubriéndola apropiadamente de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Una vez que se pueda reencender el
C-PEC, se deben descontaminar, limpiar y desinfectar (si se usa para preparación magistral estéril) todas las superficies y espe-
rar a que transcurra el tiempo de recuperación especificado por el fabricante antes de reiniciar la preparación magistral.
Se debe contar con un lavabo para lavarse las manos. Además, se debe tener fácil acceso a una estación de lavado de ojos
y/u otras precauciones de emergencia o seguridad que cumplan con las leyes y reglamentaciones aplicables. Se debe tener
cuidado de ubicar fuentes de agua y drenajes en áreas en las que su presencia no interfiera con las clasificaciones ISO requeri-
das. Las fuentes de agua y los drenajes deben ubicarse a una distancia de al menos 1 metro del C-PEC.
En el caso de las entidades que hacen preparaciones magistrales de HD estériles y no estériles, los C-PEC respectivos deben
ubicarse en cuartos separados, a menos que dichos C-PEC usados para la preparación magistral no estéril sean suficientemente
efectivos para que el cuarto pueda conservar continuamente la clasificación ISO 7 durante toda la actividad de preparación
magistral no estéril. Si los C-PEC usados para preparación magistral estéril y no estéril se ubican en el mismo cuarto, deben
estar separados a una distancia de al menos 1 metro y no se deben realizar actividades que generen partículas cuando se esté
llevando a cabo un proceso de preparación magistral estéril.

5.3.1 PREPARACIÓN MAGISTRAL NO ESTÉRIL

Además de las disposiciones de este capítulo, la preparación magistral no estéril debe seguir las normas del capítulo Prepara-
ción Magistral-Preparaciones No Estériles (795). No se requiere un C-PEC cuando las manipulaciones se limiten a la manipula-
ción de las formas farmacéuticas finales (p.ej., conteo o reenvasado de tabletas y cápsulas) que no produzcan partículas, aero-
soles o gases.
Los C-PEC usados para la manipulación de HD no estériles deben contar con ventilación externa (de preferencia) o con fil-
tros HEPA redundantes en serie. La preparación magistral no estéril de HD debe realizarse en un C-PEC que provea protección
del personal y del ambiente, tal como una Cabina de Seguridad Biológica (BSC, por sus siglas en inglés) Clase 1 o un Recinto
Ventilado de Contención (CVE, por sus siglas en inglés). También se puede usar una BSC Clase 11 o un aislador de contención
aséptico para preparación magistral (CACI, por sus siglas en inglés). Para la preparación ocasional de preparaciones magistral
es de HD, se puede usar un C-PEC usado para preparación magistral estéril (p.ej., BSC Clase 11 o CACI) pero debe descontami-
narse, limpiarse y desinfectarse antes de reiniciar la preparación magistral estéril en dicho C-PEC. Un C-PEC que se usa única-
mente para preparación magistral no estéril no requiere flujo de aire unidireccional debido a que el ambiente crítico no requie-
re clasificación ISO.
El C-PEC debe colocarse en un C-SEC que tenga al menos 12 ACPH. La Tabla 2 resume los controles de ingeniería requeridos
para la preparación magistral no estéril de HD.
Debido a la dificultad que implica la limpieza de contaminación por HD, las superficies de cielos rasos, paredes, pisos, mobi-
liario fijo, estantes, mostradores y gabinetes en el área de preparación magistral no estéril deben ser lisas, impermeables, no
deben tener grietas ni fisuras y no deben desprender partículas.
Tabla 2. Controles de Ingeniería para la Preparación Magistral de HD No Estéril
C-PEC Requisitos para el C-SEC
• Ventilación externa
• Ventilación externa (de preferencia) o filtración HEPA redundante • 12 ACPH
en serie • Presión negativa de entre 0,01 y 0,03 pulgadas de columna de
• Ejemplos: CVE, BSC Clase 1 o 11, CACI agua con respecto a las áreas adyacentes
788 (800) Fármacos Peligrosos-Manipulación / Pruebas Físicas USP 40

5.3.2 PREPARACIÓN MAGISTRAL ESTÉRIL

Además de este capítulo, la preparación magistral debe seguir las normas del capítulo (797).
Todos los C-PEC usados para la manipulación de HD estériles deben tener ventilación externa. La preparación magistral esté-
ril de HD debe realizarse en un C-PEC que provea una calidad de aire ISO Clase 5 o mejor, tal como una BSC Clase 11 o 111 o un
CACI. Las BSC Clase 11 de tipo A2, B1 o B2 son aceptables. Para la mayoría de los HD conocidos, las cabinas tipo A2 ofrecen
una integración simple y confiable con los requisitos de ventilación y presurización del C-SEC. Las BSC Clase 11 tipo B2 por lo
regular están reservadas para uso con componentes volátiles. El Apéndice 3 describe los diferentes tipos de BSC.
No se deben usar cabinas de flujo laminar (LAFW, por sus siglas en inglés) o aisladores asépticos para preparación magistral
(CAi, por sus siglas en inglés) de un HD antineoplásico. Una BSC o CACI usado para la preparación de HD no debe usarse para
la preparación de un fármaco no peligroso a menos que la preparación del fármaco no peligroso se coloque dentro de un
envoltorio externo protector al retirarlo del C-PEC y a menos que se le coloque una etiqueta de precaución con respecto al uso
de PPE durante la manipulación.
El C-PEC debe ubicarse en un C-SEC, el cual puede ser una zona amortiguadora ISO Clase 7 con una antesala ISO Clase 7
(preferida) o un área de contención segregada para preparación magistral (C-SCA) sin clasificar. Si el C-PEC se coloca en un
C-SCA, la fecha límite de uso (FLU) de todas las preparaciones magistrales estériles (CSP, por sus siglas en inglés) debe limitarse
conforme a lo descrito en el capítulo (797) para CSP preparadas en un área de preparación magistral segregada. La Tabla 3
resume los controles de ingeniería requeridos para preparación magistral estéril de HD.
Tabla 3. Controles de Ingeniería para Preparación Magistral de HD Estéril
Configuración C-PEC C-SEC FLU máxima
• Ventilación externa
• 30 ACPH
• Presión negativa de entre
• Ventilación externa 0,01 y 0,03 pulgadas de
Zona amortiguadora ISO Clase 7 • Ejemplos: BSC Clase 11 columna de agua con res- Según se describe en el capítulo
con antesala ISO Clase 7 CACI pecto a las áreas adyacentes (797)
• Ventilación externa
• 12 ACPH
• Presión negativa de entre Según se describe en el capítulo
• Ventilación externa 0,01 y 0,03 pulgadas de (797) para CSP preparadas en un
• Ejemplos: BSC Clase 11 columna de agua con res- área de preparación magistral se-
C-SCA sin clasificación CACI pecto a las áreas adyacentes gregada

Zona amortiguadora ISO Clase 7 con antesala ISO Clase 7: El C-PEC se ubica en una zona amortiguadora ISO Clase 7 con
paredes fijas, suministro de aire filtrado por HEPA, presión negativa de entre 0,01 y 0,03 pulgadas de columna de agua con
respecto a todas las áreas adyacentes y un mínimo de 30 ACPH.
La zona amortiguadora debe tener ventilación externa. Debido a que el cuarto a través del cual se ingresa a la zona amorti-
guadora de HD (p.ej., antesala o zona amortiguadora de fármacos no peligrosos) desempeña un papel importante con respec-
to al control total de contaminación, se requiere contar con lo siguiente:
• Un mínimo de 30 ACPH de suministro de aire filtrado por HEPA
• Mantener una presión positiva de al menos 0,02 pulgadas de columna de agua con respecto a todas las áreas adyacentes
sin clasificación
• Mantener una calidad de aire ISO Clase 7 o mejor
Se requiere una antesala ISO Clase 7 con paredes fijas para proveer una migración interna de aire que tenga la misma lim-
pieza de aire clasificada hacia el interior de la zona amortiguadora con presión negativa para poder contener cualquier HD
transportado por el aire. Se debe colocar un lavamanos en la antesala al menos a 1 metro de distancia de la entrada a la zona
amortiguadora de HD para evitar la migración de contaminación hacia el interior de la zona amortiguadora de HD con presión
negativa.
Aunque no es un diseño de instalación recomendado, si el ingreso a la zona amortiguadora de HD con presión negativa es a
través de la zona amortiguadora de fármacos no peligrosos con presión positiva, también se requiere lo siguiente:
• Se debe definir una línea de demarcación dentro de la zona amortiguadora con presión negativa para ponerse y quitarse
el PPE
• Un método para transportar HD, CSP de HD y desechos de HD dentro y fuera de la zona amortiguadora con presión ne-
gativa para minimizar la difusión de contaminación por HD. Esto se puede lograr usando una cabina de transferencia en-
tre el área de amortiguación con presión negativa y el espacio adyacente. La cabina de transferencia de materiales debe
incluirse en la certificación de la instalación para asegurar de que las partículas no comprometan la calidad del aire de la
zona amortiguadora con presión negativa. No se debe usar una cabina de transferencia de materiales refrigerada. Se pue-
den usar otros métodos de contención (tales como envases sellados).
Las CSP de HD preparadas en una zona amortiguadora ISO Clase 7 con una antesala ISO Clase 7 pueden usar las FLU descri-
tas en el capítulo (797), basándose en las categorías de preparación magistral estéril, prueba de esterilidad y temperatura de
almacenamiento.
USP 40 Pruebas Físicas/ (800) Fármacos Peligrosos-Manipulación 789

Área de contención segregada para preparación magistral (C-SCA): El C-PEC se coloca en un C-SCA sin clasificación que
tenga paredes fijas, una presión negativa de entre 0,01 y 0,03 pulgadas de columna de agua con respecto a todas las áreas
adyacentes y un mínimo de 12 ACPH. El C-SCA debe contar con ventilación externa. Se debe colocar un lavamanos a una
distancia de al menos 1 metro del C-PEC y puede estar dentro del C-SCA o directamente afuera del C-SCA.
Sólo pueden hacerse CSP de HD de nivel de riesgo bajo y medio en un C-SCA. Las CSP de HD hechas en el C-SCA no deben
exceder las FLU descritas en el capítulo (797) para CSP hechas en un área de preparación magistral segregada.

5.4 Controles de Ingeniería Suplementarios para Contención

Los controles de ingeniería suplementarios para contención, tales como los CSTD, proveen controles adjuntos para ofrecer
un nivel adicional de protección durante la preparación magistral o la administración. Se ha demostrado que algunos CSTD
limitan el potencial de generación de aerosoles durante la preparación magistral. Sin embargo, no se tiene la certeza de que
todos los CSTD tendrán un desempeño adecuado. Hasta que se encuentre disponible una norma universal de desempeño pu-
blicada para la evaluación de la contención de un CSTD, los usuarios deben evaluar cuidadosamente las declaraciones de de-
sempeño relacionadas con los CSTD disponibles basándose en estudios de referencia independientes y en la reducción demos-
trada de la contención.
Un CSTD no debe usarse como un sustituto de un C-PEC durante la preparación magistral. Los CSTD deben usarse al prepa-
rar magistralmente HD cuando así lo permita la forma farmacéutica. Los CSTD deben usarse al administrar HD anti neoplásicos
cuando así lo permita la forma farmacéutica. Los CSTD que sean física o químicamente incompatibles con un HD específico no
deberán usarse para dicho HD.

6. CALIDAD Y CONTROL AMBIENTAL

El muestreo ambiental con paños para residuos de HD en superficies debe realizarse de forma rutinaria (p.ej., inicialmente
como punto de referencia y al menos cada 6 meses, o con mayor frecuencia según se requiera, para verificar la contención). El
muestreo de superficies con paños debe incluir:
• El interior del C-PEC y el equipo en su interior
• Cabinas de transferencia de materiales
• Superficies en áreas de preparación o de trabajo cerca del C-PEC
• Áreas adyacentes a los C-PEC (p.ej., los pisos directamente debajo del C-PEC, de las áreas de preparación y dispensación)
• Las áreas inmediatamente aledañas a la zona amortiguadora de HD o al C-SCA
• Las áreas de administración en pacientes
En la actualidad, no existen estudios que demuestren la efectividad de un número o tamaño específico de muestras de pa-
ños para la determinación de niveles de contaminación por HD. Los kits de muestreo con paños deben verificarse antes de su
uso para asegurar de que el método y el reactivo usados hayan sido probados para la recuperación de un porcentaje específico
de fármacos marcadores conocidos en diversos tipos de superficies encontradas en el área muestreada. En la actualidad, no
existen agencias certificadoras para proveedores de kits de muestreo con paños.
Asimismo, en la actualidad no existe un estándar de límites aceptables de contaminación de superficies por HD. Los HD mar-
cadores comunes que pueden valorarse incluyen ciclofosfamida, ifosfamida, metotrexato, fluorouracilo y fármacos que contie-
nen platino. Un ejemplo de contaminación medible serían niveles de ciclofosfamida >1,00 ng/cm 2, los cuales algunos estudios
demostraron tener como consecuencia la captación del fármaco en trabajadores expuestos. Si se encuentra cualquier contami-
nación medible, la persona designada debe identificar, documentar y contener la causa de la contaminación. Dicha acción
puede incluir la reevaluación de prácticas laborales, la recapacitación del personal, el llevar a cabo una inactivación minuciosa,
la descontaminación, la limpieza y el mejoramiento de los controles de ingeniería. Repetir el muestreo con paños para validar
la inactivación/descontaminación y que los pasos de limpieza hayan sido efectivos.

7. EQUIPO DE PROTECCIÓN PERSONAL

El Equipo de Protección Personal (PPE) provee protección al trabajador para reducir la exposición a aerosoles y residuos de
HD. El PPE adicional puede ser necesario para manipular los HD fuera de un control de ingeniería primaria de contención, por
ejemplo, al tratar a un paciente o al limpiar un derrame. La lista NIOSH de anti neoplásicos y otros HD provee una guía general
sobre PPE para escenarios potenciales que pueden presentarse en entornos de cuidados de la salud. No se debe reusar el PPE
desechable. El PPE reusable debe descontaminarse y limpiarse después de su uso.
Se requieren batas, cubrepelo, cubrecabezas y cubrecalzado, así como dos pares de guantes para quimioterapia para la pre-
paración magistral de HD estériles y no estériles. Asimismo, se requieren dos pares de guantes para quimioterapia para la ad-
ministración de HD antineoplásicos. Al administrar HD antineoplásicos inyectables, se requieren batas con resistencia demos-
trada a la permeabilidad de los mismos. Para todas las demás actividades, el Procedimiento Operativo Estándar (SOP, por sus
siglas en inglés) de la entidad debe describir el PPE apropiado que debe ser usado basándose en su plan de seguridad ocupa-
cional y en la evaluación de riesgos (cuando se utilice). La entidad debe desarrollar SOP para PPE basándose en el riesgo de
exposición (ver Tipos de Exposición) y en las actividades realizadas.
790 (800) Fármacos Peligrosos-Manipulación / Pruebas Físicas USP 40

Se debe usar el PPE adecuado durante la manipulación de HD que incluye lo siguiente:

•Recepción
•Almacenamiento
•Transporte
• Preparación Magistral (estéril y no estéril)
• Administración
• lnactivación/descontaminación, limpieza y desinfección
• Control de derrames
• Eliminación de desechos

7.1 Guantes

Cuando se requieren guantes para quimioterapia, estos deberán cumplir con la norma D6978 (o su sucesora) de la American
Society for Testing and Materials (Sociedad Estadounidense de Análisis y Materiales o ASTM). Los guantes para quimioterapia
deben usarse para la manipulación de todos los HD, incluyendo los HD no antineoplásicos y los que presentan únicamente
riesgos reproductivos. Los guantes para quimioterapia deben estar exentos de polvo debido a que el polvo puede contaminar
el área de trabajo y puede adsorber y retener HD. Los guantes deben ser inspeccionados para detectar defectos físicos antes de
su uso. No usar guantes con orificios de alfiler o puntos débiles.
Cuando se usan para la preparación magistral estéril, los guantes para quimioterapia externos deben ser estériles. Los guan-
tes para quimioterapia deben cambiarse cada 30 minutos, a menos que la documentación del fabricante recomiende algo dis-
tinto, y deben cambiarse cuando presenten daños, orificios o contaminación. Las manos deben lavarse con jabón y agua des-
pués de retirarse los guantes.

7.2 Batas

Cuando se requieran batas, éstas deben ser desechables y tener una resistencia demostrada a la permeabilidad de los HD.
Las batas deben seleccionarse basándose en los HD manipulados. Las batas desechables fabricadas con polipropileno recubier-
to de polietileno u otros materiales laminados ofrecen mejor protección que aquellas hechas de materiales sin recubrimiento.
Las batas deben cerrarse por la espalda (es decir, no abrirse por el frente), deben ser de mangas largas y con puños cerrados
elásticos o tejidos. Las batas no deben tener costuras ni cierres que pudieran permitir el paso de HD.
Las batas de laboratorio de tela, las batas para cirugía, las batas de aislamiento y otros materiales absorbentes no son vesti-
mentas de protección apropiadas para manipular HD debido a que pueden permitir la impregnación de los HD y mantener los
fármacos derramados en contacto con la piel, lo cual incrementa la exposición. La vestimenta también puede retener residuos
de HD derivados del contacto y puede transferirlos a otros trabajadores de cuidados de la salud o a distintas superficies. El
lavado de vestimentas no desechables contaminadas con residuos de HD debe realizarse únicamente de conformidad con la
política del establecimiento, debido a que el residuo de los medicamentos podría ser transferido a otras vestimentas. Las vesti-
mentas potencialmente contaminadas no deben ser llevadas al hogar bajo ninguna circunstancia.
Las batas deben ser reemplazadas de conformidad con la información del fabricante sobre la impregnación de las batas. Si
no se cuenta con información sobre impregnación para las batas en uso, se deben cambiar cada 2-3 horas o inmediatamente
después de un derrame o salpicadura. Las batas usadas en las áreas de manipulación de HD no deben ser usadas en otras áreas
a fin de evitar la diseminación de contaminación por HD y la exposición de otros trabajadores de cuidados de la salud.

7.3 Cubrecabeza, cubrepelo, cubrecalzado y cubremangas

Los cubrecabeza y cubrepelo (incluyendo los cubrebarbas y cubrebigotes, para casos apropiados), los cubrecalzado y los cu-
bremangas proveen protección contra el contacto con residuos de HD. Durante la preparación magistral de HD, se debe usar
un segundo par de cubrecalzado antes de entrar al C-SEC y debe retirarse al salir del C-SEC. El cubrecalzado usados en las
áreas de manipulación de HD no deben ser usados en otras áreas para evitar la contaminación con HD y la exposición de otros
trabajadores de cuidados de la salud.
Los cubremangas desechables pueden usarse para proteger las áreas del brazo que pudieran entrar en contacto con HD. Los
cubremangas desechables fabricados con polipropileno recubierto de polietileno u otros materiales laminados ofrecen una me-
jor protección que los fabricados con materiales no recubiertos.

7.4 Protección de Ojos y Cara

Muchos HD son irritantes para los ojos y las membranas mucosas. Se debe usar protección adecuada para ojos y cara siem-
pre que exista riesgo de derrames o salpicaduras de HD o de materiales de desecho de HD al trabajar fuera de un C-PEC (p.ej.,
administración en la sala de cirugía, al trabajar por encima o al nivel de los ojos o al limpiar un derrame). Un respirador que
cubre toda la cara provee protección para ojos y cara. Se deben usar gafas de seguridad siempre que se requiera protección
para los ojos. Los anteojos o gafas de seguridad con barreras laterales no protegen adecuadamente los ojos de las salpicaduras.
USP 40 Pruebas Físicas/ (800) Fármacos Peligrosos-Manipulación 791

Los protectores para cara en combinación con gafas de seguridad proveen un rango completo de protección contra salpicadu-
ras a la cara y ojos. Los protectores de cara solos no proveen protección completa para ojos y cara.

7.5 Protección Respiratoria

El personal que desempaca HD que no están envasados en plástico deben usar una media máscara elastomérica con un car-
tucho multigas y un filtro Pl 00 hasta que se pueda realizar la evaluación de la integridad del envase para asegurarse de que no
hayan ocurrido roturas o derrames durante el transporte. Si el tipo de fármaco puede definirse de mejor manera, se puede usar
un cartucho más adecuado para éste.
Las máscaras quirúrgicas no proveen protección respiratoria a la exposición a fármacos y no deben usarse cuando se requie-
ra protección respiratoria en la exposición a HD. Un respirador quirúrgico N95 provee la protección respiratoria de un respira-
dor N95 y, al igual que una máscara quirúrgica, provee una barrera contra salpicaduras, gotitas y aerosoles alrededor de la
nariz y boca.
Para la mayoría de las actividades que requieren protección respiratoria, resulta suficiente un respirador N95 certificado por
el NIOSH con prueba de ajuste o un respirador que proteja más contra partículas aéreas. Sin embargo, los respiradores N95 no
ofrecen protección contra gases y vapores, y ofrecen una protección mínima contra salpicaduras directas de líquidos (ver la
Respirator Trusted-Source lnformation [Información de Fuentes confiables en Respiradores] de los Centers for Disease Control
and Prevention [Centro para el Control y la Prevención de Enfermedades o CDC]).
Se debe comprobar la aptitud del respirador y capacitar a los trabajadores en el uso de protección respiratoria. Se deben
seguir todos los requisitos de la norma de protección respiratoria (Título 29 del CFR 1910.134) de la Occupational Safety and
Health Administration (Administración de Seguridad y Salud en el Lugar de Trabajo u OSHA, por sus siglas en inglés). Se debe
usar un respirador de máscara completa apropiado tipo cartucho para químicos o un respirador con purificación de aire a mo-
tor (PAPR, por sus siglas en inglés) cuando exista riesgo de exposición respiratoria a HD, incluyendo los siguientes casos:
•Atender derrames de HD mayores que los que se pueden contener con un kit para derrames
• lnactivar, descontaminar y limpiar debajo de la superficie de trabajo de un C-PEC
• Cuando se conoce o se sospecha de una exposición a polvos y vapores

7.6 Eliminación de Equipo de Protección Personal Usado

Se debe tener en cuenta que todo el PPE usado durante la manipulación de HD habrá de contaminarse, al menos, con trazas
de HD. El PPE debe colocarse en un envase apropiado para desechos y eliminarse de conformidad con las reglamentaciones
locales, estatales y federales. El PPE usado durante la preparación magistral debe ser desechado en el envase para desecho ade-
cuado antes de abandonar el C-SEC. Los guantes para quimioterapia y los cubremangas (cuando se usen) usados durante la
preparación magistral deben ser retirados con cuidado y desechados de inmediato en un envase para desechos aprobado para
desecho contaminado con trazas dentro del C-PEC o contenidos en una bolsa sellable para su desecho fuera del C-PEC.

8. PROGRAMA DE COMUNICACIÓN DE PELIGROS

Se requiere que las entidades establezcan políticas y procedimientos que aseguren la seguridad del trabajador en todos los
aspectos relacionados con la manipulación de HD. La entidad debe desarrollar SOP para asegurar la capacitación efectiva con
respecto al etiquetado, transporte, almacenamiento y eliminación adecuados de los HD y al uso de Hoja de Datos de Seguri-
dad (SDS, por sus siglas en inglés), basándose en el Globally Harmonized System of Classification and Labeling of Chemicals
(Sistema Globalmente Armonizado (GHS, por sus siglas en inglés) de Clasificación y Etiquetado de Productos Químicos.
Los elementos del plan del programa de comunicación de peligros deben incluir:
• Un plan escrito que describa la forma en que se implementará la norma
•Todos los envases de químicos peligrosos deben etiquetarse, señalizarse o marcarse con la identidad del material y las ad-
vertencias sobre peligros adecuadas
• Las entidades deben contar con una SDS para cada químico peligroso que usen (Título 29 del CFR 1910.1200)
• Las entidades deben asegurarse de que las SDS para cada producto químico peligroso usado sean de fácil acceso para el
personal de cada turno y cuando se encuentren en sus áreas de trabajo
• El personal que pudiera estar expuesto a productos químicos peligrosos durante sus labores debe recibir información y
capacitación antes de su primer contacto con un producto químico peligroso y siempre que se presenten cambios en los
peligros
• El personal que esté en edad reproductiva debe confirmar por escrito que entienden los riesgos de manipular HD

9. CAPACITACIÓN DEL PERSONAL

Todo el personal que manipula HD debe recibir capacitación basándose en sus funciones en el lugar de trabajo (p.ej., en la
recepción, almacenamiento, preparación magistral, reenvasado, dispensación, administración y eliminación de HD). La capaci-
tación debe proveerse antes de que el empleado manipule HD de manera independiente. Cada uno de los empleados debe
792 (800) Fármacos Peligrosos-Manipulación / Pruebas Físicas USP 40

demostrar la efectividad de la capacitación sobre la competencia en la manipulación de HD. La competencia del personal debe
ser reevaluada por lo menos cada 12 meses. El personal debe recibir capacitación antes de la introducción de un nuevo HD o
de equipo nuevo y antes de que se realice un cambio significativo en el proceso o en un SOP. Además, se debe documentar
toda capacitación y evaluación de competencias.
La capacitación debe incluir al menos lo siguiente:
• Descripción general de la lista de HD de la entidad y sus riesgos
• Revisión de los SOP de la entidad relacionados con la manipulación de HD
• Uso apropiado de PPE
• Uso apropiado de equipo y dispositivos (p.ej., controles de ingeniería)
• Respuesta a exposiciones confirmadas o sospechadas a HD
• Manejo de derrames
• Eliminación apropiada de HD y materiales contaminados con trazas

1 O. RECEPCIÓN
La entidad debe establecer SOP para recibir HD. Los HD deben ser recibidos del proveedor en plástico impermeable para
aislarlos de otros fármacos y para fomentar la seguridad durante el proceso de recepción y transferencia interna. Los HD deben
ser entregados al área de almacenamiento de HD inmediatamente después de desempacarlos.
Se debe usar PPE, incluyendo guantes para quimioterapia, al desempacar los HD (ver Equipo de Protección Persona0. Se debe
contar con un kit para derrames en el área receptora.
La entidad debe aplicar políticas que incluyan un enfoque escalonado, comenzando con el examen visual del envase de
transporte para detectar señales de daños o roturas (p.ej., manchas visibles de fugas, sonidos de vidrio roto). La Tabla 4 resu-
me los pasos para recibir y manipular envases de transporte dañados.
T a bl a 4 Resumen d e Requ151
. "t05 para 1a Recepc I'on y M ampu 1ac1on
"' d e Enva5es d e T ransporte d e HD D - d 05 ª"ª
• Sellar el envase sin abrir y contactar al proveedor
• Si el envase sin abrir va a ser devuelto al proveedor, sellar el envase en un empaque impermeable y etiquetar el
Si el envase de transporte envase externo como "Peligroso"
parece estar dañado • Si el proveedor no acepta la devolución, eliminar como desecho peligroso
• Sellar el envase en un envase plástico o impermeable
• Transportarlo a un C-PEC y colocarlo en un mantel de preparación con el revés plástico
• Abrir el envase y retirar los artículos no dañados
• Limpiar la parte externa de los artículos no dañados con un paño desechable
• Aislar los artículos dañados en un envase impermeable y etiquetar el envase externo como "Peligroso"
Cuando es necesario abrir • Si el proveedor no acepta la devolución, eliminar como desecho peligroso
un envase de transporte • lnactivar, descontaminar y limpiar el C-PEC (C-PEC, por sus siglas en inglés) (ver lnactivación, Descontaminación,
dañado Limpieza y Desinfección) y desechar el mantel y los artículos de limpieza desechables como desechos peligrosos

Al abrir los envases de transporte dañados, de preferencia deben ser transportados a un C-PEC designado para preparación
magistral no estéril. Si sólo se cuenta con un C-PEC designado para preparación magistral estéril, éste debe ser desinfectado
después de la etapa de descontaminación, inactivación y limpieza antes de volver a usarlo para cualquier actividad de prepara-
ción magistral estéril.
Las cajas de cartón o paquetes de transporte dañados deben considerarse derrames los cuales deben ser informados a la
persona designada y manejados de acuerdo con los SOP de la Entidad. Los HD en espera de ser devueltos al proveedor deben
ser segregados en un área designada con presión negativa. La limpieza debe cumplir con los Procedimientos Operativos Están-
dar establecidos.

11. ETIQUETADO, ENVASADO, TRANSPORTE Y ELIMINACIÓN

La entidad debe establecer SOP para el etiquetado, envasado, transporte y eliminación de HD. Los SOP deben tratar la pre-
vención de exposiciones o derrames accidentales, la capacitación de personal para responder a la exposición y el uso de un kit
para derrames. Algunos ejemplos de estrategias especiales de reducción de exposición incluyen conectores y jeringas de pe-
queño calibre (tales como los del tipo Luer Lock), tapas de jeringas, CSTD, tapas en los puertos de los envases, bolsas de plásti-
co impermeables selladas, envases resistentes a impactos y/o impermeables y etiquetado precautorio.

11.1 Etiquetado

Los HD identificados por la entidad que requieren precauciones especiales sobre la manipulación de HD deben estar etique-
tados con claridad en todo momento durante su transporte. El personal debe asegurarse de que los procesos de etiquetado
para preparaciones magistrales no introduzcan contaminación en las áreas de manipulación de fármacos no peligrosos.
USP 40 Pruebas Físicas/ (800) Fármacos Peligrosos-Manipulación 793

11.2 Envasado

El personal debe seleccionar y usar envases y materiales de envasado que mantengan la integridad física, la estabilidad y la
esterilidad (en caso necesario) de los HD durante el transporte. Los materiales de envasado deben proteger el HD de daños,
fugas, contaminación y degradación y, al mismo tiempo, proteger a los trabajadores de cuidados de la salud que transportan
HD. La entidad debe contar con SOP escritos que describan los envases de transporte apropiados y materiales de aislamiento,
basados en información de las especificaciones del producto, proveedores y modo de transporte.

11.3 Transporte

Los HD que requieren transporte deben etiquetarse, almacenarse y manipularse de conformidad con las reglamentaciones
federales, estatales y locales aplicables. Los HD deben ser transportados en envases que minimicen el riesgo de ruptura o derra-
mes. No se deben usar tubos neumáticos para transportar HD líquidos ni HD antineoplásicos debido al potencial de ruptura y
contaminación.
Al transportar HD a sitios fuera de la entidad, la entidad deberá consultar la Información sobre Transporte de la SDS. La enti-
dad debe asegurarse de que las etiquetas y el etiquetado accesorio para los HD incluyan instrucciones de almacenamiento, de
eliminación, así como información sobre la categoría del HD en un formato que se apegue a las políticas del transportista.

11.4 Eliminación

Todo el personal que lleve a cabo la eliminación de desechos y actividades de limpieza rutinaria en las áreas de manipulación
de HD debe estar capacitado en los procedimientos adecuados para prevenir la contaminación por HD para protegerse a sí
mismo y al entorno. La eliminación de todos los desechos de HD, incluyendo, entre otros, HD sin usar y PPE contaminado con
trazas y otros materiales, debe cumplir con todas las reglamentaciones federales, estatales y locales aplicables.

12. DISPENSACIÓN DE FORMAS FARMACÉUTICAS FINALES

Los HD que no requieran manipulación adicional, aparte del conteo o reenvasado de formas farmacéuticas finales, pueden
prepararse para dispensación sin otros requisitos adicionales de contención, a menos que sean requeridos por el fabricante o si
se presentan indicadores visuales de peligro de exposición a HD (p.ej., polvo o derrames de HD).
El conteo o reenvasado de HD debe realizarse con cuidado. Con HD se debe usar equipo limpio, el cual debe descontami-
narse después de cada uso. Las formas farmacéuticas en tableta y cápsula de HD antineoplásicos no deben colocarse en má-
quinas de recuento ni de envasado automatizadas, las cuales someten las formas a tensión y pueden crear contaminantes en
polvo.

13. PREPARACIÓN MAGISTRAL

Las entidades y el personal implicado en la preparación magistral de HD debe cumplir con las normas USP apropiadas para
preparación magistral, incluidos los capítulos (795) y (797). La preparación magistral debe realizarse en controles de ingeniería
apropiados de acuerdo con lo descrito en Preparación Magistral. Al realizar preparaciones magistrales de HD en un C-PEC, se
debe colocar un mantel de preparación con el revés plástico en la superficie de trabajo del C-PEC. El mantel debe cambiarse
inmediatamente siempre que ocurra un derrame y de forma regular durante el uso, además de que debe desecharse al final de
la actividad diaria de preparación magistral. Se debe utilizar equipo desechable o limpio para preparación magistral (tal como
morteros y manos de morteros y espátulas) cuando se trabaje con HD.
Los envases a granel de HD líquidos y de API deben manipularse con cuidado para evitar derrames. Cuando se usen API u
otros HD en polvo, éstos deberán manipularse en un C-PEC para protegerse de la exposición en el lugar de trabajo, en especial
durante las actividades que generan partículas (tales como el triturado de tabletas, la apertura de cápsulas y el pesado de pol-
vos).

14. ADMINISTRACIÓN
Los HD deben ser administrados de forma segura usando dispositivos médicos y técnicas de protección. Algunos ejemplos
de dispositivos médicos de protección incluyen sistemas sin agujas y cerrados. Además, algunos ejemplos de técnicas de pro-
tección incluyen agregar cantidades conocidas o cebar tuberías IV con una solución de fármaco no peligroso en un C-PEC y
triturar las tabletas en una bolsa de plástico.
Se debe usar PPE apropiado al momento de administrar HD. Después de su uso, el PPE debe ser retirado y desechado en un
recipiente para desechos aprobado para desechos contaminados con trazas de HD en el sitio de administración del fármaco. El
equipo (tal como tuberías y agujas) y los materiales de envasado deben ser desechados de manera apropiada, por ejemplo, en
recipientes para desechos de HD, después de la administración.
794 (800) Fármacos Peligrosos-Manipulación / Pruebas Físicas USP 40

Se deben usar CSTD para la administración de HD antineoplásicos cuando la forma farmacéutica lo permita. Se deben usar
técnicas y dispositivos auxiliares que minimicen los riesgos presentados por los sistemas abiertos al administrar HD por ciertas
vías. La administración dentro de algunos órganos o cavidades corporales (p.ej., vejiga, ojos, cavidad peritoneal o cavidad pec-
toral) a menudo requiere de equipos para los que no se encuentran disponibles conexiones de bloqueo o no es posible obte-
nerlas.
Cuando sea posible, el personal de cuidados de la salud debe evitar actividades de manipulación de HD tales como triturar
tabletas o abrir cápsulas. Se prefieren las formulaciones líquidas cuando las formas farmacéuticas sólidas orales no sean apro-
piadas para el paciente. Si las formas farmacéuticas de HD requieren actividades de manipulación tales como el triturado de
tabletas o la apertura de cápsulas para una dosis individual, el personal debe vestir PPE apropiado y usar una bolsa de plástico
para contener el polvo o partículas generadas.

15. INACTIVACIÓN, DESCONTAMINACIÓN, LIMPIEZA V DESINFECCIÓN

Se deben inactivar, descontaminar y limpiar todas las áreas en las que se manipulan HD, así como todo el equipo y dispositi-
vos reusables. Además, se deben desinfectar posteriormente las áreas y dispositivos de preparación magistral estéril.
La entidad debe establecer procedimientos escritos para descontaminación, inactivación y limpieza, así como para la desin-
fección de las áreas de preparación magistral estéril. Asimismo, la limpieza de las áreas de preparación magistral no estéril de-
ben cumplir con las disposiciones del capítulo (795), y las limpieza de las áreas de preparación magistral estéril deben cumplir
con las disposiciones del capítulo (797). Los procedimientos de limpieza escritos deben incluir los requisitos de los procedi-
mientos, los agentes usados, las diluciones (cuando se usen), la frecuencia y documentación.
Todo el personal que lleva a cabo actividades de inactivación, descontaminación, limpieza y desinfección en áreas donde se
manipulan HD debe estar capacitado con respecto a los procedimientos apropiados para protegerse a sí mismos y al entorno
de la contaminación. Todo el personal que realiza estas actividades deben usar PPE apropiado resistente a los agentes de lim-
pieza usados, incluyendo dos pares de guantes para quimioterapia y batas impermeables desechables (ver Equipo de Protección
Personal). Además, se debe usar protección para los ojos y la cara cuando exista posibilidad de salpicaduras. Si la actividad lo
requiere, se debe usar protección respiratoria.
Los agentes de inactivación, descontaminación, limpieza y desinfección seleccionados deben ser apropiados para el tipo de
contaminantes de HD, la ubicación y los materiales de la superficie. Los productos usados deben ser compatibles con el mate-
rial de la superficie. Consultar la información del fabricante o del proveedor sobre la compatibilidad con los agentes de limpie-
za usados. Los agentes usados para inactivación, descontaminación y limpieza deben aplicarse usando paños humedecidos
con una solución apropiada y no deben administrarse mediante un atomizador para evitar la dispersión de residuos de HD. La
eliminación de todos los materiales desechables debe cumplir con las reglamentaciones de la Agencia de Protección Ambiental
(EPA, por sus siglas en inglés) y las políticas de la entidad. Realizar las tareas de limpieza en áreas con ventilación suficiente. La
Tabla 5 resume el propósito y ejemplifica los agentes para cada paso.
Tabla 5. Etapas de Limpieza
Etapa de Limpieza Propósito Ejemplos de Agentes
Conforme a lo citado en el etiquetado del HD u
otros agentes que pueden incorporar oxidan-
tes registrados por la EPA (p.ej., formulaciones
lnactivación lnactivar el compuesto o volverlo inerte de peróxido, hipoclorito de sodio, etc.)
Materiales cuya efectividad haya sido validada
para la descontaminación de HD, o mediante
otros materiales cuya efectividad haya sido
probada mediante análisis, los cuales pueden
incluir alcohol, agua, peróxido o hipoclorito de
Descontaminación Retirar los residuos de HD sodio
Limpieza Retirar materia orgánica e inorgánica Detergente germicida
Usar desinfectante registrado ante la EPA y/o al-
Desinfección (para manipulaciones estériles) Destruir microorganismos cohol estéril, según corresponda

15.1 lnactivación

La inactivación vuelve inerte o inactivo a un compuesto. El residuo de la inactivación debe ser eliminado mediante la descon-
taminación de la superficie.
No existe un método único comprobado para la inactivación de todos los compuestos. El objetivo final debe ser la desconta-
minación completa de la superficie. Siempre que sea posible, se deben usar productos con propiedades de inactivación cono-
cidas (agentes oxidantes registrados ante la EPA que sean apropiados para el uso pretendido). Se debe tener cuidado al selec-
cionar materiales para la inactivación debido a los efectos adversos potenciales (subproductos peligrosos, efectos respiratorios
y daños cáusticos en las superficies). Los daños a las superficies se evidencian por la corrosión en superficies de acero inoxida-
ble ocasionada por el hipoclorito de sodio cuando se deja sin tratar. Para evitar la corrosión, el hipoclorito de sodio debe ser
USP 40 Pruebas Físicas/ (800) Fármacos Peligrosos-Manipulación 795

neutralizado con tiosulfato de sodio o con un agente para eliminar el hipoclorito de sodio (p.ej., alcohol estéril, agua estéril,
detergente germicida o agente esporicida).

15.2 Descontaminación

La descontaminación ocurre mediante la inactivación, neutralización o eliminación física de residuos de HD de superficies no

desechables y transfiriéndolo a materiales desechables absorbentes (p.ej., paños, almohadillas o toallas) apropiadas para el área
que se está limpiado. Al seleccionar entre diversos productos disponibles para la descontaminación de HD, se debe tener en
cuenta la compatibilidad de la superficie y los requisitos de las instalaciones. Es obligatorio apegarse a las instrucciones de uso
del fabricante. Debido al creciente número de valoraciones disponibles para HD, ahora es posible el muestreo adicional de su-
perficies con paños, el cual debe realizarse para documentar la efectividad de cualquier agente usado para la descontamina-
ción de las superficies de trabajo de residuos de HD (ver Calidad y Control AmbientaO.
La cantidad de contaminación por HD introducida en el C-PEC puede reducirse limpiando los envases de HD. La solución
usada para limpiar los envases de HD no debe alterar la etiqueta del producto. La superficie de trabajo del C-PEC debe ser
descontaminada entre cada procedimiento de preparación magistral de distintos HD. El C-PEC debe ser descontaminado al
menos a diario (cuando se use), siempre que ocurra un derrame, antes y después de la certificación, siempre que ocurra una
interrupción voluntaria y siempre que se cambie de lugar el dispositivo de ventilación.
Los C-PEC pueden tener áreas debajo de la bandeja de trabajo en las que podría acumularse contaminación. Dichas áreas
deben ser inactivadas, descontaminadas y limpiadas al menos mensualmente para reducir el nivel de contaminación en el
C-PEC. El acceso a dichas áreas puede ser complicado. Se deben inactivar, descontaminar y limpiar tanto como sea posible las
superficies del C-PEC antes de ingresar al área ubicada debajo de la bandeja de trabajo. Al inactivar, descontaminar y limpiar el
área debajo de la bandeja de trabajo de un C-PEC, los flujos de aire de contención se ven comprometidos por la apertura de
las cabinas. Para proteger al trabajador al realizar esta tarea, puede ser necesario proveerle protección respiratoria.

15.3 Limpieza

La limpieza es un proceso que tiene como resultado la eliminación de contaminantes (p.ej., polvo, contaminación microbia-
na, residuos de HD) de objetos y superficies usando agua, detergentes, agentes tensoactivos, disolventes y/u otros químicos.
Los agentes de limpieza usados en el equipo de preparación magistral no deben introducir contaminación microbiana. No se
deben realizar tareas de limpieza cuando se llevan a cabo actividades de preparación magistral.

15.4 Desinfección

La desinfección es un proceso de inhibición o destrucción de microorganismos. Antes de poder llevar a cabo adecuadamen-
te una desinfección, es necesario limpiar las superficies. La desinfección debe realizarse en áreas que requieren ser estériles,
incluyendo las áreas de preparación magistral.

16. CONTROL DE DERRAMES

Todo el personal que pudiera estar implicado en la limpieza de derrames de HD debe recibir capacitación adecuada con
respecto al manejo de derrames y al uso de PPE y respiradores certificados por NIOSH (ver Equipo de Protección PersonaO. Los
derrames deben ser contenidos y limpiados inmediatamente por personal calificado únicamente con PPE apropiado. Se debe
disponer en todo momento de personal calificado durante la manipulación de HD. Se deben colocar señalizaciones de restric-
ción de acceso en el área del derrame. Los kits para derrames que contienen todos los materiales requeridos para limpiar un
derrame de HD deben estar disponibles en todo momento en las áreas en las que se manipulan HD rutinariamente. Cuando se
preparen o administren HD en un área de cuidados de la salud no habitual, se debe contar con un kit para derrames y un
respirador. Todos los materiales del derrame deben ser desechados como desechos peligrosos.
Asimismo, se deben documentar las circunstancias y el manejo de los derrames. Se debe evaluar de inmediato al personal
que haya estado potencialmente expuesto durante el derrame o la limpieza de éste, o cuyos ojos o piel entren en contacto
directo con HD. Toda persona que no forme parte del personal que haya sido expuesta a un derrame de HD deberá seguir las
políticas de la entidad, las cuales pueden incluir informar al servicio de emergencia designado para una evaluación inicial, así
como completar un informe del incidente o formulario de exposición.
Se deben desarrollar SOP para prevenir derrames de HD y para dirigir la limpieza de los mismos. Los SOP deben contemplar
el tamaño y el alcance del derrame y especificar al personal responsable del manejo del mismo y el tipo de PPE requerido. El
manejo del derrame (p.ej., descontaminación, desactivación y limpieza) pueden depender del tamaño y tipo del derrame. El
SOP debe contemplar la ubicación de los kits para derrames y de los materiales de limpieza, así como la capacidad del kit para
derrames. Los procedimientos escritos deben tratar el uso de una máscara de cara completa apropiada, respiradores de tipo
cartucho para químicos si se ve excedida la capacidad del kit para derrames o si se confirma o se sospecha la exposición aérea
a vapores o gases.
796 (800) Fármacos Peligrosos-Manipulación / Pruebas Físicas USP 40

17. DOCUMENTACIÓN Y PROCEDIMIENTOS OPERATIVOS ESTÁNDAR

La entidad debe mantener SOP para la manipulación segura de HD para todos los casos en que se usen HD en las diversas
áreas de las instalaciones. Los SOP deben ser revisados al menos cada 12 meses por la persona designada y dicha revisión debe
ser documentada. Se deben revisar formularios o registros según se requiera y dichas revisiones deberán ser comunicadas a
todo el personal que manipula HD.
Los SOP para la manipulación de HD deben incluir:
• Programa de comunicación de peligros
• Programa de seguridad en el lugar de trabajo
• Designación de áreas para HD
•Recepción
•Almacenamiento
• Preparación Magistral
• Uso y mantenimiento de controles de ingeniería apropiados (p.ej., C-PEC, C-SEC y CSTD)
• Higiene de manos y uso de PPE dependiendo del tipo de actividad (p.ej., recepción, transporte, preparación magistral,
administración, derrames y eliminación)
• lnactivación, descontaminación, limpieza y desinfección
• Dispensación
•Transporte
• Administración
• Monitoreo ambiental (p.ej., muestreo por paños)
• Eliminación
• Control de derrames
• Vigilancia médica
El personal que transporta, prepara las preparaciones magistrales de HD o administra HD debe documentar su capacitación
de conformidad con las normas OSHA (ver Norma OSHA 191 0.120 Hazardous Waste Operations and Emergency Response
[Operaciones para Desechos Peligrosos y Respuesta a Emergencias]) y otras leyes y reglamentaciones aplicables.

18. VIGILANCIA MÉDICA

La vigilancia médica forma parte de un programa integral de control de exposición que complementa los controles de inge-
niería, los procesos de seguridad en el lugar de trabajo y el uso de PPE. Los trabajadores de cuidados de la salud que manipu-
lan HD como parte regular de sus funciones deben registrarse en un programa de vigilancia médica. El propósito general de la
vigilancia es minimizar los efectos adversos a la salud en el personal potencialmente expuesto a HD. Los programas de vigilan-
cia médica implican la evaluación y documentación de quejas por síntomas, hallazgos físicos y valores de laboratorio (tales co-
mo hemograma) para determinar si existe una desviación de las normas esperadas.
La vigilancia médica también puede considerarse como una herramienta de prevención secundaria que puede proveer un
medio para la detección temprana en caso de que se desarrolle un problema de salud. El rastreo del personal mediante la vigi-
lancia médica permite comparar en cada trabajador variables de salud con el paso del tiempo, lo cual puede facilitar la detec-
ción temprana de un cambio en un valor de laboratorio o en una condición médica. Los programas de vigilancia médica tam-
bién buscan tendencias en poblaciones de trabajadores. Examinar datos agrupados comparados con datos de trabajadores no
expuestos puede revelar una pequeña alteración o incremento en la frecuencia de un efecto de salud que de otro modo podría
quedar oculta si se consideraran los resultados de trabajadores individuales por sí solos.
La vigilancia médica evalúa la protección lograda por los controles de ingeniería, otros controles administrativos, procesos
de trabajo seguro, PPE y educación del trabajador con respecto a los peligros de los materiales con los que trabajan durante el
desarrollo de sus funciones. Los elementos de recopilación de datos de un programa de vigilancia médica se usan para estable-
cer una línea base de la salud de los trabajadores y, posteriormente, para monitorear su salud futura con respecto a cualquier
cambio que pudiera resultar de la exposición a HD.
Los elementos de un programa de vigilancia médica deben ser congruentes con las políticas de Recursos Humanos de la
entidad y deben incluir:
• El desarrollo de un enfoque organizado para identificar a los trabajadores que estén potencialmente expuestos a HD de-
pendiendo de sus funciones laborales
• El uso de una entidad o servicio de salud contratado para llevar a cabo la vigilancia médica de los empleados protegiendo
al mismo tiempo la confidencialidad de su información médica personal
• La evaluación inicial (pre-ocupacional) del estado de salud e historial médico de un trabajador. Los datos recolectados in-
cluyen un historial médico (incluso el historial reproductivo) y el historial laboral para evaluar la exposición a HD, examen
físico y pruebas de laboratorio. Los métodos usados para evaluar el historial de exposición incluyen una revisión de:
- Registros de HD manipulados, con cantidades y formas farmacéuticas
- Número estimado de HD manipulados por semana
- Estimaciones de horas empleadas en la manipulación de HD por semana y/o por mes
USP 40 Pruebas Físicas/ (800) Fármacos Peligrosos-Manipulación 797

- Realizar una evaluación física y estudios de laboratorio vinculados a órganos afectados por los HD comúnmente usa-
dos, tales como un hemograma completo basal. En la actualidad, no se recomienda el monitoreo biológico para de-
terminar niveles de HD específicos en la sangre u orina en protocolos de vigilancia, aunque puede realizarse en el
seguimiento apenas haya ocurrido el derrame grave de un agente específico.
• Los registros médicos de vigilancia se deben mantener en conformidad con la reglamentación OSHA con respecto al acce-
so a los registros de exposición de empleados y sus registros médicos
• Monitorear la salud de los trabajadores de manera prospectiva mediante la vigilancia periódica usando la recopilación de
los datos descritos anteriormente (historial de salud y exposición actualizado, evaluación física y mediciones de laborato-
rio, cuando sea apropiado)
• Monitorear los datos para identificar fallas en la prevención que afecten la salud; este monitoreo puede realizarse en cola-
boración con el servicio de salud del empleado
• Desarrollo de un plan de seguimiento para trabajadores que han presentado cambios en la salud que sugieran toxicidad o
que hayan experimentado una exposición aguda. Este seguimiento debe incluir la evaluación de los controles de ingenie-
ría y administrativos vigentes y del equipo para asegurar de que todos los sistemas hayan sido implementados de forma
apropiada y exacta (ver el Plan de Seguimiento)
• Completar un examen de salida al finalizar la relación laboral de un trabajador con la entidad para documentar la infor-
mación en los historiales médico, reproductivo y de exposición del empleado. Los exámenes y evaluaciones de laboratorio
deben basarse en el historial de exposición del individuo y deben seguir el esquema de la evaluación periódica

18.1 Plan de Seguimiento

La existencia de cambios en la salud relacionados con la exposición debe dar lugar a una reevaluación inmediata de las me-
didas de prevención primarias (p.ej., controles administrativos y de ingeniería, PPE, entre otros). De esta forma, la vigilancia
médica actúa como una verificación de la efectividad de los controles usados actualmente.
La entidad debe llevar a cabo las siguientes acciones:
• Realizar un examen posterior a la exposición diseñado especialmente para el tipo de exposición (p.ej., derrames o pincha-
zos con agujas de jeringas que contengan HD). Se debe llevar a cabo una evaluación del grado de exposición y debe
incluirse en una base de datos confidencial y en un informe de incidentes. El examen físico debe enfocarse en las áreas
implicadas, así como en cualquier otro sistema de órganos afectados comúnmente (es decir, la piel y las membranas mu-
cosas en caso de contacto directo o inhalación; el sistema pulmonar en el caso de HD en aerosol). El tratamiento y los
estudios de laboratorio deberán hacerse de la manera indicada y guiarse por lo prescrito en los protocolos de emergencia
• Comparar el desempeño de controles con las normas recomendadas; realizar muestreo ambiental cuando se disponga de
métodos analíticos
• Verificar y documentar que todos los controles de ingeniería estén en condiciones de operación apropiadas
•Verificar y documentar que el trabajador haya cumplido con las políticas existentes. Revisar las políticas para el uso de PPE
y el cumplimiento del empleado de las políticas y el uso del PPE. Revisar la disponibilidad de PPE apropiado (ver Equipo de
Protección Persona0
• Desarrollar y documentar un plan de acción que prevenga la exposición adicional de trabajadores
•Asegurar la comunicación bidireccional y confidencial entre el trabajador y las unidades de salud del empleado con res-
pecto a notificaciones, discusiones sobre un cambio en la condición de la salud o la detección de un efecto adverso para
la salud
• Proveer y documentar una encuesta médica de seguimiento para demostrar que el plan se esté implementando de forma
efectiva
•Asegurar que todo el personal expuesto reciba notificaciones confidenciales sobre cualquier efecto adverso para la salud.
Ofrecer funciones alternativas o reubicación laboral temporal
• Proveer vigilancia médica continua a todos los trabajadores que estén en riesgo de exposición a HD para determinar la
efectividad del plan implementado

Cambio en la redacción:

GLOSARIO

Ingrediente Farmacéutico Activo (API, por sus siglas en inglés): Cualquier sustancia o mezcla de sustancias destinadas
a su uso en una preparación magistral de medicamentos, convirtiéndose así en el ingrediente activo de dicha preparación
y que proporciona una actividad farmacológica u otro efecto directo en el diagnóstico, cura, mitigación, tratamiento o
prevención de enfermedades en humanos y animales o que afecta la estructura y función del cuerpo.
Función alternativa: Realización de otras tareas que no incluyan la manipulación directa de HD.
Antesala: Sala ISO Clase 7 o mejor donde el personal efectúa procedimientos de higiene de manos y vestimenta, así co-
mo otras actividades que generan altos niveles de partículas. La antesala es el cuarto de transición entre el área no clasifi-
cada de la instalación y la zona amortiguadora.
798 (800) Fármacos Peligrosos-Manipulación / Pruebas Físicas USP 40

Evaluación de riesgos: Evaluación de riesgos para determinar estrategias de contención y/o prácticas laborales alternati-
vas.
Fecha Límite de Uso (FLU): Fecha u hora después de la cual no se debe usar una preparación magistral y debe ser dese-
chada (ver (795) y (797)). La fecha u hora se determina a partir de la fecha y hora de la preparación magistral.
Cabina de Seguridad Biológica (BSC, por sus siglas en inglés): Cabina ventilada que a menudo se usa para la prepara-
ción de fármacos peligrosos. Estas cabinas se dividen en tres clases generales (Clase 1, Clase 11 y Clase 111). Las BSC Clase 11
se dividen adicionalmente en varios tipos (Tipo A1, Tipo A2, Tipo Bl y Tipo B2). Ver el Apéndice 3 para más detalles.
Zona amortiguadora: Un tipo de C-SEC con presión negativa que cumple con la calidad de aire ISO Clase 7 o mejor en
el cual se localiza físicamente el C-PEC que genera y mantiene un ambiente ISO Clase 5. Las actividades que ocurren en
esta área se limitan a la preparación y clasificación de componentes y suministros usados para la preparación magistral de
HD.
Guantes para quimioterapia: Guantes médicos que cumplen con la Standard Practice for Assessment of Resistance of
Medica! Gloves to Permeation by Chemotherapy Drugs (Práctica Estándar para la Evaluación de la Resistencia de Guantes
Médicos a la Impregnación por Medicamentos Quimioterapéuticos) (D6978) de la ASTM o su sucesora.
Espacio clasificado: Área que mantiene una clasificación de limpieza de aire basada en la lnternational Organization for
Standardization (Organización Internacional para la Estandarización o ISO).
Limpieza: Proceso de eliminación de suciedad (p.ej., material orgánico e inorgánico) de objetos y superficies que por lo
regular se logra de forma manual o mecánica usando agua con detergentes o productos enzimáticos.
Dispositivo de transferencia de fármaco en sistema cerrado (CSTD, por sus siglas en inglés): Dispositivo de transfe-
rencia de fármaco que evita mecánicamente la transferencia de contaminantes ambientales hacia el interior del sistema así
como el escape de HD o concentraciones de vapor hacia afuera del sistema.
Preparación magistral: Una preparación magistral de un medicamento o nutriente estéril o no estéril preparada en una
farmacia autorizada u otra institución relacionada con el cuidado de la salud, de acuerdo o en anticipación a una prescrip-
ción u orden de medicación proveniente de un médico autorizado.
Aislador de contención aséptico para preparación magistral (CACI, por sus siglas en inglés): Tipo específico de aisla-
dor aséptico diseñado para la preparación de preparaciones magistrales de HD estériles. El CACI está diseñado para prote-
ger al trabajador de la exposición a niveles indeseables de fármacos transmitidos por el aire durante los procesos de pre-
paración magistral y de transferencia de materiales y para proveer un ambiente aséptico con flujo de aire unidireccional
para preparaciones magistrales estériles.
Aislador aséptico para preparación magistral (CAi, por sus siglas en inglés): Aislador diseñado específicamente para la
preparación de preparaciones magistrales estériles de ingredientes o preparaciones farmacéuticas no peligrosas. El CAi es-
tá diseñado para mantener un ambiente aséptico para las preparaciones magistrales durante los procesos de preparación
magistral y transferencia de materiales.
Personal de preparación magistral: Individuos que participan en el proceso de preparación magistral.
• • ERR (01.¡un·Í()l 6)
Control de ingeniería primario de contención (C-PEC, por sus siglas en inglés): Un dispositivo ventilado diseñado y
operado para minimizar las exposiciones ambientales y del trabajador a HD mediante el control de emisiones de contami-
nantes transportados por el aire mediante lo siguiente:
• El cierre total o parcial de una fuente de contaminación potencial
• El uso de un flujo de aire con velocidades de captura específicas para atrapar y eliminar rápidamente contaminantes
transportados por el aire cerca de su punto de generación
• El uso de relaciones de presión de aire que definen la dirección del flujo de aire hacia el interior de la cabina
• El uso de filtración HEPA en todas las corrientes de escape potencialmente contaminadas
Control de ingeniería secundario de contención (C-SEC, por sus siglas en inglés): Cuarto con paredes fijas en el que
se coloca el C-PEC. Incorpora un diseño y parámetros operativos específicos requeridos para contener el peligro potencial
dentro del cuarto de preparación magistral.
Área de contención segregada para preparación magistral (C-SCA, por sus siglas en inglés): Tipo de C-SEC con re-
quisitos nominales de flujo de aire y presurización del cuarto relacionados con la preparación magistral de HD.
Recinto ventilado de contención (CVE, por sus siglas en inglés): Recinto total o parcialmente cerrado que usa princi-
pios de ventilación para capturar, contener y eliminar contaminantes transportados por el aire mediante filtración HEPA y
para prevenir su liberación en el ambiente de trabajo.
lnactivación: Tratamiento del HD contaminante sobre una superficie con un químico, calor, luz ultravioleta u otro agente
para transformar el HD en un agente menos peligroso.
Descontaminación: lnactivación, neutralización o eliminación de contaminantes de HD en superficies, por lo regular por
medios químicos.
Desvestirse: Quitarse el PPE.
Vestirse: Colocarse el PPE.
Desinfección: Proceso de inhibir o destruir microorganismos.
Control de ingeniería: Dispositivos primarios, secundarios y suplementarios diseñados para eliminar o reducir la exposi-
ción de los trabajadores a HD.
USP 40 Pruebas Físicas/ (800) Fármacos Peligrosos-Manipulación 799

Desinfectante registrado ante la EPA: Productos antimicrobianos registrados ante la Environmental Protection Agency
(Agencia de Protección Ambiental o EPA) para uso en el entorno de cuidados de la salud contra los patógenos especifica-
dos en el etiquetado del producto.
Ventilación externa: Escape de ventilación hacia el exterior
Forma farmacéutica final: Cualquier forma de un medicamento que no requiera de manipulación adicional antes de su
administración.
Globally Harmonized System of Classification and Labeling of Chemicals (Sistema Globalmente Armonizado de
Clasificación y Etiquetado de Productos Químicos): Sistema para la estandarización y armonización de la clasificación y
etiquetado de productos químicos.
Gafas de seguridad: Protección ocular de ajuste hermético que cubre completamente los ojos, la cuenca de los ojos y el
área facial que rodea inmediatamente los ojos. Las gafas de seguridad proveen protección contra impactos, polvo y salpi-
caduras. Algunas gafas de seguridad se ajustan sobre los anteojos.
Fármaco peligroso (HD, por sus siglas en inglés): Todo fármaco identificado mediante al menos uno de los siguientes
criterios:
• Carcinogenicidad, teratogenicidad o toxicidad en el desarrollo
•Toxicidad reproductiva en humanos
•Toxicidad en órganos humanos o animales a dosis baja
• Genotoxicidad o fármacos nuevos que mimetizan la estructura o toxicidad de HD existentes
Filtración de aire de alta eficiencia para partículas (HEPA): Filtro de tipo seco de medio extendido en un armazón rígi-
do con una eficiencia de recolección mínima de partículas del 99,97% para partículas con un diámetro mediano de masa
de 0,3 µm cuando se analiza con un flujo de aire estandarizado de acuerdo con la norma MIL STD 282 usando la Norma
Recomendada IEST RP-CCOOl .5.
Cuarto de presión negativa: Cuarto que se mantiene a una presión menor que las áreas adyacentes; por lo tanto, el flujo
neto de aire es hacia el cuarto.
Cabina de Transferencia de materiales: Área con compuertas que se coloca entre dos espacios con el propósito de re-
ducir la transferencia de partículas al mover materiales de un espacio a otro. Una cabina de transferencia que da servicio a
los cuartos de presión negativa debe estar equipada con puertas selladas.
Equipo de protección personal (PPE, por sus siglas en inglés): Artículos tales como guantes, batas, respiradores, gafas
de seguridad, máscaras de protección y otros artículos que protegen a cada trabajador de exposiciones físicas o químicas
peligrosas.
Cuarto de presión positiva: Cuarto que se mantiene a una presión mayor que las áreas adyacentes; por lo tanto, el flujo
neto de aire es hacia fuera del cuarto.
Reenvasado: Acción de retirar un producto de su envase primario original y colocarlo en otro envase primario, por lo
regular de menor tamaño.
Hoja de datos de seguridad (SDS, por sus siglas en inglés): Documento informativo que provee material escrito o im-
preso relacionado con un producto químico peligroso. La SDS se prepara de conformidad con la Norma de Comunica-
ción de Peligros (HCS, por sus siglas en inglés) [previamente conocida como Hoja de Datos de Seguridad del Material
(MSDS, por sus siglas en inglés)].
Kit para derrames: Recipiente con suministros, señales de advertencia y materiales relacionados que se usan para conte-
ner un derrame de HD.
Procedimiento operativo estándar (SOP, por sus siglas en inglés): Procedimientos operativos que describen operacio-
nes, análisis, muestreo, interpretación de resultados y acciones correctivas relacionadas con las operaciones que se están
llevando a cabo.
Control de ingeniería suplementario: Control auxiliar (p.ej., CSTD) que puede usarse de forma simultánea con los con-
troles de ingeniería primarios y secundarios. Los controles de ingeniería suplementarios ofrecen niveles adicionales de pro-
tección y pueden facilitar el mejoramiento de la protección en el lugar de trabajo, en especial durante la manipulación de
HD fuera de los controles de ingeniería primario y secundario (p.ej., durante la administración).
Espacio sin clasificación: Área para la que no se requiere una clasificación de limpieza de aire basada en la lnternational
Organization for Standardization (Organización Internacional para la Estandarización o ISO).

Cambio en la redacción:

APÉNDICES

Apéndice 1: Acrónimos en inglés usados en este capítulo

ACPH Cambios de aire por hora

API Ingrediente Farmacéutico Activo
ASTM American Society for Testing and Materials
BSC Cabina de seguridad biológica
800 (800) Fármacos Peligrosos-Manipulación / Pruebas Físicas USP 40

FLU Fecha límite de uso

CACI Aislador de contención aséptico para preparación magistral
CAi Aislador aséptico para preparación magistral
CDC Centers for Disease Control and Prevention
C-PEC Control de ingeniería primario de contención
C-SCA Área de contención segregada para preparación magistral
C-SEC Control de ingeniería secundario de contención
CSP Preparación Magistral estéril
CSTD Dispositivo de transferencia de fármaco en sistema cerrado
CVE Recinto de contención ventilado
EPA Environmental Protection Agency
Globally Harmonized System of Classification and Labeling of Chemicals) (Sistema Armonizado Global de Clasificación y
GHS Etiquetado de Productos Químicos)
HCS Norma de Comunicación de Peligros
HD Fármaco peligroso o medicamento peligroso
HEPA Filtro de aire de alta eficiencia para partículas
IV lntravenoso(a)
LAFW Cabina de flujo laminar
NIOSH National lnstitute for Occupational Safety and Health
ONS Oncology Nursing Society
OSHA Occupational Safety and Health Administration
PAPR Respirador motorizado para purificación de aire
PPE Equipo de protección personal
SDS Hoja de Datos de Seguridad
SOP Procedimiento Operativo Estándar
ULPA Filtro de aire para partículas ultra pequeñas
UPS Fuente de energía ininterrumpida
USP 40 Pruebas Físicas/ (800) Fármacos Peligrosos-Manipulación 801

Apéndice 2: Ejemplos de Diseños de Áreas de Preparación Magistral de Fármacos Peligrosos·

Control Primario ACPH Limitaciones del ACPH Notas

Uso y Secundario Óptimos mínimos Control Primario y Secundario mínimos para limitaciones

Preparación 12
Magistral de HD
No Estériles

Preparación 30 12 Fecha límite de uso

Magistral de HD máxima según se
Estériles describe en <797>
para un área de
preparación magistral
segregada

o o
30 Si se cuenta con este
diseño, se deben tomar
medidas para evitar la
contaminación de la zona
amortiguadora con presión
positiva

No se recomienda este diseño

o
30 Fecha límite de uso
máxima según se describe
en <797>.

Por lo regular se usa en entornos

clínicos oncológicos.

Preparación Se recomienda un cuarto separado 30 Para zonas usadas para

Magistral de HD para preparación magistral estéril preparación magistral estéril
Estériles y y no estéril y no estéril, no se deben
realizar actividades que
Preparación
generen particulas cuando
Magistral de HD esté en proceso la
No Estériles preparación magistral
estéril. Las C-PEC deben
tener al menos 1 metro de
separación.
12 Fecha límite de uso
máxima según se
describe en <797>
para un área de
preparación magistral
segregada

o
12 Fecha límite de uso
máxima según se
describe en <797>
para un área de
preparación magistral
segregada

'Las flechas indican la dirección del flujo de aire

802 (800) Fármacos Peligrosos-Manipulación / Pruebas Físicas USP 40

Apéndice 3: Tipos de Cabinas de Seguridad Biológica

Clase 1: BSC que protege al personal y al ambiente pero que no protege al producto/preparación. Se arrastra aire del
cuarto sin filtrar a una velocidad mínima de 75 pies lineales/minuto a través de la apertura frontal y a lo largo de la super-
ficie de trabajo para proveer protección al personal. Posteriormente, el aire se pasa a través de un filtro HEPA/ULPA (filtro
de aire para partículas ultra pequeñas), hacia el interior del cuarto o hacia afuera en la distribución de escape para proveer
protección ambiental.
Clase 11: Las BSC Clase 11 (tipos A 1, A2, B1 y B2) son sistemas de barrera parcial que se basan en el movimiento del aire
para proveer protección al personal, al ambiente y al producto/preparación. La protección para el personal y para el pro-
ducto/preparación se provee mediante la combinación del flujo de aire hacia el interior y hacia abajo capturado por la
rejilla delantera de la cabina. La contaminación cruzada lateral de productos/preparaciones se minimiza mediante el flujo
interno hacia abajo de aire filtrado por HEPA/ULPA que se mueve hacia la superficie de trabajo y que posteriormente es
arrastrado hacia el interior de las rejillas de captación delantera y trasera. La protección ambiental se provee al pasar el aire
de escape de la cabina a través de un filtro HEPA/ULPA.
Tipo A 1 (anteriormente, Tipo A): Estas BSC de Clase 11 mantienen una velocidad de entrada mínima de 75 pies/
minuto; tienen aire filtrado por HEPA que fluye hacia abajo que es una porción de la mezcla de aire que fluye hacia
abajo con aire de entrada de una distribución común; puede expulsar aire filtrado por HEPA de vuelta al interior del
laboratorio o al ambiente mediante una campana de escape; y puede tener cámaras y conductos de presión positiva
contaminados que no están rodeados de cámaras con presión negativa. Las BSC de Tipo Al no son adecuadas para
uso con productos químicos tóxicos volátiles ni •radíonucleidos.• ERR(Ohoct-2016¡ volátiles.
Tipo A2 (anteriormente, Tipo B3): Estas BSC de Clase 11 mantienen una velocidad de entrada mínima de 100 pies/
minuto; tienen aire filtrado por HEPA que fluye hacia abajo, y que es una porción de la mezcla de aire que fluye hacia
abajo con aire de entrada de una distribución de escape común; puede eliminar aire filtrado por HEPA de vuelta al
interior del laboratorio o al ambiente mediante una campana de escape; y tienen todas las cámaras y conductos con-
taminados bajo presión negativa o rodeados por cámaras y conductos de presión negativa. Cuando dichas cabinas se
usan para cantidades diminutas de químicos tóxicos volátiles y trazas de •radionucleidos. ERR(Ol-oct-2016), se deben ven-
tilar mediante campanas de escape que funcionen adecuadamente.
Tipo B1: Estas BSC de Clase 11 mantienen una velocidad de entrada mínima de 100 pies/minuto; tienen aire filtrado
por HEPA que fluye hacia abajo compuesto en gran medida por aire de entrada recirculado y no contaminado; elimi-
na la mayoría del aire contaminado que fluye hacia abajo a través de un conducto dedicado que se ventila hacia la
atmósfera pasándolo a través de un filtro HEPA; y tienen todos los conductos y cámaras contaminados bajo presión
negativa o rodeados por cámaras y conductos de presión negativa. Cuando estas cabinas se usan para trabajo que
implique cantidades mínimas de químicos tóxicos volátiles y trazas de •radionucleidos. <RR(Ol-oc1.2oi 6), el trabajo debe
realizarse en la porción directamente ventilada de la cabina.
Tipo B2 (escape total): Estas BSC de Clase 11 mantienen una velocidad de entrada mínima de 100 pies/minuto; tie-
nen aire filtrado por HEPA que fluye hacia abajo extraído desde el laboratorio o del exterior; ventilan hacia la atmós-
fera todo el aire entrante y que fluye hacia abajo después de su filtración mediante un filtro HEPA sin recirculación
hacia el interior de la cabina o de regreso al laboratorio; y tienen todos los conductos y cámaras contaminadas bajo
presión negativa o rodeados por cámaras y conductos de presión negativa con ventilación de escape directa. Estas
cabinas pueden usarse con productos químicos tóxicos volátiles y •radionucleidos• ERR(Ol·oct-2016¡·
Clase 111: La BSC de Clase 111 está diseñada para trabajar con agentes microbiológicos altamente infecciosos y otras opera-
ciones peligrosas. Provee protección máxima para el ambiente y el trabajador. Se trata de un sistema cerrado impermea-
ble a los gases con una ventana de observación asegurada con esclusas y/o requiere el uso de herramientas para abrirla. El
aire de suministro y el aire de escape están filtrados por HEPA/ULPA. El aire de escape debe pasar a través de dos filtros
HEPA/ULPA en serie antes de ser descargado hacia el exterior.

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(801) POLAROGRAFÍA

La polarografía es un método de análisis electroquímico basado en la medición del flujo de corriente resultante de la electró-
lisis de una solución en un microelectrodo polarizable, en función de un voltaje aplicado. El polarograma (ver Figura 1) obteni-
do por esta medición proporciona información cualitativa y cuantitativa de sustancias electro-reducibles y electro-oxidables. El
intervalo normal de concentraciones para las sustancias que se analizan es de 10-2 molar a 10-5 molar.
En la polarografía de corriente directa (cd), el microelectrodo es un electrodo de goteo de mercurio (EGM) que consiste en
pequeñas gotas de mercurio reproducibles que fluyen del orificio de un tubo capilar conectado a un reservorio de mercurio. El
electrodo de referencia más comúnmente empleado es un electrodo de calomel saturado (ECS) que posea una superficie ex-
tensa. El voltaje aplicado a la celda se aumenta gradualmente y sólo fluye una corriente residual muy pequeña hasta que la
sustancia que se valora experimenta reducción u oxidación. Al principio la corriente aumenta gradualmente, luego lo hace de
manera casi lineal con el voltaje y gradualmente alcanza un valor límite, como se muestra en la Figura 1. En la porción ascen-
dente inicial de la onda polarográfica, el aumento del flujo de corriente provoca una disminución en la concentración de las
especies electroactivas en la superficie del electrodo. A medida que aumentan el voltaje y la corriente, la concentración de las
especies reactivas disminuye aún más hasta alcanzar un valor mínimo en la superficie del electrodo. La corriente queda limita-
da entonces por la velocidad de difusión de las especies reaccionantes desde el seno de la solución hasta la superficie del mi-
croelectrodo. El incremento final de la corriente es provocado por la reacción del electrólito soporte. Esta gran concentración
de electrólito es inerte dentro del intervalo de potencial utilizado para el análisis e impide que las especies reactivas alcancen el
electrodo por migración eléctrica. De este modo, se asegura que la corriente limitante esté controlada por la difusión.
Dado que, en el caso del EGM, la superficie del electrodo se renueva constantemente en forma cíclica, la corriente aumenta
desde un valor pequeño, cuando la gota comienza a formarse, hasta alcanzar un valor máximo cuando la gota cae. Mediante
el empleo de un registrador apropiado para medir la corriente, se obtiene el registro característico con perfil dentado. La co-
rriente limitante es la suma de las corrientes residual y de difusión. La corriente residual se resta de la corriente limitante para
obtener la altura de la onda.
USP 40 Pruebas Físicas/ (801) Polarografía 805

-- ---
w
1-
z
w
a:a:
8

VOLTAJE APLICADO

Fig. 1. Polarograma típico que muestra el cambio en el flujo de corriente en función del aumento del potencial aplicado al
electrodo de goteo de mercurio.

ECUACIÓN DE ILKOVIC

La relación lineal entre la corriente de difusión (id) y la concentración de especies electro-activas se muestra por la ecuación
de llkovic:
id = 708nD 1i 2 Cm 2i3t1 i 6

en la cual id es la corriente máxima en microamperios; n es el número de electrones requeridos por molécula de sustancia elec-
tro-activa; D es el coeficiente de difusión, en centímetros cuadrados por segundo; C es la concentración, en milimoles por L; m
es la velocidad de flujo de mercurio del EGM, en mg por segundo; y tes el tiempo de caída de la gota, en segundos.
Los polarógrafos modernos están equipados con registradores capaces de determinar la corriente hasta la última porción de
la vida de la gota; en consecuencia, registran la máxima fluctuación de corriente. Cuando la corriente se mide sólo al final de la
vida de la gota, la técnica se denomina polarografía cd por muestreo. En este caso, sólo se registran los máximos de corriente y
no se observan las oscilaciones debidas al crecimiento de la gota.
Para instrumentos equipados con galvanómetros para medir la corriente, o en el caso de los registradores operados en mo-
dalidad de curva suavizada, las ondas dentadas son oscilaciones alrededor de la corriente promedio. En el último caso, la medi-
da de la corriente es el promedio de las oscilaciones. Para los polarogramas obtenidos de esta manera, la id dada por la ecua-
ción de llkovic es la corriente promedio en microamperios observada durante la vida de la gota en lugar de la corriente máxi-
ma, y entonces el coeficiente 708 se reemplaza por 607.

CONTROL DE LA CORRIENTE DE DIFUSIÓN

La ecuación de llkovic identifica las variables que deben ser controladas para asegurar que la corriente de difusión sea direc-
tamente proporcional a la concentración de material electro-activo. A 25º los coeficientes de difusión para soluciones acuosas
de muchos iones y moléculas orgánicas aumentan 1% a 2% por grado de aumento en la temperatura. Por lo tanto, la tempe-
ratura de la celda polarográfica debe controlarse en un margen de± 0,5º. Las cantidades m y t dependen de las dimensiones
del capilar y de la altura de la columna de mercurio por encima del electrodo. Si bien es posible comparar resultados obteni-
dos con capilares diferentes si se conoce el producto m 2 13t 1i 6, es recomendable utilizar el mismo capilar con una altura de mer-
curio constante durante una serie de análisis. La corriente de difusión es proporcional a la raíz cuadrada de la altura de la co-
lumna de mercurio. Un reservorio de mercurio con un diámetro de más de 4 cm previene una disminución significativa del
nivel de mercurio durante una serie de determinaciones.
806 (801) Polarografía / Pruebas Físicas USP 40

El capilar para el EGM tiene un orificio de aproximadamente 0,04 mm y una longitud de 6 cm a 15 cm. La altura de la
columna de mercurio, medida desde el extremo del capilar hasta la parte superior del depósito de mercurio, oscila entre 40
cm y 80 cm. La longitud exacta del capilar y la altura de la columna de mercurio se ajustan de modo que el tiempo de caída
esté entre 3 y 5 segundos con el circuito abierto y con el capilar inmerso en la solución de prueba.
Se encuentran disponibles equipos que permiten controlar los tiempos de goteo desde fracciones de segundo hasta varios
segundos. Como el detalle dentro de un polarograma se relaciona con el número de gotas proporcionadas durante un cambio
de potencial dado, los tiempos cortos de goteo permiten un registro más rápido del polarograma.
La corriente que fluye a través de la solución de prueba durante el registro de un polarograma está en el orden de los mi-
croamperios. Por lo tanto, el flujo de corriente produce cambios inapreciables en la solución de prueba y es posible realizar
varios polarogramas con la misma solución de prueba sin obtener diferencias significativas.

POTENCIAL DE MEDIA ONDA

El potencial de media onda (E 112 ) tiene lugar, en el polarograma, al punto medio de la distancia entre la corriente residual y
la meseta de la corriente limitante. Este potencial es característico de las especies electro-activas y, por lo general, es indepen-
diente de su concentración o del capilar empleado para obtener la onda. Depende de la composición de la solución y puede
cambiar con variaciones en el pH o en el sistema de disolventes, o con la adición de agentes formadores de complejos. El po-
tencial de media-onda, por lo tanto, sirve como criterio para la identificación cualitativa de una sustancia.
El potencial del EGM es igual al voltaje aplicado frente al electrodo de referencia después de la corrección para la caída iR (el
potencial necesario para pasar la corriente, i, a través de la solución con una resistencia R). Resulta especialmente importante
hacer esta corrección para soluciones no acuosas, las cuales suelen poseer alta resistencia, si se necesita un potencial exacto
para el EGM. No se necesita la corrección del potencial de media-onda para el análisis cuantitativo. A menos que se indique de
otro modo, se entiende que los potenciales representan mediciones realizadas frente al ECS.

ELIMINACIÓN DEL OXÍGENO DISUELTO

Puesto que el oxígeno se reduce en el EGM en dos pasos, primero a peróxido de hidrógeno y después a agua, interfiere
cuando los polarogramas deben realizarse a potenciales más negativos que aproximadamente O voltio en función de ECS, y
por lo tanto debe ser eliminado. Esto puede realizarse introduciendo burbujas de nitrógeno libre de oxígeno a través de la
solución durante 1O a 15 minutos inmediatamente antes de registrar la onda; el nitrógeno primero debe pasarse a través de
una porción separada de la solución para "acondicionarlo" y de este modo reducir al mínimo los cambios debidos a la evapo-
ración.
Es necesario que la solución esté en reposo y libre de vibraciones durante el tiempo en que se registra la onda, a fin de ase-
gurar que la corriente dependa solamente de la difusión. Por lo tanto, el burbujeo con nitrógeno debe detenerse y el gas se
debe dirigir para que fluya sobre la superficie de la solución antes de registrar un polarograma.
En medios alcalinos, se puede agregar bisulfito de sodio para eliminar el oxígeno, siempre que el reactivo no reaccione con
otros componentes del sistema.

MEDICIÓN DE LA ALTURA DE LA ONDA

Para usar un polarograma cuantitativamente, es necesario medir la altura de la onda. Como ésta es una medida de la magni-
tud de la corriente de difusión, se mide verticalmente. Para compensar la corriente residual, el segmento de la curva que pre-
cede al aumento de la onda se extrapola más allá del ascenso en la onda. Para una onda bien formada donde esta extrapola-
ción es paralela a la meseta de la corriente limitante, la medición no es ambigua. Para ondas no muy bien definidas, puede
utilizarse el siguiente procedimiento a menos que se especifique algo difrente en la monografía individual. Se extrapolan con
líneas rectas tanto la corriente residual como la corriente limitante, tal como se muestra en el gráfico (Figura 1). La altura de la
onda se toma como la distancia vertical entre las líneas extrapoladas medida a nivel del potencial de media onda.

PROCEDIMIENTO

[Precaución-El vapor de mercurio es tóxico y el mercurio metálico tiene una presión de vapor significativa a temperatura ambiente.
El lugar de trabajo donde se utiliza mercurio debe construirse de modo que cualquier salpicadura o gota de mercurio derramada pue-
da recuperarse completamente con relativa facilidad. Limpiar meticulosamente los derrames de mercurio después de cada uso del
instrumento. Trabajar en un laboratorio bien ventilado, teniendo cuidado de limpiar cualquier derrame de mercurio.]
Transferir una porción de la dilución final de la sustancia valorada a una celda polarográfica apropiada inmersa en un baño
de agua regulado a 25 ± 0,5º. Pasar una corriente de nitrógeno a través de la solución durante 1O a 15 minutos para eliminar
el oxígeno disuelto. Comenzar el goteo de mercurio desde el capilar, insertar el capilar en la solución de prueba y ajustar la
altura del reservorio de mercurio. Modificar el flujo de nitrógeno de modo que pase sobre la superficie de la solución y regis-
trar el polarograma en el intervalo de potencial indicado en la monografía individual, empleando un registrador o galvanóme-
tro de sensibilidad adecuada para obtener una onda apropiada. Medir la altura de la onda y, a menos que se indique de otro
USP 40 Pruebas Físicas/ (801) Polarografía 807

modo en la monografía, compararla con la altura de la onda obtenida con el Estándar de Referencia USP apropiado, medida
bajo las mismas condiciones.

POLAROGRAFÍA DE PULSOS

En la polarografía de cd convencional, la corriente se mide continuamente mientras se aplica un potencial como una rampa
lineal (ver Figura 2).

imedida continuamente

TIEMPO

Fig. 2. Polarografía de Corriente Directa (cd).

