Capitulo FARMACOPEA MICROBIOLOGIA

2014
USP 37 FARMACOPEA
,
AME RICA
DE LOS ESTADOS UNIDOS DE
NF 32 FORMULARIO NACIONAL
Volumen 1 Autorizados por la Convención de la Farmacopea de

los Estados Unidos de América. Preparados por el Consejo
de Expertos y sus Comités de Expertos
Oficial desde el 7º de mayo de 20 74
La designación "USP NF 2014" en la cubierta de esta publicación es sólo para

fines de identificación. La publicación contiene dos compendios separados: la
Farmacopea de los Estados Unidos de América, Trigésima Séptima Revisión, y el
Formulario Nacional, Trigésima Segunda Edición.
THE UNITED STATES PHARMACOPEIAL CONVENTION

12601 Twinbrook Parkway, Rockville, MD 20852,
Estados Unidos de América
58 (51) Pruebas de Eficacia Antimicrobiana / Pruebas Microbiológicas USP 37
Pruebas Microbiológicas
(51) PRUEBAS DE EFICACIA ANTI MICROBIANA
Los conservantes antimicrobianos son sustancias agregadas a las formas farmacéuticas no estériles para protegerlas del desa-
rrollo microbiano o de microorganismos que se introducen sin ser advertidos durante el proceso de fabricación o después de
éste. En el caso de artículos estériles dispensados en envases multidosis, los conservantes antimicrobianos se agregan para inhi-
bir el desarrollo de microorganismos que puedan introducirse por la extracción reiterada de dosis individuales.
Los conservantes antimicrobianos no deben emplearse en lugar de las buenas prácticas de fabricación o solamente para re-
ducir la población microbiana viable de un producto no estéril o para controlar la biocarga antes de la esterilización de formu-
laciones multidosis durante la fabricación. Los conservantes antimicrobianos de las formas farmacéuticas oficiales cumplen con
los requisitos para Sustancias Agregadas en Ingredientes y Procesos de las Advertencias Generales.
Todos los agentes antimicrobianos útiles son sustancias tóxicas. Para la máxima protección de los pacientes, la concentra-
ción del conservante que se indique como eficaz en el producto envasado final debe ser inferior al nivel que pueda resultar
tóxico para los seres humanos.
La concentración de un conservante antimicrobiano agregado puede mantenerse al mínimo si los ingredientes activos de la
formulación poseen eficacia antimicrobiana intrínseca. La eficacia antimicrobiana, ya sea inherente al producto o producida
por la adición de un conservante anti microbiano, debe ser demostrada para todas las inyecciones dispensadas en envases mul-
tidosis o para otros productos que contengan conservantes antimicrobianos. La eficacia antimicrobiana debe ser demostrada
para formas farmacéuticas multidosis orales y tópicas y para otras formas farmacéuticas, como por ejemplo oftálmicas, óticas,
nasales, de irrigación y líquidos de diálisis (ver Formas Farmacéuticas (1151 )).
Este capítulo estipula pruebas para demostrar la actividad de protección antimicrobiana. Los conservantes antimicrobianos
deben estar indicados en la etiqueta. Las pruebas y criterios de eficacia se aplican al producto en su envase original cerrado, en
el que fue distribuido por el fabricante.
CATEGORÍAS DE PRODUCTOS
Para los fines de las pruebas, los artículos farmacopeicos han sido divididos en cuatro categorías (ver Tabla 7). Los criterios
de eficacia antimicrobiana para estos productos se establecen en función de la ruta de administración.
Tabla 1. Categorías de Productos Farmacopeicos
Categoría Descripción del Producto
1 Inyectables, otros parenterales incluyendo emulsiones, productos áticos, productos nasales estériles y productos
oftálmicos preparados con bases o vehículos acuosos.
2 Productos empleados de manera tópica preparados con bases o vehículos acuosos, productos nasales no estéri-
les y emulsiones, incluyendo aquellos que se aplican a membranas mucosas.
3 Productos orales a excepción de antiácidos, preparados con bases o vehículos acuosos.
4 Antiácidos preparados con una base acuosa.
ORGANISMOS DE PRUEBA
Emplear cultivos de los siguientes microorganismos 1 : Candida albicans (ATCC Nº 10231 ), Aspergillus niger (ATCC Nº 16404),
Escherichia co/i (ATCC Nº 8739), Pseudomonas aeruginosa (ATCC Nº 9027) y Staphylococcus aureus (ATCC Nº 6538). Los micro-
organismos viables empleados en la prueba no deben haber sufrido más de cinco pasajes desde su extracción del cultivo origi-
nal de ATCC. Para los fines de la prueba, un pasaje se define como la transferencia de organismos desde un cultivo establecido
a un medio nuevo. Todas las transferencias se cuentan. En el caso de organismos mantenidos mediante técnicas de siembra en
lote, cada ciclo consistente en congelar, descongelar y revivir a los microorganismos en un medio nuevo se considera como
una sola transferencia. Para el almacenamiento de cultivos a largo plazo, se debe emplear una técnica de siembra a partir de
cultivo madre. Los cultivos recibidos de ATCC se deben revivir de acuerdo con las instrucciones. Si han sido desarrollados en
caldo, las células son precipitadas mediante centrifugación. Resuspender en 1 /20 el volumen del caldo de mantenimiento nue-
vo y agregar un volumen igual de 20% (v/v en agua) de glicerol estéril. Las células desarrolladas en agar pueden rasparse de la
superficie y transferirse al caldo con glicerol al 10%. Dispensar alícuotas pequeñas de la suspensión en viales estériles. Almace-
nar los viales en nitrógeno líquido o en un congelador mecánico a no más de -50º. En los casos en que se requiera un vial para
siembra madre, se puede retirar y emplear para inocular una serie de cultivos de trabajo. Los cultivos de trabajo entonces pue-
den ser empleados de forma periódica (todos los días en el caso de bacterias y levaduras) para iniciar el cultivo de inóculos.
1 Disponible en American Type Culture Collect1on, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209 (http://www.atcc.org).
USP 37 Pruebas Microbiológicas/ (51) Pruebas de Eficacia Antimicrobiana 59
MEDIOS
La promoción del crecimiento de todos los medios empleados en la prueba debe ser evaluada. Emplear los microorganismos
indicados más arriba en Organismos de Prueba.
PREPARACIÓN DE INÓCULOS
Antes de la prueba, inocular la superficie de un volumen apropiado de un medio de agar sólido proveniente de un cultivo
madre de cada microorganismo especificado revivido recientemente. Las condiciones de cultivo para el inóculo se describen
en la Tabla 2 en la que los medios apropiados son el Medio de Agar Sabouraud-Dextrosa o de Digerido de Caseína-Soja (ver
Pruebas de Recuento Microbiano (61) y Pruebas de Microorganismos Específicos (62)).
Para cosechar los cultivos bacterianos y de C. albicans, emplear solución salina SR estéril, lavando el desarrollo de la superfi-
cie, colocándolo en un recipiente apropiado y agregando suficiente solucion salina SR estéril para obtener un recuento micro-
biano de aproximadamente 1 x 108 unidades formadoras de colonias (ufc) por mL. Para cosechar las células de A. niger, em-
plear solución salina SR estéril con 0,05% de polisorbato 80 y agregar suficiente solución salina SR estéril para obtener un re-
cuento de aproximadamente 1 x 1 0 8 ufc por mL.
Alternativamente, los organismos de cultivo madre pueden desarrollarse en un medio líquido apropiado (es decir, Caldo de
Digerido de Caseína-Soja o Caldo de Sabouraud-Dextrosa) y las células se pueden cosechar mediante centrifugación, luego
lavar y resuspender en solución salina SR estéril para obtener un recuento microbiano de aproximadamente 1 x 1 0 8 ufc por
mL. [NOTA-El cálculo de la concentración de inóculo se puede realizar mediante mediciones turbidimétricas para los microor-
ganismos de desafío. Refrigerar la suspensión si no se va a emplear dentro de las 2 horas.]
Determinar el número de ufc por mL en cada suspensión, utilizando las condiciones de los medios y los tiempos de incuba-
ción para recuperación microbiana indicados en la Tabla 2 para confirmar el cálculo inicial de ufc por ml. Este valor sirve para
calibrar el tamaño del inóculo empleado en la prueba. Las suspensiones bacterianas y de levaduras se deben utilizar dentro de
las 24 horas de cosechadas, pero la preparación de hongos puede ser almacenada en refrigeración hasta 7 días.
PROCEDIMIENTO
La prueba puede realizarse ya sea en cinco recipientes originales si hay suficiente volumen de producto disponible en cada
recipiente y el recipiente del producto puede ser inoculado asépticamente (es decir, aguja o jeringa a través de un tapón de
goma elastomérico), o en cinco recipientes bacteriológicos estériles con tapa de tamaño apropiado a los que se ha transferido
un volumen suficiente de producto. Inocular cada recipiente con uno de los inóculos preparados y normalizados y mezclar. El
volumen del inóculo empleado es de entre 0,5% y 1,0% del volumen del producto. La concentración de microorganismos de
prueba agregada al producto (Categorías 7; 2 y 3) es tal que la concentración final de la preparación de prueba luego de la
inoculación está comprendida entre 1 x 10 5 y 1 x 1 0 6 ufc por mL de producto. En los productos de la Categoría 4 (antiácidos),
la concentración final de la preparación de prueba luego de la inoculación está comprendida entre 1 x 1 0 3 y 1 x 1O 4 ufc por
mL de producto.
La concentración inicial de microorganismos viables en cada preparación de prueba se calcula a partir de la concentración
de microorganismos de cada inóculo normalizado determinado mediante el método de recuento de placas.
Incubar los recipientes inoculados a 22,5 ± 2,5º. Tomar muestras de cada recipiente en los intervalos apropiados especifica-
dos en la Tabla 3. Registrar todos los cambios observados en apariencia en estos intervalos. Determinar mediante el procedi-
miento de recuento en placas el número de ufc presentes en cada preparaci'ón de prueba en los intervalos correspondientes
(ver Procedimiento en Pruebas de Recuento Microbiano (61) y Pruebas de Microorganismos Específicos (62)). Incorporar un inacti-
vador (neutralizante) del antimicrobiano específico en el recuento en placas o en la dilución apropiada preparada para el re-
cuento en placas. Estas condiciones se determinan en el estudio de validación para dicha muestra a partir de las condiciones
de los medios y los tiempos de incubación para recuperación microbiana indicados en la Tabla 2. Empleando las concentracio-
nes calculadas de ufc por mL presentes al inicio de la prueba, calcular el cambio en valores en 109 10 de la concentración de ufc
por mL de cada microorganismo en los intervalos de prueba correspondientes y expresar los cambios en términos de reduccio-
nes logarítmicas.
Tabla 2. Condiciones de Cultivo para la Preparación de lnóculos
lnóculo Recuperación
Temperatura Tiempo Microbiana
Organismo Medio Apropiado de Incubación de Incubación Tiempo de Incubación
Escherichia coli Caldo Digerido de Caseína y Soja; 32,5 ± 2,5" 18 a 24 horas 3 a 5 días
(ATCC Nº 8739) Agar Digerido de Caseína y Soja ...
Pseudomonas aeruginosa Caldo Digerido de Caseína y Soja; 32,5 ± 2,5' 18 a 24 horas 3 a 5 días
(ATCC Nº 9027) Agar Digerido de Caseína y Soja
Staphylococcus aureus Caldo Digerido de Caseína y Soja; 32,5 ± 2y 18 a 24 horas 3 a 5 días
(ATCC Nº 6538) Agar Digerido de Case1na y Soja
1
60 (51) Pruebas de Eficacia Anti microbiana / Pruebas Microbiológicas USP 37
Tabla 2. Condiciones de Cultivo para la Preparación de lnóculos (Continuación)

lnóculo Recuperación
Temperatura Tiempo Microbiana
Organismo Medio Apropiado de Incubación de Incubación Tiempo de Incubación
Candida albicans Agar Sabouraud Dextrosa; 22,5 ± 2,5º 44 a 52 horas 3 a 5 días
(ATCC Nº 10231) Caldo Sabouraud Dextrosa
Aspergillus niger Agar Sabouraud Dextrosa; 22,5 ± 2,5° 6 a 1O días 3 a 7 días
(ATCC Nº 16404) Caldo Sabouraud Dextrosa
CRITERIOS DE EFICACIA
ANTI MICROBIANA
Los requisitos de eficacia antimicrobiana se cumplen si se cumplen los criterios especificados en la Tabla 3 (ver Cifras Signifi-
cativas y Tolerancias en las Advertencias Generales). La expresión "ningún incremento" se define como no más de 0,5 unidades
de log 10 por encima del valor medido previamente.
Tabla 3. Criterios para Microorganismos Evaluados
En productos de la Categoría 7
Bacterias: A los 7 días, una reducción logarítmica de no menos de 1,0 desde el recuento calculado
en el inicio; a los 14 días, una reducción logarítmica de no menos de 3,0 del recuento
inicial; y a los 28 días ningún incremento del recuento de los 14 días.
Levaduras y Hongos Ningún incremento a los 7, 14 y 28 días respecto del recuento inicial.
Filamentosos:
Bacterias: A los 14 días, una reducción logarítmica de no menos de 2,0 desde el recuento inicial; y
a los 28 días ningún incremento del recuento de los 14 días.
Levaduras y Hongos Ningún incremento a los 14 y 28 días respecto del recuento inicial.
Filamentosos:
Bacterias: A los 14 días, una reducción logarítmica de no menos de 1,0 del recuento inicial; y a los
28 días ningún incremento del recuento de los 14 días.
Levaduras y Hongos Ningún incremento a los 14 y 28 días respecto del recuento inicial.
Filamentosos:
Bacterias, Levaduras y Hongos Filamentosos: Ningún incremento a los 14 y 28 días respecto del recuento inicial.
(55) INDICADORES BIOLÓGICOS-PRUEBAS DE RESISTENCIA
RECUENTO TOTAL DE ESPORAS. VIABLES
Para indicadores biológicos en portador de papel, retirar tres muestras del indicador biológico pertinente de sus envases in-
dividuales originales. Desmenuzar el papel hasta reducirlo a las fibras que lo componen colocando las muestras de prueba en
un vaso estéril de 250 mL de un mezclador adecuado que contenga 100 mL de Agua Purificada esterilizada y enfriada, y mez-
clando durante el tiempo que se considere adecuado para obtener una suspensión homogénea. No es inusual que se requie-
ran tiempos de mezclado de 15 minutos o más para obtener una recuperación óptima. Transferir a un tubo estéril de 16 mm x
125 mm con tapa de rosca una alícuota de 1O mL de la suspensión. Si se trata de un Indicador Biológico para Esterilización por
Vapor, Portador de Papel, calentar el tubo que contiene la suspensión en un baño de agua de 95º a 100º durante 15 minutos
(choque térmico), comenzando a medir el tiempo cuando la temperatura alcanza los 95º. Si se trata de un Indicador Biológico
para Esterilización por Calor Seco, Portador de Papel y de un Indicador Biológico para Esterilización con Óxido de Etileno, Portador de
Papel, calentar el tubo que contiene la suspensión en un baño de agua de 80º a 85º durante 1O minutos, comenzando a medir
el tiempo cuando la temperatura de la suspensión de esporas alcance los 80º. Enfriar rápidamente en un baño de hielo-agua
de Oº a 4º. Transferir a tubos adecuados dos alícuotas de 1 mL y hacer diluciones seriadas apropiadas en Agua Purificada estéril;
las diluciones se seleccionan por medio de cálculos de manera que se obtengan preferentemente entre 30 y 300 colonias, pero
no menos de 6, en cada una de las placas del par cuando se tratan según se describe a continuación. Cuando el indicador
biológico tiene una concentración baja de esporas, puede ser necesario modificar la serie de diluciones y usar más placas en
cada dilución. Preparar una serie independiente de placas para cada alícuota. Colocar 1,0 mL de cada dilución seleccionada en
cada placa de un par de placas de Petri de 15 mm x 100 mm. En un plazo de 20 minutos, agregar a cada placa 20 mL de
Medio Agar con Digerido de Caseína y Soja que se haya fundido y enfriado a una temperatura entre 45º y 50º. Agitar por rota-
USP 37 Pruebas Microbiológicas/ (55) Indicadores Biológicos 61
ción suave para obtener una suspensión homogénea y dejar solidificar. Incubar las placas en posición invertida a una tempera-
tura entre 55º y 60º para el Indicador Biológico para Esterilización por Vapor, Portador de Papel, y a una temperatura entre 30º y
35º para el Indicador Biológico para Esterilización con Óxido de Etileno, Portador de Papel y para el Indicador Biológico para Esterili-
zación por Calor Seco, Portador de Papel, o a la temperatura de recuperación óptima especificada por el fabricante. Examinar las
placas después de transcurridas 24 y 48 horas, registrando el número de colonias para cada placa, y usar el número de colo-
nias observado después de 48 horas para calcular los resultados. Calcular el número promedio de esporas por muestra a partir
de los resultados, usando el factor de dilución apropiado. La prueba es válida si el logaritmo del número de esporas por porta-
dor a las 48 horas es igual o mayor que el logaritmo del número después de 24 horas en cada caso. Para Indicador Biológico
para Esterilización por Vapor, Autocontenido, extraer asépticamente los tres portadores del envase y proceder según se indica en
Indicador Biológico para Esterilización por Vapor, Portador de Papel.
Para Indicadores Biológicos para Esterilización por Calor Húmedo, Calor Seco y Gases, Portadores Diferentes al Papel, retirar asép-
ticamente los tres portadores de su empaque o envase original. Colocar cada portador en un recipiente estéril apropiado que
contenga 1 00 mL de Agua Purificada enfriada y someter a ultrasonido o agitar en un agitador de vaivén durante un tiempo
apropiado. Para una recuperación óptima se pueden requerir 15 minutos o más. Se debe llevar a cabo un estudio previo que
garantice que el método de recuperación produzca como resultado una recuperación de por lo menos 50% a 300% del re-
cuento viable de esporas declarado. Transferir a un tubo estéril de 16 mm x 125 mm con tapa de rosca una alícuota de 1 O mL
de la suspensión. Calentar los tubos que contienen suspensiones de Bacil/us atrophaeus, Bacil/us subtilis y Bacil/us coagulans en-
tre 80º y 85º durante 1 O minutos. Calentar los tubos que contienen una suspensión de Geobacillus stearothermophilus entre 95º
y 1 00º durante 15 minutos. Comenzar a medir el tiempo cuando se alcance la temperatura más baja de los intervalos indica-
dos. Enfriar rápidamente en un baño de hielo-agua de Oº a 4º. Transferir dos alícuotas de 1 mL a tubos adecuados y hacer
diluciones seriadas apropiadas en Agua Purificada. Las diluciones seleccionadas deben ser aquellas que preferiblemente rindan
entre 30 y 300 colonias, pero no menos de 6, en cada par de placas cuando se traten según se describe a continuación. Cuan-
do el indicador biológico tiene una concentración baja de esporas, puede ser necesario modificar la serie de diluciones y usar
más placas en cada dilución. Preparar una serie independiente de placas para cada alícuota. Colocar 1,0 ml de cada dilución
seleccionada en cada placa de un par de placas de Petri de 15 mm x 1 00 mm. En un plazo de 20 minutos, agregar la alícuota
a cada placa conteniendo 20 mL de agar que se haya fundido y enfriado a una temperatura entre 45º y 50º. Agitar por rota-
ción suave para obtener una suspensión homogénea.
Para G. stearothermophilus, B. atrophaeus, B. subtilis y B. coagulans, usar Medio de Agar Digerido de Caseína y Soja, e incubar
las placas aeróbicamente en posición invertida a las siguientes temperaturas respectivas para cada microorganismo: de 55º a
60º, de 30º a 35º y de 48º a 52º, o a la temperatura óptima especificada por el fabricante del indicador biológico. Examinar las
placas después de transcurridas 24 y 48 horas. Registrar el número de colonias observado en cada placa. Calcular el número
promedio de esporas por portador a partir de los resultados, usando el factor de dilución apropiado. La prueba es válida si el
logaritmo del número de esporas por portador a las 48 horas es igual o mayor que el logaritmo del número después de 24
horas en cada caso.
Para Indicadores Biológicos para Esterilización por Calor Húmedo, Calor Seco y Gases, Suspensiones Líquidas de Esporas, usando
G. stearothermophilus, B. atrophaeus, B. subtilis y B. coagulans como indicadores biológicos, preparar una dilución seriada apro-
piada de la suspensión original de esporas en Agua Purificada enfriada contenida en un tubo estéril de 16 mm x 125 mm con
tapa de rosca y efectuar los procedimientos de recuentos de esporas viables especificados en Indicadores Biológicos para Esterili-
zación por Calor Húmedo, Calor Seco y Gases, Portadores Diferentes al Papel.
DETERMINACIÓN DEL VALOR D
Efectuar todas las pruebas descritas en esta sección bajo condiciones asépticas, usando equipo estéril para microorganismos
no termofílicos. La determinación del Valor D para G. stearothermophilus y B. coagulans se puede realizar en un ambiente con-
trolado pero no clasificado.
Aparatos
El equipo de prueba para la determinación de la resistencia microbiana se describe en detalle en la norma ISO 18472, Sterili-
zation of Health Care Products-Biological and Chemical lndicators-Test Equipment (Esterilización de Productos para el Cuidado de
la Salud-Indicadores Biológicos y Químicos-Equipo de Prueba). 1 Los detalles de los Resistómetros para Evaluación de Indicado-
res Biológicos (BIER, por sus siglas en inglés) individuales varían según su diseño y el proceso de esterilización particular con el
que se usan conjuntamente. Siempre y cuando el desempeño del BIER cumpla con los requisitos de la norma ISO para exposi-
ción del indicador biológico, se aceptan diferencias en el diseño.
1 ANSl/AAMl/ISO 18472:2006, Sterilization of Health Care Products-Biological and Chemical lndicators-Test Equipment (Esterilización de Productos para el Cuida-
do de la Salud-Indicadores Biológicos y Químicos-Equipo de Prueba). Association far the Advancement of Medical lnstrumentation (AAMI), 111 O N. Glebe Road,
Suite 220, Arlington, VA 22201-4795
62 (55) Indicadores Biológicos/ Pruebas Microbiológicas USP 37
Procedimiento
Realizar las pruebas del valor D para cada set de condiciones de esterilización aplicable según indique la etiqueta del indica-
dor biológico envasado en análisis. Tomar un número suficiente de grupos de muestras de indicadores biológicos en sus enva-
ses individuales originales, constando cada grupo de no menos de 5 muestras. El número de grupos proporciona un intervalo
de observaciones desde no menos de un valor D declarado por debajo del tiempo de supervivencia declarado, hasta no menos
de un valor D declarado por encima del tiempo de muerte declarado. Colocar cada grupo en portamuestras separados ade-
cuados que permitan exponer cada muestra a la condición de esterilización indicada en una ubicación específica en la cámara
de esterilización del BIER. Controlar los parámetros de funcionamiento del aparato BIER, usando portamuestras sin muestras.
Seleccionar una serie de tiempos de esterilización en incrementos a partir del menor tiempo para las muestras a analizar. Las
diferencias en los tiempos de esterilización a lo largo de las series son tan constantes como sea posible y la diferencia entre los
tiempos adyacentes no es mayor de 75% del valor D declarado.
Los procedimientos de prueba para el uso de resistómetros BIER en la evaluación de la resistencia microbiana se definen en
una serie de normas ISO bajo la serie 111 38. 2 · 3· 4 · 5 Se debe seguir la norma apropiada para el indicador biológico. Los métodos
de prueba y los portadores usados con el BIER se pueden adaptar a las características específicas del indicador biológico. El
método y aparatos usados para portadores de papel pueden diferir de los de otros portadores y serán sustancialmente diferen-
tes de los usados para suspensiones de indicadores biológicos.
Las condiciones de exposición para el valor D de portadores de materiales alternativos son iguales a las condiciones usadas
para determinar el valor D de portadores de papel. Si la etiqueta del fabricante permite el uso del portador de indicador bioló-
gico con múltiples métodos de esterilización, entonces los datos sobre el valor D, tiempo de supervivencia y tiempo de muerte
tendrán que ser proporcionados por el fabricante para cada método de esterilización. Es posible que los indicadores biológicos
inoculados en portadores distintos de los de papel se usen para métodos de esterilización y descontaminación por gas o vapor
tales como dióxido de cloro y peróxido de hidrógeno en fase de vapor.
Las condiciones físicas estándar para la evaluación de indicadores biológicos para uso con dióxido de cloro o peróxido de
hidrógeno en fase de vapor no han sido definidos. En el caso de dióxido de cloro, la concentración del gas, la humedad relati-
va y la temperatura son condiciones críticas del control del proceso que se pueden medir con exactitud. El fabricante de los
indicadores biológicos comercializados para uso con dióxido de cloro debería declarar las condiciones bajo las cuales se llevó a
cabo la determinación del valor D en forma tal que el usuario pueda, cuando menos, discernir la resistencia de un lote de
indicadores biológicos en comparación con sus propias condiciones de uso anticipadas. La situación con el peróxido de hidró-
geno en fase de vapor es más compleja. Diversos fabricantes de equipos han propuesto diferentes condiciones de descontami-
nación o esterilización. Por esa razón, no existe un proceso estándar para efectuar la descontaminación o esterilización de su-
perficie con peróxido de hidrógeno en fase de vapor. Como consecuencia, no existen métodos industriales estándar de evalua-
ción de indicadores biológicos para peróxido de hidrógeno en fase de vapor y se ha informado que podría no haber una corre-
lación directa entre la concentración de vapor y la velocidad o incluso la eficacia de inactivación del indicador biológico. Adi-
cionalmente, resulta difícil evaluar con exactitud la humedad relativa, que a menudo se define como un parámetro crítico para
el proceso, en presencia de peróxido de hidrógeno en forma de vapor. Por estas razones es preferible considerar la resistencia
de los indicadores biológicos como una medida relativa o comparativa del fabricante, más que como un verdadero valor D.
Por lo tanto, dependiendo del equipo y de los procesos empleados, podría ser imposible para un usuario final duplicar las
pruebas de resistencia del indicador biológico efectuadas por el fabricante.
Para Indicadores Biológicos para Esterilización por Calor Húmedo, Calor Seco y Gases, Suspensiones Líquidas de Esporas efectuar
las determinaciones del valor D para cada uno de los microorganismos que se proporcionan como una suspensión líquida de
esporas. La prueba se efectúa usando diluciones seriadas apropiadas basadas en ·el título declarado de esporas de la suspensión
en Agua Purificada en un tubo estéril.
Cuando la suspensión se coloca sobre o en un sustrato como un tapón elastomérico o un producto formulado, su resistencia
puede diferir de la determinada en Agua Purificada. La diferencia puede ser significativa para el uso de indicadores biológicos y
las medidas apropiadas hechas antes del uso en actividades de validación de la esterilización.
Recuperación
Después de completar el procedimiento de esterilización para el Indicador Biológico para Esterilización por Calor Seco, Portador
de Papel, el Indicador Biológico para Esterilización con Óxido de Etileno, Portador de Papel o el Indicador Biológico para Esterilización
2 ANSl/AAMl/ISO 11138-1 :2006, Sterilization of Health Care Products-Biological lndicators--Part 1: General requirements, 2nd ed. (Esterilización de Productos de
Salud-indicadores Biológicos-Parte 7: Requisitos generales, 2º ED.). Association far the Advancement of Medica! lnstrumentation (AAMI), 111 O N. Glebe Road, Sui-
te 220, Arlington, VA.
3 ANSl/AAMl/ISO 11138-2:2006, Sterilization of Health Care Products-Biological lndicators--Part 2: Biological lndicators far Ethylene Oxide Sterilization Proces-
ses, 3rd ed. (Esterilización de Productos para el Cuidado de la Salud-indicadores Biológicos-Parte 2: Indicadores Biológicos para Procesos de Esterilización con Óxido de
Etiieno, 3° Ed.) Association far the Advancement of Medical lnstrumentation (AAMI), 111 O N. Glebe Road, Suite 220, Arlington, VA.
4 ANSl/AAMl/ISO 11138-3:2006, Sterilization of Health Care Products-Biological lndicators--Part 3: Biological lndicators for Moist Heat Sterilization Processes.
(Esterilización de Productos para el Cuidado de la Salud-indicadores Biológicos-Parte 3: indicadores Biológicos para Procesos de Esterilización por Calor Húmedo.) Asso-
ciation far the Advancernent of Medical lnstrumentation (AAMI), 111 O N. Glebe Road, Suite 220, Arlington, VA.
5 ANSl/AAMl/ISO 11138-4:2006, Sterilization of Health Care Products-Biological lndicators-Part 4: Biological lndicators for Dry Heat Sterilization Processes.
(Esterilización de Productos para el Cuidado de la Salud-indicadores Biológicos-Parte 4: Indicadores Biológicos para Procesos de Esterilización por Calor Seco.) Associa-
tion far the Advancernent of Medical lnstrumentation (AAMI), 111 O N. Glebe Road, Suite 220, Arl1ngton, VA.
USP 37 Pruebas Microbiológicas/ (61) Examen Microbiológico 63
por Vapor, Portador de Papel, según corresponda y dentro de un tiempo determinado no mayor de 4 horas, retirar aséptica-
mente cada tira y agregarla a un medio apropiado (ver Medios en Pruebas de Esterilidad 171 \) para sumergir el indicador bioló-
gico por completo en un tubo adecuado. Para cada muestra del Indicador Biológico para Esterilización por Vapor, Autocontenido,
se sumerge la tira de papel en el medio autocontenido según las instrucciones del fabricante, dentro de un tiempo determina-
do no mayor de 4 horas. Incubar cada tubo a la temperatura óptima de recuperación especificada por el fabricante. Observar
cada tubo con medio inoculado a intervalos apropiados durante un total de 7 días después de la inoculación. (Cuando se ob-
serva crecimiento en cualquier momento de la observación en particular, se puede suspender la incubación de dicha muestra.)
Tomar nota del número de muestras que no presentan evidencia de crecimiento en ningún momento.
Para Indicadores Biológicos para Esterilización por Calor Húmedo, Calor Seco y Gases, Portadores Diferentes al Papel, la recupera-
ción de esporas de los portadores de indicador biológico seguirá los procedimientos de recuperación descritos en Recuento To-
tal de Esporas Viables. Los métodos de determinación del valor D para indicadores biológicos en portador de papel se pueden
usar para calcular el valor D de portadores diferentes al papel. Las condiciones de incubación para los microorganismos que se
pueden usar para indicadores b1olog1cos en portadores diferentes al papel se describen en la sección Recuento Total dr Esporas
Viables.
Para Indicadores Biológicos para Esterilización por Calor Húmedo, Calor Seco y Gases, Suspensiones Líquidas de Esporas, los méto-
dos de recuperación después de la exposición a las condiciones de esterilización son aquellos descritos en la sección Recuento
Total de Esporas Viables para suspensiones líquidas y cuando se hace una determinación del valor D por calor seco a partir de
suspensiones de B. atrophaeus, se siguen los mismos procedimientos de recuperación descritos en Indicador Biológico para Este-
rilización por Vapor, Portador de Papel.
Cuando se usa C. sporogenes como indicador biológico, los métodos para la preparación e inoculación, así como los méto-
dos y medios de recuperación, deben adaptarse al uso de este formador de esporas anaeróbico.
Cálculos
La determinación de los valores D de los indicadores biológicos se puede efectuar usando el Método de Spearman-Karber
Limitado, el Método de la Curva de Supervivencia o los procedimientos de Stumbo-Murphy-Cochran. 6• 7• 8 Para determinar los
valores D, es preferible usar el mismo método definido por el fabricante del indicador biológico. El uso de un método distinto
puede producir diferencias que son más un artefacto del método que una variación en el desempeño del indicador biológico.
Tiempo de Supervivencia y Tiempo de Muerte
Tomar dos grupos, cada uno integrado por 1 O muestras del indicador biológico pertinente, en sus envases individuales origi-
nales. Colocar las muestras de un grupo en un portamuestras adecuado que permita exponer cada muestra a las condiciones
de esterilización en una ubicación específica en la cámara BIER.
Exponer las muestras durante el tiempo de supervivencia requerido, ingresar a la cámara y retirar los portamuestras con las
1 O muestras. Repetir el procedimiento anterior inmediatamente, o precalentar si transcurrió un tiempo sustancial, para some-
ter el segundo portamuestras con 1 O muestras a condiciones similares a las primeras pero durante el tiempo de muerte reque-
rido.
El Tiempo de supervivencia y el tiempo de muerte para todos los indicadores biológicos con monografías se describe en la co-
rrespondiente monografía oficial bajo el encabezamiento de cada uno.
(61 > EXAMEN MICROBIOLÓGICO DE PRODUCTOS NO

ESTÉRILES: PRUEBAS DE RECUENTO MICROBIANO
INTRODUCCIÓN
Las pruebas que se describen en este capítulo permitirán el recuento cuantitativo de bacterias mesófilas y hongos que pue-
den desarrollarse en condiciones aeróbicas.
Las pruebas han sido diseñadas principalmente para determinar si una sustancia o preparación cumple con una especifica-
ción establecida de calidad microbiológica. Si se emplean con tales propósitos, seguir las instrucciones que se indican a conti-
nuación, incluyendo el número de muestras a tomar, e interpretar los resultados según se indica más abajo.
6 Pflug, 1.). Syflabus far an fntroductory Course in the Microbio!ogy and Engineerinq of SteofiLalion Processes, 4th ed. St. Paul, MN: Environmental Sterilization Services,
1980.
7 Pflug, l.)., and G.M. Smith. The Use of Biological lndicators tor Monitoring Wet-Heat Sterili1ation Processes, in Sterilization of Medica/ Products, ed. E.R.L. Gaugh-
ran and K. Kereluk. New Brunswick, NJ: johnson and )ohnson, 1977, 193--230.
8 Holcomb, R.G., and l.j. Pflug. The Spearman-Karber Method of Analyzing Quantal A'5ay Microbial Destruction Data, in Microbio/oqy and Fngineering Sterifization
ProceS1es, ed. l.). Pflug. St. Paul. MN: rnvironmental Sterili1ation Services, 1979.
64 (61) Examen Microbiológico /Pruebas Microbiológicas USP 37
Los métodos no son aplicables a productos que contengan microorganismos viables como ingredientes activos.
Pueden utilizarse procedimientos microbiológicos alternativos, incluidos los métodos automatizados, siempre que se haya
demostrado su equivalencia con el método Farmacopeico.
PROCEDIMIENTOS GENERALES
Realizar la determinación en condiciones diseñadas para evitar la contaminación microbiana extrínseca del producto a exa-
minar. Las precauciones a tomar para evitar la contaminación deben ser tales que no afecten a ningún microorganismo que
deba detectarse en la prueba.
Si el producto a examinar posee actividad antimicrobiana, ésta debe eliminarse o neutralizarse en la medida de lo posible. Si
se usan inactivadores para este fin, se debe demostrar su eficacia y la ausencia de toxicidad para los microorganismos.
Si se emplean sustancias tensoactivas en la preparación de la muestra, se debe demostrar la ausencia de toxicidad para los
microorganismos y su compatibilidad con cualquier inactivador usado.
MÉTODOS DE RECUENTO
Usar, según se indica, el método de Filtración por Membrana o uno de los Métodos de Recuento en Placa. El Método del Núme-
ro Más Probable (NMP) es generalmente el método de recuento microbiano menos exacto; sin embargo, para algunos grupos
de productos con biocarga muy baja, puede resultar el método más apropiado.
La elección de un método se basa en factores tales como la naturaleza del producto y el límite de microorganismos requeri-
do. El método seleccionado debe permitir el análisis de un tamaño de muestra suficiente para juzgar el cumplimiento con la
especificación. Se debe establecer la aptitud del método seleccionado.
PRUEBA DE PROMOCIÓN DEL CRECIMIENTO, APTITUD DEL MÉTODO DE RECUENTO Y

CONTROLES NEGATIVOS
Consideraciones Generales
Se debe establecer la aptitud de la prueba para detectar microorganismos en presencia del producto a examinar.
Se debe confirmar la aptitud si se introduce un cambio en la realización de la prueba o en el producto que pudiera afectar
los resultados del análisis.
Preparación de Cepas de Prueba
Usar suspensiones estables estandarizadas de cepas de prueba o preparar según se indica más abajo. Las técnicas de mante-
nimiento de cultivos de lote de siembra (sistemas de lote de siembra) se usan para que los microorganismos viables empleados
para inoculación correspondan a no más de cinco pasajes desde el lote de siembra maestro original. Cultivar, por separado,
cada cepa bacteriana y fúngica de prueba según se indica en la Tabla 7.
Tabla 1. Preparación y Uso de Microorganismos de Prueba
Aptitud del Método de Recuento en
Promoción del Crecimiento Presencia del Producto
Recuento Total Recuento To-
Recuento Total de de Hongos Fila- Recuento Total de tal de Hongos
Preparación de Ce- Microorganismos Ae- mentosos y Le- Microorganismos Filamentosos y
Microorganismo pas de Prueba robios vaduras Aerobios Levaduras
Staphy/acoccus aureus por Agar Digerido de Caseí- Agar Digerido de Caseína Agar Digerido de Caseí-
ejemplo ATCC 6538, na y Soja o Caldo Di- y Soja y Caldo Digerido na y Soja/NMP Caldo
NCIMB 9518, CIP 4.83 o gerido de Caseína y de Caseína y Soja So 100 Digerido de Caseína y
NBRC 13276 Soja 30º-35º ufc Soja So 1 00 ufc
18-24 horas 30º-35º So 3 días 30º-35º So 3 días
Pseudomonas aeruginosa Agar Digerido de Caseí- Agar Digerido de Caseína Agar Digerido de Caseí-
por ejemplo ATCC 9027, na y Soja o Caldo Di- y Soja y Caldo Digerido na y Soja/NMP Caldo
NCIMB 8626, CIP 82.118 gerido de Caseína y de Caseína y Soja So 1 00 Digerido de Caseína y
o NBRC 13275 Soja 30º-35º ufc Soja So 1 00 ufc
Bacillus subtilis por ejem- Agar Digerido de Caseí- Agar Digerido de Caseína Agar Digerido de Caseí-
plo ATCC 6633, NCIMB na y Soja o Caldo Di- y Soja y Caldo Digerido na y Soja/NMP Caldo
8054, CIP 52.62 o NBRC gerido de Caseína y de Caseína y Soja So 100 Digerido de Caseína y
3134 Soja 30º-35º ufc Soja So 100 ufc
Tabla 1. Preparación y Uso de Microorganismos de Prueba (Continuación)