Esta corriente se compone de dos elementos. El primero, la corriente de difusión (faradaica), que se produce por la sustancia
que experimenta la reducción u oxidación en el electrodo de trabajo y es directamente proporcional a la concentración de esta
sustancia. El segundo elemento es la corriente capacitativa (relacionada con la carga de la doble capa electroquímica). Ambas
corrientes cambian a medida que varía el tamaño de la gota de mercurio. Estos cambios producen las oscilaciones presentes
en los típicos polarogramas de cd.
En la polarografía de pulso normal, se aplica un pulso de potencial al electrodo de mercurio cerca del final de la vida de la
gota, manteniendo el potencial inicial durante el período de crecimiento de la gota (ver Figura 3).

Ímedida

f-TIEMPO DE GOTEO+ TIEMPO DE GOTEO+ TIEMPO DE GOTEO -j

Fig. 3. Polarografía de pulso.

A cada gota siguiente se le aplica un pulso ligeramente mayor, con una constante de incremento determinada por la velocidad
de barrido seleccionada. La corriente se mide al final del pulso cuando la corriente capacitativa es cercana a cero y, por lo
tanto, se mide principalmente la corriente faradaica (ver Figura 4).
808 (801) Polarografía / Pruebas Físicas USP40

1-------- PULSO ---------+<

w
f-
zw
¡:¡;
a:
o
(.)

1
• 1
TIEMPO 1 medida

Fig. 4 Gráfico de corriente en función del tiempo en polarografía de pulso.

Además, como el pulso que se aplica es de corta duración, la capa de difusión no se agota tanto como en la polarografía de
cd, y se obtienen niveles de corriente más elevados para concentraciones equivalentes. Se pueden medir concentraciones de
tan sólo 10-6 M, lo que permite una sensibilidad aproximadamente 1O veces mayor que la polarografía de cd. Los valores de la
corriente limitante se miden más fácilmente, dado que las ondas están libres de oscilaciones.
La polarografía de pulso diferencial es una técnica mediante la cual se aplica un pulso de altura fija al final de la vida de cada
gota, superpuesta a una corriente directa aumentada linealmente (ver Figura 5).

f.-- TIEMPO DE GOTEO -+- TIEMPO DE GOTEO---!

Fig. 5. Polarografía de pulso diferencial.

El flujo de corriente se mide justo antes de la aplicación del pulso y nuevamente al final del pulso. La diferencia entre estas dos
corrientes se mide y se representa en el registrador. Dicha señal diferencial proporciona una curva que se aproxima a la deriva-
da de la onda polarográfica y presenta un pico. El potencial del pico es equivalente a:

E112 - 13.E/2
en donde !'!.E es la altura del pulso. La altura del pico es directamente proporcional a la concentración a velocidades de barrido
constantes y a alturas de pulso constantes. Esta técnica es especialmente sensible (pueden determinarse concentraciones de
10-7M) y proporciona mejor resolución entre ondas poco espaciadas.

VOLTAMPEROMETRÍA DE REDISOLUCIÓN ANÓDICA

La voltamperometría de redisolución anódica es una técnica electroquímica por la cual se concentran (reducen) vestigios de
sustancias en solución sobre un electrodo y luego se redisuelven (oxidan) en la solución barriendo anódicamente el voltaje
aplicado. La medición del flujo de corriente como una función de este voltaje y la velocidad de barrido proporcionan informa-
USP 40 Pruebas Físicas/ (811) Finura de Polvos 809

ción cualitativa y cuantitativa sobre dichas sustancias. El paso de concentración permite realizar análisis a concentraciones de
10- 7 M a 10-9 M.
El instrumental básico incluye un generador de rampa de voltaje, un conjunto de circuitos para medición de corriente, una
celda con electrodos de trabajo, electrodos de referencia y contraelectrodos, y un registrador u otro dispositivo de lectura. Los
instrumentos que tienen capacidades polarográficas de cd o de pulso generalmente son muy adecuados para aplicación en
redisolución. El electrodo de trabajo comúnmente utilizado es el electrodo de gota de mercurio colgante (EGMC), si bien el
electrodo de capa fina de mercurio (ECFM) ha sido aceptado. Para el análisis de metales como por ejemplo plata, platino y
oro, cuyos potenciales de oxidación son más positivos que los del mercurio, y del mercurio mismo, se requiere el uso de elec-
trodos sólidos como por ejemplo platino, oro y carbón. Un electrodo de calomel saturado o un electrodo de plata-cloruro de
plata sirve como electrodo de referencia excepto para el análisis de mercurio o de plata. Como contraelectrodo se suele utilizar
un alambre de platino.
Las muestras que contienen el electrólito adecuado se colocan con pipeta en la celda. El oxígeno disuelto se elimina hacien-
do burbujear nitrógeno en la celda durante 5 a 1O minutos.
En general, se aplica un potencial de electrólisis equivalente a 200 a 300 mV más negativo que el potencial de media onda
del material que se debe analizar (aunque este potencial se debe determinar experimentalmente), con agitación durante 1 a
1O minutos. Para obtener resultados reproducibles, hay que mantener condiciones constantes (a saber, tiempo de deposición,
velocidad de agitación, temperatura, volumen de la muestra y tamaño de la gota, si se utiliza EGMC).
Después de la deposición, la agitación se suspende y la solución y el electrodo se dejan equilibrar durante un breve período.
El potencial luego se barre anódicamente con rapidez (1 O mV/segundo o más en polarografía de cd y 5 mV/segundo en pola-
rografía de pulso diferencial). Al igual que en la polarografía, la corriente limitante es proporcional a la concentración de las
especies (altura de la onda en cd y pulso, altura del pico en pulso diferencial), mientras que el potencial de media onda (cd,
pulso) o el potencial de pico (pulso diferencial) identifica la especie. Para obtener un desempeño satisfactorio, es fundamental
elegir cuidadosamente el electrólito de soporte. Por lo general, la cuantificación se logra por el método de adición del estándar
o por calibración.
Esta técnica es apropiada para el análisis de vestigios de metales pero tiene un uso limitado en las determinaciones orgáni-
cas, dado que muchas de estas reacciones son irreversibles. Al analizar sustancias tales como el cloruro, se puede emplear vol-
tamperometría de redisolución catódica. La técnica es la misma que la voltamperometría de redisolución anódica, excepto en
que la sustancia se deposita anódicamente y luego se redisuelve mediante un barrido de voltaje catódico.

(811) FINURA DE POLVOS

La distribución del tamaño de partícula se debe calcular mediante Estimación de la Distribución del Tamaño de Partícula por
Tamizado Analítico (786) o aplicando otros métodos, cuando resulte conveniente. En este capítulo, se proporciona una clasifi-
cación de finura de polvos, en términos descriptivos y sencillos. La medida de la finura de los polvos se realiza, por motivos
prácticos, mediante tamices. El tamizado es el método más adecuado si la mayoría de las partículas superan aproximadamente
los 75 µm, aunque también se puede usar para algunos polvos cuyos tamaños de partícula son inferiores, cuando el método se
pueda validar. La difracción de luz es otra técnica que también se utiliza ampliamente para medir el tamaño de una gran varie-
dad de partículas.

CLASIFICACIÓN DE FINURA DE POLVOS

Cuando la distribución acumulativa se determina mediante tamizado analítico u otros métodos, la finura de los polvos se
puede clasificar de la siguiente manera:
x90 =dimensión de partícula correspondiente al 90% de la distribución acumulativa de partículas de tamaño inferior al
esperado
x50 =mediana de la dimensión de partícula (es decir, 50% de las partículas son de menor tamaño y 50% de las partículas
son de mayor tamaño)
x 10 =dimensión de partícula correspondiente al 10% de la distribución acumulativa de partículas de tamaño inferior al
esperado
Se reconoce que el símbolo d también se utiliza ampliamente para designar estos valores. Por tanto, se pueden emplear los
símbolos d 90, d50 y d, 0 •
Los siguientes parámetros se pueden definir basándose en la distribución acumulativa. Qix) =distribución acumulativa de
partículas con una dimensión menor o igual ax, donde el subíndice R representa el tipo de distribución.

R Tipo de Distribución
o Número
1 Longitud
81 O (811) Finura de Polvos /Pruebas Físicas USP 40

R Tipo de Distribución
2 Área
3 Volumen

Por consiguiente, por definición:

1. Qix) = 0,90 cuando x = x90
2. QR(x) = 0,50 cuando x = x50
3. QR(x) =O, 1O cuando x = x10
La tabla que figura a continuación presenta un método alternativo, aunque menos informativo, para clasificar la finura de los
polvos.
Clasificación de los Polvos según su Finura
Distribución Acumulativa
Término Basada en Volumen,
Descriptivo Xso (µm) Q3(X)
Grueso >355 QJ(355) <0,50
Moderadamente Fino 180-355 Q3(l 80) <0,50 y Q,(355) 20,50
Fino 125-180 Q,(125) <0,50 y Q,(180) 20,50
Muy Fino <;125 Q,(125) 20,50

(821) RADIOACTIVIDAD

Cambio en la redacción:

1. INTRODUCCIÓN
2. CAPACITACIÓN DEL PERSONAL Y DÚCUMENTACIÓN
3. CALIFICACIÓN. DE INSTRUMENTOS
.. ..

4.1 lnspecdonesfískas.
4.2 J>arámetrosdel Sistema
4.3 Prueb(}s Opef<ltivas.... ·•· · • .. ··
5. IDENTIFICACIÓN DE RAOIONUCLEl·DOS
5.1 Determinación de laVidaMedia
5 .2 fipectrometría ¡;le Rayos Gamma
5. 3 Análisis e Identificación·· ¡;le .Emis!;)Jes li3eta
5.4 EspectrometríaAlfa. ·.· .· •· << ·
6. VALO!lACIÓN!)ERADIQN\)~~EIO()S •·. ••····>••• .. <•·.........·•.•.•··.·•·..• •<.••·••··••····· >
6.1 •Medición de la RadioactiviciadUsando un Calibrad()r de Dosis··
6.2 •. Medi<;i<)n. . dela Radipactiviciady~apdo ~n Dete~tpr,de.Es~(} do
6.3 Medición de Ja ~adio<'!ctividad ysando Si*mas Cromatog ... os
6.4.Medición
GLOSARIO ........ de la· ·. ~adioactiyidad
·.. ·. ·.·.· .... ·.... ·.......usando
··.· . . 1,.1nContac;lordeCentelleolíq\.lic;lp
. .... ·..· · .· . ·.·· . ·. · . ·........·..· . . ·
REFERENCIAS

los radiofánnacos· y dispositivos raqio¡;¡ctivqsrequieren• té.c:nic:af€specializadf,!,sparµ s1,1.•pi:oquq:ióf"1,• •¡;tn\jUsis,. manip1.d¡;¡c;ión,

dispensación y admin istrac.;ión,.afin de a$egurar• la efectividad .(>p~il:Tia y·rna[lteher.la seg(jridac;I cie tr¡;t:bájadqres,pacientes yet
público. Por ende, todas las operaciones que implkan dkhos artículos debel'l ser lli:¡vacias acabo poi' persi::mal qüe haya sido
adecuadamente capacitado ef"l lamanipulación de materiales radioactivos e instrumentos apropiados o bQ.johtsupervlsiónde
estos.
Las instalaciones. de produQ::ión, almacenamiento y uso de fármacos radioactivosy dispositivos radioactivos por fo. general
están sujetas a la U. S. Nuclear Regulatory Cornmission (Comisión Nudear Reglamentaria de los• EE.UU.) p agencicfdel Estado
USP 40 Pruebas Físicas/ (821) Radioactividad 811

Miembro, u otra agencia gubernamental similar fuera de los Estados Unidos. La mayoría de los fármacos radioactivos y disposi-
tivos radioactivos están sujetos a otras reglamentaciones relacionadas con el transporte, liberación en el medio ambiente y se-
guridad en el lugar de trabajo.
Las monografías USP para artículos radioactivos incluyen especificaciones .para la identificación de radionucleidos y la valora-
ción de radioactividad. Además, los sistemas de conteo de radioactividad o detec.tores de radioacti.vidad son instrumentos re-
queridos. para la determinación de la pureza radionucleídica y la pureza radioquímica. El propósito de este capítulo general es
proveer estándares para la medición de radioactividad, incluyendo calificación del instrumento, verificaciones de desempeño,
identificación de radionucleidos e impurezas radionucleídicas y la valoración de radionucleidos.
La información relacionada con la radioactividad se describe en RGdioactividad~ Teoría y Pr<ktica {1821), que ind uye defini-
ciones, tipos de desintegración, consideraciones generales relacionadas con la desintegración radioactiva, conteo, producción
de. radionucleidos, purez¡i, etiquetado e instrumentos para la detección y medición de emisiones radioactivas, así como un glo-
sario.

2. CAPACITACIÓN DEL PERSC>NAL Y DC>(U~ENTACIÓN

La capacitación del personal debe completarse de acuerdo con políticas y/o procedimientos escritos. La .documentadón de
la capacitación del personal debe incluirse en el Programa de Garantía de Calidad. El plazo de conservación de. la documenta-
ción varía dependiendo de los requisitos reglamentarios apropiados.

3. CALIFICACIÓN DE INSTRUMENTOS
La calificación de instrumentos debe completarse de acuerdo con políticas y/o procedimientos escritos. La documentación
de la Cé!lifícación. de instrumentos debe incluirse en el Programa de Garantía de Calidad. El plazo de conservación .de la d<1cu-
mentación varía dependiendo de los requisitos reglamentarios aplicables.

3.1 Calificación de la fnstalación

La calificación de la instalación (IQ, por sus siglas en inglés) debe realizarse al momento de la instalación de un instrumento
y después de una reparación mayor. Existen dos categorías en una calificación de la .instalación-la inspección visual y el. ~mtor­
no operntivo. •La inspección visual implica la verificación de. la condición del instrumento para determinar si está listo para uso.
La inspección confirma que todos los cables están intactos, que el .instrumento .está intacto sin piezas/partes rotas, y todos le>~
componentes del equipo están en condiciones de trabajo. El entorno operativo para el dispositivo se. somete ¡i una verificación
de. la temperatura, humedad y requisitos de energía apropiado.s. Se debe verificar .el entorno operativo. para evitar µna alta
radioactividad de fondo. Las temperaturas están por lo general .entre 10"-30~ y el rango de l}umedad relativa es por lo general
de 20o/<!-'-90%. Pvede ser necesario .el apantallamiento para asegurar que la r¡idiación de fondo no tenga un efecto m:igativo
sobre el desempeño del instrumento.

3.2 Calificación Operativa

La calificación operativa (OQ, por sus siglas en inglés) es una verificación de las especificaciones operativas para el equipo,
incluyendo configuración del equipo, análisis funcional de subsistemas y operáción general apropiada. La calificación operativa
debe describir los procedimientos operativos para el equipo y se lleva a cabo después de la calificación de la instalación y de
reparaciones mayores. La calificación operativa .debe inclµir todas las pruebas apropiadas para demostrar que el instrumento es
capaz de func.ionar de manera correcta. Los ejemplos típicos de calificación operativa incluyen exactitud del cronómetro, alto
voltaje,. ajuste a cero, respuesta de fondo y verificacióri de la contaminación.

3.3 Calificación ·del ,Desempeño

La calificación del desempeño (PQ, por sus siglas en inglés) demuestra que el equipo es capaz de reaUzar las tareas requeri-
das en el entorno operativo y que provee los resultados pretendidos. La calificación del desempeño debe describír las.tafeas de
desempeño requeridas para el equipo e incluir todas las pruebas apropiadas para demostrar que el instrumento funciona den-
tro de sus parámetros operativos. Estas pruebas de calificación del desempeño se realizan después de las pruebas de califica-
ción operativa. Además, algunas o todas las pruebas de calificación del desempeño se realizan de forma rutinaria (p. ej., a dia-
rio, trimestralmente, semíanualmente, anualmente) para demostrar la aceptación continua para el uso del instrumento, Las
pruebas típicas de calificación .del desempeño incluyen constancia y respuesta relativa, exactitud, reproducibilidad (precisión),
linealidad del sistema, determinación de curvas de "extinción" {quench), en contadores de centelleo líquido y equivalencia de
proveedores.
812 (821) Radioactividad / Pruebas Físicas USP 40

3A Análisis de la Geometría
El propósito del análisis de la geometría es demostrar lecturas correctas de la· muestra de prueba, teniendó>en ·cU:enta las
diferencias deen\lase, voh.il11en o>p()sieión dela muestra de prueba en comparación con el· estándar de calibradon radioactivo.
El Jiná1Isisdelágeó111etría debe realizarse dUránte la instiilladóndel C:alibradordedósis.Y para··cada.tipo deyial·y jeringa usados
para co.ntener .la muestra .de pri:Jeba.TElanálisisdebe inclüiref· receptáculo dela muestra de prueba.·Se pueden desarrollar fac-
tores de corretciórfsegún se reqoieri'L

4 .. PRUEBAS CONTlf!IUASDl··oESIMPERO DE>l.OS INSTRUMENTOS

Las pruebas de· desempeñó y opetathias se realizan deforma periódica pafaasegurar que el ínStrumento sea· capaz <le Cllrti-
plir con los criterios especificados para valoraciones exactas y qUe no han ocurrido cambios desde la prueba inicial. Las pruebas
incluyen inspección física, rnedicJó11 de l9s pªrárn.etrqs del sislefl'la y pruebas ()perativas con fuentes de calil)ración radioactiva.
Estas pruebas··también·debencompletarsedespu~s·qelásrepáraci!Q\1es.+Lasagencias•·teglamentáda{pueden reqUerir··1aaplica-
ción de pruebas. específicas ton Uf'la frecuén(:ía regular. (as siguientes secciones describen las pruebas de desempeño emplean-
do un• calibrador: ·de dosisi;;omóejémplo, Las pruel;l.as conttnt.lasde desempeñó p¡;¡fo•·otros• insttumentps usados en ni ediciones
de••tac¡iiación···debén tenerui:fdl$eñó>apropí¡1do.para cada •instr~mento, arializarido . los ·parámetros· pertinentes ·.para asegurar el
desempeño del instrumento, considerando su aplícación y él {livetde preeísión de la medición requerida.El mismo prif'leípio
aplicará para otros instrumentos usados par¡;¡ medidol"les de radiación.

4.J lnspe<;dones Físicas

Asegurarse dé que él· calibi'ador dé dosis y los attésoflosreladbnados, tales como receptáculos para la füente y los tubos
(well liners), estén .li[¡.res de daños y que no haya objetos extraí'ios•présentes en lacárnara. Ante$ de su uso,· se debe ·reparar·o
reemplazar cualquier componente dañado seg~n seJequíera yse deben retirar todos los objetos extraños.

4.2. Parámetros del Sistema

lOs·cor'ñpone11iteselectrónicosdeísistemádeben·an.111izarsede·ác1Jé~doconlósprocedím!entosdediagnóstitoae1•t¡;¡brican­
te~·Los··resultadosdebenttimplfr·•t!:l1'1;10stritéri0sc;leiai;;ép1áción>cre~lladosérielmanual•del···tabrícante/E5tas.·patámetras.·por•·10
general •incl.u~eri e1•·aJt-O·••voltaj~ erila(6rriata¡••el:ájust~•acero. e.ri ehelet:trómetro;•1a•verificadól'lde·las ·.c-Omurllcadonés entre
componentes detsi~tel11ay·•aéxatütlid••ael•crórl9metr<;i del: sistél11;i.
Si .no están.dlsponibl€slos·prócé(lir(¡iént<;lsdé·díi!f~nóstíco >(:te¡tanricánté, ehtóncesf como mínimo,• el· usuario delJe verifiéar1
registrárJ·gtafit:arlas.tendetlciasi;lélillto'\loltáfedélá••c~máriiJ•y<.felvalor·mec;tidopara•la•vedficatróri••de ájuste•·acerd•det•·eiec~
trómetro.·· Pequéños·cál11blósériél•·alto•vólfaié idéntifkafatli1uo<:lonár'ñiéntos.••íriadecuádos•en•·e1 sistema que podrían• no•.ser
aparentes con el uso de fuentes eje calíbr¡;¡ción ·radio¡;¡ttiva, pero que comenzarán a impactar lás lecfürás de aetividad mayores.
El cronómetro del sistema de.be ser verificadoydebe teneruna e>Sáetitud co.n una aproximación de un minuto;

4.J Pruel:)as Operativas

PRtJEBA. DERAOl~tl©N>DE FONÓCYY CClNTAMINACIÓN

El propóslt<:)de•estaprlie6itt és qéterr'ñinatél •f1.i\rél••dé~ai;llaci9n de fondo. 'f ·asegurar ta aüsencia·•··dé contaminación• que ·pudiec
ra ••afetfar· las··mediciones••deli::á1tbrá\'lqrdéd~$is; (át'adiaJ::ióri•de ftfrfolo pue<léfluctuar·.de!Jido al movlmienlo dé.·fuentes tercá-
nas a la cámara, así corno póda contarninadón ell o'cércá Clé.fá cár(¡árá, el fübo<o el rece!Jtáculo pará la f:u(!!nteCP.oresta
ra:z:ón, esta prueba debe realizarse c.on el tuboy elreceptácUl9 para la fuente en la támara. Todas las fuentes radioactivas de~
ber1contar con un apanta!Jamiento adetuadd6estaraúnadlstarici(l~º~cleritédela cámara. El nivel de radiación de fondo
debe determinarse y registrarse en· lc;i instala!;:ión inicia,I, y verificarse de manera periódica .. La radiación de fondo de6e registrar-
se al···menos0unavez.ca<Jadía.de u~q,•o c6.n.·['fi:(lypr.fre~ue:nciá·d.e•.·setne!ciesario¡•Usandota confígúr(l.Ción. del l"adiddUtJeido más
cornún·.·Es·.de.·espei;;ialimpottanc:;fa•verin<tarsilaC.antidádfüínll11adera'.dioacti\lidad•valorada.:dei;:rece.

El .·pfopósito•de.·•est¡¡¡ ptué~ é$. aségutarfü c9f'lstc;inti(l «:íe!italipradC>ti:fe·dosis ·c;.on•·et··páso •del·· tiempo. •.Esta· prueba •debe·reali-
.zarse· tada ·día.dé. uso•Y ~omple~arsadespaésd~· 1as pfl.~ebaScietsistema• descritas• ¡¡interiormente. Las•fuelltesdé calibraci9n
radloattiva•tfpitasusádasénesta pfl.1et>a• Són<el••Cesl(:>.l137 o•·el Co6a1to..;.<IO contenidos.•dentro ·de·· l.lna•··mattíi sólida;. H·éo!Jal~
to-57 puede no ser adecuadodebidoasuvida rnedia nominal de menos de un año. No se requiere que la fuente de calibra-
ción radioactiva tenga la misma geometría que las muestras de prueba de rutina. Una fuente de calibración radioactiva indivi-
dual es suficiente para esta verificación .La fuente se coloca en el receptáwlo para la fuente y la lectura se registra para la confi-
guración de radionucleido dedicada1 asfcomo paratodas las demás configuraciones de radionudeido comúnmente usadas.
USP 40 Pruebas Físicas/ (821 >Radioactividad 813

Esto asegura la ausencia de deriva en la respuesta para cualquier configurac;ión. Se deben registrar los resultados, los cuales
deben estar dentro del intervalo apropiado del valor corregido de desintegración registrado durante la calificación de la insta-
lación. Se deben usar gráficas de control u otras representaciones <:le da.tos pata identificar y documentar las tendencias.

PRUEBA DE EXACTITUD

El propósito de esta prueba es demostrar la estabilidad del calibrad.ar de d()$is a lo. largo del ·intervalo de eriergía usado. Esta
prueba debe realizarse anualmente o después de efectuar reparaciones:.óde rriover el,cal.ibrador de dosis. Si el calibrador de
dosis se usa para medir la cantidad. de múltiples radionucleidos,;. se deben incluir dos o tres fuentes.de .cáUbr~cióF! Jadjoactiva
distintas con díferehtes energías para aban:;ar el interválo de energía e~f:>erado de radíqnucleidos; Estas fuentes de calibración
podo general están contenidas en una matriz ~ólida y no necesaria merite cori'e$pondén cori la geometría qe las muest.ras de
prueba de rutina. Si el callbrador de dosis se usa únicamente para. un ·rádionudeidofüdividuál, q s(Jlo Píl:ra r:adiom.1deidos para
tomografía. de emisión de positrone5 (PET, pórsus siglas en inglés), :puede ser ¡;¡deé1,1ada !Sílii'sola fuente <'le calibración. La
cantidad de radioactividad en la fuente de calil:¡ración debe ser rnayór que .1 00 µCi (3;T ~ JOli Bq). las fuentes usadas para esta
prueba deben ser rastreables al Instituto Nadonal de Metrología cor;respondfehte; Las mediciones ·de la actividad de la. ft1ente
de calibración se registran y el v¡,¡lor medido promedio .se compara con el valor esperado, El valor medid!::> debe estar dentro
del intervalo apropiado del valor esperado.

PRUEBA DE REPRODUCIBILIDAD

El prqpósito de esta prueba es medir la precisión del cálibrador: de. dosis.y debe realizarse almenas anualmente. la fuente de
calibración radioactiva debe tener uná vida media tal .que no se requieran co.rrecciones,por desintegración durante efperiodo
de la prueba~ La <:.antidad de radioactividad .én la fuente de calibración'debe ser mayor: que l 00 ¡.tCi (3, 7, >< lo~ Bq). Se registra
un número aprópiado de lecturas consecutivas usando la misma geometría. Cada una de. las mediciones tomadas debe estar
dentro de un intervalo apropiado de fa medra de todas las mediciónes,

PRUEBA DE llN.EALrE>AD

El propósito de esta prueba es demostrar que la respúesta del calibra(:!or de dósís sea lineal en efintervalo de los niveles de
radioactividad que se vana medir. Esto esespedalmente crítico a niveles altos de radioadiVidád en donde.Ja radioactívidad
m~dida puede diferir de la verdadera radioactividad debido a efectos de saturáción,Y,a niveles baJos de radfoactMdad debido
a las variaciones en la radiación de fondo y a cambios en ~l posicionamiento de la fuente. Esta prueba debe realizárse anual-
mente o después de efectuar reparaciones o mover el calibrador dé dosis.
La prueba· se considera exitosa si el cociente entre la i"ádioactividad medida y la activídiid esperada esta dentro del interv:alo
apropiado de los valores esperados. Se pueden emplear tres técnicas para esta prueba: desintegración; bllndafe graduado y
fuente graduada. El uso de blindajes graduados es aceptable una vez que la prl!eba de lineafidad inieial que emplea. el método
de desintegración se completa de forma exitosa. Consultar las recomendaciones dél .fabricante sobre el uso de blindajes gra-
duados. El método de fuente graduadarequiere medicionesexáctas de\lofumen·o masa, ypor ló general no se recomienda.
La Tabla 1 es un ejemplo de verificaciones continuas de desempeño para calibradores de dosis.
Tabla 1. lista de Pruebas de Desempeño
Parámetro Diario" Anual (como mínimo)
Inspección física Sí N/A
Coll)ponentes electrónicos del sistema Sí N/A
Exactitud del cronómetro Sí N/A
Alto Voltaje Sí N/A
Ajuste del cero Sí N/A
Verificación de respuesta a la radiación de fondo
y contaminación Sí N/A
Fuente de calibración radioactiva (constancia y
respuesta relativa) sr N/Á
Exactitud Ver nota a! pieb Sí
Reproducibilidad (precisión) Ver nota alpieb Sí
Linealidad del sistema Vf:.r nota iil pieh Sí
• Al inicio de cada día de uso.
b Se requiere después de las reparaciones.
814 (821) Radioactividad / Pruebas Físicas USP 40

5. IDEN'flflCAC.IÓN DE .RADIONUCLEIDOS

5.2 Espectrometría de Rayos Gamma

5.4 Espectrometría Alfa

USP 40 Pruebas Físicas/ (821) Radioactividad 815

6. VALORACIÓN DE RADIONUCLEIDOS

6.1 Medición de la Radioactividad Usando un Calibrador de Dosis

La muestra de prueba se coloca en la cámara del calibrador de dosis usando un dispositivo que la mantiene en una posición
dada. La lectura de radioactividad se toma cuando se estabiliza la respuesta. Los resultados más exactos se obtienen al realizar
mediciones en la muestra de prueba con la misma geometría que la fuente de calibración; sin embargo, se pueden desarrollar
factores de corrección geométrica según se requiera. Consultar las recomendaciones del fabricante con respecto a la radioacti-
vidad máxima que se puede determinar en el calibrador de dosis.

6.2 Medición de la Radioactividad Usando un Detector de Estado Sólido

La muestra de prueba se coloca en frente del detector o en el interior del pozo del detector tipo pozo. El detector debe
blindarse de forma adecuada y calibrarse usando una fuente de calibración radioactiva rastreable a un Instituto Nacional de
Metrología.

6.3 Medición de la Radioactividad Usando Sistemas Cromatográficos

Se puede usar un detector de centelleo para mediciones dinámicas de radioactividad (p. ej., se hace pasar el eluato de un
cromatógrafo de líquidos a través de un detector o sobre él). La cantidad de radioactividad en la muestra de prueba debe
proveer una velocidad de conteo que esté dentro del intervalo lineal del detector.

6.4 Medición de la Radioactividad Usando un .Contador de Centelleo Líquido

El método de conteo por cen.telleo líquido es el método de laboratorio estándar para cuantificar la radioactividad de radio-
nucleidos emisores de partículas, en su mayoría radionucleidos que emiten partículas alfa y beta. El fluido de centelleo líquido
(cóctel) se elige dependiendo de la energía de la partícula beta en la muestra que se va analizar. El método de detección me-
diante conteo de centelleo líquido usa cócteles de centelleo líquido para transformar la radiación emitida en fotones de luz
detectables. La muestra que se va a analizar se coloca en un vial de centelleo líquido y el cóctel se agrega en la cantidad reque-
rida. Aunque se prefiere que la muestra disuelva en el fluido, se pueden valorar otras muestras si se cuantifica el impacto de la
porción no disuelta sobre la emisión de luz. El detector debe calibrarse usando una fuente de calibración radioactiva apropiada
rastreable a un Instituto Nacional de Metrología. La absorción de los fotones de centelleo se denomina extinción, y es necesa-
rio desarrollar una "curva de extinción" durante la calificación del desempeño, además de que pueden ser necesarias curvas de
extinción adicionales para diferentes tipos de muestras para corregir la eficiencia del conteo. Las pruebas de desempeño del
sistema de conteo de centelleo líquido deben llevarse a cabo cada día que se use el sistema para asegurar su funcionalidad.

GLOSARIO
Las siguientes definiciones se aplican a términos y frases comúnmente encontrados al tratar con Ja radioactividad.
Partículas alfa (a): Partículas con carga positiva emitidas a partir de núcleos durante la desintegración radioactiva. Las partí-
culas alfa son núcleos de Helio-4, que consisten en dos protones y dos neutrones, pero sin electrones.
Partículas beta (/3 -): Partículas con carga negativa emitidas a partir de núcleos durante la desintegración radioactiva. Las
partículas beta son electrones.
Factor de calibración: Coeficiente usado para convertir la corriente medida de la cámara de ionización a una radioactividad
nominal. Este término a menudo es conocido como el "coeficiente de calibración".
Tiempo de calibración: Tiempo y fecha arbitrarios, cuando resulte apropiado, en el cual se encuentra presente la cantidad
especificada de radioactividad.
Dispositivo de conteo: Consta de un elemento sensor y un dispositivo electrónico para ajustar la escala. La unidad sensor
puede ser un tubo Geiger-Müller, un contador proporcional, un detector de centelleo en el que se emplea un tubo fotomulti-
plicador en conjunto con un centellador, o un semiconductor en estado sólido.
Calibrador de dosis: Cámara de ionización de tipo pozo usada comúnmente para valorar radiofármacos. Por lo general, las
unidades de medida que se muestran están en curios {µCi/mCi/Ci) o becquerelios (kBq/MBq/GBq).
Rayos gamma (rayos y): Radiación electromagnética emitida a partir de núcleos durante la desintegración radioactiva. Los
rayos gamma tienen un amplio intervalo de energías. Los rayos gamma emitidos a partir de un radionucleido dado tienen
siempre las mismas energías, lo que provee una característica única que permite la identificación de un radionucleido emisor
gamma.
Contador Geiger-Müller: A menudo referido como "contador G-M" o "contador Geiger", es un instrumento en el que se
aplica un potencial de alto voltaje a través de un volumen de gas inerte con el propósito de recolectar iones producidos por un
campo de radiación. Los electrones negativos se multiplican internamente para producir un pulso de corriente fácilmente de-
tectable. Por lo general, las unidades se muestran en cuentas por minuto (cpm) o miliroentgen por hora (mR/hr).
816 (821) Radioactividad / Pruebas Físicas USP 40

Geometría: Las características de una fuente radioactiva (es decir, tipo de envase, espesor de la pared del envase, volumen y
posición del envase en la cámara de pozo) que, junto con las características físicas de la cámara de ionización, afectan la mag-
nitud del coeficiente de calibración para un radionucleido específico. Las consideraciones principales sobre geometría que pue-
den afectar la exactitud de una medición de la fuente en el calibrador de dosis son la configuración del envase, el volumen de
fuente, la posición de la fuente en el pozo de la cámara y el radionucleido mismo. [NOTA-Es común comparar una prepara-
ción estandarizada y un radiofármaco o preparación radiofarmacéutica usando condiciones geométricas idénticas para valora-
ción, identificación y otros parámetros. La validez del.resultado depende en gran medida de la reproducibilidad de la.s relado-
nes espaciales entre la fuente con el detector y sus alrededores, y de la exactitud de la preparación estandarizada.]
Cámara de ionización: Instrumento en el que se aplica un campo eléctrico a través de un volumen de gas ínerte con el pro-
pósito de recolectar iones producidos por un campo de radiación. Los iones positivos y los electrones negativos derivan a lo
largo de las líneas de fuerza del campo eléctrico, y se recolectan en electrodos, produciendo una corriente de ionización. El
formato de cámara de ionización de uso más común para la medíción de las actividades de radiofármacos es una cámara de
ionización de tipo pozo conocida como calibrador de dosis.
Isóbaras: Nucleidos con el mismo número másico (protones +neutrones).
Isómeros: Átomos con el mismo número de protones y neutrones, pero con una configuración de energía nuclear diferente.
Los isómeros radioactivos de vida corta por lo general se denominan metaestables. Isómeros diferentes son nucleidos que difie-
ren en sus configuraciones de energía nuclear.
lsótonos: Nucleidos con el mismo número de neutrones y un número diferente de protones. Los isótonos son elementos di-
ferentes con masas atómicas diferentes.
Isótopos: Nucleidos con el mismo número de protones y un número diferente de neutrones. Los isótopos son átomo.s del
mismo elemento con masa atómica diferente.
Portador isotópico (también denominado portador): Isótopo estable de! elemento en cuestión que está presente o que se
agrega a la preparación radioactiva en la misma forma química que el radionucleido.
Contador de centelleo líquido (LSC, por sus siglas en inglés): Instrumento que detecta luz de centelleo producida por la
absorción de energía de radiación en un líquido de centelleo. Este instrumento se usa principalmente para radionucleidos emi-
sores beta que no emiten fotones gamma. Para mejores resultados, la muestra radioactiva debe ser soluble en el líquido de
centelleo.
Actividad detectable mínima: Cantidad más pequeña de radioactividad que puede detectarse por encima de la radiación
de fondo con un nivel especificado de confianza.
Instituto Nacional de Metrología (NMI, por sus siglas en inglés): Entidad de estándares de medición, que es un laboratorio
de metrología que establece estándares para un país u organización. Por ejemplo el Nátional lnstitute of Stand.ards and Tech-
nology (Instituto Nacional de Normas y Tecnología o NISl) es el instituto nacional de metrología para los Estados Unidos.
Nucleido: Átomo con un número específico de protones y neutrones en· un estado de energía nuclear dado.
Positrones (J3 +}: Partículas con carga positiva emitidas a partir de un núcleo durante la desintegración radioactiva. Los posi-
trones son anti-electrones.
Radioactividad: (1) Transformación espontánea de núcleos caracterizada por la emisión de partíéulas o fotones. La radioacti-
vidad por lo general se describe como átomos que experimentan desintegración radioactiva en función del tiempo (o desinte-
graciones por unidad de tiempo). (2) La cantidad de material radioactivo, medida en curios (unidades de los EE.UU.) o bec-
querelios (Unidades del Sistema Internacional). La cantidad de material radioactivo también se denomina actividad.
Identidad radioquímica: La estructura molecular del ingrediente farmacéutíco radiactivo esperado que está presente en la
preparación radiofarmacéutica.
Pureza radioqufmica: El cociente, expresado como porcentaje, entre la radioactividad del ingrediente radiofarmacéutico ac-
tivo esperado y la radioactividad total de las impurezas e ingredientes radioactivos presentes en la preparación radiofarmacéu-
tica.
Radioisótopo: Un átomo radioactivo que por lo general se usa en el contexto de un isótopo de un elemento.
Radionudeido: Nucleido inestable que experimenta una desintegración radioactiva; un núcleo radioactivo. Los términos ra-
dio nucleido y radioisótopo comúnmente se usan de manera intercambiable.
Identidad radionucleídica: El radionudeido esperado en la preparación radiofarmacéutica.
Pureza radionucleídica: El cociente, expresado como porcentaje, entre la radioactividad del ingrediente radionucleído espe~
rado y la radioactividad total de todos los radionucleidos en la preparación radiofarmacéutica.
Radiofármaco (preparación radiofarmacéutica/fármaco radioactivo): Forma farmacéutica terminada que contiene una sus-
tancia radioactiva en conjunto con uno o más ingredientes y que está destinada para diagnosticar, clasificar una enfermedad,
monitorear tratamiento o proveer terapia. Un radiofármaco incluye cualquier kit de reactivo no radioactivo o generador de ra-
dionucleido que esté destinado para uso en la preparación de dicho tipo de sustancia. Los términos radiofármaco y prepara-
ción radiofarmacéutica a menudo se usan de manera intercambiable.
Contador de cristal de centelleo: Instrumento que cons~a de un cristal centellador, tal como Nal (TI), con un tubo fotomul-
tiplicador y componentes electrónicos asociados. La luz de centelleo producida a partir de la absorción de rayos gamma y ra-
yos X en el cristal se convierte a electrones y se amplifica en el tubo fotomultiplicador. El pulso de corrienté resultante puede
someterse a un análisis adicional con respecto a la energfa fotónica. Una forma comúnmente usada de este instrumento tiene
un orificio en el cristal con un tamaño suficiente para permitir la colocación de un tubo de prueba o un envase similar y se
conoce como contador de pozo. ·
USP 40 Pruebas Físicas/ (823) Fármacos para Tomografía de Emisión de Positrones 817

Detector semiconductor: Instrumento que consta de un material semiconductor, tal como cristales de silicio o germanio,
que detecta la radiación ionizante a través de la generación de portadores de carga (pasaje de electrones a través de orificios).
Se puede amplificar y analizar adicionalmente el pulso de corriente producido por la migración de.estos portadores de carga
bajo la influencia de un potencial de voltaje a lo largo del material, para determinar la cantidad y la energía de la radiación
incident.e.
Detector de estado sólido: Detector basado en cristal, diferente al detector basado en gas. A menudo se usa como sinóni-
mo de detector semiconductor.
Dosificación (concentración de radioactividad): La concentración de radioactividad del radiofármaco al momento de la.ca-
libración. La unidad de concentración es la cantidad de radioactividad por unidad de volumen (p. ej., mCi/ml. o MBq/mL).
Radioactividad total: La radioactividad del radionucleido, expresada por unidad (p. ej., vial, cápsula, ampolla, generador,
entre otros) al momento de la calibración.
Validación: Establecimiento de evidencia documentada de que un método, proceso o sistema cumple con los requisitos es-
perados.
Verificación: Confirmación de que un método, proceso o sistema establecido cumple con los criterios de aceptación prede-
terminados.
Rayos X: Tipo de radiación electromagnética emitida a partir de orbitales electrónicos. Aunque no surgen del núcleo, a me~
nudo se presentan inmediatamente después de un evento de desintegración si existen interacciones entre la radiación emitida
y los electrones orbitales.

REFERENCIAS
l. American Society for Testing and Materials (ASTM). Active.Standard ASTM 03648. Standard practices for the measur.e-
ment of radioactivity. West Conshohocken, PA: ASTM lnternational; 2011.
2. American A$sociation of Physicists in Medicine (AAPM). AAPM Report No. 181. The selection, use, calibration, and quality
assurance of radionuclide calibrators used in nuclear medicine. CoJlege Park, MD: AAPM; June 2012..,usr4 o

(823) FÁRMACOS PARA TOMOGRAFÍA DE EMISIÓN DE POSITRONES

PARA USO EN PREPARACIONES MAGISTRALES, INVESTIGACIÓN
CLÍNICA Y ESTUDIOS CIENTÍFICOS

INTRODUCCIÓN

Los radionucleidos usados para la tomografía de emisión de positrones (TEP) a menudo tienen vidas medias físicas cortas,
Tl/2 (p.ej., Tl/2 de 15 0 = 2,03 min, 62 Cu = 9,67 min, 13 N = 9,96 min, 11c = 20,4 min, 6BGa = 67,7 min, 1sF = 109,8 min, 6 4 Cu =
12,7 h). Como resultado, estos radionucleidos a menudo se obtienen mediante técnicas de aceleración de partículas (p.ej.,
ciclotrones) o en generadores, y luego se procesan para fabricar el producto farmacéutico terminado para TEP, muy cerca del
sitio donde se llevará a cabo el procedimiento de TEP.
Las cortas vidas medias de los radionucleidos para TEP derivan en limitaciones únicas para la preparación y análisis de pro-
ductos farmacéuticos para TEP. Este capítulo describe guías para la elaboración y análisis de productos farmacéuticos para TEP,
basándose en las siguientes limitaciones:
• No es posible completar todo el análisis antes de usar los productos farmacéuticos para TEP.
• Un solo vial puede contener una partida o subpartida completa de producto farmacéutico para TEP. Las muestras retira-
das para el análisis de control de calidad (CC) son representativas de toda la partida o subpartida.
• Una partida o subpartida completa puede administrarse a un único paciente.
• La masa del fármaco para TEP en un producto farmacéutico para TEP a menudo se encuentra en cantidades que varían
desde nanogramos hasta microgramos.
• Los productos farmacéuticos para TEP no entran en una cadena de distribución de medicamentos tradicional, sino que
estos se usan internamente o se entregan en el lugar de uso por servicios de distribución especializados.
• Las instalaciones de producción a pequeña escala para la preparación de productos farmacéuticos para TEP cuentan con
personal y recursos limitados, los cuales requieren lo siguiente:
- Facilitar la realización de operaciones múltiples en un área con controles adecuados;
- Facilitar la fabricación y el análisis de múltiples productos farmacéuticos para TEP usando equipo compartido;
- Requerimientos apropiados para operaciones asépticas;
- Requerimientos apropiados para la aptitud del equipamiento y demás actividades en el día de uso;
- Requisitos de control de calidad para componentes, materiales e insumos;
818 (823) Fármacos para Tomografía de Emisión de Positrones/ Pruebas Físicas USP 40

- Autoverificación de etapas importantes en la producción de radionucleidos, producción de fármacos para TEP o pre-
paración magistral y análisis; y
- Supervisión de la producción y preparación magistral, revisión de registros de partida y autorización para la libera-
ción por parte de una sola persona.
El alcance de este capítulo incluye la producción y preparación magistral de productos farmacéuticos para TEP para adminis-
tración en humanos para su uso (a) de conformidad con la práctica médica y farmacéutica regulada por el estado, (b) de con-
formidad con una solicitud de nuevo fármaco en investigación aprobada (IND, por sus siglas en inglés) (ver el Título 21 del
CFR 312) y (e) de conformidad con los requisitos para uso en estudios científicos bajo la supervisión de un Comité de Estudios
Científicos para Fármacos Radioactivos (Radioactive Drug Research Committee o RDRC; ver el Título 21 del CFR 361 ). El alcan-
ce de este capítulo no incluye actividades de dispensación conforme a lo definido en otros capítulos generales de la USP.

PERSONAL

Se debe contar con un número suficiente de personal con educación, capacitación y experiencia apropiadas para la prepara-
ción y análisis de productos farmacéuticos para TEP. El número depende del tamaño y la complejidad de las operaciones efec-
tuadas en cada instalación.

Requisitos de Capacitación
Se debe capacitar al personal antes de que comience a fabricar y a analizar productos farmacéuticos para TEP. La capacita-
ción se puede llevar a cabo mediante diversos métodos, que incluyen la instrucción presencial, la instrucción audiovisual y el
estudio de publicaciones. La capacitación debe tratar, pero no limitarse a, técnicas de producción de radionucleidos, métodos
de síntesis y purificación, materiales, componentes, reactivos, soluciones madre, aparatos automatizados y manuales usados
para fabricar productos farmacéuticos para TEP, así como métodos de ce, incluyendo equipos, software y documentación. La
capacitación se debe documentar.

Capacitación en Operaciones Asépticas

La capacitación debe tratar las manipulaciones asépticas y las técnicas y equipos usados para lograr y mantener las condicio-
nes ambientales Clase 5 de la lnternationa/ Organization far Standardization (ISO). La capacitación también debe tratar todas las
operaciones asépticas, incluyendo el ensamble de componentes estériles, la preparación magistral y el filtrado. Las manipula-
ciones de soluciones estériles deben ser llevadas a cabo por operadores calificados para el uso de técnicas asépticas (ver Instala-
ciones y Equipo a continuación).
Se debe evaluar periódicamente al personal implicado en operaciones asépticas mediante simulaciones asépticas en las que
se utilice medio de crecimiento microbiológico para evaluar la calidad de la operación aséptica. Las simulaciones asépticas de-
ben cumplir con lo siguiente:
• Incluir todas las manipulaciones requeridas para el montaje aséptico del ensamble del vial de producto farmacéutico para
TEP (p.ej., vial, filtro y ensamble de jeringa, entre otros).
• Representar los casos más extremos para operaciones asépticas.
• Deben realizarse por triplicado para calificar a un nuevo operador. Cada operador debe someterse anualmente a una reca-
lificación mediante por lo menos un llenado de medios.
• Se debe realizar siempre que se presenten cambios significativos en los procedimientos.
Después del proceso de simulación, los medios deben estar exentos de contaminación después de la incubación a una tem-
peratura adecuada durante 14 días. Un operador que no apruebe las evaluaciones escritas o cuyas simulaciones asépticas pre-
senten crecimiento microbiano deberá ser inmediatamente reinstruido y reevaluado a fin de asegurar la corrección de las defi-
ciencias en su práctica aséptica.

GARANTÍA DE CALIDAD

La GC es un concepto amplio que abarca todos los aspectos que influyen en la identidad, concentración, calidad y pureza
de un producto farmacéutico para TEP. El control de calidad es un subconjunto de la GC que trata el análisis de materiales y de
productos farmacéuticos para TEP para determinar si cumplen con los criterios de aceptación. La función de la GC por lo gene-
ral consiste en actividades de supervisión, mientras que la función del control de calidad se basa en actividades de ejecución.
Las funciones del control de calidad incluyen lo siguiente.
• Evaluar cada lote de material entrante para asegurar que cumple con las especificaciones establecidas antes de su uso en
la preparación o análisis de productos farmacéuticos para TEP.
• Evaluar cada partida de un producto farmacéutico para TEP para asegurar que ésta cumple con las especificaciones esta-
blecidas antes de autorizar su liberación final.
Las funciones de supervisión relacionadas con la GC incluyen lo siguiente:
• Revisar los registros de partida una vez completos para verificar su exactitud y que estén completos.
USP 40 Pruebas Físicas/ <823) Fármacos para Tomografía de Emisión de Positrones 819

• Aprobar procedimientos, especificaciones, procesos y métodos.

•Asegurar que el personal esté apropiadamente capacitado y calificado, según corresponda.
• Asegurar que los productos farmacéuticos para TEP posean una identidad, concentración, calidad y pureza suficientemen-
te definidos.
• Asegurar que los cambios en la calidad de los componentes, proveedores, cambios en los procedimiento de producción y
los cambios en los procedimientos de análisis y especificaciones sean apropiados y que se implementen de manera corres-
pondiente.
• Investigar errores y asegurar que se tomen las acciones correctivas y de prevención correspondientes para prevenir su re-
currencia.
• Gestión de quejas.
• Asegurar que la producción, análisis, etiquetado, liberación y distribución de los productos farmacéuticos para TEP se lle-
ven a cabo de conformidad con los procedimientos y prácticas establecidos en la instalación para productos farmacéuti-
cos para TEP.
• Llevar a cabo auditorías periódicas para monitorear el cumplimiento de los procedimientos y prácticas establecidos para
productos farmacéuticos para TEP.
El personal de la instalación puede ejercer funciones tanto de GC como de CC.

INSTALACIONES V EQUIPO

Las instalaciones deben ser adecuadas para la producción, preparación magistral y análisis de productos farmacéuticos para
TEP. Las áreas de trabajo deben mantenerse organizadas para evitar contaminación cruzada, mezclas y errores, especialmente
en las áreas usadas para la fabricación de múltiples productos farmacéuticos para TEP. El personal debe limpiar las áreas de
trabajo periódicamente para prevenir la contaminación de equipos, materiales, componentes o productos farmacéuticos para
TEP o aquellas condiciones del entorno, que pudieran tener un impacto negativo sobre la calidad del producto farmacéutico
para TEP. Estos requisitos deben describirse mediante procedimientos escritos y se debe documentar el ejercicio rutinario de
los mismos.

Controles Ambientales para Productos Farmacéuticos Parenterales para TEP

Debido a que los resultados de las pruebas de esterilidad para productos farmacéuticos parenterales para TEP se obtienen
después de la liberación, las instalaciones y equipos deben salvaguardar la esterilidad de un producto farmacéutico para TEP.

ESTACIÓN DE TRABAJO ASÉPTICA

El control ambiental primario para operaciones asépticas es un filtro de partículas del aire de alta eficiencia (HEPA, por sus
siglas en inglés) capaz de producir aire con un nivel de limpieza ISO Clase 5. Esto se puede lograr con una estación de trabajo
con flujo de aire laminar, aislador aséptico, cabina de seguridad biológica u otro dispositivo adecuado (reciben el nombre ge-
nérico de estaciones de trabajo asépticas). La estación de trabajo aséptica debe estar protegida de fuentes de contaminación
microbiana y se debe situar en un área en la que el tránsito de personal sea limitado. El área circundante a la estación de traba-
jo aséptica no debe usarse para el almacenamiento de materiales que desprendan grandes cantidades de partículas (p.ej., cajas
corrugadas).
La operación adecuada de la estación de trabajo aséptica se debe certificar midiendo las partículas en el aire, analizando la
integridad del filtro HEPA, analizando la presión diferencial, o por otros medios. Las pruebas específicas a realizar dependen del
tipo de estación de trabajo aséptica. La certificación debe llevarse a cabo al inicio de las operaciones y, posteriormente, por lo
menos una vez al año o después de reparar o reemplazar el filtro HEPA. Estos requisitos reemplazan cualquier otro requisito
provisto en los capítulos de información general de la USP (p.ej., Control Microbiológico y Monitoreo de Ambientes de Procesa-
miento Aséptico (1116)).
El área de trabajo dentro de la estación de trabajo aséptica debe estar limpia. Las superficies internas deben ser fáciles de
limpiar y desinfectar. Las superficies internas se deben limpiar y desinfectar usando desinfectantes apropiados esterilizados por
filtración o con certificación de esterilidad demostrada mediante certificado del fabricante.

PRUEBAS MICROBIOLÓGICAS

Se deben llevar a cabo pruebas microbiológicas del ambiente para evaluar la calidad del aire y la desinfección de la superficie
de las áreas asépticas. Esto se puede lograr mediante placas de muestreo por sedimentación o con placas activas para mues-
treo de aire. La desinfección de superficies críticas (p.ej., la superficie de trabajo de la estación de trabajo aséptica o los dedos
del operador) se debe evaluar con un hisopo o placas de contacto. Para el análisis microbiológico de la estación de trabajo
aséptica, se debe analizar el aire como parte de la calificación de la estación de trabajo (p.ej., semestralmente), mientras que la
superficie se debe evaluar (usando un hisopo o placas de contacto) después de su uso, cada día de uso. Los recuentos de partí-
820 (823) Fármacos para Tomografía de Emisión de Positrones/ Pruebas Físicas USP 40

culas no viables se pueden determinar con menor frecuencia después de la certificación de la Estación de Trabajo Aséptica (ver
anteriormente).
Se deben establecer límites de alerta e intervención para muestras obtenidas durante las pruebas microbiológicas. Los niveles
de alerta típicos se establecen a menos de tres unidades formadoras de colonias (ufc) por placa. Más de tres ufc requieren
acciones correctivas que pueden incluir la recapacitación del operador, recertificación de la estación de trabajo aséptica u otras
acciones. Los resultados de las pruebas microbiológicas también deben usarse para la investigación de pruebas de esterilidad
positivas.

Equipo

El equipo usado para fabricar y analizar productos farmacéuticos para TEP debe ser apropiado para el propósito al que se
destina y se debe instalar, limpiar y mantener de la manera correspondiente. El equipo debe ser capaz de producir resultados
uniformes.
Los siguientes requisitos deben describirse mediante procedimientos escritos y se debe documentar el ejercicio de los mis-
mos.
1. Instalación de Equipo Nuevo-El equipo recién instalado debe ser calificado con suficiente detalle antes de usarlo en la fa-
bricación o análisis de productos farmacéuticos para TEP, basándose en la complejidad del equipo. Todas las actividades
de calificación deben documentarse de manera apropiada, incluyendo la fecha y el nombre de la persona que llevó a ca-
bo la calificación. Para equipos más complejos, la calificación consiste en tres fases:
• Calificación de la Instalación (Cl)-La CI es una verificación de los puntos requeridos para la instalación apropiada del
equipo, los cuales incluyen ubicación física, servicios e insumos requeridos, interfases y condiciones ambientales. La
CI debe describir el procedimiento de instalación para el equipo.
• Calificación Operativa (CO)-La CO es una verificación de las especificaciones operativas del equipo, las cuales inclu-
yen configuración del equipo, pruebas de funcionalidad de subsistemas y la operación general adecuada. La CO de-
be describir los procedimientos operativos para el equipo.
• Calificación del Desempeño (CD)-La CD demuestra que el equipo es capaz de realizar las tareas requeridas para la
fabricación y análisis de productos farmacéuticos para TEP en el ambiente operativo y que el equipo proporciona los
resultados pretendidos. La CD debe describir las tareas que el equipo debe desempeñar.
2. Calibración del Equipo-La calibración del equipo analítico se debe llevar a cabo antes de su uso, según corresponda. Se
debe desarrollar un programa de recalibración que cuente con una frecuencia suficiente para asegurar resultados exactos.
Las actividades de calibración deben documentarse de manera apropiada, incluyendo la fecha y el nombre de la persona
que llevó a cabo la calibración.
3. Mantenimiento Preventivo del Equipo-Se debe desarrollar un programa de mantenimiento preventivo para equipo impor-
tante de producción y análisis, incluyendo módulos de análisis químicos automatizados, cromatógrafos de gases, croma-
tógrafos de líquidos de alta resolución, entre otros. El programa debe contar con una frecuencia suficiente para minimizar
el tiempo de inactividad del equipo. Las reparaciones serias pueden requerir recalibración y recalificación. Las actividades
de mantenimiento preventivo deben documentarse de manera apropiada, incluyendo la fecha de la acción y el nombre
de la persona que la llevó a cabo.

Limpieza de Equipos y Componentes

El equipo usado en la producción o preparación magistral de productos farmacéuticos para TEP incluye dispositivos automa-
tizados controlados por computadoras, así como aparatos de operación manual. Antes de su uso en la fabricación de produc-
tos farmacéuticos para TEP, el equipo debe limpiarse de manera apropiada para asegurar que el producto farmacéutico para
TEP resultante cumpla con las especificaciones establecidas de identidad, concentración, calidad y pureza (ver Controles y Crite-
rios de Aceptación para Productos Farmacéuticos para TEP Terminados a continuación). Una vez limpio, el equipo debe mantener-
se en dicho estado antes de su uso.
Es posible utilizar el equipo para fabricar múltiples partidas de uno o más productos farmacéuticos para TEP. Por lo que se
debe demostrar mediante estudios documentados la efectividad de los procesos de limpieza entre partidas. Se deben controlar
todas las impurezas a niveles que cumplan con las especificaciones establecidas para identidad, concentración, calidad y pure-
za. Los procedimientos escritos para la liberación de líneas entre partidas de diferentes productos farmacéuticos para TEP de-
ben describir la realización de los procesos de limpieza.

Verificaciones en el Día de Uso

Son necesarias ciertas verificaciones en el día de uso para asegurar el funcionamiento apropiado del equipo de procesamien-
to. Se deben establecer y seguir procedimientos escritos para las verificaciones en el día de uso. Estos procedimientos deben
estar diseñados para verificar parámetros clave al inicio de cada ciclo de operaciones (p.ej., temperatura, integridad de la pre-
sión, suministro de gas, suministro de vacío, selección de línea de entrega apropiada, volúmenes de entrega de reactivos, velo-
USP 40 Pruebas Físicas/ (823) Fármacos para Tomografía de Emisión de Positrones 821

cidades de flujo de gases, monitores de radiación y demás sensores del proceso). Algunos parámetros pueden verificarse perió-
dicamente como parte de los programas de calibración y mantenimiento preventivo, según se describió anteriormente.

Aptitud del Sistema para Equipo de CC

Las pruebas de aptitud del sistema para el equipo de CC son necesarias para asegurar que el conjunto de equipo, sus com-
ponentes y el personal operador (es decir, el sistema considerado como un todo) funcionen apropiadamente para ejecutar el
método analítico deseado. Las pruebas de aptitud del sistema se deben realizar antes de usar el equipo de acuerdo con los
procedimientos establecidos. Se deben establecer y seguir procedimientos escritos para las pruebas de aptitud del sistema, y se
deben documentar los resultados de dichas pruebas.
Las pruebas de aptitud del sistema requeridas para métodos cromatógraficos incluyen factor de asimetría, inyecciones repe-
tidas y resolución. Cuando el cromatograma de prueba usado para la aptitud del sistema contiene un único pico, entonces el
factor de asimetría, las inyecciones repetidas y la eficiencia de la columna (platos teóricos) son suficientes. Para estas determi-
naciones, es necesario el uso de estándares internos o externos con una concentración conocida. Los estándares deben prepa-
rarse a partir de materiales bien caracterizados o materiales certificados por el fabricante. A continuación se presentan dos en-
foques aceptables que se pueden usar para métodos cromatográficos:
1. Crear una curva de calibración a partir de una serie de estándares en un intervalo de concentraciones conocidas. Las con-
centraciones de los estándares deben comprender las condiciones de uso para el método cromatográfico. La curva de ca-
libración se debe utilizar durante un periodo adecuadamente especificado (p.ej., seis meses), después del cual se debe
crear una nueva curva de calibración. Se debe crear una nueva curva de calibración cada vez que se altere el sistema cro-
matográfico. La aptitud del sistema de rutina para inyecciones repetidas consiste en una sola inyección de un estándar
conocido y una medición de la concentración basada en la curva de calibración. Si la concentración medida concuerda
con la concentración conocida dentro de un intervalo predefinido (p.ej., 10% para inyecciones manuales y 5% para in-
yecciones automatizadas) esto demuestra la aptitud del sistema en inyecciones repetidas y asegura que la curva de cali-
bración es apropiada para su uso en inyecciones de muestra subsiguientes. El factor de asimetría y la resolución (o eficien-
cia de la columna, según corresponda) se deben determinar a partir del mismo cromatograma.
2. Al inicio de cada ciclo de análisis, crear una calibración de un solo punto, a partir de dos inyecciones de un estándar cono-
cido. El área medida de los picos para estas inyecciones debe concordar dentro de un intervalo predefinido (p.ej., 10%
para inyecciones manuales y 5% para inyecciones automatizadas). Posteriormente, los resultados se promedian y utilizan
con la concentración estándar para proporcionar un factor de calibración que se usa en inyecciones de muestra subsi-
guientes para ese día. El factor de asimetría y la resolución (o eficiencia de la columna, según corresponda) se deben de-
terminar a partir de uno de los dos cromatogramas.
Otros parámetros cromatográficos, tales como la relación señal-ruido, el límite de detección y el límite de cuantificación, se
pueden determinar como parte de un análisis rutinario de la aptitud del sistema.
Las pruebas de aptitud del sistema también pueden ser apropiadas para otro equipo de CC, incluyendo calibradores de do-
sis, escáneres para radio-cromatografía en capa delgada (radio-TLC) y analizadores multicanal. Cuando se utilizan, estas prue-
bas deben realizarse al momento de instalar, reubicar y, posteriormente, en intervalos apropiados. En estas pruebas, se deben
usar estándares conocidos para demostrar el funcionamiento apropiado del equipo, por ejemplo:
1. Calibrador de Dosis-La exactitud, geometría y linealidad se deben evaluar al momento de la instalación y, posteriormen-
te, en intervalos apropiados. El instrumento debe calibrarse de conformidad con estándares reconocidos a nivel nacional o
con las instrucciones del fabricante. Las pruebas de aptitud del sistema de rutina deben incluir una verificación de cons-
tancia con una fuente de radionucleidos de alta energía adecuada.
2. Escáner para Radio-TLC-La unformidad, exactitud posicional, linealidad del detector y resolución se deben evaluar con
una fuente de radionucleido adecuada. La prueba de aptitud del sistema de rutina debe incluir verificaciones para estos
parámetros.
3. Analizador Multicanal-La sensibilidad y la resolución se deben evaluar al momento de la instalación y, posteriormente, en
intervalos apropiados. Las pruebas de aptitud del sistema de rutina deben incluir una verificación de constancia con una
fuente de radionucleidos de alta energía adecuada.

CONTROL DE COMPONENTES, MATERIALES E INSUMOS

Se deben controlar los componentes, materiales e insumos que se usan en la preparación de productos farmacéuticos para
TEP para evitar la contaminación, mezclas y errores. Se debe designar a una persona como responsable de asegurar que estas
actividades se lleven a cabo y se completen de manera apropiada. Los registros de exámenes y pruebas completados para
componentes, materiales e insumos se deben conservar durante un año después de su vencimiento o durante un año después
de la liberación del lote, lo que represente el periodo más largo. Es necesario establecer y llevar a cabo las siguientes activida-
des:
1. Establecer especificaciones escritas para la identidad, concentración, calidad y pureza de ingredientes, reactivos, materia-
les diana y gases.
822 (823) Fármacos para Tomografía de Emisión de Positrones/ Pruebas Físicas USP 40

2. Establecer especificaciones escritas para la identidad y calidad de viales vacíos estériles, líneas de transferencia, llaves de
paso estériles, agujas estériles, filtros de membrana estériles y otros componentes usados en el ensamble del vial del pro-
ducto farmacéutico para TEP.
3. Establecer especificaciones escritas para la identidad, concentración, calidad y pureza de insumos analíticos (p.ej., disol-
ventes, columnas cromatográficas y estándares auténticos), medios de pruebas de esterilidad y reactivos para pruebas de
endotoxinas usados en el análisis de productos farmacéuticos para TEP.
4. Establecer condiciones de almacenamiento apropiadas (basadas en calor, luz, humedad y otros factores) para componen-
tes, materiales e insumos usados para fabricar y analizar productos farmacéuticos para TEP.
5. Almacenar componentes, materiales e insumos en un área con acceso controlado, de acuerdo con las condiciones de al-
macenamiento establecidas. Segregar componentes, materiales e insumos, según corresponda, para evitar mezclas y erro-
res.
6. Anotar cada lote de envío de componentes, materiales e insumos, y registrar la fecha de recepción, cantidad recibida,
fabricante, número de lote del fabricante y fecha de caducidad. Si el fabricante no designa una fecha de caducidad, asig-
nar una basándose en el conocimiento de sus propiedades físicas y químicas y en la experiencia de uso previa. Para sustra-
tos orgánicos y reactivos que son potencialmente susceptibles a la degradación o a cambios en su composición, la fecha
de caducidad se debe basar en la estabilidad del material.
7. Determinar que cada lote de componentes, materiales e insumos cumple con las especificaciones escritas establecidas. El
cumplimiento de las especificaciones se puede demostrar inspeccionando el etiquetado o inspeccionando la certificación
del fabricante. La identidad de cada lote de componentes, materiales e insumos debe ser verificada mediante procedi-
mientos y pruebas definidas, o con la certificación documentada del fabricante, según corresponda. Realizar una prueba
de identidad para precursores (p.ej., determinación del punto de fusión u otras pruebas adecuadas). Como alternativa, se
puede usar la certificación del fabricante como el único criterio de aceptación para un precursor, si se asegura mediante el
análisis del producto farmacéutico para TEP que se ha utilizado el precursor correcto. Los estándares de referencia usados
en los procedimientos cromatográficos deben contar con documentación adecuada sobre identidad y pureza. Se pueden
aceptar otros componentes basándose únicamente en la certificación del fabricante.
8. Los filtros de membrana usados con productos farmacéuticos parenterales para TEP deben contar con la certificación del
fabricante. Examinar la certificación del fabricante para cada lote a fin de asegurar el cumplimiento de la especificaciones
escritas.
9. Los medios usados en las pruebas de esterilidad de productos farmacéuticos para TEP se pueden obtener de fuentes co-
merciales. Si los medios se obtienen de fuentes comerciales, entonces la prueba de promoción de crecimiento que emplea
una sola especie de organismo adecuada se debe llevar a cabo durante la calificación inicial del proveedor y, en adelante,
periódicamente (p.ej., trimestralmente).

CONTROLES DE PROCESO V OPERATIVOS

Controles de Proceso

Los siguientes controles de proceso deben establecerse y resumirse en una fórmula maestra para el producto farmacéutico
para TEP. Se debe designar a una persona como responsable de asegurar que estas actividades se lleven a cabo y se completen
de manera apropiada.
1. Se deben establecer criterios de aceptación escritos para la identidad, concentración, calidad y pureza de cada producto
farmacéutico para TEP. Para productos farmacéuticos para TEP destinados para administración parenteral, las especifica-
ciones deben incluir esterilidad y endotoxinas bacterianas. Cuando existe una monografía de la USP o cuando existen es-
pecificaciones previamente aceptadas por la agencia reglamentaria correspondiente (p.ej., FDA), entonces estos estánda-
res, si corresponde, pueden utilizarse como los criterios de aceptación mínimos.
2. Los procedimientos escritos para la preparación de cada producto farmacéutico para TEP deben incluir lo siguiente:
• Incorporar, para cada producto farmacéutico para TEP destinado para administración parenteral, filtración por mem-
brana estéril (0,22 µm) o esterilización por vapor;
• Incorporar, para cada producto farmacéutico para TEP destinado para inhalación, filtración de partículas (0,45 µm);
• Describir procedimientos de limpieza de rutina para el equipo y las instalaciones;
• Describir componentes, materiales e insumos usados para fabricar productos farmacéuticos para TEP, incluyendo pre-
cursores, estándares, reactivos, soluciones madre y artículos relacionados;
• Describir el proceso y los pasos empleados para fabricar el producto farmacéutico para TEP;
• Describir el proceso de formulación, incluyendo el uso de estabilizadores, soluciones amortiguadoras y otros agentes;
• Describir los cálculos realizados para parámetros cuantitativos relacionados con la fabricación y el análisis de CC del
producto farmacéutico para TEP (p.ej., incluir rendimiento radioquímico, pureza radioquímica, actividad específica,
cantidades de disolvente, etc.);
• Describir pruebas de control de calidad para el producto farmacéutico final para TEP (ver Controles y Criterios de Acep-
tación para Productos Farmacéuticos para TEP Terminados a continuación), incluyendo un programa que defina las
pruebas que se deben realizar para cada partida y que indique si los resultados deben estar completados al momento
de la liberación.
USP 40 Pruebas Físicas/ (823) Fármacos para Tomografía de Emisión de Positrones 823

3. Se debe verificar la calidad de cada partida de un producto farmacéutico para TEP, mediante el análisis del producto ter-
minado total, antes de su uso para asegurar que el producto cumple con todas las especificaciones.
4. Para los casos en los que no sea posible o práctico llevar a cabo el análisis descrito en el párrafo anterior, la calidad de un
producto farmacéutico para TEP también se puede asegurar mediante estudios de validación documentados, en lugar de
pruebas previas a la liberación. Estos estudios deben cumplir con lo siguiente:
• Demostrar que el proceso es uniforme y adecuado para la preparación del producto farmacéutico para TEP deseado;
• Realizarse en tres partidas fabricadas de acuerdo con la fórmula maestra, en donde todas estas partidas deben cum-
plir con los criterios de aceptación;
• Incluir la evaluación de identidad y pureza radioquímica, identidad y pureza radionucléidica, actividad específica, es-
terilidad (para productos farmacéuticos parenterales para TEP), endotoxinas bacterianas (para productos farmacéuti-
cos parenterales para TEP), pH, apariencia, pureza estereoquímica (para compuestos aplicables), disolventes residua-
les, otros productos químicos tóxicos que pudieran haberse usado durante el procedimiento de síntesis o purifica-
ción, concentración efectiva de un estabilizante (si lo hubiere), pureza química del producto farmacéutico para TEP y
equivalencia de subpartidas iniciales y finales (ver la sección anterior, Definiciones);
• Repetirse si el proceso y los pasos descritos en la fórmula maestra han sido alterados de alguna manera que pudiera
cambiar la identidad, concentración, calidad o pureza del producto farmacéutico para TEP;
5. Los procesos y pasos descritos en la fórmula maestra deben actualizarse según se requiera y revisarse anualmente para
asegurar su vigencia. Antes de implementar cualquier actualización, será necesario llevar a cabo y aprobar una validación
y/o verificación.
Los controles apropiados de los equipos controlados por computadora deben asegurar que los cambios en el proceso sean
instituidos únicamente por personal autorizado y que tales cambios sean documentados y verificados. Es indispensable crear
copias de seguridad y controlar los métodos de producción, preparación magistral y análisis para evitar el uso accidental de
métodos desactualizados. En lo que respecta a procesos o métodos de prueba de un proveedor que se usan sin alteraciones, es
aceptable basarse en la certificación del proveedor para la verificación del software y la operación adecuada.

Controles Operativos

Los controles operativos siguientes deben establecerse y resumirse en un registro de partida que es una parte de la fórmula
maestra para el producto farmacéutico para TEP. El registro de partida debe documentar de manera adecuada el proceso de
rutina para la fabricación del producto farmacéutico para TEP. Se debe designar a una persona como responsable de asegurar
que estas actividades se lleven a cabo y se completen de manera apropiada. Los registros de partida completados y la docu-
mentación relacionada deberá conservarse durante un año después de la liberación de partida.
1. Se deben ejecutar los procedimientos de liberación de línea adecuados para evitar mezclas y contaminación cruzada, que
incluyan la inspección de áreas usadas para fabricar y analizar productos farmacéuticos para TEP y la inspección de la lim-
pieza y aptitud de todo el equipo antes de su uso. Retirar materiales y etiquetas que no correspondan a la partida de estas
áreas y equipos.
2. Asegurar la identidad, concentración, calidad y pureza correctos de componentes, materiales e insumos usados en la pre-
paración del producto farmacéutico para TEP. Etiquetar componentes según corresponda para propósitos de identidad y
rastreabilidad.
3. Ejecutar procedimientos de limpieza de rutina para los equipos e instalaciones.
4. Preparar el producto farmacéutico para TEP de acuerdo con la fórmula maestra vigente y mantener un registro de partida
para cada partida. Los registros de partida pueden constar de documentación en papel, registros electrónicos o una com-
binación de los mismos. Se deben verificar las planillas de cálculo y demás herramientas electrónicas para conservación de
registros, a fin de asegurar la rastreabilidad, integridad de los datos, exactitud de resultados para cálculos, entre otros. El
registro de partida debe incluir lo siguiente:
• Los número de lote u otros identificadores únicos para todos los componentes, materiales e insumos usados para fa-
bricar el producto farmacéutico para TEP;
• Una descripción de los procedimientos individuales realizados;
• Las iniciales, firma u otro identificador del individuo responsable de confirmar que se hayan completado los pasos y
procesos críticos usados para fabricar y analizar el producto farmacéutico para TEP;
• El rendimiento porcentual calculado con respecto a la cantidad conocida o esperada del radionucleido inicial que se
incorpora sintéticamente al producto farmacéutico para TEP;
• Los datos analíticos brutos de cada partida de producto farmacéutico para TEP;
• Etiquetado para el producto farmacéutico para TEP (ver Etiquetado a continuación);
• Cálculos para parámetros clave definidos en la fórmula maestra;
• Resultados obtenidos de las pruebas de control de calidad del producto farmacéutico para TEP, incluyendo cromato-
gramas, listados impresos y demás datos de prueba;
• Las iniciales del analista que realizó cada prueba de control de calidad;
• Indicación del resultado de cada prueba de control de calidad, indicando si el resultado cumple o no con los criterios
de aceptación;
824 (823) Fármacos para Tomografía de Emisión de Positrones/ Pruebas Físicas USP 40

• La fecha y hora de la liberación y la firma del individuo que asume la responsabilidad general y el cumplimiento con
los procedimientos definidos para fabricar la partida y que autoriza la liberación de la partida para administración en
humanos; y
• Documentación de las desviaciones del proceso en el registro de partida, cuando corresponda.
Las entradas en los registros de partida se deben realizar inmediatamente después de haber llevado a cabo la actividad y
deben incluir las iniciales, firma u otro identificador de la persona que registra la entrada. Las correcciones a las entradas en
papel deben incluir fechas e iniciales, firmas o anotaciones con un identificador de la persona que efectúa las correcciones pero
dejando la entrada original legible.

Operaciones Asépticas para Productos Farmacéuticos Parenterales para TEP

Debido a que los resultados de las pruebas de esterilidad para productos farmacéuticos parenterales para TEP se obtienen
después de la liberación para administración en humanos, las operaciones y procedimientos asépticos deben asegurar de ma-
nera adecuada la esterilidad del producto farmacéutico para TEP estéril. Todos los productos farmacéuticos para TEP prepara-
dos asépticamente para administración parenteral se deben filtrar a través de un filtro de membrana estéril con un tamaño de
poro de 0,22 µm o menor en un vial o envase cerrado estéril o esterilizado mediante esterilización por vapor. Aunque la sínte-
sis química de un producto farmacéutico parenteral para TEP se puede llevar a cabo en un aparato abierto o cerrado, la filtra-
ción por membrana del producto farmacéutico para TEP se debe realizar en un sistema cerrado posterior al filtro de membra-
na. Este sistema se debe ensamblar asépticamente, usando componentes preesterilizados, disponibles comercialmente.

COMPONENTES

Los componentes estériles usados en el aparato ensamblado asépticamente, por lo general, consisten en un vial vacío, agu-
jas, filtros de membrana, agujas de venteo, jeringas, sistemas de tubos, llaves de paso, entre otros. Todos los componentes
deben ser artículos preesterilizados disponibles comercialmente y de un solo uso. Si los componentes del aparato ensamblado
asépticamente se esterilizan en la instalación donde se lleva a cabo la TEP, se deben verificar los procesos de esterilización. La
configuración exacta del ensamble del vial de producto farmacéutico para TEP depende de cada proceso. Un ejemplo típico es
un vial vacío, estéril, con un filtro de membrana con un tamaño de poro de 0,22 µm, unido a una aguja que se inserta a través
del septo del vial para filtración, un filtro de membrana con un tamaño de poro de 0,22 µm unido a una aguja que se inserta a
través del septo del vial para ventear el vial durante la filtración, y una jeringa con una aguja insertada a través del septo del
vial para retirar la muestra de control de calidad después de completar la filtración.

ENSAMBLE DEL VIAL DE PRODUCTO FARMACÉUTICO PARA TEP

Se deben usar técnicas asépticas en el ensamblaje del vial de producto farmacéutico para TEP, especialmente en el ensamble
de todos los componentes subsiguientes al filtro de esterilización por membrana. Estas operaciones deben llevarse a cabo en
un ambiente ISO Clase 5 (ver la sección anterior, Instalaciones y Equipo).
Después de ensamblar el vial de producto farmacéutico para TEP en el ambiente ISO Clase 5, el ensamble puede ser retirado
hacia otra localización para filtración. Esta ubicación puede ser un ambiente no controlado siempre que no se comprometa
durante el proceso la integridad del ensamble del vial de producto farmacéutico para TEP. Todo ensamble de vial de producto
farmacéutico para TEP cuya integridad se vea comprometida durante dicho proceso, deberá ser desechado.

TÉCNICAS ASÉPTICAS

Cualquier componente estéril posterior al filtro de membrana que entre en contacto con el producto farmacéutico para TEP,
deberá manipularse usando técnicas asépticas adecuadas, dentro de la estación de trabajo aséptica. Durante las operaciones
asépticas, los operadores deben usar vestimentas adecuadas, que incluyen una bata de laboratorio limpia, mangas para ante-
brazos, cubre cabello, guantes higienizados que cubran las muñecas y cubrebarbas/bigote (según corresponda). Durante un
solo ciclo operativo aséptico es posible preparar múltiples ensambles de viales de productos farmacéuticos para TEP. Las condi-
ciones de almacenamiento y el tiempo de ensamble de los viales debe basarse en datos obtenidos de simulaciones asépticas.

INOCULACIONES PARA PRUEBAS DE ESTERILIDAD

Se deben llevar a cabo pruebas de esterilidad para evaluar la calidad de los productos farmacéuticos para TEP destinados
para administración parenteral. La inoculación de los medios para pruebas de esterilidad se debe realizar de tal manera que se
ajuste a los requisitos de exposición del personal a la radiación, al tiempo que minimice el riesgo de falsos positivos ocasiona-
dos por contaminación adventicia durante el proceso de inoculación. Para tubos de medios con abertura mediante tapa de
rosca, la inoculación se debe realizar en la estación de trabajo aséptica. Los tubos de medios con una tapa de septo se pueden
inocular en un área blindada que no contenga un filtro HEPA.
USP 40 Pruebas Físicas / (823) Fármacos para Tomografía de Emisión de Positrones 825

ESTABILIDAD

Se deben establecer especificaciones escritas para la fecha de caducidad y las condiciones de almacenamiento de cada pro-
ducto farmacéutico para TEP. La fecha de caducidad debe basarse en los resultados de las pruebas de estabilidad (y en requisi-
tos de actividad específicos, según corresponda). Las pruebas de estabilidad del producto farmacéutico para TEP se deben lle-
var a cabo a la concentración más alta del producto farmacéutico para TEP y en el vial o envase final previsto. Se deben alma-
cenar por lo menos tres partidas del producto farmacéutico para TEP de acuerdo con las condiciones propuestas y deberán
examinarse una vez transcurrido un periodo equivalente a la vida útil propuesta. Asimismo, el producto farmacéutico para TEP
debe cumplir con los criterios de aceptación para pureza radioquímica, apariencia (color y claridad), pH y efectividad del esta-
bilizante (según corresponda) y pureza química al momento de la caducidad. Los métodos analíticos deben ser confiables, sig-
nificativos y específicos. Los estudios de estabilidad deben repetirse si se presenta un cambio en la concentración, en el conte-
nido de estabilizante (o conservante) que pudiera afectar la estabilidad, el vial o envase final, las condiciones de almacena-
miento o la fecha de caducidad. Se deben documentar los resultados de las pruebas de estabilidad.

CONTROLES Y CRITERIOS DE ACEPTACIÓN PARA PRODUCTOS FARMACÉUTICOS PARA TEP

TERMINADOS

Se deben establecer especificaciones escritas para la identidad, concentración, calidad y pureza de cada producto farmacéu-
tico para TEP. Para productos farmacéuticos para TEP destinados para administración parenteral, se deben incluir especificacio-
nes sobre esterilidad y endotoxinas bacterianas.
Se deben desarrollar procedimientos escritos para pruebas de control de calidad. Se deben establecer requisitos sobre con-
trol de calidad y documentación para cada partida o subpartida de un producto farmacéutico para TEP (ver la sección anterior,
Controles de Proceso y Operativos). Todas las pruebas de control de calidad deben ser ejecutadas por personal calificado y capa-
citado de acuerdo con los procedimientos escritos.
La corta vida media de los radionucleidos para TEP con frecuencia impide completar todas las pruebas de control de calidad
antes del envío del producto farmacéutico para TEP, lo que genera dos niveles de liberación, uno para distribución y el otro
para administración en humanos. Lo anterior es aceptable siempre y cuando las pruebas de control de calidad requeridas para
la liberación del producto farmacéutico para TEP para administración en humanos (ver a continuación) se completen antes de
la administración. Los controles usados en la liberación para distribución deberán establecerse previamente por escrito y docu-
mentarse de manera rutinaria. No es necesario conservar muestras de reserva de productos farmacéuticos para TEP.
Cuando se usa un procedimiento farmacopeico de la USP, éste deberá ser verificado para demostrar que la prueba funciona
en las condiciones de uso reales. Los procedimientos de prueba no farmacopeicos usados para analizar un producto farmacéu-
tico para TEP deben ser confiables y específicos. Los datos que respaldan todos los métodos analíticos deben estar documenta-
dos. Algunas pruebas de control de calidad se pueden omitir basándose en datos obtenidos de controles realizados durante el
proceso o de estudios realizados sobre el proceso. Un ejemplo de este tipo de procedimiento es la exención de la determina-
ción de clorodesoxiglucosa cuando se analiza [1BF]fludesoxiglucosa. Se deben documentar los controles durante el proceso y
los datos que respaldan los estudios realizados sobre los procesos.

Pruebas de Control de Calidad

Las siguientes pruebas de control de calidad se deben llevar a cabo en cada partida antes de su liberación para adminstra-
ción:
1. Apariencia mediante inspección visual del color y transparencia (ausencia de partícufas) para formas farmacéuticas paren-
terales.
2. Medición del pH para formas farmacéuticas parenterales.
3. Determinación de la pureza radioquímica e identidad para todas las formas farmacéuticas.
4. Determinación de la identidad radionucléidica de todas las formas farmacéuticas por medición de vida media.
5. Determinación de la concentración.
6. Determinación de la actividad específica de productos farmacéuticos para TEP cuya localización sea dependiente de la
masa o cuya toxicidad sea preocupante.
7. Determinación de disolventes residuales usados en los procesos de síntesis o purificación.
8. Determinación de la pureza química y compuestos residuales usados en los procesos de síntesis o purificación (p.ej., el
criptando [2.2.2]).
9. Determinación de conservante o estabilizante, si estuvieran presentes.
Para productos farmacéuticos para TEP con radionucleidos con vidas muy cortas, preparar una subpartida inicial para control
de calidad que sea representativa de las subpartidas subsiguientes que se preparan en un ciclo operativo definido. Las pruebas
de control de calidad descritas en el párrafo anterior se deben tomar en cuenta para la subpartida de control de calidad antes
de la liberación de subpartidas subsiguientes para administración en humanos. Para partidas subsiguientes de formas farma-
céuticas parenterales y de inhalación, se debe llevar a cabo una inspección visual antes de la administración en humanos. En
algunos casos, puede ser apropiado realizar un análisis limitado de cada subpartida antes de su administración (p.ej., determi-
nación de pH en el caso de [13 N]amoníaco producido por la aleación de Devarda).
826 (823) Fármacos para Tomografía de Emisión de Positrones / Pruebas Físicas USP 40

Pruebas Periódicas Indicadoras de Calidad

En todos los productos farmacéuticos para TEP, se debe medir periódicamente la pureza radionucléidica de muestras desin-
tegradas del producto, a fin de evaluar la presencia de radionucleidos de vida larga producidos durante el bombardeo con el
acelerador de partículas. En productos farmacéuticos para TEP marcados con ciertos radionucleidos (p.ej., 94mTc, 1 241, 64Cu, 76Br,
entre otros), se deberá considerar la medición de pureza radionucléidica mediante espectrometría por emisión de rayos gam-
ma. Las pruebas periódicas indicadoras de calidad de productos farmacéuticos para TEP también incluyen impurezas no tóxi-
cas de bajo nivel (p.ej., disolventes residuales Clase 3). Las pruebas periódicas deben llevarse a cabo en intervalos predetermi-
nados en lugar de partida por partida.

Pruebas Microbiológicas para Productos Farmacéuticos para TEP Estériles

Para productos farmacéuticos para TEP destinados para administración parenteral, realizar las siguientes pruebas de control
de calidad, además de las descritas anteriormente:
1 . Determinar la integridad del filtro de membrana. Las unidades de filtro usadas para esterilizar productos farmacéuticos
para TEP deben someterse a las pruebas de integridad recomendadas por el fabricante, como por ejemplo, la prueba de
punto de burbuja. La prueba de integridad del filtro se realiza después de completar la filtración y antes de liberar el pro-
ducto farmacéutico para TEP para administración en humanos. En el caso de productos farmacéuticos para TEP con
T112 < 1 O minutos, el producto farmacéutico para TEP se puede liberar para administración en humanos antes de comple-
tar la prueba de integridad del filtro. En este caso, la prueba debe completarse lo más pronto posible, después de la libe-
ración.
2. Efectuar una prueba de endotoxinas bacterianas en cada partida o subpartida de control de calidad de un producto far-
macéutico para TEP. La prueba se puede llevar a cabo usando los procedimientos reconocidos en la USP (ver Prueba de
Endotoxínas Bacterianas (85)). Independientemente de la prueba que se utilice, ésta debe iniciarse antes de la liberación de
cada partida para administración en humanos. Para productos farmacéuticos para TEP con radionucleidos con vidas muy
cortas, completar la prueba en la subpartida de control de calidad antes de la liberación de subpartidas subsiguientes para
administración en humanos. Luego de haber registrado el éxito de una prueba de endotoxinas bacterianas en un produc-
to farmacéutico para TEP en particular, sólo será necesario analizar la primera partida de cada día para dicho producto.
3. Efectuar una prueba de esterilidad en cada partida o en cada subpartida de control de calidad. La prueba de esterilidad
consiste en la inoculación e incubación de una muestra en cada uno de dos medios: caldo tripticasa de soja y tioglicolato
líquido. El volumen inoculado se puede ajustar para evitar pérdidas excesivas debidas a la prueba de esterilidad (p.ej., O, 1
mL inoculados en 1 O mL de medio). El periodo de incubación para pruebas de esterilidad debe comenzar dentro de las
30 horas posteriores a la filtración por membrana. Las muestras se pueden inocular inmediatamente después de comple-
tar la filtración por membrana, o se puede dejar que se deterioren en un área blindada durante un máximo de 30 horas
antes de la inoculación. Se permite exceder el periodo de 30 horas debido a fines de semana o días feriados siempre y
cuando se demuestre que dicha extensión no reduce de manera significativa la viabilidad de un organismo indicador ade-
cuado en la muestra. La prueba de esterilidad se puede llevar a cabo usando otros procedimientos reconocidos en la USP
(ver Pruebas de Esterílídad (71 )). Las muestras deben analizarse individualmente y no se pueden combinar. Una vez que se
haya establecido el registro de una prueba de esterilidad exitosa para un producto farmacéutico para TEP en particular,
sólo será necesario analizar la primera partida preparada cada día para dicho producto farmacéutico para TEP.

Pruebas de Liberación Condicionada Final

Puede ser apropiado liberar condicionalmente una partida cuando no sea posible completar una prueba de control de cali-
dad requerida para un producto farmacéutico para TEP debido a una falla en el equipo de análisis. Los productos farmacéuti-
cos para TEP no pueden ser liberados sin determinar su identidad y pureza radioquímicas. La partida puede liberarse siempre
que se cumplan las siguientes condiciones:
1. Revisar los datos históricos de control de calidad para evaluar la frecuencia de resultados fuera de la especificación o fallas
relacionadas con la prueba de control de calidad. La liberación condicionada es apropiada únicamente cuando los datos
históricos develan un registro de culminación exitosa de la prueba de control de calidad.
2. Confirmar que los criterios de aceptación se cumplen para todas las demás pruebas de control de calidad para la partida.
3. Conservar una muestra de la partida que es objeto de liberación condicionada.
4. Corregir lo antes posible la falla del equipo de prueba.
5. Completar la prueba de control de calidad omitida en la muestra lo más pronto posible, después de que se haya corregi-
do la falla. Este último paso no será necesario si el resultado del control de calidad omitido es intrascendente una vez que
el producto farmacéutico para TEP se haya desintegrado.
6. Si la muestra no pasa la prueba de control de calidad omitida, notificar inmediatamente al médico o a la instalación re-
ceptora que ordenó el producto farmacéutico para TEP.
7. Documentar todas las acciones relacionadas con la liberación condicionada del producto farmacéutico para TEP, incluyen-
do la justificación de la liberación, los resultados de la prueba completada, así como cualquier notificación y acción co-
rrectiva y preventiva que haya resultado del incidente.
USP 40 Pruebas Físicas/ (823) Fármacos para Tomografía de Emisión de Positrones 827

Además de la prueba de control de calidad terminada, otras determinaciones de laboratorio apropiadas pueden implicar lo
siguiente: análisis durante el proceso de un atributo que sea equivalente al análisis del producto terminado de dicho atributo;
monitoreo estadístico continuo del proceso; o una combinación de estos procedimientos con el análisis concluido de cada pro-
ducto farmacéutico para TEP.

PRODUCTOS FARMACÉUTICOS PARA TEP QUE NO CUMPLEN CON LAS ESPECIFICACIONES

Cuando el resultado de una prueba de control de calidad para un producto farmacéutico para TEP no cumple con los crite-
rios de aceptación establecidos, el resultado se considera fuera de la especificación. Un resultado fuera de la especificación no
necesariamente significa que el producto farmacéutico para TEP es fallido y que debe rechazarse, sino que se debe llevar a
cabo una investigación para resultados fuera de la especificación a fin de determinar si dicho resultado indica una falla real o
un error analítico.
Si la investigación de los resultados fuera de especificación determina que dicho resultado fue ocasionado por un error analí-
tico, se debe invalidar la prueba original. Si hay una impresión de los resultados de la prueba, se debe marcar dicho resultado
impreso como inválido, conservarlo en el registro de partida y repetir la prueba.
Si la investigación de los resultados fuera de especificación determina que dicho resultado fue una falla real, la partida debe-
rá ser rechazada y no se podrá liberar para administración en humanos. Segregar la partida para evitar que sea utilizada. Inves-
tigar todas las fallas y documentar los resultados de acuerdo con los procedimientos escritos. La investigación debe incluir, en-
tre otros elementos, la evaluación de procesos, operaciones y registros de partidas previas, así como quejas y demás fuentes de
información pertinentes. De ser posible, se debe asignar una causa real o probable a la falla, además de documentar las accio-
nes correctivas tomadas como resultado de la investigación. Dependiendo de la naturaleza de la falla, el producto farmacéuti-
co para TEP puede reprocesarse de acuerdo con los procedimientos escritos preestablecidos (ver la sección Reprocesamiento a
continuación).
Cuando una prueba de esterilidad de un producto farmacéutico para TEP presenta señales de crecimiento microbiano, el
resultado de la prueba se considera fuera de especificación, por lo que deberá ser investigado. Una vez completada la investi-
gación, notificar de inmediato a todas las instalaciones receptoras si el producto no cumple con el criterio de esterilidad, inclu-
yendo los hallazgos microbiológicos de la investigación.

REPROCESAMIENTO

Si un producto farmacéutico para TEP es rechazado debido a una falla real, la partida podría reprocesarse de acuerdo con los
procedimientos establecidos. Aunque resulta imposible describir todas las operaciones de reprocesamiento, a continuación se
presentan algunos ejemplos:
• Ajuste de pH;
• Cuando se presente una prueba de integridad del filtro fallida, un segundo pasaje a través de un filtro de membrana; y
• Un segundo pasaje por una columna de purificación para eliminar una impureza.
Cuando se reprocesa un producto farmacéutico para TEP, la partida reprocesada debe someterse a pruebas para asegurar
que cumple con los criterios de aceptación establecidos para el producto farmacéutico para TEP antes de su liberación para
administración en humanos.

ETIQUETADO

La siguiente información debe aparecer en la etiqueta adherida al envase final del producto farmacéutico para TEP:
• El nombre del producto farmacéutico para TEP, incluyendo la forma farmacéutica;
• El número de partida asignado; y
•Declaraciones o símbolos de advertencia (p.ej., exclusivamente para uso en investigación clínica, radioactivo).
La siguiente información debe aparecer en el blindaje del producto farmacéutico para TEP:
• El nombre del producto farmacéutico para TEP, incluyendo la forma farmacéutica;
• El número de partida asignado;
• La fecha y hora de la calibración;
• Declaraciones o símbolos de advertencia (p.ej., exclusivamente para uso en investigación clínica, radioactivo);
•La radioactividad total en MBq (o mCi) o la concentración en MBq/mL (o mCi/mL) al momento de la calibración, según
corresponda;
• Fecha y hora de caducidad;
• Sustancias agregadas (p.ej., ingredientes inactivos del estabilizante);
• El nombre del establecimiento productor donde se fabricó el producto farmacéutico para TEP o el nombre del distribui-
dor;
• Cualquier otra advertencia aplicable (p.ej., "No usar si presenta turbidez o si contiene partículas" o etiquetado para uso
en investigación clínica); y
• Cualquier otra información relevante (si se requiere), como por ejemplo, condiciones de almacenamiento y vida media.
828 (823) Fármacos para Tomografía de Emisión de Positrones / Pruebas Físicas USP 40

GLOSARIO

Actividad específica: La radioactividad de un radionucleido por unidad de masa del elemento o compuesto. La unidad de
actividad específica se expresa en unidades de radioactividad por unidad de masa en gramos o en moles, (p.ej., mCi/µg [MBq/
µg], Ci/mmol [GBq/mmol]).
Certificación del Fabricante: Documentación que incluye, entre otros, certificados de análisis, certificados de cumpli-
miento o certificados de calidad obtenidos del fabricante, proveedor o vendedor de un material o componente, el cual descri-
be las características de calidad críticas usadas para determinar la aceptabilidad de uso.
Concentración: La concentración de radioactividad del fármaco para TEP en el producto farmacéutico para TEP por uni-
dad de volumen, determinada al momento de la calibración. La unidad de concentración es la cantidad de radioactividad por
unidad de volumen al momento de la calibración (p.ej., mCi/mL [MBq/mL]).
Control de calidad (CC): Sistema para analizar la calidad de los componentes, materiales, insumos y productos farmacéu-
ticos para TEP mediante procedimientos, pruebas, métodos analíticos y criterios de aceptación.
Fármaco para TEP: Sustancia radioactiva (ingrediente farmacéutico activo) que presenta núcleos inestables de desintegra-
ción espontánea mediante la emisión de positrones y que se incorpora en un producto farmacéutico para TEP para producir un
efecto directo en el diagnóstico o seguimiento de una enfermedad o manifestación de una enfermedad en humanos, o para el
seguimiento del tratamiento de una enfermedad o procedimientos terapéuticos (p.ej., terapia para tumores).
Fuera de la especificación (OOS, por sus siglas en inglés): Resultado de la prueba de control de calidad para un pro-
ducto farmacéutico para TEP que no cumple con los criterios de aceptación establecidos.
Garantía de calidad (GC): Sistema planeado para asegurar, mediante procedimientos, pruebas y métodos analíticos, que
un producto farmacéutico para TEP posee la identidad, concentración, calidad y pureza requeridos para el propósito esperado.
Liberación condicionada final: Se refiere a una liberación final para administración en pacientes antes de haber comple-
tado las pruebas requeridas debido a una falla del equipo analítico.
Liberación de línea: Segregación y limpieza de diferentes áreas de procesamiento y trabajo para evitar la contaminación
cruzada y las mezclas entre la producción y/o la preparación magistral de diferentes productos farmacéuticos para TEP.
Lote: Cantidad de materiales (p.ej., reactivos, disolventes, gases, columnas de purificación y demás materiales auxiliares)
que tienen un carácter y calidad uniformes dentro de los límites especificados y que se usan para fabricar un producto farma-
céutico para TEP.
Partida: Cantidad de producto farmacéutico para TEP que se supone tiene un carácter y calidad uniformes, dentro de los
límites especificados, y que se prepara en un solo ciclo operativo de acuerdo con una o más órdenes de producción.
Preparación magistral: Conforme a lo descrito en la Ley de Alimentos, Medicamentos y Cosméticos, (Food, Drug and
Cosmetic Act) (1997) Capítulo 11, Sección 121 (a) (ii) (1) (B), se refiere a la práctica de sintetizar o formular un producto farma-
céutico para TEP, por parte o por orden de un profesional acreditado por un Estado para preparar magistralmente o para orde-
nar la preparación magistral de un producto farmacéutico para TEP, y que se prepara magistralmente de conformidad con la
ley de dicho Estado, para un paciente o con propósitos de estudios científicos, de enseñanza o de control de calidad.
Producción: Proceso de síntesis o formulación de un producto farmacéutico para TEP que incluye procesamiento, envasa-
do, etiquetado, reprocesamiento y análisis para investigación médica o estudios científicos.
Producto Farmacéutico para TEP: Forma farmacéutica terminada que contiene un fármaco para TEP, sin importar si se
encuentra o no en asociación con uno o más ingredientes.
Subpartida: Cantidad de producto farmacéutico para TEP con carácter y calidad uniformes, dentro de los límites especifi-
cados, que se produce durante una sucesión de irradiaciones múltiples, usando una operación de síntesis o purificación deter-
minada. Un grupo de subpartidas forman colectivamente una partida que se supone cuenta con un carácter y calidad unifor-
mes, dentro de los límites especificados. Las subpartidas pueden ser necesarias para productos farmacéuticos para TEP con ra-
dionucleidos con vidas muy cortas (p.ej., BN y 15 0) debido a que no es posible completar las pruebas de control de calidad
antes de su uso.
Validación: Confirmación mediante evidencia documental de que un método, proceso o sistema cumple con los requisi-
tos de desempeño esperados.
Verificación: Confirmación de que un método, proceso o sistema establecido cumple con los criterios de aceptación pre-
determinados.

(831) ÍNDICE DE REFRACCIÓN

El índice de refracción (n) de una sustancia es la relación entre la velocidad de la luz en el aire y la velocidad de la luz en la
sustancia. Es valioso en la identificación de sustancias y en la detección de impurezas.
La temperatura estándar en las determinaciones farmacopeicas es 25º pero a menudo las especificaciones en las monografías
individuales indican que es necesario calcular el valor del índice de refracción a 20º. Es necesario ajustar y mantener la tempe-
ratura cuidadosamente ya que el índice de refracción varía considerablemente con la temperatura.
USP 40 Pruebas Físicas / (841) Peso Específico 829

Los valores del índice de refracción indicados en esta Farmacopea son para la línea D de sodio (doblete a 589,0 nm y 589,6
nm). La mayoría de los instrumentos disponibles están diseñados para usarse con luz blanca pero están calibrados para expre-
sar el índice de refracción con respecto a la línea D de la luz de sodio.
El refractómetro Abbé mide la gama de índices de refracción de los materiales farmacopeicos para los cuales se indican di-
chos valores. Se pueden utilizar otros refractómetros de igual o mayor precisión.
Para lograr la exactitud teórica de ±0,0001, es necesario calibrar el instrumento contra un estándar suministrado por el fabri-
cante y comprobar con frecuencia el control de temperatura y la limpieza del instrumento mediante la determinación del índi-
ce de refracción de agua destilada, cuyos valores son 1,3330 a 20º y 1,3325 a 25º.

(841) PESO ESPECÍFICO

A menos que se especifique algo diferente en la monografía individual, la determinación del peso específico sólo se aplica a
líquidos y, a menos que se especifique algo diferente, se calcula como el cociente entre el peso de un líquido en el aire a 25º y
el de un volumen igual de agua a la misma temperatura. Si en la monografía individual se indica una temperatura, el peso
específico es el cociente entre el peso del líquido en el aire a la temperatura indicada y el de un volumen igual de agua a la
misma temperatura. Si la sustancia es un sólido a 25º, determinar el peso específico del material fundido a la temperatura indi-
cada en la monografía individual y referirse al agua a 25º.
A menos que se especifique algo diferente en la monografía individual, la densidad se define como la masa de una unidad
de volumen de la sustancia a 25º, expresada en kilogramos por metro cúbico o en gramos por centímetro cúbico (1 kg/m3 =
10-3 g/cm3). Cuando se conoce la densidad, la masa se puede convertir a volumen o viceversa, mediante la fórmula: volumen
= masa/densidad.
A menos que se especifique algo diferente en la monografía individual, usar el Método l.

MÉTODO 1

Procedimiento

Seleccionar un picnómetro escrupulosamente limpio y seco que haya sido previamente calibrado mediante la determinación
de su peso y el peso de agua recién hervida contenida en él a 25º. Ajustar la temperatura del líquido aproximadamente a 20º y
llenar el picnómetro. Ajustar la temperatura del picnómetro lleno a 25º, retirar todo exceso de líquido y pesar. Cuando la mo-
nografía especifique una temperatura diferente a 25º, los picnómetros llenos deben elevarse a la temperatura de la balanza
antes de ser pesados. Restar el peso de tara del picnómetro del peso llenado.
El peso específico del líquido es el cociente que se obtiene al dividir el peso del líquido contenido en el picnómetro por el
peso del agua contenida en éste, ambos determinados a 25º, a menos que en la monografía individual se especifique algo
diferente.

MÉTODO 11
El procedimiento incluye el uso del densímetro transductor oscilante. El aparato consiste en lo siguiente:
• un tubo en forma de U, por lo general de vidrio de borosilicato, que contiene el líquido que se va a examinar;
• un sistema de excitación magnetoeléctrico o piezoeléctrico que hace oscilar al tubo como un oscilador en voladizo a una
frecuencia característica que depende de la densidad del líquido que se va a examinar;
• un medio para determinar el período de oscilación (T), que el aparato puede convertir para arrojar una lectura directa de
densidad o que puede ser utilizado para calcular densidades a través de las constantes A y B descritas más adelante; y
• un medio para determinar y/o controlar la temperatura del transductor oscilante que contenga el líquido que se va a pro-
bar.
El período de oscilación es una función de la constante del resorte (c) y de la masa del sistema:
T2 = {(M/c) + [(p x V)/c]} x 4rr2
en donde pes la densidad del líquido que se va a analizar, Mes la masa del tubo y V es el volumen del tubo lleno.
La introducción de dos constantes A= c/(4rr2 x V) y B = (M/V), lleva a la ecuación clásica del transductor oscilante:
p=Ax T2-B
El peso específico del líquido se provee mediante la fórmula:

P11/P1wy
830 (841) Peso Específico / Pruebas Físicas USP 40

en donde p(L) y P(wJ son las densidades del líquido y del agua, respectivamente, ambas determinadas a 25º, a menos que se
especifique algo diferente en la monografía individual.

Calibración

Las constantes A y B se determinan al operar el instrumento con el tubo en forma de U llenado con dos muestras diferentes
con densidad conocida (p.ej., agua desgasificada y aire). Llevar a cabo las mediciones de control diariamente usando agua
desgasificada. Los resultados mostrados para la medición de control usando agua desgasificada no se desvían del valor de refe-
rencia (p2s = 0,997043 g/cm 3) más allá del error especificado. La precisión es una función de la capacidad de repetición y de la
estabilidad de la frecuencia del oscilador. Los densímetros pueden obtener mediciones con un error del orden de 1xl0-3 g/cm 3
a 1 xl o-s g/cm 3 y una capacidad de repetición de 1xl0-4 g/cm3 a 1xl0-6 g/cm 3. Por ejemplo, un instrumento especificado a
±1xl0-4 g/cm 3 debe mostrar 0,9970 ± 0,0001 g/cm3 para poder usarse en mediciones posteriores o, de lo contrario, necesita-
rá un ajuste. Se debe llevar a cabo la calibración regular con materiales de referencia certificados.

Procedimiento

Seguir las instrucciones del fabricante para llevar a cabo mediciones empleando el mismo procedimiento utilizado para la
Calibración. Si fuera necesario, equilibrar el líquido que será examinado a 25º antes de introducirlo en el tubo para evitar la
formación de burbujas y reducir el tiempo necesario para obtener la medición. Los factores que afectan la precisión incluyen
los siguientes:
• uniformidad de la temperatura en todo el tubo,
•falta de linealidad en un rango de densidad,
• efectos resonantes parásitos, y
• viscosidad, si los densímetros transductores oscilantes empleados no proporcionan compensación automática para la in-
fluencia de la viscosidad de la muestra.

(846) ÁREA SUPERFICIAL ESPECÍFICA

INTRODUCCIÓN

El área superficial específica de un polvo se determina mediante la adsorción física de un gas sobre la superficie del sólido,
calculando la cantidad de gas adsorbida que corresponde a una capa monomolecular en la superficie. La adsorción física es el
resultado de fuerzas relativamente débiles (fuerzas de van der Waals) entre las moléculas del gas adsorbato y la superficie ad-
sorbente del polvo de prueba. Generalmente, la determinación se lleva a cabo a la temperatura del nitrógeno líquido. La canti-
dad de gas adsorbido puede medirse por un procedimiento volumétrico o de flujo continuo.

TEORÍA DE BRUNAUER, EMMETT V TELLER (BET) V DETERMINACIÓN DE ÁREA ESPECÍFICA

Medición de Múltiples Puntos

Los datos se tratan según la ecuación de la isoterma de adsorción de Brunauer, Emmett y Teller (BET):

p = presión parcial de vapor de gas adsorbato en equilibrio con la superficie a 77,4 K (punto de ebullición del nitrógeno líquido),
en Pa,
Po = presión de saturación del gas adsorbato, en Pa;
v. = volumen de gas adsorbido a temperatura y presión estándar (STP, por sus siglas en inglés) [273, 15 K y presión atmosférica de
(1,013 x 1 os Pa)], en ml;
vm = volumen de gas adsorbido a STP que produce una monocapa aparente en la superficie de la muestra, en ml;
e = una constante adimensionada relacionada con la entalpía de adsorción del gas adsorbato sobre la muestra de polvo.

Se mide un valor de v. en cada uno de no menos de tres valores de P/P 0•

Luego, el valor BET

se grafica en función de P/P 0 , conforme a la ecuación (1 ). Este gráfico debe producir una línea recta en el intervalo de presión
relativo aproximado de 0,05 a 0,3. Los datos se consideran aceptables si el coeficiente de correlación, r, de la regresión lineal
USP 40 Pruebas Físicas/ (846) Área Superficial Específica 831

no es menor de 0,9975; es decir, r2 no es menor de 0,995. A partir de la gráfica lineal resultante, la pendiente, que es igual a
(C - 1)/Vme y la intersección, que es igual a 1/V me, se evalúan por análisis de regresión lineal. A partir de estos valores, Vm se
calcula como 1!(pendiente+ intersección), mientras que C se calcula como (pendiente/intersección)+ 1. A partir del valor de Vm
así determinado se calcula el área específica, S, en m 2 • g- 1, por la ecuación:

s = (VmNa)/(m X 22 400) (2)

N = constante de Avogadro (6,022 x 1023 mol-1),

a = área efectiva de sección transversal de una molécula de adsorbato, en nanómetros cuadrados (O, 1 62 nm 2 para el nitró-
geno y O, 195 nm 2 para el criptón),
m = masa de polvo de prueba, en g
22400 = volumen, en ml, ocupado por 1 mol de gas adsorbato a STP, admitiendo pequeñas desviaciones del estado ideal.

Es necesario un mínimo de tres datos. Se pueden llevar a cabo mediciones adicionales, especialmente cuando falta linealidad
a un valor P/P 0 cercano a 0,3. Como la no linealidad se obtiene a menudo con valores P/P 0 por debajo de 0,05, no se reco-
miendan los valores en esta región. La prueba de linealidad, el tratamiento de los datos y el cálculo del área superficial específi-
ca de la muestra se han descrito anteriormente.

Medición con un Único Punto

Normalmente se necesitan como mínimo tres mediciones de Vª, cada una a distintos valores de P/P 0 , para determinar el área
superficial específica mediante la técnica de la adsorción de gas por flujo dinámico (Método/) o mediante la técnica volumétri-
ca de adsorción de gas (Método 11). Sin embargo, bajo ciertas circunstancias que se describen a continuación, puede ser acep-
table determinar el área superficial específica de un polvo con un único valor de Vª medido a un único valor de P/P 0 como por
ejemplo 0,300 (correspondiente a 0,300 moles de nitrógeno o a una fracción molar de criptón de 0,001038), empleando la
siguiente ecuación para calcular Vm:

Luego se calcula el área superficial específica a partir del valor de Vm con la ecuación (2) indicada anteriormente.
El método de un único punto puede emplearse directamente para una serie de muestras de polvo de un material dado
cuando la constante del material C es mucho mayor que la unidad. Estas circunstancias pueden verificarse por comparación de
los valores de área específica determinados por el método de un único punto con los valores determinados por el método de
puntos múltiples para una serie de muestras de polvo. La semejanza estrecha entre los valores obtenidos con un único punto y
con múltiples puntos sugiere que 1/C se aproxima a cero.
El método de un único punto puede emplearse indirectamente para una serie de muestras de polvo similares de un material
dado cuando la constante del material C no es infinita, pero se puede suponer que no varía. En estas circunstancias, el error
asociado al método de un único punto puede reducirse o eliminarse empleando el método de puntos múltiples para evaluar C
para una de las muestras de las serie a partir del gráfico de BET, en el cual C se calcula como (1 +pendiente /intersección).
Luego se calcula Vm a partir del valor único de Vª medido a un único valor de P/P 0 , por la ecuación:

vm = V.[(Po/P)-1] [(1/C) + ((C -1)/C) X (P/Po)l (4)

Luego se calcula el área específica a partir del valor de Vm con la ecuación (2) antedicha.

TÉCNICAS EXPERIMENTALES
Esta sección describe los métodos que se utilizan para la preparación de la muestra, la técnica de adsorción de gas por flujo
dinámico (Método/) y la técnica volumétrica de adsorción de gas (Método 11).

Preparación de la Muestra

DESGASIFICACIÓN

Antes de determinar el área superficial específica de la muestra, es necesario eliminar los gases y vapores adsorbidos física-
mente en la superficie después de la fabricación y durante el tratamiento, manipulación y almacenamiento. Si no se logra la
desgasificación, el área superficial específica podría reducirse o variar, puesto que parte de la superficie estaría cubierta con
moléculas de los gases o vapores previamente adsorbidos. Las condiciones de desgasificación son de vital importancia para
obtener la precisión y la exactitud requeridas de las mediciones de área específica de sustancias farmacéuticas debido a la sen-
sibilidad de la superficie de los materiales.
Se debe demostrar que las condiciones de desgasificación proporcionan gráficos BET reproducibles, un peso constante de
polvo de prueba y ningún cambio físico o químico detectable en el polvo de prueba.
832 (846) Área Superficial Específica / Pruebas Físicas USP 40

Las condiciones de desgasificación definidas por la temperatura, la presión y el tiempo deben elegirse de tal modo que la
superficie original del sólido se reproduzca lo más posible. Con frecuencia, la desgasificación de muchas sustancias se logra
mediante la aplicación de vacío o purgando la muestra en una corriente de un gas no reactivo, seco o aplicando un método
de ciclos de desorción y adsorción. En cualquiera de los casos, algunas veces se aplican temperaturas elevadas para aumentar
la velocidad de eliminación de los contaminantes desde la superficie. Se debe tener cuidado cuando se desgasifiquen muestras
de polvo con temperaturas elevadas, con el fin de evitar la degradación de la muestra.
Si se emplea calor, la temperatura y el tiempo de desgasificación recomendados deben ser tan bajos como sea posible para
lograr mediciones de área superficial específica reproducibles dentro de un plazo aceptable. Para desgasificar muestras sensi-
bles, se pueden emplear otros métodos de desgasificación, tal como el método de los ciclos de desorción y adsorción.

ADSORBATO

La técnica estándar es la adsorción de nitrógeno de calidad analítica a la temperatura del nitrógeno líquido.
Para polvos de área superficial específica pequeña (< 0,2 mzg-1), la proporción adsorbida es pequeña. En tales casos, se pre-
fiere usar criptón a la temperatura del nitrógeno líquido porque su baja presión de vapor reduce el error en gran medida. El
uso de cantidades mayores de muestra, cuando fuera posible (equivalentes a áreas totales de 1 m 2 o mayores empleando ni-
trógeno), pueden compensar los errores para determinar áreas pequeñas.
Todos los gases empleados deben estar exentos de humedad.

CANTIDAD DE MUESTRA

Medir con exactitud una cantidad de polvo de prueba desgasificado de forma tal que el área de la superficie total sea como
mínimo de 1 mz cuando el adsorbato es nitrógeno y de 0,5 m 2 cuando el adsorbato es criptón.
Se pueden emplear cantidades menores de muestra después de la validación correspondiente.

Mediciones

Como la cantidad de gas adsorbido a una presión dada tiende a aumentar cuando disminuye la temperatura, las mediciones
de adsorción por lo general se realizan a temperaturas bajas. Las mediciones se realizan a 77,4 K, el punto de ebullición del
nitrógeno líquido.

Método 1: Método de Flujo Dinámico

PRINCIPIO

En el método de flujo dinámico (ver Figura 1), el gas adsorbato recomendado es criptón o nitrógeno secos, mientras que se
emplea helio como gas diluyente, el cual no se adsorbe bajo las condiciones recomendadas.
Se requiere un mínimo de tres mezclas del gas adsorbato apropiado con helio dentro de un intervalo de P/P 0 entre 0,05 y
0,30.
El detector de gas-integrador debe proporcionar una señal que sea aproximadamente proporcional al volumen de gas que
lo atraviesa en condiciones definidas de presión y temperatura. Con este fin, entre los distintos tipos de dispositivos adecuados
se cuenta un detector de conductividad térmica con un integrador electrónico. Se determina un mínimo de tres puntos dentro
del intervalo recomendado de 0,05 a 0,30 de P/P 0 •
USP 40 Pruebas Físicas/ (846) Área Superficial Específica 833

Argollas
de sello

Válvula
de control
¡ =-o=' Difusor
de flujo =:>..
"'
.e"'
=
¡;¡
tram- =- Celda de Estación
pa fri :l.
o muestra de desga-
Controlador ..... sificación
de flujo "'' Balastro
diferencial
Válvula de
oª
:=;· de paso
corto
Balastro
de paso
,.__.__largo
encendido/
apagado
A B Venteo
Entrada
Detector Detector
de Gas

Figura 1. Diagrama esquemático del aparato para el método por flujo dinámico.

PROCEDIMIENTO

Se hace pasar una mezcla conocida de gases, por lo general nitrógeno y helio, a través de una celda de conductividad térmi-
ca, nuevamente a través de la muestra, a través de la celda de conductividad térmica y posteriormente hasta un potencióme-
tro registrador.
La celda de muestra se sumerge en nitrógeno líquido y la muestra adsorbe nitrógeno de la fase móvil. Esto desequilibra la
celda de conductividad térmica y se genera un pulso en la gráfica del registrador.
Se retira la muestra del refrigerante; esto proporciona un pico de desorción igual en área y en dirección opuesta al pico de
adsorción. Debido a que éste está mejor definido que el pico de adsorción, es el que se emplea para la determinación.
Para efectuar la calibración, se inyecta en el sistema una cantidad conocida de adsorbato, suficiente para proporcionar un
pico de magnitud similar al pico de desorción y se obtiene la proporción de volumen de gas por unidad de área de pico.
Para una determinación en un único punto se emplea una mezcla de nitrógeno y helio; y para la determinación de puntos
múltiples se usan varias mezclas similares o mezclas previas de dos corrientes de gas.
Los cálculos son los mismos que en el método volumétrico.

Método 11: Método Volumétrico

PRINCIPIO

En el método volumétrico (ver Figura 2), el gas adsorbato recomendado es nitrógeno, que puede acceder al espacio vacío
ubicado encima de la muestra de polvo previamente desgasificada para proporcionar una presión de equilibrio definida, P, del
gas. El empleo de un gas diluyente, tal como helio, es por lo tanto innecesario, a pesar de que el helio puede emplearse para
otros fines, como por ejemplo para medir el volumen muerto.
Dado que se emplea solamente gas adsorbato puro, en lugar de una mezcla de gases, al emplear este método se evitan los
efectos de interferencia de la difusión térmica.
834 (846) Área Superficial Específica / Pruebas Físicas USP 40

A las trampas frías

vacío y bombas de vacío
7
8
Reservorio
de helio

Vacío
Manómetro de
presión de vapor

Figura 2. Diagrama esquemático del aparato para el método volumétrico.

PROCEDIMIENTO

Colocar una cantidad pequeña de nitrógeno seco en el tubo de la muestra para evitar la contaminación de la superficie lim-
pia, retirar el tubo de la muestra, taparlo y pesarlo, y calcular el peso de la muestra. Conectar el tubo de la muestra al aparato
volumétrico. Cuidadosamente aplicar vacío sobre la muestra a la presión especificada (por ejemplo, entre 2 Pa y 1O Pa). Alter-
nativamente, algunos instrumentos se operan aplicando vacío a una velocidad definida de cambio de presión (por ejemplo,
menos de 13 Pa/30 s) y manteniéndola durante un período de tiempo antes de comenzar el siguiente paso.
Si el principio de operación del instrumento requiere la determinación del volumen muerto en el tubo de la muestra, por
ejemplo, mediante la admisión de un gas no adsorbido, tal como helio, este procedimiento se lleva a cabo en este momento,
seguido de la aplicación de vacío a la muestra. La determinación del volumen muerto se puede evitar usando mediciones dife-
renciales: es decir, por medio de tubos de referencia y de muestra conectados mediante un transductor diferencial. Luego se
mide la adsorción de nitrógeno gaseoso como se describe a continuación.
Elevar el vaso Dewar que contiene nitrógeno líquido a 77,4 K hasta un punto definido en la celda de muestra. Dejar entrar
una cantidad suficiente de gas adsorbato para proporcionar la presión relativa deseada más baja. Medir el volumen adsorbido,
Vª. Para mediciones de múltiples puntos, repetir la medición de Vª a valores P/P 0 sucesivamente mayores. Cuando se utiliza
nitrógeno como gas adsorbato, los valores de P/P 0 de 0, 1O; 0,20 y 0,30 son a menudo adecuados.

Materiales de Referencia

Verificar periódicamente el funcionamiento del aparato empleando materiales de referencia apropiados de áreas conocidas
que tengan un área superficial específica similar a la de la muestra que se debe examinar.

(852) ESPECTROSCOPÍA DE ABSORCIÓN ATÓMICA

INTRODUCCIÓN

La espectroscopía de absorción atómica (AA) es un método analítico para la identificación y/o la cuantificación de elemen-
tos. Para estas aplicaciones, el método de AA se utiliza en procedimientos que miden la absorbancia de radiación a una longi-
tud de onda característica por parte de un vapor compuesto de átomos en estado fundamental. Un instrumento típico consta
de una fuente de energía primaria que produce el espectro del elemento en análisis, un monocromador y un detector adecua-
do.
Para obtener información sobre teoría y principios de mediciones, ver el capítulo Espectroscopía de Absorción Atómica-Teoría
y Práctica (1852), recurso que puede ser útil, aunque no es obligatorio.
USP 40 Pruebas Físicas / (852) Espectroscopía de Absorción Atómica 835

CALIFICACIÓN DE ESPECTROFOTÓMETROS DE ABSORCIÓN ATÓMICA

La calificación de un espectrofotómetro de AA puede dividirse en tres elementos: calificación de la instalación (IQ, por sus
siglas en inglés), calificación operativa (OQ, por sus siglas en inglés) y calificación de desempeño (PQ, por sus siglas en inglés);
ver también el capítulo de información general Calificación de Instrumentos Analíticos (1058).

Calificación de la Instalación

Los requisitos de calificación de la instalación proveen evidencia de que el hardware y el software se han instalado adecuada-
mente en el lugar deseado.

Calificación Operativa

En la calificación operativa, se caracteriza el desempeño de un instrumento usando estándares con propiedades espectrales
conocidas para verificar que el sistema opera dentro de las especificaciones esperadas (ver la Tabla 7 y la Tabla 2). El propósito
de la calificación operativa es demostrar que el desempeño del instrumento es adecuado. La calificación operativa es una verifi-
cación de los parámetros operativos clave que se realiza después de la instalación y después de las reparaciones y/o el manteni-
miento.
Las pruebas de calificación operativa discutidas en las secciones siguientes son ejemplos típicos. Se pueden usar otras prue-
bas y muestras para establecer las especificaciones para la calificación operativa. Los proveedores de instrumentos a menudo
proveen muestras y parámetros de prueba como parte del paquete de Calificación de la Instalación/Calificación Operativa.
Tabla 1. Prueba de Calificación Operativa y Criterios de Aceptación para Espectrofotómetros de AA a la Llama
Prueba Procedimiento Criterios de Aceptación
Aspirar un estándar de Zn de 0,3 µg/ml y registrar la absor-
Sensibilidad bancia. ±20% de UA" especificada por el fabricante del instrumento
Aspirar el blanco y estándares de Zn de 0,05; 0,075; O, 1 O;
0,25 y 0,50 µg/ml. Generar una curva de calibración y regis-
Linealidad trar el coeficiente de correlación (R). Coeficiente de correlación, no menos de 0,995
Valorar por separado 5 determinaciones repetidas del estándar
de Zn de O, 1 O µg/ml en función de la curva estándar gene-
rada para la prueba de Linealidad. Calcular la %RSD de los 5
Precisión resultados en µg/ml. %RSDb, no más de 3%
ª UA = unidad de absorbancia.
b %RSD = desviación estándar relativa porcentual.

Tabla 2. Prueba de Calificación Operativa y Criterios de Aceptación para Espectrofotómetros de AA con Horno de Grafito
Prueba Procedimiento Criterios de Aceptación
Preparar un estándar de Cu y medir la masa característica según ±20% de masa característica de Cu según lo especificado
Sensibilidad lo descrito por el fabricante. por el fabricante

Generar una curva de calibración a partir de un blanco y están-
dares de Cu de 25; 50; 75 y 100 µg/L. Inyectar cada estándar
Linealidad por triplicado y registrar la %RSD.
Valorar por separado 5 determinaciones repetidas del estándar
de Cu de 50 µg/L en función de la curva estándar generada
para la prueba de Linealidad. Inyectar cada determinación re-
Precisión petida por triplicado.
Coeficiente de correlación, no menos de 0,995
%RSD para inyecciones por triplicado de cada estándar de
Cu, no más de 5% (sin incluir el blanco)
%RSD para 5 determinaciones repetidas, no más de 3%
%RSD para inyecciones por triplicado, no más de 5%

Calificación de Desempeño

La calificación de desempeño determina que el instrumento es capaz de cumplir con los requisitos del usuario para todos los
parámetros que pueden afectar la calidad de la medición.
Dependiendo del uso típico, las especificaciones de calidad de desempeño pueden diferir de las especificaciones del fabri-
cante. Para métodos validados, las pruebas de calidad de desempeño específicas, también conocidas como pruebas de aptitud
del sistema, se pueden usar en lugar de los requisitos de calificación de desempeño.
Los procedimientos específicos, criterios de aceptación e intervalos de tiempo para caracterizar el desempeño de un espec-
trofotómetro de AA dependen del instrumento y de la aplicación para la que se utiliza. Demostrar el desempeño estable del
instrumento durante periodos prolongados provee cierta garantía de que se pueden tomar mediciones confiables a partir de
los espectros de la muestra de prueba usando procedimientos validados de AA.
836 (852) Espectroscopía de Absorción Atómica / Pruebas Físicas USP 40

PROCEDIMIENTO

Evaluar y seleccionar el tipo de material de fabricación, y métodos de pretratamiento y limpieza del material de laboratorio
analítico usado en los análisis de AA. El material debe ser inerte y, dependiendo de la aplicación específica, resistente a disol-
ventes cáusticos, ácidos u orgánicos. Para algunos análisis, se debe tomar adecuada precaución para prevenir la adsorción de
analitos en la superficie del recipiente, especialmente en los análisis a nivel de ultratraza. La contaminación de las soluciones de
muestra derivada de metales e iones presentes en el recipiente también puede generar resultados inexactos.
Para el análisis de un elemento ubicuo, a menudo resulta necesario usar el grado más puro disponible de un reactivo o disol-
vente. Verificar todas las soluciones (diluyentes, soluciones modificadoras de matriz, soluciones para supresión de ionización,
reactivos y otros) para detectar contaminación elemental antes de usarlas en un análisis.

Solución Estándar

Preparar según se indica en la monografía individual. [NOTA-Se pueden usar soluciones estándar de elementos individuales
o multielementos disponibles comercialmente, rastreables al Instituto Nacional de Normas y Tecnología) (National lnstitute of
Standards and Technology o a una organización de metrología nacional equivalente, para la preparación de las soluciones es-
tándar.] Las soluciones estándar, en especial aquéllas usadas en el análisis a nivel de ultratraza, pueden tener una vida útil limi-
tada. Las soluciones estándar deben conservarse durante no más de 24 horas, a menos que su estabilidad se demuestre experi-
mentalmente.
Asimismo, se puede usar el método de estándar agregado. Este método implica agregar a la muestra una concentración co-
nocida del elemento analito a no menos de dos niveles de concentración con respecto a una preparación de la muestra sin el
agregado de cantidades conocidas. La respuesta del instrumento se grafica en función de la concentración del elemento anali-
to agregado y se traza una línea de regresión lineal con los puntos correspondientes a los datos. La concentración del analito
de la muestra se obtiene multiplicando el valor absoluto del punto donde la recta corta el eje x-por el factor de dilución que
corresponda.

Solución Muestra

Preparar según se indica en la monografía individual.

Pueden indicarse diversas técnicas de digestión para disolver la muestra. Éstas pueden incluir digestiones en placa caliente o
digestiones asistidas por microondas, y mediante aproximaciones con recipiente abierto o cerrado. Debe tomarse en cuenta
que la digestión en recipientes abiertos por lo general no se recomienda en los análisis de metales volátiles, p.ej., selenio y
mercurio.

Análisis

Seguir el procedimiento según se indica en la monografía individual con respecto a los parámetros instrumentales.
El instrumento debe estandarizarse para cuantificación al momento de su uso. La absorbancia de las soluciones estándar que
abarcan la concentración esperada se determina en función de un blanco apropiado. La respuesta del detector se grafica como
una función de la concentración del analito. Al realizar un análisis en el límite de detección o en su cercanía, no siempre es
posible usar un estándar que abarque la concentración esperada (bracketing standard). Esto es aceptable para pruebas cualita-
tivas, pero no para pruebas cuantitativas. El análisis de regresión de la gráfica estándar debe usarse para evaluar la linealidad de
la respuesta del detector, y las monografías individuales pueden establecer criterios para el error residual de la línea de regre-
sión.
Para demostrar la estabilidad de la estandarización inicial del sistema, se debe volver a valorar una solución usada en la curva
estándar inicial como un estándar de verificación en intervalos apropiados durante todo el análisis del conjunto de muestras. A
menos que se indique de otro modo en la monografía individual, el estándar nuevamente analizado debe concordar con su
valor esperado con una aproximación de ±3% para una valoración, o de ±20% para un análisis de impurezas.
Las concentraciones de la muestra se calculan en función de la curva de calibración que se genera graficando la respuesta
del detector en función de la concentración del analito en las soluciones estándar.

Cambió en la redacción:

VALIDACIÓN V VERIFICACIÓN

Validación

La validación es necesaria cuando un método de AA se destina para su uso como una alternativa al procedimiento oficial
para el análisis de un artículo oficial.
USP 40 Pruebas Físicas/ (852) Espectroscopía de Absorción Atómica 837

El objetivo de una validación de un procedimiento de AA es demostrar que la medición es adecuada para su propósito pre-
visto, incluyendo la determinación cuantitativa del componente principal en un fármaco o medicamento (valoraciones de Ca-
tegoría 1), la determinación cuantitativa de impurezas o pruebas de límite (Categoría 11) y las pruebas de identificación (Cate-
goría IV). [NOTA-Para definiciones sobre las diversas categorías, ver el capítulo Validación de Procedimientos Farmacopeicos
(1225).] Dependiendo de la categoría de la prueba, la validación del procedimiento analítico para AA puede requerir el análisis
de la linealidad, el intervalo, la exactitud, la especificidad, la precisión, el límite de detección, el límite de cuantificación y la
robustez. Estas características de desempeño analítico se aplican a métodos con estándar externo y a métodos de estándar
agregado.
El capítulo de información general (1225) provee definiciones y pautas generales sobre la validación de procedimientos ana-
líticos sin indicar criterios de validación específicos para cada parámetro. La intención de las secciones siguientes es proveer al
usuario criterios específicos de validación representativos de las expectativas mínimas para esta tecnología. Para cada aplica-
ción particular, pueden requerirse criterios más estrictos para demostrar la aptitud para el uso previsto.

EXACTITUD

Para valoraciones de Categoría 1 o pruebas de Categoría 11, la exactitud se puede determinar realizando estudios de recupe-
ración con la matriz apropiada adicionada con concentraciones conocidas del elemento a analizar. También es una práctica
aceptable comparar los resultados de la valoración obtenidos usando el procedimiento de AA que se está validando con aqué-
llos de un procedimiento analítico establecido. En los métodos de estándar agregado, la evaluación de la exactitud se basa en
la concentración final calculada a partir de la ordenada al origen, y no en la recuperación calculada a partir de las adiciones de
estándar individuales.
Criterios de validación: 95,0%-105,0% de recuperación media para la valoración del fármaco y la valoración del medica-
mento, y 70,0%-150,0% de recuperación para el análisis de impurezas. Estos criterios se aplican a todo e! intervalo previsto.

Precisión

REPETIBILIDAD

El procedimiento analítico debe evaluarse midiendo las concentraciones de seis soluciones muestra preparadas de manera
independiente al 100% de la concentración de la prueba de valoración. Alternativamente, se pueden usar tres determinaciones
repetidas de tres soluciones muestra independientes a diferentes concentraciones. Las tres concentraciones deben ser lo sufi-
cientemente cercanas para que la repetibilidad sea constante en todo el intervalo de concentraciones. En este caso, la repetibi-
lidad en las tres concentraciones se combina para compararla con los criterios de aceptación. Si se valida un procedimiento
usando el método de estándar agregado, el criterio de precisión se aplica al resultado experimental final, no a la exactitud de
los niveles individuales de estándar agregado.
Criterios de validación: La desviación estándar relativa es no más de 5,0% para la valoración del fármaco, no más de 5,0%
para la valoración del medicamento y no más de 20% para el análisis de impurezas.

PRECISIÓN INTERMEDIA

Se debe establecer el efecto que tienen los eventos aleatorios sobre la precisión analítica del procedimiento. Las variables
típicas incluyen realizar el análisis en días diferentes, con diferentes instrumentos o que dos o más analistas realicen el método.
Como mínimo, el procedimiento analítico debe evaluarse realizando la prueba de repetibilidad en •cualquier combinación de
por lo menos dos• ERR(OH«:·20151 de las condiciones mencionadas previamente (con un total de 12 mediciones).
Criterios de validación: La desviación estándar relativa es no más de 8,0% para la valoración del fármaco, no más de 8,0%
para la valoración del medicamento y no más de 25,0% para el análisis de impurezas.

ESPECIFICIDAD

El procedimiento debe ser capaz de evaluar inequívocamente cada analito elemental en presencia de componentes que se
espera encontrar, incluyendo cualquier componente de la matriz.
Criterios de validación: Se demuestran mediante el cumplimiento con el requisito de exactitud.

LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN

El límite de cuantificación (QL, por sus siglas en inglés) se puede estimar calculando la desviación estándar de no menos de
seis mediciones repetidas de una solución blanco, dividida por la pendiente de una curva estándar y multiplicando por 1 O. Si
se valida un procedimiento usando el método de estándar agregado, se usa la pendiente de los estándares aplicados a una
solución del material de prueba. Se pueden usar otros enfoques adecuados (ver el capítulo (1225)).
838 (852) Espectroscopía de Absorción Atómica / Pruebas Físicas USP 40

Se debe llevar a cabo una medición de una solución de prueba, preparada a partir de una matriz de muestra representativa
a la que se le han agregado cantidades conocidas, a la concentración de límite de cuantificación para confirmar la exactitud. Si
se valida un procedimiento usando el método de estándar agregado, el criterio de validación se aplica al resultado experimen-
tal final, no a la recuperación de cantidades agregadas conocidas de los niveles de adición de estándar individuales.
Criterios de validación: El procedimiento analítico debe ser capaz de determinar el analito con precisión y exactitud a un
nivel equivalente al 50% de la especificación.

LINEALIDAD

Se prepara una curva de respuesta entre la concentración del analito y la absorbancia, a partir de no menos de cinco solucio-
nes estándar con concentraciones que abarquen la concentración anticipada de la solución de prueba. Posteriormente, la cur-
va estándar se evalúa usando métodos estadísticos apropiados, tales como la regresión de cuadrados mínimos.
Para experimentos que no generen una relación lineal entre la concentración de analito y la respuesta de AA, se deben apli-
car métodos estadísticos apropiados para describir la respuesta analítica.
Criterios de validación: Coeficiente de correlación (R), no menos de 0,995 para valoraciones de Categoría 1 y no menos de
0,99 para pruebas cuantitativas de Categoría 11.

INTERVALO

El término intervalo se refiere al rango entre las concentraciones superior e inferior (cantidades) de analito en la muestra (in-
cluyendo estas concentraciones) para las que se ha demostrado que el procedimiento analítico tiene un nivel adecuado de
precisión, exactitud y linealidad. El intervalo se demuestra cumpliendo con los requisitos de linealidad, precisión y exactitud.
Criterios de validación: Para pruebas de Categoría 1, el intervalo de validación para criterios de aceptación centrados en
100,0% es 80,0%-120,0%. Para criterios de aceptación no centrados, el intervalo de validación es 10,0% por debajo del límite
inferior hasta 10,0% por encima del límite superior. Para uniformidad de contenido, el intervalo de validación es 70,0%-
130,0%. Para pruebas de Categoría 11, el intervalo de validación abarca 50,0%-120,0% de los criterios de aceptación.

ROBUSTEZ

La confiabilidad de una medición analítica se demuestra mediante cambios deliberados en los parámetros experimentales.
Para la AA esto puede incluir, entre otros, las etapas de preparación de la muestra y los programas de calentamiento, incluyen-
do el tiempo de espera de atomización o la temperatura de atomización. Se debe tener cuidado al cambiar los flujos de com-
bustible y gas de oxidación así como las partes del mechero, ya que podrían crearse condiciones de retroceso de la llama.

Verificación

Las reglamentaciones de las Buenas Prácticas de Fabricación Vigentes para los EE.UU. [título 21 del CFR 211.194(a)(2)] indi-
can que los usuarios de los procedimientos analíticos, según se describen en los compendios USP-NF, no están obligados a
validar dichos procedimientos cuando se provean en una monografía. En vez de esto, los usuarios simplemente deben verificar
su aptitud en condiciones reales de uso.
El objetivo de una verificación del procedimiento de AA es demostrar que el usuario puede llevar a cabo el procedimiento,
según se describe en la monografía específica, con una exactitud, especificidad, linealidad y precisión adecuadas usando los
instrumentos, analistas y matrices de muestra disponibles. De acuerdo con el capítulo Verificación de Procedimientos Farmacopei-
cos (1226), si la verificación del procedimiento farmacopeico, siguiendo la monografía, no resulta exitosa, el procedimiento
puede no ser adecuado para su uso con el artículo en análisis. Por consiguiente, puede ser necesario desarrollar y validar un
procedimiento alternativo conforme a lo permitido en las Advertencia Generales 6.30.
La verificación de los métodos farmacopeicos de AA deben, como mínimo, incluir la ejecución de los parámetros de valida-
ción para especificidad, linealidad, exactitud, precisión y límite de cuantificación, cuando resulte apropiado, conforme a lo in-
dicado en Validación.
USP 40 Pruebas Físicas/ (853) Espectroscopía de Fluorescencia 839

(853) ESPECTROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA

INTRODUCCIÓN

La fluorescencia es un proceso de dos etapas que requiere la absorción de luz a una longitud de onda específica (excitación)
seguida de emisión de luz, por lo regular a una longitud de onda mayor. La emisión de luz se denomina fluorescencia.
El tipo más común de muestra fluorescente es una solución transparente submicromolar que absorbe la luz siguiendo la Ley
de Lambert-Beer-Bouguer y emite fluorescencia con una intensidad que es directamente proporcional a la concentración, a la
absortividad y al rendimiento cuántico de fluorescencia de las especies fluorescentes o del fluoróforo.
A diferencia de la espectroscopía de absorción, en donde la desviación de la linealidad es la excepción, la linealidad de la
fluorescencia puede verse afectada por una variedad de efectos relacionados con la muestra. Para obtener información adicio-
nal, ver el capítulo Espectroscopía de Fluorescencia-Teoría y Práctica (1853).
Los métodos de fluorescencia también se denominan exentos de fondo debido a la poca luz de excitación que alcanza el de-
tector. Esta característica hace que la detección de fluorescencia sea altamente sensible, hasta el punto de lograr la detección
de una sola molécula en algunos casos. La detección de fluorescencia también puede ser altamente específica debido a que un
fluoróforo tiene un patrón de emisión característico. La especificidad y la sensibilidad son dos de los puntos fuertes más impor-
tantes de los métodos de fluorescencia.

CALIFICACIÓN DE INSTRUMENTOS DE FLUORESCENCIA

Los analistas aseguran la aptitud de un instrumento específico para un procedimiento dado usando una evaluación paso a
paso para la aplicación deseada, desde la selección, hasta el retiro del instrumento: calificación del diseño (DQ, por sus siglas
en inglés); calificación de la instalación (IQ, por sus siglas en inglés); una calificación inicial del desempeño con respecto a la
especificación, también conocida como calificación operativa (OQ, por sus siglas en inglés); y una continua calificación del de-
sempeño (PQ, por sus siglas en inglés). Para obtener información adicional, ver el capítulo general Calificación de Instrumentos
Analíticos (1058).
La calificación del diseño y la calificación de la instalación quedan fuera de la consideración de este capítulo. El propósito de
esta sección es proveer métodos de prueba y criterios de aceptación para asegurar que el instrumento es adecuado para su uso
previsto (calificación operativa) y que continuará funcionando adecuadamente durante periodos extensos (calificación del de-
sempeño).
Al igual que con cualquier dispositivo espectrométrico, se debe calificar la exactitud y precisión de la longitud de onda (eje
x) y la intensidad relativa (eje yo eje de señal) de un espectrofluorómetro. Asimismo, se debe establecer la sensibilidad. La
calificación operativa debe abarcar los intervalos de operación requeridos para las escalas de intensidad y de longitud de onda.

Calificación Operativa de Instrumentos

Las tolerancias provistas en la calificación de la operación y del desempeño del instrumento son aplicables para su uso gene-
ral. Las especificaciones para instrumentos y aplicaciones particulares pueden variar dependiendo del procedimiento analítico
usado y la exactitud deseada en el resultado final. Los proveedores de instrumentos a menudo ponen a disposición muestras y
parámetros de prueba como parte del paquete de Calificación de la Instalación/Calificación Operativa.
Siempre que sea posible, para las etapas que se detallan a continuación, deben usarse materiales de referencia certificados
para propósitos de calibración en lugar de soluciones preparadas en el laboratorio. Cuando los materiales de referencia certifi-
cados se obtengan de una fuente acreditada reconocida, deberán tener asignaciones de valores rastreables y verificados de
manera independiente y con incertidumbres asociadas ya calculadas.
En este capítulo se diferencian dos tipos generales de mediciones instrumentales: espectrales (es decir, aquéllas que miden la
intensidad en función de la longitud de onda) y fijas (es decir, aquéllas que miden la intensidad a una longitud de onda y
ancho de banda fijos).

CONTROL DE LONGITUDES DE ONDA

El nivel de confianza de las posiciones observadas de los picos se define mediante la exactitud de la longitud de onda para
mediciones espectrales. La determinación de la exactitud de una gran cantidad de longitudes de onda a lo largo del intervalo
de longitud de onda deseado demuestra si es necesaria la calibración adicional en más de un solo punto. La calibración en
múltiples puntos implica medir los sesgos de la longitud de onda a múltiples longitudes de onda y corregir por la dependencia
de la longitud de onda del sesgo. A menudo, se puede aplicar una calibración en un solo punto al eje de la longitud de onda
en el software de un instrumento antes de recopilar los datos, pero una calibración en múltiples puntos puede requerir que se
aplique la corrección a los espectros después de recopilarlos.
Para mediciones fijas, la posición de la longitud de onda y el ancho de banda deben ser reproducibles. Para la selección de
longitudes de onda basadas en filtros, se requiere únicamente usar el mismo filtro al comparar datos a lo largo del tiempo. Si
 840 (853) Espectroscopía de Fluorescencia / Pruebas Físicas USP 40

se debe usar un filtro distinto (p.ej., cuando los datos se comparan entre instrumentos y laboratorios), entonces deben compa-
rarse las curvas de transmisión de los filtros.
La precisión de la longitud de onda debe determinarse sobre el intervalo de operación usando al menos seis mediciones
repetidas. La desviación estándar no debe exceder de± 1 nm.

ESPECTROS DE LÍNEAS ATÓMICAS

Este procedimiento se describe como la aplicación primaria debido a que las líneas de emisión producidas a partir de una
lámpara de descarga son características del elemento fuente y, como estándar físico fundamental, dichas longitudes de onda
han sido medidas con una incertidumbre de no más de± 0,01 nm. En la espectrofluorometría en solución, el sesgo de la longi-
tud de onda requerida raramente excede de 1,0 nm. Por estas razones, los valores del estándar atómico de línea se citan sin la
incertidumbre. La lámpara debe colocarse en la posición de la fuente del espectrofluorómetro.
Una lámpara de mercurio de baja presión comúnmente empleada tiene una variedad de líneas intensas que abarcan una
gran parte del intervalo UV y visible. Los fabricantes usan a menudo dos líneas de xenón a partir de la fuente a 260,5 y 541,9
nm como una verificación interna de la calibración, debido a que es posible verificar la exactitud de los monocromadores de
excitación y de emisión y usarla para propósitos de diagnóstico (ver la Tabla 7).1
Tabla 1. Longitudes de Onda de Espectros de Líneas de Elementos
Longitud de Onda
Elemento (nm)
Hg 253,7
Xe 260,5
Hg 296,7
Hg 365,0
Hg 404,7
Hg 435,8
Xe 541,9
Hg 546,1
Hg 577,0
Hg 579,1

USO DE SOLUCIONES DE ÓXIDOS DE TIERRAS RARAS

Este procedimiento emplea una solución de óxido de tierras raras que se prepara mediante disolución en medio ácido. La
más frecuente está compuesta de óxido de holmio en ácido perclórico en combinación con un reflector difuso localizado en la
posición de la muestra. Se encuentran disponibles comercialmente materiales de referencia certificados adecuados.2 Se debe
retirar el selector de longitud de onda que no está siendo escaneado; si no resulta práctico retirarlo, se deberá ajustar a orden
cero (en esta posición una red de difracción se comporta como un espejo que refleja todas las longitudes de onda). El reflector
difuso se escanea con y sin la muestra de tierra rara en posición, y se calcula el cociente entre las dos intensidades para obtener
un espectro de transmitancia efectiva. Los mínimos en el cociente entre las intensidades corresponden a los picos de absorción
de la muestra. Para una solución al 4% (p/p) de óxido de holmio en ácido perclórico a un ancho de banda espectral de 1,0 nm
y una longitud de paso de 1 cm, estos mínimos se encuentran en la Tabla 2.3
Tabla 2
Longitud de Onda
(nm)
241,1
249,9
278,1
287,2
333,5
345,4
361,3
385,6
416,3

1 Los valores redondeados se toman de la Norma E388-04 (2009) de la ASTM.

2 La norma NIST SRM 2034 ya no está disponible.
3 Los valores redondeados se toman de los datos de banda de absorción estándar a la longitud de onda intrínseca provistos en Travis et al. j Phys Chem Ref Data
2005; 34(1 ):41. La incertidumbre de la medición del 95% del máximo es ±0,06 nm.
 USP 40 Pruebas Físicas/ (853) Espectroscopía de Fluorescencia 841

Tabla 2 (Continuación)
Longitud de Onda
(nm)
451,4
467,8
485,2
536,6
640,5

Si el intervalo operativo del espectrofotómetro se encuentra fuera de 240-650 nm, se usan otros óxidos de tierras raras certi-
ficados u otras soluciones.
El didimio (una mezcla de neodimio y praseodimio) se encuentra disponible como un estándar rastreable en presentaciones
tanto en solución como vidrio. El didimio es similar en su preparación a los materiales de holmio y tiene características de pico
útiles en la región de 730-870 nm. Los picos útiles se encuentran en la solución de didimio a aproximadamente 731,6; 740,0;
794, 1; 799,0 y 864,4 nm.

USO DE REFERENCIAS DOPADAS CON POLIMETILMETACRILATO

Este procedimiento usa materiales de referencia sólidos fabricados mediante la polimerización de una variedad de compues-
tos activos fluorescentes de anillo aromático en una matriz de polimetilmetacrilato (PMMA) inerte. Estos materiales se proveen
en forma de bloques pulidos para su uso en un portacubetas estándar (ver la Tabla 3).
Tabla 3. Datos de Dopante, Excitación y Emisión para Materiales de Referencia Seleccionados
Excitación 'A Emisión 'A
Dopante (nm) (nm)
p-Terfenilo 295 338
Ovaleno 342 482
Tetrafenilbutadieno 348 422
Antraceno 360 402

Verificación del Desempeño

Los resultados obtenidos del análisis diario de estándares de intensidad fotoestable se usan para verificar el desempeño de
un instrumento. Si la intensidad medida no cambia con respecto a la observada al momento de calificar el instrumento, enton-
ces se considera que el desempeño del instrumento no ha cambiado y continúa en estado calificado. Usar dichos estándares
para determinar una escala de intensidad casi absoluta o basada en artefactos permite que las intensidades y la sensibilidad de
los instrumentos medidas puedan compararse con el paso del tiempo o entre instrumentos. Las mediciones de las intensidades
deben estar dentro del intervalo lineal del sistema de detección del instrumento antes de que los analistas intenten realizar
comparaciones de las intensidades, y se verán afectadas por cualquier efecto instrumental directamente relacionado con la se-
ñal de fluorescencia, p.ej., cambios en la intensidad de la fuente, respuesta del detector, entre otros.
Para instrumentos con selección de longitud de onda basada en filtros, se usan estándares de fluorescencia para corrección
espectral a fin de determinar las diferencias esperadas entre intensidades ocasionadas por filtros con diversos perfiles de trans-
misión. Mediante la compensación de estas diferencias de intensidad debidas a la falta de correspondencia espectral, es posi-
ble determinar una escala de intensidad casi absoluta para dichos instrumentos. Los analistas deben abordar las comparaciones
entre instrumentos con particular precaución debido a que las incertidumbres implicadas son relativamente grandes y difíciles
de cuantificar.

USO DE AGUA DE BAJA CONDUCTIVIDAD (18 MQ)

La banda Raman del agua se usa para medir las relaciones señal-ruido en instrumentos de fluorescencia. La banda Raman del
agua es inherentemente reproducible y no se degrada con el tiempo. El agua es conveniente de obtener en un estado puro y
permite realizar comparaciones entre laboratorios con un alto nivel de confianza. No se requiere preparación o dilución. La
banda Raman es una señal de bajo nivel que provee una buena prueba para los componentes ópticos y electrónicos de un
sistema instrumental.
La banda Raman del agua no se debe a un fenómeno de fluorescencia, sino que es el resultado de la dispersión Raman. Para
el agua, la banda Raman siempre presenta un desplazamiento hacia el rojo de 3382 cm- 1 con respecto a la excitación. 4 Esta
banda por lo regular se mide mediante excitación a 350 nm, lo que resulta en un pico Raman a 397 nm, aunque también se
puede usar radiación de hasta 500 nm como longitud de onda de excitación, y el pico de emisión correspondiente es 602 nm.

4 El valor de desplazamiento hacia el rojo se toma de Parker CA. Raman spectra in spectrofluorimetry. Analyst. 1959; 84:446-453.
 842 (853) Espectroscopía de Fluorescencia/ Pruebas Físicas USP 40

USO DE ESTÁNDARES DE INTENSIDAD

Se encuentran disponibles diversos materiales fluorescentes dopados con sólidos.s Estos polímeros o materiales vítreos per-
miten la corrección espectral relativa y la calificación diaria del desempeño de instrumentos de fluorescencia a lo largo de las
regiones UV, visible e infrarrojo cercano de 320 a 830 nm. La alta fotoestabilidad de los materiales los hace particularmente
útiles como estándares de intensidad para uso diario, incluso cuando no se requiere la corrección espectral o cuando la longi-
tud de onda de excitación difiere de la usada para certificación. Se provee un espectro de emisión en estado estacionario certi-
ficado con cada material de referencia certificado, junto con las incertidumbres totales estimadas. La referencia está disponible
en forma de cubeta de vidrio sólido, de tamaño estándar (12,5 mm x 12,5 mm x 45 mm) con tres caras largas pulidas para
detección a 90º y una cara larga esmerilada para detección de cara frontal o de epifluorescencia.
Como alternativa, se pueden usar soluciones de fluoróforos que hayan demostrado ser estables. 6J

MEDICIONES CUALITATIVAS V CUANTITATIVAS DE FLUORESCENCIA

Por lo regular se llevan a cabo dos clases de procedimientos de medición generales mediante espectrometría de fluorescen-
cia: cualitativa y cuantitativa.

Mediciones Cualitativas de Fluorescencia

Las mediciones cualitativas de fluorescencia se usan para detectar la presencia de analitos particulares y brindar una respues-
ta positiva o negativa. Las longitudes de onda de excitación y de emisión a menudo se seleccionan en el máximo del pico del
fluoróforo que se va a detectar. Se debe considerar la cantidad mínima de analito requerida para obtener un resultado positivo
que asegure que el método es apropiado para la aplicación particular. La observación de fluorescencia en la posición del pico
por encima del límite de detección (generalmente 3 veces el nivel de ruido) indica un resultado positivo.

Mediciones Cuantitativas de Fluorescencia

Las mediciones cuantitativas de fluorescencia se usan para determinar las cantidades o concentraciones de analitos en mues-
tras desconocidas. Estas cantidades pueden determinarse en unidades absolutas, tales como moles o moles por L, o en unida-
des relativas, tales como el cociente entre las concentraciones de dos analitos fluorescentes contenidos en una sola solución
desconocida. Dichas determinaciones usan la siguiente proporcionalidad, que relaciona la señal de fluorescencia (S) con la
concentración de analito fluorescente (e) en un par dado de longitudes de onda de excitación y de emisión O'ex, A,em):
S oc /0 x n x Rd x a x <P x e

/ 0= intensidad del haz de excitación

n =fracción de la fluorescencia recolectada por el sistema de detección
Rd = capacidad de respuesta del sistema de detección
a = coeficiente de absorción
cI> = rendimiento cuántico de fluorescencia
e= concentración del analito fluorescente
Esta proporcionalidad lineal con la concentración se aplica a muestras ópticamente diluidas (p.ej., soluciones con una absor-
bancia de menos de 0,05 a una longitud de paso de 1 cm).

BUENA PRÁCTICA ESPECTROSCÓPICA

La mejor manera de realizar comparaciones de una muestra de prueba con un Estándar de Referencia es en un pico de emi-
sión espectral para el compuesto de interés. Los ensayos basados en espectrofluorometría proveen las longitudes de onda co-
múnmente aceptadas para la excitación y para la emisión de pico espectral de la sustancia de interés. Espectrofluorómetros
diferentes pueden presentar variaciones menores en la longitud de onda aparente de este pico. Las comparaciones deben reali-
zarse a la longitud de onda en la que ocurre el pico de emisión. Si ésta difiere de la longitud de onda especificada en la mono-
grafía en más de ±1 nm en el intervalo de 200-400 nm o en más de ±2 nm en el intervalo de 400-800 nm, puede ser una
indicación de la necesidad de recalibrar el instrumento.

s Disponibles a través de proveedores comerciales y en el NIST como SRMs 2940 (emisión naranja), 2941 (emisión verde), 2942 (emisión UV), 2943 (emisión azul)
y 2944 (emisión roja/IR).
6 Los proveedores comerciales proporcionan una solución de 1 mg/L de sulfato de quinina deshidratado en ácido perclórico O, 105 M que ha sido completamente

caracterizada por el NIST como SRM 936a.

7 Se encuentra disponible una serie de Estándares de Intensidad para uso diario en el Instituto Federal Alemán para Investigación y Análisis de Materiales (BAM, por
sus siglas en alemán).
USP 40 Pruebas Físicas/ (853) Espectroscopía de Fluorescencia 843

Uso de Estándares de Referencia

Salvo algunas excepciones, los procedimientos espectrofluorométricos farmacopeicos proveen resultados mediante compa-
ración contra un Estándar de Referencia USP. Esto asegura una medición en condiciones idénticas para la muestra de prueba y
el Estándar de Referencia. Dichas condiciones pueden incluir el ajuste de la longitud de onda, la selección del ancho de banda
espectral, la colocación y corrección de la celda, y los niveles de intensidad. Las celdas que presentan características de fluores-
cencia óptica idénticas a una longitud de onda específica pueden diferir considerablemente a otras longitudes de onda. Se
deben establecer y usar correcciones de celda apropiadas cuando así se requiera.
Los términos preparación similar y solución similar en pruebas y valoraciones que implican espectrofluorometría indican que el
Estándar de Referencia debe prepararse y observarse de una manera idéntica a la usada para la muestra en análisis. Por lo regu-
lar, cuando se prepara una solución del Estándar de Referencia especificado a (es decir, dentro del 10% de) la concentración
deseada, la intensidad de fluorescencia se calcula basándose en la cantidad exacta pesada. Cuando no se haya usado una
muestra previamente secada del Estándar de Referencia, esta intensidad deberá corregirse con respecto a la sustancia anhidra.
Las expresiones determinar concomitantemente y medidos(as) concomitantemente según se usan en los procedimientos que
implican espectrofluorometría indican que la fluorescencia de la solución muestra y de la solución estándar, con respecto al
blanco de prueba especificado, deben medirse de manera sucesivamente inmediata.

Preparación de la Solución Muestra

Para determinaciones en las que se usa espectrofluorometría UV o visible, la muestra por lo general se disuelve en un disol-
vente. A menos que se indique de otro modo en la monografía, las determinaciones se realizan a temperatura ambiente usan-
do una longitud de paso de 1 cm. Muchos disolventes son adecuados para estos intervalos, incluyendo agua, alcoholes, cloro-
formo, hidrocarburos pequeños, éteres y soluciones diluidas de ácidos fuertes y álcalis. Los disolventes deben estar libres de
contaminantes que emitan fluorescencia en la región espectral que se está analizando. Para el disolvente, se debe usar metanol
o alcohol exentos de agua, o alcohol que se haya desnaturalizado mediante la adición de metanol, pero que no contenga ben-
ceno u otras impurezas interferentes. Los disolventes de calidad espectrofotométrica que garantizan estar exentos de contami-
nantes están disponibles comercialmente de diversos proveedores, pero algunos disolventes analíticos orgánicos de grado
reactivo pueden contener trazas de impurezas que emiten una fuerte fluorescencia en la región UV. Se debe verificar la trans-
parencia de los nuevos lotes de estos disolventes, y se debe tener cuidado de usar el mismo lote de disolvente para la prepara-
ción de la solución muestra, de la solución estándar y del blanco. Se deben usar disolventes que no tengan una señal de fluo-
rescencia interferente a las longitudes de onda de interés. En el uso normal, la intensidad de la línea base de fluorescencia no
debe ser más del 2% de la señal de la medición esperada a menos que se haya justificado previamente un valor mayor.
Las valoraciones en la región visible por lo regular exigen comparar concomitantemente las intensidades de fluorescencia
producidas por la solución muestra con la producida por una solución estándar que contenga una cantidad aproximadamente
igual de un Estándar de Referencia USP. En algunos casos, se puede permitir la omisión del uso de un Estándar de Referencia.
Lo anterior es posible cuando las valoraciones espectrofluorométricas se llevan a cabo con una frecuencia de rutina, cuando
hay una curva estándar adecuada disponible, preparada con el Estándar de Referencia USP adecuado, y cuando la sustancia
valorada cumple con la Ley de Lambert-Beer-Bouguer dentro del intervalo de aproximadamente 75%-125% de la concentra-
ción final usada en la valoración. En estas circunstancias, la intensidad de fluorescencia encontrada en la valoración se puede
interpolar en la curva estándar y se puede calcular el resultado de la valoración. Dichas curvas estándar deben ser confirmadas
con frecuencia y siempre que se vayan a utilizar nuevos espectrofluorómetros o nuevos lotes de reactivos.

VALIDACIÓN V VERIFICACIÓN

Validación

La validación es necesaria cuando se pretende usar un procedimiento basado en espectroscopía de fluorescencia como alter-
nativa al procedimiento oficial. El objetivo de una validación es demostrar que la medición es adecuada para su propósito de-
seado, lo cual incluye lo siguiente: la determinación cuantitativa del componente principal en un fármaco o un medicamento
(valoraciones de Categoría 1), la determinación cuantitativa de impurezas o pruebas de límite (Categoría 11) y las pruebas de
identificación (Categoría IV). Dependiendo de la categoría de la prueba (para información adicional, ver la Tabla 2 del capítulo
Validación de Procedimientos Farmacopeicos (1225)), el proceso de validación del procedimiento analítico para fluorescencia re-
quiere analizar la linealidad, el intervalo, la exactitud, la especificidad, la precisión, el límite de detección, el límite de cuantifi-
cación y la robustez. Estas características de desempeño analítico se aplican a procedimientos con estándar externo y a aqué-
llos que emplean estándar agregado. El capítulo (1225) provee definiciones y pautas generales sobre la validación de procedi-
mientos analíticos sin indicar criterios de validación específicos para cada parámetro. La intención de las secciones siguientes es
proveer al usuario criterios específicos de validación que representan las expectativas mínimas para la tecnología de fluorescen-
cia. Para cada aplicación particular, pueden requerirse criterios más estrictos para demostrar la aptitud para el uso previsto.
844 (853) Espectroscopía de Fluorescencia/ Pruebas Físicas USP 40

EXACTITUD

Para procedimientos de Categoría 1, Categoría 11 y Categoría 111, la exactitud se determina realizando estudios de recupera-
ción agregando concentraciones conocidas del analito a la matriz apropiada. Asimismo, se pueden comparar los resultados de
la valoración obtenidos usando el procedimiento de fluorescencia que se está validando con aquéllos de un procedimiento
analítico establecido.
Criterios de validación: 98,0%-102,0% de recuperación media para un fármaco, 95,0%-105,0% de recuperación media
para la valoración de un medicamento y 80,0%-120,0% de recuperación media para el análisis de impurezas. Estos criterios
deben cumplirse en todo el intervalo previsto.

Precisión

REPETIBILIDAD

La repetibilidad del procedimiento analítico se evalúa midiendo las concentraciones de seis soluciones muestra preparadas
de manera independiente al 100% de la concentración de prueba de la valoración. Alternativamente, la repetibilidad puede
evaluarse midiendo las concentraciones de tres determinaciones repetidas de tres soluciones muestra independientes a diferen-
tes concentraciones. Las tres concentraciones deben ser lo suficientemente similares para que la repetibilidad sea similar en
todo el intervalo de concentración. Si esto se lleva a cabo, la repetibilidad en las tres concentraciones se puede combinar para
compararla con los criterios de aceptación.
Criterios de validación: La desviación estándar relativa es no más de 1,0% para la valoración de un fármaco, no más de
2,0% para un medicamento y no más de 20,0% para el análisis de impurezas.

Precisión Intermedia

Se debe evaluar el efecto que tienen los eventos aleatorios sobre la precisión analítica del procedimiento. Las variables típicas
incluyen realizar el análisis en días diferentes, con diferentes instrumentos y que dos o más analistas realicen el método. Como
mínimo, cualquier combinación de al menos dos de estos factores para un total de seis experimentos proveerán una estima-
ción de la precisión intermedia.
Criterios de validación: La desviación estándar relativa es no más de 1,0% para un fármaco, no más de 3,0% para la valora-
ción de un medicamento y no más de 25,0% para el análisis de impurezas.

ESPECIFICIDAD

En las mediciones de fluorescencia, la especificidad se asegura mediante el uso de un Estándar de Referencia siempre que sea
posible y se demuestra por la ausencia de interferencia de otros componentes presentes en la matriz.
Criterios de validación: Se demuestran cumpliendo con los requisitos de exactitud.

LÍMITES DE DETECCIÓN

El límite de detección (DL, por sus siglas en inglés) se puede estimar calculando la desviación estándar de no menos de seis
mediciones repetidas de una solución blanco y multiplicando por 3,3. Como alternativa, la desviación estándar puede determi-
narse a partir del error de la ordenada al origen de una curva de calibración o demostrando que la relación señal-ruido es >3,3.
Además, se debe confirmar el límite de detección estimado analizando muestras a la concentración calculada.

LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN

El límite de cuantificación (QL, por sus siglas en inglés) se puede estimar calculando la desviación estándar de no menos de
seis mediciones repetidas de una solución blanco y multiplicando por 1O. Como alternativa, la desviación estándar puede de-
terminarse a partir del error en la ordenada al origen de una curva de calibración o demostrando que la relación señal-ruido es
>10.
Para confirmar una sensibilidad suficiente y una precisión adecuada, se mide una solución de muestra preparada a partir de
una matriz de muestra representativa a la que se le han agregado cantidades conocidas a la concentración del límite de cuanti-
ficación requerido. La relación señal-ruido observada en el límite de cuantificación requerido debe ser> 1O.
Criterios de validación: Para considerar que el límite de cuantificación estimado es válido, la concentración medida debe ser
exacta y precisa a un nivel igual o menor al 50% de la especificación.
USP 40 Pruebas Físicas/ (854) Espectroscopía en el Infrarrojo Medio 845

LINEALIDAD

Se prepara una curva de respuesta entre la concentración del analito y la señal de fluorescencia a partir de no menos de
cinco Soluciones estándar con concentraciones que abarquen la concentración anticipada de la solución muestra. Posterior-
mente, se debe evaluar la linealidad de la curva estándar usando métodos estadísticos apropiados, tales como la regresión de
cuadrados mínimos. La desviación de la linealidad pude derivarse de factores instrumentales o de la muestra, o ambos, y pue-
de reducirse a niveles aceptables mediante la reducción de la concentración del analito y, por consiguiente, de los valores de
absorbancia relacionados.
Criterios de validación: El coeficiente de correlación (R) debe ser no menos de 0,995 para valoraciones de Categoría 1 y no
menos de 0,99 para pruebas cuantitativas de Categoría 11.

INTERVALO

El intervalo de operación de un instrumento analítico (y el procedimiento analítico en su totalidad) es el intervalo entre las
concentraciones superior e inferior (cantidades) de analito en la muestra (incluyendo estas concentraciones) para las que se ha
demostrado que la función de la respuesta del instrumento tiene un nivel adecuado de precisión, exactitud y linealidad.
Criterios de validación: Para pruebas de Categoría 1, el intervalo de validación para criterios de aceptación centrados en
100,0% es 80,0%-120,0%. Para criterios de aceptación no centrados, el intervalo de validación es 10,0% por debajo del límite
inferior hasta 10,0% por encima del límite superior. Para uniformidad de contenido, el intervalo de validación es 70,0%-
130,0%. Para pruebas de Categoría 11, el intervalo de validación abarca 50,0%-120,0% de los criterios de aceptación.