Aptitud del Método de Recuento en
Promoción del Crecimiento Presencia del Producto
Recuento Total Recuento To-
Recuento Total de de Hongos Fila- Recuento Total de tal de Hongos
Preparación de Ce- Microorganismos Ae- mentosos y Le- Microorganismos Filamentosos y
Microorganismo pas de Prueba robios vaduras Aerobios Levaduras
Candida albicans por ejem- Agar Sabouraud Dextro- Agar Digerido de Caseína Agar Sabouraud Agar Digerido de Caseí- Agar Sabouraud
plo ATCC 1 0231, NCPF sa o Caldo Sabouraud y Sojas 100 ufc Dextrosa s 1 00 na y Soja s 100 ufc Dextrosa s 100
3179, JP 48.72 o NBRC Dextrosa 20º-25º 2-3 30º-35º s 5 días ufc 20º-25º s 5 30º-35º s 5 días NMP: ufc 20º-25º s 5
1594 días días no aplica días
Aspergillus brasi/iensis por Agar Sabouraud Dextro- Agar Digerido de Caseína Agar Sabouraud Agar Digerido de Caseí- Agar Sabouraud
ejemplo ATCC 16404, sa o Agar Papa Dextro- y Sojas 100 ufc Dextrosa s 100 na y Soja s 100 ufc Dextrosa s 1 00
IMI 149007, IP 1431.83 sa 20º-25º 30º-35º s 5 días ufc 20º-25º s 5 30º-35º s 5 días NMP: ufc 20º-25ºS 5
o NBRC 9455 5-7 días o hasta alean- días no aplica días
zar una buena esporu-
lación
Usar Solución Amortiguada de Cloruro de Sodio-Peptona de pH 7,0 o Solución Amortiguadora de Fosfato de pH 7,2 para realizar
las suspensiones de prueba; para suspender esporas de A. brasiliensis, se puede añadir 0,05% de polisorbato 80 a la solución
amortiguadora. Utilizar las suspensiones dentro de las 2 horas o dentro de las 24 horas si se almacenan a una temperatura
entre 2º y 8º. Como alternativa para la preparación y posterior dilución de una suspensión fresca de las células vegetativas de
A. brasiliensis o B. subtilis, preparar una suspensión estable de esporas y luego usar un volumen apropiado de la suspensión de
esporas para la inoculación de prueba. La suspensión estable de esporas puede mantenerse a una temperatura de 2º a 8º du-
rante un período validado.
Control Negativo
Para verificar las condiciones de prueba, realizar un control negativo usando el diluyente seleccionado en lugar de la prepa-
ración de prueba. No debe observarse crecimiento de microorganismos. Asimismo, realizar un control negativo al analizar los
productos según se indica en Pruebas de Productos. Es necesario investigar cualquier falla en el control negativo.
Promoción del Crecimiento de los Medios
Analizar cada partida de medio listo para usar y cada partida de medio preparado a partir de medio deshidratado o de los
ingredientes indicados.
Inocular porciones/placas de Caldo Digerido de Caseína y Soja y Agar Digerido de Caseína y Soja con un número pequeño (no
más de 100 ufc) de los microorganismos indicados en la Tabla 7, empleando una porción/placa individual de medio para cada
uno. Inocular placas de Agar Sabouraud Dextrosa con un número pequeño (no más de 100 ufc) de los microorganismos indica-
dos en la Tabla 7, empleando una placa individual de medio para cada uno. Incubar de acuerdo con las condiciones descritas
en la Tabla 7.
Para medios sólidos, el crecimiento obtenido no debe diferir en un factor mayor de 2 a partir del valor calculado para un
inóculo estandarizado. Para un inóculo recién preparado, se produce un cr~cimiento de microorganismos comparable al obte-
nido anteriormente con una partida de medio analizada y aprobada previamente. Los medios líquidos son adecuados si se pro-
duce un crecimiento claramente visible de microorganismos comparable al obtenido anteriormente con una partida de medio
analizada y aprobada previamente.
Aptitud del Método de Recuento en Presencia del Producto
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA
El método para preparar la muestra depende de las características físicas del producto a examinar. Si ninguno de los procedi-
mientos que se describen a continuación resultara satisfactorio, se debe desarrollar un procedimiento alternativo adecuado.
Productos Solubles en Agua-Disolver o diluir (por lo general se prepara una dilución 1 en 1O) del producto a examinar
en Solución Amortiguada de Cloruro de Sodio-Peptona de pH 7,0, en Solución Amortiguadora de Fosfato de pH 7,2 o en Caldo Di-
gerido de Caseína y Soja. Si fuera necesario, ajustar a un pH de 6 a 8. Preparar diluciones adicionales, con el mismo diluyente, si
fuera necesario.
Productos No Grasos Insolubles en Agua-Suspender el producto a analizar (por lo general se prepara una dilución 1 en
1O) en Solución Amortiguada de Cloruro de Sodio-Peptona de pH 7,0, en Solución Amortiguadora de Fosfato de pH 7,2 o en Caldo
Digerido de Caseína y Soja. Se puede añadir un agente tensoactivo, tal como 1 g por L de polisorbato 80, para favorecer la
suspensión de sustancias poco humectables. Si fuera necesario, ajustar a un pH de 6 a 8. Preparar diluciones adicionales, con el
mismo diluyente, si fuera necesario.
66 (61) Examen Microbiológico /Pruebas Microbiológicas USP 37
Productos Grasos-Disolver el producto a examinar en miristato de isopropilo esterilizado por filtración o mezclarlo con la
cantidad mínima necesaria de polisorbato 80 estéril u otro reactivo tensoactivo estéril no inhibitorio que se calienta, si fuera
necesario, a no más de 40º o, en casos excepcionales, a no más de 45º. Mezclar cuidadosamente y, si fuera necesario, mante-
ner la temperatura en un baño de agua. Agregar una cantidad suficiente del diluyente seleccionado precalentado para obtener
una dilución 1 en 1O del producto original. Mezclar cuidadosamente, manteniendo la temperatura durante el menor tiempo
necesario para la formación de una emulsión. Se puede preparar una serie de diluciones decimales adicionales empleando el
diluyente seleccionado que contenga una concentración adecuada de polisorbato 80 estéril u otro reactivo tensoactivo estéril
no inhibitorio.
Líquidos o Sólidos en Forma de Aerosol-Transferir el producto asépticamente a un aparato con filtro de membrana o un
recipiente estéril para un muestreo posterior. Usar el contenido completo o una cantidad definida de dosis fijas de cada envase
analizado.
Parches Transdérmicos-Retirar las láminas protectoras ("cubiertas de protección") de los parches transdérmicos y colo-
carlas, con el adhesivo hacia arriba, sobre bandejas de vidrio o plástico estériles. Cubrir la superficie adhesiva con un material
poroso estéril adecuado (p.ej., gasa estéril) para prevenir que los parches se peguen unos a otros y transferirlos a un volumen
adecuado del diluyente seleccionado que contenga inactivadores tales como polisorbato 80 y/o lecitina. Agitar la preparación
vigorosamente por lo menos durante 30 minutos.
INOCULACIÓN Y DILUCIÓN
Agregar a la muestra, preparada según las instrucciones previas, y a un control (sin incluir material de la prueba) un volumen
suficiente de suspensión microbiana para obtener un inóculo de no más de 100 ufc. El volumen de la suspensión del inóculo
no debe exceder del 1% del volumen del producto diluido.
Para demostrar una recuperación microbiana aceptable del producto, se debe usar el factor de dilución más bajo posible de
la muestra preparada para la prueba. Si esto no fuera posible debido a la actividad antimicrobiana o la baja solubilidad, deben
desarrollarse otros protocolos adecuados. Si la inhibición del crecimiento por la muestra no puede evitarse de cualquier otra
manera, la alícuota de suspensión microbiana puede agregarse después de la neutralización, la dilución o la filtración.
NEUTRALIZACIÓN/ELIMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA
Comparar el número de microorganismos recuperados a partir de la muestra preparada, diluida según se indica en Inocula-
ción y Dilución e incubada siguiendo el procedimiento descrito en Recuperación de Microorganismos en Presencia del Producto,
con el número de microorganismos recuperados a partir de la preparación de control.
Si se inhibe el crecimiento (reducción en un factor mayor de 2), modificar el procedimiento para la prueba de recuento par-
ticular con el objeto de garantizar la validez de los resultados. La modificación del procedimiento puede incluir, por ejemplo,
(1) Un aumento en el volumen del diluyente o medio de cultivo;
(2) Incorporación de agentes neutralizantes generales o específicos en el diluyente;
(3) Filtración por membrana; o
(4) Una combinación de todas las medidas anteriores.
Agentes Neutralizantes-Los agentes neutralizantes pueden usarse para neutralizar la actividad de los agentes antimicro-
bianos (ver la Tabla 2). Pueden añadirse al diluyente seleccionado o al medio, preferentemente antes de la esterilización. Si se
usan, se debe demostrar su eficacia y la ausencia de toxicidad para los microorganismos mediante un blanco con neutralizador
y sin el producto. ·
Tabla 2. Agentes Neutralizantes Comunes/Métodos para
Sustancias de Interferencia
Agentes Neutrallzantes
Sustancia de Interferencia Potenciales/Método
Glutaraldehído, mercuriales Sulfito ácido de sodio (Bisulfito de sodio)
Fenólicos, alcohol, aldehídos, sorbato Dilución
Aldehídos Glicina
Compuestos de amonio cuaternario (CAC), parahidroxibenzoatos (parabenos), bis-biguanidas Lecitina
CAC, yodo, parabenos Polisorbato
Mercuriales Tioglicolato
Mercuriales, halógenos, aldehídos Tiosulfato
EDTA (edetato) Iones de Mg o Ca
Si no se encuentra un método de neutralización adecuado, puede suponerse que la imposibilidad de aislar el microorganis-
mo inoculado es atribuible a la actividad microbicida del producto. Esta información permite deducir que no es probable que
el artículo se contamine con esa determinada especie de microorganismo. No obstante, es posible que el producto inhiba sola-
mente algunos microorganismos especificados en este capítulo pero que no inhiba otros no incluidos entre las cepas de prue-
ba o aquellos para los cuáles éstas no son representativas. En consecuencia, realizar la prueba con el factor de dilución más alto
compatible con el crecimiento microbiano y el criterio de aceptación específico.
RECUPERACIÓN DE MICROORGANISMOS EN PRESENCIA DEL PRODUCTO
Para cada uno de los microorganismos en la lista, realizar pruebas individuales. Contar sólo los microorganismos de la cepa
de prueba agregada.
Filtración por Membrana-Usar filtros de membrana con un tamaño nominal de poro no mayor de 0,45 pm. Escoger el
tipo de material del filtro de manera que la eficiencia en la retención de bacterias no se vea afectada por los componentes de
la muestra a investigar. Usar un filtro de membrana para cada uno de los microorganismos mencionados.
Transferir una cantidad adecuada de la muestra preparada según se indica en Preparación de la Muestra, Inoculación y Dilu-
ción y Neutralización/Eliminación de la Actividad Antimicrobiana (que preferiblemente represente 1 g del producto, o menos si se
espera un gran número de ufc) al filtro de membrana, filtrar inmediatamente y enjuagar el filtro de membrana con un volu-
men adecuado de diluyente.
Para determinar el recuento total de microorganismos aerobios (RTMA), transferir el filtro de membrana a la superficie del
Agar Digerido de Caseína y Soja. Para determinar el recuento total combinado de hongos filamentosos y levaduras (RTCHL),
transferir la membrana a la superficie del Agar Sabouraud Dextrosa. Incubar las placas según se indica en la Tabla 1. Realizar el
recuento.
Métodos de Recuento en Placa-Aplicar los métodos de recuento en placa al menos por duplicado para cada medio y
usar el recuento medio del resultado.
Método de Vertido en Placa-Para placas de Petri de 9 cm de diámetro, agregar a la placa 1 mL de la muestra preparada
según se indica en Preparación de la Muestra, Inoculación y Dilución y Neutralización/Eliminación de la Actividad Antimicrobiana y
de 15 a 20 ml de Agar Digerido de Caseína y Soja o Agar Sabouraud Dextrosa, manteniendo la temperatura de ambos medios a
no más de 45º. Si se emplean placas de Petri más grandes, aumentar la cantidad del medio de agar proporcionalmente. Em-
plear al menos dos placas de Petri para cada microorganismo mencionado en la Tabla 1.
Incubar las placas según se indica en la Tabla 1. Tomar la media aritmética de los recuentos obtenidos en cada medio y
calcular el número de ufc en el inóculo original.
Método de Extensión en Superficie-Agregar de 15 a 20 mL de Agar Digerido de Caseína y Soja o Agar Sabouraud Dextrosa a
cada placa de Petri de 9 cm de diámetro, aproximadamente a 45º, y dejar solidificar. Si se emplean placas de Petri más gran-
des, aumentar el volumen del agar proporcionalmente. Secar las placas, por ejemplo, en un gabinete con flujo de aire laminar
o en una incubadora. Emplear al menos dos placas de Petri para cada microorganismo mencionado en la Tabla 1. Esparcir un
volumen medido de no menos de O, 1 mL de la muestra, preparada según se indica en Preparación de la Muestra, Inoculación y
Dilución y Neutralización/Eliminación de la Actividad Antimicrobiana sobre la superficie del medio. Incubar y realizar el recuento
según se indica en Método de Vertido en Placa.
Método del Número Más Probable (NMP)-La precisión y exactitud del Método del NMP son menores que las del méto-
do de Filtración por Membrana o el Método de Recuento en Placa. Los resultados no confiables se obtienen particularmente para
el recuento de hongos filamentosos. Por estas razones, el Método del NMP se reserva para el RTMA en situaciones en las que no
haya otro método disponible. Si se justifica el empleo del método, proceder de la siguiente manera:
Preparar una serie de al menos tres diluciones decimales en serie del producto según se indica en Preparación de la Muestra,
Inoculación y Dilución y Neutralización/Eliminación de Actividad Antimicrobiana. A partir de cada nivel de dilución, usar tres alí-
cuotas de 1 g o 1 ml para inocular tres tubos con 9 a 1 O ml de Caldo Digerido de Caseína y Soja. Si fuera necesario, se puede
agregar al medio un agente tensoactivo, tal como polisorbato 80, o un inactivador de agentes anti microbianos. Por lo tanto, si
se preparan tres niveles de dilución, inocular nueve tubos.
Incubar todos los tubos a una temperatura de 30º a 35º durante no más de 3 días. Si la lectura de los resultados resulta
difícil o dudosa dada la naturaleza del producto a examinar, subcultivar en el mismo caldo o en Agar Digerido de Caseína y Soja
durante un período de 1 a 2 días a la misma temperatura y usar estos resultados. A partir de la Tabla 3, determinar el número
más probable de microorganismos por g o por ml del producto a examinar.
Tabla 3. Valores del Número Más Probable de Microorganismos
Combinaciones Observadas de Números de NMP porgo Límites
Tubos que Muestran Crecimiento en Cada por ml de de Confianza
Juego Producto de 950/o
Número de g o ml de Producto por Tubo
0,1 0,01 0,001
o o o <3 0-9,4
o o 1 3 0,1-9,5
o 1 o 3 0,1-10
o 1 1 6,1 1,2-17
o 2 o 6,2 1,2-17
o 3 o 9,4 3,5-35
68 (61) Examen Microbiológico /Pruebas Mícrobíológícas USP 37
Tabla 3. Valores del Número Más Probable de Microorganismos (Continuación)

Combinaciones Observadas de Números de NMP porgo Límites
Tubos que Muestran Crecimiento en Cada por ml de de Confianza
Juego Producto de95%
Número de g o ml de Producto por Tubo
0,1 0,01 0,001
1 o o 3,6 0,2-17
1 o 1 7,2 1,2-17
1 o 2 11 4-35
1 1 o 7,4 1,3-20
1 1 1 11 4-35
1 2 o 11 4-35
1 2 1 15 5-38
1 3 o 16 5-38
2 o o 9,2 1,5-35
2 o 1 14 4-35
2 o 2 20 5-38
2 1 o 15 4-38
2 1 1 20 5-38
2 1 2 27 9-94
2 2 o 21 5-40
2 2 1 28 9-94
2 2 2 35 9-94
2 3 o 29 9-94
2 3 1 36 9-94
3 o o 23 5-94
3 o 1 38 9-104
3 o 2 64 16-181
3 1 o 43 9-181
3 1 1 75 17-199
3 1 2 120 30-360
3 1 3 160 30-380
3 2 o 93 18-360
3 2 1 150 30-380
3 2 2 210 30-400
3 2 3 290 90-990
3 3 o 240 40-990
3 3 1 460 90-1980
3 3 2 1100 200-4000
3 3 3 >1100
RESULTADOS E INTERPRETACIÓN
Al verificar la aptitud del método de Filtración por Membrana o del Método de Recuento en Placa, se debe obtener un recuento
medio de cualquier microorganismo de prueba que no difiera en un factor mayor de 2 del valor del control definido en Inocu-
lación y Dilución en la ausencia del producto. Al verificar la aptitud del Método del NMP, el valor calculado a partir del inóculo
debe estar dentro de los límites de confianza de 95% de los resultados obtenidos con el control.
Si los criterios mencionados anteriormente no pueden cumplirse para uno o más de los microorganismos analizados con
cualquiera de los métodos descritos, se debe utilizar para examinar el producto, el método y las condiciones de prueba más
cercanas a esos criterios.
PRUEBA DE PRODUCTOS
Cantidad Usada para la Prueba
A menos que se indique algo diferente, usar 1Og o 1O mL del producto a examinar, tomados con las precauciones mencio-
nadas anteriormente. Para líquidos o sólidos en forma de aerosol, muestrear 1O envases. Para parches transdérmicos, mues-
trear 1O parches.
Se puede reducir la cantidad a analizar de las sustancias activas que se formulan en las siguientes condiciones: la cantidad
por unidad de dosificación (por ej., tableta, cápsula, inyección) es menor o igual a 1 mg o la cantidad por g o mL (para prepa-
raciones que no se presentan en unidades de dosificación) es menor de 1 mg. En estos casos, la cantidad de la muestra a anali-
zar no es menor que la cantidad presente en 1O unidades de dosificación o 1O g o 1O mL del producto.
Para materiales que se usan como sustancias activas en los que la cantidad de la muestra es limitada o el tamaño de la parti-
da es extremadamente pequeño (es decir, menos de 1000 mL o 1000 g), la cantidad analizada debe ser 1% de la partida a
menos que se indique, o justifique y autorice una cantidad menor.
Para productos cuyo número total de entidades en una partida es menor de 200 (por ej. muestras que se usan en ensayos
clínicos), el tamaño de la muestra puede reducirse a dos unidades o a una unidad si el tamaño es menor de 1OO.
Escoger la(s) muestra(s) aleatoriamente a partir del material a granel o de los envases disponibles de la preparación. Para
obtener la cantidad requerida, mezclar los contenidos de un número suficiente de envases para proporcionar la muestra.
Examen del Producto
FILTRACIÓN POR MEMBRANA
Usar un aparato de filtración diseñado para permitir la transferencia del filtro al medio. Preparar la muestra empleando un
método cuya aptitud se haya demostrado según se indica en Prueba de Promoción del Crecimiento y Aptitud del Método de Re-
cuento, transferir la cantidad adecuada a dos filtros de membrana y filtrar inmediatamente. Lavar cada filtro siguiendo el proce-
dimiento que haya demostrado su aptitud.
Para determinar el RTMA, transferir uno de los dos filtros de membrana a la superficie del Agar Digerido de Caseína y Soja.
Para determinar el RTCHL, transferir la otra membrana a la superficie del Agar Sabouraud Dextrosa. Incubar la placa de Agar
Digerido de Caseína y Soja a una temperatura de 30º a 35º durante un período de 3 a 5 días y la placa de Agar Sabouraud
Dextrosa a una temperatura de 20º a 25º durante un período de 5 a 7 días. Calcular el número de ufc por g o por mL del
producto.
Al examinar los parches transdérmicos, filtrar por separado 10% del volumen de la preparación descrita en Preparación de la
Muestra a través de cada una de las dos membranas de filtración estériles. Transferir una membrana al Agar Digerido de Caseína
y Soja para el RTMA y la otra membrana al Agar Sabouraud Dextrosa para el RTCHL.
MÉTODOS DE RECUENTO EN PLACA
Método de Vertido en Placa-Preparar la muestra empleando un método cuya aptitud se haya demostrado según se des-
cribe en Prueba de Promoción del Crecimiento y Aptitud del Método de Recuento. Preparar al menos dos placas de Petri para cada
medio por cada nivel de dilución. Incubar las placas de Agar Digerido de Caseína y Soja a una temperatura entre 30º y 35º
durante un período de 3 a 5 días y las placas de Agar Sabouraud Dextrosa á una temperatura entre 20º y 25º durante un perío-
do de 5 a 7 días. Escoger las placas correspondientes a una dilución determinada y que muestren el mayor número de colo-
nias, menor de 250 para el RTMA y 50 para el RTCHL. Tomar la media aritmética de los recuentos por medio de cultivo y cal-
cular el número de ufc por g o por mL del producto.
Método de Extensión en Superficie-Preparar la muestra empleando un método cuya aptitud se haya demostrado según
se describe en Prueba de Promoción del Crecimiento y Aptitud del Método de Recuento. Preparar al menos dos placas de Petri para
cada medio y cada nivel de dilución. Para la incubación y cálculo del número de ufc, proceder según se indica en el Método de
Vertido en Placa.
MÉTODO DEL NÚMERO MÁS PROBABLE
Preparar y diluir la muestra empleando un método cuya aptitud se haya demostrado según se describe en Prueba de Promo-
ción del Crecimiento y Aptitud del Método de Recuento. Incubar todos los tubos durante un período de 3 a 5 días a una tempera-
tura de 30º a 35º. Subcultivar, si fuera necesario, empleando el procedimiento cuya aptitud se haya demostrado. Registrar para
cada nivel de dilución el número de tubos que muestran crecimiento microbiano. A partir de la Tabla 3, determinar el número
más probable de microorganismos por g o por mL del producto a examinar.
70 (61) Examen Microbiológico / Pruebas Microbiológicas USP 37
Interpretación de los Resultados
El recuento total de microorganismos aerobios (RTMA) se considera equivalente al número de ufc encontrado usando Agar
Digerido de Caseína-Soja; si se detectan colonias de hongos en este medio, contarlas como parte del RTMA. El recuento total
combinado de hongos filamentosos y levaduras (RTCHL) se considera equivalente al número de ufc encontrado empleando
Agar Sabouraud Dextrosa; si se detectan colonias de bacterias en este medio, contarlas como parte del RTCHL. Cuando se espe-
ra que el RTCHL exceda el criterio de aceptación debido al crecimiento bacteriano, se puede usar Agar Sabouraud Dextrosa que
contenga antibióticos. Si se realiza el recuento mediante el Método del MNP, el valor calculado es RTMA.
Cuando se indica un criterio de aceptación para la calidad microbiológica, éste se interpreta de la siguiente manera:
- 10 1 ufc: recuento máximo aceptable = 20;
- 102 ufc: recuento máximo aceptable = 200;
- 10 3 ufc: recuento máximo aceptable = 2000;
y así sucesivamente.
Las soluciones y medios recomendados se indican en Pruebas de Microorganismos Específicos (62).
(62) EXAMEN MICROBIOLÓGICO DE PRODUCTOS NO

ESTÉRILES: PRUEBAS DE MICROORGANISMOS ESPECÍFICOS
INTRODUCCIÓN
Las pruebas que se describen en este capítulo permitirán determinar la ausencia, o presencia limitada, de microorganismos
específicos que puedan ser detectados en las condiciones descritas.
Las pruebas han sido diseñadas principalmente para determinar si una sustancia o preparación cumple con alguna especifi-
cación establecida de calidad microbiológica. Si se emplean con tales propósitos, seguir las instrucciones que se indican a con-
tinuación, incluyendo el número de muestras a tomar, e interpretar los resultados según se indica más abajo.
Pueden utilizarse procedimientos microbiológicos alternativos, incluyendo métodos automatizados, siempre que se haya de-
mostrado su equivalencia con el método farmacopeico.
PROCEDIMIENTOS GENERALES
La preparación de muestras se realiza según se indica en Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Recuento
Microbiano (61 ).
Si el producto a examinar posee actividad antimicrobiana, ésta debe eliminarse o neutralizarse en la medida de lo posible
según se describe en Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Recuento Microbiano (61 ).
Si se emplean sustancias tensoactivas en la preparación de la muestra, se debe demostrar su ausencia de toxicidad para los
microorganismos y su compatibilidad con cualquier inactivador usado, según se describe en Examen Microbiológico de Produc-
tos No Estériles: Pruebas de Recuento Microbiano (61 ).
PROPIEDADES DE PROMOCIÓN DEL CRECIMIENTO E INHIBITORIAS DE LOS MEDIOS,

APTITUD DE LA PRUEBA Y CONTROLES NEGATIVOS
Se debe establecer la capacidad de la prueba para detectar microorganismos en presencia del producto a examinar. Se debe
confirmar la aptitud de la prueba si se introduce un cambio en la ejecución de la prueba o en el producto que pudiera afectar
los resultados.
Preparación de Cepas de Prueba
Usar suspensiones estables estandarizadas de cepas de prueba según se indica más abajo. Las técnicas de mantenimiento de
cultivos de lote de siembra (sistemas de lote de siembra) se usan para que los microorganismos viables empleados para inocu-
lación correspondan a no más de cinco pasajes desde el lote de siembra maestro original.
MICROORGANISMOS AEROBIOS
Cultivar por separado cada cepa bacteriana de prueba en recipientes que contengan Caldo Digerido de Caseína y Soja o Agar
Digerido de Caseína y Soja a una temperatura de 30º a 35º durante un período de 18 a 24 horas. Cultivar por separado la cepa
USP 37 Pruebas Microbiológicos/ (62) Examen Microbiológico 71
de prueba de Candida albicans en Agar Sabouraud Dextrosa o Caldo Sabouraud Dextrosa a una temperatura de 20º a 25º duran-
te un período de 2 a 3 días.
Staphyfococcus aureus Por ejemplo ATCC 6538, NCIMB 9518, CIP 4.83 o NBRC 13276
Pseudomonas aeruginosa Por ejemplo ATCC 9027, NCIMB 8626, CIP 82.118 o NBRC
13275
Escherichia cofi Por ejemplo ATCC 8739, NCIMB 8545, CIP 53.126 o NBRC
3972
Safmonefla enterica subesp. enterica serovar Typhimurium o, como alternativa, Por ejemplo ATCC 14028
Salmonefla enterica subesp. enterica serovar Abony Por ejemplo NBRC 100797, NCTC 6017 o CIP 80.39
Candida a/bicans Por ejemplo ATCC 10231, NCPF 3179, IP 48.72 o NBRC 1594
Usar Solución Amortiguada de Cloruro de Sodio-Peptona de pH 7, O o Solución Amortiguadora de Fosfato de pH 7,2 para preparar
las suspensiones de prueba. Usar las suspensiones dentro de las 2 horas o dentro de las 24 horas si se almacenan a una tempe-
ratura de 2º a 8º.
CLOSTRIDIOS
Usar Clostridium sporogenes, como por ejemplo ATCC 11437 (NBRC 14293, NCIMB 12343, CIP 100651) o ATCC 19404
(NCTC 532 o CIP 79.3). Cultivar la cepa clostridial de prueba en condiciones anaeróbicas en Medio Reforzado para Clostridios a
una temperatura de 30º a 35º durante un período de 24 a 48 horas. Como alternativa para la preparación y posterior dilución
de una suspensión fresca de las células vegetativas de CI. sporogenes, se emplea una suspensión estable de esporas para la ino-
culación de prueba. La suspensión estable de esporas puede mantenerse a una temperatura de 2º a 8º durante un período
validado.
Control Negativo
Para verificar las condiciones de prueba, realizar un control negativo usando el diluyente seleccionado en lugar de la prepa-
ración de prueba. No debe observarse crecimiento de microorganismos. Asimismo, realizar un control negativo al analizar los
productos según se indica en Pruebas de Productos. Es necesario investigar cualquier falla en el control negativo.
Propiedades de Promoción del Crecimiento e Inhibitorias de los Medios
Analizar cada partida de medio listo para usar y cada partida de medio preparado a partir de medio deshidratado o de los
ingredientes. Verificar las propiedades adecuadas de los medios pertinentes según se indica en la Tabla 7.
Tabla 1. Propiedades Indicadoras de Promoción del Crecimiento e Inhibitorias de los Medios
Prueba/Medio Propiedad Cepas de Prueba
Prueba eara bacterias Gram-negativas tolerantes a la bilis
Caldo Mossel para Enriquecimiento de En- Promoción del crecimiento E. coli
terobacterias
P. aeruginosa
Inhibitoria S. aureus
Agar Violeta Rojo Bilis Glucosa Promoción del crecimiento+ Indicadora E. coli
P. aeruginosa
Prueba de Escherichia coli
Caldo MacConkey Promoción del crecimiento E. cofi
Agar MacConkey Promoción del crecimiento + Indicadora E. co/i
Prueba de Salmonella
Caldo Rappaport-Vassiliadis para Enrique- Promoción del crecimiento Safmonefla enterica subesp. enterica serovar Typhimu-
cimiento de Salmonella rium o
Salmonefla enterica subesp. enterica serovar Abony
Agar Xilosa Lisina Desoxicolato Promoción del crecimiento + Indicadora Safmonefla enterica subesp. enterica serovar Typhimu-
rium o
Salmonefla enterica subesp. enterica serovar Abony
Prueba de Pseudomonas aeruginosa
Agar Cetrimida Promoción del crecimiento P. aeruginosa
72 (62) Examen Microbiológico/ Pruebas Microbiológicas USP 37
Tabla 1. Propiedades Indicadoras de Promoción del Crecimiento e Inhibitorias de los Medios (Continuación)
Prueba/Medio [ Propiedad [ Cepas de Prueba
[ Inhibitoria [ E. coli
Prueba de StaQhi¿lococcus aureus
Agar Manito! Salado [ Promoción del crecimiento + Indicadora [ S. aureus
[ Inhibitoria [ f. co/i
Prueba de Clostridios
Medio Reforzado para Clostridios 1 Promoción del crecimiento [ CI. sporogenes
Agar Columbia 1 Promoción del crecimiento [ C/. sporogenes
Prueba de Candida albicans
Caldo Sabouraud Dextrosa 1 Promoción del crecimiento 1 C. albicans
Agar Sabouraud Dextrosa [ Promoción del crecimiento + Indicadora 1 C. albicans
Prueba de las Propiedades de Promoción del Crecimiento, Medios Líquidos-Inocular una porción del medio apropia-
do con un número pequeño (no más de 100 ufc) del microorganismo adecuado. Incubar a la temperatura especificada duran-
te un tiempo no mayor que el período menor indicado en la prueba. Se produce un crecimiento claramente visible de micro-
organismos comparable al obtenido anteriormente con una partida de medio analizada y aprobada previamente.
Prueba de las Propiedades de Promoción del Crecimiento, Medios Sólidos-Usar el Método de Extensión en Superficie
(ver Métodos de Recuento en Placa en Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Recuento Microbiano (61 )), ino-
culando cada una de las placas con un número pequeño (no más de 100 ufc) del microorganismo adecuado. Incubar a la
temperatura especificada durante un tiempo no mayor que el período menor indicado en la prueba. Se produce un crecimien-
to de microorganismos comparable al obtenido anteriormente con una partida de medio analizada y aprobada previamente.
Prueba de las Propiedades Inhibitorias, Medios Sólidos o Líquidos-Inocular el medio apropiado con al menos 100 ufc
del microorganismo adecuado. Incubar a la temperatura especificada durante un tiempo no menor del período mayor indica-
do en la prueba. No se produce crecimiento del microorganismo de prueba.
Prueba de las Propiedades Indicadoras-Usar el Método de Extensión en Superficie (ver Métodos de Recuento en Placa en
Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Recuento Microbiano (61 )), inoculando cada una de las placas con
un número pequeño (no más de 100 ufc) del microorganismo adecuado. Incubar a la temperatura especificada durante un
período que se encuentre en el intervalo indicado en la prueba. Las colonias son comparables, en apariencia y reacciones indi-
cadoras, a aquellas anteriormente obtenidas con una partida de medio analizada y aprobada previamente.
Aptitud del Método de Prueba

Para cada producto nuevo a analizar, realizar una preparación de la muestra según se indica en el párrafo pertinente en
Pruebas de Productos. Al momento de la mezcla, agregar cada cepa de prueba en el medio de crecimiento indicado. Inocular
individualmente las cepas de prueba. Usar un número de microorganismos equivalente a no más de 100 ufc en la preparación
de prueba inoculada.
Realizar la prueba según se indica en el párrafo pertinente en Pruebas de Productos empleando el período más corto de incu-
bación indicado.
Se deben detectar los microorganismos específicos con las reacciones indicaqoras según se describe en Pruebas de Productos.
Cualquier actividad antimicrobiana del producto requiere de una modificación del procedimiento de la prueba (ver Neutrali-
zación/Eliminación de la Actividad Antimicrobiana en Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Recuento Micro-
biano (61 )).
Para un producto determinado, si la actividad antimicrobiana con respecto al microorganismo para el cual se indica la prue-
ba no puede neutralizarse, se asume que el microorganismo inhibido no estará presente en el producto.
PRUEBAS DE PRODUCTOS
Bacterias Gram-Negativas Tolerantes a la Bilis

Preparación de la Muestra e Incubación Previa-Preparar una muestra empleando una dilución 1 en 1O de no menos de
1 g del producto a analizar según se indica en Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Recuento Microbiano
(61 ), excepto que se debe usar Caldo Digerido de Caseína y Soja como diluyente de elección, mezclar e incubar a una tempera-
tura de 20º a 25º durante un período suficiente para resucitar las bacterias pero que no estimule la multiplicación de los orga-
nismos (por lo general 2 horas pero no más de 5 horas).
Prueba de Ausencia-A menos que se indique algo diferente, usar un volumen correspondiente a 1 g del producto, según
se indica en Preparación de la Muestra e Incubación Previa, para inocular Caldo Mossel para Enriquecimiento de Enterobacterias.
Incubar a una temperatura de 30º a 35º durante un período de 24 a 48 horas. Subcultivar en placas de Agar Violeta Rojo Bilis
Glucosa. Incubar a una temperatura de 30º a 35º durante un período de 18 a 24 horas.
El producto cumple con la prueba si no se desarrollan colonias.

Prueba Cuantitativa-
Se/ección y Subcultivo-lnocular cantidades adecuadas de Caldo Mossel para Enriquecimiento de Enterobacterias con la prepa-
ración según se indica en Preparación de la Muestra e Incubación Previa y/o diluciones de la misma que contengan respectiva-
mente O, 1 g; 0,01 g y 0,001 g (ó 0, 1 ml; 0,01 ml y 0,001 ml) del producto a examinar. Incubar a una temperatura de 30º a
35º durante un período de 24 a 48 horas. Subcultivar cada uno de los cultivos en una placa de Agar Violeta Rojo Bilis Glucosa.
Incubar a una temperatura de 30º a 35º durante un período de 18 a 24 horas.
Interpretación-El crecimiento de colonias constituye un resultado positivo. Indicar la menor cantidad del producto que pro-
duce un resultado positivo y la mayor cantidad que produce un resultado negativo. Determinar la cantidad probable de bacte-
rias a partir de la Tabla 2.
Tabla 2. Interpretación de Resultados
Resultados para Cada Cantidad
del Producto Cantidad Probable de Bacterias por
0,1go0,1 ml 0,01 g o 0,01 ml 0,001 g o 0,001 ml g o ml del Producto
+ + + más de 10 3
+ + - menos de 10 3 y más de 102
+ - - menos de 1 02 y más de 1 O
- - - menos de 10
Escherichia coli
Preparación de la Muestra e Incubación Previa-Preparar una muestra usando una dilución 1 en 1O de no menos de 1 g
del producto a analizar según se indica en Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Recuento Microbiano (61)
y usar 1O ml o la cantidad correspondiente a 1 g o 1 ml, para inocular una cantidad adecuada (determinada según se describe
en Aptitud del Método de Prueba) de Caldo Digerido de Caseína y Soja, mezclar e incubar a una temperatura de 30º a 35º duran-
te un período de 18 a 24 horas.
Selección y Subcultivo-Agitar el recipiente, transferir 1 ml de Caldo Digerido de Caseína y Soja a 100 ml de Caldo MacCon-
key e incubar a una temperatura de 42º a 44º durante un período de 24 a 48 horas. Subcultivar en una placa de Agar MacCon-
key a una temperatura de 30º a 35º durante un período de 18 a 72 horas.
Interpretación-El crecimiento de colonias indica la posible presencia de E. coli. Esto se confirma mediante pruebas de
identificación.
El producto cumple con la prueba si no se desarrollan colonias o si los resultados de las pruebas de identificación son negati-
vos.
Sa/monel/a
Preparación de la Muestra e Incubación Previa-Preparar el producto a analizar según se indica en Examen Microbiológico
de Productos No Estériles: Pruebas de Recuento Microbiano (61) y usar una cantidad correspondiente a no menos de 1O g ó
1O ml, para inocular una cantidad adecuada (determinada según se describe en Aptitud del Método de Prueba) de Caldo Digeri-
do de Caseína y Soja, mezclar e incubar a una temperatura de 30º a 35º durante un período de 18 a 24 horas.
Selección y Subcultivo-Transferir O, l ml de Caldo Digerido de Caseína y Soja a 1Oml de Caldo Rappaport-Vassiliadis para
Enriquecimiento de Salmonella e incubar a una temperatura de 30º a 35º durante un período de 18 a 24 horas. Subcultivar en
placas de Agar Xi/osa Lisina Desoxicolato. Incubar a una temperatura de 30º a 35º durante un período de 18 a 48 horas.
Interpretación-El crecimiento de colonias bien desarrolladas de color rojo, con o sin centros negros indica la posible pre-
sencia de Salmonella. Esto se confirma mediante pruebas de identificación.
El producto cumple con la prueba si no se desarrollan colonias de los tipos descritos o si los resultados de las pruebas de
identificación confirmatorias son negativos.
Pseudomonas aeruginosa
Preparación de la Muestra e Incubación Previa-Preparar una muestra usando una dilución 1 en 1O de no menos de 1 g
y usar 1O ml o la cantidad correspondiente a 1 g ó 1 ml, para inocular una cantidad adecuada (determinada según se describe
en Aptitud del Método de Prueba) de Caldo Digerido de Caseína y Soja y mezclar. Al analizar parches transdérmicos, filtrar el volu-
men de muestra correspondiente a un parche de la preparación (ver Parches Transdérmicos en Preparación de la Muestra en
Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Recuento Microbiano (61 )) a través de un filtro de membrana estéril
y colocar en 100 ml de Caldo Digerido de Caseína y Soja. Incubar a una temperatura de 30º a 35º durante un período de 18 a
24 horas.
Selección y Subcultivo-Subcultivar en una placa de Agar Cetrimida e incubar a una temperatura de 30º a 35º durante un
período de 18 a 72 horas.
Interpretación-El crecimiento de colonias indica la posible presencia de P. aeruginosa. Esto se confirma mediante pruebas
de identificación.
El producto cumple con la prueba si no se desarrollan colonias o si los resultados de las pruebas de identificación confirma-
torias son negativos.
5taphylococcus aureus
Preparación de la Muestra e Incubación Previa-Preparar una muestra usando una dilución 1 en 1 O de no menos de 1 g
y usar 1 O ml o la cantidad correspondiente a 1 g ó 1 ml, para inocular una cantidad adecuada (determinada según se describe
en Aptitud del Método de Prueba) de Caldo Digerido de Cmema y Soja y homogenizar. Al analizar parches transdérmicos, filtrar el
volumen de muestra correspondiente a un parche de la preparación (ver Parches Transdérmicos en Preparación de la Muestra en
Examen Microbiológico de Productos No Estériles: Pruebas de Recuento Microbiano (61 )) a través de un filtro de membrana estéril
y colocar en 100 ml de Caldo Digerido de Caseína y Soja. Incubar a una temperatura de 30º a 35º durante un período de 18 a
24 horas.
Selección y Subcultivo-Subcultivar en una placa de Agar Manito/ Salado e incubar a una temperatura de 30º a 35º duran-
te un período de 18 a 72 horas.
Interpretación-El crecimiento de colonias amarillas o blancas rodeadas de una zona amarilla indica la posible presencia de
S. aureus. Esto se confirma mediante pruebas de identificación.
El producto cumple con la prueba si no se desarrollan colonias de los tipos descritos o si los resultados de las pruebas de
identificación confirmatorias son negativos.
Clostridios
Preparación de la Muestra y Tratamiento Térmico-Preparar una muestra usando una dilución 1 en 1 O (con un volumen
total mínimo de 20 ml) de no menos de 2 g o 2 ml del producto a analizar según se indica en Examen Microbiológico de Pro-
ductos No Estériles: Pruebas de Recuento Microbiano (61 ). Dividir la muestra en dos porciones de al menos 1 O ml. Calentar una
porción a 80º durante 1 O minutos y enfriar rápidamente. No calentar la otra porción.
Selección y Subcultivo-Usar 1O ml o la cantidad correspondiente a 1 g o 1 ml del producto a analizar de ambas porcio-
nes para inocular cantidades adecuadas (determinadas según se indica en Aptitud del Método de Prueba) de Medio Reforzado
para Clostridios. Incubar bajo condiciones anaeróbicas a una temperatura de 30º a 35º durante 48 horas. Después de la incuba-
ción, realizar subcultivos a partir de cada recipiente en Agar Columbia e incubar bajo condiciones anaeróbicas a una temperatu-
ra de 30º a 35º durante 48 a 72 horas.
Interpretación-El crecimiento anaeróbico de bacilos (con o sin endosporas) que dan una reacción de catalasa negativa
indica la presencia de Clostridios.
Esto se confirma mediante pruebas de identificación. Si no se detectan colonias de los tipos descritos o si las pruebas de
identificación confirmatorias resultan negativas, el producto cumple con la prueba.
Candida albicans
Preparación de la Muestra e Incubación Previa-Preparar el producto a analizar según se indica en Examen Microbiológico
de Productos No Estériles: Pruebas de Recuento Microbiano (61) y usar 1 O ml o la cantidad correspondiente a no menos de 1 g ó
1 ml, para inocular 100 ml de Caldo Sabouraud Dextrosa y mezclar. Incubar a una temperatura de 30º a 35º durante un perío-
do de 3 a 5 días.
Selección y Subcultivo-Subcultivar en una placa de Agar Sabouraud Dextrosa e incubar a una temperatura de 30º a 35º
durante un período de 24 a 48 horas.
Interpretación-El crecimiento de colonias blancas puede indicar la presencia de C. albicans. Esto se confirma mediante
pruebas de identificación.
El producto cumple con la prueba si no se desarrollan tales colonias o si las pruebas de identificación confirmatorias resultan
negativas.
SOLUCIONES RECOMENDADAS Y
MEDIOS DE CULTIVO
NOTA-Esta sección se proporciona como información.