ROBUSTEZ

Se debe demostrar la confiabilidad de una medición analítica mediante cambios deliberados en los parámetros experimenta-
les. En el caso de la fluorescencia, estos cambios pueden incluir la medición de la estabilidad del analito en condiciones de
almacenamiento especificadas, la variación del pH, la eliminación del oxígeno y la adición de posibles muestras interferentes,
por citar algunos ejemplos. Los analistas deben determinar la robustez de manera simultánea usando un diseño experimental
adecuado.

Verificación

Los procedimientos analíticos descritos en los compendios USP-NF no requieren validación. En vez de esto, se usa una verifi-
cación para determinar la aptitud de un procedimiento en condiciones reales de uso.
Por lo tanto, el objetivo de la verificación del procedimiento de fluorescencia es demostrar la aptitud de un procedimiento
de prueba en condiciones reales de uso. Las características de desempeño que verifican la aptitud de un procedimiento de
fluorescencia son similares a las requeridas para cualquier procedimiento analítico. Para información adicional, el capítulo Verifi-
cación de Procedimientos Farmacopeicos (1226) incluye un análisis sobre los principios generales aplicables. La verificación debe
realizarse usando material de referencia y una matriz bien definida. La verificación de los procedimientos farmacopeicos de
fluorescencia deben, como mínimo, incluir la ejecución de los parámetros de validación para especificidad, exactitud, precisión
y límite de cuantificación, cuando resulte apropiado, conforme a lo indicado en Validación.

Requisitos para Mediciones Indirectas

Algunos procedimientos de fluorescencia emplean reacciones cromogénicas. Por lo general, se deben usar los requisitos para
los parámetros de desempeño analítico. En algunos casos, puede no ser posible conseguir la exactitud y la precisión requeridas
para las mediciones directas. En dichas circunstancias, los requisitos de exactitud y precisión pueden ampliarse hasta un 50%.
Sin embargo, cualquier ampliación de este tipo debe justificarse con bases científicas y pruebas documentadas. En tales casos,
podría incrementarse la cantidad de repeticiones requeridas para producir un valor de informe científicamente sólido.

(854) ESPECTROSCOPÍA EN EL INFRARROJO MEDIO

INTRODUCCIÓN
La espectroscopía en el infrarrojo medio es un método instrumental que se usa para medir la absorción de la radiación elec-
tromagnética sobre el intervalo de número de onda entre 4000 y 400 cm- 1 (correspondiente a longitudes de onda entre 2,5 y
25 µm). A menos que se especifique algo diferente en una monografía u otro procedimiento validado, se debe usar la región
de 3800 a 650 cm-1 (correspondiente a longitudes de onda de 2,6 a 15 µm) para asegurar el complimiento con las especifica-
846 (854) Espectroscopía en el Infrarrojo Medio/ Pruebas Físicas USP 40

ciones de la monografía para absorción IR. La absorción de fotones ocasiona la promoción de moléculas de un estado funda-
mental de su modo vibratorio a un estado vibratorio excitado.
Los modos vibratorios se definen por el movimiento de todos los átomos en una molécula. Cuando las moléculas contienen
ciertos grupos funcionales, la absorción IR a menudo ocurre en intervalos espectrales estrechos específicos. En estos casos, los
números de onda en los que ocurren dichas transiciones se conocen como frecuencias de grupos funcionales. Cuando un mo-
do vibratorio implica movimientos atómicos de más de unos pocos átomos, las frecuencias ocurren en intervalos espectrales
más amplios y no son característicos de un grupo funcional particular, sino que son más característicos de las moléculas en
conjunto. Dichas bandas se conocen como bandas de huella dactilar. Todas las bandas fuertes que absorben a números de
onda por encima de 1500 cm- 1 son frecuencias de grupos funcionales. Las bandas fuertes que absorben por debajo de 1500
cm- 1 pueden ser frecuencias de grupos funcionales o bandas de huella dactilar.
Para obtener información sobre la teoría y principios de las mediciones, ver Espectroscopía en el Infrarrojo Medio-Teoría y
Práctica (1854), que puede ser un recurso útil aunque no es obligatorio.

CALIFICACIÓN DE ESPECTROFOTÓMETROS IR

La calificación de espectrofotómetros en el infrarrojo medio se divide en tres componentes: Calificación de la Instalación (IQ,
por sus siglas en inglés), Calificación Operativa (OQ, por sus siglas en inglés) y Calificación del Desempeño (PQ, por sus siglas en
inglés). Para obtener información adicional, ver el capítulo Calificación de Instrumentos Analíticos (1058).

Calificación de la Instalación

Los requisitos de calificación de la instalación proveen evidencia de que el hardware y el software se han instalado adecuada-
mente en el lugar deseado.

Calificación Operativa

Debido a que la mayoría de los espectros de IR medio se miden mediante espectrofotómetros IR por transformada de Fou-
rier (FTIR, por sus siglas en inglés), este capítulo únicamente trata de dichos instrumentos. [NOTA-Este capítulo no incluye
valores recomendados para la relación señal-ruido o estabilidad de la línea al 100% debido a que pueden variar dependiendo
del fabricante, modelo y edad del instrumento.]

EXACTITUD DEL NÚMERO DE ONDA

El estándar de número de onda de uso más común para espectrofotometría IR es una película de poliestireno mate de apro-
ximadamente 35 µm de espesor. El espectro de dicha película presenta varias bandas pronunciadas a 3060,0; 2849,5; 1942,9;
1601,2; 1583,0; 1154,5 y 1028, 3 cm- 1 • La banda que se selecciona con mayor frecuencia para la determinación de la exacti-
tud del número de onda se encuentra a 1601,2 cm- 1 • Usando una película de poliestireno adecuada u otro estándar de núme-
ro de onda bien caracterizado, barrer números de onda desde 3800 hasta 650 cm- 1 y comparar el número de onda de la res-
puesta máxima de la banda seleccionada, usando el centro de gravedad, el procedimiento de polinomios spline u otros algo-
ritmos de selección de picos, con el número de onda de absorción conocido del estándar. La tolerancia aceptable para el nú-
mero de onda medido es± 1,0 cm- 1 •

Calificación del Desempeño

El propósito de la calificación del desempeño (PQ, por sus siglas en inglés) es determinar que el instrumento es capaz de
cumplir con los requisitos del usuario para todos los parámetros que pueden afectar la calidad de la medición.

PROCEDIMIENTO

Los espectros en el infrarrojo medio se pueden medir mediante transmisión, reflexión externa, reflexión interna (a menudo
denominada reflexión atenuada total), reflexión difusa y espectroscopía fotoacústica. Se encuentran disponibles diversas técni-
cas de preparación de la muestra para dichas opciones. A continuación se presentan las técnicas más comunes de preparación
de muestra.

Discos de Bromuro de Potasio (KBr)

Algunos haluros alcalinos en polvo tales como bromuro de potasio, cloruro de potasio y yoduro de cesio se fusionan a alta
presión y pueden formar discos autoportantes que son transparentes a la radiación en el infrarrojo medio. El haluro alcalino
que se usa más comúnmente es el bromuro de potasio seco en polvo de alta pureza, que es transparente a una radiación en el
infrarrojo medio por encima de 400 cm- 1 •
USP 40 Pruebas Físicas/ (854) Espectroscopía en el Infrarrojo Medio 847

Se encuentran disponibles prensas y matrices comerciales en una variedad de diámetros para la preparación de discos de
haluros alcalinos y similares.

Suspensiones de Aceite Mineral

Un procedimiento típico para preparar una suspensión es colocar 10-20 mg de la muestra en un mortero de ágata y luego
moler la muestra hasta obtener un polvo con un tamaño fino de partícula aplicando un movimiento rotatorio y vigoroso con la
mano del mortero. Se agrega una pequeña gota del agente de suspensión al mortero. El movimiento rotatorio de la mano del
mortero se usa para mezclar los componentes hasta formar una pasta uniforme, la cual se transfiere al centro de una ventana
limpia y transparente para IR (p.ej., bromuro de potasio, cloruro de sodio, bromuro de plata o yoduro de cesio). Se coloca una
segunda ventana igual, que calce sobre la parte superior de la suspensión y se aplica presión a la suspensión para formar una
película delgada y translúcida libre de burbujas.
El agente de suspensión más usado para la región del infrarrojo medio es aceite mineral de hidrocarburos saturados (parafina
líquida, Nujol).

Películas de Polímero Autoportantes

En ocasiones, el espectro de transmisión en el infrarrojo medio de muchos polímeros usados como materiales de envasado
se registra a partir de muestras preparadas a manera de películas delgadas autoportantes usando moldeado por compresión en
calor o microtomía.

Películas Capilares

Los líquidos no volátiles pueden examinarse sin diluirlos, usando una capa delgada colocada entre dos ventanas iguales que
sean transparentes a la radiación en el infrarrojo medio. La capa de líquido debe estar exenta de burbujas y cubrir completa-
mente el diámetro del haz del infrarrojo que se enfoca sobre la muestra.

Líquidos y Soluciones en Celdas de Transmisión

Para examinar muestras líquidas y en solución, se encuentran disponibles comercialmente montajes de celdas de transmisión
que constan de un par de ventanas, un espaciador, puertos de llenado y un soporte, en configuraciones para macro y micro
muestras.
Para aplicaciones de laboratorio, los espaciadores por lo regular están hechos de plomo, poli(tetrafluoroetileno) o poli(etilén
tereftalato) y, dependiendo de los materiales del espaciador, se pueden ofrecer en longitudes de paso con espesores estándar
que van de aproximadamente 6 µm hasta 1 mm o más.

Gases

Las celdas de transmisión de infrarrojo medio para muestreo estático o en flujo de gases y vapor están disponibles en una
amplia variedad de materiales que se ajustan a la aplicación, desde escalas de laboratorio hasta escalas de proceso. En el labo-
ratorio, la celda tradicional para gas ha sido un cilindro de 1 O cm de largo hecho de vidrio de borosilicato o acero inoxidable
con una apertura de aproximadamente 40 mm en cada extremo. Cada extremo abierto está cubierto con una tapa que con-
tiene una ventana transparente para infrarrojo medio hecha de, por ejemplo, bromuro de potasio, selenio de cinc o fluoruro
de calcio.

Reflexión Total Atenuada

La espectroscopía de reflectancia total atenuada se basa en el fenómeno óptico de la radiación pasando a través de un me-
dio con un alto índice de refracción a un cierto ángulo de incidencia que se refleja totalmente de manera interna en un borde
que está en contacto con un material con un índice de refracción más bajo. El medio con alto índice de refracción también se
conoce como elemento de reflexión interna.
La muestra en análisis debe colocarse en contacto cercano con el elemento de reflexión interna, por ejemplo, diamante, ger-
manio, selenuro de cinc u otro material adecuado con un alto índice de refracción. El contacto cercano y uniforme entre la
sustancia y toda la superficie de cristal debe asegurarse mediante la aplicación de presión para las muestra sólidas o disolvien-
do la sustancia en el disolvente apropiado y luego cubriendo el elemento de reflexión interna con la solución y evaporándola
hasta sequedad.
848 (854) Espectroscopía en el Infrarrojo Medio/ Pruebas Físicas USP 40

Reflexión Difusa

La forma más importante y de uso común para la preparación de muestras para reflexión difusa es diluir la muestra mezclán-
dola íntimamente con diluyentes transparentes al infrarrojo al 90%-99% tales como bromuro de potasio o cloruro de potasio
reducidos a polvo fino. Diluir la muestra tiene el beneficio adicional de reducir las intensidades de las bandas de absorción
hasta un nivel apropiado.

Muestreo Microscópico

Acoplar un microscopio de luz a un espectrofotómetro de infrarrojo medio permite obtener espectros a partir de muestras
muy pequeñas. Esto generalmente se aplica a modos de transmitancia o reflectancia y provee, por ejemplo, una herramienta
poderosa para obtener datos espectroscópicos de contaminantes en muestras farmacéuticas.

VALIDACIÓN Y VERIFICACIÓN

Validación

La validación es necesaria cuando se pretende usar un método IR como alternativa al procedimiento oficial para analizar un
artículo oficial.
El objetivo de una validación de un método IR es demostrar que la medición es adecuada para su propósito deseado, el cual
incluye la determinación cuantitativa del componente principal en un fármaco o medicamento (valoraciones de Categoría 1), la
determinación cuantitativa de impurezas o pruebas de límite (Categoría 11) y las pruebas de identificación (Categoría IV, ver la
Tabla 2 en Validación de Procedimientos Farmacopeicos (1225)). Dependiendo de la categoría de la prueba, la validación del
proceso para IR puede requerir el análisis de la linealidad, el intervalo, la exactitud, la especificidad, la precisión, el límite de
detección, el límite de cuantificación y la robustez. Si el procedimiento IR emplea un modelo quimiométrico calculado en fun-
ción de la respuesta de otra tecnología analítica (p.ej., HPLC), entonces se deberán aplicar los principios del capítulo Espectros-
copía en el Infrarrojo Cercano (1119), específicamente la sección Validación del Método.
El capítulo (1225) provee definiciones y pautas generales sobre la validación de procedimientos analíticos sin indicar criterios
de validación específicos para cada parámetro. La intención de las secciones siguientes es proveer al usuario criterios específi-
cos de validación representativos de las expectativas mínimas para esta tecnología. Para cada aplicación particular, pueden re-
querirse criterios más estrictos para demostrar la aptitud para el uso previsto.

EXACTITUD

Para procedimientos de Categoría 1y 11, la exactitud se puede determinar realizando estudios de recuperación agregando
concentraciones conocidas del analito a la matriz apropiada. También es una práctica aceptable comparar los resultados de la
valoración obtenidos usando el procedimiento IR que se está validando con aquéllos obtenidos de un procedimiento analítico
alternativo establecido.
Criterios de validación: 98,0%-102,0% de recuperación media para fármacos, 95,0%-105,0% de recuperación media para
la valoración de un medicamento y 70,0%-150,0% de recuperación media para el análisis de impurezas. Estos criterios deben
cumplirse en todo el intervalo previsto.

PRECISIÓN

Repetibilidad: El procedimiento analítico se evalúa midiendo las concentraciones de seis preparaciones muestra preparadas
de manera independiente al 100% de la concentración de prueba de la valoración. Alternativamente, se puede basar en medi-
ciones de tres determinaciones repetidas de tres soluciones muestra independientes a diferentes concentraciones. Las tres con-
centraciones deben ser lo suficientemente cercanas para que la repetibilidad sea constante en todo el intervalo de concentra-
ción. En ese caso, la repetibilidad en las tres concentraciones se combina para compararla con los criterios de aceptación.
Criterios de validación: La desviación estándar relativa es no más de 1,0% para un fármaco, no más de 2,0% para un medi-
camento y no más de 20,0% para el análisis de impurezas.
Precisión intermedia: Es necesario evaluar el efecto de la precisión analítica ocasionado por cambios en las variables tales
como realizar el análisis en días diferentes, con diferentes instrumentos o que dos o más analistas realicen el método. Como
mínimo, cualquier combinación de al menos dos de estos factores en un total de seis experimentos proveerán una estimación
de la precisión intermedia.
Criterios de validación: La desviación estándar relativa es no más de 1,0% para un fármaco, no más de 3,0% para la valora-
ción de un medicamento y no más de 25,0% para el análisis de impurezas.
USP 40 Pruebas Físicas/ (854) Espectroscopía en el Infrarrojo Medio 849

ESPECIFICIDAD

Para las pruebas de Categoría IV, se debe asegurar la identidad del analito. Con respecto a los procedimientos de Categoría 1
y 11, el requisito de exactitud también demuestra la especificidad para los analitos esperados.
En el caso de las pruebas de identificación, se debe demostrar la capacidad de seleccionar entre compuestos cuyas estructu-
ras están estrechamente relacionadas y que probablemente estarán presentes. Esto debe confirmarse obteniendo resultados
positivos (quizás mediante comparación con un material de referencia conocido) a partir de muestras que contengan el anali-
to, junto con resultados negativos obtenidos de muestras que no contengan el analito y confirmando que los materiales con
estructura similar o estrechamente relacionados con el analito no generan una respuesta positiva.

LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN

El límite de cuantificación se puede estimar calculando la desviación estándar de no menos de 6 mediciones repetidas de
una solución blanco, dividida por la pendiente de la línea de calibración y multiplicando por 1O. Se pueden usar otros enfo-
ques adecuados (ver el capítulo (1225)). Se debe llevar a cabo una medición de una matriz de muestra representativa a la
concentración de límite de cuantificación estimada para confirmar la exactitud.
Criterios de validación: Para considerar que el límite de cuantificación estimado es válido, la concentración medida debe ser
exacta y precisa a un nivel igual o menor al 50% de la especificación.

LINEALIDAD

Una relación lineal entre la concentración del analito y la respuesta del espectro IR se demuestra preparando no menos de 5
preparaciones estándar con concentraciones que abarquen la concentración anticipada de la preparación de prueba. Posterior-
mente, la curva estándar debe evaluarse usando métodos estadísticos apropiados, tales como la regresión de cuadrados míni-
mos. Para experimentos que no generen una relación lineal entre la concentración de analito y la respuesta del espectro IR, se
deben aplicar métodos estadísticos apropiados para describir la respuesta analítica.
Criterios de validación: Coeficiente de correlación (R), no menos de 0,995 para valoraciones de Categoría 1 y no menos de
0,99 para pruebas cuantitativas de Categoría 11

INTERVALO

Este parámetro se demuestra cumpliendo con los requisitos de linealidad, precisión y exactitud.
Criterios de validación: Para pruebas de Categoría 1, el intervalo de validación para criterios de aceptación centrados en
100,0% es 80,0%-120,0%. Para criterios de aceptación no centrados, el intervalo de validación es 10,0% por debajo del límite
inferior hasta 10,0% por encima del límite superior. Para uniformidad de contenido, el intervalo de validación es 70,0%-
130,0%. Para pruebas de Categoría 11, el intervalo de validación abarca 50,0%-120,0% de los criterios de aceptación.

ROBUSTEZ

La confiabilidad de una medición analítica se demuestra mediante cambios deliberados en los parámetros experimentales.
Para el infrarrojo medio, esto puede incluir cambios en el procedimiento de preparación de la muestra o cambios en la confi-
guración del hardware, entre otros.

Verificación

Las reglamentaciones de las Buenas Prácticas de Fabricación Vigentes para los EE.UU. [Título 21 del CFR 21 l .194(a)(2)] indi-
can que los usuarios de los procedimientos analíticos, según se describen en los compendios USP-NF, no están obligados a
validar dichos procedimientos cuando se provean en una monografía. En su lugar, los usuarios simplemente deben verificar su
aptitud en condiciones reales de uso.
El objetivo de una verificación del procedimiento IR es demostrar que el método, según se describe en las monografías espe-
cíficas, se está ejecutando con una exactitud, sensibilidad y precisión adecuadas. El capítulo Verificación de Procedimientos Far-
macopeicos (1226) indica que si la verificación del procedimiento farmacopeico, siguiendo la monografía, no resulta exitosa, el
procedimiento no es adecuado para su uso con el artículo en análisis. Por consiguiente, puede ser necesario desarrollar y vali-
dar un procedimiento alternativo conforme a lo permitido en las Advertencias y Requisitos Generales 6.30.
Aunque no se requiere una revalidación completa de un procedimiento farmacopeico, la verificación del procedimiento far-
macopeico de infrarrojo medio incluye la ejecución de ciertos parámetros críticos. Cuando el método que se esté verificando
sea para propósitos de identificación, el único parámetro requerido será la especificidad. Para aplicaciones cuantitativas, se es-
tudian parámetros de validación adicionales, los cuales, por lo general, incluyen exactitud, precisión y límite de cuantificación,
conforme a lo indicado en Validación.
850 (855) Nefelometría, Turbidimetría y Comparación Visual / Pruebas Físicas USP40

(855) NEFELOMETRÍA, TURBIDIMETRÍA Y COMPARACIÓN VISUAL

"Las técnicas de dispersión de luz" implican la medición de la luz dispersada o transmitida debida a inhomogeneidades sub-
microscópicas de la densidad óptica de los medios analizados (es decir, soluciones, gases o polvos). Las técnicas de dispersión
de luz son útiles para la determinación de pesos moleculares promedio en peso de sistemas polidispersos en el intervalo de
peso molecular de 1000 a varios cientos de millones. Dos técnicas de ese tipo usadas en el análisis farmacéutico son la "turbi-
dimetría" y la "nefelometría".
Los términos comúnmente usados para describir las técnicas de dispersión de luz son:
• Turbidancia (símbolo, S): Efecto de dispersión de luz de las partículas suspendidas. La cantidad de materia suspendida
puede medirse mediante la observación de la luz transmitida (turbidimetría) o de la luz dispersada (nefelometría).
•Turbidez (símbolo, e): En las mediciones de dispersión de luz, la turbidez es la medida de la reducción en la intensidad del
haz incidente por unidad de longitud de una suspensión dada.

APARATO

Se encuentran disponibles instrumentos de dispersión de luz y por lo general constan de una lámpara de mercurio con filtros
para las líneas espectrales verdes o azules fuertes, un obturador, un conjunto de filtros neutros con transmitancia conocida y
un fotomultiplicador sensible que se debe montar en un brazo que pueda rotarse alrededor de la celda para solución y ajustar-
se a cualquier ángulo desde -135º a Oº hasta+ 135º mediante un disco en la parte externa del compartimiento aislante de la
luz. Las celdas para solución tienen distintas formas, tales como cuadradas para medir una dispersión de 90º; semioctagonales
para dispersión de 45º, 90º y 135º; y cilíndricas para dispersión en todos los ángulos. Debido a que la determinación de peso
molecular requiere una medición precisa de la diferencia en el índice de refracción entre la solución y el disolvente [(n - n0 )/c],
se requiere un segundo instrumento -un refractómetro diferencial- para medir esta pequeña diferencia.

PROCEDIMIENTO

Dispersión de Luz

La turbidez puede medirse con un espectrofotómetro o un fotómetro con filtro fotoeléctrico estándar, de preferencia con
iluminación en la porción azul del espectro. Las mediciones nefelométricas requieren un instrumento con una fotocelda colo-
cada de modo que reciba luz dispersa en lugar de transmitida; esta geometría también se aplica a los fluorómetros por lo que,
en general, estos pueden usarse como nefelómetros mediante la selección apropiada de filtros. Un turbidímetro de relación
combina la tecnología de turbidimetría y la nefelometría a 90º: contiene fotoceldas que reciben y miden la luz dispersa a un
ángulo de 90º a partir de la muestra además de recibir y medir la dispersión frontal en el frente de la muestra; además, mide la
luz transmitida directamente a través de la muestra. La linealidad se logra calculando la relación entre la medición de luz dis-
persada en un ángulo de 90º y la suma de la medición de luz dispersada frontal y la medición de luz transmitida. El beneficio
de usar un sistema de turbidimetría de relación es que la medición de luz perdida se vuelve inapreciable. Las unidades de turbi-
dez de un nefelómetro calibrado se denominan unidades de turbidez nefelométricas (NTU, por sus siglas en inglés). Las NTU
exigen específicamente una técnica de medición a 90º y también se basan en la turbidez generada por formazina (una suspen-
sión que se prepara mezclando soluciones de sulfato de hidrazina y hexametilentetramina en agua), aunque en la actualidad,
se encuentran disponibles comercialmente suspensiones de perlas de polímeros más seguras que se reconocen como una alter-
nativa aceptable. Otras unidades reconocidas para turbidez incluyen la unidad de turbidez de formazina (FTU, por sus siglas en
inglés) y la unidad nefelométrica de formazina (FNU, por sus siglas en inglés) y cuando las mediciones en estas unidades se
realizan a 90ºconforme a lo descrito anteriormente, dichas unidades son comparables a las NTU.
En la práctica, se recomienda estar seguro de que la sedimentación de las partículas que se están midiendo sea inapreciable.
Por lo general, se logra asegurar que la sedimentación de las partículas es inapreciable incluyendo un coloide protector en el
medio de suspensión líquido. Es importante que los resultados se interpreten mediante comparación de las lecturas con aqué-
llas que representan concentraciones conocidas de materia suspendida, producidos exactamente en las mismas condiciones.
La turbidimetría o nefelometría puede ser útil para la medición de precipitados formados mediante la interacción de solucio-
nes altamente diluidas de reactivos u otras partículas tales como suspensiones de células bacterianas. Para lograr resultados
consistentes, todas las variables deben controlarse cuidadosamente. Cuando es posible lograr dicho control, se pueden medir
suspensiones extremadamente diluidas.
El soluto de muestra se disuelve en el disolvente a diversas concentraciones diferentes conocidas con exactitud, en donde la
selección de concentraciones depende del peso molecular del soluto y van desde 1% para Mw = 1O000 hasta 0,01 % para Mw =
1 000 000. Antes de obtener las mediciones, cada solución debe limpiarse con sumo cuidado mediante filtración repetida a
través de filtros finos (las monografías específicas proveerán instrucciones para la filtración de la muestra). Una partícula de
polvo en la solución vicia la intensidad de la luz dispersa medida. Un criterio para una solución transparente es que la disime-
tría, cociente de intensidad dispersa a 45º /135º, haya alcanzado un mínimo.
USP 40 Pruebas Físicas/ (857) Espectroscopía UV-Vis 851

Se mide la turbidez y el índice de refracción de las soluciones. A partir de la ecuación general de dispersión de luz a 90º, se
genera una gráfica de HC/T en función de C y se extrapola hasta dilución infinita, y el peso molecular promedio en peso, M, se
calcula a partir de la intersección, 1 /M.
En los sistemas polidispersos, la concentración, la turbidez y el peso molecular promedio se relacionan mediante la ecuación:
HC/T = l/M
H = grupo de constantes [(l 6nK)/3] a partir de las ecuaciones de dispersión usadas para relacionar intensidades con la
turbidez
C = concentración
i; = coeficiente de turbidez
M = peso molecular promedio en peso

Comparación Visual

Cuando se indica la comparación de un color o turbidez, se deben usar tubos para comparación de color lo más parecidos
posible con respecto al diámetro interno y a todas las demás características. Para la comparación de color, los tubos deben
observarse hacia abajo, contra un fondo blanco, con ayuda de una fuente de luz dirigida desde abajo de la parte inferior de los
tubos. Sin embargo, para la comparación de turbidez, los tubos deben observarse de manera horizontal contra un fondo oscu-
ro con ayuda de una fuente de luz dirigida desde los costados de los tubos. Al realizar pruebas de límite que impliquen una
comparación de colores en dos recipientes similares (p.ej., tubos idénticos para comparación de color), se puede usar un ins-
trumento adecuado en lugar de la observación visual directa.
Cuando se indica una comparación de turbidez:
• Recipientes para comparación: Se deben usar tubos para comparación de color lo más parecidos posible con respecto al
diámetro interno y a todas las demás características.
• Condiciones de observación: Los tubos deben observarse de manera horizontal contra un fondo oscuro con ayuda de una
fuente de luz dirigida desde los costados de los tubos.
Cuando se instruye una comparación de color:
• Recipientes para comparación: Se deben usar tubos para comparación de color lo más parecidos posible con respecto al
diámetro interno y a todas las demás características.
• Condiciones de observación: La iluminación típica de cuarto es adecuada para llevar a cabo la evaluación. Se puede usar
una fuente de luz si la práctica es uniforme entre los materiales que se están comparando.

(857) ESPECTROSCOPÍA ULTRAVIOLETA-VISIBLE

INTRODUCCIÓN
Los espectros en el ultravioleta-visible (UV-Vis) se obtienen cuando la interacción entre la radiación incidente y la nube de
electrones en un cromóforo resulta en una transición de electrones, la cual implica la promoción de uno o más de los electro-
nes de la capa externa o de unión de un estado fundamental a un estado de energía más elevado. Las bandas de los espectros
UV y visibles de las sustancias por lo general son amplias y sin un alto grado de especificidad para identificación de compues-
tos. Sin embargo, son adecuados para valoraciones cuantitativas y, en el caso de muchas sustancias, son útiles como formas
adicionales de identificación.
En la ley de Lambert-Beer, la absorbancia (A,i) de una solución a una longitud de onda dada, A-, se define como el logaritmo
en base 1 O de la inversa de la transmitancia (T,i):

1, = intensidad de la radiación transmitida a la misma longitud de onda A

fw =intensidad de la radiación incidente a la longitud de onda A-
Ante la ausencia de cualquier otro factor físico o químico, A,¡ es proporcional a la longitud del paso o camino óptico, b, a
través del cual pasa la radiación, y a la concentración, e, de la sustancia en la solución de acuerdo con lo siguiente:
A,= &,cb

= absortividad molar
&,
e= concentración de soluto (mol/L)
b =longitud de paso (cm)
Si la concentración, e, se expresa en g/L, la constante &, se vuelve a,, la cual se denomina absortividad.
852 (857) Espectroscopía UV-Vis / Pruebas Físicas USP 40

La expresión
111%
"1cm

que representa la absorbancia específica de una sustancia disuelta, se refiere a la absorbancia de una solución de 1O g/L (al 1%
m/v) en una celda de 1 cm medida a una longitud de onda definida, de modo que:

M = concentración molar de la solución

Cuando se miden soluciones en celdas de 1 cm, las concentraciones de aproximadamente 1O µg de la muestra por mL a
menudo producen absorbancias de 0,2-0,8 en la región UV o visible.
Para obtener información sobre teoría y principios de mediciones, ver el capítulo de información general Espectroscopía Ul-
travioleta-Visible-Teoría y Práctica (1857), el cual no es un recurso obligatorio.

CALIFICACIÓN DE ESPECTROFOTÓMETROS UV-VIS

La aptitud de un instrumento específico para un procedimiento dado se asegura usando una evaluación paso a paso del
ciclo de vida para la aplicación deseada desde la selección hasta el retiro del instrumento: calificación del diseño (DQ, por sus
siglas en inglés); calificación de la instalación (IQ, por sus siglas en inglés); una calificación inicial del desempeño con respecto
a la especificación, también conocida como calificación operativa (OQ, por sus siglas en inglés); y una calificación continua del
desempeño (PQ, por sus siglas en inglés). Para más detalles, ver el capítulo Calificación de Instrumentos Analíticos (1058).
El propósito de este capítulo es proveer métodos de prueba y criterios de aceptación para asegurar que el instrumento es
adecuado para su uso previsto (calificación operativa) y que continuará funcionando adecuadamente durante periodos exten-
sos como parte de la calificación del desempeño. Al igual que con cualquier dispositivo espectrométrico, se debe calificar la
exactitud y precisión de la longitud de onda (eje x) y fotométrica (eje y o eje de señal) de un espectrofotómetro UV-Vis, ade-
más de que se deben establecer los parámetros fundamentales de luz espuria y de resolución. La calificación operativa debe
abarcar los intervalos operativos requeridos en el laboratorio para las escalas de absorbancia y de longitud de onda.

Calificación de la Instalación

Los requisitos de calificación de la instalación proveen evidencia de que el hardware y el software se han instalado adecuada-
mente en el lugar deseado.

Calificación Operativa

Los criterios de aceptación para parámetros críticos del instrumento que establecen la "aptitud para su propósito" se verifi-
can durante la calificación de la instalación y la calificación operativa. Las especificaciones para instrumentos y aplicaciones par-
ticulares pueden variar dependiendo del procedimiento analítico usado y la exactitud deseada en el resultado final. Los provee-
dores de instrumentos a menudo proveen muestras y parámetros de prueba como parte del paquete de Calificación de la Ins-
talación/Calificación Operativa.
Siempre que sea posible para los procedimientos detallados a continuación, se deben usar materiales de referencia certifica-
dos (CRM, por sus siglas en inglés) en lugar de soluciones preparadas en el laboratorio. Dichos materiales de referencia certifi-
cados deben obtenerse de una fuente acreditada reconocida, y deben incluir asignaciones de valores rastreables y verificados
de manera independiente y con incertidumbres asociadas ya calculadas. Los materiales de referencia certificados deben mante-
nerse limpios y libres de polvo. La recertificación debe llevarse a cabo periódicamente para mantener la validez de la certifica-
ción.

Control de Longitudes de Onda

Se debe asegurar que la exactitud del eje de la longitud de onda (eje x) en todo el intervalo operativo deseado sea correcto
dentro de los límites aceptables.
Para instrumentos sin detectores de arreglo de diodos, la exactitud y la precisión de la longitud de onda se determinan en
todo el intervalo operativo usando al menos seis mediciones repetidas. Para la exactitud de la longitud de onda, la diferencia
entre el valor medio medido y el valor certificado del CRM no debe exceder ±1 nm en la región UV (200-400 nm), mientras
que en la región visible (400-700 nm) no debe exceder ±2 nm. Para la precisión de la longitud de onda, la desviación estándar
de la media no debe exceder 0,5 nm. Para instrumentos con arreglo de diodos, se requiere únicamente la medición de la exac-
titud de una longitud de onda, y no es necesario realizar la determinación de la precisión. La diferencia entre el valor certifica-
do y el medido del material de referencia certificado no debe exceder ±1 nm en la región UV (200-400 nm), mientras que en
la región visible (400-700 nm) no debe exceder ±2 nm.
 USP 40 Pruebas Físicas/ (857) Espectroscopía UV-Vis 853

ESPECTROS DE LÍNEAS ATÓMICAS

Este procedimiento se describe como la aplicación primaria debido a que las líneas de emisión producidas a partir de una
lámpara de descarga son características del elemento fuente y, como estándar físico fundamental, dichas longitudes de onda
han sido medidas con una incertidumbre de no más de± 0,01 nm. En la espectrometría en solución, la exactitud de la longi-
tud de onda requerida raramente excede 0,5 nm. Por estas razones, los valores del estándar de líneas atómicas se citan sin la
incertidumbre. La lámpara debe colocarse en la posición de la fuente del espectrofotómetro; por lo tanto, sólo se puede usar
en espectrofotómetros que puedan operarse en un modo de simple haz y en la práctica, sólo debe implementarse en un siste-
ma diseñado para acomodar dichas fuentes, por ejemplo, como un accesorio.
Las lámparas de mercurio de baja presión comúnmente empleadas tienen una variedad de líneas intensas que abarcan una
gran parte de los espectros UV y visibles. Los fabricantes usan a menudo dos líneas de deuterio de la fuente a 486,0y656,1
nm como una verificación interna de la calibración y se pueden usar para propósitos de diagnóstico (ver la Tabla 7).1
Tabla 1. Líneas Atómicas Recomendadas a partir de Lámparas de Mercurio y Deuterio de Baja Presión para Calibración de
Longitudes de Onda
Elemento nm
Hg 253,7
Hg 296,7
Hg 365,0
Hg 404,7
Hg 435,8
D? 486,0
Hg 546,1
Hg 577,0
Hg 579,l
D? 656,l

SOLUCIONES DE ÓXIDOS DE TIERRAS RARAS

Este procedimiento emplea soluciones de óxidos de tierras raras que se preparan mediante disolución en medios ácidos. La
más utilizada está compuesta de óxido de holmio en ácido perclórico. La solución de óxido de holmio ha sido aceptada inter-
nacionalmente como un estándar de longitud de onda intrínseco, y se encuentran disponibles comercialmente materiales de
referencia certificados. 2 Los máximos de picos observados se determinan usando el modo de barrido normal en el espectrofo-
tómetro. Los máximos de picos para una solución al 4% m/v de óxido de holmio en ácido perclórico a un ancho de banda
espectral de 1,0 nm y una longitud de paso de 1 cm se presentan en la Tabla 2. 3
Tabla 2. Máximos de Picos Recomendados a partir de una Solución al 4% de Óxido de Holmio en Ácido Perclórico para Calibración
de Longitudes de Onda
nm
241,1
249,9
278,1
287,2
333,5
345,4
361,3
385,6
416,3
451,4
467,8
485,2
536,6
640,5

1 Los valores ;-edondeados se toman de la Norma E275-08 de la ASTM.

2 La norma NIST SRM 2034 ya no está disponible.
3 Los valores redondeados se toman de los datos de banda de absorción estándar a la longitud de onda intrínseca disponibles en: Travis JC, Acosta JC, Andor G, et
al. lntrinsic wavelength standard absorption bands in holmium oxide solution for UV/visible molecular absorption spectrophotometry. j Phys Chem Ref Data.
2005;34(1 ):41-57. La incertidumbre máxima de la medición al 95% es ±0,06 nm.
854 (857) Espectroscopía UV-Vis / Pruebas Físicas USP 40

Si el intervalo operativo del espectrofotómetro se encuentra fuera del intervalo de 240-650 nm, se pueden usar otros óxidos
de tierras raras certificados u otras soluciones siempre que sean rastreables a un estándar nacional o internacional. El didimio
(una mezcla de neodimio y praseodimio) se encuentra disponible como un estándar rastreable tanto en solución como en vi-
drio. El didimio es similar en su preparación a los materiales de holmio y tiene picos característicos útiles en la región de 730-
870 nm. Los picos útiles se encuentran en la solución de didimio a aproximadamente 731,6; 740,0; 794,1; 799,0 y 864,4 nm.

MATERIALES VÍTREOS DE TIERRAS RARAS

Este procedimiento usa vidrios que se fabrican fundiendo el óxido de tierra rara en una matriz vítrea base. El material de uso
más frecuente es el holmio, cuyas longitudes de onda de referencia han sido bien definidas. Aunque la fabricación puede oca-
sionar variación entre las partidas de estos vidrios, pueden utilizarse materiales de referencia certificados comercialmente dis-
ponibles. Los valores típicos para vidrio de holmio usando un ancho de banda espectral de 1,0 nm son los siguientes: 241,5;
279,2; 287,5; 333,8; 360,9; 418,8; 445,8; 453,7; 460,2; 536,5 y 637,7 nm.

Control de Absorbancia

Para establecer la exactitud, la precisión y la linealidad de la transmitancia de un sistema dado, es necesario verificar la exac-
titud de la absorbancia de un sistema a lo largo de su intervalo operativo usando los siguientes procedimientos según corres-
ponda para los intervalos requeridos de longitud de onda y absorbancia.

SOLUCIONES DE DICROMATO DE POTASIO ÁCIDO EN ÁCIDO PERCLÓRICO 0,001 M

En el intervalo de 0-200 mg/L, las soluciones de dicromato de potasio proveen valores de referencia de hasta 3 unidades de
absorbancia a uno de los valores certificados de 235; 257; 313 ó 350 nm. Estas soluciones están disponibles como materiales
de referencia certificados o se pueden preparar de acuerdo con el estándar SRM 935a del NIST. Cuando se usan soluciones de
dicromato de potasio, la exactitud de la absorbancia debe ser± 1%A (para valores por encima de 1,0A) o ±0,01 OA (para valores
por debajo de l ,OA), lo que sea mayor. La precisión de la absorbancia se puede determinar como la desviación estándar de al
menos seis mediciones repetidas en dos o más niveles de absorbancia a lo largo del intervalo operativo. La desviación estándar
no debe exceder ±0,5%A (para valores por encima de l ,OA) o ±0,005A (para valores por debajo de 1,0A), lo que sea mayor.

FILTROS DE VIDRIO DE DENSIDAD ÓPTICA NEUTRA

Estos filtros de vidrio grises se fabrican con vidrio dopado y tienen un espectro nominalmente plano en la región de las lon-
gitudes de onda de calibración. Además, proveen valores de referencia de hasta 3 unidades de absorbancia a los valores certifi-
cados de 440; 465; 546, l; 590 y 635 nm. Estos filtros están disponibles como materiales de referencia certificados que son
rastreables a los estándares SRM 930e, 1930 y 2930 del NIST. Se pueden usar otras soluciones estándar o filtros ópticos certifi-
cados siempre que sean rastreables a un estándar nacional o internacional. Cuando se usan filtros grises, la exactitud de la
absorbancia debe ser ±0,8%A (para valores por encima de 1,0A) o ±0,0080A (para valores por debajo de 1,0A), lo que sea
mayor. La precisión de la absorbancia se puede determinar como la desviación estándar de al menos seis mediciones repetidas
en dos o más niveles de absorbancia a lo largo del intervalo operativo. La desviación estándar no debe exceder ±0,5%A (para
valores por encima de l ,OA) o ±0,005A (para valores por debajo de l ,OA), lo que sea mayor.

Límite de Luz Espuria (Energía Radiante Espuria)

Aunque la medición de absorbancia o transmitancia es una medición de cocientes de intensidades y, por lo tanto, es teórica-
mente independiente de la fuente intensidad monocromática, la presencia de radiación no deseada llamada "energía radiante
espuria" o "luz espuria" afecta las mediciones en la práctica. Además, el efecto adverso de la luz espuria se incrementa con el
envejecimiento de los componentes ópticos y lámparas de un espectrofotómetro. Los efectos son más pronunciados en los
extremos de los intervalos operativos del detector y de la lámpara. Se debe monitorear el nivel de luz espuria a las longitudes
de onda apropiadas como parte de la calificación del desempeño. La luz espuria puede detectarse a una longitud de onda
dada con un filtro líquido adecuado. Estas soluciones están disponibles como materiales de referencia certificados o se pueden
preparar a las concentraciones presentadas en la Tabla 3 usando materiales de grado reactivo.
Tabla 3. Intervalos Espectrales de Materiales Seleccionados para Monitoreo de Luz Espuria
Intervalo Espectral
(nm) Líquido o Solución
190-205 Cloruro de potasio acuoso (12 g/L)
210-259 Yoduro de sodio o yoduro de potasio acuosos (1 O g/L)
250-320 Acetona
300-385 Nitrito de sodio acuoso (50 g/L)
USP 40 Pruebas Físicas/ (857) Espectroscopía UV-Vis 855

Cuando se usa una celda con longitud de paso de 5 mm (rellena con el mismo filtro) como celda de referencia y luego se
mide la celda de 1 O mm en todo el intervalo espectral requerido, es posible calcular el valor de luz espuria a partir de la absor-
bancia máxima observada, usando la fórmula:
5 = 0 25
). I
X 10-W

A;.= máxima absorbancia observada

Criterios de aceptación: S; es s0,01. A, :20,7A.
El procedimiento simplemente requiere contrastar la medición de la celda de 1 O mm con la de la celda de 5 mm (rellena
con el mismo filtro) y, por lo tanto, se puede lograr mediante referencia espacial o cronológica en cualquier tipo de espectrofo-
tómetro. Como alternativa, se puede medir la absorbancia de los filtros especificados en la Tabla 3 contra la referencia apropia-
da y registrar el valor de máxima absorbancia. (Un valor de S, de 0,01 se produce con un valor A;. de 0,7A, lo cual corresponde
a un valor de máxima absorbancia de 2A, medida usando este procedimiento alternativo.) [NOTA-Para algunos instrumentos
en los que no es posible informar directamente los valores de absorbancia mayores a 3A, este procedimiento puede requerir un
proceso de dos etapas en el que el haz de la muestra se atenúa inicialmente usando un filtro de 1 a 2A, cuyo valor se mide y
registra. Después de ajustar a cero el instrumento con este filtro colocado, medir el filtro de luz espuria y registrar nuevamente
el valor de absorbancia. El valor de luz espuria estimado es ahora la suma de estas dos lecturas de absorbancia.]

Resolución

Si se deben llevar a cabo mediciones de absorbancia exactas en compuestos bencenoides u otros compuestos con bandas
de absorbancia pronunciadas (ancho medio de banda natural de menos de 15 nm), el ancho de banda espectral del espectro-
fotómetro usado no debe ser mayor que 1 /8 del ancho medio de banda natural de la absorción del compuesto.
Determinar la resolución del espectrofotómetro usando el procedimiento siguiente. Medir el cociente de absorbancias de
una solución al 0,020% (v/v) de tolueno en hexano (de grado UV) en el máximo y el mínimo a aproximadamente 269 y 266
nm, respectivamente, usando hexano como referencia. El cociente de absorbancias obtenido depende del ancho de banda
espectral del instrumento. Para la mayoría de los propósitos cuantitativos farmacopeicos, es suficiente un ancho de banda es-
pectral de 2 nm y el criterio de aceptación para el cociente es no menos de 1,3.
El efecto que tienen el ancho de banda espectral y la temperatura de medición sobre el cociente se presenta en la Tabla 4. 4
Tabla 4. Ancho de Banda Espectral y Temperatura de Medición
Ancho de Banda Espectral
Temperatura de
Medición 0,5 nm ± 0,1 nm 1,0 nm ± 0,1 nm 1,5 nm ± O, 1 nm 2,0 nm ± 0,2 nm 3,0 nm ± 0,2 nm
20 ± lº 2,4-2,5 2,0-2,l 1,6-1,7 1,3-1,4 1,0-1,1
25 ± 1º 2,3-2,4 1,9-2,0 1,6-1,7 1,3-1,4 1,0-1,1
30 ± 1º 2,1-2,2 1,8-1,9 1,5-1,6 1,3-1,4 1,0-1,l

También se pueden usar materiales de referencia certificados adecuados para esta medición. Como alternativa, se puede ba-
rrer una línea atómica adecuada en el modo de haz individual y se puede determinar el ancho del pico a la altura media del
pico. Este ancho del pico a la altura media del pico es igual al ancho de banda del espectrofotómetro.

Calificación del Desempeño

El propósito de la calificación del desempeño (PQ, por sus siglas en inglés) es determinar que el instrumento es capaz de
cumplir con los requisitos del usuario para todos los parámetros que pueden afectar la calidad de la medición y asegurar que
éste funcionará adecuadamente durante periodos extensos.

PROCEDIMIENTO

Salvo algunas excepciones, las pruebas y valoraciones espectrofotométricas farmacopeicas requieren una comparación con-
tra un Estándar de Referencia USP. Esto ayuda a asegurar una medición en idénticas condiciones para la muestra de prueba y
la sustancia de referencia. Dichas condiciones pueden incluir el ajuste de la longitud de onda, la selección del ancho de banda
espectral, la colocación y corrección de la celda y los niveles de transmitancia. Las celdas que presentan características de
transmitancia idénticas a una longitud de onda dada pueden diferir considerablemente en otras longitudes de onda. Se deben
establecer y usar correcciones de celda apropiadas cuando así se requiera.
La mejor manera de realizar comparaciones entre una muestra de prueba y un estándar de referencia es en un máximo de
absorción espectral para el compuesto de interés. Las valoraciones que se realizan mediante espectrofotometría proveen la lon-
gitud de onda comúnmente aceptada para el pico de absorción espectral de la sustancia en cuestión. Diferentes espectrofotó-
metros pueden presentar una variación menor en la longitud de onda aparente de este pico. Las buenas prácticas requieren
que las comparaciones se realicen a la longitud de onda en la que ocurre el pico de absorción. Si ésta difiere de la longitud de

4 ASTM E958 2011.

856 (857) Espectroscopía UV-Vis / Pruebas Físicas USP 40

onda especificada en la monografía individual en más de ±1 nm (en el intervalo de 200-400 nm) o ±2 nm (en el intervalo de
400-800 nm), puede ser una indicación de la necesidad de recalibrar el instrumento.
Los términos "preparación similar" y "solución similar", según se usan en pruebas y valoraciones que implican espectrofoto-
metría, indican que la referencia para comparación, que es por lo regular un Estándar de Referencia USP, debe prepararse y
observarse, para todos los propósitos prácticos, de una manera idéntica a la usada para la muestra de prueba. Generalmente,
al preparar una solución del estándar de referencia especificado, se prepara una solución de aproximadamente (es decir, den-
tro del 1 0% de) la concentración deseada y se calcula la absortividad basándose en la cantidad exacta pesada. Cuando no se
haya usado una muestra del estándar de referencia previamente secada, la absortividad se calcula con respecto a la sustancia
anhidra. Las expresiones "determinar concomitantemente" y "medir concomitantemente", según se usan en las pruebas y va-
loraciones que implican espectrofotometría, indican que las absorbancias de la solución que contiene la muestra de prueba y la
solución que contiene la muestra de referencia, con respecto al blanco de prueba especificado, deben medirse en sucesión
inmediata.

Preparación de la Solución Muestra

Para determinaciones usando espectrofotometría UV o visible, la muestra por lo general se disuelve en un disolvente. A me-
nos que se indique de otro modo en la monografía, las determinaciones se realizan a temperatura ambiente, usando una lon-
gitud de paso de 1 cm. Muchos disolventes son adecuados para estos intervalos, incluyendo agua, alcoholes, hidrocarburos
pequeños, éteres y soluciones diluidas de ácidos y álcalis fuertes. Se debe tener cuidado de usar disolventes que estén exentos
de contaminantes que absorban en la región espectral que se está analizando. Para el disolvente, se utiliza típicamente meta-
no! o alcohol exentos de agua, o alcohol desnaturalizado mediante la adición de metanol pero sin benceno u otras impurezas
interferentes. Los disolventes de calidad espectrofotométrica especial, que garantizan estar exentos de contaminantes, están
disponibles comercialmente de diversos proveedores. Algunos otros disolventes analíticos orgánicos de grado reactivo pueden
contener trazas de impurezas que absorben fuertemente en la región UV. Se debe verificar la transparencia de los nuevos lotes
de estos disolventes, y se debe tener cuidado de usar el mismo lote de disolvente para la preparación de la solución de prueba,
de la solución estándar y del blanco. La mejor práctica consiste en usar disolventes que tengan una transmitancia de no menos
de 40% (39,9% T = 0,399A) a la longitud de onda de interés.
Las valoraciones en la región visible por lo regular exigen comparar concomitantemente la absorbancia producida por la
preparación de valoración con la producida por una preparación estándar que contenga una cantidad aproximadamente igual
de un Estándar de Referencia USP. En algunas situaciones, se puede omitir el uso de un estándar de referencia (p.ej., cuando
las valoraciones espectrofotométricas se llevan a cabo rutinariamente) cuando se dipone de una curva estándar adecuada, pre-
parada con el Estándar de Referencia USP adecuado, y cuando la sustancia valorada cumple con la Ley de Lambert-Beer den-
tro del intervalo de aproximadamente 75%-125% de la concentración final usada en la valoración. En estas circunstancias, la
absorbancia medida en la valoración se puede interpolar en la curva estándar y se puede calcular el resultado de la valoración.
Dichas curvas estándar deben ser confirmadas con frecuencia y siempre que se vayan a utilizar nuevos espectrofotómetros o
nuevos lotes de reactivos.

VALIDACIÓN Y VERIFICACIÓN

Validación

La validación es necesaria cuando se pretende usar un procedimiento UV-Vis como alternativa al procedimiento oficial para
analizar un artículo oficial.
El objetivo de una validación de un procedimiento UV-Vis es demostrar que la medición es adecuada para su propósito pre-
visto, el cual incluye la determinación cuantitativa del componente principal en un fármaco o un medicamento (valoraciones
de Categoría 1), la determinación cuantitativa de impurezas o pruebas de límite (Categoría 11) y las pruebas de identificación
(Categoría IV). Dependiendo de la categoría de la prueba (ver la Tabla 2 del capítulo Validación de Procedimientos Farmacopei-
cos (1225)), el proceso de validación del método analítico para UV-Vis requiere analizar la linealidad, el intervalo, la exactitud,
la especificidad, la precisión, el límite de detección, el límite de cuantificación y la robustez. Estas características de desempeño
analítico se aplican a procedimientos con estándar externo y a métodos de estándar agregado.
El capítulo (1225) provee definiciones y pautas generales sobre la validación de procedimientos analíticos sin indicar criterios
de validación específicos para cada parámetro. La intención de las secciones siguientes es proveer al usuario criterios específi-
cos de validación representativos de las expectativas mínimas para esta tecnología. Para cada aplicación particular, pueden re-
querirse criterios más estrictos para demostrar la aptitud para el uso previsto.

EXACTITUD

Para procedimientos de Categoría 1, 11 y 111, la exactitud se puede determinar realizando estudios de recuperación agregando
concentraciones conocidas del analito a la matriz apropiada. Asimismo, se pueden comparar los resultados de la valoración
obtenidos usando el procedimiento de UV-Vis que se está validando con aquéllos de un procedimiento analítico establecido.
USP 40 Pruebas Físicas/ (857) Espectroscopía UV-Vis 857

Criterios de validación: 98,0%-102,0% de recuperación media para fármacos, 95,0%-105,0% de recuperación media para
la valoración de un medicamento y 80,0%-120,0% de recuperación media para el análisis de impurezas. Estos criterios deben
cumplirse en todo el intervalo previsto.

Precisión

REPETIBILIDAD

La repetibilidad del procedimiento analítico se evalúa midiendo las concentraciones de seis soluciones muestra preparadas
de manera independiente al 100% de la concentración de prueba de la valoración. Alternativamente, se puede evaluar midien-
do las concentraciones de tres determinaciones repetidas de tres soluciones muestra independientes a diferentes concentracio-
nes. Las tres concentraciones deben ser lo suficientemente cercanas para que la repetibilidad sea constante en todo el intervalo
de concentraciones. En ese caso, la repetibilidad en las tres concentraciones se combina para compararla con los criterios de
aceptación.
Criterios de validación: La desviación estándar relativa es no más de 1,0% para el fármaco, no más de 2,0% para la valora-
ción del medicamento y no más de 20,0% para el análisis de impurezas.

PRECISIÓN INTERMEDIA

Se debe establecer el efecto que tienen los eventos aleatorios sobre la precisión analítica del método. Las variables típicas
incluyen realizar el análisis en días diferentes, con diferentes instrumentos y que dos o más analistas realicen el método. Como
mínimo, cualquier combinación de al menos dos de estos factores para un total de seis experimentos proveerá una estimación
de la precisión intermedia.
Criterios de validación: La desviación estándar relativa es no más de 1,5% para el fármaco, no más de 3,0% para la valora-
ción del medicamento y no más de 25,0% para el análisis de impurezas.

ESPECIFICIDAD

En las mediciones UV-Vis, la especificidad se asegura mediante el uso de un estándar de referencia siempre que sea posible y
se demuestra por la ausencia de interferencia de otros componentes presentes en la matriz.

LÍMITES DE DETECCIÓN

El límite de detección (DL, por sus siglas en inglés) se puede estimar calculando la desviación estándar de no menos de 6
mediciones repetidas de una solución blanco y multiplicando por 3,3. Como alternativa, la desviación estándar puede determi-
narse a partir del error de la ordenada al origen de una curva de calibración o determinando que la relación señal-ruido es
>3,3. Además, se debe confirmar el límite de detección estimado analizando muestras a la concentración calculada.

LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN

El límite de cuantificación (QL, por sus siglas en inglés) se puede estimar calculando la desviación estándar de no menos de
6 mediciones repetidas de una solución blanco y multiplicando por 1O. Como alternativa, la desviación estándar puede deter-
minarse a partir del error de la ordenada al origen de una curva de calibración o determinando que la relación señal-ruido es
>10.
Se debe llevar a cabo una medición de una solución de prueba preparada a partir de una matriz de muestra representativa a
la que se han agregado cantidades conocidas a la concentración del límite de cuantificación requerida para confirmar una sen-
sibilidad y exactitud suficientes. La relación señal-ruido observada en el límite de cuantificación requerido debe ser> 1 O.
[NOTA-La norma ASTM 1657-98 (2006) Standard Practice far the Testing of Variable-Wavelength Photometric Detectors Used in
Liquid Chromatography provee un procedimiento adecuado para medir la relación señal-ruido.]
Criterios de validación: Para considerar que el límite de cuantificación estimado es válido, la concentración medida debe ser
exacta y precisa a un nivel :".:50% de la especificación.

LINEALIDAD

Se debe demostrar una relación lineal entre la concentración del analito y la respuesta UV-Vis preparando no menos de cin-
co soluciones estándar con concentraciones que abarquen la concentración anticipada de la solución de prueba. Posteriormen-
te, la curva estándar se evalúa usando métodos estadísticos apropiados, tales como la regresión de cuadrados mínimos. La des-
viación de la linealidad es el resultado de factores instrumentales o de la muestra, o ambos, y puede reducirse a niveles acepta-
bles mediante la reducción de la concentración del analito y, por consiguiente, de los valores de absorbancia relacionados.
858 (857) Espectroscopía UV-Vis /Pruebas Físicas USP 40

Criterios de validación: El coeficiente de correlación (R) debe ser no menos de 0,995 para valoraciones de Categoría 1 y no
menos de 0,99 para pruebas cuantitativas de Categoría 11.

INTERVALO

El intervalo operativo de un instrumento analítico (y el procedimiento analítico en su totalidad) es el intervalo entre las con-
centraciones superior e inferior (cantidades) de analito en la muestra (incluyendo estas concentraciones) para las que se ha
demostrado que la función de la respuesta del instrumento tiene un nivel adecuado de precisión, exactitud y linealidad.
Criterios de validación: Para pruebas de Categoría 1, el intervalo de validación para criterios de aceptación centrados en
100,0% es 80,0%-120,0%. Para criterios de aceptación no centrados, el intervalo de validación es 10,0% por debajo del límite
inferior hasta 10,0% por encima del límite superior. Para uniformidad de contenido, el intervalo de validación es 70,0%-
1 30,0%. Para pruebas de Categoría 11, el intervalo de validación abarca 50,0%-120,0% de los criterios de aceptación.

ROBUSTEZ

La confiabilidad de una medición analítica se demuestra mediante cambios deliberados en los parámetros experimentales.
En el caso de la UV-Vis, esto puede incluir la medición de la estabilidad del analito en condiciones de almacenamiento especifi-
cadas, la variación del pH y la adición de posibles muestras interferentes, por citar algunos ejemplos. La robustez se determina
de manera paralela usando un diseño adecuado para el procedimiento experimental.

REQUISITOS PARA MEDICIONES INDIRECTAS

Para ciertos procedimientos UV-Vis, se emplean reacciones cromogénicas. Por lo general, se usan los requisitos para las ca-
racterísticas de desempeño analítico. En algunos casos, puede que no sea posible cumplir con los criterios de exactitud y preci-
sión requeridos para las mediciones directas. En dichas circunstancias, los requisitos de exactitud y precisión pueden ampliarse
hasta un 50%. Cualquier ampliación de este tipo debe justificarse con bases científicas y pruebas documentadas. Puede ser
necesario incrementar la cantidad de determinaciones repetidas requeridas para producir un valor de informe científicamente
sólido.

Verificación

Las reglamentaciones de las Buenas Prácticas de Fabricación Vigentes para los EE.UU. [Título 21 del CFR 21l.l94(a)(2)] indi-
can que los usuarios de los procedimientos analíticos, según se describen en los compendios USP-NF, no están obligados a
validar dichos procedimientos cuando se provean en una monografía. En su lugar, los usuarios simplemente deben verificar su
aptitud en condiciones reales de uso.
El objetivo de la verificación del procedimiento de UV-Vis es demostrar la aptitud de un procedimiento de prueba en condi-
ciones reales de uso. Las características de desempeño que verifican la aptitud de un procedimiento de UV-Vis son similares a
las requeridas para cualquier procedimiento analítico. El capítulo Verificación de Procedimientos Farmacopeicos (1226) incluye un
análisis sobre los principios generales aplicables. La verificación por lo general se realiza usando un material de referencia y una
matriz bien definida. La verificación de los métodos farmacopeicos de UV-Vis incluye como mínimo la ejecución de los paráme-
tros de validación para especificidad, exactitud, precisión y límite de cuantificación, cuando resulte apropiado, conforme a lo
indicado en Validación.

(861) SUTURAS-DIÁMETRO

El calibrador para determinar el diámetro de las suturas es del tipo de peso muerto, mecánico o eléctrico, y está equipado
con un dial de lectura directa, un visor digital o una impresora. Emplear un calibrador graduado a 0,002 mm o un calibrador
más pequeño. El yunque del calibrador tiene aproximadamente 50 mm de diámetro y el pie compresor es de 12,70 ± 0,02
mm de diámetro. El pie compresor y las partes móviles conectadas a éste se gradúan de manera que se aplique una carga total
de 21 O± 3 g a la muestra. Las superficies del pie compresor y del yunque son planas, con desviaciones no mayores de 0,005
mm, y paralelas entre sí con una aproximación de 0,005 mm. Para medir el diámetro de las suturas de 0,4 y menor tamaño
métrico, retirar el peso adicional del pie compresor para que la carga total sobre la sutura no exceda de 60 g.

SUTURA QUIRÚRGICA ABSORBIBLE DE COLÁGENO

Determinar el diámetro inmediatamente después de haberla retirado del envase primario y sin estirarla. Colocar el hilo a tra-
vés del centro del yunque y el pie compresor y bajar suavemente el pie hasta que todo su peso descanse sobre la sutura. Medir
USP 40 Pruebas Físicas/ (871) Suturas-Sujeción de Agujas 859

el diámetro de cada hilo en tres puntos correspondientes, aproximadamente, a un cuarto, a la mitad y a tres cuartos de su
longitud.

SUTURA QUIRÚRGICA ABSORBIBLE SINTÉTICA

Proceder según se indica para Sutura Quirúrgica No Absorbible.

SUTURA QUIRÚRGICA NO ABSORBIBLE

Colocar el hilo a través del centro del yunque y el pie compresor y bajar suavemente el pie hasta que todo su peso descanse
sobre la sutura. Medir las suturas no absorbibles, ya sea que estén envasadas en seco o en líquido, inmediatamente después de
haberlas retirado del envase, sin secado ni acondicionamiento previos.
Medir el diámetro de la sutura en tres puntos correspondientes, aproximadamente, a un cuarto, a la mitad y a tres cuartos
de su longitud. En el caso de suturas trenzadas de tamaños mayores de 3-0 (tamaño métrico 2), hacer dos mediciones en cada
punto, una en ángulo recto respecto de la otra, y emplear el promedio como el diámetro observado en ese punto.
Cuando se midan suturas de multifilamento, fijar una porción de la sección designada del hilo en una pinza fija, de manera
que el hilo pase a través del centro del yunque. Mientras se sostiene el hilo en el mismo plano que la superficie del yunque,
someter el hilo a tensión por medios adecuados, como por ejemplo, pasando el extremo libre del hilo alrededor de un cilindro
o polea y uniendo dicho extremo libre a una pesa de aproximadamente la mitad del límite de nudo-tracción para la sutura de
Clase 1no esterilizada del tamaño en cuestión, con cuidado de no dejar que el hilo, si fuera retorcido, pierda la torsión. Medir
el diámetro en los puntos designados en el hilo y calcular el diámetro promedio según las indicaciones dadas.

(871) SUTURAS-SUJECIÓN DE AGUJAS

Las suturas quirúrgicas absorbibles (de colágeno) y las no absorbibles con Sujeción de Aguja Estándar tienen las agujas sujetas
firmemente y están diseñadas para que éstas no se desprendan. Las suturas suministradas con sujeción de agujas sin ojo corres-
ponden a las categorías de suturas con Sujeción de Aguja Estándar o con Sujeción de Aguja Desprendible. La Sujeción de Aguja
Oesprendible, tanto de las suturas quirúrgicas absorbibles como de las no absorbibles, permite separar la aguja a voluntad con
un simple tirón. Ambos tipos de sujeción son sometidos a pruebas con un equipo, según se especifica en Resistencia a la Ten-
sión (881 ).

PROCEDIMIENTO

Tomar 5 suturas y colocar una por una en el tensiómetro, sujetando la aguja con la pinza fija, dejando toda la parte embuti-
da expuesta, y en la misma dirección de la fuerza que ejerce la pinza móvil sobre la sutura. Determinar la fuerza necesaria para
desprender la sutura de la aguja. En el caso de suturas con Sujeción de Aguja Estándar, la sutura puede romperse sin despren-
derse de la aguja.

Sujeción de Aguja Estándar

Cumple con los requisitos si ni el promedio de los 5 valores ni ningún valor individual es inferior al límite fijado para el tama-
ño especificados en la Tabla 7.
Tabla 1. Sujeción de Aguja Estándar para Suturas Absorbibles y No Absorbibles
Tamaño Métrico (Calibre Nº} Límites de la Sujeción de Aguja
Sutura No Ab-
Sutura sorbible y Ab-
Absorbible de sorbible Sintéti- Promedio Individual Promedio Individual
Colágeno ca Tamaño USP (en kgf} (Mín.) (en kgf} (Mín.} (en N} (Mín.) (en N} (Mín.)
0,1 11-0 0,007 0,005 0,069 0,049
0,2 10-0 0,014 0,010 0,137 0,098
0,4 0,3 9-0 0,021 0,015 0,206 0,147
0,5 0,4 8-0 0,050 0,025 0,490 0,245
0,7 0,5 7-0 0,080 0,040 0,784 0,392
1 0,7 6-0 0,17 0,08 1,67 0,784
1,5 1 5-0 0,23 0,11 2,25 1,08
860 (871) Suturas-Sujeción de Agujas / Pruebas Físicas USP 40

Tabla 1. Sujeción de Aguja Estándar para Suturas Absorbibles y No Absorbibles (Continuación)

Tamaño Métrico (Calibre Nº) Límites de la Sujeción de Aguja
Sutura No Ah-
Sutura sorbible y Ah-
Absorbible de sorbible Sintéti- Promedio Individual Promedio Individual
Colágeno ca Tamaño USP (en kgf) (Mín.) (en kgf) (Mín.) (en N) (Mín.) (en N) (Mín.)
2 1,5 4-0 0,45 0,23 4,41 2,25
3 2 3-0 0,68 0,34 6,67 3,33
3,5 3 2-0 1,10 0,45 10,8 4,41
4 3,5 o 1,50 0,45 14,7 4,41
5 4 1 1,80 0,60 17,6 5,88
6 y superior 5 y superior 2 y superior 1,80 0,70 17,6 6,86

Sujeción de Aguja Desprendible

Cumple con los requisitos si los valores individuales de las 5 suturas se encuentran dentro de los límites establecidos en la
Tabla 2. [NOTA-Para ambos tipos de sutura, si no más de uno de los valores individuales se encuentra fuera de los límites
establecidos, repetir la prueba con 1 O suturas adicionales: cumple con los requisitos si ninguno de los 1 O valores adicionales se
encuentra fuera de los requisitos del límite individual.]
Tabla 2. Sujeción de Aguja Desprendlble para Suturas Absorbibles y No Absorbibles
Tamaño Métrico (Calibre) Límites de la Sujeción de Aguja
Sutura No Ah-
Sutura sorbible y Ah-
Absorbible de sorbible Sintéti- Mínimo Máximo Mínimo Máximo
Colágeno ca Tamaño USP (en kgf) (en kgf) (en N) (en N)
1,5 1 5-0 0,028 1,59 0,274 15,6
2 1,5 4-0 0,028 1,59 0,274 15,6
3 2 3-0 0,028 1,59 0,274 15,6
3,5 3 2-0 0,028 1,59 0,274 15,6
4 3,5 o 0,028 1,59 0,274 15,6
5 4 1 0,028 1,59 0,274 15,6
6 5 2 0,028 1,59 0,274 15,6

(881) RESISTENCIA A LA TENSIÓN

Los dispositivos para la medición de la resistencia a la tensión empleados en los Estados Unidos pueden calibrarse en unida-
des del sistema inglés de medidas. Las siguientes instrucciones se dan en unidades métricas con la comprensión de que pue-
den emplearse los equivalentes ingleses correspondientes.

SUTURA QUIRÚRGICA

Determinar la resistencia a la tensión de las suturas quirúrgicas en una máquina a motor para medir la resistencia a la ten-
sión, que tenga pinzas adecuadas para sostener la muestra con firmeza, y emplear el principio de velocidad de carga constante
sobre la muestra o el principio de velocidad de elongación constante de la muestra, según se describe a continuación. El apa-
rato tiene dos pinzas para sostener el hilo de la sutura. Una de estas pinzas es móvil. Las pinzas están diseñadas para que la
sutura que se va a probar pueda ser fijada sin posibilidad de que se deslice. La longitud calibrada de prueba se define como la
distancia interior entre las dos pinzas. Para longitudes calibradas de prueba entre 125 y 200 mm, la pinza móvil es accionada a
una velocidad de elongación constante de 30 ± 5 cm por minuto. Para longitudes calibradas de menos de 125 mm, la veloci-
dad de elongación por minuto se ajusta para que equivalga a 2 veces la longitud calibrada por minuto. Por ejemplo, si la longi-
tud es de 5 cm, la velocidad de elongación será de 1 O cm por minuto.
Determinar la resistencia a la tensión de la sutura, ya sea que esté envasada en seco o con líquido, inmediatamente después
de haberlas retirado del envase, sin secado ni acondicionamiento previos. Sujetar uno de los extremos de la sutura a la pinza
del extremo de carga de la máquina, pasar el otro extremo a través de la pinza opuesta, aplicando tensión suficiente para que
la muestra quede tirante entre las pinzas, y cerrar la segunda pinza. Realizar tantas rupturas como se especifiquen en la mono-
grafía individual. Si la ruptura ocurre en la pinza, descartar la lectura de la muestra.
USP 40 Pruebas Físicas/ (891) Análisis Térmico 861

Procedimiento para una Máquina que Opera por el Principio de Velocidad de Carga Constante
sobre la Muestra

Esta descripción se aplica a la máquina conocida como Comprobador de Plano Inclinado ("Incline Plane Tester").
El carro empleado en cualquier prueba es de un peso tal que al ocurrir la ruptura, la posición de la pluma registradora sobre
la gráfica queda entre el 20% y el 80% de la capacidad que pueda registrarse en la gráfica. La fricción en el carro es suficiente-
mente baja como para permitir que la pluma registradora se aparte de la línea cero de la gráfica en un grado que no exceda
de 2,5% de la capacidad de la gráfica cuando no haya ninguna muestra sujeta en las pinzas.
Para suturas quirúrgicas de tamaños intermedios y más grandes, la pinza para sostener la muestra es del tipo rodillo, con
una superficie de sujeción plana. El rodillo tiene un diámetro de 19 mm y la superficie de sujeción plana no es menor de 25
mm de longitud. La longitud de la muestra, una vez que se inserta en las pinzas, es de por lo menos 127 mm de un extremo a
otro. La velocidad de inclinación del plano del comprobador es tal que alcanza su inclinación máxima de 30º sobre la horizon-
tal en 20 ± 1 segundos desde el comienzo de la prueba.
Para suturas quirúrgicas de tamaños pequeños, la pinza apropiada tiene una superficie de sujeción plana de no menos de 13
mm de longitud. La velocidad de inclinación del plano es tal que alcanza su inclinación máxima de 30º sobre la horizontal en
60 ± 5 segundos desde el comienzo de la prueba.
Excepto cuando en la monografía de la sutura se indique tracción recta (no se requiere nudo), atar la sutura de prueba reali-
zando un nudo de cirujano con una vuelta de sutura, alrededor de un tubo de goma flexible con un diámetro interno de 6,5
mm y un espesor de pared de 1,6 mm. El nudo de cirujano es un nudo cuadrado en el cual el extremo libre se pasa primero
dos veces por el lazo, en lugar de una vez, y se ajusta tirante, luego se pasa una vez por un segundo lazo y se tensan los extre-
mos de manera que quede un nudo sencillo superpuesto a un nudo doble. Comenzar el primer nudo con el extremo izquierdo
sobre el extremo derecho, ejerciendo tensión suficiente para atar el nudo con firmeza. Cuando la muestra de prueba incluya
un nudo, colocar la muestra en el dispositivo de prueba con el nudo aproximadamente a media distancia entre las pinzas.
Dejar el tubo de goma flexible en su lugar mientras dure la prueba.

Procedimiento para una Máquina que Opera por el Principio de Velocidad de Elongación
Constante de la Muestra

Esta descripción se aplica a cualquier máquina adecuada para determinar la resistencia a la tensión que opera según el prin-
cipio de velocidad constante de elongación de la muestra.
Excepto cuando en las monografías de las suturas se indique tracción recta (no se requiere nudo), atar la sutura de prueba
por medio de un nudo simple, colocando un extremo del hilo, sostenido con la mano derecha, por encima del otro extremo,
sostenido con la mano izquierda, pasando un extremo sobre el hilo y a través del lazo que se formó y luego ajustando el nudo
con firmeza. La muestra se coloca en el dispositivo de prueba con el nudo aproximadamente a media distancia entre las pin-
zas.

TELAS TEXTILES Y PELÍCULAS

Determinar la resistencia a la tensión de las telas textiles, incluyendo la cinta adhesiva, en un aparato comprobador de velo-
cidad constante o de tipo péndulo, con la siguiente descripción general.
Las pinzas para sostener la muestra son mordazas lisas, planas y paralelas, de no menos de 25 mm de longitud en paralelo a
la dirección de aplicación de la carga. Cuando el ancho de la tira a probar no excede de 19 mm, las mordazas de la pinza
deben tener al menos 25 mm de ancho. Si el ancho de la tira es mayor de 19 mm y no mayor de 44 mm, el ancho de las
mordazas de la pinza debe ser de no menos de 50 mm. Si el ancho de la muestra es más de 44 mm, cortar una tira de 25 mm
y usar una pinza con mordazas de no menos de 50 mm de ancho. Redondear todos los bordes que puedan tener una acción
cortante sobre la muestra hasta un radio de 0,4 mm. Las mordazas tienen una separación entre sí de 76,2 mm al comienzo de
la prueba y se separan a una velocidad de 30,5 cm ± 13 mm por minuto. La máquina tiene una capacidad tal que cuando se
produce la ruptura, la desviación del péndulo de la vertical está entre 9º y 45º.

(891) ANÁLISIS TÉRMICO

INTRODUCCIÓN

Los sucesos termodinámicos determinados con precisión, como por ejemplo un cambio de estado, pueden indicar la identi-
dad y la pureza de los fármacos. Desde hace mucho tiempo se han venido estableciendo normas farmacopeicas para las tem-
peraturas de fusión y de ebullición de las sustancias. Estas transiciones ocurren a temperaturas características y de esta manera
862 (891) Análisis Térmico/ Pruebas Físicas USP 40

las normas farmacopeicas contribuyen a la identificación de las sustancias. Dado que las impurezas afectan a estos cambios de
manera predecible, las mismas normas farmacopeicas contribuyen al control de la pureza de las sustancias.
El análisis térmico, en el sentido más amplio, es la medición de las propiedades físicas y químicas de los materiales en fun-
ción de la temperatura. Los métodos instrumentales han suplantado, en gran medida, a métodos más antiguos, que depen-
dían de la inspección visual y de mediciones bajo condiciones fijas o arbitrarias, debido a que los métodos instrumentales son
objetivos, proporcionan más información, generan registros permanentes, y por lo general son más sensibles, precisos y exac-
tos. Además, pueden suministrar información sobre la desolvatación, la deshidratación, la descomposición, la perfección del
cristal, el polimorfismo, la temperatura de fusión, la sublimación, las transiciones vítreas, la evaporación, la pirólisis, las interac-
ciones sólido-sólido y la pureza. Tales datos resultan útiles para la caracterización de sustancias en lo que respecta a la compati-
bilidad, estabilidad, envasado y control de calidad. A continuación se describen las mediciones que se utilizan con mayor fre-
cuencia en el análisis térmico, es decir, temperaturas de transición y punto de fusión mediante calorimetría diferencial de barri-
do (DSC, por sus siglas en inglés), análisis termogravimétrico, microscopía de platina caliente y análisis de impurezas eutécti-
cas.

TEMPERATURAS DE PUNTO DE FUSIÓN Y DE TRANSICIÓN

Cuando se calienta una muestra, se pueden observar las transiciones usando DSC, análisis térmico diferencial (DTA, por sus
siglas en inglés), o microscopía de platina caliente (hot-stage microscopy). La DSC por flujo de calor (heat-flux DSC) sirve para
determinar el diferencial de calor entre la muestra y el material de referencia. En la DSC por compensación de calor (power
compensation DSC), la muestra y los materiales de referencia se mantienen a la misma temperatura, usando elementos de ca-
lentamiento individuales, y se registra la diferencia en el consumo de energía de los dos calentadores. La DTA monitorea la
diferencia de temperaturas entre la muestra y la referencia. Las transiciones que se pueden observar incluyen aquellas que se
presentan en la Tabla 1 a continuación. En el caso de la fusión, puede determinarse en forma objetiva y reproducible tanto el
"inicio" como el "pico" de temperatura, a menudo con una aproximación de unas pocas décimas de grado. Aunque estas
temperaturas son útiles para la caracterización de sustancias y la diferencia entre las dos temperaturas es un indicador de pure-
za, los valores no pueden compararse directamente con valores de "intervalos de fusión" o de "punto de fusión" visuales ni con
constantes tales como el punto triple del material puro.
Asimismo, se debe tener cuidado al comparar los resultados obtenidos a través de diferentes métodos de análisis. Los méto-
dos ópticos pueden medir el punto de fusión como la temperatura en la que se funde la última traza de material sólido. Por el
contrario, los puntos de fusión medidos con DSC pueden referir a la temperatura de inicio o a la temperatura en la que se
observó la velocidad de fusión máxima (vertex). No obstante, el vertex es sensible al peso de la muestra, a la velocidad de
calentamiento y a otros factores, mientras que la temperatura de inicio se ve menos afectada por tales factores. Cuando se
emplean técnicas térmicas, es necesario considerar las limitantes de la formación de soluciones sólidas, la insolubilidad en la
fusión, el polimorfismo y la descomposición durante el análisis.
Tabla 1
Sólido a líquido Fusión Endotérmica
Líquido a gas Vaporización Endotérmica
Congelación Exotérmica
Líquido a sólido
Cristalización Exotérmica
Sólido a gas Sublimación Endotérmica
Transición vítrea Evento de segundo orden
Desolvatación Endotérmica
Sólido a sólido
Amorfo a cristalino Exotérmica
Polimorfo Endotérmica o Exotérmica

Informe de Resultados de Métodos Instrumentales

Cada termograma debería estar acompañado por una descripción completa de las condiciones empleadas, incluyendo la
marca y el modelo del instrumento; el registro de la última calibración; el tamaño y la identificación de la muestra (incluyendo
el historial térmico); el envase; la identidad, la velocidad de flujo y la presión de la atmósfera gaseosa; la dirección y la veloci-
dad de cambio de temperatura; y la sensibilidad del instrumento y del registrador.
USP 40 Pruebas Físicas/ (891) Análisis Térmico 863

DETERMINACIÓN DE TEMPERATURA DE TRANSICIÓN (TEMPERJ\TURA DE INICIO DE FUSIÓN)

Y TEMPERATURA DE PUNTO DE FUSION

Aparato

Usar instrumental para DTA o DSC equipado con un dispositivo de programación de temperatura, detector(es) térmico(s) y
un sistema de registro que se pueda conectar a una computadora, a menos que la monografía individual para la que se em-
plea el capítulo indique algo distinto.

Calibración

Calibrar el instrumental para cambios de temperatura y entalpía usando indio u otro material adecuado certificado. La cali-
bración de la temperatura se lleva a cabo calentando un estándar a través de la transición de fusión y comparando el inicio
extrapolado del punto de fusión del estándar con el inicio certificado de punto de fusión. La calibración de la temperatura se
debería realizar a la misma velocidad de calentamiento que el experimento. La calibración de la entalpía se lleva a cabo calen-
tando un estándar a través de la transición de fusión y comparando el calor de fusión calculado con el valor teórico.

Procedimiento

Pesar con exactitud una cantidad apropiada de la sustancia a examinar en el receptáculo de la muestra (sample pan), según
se describe en la monografía específica. Ajustar la temperatura inicial, la velocidad de calentamiento, la dirección del cambio
de temperatura y la temperatura final según se especifica en la monografía. Si no se especifican en la monografía, estos pará-
metros se determinan según se indica a continuación: realizar un análisis preliminar sobre un amplio intervalo de temperaturas
(por lo general, desde la temperatura ambiente hasta la temperatura de descomposición, o aproximadamente 1 Oº a 20º por
encima del punto de fusión) y sobre un amplio intervalo de velocidades de calentamiento (1 º a 20º por minuto) para eviden-
ciar cualquier efecto inesperado. Posteriormente, determinar una velocidad de calentamiento más baja de modo que se mini-
mice la descomposición y que no se comprometa la temperatura de transición. Determinar un intervalo de temperatura que
comprenda la transición de interés de modo que la línea base se pueda extender hasta intersectar con la tangente de la fusión
(ver Figura 7).

188.7Q"C
-102.3J/g

u
o -4

"
¡;:

-6

190,31"C
·175• + - - - - - - - - - - - - - - - - - - <210
Exo Up Temperatu11 (-C)

Figura 1. Termograma.

Al examinar materiales cristalinos puros, pueden ser apropiadas velocidades tan bajas como 1 º por minuto, mientras que
para materiales poliméricos y demás materiales semicristalinos resultan más apropiadas velocidades de hasta 20º por minuto.
Comenzar el análisis y registrar la curva del análisis térmico diferencial con la temperatura en el eje x y el cambio de energía en
el eje y. La temperatura de fusión (temperatura de inicio de fusión) es la intersección (188,79º) de la extensión de la línea base
con la tangente al punto de mayor pendiente (punto de inflexión) de la curva (ver Figura 7). El vértice es la temperatura en el
pico de la curva (190,31 º). La entalpía del evento es proporcional al área bajo la curva después de aplicar una corrección de la
línea base.

ANÁLISIS TERMOGRAVIMÉTRICO
El análisis termogravimétrico incluye la determinación de la masa de una muestra como una función de la temperatura, o
del tiempo de calentamiento, o ambos. Por lo general se usa para investigar los procesos de deshidratación/desolvatación y la
descomposición de compuestos. Cuando la termogravimetría se aplica apropiadamente, ésta suministra información de mayor
utilidad que la pérdida por secado a temperatura fija, que frecuentemente se realiza durante un tiempo fijo y por lo general en
864 (891) Análisis Térmico/ Pruebas Físicas USP 40

una atmósfera mal definida. Por lo general, la pérdida de disolvente absorbido en la superficie puede distinguirse del disolven-
te en la red cristalina y de las pérdidas por degradación. Las mediciones pueden llevarse a cabo en atmósferas con una hume-
dad y una concentración de oxígeno controladas para revelar interacciones con el fármaco, entre fármacos y entre sustancias
activas y excipientes o materiales del envase.

Aparato

Mientras que los detalles dependen del fabricante, las características esenciales del equipo son una balanza que registra los
pesos y una fuente de calor programable. Los equipos difieren en la capacidad para manejar muestras de diversos tamaños, la
manera en que se registra la temperatura de la muestra y el intervalo de control de la atmósfera.