Las siguientes soluciones y medios de cultivo han resultado satisfactorios en el cumplimiento de los objetivos para los cuales
se indican en la prueba de contaminación microbiana en la Farmacopea. Se pueden usar otros medios siempre que se pueda
demostrar su aptitud.
USP 37 Pruebas Microbiológicas/ <62) Examen Microbiológico 75
Solución Amortiguadora Madre-Transferir 34 g de fosfato monobásico de potasio a un matraz volumétrico de 1 000 ml,
disolver en 500 ml de Agua Purificada, ajustar con hidróxido de sodio a un pH de 7,2 ± 0,2, agregar Agua Purificada a volumen
y mezclar. Dispensar en recipientes y esterilizar. Almacenar a una temperatura de 2º a 8".
Solución Amortiguadora de Fosfato de pH 7,2-Preparar una mezcla de Agua Purificada y Solución Amortiguadora Madre
(800:1 v/v) y esterilizar.
Solución Amortiguada de Cloruro de Sodio-Peptona

de pH 7,0
Fosfato Monobásico de Potasio 3,6 g
Fosfato Dibásico de Sodio Dihidrato 7,2 g (equivalente a fosfato 0,067 M)
Cloruro de Sodio 4,3 g
Peptona (de carne o caseína) 1,0 g
Agua Purificada 1000 ml
-~~·---·----
Esterilizar en un autoclave utilizando un ciclo validado.
Caldo Digerido de Caseína y Soja

Digerido Pancreático de Caseína 17,0 g
Digerido Papaínico de Soja 3,0 g
Fosfato Dibásico de Potasio 2,5 g
Glucosa Monohidrato 2,5 g
Ajustar el pH para que después de la esterilización sea de 7,3 ± 0,2 a 25º. Esterilizar en un autoclave utilizando un ciclo vali-
dado.
Agar Digerido de Caseína y Soja

Digerido Papaínico de Soja 5,0 g
Agar 15,0 g
dado.
Agar Sabouraud Dextrosa

Dextrosa 40,0 g
Mezcla de Digerido Péptico de Tejido 10,0 g
Animal y Digerido Pancreático de
Caseína (1 :1)
Agar 15,0 g
dado.
Agar Papa Dextrosa

Infusión de papas 200 g
Dextrosa 20,0 g
Agar 15,0 g
dado.
Caldo Sabouraud Dextrosa

Dextrosa 20,0 g
Mezcla de Digerido Péptico de Tejido 10,0 g
Animal y Digerido Pancreático de
Caseína (1: 1)
Caldo Sabouraud Dextrosa

Agua Purificada 1000 mL
Ajustar el pH para que después de la esterilización sea de 5,6 ± 0,2 a 25°. Esterilizar en un autoclave utilizando un ciclo vali-
dado.
Caldo Mossel para Enriquecimiento de Enterobacterias

Digerido Pancreático de Gelatina 10,0 g
Bilis de Buey Deshidratada 20,0 g
Fosfato Dibásico de Sodio Dihidrato 8,0 g
Verde Brillante - - -------- __J~_rnJL -
- ·--~---· ----- -------
Ajustar el pH para que después del calentamiento sea de 7,2 ± 0,2 a 25º. Calentar a 100º durante 30 minutos y enfriar inme-
diatamente.
Agar Violeta Rojo Bilis Glucosa

Extracto de Levadura 3,0 g
Sales Biliares 1,5 g
Agar 15,0 g
Rojo Neutro 30 mg
Cristal Violeta 2 mg
Ajustar el pH para que después del calentamiento sea de 7,4 ± 0,2 a 25º. Calentar hasta el punto de ebullición; no calentar
en autoclave.
Caldo MacConkey
Lactosa Monohidrato 10,0 g
Bilis de Buey Deshidratada 5,0 g
Púrpura de Bromocresol 10mg
dado.
Agar MacConkey
Peptonas (de carne y caseína) 3,0 g
Sales Biliares 1,5 g
Agar 13,5 g
Rojo Neutro 30,0 mg
Cristal Violeta 1 mg
Ajustar el pH para que después de la esterilización sea de 7, 1 ± 0,2 a 25º. Calentar a ebullición durante 1 minuto, agitando
constantemente, y luego esterilizar en un autoclave usando un ciclo validado.
Caldo Rappaport-Vassiliadis para Enriquecimiento de

Salmonella
Peptona de Soja 4,5 g
Cloruro de Magnesio Hexahidrato 29,0 g
Verde de Malaquita 0,036 g
Disolver, calentando ligeramente. Esterilizar en un autoclave utilizando un ciclo validado a una temperatura que no exceda de
115º. El pH debe ser de 5,2 ± 0,2 a 25º luego del calentamiento y esterilización en autoclave.
Agar Xilosa Lisina Desoxicolato

Xi losa 3,5 g
L-Lisina 5,0 g
Sacarosa 7,5 g
Rojo de Fenal 80 mg
Agar 13,5 g
Desoxicolato de Sodio 2,5 g
Tiosulfato de Sodio 6,8 g
Citrato Férrico Amónico 0,8 g
Ajustar el pH para que después del calentamiento sea de 7,4 ± 0,2 a 25º. Calentar a ebullición, enfriar a 50º y verter en
placas de Petri. No calentar en un autoclave.
Agar Cetrimida
Cloruro de Magnesio 1,4 g
Sulfato de Potasio 10,0 g
Cetrimida 0,3 g
Agar 13,6 g
Glicerol 10,0 mL
Calentar a ebullición durante 1 minuto con agitación. Ajustar el pH para que después de la esterilización sea de 7,2 ± 0,2 a
25º. Esterilizar en un autoclave utilizando un ciclo validado.
Agar Manitol Salado

Digerido Péptico de Tejido Animal 5,0 g
Extracto de Carne 1,0 g
o-Manito! 10,0 g
Agar 15,0 g
Rojo de Fenal 0,025 g
Calentar a ebullición durante 1 minuto con agitación. Ajustar el pH para que después de la esterilización sea de 7,4 ± 0,2 a
25º. Esterilizar en un autoclave utilizando un ciclo validado.
Medio Reforzado para Clostridios

Extracto de Carne 10,0 g
Peptona 10,0 g
•
~ Medio Reforzado para Clostridios
~Air111_cio~i_
1
SolLJ_li¡e
Glucosa Monohidrato
- -.-~ ~~---~=--======:=:------------------·- -------L------ _ _l_~O_g_
5,0 g
_____
~;~~~-r:_~º_sd_o~~i,te_í~_-"-_-~~-----_-_- -_-_-_~~----~-------~---------~~-------=--=-=-=========---=--=-=-=-~--+----=-~----=--~===~=:-~-~~:============~__,
Acetato de Sodio
_-_-_-:-
_ __
>-----------------------·--·-----·--------------+----------~----------<
3,0 g
Aga_r__________________________ ·------------------------~-----------º·~'-S~g~--------<
~gua Purificada 1000 ml
Hidratar el agar y disolver calentando hasta ebullición y revolviendo constantemente. Si fuera necesario, ajustar el pH para
que después de la esterilización sea de 6,8 ± 0,2 a 25º. Esterilizar en un autoclave utilizando un ciclo validado.
¡--· ----------------------
_ ___ J\9ar Colu111_1Ji¡¡ ______ _
_ Digerido l'ancreáticCJ_CJ_e Cas_E'.1'1<l__ _________._ 1 º~'-º~g~---------1
_ ____
5,._0~g'-----------1
Digerido Péptico de Car_ne__________________________________-+-_ _ _ _ _ _ _ _
Digerido Pancreático de Corazón 3,0 g
Almidón de Maíz 1,0 g
Agar, de acuerdo con la capacidad de
gelificación 10,0-15,0 g
Hidratar el agar y disolver calentando hasta ebullición y revolviendo constantemente. Si fuera necesario, ajustar el pH para
que después de la esterilización sea de 7,3 ± 0,2 a 25º. Esterilizar en un autoclave utilizando un ciclo validado. Dejar enfriar a
una temperatura de 45º a 50º, agregar, cuando sea necesario, sulfato de gentamicina correspondiente a 20 mg de gentamici-
na base y verter en placas de Petri.
(63) PRUEBAS PARA MICOPLASMAS
INTRODUCCIÓN
El género micoplasma representa un grupo de bacterias diminutas que no tienen pared celular. Este género comprende más
de 120 especies. Son los organismos procariotas autorreplicantes más pequeños. Las células varían en tamaño y morfología y
no se pueden colorear con Gram, pero las impresiones de las colonias sobre agar sólido se pueden colorear con azul de metile-
no o una tinción equivalente. Los micoplasmas son parásitos y comensales, y algunos pueden ser patógenos para una gran
variedad de huéspedes animales y vegetales. En humanos, los micoplasmas son por lo general parásitos de superficie que colo-
nizan el epitelio de los tractos respiratorio y urogenital. Los micoplasmas son comunes y pueden ser causa de contaminación
seria en los cultivos de células y/o tejidos usados para producir artículos farmac'opeicos. También pueden causar contamina-
ción en el caldo de digestión de caseína de soja filtrado y esterilizado. Una infección en un cultivo celular puede persistir por
un periodo prolongado sin causar un daño celular aparente. La infección de las células en un cultivo puede afectar práctica-
mente todas las vías del metabolismo celular, alterando incluso las características fenotípicas de las células y su crecimiento
normal. La presencia de especies de micoplasma no siempre trae como resultado turbidez debido a crecimiento en los cultivos
o una alteración visible de las células.
La prueba para detección de micoplasmas es un requisito necesario de control de calidad para garantizar de manera confia-
ble la pureza de los productos biotecnológicos y de los materiales afines usados para producir dichos productos. Este capítulo
de pruebas generales describe dos métodos requeridos para detectar la contaminación por micoplasma en los artículos de
prueba y en los cultivos tisulares y/o celulares usados para producir dichos artículos, caldos de digestión o cualquier otro mate-
rial en el que se sospeche contaminación por micoplasma. Estos son: (A) el procedimiento en medios de agar y caldos y (B) el
procedimiento en cultivo de células indicadoras. Estas pruebas requieren una cuidadosa técnica aséptica y condiciones de labo-
ratorio apropiadas. Con el fin de garantizar que las pruebas y la interpretación de los resultados sean apropiadas, el personal
debe estar adecuadamente capacitado y calificado. Para detectar micoplasmas se puede utilizar una técnica validada de ampli-
ficación de ácidos nucleicos (NAT, por sus siglas en inglés) o un método basado en la actividad enzimática, siempre que el
método usado demuestre ser comparable con ambos métodos (A) y (B). Los métodos alternativos se deben validar apropiada-
mente. Los requisitos de validación para los métodos alternativos no se tratarán en este capítulo.
USP 37 Pruebas Microbiológicas/ (63) Pruebas para Micoplasmas 79
MÉTODO DE CULTIVO
Elección de los Medios de Cultivo
La prueba se efectúa usando un número suficiente de medios de cultivo tanto sólidos como líquidos para garantizar el creci-
miento en las condiciones de incubación elegidas de pequeñas cantidades de micoplasmas (aproximadamente 100 unidades
formadoras de colonias o ufc; o 100 unidades cambiadoras de color, o ucc) que puedan estar presentes en el artículo o mate-
rial de prueba. Los medios de cultivo líquidos deben contener rojo de fenol. La gama de medios de cultivo escogidos ha de-
mostrado tener propiedades nutritivas satisfactorias al menos para los microorganismos que aparecen en Cepas de Microorga-
nismos de Prueba para Control de Calidad (a continuación). Las propiedades nutritivas de cada nuevo lote de medio de cultivo
se verifican para los microorganismos apropiados en la lista. Cuando se hagan las pruebas para micoplasmas se deben incluir
en cada una al menos dos especies o cepas conocidas de micoplasmas (listadas en Cepas de Microorganismos de Prueba para
Control de Calidad) como controles positivos, una de las cuales debe ser fermentadora de dextrosa (es decir, M. pneumoniae o
una especie y cepa equivalente) y la otra debe ser hidrolizadora de arginina (es decir, M. ora/e o una especie y cepa equivalen-
te). Solo al examinar líneas celulares de insectos se debe incluir una cepa de control de espiroplasma (p.ej., 5. citri ATCC 29747,
S. melliferum ATCC 29416 o una especie y cepa equivalente). Adicionalmente, estas cepas pueden ser un poco más exigentes
en sus requerimientos nutricionales. Necesitan temperaturas de incubación más bajas (al igual que las líneas celulares de insec-
tos).
Cepas de Microorganismos de Prueba para Control de Calidad
Los cultivos de controles positivos no deben tener más de 15 pases desde el aislamiento. Las especies o cepas de micoplas-
mas aptas para el uso se enumeran a continuación:
- Acholep/asma /aidlawii (vacunas y/o materiales derivados de células o cultivos para uso humano y veterinario cuando se ha
usado un antibiótico durante la producción)
- M. gallisepticum (cuando se ha usado material aviar durante la producción o cuando la vacuna o el cultivo celular están
destinados al uso en aves de corral)
- M. hyorhinis (vacunas o cultivos celulares veterinarios no aviares)
- M. ora/e (vacunas para uso humano y veterinario)
- M. pneumoniae (vacunas o bancos de células para uso humano) u otras especies apropiadas de fermentadores de o-gluco-
sa como M. fermentans
- M. synoviae (cuando se ha usado material aviar durante la producción o cuando la vacuna o el banco de células está desti-
nado al uso en aves de corral)
Las cepas de prueba pueden ser aislados de campo que han sufrido un número limitado de subcultivos (no más de 15), se
almacenan congeladas (-20º o menos) o liofilizadas y se identifican como pertenecientes a las especies requeridas, por compa-
ración con cultivos tipo, por ejemplo, los que aparecen en la Tabla 7.
Tabla 1. Cultivos Tipo para Identificar Aislados de Campo Usados como Cepas de Prueba
Organismo de Prueba Número NCTC Número CIP Número ATCC
A. laidlawii NCTC 10116 CIP 75,27 ATCC 23206
M. gallisepticum NCTC10115 CIP 104967 ATCC 19610
M. fermentans NCTC 10117 CIP 105680 ATCC 19989
M. hyorhinis NCTC 10130 CIP 104968 ATCC 17981
M. ora/e NCTC10112 CIP 104969 ATCC 23714
M. pneumoniae NCTC 10119 CIP 103766 ATCC 15531
M. synoviae NCTC 10124 CIP 104970 ATCC 25204
Condiciones de Incubación
Incubar los medios de cultivo líquidos en recipientes herméticamente tapados a 36 ± 1 º. Incubar los medios de cultivo sóli-
dos en condiciones microaerofílicas (atmósfera de hidrógeno que contenga< 0,5% de oxígeno y/o nitrógeno que contenga
5% a 10% de dióxido de carbono en nitrógeno). Debe aportarse la humedad suficiente para evitar la desecación de la superfi-
cie del agar a 36 ± 1 º.
Propiedades Nutritivas
Efectuar la prueba de propiedades nutritivas para cada nueva partida de medio de cultivo. Inocular el medio de cultivo elegi-
do con los microorganismos de prueba apropiados; no usar más de 1 00 ufc por placa que contenga al menos 9 mL de medio
de cultivo sólido y por recipiente de 1 00 mL de medio de cultivo líquido; usar una placa y un recipiente aparte para cada espe-
cie de microorganismo. Incubar el medio de cultivo y hacer subcultivos a partir de 0,2 mL de medio líquido en medio sólido a
80 (63) Pruebas para Micoplasmas / Pruebas Microbiológicas USP 37
los intervalos especificados (ver a continuación en Prueba de Micoplasmas en el Material o Artículo de Prueba). El medio sólido
cumple con la prueba si se encuentra un recuento dentro del intervalo de 0,5 unidades logarítmicas de la cantidad inoculada
para cada microorganismo de prueba. El medio líquido cumple con la prueba si se encuentra crecimiento en las placas de agar
subcultivadas a partir del caldo, por lo menos en 1 subcultivo para cada microorganismo de prueba. El uso de un microscopio
con un aumento de 1 OOx o mayor puede ser útil.
Sustancias lnhibidoras
La prueba de sustancias inhibidoras se efectúa una vez para un producto determinado y se repite siempre que haya un cam-
bio en el método de producción que pueda afectar la detección de micoplasmas. Para demostrar la ausencia de sustancias
inhibidoras, llevar a cabo la prueba de propiedades nutritivas en presencia y ausencia del artículo o material de prueba. Si el
crecimiento de un microorganismo de prueba en más de 1 subcultivo ocurre en ausencia del artículo o material de prueba
antes que en su presencia, se encuentran presentes sustancias inhibidoras. Lo mismo es cierto si las placas directamente inocu-
ladas con el artículo o material de prueba no están dentro del intervalo de 0,5 unidades logarítmicas del número de colonias
de aquellas inoculadas sin el artículo o material de prueba. En ambos casos, las sustancias inhibidoras se deben neutralizar o
contrarrestar su efecto por un método apropiado; por ejemplo, por pase en sustratos que no contengan inhibidores o por dilu-
ción en un volumen mayor de medio antes de la prueba. Si se usa la dilución, se pueden usar volúmenes mayores de medio o
se puede dividir el volumen del inóculo en varios matraces de 1 00 ml. La eficacia de la neutralización o de otros procesos se
controla repitiendo la prueba de sustancias inhibidoras después de la neutralización.
Prueba para Micoplasmas en el Artículo o Material de Prueba
Inocular no menos de 1 O mL del ¡¡rtículo o material de prueba por 100 mL de cada medio líquido. Si ocurre un cambio de
pH significativo después de la adición del artículo o material de prueba, se restablece el valor original de pH del medio de
cultivo por medio de la adición de una solución estéril de hidróxido de sodio o de ácido clorhídrico. Inocular 0,2 mL del artícu-
lo o material de prueba en cada placa de medio sólido. Incubar el medio líquido durante 20 a 21 días. Incubar el medio sólido
durante no menos de 14 días, excepto para aquellas placas correspondientes al subcultivo de 20 a 21 días, las cuales se incu-
ban durante 7 días. Simultáneamente, incubar una porción de 100 mL, sin inóculo, de cada medio líquido y placa de agar,
como control negativo. En los días 2 a 4 después de la inoculación, subcultivar cada medio líquido por inoculación de 0,2 mL
al menos en 1 placa de cada medio sólido. Repetir el procedimiento entre los días 6 y 8, de nuevo entre los días 13 y 15 y una
vez más entre los días 19 y 21 de la prueba. Observar el medio líquido cada 2 ó 3 días y si se presenta un cambio de color,
subcultivar. Si un medio líquido muestra contaminación bacteriana o fúngica, la prueba es inválida. La prueba es válida si se
puede leer al menos 1 placa por medio y por día de inoculación. Incluir en la prueba controles positivos preparados por inocu-
lación de no más de 100 ufc de al menos 1 microorganismo de prueba en medio de agar o caldo. Cuando se lleve a cabo la
prueba de detección de micoplasmas periódicamente, se recomienda utilizar los microorganismos de prueba en rotación pe-
riódica. Los microorganismos de prueba usados son los listados en Elección de Jos Medios de Cultivo. Incubar los caldos nutritivos
y las placas en una atmósfera humidificada con condiciones microaerofílicas (5% a 10% de C0 2 ).
Al finalizar el periodo de incubación prescrito, examinar todos los medios sólidos inoculados en busca de la presencia de
colonias de micoplasmas. El producto cumple con la prueba si no ha ocurrido crecimiento de las colonias típicas de micoplas-
mas. El producto no cumple con la prueba si ha ocurrido crecimiento de las colonias típicas de micoplasmas en cualquiera de
los medios sólidos. La prueba es inválida si 1 o más de los controles positivos no muestra crecimiento de micoplasmas al me-
nos en 1 placa de subcultivo. La prueba es inválida si 1 o más de los controles negativos muestra crecimiento de micoplasmas.
Si se observan colonias sospechosas, usar un método validado apropiado para determinar si se deben a micoplasmas.
Soluciones y Medios Recomendados para el Método de Cultivo
NOTA-Esta sección se proporciona como información.
SOLUCIONES
Caldo de infusión de Corazón Vacuno

Corazón vacuno (para preparar la infusión) 500 g
Peptona o
1 g
Cloruro de sodio 5g
Agua destilada hasta 1 000 ml
USP 37 Pruebas Microbiológicas/ (63> Pruebas para Micoplasmas 81
Vitaminas Esenciales
Biotina 100 mg
Pantotenato de calcio 100 mg
Cloruro de colina 100 mg
Ácido fálico 100 mg
i-lnositol 200 mg
Nicotinamida 100 mg
Clorhidrato de piridoxal 100 mg
Riboflavina 10 mg
Clorhidrato de tiamina 100 mg
Agua destilada hasta 1000 ml
Agar, Purificado
Un agar altamente refinado para usar en microbiología e inmunología, preparado por un procedimiento de intercambio iónico que da como resultado
un producto con superior pureza, claridad y poder gelificante. Contiene los siguientes ingredientes:
Agua 12,2%
Cenizas 1,5%
Cenizas insolubles en ácido 0,2%
Cloro o
Fosfato (calculado como P7 0,) 0,3%
Nitrógeno total 0,3%
Cobre 8 ppm
Hierro 170 ppm
Calcio 0,28%
Magnesio 0,32%
Solución Salina Balanceada de Hanks (modificada)