Calibración

Se requiere una calibración para todos los sistemas; es decir, la balanza se calibra usando pesas estándar, y la calibración de
temperatura implica el uso de materiales estándar, puesto que se asume que la temperatura de la muestra es la temperatura
del horno. La calibración de peso se lleva a cabo midiendo la masa de una pesa certificada o estándar y comparando la masa
medida con el valor certificado. La calibración de la temperatura se lleva a cabo analizando un estándar magnético de alta
pureza, tal como níquel, para determinar su temperatura de Curie y comparando el valor medido con el valor teórico.

Procedimiento

Aplicar el método a la muestra, empleando las condiciones descritas en la monografía, y calcular la ganancia o pérdida de
masa, expresando el cambio de masa como porcentaje. Alternativamente, colocar una cantidad adecuada de material en el
portamuestras y registrar el peso. Debido a que la atmósfera de análisis es crítica, se especifica la presión o velocidad de flujo y
la composición del gas. Ajustar la temperatura inicial, la velocidad de calentamiento y la temperatura final de acuerdo con las
instrucciones del fabricante, e iniciar el aumento de temperatura. Alternativamente, analizar el termograma sobre un amplio
intervalo de temperaturas (por lo general, desde la temperatura ambiente hasta la temperatura de descomposición, o 1 Oº a
20º por encima del punto de fusión a una velocidad de calentamiento de 1 ºa 20º por minuto). Calcular la ganancia o pérdida
de masa, expresando el cambio de masa como porcentaje.

MICROSCOPÍA DE PLATINA CALIENTE

La microscopía de platina caliente es una técnica analítica que implica el monitoreo de las propiedades ópticas de la muestra
como una función de la temperatura usando un microscopio. La microscopía de platina caliente se puede usar como técnica
complementaria de otras técnicas de análisis térmico, tales como DSC, DTA y difracción de rayos X de temperatura variable
para polvos, para la caracterización del estado sólido de compuestos farmacéuticos. Resulta de utilidad para confirmar transi-
ciones tales como fusiones, recristalizaciones y transformaciones al estado sólido usando una técnica visual. El microscopio de
platina caliente debe someterse a una calibración de temperatura.

ANÁLISIS DE IMPUREZAS EUTÉCTICAS

La base de cualquier método de pureza calorimétrica es la relación entre la disminución del punto de fusión y de congela-
ción y el nivel de impurezas. La fusión de un compuesto está caracterizada por la absorción del calor latente de fusión, ~H 1, a
una temperatura específica, T0 • En teoría, una transición de fusión para un compuesto cristalino totalmente puro debe ocurrir
dentro de un intervalo infinitamente estrecho. Una ampliación del intervalo de fusión, debido a impurezas, proporciona un
criterio de pureza sensible. El efecto es evidente mediante el examen visual de termogramas de muestras que difieren por unas
pocas décimas de porcentaje en el contenido de impurezas. Un material con 99% de pureza se funde aproximadamente en un
20% a una temperatura de 3º por debajo del punto de fusión del material puro (ver Figura 2).
USP 40 Pruebas Físicas/ (891) Análisis Térmico 865

- Temperatura

Ácido Benzoico

~Patrón Primario (NIST)

Figura 2. Termogramas superpuestos en los que se muestra el efecto de las impurezas sobre la forma del pico de fusión en
una DSC.

Los parámetros de fusión (intervalo de fusión, ~Hf y la pureza eutéctica calculada) se obtienen fácilmente a partir del termo-
grama de un solo evento de fusión empleando una muestra de prueba pequeña y el método no requiere mediciones múltiples
de temperatura reales y precisas. Las unidades del termograma se convierten directamente a transferencia de calor, en milica-
lorías por segundo.
El descenso del punto de congelación en soluciones diluidas por moléculas de tamaño casi igual se expresa mediante la ecua-
ción de van't Hoff modificada:

en donde T =temperatura absoluta en grados Kelvin; X2 =fracción molar del componente menor (soluto; impureza), ~Hf =
calor molar de fusión del componente principal en Joules por mol: R =constante de gases en Joules por mol x grados Kelvin; y
K0 =cociente de distribución del soluto entre la fase sólida y la fase líquida.
Asumiendo que el intervalo de temperatura es pequeño y que no se forman sólidos en solución (K 0 =O), la integración de la
ecuación de van't Hoff proporciona la siguiente relación entre la fracción molar de la impureza y la disminución del punto de
fusión:

(2)

en donde T0 = punto de fusión del compuesto puro, en grados Kelvin, y T m = punto de fusión de la muestra de prueba, en
grados Kelvin.
Sin formación de sólidos en la solución, la concentración de la impureza en la fase líquida, a cualquier temperatura durante
la fusión, es inversamente proporcional a la fracción fundida a esa temperatura y la disminución del punto de fusión es directa-
mente proporcional a la fracción molar de la impureza. Un gráfico de la temperatura observada de la muestra de prueba, T51
frente al recíproco de la fracción fundida, 1/ F, a una temperatura T51 debe producir una línea recta con una pendiente igual a
la disminución del punto de fusión (T0 - Tm). El punto de fusión teórico del compuesto puro se obtiene mediante extrapola-
ción a 1/F = O:

La sustitución de los valores obtenidos en forma experimental para T0 - T m1 ~H 1 y T0 en la ecuación (2) produce la fracción
molar de la impureza eutéctica total, la cual, cuando se multiplica por 100 da el porcentaje molar de impurezas eutécticas
totales.
Las desviaciones del gráfico lineal teórico también pueden ser producto de la formación de soluciones sólidas (K 0 * O), por lo
tanto se debe prestar atención al interpretar estos datos.
Para observar el efecto lineal de la concentración de impurezas sobre la disminución del punto de fusión, la impureza debe
ser soluble en la fase líquida o la fase fundida del compuesto, pero insoluble en la fase sólida, es decir, no se forma ninguna
solución sólida. Para que se produzca la solubilidad en el material fundido son necesarias algunas semejanzas químicas. Por
ejemplo, la presencia de compuestos iónicos en compuestos orgánicos neutros y la descomposición térmica quizá no se refle-
jen en las estimaciones de pureza. El alcance de estas limitaciones teóricas se ha estudiado sólo en forma parcial.
866 (891) Análisis Térmico/ Pruebas Físicas USP 40

Las impurezas presentes provenientes de la ruta sintética a menudo son similares al producto final, en consecuencia no hay
generalmente ningún problema de solubilidad en el material fundido. Las impurezas compuestas por moléculas de igual for-
ma, tamaño y carácter que las del componente principal pueden acomodarse en la matriz del componente principal sin modi-
ficar la retícula, formando soluciones sólidas o inclusiones; tales impurezas no son detectables por DSC. En tales casos, las esti-
maciones de pureza son demasiado altas. Esto es más común con cristales menos ordenados, según lo indican los valores bajos
de calor de fusión.
Además, el método es confiable cuando la pureza del componenete principal es mayor de 98,5 mol% y los materiales no se
descomponen durante la fase de fusión.
Los niveles de impurezas calculados a partir de los termogramas son reproducibles y generalmente confiables con una apro-
ximación de 0, 1% para compuestos ideales.
Los compuestos que existen en forma polimorfa no pueden usarse en la determinación de pureza a menos que el compues-
to se convierta completamente a una forma. Por otro lado, la DSC y el DTA son intrínsicamente útiles para detectar y en con-
secuencia realizar el seguimiento del polimorfismo.

Procedimiento

El procedimiento vigente y los cálculos a emplear para el análisis de impurezas eutécticas dependen del instrumento específi-
co usado. Consultar la técnica más apropiada para un instrumento dado en la bibliografía del fabricante y/o en la bibliografía
de análisis térmico. De todas formas, es imperativo recordar las limitaciones de formación de soluciones sólidas, la insolubilidad
en el material fundido, el polimorfismo y la descomposición durante el análisis.

<905) UNIFORMIDAD DE UNIDADES DE DOSIFICACIÓN

Este capítulo de pruebas generales ha sido armonizado con los textos correspondientes de la Farmacopea Europea y la Farma-
copea japonesa. Los textos del capítulo que son textos USP de aplicación nacional y que no forman parte del texto armonizado
están marcados con los símbolos(+.) para indicar esta situación.
•NOTA-En este capítulo, los términos unidad y unidad de dosificación son sinónimos .•
Para garantizar la uniformidad de las unidades de dosificación, cada unidad en un lote debe tener un contenido de fármaco
dentro de un intervalo estrecho alrededor de la cantidad declarada. Las unidades de dosificación se definen como formas far-
macéuticas que contienen una única dosis o parte de una dosis de un fármaco en cada unidad. Para suspensiones, emulsiones
o geles en envases de dosis única destinadas para administración externa o cutánea no se aplica la especificación de uniformi-
dad de unidades de dosificación.
El término "uniformidad de unidades de dosificación" se define como el grado de uniformidad en el contenido del fármaco
entre las unidades de dosificación. Por lo tanto, los requisitos de este capítulo son aplicables a cada fármaco incluido en unida-
des de dosificación que contengan uno o más fármacos, a menos que se especifique algo diferente en otra parte de esta Far-
macopea.
La uniformidad de las unidades de dosificación se puede demostrar mediante uno de los siguientes métodos, Uniformidad de
Contenido o Variación de •Peso. (ver la Tabla 1). La prueba de Uniformidad de Contenido para preparaciones que se presentan en
unidades de dosificación se basa en la valoración individual del contenido de un fármaco o fármacos en un número de unida-
des de dosificación para determinar si el contenido individual se encuentra dentro de los límites fijados. El método de Uniformi-
dad de Contenido se puede aplicar en todos los casos.
La prueba de Variación de •Peso. es aplicable para las siguientes formas farmacéuticas:

(Wl) Soluciones contenidas en envases de dosis única y en cápsulas blandas;

(W2) Sólidos (incluidos los polvos, gránulos y sólidos estériles) envasados en envases unitarios y que no contienen sustancias activas o
inactivas agregadas;
(W3) Sólidos (incluidos los sólidos estériles) envasados en envases unitarios, con o sin sustancias activas o inactivas agregadas, que
hayan sido preparados por liofilización a partir de soluciones verdaderas en sus envases finales y que declaran este método de
preparación; y
(W4) Cápsulas duras, tabletas sin cubierta o tabletas recubiertas con películas que contengan 25 mg o más de un fármaco que co-
rresponda al 25% o más, en peso, de la unidad de dosificación o, en el caso de cápsulas duras, el contenido de las cápsulas,
excepto que se demuestre la uniformidad de otros fármacos presentes en proporciones menores en cumplimiento de los re-
quisitos de Uniformidad de Contenido.
 USP 40 Pruebas Físicas/ (905) Uniformidad de Unidades de Dosificación 867

La prueba de Uniformidad de Contenido se requiere para todas las formas farmacéuticas que no cumplen las condiciones enu-
meradas anteriormente para la prueba de Variación de •Peso•. 1
Tabla 1. Aplicación de las Pruebas de Uniformidad de Contenido (UC) y Variación de Peso (VP) para Formas Farmacéuticas
Dosis y
Proporción de
Fármaco
Forma <:25 mg <25 mg
Farmacéutica Tipo Subtipo y<:25% o <25%
Tabletas Sin cubierta VP uc
Recubiertas Película VP uc
Otras uc uc
Cápsulas Duras VP uc
Blandas Suspensión, emulsión o uc uc
gel
Soluciones VP VP
Sólidos en envases Componente único VP VP
unitarios
Varios componentes Solución liofilizada en en- VP VP
vase final
Otros uc uc
Soluciones en envases de dosis única •y VP VP
en cápsulas blandas.
Otros uc uc
UNIFORMIDAD DE CONTENIDO

Seleccionar no menos de 30 unidades y proceder según se indica a continuación para cada forma farmacéutica especificada.
Cuando se utilizan procedimientos diferentes para la valoración de la preparacion y para la prueba de Uniformidad de Conte-
nido, puede ser necesario establecer un factor de corrección que deberá aplicarse a los resultados de esta última.

Formas Farmacéuticas Sólidas

Valorar 1O unidades individualmente usando un método analítico apropiado. Calcular el valor de aceptación (ver la Tabla 2).

Formas Farmacéuticas Líquidas o Semisólidas

Valorar 1O unidades individualmente usando un método analítico apropiado. Realizar la valoración sobre la cantidad de ma-
terial bien mezclado que se retira de un envase individual en condiciones normales de uso y expresar los resultados como la
dosis entregada. Calcular el valor de aceptación (ver la Tabla 2).

Cálculo del Valor de Aceptación

Calcular el valor de aceptación, por la fórmula:

en donde los términos se definen en la Tabla 2.

Tabla 2
Variable Definición Condiciones Valor
Media de los contenidos individuales (x 1 ,
-
x2 , ... , Xn), expresados como el porcenta-
X je de la cantidad declarada

1 •Textos de la Farmacopea Europea y la Farmacopea Japonesa no aceptados por la Farmacopea de los Estados Unidos: Como alternativa, para los productos lista-
dos en el punto (4) anterior que no cumplen con el límite de umbral de 25 mg/25%, se puede analizar la uniformidad de las unidades de dosificación mediante
Variación de Masa en lugar de la prueba de Uniformidad de Contenido si la desviación estándar relativa (RSD) de la concentración del fármaco en las unidades de
dosificación finales no es más de 2%, basándose en los datos de validación del proceso y en los datos de desarrollo, y si existiese una aprobación reglamentaria
para dicho cambio. La RSD de la concentración es la RSD de la concentración por unidad de dosificación (p/p o p/v), en donde la concentración por unidad de
dosificación es igual al resultado de la valoración por unidad de dosificación dividido por el peso de la unidad de dosificación individual. Ver la fórmula para la RSD
en la Tabla 2 .•
868 (905) Uniformidad de Unidades de Dosificación / Pruebas Físicas USP 40

Tabla 2 (Continuación)
Variable Definición Condiciones Valor
X1, Xz, ···, Xn Contenido individual de las unidades anali-
zadas, expresado como porcentaje de la
cantidad declarada
n Tamaño de la muestra (número de unida-
des en una muestra)
k Constante de aceptabilidad Si n = 1 O, entonces k = 2,4

l" '
Si n = 30, entonces k = 2,0
s Desviación estándar de la muestra 1
2

~(Je-X)
n-1

RSD Desviación estándar relativa (la desviación 1 OOs/X

M (caso 1) a aplicar cuando
T-<:101,5
M (caso 2) a aplicar cuando
T >101,5
Valor de aceptación (AV)
estándar de la muestra expresada como
porcentaje de la media)
Valor de referencia Si 98,5% <::X <::101,5%,
entonces M =X (AV= ks)
M = 98,5%
Si X <98,5%, entonces (AV= 98,5 - X+ ks)
Si X> 101,5%, M = 101,5%
entonces (AV= X - 101,5 + ks)
Valor de referencia Si 98,5 <::X <::T, M=X
entonces (AV= ks)
M = 98,5%
Si X <98,5%, entonces (AV= 98,5 - X+ ks)
M=To/o
Si X >T, entonces (AV= X - T + ks)
Fórmula general:

Ll Máximo valor de aceptación permitido
L2 Máximo intervalo permitido para la desvia-
ción de cada unidad de dosificación anali-
zada a partir del valor calculado de M
T Contenido deseado por unidad de dosifica-
ción al momento de la fabricación, expre-
sado como porcentaje de la cantidad de-
clarada. A menos que se indique de otro
modo, Tes 100,0% o Tes el contenido
deseado aprobado por el fabricante por
unidad de dosificación.
IM-Xl+ks
(Más arriba se especifican cálculos
para cada uno de los casos.)
L1 = 15,0 a menos que se especifi-
que algo diferente
Para los valores inferiores, nin- L2 = 25,0 a menos que se especifi-
gún resultado de unidad de que algo diferente
dosificación puede ser menor
de [1-(0,01 )(L2)]M, mientras
que para los valores superiores,
ningún resultado de unidad de
dosificación puede ser mayor
de [1 + (O,Ol)(L2)]M. (Esto es-
tá basado en un valor de L2 de
25,0.)

VARIACIÓN DE •PESO.

Llevar a cabo una valoración del (de los) fármaco(s) en una muestra representativa del lote usando un método analítico
apropiado. Este valor es el resultado A, expresado como porcentaje de la cantidad declarada (ver Cálculo del Valor de Acepta-
ción). Se debe asumir que la concentración (peso del fármaco por peso de unidad de dosificación) es uniforme. Seleccionar no
menos de 30 unidades de dosificación y proceder según se indica a continuación para la forma farmacéutica designada.
USP 40 Pruebas Físicas/ (905) Uniformidad de Unidades de Dosificación 869

Tabletas sin Cubierta o Recubiertas con Película

Pesar con exactitud 1O tabletas individualmente. Calcular el contenido, expresado como porcentaje de la cantidad declara-
da, a partir del •peso• de la tableta individual y del resultado de la Valoración. Calcular el valor de aceptación.

Cápsulas Duras

Pesar con exactitud 1O cápsulas individualmente, teniendo cuidado de preservar la identidad de cada cápsula. Retirar el con-
tenido de cada cápsula por un medio adecuado. Pesar individualmente con exactitud las cubiertas vacías y calcular para cada
cápsula el •peso• neto de su contenido restando el •peso• de la cubierta del •peso• bruto respectivo. Calcular el contenido de
fármaco de cada cápsula a partir del •peso neto• del •contenido• de la cápsula individual y del resultado de la Valoración. Calcu-
lar el valor de aceptación.

Cápsulas Blandas

Pesar con exactitud 1O cápsulas intactas individualmente para obtener sus •pesos• brutos, teniendo cuidado de preservar la
identidad de cada cápsula. Luego cortar y abrir las cápsulas con ayuda de un instrumento cortante seco, limpio y adecuado,
como por ejemplo una tijera o una cuchilla afilada, y retirar el contenido lavando con un disolvente adecuado. Dejar que el
disolvente ocluido se evapore de las cubiertas a temperatura ambiente durante un periodo de aproximadamente 30 minutos,
tomando precauciones para evitar la absorción o la pérdida de humedad. Pesar las cubiertas individuales y calcular el conteni-
do neto. Calcular el contenido de fármaco en cada cápsula a partir del •peso• del producto retirado de la cápsula individual y
del resultado de la Valoración. Calcular el valor de aceptación.

Formas Farmacéuticas Sólidas Diferentes de Tabletas y Cápsulas

Proceder según se indica para Cápsulas Duras, tratando cada unidad como allí se describe. Calcular el valor de aceptación.

Formas Farmacéuticas Líquidas

Pesar con exactitud la cantidad de líquido que se retira de cada uno de 1O envases individuales en condiciones normales de
uso. Si fuera necesario, calcular el volumen equivalente después de determinar la densidad. Calcular el contenido de fármaco
en cada envase a partir de la masa de producto retirada de los envases individuales y del resultado de la Valoración. Calcular el
valor de aceptación.

Cálculo del Valor de Aceptación

Calcular el valor de aceptación como se muestra en Uniformidad de Contenido con la excepción de que el contenido indivi-
dual de las unidades se reemplaza por el contenido estimado individual, como se define a continuación.

X11 X21···1 Xn = contenido estimado individual de las unidades analizadas, en donde X;= W; x A/ W,
W1 1 W2 1 ••• , Wn = •pesos. individuales de las unidades analizadas
A = contenido de fármaco (% de la cantidad declarada) obtenido usando un método analítico
apropiado
w = media de •pesos. individuales
(W1, Wz, ... , Wn)

CRITERIOS

Aplicar los siguientes criterios, a menos que se especifique algo diferente.

Formas Farmacéuticas Sólidas, Líquidas y Semisólidas

Se cumple con los requisitos de uniformidad de dosificación si el valor de aceptación de las primeras 1O unidades de dosifi-
cación es menor o igual a L1%. Si el valor de aceptación es mayor que L1%, analizar las siguientes 20 unidades y calcular el
valor de aceptación. Se cumple con los requisitos si el valor de aceptación final de las 30 unidades de dosificación es menor o
igual a L1 %, y si el contenido individual de •ninguna. unidad de dosificación es menor de [1 - (0,01 )(L2)]M ni mayor de [1 +
(0,01 )(L2)]M •como se especifica. en Cálculo del Valor de Aceptación en Uniformidad de Contenido o en Variación de •Peso•. A
menos que se especifique algo diferente, L1 es 15,0 y L2 es 25,0.
870 (911) Viscosidad-Métodos Capilares / Pruebas Físicas USP 40

(911) VISCOSIDAD-MÉTODOS CAPILARES

Los siguientes procedimientos se usan para determinar la viscosidad de un fluido newtoniano, es decir, un fluido con una vis-
cosidad que es independiente de la velocidad de corte o cizallamiento. [NOTA-Para más información, ver el capítulo Reome-
tría (1911 ).]
•MÉTODO l. VISCOSÍMETRO CAPILAR DE NIVEL SUSPENDIDO {O TIPO UBBELOHDE)
Aparato: La determinación se puede llevar a cabo con un viscosímetro capilar de nivel suspendido (Figura 7).

LM N

- R

Figura 1. Viscosímetro capilar de nivel suspendido (o tipo Ubbelohde).

Se pueden usar otros viscosímetros, siempre que la exactitud y la precisión no sean menores que las obtenidas con los vis-
cosímetros descritos en este capítulo.
Procedimiento: Llenar el viscosímetro a través del tubo (L) con una cantidad suficiente del fluido muestra, que sea apro-
piada para el viscosímetro en uso, o siguiendo las instrucciones del fabricante. Llevar a cabo el experimento con el tubo en
posición vertical. Llenar el bulbo (A) con el líquido y asegurarse también de que el nivel del líquido en el bulbo (B) esté por
debajo de la salida al tubo de venteo (M). Sumergir el viscosímetro en un baño de agua o aceite estabilizado a la tempera-
tura especificada en la monografía individual y controlar la temperatura a ±0, 1º, a menos que se especifique algo distinto
en la monografía individual. Mantener el viscosímetro en posición vertical durante un periodo de no menos de 30 minutos
para permitir que la temperatura de la muestra alcance el equilibrio. Cerrar el tubo (M) y elevar el nivel del líquido en el
tubo (N) hasta un nivel de aproximadamente 8 mm por encima de la marca (E= h 1). Mantener el líquido a este nivel ce-
rrando el tubo (N) y abriendo el tubo (M). Abrir el tubo (N) y medir el tiempo requerido para que el nivel del líquido baje
desde la marca (E= h1) hasta la marca (F = h 2), usando un dispositivo apropiado para la medición exacta del tiempo.
[NOTA-El tiempo de flujo mínimo debe ser 200 segundos.]
Calibración: Calibrar cada viscosímetro a la temperatura de prueba usando fluidos con viscosidades conocidas de estánda-
res de viscosidad apropiados para determinar la constante del viscosímetro, k. Los valores de viscosidad de los estándares
de calibración deben abarcar el valor de viscosidad esperado del fluido muestra.
Calcular la constante del viscosímetro, k, en mm 2 /s 2 :

k = TJ,/(p X t)
TJ. = viscosidad conocida del líquido (mPa · s)
p =densidad del líquido (g/mL)
t =tiempo de flujo requerido para que el líquido pase desde la marca superior hasta la marca inferior (s)
 USP 40 Pruebas Físicas/ (911) Viscosidad-Métodos Capilares 871

Cálculo de las viscosidades cinemática y newtoniana del fluido muestra: Seleccionar un viscosímetro capilar de modo
que el tiempo de flujo, t, sea no menos de 200 segundos; y la corrección de energía cinemática sea, por lo regular, menos
de 1%. Si se conoce la constante de viscosidad, k, usar la siguiente ecuación para calcular la viscosidad cinemática, v, en
mm2/s, a partir del tiempo de flujo, t, en segundos.
V=kxt
Si se conoce la densidad del fluido a la temperatura de la medición de la viscosidad, entonces la viscosidad newtoniana, 11,
en mPa · s, se calcula:

p =densidad del fluido (g/mL)

El tiempo de flujo del fluido en análisis es la media de no menos de tres determinaciones consecutivas. El resultado es váli-
do si la desviación estándar relativa porcentual (%RSD) para las tres lecturas es no más de 2,0%.
•MÉTODO 11. VISCOSÍMETRO CAPILAR SIMPLE DE TUBO EN FORMA DE U (O TIPO 0STWALD)
Aparato: La determinación se puede llevar a cabo con un viscosímetro capilar simple de tubo en forma de U (Figura 2).

l_

Figura 2. Viscosímetro capilar simple de tubo en forma de U (o tipo Ostwald).

Las variables y los números de las líneas en la Figura 2 se definen como:

Línea 1 = marca superior en el tubo
V =volumen dado del fluido (m3)
Línea 2 = marca inferior en el tubo
L = longitud del tubo capilar (m)
Se pueden usar otros viscosímetros, como los viscosímetros capilares tipo Ostwald modificados, 1 siempre que la exactitud y
la precisión no sean menores que las obtenidas con los viscosímetros descritos en este capítulo.
Procedimiento: Llenar el tubo con una cantidad de la muestra que sea apropiada para el viscosímetro en uso o siguiendo
las instrucciones del fabricante. El volumen de fluido usado debe ser tal que el bulbo inferior no se vacíe completamente
cuando el fluido se direcciona hacia arriba a través del tubo capilar hasta la marca de graduación más alta. Llevar a cabo el
experimento con el tubo en posición vertical. Sumergir el viscosímetro en un baño de agua o aceite estabilizado a la tem-
peratura especificada en la monografía individual y controlar la temperatura a ±0, 1 º, a menos que se especifique algo dis-
tinto en la monografía individual. Mantener el viscosímetro en posición vertical durante un periodo de no menos de 30
minutos para permitir que la temperatura de la muestra alcance el equilibrio. Usando succión, direccionar hacia arriba el
fluido a través del tubo capilar hasta que el menisco alcance el nivel de la graduación más alta. Con el tubo de llenado y el

1 Por ejemplo, el viscosímetro capilar Cannon-Fenske es uno de los viscosímetros capilares simples de tubo en forma de U y también se conoce como viscosímetro
capilar tipo Ostwald modificado.
872 (911) Viscosidad-Métodos Capilares / Pruebas Físicas USP 40

tubo capilar abiertos a la presión atmosférica, registrar el tiempo, en segundos, requerido para que el líquido fluya desde la
marca superior hasta la marca inferior en el tubo capilar. [NOTA-El tiempo de flujo mínimo debe ser 200 segundos.]
Calibración y Cálculo de las viscosidades cinemática y newtoniana del fluido muestra: Proceder según se indica en el
Método l. Para ciertos viscosímetros capilares simples de tubo en forma de U, determinar la constante del viscosímetro a la
misma temperatura que el líquido de muestra en análisis.

(912) VISCOSIDAD-MÉTODOS ROTATORIOS

El principio del método se basa en medir la fuerza (torque) que actúa sobre un rotor cuando éste rota a una velocidad angular
constante o velocidad de rotación en un líquido. Los reómetros o viscosímetros rotatorios se usan para medir la viscosidad
de fluidos newtonianos y no newtonianos. Los siguientes procedimientos se usan para determinar la viscosidad de fluidos
newtonianos o la viscosidad aparente de fluidos no newtonianos. La viscosidad calculada de los fluidos newtonianos debe
ser la misma (dentro del error experimental), independientemente de la velocidad de corte (o velocidad de rotación). Dada
la dependencia de la viscosidad con respecto a la temperatura, la temperatura de la sustancia que se está midiendo se debe
controlar dentro de ±0, 1 º, a menos que se especifique algo distinto en la monografía individual. [NOTA-Para más informa-
ción, ver el capítulo Reometría (1911 ).]
• MÉTODO l. VISCOSÍMETROS DE ROTOR
Aparato: En el viscosímetro de rotor, la viscosidad aparente se determina haciendo girar un rotor con forma de cilindro o
disco, según se muestra en la Figura 7 y la Figura 2, respectivamente, sumergido en un gran volumen de líquido.

Figura 1. Rotores con forma de cilindro.

Figura 2. Rotores con forma de disco.

No se puede calcular una viscosidad absoluta debido a la gran distancia existente entre el rotor y la pared del recipiente, o
a la geometría del rotor. El torque empleado para mantener una velocidad angular dada proporciona una medida de la
resistencia del líquido a fluir, pero a menudo esto se describe como una viscosidad aparente.
Se pueden usar otros tipos de viscosímetros de rotor, siempre que la exactitud y la precisión no sean menores que las obte-
nidas con los viscosímetros descritos en este capítulo.
USP 40 Pruebas Físicas / (912) Viscosidad-Métodos Rotatorios 873

Procedimiento: Cuando la medición de la viscosidad se realiza en un vaso de precipitados o vaso, y debido a que la veloci-
dad de corte es desconocida, para poder conseguir reproducibilidad entre laboratorios que miden la viscosidad usando ins-
trumentos diferentes, deben informarse los siguientes parámetros junto con la medida de la viscosidad:
1. Tamaño y especificaciones geométricas del rotor
2. Velocidad angular o velocidad de rotación del rotor
3. Temperatura de la sustancia de prueba
El rotor debe sumergirse a la profundidad recomendada, manteniendo al menos 1 cm de distancia con el fondo y con las
paredes del recipiente.
La preparación de la muestra de prueba, incluyendo la equilibración de temperatura, se especifica en cada monografía in-
dividual. Seguir las recomendaciones del fabricante del instrumento con respecto a la carga de la muestra, la selección del
rotor y la operación del viscosímetro.
Comprobación de la calibración: Comprobar la calibración de la configuaración de un viscosímetro particular a la tempe-
ratura de prueba, usando uno o más fluidos de viscosidad conocida (estándares de viscosidad newtoniana). Los valores de
viscosidad de los estándares de calibración deben contener el valor de viscosidad esperado del líquido de muestra. [NOTA-
Para ayudar a verificar la linealidad del aparato, se sugiere realizar mediciones de un estándar de viscosidad newtoniana a
distintas velocidades de rotación a la temperatura de prueba.]
Se considera que un viscosímetro está calibrado cuando las viscosidades aparentes medidas están dentro de ±5% de los
valores indicados.
En general, la calibración, operación y limpieza del viscosímetro se deben llevar a cabo de acuerdo con las recomendacio-
nes del fabricante del instrumento.
• MÉTODO 11. REÓMETROS DE CILINDROS CONCÉNTRICOS
Aparato: En los reómetros de cilindros concéntricos, la viscosidad aparente se determina colocando el líquido en el espacio
entre el cilindro interno y el cilindro externo. Los reómetros rotatorios de tensión controlada y de velocidad controlada es-
tán disponibles comercialmente en configuraciones con especificaciones geométricas absolutas (p.ej., espacios anulares
muy pequeños entre los cilindros concéntricos) que permiten calcular las viscosidades aparentes de fluidos no newtonia-
nos. Los reómetros de tensión de corte controlada miden las velocidades de corte resultantes al aplicar una fuerza o torque
dado (la tensión). Los reómetros de velocidad de corte controlada miden la tensión de corte (del torque sobre el eje del
rotor) resultante de la aplicación de una velocidad de corte dada (o velocidad de rotación). Los reómetros rotatorios de
cilindros concéntricos en ocasiones reciben el nombre de reómetros de vaso y cilindro ("cup-and-bob"). El uso de estos
reómetros implica consideraciones adicionales de diseño, dependiendo de si lo que gira es el cilindro externo (el vaso) o el
cilindro interno (el cilindro). Los reómetros de vaso rotatorio reciben el nombre de sistemas Couette, mientras que los reó-
metros de cilindro interno rotatorio se denominan sistemas Searle, según se muestra en la Figura 3 y la Figura 4, respectiva-
mente.
Las variables en la Figura 3 y la Figura 4 se definen como:
M = torque que actúa sobre la superficie del cilindro (N · m)
R0 = radio del cilindro externo (m)
R1 = radio del cilindro interno (m)
h = altura de inmersión del cilindro interno en el medio líquido (m)
CD =velocidad angular (radianes/s)
TJ = viscosidad (Pa · s)
v =velocidad (m/s)
Procedimiento: Colocar una cantidad suficiente de fluido de prueba en el reómetro y dejar que la muestra alcance el equi-
librio térmico, según se indica en la monografía individual. Poner en funcionamiento el reómetro siguiendo el procedimien-
to recomendado por el fabricante del instrumento. Para sistemas no newtonianos, la monografía indica el tipo de reómetro
que se debe usar y las velocidades de corte a las que se deben realizar las mediciones. Determinar las viscosidades aparen-
tes, cambiando la velocidad de corte (o la tensión de corte, si se usa un reómetro de tensión de corte controlada) en un
intervalo apropiado para el uso del material en análisis. A partir de una serie de este tipo de mediciones de viscosidad, se
puede obtener la relación entre la velocidad de corte y la tensión de corte de un líquido no newtoniano.
• MÉTODO 111. REÓMETROS DE CONO V PLACA
Aparato: En los reómetros de cono y placa, el líquido se introduce en el espacio fijo entre un disco o placa planos y un
cono los cuales forman un ángulo definido. El ángulo del cono garantiza una velocidad de corte constante debido al au-
mento del espacio y de la velocidad lineal conforme aumenta la distancia desde el origen. La medición de viscosidad se
puede realizar haciendo girar el cono o la placa, según se muestra en la Figura 5 y la Figura 6, respectivamente. [NOTA-
Puesto que el volumen de muestra es pequeño, incluso una pequeña pérdida absoluta de disolventes puede ocasionar un
gran cambio porcentual en la viscosidad. Dicha pérdida tiene una importancia particularmente relevante para disolventes
volátiles pero puede ser significativa incluso para disolventes no volátiles como el agua.]
Las variables en la Figura 5 y la Figura 6 se definen como:
CD =velocidad angular (radianes/s)
M = torque que actúa sobre la superficie de la placa plana o del cono (N · m)
a = ángulo entre la placa plana y el cono (radianes)
R = radio del cono (m)
874 (912) Viscosidad-Métodos Rotatorios/ Pruebas Físicas USP 40

Procedimiento: Proceder según se indica en el Método 11. Reómetros de Cilindros Concéntricos.

•MÉTODO IV. REÓMETROS DE PLACAS PARALELAS (O DE DISCOS PARALELOS)
Aparato: Los reómetros de placas paralelas son similares a los reómetros de cono y placa, salvo que la muestra que se va
medir se introduce en el espacio entre las dos placas o discos planos paralelos. Las mediciones se realizan normalmente
manteniendo la placa o disco inferior estacionario mientras que la placa o disco superior rota a una velocidad angular cons-
tante, w (Figura 1).
Las variables en la Figura 7 se definen como:
w =velocidad angular (radianes/s)
R = radio de la placa (m)
h = distancia entre las dos placas paralelas (m)
A diferencia de lo que ocurre con el reómetro de cono y placa, la velocidad de corte entre las placas paralelas aumenta con
la distancia desde el origen del eje de rotación debido a que las velocidades lineales aumentan para una velocidad angular
dada con un espacio constante. De esta manera, se obtiene una velocidad de corte promedio. A pesar de esto, algunas de
las ventajas del reómetro de placas paralelas incluye la facilidad de carga de la muestra (especialmente para líquidos muy
viscosos o semisólidos blandos) y su aptitud para suspensiones de partículas. Para suspensiones, el espacio debe fijarse a
una altura suficiente para evitar que las partículas se muelan entre las placas. El usuario puede definir el espacio entre las
placas paralelas (dentro de límites prácticos) y por lo tanto, ante la ausencia de partículas grandes, se pueden usar espa-
cios más estrechos. Al igual que con los reómetros de cono y placa, la pérdida de disolvente por evaporación puede afec-
tar en gran medida la viscosidad de la muestra, por lo que deben tomarse precauciones para minimizar la pérdida de
disolvente.
Procedimiento: Proceder según se indica en Método //. Reómetros de Cilindros Concéntricos.

Ro
Ri-+:

r-
h

L w
~ ~

Figura 3. Sistema de cilindros concéntricos Couette para reometría rotacional.

USP 40 Pruebas Físicas/ (912) Viscosidad-Métodos Rotatorios 875

Ro
Ri-:

Figura 4. Sistema de cilindros concéntricos Searle para reometría rotacional.

Figura 5. Reómetro rotatorio de cono y placa con cono giratorio.

876 (912) Viscosidad-Métodos Rotatorios/ Pruebas Físicas USP 40

_R_:
1
1
1

Figura 6. Reómetro rotatorio de cono y placa con placa giratoria.

0)

~
r= R *h

Figura 7. Reómetro rotatorio de placas paralelas.

USP 40 Pruebas Físicas/ (913) Viscosidad-Método de Bola Rodante 877

(913) VISCOSIDAD-MÉTODO DE BOLA RODANTE

El siguiente procedimiento se usa para determinar la viscosidad de un fluido newtoniano, es decir, un fluido con una viscosi-
dad que es independiente de la tensión o velocidad de corte. [NOTA-Para más información, ver el capítulo Reometría (1911 ).]

APARATO

Ver la Figura 1.
El diseño básico de un viscosímetro de bola rodante consiste en un tubo (o capilar) que contiene el líquido de muestra en
análisis y una bola cuyo tiempo de rodado deberá ser al menos 20 segundos en el ángulo de medición en el líquido de mues-
tra.

Fv: Fuerza de viscosidad

Fa: Fuerza de flotación
Fe: Gravedad
Tubo o Capilar - Fv

Fa 0
,_,.'7""---- Bola

Figura 1 . Diseño básico para un viscosímetro de bola rodante.

PRINCIPIO DE MEDICIÓN

La medición de viscosidad por medio de la bola rodante se basa en la Ley de Stokes y se ve influenciada por el ángulo de
inclinación del tubo (o capilar). Calcular la viscosidad newtoniana, r¡, en mPa · s:

1J = [(p 1 - p 2 ) x g x r2 x sinB]/v
00

p 7 = densidad de la bola usada (g/mL)

p 2 = densidad del líquido de muestra (g/mL)
g = constante gravitacional (mm/s 2)
r = radio de la bola (mm)
(}=ángulo de inclinación del tubo (o capilar)
v =velocidad terminal de la bola (mm/s)
00

Determinar la viscosidad del líquido, observando el tiempo de rodado de una esfera sólida (bola) bajo la influencia de la
gravedad en un tubo cilíndrico inclinado relleno del líquido de muestra. Medir el tiempo que la bola tarda en recorrer la dis-
tancia establecida entre dos marcas de anillo o sensores de medición. Para cada uno de los tiempos de rodado medidos, la
viscosidad resultante se puede expresar como viscosidad dinámica (mPa · s) o como viscosidad cinemática (mm 2 /s) para una
muestra con una densidad conocida.

PROCEDIMIENTO

Seleccionar un sistema de medición [combinación de tubo (o capilar) y bola] dentro del intervalo anticipado de viscosidad
del líquido de muestra. Calentar el tubo limpio y seco y la bola del viscosímetro a la temperatura especificada en la monografía
individual y controlar la temperatura a ±0, 1º según sea necesario, a menos que se especifique algo distinto en la monografía
individual. Seleccionar un ángulo de medición para obtener un tiempo de rodado mínimo de 20 segundos. Llenar el tubo con
el líquido de muestra, procurando evitar la formación de burbujas. Cerrar el tubo y colocarlo en el instrumento. Para un visco-
símetro de bola rodante con un tubo de diámetro grande, dejar que se equilibre a la temperatura especificada durante no
menos de 15 minutos. Para un viscosímetro de microbola rodante, seguir las instrucciones del fabricante con respecto al equili-
brio de la temperatura. Soltar la bola y registrar el tiempo requerido para que la bola ruede desde la marca de anillo superior
hasta la marca de anillo inferior (o sensor de medición). Repetir la prueba al menos cuatro veces.
El tiempo de rodado en el fluido en análisis es la media de no menos de cuatro determinaciones consecutivas. El resultado es
válido si la desviación estándar relativa porcentual (%RSD) para las cuatro lecturas es no más de 2,0%.
878 (913) Viscosidad-Método de Bola Rodante/ Pruebas Físicas USP 40

CÁLCULO Y CALIBRACIÓN

Calcular la viscosidad newtoniana, r¡, en mPa · s:

k = constante de calibración del instrumento (mm 2/s 2) a un ángulo y temperatura de medición especificados
p 7 =densidad de la bola usada (g/mL)
p 2 =densidad del líquido de muestra (g/mL)
t =tiempo de rodado de la bola (s)
Calibrar cada combinación de tubo (o capilar) y bola a la temperatura y ángulo de prueba usando fluidos con viscosidades y
densidades conocidas (estándares de viscosidad) para determinar la constante del sistema de medición, k. [NOTA-Algunos vis-
cosímetros automatizados emplean una función polinómica para determinar la calibración para diversos ángulos y temperatu-
ras.] Los valores de viscosidad de los estándares de calibración deben contener el valor de viscosidad esperado del líquido de
muestra.
Las calibraciones son específicas para el radio y densidad de la bola, la temperatura y el ángulo de prueba. Siempre que se
cambie alguno de estos parámetros será necesaria una recalibración.
Cuando no se dispone de valores de referencia a la temperatura de prueba requerida, se deben seguir las instrucciones del
fabricante para aplicar las correcciones matemáticas a la función de calibración. Cuando los materiales de la bola y el tubo no
son similares, se deben aplicar correcciones calculadas usando los coeficientes de expansión térmica lineal de los materiales.

(914) VISCOSIDAD-MÉTODOS POR MEDIDA DE PRESIÓN

INTRODUCCIÓN
Los viscosímetros/reómetros que se incluyen en este capítulo pueden usarse para medir la viscosidad de los fluidos newtonia-
nos y no newtonianos. Los dispositivos incluyen viscosímetros/reómetros de ranura y viscosímetros capilares de extrusión.
Los viscosímetros capilares que se describen en el capítulo Viscosidad-Métodos Capilares (911) se basan en el principio de que
el flujo está controlado por la gravedad y estos viscosímetros pueden clasificarse bajo uno de los métodos por medida de
presión. Sin embargo, las limitaciones de los viscosímetros capilares de vidrio los vuelven inherentemente inadecuados para
su uso en la caracterización de fluidos no newtonianos, además de que su uso en mediciones de fluidos de alta viscosidad
también resulta impráctico. El presente capítulo (914) no trata dichos viscosímetros.
[NOTA-Para información adicional, ver Reometría (1911 ).]
• MÉTODO l. VISCOSÍMETROS/REÓMETROS DE RANURA
Aparato: Ver la Figura 7.
El diseño básico de un viscosímetro/reómetro de ranura consta de un canal ranurado rectangular con un área de sección
transversal uniforme. Se bombea un líquido de prueba a una velocidad de flujo constante a través de este canal. Múltiples
sensores de presión que se montan empotrados al ras a distancias lineales a lo largo de la dirección de la corriente miden
la caída de presión, según se representa en la Figura 7.

Figura 1. Diseño básico del viscosímetro/reómetro de ranura.

USP 40 Pruebas Físicas/ (914) Métodos por Medida de Presión 879

Principio de medición: El viscosímetro/reómetro de ranura está basado en el principio fundamental de que un líquido vis-
coso resiste el flujo, por lo que presenta una presión que disminuye a lo largo de la ranura. La reducción o caída de la
presión (L1P) se correlaciona con la tensión de corte en la unión de las paredes. La velocidad de corte aparente está directa-
mente relacionada con la velocidad de flujo y la dimensión de la ranura. La velocidad de corte aparente (fa), la tensión de
corte (a) y la viscosidad aparente (77 0 ), respectivamente, se calculan de la siguiente manera:

. 6xQ
ra=wxh2

hxw AP
a= x-
2x(w+h) l

fa =velocidad de corte aparente (s- 1)

Q = velocidad de flujo (µL/s)
w = ancho del canal de flujo (mm)
h = profundidad del canal de flujo (mm)
a = tensión de corte (Pa)
L1P = diferencia de presión entre el sensor de presión inicial y el último sensor de presión (Pa)
I = distancia entre el sensor de presión inicial y el último sensor de presión (mm)
770 = viscosidad aparente (Pa · s)
Para determinar la viscosidad de un líquido, bombear la muestra líquida a través del canal ranurado a una velocidad de
flujo constante y medir la caída de la presión. Usando las ecuaciones mostradas anteriormente, calcular la viscosidad apa-
rente para la velocidad de corte aparente. Para un líquido newtoniano, la viscosidad aparente es la misma que la viscosi-
dad verdadera, y es suficiente la medición de una velocidad de corte individual. Para líquidos no newtonianos, la viscosi-
dad aparente no es la viscosidad verdadera. Para obtener la viscosidad verdadera, medir las viscosidades aparentes a múl-
tiples velocidades de corte aparentes. Calcular las viscosidades verdaderas, 77, a diversas velocidades de corte usando el
factor de corrección Weissenberg-Rabinowitsch-Mooney:

_!_=_l_x(Z+ dlny"}
77 2x77" dlnO"

La viscosidad verdadera calculada deber ser igual al valor que se obtiene usando un reómetro de cono y placa a la misma
velocidad de corte.
Procedimiento: Seleccionar dimensiones de ranura y presión máxima de los sensores de presión para obtener el intervalo
deseado de viscosidad y velocidades de corte. Cargar una muestra de prueba en una jeringa de vidrio con una bomba de
jeringa que controle la velocidad de flujo o intercambiablemente la velocidad de corte. Según sea necesario, controlar la
temperatura de la muestra con una aproximación de ±0, 1ºcon la jeringa y el viscosímetro de ranura especificado en el pro-
cedimiento individual, a menos que se especifique de otro modo. Dejar que se equilibre a la temperatura especificada du-
rante aproximadamente 3-5 minutos. Ajustar cada sensor de presión a cero. Seleccionar la primera velocidad de flujo o
velocidad de corte. Bombear la muestra a la velocidad de flujo y medir las lecturas de presión una vez que se hayan alcan-
zado valores de estado estacionario. Incrementar la velocidad de flujo (o velocidad de corte) hasta que la lectura de presión
del sensor inicial sea >5% del valor de la escala completa. Tomar el promedio de cada sensor de presión con el paso del
tiempo y calcular las caídas de presión. Calcular la viscosidad aparente. Si el procedimiento lo requiere, repetir las medicio-
nes cuatro veces. Si la muestra de prueba es no newtoniana, variar la velocidad de corte y calcular las viscosidades aparen-
tes correspondientes.
Cálculo y calibración: Calcular la viscosidad aparente dividiendo la tensión de corte por la velocidad de corte aparente.
Para líquidos no newtonianos, aplicar las correcciones Weissenberg-Rabinowitsch-Mooney para obtener la curva de viscosi-
dad verdadera. Los viscosímetros comerciales incluyen un sistema de corrección en el mismo equipo.
Calibrar los sensores individuales de presión siguiendo las recomendaciones del fabricante. No obstante, el viscosímetro de
ranura puede calibrarse con un estándar newtoniano de viscosidad conocida. Seleccionar un estándar que abarque el in-
tervalo de viscosidad de interés para la ranura seleccionada y para los sensores de presión. Medir las viscosidades a las
velocidades de corte para el 10%, 50% y 90% de la escala completa del sensor de presión inicial y obtener el promedio.
Calcular una constante (k) como el cociente entre el valor de referencia (77,er) y el valor medido C77meas) y registrar.

k= 'lrcf
r/meas

17rer = viscosidad de referencia (Pa · s)

17meas = viscosidad medida (Pa · s)
880 (914) Métodos por Medida de Presión / Pruebas Físicas USP 40

Multiplicar los nuevos datos de viscosidad por k, debido a que el valor de k corregirá la incertidumbre y la variación de la
geometría de la ranura. Idealmente, el valor de k debe permanecer constante dentro de un cambio de temperatura de
100º. Si el valor k varía en > 1%, consultar con el fabricante respecto a la compensación de temperatura de los sensores de
presión.

(921) DETERMINACIÓN DE AGUA

Numerosos artículos farmacopeicos son hidratos o contienen agua en forma adsorbida. Como consecuencia, la determina-
ción del contenido de agua es importante para demostrar el cumplimiento con las normas farmacopeicas. Por lo general, en
cada monografía se exige uno de los métodos que se describen a continuación, en función de la naturaleza del artículo. En
algunos casos poco comunes se permite elegir entre dos métodos. Si el artículo contiene agua de hidratación, se utiliza el
Método I (Volumétrico), el Método JI (Azeotrópico) o el Método JI/ (Gravimétrico), según se indica en la monografía individual, y el
requisito se especifica bajo el encabezado Agua.
El encabezado Pérdida por Secado (ver Pérdida por Secado (731 )) se utiliza en aquellos casos en los que la pérdida por calenta-
miento puede no ser totalmente de agua.

MÉTODO 1 (VOLUMÉTRICO)
Determinar el agua mediante el Método la, a menos que se especifique algo diferente en la monografía individual.

Método la (Valoración Volumétrica Directa)

PRINCIPIO

La determinación volumétrica del agua está basada en la reacción cuantitativa del agua con una solución anhidra de dióxido
de azufre y yodo en presencia de una solución amortiguadora que reacciona con los iones hidrógeno.
En la solución volumétrica original, conocida como Reactivo de Karl Fischer, el dióxido de azufre y el yodo se disuelven en
piridina y metanol. La muestra de prueba puede valorarse con el Reactivo directamente o el análisis puede realizarse mediante
un procedimiento de valoración residual. La estequiometría de la reacción no es exacta y la reproducibilidad de la determina-
ción depende de factores tales como las concentraciones relativas de los ingredientes del Reactivo, la naturaleza del disolvente
inerte utilizado para disolver la muestra de prueba y la técnica utilizada en la determinación en cuestión. Por lo tanto, para
conseguir la exactitud deseada se utiliza una técnica empíricamente estandarizada. La precisión del método depende en gran
parte de la medida en que la humedad atmosférica es eliminada del sistema. Normalmente la valoración de agua se realiza
utilizando metanol anhidro como disolvente para la muestra de prueba. En algunos casos pueden utilizarse otros disolventes
adecuados para muestras de prueba especiales o no habituales. En estos casos, se recomienda la adición de al menos 20% de
metanol u otro alcohol primario.

APARATO

Puede utilizarse cualquier aparato que garantice una exclusión de la humedad atmosférica y una determinación del punto
final adecuadas. En el caso de una valoración directa de una solución incolora, el punto final se puede observar visualmente
como un cambio de color de amarillo canario a ámbar. El caso inverso se observa cuando se realiza una valoración residual de
una muestra de prueba. Sin embargo, de forma más habitual el punto final se determina de forma electrométrica utilizando un
aparato con un circuito eléctrico simple que genera un potencial aplicado de aproximadamente 200 mV entre un par de elec-
trodos de platino sumergidos en la solución que se desea valorar. En el punto final de la valoración un ligero exceso de reacti-
vo aumenta el flujo de corriente entre 50 y 150 microamperios durante un período de 30 segundos a 30 minutos, dependien-
do de la solución que se esté valorando. Este período es menor en el caso de sustancias que se disuelven en el reactivo. En
algunos valoradores volumétricos automáticos el cambio abrupto de corriente o de potencial en el punto final hace cerrar una
válvula operada por solenoide que controla la bureta que suministra la solución volumétrica. Los aparatos disponibles comer-
cialmente comprenden por lo general un sistema cerrado que consta de una o dos buretas automáticas y un vaso de valora-
ción cubierto herméticamente equipado con los electrodos necesarios y un mezclador magnético. El aire en el sistema se man-
tiene seco con un desecante adecuado y el vaso de valoración puede purgarse mediante una corriente de nitrógeno seco o de
aire seco.
USP 40 Pruebas Físicas/ (921) Determinación de Agua 881

REACTIVO

Preparar el Reactivo de Karl Fischer según se indica a continuación. Agregar 125 g de yodo a una solución que contenga 670
ml de metano! y 170 ml de piridina, y enfriar. Colocar 100 ml de piridina en una probeta graduada de 250 ml y, mantenien-
do la piridina fría en un baño de hielo, introducir dióxido de azufre seco hasta alcanzar un volumen de 200 ml. Agregar lenta-
mente esta solución a la mezcla de yodo enfriada, agitando. Agitar hasta disolver el yodo, transferir la solución al aparato y
dejar la solución en reposo durante la noche antes de estandarizar. Un ml de esta solución recientemente preparada equivale
aproximadamente a 5 mg de agua; como esta solución se deteriora gradualmente, se recomienda estandarizarla dentro de un
período de 1 hora antes de su uso o diariamente si su uso es continuo. Proteger la solución de la luz mientras se esté utilizan-
do. Almacenar el reactivo preparado a granel en un recipiente con tapón de vidrio adecuadamente sellado, totalmente prote-
gido de la luz y refrigerado. Para determinar agua en cantidades de trazas (menos de 1%), es preferible usar un Reactivo con
un factor de equivalencia de agua de no más de 2,0, el cual generará el consumo de un volumen más significativo de solución
volumétrica.
Puede utilizarse una solución estabilizada de reactivo de tipo Karl Fischer disponible comercialmente. También pueden utili-
zarse reactivos disponibles comercialmente que contengan disolventes o bases diferentes a la piridina o alcoholes diferentes al
metanol. Éstos pueden ser soluciones individuales o reactivos formados in situ combinando los componentes de los reactivos
presentes en dos soluciones distintas. El Reactivo diluido requerido en algunas monografías debe diluirse de acuerdo con las
instrucciones del fabricante. Como diluyente puede utilizarse metano! u otro disolvente adecuado, como el éter monometílico
de etilenglicol.

PREPARACIÓN DE PRUEBA

A menos que se especifique algo diferente en la monografía individual, utilizar una cantidad pesada o medida con exactitud
de la muestra en análisis con un contenido de agua estimado de 2-250 mg. La cantidad de agua depende del factor de equi-
valencia de agua del Reactivo y del método de determinación del punto final. En la mayoría de los casos, se puede estimar la
cantidad mínima de la muestra, en mg, por la fórmula:
FCV!KF
en donde Fes el factor de equivalencia de agua del Reactivo, en mg por ml; Ces el volumen usado, en porcentaje, de la capa-
cidad de la bureta; V es el volumen de la bureta, en ml; y KF es el límite o contenido razonable de agua esperado en la mues-
tra, en porcentaje. C está generalmente entre 30% y 100% para la valoración manual, y entre 10% y 100% para el método
instrumental de determinación del punto final. [NOTA-Se recomienda que el producto de FCV sea mayor o igual a 200 para el
cálculo, a fin de asegurar que la cantidad mínima de agua valorada sea mayor o igual a 2 mg.]
Si la muestra en análisis es un aerosol con propelente, conservarla en el congelador durante no menos de 2 horas, abrir el
envase y analizar 10,0 ml de la muestra bien mezclada. Para valorar la muestra, determinar el punto final a una temperatura
de 1Oº o mayor.
Si la muestra en análisis son cápsulas, utilizar una porción del contenido mezclado de no menos de 4 cápsulas.
Si la muestra en análisis son tabletas, utilizar el polvo de no menos de cuatro tabletas molidas hasta polvo fino en una at-
mósfera con valores de temperatura y humedad relativa que se sepa que no afectan los resultados.
En los casos en los que la monografía especifique que la muestra en análisis es higroscópica, colocar una porción del sólido,
pesada con exactitud, en un vaso de valoración, procediendo inmediatamente y procurando evitar la absorción de humedad
atmosférica. Si la muestra está constituida por una cantidad definida de sólido como producto liofilizado o polvo dentro de un
vial, utilizar una jeringa seca para inyectar un volumen adecuado de metanol, u otro disolvente adecuado, medido con exacti-
tud, en un recipiente tarado y agitar hasta disolver la muestra. Con la misma jeringa, retirar la solución del recipiente y transfe-
rirla a un vaso de valoración preparado según se indica en Procedimiento. Repetir el procedimiento con una segunda porción
de metano! u otro disolvente adecuado, medido con exactitud, agregar este lavado al vaso de valoración y valorar inmediata-
mente. Determinar el contenido de agua, en mg, de una porción de disolvente con el mismo volumen total que el utilizado
para disolver la muestra y para lavar el recipiente y la jeringa, según se indica en Estandarización de la Solución de Agua para
Valoraciones Volumétricas Residuales, y restar este valor del contenido de agua, en mg, obtenido en la valoración de la muestra
en análisis. Secar el recipiente y su cierre a 100º durante 3 horas, dejar que se enfríen en un desecador y pesar. Determinar el
peso de la muestra analizada a partir de la diferencia en peso con respecto al peso inicial del recipiente.
Cuando sea apropiado, el agua puede ser desorbida o liberada de la muestra mediante calor en un horno externo conecta-
do al vaso, al que se transfiere con ayuda de un gas inerte y seco como nitrógeno puro. Se debe tomar en cuenta y corregirse
cualquier deriva debida al gas transportador. Se deben seleccionar con cuidado las condiciones de calentamiento para evitar la
formación de agua como resultado de la deshidratación debida a la descomposición de los componentes de la muestra, lo cual
puede invalidar este método.
 882 (921) Determinación de Agua/ Pruebas Físicas USP 40

ESTANDARIZACIÓN DEL REACTIVO

Colocar una cantidad suficiente de metanol o de otro disolvente adecuado en el vaso de valoración para cubrir los electro-
dos y agregar suficiente Reactivo para obtener el color característico del punto final, o 100 ± 50 microamperios de corriente
continua con un potencial aplicado de aproximadamente 200 mV.
Se puede usar Agua Purificada, tartrato de sodio dihidrato, un Estándar de Referencia USP, o estándares comerciales con un
certificado de análisis rastreable hasta un estándar nacional para estandarizar el Reactivo. El factor de equivalencia del reactivo,
el volumen de valoración recomendado, el tamaño de la bureta y la cantidad de estándar que se va a medir son factores a
considerar al momento de seleccionar el estándar y la cantidad que se va a usar. 1 Para Agua Purificada o estándares de agua,
agregar rápidamente el equivalente a entre 2 y 250 mg de agua. Calcular el factor de equivalencia del agua, F, en mg de agua
por ml de reactivo, por la fórmula:

W/V
en donde W es el peso, en mg, del agua contenida en la alícuota de estándar usado; y V es el volumen, en ml, del Reactivo
usado en la valoración. Para tartrato de sodio dihidrato, agregar rápidamente 20-125 mg de tartrato de sodio dihidrato
(C 4 H4 Na2 0 6 • 2H 2 0), pesados con exactitud por diferencia, y valorar hasta el punto final. El factor de equivalencia de agua F, en
mg de agua por ml de reactivo, se calcula por la fórmula:

W/V (36,04/230,08)
en donde 36,04 es dos veces el peso molecular de agua y 230,08 es el peso molecular de tartrato de sodio dihidrato; W es el
peso, en mg, del tartrato de sodio dihidrato; y Ves el volumen, en ml, del Reactivo consumido en la segunda valoración. To-
mar en cuenta que la solubilidad del tartrato de sodio dihidrato en metanol es tal que podría necesitarse metanol nuevo para
valoraciones adicionales del estándar de tartrato de sodio dihidrato.

PROCEDIMIENTO

A menos que se especifique algo diferente, transferir suficiente metanol u otro disolvente adecuado al vaso de valoración
asegurándose de que el volumen sea suficiente para cubrir los electrodos (aproximadamente 30-40 ml) y valorar con el Reacti-
vo hasta el punto final electrométrico o visual para consumir la humedad que pudiera estar presente. (No tomar en cuenta el
volumen consumido, ya que no se utiliza en los cálculos). Agregar rápidamente la Preparación de Prueba, mezclar, y volver a
valorar con el Reactivo hasta el punto final electrométrico o visual. Calcular el contenido de agua de la muestra tomada, en
mg, por la fórmula:

SF
en donde 5 es el volumen, en ml, del Reactivo consumido en la segunda valoración; y Fes el factor de equivalencia de agua
del Reactivo.

Método lb (Valoración Volumétrica Residual)

PRINCIPIO

Ver la información que figura en la sección Principio en Método la. En la valoración residual se agrega un exceso de Reactivo a
la muestra de prueba, se espera un tiempo suficiente para que se complete la reacción y se valora el Reactivo no consumido
con una solución estándar de agua en un disolvente como el metanol. El procedimiento de valoración residual se aplica de
forma general y evita los problemas que pueden surgir en la valoración direda de sustancias en las que el agua unida se libera
lentamente.

APARATO, REACTIVO Y PREPARACIÓN DE PRUEBA

Usar el Método la.

1 Considerar una configuración en la que el factor de equivalencia del reactivo sea de 5 mg/ml y el volumen de la bureta sea de 5 ml, así como un punto final
instrumental. Se pueden usar cantidades de estándar equivalentes a entre 2,5 mg y 22,5 mg de agua (10%-90% de la capacidad de la bureta) basándose en la
bureta y el factor de equivalencia del reactivo. El límite superior de este intervalo implicaría una cantidad excesiva de tartrato de sodio dihidrato. Si se pesa Agua
Purificada o un estándar, se requiere una balanza analítica apropiada para la cantidad pesada.
USP 40 Pruebas Físicas/ (921) Determinación de Agua 883

ESTANDARIZACIÓN DE LA SOLUCIÓN DE AGUA PARA VALORACIONES VOLUMÉTRICAS RESIDUALES

Preparar una Solución de Agua diluyendo 2 mL de agua con metanol u otro disolvente adecuado hasta 1000 ml. Estandarizar
esta solución valorando 25,0 mL con el Reactivo, previamente estandarizado según se indica en Estandarización del Reactivo.
Calcular el contenido de agua, en mg por mL, de la Solución de Agua tomada, por la fórmula:

V'F/25
en donde V es el volumen del Reactivo consumido y Fes el factor de equivalencia de agua del Reactivo. Determinar el conteni-
do de agua de la Solución de Agua semanalmente y estandarizar periódicamente el Reactivo contra éste según sea necesario.

PROCEDIMIENTO

Si la monografía individual especifica que el contenido de agua debe ser determinado por el Método lb, transferir suficiente
metanol u otro disolvente adecuado al vaso de valoración, asegurándose de que el volumen sea suficiente para cubrir los elec-
trodos (aproximadamente 30-40 mL) y valorar con el Reactivo hasta el punto final electrométrico o visual. Agregar rápidamen-
te la Preparación de Prueba, mezclar y agregar un exceso, medido con exactitud, de Reactivo. Esperar un tiempo suficiente para
que se complete la reacción y valorar el Reactivo no consumido con la Solución de Agua estandarizada hasta el punto final elec-
trométrico o visual. Calcular el contenido de agua de la muestra tomada, en mg, por la fórmula:

F(X' - XR)
en donde Fes el factor de equivalencia de agua del Reactivo; X' es el volumen, en mL, del Reactivo agregado después de intro-
ducir la muestra; X es el volumen, en mL, de la Solución de Agua estandarizada necesaria para neutralizar el Reactivo no consu-
mido; y Res el cociente, V /25 (mL de Reactivo/mL de Solución de Agua), determinado a partir de la Estandarización de Ja Solu-
ción de Agua para Valoraciones Volumétricas Residuales.

Método le (Valoración Culombimétrica)

PRINCIPIO

Para la determinación culombimétrica del agua se utiliza la reacción de Karl Fischer. El yodo, sin embargo, no se agrega en
forma de solución volumétrica sino que se obtiene por oxidación anódica en una solución que contiene yoduro. La celda de
reacción consta normalmente de un amplio compartimiento anódico y de un pequeño compartimiento catódico, separados
entre sí por un diafragma. También pueden utilizarse otros tipos adecuados de celdas de reacción (p.ej., sin diafragma). Cada
compartimiento tiene un electrodo de platino que conduce la corriente a través de la celda. El yodo, que se produce en el
electrodo anódico, reacciona inmediatamente con el agua que está presente en el compartimiento. Cuando se ha consumido
toda el agua, se produce un exceso de yodo que normalmente se detecta electrométricamente, lo que indica el punto final. La
humedad se elimina del sistema mediante pre-electrólisis. No es necesario cambiar la solución de Karl Fischer después de cada
determinación ya que las diferentes determinaciones pueden realizarse de forma sucesiva en la misma solución reactivo. Un
requisito de este método es que cada componente de la muestra de prueba sea compatible con los demás componentes y que
no se produzcan reacciones secundarias. Normalmente las muestras son transferidas al vaso en forma de solución mediante la
inyección a través de un septo. Los gases se pueden introducir en la celda utilizando un tubo de entrada de gas adecuado. La
precisión del método depende fundamentalmente del grado de eliminación de la humedad atmosférica en el sistema; por tan-
to, la introducción de sólidos en la celda puede requerir precauciones tales como trabajar en una cámara cerrada con guantes
en una atmósfera de gas inerte seco. El control del sistema se puede efectuar midiendo la deriva de la línea base, lo cual no
excluye la necesidad de una corrección con un blanco cuando se usa como vehículo de introducción de la muestra. Este méto-
do es especialmente adecuado para sustancias químicas inertes como hidrocarburos, alcoholes y éteres. En comparación con la
valoración volumétrica de Karl Fischer, la culombimetría es un micrométodo.
Cuando sea apropiado, el agua puede ser desorbida o liberada de la muestra mediante calor en un horno externo conecta-
do al vaso, al que se transfiere con ayuda de un gas inerte y seco como nitrógeno puro. Se debe tomar en cuenta y corregirse
cualquier deriva debida al gas transportador. Se deben seleccionar con cuidado las condiciones de calentamiento para evitar la
formación de agua como resultado de reacciones de descomposición por la deshidratación de los componentes de la muestra,
lo cual puede invalidar este método.

APARATO

Resulta adecuado cualquier aparato comercialmente disponible que conste de un sistema absolutamente hermético equipa-
do con los electrodos necesarios y un mezclador magnético. El microprocesador del instrumento controla el procedimiento
analítico y muestra los resultados. No es necesario calibrar el instrumento ya que la corriente consumida puede medirse de
forma absoluta.
884 (921) Determinación de Agua / Pruebas Físicas USP 40

REACTIVO

Ver las recomendaciones del fabricante.

PREPARACIÓN DE PRUEBA

Cuando la muestra sea un sólido soluble, se puede disolver una cantidad apropiada, pesada con exactitud, en metanol anhi-
dro u otros disolventes adecuados.
Cuando la muestra sea un sólido insoluble, se puede extraer una cantidad apropiada, pesada con exactitud, usando un di-
solvente anhidro adecuado y se puede inyectar en la solución del anolito. Alternativamente, se puede usar una técnica de eva-
poración en la que el agua se libere y evapore por calentamiento de la muestra en un tubo en una corriente de gas inerte seco.
El gas pasa luego al interior de la celda.
Cuando la muestra se va a usar directamente sin disolver en un disolvente anhidro adecuado, se puede introducir una canti-
dad apropiada, pesada con exactitud, directamente en la cámara.
Cuando la muestra es un líquido y es miscible con metanol anhidro u otros disolventes adecuados, se puede agregar una
cantidad apropiada, pesada con exactitud, al metanol anhidro u otros disolventes adecuados.
PROCEDIMIENTOUsando un dispositivo seco, inyectar o agregar directamente en el anolito una cantidad, medida con exacti-
tud, de la muestra o de la preparación de la muestra que se estima contiene entre 0,5 y 5 mg de agua, o la cantidad recomen-
dada por el fabricante del instrumento, mezclar, y llevar a cabo la valoración culombimétrica hasta el punto final electrométri-
co. Leer el contenido de agua de la Preparación de Prueba líquida directamente de la pantalla del instrumento y calcular el por-
centaje presente en la sustancia. Realizar una determinación con un blanco, según sea necesario, y realizar las correcciones
necesarias.

MÉTODO 11 (AZEOTRÓPICO-DESTILACIÓN CON TOLUENO)

APARATO

Utilizar un matraz de vidrio de 500 mL, A, conectado mediante una trampa, B, a un condensador de reflujo, C, usando jun-
tas de vidrio esmerilado (ver la Figura 1).

e-

Figura 1. Aparato para Determinación Azeotrópica con Tolueno

Las dimensiones críticas de las piezas del aparato son las siguientes. El tubo de conexión, D, tiene un diámetro interno de 9-
11 mm. La trampa tiene una longitud de 235-240 mm. El condensador, si es del tipo de tubo recto, tiene una longitud apro-
ximada de 400 mm y un diámetro interior de no menos de 8 mm. El tubo receptor, E, tiene una capacidad de 5 mL y su parte
cilíndrica, con una longitud de 146-156 mm, está graduada en subdivisiones de 0, 1 mL, de forma que el error de lectura no es
mayor de 0,05 mL para cualquier volumen indicado. La fuente de calor es preferiblemente un calentador eléctrico con control
de reóstato o un baño de aceite. La parte superior del matraz y el tubo de conexión pueden estar aislados.
Limpiar el tubo receptor y el condensador con un limpiador adecuado, enjuagar exhaustivamente con agua y secar en un
horno. Preparar el tolueno que se va a utilizar agitando con una pequeña cantidad de agua, separando el exceso de agua y
destilando el tolueno.
USP 40 Pruebas Físicas / (941) Difracción de Rayos X sobre Polvo 885

PROCEDIMIENTO

Colocar en un matraz seco una cantidad de la sustancia, pesada con exactitud al centígramo más próximo, para obtener de
2-4 mL de agua. Si la sustancia es de tipo pastoso, pesar sobre una lámina metálica ovalada con un tamaño que pase justo a
través del cuello del matraz. Si existe la posibilidad de que al ingresar la sustancia se produzcan proyecciones, agregar una
cantidad suficiente de arena lavada y seca para cubrir el fondo del matraz o una serie de tubos capilares de punto de fusión,
con una longitud aproximada de 100 mm, sellados por el extremo superior. Colocar aproximadamente 200 mL de tolueno en
el matraz, conectar el aparato y llenar el tubo receptor, E, con tolueno vertido a través de la parte superior del condensador.
Calentar el matraz suavemente durante 15 minutos y, una vez que el tolueno empiece a hervir, destilar a una velocidad de
aproximadamente dos gotas por segundo hasta que la mayor parte del agua haya sido arrastrada y después de aumentar la
velocidad de destilación aproximadamente a cuatro gotas por segundo. Cuando aparentemente se haya destilado toda el
agua, enjuagar el interior del tubo del condensador con tolueno mientras se cepilla el tubo en forma descendente con un cepi-
llo para tubos fijado a un alambre de cobre y saturado con tolueno. Continuar la destilación durante cinco minutos; luego
retirar la fuente del calor y dejar que el tubo receptor se enfríe a temperatura ambiente. Si quedan gotitas de agua adheridas a
las paredes del tubo receptor, arrastrarlas hacia abajo con un cepillo formado por una cinta de goma envuelta alrededor de un
alambre de cobre y humedecida con tolueno. Una vez que el agua y el tolueno se hayan separado totalmente, leer el volumen
de agua y calcular el porcentaje que estaba presente en la sustancia.

MÉTODO 111 (GRAVIMÉTRICO)

PROCEDIMIENTO PARA SUSTANCIAS QUÍMICAS

Proceder según se indica en la monografía individual preparando la sustancia química según se indica en Pérdida por Secado
(731 ).

PROCEDIMIENTO PARA SUSTANCIAS BIOLÓGICAS

Proceder según se indica en la monografía individual.

PROCEDIMIENTO PARA ARTÍCULOS DE ORIGEN BOTÁNICO

Colocar en una cápsula de evaporación tarada aproximadamente 1O g del fármaco, pesados con exactitud, y preparados
según se indica (ver Métodos de Análisis en Artículos de Origen Botánico (561 )). Secar a 105º durante 5 horas y pesar. Continuar
el secado y la pesada a intervalos de 1 hora hasta que la diferencia entre dos pesadas sucesivas no sea mayor de 0,25%.

(941) CARACTERIZACIÓN DE SÓLIDOS CRISTALINOS Y

PARCIALMENTE CRISTALINOS POR DIFRACCIÓN DE RAYOS X SOBRE
POLVO (DRXP)

INTRODUCCIÓN
Toda fase cristalina de una sustancia determinada produce un patrón característico de difracción de rayos X. Los patrones de
difracción (o difractogramas) se pueden obtener a partir de un polvo cristalino orientado aleatoriamente, compuesto de crista-
litos o fragmentos de cristal de tamaño finito. En esencia, de un patrón de difracción de un polvo se pueden obtener tres tipos
de información: la posición angular de las líneas de difracción (dependiendo de la geometría y el tamaño de la celda unidad),
las intensidades de las líneas de difracción (dependiendo principalmente del tipo y arreglo de los átomos y de la orientación de
las partículas dentro de la muestra) y los perfiles de las líneas de difracción (dependiendo de la resolución instrumental, el ta-
maño de los cristalitos, la tensión y el espesor de la muestra).
Los experimentos que arrojan posiciones angulares e intensidades de las líneas se pueden utilizar para aplicaciones como el
análisis cualitativo de las fases (p.ej., la identificación de las fases cristalinas) y el análisis cuantitativo de las fases de materiales
cristalinos. También se puede hacer un cálculo de las fracciones amorfas y cristalinas. 1

1 Existen muchas otras aplicaciones de la técnica de difracción de rayos X sobre polvo que se pueden aplicar a las sustancias farmacéuticas cristalinas, como son la
determinación de las estructuras cristalinas, el refinamiento de las estructuras cristalinas, la determinación de la pureza cristalográfica de las fases cristalinas y la
caracterización de la textura cristalográfica. Estas aplicaciones no se describen en este capítulo.
 886 (941) Difracción de Rayos X sobre Polvo / Pruebas Físicas USP 40

El método de difracción de rayos X sobre polvo (DRXP) ofrece una ventaja sobre otros métodos de análisis pues por lo gene-
ral es de naturaleza no destructiva (para garantizar una muestra orientada aleatoriamente, la preparación de la muestra se limi-
ta habitualmente a una molienda). Las investigaciones por DRXP se pueden efectuar también bajo condiciones in situ en mues-
tras expuestas a condiciones no ambientales, tales como temperatura y humedad bajas o altas.

PRINCIPIOS

La difracción de rayos X resulta de la interacción entre los rayos X y las nubes de electrones de los átomos. Dependiendo del
ordenamiento atómico, pueden surgir interferencias de los rayos X dispersados. Estas interferencias son constructivas cuando la
diferencia de recorrido entre dos ondas difractadas de rayos X es un múltiplo entero de la longitud de onda. Esta condición
selectiva está descrita por la ecuación de Bragg, llamada también ley de Bragg (ver la Figura 7).

2dhkl sen8hkl = nA,

I

/~,

• • •
Figura 1. Difracción de rayos X por un cristal, de acuerdo con la ley de Bragg.

La longitud de onda, A, de los rayos X es del mismo orden de magnitud que la distancia entre planos sucesivos de la red
cristalina, o dhkl (también llamada espaciamiento d). 8hkl es el ángulo entre el rayo incidente y la familia de planos reticulares y
sen 8hkl es inversamente proporcional a la distancia entre planos cristalinos sucesivos o espaciamiento d.
La dirección y espaciado de los planos con referencia a los ejes de la celda unidad están definidos por los índices de Miller
{hkl}. Estos índices son los recíprocos, reducidos al número entero inmediatamente inferior, de las intersecciones que realiza un
plano con los ejes de la celda unidad. Las dimensiones de la celda unidad están dadas por los espaciamientos a, by c1 y los
ángulos entre ellos a, j3 y y.
El espaciado interplanar para un conjunto específico de planos paralelos hkl se indica por dhkl· Cada una de estas familias de
planos puede presentar órdenes de difracción mayores cuando los valores d para las familias de planos relacionados nh, nk, ni
son reducidos por el factor 1 /n (siendo n un número entero: 2, 3, 4, etc.).
Cada conjunto de planos en un cristal tiene un ángulo de difracción de Bragg correspondiente, 8hklr asociado con él (para
una A específica).
Se supone que una muestra de polvo es policristalina, de manera que en cualquier ángulo ehkl hay siempre cristalitos en una
orientación que permite la difracción de acuerdo con la ley de Bragg. 2 Para una longitud de rayos X determinada, las posicio-
nes de los picos de difracción (también conocidos como "líneas", "reflexiones" o "reflexiones de Bragg") son características de
la red cristalina (espaciamientos d), sus intensidades teóricas dependen del contenido de la celda unidad cristalográfica (natu-
raleza y posiciones de los átomos) y los perfiles de las líneas dependen de la perfección y extensión de la red cristalina. Bajo
estas condiciones, el pico de difracción tiene una intensidad finita que depende del arreglo atómico, tipo de átomos, desplaza-
miento térmico e imperfecciones estructurales, así como de las características del instrumento.
La intensidad depende de muchos factores como la estructura, la temperatura, la cristalinidad, la polarización, la multiplici-
dad y el factor de Lorentz.

2 Un polvo ideal para experimentos de difracción consta de un gran número de cristalitos pequeños, esféricos, orientados aleatoriamente (dominios cristalinos que
difractan coherentemente). Si este número es suficientemente grande, siempre habrá suficientes cristalitos en cualquier orientación difractante para producir patro-
nes de difracción reproducibles.
USP 40 Pruebas Físicas/ (941) Difracción de Rayos X sobre Polvo 887

Las principales características de los perfiles de las líneas de difracción son: posición 28, altura del pico, área del pico y forma
del pico (caracterizada, por ejemplo, por el ancho o asimetría del pico, o por una función analítica o representación empírica).
Un ejemplo del tipo de patrones de polvo obtenidos para cinco fases sólidas diferentes de una sustancia se presenta en la
Figura 2.

Forma D

Forma C

Forma B

Forma A

amolia

'!'lr-tr-rrr'T ., Tr-r-rf-.,-r-r-T
.... ., :: ....., .., ....N .,N
"' "' "' ;? ~ ~ ;! ~ ~ ~ ~ ~
o ¡;¡
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N
<O
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g ;;;
20(1.Cu}- Escala

Figura 2. Patrones de difracción de rayos X sobre polvo obtenidos para cinco fases sólidas diferentes de una sustancia (las
intensidades están normalizadas).

Además de los picos de difracción, un experimento de difracción de rayos X genera también un ruido de fondo más o me-
nos uniforme sobre el cual se superponen los picos. Aparte de la preparación de la muestra, otros factores contribuyen al ruido
de fondo, por ejemplo, el portamuestras, la dispersión difusa del aire y el equipo, y otros parámetros instrumentales como el
ruido del detector y la radiación general del tubo de rayos X. La relación pico-ruido puede aumentarse minimizando el ruido
de fondo y escogiendo tiempos de exposición prolongados.

INSTRUMENTO

Configuración del Instrumento

Los experimentos de difracción de rayos X generalmente se efectúan usando difractómetros de polvo o cámaras de polvo.
Un difractómetro de polvo por lo general consta de cinco partes principales: una fuente de rayos X; el sistema óptico del haz
incidente, el cual puede efectuar la monocromatización, filtrado, colimación y/o enfoque del haz; un goniómetro; el sistema
óptico del haz de difracción, que puede incluir monocromatización, filtrado, colimación y enfoque o paralelización del haz; y
un detector. También se requieren sistemas de recolección y procesamiento de datos, que por lo general están incluidos en los
equipos modernos de medición de difracción.
Dependiendo del tipo de análisis que se va a efectuar (identificación de fases, análisis cuantitativo, determinación de los pa-
rámetros de la red, etc.) se requieren diferentes configuraciones y niveles de desempeño del instrumento de DRXP. Los instru-
mentos más simples para medir los patrones de difracción de polvo son las cámaras de polvo. El reemplazo de la película foto-
gráfica, como método de detección, por los detectores fotónicos ha llevado al diseño de difractómetros en los cuales el arreglo
geométrico del sistema óptico no hace un enfoque real sino un paraenfoque, tal como en la geometría de Bragg-Brentano. La
configuración de paraenfoque de Bragg Brentano es la más usada actualmente y por lo tanto se describe aquí brevemente.
888 (941) Difracción de Rayos X sobre Polvo / Pruebas Físicas USP 40

Un instrumento dado puede proporcionar una geometría 8/28 horizontal o vertical o una geometría 8/8 vertical. Para ambas
geometrías, el haz incidente de rayos X forma un ángulo 8 con el plano de superficie de la muestra y el haz de rayos X difracta-
do forma un ángulo 28 con la dirección del haz de rayos X incidente (un ángulo 8 con el plano de superficie de la muestra). En
la Figura 3. se representa el arreglo geométrico básico. El haz de radiación divergente del tubo de rayos X (llamado haz prima-
rio) pasa a través de un conjunto de colimadores de placas paralelas y de una ranura de divergencia e ilumina la superficie
plana de la muestra. Todos los rayos difractados por cristalitos adecuadamente orientados en la muestra en un ángulo 28 con-
vergen en una línea en la ranura receptora. Un segundo set de colimadores de placas paralelas y una ranura de dispersión se
puede colocar bien sea detrás o delante de la ranura receptora. Los ejes del foco de la línea y de la ranura receptora están a
igual distancia del eje del goniómetro. Los cuantos de rayos X se cuentan con un detector de radiación, por lo general un
contador de centelleo, un contador proporcional de gas sellado o un detector de estado sólido sensible a la posición, tal como
una placa de imágenes o un detector de acoplamiento de carga (CCD, por sus siglas en inglés). El montaje de la ranura recep-
tora y el detector se ensamblan juntos y se mueven tangencial mente al círculo de enfoque. Para barridos 8/28 el goniómetro
hace rotar la muestra sobre el mismo eje que el detector, pero a la mitad de la velocidad de rotación, en un movimiento 8/
28.La superficie de la muestra permanece de esa manera tangencial al círculo de enfoque. El colimador de placas paralelas
limita la divergencia axial del haz y por lo tanto controla parcialmente la forma del perfil de la línea difractada.

/ '

/
!
\ F

\' /

~, _____ __ /
A. tubo de rayos X O. ranura de anti-difusión G. ranura receptora del detector

B. ranura de divergencia E. ranura receptora H. detector

C. muestra F. monocromador J. círculo de enfoque

Figura 3. Arreglo geométrico de la geometría de paraenfoque de Bragg-Brentano.

También se puede usar un difractómetro en modo de transmisión. La ventaja de esta tecnología es que disminuye los efec-
tos debidos a la orientación preferencial. También se puede usar un capilar de aproximadamente 0,5 a 2 mm de espesor para
cantidades pequeñas de muestra.

Radiación de Rayos X

En el laboratorio, los rayos X se obtienen bombardeando un ánodo metálico con electrones emitidos por efecto termoiónico
y acelerados en un campo eléctrico fuerte (usando un generador de alto voltaje). La mayor parte de la energía cinética de los
electrones se convierte en calor, lo cual limita la potencia de los tubos y requiere un enfriamiento eficaz del ánodo. Con el uso
de ánodos rotatorios y sistemas ópticos de rayos X se puede obtener un aumento de 20 a 30 veces en brillantez. Como alter-
nativa, se pueden producir fotones de rayos X en instalaciones a gran escala (sincrotrón).
El espectro emitido por un tubo de rayos X que funciona a un voltaje suficiente consta de un fondo continuo de radiación
policromática y una radiación característica adicional que depende del tipo de ánodo. Solo esta radiación característica se usa
en experimentos de difracción de rayos X. Las fuentes principales de radiación usadas para difracción de rayos X son tubos de
vacío que usan cobre, molibdeno, hierro, cobalto o cromo como ánodos; los rayos X del cobre, molibdeno o cobalto se em-
plean más comúnmente para sustancias orgánicas (el uso de un ánodo de cobalto puede preferirse especialmente para separar
distintas líneas de rayos X). La elección de la radiación que se va a usar depende de las características de absorción de la mues-
 USP 40 Pruebas Físicas / (941) Difracción de Rayos X sobre Polvo 889

tra y la posible fluorescencia de los átomos presentes en la muestra. Las longitudes de onda usadas en la difracción de polvos
generalmente corresponden a la radiación Kª del ánodo. Por consiguiente, resulta ventajoso hacer que el haz de rayos X sea
"monocromático", eliminando todos los demás componentes del espectro de emisión. Esto puede conseguirse parcialmente
con filtros K¡¡, es decir, con filtros metálicos seleccionados por tener una discontinuidad de absorción entre las longitudes de
onda Kª y K¡¡ emitidas por el tubo. Dicho filtro usualmente se inserta entre el tubo de rayos X y la muestra. Otra forma más
comúnmente usada para obtener un haz de rayos X monocromático consiste en usar un cristal monocromador grande (deno-
minado por lo general "monocromador"). Este cristal se coloca delante o detrás de la muestra y difracta los diferentes picos
característicos del haz de rayos X (es decir, Kª y K¡¡) a diferentes ángulos, de forma que sólo uno de ellos puede seleccionarse
para ingresar al detector. Incluso es posible separar las radiaciones Kª 1 y Kª 2 usando un monocromador especializado. Desafor-
tunadamente, la ganancia producida por la obtención de un haz monocromático al usar un filtro o un monocromador se con-
trarresta por una pérdida en intensidad. Otra forma de separar longitudes de onda Kª y K¡¡ consiste en usar espejos curvos
para rayos X que puedan simultáneamente monocromar y enfocar o paralelizar el haz de rayos X.

PROTECCIÓN CONTRA LA RADIACIÓN

La exposición de cualquier parte del cuerpo humano a los rayos X puede ser nociva para la salud. Por lo tanto, siempre que
se use equipo de rayos X es fundamental tomar las precauciones adecuadas para proteger al operador y a cualquier persona
que se encuentre cerca. La práctica recomendada para protegerse de la radiación, así como los límites de los niveles de exposi-
ción a los rayos X son los establecidos por la legislación nacional de cada país. Si no existieran reglamentaciones o recomenda-
ciones oficiales en un país, se deben aplicar las recomendaciones más recientes de la Comisión Internacional de Protección
Radiológica.

PREPARACIÓN Y MONTAJE DE LA MUESTRA

La preparación del material en polvo y el montaje de la muestra en un soporte adecuado son pasos críticos en muchos mé-
todos analíticos, en particular para el análisis por difracción de rayos X sobre polvo, puesto que pueden afectar en gran medida
la calidad de los datos que se van a recolectar. 3 Las principales fuentes de error debido a la preparación y montaje de la mues-
tra se discuten brevemente en la siguiente sección para instrumentos que operan en la geometría de paraenfoque de Bragg-
Brentano.

Preparación de la Muestra

En general, la morfología de muchas partículas cristalinas tiende a dar una muestra que presenta cierto grado de orientación
preferencial en el soporte de la muestra. Esto es especialmente evidente para los cristales en forma de aguja o de placa cuando
la reducción de tamaño proporciona agujas o plaquetas más finas. La orientación preferencial en la muestra influye sobre la
intensidad de las diversas reflexiones, de forma que algunas son más intensas y otras menos intensas, comparado con lo que se
esperaría de una muestra completamente aleatoria. Se pueden emplear diversas técnicas para mejorar la aleatoriedad en la
orientación de los cristalitos (y por lo tanto para minimizar la orientación preferencial), pero una reducción mayor del tamaño
de la partícula es a menudo el mejor y más simple de los métodos. La cantidad óptima de cristalitos depende de la geometría
del difractómetro, la resolución requerida y la atenuación del haz de rayos X por la muestra. En algunos casos, tamaños de
partículas tan grandes como 50 µm pueden proporcionar resultados satisfactorios en la identificación de las fases. Sin embar-
go, una molienda excesiva (tamaños de cristalitos de menos de aproximadamente 0,5 µm) puede ocasionar un ensanchamien-
to de las líneas y cambios significativos en la muestra misma, tales como:
• contaminación de la muestra por partículas desprendidas de los instrumentos de molienda (mortero, mano de mortero,
bolas, etc.),
• reducción del grado de cristalinidad,
• transición del estado sólido a otro polimorfo,
• descomposición química,
• introducción de tensión interna, y
• reacciones en estado sólido.
Por lo tanto, es aconsejable comparar el patrón de difracción de la muestra sin moler con el patrón correspondiente a una
muestra de tamaño de partícula más pequeño (p.ej., una muestra molida). Si el patrón de difracción de rayos X sobre polvo es
de la calidad adecuada teniendo en cuenta el uso previsto, entonces es posible que la molienda no sea necesaria.
Cabe anotar que si una muestra contiene más de una fase y si se usa el tamizado para aislar partículas de un tamaño especí-
fico, se puede alterar la composición inicial.

3 De manera similar, pueden ocurrir cambios en la muestra durante la recolección de datos, en el caso de muestras que no están en equilibrio (temperatura,
humedad).
890 (941) Difracción de Rayos X sobre Polvo / Pruebas Físicas USP 40

Montaje de la Muestra

EFECTO DEL DESPLAZAMIENTO DE LA MUESTRA

Una superficie de muestra compensada por D con referencia al eje de rotación del difractómetro causa errores sistemáticos
que son muy difíciles de evitar totalmente; para el modo de reflexión, esto produce desplazamientos absolutos D · cos8 4 en las
posiciones 28 (por lo general del orden de 0,01 ºen 28 en los ángulos inferiores

[cose°' 1]

para un desplazamiento D = 15 µm) y ensanchamiento asimétrico del perfil hacia valores 28 bajos. El uso de un estándar inter-
no apropiado permite la detección y corrección de este efecto simultáneamente con el efecto debido a la transparencia de la
muestra. Este efecto constituye la mayor fuente de errores en los datos recolectados con difractómetros bien alineados.

EFECTO DEL ESPESOR Y TRANSPARENCIA DE LA MUESTRA

Cuando el método de DRXP se aplica en modo de reflexión, a menudo es preferible trabajar con muestras de "espesor infini-
to". Para minimizar el efecto de transparencia, es aconsejable usar un sustrato no difractante (soporte con ruido de fondo nu-
lo); por ejemplo, una placa de silicio monocristalino cortada en paralelo a los planos reticulares 51 o.s Una ventaja del modo de
transmisión es que los problemas relacionados con la altura y transparencia de la muestra son menos importantes.
El uso de un estándar interno apropiado permite la detección y corrección de este efecto simultáneamente con el efecto
debido al desplazamiento de la muestra.

CONTROL DEL DESEMPEÑO DEL INSTRUMENTO

El goniómetro y el sistema óptico correspondiente del haz de rayos X incidente y difractado tienen muchas partes mecánicas
que necesitan ajuste. El grado de alineación o desalineación influye directamente sobre la calidad de los resultados de una in-
vestigación por DRXP. Por lo tanto, los diferentes componentes del difractómetro se deben ajustar cuidadosamente (sistemas
ópticos y mecánicos, etc.) para minimizar adecuadamente los errores sistemáticos a la vez que se optimizan las intensidades
recibidas por el detector. La búsqueda de intensidad y resolución máximas es siempre antagónica cuando se alinea un difractó-
metro. Por ello, se debe buscar el mejor equilibrio entre ambas cuando se efectúa el procedimiento de alineación. Existen mu-
chas configuraciones diferentes y los equipos de cada proveedor requieren procedimientos de alineación específicos. El desem-
peño general del difractómetro se debe examinar y monitorear periódicamente usando materiales de referencia certificados
adecuados. Dependiendo del tipo de análisis, también se pueden emplear otros materiales de referencia bien definidos, aun-
que se prefiere el uso de materiales de referencia certificados.

ANÁLISIS CUALITATIVO DE LAS FASES (IDENTIFICACIÓN DE FASES)

La identificación de la composición de las fases de una muestra desconocida por DRXP por lo general se basa en la compara-
ción visual o asistida por computadora, de una porción de su patrón de difracción de rayos X con el patrón experimental o
calculado de un material de referencia. Idealmente, estos patrones de referencia se obtienen de muestras monofásicas bien
caracterizadas. Este método permite, en la mayoría de los casos, identificar una sustancia cristalina por sus ángulos de difrac-
ción 28 o espaciamientos d y por sus intensidades relativas. La comparación asistida por computadora del patrón de difracción
de la muestra desconocida con los datos de referencia se puede basar bien sea en un intervalo 28 más o menos extendido del
patrón de difracción total o en un conjunto de datos reducidos derivados del patrón. Por ejemplo, la lista de espaciamientos d
y de las intensidades normalizadas, lnorm, llamada lista (d, lnorm) extraída del patrón, es la huella cristalográfica del material y
puede compararse con listas (d, lnorm) de muestras monofásicas compiladas en bases de datos.
Para la mayoría de los cristales orgánicos, al usar radiación Cu Kª, resulta apropiado registrar el patrón de difracción en un
intervalo 28 desde lo más cerca posible a Oº hasta por lo menos 40º. La concordancia en los ángulos de difracción 28 entre la
muestra y la referencia está dentro de 0,2º para la misma forma cristalina, mientras que las intensidades relativas entre la mues-
tra y la referencia pueden variar considerablemente debido a los efectos de la orientación preferencial. Por su misma naturale-
za, se sabe que los hidratos y solvatos variables tienen dimensiones de celda unidad variables y por esa razón ocurren desplaza-
mientos en las posiciones de los picos de los patrones de DRXP medidos para estos materiales. En estos materiales exclusivos,
no es inesperada una discrepancia en las posiciones 28 mayores de 0,2º. Por esa razón, las variaciones dentro de 0,2º en la
posición del pico no son aplicables a estos materiales. Para otros tipos de muestras (p.ej., sales inorgánicas), puede ser necesa-

4 Cabe anotar que un desplazamiento en la alineación en cero del goniómetro ocasionaría un desplazamiento constante en todas las posiciones 28 observadas; es
decir, todo el patrón de difracción se mueve en este caso por una desviación de Z' en 28.
s En el caso de una muestra delgada con baja atenuación, se pueden hacer mediciones exactas de las posiciones de las líneas con configuraciones de enfoque del
difractómetro en geometría de transmisión o de reflexión. Las mediciones exactas de las posiciones de las líneas sobre muestras con baja atenuación se hacen
preferiblemente con difractómetros que tengan sistemas ópticos de haces paralelos. Esto ayuda a reducir los efectos del espesor de la muestra.
USP 40 Pruebas Físicas/ (941) Difracción de Rayos X sobre Polvo 891

ria ampliar el barrido de la región 28 hasta bastante más allá de los 40º. Por lo general es suficiente hacer un barrido de las 1 O
reflexiones más fuertes identificadas en las bases de datos de difracción de rayos X sobre polvo monofásico.
En ocasiones es difícil o incluso imposible identificar fases en los siguientes casos:
• sustancias no cristalizadas o amorfas,
• los componentes a identificar están presentes en bajas fracciones de masa respecto a las cantidades del analito (general-
mente menos de 10% m/m),
• efectos de orientación preferencial pronunciados,
• la fase no está archivada en la base de datos usada,
• la formación de soluciones sólidas,
• la presencia de estructuras desordenadas que alteran la celda unidad,
• la muestra comprende demasiadas fases,
• la presencia de deformaciones de la red cristalina,
• la similitud estructural de diferentes fases.

ANÁLISIS CUANTITATIVO DE LAS FASES

Si la muestra bajo investigación es una mezcla de dos o más fases conocidas, de las cuales no más de una es amorfa, en
muchos casos se puede determinar el porcentaje (en volumen o masa) de cada fase cristalina y de la fase amorfa. El análisis
cuantitativo de las fases se puede basar en las intensidades integradas, en las alturas de los picos de varias líneas de difracción
individuales6 o en el patrón de difracción completo. Estas intensidades integradas, alturas de los picos o datos del patrón com-
pleto se comparan con los valores correspondientes de los materiales de referencia. Estos materiales de referencia deben ser
monofásicos o una mezcla de fases conocidas. Las dificultades encontradas durante el análisis cuantitativo se deben a la prepa-
ración de la muestra (la exactitud y precisión de los resultados requieren, en particular, homogeneidad de todas las fases y una
distribución apropiada del tamaño de partículas en cada fase) y a los efectos de la matriz.
En casos favorables, en matrices sólidas se pueden determinar cantidades de fases cristalinas tan pequeñas como 10%.

Muestras Polimórficas

Para una muestra compuesta de dos fases polimórficas a y b, se puede usar la siguiente expresión para cuantificar la fracción
Fª de la fase a:

La fracción se obtiene midiendo la relación de intensidad entre las dos fases, si se conoce el valor de la constante K. K es la
relación de las intensidades absolutas de las dos fases polimórficas puras l0 ª/l 0 b. Su valor puede determinarse midiendo mues-
tras del estándar.

Métodos que Usan un Estándar

Los métodos más comúnmente usados para el análisis cuantitativo son:

• el método del estándar externo,
• el método del estándar interno, y
•el método de adición (también llamado a menudo método de adición de estándar o método de estándar agregado).
El método del estándar externo es el más general y consiste en comparar el patrón de difracción de rayos X de la mezcla, o
las intensidades de las líneas respectivas con las medidas de una mezcla de referencia o con las intensidades teóricas de un
modelo estructural, si se conoce totalmente.
Para limitar errores debidos a los efectos de la matriz, se puede usar un material de referencia interno que tenga un tamaño
de cristalitos y un coeficiente de absorción de los rayos X comparables con los de los componentes de la muestra y un patrón
de difracción que no se solape en absoluto con el de la muestra que se va a analizar. Una cantidad conocida de este material
de referencia se agrega a la muestra a analizar y a cada una de las mezclas de referencia. Bajo estas condiciones existe una
relación lineal entre la intensidad de las líneas y la concentración. Esta aplicación, llamada el método del estándar interno, re-
quiere mediciones precisas de las intensidades de difracción.
En el método de adición (o método de adición de estándar), parte de la fase pura a se agrega a la mezcla que contiene la
concentración desconocida de a. Se hacen múltiples adiciones para preparar una gráfica de intensidad en función de la con-
centración en donde la intersección negativa del eje x es la concentración de la fase a en la muestra original.

6 Si se conocen las estructuras cristalinas de todos los componentes, se puede usar el método de Rietveld para cuantificarlas con una buena exactitud. Si no se
conocen las estructuras cristalinas de los componentes se puede usar el método de Pawley o el método de cuadrados mínimos parciales (PLS, por sus siglas en
inglés).
892 (941) Difracción de Rayos X sobre Polvo / Pruebas Físicas USP 40

CÁLCULO DE LAS FRACCIONES AMORFAS V CRISTALINAS

En una mezcla de fases amorfas y cristalinas se pueden calcular las fracciones amorfas y cristalinas de varias maneras. La elec-
ción del método usado depende de la naturaleza de la muestra:
• Si la muestra consta de fracciones cristalinas y una fracción amorfa de composiciones químicas diferentes, las cantidades
de cada una de las fases cristalinas individuales puede calcularse usando sustancias estándar apropiadas, según se descri-
bió anteriormente. La fracción amorfa se deduce luego indirectamente por sustracción.
• Si la muestra consta de una fracción amorfa y una cristalina, bien sea como una mezcla de 1 fase o 2 fases, con la misma
composición elemental, la cantidad de la fase cristalina (el "grado de cristalinidad") se puede calcular midiendo tres áreas
del difractograma:
A= área total de los picos que surgen de la difracción de la fracción cristalina de la muestra,
B = área total por debajo del área A,
C =área de ruido de fondo (debido a dispersión del aire, fluorescencia, equipo, etc.).
Una vez medidas estas áreas, el grado de cristalinidad se puede calcular en forma aproximada como:
% de cristalinidad = 1 OOA/(A + B - C)
Debe mencionarse que este método no arroja un grado absoluto de valores de cristalinidad y por lo tanto se usa generalmente
para propósitos comparativos únicamente. También se cuenta con métodos más sofisticados, como el de Ruland.

ESTRUCTURA DEL MONOCRISTAL

En general, la determinación de las estructuras cristalinas se efectúa a partir de los datos de difracción de los rayos X obteni-
dos usando monocristales. Sin embargo, el análisis de la estructura cristalina de los cristales orgánicos es una tarea exigente,
puesto que los parámetros de la red son comparativamente grandes, la simetría es baja y las propiedades de dispersión son
normalmente muy bajas. Para cualquier forma cristalina dada de una sustancia, el conocimiento de la estructura cristalina per-
mite el cálculo del patrón correspondiente de DRXP, proporcionando en consecuencia un patrón de referencia de DRXP exen-
to de orientación preferencial, el cual se puede usar para la identificación de las fases.
USP 40 Información General/ (1004) Medicamentos para Mucosas 893

Capítulos Generales
Información General

Los capítulos de esta sección son de carácter informativo y no contienen normas, pruebas, valoraciones, ni otras especifica-
ciones de cumplimiento obligatorio para ningún artículo farmacopeico, a excepción de las citas de Leyes y reglamentos federa-
les que puedan ser aplicables. Las citas de Leyes y reglamentos federales se incluyen en esta sección debido a que no son de la
autoría de la Farmacopea. Las revisiones o reformas de los requisitos federales que afecten el contenido de estas citas se publi-
carán en los Suplementos de los compendios USP-NF a la brevedad posible. Los requisitos oficiales de los artículos farmacopeicos
se establecen en las Advertencias Generales, las monografías individuales y en los capítulos referentes a Pruebas y Valoraciones
Generales de esta Farmacopea.

(1004) MEDICAMENTOS PARA MUCOSAS-PRUEBAS DE DESEMPEÑO

INTRODUCCIÓN
Los medicamentos para mucosas liberan fármacos en el cuerpo mediante la vía mucosa. Para los propósitos de este capítulo,
la vía mucosa de administración de fármaco se divide en siete superficies de membrana caracterizadas como ótica, oftálmica,
nasal, orofaríngea, uretral, vaginal y rectal. Los medicamentos para mucosas incluyen una amplia variedad de formas farma-
céuticas tales como soluciones, suspensiones, emulsiones, cremas, ungüentos, geles, insertos, tiras, aerosoles, atomizadores,
películas, gomas de mascar medicadas, tabletas, tabletas de disolución bucal y supositorios. Algunas de estas formas farmacéu-
ticas también se administran mediante otras vías. Por ejemplo, las cremas pueden administrarse por la vía mucosa (vaginal) y
también por la vía tópica. En estos productos se realizan dos categorías de pruebas: calidad del producto y desempeño del
producto. Estas pruebas proveen garantías sobre la calidad entre partidas, la reproducibilidad, la confiabilidad y el desempeño
de un medicamento. Las pruebas de calidad del producto se llevan a cabo para evaluar atributos tales como valoración, identi-
ficación y uniformidad de contenido y forman parte de la monografía oficial (ver Medicamentos para Mucosas-Pruebas de Cali-
dad del Producto(4)). Las pruebas de desempeño del producto se llevan a cabo para evaluar la liberación de fármacos a partir
de la forma farmacéutica. Para ciertos medicamentos para mucosas, la determinación del tamaño aerodinámico de partícula o
del tamaño de glóbulo puede servir como una prueba de desempeño del producto.
Cuando existe una prueba de desempeño farmacopeica para una forma farmacéutica administrada por una vía no mucosa,
tal como una prueba de disolución para una tableta oral, dicha prueba podría tener aplicación para la forma farmacéutica ad-
ministrada por una vía mucosa (p.ej., tabletas bucales o tabletas sublinguales).

PRUEBAS DE DESEMPEÑO PARA MEDICAMENTOS PARA MUCOSAS

Las pruebas de desempeño para los diversos medicamentos para mucosas pueden dividirse ampliamente en dos categorías:
1) los procedimientos de prueba que usan o que pueden adoptar metodología de los capítulos generales existentes y 2) prue-
bas que requieren trabajo de desarrollo adicional antes de que puedan ser recomendadas.
El capítulo Procedimiento de Disolución: Desarrollo y Validación (1092) debe tenerse como una referencia para el desarrollo de
una prueba de liberación de fármacos (p.ej., seleccionar el medio de liberación de fármacos, el aparato/procedimiento o el
método analítico). Para varios medicamentos para mucosas, pueden ser aplicables los procedimientos de liberación de fárma-
cos descritos en Disolución (711 ), Liberación de Fármacos (724) y Medicamentos Semisólidos-Pruebas de Desempeño (1 724 ).
En algunas instancias, pueden ser adecuados aparatos con minicanastilla o minipaletas. Dichos aparatos son parecidos al de
Disolución (711 ), Aparato 7 (Aparato con Canastilla) y Disolución (711 ), Aparato 2 (Aparato con Paleta), con dimensiones reduci-
das para ajustarse a volúmenes de medio <500 mL ( 7,2). Se encuentran disponibles comercialmente diversos diseños. Sin em-
bargo, al día de hoy, dichos aparatos no están estandarizados.
894 (1004) Medicamentos para Mucosas/ Información General USP 40

Debido a los entornos diversos y específicos que caracterizan la vía de administración por mucosa, los investigadores pueden
optar por usar "medio fisiológico" para la liberación de fármacos de la forma farmacéutica específica. Es posible que el uso de
dicho medio no sea esencial para la prueba de desempeño del producto y que, en muchos casos, un amortiguador simple sea
suficiente. Para mayor información, se provee una referencia (3) para la composición de dicho medio.

Aerosoles y Espráis Nasales

Las pruebas de desempeño para aerosoles nasales y linguales y atomizadores nasales se relacionan en gran medida con la
distribución del tamaño de gotita o de partícula y la distribución del tamaño aerodinámico. Los procedimientos del capítulo
Medicamentos Nasales y para Inhalación: Pruebas de Calidad de Desempeño de Aerosoles, Atomizadores y Polvos (601) pueden
aplicarse a productos administrados por vías mucosas. Cuando un fármaco se encuentra presente como un sólido con un me-
canismo de liberación modificado en la dosis administrada, se debe intentar determinar la disolución de las partículas ( 4).

Cremas, Geles y Ungüentos

Las pruebas de liberación de fármacos para cremas, geles y ungüentos pueden llevarse a cabo usando un procedimiento
descrito en el capítulo (1724).

Emulsiones

Las pruebas de desempeño para emulsiones incluyen la determinación del tamaño de glóbulos y la prueba de disolución/
liberación de fármacos. El tamaño de glóbulos puede determinarse usando un procedimiento descrito en Distribución del Ta-
maño de Glóbulos en Emulsiones Inyectables de Lípidos (729). La prueba de liberación de fármacos puede realizarse usando Diso-
lución (711 ), Aparato 2 (Aparato con Paleta) o una celda de difusión vertical según se describe en Medicamentos Semisólidos-
Pruebas de Desempeño (1724), Determinación de la Velocidad de Liberación de Fármaco Usando un Aparato de Celda de Difusión
Vertical.

Películas

Se puede usar Liberación de Fármacos (724), Aparato 5 (Paleta sobre Disco) para determinar la liberación de fármacos a partir
de formas farmacéuticas peliculares. Se puede usar una minicanastilla para la prueba de liberación de fármacos de películas.

Gomas

Para las gomas, las pruebas de desempeño incluyen liberación de fármacos a partir de la formulación. La Farmacopea Euro-
pea (5) describe un dispositivo. La liberación del fármaco a partir de la formulación requiere una actividad de masticado que
renueva la superficie expuesta al medio. La velocidad de liberación será en parte una función de la frecuencia de masticado
que es simulada por el aparato de prueba. Las gomas pueden requerir acondicionamiento a la temperatura de la boca para
deformarse plásticamente por la acción de las platinas oscilantes del aparato de prueba.
Los parámetros importantes para el aparato incluyen: volumen del medio de disolución, distancia entre las superficies de
masticado superior e inferior, ángulo de rotación recomendado, temperatura y frecuencia de masticado. El medio de disolu-
ción seleccionado, los tiempos de prueba y el volumen muestreado también son aspectos importantes a considerar.

Insertos

La prueba de liberación de fármacos para insertos puede realizarse usando Disolución (711 ), Aparato 7 (Aparato con Canasti-
lla) o Disolución (711 ), Aparato 2 (Aparato con Paleta).

Tabletas de Disolución Bucal

La prueba de liberación de fármacos para tabletas de disolución bucal puede realizarse usando Disolución (711 ), Aparato 7
(Aparato con Canastilla); Disolución (711 ), Aparato 2 (Aparato con Paleta) con agitación rápida (175 rpm); o Disolución (711 ),
Aparato 3 (Cilindro Oscilante).

Supositorios

Existen dos tipos de supositorios: 1) hidrofílicos (solubles en agua) y 2) lipofílicos (solubles en aceite o que se funden). La
liberación de fármacos (disolución) para supositorios solubles en agua puede realizarse usando Disolución (711 ), Aparato 7
(Aparato con Canastilla); Disolución (711 ), Aparato 2 (Aparato con Paleta) o Disolución (711 ), Aparato 4 (Celda de Flujo). La prue-
ba de liberación de fármacos para supositorios lipofílicos puede requerir modificaciones en el procedimiento de disolución para
USP 40 Información General/ (1004) Medicamentos para Mucosas 895

evitar interferencia analítica de los glóbulos de aceite. Se han propuesto diversos métodos alternativos ( 6-8). Puede ser útil el
aparato de celda de flujo que usa la celda para supositorios. La selección del método dependerá de la naturaleza de la formula-
ción. La Figura 7 presenta una vista esquemática de la celda de flujo [Disolución (711 ), Aparato 4 (Celda de Flujo)] específica-
mente destinada para la disolución de supositorios. La parte inferior (1) se compone de dos cámaras adyacentes conectadas a
un dispositivo de desbordamiento. El medio de disolución pasa a través de la Cámara A y se somete a un flujo ascendente. El
flujo en la cámara B se dirige de forma descendente hacia un orificio de salida de calibre pequeño que conduce de forma as-
cendente hacia el ensamblaje de filtro. La parte media (2) de la celda tiene una cavidad diseñada para recolectar excipientes
lipofílicos que flotan en el medio de disolución. Una rejilla de metal sirve como filtro grueso. La parte superior (3) sostiene una
unidad de filtro para filtros de papel, fibra de vidrio o celulosa.

Tubo capilar

15°

Cápsula

00
"'

Tamiz con
punto

Figura 1. La celda de flujo diseñada para supositorios (dimensiones en mm).

Suspensiones
La prueba de disolución para suspensiones puede realizarse como está descrito en Disolución (711 ), Aparato 2 (Aparato con
Paleta). Se puede usar un aparato con minipaleta de volumen pequeño.

Tabletas Sublinguales y Tabletas Bucales

La prueba de liberación de fármacos para estas formas farmacéuticas puede realizarse usando Disolución (711 ), Aparato 7
(Aparato con Canastilla) o Disolución (711 ), Aparato 2 (Aparato con Paleta). Las minicanastillas o las minipaletas también pueden
usarse para la prueba de liberación de fármacos de tabletas bucales y sublinguales.

REFERENCIAS

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Dissolut Technol. 2011 ;18(3):15-28.
4. Son Y-J, Horng M, Copley M, McConville ]T. Optimization of an in vitro dissolution test method far inhalation formula-
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5. Dissolution test far medicated chewing gums. European Pharmacopoeia 8.5, 2.9.25. Strasbourg, France: Directorate far
the Quality of Medicines of the Council of Europe (EDQM); 2015: 325-328.
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896 (1004) Medicamentos para Mucosas/ Información General USP 40

6. Yamazaki M, ltoh S, Sasaki N, Tanabe K, Uchiyama M. Comparison of three test methods for suppositories. Pharmacopeial
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7. Gjellan K, Graffner C. Comparative dissolution studies of rectal formulations using the basket, the paddle, and the flow-
through methods. l. Paracetamol in suppositories and soft gelatin capsules of both hydrophilic and lipophilic types. Acta
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8. Palmieri A. Suppository dissolution testing: apparatus design and release of aspirin. Drug Dev lnd Pharm. 1981 ;7(2):247-
259.

(1005) EMISIÓN ACÚSTICA

INTRODUCCIÓN
Las técnicas ultrasónicas se pueden categorizar en dos tipos específicos: emisión acústica (modo pasivo) y espectroscopía
ultrasónica (modo activo). Ambas técnicas tienen muchas aplicaciones.
La técnica de emisión acústica se basa en la detección y análisis de sonidos producidos por un proceso o sistema. En esencia
esto es equivalente a escuchar el proceso o sistema, aunque estos sonidos a menudo están muy por encima de las frecuencias
que el oído humano puede detectar. Por lo general, las frecuencias son audibles hasta 15 kHz aproximadamente.
En el caso de la espectroscopía ultrasónica, el instrumento está diseñado para generar ondas de ultrasonido en un intervalo
de frecuencia definido. Estas ondas viajan a través de la muestra y se miden por medio de un receptor. Se puede establecer
una analogía con la espectroscopía UV visible o la espectroscopía IR, por cuanto el espectro ultrasónico detectado refleja cam-
bios en la velocidad o atenuación del sonido debido a la interacción con una muestra a través de un intervalo de frecuencias.
Sin embargo, puesto que el alcance de este capítulo se limita a la emisión acústica, no discutiremos en detalle la espectrosco-
pía ultrasónica.
La emisión acústica es bien conocida en el estudio de la mecánica de fractura, y por lo tanto, se usa ampliamente entre los
científicos de materiales. También se usa mucho como una técnica de pruebas no destructiva y se aplica en forma rutinaria
para la inspección de alas de aviones, recipientes de presión, estructuras y componentes de soporte de carga. La emisión acús-
tica también se usa en ingeniería para monitorear el desgaste de máquinas.
En términos de aplicaciones farmacéuticas, la dependencia de la medición de la emisión acústica de propiedades físicas co-
mo el tamaño de las partículas, la resistencia mecánica y la cohesión de los materiales sólidos permite el uso de esta técnica
para el control y detección del punto final de procesos como la granulación de alta velocidad, secado en lecho fluido, molien-
da y micronización.

Principios Generales

Las emisiones acústicas se pueden propagar por diferentes modos. En sólidos, los modos compresionales y de corte o trans-
versales son importantes. Los modos compresionales tienen la velocidad más alta y por lo tanto alcanzan el detector acústico
(o transductor de emisión acústica) primero. Sin embargo, en la mayoría de las aplicaciones de emisión acústica en procesos,
existen muchas fuentes y cada una de ellas produce descargas cortas de energía; por consiguiente, los diferentes modos no se
pueden resolver fácilmente. Por ejemplo, la señal detectada en la pared de un vaso es una mezcla compleja de muchas formas
de ondas superpuestas provenientes de muchas fuentes y modos de propagación.
En las interfases, dependiendo de la impedancia acústica relativa de los dos materiales, mucha de la energía se refleja de
vuelta hacia la fuente. En un lecho fluido, por ejemplo, las emisiones acústicas sólo serán detectadas a partir de partículas que
impacten directamente las paredes del lecho próximas al transductor.
Un método conveniente de estudiar la emisión acústica de los procesos es usar el "nivel medio de señal". Se puede usar un
convertidor de valor eficaz a corriente continua (convertidor RMS a CC; RMS-to-DC, por sus siglas en inglés) para convertir la
señal portadora de amplitud modulada (AM) en una señal de corriente continua (CC) que varía más lentamente. Esto se cono-
ce como nivel medio de señal (ASL, por sus siglas en inglés). El ASL puede entonces muestrearse digitalmente (por lo general a
una frecuencia de muestreo de aproximadamente 50 Hz) y almacenarse electrónicamente para el procesamiento adicional de
la señal.
La forma más sencilla de estudiar los datos acústicos consiste en examinar cambios en el ASL. Sin embargo, se puede recabar
otra información al examinar el espectro de potencia del ASL. El espectro de potencia se calcula tomando el cuadrado comple-
jo del espectro de amplitud y se puede obtener efectuando una Transformada Rápida de Fourier (TRF) sobre el registro de
datos digitalizados sin procesar. Los espectros de potencia se pueden promediar para producir un cálculo confiable de la densi-
dad espectral de potencia o para obtener una "huella digital (fingerprint)" de un régimen de proceso particular. La interpreta-
ción del espectro de potencia se complica por el hecho de que la señal acústica originada en el sistema se distorsiona por va-
rios factores, incluyendo la transmisión, reflexión y características de la señal de transferencia.
USP 40 Información General/ (1005) Emisión Acústica 897

La forma del espectro de potencia en el registro del ASL es una función de la dinámica del proceso. Los procesos periódicos
(p.ej., mezclado mecánico o burbujeo periódico de un lecho fluido) muestran alta potencia a determinadas frecuencias discre-
tas. Los procesos aleatorios muestran propiedades de tipo parpadeante (flicker noise), donde la potencia es inversamente pro-
porcional a la frecuencia, o propiedades del ruido blanco en donde la potencia es independiente de la frecuencia. La amplitud
del espectro de potencia también se ve afectada por la energía de las emisiones acústicas producidas por el proceso. Por ejem-
plo, si se está procesando un material duro, la emisión acústica producida por el impacto de las partículas será mayor que la
producida por un material blando.

INSTRUMENTACIÓN

Por lo general, los sensores piezoeléctricos se usan para detectar y cuantificar las señales acústicas producidas por un proce-
so. Los transductores piezoeléctricos se fabrican a partir de sólidos cristalinos piezoeléctricos conectados a circuitos de control
de transductores por contactos eléctricos. Cuando está configurado como un detector, una onda acústica que incide sobre el
elemento piezoeléctrico se transforma en una señal eléctrica en el circuito de control del transductor. Cuando se lo configura
como generador acústico, una señal eléctrica aplicada al elemento piezoeléctrico por el circuito de control genera una onda
acústica que puede propagarse por el medio al cual está conectado el transductor. Por lo general, esto significa que los detec-
tores de emisión acústica pueden funcionar también como generadores de ondas acústicas y esta característica se usa para
garantizar el buen desempeño del sensor según se describe más adelante (ver Calificación y Verificación de Instrumentos de Emi-
sión Acústica).
En las aplicaciones generales de emisión acústica, a menudo se usan sensores con frecuencias de resonancia diferentes (p.ej.,
70 y 190 kHz, aunque frecuencias más altas podrían ser más apropiadas a menores escalas de funcionamiento), que compren-
den varios pasos de banda. A medida que el sonido (ultrasonido) del intervalo de frecuencia apropiada alcanza estos sensores,
se genera una señal eléctrica cuya amplitud es directamente proporcional a la energía (amplitud) de las ondas de sonido inci-
dentes.
Estas señales se procesan por medio de:
(1) un preamplificador (que incluye filtrado de señales),
(2) un convertidor RMS a CC,
(3) un amplificador de ganancia variable y
(4) una terminal de recolección de datos conectada a una computadora, la cual cuenta también con un software de control.
El equipo de emisión acústica por lo general permite usar varios sensores simultáneamente, con la incorporación de múlti-
ples canales electrónicos en un solo instrumento.

Procesamiento de la Señal

La señal de un transductor resonante se asemeja a una señal de radio de amplitud modulada (AM). A la frecuencia de reso-
nancia del transductor, la señal consiste en una onda transportadora cuya amplitud es modulada por el proceso. Para demodu-
lar la señal se usa un convertidor RMS a CC. La potencia de salida de este dispositivo es la señal o envolvente de modulación.
El envolvente se vuelve a muestrear digitalmente a una frecuencia apropiada para el proceso. Por ejemplo, 50 Hz es la tasa
habitual de muestreo digital para un secador de lecho fluido o un granulador de alta velocidad.

FACTORES QUE AFECTAN LA MEDICIÓN

Los siguientes factores pueden afectar los datos acústicos obtenidos y deben tenerse en consideración al instalar un sistema
de emisión acústica.
1. Falla o Daño Físico-Al igual que cualquier otro tipo de sensor, los sensores de emisión acústica pueden fallar con el tiem-
po o como resultado de daño físico. Es importante verificar la función del sensor como parte del mantenimiento de rutina
del instrumento. Si se instalan múltiples sensores en el mismo recipiente, se puede generar una señal activa desde un sen-
sor y ésta se puede usar para verificar la detección en otro sensor. Este ejercicio debería garantizar que los sensores estén
detectando las señales acústicas generadas por el proceso. Al comenzar, en la mitad y al final del proceso se debe deter-
minar y monitorear también la "señal acústica aceptable mínima" para los sensores, que sea estadísticamente válida, con
el fin de garantizar el desempeño de los sensores durante una corrida del proceso. Esto se puede establecer a partir de
experimentos rutinarios de la señal de mantenimiento o basándose en los datos históricos de los sensores.
2. Problemas de Interfase del Sensor-Los sensores se instalan por lo general en la pared exterior del recipiente usado en el
proceso. Para asegurar el sensor a la pared exterior se pueden usar varios tipos de adhesivos (temporales o permanentes).
Durante las limpiezas y movimientos repetidos del recipiente, se puede alterar la unión del sensor al recipiente. La verifica-
ción de la integridad de la instalación debe formar parte del mantenimiento rutinario. En forma similar al punto 1 tratado
anteriormente, se puede usar una señal activa para garantizar la unión apropiada entre el sensor y el recipiente, lo cual
ayuda a confirmar la correspondencia de la impedancia acústica.
3. Influencia del Ruido Mecánico-El uso de altas frecuencias reduce significativamente la contribución del ruido mecánico a la
señal acústica detectada, especialmente en funcionamiento a menor escala, aunque no lo elimina completamente. Si se
898 (1005) Emisión Acústica / Información General USP 40

analiza el efecto de varios ajustes de motor, por ejemplo, se puede determinar si la señal acústica detectada es una fun-
ción del ruido mecánico. Si el efecto es significativo, puede ser necesario usar frecuencias más altas. Es importante recono-
cer y considerar la contribución del ruido mecánico, no importa qué tan reducido sea, a medida que los motores enveje-
cen o se reemplazan.
4. Influencia de las Características de Ja Pared del Recipiente-Dado que los sensores se colocan a menudo en la pared exterior
del recipiente, el espesor de dicha pared puede afectar la calidad de la señal detectada. Si el recipiente está encamisado,
la amplitud de la señal acústica se puede reducir. Si se agregan más sensores al recipiente se puede mejorar la calidad de
la señal. Como alternativa, se puede obtener un aumento en la señal si se colocan sensores en un lugar donde exista con-
tacto entre las paredes exteriores e interiores, lo que básicamente proporciona una guía de onda entre el sensor y la fuen-
te de sonido. Las guías de onda se pueden incluir también en el diseño del equipo de fabricación para permitir el monito-
reo de la emisión acústica. Es necesario efectuar la validación apropiada para garantizar que esto no afecte adversamente
el desempeño del equipo.
5. Efecto de las Propiedades de Jos Materiales-Durante el funcionamiento, la señal acústica recolectada es una suma de diver-
sos eventos que ocurren en el proceso. Por ejemplo, la señal acústica generada cuando las partículas golpean la pared en
un granulador es una función de las propiedades materiales de los gránulos (es decir, densidad, tamaño, porosidad). Por
lo tanto, los cambios significativos en cualquiera de estos parámetros pueden afectar la señal acústica y la calidad de la
predicción resultante.
6. Influencia de Factores Relacionados con el Proceso-En forma similar al punto 5 mencionado anteriormente, las propiedades
relacionadas con el proceso (es decir, fuerza del impacto, frecuencia del impacto, cantidad de material) pueden afectar
también la señal acústica y la calidad de la predicción resultante.
7. Impacto de las Condiciones Ambientales-Por último, también se debe tener en cuenta la influencia de los factores ambien-
tales (es decir, temperatura, humedad).
Los datos de emisión acústica recolectados son específicos del recipiente o equipo. No es aconsejable aplicar a un equipo un
modelo generado en otro, porque la información acústica puede diferir como resultado de los problemas comentados en los
puntos 3, 4 y 5.

Calificación y Verificación de Instrumentos de Emisión Acústica

Se debe adoptar un enfoque de aptitud del sistema en lo que respecta al desempeño del instrumento, estableciendo la ópti-
ma configuración de las mediciones y comparando después el desempeño del instrumento con los valores obtenidos durante
el uso rutinario con aquellos obtenidos durante la calificación de la instalación (IQ, por sus siglas en inglés).
Este enfoque ofrece respuesta a las inquietudes relacionadas con el muestreo porque, a diferencia de otros sistemas analíti-
cos en línea, los transductores pueden ubicarse óptimamente y conectarse para recibir la señal máxima sin modificación del
recipiente.
Las tasas de muestreo tienen que cumplir con el teorema de muestreo de Nyquist, el cual afirma que una señal se debe
muestrear a una tasa que sea el doble del componente de frecuencia más alto en la señal. Se debe usar un filtro de paso bajo
para retirar los componentes de frecuencia que sean mayores que la mitad de la frecuencia de muestreo (frecuencia de
Nyquist). Si no se cumple con este criterio se puede incurrir en solapamiento (aliasing).
Debido a la naturaleza de los transductores piezoeléctricos y dado que las frecuencias de resonancia son propiedades natura-
les de los cristales, no es necesario analizar la variación (reproducibilidad) o derivar en el dominio de frecuencia. Esto puede ser
necesario si se usan otros tipos de transductores. Cualquier cambio considerable en el dominio de frecuencia se registrará co-
mo un descenso en la intensidad de la potencia a la frecuencia de resonancia y por lo tanto está cubierto por los análisis de
intensidad de potencia.
Las dos áreas principales para la verificación del desempeño del instrumento son la intensidad de la potencia y la temporiza-
ción. Cualquier cambio en la intensidad de la señal afectará la señal cruda y el ASL y, por lo tanto, afectará también el espectro
de la potencia. Como consecuencia de los cambios en el proceso (p.ej., variación en dureza o humedad en las partículas que
impactan la pared del recipiente) o de los cambios en la conducción acústica del proceso al transductor se pueden presentar
cambios en la intensidad de la potencia.
La reproducibilidad de la conducción acústica se debe evaluar usando un segundo transductor para registrar un pulso o
"ping" en la frecuencia de resonancia del sensor receptor. Este valor de reproducibilidad representa el ruido de la señal y pue-
de usarse en cálculos del límite de detección (LOD, por sus siglas en inglés) y el límite de cuantificación (LOQ, por sus siglas en
inglés), donde LOD se define como tres veces el ruido de la señal y LOQ es diez veces el ruido de la señal. El ruido a nivel de la
señal de fondo (en la emisión acústica, esta señal de fondo se debe principalmente al ruido del amplificador) se debe calcular a
partir de veinte valores secuenciales de ASL adquiridos a la frecuencia de muestreo usada para el funcionamiento normal. Esta
prueba se debe repetir a la inversa con el fin de establecer que se pueden obtener valores de intensidad estadísticamente simi-
lares en ambos canales.
La reproducibilidad a corto plazo permite calcular el ruido. Sin embargo, no proporciona una medida de la integridad de la
conducción acústica en el tiempo o, más específicamente, de los cambios causados por el proceso (p.ej., variaciones en las
propiedades adhesivas con cambios del proceso tales como calentamiento y enfriado). La prueba de ruido se debe repetir
mientras se ejecutan los parámetros normales de procesamiento (usando un recipiente vacío) y se debe calcular la deriva en el
ASL. Se deben tomar las precauciones necesarias para garantizar que la deriva en la señal (debido a la variación normal en los
USP 40 Información General/ (1005) Emisión Acústica 899

parámetros del proceso) no impacte los modelos quimiométricos usados para la determinación del punto final. Para los gráfi-
cos de tendencia, se debe demostrar que la deriva no es estadísticamente significativa; caso contrario, se deberá corregir la
deriva. Los valores de ruido, deriva y ASL absoluto se deben registrar y guardar, y repetir las pruebas si se hacen cambios al
equipo de procesamiento o al sistema de emisión acústica. Si no se hacen cambios, las pruebas se deben repetir todos los me-
ses. De esta forma se puede demostrar que la calidad de la conducción acústica está intacta y cualquier cambio a la intensidad
de la señal se puede aislar y atribuir al proceso mismo.
Durante el uso rutinario se recomienda ejecutar la prueba de ruido (como se describe anteriormente) antes de cada corrida
del proceso y calcular la intensidad de la potencia y el ruido. Estos valores se deben registrar y comparar con los generados
tanto durante el uso previo como durante la instalación. El impacto de la desviación con respecto a valores previos dependerá
del modelo de predicción y se debe considerar mediante la validación del método.
Los datos de ruido (de lo anterior) se pueden usar también para calcular el tiempo de vuelo del pulso. Si la activación del
pulso y la recepción de la señal están sincronizados, se puede medir el tiempo tomado por el pulso para transmitir a través del
recipiente. Esta es una buena indicación de la medición electrónica, así como de la condición general de la conducción acústi-
ca. Sin embargo, esta prueba se debe considerar como una medición de la condición del "sistema" y se debe ejecutar sólo si
se han hecho cambios al equipo del proceso o al sistema de emisión acústica, o cada 6 meses. La correlación de los tiempos
medidos con los históricos debe ser estadísticamente válida. De no ser así, esto es un indicador de que el sistema de emisión
acústica puede necesitar recalificación por parte del fabricante o proveedor del instrumento o de que hay cambios en la con-
ducción acústica.
Todas estas pruebas requieren el uso de un pulso acústico generado eléctricamente. Una falla en cualquiera de las pruebas
antes mencionadas se puede atribuir a la generación misma de la señal. Se recomienda que el sistema de generación de pulsos
eléctricos sea recalificado y certificado de acuerdo con estándares rastreables al Instituto Nacional de Estándares y Tecnología
(NIST, por sus siglas en inglés) cada 12 meses.

ANÁLISIS DE LOS DATOS

La emisión acústica de granuladores y secadores de lecho fluido se conoce como emisión acústica continua. La emisión acús-
tica continua es afásica (es decir, la señal no tiene comienzo ni interrupción). Esto significa que no es necesario usar las técnicas
de procesamiento de la señal que preservan la fase. El análisis espectral de potencia es una técnica útil para procesar las señales
de emisión acústica. La información en los espectros de potencia, a diferencia de las señales crudas de emisión acústica, es
coherente en el corto plazo, permitiendo promediar la señal. Esto proporciona un mejor cálculo de la densidad espectral de
potencia que el proporcionado por un único espectro de potencia.
Para detectar puntos finales en procesos de lotes (p.ej., punto final de granulación o secado) es apropiado un modelo multi-
variado cualitativo (p.ej., PCA o SIMCA). Efectuar la siguiente secuencia de operaciones:
(1) Entrenamiento o Calibración-Obtener los espectros de emisión acústica que sean representativos del punto final.
(2) Modelado-Crear un modelo multivariado que describa la distribución de las señales de emisión acústica en el punto final.
(3) Predicción-Comparar los espectros de emisión acústica contra el modelo. Monitorear el ajuste al modelo (expresado por
lo general en términos de un número de desviaciones estándar). A medida que el sistema se aproxima al punto final, el
ajuste mejora y se establece la finalización del proceso una vez que el modelo concuerda con los criterios predefinidos. El
modelo de predicción se genera a partir de los espectros de emisión acústica obtenidos del proceso funcionando en con-
diciones normales. Las perturbaciones (p.ej., la aglomeración indeseada en los equipos de recubrimiento) se detectan ob-
servando las desviaciones estadísticamente válidas con respecto al modelo.
El modelado adaptativo también se ha propuesto para la detección de perturbaciones. Esto implica generar continua-
mente modelos multivariados a medida que se adquieren las señales de emisión acústica. La desviación inusual de la señal
de emisión acústica indica la ocurrencia de una perturbación del proceso. La ventaja del modelo adaptativo es que no es
necesario efectuar un paso de calibración por separado.

GLOSARIO

Amplitud: La magnitud o potencia de una forma de onda variable.

Convertidor RMS a CC (RMS-to-DC, por sus siglas en inglés): Es un dispositivo electrónico que convierte una señal alterna
a un nivel de voltaje proporcional a la potencia promedio en la señal.
Densidad Espectral de Potencia: La medida de la potencia de emisión acústica en cada elemento de resolución del espectro
de potencia.
Emisión Acústica Continua: Señales de emisión acústica que no se pueden separar en el tiempo y son típicas de procesos
farmacéuticos tales como granulación y secado en lecho fluido.
Espectro de Potencia: El espectro de potencia de una señal es una representación de la potencia de la señal en función de la
frecuencia. El espectro de potencia se calcula a partir de la señal del dominio tiempo por medio de un algoritmo de Transfor-
mada Rápida de Fourier (TRF). Resulta útil estudiar las señales de emisión acústica en el dominio espectral o de frecuencia, ya
que a menudo el espectro es característico del mecanismo. Se pueden obtener mejoras en la relación señal-ruido al promediar
un número de espectros de potencia, ya que estos son coherentes.
900 (1005) Emisión Acústica / Información General USP 40

Filtrado de Señal: Filtrar una señal significa atenuar las frecuencias por fuera de un rango prescrito. En trabajos de emisión
acústica, se usa el filtrado de paso de banda para mejorar la relación señal-ruido al atenuar el ruido fuera del ancho de banda
del sensor. El filtrado de paso bajo se usa para eliminar frecuencias más altas que la frecuencia Nyquist con el fin de evitar el
solapamiento.
Frecuencia Nyquist: La frecuencia Nyquist está definida como la mitad de la tasa de muestreo digital y es la frecuencia más
alta que se puede reproducir confiablemente.
Frecuencia Resonante: La frecuencia a la cual es más sensible un sensor de emisión acústica. Los sensores de emisión acústi-
ca resonantes tienen una frecuencia de resonancia claramente definida, pero por lo general son sensibles a otras frecuencias.
Ganancia: El factor de amplificación para un componente, expresado generalmente en términos de decibeles (dB).
Ganancia en dB = 20 log 10 (Voltajede salida Voltajedeentrada).
Impedancia Acústica: La impedancia acústica (Z) se define como Z = pv (donde pes la densidad y ves la velocidad del soni-
do). Es un dato importante que informa la proporción de la energía del sonido transmitida de un medio a otro y la cantidad de
energía reflejada en la interfase.
Modelado Adaptativo: Es un método que predice el estado de un proceso sin el uso de un modelo generado previamente
(es decir, no hay un entrenamiento ni un paso de calibración previos).
Modo de Corte (Cizalladura): Un modo transverso de transmisión acústica que se presenta solo en sólidos.
Modo Compresiona!: Un modo longitudinal de transmisión acústica encontrado en sólidos, líquidos y gases.
Modo Transversal: Un modo de propagación de la onda donde el desplazamiento del material es perpendicular a la direc-
ción de la propagación. Estos modos sólo se encuentran en materiales sólidos.
Nivel Medio de Señal (ASL): Una medida de la potencia promedio en una señal de emisión acústica.
Paso de Banda: El intervalo de frecuencias dentro de las cuales funciona un componente.
Piezoeléctrico: Un material que al comprimirse genera un campo eléctrico. Los materiales piezoeléctricos se usan en la cons-
trucción de sensores de emisión acústica. Un material común es el titanato de circonio y plomo (PZT).
Propiedades de Tipo Parpadeante (flicker noise): Un tipo de señal asociada con muchos procesos naturales. Las característi-
cas del ruido parpadeante son: la potencia del ruido es directamente proporcional a la señal y tiene aproximadamente una
distribución de densidad espectral de 1 /f (f = frecuencia).
Ruido Blanco: El ruido blanco se caracteriza por un espectro de potencia de densidad espectral uniforme y está asociado con
procesos puramente aleatorios.
Solapamiento (aliasing): Los componentes espurios de baja frecuencia que aparecen en la señal y son en realidad frecuen-
cias por encima de la frecuencia Nyquist.
Transductor de Emisión Acústica: Un dispositivo en estado sólido que incorpora por lo general un elemento piezoeléctrico
para convertir la onda de emisión acústica a una señal eléctrica.

(101 O) DATOS ANALÍTICOS-INTERPRETACIÓN Y TRATAMIENTO

INTRODUCCIÓN

Este capítulo proporciona información acerca de las prácticas aceptables para el análisis e interpretación uniforme de los da-
tos obtenidos de los análisis químicos y otros análisis. Se describen además algunos métodos estadísticos básicos para la eva-
luación de datos y se analiza en cierto detalle el tratamiento de los resultados aberrantes y la comparación de procedimientos
analíticos.
[NOTA-No debe inferirse que las herramientas de análisis mencionadas en este capítulo conforman una lista exhaustiva. Pue-
den utilizarse otros métodos estadísticos igualmente válidos a criterio del fabricante y demás usuarios de este capítulo.]
La garantía de calidad de los productos farmacéuticos se logra combinando una serie de prácticas, que incluyen un diseño
robusto de la formulación, validación, análisis de materias primas, análisis durante el proceso y pruebas del producto final. Ca-
da una de estas prácticas depende de procedimientos de prueba confiables. Durante el proceso de desarrollo, se desarrollan y
validan procedimientos de prueba para asegurar que los productos fabricados estén perfectamente caracterizados. Las pruebas
del producto final permiten comprobar que los productos son uniformemente seguros y eficaces, y que cumplen con sus espe-
cificaciones.
Las mediciones son intrínsecamente variables y la USP reconoce tal variabilidad para las pruebas biológicas desde hace mu-
cho tiempo. La necesidad de tener en cuenta esta variabilidad cuando se analizan datos de pruebas biológicas, por ejemplo, se
trata en el capítulo Análisis de Valoraciones Biológicas (1034). Las mediciones de análisis químicos comúnmente utilizadas para
analizar productos farmacéuticos también son intrínsecamente variables, aunque en menor grado que las pruebas biológicas.
No obstante, en muchos casos los criterios de aceptación son proporcionalmente más estrictos y, en consecuencia, debe te-
nerse en cuenta esta menor variabilidad aceptable cuando se analizan datos obtenidos por procedimientos analíticos. Si no se
caracteriza ni se especifica la variabilidad de una medición junto con el resultado obtenido, los datos sólo pueden interpretarse
en el sentido más limitado. Por ejemplo, si se especifica que la diferencia entre los promedios de los resultados obtenidos por
USP 40 Información General/ (101 O) Datos Analíticos 901

dos laboratorios al analizar el mismo conjunto de muestras es del 10%, la interpretación es limitada en cuanto a la importancia
de dicha diferencia a menos que se especifique la variabilidad dentro de cada laboratorio.
Este capítulo proporciona indicaciones para el tratamiento e interpretación científicamente aceptables de los datos. Se des-
criben además herramientas estadísticas que pueden resultar útiles para la interpretación de los datos analíticos. Muchas esta-
dísticas descriptivas, como la desviación estándar y la media, son de uso difundido. Otras herramientas estadísticas, como las
pruebas de resultados aberrantes, pueden realizarse utilizando diferentes métodos científicamente válidos, de los cuales tam-
bién se incluyen ejemplos y sus aplicaciones. El marco dentro del cual se interpretan los resultados de una prueba farmacopei-
ca se describe en detalle en Advertencias y Requisitos Generales 7. Resultados de Pruebas. En el Apéndice 7 al final de este capítu-
lo, se incluye una selección de referencias útiles para obtener información adicional sobre las herramientas estadísticas aquí
descritas. La USP no avala específicamente las referencias citadas, que no constituyen una lista exhaustiva. Puede encontrarse
información adicional sobre cualquiera de los métodos citados en este capítulo en la mayoría de los textos de estadística.

PRE-REQUISITOS PARA LAS PRÁCTICAS V PRINCIPIOS DE LABORATORIO

La correcta aplicación de los principios estadísticos a los datos de laboratorio supone que estos datos han sido obtenidos de
forma rastreable (es decir, documentada) y sin sesgo. Para asegurarse de ello, son útiles las prácticas siguientes.

Mantenimiento Adecuado de Registros

Los registros de laboratorio deben mantenerse con suficiente detalle para que otros analistas igualmente calificados puedan
reconstruir las condiciones experimentales y revisar los resultados obtenidos. Por lo general, al obtener datos, deben utilizarse
más decimales que los requeridos en la especificación y las cifras sólo deben redondearse una vez realizados los cálculos finales,
conforme a lo establecido en las Advertencias y Requisitos

Consideraciones Relativas al Muestreo

Un muestreo eficaz es un paso importante para la evaluación de un atributo de calidad de una población. El objetivo del
muestreo es proporcionar datos representativos (la muestra) para estimar las propiedades de la población. La manera en que
se obtiene dicha muestra depende totalmente de la pregunta que se busca responder con los datos de la muestra. Por lo gene-
ral, un proceso aleatorio se considera la manera más adecuada de seleccionar una muestra. De hecho, es necesario utilizar una
muestra aleatoria e independiente para asegurar que los datos obtenidos produzcan estimaciones válidas acerca de las propie-
dades de la población. La generación de una muestra no aleatoria o "de conveniencia" conlleva el riesgo de que las estimacio-
nes estén sesgadas. El tipo de muestreo aleatorio más directo se conoce como muestreo aleatorio simple y es un proceso en el
que cada unidad de la población tiene la misma probabilidad de aparecer en la muestra. No obstante, en algunos casos, este
método de selección de muestra aleatoria no es óptimo ya que no garantiza la misma representatividad en relación con todos
los factores (es decir, tiempo, lugar, máquina) que podrían influir en las propiedades críticas de la población. Por ejemplo, si se
requieren 12 horas para fabricar todas las unidades de un lote y es fundamental que la muestra sea representativa de todo el
proceso de producción, no sería adecuado tomar una muestra aleatoria simple al finalizar la producción ya que no se puede
garantizar que contenga una cantidad similar de unidades fabricadas en cada período del proceso de 12 horas. En estos casos
es mejor tomar una muestra aleatoria sistemática, seleccionando al azar una unidad del proceso de producción a intervalos o
en lugares sistemáticamente seleccionados (p.ej., muestreando cada 30 minutos, entre las unidades producidas durante ese
período) para asegurarse de incluir en la muestra unidades tomadas durante todo el proceso de fabricación. Se requerirá otro
tipo de procedimiento de muestreo aleatorio si, por ejemplo, un producto se introduce en los viales usando cuatro máquinas
de llenado diferentes. En este caso, sería importante tomar una muestra aleatoria de los viales de cada una de las máquinas de
llenado. Una muestra aleatoria estratificada, método que consiste en tomar una muestra al azar del mismo número de viales en
cada una de las cuatro máquinas de llenado, cumple con este requisito. Independientemente del motivo del muestreo (p.ej.,
prueba de liberación de partida), debe establecerse un plan de muestreo que indique detalladamente cómo se debe obtener la
muestra para asegurar que sea representativa de toda la población y que los datos resultantes tengan la sensibilidad requerida.
La estrategia de muestreo óptima depende del conocimiento de los procesos de fabricación y medición analítica. Una vez defi-
nido el plan de muestreo, es probable que incluya cierto elemento de selección aleatoria. Por último, debe obtenerse una can-
tidad de muestra suficiente para el análisis original, los análisis de verificación subsiguientes y otros análisis. Se recomienda
consultar a un estadístico para identificar la estrategia de muestreo óptima.
Las pruebas que se describen en el resto de este capítulo suponen que se ha realizado un muestreo aleatorio simple.

Uso de Estándares de Referencia

Cuando una prueba o valoración de los compendios USP o NF indique el uso de un Estándar de Referencia USP, sólo se con-
siderarán concluyentes los resultados obtenidos usando el Estándar de Referencia USP especificado con respecto a la demostra-
ción del cumplimiento de la norma USP o NF. Aunque las normas USP son aplicables durante toda la vida de un artículo, des-
de su producción hasta su caducidad, la USP no especifica cuando se deben realizar las pruebas ni la frecuencia de análisis. Por
902 (101 O) Datos Analíticos / Información General USP 40

lo tanto los usuarios de los compendios USP y NF deben aplicar una variedad de estrategias y prácticas para asegurar que los
artículos cumplan con los requisitos farmacopeicos y mantengan dicho cumplimiento, incluyendo el momento y la necesidad
de realizar las pruebas. Dichas estrategias y prácticas pueden incluir el uso de estándares secundarios rastreables al Estándar de
Referencia USP, para complementar o sustentar cualquier análisis realizado con el propósito de demostrar de manera conclu-
yente el cumplimiento con los estándares farmacopeicos aplicables. Debido a que la asignación de un valor a un estándar es
uno de los factores más importantes de la exactitud de un análisis, es fundamental hacerlo correctamente.

Verificación del Desempeño del Sistema

La verificación de un nivel del desempeño aceptable de un sistema analítico que se utiliza en forma rutinaria o continua pue-
de ser una práctica valiosa. Esto se puede lograr analizando una muestra de control a intervalos adecuados o examinando
otros factores, como la variación entre estándares, las relaciones señal-ruido de fondo, etc. Si se realiza un seguimiento del
parámetro medido, por ejemplo graficando los resultados del análisis de una muestra de control, se pueden detectar cambios
en el desempeño que requieren el ajuste del sistema analítico. El Apéndice 1 proporciona un ejemplo de una gráfica de control.

Validación del Procedimiento

Todos los procedimientos analíticos deben validarse según se especifica en Validación de Procedimientos Farmacopeicos
(1225). Los procedimientos analíticos publicados en la USP-NF se han validado y cumplen con los requisitos reglamentarios de
Buenas Prácticas de Fabricación vigentes establecidos en el Código de Reglamentos Federales. Los procedimientos validados
pueden utilizarse para analizar una nueva formulación (por ejemplo, un nuevo producto, forma de dosificación o producto
intermedio de un proceso) únicamente después de verificar que la nueva formulación no interfiere con la exactitud, linealidad
ni precisión del método. No puede suponerse que un procedimiento validado puede medir correctamente el ingrediente acti-
vo de una formulación que es diferente a la utilizada para establecer la validez original del procedimiento. [NOTA SOBRE
TERMINOLOGÍA-La definición de exactitud en el capítulo (1225) y en ICH Q2 corresponde únicamente a ausencia de sesgo. Para
el Vocabulario Internacional de Metrología (VIM, por sus siglas en inglés) y la documentación de la Organización Internacional
de Normalización (ISO, por sus siglas en inglés), exactitud tiene un significado distinto. Para ISO, exactitud combina los concep-
tos de ausencia de sesgo (denominada certeza) y precisión. Este capítulo sigue a la definición del capítulo (1225), que corres-
ponde únicamente a veracidad.]

PRINCIPIOS DE MEDICIÓN Y VARIACIÓN

Todas las mediciones son, en el mejor de los casos, estimaciones del valor real ("verdadero" o "aceptado"), ya que contie-
nen una variabilidad aleatoria (también denominada error aleatorio) y, en algunos casos, un error sistemático (sesgo). En con-
secuencia, el valor medido difiere del valor real debido a la variabilidad intrínseca de la medición. Si un conjunto de medicio-
nes consta de resultados individuales representativos del todo, pueden usarse métodos estadísticos para estimar propiedades
informativas de la totalidad y otras pruebas estadísticas para determinar si es probable que dichas propiedades cumplan con
los requisitos establecidos. Los análisis estadísticos resultantes deben considerar la variabilidad asociada con el proceso de me-
dición, así como la variabilidad de la entidad que se está midiendo. Las mediciones estadísticas usadas para evaluar la dirección
y magnitud de estos errores incluyen la media, la desviación estándar y expresiones derivadas de éstas, como el coeficiente de
variación porcentual (%CV, también denominado desviación estándar relativa porcentual o %RSD). La variabilidad estimada
puede usarse para calcular intervalos de confianza para la media, o mediciones de variabilidad, e intervalos de tolerancia que
capturan una proporción especificada de las mediciones individuales.
El uso de mediciones estadísticas debe complementarse con el buen juicio, especialmente con respecto al muestreo repre-
sentativo. Los datos deberían ser congruentes con las suposiciones estadísticas usadas para el análisis. Puede ser necesario el
uso de métodos alternativos para la evaluación de los datos si se considera que una o más de estas suposiciones han sido viola-
das. En particular, la mayoría de las mediciones estadísticas y pruebas citadas en este capítulo suponen que la distribución de
la población total es una distribución normal y que la muestra analizada es un subconjunto representativo de dicha población.
La distribución normal (o gaussiana) tiene forma de campana, es simétrica respecto de su centro y tiene ciertas características
requeridas para que estas pruebas sean válidas. No siempre se puede esperar que los datos sigan una distribución normal, pu-
diéndose requerir de una transformación para que se ajusten a la misma. Por ejemplo, existen variables que tienen distribucio-
nes cuyo gráfico muestra una cola más larga hacia la derecha que hacia la izquierda. Por lo general, estas distribuciones pue-
den volverse aproximadamente normales mediante una transformación logarítmica. Un método alternativo sería el uso de pro-
cedimientos estadísticos "independientes de la distribución" o "no paramétricos" que no requieren que la población tenga
una distribución normal. Cuando el objetivo es determinar un intervalo de confianza para la media o para la diferencia entre
dos medias, por ejemplo, la suposición de normalidad no es tan importante debido al teorema de límite central. No obstante,
debe verificarse la normalidad de los datos para calcular intervalos de confianza válidos para desviaciones estándar y relaciones
de las desviaciones estándar, para realizar algunas pruebas de resultados aberrantes y para determinar límites de tolerancia es-
tadística válidos. En este último caso, la normalidad es una suposición fundamental. Los métodos gráficos simples, como gráfi-
cos de puntos, histogramas y gráficos de probabilidad normales, son útiles para verificar esta suposición.
 USP 40 Información General/ (1 01 O) Datos Analíticos 903

Una medición analítica simple puede ser útil para evaluar la calidad si la muestra proviene de un lote que se ha preparado
utilizando un proceso documentado debidamente validado y si los errores analíticos son bien conocidos. El resultado analítico
obtenido puede condicionarse incluyendo una estimación de los errores asociados. En algunos casos puede considerarse el uso
de promedios ya que la variabilidad asociada con un valor promedio siempre es menor que la variabilidad de las mediciones
individuales. La opción de utilizar mediciones individuales o promedios depende de la aplicación de la medición y su variabili-
dad. Por ejemplo, cuando se obtienen mediciones múltiples con la misma alícuota de muestra, como en el caso de varias in-
yecciones de muestra en un método de HPLC, por lo general es aconsejable promediar los datos obtenidos, por la razón que
se mencionó anteriormente.
La variabilidad se asocia con la dispersión de observaciones en torno al centro de una distribución. El parámetro estadístico
más comúnmente utilizado para medir el centro es la media de la muestra (x):
n
LX1
- i=1 X1+X2+ ... +Xn
X=~~-=~~~~~~~~-
n n
La variabilidad del procedimiento analítico puede estimarse de varias maneras diferentes. La evaluación más común y útil de
la variabilidad de un procedimiento es la determinación de la desviación estándar basada en mediciones independientes repe-
tidas1 de una muestra. La desviación estándar de la muestra, s, se calcula por la fórmula:

en donde X¡ es la medición individual en un conjunto de n mediciones; y xes la media de todas las mediciones. A continua-
ción, se calcula la desviación estándar relativa porcentual (%RSD) como:

%RSD = ~X · 100%
y se expresa como un porcentaje. Si los datos requieren la transformación logarítmica para lograr la normalidad (p.ej., para
valoraciones biológicas), existen métodos alternativos. 2
Debe realizarse un estudio de precisión para obtener una mejor estimación de la variabilidad del procedimiento. El estudio
de precisión puede diseñarse para determinar la precisión intermedia (que incluye los componentes de variabilidad "entre aná-
lisis" e "intra-análisis") y la repetibilidad (variabilidad "intra-análisis"). Los estudios de precisión intermedia deben permitir
cambios en las condiciones experimentales que podrían esperarse, como por ejemplo diferentes analistas, diferentes prepara-
ciones de reactivos, diferentes días y diferentes instrumentos. Para realizar un estudio de precisión, la prueba debe repetirse
varias veces. Cada análisis debe ser completamente independiente de los demás para obtener estimaciones exactas de los dife-
rentes componentes de variabilidad. Además, dentro de cada análisis, deben realizarse determinaciones repetidas para estimar
la repetibilidad. Ver un ejemplo de un estudio de precisión en el Apéndice 2.
Puede considerarse un intervalo de confianza en la interpretación de los datos. Estos intervalos se calculan a partir de varios
datos usando la media (x) y la desviación estándar de la muestra(s) según la fórmula:

(-X - tcx/2, n - 1
s -
-{ri s )
, X + tcx/2, n - 1 -{ri

1 Las mediciones múltiples (o, por equivalencia, los errores experimentales asociados con las mediciones múltiples) son independientes entre sí cuando se puede
suponer que representan una muestra aleatoria de la población. En estas muestras, la magnitud de una medición no está influenciada por otra medición ni influye
en la magnitud de ninguna otra medición. La falta de independencia implica que las mediciones están correlacionadas en función del tiempo o del espacio. Consi-
deremos, por ejemplo, una placa de microtitulación de 96 pocillos. Supongamos que, por causa desconocida, se produce un error experimental con valor bajo
(error negativo) en una muestra colocada en la primera columna, y que entonces esta misma causa produce un valor bajo para una muestra colocada en la segun-
da columna; en este caso, las dos mediciones resultantes no son estadísticamente independientes. Una manera de evitar dichas posibilidades sería aleatorizar la
colocación de las muestras en la placa.
2 Cuando los datos se han transformado logarítmicamente (base e) para lograr la normalidad, la o/oRSD es:

%RSD = 100% ·..je-;¡=·;,

Esto puede aproximarse razonablemente según:

%RSD = 100% ·(e'- 1)

en donde s es la desviación estándar de los datos transformados logarítmicamente (base e).

904 (101 O) Datos Analíticos / Información General USP 40

en donde tª 12,n_1 es un número estadístico que depende del tamaño de la muestra (n), el número de grados de libertad (n - 1)
y el nivel de confianza deseado (1 - a). Sus valores se obtienen a partir de las tablas publicadas de la distribución t de Student.
El intervalo de confianza proporciona una estimación del intervalo donde cae la media de la población "verdadera" (µ)y, ade-
más, evalúa la confiabilidad de la media de la muestra como una estimación de la media verdadera. Si se repitiera la misma
configuración experimental una y otra vez y se calculara cada vez un intervalo de confianza del 95% (por ejemplo) para la
media verdadera, entonces se esperaría que el 95% de dichos intervalos incluyera la media verdadera, µ. No se puede afirmar
con seguridad si el intervalo de confianza derivado de un conjunto de datos específicos obtenidos contiene µ. No obstante,
suponiendo que los datos representan mediciones independientes entre sí generadas en forma aleatoria a partir de una pobla-
ción normalmente distribuida, el procedimiento usado para determinar el intervalo de confianza garantiza que el 95% de di-
chos intervalos de confianza contienen µ. Debe tenerse en cuenta que es importante definir la población apropiadamente para
capturar todas las fuentes de variación pertinentes. [NOTA SOBRE TERMINOLOGÍA-La documentación de la Organización Interna-
cional de Normalización (ISO) utiliza diferente terminología para algunos de los conceptos aquí descritos. En la documenta-
ción de la ISO, al término s/'1n, comúnmente denominado como error estándar de la media, se denomina incertidumbre es-
tándar. Asimismo, la ISO denomina al término tª12 , n-l S/'1n como incertidumbre expandida, mientras que denomina a tª12 ,n_ 1
como factor de cobertura. Cuando la desviación estándar se calcula combinando los estimados de variabilidad de diversas
fuentes, recibe el nombre de incertidumbre estándar combinada. Algunas de estas fuentes podrían tener estimaciones no esta-
dísticas de incertidumbre, denominadas incertidumbres Tipo B, como la incertidumbre en la calibración de una balanza.]

RESULTADOS ABERRANTES

Ocasionalmente, los resultados analíticos observados son muy diferentes de los esperados. Las observaciones aberrantes,
anómalas, contaminadas, discordantes, falaces, sospechosas o absurdas, así como otros tipos de valores erráticos, se denomi-
nan resultados aberrantes. Al igual que todos los resultados de laboratorio, estos resultados aberrantes se deben documentar,
interpretar y manejar. Dichos resultados pueden ser mediciones exactas de lo que se está midiendo aunque diferentes de los
valores esperados. En otros casos, debido a un error en el sistema analítico, los resultados pueden no ser típicos, aunque la
entidad que se mide sea típica. Cuando se obtiene un resultado aberrante, deben realizarse investigaciones sistemáticas del
laboratorio y, en algunos casos, de los procesos para establecer la causa de ese resultado. Los factores que deben considerarse
al investigar un resultado aberrante incluyen, entre otros, error humano, error de instrumentación, error de cálculo y deficien-
cias del producto o de sus componentes. Si se encuentra una causa no relacionada con la deficiencia del producto o de sus
componentes, pueden repetirse las pruebas con la misma muestra, en lo posible, o con una muestra nueva. Deben examinarse
la precisión y exactitud del procedimiento, el Estándar de Referencia USP, las tendencias del proceso y los límites de la especifi-
cación. Los datos pueden considerarse no válidos, según esta investigación documentada, y eliminarse de los cálculos posterio-
res.
Si no se encuentra una causa atribuible que se pueda documentar para el resultado aberrante de laboratorio, el resultado
puede analizarse, como parte de toda la investigación, para determinar si se trata de un resultado aberrante.
No obstante, se requiere una cuidadosa consideración cuando se utilizan estas pruebas. Pueden producirse dos tipos de
errores en las pruebas de los resultados aberrantes: (a) identificar observaciones como resultados aberrantes cuando en reali-
dad no lo son; y (b) no identificar resultados aberrantes que sí existen. Cualquier conclusión acerca de la aceptabilidad de los
datos en que se observan resultados aberrantes requiere una interpretación cuidadosa.
La "designación de resultado aberrante" es el reconocimiento informal de valores de laboratorio sospechosos que deben in-
vestigarse con métodos más formales. La elección de la técnica correcta para la identificación de resultados aberrantes suele
depender del reconocimiento inicial del número y ubicación de los valores. Frecuentemente, la designación de resultado abe-
rrante se hace visualmente con técnicas gráficas. La "identificación de resultados aberrantes" es el uso de pruebas de significan-
cia estadística para confirmar que los valores no cumplen con el modelo estadístico conocido o supuesto.
Cuando se utilizan adecuadamente, las pruebas de resultados aberrantes son herramientas valiosas para los laboratorios far-
macéuticos. Existen varias pruebas para detectar resultados aberrantes. Se incluyen en el Apéndice 3 ejemplos ilustrativos de
tres de estos procedimientos: la Prueba de Desviación Estudentizada Extrema (ESD, por sus siglas en inglés), la Prueba de Di-
xon y la Regla de Hampel.
La elección de la prueba de resultados aberrantes adecuada depende del tamaño de la muestra y de las suposiciones de
distribución. Muchas de estas pruebas (p.ej., la Prueba ESD) requieren la suposición de que los datos generados por el labora-
torio puedan considerarse como una muestra aleatoria de una población normalmente distribuida, posiblemente después de
su transformación. Si se realiza una transformación de los datos, la prueba de resultado aberrante se aplica a los datos transfor-
mados. Las transformaciones más comunes incluyen tomar el logaritmo o la raíz cuadrada de los datos. Existen otros métodos
para la manipulación de un resultado aberrante simple y un resultado múltiple que también pueden utilizarse, e incluyen prue-
bas que utilizan medidas robustas de dispersión y tendencia central, como por ejemplo la mediana y la desviación absoluta de
la mediana y métodos de análisis exploratorio de datos (EDA, por sus siglas en inglés). El "Acomodamiento de resultados abe-
rrantes" es el uso de técnicas robustas, tales como pruebas basadas en el orden o rango de cada valor en el conjunto de datos
en lugar del valor real, para producir resultados que no estén adversamente influidos por la presencia de resultados aberrantes.
El uso de dichos métodos reduce los riesgos asociados con ambos tipos de error en la identificación de resultados aberrantes.
El "rechazo de resultados aberrantes" es la eliminación efectiva del resultado aberrante identificado del conjunto de datos.
No obstante, una prueba de resultado aberrante no puede ser el único medio para eliminar un resultado aberrante de los da-
USP 40 Información General/ (101 O) Datos Analíticos 905

tos de laboratorio. Una prueba de resultado aberrante puede resultar útil como parte de la evaluación de la significancia de ese
resultado, junto con otros datos. Las pruebas de resultado aberrante no son válidas en aquellos casos en que se está evaluando
la variabilidad del producto, como por ejemplo la uniformidad del contenido, la disolución o la determinación de la velocidad
de liberación. En estos casos, un valor considerado como resultado aberrante puede ser en realidad un resultado exacto de un
producto no uniforme. Todos los datos, especialmente los resultados aberrantes, deben conservarse para su análisis futuro. Los
datos inusuales, cuando se observan en el contexto de otros datos históricos, por lo general no son tales sino que reflejan las
influencias de fuentes adicionales de variación.
En resumen, el rechazo o la conservación de un resultado aparentemente aberrante puede ser una fuente grave de sesgo.
Deben tenerse en cuenta las características de las pruebas, así como el conocimiento científico del proceso de fabricación y el
procedimiento analítico, para determinar el origen del resultado aparentemente aberrante. Una prueba de resultado aberrante
nunca puede reemplazar una investigación de laboratorio exhaustiva sino que debe realizarse únicamente cuando la investiga-
ción no es concluyente y no se observaron desviaciones en la fabricación o pruebas del producto. Incluso si dichas pruebas
estadísticas indicaran que uno o más valores son resultados aberrantes, deben conservarse igualmente en los registros. La in-
clusión o exclusión de resultados aberrantes en los cálculos para evaluar la conformidad del producto con los criterios de acep-
tación debe basarse en el juicio científico y en las normas internas del fabricante. Suele ser útil realizar los cálculos con y sin los
resultados aberrantes para evaluar su impacto.
Los resultados aberrantes que se atribuyen a errores en el proceso de medición deben informarse (es decir, mediante una
nota al pie de página), pero no incluirse en los cálculos estadísticos posteriores. Al evaluar si el producto cumple con un criterio
de aceptación en particular, es importante definir si el resultado a informar (el resultado que se compara con los límites) es un
valor promedio, una medición individual u otra cosa. Por ejemplo, si el criterio de aceptación se establece para un promedio,
entonces no es estadísticamente apropiado requerir que las mediciones individuales también cumplan con el criterio, ya que la
variabilidad asociada con el promedio de una serie de mediciones es menor que la de cualquier medición individual.

COMPARACIÓN DE PROCEDIMIENTOS ANALÍTICOS

Con frecuencia es necesario comparar dos procedimientos para determinar si hay una diferencia importante en sus resulta-
dos promedios o sus variabilidades. El objetivo de un experimento de comparación de procedimientos es generar datos ade-
cuados que permitan evaluar la equivalencia de los dos procedimientos en toda una gama de valores. En esta sección se descri-
ben algunos de los factores que se deben tener en cuenta al realizar dichas comparaciones.

Precisión

La precisión es el grado de coincidencia entre los resultados de pruebas individuales cuando el procedimiento analítico se
aplica repetidamente a una muestra homogénea. Para considerar que un procedimiento alternativo tiene una precisión "com-
parable" a la del procedimiento vigente, su precisión (ver Validación de Procedimientos Farmacopeicos (1225), Valoración) no
debe ser peor que la del procedimiento vigente en un valor considerado importante. Una disminución en la precisión (o au-
mento en la variabilidad) puede aumentar el número de resultados que no cumplan con las especificaciones requeridas. Por el
contrario, un procedimiento alternativo que proporciona una precisión superior es aceptable.
Una manera de comparar la precisión de dos procedimientos es estimando la varianza de cada procedimiento (la varianza
de la muestra, s2 , es el cuadrado de la desviación estándar de la muestra) y calculando un intervalo de confianza superior unila-
teral para la relación de varianzas (verdaderas), en donde relación se define como la varianza del procedimiento alternativo
dividida por la varianza del procedimiento vigente. Se incluye un ejemplo basado en esta suposición en el Apéndice 4 El límite
de confianza superior unilateral debe compararse con un límite superior considerado aceptable, a priori, por el laboratorio ana-
lítico. Si el límite de confianza superior unilateral es inferior a este límite aceptable superior, la precisión del procedimiento al-
ternativo se considera aceptable, ya que el uso del procedimiento alternativo no llevará a una pérdida importante de precisión.
Debe tenerse en cuenta que si el límite de confianza superior unilateral es inferior a uno, se ha comprobado que el procedi-
miento alternativo tiene una precisión superior a la del procedimiento vigente.
El método de intervalo de confianza que se acaba de describir es preferible a la prueba F en dos muestras para evaluar la
significancia estadística de la relación de varianzas. Para realizar la prueba F de dos muestras, la relación de varianzas calculada
con las muestras se compara con un valor crítico basado en los valores tabulados de la distribución F para el nivel de confianza
deseado y el número de grados de libertad de cada varianza. La mayoría de los textos de estadística incluyen tablas con los
valores F. Si la relación calculada excede este valor crítico, se dice que existe una diferencia estadísticamente significativa en la
precisión de los dos procedimientos. No obstante, si la relación calculada es inferior al valor crítico, esto no prueba que los
procedimientos tienen la misma precisión o una precisión equivalente, sino que no hay suficiente evidencia para probar que
existe una diferencia estadísticamente significativa.