Cloruro de sodio 6,4 g
Cloruro de potasio 0,32 g
Sulfato de magnesio heptahidrato 0,08 g
Cloruro de magnesio hexahidrato 0,08 g
Cloruro de calcio anhidro 0,112 g
Fosfato ácido disódico dihidrato 0,0596 g
Fosfato diácido de potasio anhidro 0,048 g
Infusión de Cerebro-Corazón
Infusión de cerebro de ternero 200 g
Infusión de corazón vacuno 250 g
Proteosa peptona 10 g
Glucosa monohidrato 2g
Cloruro de sodio 5g
Fosfato ácido disódico anhidro 2,5 g
Caldo PPLO
Infusión de corazón vacuno 50 g
Peptona 10 g
Cloruro de sodio 5g
MEDIOS
Se recomiendan los siguientes medios. Se pueden usar otros medios, siempre que cumplan los criterios dados en las seccio-
nes Elección de los Medios de Cultivo, Condiciones de Incubación, Propiedades Nutritivas y Sustancias lnhibidoras.
82 (63) Pruebas para Micoplasmas /Pruebas Microbiológicas USP 37
Medios de Hayflick
(recomendado para la detección general de micoplasmas)
1 Medio Líquido
~·
Caldo de infusión de corazón vacuno 90,0 ml
Suero de caballo (sin calentar) 20,0 ml
Extracto de levadura (250 g/L) (se recomienda extracto de levadura fresca) 10,0 ml
Rojo de fenal (solución de 0,6 g/L) 5,0 ml
Penicilina (20 000 UJ/ml) 0,25 ml
Ácido desoxirribonucleico (solución de 2 g/L) 1,2 ml
Ajustar a un pH de 7,8
Medio Sólido
Preparar como se describió anteriormente, reemplazando el caldo de infusión de corazón vacuno por agar de infusión de corazón vacuno que conten-
lJd 15 g/L de dgclr.
Medios de Frey
(recomendado para la detección de M. synoviae)
Medio Líquido
Vitaminas esenciales 0,02S ml
Glucosa monohidrato (solución de 500 g/L) 2,0 ml
Suero de cerdo (inactivado a 56º durante 30 min) 12,0 ml
P.Nicotinamida adenina dinucleótido 1,0 ml
(solución de 1 O g/L)
Clorhidrato de cisteína (solución de 1O g/L) 1,0 ml
Rojo de fenol (solución de 0,6 g/L) 5,0 ml
Penicilina (20 000 UJ/ml) 0,25 ml
Mezclar las soluciones de p.nicotinamida adenina dinucleótido y clorhidrato de cisteína y después de 1O minutos agregar a Jos demás ingredientes.
Ajustar a un pH de 7,8
Medio Sólido
Agar, purificado 1,4 g
Ajustar a un pH de 7,8; esterilizar en autoclave y Juego agregar:
Vitaminas esenciales 0,025 ml
Glucosa monohidrato (solución de 500 g/L) 2,0 ml
Suero de cerdo (sin calentar) 12,0 ml
p.Nicotinamida adenina dinucleótido (solución de 1O g/L) 1,0 ml
Clorhidrato de cisteína (solución de 1O g/L) 1,0 ml
Rojo de fenol (solución de 0,6 g/L) 5,0 ml
Penicilina (20 000 Ul/ml) 0,25 ml
Medios de Frlls
(recomendado para la detección de micoplasmas no aviares)
Medio Líquido
Solución salina balanceada de Hanks (modificada) 800 ml
Agua destilada 67 ml
Infusión de cerebro-corazón 135 ml
Caldo PPLO 248 ml
Extracto de levadura (1 70 g/L) 60 ml
Bacitraci na 250 mg
Meticilina 250 mg
Rojo de fenol (5 g/L) 4,5 ml
Suero de caballo 165 ml
Suero de cerdo 165 ml
Ajustar a un pH de 7,40 a 7,45
USP 37 Pruebas Microbiológicas/ (63) Pruebas para Micoplasmas 83
Medios de Friis
(recomendado para la detección de micoplasmas no aviares)
Medio Sólido
Solución salina balanceada de Hanks (modificada) 200 ml
DEAE-dextrano 200 mg
Agar, purificado 15,65 g
Mezclar bien y esterilizar en autoclave. Enfriar a 100º. Agregar a 1 740 ml de Medio Líquido como se describió anteriormente.
MÉTODO DE CULTIVO DE CÉLULAS INDICADORAS
Los cultivos celulares se tiñen con un colorante fluorescente que se une al ADN. Los micoplasmas se detectan por su patrón
de fluorescencia filamentoso o particulado característico sobre la superficie celular y, si la contaminación es abundante, en las
áreas vecinas. Las mitocondrias en el citoplasma se pueden teñir pero se distinguen fácilmente de los micoplasmas. Para sus-
pensiones virales, si la interpretación de los resultados se ve afectada por efectos citopáticos marcados, neutralizar el virus
usando un antisuero específico que no tenga efectos inhibidores sobre los micoplasmas o usar un sustrato de cultivo celular
que no permita el crecimiento del virus. Para demostrar la ausencia de efectos inhibidores del suero, efectuar las pruebas con
controles positivos en presencia y ausencia del antisuero.
Verificación del Sustrato
Usar células Vero o un cultivo celular equivalente (por ejemplo, la línea de células de producción) que tenga una eficacia
equivalente para detectar micoplasmas. Probar la eficacia de las células que se van a usar aplicando el procedimiento descripto
a continuación e inoculando no más de 100 ufc o ucc de microorganismos de cepas de referencia adecuadas de M. hyorhinis y
M. ora/e. Las células son adecuadas si se detectan ambas cepas de referencia. Las células indicadoras se deben subcultivar sin
antibióticos antes de usarlas en la prueba.
Método de Prueba
NOTA-Lo siguiente se proporciona como información.
SOLUCIONES
Solución Salina Amortiguada con Fosfato-

Fosfato Monobásico de Potasio 2,0 M-Disolver 13,61 g de fosfato monobásico de potasio anhidro en 50 mL de agua.
Fosfato Dibásico de Potasio 2,0 M-Disolver 17,42 g de fosfato dibásico de potasio anhidro en 50 mL de agua.
Solución Salina Amortiguada con Fosfato (pH 7,4)---Combinar 3,6 mL de Fosfato Monobásico de Potasio 2,0 M, 16,4 mL de
Fosfato Dibásico de Potasio 2,0 M, 8 g de cloruro de sodio, y 1 L de agua. Mezclar bien. Ajustar el pH si fuera necesario.
Solución Madre de Bisbenzimida-Disolver 5 mg de bisbenzimida en agua y diluir con el mismo disolvente hasta 100 ml.
Almacenar en la oscuridad.
Solución de Trabajo de Bisbenzimida-lnmediatamente antes de usar, diluir 100 µL de Solución Madre de Bisbenzimida
con Solución Salina Amortiguada con Fosfato (pH 7,4) hasta 100 ml.
Solución Amortiguadora de Fosfato-Citrato de pH 5,5-Mezclar 56,85 mL de una solución de 28,4 g/L de fosfato ácido
disódico anhidro y 43, 15 mL de una solución de 21 g/L de ácido cítrico.
MÉTODO
1. Sembrar el cultivo de células indicadoras con una densidad apropiada (por ejemplo, 2 x 104 a 2 x 1 os células/mL, 4 x 10 3 a
2,5 x 104 células/cm 2 ) que lleven a la confluencia después de 3 días de crecimiento. Inocular 1 mL del producto a exami-
nar en el recipiente con cultivo celular e incubar a 36±1 º.
2. Después de 3 días de incubación como mínimo, cuando las células hayan alcanzado la confluencia, hacer un subcultivo
sobre cubreobjetos en recipientes adecuados o sobre alguna otra superficie (por ejemplo, portaobjetos con cámara para
cultivo) adecuada para el procedimiento de prueba. Sembrar las células con baja densidad, de forma que puedan alcanzar
una confluencia del 50% después de 3 a 5 días de incubación. La confluencia completa impide la visualización de mico-
plasmas después de la tinción y debe evitarse.
3. Retirar el medio y enjuagar las células indicadoras con solución salina amortiguada con fosfato, pH 7,4; luego agregar una
solución fijadora adecuada (una mezcla recién preparada de 1 volumen de ácido acético glacial SR y 3 volúmenes de me-
tano! se considera adecuada cuando se usa bisbenzimida para la tinción).
4. Retirar la solución fijadora y lavar las células con Agua Purificada estéril. Secar los portaobjetos completamente si se van a
colorear más de 1 hora después (es preciso tener especial cuidado cuando se colorean las láminas después del secado
debido a los artefactos que se podrían producir).
84 (63) Pruebas para Micoplasmas / Pruebas Microbiológicas USP 37
5. Agregar un colorante apto para ADN y dejar en reposo durante el tiempo adecuado (la solución de trabajo de bisbenzimi-
da y un tiempo de reposo de 1 O minutos se consideran adecuados).
6. Retirar el colorante y enjuagar la monocapa con Agua Purificada.
7. Montar cada cubreobjetos, cuando corresponda (una mezcla de volúmenes iguales de glicerol y Solución Amortiguadora
de Fosfato-Citrato de pH 5,5 es apropiada para el montaje). Examinar por fluorescencia (para la coloración con bisbenzimi-
da resulta apropiado usar un filtro de excitación de 330 nm a 380 nm y un filtro de barrera LP de 440 nm) con un au-
mento de 400x o mayor.
8. Comparar la apariencia microscópica de los cultivos de prueba con la de los controles negativos y positivos, buscando
fluorescencia extranuclear. Los micoplasmas producen puntitos o filamentos en el citoplasma de la célula indicadora.
También pueden producir puntitos y filamentos en los espacios intercelulares. Siguiendo el protocolo establecido durante
la validación, se examinan múltiples campos microscópicos.
El producto a examinar cumple con la prueba si no está presente la fluorescencia típica de los micoplasmas. La prueba es
inválida si los controles positivos no presentan la fluorescencia típica de los micoplasmas. La prueba es inválida si los controles
negativos presentan la fluorescencia típica de los micoplasmas.
(71) PRUEBAS DE ESTERILIDAD
•Algunas partes de este capítulo general han sido armonizadas con los textos correspondientes de la Farmacopea Europea
y/o la Farmacopea japonesa. Las partes no armonizadas están marcadas con los símbolos (•.) para indicar esta situación .•
Estos procedimientos farmacopeicos no se han diseñado para garantizar que una partida de un producto es estéril o ha sido
esterilizada. Esta garantía se consigue principalmente mediante la validación del proceso de esterilización o de los procedi-
mientos del procesamiento aséptico.
La prueba se aplica a sustancias, preparaciones o artículos cuya esterilidad es requerida por la Farmacopea. Sin embargo, un resul-
tado satisfactorio únicamente indica que no se han encontrado microorganismos contaminantes en la muestra examinada bajo las
condiciones de la prueba.
PRECAUCIONES CONTRA LA CONTAMINACIÓN MICROBIANA

La prueba de esterilidad se lleva a cabo bajo condiciones asépticas, por lo que, para lograr tales condiciones, el entorno de la
prueba debe adaptarse a la manera en que ésta se realice. Las precauciones para evitar la contaminación se deben tomar de
modo tal que no se afecte a ningún microorganismo que deba detectarse en esta prueba. Las condiciones de trabajo en las
que se efectúan las pruebas se monitorean regularmente mediante el muestreo adecuado del área de trabajo y la realización
de controles apropiados.
MEDIOS DE CULTIVO Y TEMPERATURAS DE INCUBACIÓN

Los medios para la prueba se pueden preparar según se indica a continuación o se pueden usar medios equivalentes dispo-
nibles comercialmente siempre y cuando cumplan con los requisitos de la Prueba de Promoción del Crecimiento de Organismos
Aerobios, Anaerobios y Hongos.
Se ha hallado que los medios de cultivo siguientes son adecuados para la prueba de esterilidad. El Medio Líquido de Tioglico-
lato sirve principalmente para el cultivo de bacterias anaerobias. Sin embargo, también detecta bacterias aerobias. El Medio de
Digerido de Caseína y Soja es adecuado para el cultivo tanto de hongos como de bacterias aerobias.
USP 37 Pruebas Microbiológicas/ (71) Pruebas de Esterilidad 85
Medio Líquido de Tiogllcolato

L-Cistina 0,5 g
Dextrosa Monohidrato/Anhidra 5,5/5,0 g
Agar 0,75 g
Extracto de Levadura (soluble en agua) 5,0 g
Tioglicolato de Sodio 0,5 g
o Ácido Tioglicólico 0,3 ml
Solución de Resazurina Sódica (1 en 1000), recién preparada 1,0 ml
El pH después de la esterilización es de 7, 1 ± 0,2.

Mezclar la L-cistina, el agar, el cloruro de sodio, la dextrosa, el extracto de levadura y el digerido pancreático de caseína con
el agua purificada y calentar hasta su disolución. Disolver el tioglicolato de sodio o el ácido tioglicólico en la solución y, de ser
necesario, agregar hidróxido de sodio 1 N de modo que, después de la esterilización, la solución tenga un pH de 7, 1 ± 0,2. Si
se requiere filtración, calentar nuevamente la solución sin llegar a ebullición y filtrar mientras está caliente a través de un papel
de filtro humedecido. Agregar la solución de resazurina sódica, mezclar y colocar el medio en recipientes adecuados, de forma
que la relación entre superficie y profundidad sea tal que no más de la mitad superior del medio haya experimentado un cam-
bio de color indicativo de la captación de oxígeno al final del período de incubación. Esterilizar usando un proceso validado. Si
el medio se almacena, mantenerlo a una temperatura entre 2º y 25º en un envase estéril y hermético. Si una porción mayor
que el tercio superior del medio ha adquirido un color rosado, el medio puede recuperarse una vez calentando los recipientes
en un baño de agua o en vapor fluente hasta que desaparezca el color rosado, y enfriar rápidamente tratando de evitar la
entrada de aire no estéril en el recipiente. No usar el medio por un periodo de almacenamiento más largo que el que ha sido
validado.
El Medio Líquido de Tioglicolato debe incubarse a 30º-35º. Para productos que contienen un conservante mercurial que no se
pueden analizar mediante el método de filtración por membrana, se puede utilizar Medio Líquido de Tioglicolato incubado a
20º-25º en lugar de Medio de Digerido de Caseína y Soja, siempre y cuando haya sido validado según se indica en Prueba de
Promoción del Crecimiento de Organismos Aerobios, Anaerobios y Hongos. Es posible utilizar el siguiente medio de tioglicolato
alternativo para los casos en que se prescriba o justifique y autorice. Preparar una mezcla que tenga la misma composición que
la del Medio Líquido de Tioglicolato, pero omitiendo el agar y la solución de resazurina sódica. Esterilizar según se indica ante-
riormente. El pH después de la esterilización es 7, 1 ± 0,2. Calentar en un baño de agua antes de usar e incubar a 30º-35º bajo
condiciones anaeróbicas.
Medio de Digerido de Caseína y Soja
Digerido Papaínico de Harina de Soja 3,0 g
Dextrosa Monohidrato/Anhidra 2,5/2,3 g
El pH después de la esterilización es de 7,3 ± 0,2.

Disolver los sólidos en el Agua Purificada, calentando ligeramente hasta lograr la disolución. Enfriar la solución a temperatura
ambiente y ajustar el pH con hidróxido de sodio 1 N de modo que, después de la esterilización, se obtenga un pH de 7,3 ±
0,2. Filtrar el medio si fuera necesario para lograr una solución transparente, y verter en recipientes adecuados y esterilizar
usando un procedimiento validado. Almacenar a temperatura entre 2º y 25º en un recipiente estéril y bien cerrado, a menos
que se use inmediatamente. No usar el medio por un periodo de almacenamiento más largo que el que ha sido validado.
El Medio de Digerido de Caseína y Soja debe incubarse a 22,5 ± 2,5º.
•Medios para Penicilinas o Cefalosporinas
Cuando deban usarse medios de prueba de esterilidad en el método de Inoculación Directa del Medio de Cultivo que se indica
en Prueba de Esterilidad del Producto a Examinar, modificar la preparación del Medio Líquido de Tioglicolato y del Medio de Digeri-
do de Caseína y Soja según se indica a continuación. Transferir aséptica mente a los recipientes de cada medio una cantidad de
,B-lactamasa suficiente para inactivar la cantidad de antibiótico presente en la muestra de prueba. Determinar la cantidad de ,B-
lactamasa requerida para inactivar el antibiótico empleando una preparación de ,B-lactamasa cuyo poder inactivante de penici-
linas o cefalosporinas haya sido valorado previamente. [NOTA-Los medios complementados con ,B-lactamasa también pueden
usarse en la prueba de filtración por membrana.]
86 (71 > Pruebas de Esterilidad / Pruebas Microbiológicas USP 37
Alternativamente (en un lugar completamente separado del usado para las pruebas de esterilidad), confirmar que se incor-
pora una cantidad adecuada de /J-lactamasa en el medio, siguiendo cualquiera de los dos métodos indicados en Prueba de
Aptitud del Método, usando como desafío menos de 1 00 unidades formadoras de colonias (ufc) de Staphylococws aureus (ver
Tabla 7). Debe observarse un crecimiento microbiano típico del cultivo inoculado como confirmación de que la concentración
de /i-lactamasa es adecuada .•
Tabla 1. Cepas de Microorganismos de Prueba Adecuados para Usar en la Prueba de Promoción del Crecimiento y en la
Prueba de Aptitud del Método
Bacterias Aerobias
Staphy/ococcus aureus ATCC 6538, CIP 4.83, NCTC 10788, NCIMB 9518, NBRC
13276
Bacillus subtifis ATCC 6633, CIP 52.62, NCIMB 8054, NBRC 3134
Pseudomonas aeruginosa• 1 • ATCC 9027, NCIMB 8626, CIP 82.118, NBRC 13275
Bacteria anaerobia
Clostridium sporogenes• 2 • ATCC 19404, CIP 79.3, NCTC 532 or ATCC 11437, NBRC
14293
Hongos
Candida a/bicans ATCC 10231, IP 48.72, NCPF 3179, NBRC 1594
Aspergillus brasi/iensis ATCC 16404, IP 1431.83, IMI 149007, NBRC 9455
(Aspergillus Niger)
• 1 Un microorganismo alternativo es Kocuria rhizophifa (Micrococcus luteus) ATCC 9341.+
• 2 Una alternativa para Clostridium sporogenes, cuando se desea usar un microorganismo no formador de esporas, es Bacteroides vulgatus (ATCC 8482) .•
Los medios usados cumplen con las pruebas siguientes, realizadas antes o en forma paralela, con la prueba sobre el produc-
to a examinar.
Esterilidad
Incubar porciones del medio durante 14 días. No se produce crecimiento de ningún organismo.
Prueba de Promoción del Crecimiento de Organismos Aerobios, Anaerobios y Hongos
Evaluar cada lote de medio listo para usar, y cada partida de medio preparado ya sea a partir de medio deshidratado o mez-
clando los ingredientes. Las cepas adecuadas de microorganismos se indican en la Tabla 7.
Inocular porciones de Medio Líquido de Tiog/icolato con un número pequeño (no más de 100 ufc) de los microorganismos
siguientes, usando una porción de medio distinta para cada una de las especies: Clostridium sporogenes, Pseudomonas aerugino-
sa y Staphylococcus aureus. •Inocular porciones de medio de tioglicolato alternativo con un número pequeño (no más de 100
ufc) de Clostridium sporogenes .• Inocular porciones de Medio de Digerido de Caseína y Soja con un número pequeño (no más de
100 ufc) de los microorganismos siguientes, usando una porción de medio distinta para cada una de las especies: Aspergillus
brasiliensis, Bacil/us subtilis y Candida a/bicans. Incubar durante no más de 3 días en el caso de bacterias y durante no más de 5
días en el caso de hongos. Las técnicas de mantenimiento de cultivos de lote de siembra (sistemas de lote de siembra) se usan
para que los microorganismos viables empleados para la inoculación correspondan a no más de cinco pasajes desde el lote de
siembra maestro original.
Los medios son adecuados si se produce un crecimiento claramente visible de los microorganismos.
•LÍQUIDOS DE DILUCIÓN Y LAVADO PARA FILTRACIÓN POR MEMBRANA
Líquido A
PREPARACIÓN
Disolver 1 g de digerido péptico de tejido animal en agua para obtener 1 litro, filtrar o centrifugar para clarificar, si fuera
necesario, y ajustar a un pH de 7, 1 ± 0,2. Transferir a envases y esterilizar empleando un proceso validado.
PREPARACIÓN PARA PENICILINAS O CEFALOSPORINAS
Agregar aséptica mente a la Preparación anterior, si fuera necesario, una cantidad de ft-lactamasa estéril suficiente para inacti-
var cualquier actividad residual de antibióticos en las membranas después de haber filtrado la solución de la muestra de prue-
ba (ver Medios para Penicilinas o Cefalosporinas).
USP 37 Pruebas Microbiológicas/ (71) Pruebas de Esterilidad 87
Líquido D
Agregar 1 mL de polisorbato 80 por cada litro de Líquido A, y ajustar a un pH de 7, 1 ± 0,2. Transferir a er.v.:ises y esteri!iz.:ir
empleando un proceso validado. Usar este líquido para artículos que contengan lecitina o aceite, o para dispositivos etiqueta-
dos "para administración estéril".
Líquido K
Disolver 5,0 g de digerido péptico de tejido animal, 3,0 g de extracto de carne bovina y 10,0 g de polisorbato 80 en agua
para obtener 1 litro. Ajustar el pH para obtener, después de la esterilización, un pH de 6,9 ± 0,2. Transferir a envases y esterili-
zar empleando un proceso validado .•
PRUEBA DE APTITUD DEL MÉTODO
Llevar a cabo una prueba según se describe más adelante en Prueba de Esterilidad del Producto a Examinar usando exacta-
mente los mismos métodos, a excepción de las modificaciones siguientes.
Filtración por Membrana
Después de transferir a la membrana el contenido del envase o envases a analizar, agregar un inóculo de un número peque-
ño de microorganismos viables (no más de 100 ufc) en la porción final del diluyente estéril usado para enjuagar el filtro.
Inoculación Directa
Después de transferir al medio de cultivo el contenido del envase o envases a analizar (para catgut y otros materiales de
sutura quirúrgica para uso veterinario: hebras), agregar al medio un inóculo de un número pequeño de microorganismos via-
bles (no más de 100 ufc).
En ambos casos, usar los mismos microorganismos que los mencionados anteriormente en Prueba de Promoción del Creci-
miento de Organismos Aerobios, Anaerobios y Hongos. Realizar una prueba de promoción del crecimiento como control positivo.
Incubar todos los recipientes que contienen medio durante no más de 5 días.
Si después de la incubación se obtiene un crecimiento claramente visible de microorganismos, comparable visualmente con
el del recipiente de control sin producto, el producto no posee actividad antimicrobiana en las condiciones de la prueba o tal
actividad se ha eliminado satisfactoriamente. La prueba de esterilidad puede entonces llevarse a cabo sin otras modificaciones.
Si no se obtiene un crecimiento claramente visible en presencia del producto a evaluar, comparable visualmente con el de
los recipientes de control sin producto, el producto posee actividad antimicrobiana que no se ha eliminado satisfactoriamente
en las condiciones de la prueba. Modificar las condiciones con el fin de eliminar la actividad antimicrobiana y repetir la Prueba
de Aptitud del Método.
Esta prueba de aptitud del método se lleva a cabo (a) cuando la prueba de esterilidad tiene que realizarse en un producto
nuevo; y (b) siempre que haya un cambio en las condiciones experimentales de la prueba. La prueba de aptitud del método
podrá llevarse a cabo simultáneamente con la Prueba de Esterilidad del Producto a Examinar.
PRUEBA DE ESTERILIDAD DEL PRODUCTO A EXAMINAR
•Número de Artículos a Evaluar
A menos que se especifique algo diferente en otra parte de este capítulo o en la monografía individual, evaluar el número de
artículos especificado en la Tabla 3. Si el contenido de cada artículo está en cantidad suficiente, (ver la Tabla 2) se puede divi-
dir para agregarlo a cada uno de los medios especificados en porciones iguales y apropiadas. [NOTA-Realizar las pruebas de
esterilidad empleando dos o más de los medios especificados.] Si cada artículo no contiene las cantidades suficientes para cada
medio, usar el doble del número de artículos indicado en la Tabla 3 .•
Tabla 2. Cantidad Mínima a Usar para cada Medio
Cantidad Mínima a Usar
Cantidad por Envase (a menos que se justifique y autorice algo diferente)
Líquidos
Menos de 1 ml El contenido total de cada envase
1-40 ml La mitad del contenido de cada envase, pero no menos de 1 ml
Más de 40 ml y no más de 100 ml 20 ml
Más de 100 ml 10% del contenido del envase, pero no menos de 20 ml
Líquidos antibióticos 1 ml
88 (71) Pruebas de Esterilidad / Pruebas Microbiológicas USP 37
Tabla 2. Cantidad Mínima a Usar para cada Medio (Continuación)

Cantidad Mínima a Usar
Cantidad por Envase (a menos que se justifique y autorice algo diferente)
Preparaciones insolubles, cremas y ungüentos que deben suspenderse o emul- Usar el contenido de cada envase para suministrar no menos de 200 mg
sionarse
Sólidos
Menos de 50 mg El contenido total de cada envase
50 mg o más, pero menos de 300 mg La mitad del contenido de cada envase, pero no menos de 50 mg
300 mg-5 g 150 mg
Más de 5 g 500 mg
Catgut y otros materiales de sutura quirúrgica para uso veterinario 3 secciones de una hebra (cada una de 30 cm de longitud)
•Apósito quirúrgico/algodón/gasa (en envases) 100 mg por envase
Material de sutura y otro material de un solo uso envasado individualmen- El dispositivo completo
te
Otros dispositivos médicos El dispositivo completo, cortado en piezas o desmontado ..
Tabla 3. Número Mínimo de Artículos a Evaluar en Relación con el Número de Artículos en la Partida
Número Mínimo de Artículos a Analizar para cada Medio
Número de Artículos en la Partida* (a menos que se justifique y autorice algo diferente)**
Preparaciones parenterales
No más de 100 envases 10% o 4 envases, lo que resulte mayor
Más de 1 00 pero no más de 500 envases 1 O envases
Más de 500 envases 2% o 20 envases, lo que resulte menor
•Para preparaciones parenterales de gran volumen 2% o 1O envases, lo que resulte menor
Antibióticos sólidos
Envases a granel para farmacias (<5 g) 20 envases
Envases a granel para farmacias (~5 g) 6 envases
Graneles y mezclas Ver Productos sólidos a granel+
Preparaciones oftálmicas y otras preparaciones no inyectables
No más de 200 envases 5% o 2 envases, lo que resulte mayor
Más de 200 envases 1 O envases
Si el producto se presenta en la forma de envases monodosis, aplicar el
esquema mostrado anteriormente para preparaciones para uso parente-
ral.
Catgut y otros materiales de sutura quirúrgica para uso veterinario 2% o 5 envases, lo que resulte mayor, hasta un total máximo de 20 enva-
ses
•No más de 100 artículos 10% o 4 artículos, lo que resulte mayor
Más de 100, pero no más de 500 artículos 1 O artículos
Más de 500 artículos 2% o 20 artículos, lo que resulte menor..
Productos sólidos a granel
Hasta 4 envases Cada envase
Más de 4 envases, pero no más de 50 envases 20% o 4 envases, lo que resulte mayor
Más de 50 envases 2% o 1 O envases, lo que resulte mayor
• Si no se conoce el tamaño de la partida, usar el número máximo de artículos prescritos.
•• Si el contenido de un envase es suficiente para inocular dos medios, esta columna da el número de envases necesarios para los dos medios juntos.
La prueba puede llevarse a cabo mediante la técnica de Filtración por Membrana o por Inoculación Directa del Medio de Cultivo
con el producto a examinar. Se incluyen controles negativos adecuados. La técnica de filtración por membrana se usa cuando
la naturaleza del producto lo permite, es decir, para preparaciones acuosas filtrables, para preparaciones alcohólicas o aceitosas
y para preparaciones miscibles con, o solubles en, disolventes acuosos o aceitosos, siempre que dichos disolventes no posean
un efecto antimicrobiano en las condiciones de la prueba.
Filtración por Membrana
Usar filtros de membrana con un tamaño nominal de poro no mayor de 0,45 µm, cuya eficacia para retener microorganis-
mos haya sido establecida. Por ejemplo, se usan filtros de nitrato de celulosa para soluciones acuosas, oleosas y con bajo con-
tenido alcohólico; y se usan filtros de acetato de celulosa, por ejemplo, para soluciones con alto contenido alcohólico. Es posi-
ble que para ciertos productos (p.ej., antibióticos) se necesiten filtros especialmente adaptados.
USP 37 Pruebas Microbiológicas / (71) Pruebas de Esterilidad 89
La técnica descrita más adelante supone que se usarán membranas de aproximadamente 50 mm de diámetro. Si se usan
filtros de un diámetro diferente, los volúmenes de las diluciones y los lavados deben ajustarse según corresponda. El aparato de
filtración y la membrana se esterilizan usando técnicas adecuadas. El aparato se disena de tal modo que la solución a examinar
se pueda introducir y filtrar en condiciones asépticas: permite retirar aséptica mente la membrana para transferirla al medio de
cultivo, o es adecuado para llevar a cabo la incubación dentro del aparato mismo después de agregarle el medio.
SOLUCIONES ACUOSAS
Si corresponde, transferir una pequeña cantidad de un diluyente estéril adecuado, como por ejemplo el •Líquido A (ver Líqui-
dos de Dilución y Lavado para Filtración por Membrana),. a la membrana en el aparato y filtrar. El diluyente puede contener
sustancias neutralizantes adecuadas y/o sustancias inactivantes apropiadas, por ejemplo, en el caso de los antibióticos.
Transferir a la membrana o membranas el contenido del envase o envases a analizar, si fuera necesario, después de diluirlo
hasta el volumen usado en la Prueba de Aptitud del Método con el diluyente estéril elegido, pero usando no menos de las canti-
dades del producto a examinar indicadas en las Tablas 2 y 3. Filtrar inmediatamente. Si el producto posee propiedades antimi-
crobianas, lavar la membrana no menos de tres veces, filtrando en cada lavado el volumen del diluyente estéril elegido usado
en la Prueba de Aptitud del Método. El ciclo de lavado no debe exceder de cinco lavados con 100 mL por filtro, cada uno, inclu-
so si durante la prueba de aptitud del método se ha demostrado que tal ciclo no elimina por completo la actividad antimicro-
biana. Transferir la membrana completa al medio de cultivo o cortarla asépticamente en dos partes iguales y transferir cada
mitad a sendos medios adecuados. Usar el mismo volumen de cada medio que el empleado en la Prueba de Aptitud del Méto-
do. Alternativamente, transferir el medio a la membrana en el aparato. Incubar los medios durante no menos de 14 días.
SÓLIDOS SOLUBLES
Usar para cada medio no menos de la cantidad de producto indicada en las Tablas 2 y 3 disuelto en un disolvente adecua-
do, como por ejemplo el disolvente suministrado con la preparación, Agua Estéril para Inyección, solución salina estéril o una
solución estéril adecuada como por ejemplo •Líquido A (Líquidos de Dilución y Lavado para Filtración por Membrana),. y proce-
der con la prueba según lo indicado anteriormente para Soluciones Acuosas usando una membrana adecuada para el disolvente
elegido.
ACEITES Y SOLUCIONES OLEOSAS
Usar para cada medio no menos de la cantidad de producto indicada en las Tablas 2 y 3. Los aceites y las soluciones oleosas
de viscosidad lo suficientemente baja se pueden filtrar sin dilución a través de una membrana seca. Los aceites viscosos se pue-
den diluir según sea necesario con un diluyente estéril adecuado, como por ejemplo el miristato de isopropilo, que ha demos-
trado no tener actividad antimicrobiana en las condiciones de la prueba. Dejar que el aceite penetre la membrana por su pro-
pio peso y, a continuación, filtrar, aplicando presión o succión gradualmente. Lavar la membrana al menos tres veces filtrando
cada vez aproximadamente 100 mL de una solución estéril adecuada, como por ejemplo el •Líquido A (ver Líquidos de Dilución
y Lavado para Filtración por Membrana),. que contenga un agente emulsionante adecuado a una concentración que haya de-
mostrado ser apropiada en la Prueba de Aptitud del Método, como por ejemplo polisorbato 80 a una concentración de 1 O g por
L •(Líquido K) •. Transferir la membrana o membranas al medio o medios de cultivo, o viceversa, según lo descrito anteriormen-
te para Soluciones Acuosas e incubar a las mismas temperaturas y durante los mismos tiempos.
UNGÜENTOS Y CREMAS
Usar para cada medio no menos de las cantidades de producto indicadas en las Tablas 2 y 3. Los ungüentos en base grasa y
las emulsiones del tipo agua en aceite pueden diluirse al 1 % en miristato de isopropilo según lo descrito anteriormente, calen-
tando si fuera necesario a no más de 40º. Es probable que en casos excepcionales se requiera calentar hasta no más de 44º.
Filtrar tan rápidamente como sea posible y proceder según lo descrito anteriormente para Aceites y Soluciones Oleosas.
•JERINGAS PRELLENADAS
Para jeringas prellenadas sin agujas estériles acopladas, expulsar el contenido de cada jeringa en uno o dos embudos para
filtración por membrana individuales o en recipientes individuales antes de la transferencia. Si se adjunta una aguja estéril, ex-
pulsar directamente el contenido de la jeringa tal como se ha indicado anteriormente y proceder según lo descrito para Solu-
ciones Acuosas. Evaluar la esterilidad de la aguja mediante el procedimiento de Inoculación Directa que se indica en Prueba de
Aptitud del Método.
90 (71 > Pruebas de Esterilidad / Pruebas Microbiológicas USP 37
SÓLIDOS PARA INYECCIÓN DISTINTOS DE ANTIBIÓTICOS
Reconstituir los artículos de prueba según las instrucciones de la etiqueta y proceder según lo indicado para Soluciones Acuo-
sas o Aceites y Soluciones Oleosas, lo que corresponda aplicar. [NOTA-Si fuera necesario, se puede agregar diluyente en exceso
para facilitar la reconstitución y filtración del artículo de prueba reconstituido.]
ANTIBIÓTICOS SÓLIDOS PARA INYECCIÓN
Envases a Granel para Farmacias, <5 g-Tomar una cantidad aproximada a 300 mg de sólido de cada uno de 20 envases,
transferir aséptica mente a un matraz Erlenmeyer estéril de 500 mL, disolver en aproximadamente 200 mL de Líquido A (ver
Líquidos de Dilución y Lavado para Filtración por Membrana) y mezclar; o bien, reconstituir según lo indicado en la etiqueta,
cada uno de 20 envases y transferir una cantidad de líquido o suspensión que equivalga aproximadamente a 300 mg de sólido
a un matraz Erlenmeyer estéril de 500 mL, disolver en aproximadamente 200 mL de Líquido A y mezclar. Proceder según lo
indicado para Soluciones Acuosas o para Aceites y Soluciones Oleosas, lo que corresponda aplicar.
Envases a Granel para Farmacias, :>5 g-Tomar aproximadamente 1 g de sólido de cada uno de 6 envases, transferir asép-
ticamente a un matraz Erlenmeyer estéril de 500 mL, disolver en aproximadamente 200 mL de Líquido A y mezclar; o bien,
reconstituir según lo indicado en la etiqueta, cada uno de 6 envases y transferir una cantidad de líquido que equivalga aproxi-
madamente a 1 g de sólido a un matraz Erlenmeyer estéril de 500 mL, disolver en aproximadamente 200 mL de Líquido A y
mezclar. Proceder según lo indicado para Soluciones Acuosas.
ANTIBIÓTICOS SÓLIDOS, GRANELES Y MEZCLAS
Retirar asépticamente una cantidad suficiente de sólido de la cantidad adecuada de envases (ver Tabla 2), mezclar hasta ob-
tener una mezcla que equivalga aproximadamente a 6 g de sólido y transferir a un matraz Erlenmeyer estéril de 500 ml. Disol-
ver en aproximadamente 200 mL de Líquido A y mezclar. Proceder según lo indicado para Soluciones Acuosas.
PRODUCTOS ESTÉRILES EN AEROSOL
Para productos líquidos en forma de aerosol presurizado, congelar los envases en una mezcla de hielo seco y alcohol por lo
menos a -20º durante aproximadamente 1 hora. Si es posible, dejar que el propelente escape antes de abrir asépticamente el
envase y transferir el contenido a un recipiente de combinación estéril. Agregar 100 mL de Líquido O al recipiente de combina-
ción y mezclar suavemente. Proceder según lo indicado para Soluciones Acuosas o para Aceites y Soluciones Oleosas, según co-
rresponda.
DISPOSITIVOS CON GUÍAS QUE DECLARAN SER ESTÉRILES
Pasar asépticamente un volumen de Líquido O no inferior a 1 O veces el volumen de las guías a través de cada dispositivo
analizado. Recoger los líquidos en un recipiente estéril adecuado y proceder según lo indicado para Soluciones Acuosas o Aceites
y Soluciones Oleosas, según corresponda.
En el caso de jeringas vacías estériles, extraer diluyente estéril hacia el émbolo a través de la aguja estéril, si está acoplada, o
a través de una aguja estéril acoplada para el propósito de la prueba y expulsar el contenido en un recipiente de combinación
estéril. Proceder según lo indicado anteriormente .•
Inoculación Directa del Medio de Cultivo
Transferir directamente en el medio de cultivo la cantidad de la preparación a examinar que se indica en las Tablas 2 y 3, de
modo que el volumen del producto no sea mayor que el 10% del volumen del medio, a menos que se indique algo diferente.
Si el producto a examinar posee actividad antimicrobiana, realizar la prueba después de neutralizar esta actividad con una
sustancia neutralizante adecuada o mediante su dilución en una cantidad suficiente de medio de cultivo. Cuando sea necesario
usar un volumen grande del producto, probablemente sea preferible usar un medio de cultivo concentrado preparado de tal
modo que se tenga en cuenta la dilución subsiguiente. Cuando corresponda, el medio concentrado podrá agregarse directa-
mente al producto en su envase.
LÍQUIDOS OLEOSOS
Usar medios a los que se les haya agregado un agente emulsionante apropiado a una concentración que haya demostrado
ser adecuada en la Prueba de Aptitud del Método, por ejemplo polisorbato 80 a una concentración de 1O g por L.
USP 37 Pruebas Microbiológicas/ <71) Pruebas de Esterilidad 91
UNGÜENTOS Y CREMAS
Realizar una dilución de aproximadamente 1 en 1O, emulsionando con el agente elegido en un diluyente estéril adecuado,
como por ejemplo el •Líquido A (ver Líquidos de Dilución y Lavado para Filtración por Membrana) .• Transferir el producto diluido
a un medio que no contenga agente emulsionante.
Incubar los medios inoculados durante no menos de 14 días. Observar los cultivos varias veces durante el período de incuba-
ción. Agitar suavemente los cultivos que contengan productos oleosos todos los días. Sin embargo, cuando se use Medio Líqui-
do de Tioglicolato para detectar microorganismos anaerobios, agitar o mezclar mínimamente con el fin de mantener las condi-
ciones anaerobias.
CATGUT Y OTROS MATERIALES DE SUTURA QUIRÚRGICA PARA USO VETERINARIO
Usar para cada medio no menos de las cantidades del producto indicadas en las Tablas 2 y 3. Abrir el envase sellado tenien-
do en cuenta las precauciones de asepsia y retirar tres secciones de la hebra para cada medio de cultivo. Llevar a cabo la prue-
ba sobre las tres secciones, cada una de 30 cm de longitud, que se han cortado al comienzo, medio y final de la hebra. Usar
hebras completas de envases recién abiertos. Transferir cada una de las secciones de la hebra a los medios elegidos. Usar sufi-
ciente medio para cubrir adecuadamente el material a analizar (de 20 mL a 150 mL).
•SÓLIDOS
Transferir una cantidad de producto en forma de sólido seco (o preparar una suspensión del producto agregando diluyente
estéril al envase primario) correspondiente a no menos de la cantidad indicada en las Tablas 2 y 3. Transferir el material así
obtenido a 200 mL de Medio Líquido de Tioglicolato y mezclar. Del mismo modo, transferir la misma cantidad a 200 mL de
Medio de Digerido de Caseína y Soja y mezclar. Proceder según lo indicado anteriormente.
ALGODÓN PURIFICADO, GASA, APÓSITOS QUIRÚRGICOS Y ARTÍCULOS RELACIONADOS
De cada envase de algodón, vendas de gasa enrollada o apósitos quirúrgicos grandes que se deba evaluar, extraer aséptica-
mente dos o más porciones de 100 a 500 mg cada una de la parte más interna de la muestra. Para materiales de un solo uso
envasados individualmente, extraer asépticamente todo el artículo. Sumergir las porciones o el artículo en cada medio y proce-
der según lo indicado anteriormente.
DISPOSITIVOS ESTÉRILES
Los artículos pueden sumergirse ensamblados o desmontados. Para asegurar que los conductos del dispositivo también es-
tén en contacto con los medios, sumergir la cantidad adecuada de unidades en un volumen de medio suficiente para sumergir
completamente el dispositivo y proceder según lo indicado anteriormente. Para dispositivos extremadamente grandes, sumer-
gir aquellas porciones del dispositivo que han de entrar en contacto con el paciente en un volumen de medio suficiente para
lograr la inmersión completa de esas porciones.
Para catéteres en los que se requiere la esterilidad del lumen interno y de la parte externa, cortarlos en piezas de modo que
el medio entre en contacto con todo el lumen, o llenar el lumen con medio y sumergir la unidad intacta .•
OBSERVACIÓN E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS
A intervalos durante el período de incubación, y al momento de su finalización, examinar los medios en busca de evidencias
macroscópicas de crecimiento microbiano. Si el material que se está evaluando enturbia el medio de modo que no puede de-
terminarse fácilmente la presencia o ausencia de crecimiento microbiano mediante examen visual, transferir porciones de me-
dio (no menores de 1 mL cada una) 14 días después de comenzada la incubación, a recipientes nuevos con el mismo medio y,
a continuación, incubar el recipiente original y el de transferencia durante no menos de 4 días.
Si no se hallan evidencias de crecimiento microbiano, el producto examinado cumple con la prueba de esterilidad. Si se ha-
llan pruebas de crecimiento microbiano, el producto examinado no cumple con la prueba de esterilidad, a menos que pueda
demostrarse claramente que la prueba resultó inválida por causas no relacionadas con el producto examinado. La prueba pue-
de considerarse inválida sólo si se cumplen una o más de las siguientes condiciones:
a. Los datos de monitoreo microbiológico de las instalaciones para pruebas de esterilidad demuestran una falla.
b. Una revisión del procedimiento analítico usado durante la prueba en cuestión revela un error.
c. Se halla crecimiento microbiano en los controles negativos.
d. Después de determinar la identidad de los microorganismos aislados de la prueba, el crecimiento de esta especie (o espe-
cies) puede atribuirse de manera inequívoca a errores con respecto al material o a la técnica usados al realizar el procedi-
miento de la prueba de esterilidad.
92 (71) Pruebas de Esterilidad / Pruebas Microbiológicas USP 37
Si la prueba se declara inválida, se repetirá con el mismo número de unidades de la prueba original. Si no se hallan pruebas
de crecimiento microbiano en la prueba repetida, el producto examinado cumple con la prueba de esterilidad. Si se hallan
pruebas de crecimiento microbiano en la prueba repetida, el producto examinado no cumple con la prueba de esterilidad.
APLICACIÓN DE LA PRUEBA A PREPARACIONES PARENTERALES, OFTÁLMICAS V OTRAS