Exactitud

La comparación de la exactitud de los procedimientos (ver Validación de Procedimientos Farmacopeicos (1225), Valoración)
proporciona información útil para determinar si el nuevo procedimiento es equivalente, en general, al procedimiento vigente.
906 (1010) Datos Analíticos / Información General USP 40

Un método sencillo para realizar esta comparación es calcular un intervalo de confianza para la diferencia entre las medias ver-
daderas, donde la diferencia se calcula restando la media del procedimiento vigente de la media de la muestra obtenida con el
procedimiento alternativo.
El intervalo de confianza debe compararse con un límite inferior y un límite superior considerados aceptables, a priori, por el
laboratorio. Si el intervalo de confianza cae totalmente dentro del rango aceptable, los dos procedimientos pueden considerar-
se equivalentes, ya que la diferencia promedio entre ellos es insignificante en la práctica. El límite inferior y el superior del inter-
valo de confianza sólo muestran el tamaño de la posible diferencia real entre los dos procedimientos y no si la diferencia se
considera tolerable. Dicha evaluación sólo puede realizarse dentro del contexto científico adecuado. Este enfoque a menudo se
denomina Pruebas Unilaterales Dobles (TOST, por sus siglas en inglés; ver Apéndice 6).
El método del intervalo de confianza que se acaba de describir es preferible a la aplicación de una prueba t para evaluar la
significancia estadística de la diferencia en promedios. Una manera de realizar la prueba tes calculando el intervalo de confian-
za y examinando si contiene o no el valor cero. Los dos procedimientos muestran una diferencia estadísticamente significativa
en promedios si el intervalo de confianza excluye el valor cero. Una diferencia estadísticamente significativa puede no tener
una magnitud suficiente para tener importancia práctica en el laboratorio ya que puede haber surgido de datos muy precisos o
de una muestra de un tamaño mayor. Por otra parte, es posible que no se encuentre ninguna diferencia estadísticamente sig-
nificativa, lo cual ocurre cuando el intervalo de confianza incluye el valor cero y, de todas maneras, no puede descartarse una
diferencia práctica importante. Esto podría ocurrir, por ejemplo, si los datos son muy variables o si el tamaño de la muestra es
demasiado pequeño. En consecuencia, si bien el resultado de la prueba t indica si se ha observado o no una diferencia estadís-
ticamente significativa, no determina la presencia o ausencia de una diferencia de importancia práctica.

Determinación del Tamaño de la Muestra

La determinación del tamaño de la muestra se basa en la comparación de la exactitud y precisión de los dos procedimien-
tos3 y es similar al método utilizado para evaluar la hipótesis acerca de diferencias de promedio y relaciones de varianza, res-
pectivamente, aunque el significado de algunos de los datos es diferente. El primer componente que se debe especificar es 8,
la diferencia aceptable más grande entre los dos procedimientos que, si se logra, permite llegar a una conclusión de equivalen-
cia. Es decir, si los dos procedimientos difieren en no más de 8, en el promedio, se consideran aceptablemente similares. La
comparación puede ser bilateral como se acaba de expresar, considerando una diferencia de 8 en cualquier dirección, como
cuando se comparan medias. Alternativamente, puede ser unilateral, como cuando se comparan varianzas, en cuyo caso es
deseable una reducción en la variabilidad y se considera que los métodos son equivalentes si la relación entre las varianzas
(método nuevo/método vigente como una proporción) no es más de 1,0 + 8. El investigador deberá especificar el 8 basándose
en el conocimiento del procedimiento vigente y/o en su uso, o bien puede calcularlo. Un factor que se debe tener en cuenta
cuando hay que cumplir con ciertas especificaciones es que el nuevo procedimiento no debe diferir demasiado del procedi-
miento vigente para que no se generen resultados fuera de la especificación. En estos casos, se elige un 8 que represente una
baja probabilidad de que esto ocurra, por ejemplo, comparando la distribución de datos para el procedimiento vigente con los
límites de especificación. Esto puede hacerse gráficamente o usando un intervalo de tolerancia, del que se incluye un ejemplo
en el Apéndice 5. En general, la elección de 8 depende de los requisitos científicos del laboratorio.
Los dos componentes siguientes se refieren a la probabilidad de error. Los datos podrían llevar a una conclusión de similitud
cuando los procedimientos son inaceptablemente diferentes (según lo definido por el 8). Esto se llama falso positivo o error de
Tipo l. El error también podría darse en sentido opuesto, es decir, los procedimientos podrían ser similares pero los datos no
permiten esa conclusión. Esto se llama falso negativo o error de Tipo 11. Con los métodos estadísticos, no es posible eliminar
completamente la posibilidad de cualquiera de estos errores. No obstante, al elegir bien el tamaño de la muestra, la probabili-
dad de cada uno de estos errores puede reducirse aceptablemente. La probabilidad máxima aceptable de un error de Tipo 1
comúnmente se denomina a y suele considerarse del orden del 5%, pero puede elegirse otro valor. La probabilidad máxima
deseada de un error de Tipo 11 comúnmente se denomina f3. Con frecuencia, f3 se especifica indirectamente eligiendo un nivel
deseado de 1 - f3, que se denomina la "potencia" de la prueba. En el contexto de pruebas de equivalencia, la potencia es la
probabilidad de concluir correctamente que dos procedimientos son equivalentes. Normalmente, se toma una potencia del
orden del 80% o 90% (correspondiente a un f3 de 20% o 10%), aunque pueden elegirse otros valores. El protocolo para el
experimento debe especificar el 8, el a y la potencia. El tamaño de la muestra depende de todos estos componentes. Se inclu-
ye un ejemplo en el Apéndice 5. Aunque el Apéndice 5 sólo determina un valor único, suele ser útil determinar una tabla de
tamaños de muestras para diferentes opciones de 8, a y potencia. Dicha tabla permite una elección mejor fundamentada del
tamaño de la muestra para equilibrar mejor los recursos y los riesgos (conclusiones falsamente negativas y falsamente positi-
vas).

3 En general, el tamaño de la muestra requerido para comparar la precisión de dos procedimientos es mayor que el requerido para comparar su exactitud.
USP 40 Información General/ (101 O) Datos Analíticos 907

APÉNDICE

Apéndice 1: Gráficas de Control

La Figura 7 muestra una gráfica de control para valores individuales. Existen varios métodos diferentes para calcular el límite
de control superior (UCL, por sus siglas en inglés) y el límite de control inferior (LCL, por sus siglas en inglés). Un método
utiliza el intervalo móvil, que se define como la diferencia absoluta entre dos mediciones consecutivas (x; - x,_ 1). Estos interva-
los móviles se promedian (MR) y se usan en las siguientes fórmulas:

x
en donde es la media de la muestra y d2 es una constante comúnmente usada para este tipo de gráfica, que está basada en
el número de observaciones asociadas con el cálculo del intervalo móvil. Cuando n = 2 (dos mediciones consecutivas), como
aquí, d2 =1,128. Para el ejemplo de la Figura 1, el MR era de 1,7:

UCL=102,0+3 1\~ =106,5 8

LCL=102,0-3 1 \~ =97,5 8
Existen otros métodos que permiten detectar mejor pequeñas variaciones en la media del proceso, como la suma acumulativa
(también conocida como "CUSUM") y el intervalo móvil exponencialmente ponderado ("EWMA").

-------------- ------------- UCL = 106,5

-ro 105
::J
-o
:2'.
-o
e
~ Media= 102,0
'-
º
~100

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - LCL = 9 71 5

o 50 100
Número de Observación

Fig. 1. Gráfica de control para cada X o mediciones individuales de muestras de control. En este ejemplo particular, la media
de todas las muestras (X) es 102,0, el UCL es 106,5 y el LCL es 97,5.

Apéndice 2: Estudio de Precisión

La Tabla 7 muestra datos obtenidos de un estudio de precisión. En este estudio se hicieron cinco análisis independientes y,
dentro de cada análisis, se obtuvieron los resultados de tres determinaciones repetidas.
Tabla 1. Datos de un Estudio de Precisión
Nº del Análisis
Nº de la Repetición 1 2 3 4 5
1 100,70 99,46 99,96 101,80 101,91
2 101,05 99,37 100,17 102,16 102,00
3 101,15 99,59 101,01 102,44 101,67
Media 100,97 99,47 100,38 102,13 101,86
Desviación Estándar 0,236 0,111 0,556 0,321 0,171
o/oRSDª 0,234% 0,111% 0,554% 0,314% 0,167%
ª %RSD (desviación estándar relativa porcentual)= 100% x (desviación estándar/media)
908 (1 01 O) Datos Analíticos / Información General USP 40

Tabla lA. Tabla de Análisis de Varianza para los Datos Presentados en la Tabla 1
Fuente de Grados de Libertad Suma de Cuadrados Cuadrados Mediosª
Variación (df) (SS) (MS) f = MSR/MSw
Entre Análisis 4 14,200 3,550 34,886
lntra-análisis 10 1,018 0,102
Total 14 15,217
ª Los Cuadrados Medios Entre (MS 6) = SSEntreldf¡ntre y los Cuadrados Medios lntra (MSw) = SS 1ntraldf1ntra
Un análisis de varianza (ANOVA) con los datos de la Tabla 1 genera la tabla ANOVA (Tabla 1A). Como había un número
igual de determinaciones repetidas por análisis en el estudio de precisión, los valores de VarianzaAnálisis y VarianzaRep pueden
conseguirse directamente de la tabla ANOVA. Las siguientes ecuaciones calculan la variabilidad asociada con los análisis y las
determinaciones repetidas, donde MSintra representa el cuadrado medio de "error" o "intra-análisis" y MSentre representa el cua-
drado medio "entre análisis".

VarianzaRep = MSintra =O, 102

Varianza MSentre - MSintra 3,550-0,102 1, 149

Análisis Nº repeticiones
por análisis 3

[NOTA-Una práctica común consiste en utilizar un valor de O para VarianzaAnálisis cuando el valor calculado es negativo]. Las
estimaciones también pueden obtenerse con determinaciones repetidas desiguales, pero las fórmulas son más complejas. Mu-
chos programas de software estadístico pueden manejar fácilmente determinaciones repetidas desiguales. Es importante estu-
diar la magnitud relativa de los dos componentes de la varianza cuando se diseña e interpreta un estudio de precisión. El cono-
cimiento adquirido puede enfocarse en cualquier esfuerzo de mejoramiento del procedimiento continuo y, lo más importante,
se puede utilizar para asegurar que los procedimientos tienen la capacidad de respaldar los usos para los que están destinados.
Al definir cuidadosamente lo que constituye un resultado (es decir, un valor informable), se está aprovechando el poder de
promediar, con lo que se puede lograr prácticamente cualquier precisión deseada. Esto significa que, al basar el valor de infor-
me en un promedio a través de determinaciones repetidas y/o análisis, en vez de en un solo resultado, es posible reducir la
%RSD y hacerlo de manera predecible.
La Tabla 2 muestra la varianza computada y la %RSD de la media (es decir, del valor de informe) para diferentes combina-
ciones de número de análisis y número de determinaciones repetidas por análisis, usando las siguientes fórmulas:

Varianza de la media =
VarianzaAnalisis Varianza Rep
---~=+-------~---

(Nºde análisis) (Nº de anál)(Nºde rep. por anál.)

Desviación estándar de la media= .Jvarianza de la media

RSD = Desviación estándar de la media x 1OO%
Promedio de todos los resultados

Por ejemplo, la Varianza de la media, Desviación estándar de la media y %RSD de una prueba de dos análisis y tres determina-
ciones repetidas por cada análisis son 0,592; 0,769 y 0,76%, respectivamente, según se indica a continuación.

Varianza de la media= 1•149 + 1 2 =0 592

2 (2·3) •
º· º
Desviación estándar de la media= .J0,592 =0, 769

RSD = (0,769/l 00,96) X 100% = 0,76%

en donde 100,96 es la media para todos los datos en la Tabla 1. Como se muestra en la Tabla 2 aumentar el número de análi-
sis de uno a dos permite obtener una reducción más importante en la variabilidad del valor de informe que aumentar el núme-
ro de determinaciones repetidas por análisis.
No se hicieron suposiciones de distribución sobre los datos de la Tabla 1 ya que el propósito de este Apéndice es mostrar los
cálculos en un estudio de precisión.
Tabla 2. El Impacto Previsto del Plan de Prueba (Nº de Análisis y Nº de Determinaciones Repetidas por Análisis) sobre la Precisión
de la Media
Nº de
Nº de Determinaciones Repe- Varianza Desviación Estándar
Análisis tidas por Análisis de la Media de la Media % RSDª
1 1 1,251 1, 118 1,11
ª La o/oRSD se calculó utilizando un valor de la media de 100,96 (como divisor), basado en los 15 puntos de datos presentados en la Tabla 1.
USP 40 Información General/ (101 O) Datos Analíticos 909

Tabla 2. El Impacto Previsto del Plan de Prueba (Nº de Análisis y Nº de Determinaciones Repetidas por Análisis) sobre la Precisión
de la Media (Continuación)
Nº de
Nº de Determinaciones Repe- Varianza Desviación Estándar
Análisis tidas por Análisis de la Media de la Media % RSDª
1 2 1,200 1,095 1,09
1 3 1,183 1,088 1,08
2 1 0,625 0,791 0,78
2 2 0,600 0,775 0,77
2 3 0,592 0,769 0,76
ª La o/oRSD se calculó utilizando un valor de la media de 100,96 (como divisor), basado en los 15 puntos de datos presentados en la Tabla 1.

Cambio en la redacción:

Apéndice 3: Ejemplos de Pruebas de Resultados Aberrantes para Datos Analíticos

Considerando el siguiente conjunto de 1O mediciones: 100,0; 100, 1; 100,3; 100,0; 99,7; 99,9; 100,2; 99,5; 100,0 y 95,7
(media = 99,5, desviación estándar= 1,369), ¿hay algún resultado aberrante?

PRUEBA DE DESVIACIÓN ESTUDENTIZADA EXTREMA (ESD) GENERALIZADA

Esta prueba es una versión modificada de la Prueba ESD que permite analizar hasta un número previamente especificado, r,
de resultados aberrantes de una población normalmente distribuida. Para la detección de un solo resultado aberrante (r = 1),
el procedimiento de ESD generalizado también se conoce como prueba de Grubb. No se recomienda la prueba de Grubb para
la detección de múltiples resultados aberrantes. Supongamos que res igual a 2 y que n es igual a 1O.
Etapa 1 (n = 1O): Normalizar cada resultado restando la media de cada valor y dividiendo esta diferencia por la desviación
estándar (ver la Tabla 3). 4
Tabla 3. Resultados de la Prueba ESD Generalizada
n = 10 n=9
Datos Normalizados Datos Normalizados
100,3 +0,555 100,3 +1,361
100,2 +0,482 100,2 +0,953
100,1 +0,409 100,1 +0,544
100,0 +0,336 100,0 +0,136
100,0 +0,336 100,0 +0,136
100,0 +0,336 100,0 +0,136
99,9 +0,263 99,9 -0,272
99,7 +0,117 99,7 -1,089
99,5 -0,029 99,5 -1,905
95,7 -2,805
Media= 99,54 99,95
SD = 1,369 0,245

Tomar el valor absoluto de estos resultados, seleccionar el valor máximo (R 1 = 2,805), y compararlo con un valor crítico ta-
bulado, previamente especificado, A. 1 (2,290) basado en el nivel de significancia seleccionado (por ejemplo, 5%). El valor máxi-
mo es más grande que el valor tabulado y se determina que no concuerda con los datos restantes. Las fuentes de los valores A,
se incluyen en muchos textos de estadística. Las tablas estadísticas deben usarse con cautela para asegurarse de utilizar las no-
taciones correctas (es decir, el nivel de error aceptable) cuando se extraen los valores de la tabla.
Etapa 2 (n = 9): Eliminar la observación correspondiente al resultado normalizado absoluto máximo del conjunto de datos
originales, de modo tal que n sea ahora igual a 9. Nuevamente, determinar la media y desviación estándar (Tabla 3, las dos
columnas de la derecha), normalizar cada valor y tomar el valor absoluto de estos resultados. Determinar el máximo de los
valores absolutos de los 9 resultados normalizados (R 2 = 1,905), y compararlo con A.2 (2,215). El valor máximo no es mayor
que el valor tabulado.
Conclusión: El resultado de la primera etapa, 95,7, se declara resultado aberrante, pero el resultado de la segunda etapa,
99,5, no es un resultado aberrante.

4 La diferencia entre cada valor y la media se denomina residual. Existen otras pruebas de resultados aberrantes residuales estudentizados donde el residual, en
lugar de dividirse por la desviación estándar, se divide por la desviación estándar multiplicada por la raíz cuadrada de n - 1 dividido por n.
91 O (101 O) Datos Analíticos / Información General USP 40

PRUEBAS TIPO ÜIXON

La Prueba de Dixon puede ser unilateral o bilateral, dependiendo de si se decide con anterioridad que únicamente se consi-
derarán resultados aberrantes en uno de los lados. Al igual que con la prueba de ESD, la Prueba de Dixon supone que los
datos, en ausencia de resultados aberrantes, provienen de una sola población normal. Siguiendo la estrategia usada para la
prueba de ESD, se procede como si no se hubiera tomado una decisión a priori en relación con uno de los lados y se utiliza
una Prueba de Dixon bilateral. A partir del análisis de los datos del ejemplo, se observa que los dos más pequeños son los que
se examinarán como resultados aberrantes. La Prueba de Dixon permite el análisis de dos resultados aberrantes de manera
simultánea; sin embargo, estos procedimientos están más allá del alcance de este Apéndice. El procedimiento por pasos que se
discute a continuación no es un procedimiento exacto para realizar una prueba para el segundo resultado aberrante, ya que el
resultado de la segunda prueba depende del primero. Debido a que el tamaño de la muestra también se reduce en la segunda
etapa, el resultado final es un procedimiento que no suele tener la sensibilidad de los procedimientos exactos de Dixon.
Etapa 1 (n = 1O): Los resultados se ordenan según su magnitud (es decir, Xn es la observación más grande, Xn es la segunda
observación más grande, etc., y X1 es la observación más pequeña). Las relaciones de la Prueba de Dixon se basan en el tama-
ño de la muestra (en este ejemplo, n = 1 O); para declarar que X1 es un valor aberrante, se calcula la relación, r 11 , según la
fórmula siguiente:

Se utilizaría otra relación si el dato más grande se analiza como resultado aberrante. El resultado r 11 se compara con un valor
r 11 , 0, 05 en una tabla de valores críticos. Si r 11 es mayor que r 11 ,. 0, 05 , se declara que es un resultado aberrante. Para el conjunto de
datos anterior, r 11 = (99,5 - 95,7)/(100,2 - 95,7) = 0,84. Esta relación es mayor que r 11 ,. 0, 05 , que es 0,52979 al nivel de signifi-
cancia del 5% para una Prueba de Dixon bilateral. Las fuentes de los valores r 11 ,. 0, 05 se incluyen en muchos textos de estadísti-
ca.5
Etapa 2: Eliminar la observación más pequeña del conjunto de datos original, de modo que n ahora sea 9. Se utiliza la mis-
ma ecuación r 11 , pero se requiere un nuevo valor crítico r 11 , o.os para n = 9 r 11 ,. 0, 05 = 0,56420). Ahora r 11 = (99,7 - 99,5)/(100,2 -
99,5) = 0,29, que es menor que r 11 ,. 0, 05 y no es significativo al nivel del 5%.
Conclusión: Por lo tanto, 95,7 se declara como resultado aberrante, mientras que 99,5 no es un resultado aberrante.

REGLA DE HAMPEL

Paso 7-EI primer paso para aplicar la Regla de Hampel es normalizar los datos. No obstante, en lugar de restar la media de
cada dato y dividir la diferencia por la desviación estándar, se resta la mediana de cada dato y las diferencias resultantes se
dividen por la MAD (ver a continuación). El cálculo de MAD se realiza en tres etapas. En primer lugar, se resta la mediana de
cada dato. A continuación, se obtienen los valores absolutos de las diferencias, que se denominan desviaciones absolutas. Por
último, se calcula la mediana de las desviaciones absolutas y se multiplica por la constante 1,483 para obtener la MAD. 6
Paso 2-EI segundo paso es tomar el valor absoluto de los datos normalizados. Cualquier resultado mayor que 3,5 se decla-
ra como un resultado aberrante. La Tabla 4 resume los cálculos.
El valor de 95,7 vuelve a identificarse como un resultado aberrante. Luego, este valor puede extraerse del conjunto de datos
y volver a aplicarse la Regla de Hampel a los datos restantes. La tabla resultante aparece como la Tabla 5. Al igual que en los
ejemplos anteriores, 99,5 no se considera un resultado aberrante.
Tabla 4. Resultados de la Prueba Usando la Regla de Hampel
n = 10
Desviaciones
dela Desviaciones Normalizadas
Datos Mediana Absolutas Absolutas
100,3 0,3 0,3 1,35
100,2 0,2 0,2 0,90
100, 1 o, 1 o, 1 0,45
100 o o o
100 o o o
100 o o o
99,9 -0, 1 o, 1 0,45
99,7 -0,3 0,3 1,35
99,5 -0,5 0,5 2,25

s Los valores críticos para r en este ejemplo se toman de la Referencia 2 en Apéndice 7, Pruebas de Resultados Aberrantes.
6 Suponiendo una distribución normal subyacente, 1,483 es una constante utilizada de modo que la MAD resultante es un estimador uniforme de la desviación

estándar de la población. Esto significa que a medida que aumenta el tamaño de la muestra, MAD se acerca a la desviación estándar de la población.
USP 40 Información General/ (101 O) Datos Analíticos 911

Tabla 4. Resultados de la Prueba Usando la Regla de Hampel (Continuación)

n = 10
Desviaciones
dela Desviaciones Normalizadas
Datos Mediana Absolutas Absolutas
95,7 -4,3 4,3 19,33
Mediana= 100 o, 15
MAD= 0,22

Tabla 5. Resultados de la Prueba Reutilizando la Regla de Hampel

n=9
Desviaciones
dela Desviaciones Normalizadas
Datos Mediana Absolutas Absolutas
100,3 0,3 0,3 2,02
100,2 0,2 0,2 1,35
100,1 0,1 0,1 0,67
100 o o o
100 o o o
100 o o o
99,9 -0,1 0,1 0,67
99,7 -0,3 0,3 2,02
99,5 -0,5 0,5 3,37
Mediana= 100 0,1
MAD= •0,15. FRRfíl1-0Ct-2016\

Apéndice 4: Comparación de Procedimientos-Precisión

El siguiente ejemplo muestra el cálculo de un intervalo de confianza del 90% para la relación de varianzas (verdaderas) a fin
de comparar la precisión de dos procedimientos. Se supone que la distribución subyacente de las mediciones de la muestra
está bien caracterizada por distribuciones normales. Para este ejemplo, supongamos que el laboratorio aceptará el procedi-
miento alternativo si su precisión (medida por la varianza) no es más de cuatro veces mayor que la del procedimiento vigente.
Para determinar el tamaño de muestra adecuado para la precisión, existe un método de tanteos sucesivos utilizando la si-
guiente fórmula:

donde n es el tamaño de muestra más pequeño requerido para proporcionar la potencia deseada, que es la probabilidad de
afirmar correctamente que el procedimiento alternativo tiene una precisión aceptable cuando los dos procedimientos realmen-
te tienen la misma precisión; a es el riesgo de afirmar erróneamente que el procedimiento alternativo tiene una precisión acep-
table; y 4 es el límite superior permitido para un aumento en la varianza. Los valores F se encuentran en tablas comúnmente
disponibles de valores críticos de la distribución F. Fa, n _1, n _1 es el percentil a superior de una distribución Fcon numerador n
- 1 y denominador de n - 1 grados de libertad; es decir, el valor excedido con la probabilidad a. Supongamos inicialmente
que el laboratorio estimó necesario un tamaño de muestra de 11 por procedimiento (1 Ogrados de libertad para el numerador
y el denominador); el cálculo de la potencia sería el siguiente: 7

Pr [F > 1/4Fa, n - l, n _1] = Pr [F > 1/4Fo,os; 10: 10 ] = Pr [F > (2,978/4)] = 0,6751

En este caso, la potencia fue de sólo 68%; es decir, aunque los dos procedimientos tenían varianzas exactamente iguales, con
sólo 11 muestras por procedimiento, existe solamente una probabilidad de 68% de que el experimento lleve a datos que per-
mitan concluir que la varianza ha aumentado no más de cuatro veces. Lo más común es elegir un tamaño de muestra que
tenga una potencia de al menos 80% y en algunos casos de 90% o más. Para determinar el tamaño de muestra adecuado,
pueden probarse diversos números hasta encontrar una probabilidad que exceda el límite aceptable (p.ej., potencia> 0,90).
Por ejemplo, la determinación de la potencia para tamaños de muestra de 12-20 se muestran en la Tabla 6. En este caso, la
suposición inicial de un tamaño de muestra de 11 no fue adecuada para comparar la precisión, pero 15 muestras por procedí-

7 Esto podría calcularse usando una planilla de cálculo de computadora. Por ejemplo, en Microsoft® Excel la fórmula sería: FDIST((R/A)*FINV(alfa, n - 1, n - 1 ), n -
1, n - 1), donde Res la relación de varianzas a las que se determina la potencia (p.ej., R = 1, que fue el valor escogido en los cálculos de potencia provistos en la
Tabla 6) y A es la relación máxima para aceptación (p.ej., A= 4). Alfa es el nivel de significancia, normalmente 0,05.
912 (101 O) Datos Analíticos / Información General USP 40

miento proporcionarían un tamaño de muestra lo suficientemente grande para una potencia del 80%, o 20 por procedimiento
para una potencia del 90%.
Tabla 6. Determinaciones de Potencia para Diferentes Tamaños de Muestras (Específicas para el Ejemplo del Apéndice 4)
Tamaño de la Muestra Pr[F > '!• Foo<·n- l·n-11

12 0,7145
13 0,7495
14 0,7807
15 0,8083
16 0,8327
17 0,8543
18 0,8732
19 0,8899
20 0,9044

Típicamente, el tamaño de la muestra para las comparaciones de precisión debe ser mayor que para las comparaciones de
exactitud. Si el tamaño de la muestra para comparar la precisión es demasiado grande y no es factible llevar a cabo el estudio
en el laboratorio, existen algunas opciones. La primera es reconsiderar la elección de un aumento permitido en la varianza.
Para aumentos mayores permitidos en la varianza, el tamaño de la muestra requerida para una potencia fija es más pequeño.
Otra alternativa es planificar un análisis intermedio con un tamaño de muestra más pequeño, con la posibilidad de continuar
con un tamaño de muestra más grande, si fuera necesario. En este caso, es muy recomendable buscar ayuda profesional de un
experto en estadística.
Supongamos ahora que el laboratorio opta por una potencia de 90% y obtiene los resultados presentados en la Tabla 7
basados en los datos generados con 20 análisis independientes por procedimiento.
Relación =varianza del procedimiento alternativo/varianza del procedimiento vigente= 45,0/25,0 = 1,8
Límite inferior del intervalo de confianza= relación/~ 05 = 1,8/2, 168 = 0,83

Límite superior del intervalo de confianza = relación/ ~ 95 = 1,8/0,461 = 3,90

Tabla 7. Ejemplo de Mediciones de Varianza para Análisis Independientes (Específicos para el Ejemplo del Apéndice 4)
Varianza Tamaño de la Grados de
Procedimiento (desviación estándar) Muestra Libertad
Alternativo 45,0 (6,71) 20 19
Vigente 25,0 (5,00) 20 19

Para esta aplicación, se utiliza un intervalo de confianza del 90% (bilateral) cuando se busca una prueba unilateral del 5%.
Esta prueba es unilateral ya que sólo importa el aumento en la desviación estándar del procedimiento alternativo. Hay que
tomar algunas precauciones al usar intervalos bilaterales de esta manera, ya que deben tener colas iguales-los intervalos más
comunes tienen esta propiedad. Como el límite de confianza superior unilateral, 3,90, es inferior al límite permitido,4,0, el es-
tudio ha demostrado que el procedimiento alternativo tiene una precisión aceptable. Si se hubieran obtenido los mismos resul-
tados de un estudio con un tamaño de muestra de 15-como si se hubiera elegido una potencia del 80%-el laboratorio no
hubiera podido concluir que el procedimiento alternativo tiene una precisión aceptable (límite de confianza superior de 4,47).

Apéndice 5: Comparación de Procedimientos-Determinación de la Máxima Diferencia

Aceptable, o, Entre Dos Procedimientos

Este Apéndice describe un método para determinar la diferencia, 8, entre dos procedimientos (alternativo-vigente), diferen-
cia que, si se logra, también permite concluir que dos procedimientos son equivalentes. Si no existe otra información previa
que guíe al laboratorio en la elección del 8, ésta es una manera razonable de proceder. En este Apéndice se describen los cál-
culos del tamaño de la muestra en diferentes situaciones.

DETERMINACIÓN DEL INTERVALO DE TOLERANCIA

Suponer que no se conocen la media ni la desviación estándar del proceso, pero una muestra de tamaño 50 produjo una
media y una desviación estándar de 99,5 y 2,0, respectivamente. Estos valores se calcularon usando los últimos 50 resultados
generados por este procedimiento específico para una muestra (de control) en particular. Con esta información, pueden calcu-
larse los límites de tolerancia según la siguiente fórmula:
USP 40 Información General/ (1 01 O) Datos Analíticos 91 3

x
en donde es la media, s es la desviación estándar, y K se basa en el nivel de confianza, la proporción de resultados a capturar
en el intervalo y el tamaño de la muestra, n. Hay disponibles Tablas que proporcionan los valores de K. En este ejemplo, el
valor de K requerido para incluir el 95% de la población con una confianza del 95% para 50 muestras es de 2,382. 8 Los límites
de tolerancia se calculan de la siguiente manera:

99,5 ± 2,382 X 2,0

en consecuencia, el intervalo de tolerancia es de (94,7; 104,3).

COMPARACIÓN DE LOS LÍMITES DE TOLERANCIA CON LOS LÍMITES DE LA ESPECIFICACIÓN

Supongamos que el intervalo especificado para este procedimiento es de (90,0; 110,0) y que la media y la desviación están-
dar del proceso no han cambiado desde que se estableció este intervalo. Pueden definirse las siguientes cantidades: el límite
inferior de la especificación (LSL, por sus siglas en inglés) es 90,0; el límite superior de la especificación (USL, por sus siglas en
inglés) es 110,0; el límite de tolerancia inferior (LTL, por sus siglas en inglés) es 94,7 y el límite de tolerancia superior (UTL, por
sus siglas en inglés) es 104,3. Calcular la diferencia aceptable, (8), de la siguiente manera:
A= LTL- LSL para LTL ¿ LSL
(A= 94,7 - 90,0 = 4,7);
B = USL - UTL para USL ¿ UTL

(B = 110,0 - 104,3 = 5,7); y

--A--
90,0
8 =mínimo (A, B) = 4,7

94,7
--s-
104,3 110,0
Figura 2. Gráfica de los valores calculados anteriormente.

Con esta opción de 8 y suponiendo que los dos procedimientos tienen una precisión comparable, el intervalo de confianza
para la diferencia en medias obtenidas con los dos procedimientos (alternativo-vigente) debe encontrarse entre -4,7 y +4,7
para afirmar que no existe ninguna diferencia importante entre los dos procedimientos.
Los laboratorios analíticos de control de calidad a veces utilizan límites de tolerancia del 99%, en cuyos casos el intervalo es
mayor. Usando el ejemplo anterior, el valor de K requerido para incluir el 99% de la población con una confianza del 99% para
50 muestras es de 3,390. Los límites de tolerancia se calculan de la siguiente manera:

99,5 ± 3,390 X 2,0

El intervalo de tolerancia más amplio resultante es de (92,7; 106,3). De la misma manera, el nuevo LTL de 92,7 y UTL de 106,3
producirían un 8 más pequeño:

A= LTL - LSL para LTL ¿ LSL

(A= 92,7 - 90,0 = 2,7);
B = USL - UTL para USL ¿ UTL

(B = 110,0 - 106,3 = 3,7); y

8 = mínimo (A, B) = 2,7

Aunque un fabricante puede elegir cualquier 8 que funcione adecuadamente para la determinación de equivalencia, la elec-
ción de un 8 más grande, aún cuando lleva a un n más pequeño, presenta el riesgo de una pérdida de capacidad para la discri-
minación entre procedimientos.

TAMAÑO DE LA MUESTRA

Existen fórmulas que pueden utilizarse para un 8 específico, suponiendo que se conocen las varianzas de la población y que
son iguales, para calcular el número de muestras que se debe analizar por procedimiento, n. El nivel de confianza y la potencia
también deben especificarse. [NOTA-Potencia se refiere a la probabilidad de llegar a la conclusión correcta de que dos proce-
dimientos idénticos son equivalentes.] Por ejemplo, si 8 = 4,7 y se supone que las varianzas de las dos poblaciones son iguales

8 Existen tablas de factores de tolerancia que indican los valores aproximados y, en consecuencia, difieren ligeramente de los valores aquí informados.
 914 (101 O) Datos Analíticos / Información General USP 40

a 4,0; entonces, para una prueba de un nivel del 5% 9 y una potencia del 80% (con los correspondientes valores z de 1,645 y
1,282, respectivamente), el tamaño de la muestra aproximado se calcula según la siguiente fórmula:

n 2'. 2 (4 )2 (1,645 + 1,282) 2 =3,10

(4,7)

En consecuencia, suponiendo que cada procedimiento tiene una varianza poblacional, cr 2 , de 4,0, el número de muestras, n,
requerido para concluir con una probabilidad de 80% de que los dos procedimientos son equivalentes (el intervalo de confian-
za del 90% para la diferencia en las medias verdaderas se encuentra entre -4,7 y +4,7) cuando, en realidad, son idénticos (la
diferencia de medias verdadera es cero) es 4. Como se utilizó la distribución normal en la fórmula anterior, 4 es en realidad un
límite inferior en el tamaño de muestra requerido. Si es factible, podría convenir un tamaño de muestra más grande. Los valo-
res de z para niveles de confianza comunes se presentan en la Tabla 8. La fórmula anterior se basa en tres suposiciones: 1) la
varianza usada en el cálculo del tamaño de la muestra se basa en una cantidad de datos previos suficientemente grande que
pueden tratarse como conocidos; 2) se utiliza la varianza conocida previa en el análisis del nuevo experimento, o el tamaño de
la muestra para el nuevo experimento es lo suficientemente grande como para que la distribución normal sea una buena apro-
ximación a la distribución t; y 3) el laboratorio está seguro de que no existe ninguna diferencia real en las medias, que es el
caso más optimista. No es común que se den estas tres suposiciones. La fórmula anterior debe tratarse con más frecuencia
como una aproximación inicial. Las desviaciones de estas tres suposiciones conlleva la necesidad de utilizar un tamaño de
muestra más grande. En general, se recomienda recurrir a alguna persona familiarizada con los métodos necesarios.
Tabla 8. Valores Comunes para una Distribución Normal Estándar
Valores z
Nivel de Confianza Unilateral (a) Bilateral (a/2)
99% 2,326 2,576
95% 1,645 1,960
90% 1,282 1,645
80% 0,842 1,282

Cuando se requiere una transformación logarítmica para lograr la normalidad, la fórmula de tamaño de la muestra debe
ajustarse ligeramente según se indica a continuación. En lugar de formular los problemas con respecto a la varianza de la po-
blación y la diferencia aceptable más grande, o, entre los dos procedimientos, ahora se formula con respecto a la %RSD de la
población y la diferencia proporcional aceptable más grande entre los dos procedimientos.

en donde

<Tf = log((%RSD/100) 2 + 1)

o~=(log(p+1))2
yp representa la diferencia proporcional aceptable más grande entre los dos procedimientos(alternativo-vigente)/(vigente) y
se supone que las o/oRSDs de la población son conocidas e iguales.

Apéndice 6: Análisis de Equivalencia y Pruebas Unilaterales Dobles

En un análisis estadístico clásico de hipótesis, existen dos hipótesis, la nula y la alternativa. Por ejemplo, la hipótesis nula
puede indicar que dos medias son iguales, entonces la hipótesis alternativa indicaría que difieren. Con este enfoque clásico, se
rechaza la hipótesis nula en favor de la alternativa si la evidencia contra la hipótesis nula es suficiente. Un error común es inter-
pretar la incapacidad de rechazar la hipótesis nula como evidencia de que dicha hipótesis es verdadera, cuando en realidad la
incapacidad de rechazar la hipótesis nula sólo quiere decir que la evidencia contra ésta no fue suficiente. Por ejemplo, el proce-
dimiento usado podría tener una variabilidad demasiado alta o el número de determinaciones ser demasiado pequeño.
La consecuencia de esta interpretación es que, cuando se busca demostrar la similitud, como en el caso de la comparación
de los resultados obtenidos por dos laboratorios, es necesaria la similitud como hipótesis alternativa. La prueba estadística que
emplea la similitud como hipótesis alternativa recibe el nombre de análisis de equivalencia. Es importante entender que "equi-

9 Cuando se analiza la equivalencia, una prueba de nivel del 5% corresponde a un intervalo de confianza del 90%.
USP 40 Información General/ (1 01 O) Datos Analíticos 915

valencia" aquí no significa "igualdad". La equivalencia debe entenderse como "suficientemente similar" para la necesidad de
los dos laboratorios. Tal como se indicó anteriormente en este capítulo, el nivel de similitud que se considera suficiente es un
aspecto que debe decidirse con antelación.
Como ejemplo específico, supóngase que se está interesado en comparar resultados promedio, como cuando se transfiere
un procedimiento de un laboratorio a otro. (Dicha aplicación probablemente también incluiría una comparación de precisión;
ver el Apéndice 4.) Se debe definir con antelación que la diferencia entre las medias no debe ser mayor que un valor positivo, 8,
para que los resultados promedio puedan considerarse equivalentes o suficientemente similares. (El Apéndice 5 provee reco-
mendaciones para la selección de 8.) Entonces, las hipótesis son:
Alternativa (H 7): 1µ 1 - µ21::; 8
Nula (H 0 ): 1µ 1 - µ21 > 8
donde µ 1 y µ 2 son las dos medias que se están comparando.
El enfoque de pruebas unilaterales dobles (TOST, por sus siglas en inglés) consiste en convertir las hipótesis de equivalencia
anteriores en dos hipótesis unilaterales. La justificación es que es posible determinar 1µ 1 - µ21::;8 siempre y cuando se puedan
demostrar tanto

En su condición de pruebas unilaterales, se pueden tratar como pruebas-t unilaterales estándar. Para que la prueba de las
hipótesis de equivalencia tenga el nivel a, ambas pruebas unilaterales deben realizarse al nivel a (por lo regular, aunque no
necesariamente, 0,05). A menudo, la prueba unilateral doble se lleva a cabo usando un intervalo de confianza. En este caso, se
rechaza la hipótesis nula en favor de la hipótesis de equivalencia si el intervalo de confianza bilateral 100(1 - 2a)% está com-
pletamente contenido en (-8, +8). Éste es el enfoque descrito anteriormente en la sección Exactitud.

Apéndice 7: Fuentes de Información Adicionales

Es posible utilizar una gran variedad de pruebas estadísticas para evaluar un conjunto de datos. Este capítulo presenta varias
pruebas que permiten interpretar y manejar datos analíticos, pero pueden emplearse muchas otras pruebas semejantes. En es-
te capítulo simplemente se ilustra el análisis de datos usando métodos estadísticamente aceptables. Como se menciona en la
Introducción, las pruebas específicas se incluyen con fines ilustrativos únicamente y USP no avala ninguna de estas pruebas co-
mo único método para el tratamiento de los datos analíticos. Puede encontrarse información adicional y pruebas alternativas
en las referencias enumeradas a continuación o en muchos textos de estadística.
Gráficas de Control:
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916 (1 01 O) Datos Analíticos / Información General USP 40

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Computation, 1978; 7: 183-201.
USP 40 Información General/ (1 015) Aparatos Automatizados de Síntesis Radioquímica 91 7

Eliminar lo siguiente:

. . (1015) APARATOS AUTOMATIZADOS DE SÍNTESIS RADIOQUÍMICA

La preparación y el control de calidad de radiofármacos de diagnóstico marcados con nucleidos de vida media muy corta
que emiten positrones (p.ej., 15 0, nN, 11 C y 18F cuyas vidas medias son de 2, 1O, 20 y 11 O minutos, respectivamente}, están
sujetos a restricciones diferentes de las que se aplican a los fármacos de uso terapéutico: (1) La síntesis debe ser rápída, aunque
se deben tomar medidas para proteger al químico o al farmacéutico de la excesiva exposición a la radiación. (2) Excepto en un
grado limitado para el 18F, la síntesis debe producirse en el momento del uso. (3) A excepción del 18F, cada partida de radiofár-
macos generalmente se dirige a una sola administración.
Estos factores aumentan la importancia del control de calidad del producto farmacéutico final con relación a la. validación
del proceso de síntesis. Dado que cada dosis se prepara de forma individual, salvo contadas excepciones, lo ideal sería que
cada dosis fuera sometida a pruebas de control de calidad de pureza radioquímica y otros aspectos de calidad esenciales antes
de su administración. Debido a que no es posible realizar el control de calidad de cada partida, se seleccionan partidas a inter-
valos regulares para establecer y caracterizar completamente su pureza radiofarmacéutica. Esta prueba de calidad rutinaria y
rig.urosa de las partidas seleccionadas constituye la base de la validación del proceso, que es absolutamente esencial. para la
evaluación anticipada de la calidad y pureza de las partidas cuando se trata de radiofármacos de vida mecfü~ extremadamente
corta. Puesto que los radiofármacos empleados en tomografía por emisión de positrones (TEP) se administran por vía intrave-
nosa o (en el caso de gases radioactivos) por inhalación, la variabilidad entre partidas, en relacíón con la biodisponibilidad, no
constituye un problema. Es más, la síntesis en muy pequeña escala de radiofármacos (casi siempre menos de 1 miligramo y a
menudo dentro del rango de los mkrogramos) y el hecho de que los pacientes generalmente reciben sólo un!l dosis únic~ de
fármaco radioactivo reducen al mínimo la posibilidad de administrar cantidades nocivas de impurezas químicas. Estas afirma-
ciones no intentan rebatir la necesidad del control de calidad en el manejo de equipos automatizados de síntesis, sino colocar
la fabricación de radiofármacos que emiten positrones en una perspectiva adecuada y enfatizar una vez más la enorme impor-
tancia de la validación anticipada de procesos y el control de calidad del producto terminado.
La síntesis de rutina de radiofármacos puede exponer al personal a dosis innecesariamente altas de radiación. Los dispositi-
vos automatizados de síntesis radioquímica se han ideado, en parte, para cumplir con el concepto de reducir las exposiciones
del personal a la radiación ,,hasta el menor grado razonablemente posible" (AlARA, del inglés "as low as reasonably achieva-
ble"). Estos dispositivos automatizados de síntesis pueden ser más precisos y eficaces que los métodos manuales existentes.
Dichos métodos automatizados son particularmente útiles cuando una síntesis radioquímica requieremanipulacionesrepetiti·
vas y uniformes a diario.
Los productos de estos dispositivos automatizados de radiosíntesis deben cumplir Jos mismos criterios de garantía de calidad
que los productos obtenidos mediante síntesis manual convencional. En el caso de radiofármacos que emiten positrones, estos
criterios incluyen muchas de las mismas determinaciones que se usan para los radiofármacos utilizados en medicina nuclear
convencional, por ejemplo, pruebas de esterilidad y de endotoxinas bacterianas. Se aplican muchas de las mismas limitaciones.
En general, no se pueden aplicar los procedimientos típicos, como por ejemplo la espectroscopia, debido a que la cantidad de
producto es tan pequeña que cae debajo del nivel de detección mínima del método. En todos los casos, ~I método farmaco-
peico aplicable es el árbitro decisivo (ver Procedimiento en Pruebas y Valoraciones en las Advertencias Generales).
La preparación de la Inyección de Fludesoxiglucosa F 18 y otros radiofármacos que emiten positrones se puede adaptar fácil-
mente a la síntesis automatizada. En general, el equipo necesario para los métodos manuales es más sencillo y menos costoso
que el que se emplea en los métodos automatizados, pero requiere mayor trabajo. Son de particular interés los métodos rela-
cionados con la validación del rendimiento correcto de un aparato automatizado. En un procedimiento manual, la interven·
ción humana y la corrección mediante inspección pueden evitar muchos errores de procedimiento. En un sistema automatiza-
do, la retroalimentación eficaz también puede comenzar durante la síntesis. Por ejemplo, los detectores de radiación pueden
controlar la actividad en varias etapas de la radiosíntesis. Cuando no se logra la actividad adecuada se puede activar un si.stema
de alarma que conduce a la intervención humana.
Radioquímicos frente a Radiofármacos-Se debe establecer una distinción. entre un radioquímico y el radiofármaco co-
rrespondiente. En los centros de investigación de TEP, los equipos automatizados se emplean para preparar compuestos mar-
cados para experimentos con animales. Estos radioquímicos no se consideran radiofármacos si (1) no están preparados de
acuerdo a un proceso validado que proporcione un alto grado de seguridad y garantice que la preparación cumpla todos los
requisitos establecidos de calidad y pureza; y (2) no han sido certificados por personal calificado (farmacéuticos y médicos au·
torizados) de conformidad con los métodos farmacopeicos publicados para los radiofármacos individuales.
Equipo Automati;zado-Las consideraciones que se hacen en este capítulo corresponden a la síntesis que se lleva a cabo
mediante robots de uso general y aparatos especiales. Ambos son dispositivos automatizados que se emplean en la síntesis de
radioquímicos. El método exacto de control de los dispositivos de síntesis es variable. Tanto los dispositivos de síntesis contro-
lados electrónicamente como los controlados por programas informáticos caen dentro de la designación general y tienen .un
espectro que varía desde el equipo manual tradicional, pasando por dispositivos semiautomatizados, hasta dispositivos com-
pletamente automáticos.
918 (1 015) Aparatos Automatizados de Síntesis Radioquímica / Información General USP 40
USP 40 Información General/ (1024) Suero Bovino 919

Cambios: en el Método de Síntesis-:Algunos cambios en los aparatos de síntesis se pueden considerar no significativos. A
menudo, esta categoría incluye cambios que no afectan a ninguno de los parámetros cóntrolados. Sin embargo, es importante
tener cuidado para garantizar que los cambios que parecen inofensivos no tengan un efecto inesperado. Por ejemplo, cambios
en una línea de comentario de un programa informático pueden provocar un cambio inadvertido o.la eliminación de una. ins-
trucción importante. Cualquier cambio en los parámetros controlados puede cambiar .el resultado del proceso. Si el radioquí-
mico resúltante no cumple con las especificaciones o si el radiofármaco posterior no satisface los criterios farmacopeicos1 el
cambio del proceso es inaceptable; se debe corregir la falla y volver a validar el proceso...,usMo

(1024) SUERO BOVINO

INTRODUCCIÓN
El suero bovino es la fracción líquida de la sangre coagulada de buey (Bos taurus, entre otras especies), de la que se han
eliminado células, fibrina y factores de coagulación. Desde la aparición del cultivo celular moderno, los fabricantes de produc-
tos biológicos han usado ampliamente el suero bovino como suplemento de crecimiento para cultivos celulares. Su composi-
ción altamente nutricional de proteínas, factores de crecimiento, hormonas, aminoácidos, vitaminas, azúcares, lípidos, oligoe-
lementos y demás componentes sustenta una amplia gama de aplicaciones de cultivo celular para la investigación y fabrica-
ción comercial de vacunas, productos biológicos de origen natural y recombinantes (en lo sucesivo, productos biológicos), teji-
dos obtenidos por ingeniería y otros productos celulares terapéuticos destinados para uso humano o veterinario. El Suero Fetal
Bovino (FBS, por sus siglas en inglés) es el tipo predominante de suero usado en las aplicaciones de investigación. El suero de
ternero (de animales recién nacidos o mayores) se usa con mucho menor frecuencia, aunque por su bajo costo, sería amplia-
mente usado en la fabricación comercial.
Al igual que con otros productos de origen animal, el suero bovino conlleva el riesgo potencial de introducir agentes extra-
ños en el cultivo celular. Los fabricantes de suero y reguladores deben adoptar procedimientos rigurosos de obtención y análi-
sis, además de estrictas guías de procesamiento y producción para asegurar la calidad del suero bovino.
Con el objetivo de incrementar la calidad y seguridad de los productos biológicos producidos con suero bovino, y de mitigar
las exigencias reglamentarias, los desarrolladores han investigado alternativas a la suplementación con suero, lo que ha resulta-
do en formulaciones de medios exentos de suero para aplicaciones específicas. Aunque se reconoce que debe evitarse el uso
de suero bovino siempre que exista la opción de emplear medio exento de suero, hay casos en los que resulta técnicamente
imposible o poco práctico.
Este capítulo describe cuestiones relacionadas con la obtención, producción y caracterización de suero bovino para asegurar
su uso seguro. El Apéndice 7 presenta una lista de guías y documentos reglamentarios pertinentes. Los fabricantes de suero y
los usuarios finales de suero (fabricantes de productos biológicos) deben considerar y aplicar, según se requiera, los controles y
procedimientos establecidos en este capítulo para asegurar el uso seguro de componentes de suero bovino en la investigación
y fabricación farmacéutica.

Tipos de Suero Bovino

• El suero fetal bovino (FBS) se obtiene de fetos, previo al parto, de hembras reproductoras bovinas sanas que se consideran
aptas para consumo humano mediante inspección ante y postmortem realizada por veterinarios autorizados. El suero se
recolecta en mataderos sujetos a inspección y registro gubernamental.
• El suero de ternero recién nacido (también conocido como suero de bovino recién nacido) se obtiene de animales con
una edad menor de 20 días en mataderos sujetos a inspección y registro gubernamental.
• El suero de ternero se obtiene de animales con una edad entre 20 días y 12 meses en mataderos sujetos a inspección y
registro gubernamental.
• El suero de bovino donante (también conocido como suero de ternero donante) se obtiene mediante el sangrado repeti-
do de animales donantes pertenecientes a manadas donantes controladas, y sujetas a inspección y registro gubernamen-
tal. Los animales tienen entre 12-36 meses de edad.
• El suero de bovino adulto se obtiene de ganado con una edad mayor de 12 meses que se declara apto para consumo
humano en mataderos sujetos a inspección y registro gubernamental.

SUERO BOVINO: HISTORIA Y TIPOS DE USOS

Historia del Uso de Suero Bovino

El suero animal y demás materiales biológicos complejos se han empleado durante aproximadamente 100 años en el cultivo
de células de mamíferos. Fueron varios los factores que llevaron a la adopción de suero bovino como suplemento estándar
920 (1024) Suero Bovino/ Información General USP 40

para el cultivo de tejidos. En comparación con el suero de otras especies animales (caballo, cabra), el suero bovino se obtiene
fácilmente por lo que resulta más económico. Muchos investigadores deciden usar suero fetal en sus sistemas experimentales
debido a las inquietudes relacionadas con anticuerpos presentes en suero de recién nacido y de adulto que podrían provocar
una reacción cruzada con las células en cultivo y ocasionar lisis celular mediada por complemento. A fin de terminar con tales
inquietudes, se comenzó a usar calor para inactivar el complemento potencialmente presente en el suero. Los estudios de FBS
realizados en la década de 1950 en el cultivo de células humanas de baja densidad para dilucidar mecanismos de crecimiento
celular demostraron que (1) el componente albúmina puede actuar como portador de moléculas pequeñas esenciales; (2) la
fetuína, una glicoproteína que se presenta en altos niveles en la fracción alfa globulina, facilita la adhesión y extensión celular;
y (3) la fetuína inhibe considerablemente la tripsina, y tal actividad antiproteolítica puede jugar un papel en la capacidad de la
fetuína para estimular el crecimiento celular.
Durante las décadas de 1960 y 1970, la suplementación con suero de los medios de cultivo de tejidos se convirtió en una
práctica normal, lo que facilitó tanto la investigación biomédica como los primeros procesos de fabricación de vacunas a gran
escala. La suplementación con suero redujo la necesidad de optimizar las formulaciones de medios para diferentes tipos de
células. Además, se demostró que el FBS proporcionaba una variedad de factores de crecimiento polipeptídicos. Presuntamen-
te, la albúmina promovía el crecimiento celular debido a sus capacidades para funcionar como proteína portadora de molécu-
las pequeñas o lípidos, para unir iones metálicos, para servir como amortiguador del pH, y para proteger a las células de la
ruptura. Asimismo, se encontraron funciones similares en otros componentes del suero como transferrina, hormonas y otros
factores de adhesión derivados del suero como fibronectina, vitronectina y laminina.

Usos del Suero Bovino

El suero es una mezcla compleja de macromoléculas requerida para el crecimiento celular y la producción de virus, y su uso
como materia prima presenta diversos retos, entre los que se incluyen su composición lote a lote y el riesgo de contaminación
por agentes adventicios. El desarrollo de medios exentos de suero ha reemplazado al suero en algunas aplicaciones biotecnoló-
gicas nuevas de fabricación; sin embargo, muchas líneas celulares usadas en la fabricación aún no han sido adaptadas a estos
medios exentos de suero. Las restricciones reglamentarias y los retos científicos por lo general vuelven poco práctico alterar los
procesos de fabricación existentes en los que se usa suero como materia prima.
En ocasiones, el FBS es necesario para el bioprocesamiento de células y tejidos, lo cual a menudo implica el cultivo de células
provenientes de explantes y biopsias de tejidos. Además, para algunos procesos biológicos puede ser necesario mantener ca-
racterísticas celulares específicas durante el cultivo. El FBS a menudo parece facilitar tales procedimientos y puede afectar el
comportamiento biológico de los tipos de células exigentes (fastidious cells). Se ha demostrado que el FBS afecta la transcrip-
ción de genes importantes para el desarrollo, la apoptosis y la expresión génica relacionada con la apoptosis, además de que
proporciona factores neuroprotectores y antioxidantes, todo lo cual puede ser beneficioso para la supervivencia y el desarrollo
de células en cultivo. Por lo tanto, el FBS seguirá jugando un papel importante como suplemento para cultivos celulares en la
producción de terapias celulares y de tejidos.
En la mayoría de los procesos de fabricación de vacunas de virus los medios usados para la expansión de cultivos celulares y
la infección/producción de virus se suplementan con diferentes tipos de suero a diversas concentraciones. En estos procesos, el
suero bovino ayuda a generar una masa de células en un estado fisiológico óptimo para una replicación viral eficiente.

RECOLECCIÓN V PRODUCCIÓN DE SUERO BOVINO

Recolección de Sangre

Para todos los tipos de suero bovino, la sangre se debe recolectar en instalaciones sujetas a inspección y registro guberna-
mental (mataderos y granjas de donantes). La sangre debe ser recolectada por operarios capacitados siguiendo los procedi-
mientos escritos aprobados por el fabricante de suero y usando dispositivos de recolección desechables para un sólo uso o
equipo de recolección reutilizable que cuente con procedimientos de limpieza validados.

SUERO DE BOVINO DONANTE

Para cada lote de suero de animales donantes, los fabricantes de suero deben asegurar la rastreabilidad a la manada donante
mediante registros de producción y certificados de salud y de origen de los animales. Los animales donantes están sujetos a
inspecciones veterinarias regulares y se les desangra varias veces siguiendo los procedimientos establecidos. Debe ser posible
rastrear a los animales introducidos a la manada por origen, raza e historial de crianza. Los recolectores deben introducir nue-
vos animales a la manada siguiendo procedimientos especificados y aprobados que incluyen inspección y análisis del animal
previos a la compra, transporte adecuado, un periodo de cuarentena, examen y análisis veterinario durante el periodo de cua-
rentena y criterios de liberación de los animales en cuarentena para la producción del suero. Los recolectores no deben vacu-
nar a los animales donantes contra la diarrea viral bovina (DVB). Los recolectores deben someter los animales a análisis para
determinar la presencia de cualquier agente y anticuerpo de los que se declara estar exenta la manada.
USP 40 Información General/ (1024) Suero Bovino 921

SUERO DE TERNERO RECIÉN NACIDO, SUERO DE TERNERO Y SUERO DE BOVINO ADULTO

Los certificados de salud y de origen de los animales y/o los registros de producción de suero deben asegurar que los fabri-
cantes de suero puedan rastrear el origen del suero bovino derivado de animales sacrificados hasta el matadero. Los fabricantes
de suero deben requerir que los mataderos mantengan la documentación del origen de los animales para sacrificio. La sangre
se debe recolectar de animales que hayan sido sacrificados para consumo humano en mataderos inspeccionados por la autori-
dad competente del país de origen. Los inspectores deben inspeccionar a los animales de manera rutinaria tanto antemortem
como postmortem para verificar clínicamente la presencia de infecciones y enfermedades parasitarias, además de otros proble-
mas o condiciones relacionados con la salud de los animales. Los animales deben estar exentos de evidencia clínica de enfer-
medades infecciosas al momento del sacrificio. Deben implementarse procedimientos de recolección sanguínea que preven-
gan la contaminación cruzada con otros tejidos y fluidos corporales y el ambiente aledaño. El procedimiento de sacrificio es-
tándar consiste en un método aprobado de aturdimiento del animal seguido de desangrado.

SUERO FETAL BOVINO

Las especificaciones de producto y los procedimientos de análisis para FBS se presentan en el capítulo general propuesto
Suero Fetal Bovino-Atributos de Calidad y Pruebas de Funcionalidad (90). Los fabricantes de suero deben recolectar la sangre
fetal bovina a partir de fetos bovinos provenientes de hembras reproductoras que hayan sido sacrificadas. Las hembras repro-
ductoras deben ser declaradas aptas para consumo humano y deben haber sido sacrificadas en mataderos inspeccionados por
la autoridad competente del país de origen. Los inspectores deben examinar a todos los animales tanto antemortem como
postmortem para verificar clínicamente la presencia de infecciones y enfermedades parasitarias, además de otros problemas o
condiciones relacionados con la salud de los animales. Los animales deben estar exentos de evidencia clínica de enfermedades
infecciosas al momento del sacrificio. El útero debe extraerse y transportarse a un espacio dedicado para recolección de sangre
fetal bovina, en donde el personal de recolección sanguínea evalúa el feto para detectar signos de muerte fetal, que incluyen
hinchazón, decoloración de la piel, olor, deformación, y caída del pelaje. Asimismo, los recolectores deben verificar el color, la
cantidad y la claridad del fluido amniótico. Los fabricantes de suero deben recolectar la sangre de fetos aceptables mediante
punción cardíaca en un sistema cerrado de recolección en condiciones diseñadas para minimizar la contaminación microbiana.
Los fabricantes deben implementar procedimientos que prevengan la contaminación cruzada con otros tejidos fetales y fluidos
corporales y el ambiente aledaño.

Recolección y Procesamiento del Suero

La separación (recolección) del suero y demás actividades de procesamiento deben ser realizadas por personal capacitado
siguiendo procedimientos escritos y aprobados. El suero primero se separa y combina, y luego se filtra y deposita en envases
limpios y desinfectados. Si el suero se somete a uno o más tratamientos de inactivación viral en el proceso de producción, los
fabricantes de suero deben validar los procesos de inactivación viral contra una gama de virus pertinentes. Se recomienda in-
cluir al virus de la diarrea viral bovina (VDVB) en cualquier estudio de validación viral debido a que este virus es ubicuo.

SEPARACIÓN Y RECOLECCIÓN DEL SUERO

El procesamiento de sangre bovina y la separación (recolección) del suero deben realizarse en una manera que minimice la
contaminación bacteriana y micoplasmática, lo cual a su vez minimiza los niveles de endotoxinas en el producto del suero. El
procesamiento cuidadoso y rápido de la sangre ayuda a minimizar la hemólisis, lo que mejora aún más la calidad del producto
del suero. Después de la recolección, primero se deja que la sangre coagule durante un periodo específico y en condiciones
controladas, y luego se centrifuga en una centrífuga refrigerada. Posteriormente, el suero se separa del coágulo, generalmente
por centrifugación, se combina y mezcla en un recipiente de combinación, se transfiere a envases etiquetados, y se congela, a
menos que se esterilice inmediatamente por filtración. Los fabricantes de suero deben describir cada etapa del proceso y reali-
zar las actividades de procesamiento del suero, incluyendo la recolección de muestras y las pruebas de control de calidad du-
rante el proceso, siguiendo los procedimientos aprobados del fabricante.

COMBINACIÓN DE SUEROS ANTES DEL FILTRADO

Debido a la limitada cantidad de sangre que se puede recolectar de cada animal, los fabricantes de suero combinan el suero
bruto de muchos animales para crear lotes de tamaño comercial. Después de descongelar el suero bruto y antes de la filtra-
ción, el suero se combina en un recipiente de combinación y se mezcla a una velocidad y temperatura controladas. Las combi-
naciones o lotes de suero de bovino donante pueden consistir en muchas recolecciones separadas de miembros individuales
de la manada. Los lotes de FBS pueden consistir en el suero combinado de miles de animales. Los fabricantes de suero deben
describir cada etapa del proceso de combinación de sueros previa al filtrado y deben realizar la descongelación del suero, la
combinación previa al filtrado y las actividades de mezclado siguiendo los procedimientos aprobados del fabricante.
922 (1024) Suero Bovino/ Información General USP 40

FILTRACIÓN

El suero combinado se mezcla y se pasa asépticamente a través de filtros con un tamaño de poro de 0,2 µm o menor, de-
pendiendo de la aplicación prevista. Deben validarse los procesos de filtración. Se ha demostrado que la filtración triple usando
filtros con un tamaño de poro de 0, 1 µm resulta en un alto grado de eliminación de micoplasmas. Aunque la filtración puede
eliminar algunos virus de gran tamaño y agregados virales del suero, los virus generalmente no pueden eliminarse por comple-
to mediante esta técnica. Además, no se ha demostrado que los filtros eliminen el agente causante de la encefalopatía espon-
giforme bovina (BSE, por sus siglas en inglés). Después de la filtración, los fabricantes de suero llenan envases estériles con el
suero filtrado mediante procesamiento aséptico en un ambiente adecuadamente controlado. Los fabricantes de suero deben
describir cada etapa del proceso de filtración y deben realizar las actividades de filtrado, llenado y recolección de muestras de
suero siguiendo los procedimientos aprobados del fabricante.

RADIACIÓN

El tratamiento del suero por radiación gamma es muy común y representa uno de los métodos más efectivos de inactivación
viral. La dosis mínima usada con más frecuencia es de 25 kilograys (kGy). Algunos países especifican requerimientos de dosis
mayores (>30 kGy) para suero importado. La radiación gamma puede inactivar virus, micoplasma y bacterias, pero los usuarios
finales del suero deben asegurarse de que el proceso de radiación gamma no afecte negativamente sus aplicaciones específi-
cas. La radiación puede tener efectos adversos sobre la calidad del suero, los cuales tienden a incrementarse a mayores dosis.
La validación de la radiación gama presenta dos aspectos: (1) la administración de la dosis en una configuración de carga
definida y (2) la capacidad de inactivación. Los parámetros críticos del proceso de radiación incluyen la temperatura del pro-
ducto (suero), el tamaño y la configuración del envasado, la distribución de dosímetros y la dosis mínima/máxima definida de
radiación recibida. Los dosímetros deben usarse para monitorear las posiciones de dosis alta y dosis baja en cada aplicación de
radiación. Si el fabricante de suero declara haber realizado inactivaciones, éstas deben estar sustentadas mediante estudios de
inactivación viral bien diseñados por el mismo fabricante.

TRATAMIENTO ULTRAVIOLETA (uv)

Los fabricantes de suero pueden usar tratamiento UV para inactivar virus, micoplasmas y bacterias, sin embargo deben vali-
dar el proceso para demostrar su eficacia. Además, los fabricantes deben ser conscientes de que el tratamiento UV puede tener
un efecto adverso sobre la calidad del suero y por consiguiente deben considerar los efectos del tratamiento UV para cada
aplicación, como deben hacerlo también los usuarios finales del suero.

INACTIVACIÓN CON CALOR

La inactivación con calor implica elevar la temperatura del suero a >56º durante al menos 30 minutos para inactivar el com-
plemento. La inactivación con calor también puede inactivar virus, micoplasmas y bacterias, aunque puede tener un efecto
adverso sobre la calidad del suero, por lo que los fabricantes deben validar la aptitud del procedimiento para aplicaciones es-
pecíficas. En comparación con la radiación, la inactivación con calor proporciona una garantía de inactivación significativamen-
te menor.

ESTUDIOS DE DEPURACIÓN VIRAL

El capítulo general Evaluación de la Seguridad Viral en Productos Biotecnológicos Obtenidos de Líneas Celulares de Origen Huma-
no o Animal (1050) y otros documentos reglamentarios proporcionan guías sobre la realización de estudios de depuración viral
que ayudan a validar los procesos de eliminación/inactivación. Los fabricantes de suero deben también realizar estudios forma-
les con agregado (spiking) de virus pertinentes y representativos (modelo), y deben analizar y comparar muestras de suero con
virus agregado e inactivado, controles negativos y controles positivos.

TRATAMIENTO CON CARBÓN

Algunos fabricantes de suero usan tratamientos con carbón/dextrano para reducir los niveles de hormonas del suero.

DIÁLISIS

Algunos fabricantes utilizan diálisis o diafiltración para eliminar componentes de bajo peso molecular del suero.
USP 40 Información General/ (1024) Suero Bovino 923

LIMPIEZA Y ESTERILIDAD DEL EQUIPO

Las tuberias y sistemas de acero inoxidable usados en la fabricación de suero bovino deben limpiarse y esterilizarse para pre-
venir la contaminación cruzada y el crecimiento de agentes adventicios. Los fabricantes de suero deben validar sus procesos de
limpieza para la eliminación e inactivación de agentes de interés. Posteriormente, los fabricantes deben implementar controles
de proceso que verifiquen de manera rutinaria los ciclos de limpieza. La esterilización por vapor en el sitio (sterilization-in-pla-
ce) es una técnica de esterilización común y efectiva. Los fabricantes de suero que usan esta tecnología deben validar los ciclos
de vapor para demostrar su uniformidad y capacidad para destruir esporas bacterianas resistentes al calor. Los fabricantes pue-
den, alternativamente, usar sistemas desechables estériles que no requieren de validación de limpieza.

Control de Calidad

RASTREABILIDAD

Recolección en Mataderos: Los materiales recolectados en EE.UU. deben obtenerse de instalaciones registradas en el De-
partamento de Agricultura de EE.UU. (USDA, por sus siglas en inglés). Los fabricantes de suero deben conservar documenta-
ción que permita rastrear un sublote de suero específico hasta el matadero donde se recolectó. Los mataderos mantienen re-
gistros del origen del animal. La práctica industrial general es conservar esta información como parte del Registro Maestro del
Dispositivo (DMR, por sus siglas en inglés). Los requisitos generales de conservación de registros en mataderos autorizados por
el USDA se citan en el Título 9 del Código de Reglamentaciones Federales (en lo sucesivo CFR, por sus siglas en inglés) 320.
Los materiales recolectados en países aprobados por el USDA para la importación de productos bovinos a EE.UU. deben
cumplir con los requisitos de la autoridad competente del país de origen. Además, los fabricantes de suero deben conservar
registros de análisis de seguridad requeridos por el USDA para materiales importados (si fuera requerido) como parte de su
Registro Histórico del Dispositivo (DHR, por sus siglas en inglés).
Los fabricantes de suero deben consultar el Título 9 del CFR 309 y el Título 9 del CFR 31 O con respecto a los requisitos de
inspección de animales para diversas enfermedades antes y después del sacrificio. Se recomienda cumplir con tales requisitos
para materiales recolectados fuera de EE.UU.
Recolección en Manadas Donantes: Los fabricantes de suero deben mantener la rastreabilidad hasta la granja de anima-
les donantes en la que se recolectó la sangre de los animales donantes. En la mayoría de los casos, los fabricantes de suero
identifican de manera individual a los animales de la granja y conservan registros sobre las fechas de sangrado y procesamien-
to, lo que permite rastrear la recolección sanguínea hasta un animal en particular. Los animales deben ser inspeccionados con
regularidad por un veterinario autorizado o individuo designado bajo la guía de un veterinario, quienes deben certificar que los
animales están libres de enfermedades y son aptos para consumo humano, de conformidad con el Título 9 del CFR 309.

ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD DEL PRODUCTO

El suero debe almacenarse en estado de congelación a una temperatura de -1 Oº o menor. El suero se congela tan rápido
como sea posible para preservar la calidad del producto y se almacena en condiciones controladas de almacenamiento. Los
fabricantes de suero deben establecer la estabilidad del producto del suero para respaldar la fecha de caducidad propuesta. La
fecha de caducidad típica para el suero bovino es de 5 años a partir de la fecha de filtración y envasado. El uso de cualquier
tipo de suero bovino después de la fecha de caducidad indicada depende de la aplicación y el usuario del suero debe estable-
cer la aptitud continua del producto para su uso.

Etiquetado

Las etiquetas del producto terminado deben contener la siguiente información: descripción del producto, número de lote,
condiciones de almacenamiento, nombre y dirección del fabricante y una declaración que indique el uso previsto. Los materia-
les destinados para propósitos de investigación están exentos de las reglamentaciones de etiquetado (Título 21 del CFR 801 ).
Por lo general, los fabricantes de suero proporcionan un Certificado de Análisis (COA, por sus siglas en inglés) específico del
lote, el cual se clasifica como parte del etiquetado del producto. Ver los requisitos para el COA en la sección siguiente.

Certificación/Documentación

CERTIFICADO DE ANÁLISIS

El COA debe proveer información sobre un lote de suero específico, incluidas las pruebas realizadas y los resultados de las
mismas (de acuerdo con las especificaciones de liberación del fabricante del suero), así como los identificadores críticos del
etiquetado tales como número de lote, número de catálogo, descripción del tipo de suero bovino, país de origen y fecha de
fabricación o caducidad, o ambas. Este documento es distinto al certificado de salud emitido por la autoridad competente del
país de origen.
924 (1024) Suero Bovino/ Información General USP 40

CERTIFICADO DE ORIGEN Y CERTIFICADO DEL ESTADO DE SALUD DEL ANIMAL

El Certificado de Origen establece el país en el que se recolectó la sangre bovina, así como la certificación veterinaria de la
salud de los animales antes y después de la recolección (Título 9 del CFR 327.4).

DOCUMENTOS DE IMPORTACIÓN/EXPORTACIÓN

Los documentos de importación/exportación incluyen una certificación formal del estado de las enfermedades animales en
el país de origen y las disposiciones de certificación negociadas/acordadas, las cuales varían de país a país. Cada país define sus
requisitos de importación/exportación a fin de controlar la introducción de enfermedades animales exóticas y su impacto eco-
nómico, así como evaluaciones de seguridad del producto (riesgo vs. investigación, diagnóstico y/o beneficios terapéuticos).

INFORMES DE PRODUCCIÓN

Los informes de producción son generalmente registros de partidas que documentan las materias primas de manera identifi-
cable y rastreable, métodos de producción (centrifugación o filtración) usados en la fabricación, limpieza de equipo e instala-
ciones, pruebas de control de calidad y personal que realiza las actividades requeridas. La materia prima con Certificados de
Origen o registros de producción de suero facilita la rastreabilidad hasta el origen de la sangre que se usó para crear el suero.
Cuando se usa suero como una materia prima para fabricación, la documentación del proceso también ayuda a demostrar la
fabricación controlada del suero bovino.

EVALUACIÓN DE RIESGO DE BSE

A pesar del bajo potencial de riesgo de encefalopatías espongiformes transmisibles (TSE, por sus siglas en inglés) en el suero
bovino, diversas agencias reguladoras de EE.UU. e internacionales han desarrollado guías para ayudar a manejar y reducir aún
más los riesgos potenciales de transmisión. Ante la ausencia de métodos de prueba apropiados para detectar al agente infec-
cioso en fluidos como la sangre, la recomendación acordada por varias agencias reguladoras es adoptar buenas estrategias de
evaluación de riesgos. Esta sección del capítulo proporciona algunos antecedentes de la enfermedad y los métodos de detec-
ción vigentes; además señala estrategias de evaluación de riesgos y de reducción de riesgos para prevenir potencialmente la
transmisión de la enfermedad a través del uso de suero en la fabricación de productos medicinales.

Descripción de la Enfermedad

Las TSE son enfermedades animales y humanas transmisibles que se caracterizan por una degeneración del cerebro, relacio-
nada con severos signos y síntomas neurológicos. Debido a las epidemias de TSE en ganado bovino, denominadas BSE, las
cuales se transmitieron a otras especies, los funcionarios de salud pública están preocupados por el riesgo de infección de TSE,
incluida la posibilidad de transmisión de TSE por el uso de productos terapéuticos que se fabrican usando suero bovino. Se han
encontrado titulos bajos en el fluido cerebroespinal, pulmón, tejido linfático, bazo, riñón, hígado e íleon del ganado bovino
infectado con BSE. Los estudios han demostrado que la transfusión sanguínea a partir de una oveja infectada con BSE o prurito
lumbar pero sin enfermedad evidente puede infectar a una oveja que no ha sido expuesta previamente a la infección. Aunque
siempre está presente el riesgo de contaminación cruzada, a la fecha, ningún estudio ha demostrado que la enfermedad pue-
de transmitirse a partir de la sangre de ganado bovino con BSE. Los embriones de ganado bovino afectado por BSE no han
transmitido enfermedades a ratones. Los terneros nacidos de hembras reproductoras que recibieron embriones de ganado bo-
vino afectado por BSE han sobrevivido por hasta 7 años, y el examen practicado a los cerebros de las hembras reproductoras
no afectadas y de sus crías no revelaron encefalopatía espongiforme.

Estrategias de Detección

Ninguno de los procedimientos actualmente disponibles cuenta con una sensibilidad validada que sea suficiente para llevar a
cabo la detección antemortem en animales asintomáticos, aunque se encuentran en desarrollo métodos analíticos para la de-
tección y cuantificación en materiales de baja infectividad como la sangre. La prueba clásica de diagnóstico para TSE es el exa-
men histológico postmortem de tejido cerebral para confirmar la característica degeneración vacuolar. Otras opciones de aná-
lisis incluyen pruebas inmunohistoquímicas que pueden confirmar la presencia de PrPSc, la conformación anormal específica
para la enfermedad de la proteína priónica (PrP), en las regiones vacuoladas del cerebro; y pruebas inmunoquímicas como
transferencias Western y enzimoinmunoensayos que pueden detectar PrPSc en tejidos con titulos altos o moderadamente al-
tos. Estas pruebas generalmente toman menos tiempo que el examen histológico (6-8 horas vs. semanas, respectivamente) y
se pueden automatizar parcial o totalmente. Aunque muchas de éstas pruebas son postmortem, los estudios han demostrado
la viabilidad de las pruebas antemortem de muestras de tejido linfoide obtenido de las amígdalas o de la membrana nictitante
de animales infectados. Las pruebas inmunoquímicas requieren de una extensa recolección y preparación de muestras y pue-
den ser demasiado caras para emplearse como pruebas y monitoreos de rutina de la enfermedad en manadas grandes. Las
USP 40 Información General/ (1024) Suero Bovino 925

estrategias de diagnóstico deben considerar la sensibilidad del análisis en ciertos tejidos, así como la capacidad de la prueba
para detectar la infectividad en los animales antes del desarrollo de signos clínicos de enfermedad. Los resultados negativos no
aseguran la ausencia de infectividad. La detección de infectividad es posible si se inocula el tejido sospechoso en animales ex-
perimentales intracranealmente donde el agente causante puede amplificarse. Esta metodología de detección de baja infectivi-
dad puede tomar desde meses hasta años para arrojar un resultado positivo.

Estrategias de Evaluación y Reducción de Riesgos

Los fabricantes de suero deben emplear estrategias de reducción de riesgos para eliminar el peligro de contaminación cruza-
da de sangre fetal con otros tejidos, que incluyan la obtención apropiada de artículos de origen animal y el uso de prácticas
que han demostrado eliminar o minimizar el riesgo de transmisión de TSE mediante productos alimenticios o para el cuidado
de la salud. Los usuarios finales del suero deben realizar una evaluación de riesgos relacionada con su estrategia de obtención
del material en la que se considere la cantidad de suero bovino usada en su aplicación, y deben realizar auditorías a los provee-
dores para asegurar la rastreabilidad del origen, manejo y sistemas de control de calidad apropiados.

ORIGEN Y EDAD DE LOS ANIMALES

Los fabricantes de suero deben monitorear la rastreabilidad de cada lote de suero para asegurar la calificación del suero bovi-
no, según se describió previamente en las secciones Recolección y Procesamiento del Suero y Control de Calidad. Además de la
rastreabilidad, la selección cuidadosa de materiales de origen es el criterio más importante para la seguridad de los productos
medicinales. La certificación de origen debe estar disponible por parte del proveedor y los fabricantes deben conservar esta
información en sus archivos. Las recomendaciones de la Administración de Alimentos y Medicamentos de EE.UU. (FDA, por sus
siglas en inglés) prohíben el uso en productos regulados por la FDA (con excepción de la gelatina) de cualquier material bovi-
no originario de países con casos reportados de BSE autóctona. La regla vigente propuesta califica al FBS como una fuente
improbable de material infeccioso de BSE, puesto que la evidencia actual sugiere que la transmisión de BSE de la vaca al terne-
ro es poco probable. La regla propuesta indica además que los materiales de ganado bovino prohibidos no incluyen materiales
derivados de fetos de terneros provenientes de vacas inspeccionadas y aprobadas, siempre que los materiales se hayan obteni-
do mediante procedimientos que puedan prevenir la contaminación con materiales de riesgo especificados. Para productos
biológicos veterinarios, los reglamentos vigentes aplicados por el Centro de Productos Biológicos Veterinarios del USDA (US-
DA's Center for Veterinary Biologics o CVB) indican que los ingredientes de origen animal deben obtenerse de países sin o con
un riesgo bajo de BSE, según lo definido por el Centro Nacional de Importaciones y Exportaciones de EE.UU. y el Título 9 del
CFR 94.18.
Las fuentes de materiales más satisfactorias provienen de países con las siguientes características:
• Sin casos reportados de BSE autóctona
• Notificación obligatoria de pruebas positivas
• Verificación obligatoria clínica y en el laboratorio de casos sospechosos
• Prohibición de uso de harina de carne y huesos que contengan proteínas de animales rumiantes como fuente alimenta-
ción de animales rumiantes
• Sin importación de ganado bovino de países donde se haya presentado una alta incidencia de BSE
• Sin importación de progenie de hembras afectadas
La infectividad de la BSE puede incrementarse con la edad del animal. Aunque el suero bovino se considera un material de
bajo riesgo de transmisión de TSE, algunos usuarios finales consideran prudente obtener el suero a partir de hembras repro-
ductoras menores de una edad máxima establecida. Si los fabricantes no pueden determinar la fecha de nacimiento de la
hembra reproductora, deben considerar tanto la fecha de implementación de la prohibición alimentaria en el país de origen y
el periodo de incubación de BSE a fin de determinar la seguridad de la fuente. En julio de 1988 se impuso una prohibición
alimentaria para animales rumiantes en el Reino Unido. Estas consideraciones son específicas del lote, por lo que las auditorías
del proveedor de materia prima deben incluir una revisión de los registros.

PROCESO DE PRODUCCIÓN

El usuario final debe contar con sistemas de fabricación para monitorear el proceso de producción y para delinear la partida
(definición de partida, separación de partidas y limpieza entre partidas). El control de contaminación cruzada potencial con
material posiblemente infeccioso es de primera importancia. Debido a la resistencia documentada de los agentes de TSE a la
mayoría de los procedimientos de inactivación, la obtención controlada de materiales es el criterio más importante para lograr
una seguridad aceptable del producto.
Siempre que sea posible, los fabricantes deben identificar las etapas que teórica o demostrativamente eliminen o inactiven
agentes durante la fabricación del material. Los fabricantes deben continuar sus investigaciones sobre métodos de eliminación
e inactivación para identificar etapas/procesos que ayuden a asegurar la eliminación o inactivación de agentes de TSE. Los fa-
bricantes deben diseñar procesos de producción usando métodos disponibles que presenten la mayor probabilidad de inacti-
var o eliminar agentes de TSE. Por ejemplo, la exposición prolongada de tejidos a calor húmedo alto y pH elevado inactiva al
926 (1024) Suero Bovino/ Información General USP 40

agente de BSE. No obstante, dichos tratamientos son inapropiados para la extracción de muchos otros tipos de artículos bovi-
nos tales como el suero, debido a que estos tratamientos conllevan a la destrucción del material. Los procedimientos conven-
cionales químicos y bioquímicos de extracción y aislamiento pueden ser suficientes para eliminar al agente infeccioso. Técnicas
similares pueden ser efectivas para otros artículos bovinos. La investigación adicional ayudará a desarrollar una comprensión de
la metodología más apropiada para los estudios de validación. Las cuestiones a considerar durante la validación de un proceso
para eliminar los agentes de TSE incluyen lo siguiente:
• La naturaleza del material contaminado intencionalmente (spiked material) y su relevancia para la situación natural
• Diseño del estudio (incluyendo metodologías de reducción de escala de los procesos)
•Método para detectar al agente (ensayos in vitro o in vivo) después de la contaminación intencional y después del trata-
miento
• Caracterización y estandarización de materiales de referencia para la contaminación intencional
•Tratamiento y análisis de datos (ver Diseño y Análisis de Valoraciones Biológicas (111 ))
Debido a que ningún estudio ha validado con éxito métodos analíticos para la detección de pequeñas cantidades del agente
de TSE, los estudios de validación para depuración de TSE por lo general emplean la inyección intracraneal de material en pro-
ceso en roedores para la amplificación y detección de infectividad residual potencial.

ANÁLISIS V CONTROL DE AGENTES ADVENTICIOS

Introducción

Los procedimientos de análisis rigurosos, las guías estrictas de procesamiento y producción, y las evaluaciones de riesgos
apropiadas ayudan a asegurar la seguridad de los diferentes tipos de suero bovino. Esta sección analiza pruebas específicas que
pueden detectar y controlar agentes adventicios.

Análisis de Agentes Adventicios

Los análisis de agentes adventicios requeridos para la evaluación de siembras maestras, células maestras y productos brutos y
finales se describen en el Título 9 del CFR 113.53 y en las directivas de la Agencia Europea para la Evaluación de Productos
Medicinales (EMEA, por sus siglas en inglés) (EMEA/CVMP/743/00 y EMEA/CPMP/BWP/1793/02). Los métodos de análisis se-
ñalados en estos documentos pueden detectar una amplia gama de agentes microbianos bovinos en productos de suero. Estos
métodos de análisis cumplen con los requisitos de la mayoría de las agencias reguladoras mundiales. Los fabricantes de suero
deben analizar una muestra representativa de cada lote de suero para determinar la presencia de agentes adventicios. El análi-
sis se realiza después de la filtración pero antes de cualquier procesamiento destinado a inactivar o eliminar virus.
La filtración con filtros con un tamaño de poro de 100 nm (O, 1 µm) es un método aceptado de eliminación de micoplasmas,
mientras que la radiación gamma(> 25 kGy cuando está congelado) y los tratamientos químicos (p.ej. con betapropiolactona)
son métodos aceptados de inactivación de virus y micoplasmas; los fabricantes de suero usan rutinariamente estas herramien-
tas en las instalaciones de producción y análisis. Estos tratamientos no eliminan anticuerpos que puedan interferir con algunas
aplicaciones. Además, los tratamientos no aseguran la eliminación ni la inactivación total de virus, pero pueden reducir signifi-
cativamente el riesgo de actividad viral. La serie de análisis para determinar la ausencia de agentes adventicios en el suero bovi-
no generalmente incluye lo siguiente:
•Análisis de esterilidad bacteriana y fúngica, según se describe en el Título 9 del CFR 113.26
•Análisis de micoplasmas según se describe en el Título 9 del CFR 113.28
•Análisis viral según se describe en el Título 9 del CFR 113.53
Los procedimientos descritos en Pruebas de Esterilidad (71) confirman la ausencia de infección bacteriana y fúngica. En lo que
respecta a virus, únicamente el cultivo usando células sustrato adecuadas puede indicar infectividad y replicación viral. Aque-
llos que usan suero para investigación o producción deben analizar el suero para demostrar la ausencia de agentes adventicios
de una manera que sea congruente con la aplicación prevista del producto, teniendo en cuenta que el análisis únicamente
indica la presencia o ausencia de agentes adventicios dentro de los límites de los procedimientos de análisis usados.

Análisis de Micoplasmas

La contaminación con micoplasmas en el cultivo de tejidos puede surgir de muchas fuentes de origen animal, incluido el
suero, pero resulta con mayor regularidad de la contaminación cruzada de cultivos infectados. Los micoplasmas son contami-
nantes particularmente insidiosos en el cultivo celular debido a que
• no pueden visualizarse mediante microscopia de luz incluso a alta densidad (> 10 7 unidades formadoras de colonias/mL);
• no ocasionan cambios observables de turbidez o pH del fluido de cultivo;
• no se pueden eliminar rutinariamente mediante filtros de esterilización individuales, aunque se puede lograr la eliminación
a través de una serie de tres filtros de O, 1 µm;
• los antibióticos tradicionales que se usan en el cultivo celular no los afectan; y
• provocan una variedad extremadamente amplia de efectos adversos en el cultivo de tejidos.
USP 40 Información General/ (1024) Suero Bovino 927

El capítulo Pruebas para Micoplasmas (63) describe la detección clásica de micoplasmas.

Además de estos métodos, los procedimientos de detección más recientes incluyen los ensayos luminiscente y de reacción
en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés). El capítulo Técnicas Basadas en Ácidos Nucleicos-Amplificación
(1127) describe los principios generales de los ensayos de PCR. El ensayo sensible luminiscente de 20 minutos mide una activi-
dad enzimática específica de molicutes que convierte el difosfato de adenosina a trifosfato de adenosina mediante una reac-
ción de luciferasa/luciferina. Los resultados son inequívocos y semicuantitativos. Los métodos de PCR son rápidos y sensibles y
su funcionamiento es bastante fiable, aunque los resultados falsos positivos ocasionales representan una preocupación en lo
que respecta a laboratorios de servicios de análisis comerciales. La PCR puede detectar fragmentos de ADN micoplasmáticos
no infecciosos.

Análisis Viral

Los procedimientos de análisis viral para productos de suero se citan en el Título 9 del CFR 113.52 y en el Título 9 del CFR
113.53. Además, existen otros documentos que pueden incluir análisis equivalentes o pertinentes, como por ejemplo EMEA/
CVMP/743/00-Rev.2 del Comité para Productos Medicinales Veterinarios (Committee for Veterinary Medicinal Products o
CVMP) Guía Revisada de Requisitos y Controles Aplicados al Suero Bovino Usado en la Producción de Productos Medicinales Veterina-
rios Inmunológicos (Revised Guideline on Requirements and Controls Applied to Bovine Serum Used in the Production of lmmunologi-
cal Veterinary Medicinal Products) y EMEA/CPMP/BWP/1793/02 del Comité para Productos Medicinales de Patente (Committee
for Proprietary Medicinal Products o CPMP) Guías sobre el Uso de Suero Bovino en la Fabricación de Productos Medicinales Biológi-
cos de Uso Humanos (Note for Guidance on the Use of Bovine Serum in the Manufacture of Human Biological Medicinal Pro-
ducts). Los fabricantes de suero deben realizar análisis de virus que cumplan con esta reglamentación, usando por lo menos
dos líneas de células detectoras diferentes y sensibles, de las cuales una debe ser de origen bovino. Las pruebas incluyen el
cultivo de células detectoras en medios de cultivo celular suplementados con el suero de prueba al 15% durante al menos 21
días. Las células se subcultivan por lo menos dos veces durante este periodo, generalmente a los 7 y 14 días posteriores a la
inoculación. Una vez terminado el último subcultivo (después de un total de al menos 21 días de incubación), las células se
examinan para detectar signos generales de amplificación del virus. Los siguientes puntos finales se usan para la detección ge-
neral de virus: examen microscópico celular para agentes citopatogénicos tales como el virus de la rinotraqueitis bovina infec-
ciosa, tinción celular y examen microscópico para cuerpos de inclusión, y prueba de hemadsorción para detectar agentes he-
madsorbentes tales como Pl-3. Además de esta serie de análisis y al finalizar el último subcultivo (después de un total de al
menos 21 días de incubación), las células se tiñen con anticuerpos específicos fluorescentes contra los siguientes agentes vira-
les específicos:
• BVDV
• Parvovirus bovino
• Adenovirus bovino
• Virus de la lengua azul
• Virus respiratorio sincicial bovino
• Reovirus
• Virus de la rabia
Además de los virus listados anteriormente, otros virus pueden ser agentes causantes de enfermedades y que requieren de
análisis en diversas aplicaciones del suero bovino. El usuario final del suero es el responsable de determinar si el análisis com-
pleto del Título 9 del CFR es suficiente y si se deben analizar otros agentes virales específicos. Ejemplos de virus específicos no
cubiertos por la guía de análisis viral vigente pueden incluir akabane, virus del herpes bovino tipo 1 (VHB-1 ), virus de la parain-
fluenza tipo 3 (Pl-3), leucemia bovina, rotavirus bovino, circovirus bovino, poliomavirus bovino, coronavirus, torovirus, entero-
virus bovino, astrovirus bovino, virus de fiebre aftosa (VFA) y peste bovina. El Apéndice 2 proporciona una descripción general
de estos virus, así como de aquellos para los que se requiere de análisis. El análisis de riesgos extensivo por parte del usuario
final del suero debe determinar el alcance del análisis y las opciones para el tratamiento del suero.

Estrategias de Evaluación y Detección de Riesgos

Los fabricantes de suero y los usuarios finales de suero deben llevar a cabo evaluaciones integrales de riesgos basadas en
datos científicos (p.ej. análisis de modos y efectos de falla) a fin de comprender de mejor manera el perfil de seguridad del
producto del suero. Se pueden tomar en cuenta los siguientes elementos de evaluación de riesgos, aunque es posible incluir
otros elementos según sea apropiado: país de origen, región del país, estado de enfermedad animal del país/región de origen,
edad del animal, proceso de recolección sanguínea, método de aturdimiento del animal y método de desangrado, proceso de
fabricación del suero, tipo de sistema de calidad de producción, controles de producción durante el proceso, análisis del pro-
ducto final, inactivación del virus, segregación del equipo, procedimiento de limpieza del equipo, capacitación del personal,
uso/aplicación del suero, tipo de producto farmacéutico y uso previsto.
La barrera de especies proporciona un grado de protección en contra de infecciones por algunos agentes etiológicos anima-
les. Esta barrera no es una alternativa para asegurar de manera proactiva que los productos farmacéuticos se fabriquen única-
mente a partir de materias primas de origen animal que presentan niveles indetectables de agentes adventicios. La inoculación
de organismos viables en especies no anfitrionas conlleva el riesgo de que los organismos puedan cruzar la barrera de especies.
928 (1024) Suero Bovino/ Información General USP 40

Por lo tanto, un régimén apropiado de análisis del material del suero debe incluir exámenes para determinar la presencia de
contaminantes potenciales relacionados con la especie de origen y la especie objetivo. Los tratamientos del suero para inactivar
agentes virales son un factor para establecer el régimen de análisis adecuado para un material en particular. El nivel de riesgo
más bajo de contaminación se relaciona con materiales biológicos que se esterilizan de manera terminal.
Un nivel de riesgo igual a cero es imposible e irrazonable. Los fabricantes de suero deben describir completamente los regí-
menes de análisis específicos en las especificaciones del producto, los cuales variarán dependiendo del tipo y origen del suero.
Por tanto, las pautas de detección descritas en este capítulo únicamente son ejemplificativas y es posible que no se requiera de
la detección de todos los virus citados para un material en particular. Algunos fabricantes pueden realizar ciertas pruebas sobre
el producto terminado o los materiales en proceso en lugar de realizarlas sobre los componentes individuales. Los fabricantes
también deben evaluar el efecto de dilución en relación con el límite de detección del procedimiento de análisis. La interferen-
cia con el crecimiento o neutralización de actividad viral por parte del suero puede ser indicativo de un anticuerpo específico o
de ciertos factores inespecíficos de enmascaramiento del agente viral por parte del suero. Se recomienda que los fabricantes de
suero consideren esta posibilidad al momento de determinar un nivel adecuado de tratamiento en sus estudios de inactivación
viral o aplicaciones de análisis viral.
Los fabricantes de suero deben confirmar que la especie de origen es bovina para asegurar la ausencia de otros agentes no
bovinos. Los fabricantes deben realizar análisis de virus extraños en cultivos celulares apropiados (ver Métodos de Pruebas Viro-
lógicas (1237) para seleccionar adecuadamente las líneas celulares, dependiendo del ensayo y del agente buscado). Si fuera
necesario, se deben realizar estudios de seroconversión en especies animales susceptibles al virus, usando una respuesta inmu-
ne mediada por anticuerpos en la especie anfitriona como método de detección. Los estudios deben usar este procedimiento
después de una etapa de inactivación para detectar si el virus estaba presente antes del proceso de inactivación viral.
Los procesos de fabricación de suero deben realizarse de manera congruente, siguiendo los procedimientos de fabricación
establecidos, con sistemas de calidad adecuados incorporados al proceso de producción. Además, la segregación de equipo
(por especies de origen), los procedimientos de limpieza de equipo e instalaciones, y la capacitación de personal son elemen-
tos importantes en la evaluación de riesgos del proceso.

Consideraciones de Seguridad

Los usuarios finales de suero bovino de donante pueden requerir que el suero no presente anticuerpos detectables contra el
VDVB u otros agentes específicos, de modo que los usuarios puedan propagar cultivos celulares usados en la producción de
vacunas, en el análisis de diagnóstico, y en la preparación de kits de pruebas, especialmente para el mantenimiento de reservas
de células maestras y de siembra. Se encuentran disponibles más de 40 tipos de células para la producción de productos bioló-
gicos veterinarios, pero menos de 1 O tipos de medios para su propagación. Algunos investigadores han propuesto medios
exentos de suero como alternativa para propagar ciertas células y virus; sin embargo, esto significa adaptar los procedimientos
de cultivo, lo que puede alterar las células y cambiar los resultados de producción. Si se importan sueros nuevos o diferentes a
EE.UU., los usuarios finales del suero requerirán confirmación de origen, especies y documentación de origen de los sueros en
países libres de FA y peste bovina.

CARACTERIZACIÓN DE SUERO BOVINO

Introducción

Ante la ausencia de requisitos específicos del producto final, se debe analizar cada lote de FBS para confirmar que el suero
cumpla con los requisitos del capítulo general propuesto Suero Fetal Bovino-Atributos de Calidad y Pruebas de Funcionalidad
(90). Esta sección describe diversos procedimientos claves de caracterización para todos los demás tipos de suero. Estos proce-
dimientos no son obligatorios pero representan guías que los fabricantes pueden considerar para sus aplicaciones individuales.
La tabla de la sección Hemoglobina presenta ejemplos de especificaciones para los diversos tipos de suero bovino.

Identificación de Especies

El suero bovino debe someterse a ensayos de identificación tanto inter como intraespecies para confirmar la identidad de la
especie y la integridad de los productos del suero, así como para asegurar que no se encuentren presentes agentes no bovinos.
El ensayo más comúnmente usado para la identificación de la especie bovina se basa en el perfil electroforético de proteínas
específicas del suero. Con la electroforesis, las proteínas del suero por lo general se separan hasta en seis fracciones: albúmina,
alfa 1, alfa 2, beta 1, beta 2 y gamma globulinas.
Otros procedimientos usados para la determinación de especies bovinas incluyen la inmunodifusión radial (IDR) y el método
de difusión doble de Ouchterlony. Estos procedimientos permiten mediciones cualitativas o cuantitativas de los niveles de in-
munoglobulina G en el suero. El método por IDR se basa en la difusión de un antígeno desde un pocillo circular en un gel
homogéneo que contiene un antisuero específico para cada antígeno en particular. Se forma un círculo de antígeno y anti-
cuerpo precipitados y continúa creciendo hasta que alcanza el equilibrio. Los diámetros de los anillos son una función de con-
centración de antígeno. El método de Ouchterlony es una prueba de difusión doble en gel en la que el antígeno y el anticuer-
USP 40 Información General/ (1024) Suero Bovino 929

po difunden uno hacia el otro en un medio semisólido hasta un punto en el medio en el que se alcanza una concentración
óptima de cada uno, formando un precipitado. Las placas de Ouchterlony contienen pocillos cilíndricos-un pocillo de antíge-
no central de 8 mm de diámetro, rodeado por seis pocillos de antisuero de 3 mm-que posibilitan el monitoreo simultáneo de
múltiples sistemas de antígeno-anticuerpo y la identificación de antígenos particulares en una preparación. El capítulo general
propuesto Suero Fetal Bovino-Atributos de Calidad y Pruebas de Funcionalidad (90) describe el procedimiento aceptado.

Hemoglobina

La hemoglobina es una proteína de subunidades múltiples que forma una unión inestable y reversible con el oxígeno en los
eritrocitos. La forma cargada de oxígeno se denomina oxihemoglobina y es de color rojo brillante. La forma que no está carga-
da de oxígeno se denomina desoxihemoglobina y es de color azul púrpura. La oxihemoglobina es la forma predominante en
los eritrocitos.
El bajo contenido de hemoglobina en los sueros es ampliamente aceptado como una buena indicación general de procesa-
miento rápido y cuidadoso de la sangre que se usará para el suero. Los eritrocitos son frágiles y se rompen fácilmente, liberan-
do hemoglobina en el suero. La manipulación brusca de la sangre recolectada, el pobre control de temperatura o los retrasos
en el procesamiento elevan el contenido de hemoglobina en el suero. Los niveles aceptables de hemoglobina pueden variar
dependiendo de la aplicación prevista. Los niveles de hemoglobina se miden usando procedimientos espectrofotométricos (ver
Espectroscopía Ultravioleta-Visible (857)) según se describe en el capítulo general propuesto Suero Fetal Bovino-Atributos de Cali-
dad y Pruebas de Funcionalidad (90).

Suero de Suero Suero de

Ternero de Bovino Bovino
FBS Recién Nacido Suero de Ternero Donante Adulto
Prueba de Esterilidad No se detecta No se detecta No se detecta No se detecta No se detecta
crecimiento crecimiento crecimiento crecimiento crecimiento
Micoplasmas No se detectan No se detectan No se detectan No se detectan No se detectan
Análisis de virus No se detectan No se detectan No se detectan No se detectan No se detectan
Hemoglobina (mg/dl) <30 <30 <30 <30 <30
Proteínas totales (g/dL) 3,0-4,5 3,5-6,0 5,0-8,0 5,0-8,0 6,0-10,0
pH 7,00-8,00 7,00-8,00 7,00-8,00 7,00-8,00 7,00-8,00
Osmolalidad (mOsmol/Kg) 280-360 240-340 240-340 240-340 240-340

Perfil Químico

El análisis de componentes tales como colesterol, alfa globulina, beta globulina, gamma globulina, albúmina, creatinina, bili-
rubina, glucosa, alanina aminotransferasa, aspartato aminotransferasa, fósforo, potasio, calcio y sodio por lo general no se con-
sidera un criterio para liberación del lote de suero bovino. Algunos fabricantes no realizan análisis de manera rutinaria sino úni-
camente como análisis auxiliares. En algunas ocasiones, los laboratorios clínicos hospitalarios pueden llevar a cabo los análisis.
Los niveles de estas sustancias químicas en el suero son importantes para los usuarios finales y se pueden usar también para
evaluar la variabilidad de lote a lote.

Niveles de Endotoxinas

Aunque los niveles altos de endotoxina no son adecuados para aplicaciones que involucren inyectables, los niveles acepta-
bles en suero bovino varían dependiendo de la aplicación prevista. Algunos fabricantes pueden pasar por alto la importancia
de los niveles bajos de endotoxinas en el suero bovino usado en aplicaciones de cultivo celular. Las endotoxinas influyen en
más de 30 actividades biológicas, algunas de las cuales incluyen activación de macrófagos, estimulación mitogénica y la induc-
ción de interferones y de factor estimulante de colonias (para algunas aplicaciones, estas pueden ser actividades positivas). Las
endotoxinas también pueden conllevar a citoxicidad al iniciar la activación del complemento. Los métodos más comúnmente
usados para la detección de endotoxinas son el procedimiento semicuantitativo de coagulación con lisado de amebocitos de
Limulus y el método cromogénico cinético cuantitativo descritos en Prueba de Endotoxinas Bacterianas (85). Tanto para el ensa-
yo de coagulación como el ensayo cromogénico cinético, un ensayo válido de endotoxinas requiere de tratamiento apropiado
por calor o dilución a fin de evitar efectos adversos de sustancias interferentes en el suero. Los investigadores deben incluir un
control de producto positivo en cada ensayo para confirmar que se ha superado cualquier interferencia por el tratamiento por
calor o dilución.

Osmolalidad

La prueba de osmolalidad está diseñada para evaluar la concentración de electrolitos en el suero bovino. Las sustancias quí-
micas que afectan la osmolalidad del suero incluyen sodio, cloruro, bicarbonato, potasio, proteínas y glucosa. Los fabricantes
930 (1024) Suero Bovino/ Información General USP 40

de suero deben medir la osmolalidad de cada partida de suero para verificar el cumplimiento con las especificaciones del pro-
ducto, usando equipos calibrados con estándares rastreables al Instituto Nacional de Estándares y Tecnología (National lnstitu-
te of Standards and Technology). El capítulo Osmolalidad y Osmolaridad (785) describe la forma en que se determina la osmo-
lalidad mediante disminución del punto de congelamiento de la solución de suero bovino. Los científicos emplean por lo me-
nos dos estándares para calibrar el instrumento. La osmolalidad de cada muestra se calcula y relaciona con el contenido de
agua del suero y se expresa en mOsmol/kg H2 0.

Nivel de Proteínas Totales

El nivel de proteínas totales en el suero se mide para verificar la edad del animal y el cumplimiento con las especificaciones
del producto. El capítulo Artículos Obtenidos por Biotecnología-Valoración de Proteínas Totales (1057) describe dos procedi-
mientos, los métodos de Biuret y de Bradford, para determinar la concentración de proteína. El usuario final debe evaluar el
nivel aceptable de proteína en el suero basándose en la aplicación prevista.

Propiedades de Crecimiento Celular

Se debe analizar la capacidad de cada lote de suero para sustentar el crecimiento in vitro de líneas celulares específicas. Los
sueros bovinos son muy variables por lo que lotes distintos pueden producir resultados diferentes. Debido a esta variabilidad,
los usuarios finales deben caracterizar y estandarizar las líneas celulares que usarán para este tipo de análisis. Los usuarios fina-
les deben diseñar procedimientos de crecimiento celular que les ayuden a verificar la eficacia del suero bovino en la promoción
del crecimiento celular. Los fabricantes de suero se beneficiarán del monitoreo de la promoción de crecimiento celular durante
varias generaciones de subcultivos para detectar cualquier evidencia de citoxicidad o cambios en la morfología celular. Los fa-
bricantes de suero usan distintos tipos de células, y los estudios de crecimiento y las líneas celulares usadas por los fabricantes
de suero también pueden variar de aquellos aplicados por los usuarios finales del suero. Al evaluar las propiedades de creci-
miento de una línea celular específica en respuesta a un lote específico de suero, los fabricantes de suero deben tomar en
cuenta la eficiencia del plaqueo y/o la promoción de crecimiento o algunas otras pruebas de funcionalidad que califiquen al
lote de suero para su uso previsto.
La eficiencia del plaqueo a baja densidad celular es un método preferido para analizar la capacidad de proliferación y la su-
pervivencia de células individuales en condiciones óptimas de crecimiento. Este procedimiento puede revelar diferencias en la
velocidad de crecimiento dentro de la población y es capaz de distinguir entre cambios en la velocidad de crecimiento (tama-
ño de las colonias) y la supervivencia de las células (número de las colonias). La cinética del crecimiento es otro aspecto impor-
tante en el diseño de experimentos celulares. Determinar la curva de crecimiento de cada línea celular ayuda a definir condi-
ciones de cultivo óptimas, debido a que la variación en el suero y otros aditivos de crecimiento pueden tener influencia sobre
los parámetros de crecimiento, lo cual puede afectar el resultado del experimento.
Ante la ausencia de pruebas específicas diseñadas para sus productos particulares, los usuarios del suero pueden referirse a
las pruebas de funcionalidad descritas en el capítulo general propuesto Suero Fetal Bovino-Atributos de Calidad y Pruebas de
Funcionalidad (90) para determinar si un lote de suero es adecuado para sus aplicaciones. Este capítulo proporciona guías sobre
cómo realizar las pruebas de promoción de crecimiento y de eficiencia del plaqueo.

Citotoxicidad In Vitro

Los fabricantes de suero deben usar una línea celular apropiada para analizar cada lote de suero y deben realizar estudios de
crecimiento a través de varias generaciones subcultivadas para asegurar que el suero no tenga efectos citotóxicos sobre las cé-
lulas. La elección de una línea celular depende del uso previsto del suero. Los ensayos de crecimiento celular y de citotoxicidad
deben realizarse en el lote final de suero después de cualquier etapa de inactivación viral o de cualquier procesamiento adicio-
nal.

CONCLUSIÓN
Es probable que el suero bovino se mantenga como un componente importante en la fabricación de muchos productos bio-
lógicos, en particular de aquellos que dependen del cultivo celular. Al igual que otros materiales similares, la calidad del suero
bovino es intrínsecamente variable. Por consiguiente, los usuarios finales del suero deben establecer pruebas, procedimientos y
criterios de aceptación adecuados para la introducción de materiales en el proceso de una aplicación particular que utilice sue-
ro. Lo anterior puede requerir el análisis de múltiples lotes de suero bovino para determinar aquellos lotes que cumplen con la
especificación (ver la sección Caracterización de Suero Bovino).
Los fabricantes de productos terapéuticos que usan suero bovino son responsables de asegurar y documentar su calidad, así
como el impacto sobre la calidad, seguridad y eficacia del producto final. Además, es importante asegurar que el desempeño
de cada lote de suero sea equivalente durante la fabricación. El suero también puede interferir con la purificación del producto
final; por lo tanto, es importante comprender el efecto del suero bovino sobre el proceso de fabricación a fin de entender el
efecto que pueden tener varios procesos sobre el producto final. Por último, es posible disminuir los riesgos a través del diseño
USP 40 Información General/ (1024) Suero Bovino 931

de procesos que incluyan etapas que eliminen adecuadamente el material bovino mediante dilución, separación o inactiva-
ción, así como el desarrollo de ensayos analíticos para evaluar el contenido residual del material bovino durante los procesos y
en el producto terapéutico final. Diversos ensayos sensibles pueden proporcionar un medio cuantitativo para detectar el mate-
rial bovino en niveles de picogramos.

APÉNDICE

Apéndice 1: Referencias Reglamentarias Pertinentes

El suero bovino y los productos relacionados con el suero usados en la fabricación de productos biológicos se encuentran
reglamentados en el contexto de Requisitos para Ingredientes de Origen Animal Usados en la Producción de Productos Biológicos
(Requirements far lngredients of Animal Origin Used far the Production of Biologics), Título 9 del CFR 113.53. En la actualidad,
cada fabricante de suero realiza estudios de detección para identificar virus contaminantes. Debido a la potencial comercializa-
ción internacional del suero, los fabricantes de suero necesitan tener en cuenta otros requisitos reglamentarios. Los fabricantes
pueden usar los documentos listados en este capítulo como guía para la determinación de contaminación por agentes adventi-
cios en sueros bovinos. Debido al riesgo que conllevan los productos de suero derivado de animales, los fabricantes de suero y
los usuarios finales deben asegurar que el país de origen del material cumpla con los requisitos reglamentarios aplicables. Aun-
que en la actualidad ningún ensayo de desempeño celular demuestra la ausencia de BSE en el suero, los fabricantes de suero
deben cumplir con los requisitos reglamentarios de los países donde el suero se obtiene y comercializa a fin de asegurar un
riesgo mínimo de infección por BSE/TSE.
Más allá de los capítulos de USP pertinentes referidos en este capítulo, la siguiente lista incluye documentos reglamentarios
así como las mejores prácticas para el desarrollo, fabricación, control de calidad y garantía de calidad del producto y los proce-
sos.
CFR
•Título 9 del CFR 94.18 (CVB, 2001)
•Título 9 del CFR 113.46
•Título 9 del CFR 113.47
•Título 9 del CFR 113.52
•Título 9 del CFR 113.53
• Título 9 del CFR 11 3.55
• Título 9 del CFR 320
•Título 9 del CFR 327.4
•Título 21 del CFR 211 Subparte E
• Título 21 del CFR 801.1
• Título 21 del CFR 809 .1 O
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• CPMP/CVMP. Note far guidance on minimising the risk of transmitting animal spongifarm encephalopathy agents vía human
and veterinary medicinal products (Nota de orientación sobre la minimización del riesgo de transmisión de agentes de encefalo-
932 (1024) Suero Bovino/ Información General USP 40

patía espongiforme animal mediante productos medicinales para uso humano y veterinario). Disponible en http://
www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Scientific_guideline/2009/09/WC500003712.pdf
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• OMS. 2006. WHO guidelines on tissue infectivity distribution in transmissible spongiform encephalopathies (Guías de la OMS
sobre la distribución tisular de la infectividad de encefalopatías espongiformes transmisibles). http://www.who.int/bloodpro-
ducts/cs/TSEPUBLISHEDREPORT.pdf

Apéndice 2: Virus a Considerar en el Análisis de Suero Bovino

A continuación se presenta una descripción general de los virus que los fabricantes pueden considerar al determinar la au-
sencia de agentes adventicios en suero bovino. La lista se proporciona únicamente para propósitos de información general. La
lista de análisis requeridos se proporciona en este capítulo en la sección Análisis Viral.
Akabane-Virus transmitido por insectos que ocasiona anormalidades congénitas del sistema nervioso central de animales
rumiantes. La enfermedad debida al virus de Akabane ha sido reconocida en Australia, Israel, japón y Corea. Se han encontrado
anticuerpos contra este virus en varios países en el Sureste Asiático, el Medio Oriente y África. La enfermedad afecta a los fetos
de ganado bovino, ovejas y cabras. Se ha demostrado serológicamente la infección asintomática en caballos, búfalos y vena-
dos (aunque no en humanos ni cerdos) en áreas endémicas.
Lengua Azul-Enfermedad viral infecciosa no contagiosa transmitida por artrópodos que afecta principalmente a animales
rumiantes domésticos y salvajes. La infección por el virus de la lengua azul es común a nivel mundial pero por lo general es
subclínica o moderada. El virus de la lengua azul corresponde a la especie tipo del género Orbivirus de la familia Reoviridae. Se
han identificado 24 serotipos a nivel mundial, aunque no todos los serotipos existen en una sola área geográfica: p.ej., se han
reportado únicamente 5 serotipos (2, 1O, 11, 13 y 17) en los EE.UU. La distribución a nivel mundial es análoga a la distribución
espacial y temporal de las especies vector de los jejenes Culicoides, que representan el único transmisor natural significativo del
virus.
Adenovirus bovino-Se relaciona con un amplio espectro de enfermedades. El adenovirus bovino tipo 3 es el serotipo más
comúnmente asociado con la enfermedad respiratoria bovina. Los adenovirus bovinos son virus de ADN que se han separado
en dos géneros: el Mastadenovirus o adenovirus mamífero y el Aviadenovirus o adenovirus aviar. El género Mastadenovirus com-
prende numerosos serotipos específicos de especie, de los cuales se han identificado nueve en el ganado bovino. También se
han podido aislar adenovirus epiteliotrópicos de animales rumiantes que por lo general son clínicamente inaparentes. La enfer-
medad clínica está dictada por varios factores que incluyen la cepa del virus, la infección concurrente, el estrés, las condiciones
ambientales y las prácticas de manejo.
Virus del herpes bovino tipo 1 (VHB-1)-Se relaciona con diversas enfermedades en el ganado bovino entre las que se
incluyen la rinotraqueitis infecciosa bovina, vulvovaginitis pustular infecciosa, balanopostitis, conjuntivitis, aborto, encefalomie-
litis y mastitis. Las infecciones por VHB-1 están muy extendidas en la población de ganado bovino. La forma respiratoria es la
más común en el ganado bovino de engorde a corral.
Leucemia bovina-Oncovirus exógeno tipo C de la familia Retroviridae. La leucemia bovina es una enfermedad viral del
ganado bovino adulto que se caracteriza por la neoplasia de linfocitos y nodos linfáticos. La infección ocurre por la transferen-
cia iatrogénica de linfocitos infectados seguida por una respuesta de anticuerpos permanente. Aunque la prevalencia de la in-
fección en una manada puede ser elevada, sólo unos pocos animales desarrollan linfosarcoma fatal. La infección se propaga
por el contacto con la sangre contaminada de un animal infectado.
Reovirus bovino-Virus de ácido ribonucleico de doble cadena (ARNdc) con viriones esféricos sin envoltura de 60-80 nm
de diámetro, los cuales ocasionan enfermedades respiratorias bovinas.
Virus respiratorio sincicial bovino (VRSB)-Virus de ARN clasificado como pneumovirus de la familia Paramixovirus. El
nombre del virus se deriva de su efecto citopático característico: la formación de células sinciciales. Además del ganado bovi-
no, las ovejas y cabras también pueden resultar infectadas por virus respiratorios sinciciales. El virus respiratorio sincicial huma-
no (VRSH) es un patógeno respiratorio importante en infantes y niños pequeños. El VRSH comprende subtipos antigénicos y la
evidencia preliminar sugiere la existencia de subtipos antigénicos de VRSB. El VRS3 está distribuido por todo el mundo y es
autóctono de la población de ganado bovino. Las infecciones por VRSB relacionadas con enfermedades respiratorias ocurren
predominantemente en ganado bovino joven para producción de carne y leche.
Rotavirus bovino-Virión esférico de ARNdc de 60-80 nm de diámetro que carece de envoltura. Es la causa viral más co-
mún de diarrea en terneros y corderos.
Virus de la diarrea viral bovina (VDVB)-Virus de ARN clasificado como Pestivirus de la familia Flaviviridae. El BDVB puede
atravesar la placenta y parece ser es capaz de inducir la inmunosupresión, lo que permite el desarrollo de neumonía bacteriana
secundaria. Se ha informado que el VDVB es el virus asociado con mayor frecuencia con múltiples infecciones virales del tracto
respiratorio en terneros.
Fiebre aftosa (FA)-Enfermedad viral altamente infecciosa del ganado bovino, cerdos, ovejas, cabras, búfalos y especies de
artiodáctilos silvestres. En una población susceptible, la morbilidad se acerca al 100%. La enfermedad sólo es fatal en raras oca-
siones, excepto en animales jóvenes. La FA es ocasionada por un Aftovirus de la familia Picornaviridae. Se conocen siete seroti-
pos inmunológicamente distintos y dentro de cada serotipo existe un gran número de cepas que presentan un espectro de
características antigénicas.
USP 40 Información General/ (1025) Pancreatina 933

Virus de la parainfluenza tipo 3 (Pl-3)-Virus de ARN clasificado en la familia Paramixovirus. Aunque el Pl-3 es capaz de
ocasionar enfermedad, el virus por lo general se asocia con infecciones moderadas a subclínicas. El papel más importante del
Pl-3 es actuar como un iniciador que puede llevar al desarrollo de neumonía bacteriana secundaria. Las infecciones ocasiona-
das por Pl-3 son comunes en el ganado bovino.
Parvovirus-Virus de ADN de cadena simple relativamente estable al calor de aproximadamente 20 nm de diámetro que se
ha aislado del ganado bovino pero que en condiciones naturales se desconoce si ocasiona enfermedades.
Rabia-Encefalomielitis viral aguda que afecta principalmente a carnívoros y murciélagos, aunque puede afectar a cualquier
mamífero. La rabia es ocasionada por Lisavirus de la familia Rabdovirus. Aunque generalmente están confinados a una especie
principal de reserva en un área geográfica, es común la extensión a otras especies.
Peste bovina-Morbillivirus estrechamente relacionado con los virus que ocasionan moquillo canino y sarampión. Las cepas
pueden variar en gran medida en cuanto a la gama de huéspedes y virulencia. El suero de ganado recuperado o vacunado
provoca una reacción cruzada con todas las cepas en las pruebas de neutralización, aunque se han demostrado diferencias
antigénicas menores. El virus es frágil y se inactiva rápidamente con calor y luz, pero permanece viable durante largos periodos
en tejidos enfriados o congelados. La peste bovina es endémica en muchos países de Asia y África. Históricamente, el virus se
ha distribuido en gran medida en Europa y África, pero a la fecha no se ha establecido por sí mismo en Norteamérica, Centroa-
mérica, las Islas del Caribe, Sudamérica, Australia ni Nueva Zelanda. La peste bovina se incluye en la lista de enfermedades
transmisibles de la Organización Mundial de Sanidad Animal (Oficina Internacional de Epizootias) de la OMS que tienen un
potencial de propagación muy rápida y seria, sin distinción de fronteras nacionales, que representan serias consecuencias so-
cioeconómicas o de salud pública, y que son de alta importancia en el mercado internacional de ganado y productos ganade-
ros.

(1025) PANCREATINA

ÍNDICE

1. Introducción
2. Recolección de Páncreas y Producción de Pancreatina
3. Control de Calidad
4. Etiquetado
5. Certificación y Documentación
6. Análisis y Control de Agentes Infecciosos Adventicios
6.1 Información General
6.2 Estrategias de Evaluación de Riesgos
6.3 Pruebas de Identificación para Panel de Virus Relevantes
6.4 Depuración Viral por Etapas del Proceso de Fabricación
6.5 Análisis Viral
7. Caracterización de la Pancreatina
7 .1 Descripción de las Propiedades Físico-Químicas
7.2 Contenido Proteico y Enzimático
7.2.1 Proteasas Pancreáticas
7.2.2 Lipasa y Colipasa Pancreática
7.2.3 Fosfolipasa Pancreática A2
7.2.4 Amilasa Pancreática
8. Mediciones de la Actividad Enzimática
8.1 Actividad de Lipasa
8.2 Actividad de Proteasa
8.3 Actividad de Amilasa
9. Apéndice 1: Bibliografía Reglamentaria
1 O. Apéndice 2: Bibliografía de Referencia

1. INTRODUCCIÓN

La pancreatina es una preparación de enzimas pancreáticas que contiene amilasa, proteasa y lipasa aislada de la glándula
pancreática del cerdo Sus scrofa L. var. domesticus Gray (Fam. Suidae). El páncreas es un órgano secretor que desempeña un
papel crucial en el proceso digestivo mediante la producción de bicarbonato para neutralizar el ambiente ácido en el duodeno,
hormonas que regulan diversas funciones catabólicas, y una variedad de enzimas digestivas para degradar los alimentos en el
intestino delgado. La pancreatina y los productos medicinales que contienen pancreatina se usan para facilitar la digestión y
934 (1025) Pancreatina / Información General USP 40

absorción de alimentos (carbohidratos, grasa y proteínas) en pacientes con insuficiencia pancreática exocrina ocasionada por
fibrosis cística, pancreatitis crónica y otras condiciones que pueden causar una deficiencia en la secreción de enzimas pancreá-
ticas.
Los productos de enzimas pancreáticas de origen porcino se han comercializado en los Estados Unidos para el tratamiento
de la insuficiencia pancreática exocrina desde antes de la promulgación de la Ley Federal de Alimentos, Medicamentos y Cos-
méticos (Federal Food, Drug, and Cosmetic Act) de 1938. Las enzimas pancreáticas suplementarias están disponibles en medi-
camentos de venta con receta y de venta libre. Desde el 2004, la Administración de Alimentos y Medicamentos de los EE.UU.
(FDA, por sus siglas en inglés) ha ordenado que todos los medicamentos de enzimas pancreáticas comercializados en los
EE.UU. obtengan la aprobación de dicha agencia mediante una Solicitud para Nuevo Medicamento (NDA, por sus siglas en
inglés). Aunque los medicamentos de enzimas pancreáticas de venta libre están disponibles sin receta médica, estos se clasifi-
can como suplementos dietéticos en lugar de medicamentos. La pancreatina y la pancreolipasa tienen funciones e indicaciones
similares; sin embargo, la pancreolipasa, que está disponible sólo como medicamento de venta con receta médica, contiene
más enzima lipasa activa y extracto pancreático purificado que la pancreatina.
Este capítulo describe las mejores prácticas relacionadas con la obtención y fabricación de materias primas de pancreatina
que se usan en los medicamentos de pancreatina y pancreolipasa; estas mejores prácticas ayudan a asegurar la seguridad y la
eficacia de los medicamentos preparados a partir de este ingrediente farmacéutico activo. El Apéndice 7: Bibliografía Reglamen-
taría provee una lista de documentos guía reglamentarios aplicables.

2. RECOLECCIÓN DE PÁNCREAS Y PRODUCCIÓN DE PANCREATINA

La materia prima de origen animal (páncreas) destinada para procesamiento farmacéutico es un subproducto de la produc-
ción de carne y se recolecta en mataderos aprobados por la autoridad nacional competente e inspeccionados por la autoridad
veterinaria pertinente. Los animales a partir de los que se deriva la pancreatina deben cumplir con los requisitos de salud ani-
mal adecuados para consumo humano.
Un ejemplo de un proceso de fabricación típico se resume en la descripción y en el diagrama de flujo (Figura 7) a continua-
ción.
Las glándulas pancreáticas deben mantenerse congeladas para prevenir una pérdida de actividad enzimática durante su con-
servación y transporte. Después de que el fabricante acepta los materiales congelados, la pancreatina se extrae y se purifica en
condiciones que reducen la carga microbiológica y otras impurezas potenciales. Para lograr lo anterior, las glándulas pancreáti-
cas se maceran hasta obtener una suspensión espesa fina, la cual se trata con activadores para convertir los precursores de
enzimas pancreáticas inactivas (zimógenos) en enzimas activas. La activación se lleva a cabo en condiciones controladas; los
factores tales como tiempo, temperatura, fuerza iónica o concentración se controlan según lo definido en el proceso de cada
fabricante. Una vez que se ha completado la activación, esta etapa se detiene agregando acetona, alcohol isopropílico u otros
disolventes compatibles con enzimas. Después de separar la materia insoluble (cuando corresponda), la mezcla se combina
con disolvente para precipitar la pancreatina. El sobrenadante se separa y el residuo sólido se lava con disolvente. Finalmente,
la pancreatina se seca a la temperatura y vacío adecuados. La actividad biológica puede ajustarse y/o estabilizarse agregando
aditivos adecuados, tales como lactosa; sacarosa que contenga no más de 3,25% de almidón; pancreatina con bajo poder di-
gestivo; celulosa microcristalina; maltodextrina; o cloruro de sodio.
USP 40 Información General/ (1025) Pancreatina 935

Glilndulas pancreáticas de origen porcino

....---. Residuo insoluble

(desechado)

Pancreatina Seca (ingrediente farmacéutico activo)

Figura 1. Diagrama de flujo que presenta las etapas del proceso de fabricación de pancreatina.

3. CONTROL DE CALIDAD
Cada lote de pancreatina se somete a un análisis de control de calidad apropiado. El análisis de control de calidad debe con-
siderar los requisitos de la monografía correspondiente, así como otros parámetros de calidad identificados. Dichas pruebas
deben incluir apariencia, identificación, pureza y actividad de la pancreatina. Se deben tener en cuenta las impurezas relacio-
nadas con el proceso y con el producto tales como los disolventes residuales de la extracción y precipitación, y la grasa.
El agua es crítica para la actividad y la estabilidad enzimática, por ende, se debe especificar y monitorear el contenido de
agua usando métodos analíticos apropiados como pérdida por secado (ver el capítulo (731) Pérdida por Secado). Las valoracio-
nes que determinan la actividad enzimática se aplican para confirmar que la pancreatina cumple con los límites predefinidos
para los niveles de actividad de lipasa, amilasa y proteasas, que se consideran atributos críticos de calidad.
Debido al origen biológico de la pancreatina, el control de calidad incluye análisis microbiano así como pruebas para deter-
minar la ausencia de algunos agentes adventicios patógenos para humanos.
936 (1025) Pancreatina / Información General USP 40

4. ETIQUETADO

El producto debe etiquetarse de conformidad con los requisitos de la monografía y reglamentarios pero también de acuerdo
con los requisitos de los clientes cuando corresponda. La etiqueta contiene información tal como el nombre y la dirección del
fabricante, la fecha de fabricación, la fecha de reanálisis, la fecha de caducidad, el número de lote, las condiciones de almace-
namiento y las precauciones específicas (p.ej., "proteger de la humedad"), y una declaración que indique el uso previsto.

5. CERTIFICACIÓN V DOCUMENTACIÓN
El producto debe estar acompañado por los certificados y la documentación necesarios, cuando corresponda. La documen-
tación debe incluir un certificado de análisis u otro certificado que documente el cumplimiento con los requisitos de la mono-
grafía y los resultados de las pruebas de control de calidad; un certificado de origen indicando la especie animal; y certificacio-
nes con respecto a agentes adventicios, incluyendo, cuando corresponda, declaraciones sobre Encefalopatía Espongiforme
Transmisible/Encefalopatía Espongiforme Bovina. Asimismo, se debe incluir, cuando corresponda, otra información pertinente
y requerida, tal como la fecha de reanálisis o caducidad, almacenamiento y recomendaciones de envasado.
El fabricante/proveedor debe ser capaz de proveer documentación para propósitos reglamentarios que contengan la si-
guiente información:
• Información sobre el número de aprobación/autorización de la agencia reglamentaria y la dirección completa del sitio de
fabricación de la pancreatina.
• Una declaración que indique que las materias primas de origen animal destinadas para procesamiento farmacéutico fue-
ron recolectadas y entregadas bajo la supervisión de las autoridades responsables/competentes.
• Una lista de los países de origen de las materias primas recolectadas.
• Una declaración que indique que, durante el transporte, las glándulas pancreáticas pueden ser identificadas como subpro-
ductos animales para propósitos farmacéuticos mediante documentación apropiada de acuerdo con los reglamentos lega-
les correspondientes (tales como certificados de salud animal expedidos por veterinarios oficiales o documentación técni-
ca de comercio).
• Una declaración que indique que las glándulas pancreáticas se recolectan en mataderos aprobados y que los animales de
los que se recolectaron las glándulas pancreáticas fueron sometidos a una inspección en conformidad con la legislación
vigente correspondiente y que se les declaró adecuados para consumo humano, o que no se detectaron señales visibles
de enfermedades transmisibles a humanos o animales al momento de la matanza .

6. ANÁLISIS V CONTROL DE AGENTES INFECCIOSOS ADVENTICIOS

6.1 Información General

Aunque no se han presentado informes que documenten enfermedades infecciosas después del uso de productos medicina-
les derivados de pancreatina, existe un riesgo teórico de transmisión de patógenos porcinos a partir de la pancreatina.
La seguridad de los productos de enzimas pancreáticas de origen porcino debe mejorarse mediante la implementación de
múltiples estrategias complementarias y/o superpuestas para el control, depuración y contención de agentes adventicios. Los
fabricantes deben emplear continuamente un método basado en posibles riesgos para mejorar la seguridad de estos productos
con respecto a los agentes adventicios, el cual incluya incorporar evaluaciones de riesgos, mitigación de riesgos y estrategias
de manejo de los materiales del proceso. Cuando resulte apropiado, se debe incluir un análisis que garantice que los beneficios
terapéuticos del producto son considerablemente mayores que los riesgos generados por su consumo, y simultáneamente se
garantice la disponibilidad del medicamento para los pacientes.

6.2 Estrategias de Evaluación de Riesgos

La Guía para la Industria: "Medicamentos para Insuficiencia Pancreática Exócrina" (Guidance for lndustry: Exocrine Pancrea-
tic lnsufficiency Drug Products) de la FDA promueve un método basado en riesgos para tratar el potencial de contaminación
viral de los productos de enzimas pancreáticas, de acuerdo con la ICH Q5A(Rl) y el capítulo (1050) Evaluación de la Seguridad
Viral de Productos Biotecnológicos Obtenidos de Líneas Celulares de Origen Humano o Animal. En general, el perfil de riesgos de
agentes adventicios de productos biológicos está supeditado a una variedad de factores, entre los que se incluye el origen del
producto biológico, el tipo de las materias primas usadas, los procesos de fabricación y la vía de administración. Debido a que
los procesos de obtención y de fabricación pueden variar entre fabricantes, cada fabricante debe establecer e implementar una
evaluación individual de riesgos completa para agentes adventicios.
Aunque el alcance de la ICH QSA(Rl) abarca la evaluación de la seguridad viral de productos biotecnológicos derivados de
líneas celulares de origen humano y animal, los principios y los métodos de evaluación de riesgos pueden proveer los funda-
mentos para una estrategia de evaluación de riesgos en los productos de pancreatina. A través de la aplicación de los princi-
pios de la ICH Q5A(Rl ), la estrategia de minimización de riesgos para proteger a los pacientes de la exposición inadvertida a
agentes adventicios debe reflejar una combinación de tres componentes:
USP 40 Información General/ (1025) Pancreatina 937

1. Obtención: Uso de procedimientos de obtención cuidadosos para limitar el acceso de agentes adventicios al proceso de
fabricación. Debido a que el material de la pancreatina es un subproducto de la industria de la carne, es importante ase-
gurar que el ingrediente farmacéutico activo de pancreatina se produce únicamente a partir de animales adecuados para
consumo humano.
2. Depuración: Incorporación de etapas robustas de depuración en el proceso de fabricación. La eficacia de estas estrategias
depende de la resistencia de los agentes adventicios al tipo de inactivación física y química usado.
3. Análisis: El control y análisis de agentes adventicios en etapas adecuadas del proceso de fabricación para dar garantía de
que cualquier carga remanente de un agente adventicio potencialmente nocivo se encuentra en niveles suficientemente
bajos. Esto se logra usando ensayos de detección adecuados contra un panel de virus relevantes. En esta parte de la eva-
luación de riesgos, se debe tener en cuenta el riesgo potencial para la salud humana que presentan los virus de origen
porcino.
Para identificar agentes adventicios potenciales que pudieran estar presentes en una preparación de pancreatina, los fabri-
cantes deben identificar los agentes adventicios que están presentes en el cerdo y evaluar la probabilidad de su presencia en
los materiales de partida y en el ingrediente farmacéutico activo. Los capítulos (61) Examen Microbiológico de Productos No Esté-
riles: Pruebas de Recuento Microbiano y (62) Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Microorganismos Específi-
cos tratan el análisis de contaminación específica microbiana, según se define en las monografías pertinentes de productos re-
lacionados con pancreatina. Asimismo, los fabricantes deben evaluar específicamente la presencia potencial de virus porcinos.
En esta evaluación se deben identificar las etapas de fabricación que son capaces de eliminar o inactivar virus, y se debe de-
mostrar la eficiencia del proceso para eliminar y/o inactivar virus mediante estudios de validación viral que sigan las guías co-
rrespondientes. Una vez que se ha establecido la lista de virus críticos potencialmente presentes en el material de partida y/o
en el ingrediente farmacéutico activo, los fabricantes deberán decidir cuáles serán las etapas apropiadas del proceso para reali-
zar el análisis viral y establecer el nivel de análisis viral que se va a realizar para cada lote. Se deben desarrollar y validar pruebas
para virus específicos, y se deben establecer y usar criterios de aceptación para tomar decisiones de aceptación/rechazo de
partidas del ingrediente farmacéutico activo de pancreatina.
El potencial carácter zoonótico o no zoonótico del virus debe tenerse en cuenta al establecer criterios de aceptación.

6.3 Pruebas de Identificación para Panel de Virus Relevantes

La estrategia de evaluación de riesgos descrita anteriormente requiere la identificación de contaminantes virales potenciales
de los materiales de partida de origen porcino. La Tabla 7 provee una descripción general de los virus envueltos y sin envoltura
que se conoce están presentes en cerdos y que pueden presentar un riesgo de contaminación al usar cerdos que se consideran
adecuados para consumo humano como fuente de materia prima. La evaluación de riesgos debe tratar al menos los virus lista-
dos; sin embargo, dependiendo del origen de los animales y de la capacidad del proceso de fabricación, la lista puede adaptar-
se y se pueden considerar virus adicionales (ver el ejemplo en la Figura 2). Los fabricantes deben implementar sistemas para
identificar la emergencia de nuevos virus potencialmente relevantes.
Tabla 1. Identificación de Peligros: Virus Presentes en Cerdos
Virus con Envoltura Virus sin Envoltura
Virus de la fiebre porcina clásica Virus de la encefalomiocarditis (EMCV, por sus siglas en inglés)
Virus de la fiebre porcina africana (ASFV, por sus siglas en inglés) Virus de la enfermedad vesicular porcina (SVDV, por sus siglas en inglés)
Virus de la influenza Virus de la enfermedad de pies y boca (FMDV, por sus siglas en inglés)
Virus del Nilo Occidental (WNV, por sus siglas en inglés) Reovirus (REO, por sus siglas en inglés)
Virus de estomatitis vesicular (VSV, por sus siglas en inglés) Virus de la hepatitis E porcina (swHEV, por sus siglas en inglés)
Virus de la encefalitis equina del este (EEEV, por sus siglas en inglés) Rotavirus porcinos (pRotaV, por sus siglas en inglés)
Virus de la rabia (RABV, por sus siglas en inglés) Enterovirus porcino (PEVs, por sus siglas en inglés)
Virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino (PRRSV, por sus
siglas en inglés) Parvovirus porcino (PPV, por sus siglas en inglés)
Virus de la gastroenteritis transmisible (TGEV, por sus siglas en inglés) Circovirus porcino tipos 1 y 2 (PCVl /2, por sus siglas en inglés)
Virus de la pseudo rabia (SuHV-1, por sus siglas en inglés)
Virus Nipah
Retrovirus endógeno porcino (PERV, por sus siglas en inglés)

6.4 Depuración Viral por Etapas del Proceso de Fabricación

Demostrar la depuración viral es un componente crítico para asegurar la seguridad general de los productos derivados de
pancreatina. El objetivo de los estudios de evaluación de depuración viral no es únicamente evaluar la capacidad del proceso
de fabricación para depurar contaminantes virales conocidos y estimar cuantitativamente el nivel general de reducción de virus
por parte del proceso de fabricación, sino también estimar la capacidad de las etapas del proceso de fabricación para depurar
virus en general. Los estudios de depuración viral para el proceso de fabricación de pancreatina deben llevarse a cabo de
acuerdo con la guía correspondiente vigente, ICH Q5A(Rl ).
938 (1025) Pancreatina / Información General USP 40

Los procesos actuales de producción de pancreatina se consideran efectivos para inactivar virus con envoltura, de acuerdo a
los resultados de los estudios de depuración viral. Sin embargo, los virus sin envoltura son más resistentes a la inactivación
físico-química, lo que genera una mayor variabilidad en su inactivación. Los ejemplos de virus que se encuentran en la clasifica-
ción de alta resistencia viral al tratamiento y que presentan inactivación moderada a limitada, incluyen el parvovirus porcino y
el circovirus porcino 1 /2 (ver la Figura 2).

~
Evaluadón de desgo" ~
Probabilidad de
Virus presentes ocurrencia debida al
.. en . origen geográfico,
tejidos porcinos materiales de obtención,
etc.

Evaluación de riesgos:
Resistencia viral a la
inactivación fisicoquímica

EMCV,
PPV,
Virus con SVDV,
PCV112
envoltura PEVs,
pRotaV,
swHEV

Ver ICHQSA(Rl) para la descripción de los niveles de resistencia.

Figura 2. Ejemplo de un método de evaluación de riesgos para la identificación de virus para el panel de prueba.

6.5 Análisis Viral

Se requiere una estrategia de análisis cuando no ha sido demostrada la capacidad del proceso para eliminar o inactivar un
virus específico a niveles apropiados. El potencial carácter zoonótico o no zoonótico del virus debe tenerse en cuenta al esta-
blecer criterios de aceptación, en términos de la sensibilidad del ensayo y del establecimiento de límites de especificación. Se
deberán rechazar las partidas de ingrediente farmacéutico activo que den positivo en las pruebas de virus zoonóticos. Como
parte del control de calidad, el análisis viral debe realizarse en cada lote de ingrediente farmacéutico activo. Las pruebas usadas
deben permitir la exclusión de cualquier carga de niveles potencialmente nocivos de agentes adventicios. El Título 9 del Códi-
go de Reglamentos Federales describe los requisitos que se deben cumplir en la valoración de productos biológicos porcinos
incluyendo vacunas de virus vivos y productos de anticuerpos, aunque no trata específicamente la pancreatina. La aplicación
de los principios del Título 9 del Código de Reglamentos Federales, ensayos para detectar virus porcinos, pueden, por ejemplo,
basarse en el monitoreo de cultivo celular con respecto a efectos citopatógenos durante un tiempo de incubación apropiado,
análisis de hemoadsorción, técnicas de tinción para virus específicos u otras combinaciones de los mismos (ver también el capí-
tulo (1237) Métodos de Pruebas Virológicas). Además de las tecnologías y virus tratados en el Título 9 del Código de Reglamen-
tos Federales, se pueden usar nuevas tecnologías basadas en biología molecular, y además otros virus con potencial zoonótico
que sean identificados pueden requerir de análisis. Los ejemplos de virus específicos no tratados por la guía vigente para el
análisis de virus puede incluir el virus de la hepatitis E porcina.
El fabricante debe justificar la elección del panel de virus relevantes, la selección de la etapa del proceso apropiada, la apti-
tud del método de prueba y la sensibilidad del método de prueba. Todas las pruebas para virus específicos deben desarrollarse
y validarse de acuerdo con las guías vigentes, por ejemplo, los capítulos (1225) Validación de Procedimientos Farmacopeicos y
(1033) Validación de Valoraciones Biológicas, según corresponda, y se deben establecer y usar criterios de aceptación para to-
mar decisiones de aceptación o rechazo de partidas del ingrediente farmacéutico activo de pancreatina.

7. CARACTERIZACIÓN DE LA PANCREATINA

7.1 Descripción de las Propiedades Físico-Químicas

La pancreatina es un polvo amorfo de color ligeramente marrón a bronceado con un olor y sabor a carne cruda. La pancrea-
tina es parcialmente soluble en agua, forma una solución ligeramente turbia y es insoluble en alcohol y éter. Los siguientes
compuestos pueden degradar la pancreatina: ácidos minerales, hidróxidos álcali, agentes de oxidación y muchas sales metáli-
cas; adicionalmente la degradación de la pancreatina es favorecida por temperatura y humedad elevadas. Las soluciones que
contienen pancreatina deben ser filtradas con precaución, debido a la potencial retención de la lipasa y las proteasas en el
filtro. La actividad enzimática alcanza un máximo en soluciones neutras a débilmente alcalinas. La actividad disminuye rápida-
mente en soluciones ácidas o alcalinas fuertes. Lo mismo se aplica al calentamiento a ebullición de las soluciones acuosas que
USP 40 Información General/ (1025) Pancreatina 939

contienen pancreatina. En formulaciones sin recubrimiento entérico, no se recomienda exponer el producto a un pH de 4,5 o
menos, debido a que se ha observado la pérdida casi total de actividad lipolítica.
Debido a que la pancreatina es de origen biológico, se encuentran presentes otros componentes además de las proteínas
enzimáticamente activas. Estos otros componentes incluyen proteínas, aminoácidos, péptidos, ácidos nucleicos y fragmentos
de los mismos, componentes de tejidos, grasa y sustancias inorgánicas. Estos componentes pueden tener un impacto sobre la
calidad del material final.

7.2 Contenido Proteico y Enzimático

La pancreatina contiene diferentes enzimas digestivas que en su mayoría son producidas y almacenadas como zimógenos
(precursores inactivos) en las células pancreáticas acinares. En condiciones fisiológicas, los zimógenos pancreáticos se transfor-
man en enzimas activas una vez que la secreción pancreática alcanza el intestino delgado superior. Una proteasa intestinal, la
enteroquinasa, desencadena el proceso de activación mediante la escisión del zimógeno de tripsina, el cual seguidamente acti-
va a las otras proteasas. Durante el proceso de producción, las enzimas presentes en la pancreatina son activadas por la tripsina
(ver la Figura 1).
La Tabla 2 resume algunas de las características importantes de las enzimas pancreáticas principales encontradas en la pan-
creatina.
Tabla 2. Características de las Enzimas Conocidas Presentes en la Pancreatina Porcina
UniProtKB/
Swiss-Prot Producidos Peso Longitud de
Número Aumento de como un Molecular la Punto
Nombre E.C. Número Sustratos Precursor (kDa) Secuencia lsoeléctrlco
23,8 (zimóge- 231 a.a. (zimó-
no), 23,5 (acti- geno), 223 a.a. 9,3 (zimógeno),
Tripsina 3.4.21.4 P00761.l Proteínas Sí vado) (activado) 10,5 (activado)
29, 1 (zimóge- 268 a.a. (zimó-
no), 25,6 (acti- geno), 221 a.a.
Quimotripsina 3.4.21.1 G1ARD6_PIG Proteínas Sí vado) (activado) 8,7
250 a.a. (zimó-
geno), 240 a.a.
Elastasa 3.4.21.36 P00772.1 Proteínas Sí 25, 9 (activado) (activado) 8,5
Carboxipeptida- 308 a.a.
sa Al 3.4.17.1 P09954 Proteínas Sí 34,7 (activado) (activado) Desconocido
Carboxipeptida- 305 a.a.
sa B 3.4.17.2 P09955.5 Proteínas Sí 34,7 (activado) (activado) 6,0
246 a.a. (zimó-
Calicreína, glan- geno), 239 a.a.
dular 3.4.21.35 P00752.4 Proteínas Sí 25-28 kDa (activado) 4,2-4,3
50, 1 (dos isofor-
mas de glicosi-
Triacilglicerol Triglicéridos, lación, 450 a.a. 4,9 (lipasa A),
lipasa 3.1.1.3 P00591.2 diglicéridos No lipasas A y B) (madura) 5,0 (lipasa B)
Sin actividad en- 10,3 (procolipa-
zimática, cofac- sa A porcina), 93 a.a. (procoli-
tor de lipasa 1O,1 (procoli- pasa A), 95 a.a.
Colipasa P02703.3 pancreática Sí pasa B porcina) (procolipasa B) Desconocido
14,7 (zimóge- 146 a.a. (zimó-
no), 14 (activa- geno), 123 a.a.
Fosfolipasa A2 3.1.1.4 P00592 Fosfolípidos Sí do) (activado) 4,4-4,5
Colesterol
este rasa, Valores carentes
también deno- de uniformidad
minada éster Ésteres de coles- en la literatura
carboxílico terol, ésteres de que van de 65
lipasa (ECL), és- vitamina, mo- a 98 kDa.
ter carboxílico noglicéridos, Aunque se han
hidrolasa (ECH) Secuencia com- fosfolípidos, ga- identificado Composición
o lipasa estimu- pleta de ami- lactolípidos, formas proteo- completa de
lada por noácido algo de activi- líticas, aún aminoácido
sales biliares aún desconoci- dad en triglicé- se desconoce el aún desconoci-
(LESB) 3.1.1.13, 3.1.1.1 da en cerdos ridos No peso exacto. da en cerdos 4,2-4,8
5,95 (amilasa 1),
496 a.a. 5,45 (amilasa
a-Ami lasa 3.2.1.1 P00690.3 Polisacáridos No 55,3 (maduro) 11)
940 (1025) Pancreatina / Información General USP 40

7.2.1 PROTEASAS PANCREÁTICAS

Las proteasas son enzimas que digieren proteínas en fragmentos de péptidos más pequeños y aminoácidos mediante la hi-
drólisis de los enlaces peptídicos. La pancreatina contiene cinco proteasas principales: tripsina, elastasa, quimotripsina, carboxi-
peptidasa A1 y carboxipeptidasa B. La tri psi na, la quimotripsina y la elastasa se clasifican como endopeptidasas y serina protea-
sas debido a que escinden los enlaces peptídicos en el lado C-terminal de un amino ácido y tienen en sus sitios activos un
residuo de serina catalíticamente importante. Las carboxipeptidasas catalizan la hidrólisis de los aminoácidos de la posición del
extremo C-terminal en polipéptidos y, por lo tanto, se clasifican como exopeptidasas. Las carboxipeptidasas liberan secuencial-
mente residuos del e-terminal de proteínas y péptidos con una especificidad bien definida.
La tripsina actúa específicamente en el lado e-terminal de los residuos de aminoácidos con carga positiva, específicamente
lisina y arginina. El tripsinógeno es secretado por el páncreas como un precursor inactivo y se descarga dentro del duodeno
donde la enteroquinasa convierte el tripsinógeno en tripsina activa. La enteroquinasa es secretada en el duodeno por células
de la mucosa duodenal. La enteroquinasa elimina un octapéptido terminal del tripsinógeno y genera una cadena de polipépti-
do de tripsina activa entrecruzada por seis puentes disulfuro. La tripsina contiene un sitio de unión de calcio de alta afinidad
requerido para la estabilidad de la enzima.
La quimotripsina actúa preferentemente en el lado C-terminal de los residuos de tirosina, fenilalanina y triptófano. Se secreta
como un zimógeno inactivo, quimotripsinógeno, que es sometido a procesamiento proteólico por la tripsina para formar la
enzima activa. La quimotripsina une un ión de calcio por molécula.
La elastasa actúa sobre residuos pequeños de aminoácidos neutros tales como glicina y alanina, aunque también hidroliza
amidas y ésteres y se distingue porque actúa sobre la elastina. La elastasa es producida como un zimógeno y la forma activada
contiene cuatro puentes disulfuro. La elastasa une un ión de calcio por molécula.
La carboxipeptidasa A 1 es una exopeptidasa que hidroliza el enlace peptídico adyacente al extremo e-terminal de una cade-
na de polipéptido, liberando así el aminoácido e-terminal. Escinde residuos aromáticos y voluminosos de aminoácido alifático
y presenta una actividad baja o nula con residuos de aminoácido de ácido aspártico, ácido glutámico, arginina, lisina y prolina.
Contiene un ión de cinc por molécula. El ión de cinc es esencial para la actividad; si se elimina durante la diálisis, debe ser
reemplazado. Por lo tanto, la carboxipeptidasa A 1 también se clasifica como una metaloproteasa.
La carboxipeptidasa B cataliza la hidrólisis de los aminoácidos básicos lisina, arginina y ornitina del extremo C-terminal de
una cadena polipeptídica. También puede tener una función en la degradación adicional de productos de digestión tríptica. La
enzima une un ión de cinc por molécula, que es una parte funcional necesaria para la actividad de la enzima, y, por lo tanto, la
carboxipeptidasa B también se clasifica como una metaloproteasa.

7.2.2 LIPASA Y COLIPASA PANCREÁTICA

La lipasa pancreática (LP, también conocida como triacilglicerol acil hidrolasa) es una glicoproteína y es producida directa-
mente como una enzima activa por el páncreas. Dos isoformas de glicosilación de la LP, la lipasa A y la lipasa B, están presen-
tes en la pancreatina. Estas dos isoformas tienen composiciones idénticas de aminoácidos pero difieren ligeramente en sus pa-
trones de glicosilación, con lipasa A siendo más ácida que la lipasa B. La LP es una enzima soluble en agua que actúa sobre los
sustratos lípidos insolubles, triglicéridos, en la interfase de lípido-agua. Su actividad depende de la superficie específica del sus-
trato accesible a la enzima, y se incrementa con el estado de emulsificación de los lípidos. La LP hidroliza preferencialmente
enlaces éster en las posiciones C-1 y C-3 de triglicéridos y presenta un espectro amplio de especificidad de longitud de cadena
de ácido graso. Por lo tanto, la LP se muestra activa contra una amplia variedad de los triglicéridos que por lo general están
presentes en la dieta. Asimismo, actúa sobre los diglicéridos, pero su actividad sobre los monoglicéridos es muy baja. Principal-
mente convierte los triglicéridos en monoglicéridos y ácidos grasos libres; los productos de lipólisis de mayor polaridad se ab-
sorben en el intestino delgado. En presencia de diversos amfífilos tales como sales biliares a concentraciones micelares, la ab-
sorción de la LP en la interfase de lípido-agua puede verse obstruida, lo que reduce la actividad lipolítica.
Un pequeño cofactor proteico también producido por el páncreas, la colipasa, ayuda a la LP a anclarse a interfases ante la
presencia de amfífilos competitivos, restaurando así la actividad de la LP. La colipasa también es producida por el páncreas
como un precursor, la procolipasa. La procolipasa es activada por la tripsina.

7.2.3 FOSFOLIPASA PANCREÁTICA A2

La fosfolipasa A2 (también conocida como PLA2 secretora tipo IB) es una enzima termoestable soluble en agua que cataliza
la hidrólisis dependiente de calcio de los grupos 2-acilo en 3-sn-fosfoglicéridos. Se produce como un precursor, que es activa-
do por la tripsina.

7.2.4 AMILASA PANCREÁTICA

La a-amilasa pancreática porcina (glucanohidrolasa 1,4-a-D-glucano) cataliza la hidrólisis de los enlaces glucosídicos 1,4-a-D
internos en polisacáridos que contienen tres o más unidades de o-glucosa con enlace a-1,4 para generar una mezcla de dextri-
nas, maltosa y glucosa. La amilasa existe en dos formas (1 y 11) que tienen propiedades enzimáticas similares pero que difieren
USP 40 Información General/ (1025) Pancreatina 941

en sus puntos isoeléctricos. Ambas formas moleculares de amilasa son glicoproteínas que contienen fucosa, galactosa, manosa
y diversos contenidos de glucosamina. Ambas amilasas constan de una sola cadena polipeptídica con cuatro puentes disulfuro
y contienen un ión de calcio fuertemente enlazado.

8. MEDICIONES DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

Aunque la pancreatina contiene una variedad de enzimas, por lo regular se caracteriza midiendo las actividades de las tres
clases de enzimas principales, lipasa, proteasa y amilasa.

8.1 Actividad de Lipasa

La actividad de lipasa de la pancreatina sobre los triglicéridos con ácidos grasos de cadena larga se debe principalmente a la
LP, lo que requiere la presencia de su cofactor específico, la colipasa, para actuar sobre emulsiones de triglicéridos en presencia
de sales biliares que son competidoras para la adsorción de lipasa en la superficie de las gotitas de lípidos. La colipasa y la
lipasa forman un complejo activo con una estequiometría 1 a 1. Las preparaciones comerciales de pancreatina por lo regular
contienen colipasa; sin embargo, se recomienda verificar que el proceso de fabricación del ingrediente farmacéutico activo
provee suficiente colipasa para la actividad de lipasa. Este control debe ser parte de una caracterización apropiada que se debe
realizar durante la validación del proceso del ingrediente farmacéutico activo.
Además de la LP, la pancreatina también contiene carboxil éster lipasa (CEL) pancreática, que hidroliza diversos sustratos
lipídicos. La actividad de la CEL sobre los triglicéridos se considera generalmente muy baja, en comparación con la de la LP, y
su contribución con la actividad de la lipasa de la pancreatina es inapreciable, según se mide usando la valoración de actividad
de lipasa USP.
La valoración de actividad de lipasa descrita en la monografía USP de Pancreatina se basa en la determinación de la veloci-
dad con que la enzima digiere al aceite de oliva emulsificado con acacia (también conocida como goma arábiga)'. La actividad
de la muestra de prueba se calcula comparándola con una preparación estándar de la enzima con actividad conocida. El aceite
de oliva contiene triglicéridos con ácidos grasos de cadena larga que son representativos de los triglicéridos dietéticos. La acti-
vidad de lipasa se mide basándose en la valoración volumétrica de los ácidos grasos libres liberados del aceite de oliva por la
lipólisis producida por la lipasa presente en la pancreatina. Esta valoración volumétrica usando hidróxido de sodio se realiza a
un pH constante de 9,0 mediante valoración volumétrica de pH o potencioestática, en la que los ácidos grasos de cadena larga
se ionizan completamente. Vale la pena notar que este valor de pH no corresponde a las condiciones fisiológicas (el pH medio
del contenido del intestino delgado es cercano a 6,0 durante una comida), pero permite medir la actividad óptima de lipasa in
vitro. Debido a que la solución de la valoración de lipasa USP contiene ER Sales Biliares USP, la detección de la actividad enzi-
mática requiere que tanto la lipasa como la colipasa estén presentes en la pancreatina. Una Unidad USP de lipasa se define
como la cantidad de enzima que, en las condiciones definidas con el sustrato definido, libera 1 µmol de ácido graso por minu-
to.
Se encuentran disponibles otras valoraciones de lipasa para monitorear la actividad de lipasa en la pancreatina. Al usar valo-
raciones de lipasa con sustratos no naturales, tales como tributirina, se recomienda confirmar que la muestra de pancreatina
analizada también sea activa sobre los triglicéridos de cadena larga, en particular usando la valoración de actividad de lipasa
USP con emulsión de aceite de oliva-acacia.

8.2 Actividad de Proteasa

La actividad proteolítica de la pancreatina sobre los polipéptidos y las proteínas es inherente a las enzimas tripsina, quimo-
tripsina, elastasa, carboxipeptidasa A1 y carboxipeptidasa B. Las dos proteasas pancreáticas principales son la tripsina y la qui-
motripsina, y junto con la elastasa, estas endopeptidasas generan pequeños polipéptidos a partir de proteínas más grandes. La
acción adicional de las exopeptidasas carboxipeptidasa A1 y B genera aminoácidos individuales durante la digestión.
La valoración espectrofotométrica USP para la actividad de proteasa a partir de pancreatina se basa en la velocidad de diges-
tión de caseína en las condiciones de la prueba. La actividad de la muestra de prueba se calcula comparándola con una prepa-
ración estándar de la enzima con actividad conocida. La caseína está compuesta por a (sl) y a (s2)-caseínas, f3 -caseína y K-
caseína, las cuales se fosforilan en los residuos de serina y carecen de puentes disulfuro. La conformaciónde la caseína es similar
a la de las proteínas globulares desnaturalizadas con poca o sin estructura terciaria .. Se recomienda a los usuarios evaluar a los
proveedores de sustrato de caseína con respecto a la consistencia de la dispersión.
La hidrólisis de caseína por parte de las proteasas pancreáticas genera aminoácidos individuales y péptidos pequeños, y su
liberación puede cuantificarse midiendo su absorción a 280 nm. Antes de esta medición, se deben separar las proteínas no
hidrolizadas y los péptidos grandes mediante una precipitación selectiva con ácido tricloroacético, seguida de filtración. Poste-
riormente, el filtrado se usa para la valoración espectrofotométrica de la actividad de proteasa, usando tirosina como calibra-
dor. Una Unidad USP de actividad de proteasa está contenida en la cantidad de pancreatina que hidroliza la caseína a una
velocidad inicial de modo que la cantidad de péptidos liberados por minuto y que no sean precipitados por el ácido tricloroa-
cético provea la misma absorbancia a 280 nm que 15 nmol de tirosina.
942 (1025) Pancreatina / Información General USP40

Se encuentran disponibles otras valoraciones para monitorear la actividad de proteasas individuales y totales en pancreatina,
y las asignaciones de unidades son específicas para cada sustrato. El éster etílico de N-acetil-L-tirosina se usa comúnmente en
las valoraciones volumétricas y espectrofotométricas (/e= 237 nm) de actividad de quimotripsina. De manera similar, el éster
etílico de N-benzoil-L-arginina se usa comúnmente en las valoraciones volumétricas y espectrofotométricas (A,= 253 nm) de la
actividad de tripsina. En ambos casos, la valoración volumétrica se basa en la hidrólisis de enlaces éster por proteasas y la libe-
ración de grupos ácidos, mientras que la valoración espectrofotométrica se basa en las propiedades cromogénicas de estos áci-
dos. El éster metílico de tolueno-sulfonil-L-arginina es otro sustrato cromogénico (/e= 247 nm) que se usa para medir la activi-
dad de tripsina. Sin embargo, estos sustratos no son proteínas y las valoraciones implican la escisión de un enlace de éster
carboxílico en lugar de un enlace peptídico.
Se han desarrollado otras valoraciones que usan péptidos cromogénicos como sustratos para mejorar la especificidad y la
sensibilidad. Asimismo, se han desarrollado valoraciones de proteasa más específicas y sensibles usando sustratos de péptidos
sintéticos cortos (de 3-5 residuos de aminoácidos) con un grupo cromogénico (4-nitroanilina) acoplado al extremo C-terminal
mediante un enlace amida. El grupo cromogénico es eliminado específicamente por proteasas y se mide fotométricamente. El
cambio en la absorbancia a 405 nm es directamente proporcional a la actividad de proteasa. Los sustratos específicos están
disponibles comercialmente para tripsina (acetato de carbobenzoxi-valil-glicil-arginina-4-nitril-anilida) y quimotripsina (clorhi-
drato de metil-O-succinoil-arginil-prolil-tirosina-4-nitril-anilida). La caseína marcada con isotiocianato de fluoresceína también
se usa como sustrato general para proteasa. La valoración se basa en que la fluorescencia de la fluoresceína es disminuida
cuando está unida a la caseína. Cuando las proteasas digieren a la caseína marcada con isotiocianato de fluoresceína en pépti-
dos más pequeños, la fluorescencia a 530 nm (excitación a 485 nm) se incrementa y se puede medir para determinar la activi-
dad de proteasa.

8.3 Actividad de Amilasa

La actividad glicolítica de la pancreatina se debe a las amilasas tipo a. Dichas enzimas catalizan la hidrólisis de los enlaces
internos a-1,4-glucano en polisacáridos que contienen tres o más unidades de o-glucosa con enlace a-1,4, lo que genera una
mezcla de maltosa y glucosa. Las dos isoformas principales (1 y 11) de amilasas porcinas tienen propiedades enzimáticas idénti-
cas. En las últimas décadas, se han desarrollado varios métodos para valorar la actividad de amilasa; muchos de estos se basan
en la detección de la hidrólisis de almidón, puesto que este polímero es el sustrato natural de amilasa. El almidón consta de
dos tipos de moléculas, amilosa (por lo general 20%-30%) y amilopectina (por lo general 70%-80%). Ambos polímeros resul-
tan del ensamble de unidades de glucosa conectadas mediante enlaces de a-1,4-glucano; además, en la amilopectina, 1 de
cada 20 residuos aproximadamente, también tiene un enlace a-(1 ~6), lo que forma puntos de ramificación.
La valoración de actividad de amilasa USP en la monografía de Pancreatina se basa en la velocidad de digestión del almidón
por la enzima, y la actividad de la muestra de prueba se calcula comparándola con una preparación estándar de enzima con
actividad conocida. El almidón es hidrolizado por la amilasa; los grupos reductores resultantes de la hidrólisis reaccionan con
yodo en solución alcalina; y el yodo en exceso se valora con tiosulfato. Una Unidad USP de actividad de amilasa se define co-
mo la cantidad de pancreatina que descompone el almidón a una velocidad inicial tal que se hidrolizan O, 16 µEq de enlace
glicosídico por minuto en las condiciones de la valoración.

APÉNDICE 1: BIBLIOGRAFÍA REGLAMENTARIA

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vity. Biochim Biophys Acta. 1969;188(2):272-282.

(1027) CITOMETRÍA DE FLUJO

INTRODUCCIÓN

La citometría de flujo es un método analítico que desempeña un papel crítico en la evaluación cuantitativa y cualitativa de
poblaciones de células en muestras de pacientes y de productos celulares. La capacidad de la citometría de flujo se basa en su
aptitud para analizar de manera rápida y confiable múltiples atributos de células individuales dentro de poblaciones de células
heterogéneas. A pesar del valor de los datos obtenidos mediante citometría de flujo, validar el método presenta desafíos-qui-
zás más que para otros métodos analíticos-debido a los errores y artefactos derivados de múltiples fuentes.
Aunque los métodos de la citometría de flujo también se pueden usar para clasificar y aislar células como parte del proceso
de fabricación para productos biológicos derivados de células y tejidos, el alcance de este capítulo se limita al uso de la citome-
tría de flujo como método analítico. Este capítulo presenta los aspectos técnicos del método, incluyendo el instrumental, el
manejo y la tinción de muestras y el análisis de datos. Las fuentes de error se consideran en el contexto de las características
técnicas, y en consideraciones de control de calidad, garantía de calidad y normalización. Por último, se presentan las aplica-
ciones actuales y principios de resolución de problemas del ensayo. Para información adicional sobre los fundamentos y aspec-
tos prácticos de la citometría de flujo, ver la edición vigente de Practica/ Flow Cytometry (Citometría de Flujo Práctica) (Shapiro,
2003).
La citometría de flujo se usa ampliamente en la caracterización de productos derivados de células y tejidos, aunque la mayo-
ría de los métodos de ensayo aún no han sido normalizados. Además de los aspectos relacionados con la complejidad técnica,
se presentan desafíos para la normalización de los métodos de citometría de flujo para clases o tipos específicos de productos
en relación con la naturaleza heterogénea de los mismos, incluso para aquellos con procesos de fabricación y usos clínicos si-
milares. Es posible que las innovaciones vigentes y futuras relacionadas con los instrumentos, los reactivos analíticos, los algo-
ritmos analíticos y la automatización, mejoren las capacidades de la tecnología, pero es poco probable que eliminen los desa-
fíos (p.ej., valoración biológica, pruebas de identificación y otras aplicaciones).
944 (1 027) Citometría de Flujo / Información General USP 40

PRINCIPIOS DE OPERACIÓN, MÉTODOS, CALIDAD V NORMALIZACIÓN

El proceso de citometría de flujo requiere que las células pasen por una fuente de luz fija que consiste en uno o más láseres,
de manera que cada célula, individualmente, se pueda observar o se puedan analizar sus características tales como tamaño,
granularidad y presencia de antígenos o moléculas intracelulares o en la superficie de la membrana. Las células se suspenden
en un líquido en el que el movimiento se controla mediante el tamaño y la configuración de las conexiones de tubos, cámaras
y bombas específicas del instrumento de citometría de flujo. El patrón de las señales de luz producido a partir de la interacción
de la luz láser con las células se captura mediante un sistema de detección, también específico del instrumento, y las señales
detectadas se transforman en datos que se pueden analizar y combinar con datos de otras células en una muestra dada. Los
datos de una suspensión de células se pueden expresar posteriormente en formatos visuales uni, bi o tridimensionales, o en
formatos numéricos, para caracterizar la muestra celular y sus subpoblaciones de manera cuantitativa y cualitativa.

Instrumental de Citometría de Flujo

A continuación se describen los citómetros de flujo, los cuales incorporan elementos para el procesamiento de señales ópti-
cas, electrónicas y de fluidos.

FLUIDOS

El sistema de fluidos mueve una mezcla a granel de células de manera que se forme una corriente de células individuales.
Dentro del citómetro de flujo, la suspensión de células individuales pasa a través de una región confinada en la que cada célula
es iluminada secuencialmente por una fuente de luz uniforme en el punto de observación (punto de análisis). La mayoría de
los instrumentos emplean una cámara de flujo (celda de flujo) la cual, después de que la muestra de células se introduce en la
punta de inyección de muestra, combina las células con fluido envolvente isotónico, usando un ensamble de boquilla cónica
diseñado geométricamente para producir un flujo laminar de fluido (Figura 1). La boquilla de salida de líquido por lo general
tiene un orificio de 50-250 µm de diámetro, a través del cual sale el fluido a una alta velocidad de flujo. Las presiones diferen-
ciales entre la corriente de la muestra de células (presión más baja) y la corriente envolvente (presión más alta) trasladan las
células/partículas en una corriente confinada. La corriente coaxial resultante dentro de una corriente es altamente eficiente y la
corriente de la muestra en el punto de observación es, por lo general, ligeramente más grande qu