PREPARACIONES NO INYECTABLES QUE DEBEN CUMPLIR CON LA PRUEBA DE ESTERILIDAD
Al usar la técnica de filtración por membrana, utilizar, siempre que sea posible, el contenido total del envase, pero no menos
de las cantidades indicadas en las Tablas 2, diluyendo cuando sea necesario hasta aproximadamente 100 mL con una solución
estéril adecuada, como por ejemplo el •Líquido A (ver Líquidos de Dilución y Lavado para Filtración por Membrana) .•
Al usar la técnica de inoculación directa de medios, usar las cantidades que se muestran en la Tabla 2, a menos que se justifi-
que y autorice algo diferente. Las pruebas de esterilidad bacteriana y fúngica se llevan a cabo sobre la misma muestra del pro-
ducto a examinar. Cuando el volumen o la cantidad de un único envase sea insuficiente para llevar a cabo las pruebas, se usará
el contenido de dos o más envases para inocular los distintos medios.
NÚMERO MÍNIMO DE ARTÍCULOS A ANALIZAR
En la Tabla 3 se indica el número mínimo de artículos a analizar en relación con el tamaño de la partida.
Pruebas y Valoraciones Biológicas
(81) ANTIBIÓTICOS-VALORACIONES MICROBIOLÓGICAS
Introducción e Información General
En las condiciones adecuadas, la actividad (potencia) de los antibióticos puede demostrarse por su efecto inhibidor sobre los
microorganismos. La reducción en la actividad microbiana puede ser difícil de demostrar por métodos químicos. Este capítulo
resume los procedimientos para antibióticos reconocidos en la Farmacopea de los Estados Unidos (USP) para los que la valora-
ción microbiológica es el método analítico estándar.
Se utilizan dos técnicas generales: la valoración en cilindro-placa (o en placa) y la valoración turbidimétrica (o en tubo). La
Tabla 1 lista todos los antibióticos que incluyen valoraciones microbiológicas y especifica el tipo de valoración (cilindro-placa o
turbidimétrica).
Tabla 1
Antibiótico Tipo de Valoración
Amfotericina B Cilindro-placa
Bacitracina Cilindro-placa
Bleomicina Cilindro-placa
Capreomicina Turbidimétrica
Carbenicilina Cilindro-placa
Cloranfenicol Turbidimétrica
Clortetraciclina Turbidimétrica
Cloxacilina Cilindro-placa
Colistimetato Cilindro-placa
Colistina Cilindro-placa
Cilindro-placa
Dihidroestreptomicina Turbidimétrica
Eritromicina Cilindro-placa
Gentamicina Cilindro-placa
Gramicidina Turbidimétrica
Nafcilina Cilindro-placa
USP 37 Pruebas Biológicas/ (81) Antibióticos-Valoraciones Microbiológicas 93
Tabla 1 (Continuación)
Antibiótico - ---- ---
Tipo de Valoración
Natamicina Cilindro-placa
Cilindro-placa
Neomicina T urbidimétrica
Novobiocina Cilindro-placa
Nistatina Cilindro-placa
Oxitetraciclina Turbidimétrica
Paromomicina Cilindro-placa
Penicilina G Cilindro-placa
Polimixina B Cilindro-placa
Sisomicina Cilindro-placa
Tetracicli na Turbidimétrica
Tioestreptona Turbidimétrica
Troleandomicina Turbidimétrica
Ti losina Turbidimétrica
Vancomicina Cilindro-placa
[NOTA-Realizar todos los procedimientos descritos en las monografías asépticamente. Tomar las precauciones de seguridad
adecuadas al realizar estas valoraciones debido a las posibles alergias a los fármacos y a que se usan cultivos vivos de organis-
mos en los procedimientos]
Valoración en cilindro-placa: La valoración en cilindro-placa se basa en la difusión del antibiótico desde un cilindro vertical a
través de una capa de agar solidificado en un plato o placa de Petri. El crecimiento del microorganismo específico inoculado en
el agar resulta inhibido en un área circular o zona en torno al cilindro que contiene la solución del antibiótico.
Valoración turbidimétrica: La valoración turbidimétrica se basa en la inhibición del crecimiento de un microorganismo en
una solución uniforme del antibiótico en un medio fluido que favorezca el crecimiento del microorganismo en ausencia del
antibiótico.
Unidades y Estándares de Referencia: La potencia de los antibióticos se designa en unidades (U) o en µg de actividad. En
ambos casos, la unidad o µg de actividad del antibiótico se establece originalmente contra un Estándar Maestro Federal de los
Estados Unidos para el antibiótico en cuestión. El Estándar de Referencia USP correspondiente se calibra en términos del están-
dar maestro.
En un principio, se consideraba que un antibiótico seleccionado como estándar de referencia constaba en su totalidad de
una sola entidad química y, por lo tanto, se le asignaba una potencia de 1000 µg/mg. En muchos de estos casos, a medida
que los métodos de fabricación y purificación para ciertos antibióticos avanzaron en su desarrollo, fue posible obtener antibió-
ticos con más de 1000 µg de actividad/mg. Tales antibióticos tenían una actividad equivalente a un número determinado de
µg del estándar de referencia original. No obstante, la mayoría de las veces, los µg de actividad son, numéricamente, exacta-
mente equivalentes a los µg (peso) de la sustancia pura. En ciertas ocasiones, como las citadas a continuación, los µg de activi-
dad definidos en términos del estándar maestro original equivalen a una unidad:
1. Cuando el antibiótico se presenta como la base libre y en forma de sal, y los µg de actividad han sido definidos en térmi-
nos de una de estas formas.
2. Cuando la sustancia antibiótica consta de un número de componente~ que son químicamente similares pero que difieren
en actividad antibiótica.
3. Cuando las potencias de una familia de antibióticos se expresan en términos de un estándar de referencia que consta de
un solo miembro de la familia el cual, no obstante, puede ser por sí mismo heterogéneo.
No se debe asumir que los µg de actividad corresponden a los µg (peso) de la sustancia antibiótica.
Aparato: El material de laboratorio usado para almacenar y transferir microorganismos y diluciones de prueba debe ser esté-
ril y estar exento de residuos que pudieran interferir en la valoración (ver Limpieza de Material de Vidrio (1051 )). Usar un méto-
do de esterilización validado tal como calor seco, vapor o irradiación; o usar material de laboratorio estéril y desechable.
Control de temperatura: Se requiere control termostático en varias etapas de una valoración microbiológica: durante el cul-
tivo de un microorganismo y la preparación de su inóculo, así como durante la incubación en las valoraciones en placa y tubo.
Referirse a los requisitos específicos de temperatura provistos más adelante para cada tipo de valoración.
Organismos de prueba: El organismo de prueba para cada antibiótico se lista en la Tabla 3 para la valoración en cilindro-
placa y en la Tabla 8 para la valoración turbidimétrica. Los organismos de prueba se especifican mediante su número de identi-
ficación en la American Type Culture Collection (Colección de Cultivos Tipo de los EE.UU. o ATCC).
Para asegurar el desempeño aceptable de los organismos de prueba, estos deben ser almacenados y conservados de manera
apropiada. Se deben establecer las condiciones de almacenamiento específicas durante la validación o verificación del método.
Desechar los cultivos si se observa un cambio en las características del organismo.
Almacenamiento prolongado: Para el almacenamiento prolongado, mantener los organismos de prueba en una solución
de almacenamiento adecuada, tal como suero fetal de ternero al 50% en caldo, glicerol al 10%-15% en caldo tripticasa de
94 (81) Antibióticos-Valoraciones Microbiológicas / Pruebas Biológicas USP 37
soja (caldo digerido de caseína y soja), sangre de oveja desfribinada o leche descremada. Los cultivos que se van a almacenar
durante periodos prolongados se almacenan mejor en estado liofilizado; se prefieren temperaturas de -60º o inferiores; son
aceptables temperaturas inferiores a -20c.
Cultivos primarios: Preparar los cultivos primarios transfiriendo organismos de prueba desde los viales de almacenamien-
to prolongado a medios apropiados e incubando en condiciones de crecimiento adecuadas. Almacenar los cultivos primarios a
la temperatura apropiada, por lo general a 2º- 8º, y desechar después de tres semanas. Se puede usar el mismo cultivo prima-
rio para preparar los cultivos de trabajo por un máximo de siete días únicamente.
Cultivos de trabajo: Preparar los cultivos de trabajo transfiriendo el cultivo primario a medios sólidos apropiados para ob-
tener colonias aisladas. Incubar los cultivos de trabajo en condiciones apropiadas para obtener un crecimiento satisfactorio pa-
ra la preparación de los inóculos de prueba. Preparar cultivos de trabajo nuevos para cada día de análisis.
Crecimiento o desempeño no característicos de un organismo de prueba: Usar cultivos madre, cultivos primarios o
cultivos de trabajo nuevos cuando un organismo de prueba presente crecimiento o desempeño no característicos.
Diseños de valoración: Los rliseños experimentales adecuados son clave para incrementar la precisión y minimizar el sesgo.
Controlar los parámetros de incubación, la distribución de temperaturas y el tiempo es crítico para minimizar el sesgo; esto se
puede lograr acomodando las placas y gradillas, según se indica en cada valoración.
Valoración en cilindro-placa: Las comparaciones se limitan a las relaciones entre las mediciones del diámetro de la zona
dentro de las placas, sin tener en cuenta la variación entre placas. Las respuestas individuales de las placas se normalizan ba-
sándose en el tamaño relativo de la zona del estándar comparado con el tamaño medio de la zona del estándar en todas las
placas.
Valoración turbidimétrica: Para evitar un sesgo sistemático, colocar aleatoriamente tubos duplicados en gradillas separa-
das de manera que cada gradilla contenga un conjunto completo de tratamientos. El propósito de esta configuración es mini-
mizar la influencia de la distribución de la temperatura sobre las muestras duplicadas. La valoración turbidimétrica, debido a la
configuración de las muestras en las gradillas para tubos de ensayo, es sensible a ligeras variaciones de temperatura. Asimismo,
la influencia de la variación de la temperatura se puede disminuir al asegurar un flujo de aire o la convección de calor adecua-
dos durante la incubación. Se deben colocar por lo menos tres tubos para cada concentración muestra y estándar (un conjun-
to completo de muestras) en una sola gradilla. Las comparaciones se limitan a las relaciones entre los valores de turbidez ob-
servados dentro de las gradillas.
Consideraciones sobre potencia: Dentro de las restricciones citadas anteriormente, el diseño de valoración recomendado
emplea una curva estándar de cinco concentraciones y una sola concentración de cada preparación muestra.
Para la valoración en cilindro-placa, cada placa incluye únicamente dos tratamientos, el tratamiento de referencia (mediana
de los niveles del estándar, es decir, 53) y una de las otras cuatro concentraciones del estándar (5 7, 52, 54 y 55 ) o la muestra (U 3 ).
La concentración de la muestra es una estimación basada en la concentración deseada. La muestra se debe diluir para propor-
cionar una concentración nominal que se estima es equivalente a la mediana de la concentración de referencia del estándar
(5 3). El propósito de diluir a la mediana de la concentración de referencia es asegurar que el resultado de la muestra caerá
dentro de la porción lineal de la curva estándar. La prueba determina la potencia relativa de U3 en función de la curva están-
dar. La muestra (U) debe tener una potencia relativa de aproximadamente 100%. La potencia final de la muestra se obtiene
multiplicando el resultado de U3 por el factor de dilución.
Una valoración debe considerarse preliminar si el valor de potencia de la muestra calculado es inferior al 80% o superior al
125%. En dicho caso, los resultados sugieren que la concentración de la muestra supuesta durante la preparación de la solu-
ción madre de la muestra era incorrecta. Si esa fuera la situación, se puede ajustar la potencia supuesta de la muestra basándo-
se en el valor de potencia preliminar y repetir la valoración. De otro modo, la potencia se derivará de una porción de la curva
donde las respuestas del estándar y la muestra probablemente no serán paralela?.
Las determinaciones microbiológicas de potencia están sujetas a variables intervaloración e intravaloración, de modo tal que
se requieren dos o más valoraciones independientes para obtener una estimación confiable de la potencia de una muestra de-
terminada. Partiendo de soluciones madre y diluciones de prueba tanto del estándar como de la muestra, preparadas por se-
pardo, llevar a cabo otro día valoraciones adicionales de una muestra determinada. La potencia media debe incluir los resulta-
dos de todas las valoraciones independientes válidas. El número de valoraciones requerido para lograr una estimación de po-
tencia confiable depende de la variabilidad de la valoración y de la incertidumbre máxima requerida para la estimación de po-
tencia. Ésta última se evalúa mediante la amplitud del intervalo de confianza (ver Cálculos, Límites de confianza y combinaciones
de cálculos de valoración). El resultado combinado de una serie de valoraciones independientes más pequeñas a lo largo de
varios días es una estimación de potencia más confiable que la obtenida de una sola valoración grande con el mismo número
total de placas o tubos. Se debe tomar en cuenta que las valoraciones adicionales o una menor variabilidad permite que el
producto cumpla con intervalos de especificación más estrechos. Al reducir la variabilidad de las valoraciones se logra el límite
de confianza requerido con menos valoraciones.
Método de Cilindro-Placa
Control de temperatura: Usar equipo calificado y calibrado de manera apropiada para obtener los rangos de temperatura
especificados en la Tabla 3.
Aparato
Placas: Placas de Petri de plástico desechables o de vidrio (de aproximadamente 20 x 100 mm) con tapas
USP 37 Pruebas Biológicas/ <81) Antibióticos-Valoraciones Microbiológicas 95
Cilindros: Cilindros de acero inoxidable o porcelana; de 8 ±O, 1 mm de diámetro externo; de 6 ±O, 1 mm de diámetro in-
terno; de 1O±0, 1 mm de altura. [NOTA-Limpiar los cilindros cuidadosamente para eliminar cualquier residuo; es necesario
limpiar ocasionalmente en un baño ácido, por ejemplo, con ácido nítrico aproximadamente 2 N o con ácido crómico (ver
Limpieza de Aparatos de Vidrio (1051 )).]
Soluciones estándar: Para preparar una solución madre, disolver una cantidad adecuada del Estándar de Referencia USP de
un determinado antibiótico o todo el contenido de un vial de Estándar de Referencia USP, cuando corresponda, en el disolven-
te especificado en la Tabla 2 y diluir a la concentración especificada. Almacenar a 2º-8º y usar dentro del periodo indicado. En
el día de la valoración, preparar a partir de la solución madre cinco o más diluciones de prueba, con un aumento de concen-
tración entre diluciones sucesivas, por lo general, en una proporción de 1 :1,25. Usar el diluyente final especificado de tal ma-
nera que la mediana tenga la concentración sugerida en la Tabla 2.
Soluciones muestra: Asignar a la muestra una potencia supuesta por unidad de peso o volumen. En el día de la valoración,
preparar una solución madre de la misma manera que se especifica para el Estándar de Referencia USP (Tabla 2). Diluir la solu-
ción madre de la muestra en el diluyente final especificado hasta obtener una concentración nominal igual a la mediana de la
concentración del estándar (5 3).
Tabla 2
Solución Madre Dilución de Prueba
Mediana
Concentra- dela
Disolvente ción Diluyente Concentración Usar Diluyente Concentración
Antibiótico Inicial Inicial Adicional Final dentro de Final (S,)•,b
Anfotericina Bc,d Dimetil sulfóxido - - 1 mg/ml El mismo día B. loe 1 µg/ml
Ácido clorhídrico
- -
Bacitracinaf 0,01 N 100 U/ml El mismo día B.le 1 U/ml
Bleomicina B.16e - - 2 U/ml 14 días B.l 6e 0,04 U/ml
Carbenicilina B.ie - - 1 mg/ml 14 días B.le 20 µg/ml
Cloxacilina B.ie - - 1 mg/ml 7 días B.le 5 µg/ml
Colistemetato< Agua 10 mg/ml B.6e 1 mg/ml El mismo día B.6e 1 µg/ml
Colistina Agua 10 mg/ml B.6e 1 mg/ml 14 días B.6e 1 µg/ml
Dihidrostreptomicina9 B.3• - - 1 mg/ml 30 días B.3e 1 µg/ml
Eritromicina Methanol 10 mg/ml B.3e 1 mg/ml 14 días B.3e 1 µg/ml
Gentamicina B.3e - - 1 mg/ml 30 días B.3e 0.1 µg/ml
Nafcilina B.ie - - 1 mg/ml 2 días B.ie 2 µg/ml
Natamicina Dimetil sulfóxido - - 1 mg/ml El mismo día B.1oe 5 µg/ml
Neomicina9 B.3e - - 1 mg/ml 14 días B.3e 1 µg/ml
Novobiocina alcohol 10 mg/ml B.3e 1 mg/ml 5 días B.6e 0,5 µg/ml
Nistatinac,h Dimetilformamida - - 1000 U/ml El mismo día B.6e 20 U/ml
Paromomicina B.3e - - 1 mg/ml 21 días B.3e 1 µg/ml
Penicilina G B.le - - 1000 U/ml 4 días B.ie 1 U/ml
Polimixina Bi Agua - B.6e 10 000 14 días B.6e 10 U/ml
U/ml
Sisomicina B.3e - - 1 mg/ml 14 días B.3e 0,1 µg/ml
Vancomicina Agua - - 1 mg/ml 7 días B.4e 10 µg/ml
ª Se puede ajustar la mediana de la concentración para optimizar los tamaños de la zona si los datos se mantienen en el intervalo lineal.
b µg en esta columna se refiere a µg de actividad.
e Preparar el Estándar de Referencia USP y las diluciones de prueba de la muestra al mismo tiempo.
d Diluir adicionalmente la solución madre con dimetil sulfóxido para obtener concentraciones de 12,8; 16; 20; 25 y 31,2 µg/ml antes de realizar las diluciones
de prueba. La dilución de prueba de la muestra debe contener la misma cantidad de dimetil sulfóxido que las diluciones de prueba del Estándar de Referencia
USP.
e La letra B se refiere a la solución amortiguadora. Ver Medios y Soluciones, Soluciones amortiguadoras para una descripción de cada solución amortiguadora lista-
da en esta tabla.
f Cada una de las diluciones de prueba del estándar debe contener la misma cantidad de ácido clorhídrico que la dilución de prueba de la muestra.
9 Se puede usar la valoración turbidimétrica como un procedimiento alternativo.
h Diluir adicionalmente la solución madre con dimetilformamida para obtener concentraciones de 256; 320; 400; 500 y 624 U/mL antes de preparar las dilucio-
nes de pruebas. Preparar las diluciones de prueba del estándar al mismo tiempo que las diluciones de prueba de la muestra a analizar. La dilución de prueba de
la muestra debe contener la misma cantidad de dimetilformamida que las diluciones de prueba del estándar. Usar material de vidrio con protección actínica.
i Preparar la solución madre agregando 2 mL de agua por cada 5 mg del Estándar de Referencia USP.
lnóculos: Suspender el organismo de prueba obtenido de un cultivo o cultivo inclinado (slant) recientes en 3 ml de solución
salina SR estéril. Se pueden usar perlas de vidrio para facilitar la suspensión. Esparcir la suspensión salina sobre la superficie de
dos o más placas de agar (cubriendo toda la superficie) o sobre la superficie de un frasco Roux que contenga 250 ml del me-
dio especificado (ver la Tabla 3).
Incubar durante el tiempo y a la temperatura especificados en la Tabla 3, o hasta que el crecimiento sea evidente.
96 (81) Antibióticos-Valoraciones Microbiológicas/ Pruebas Biológicas USP 37
Después de incubar, recolectar el organismo de las placas o frasco Roux con aproximadamente 50 ml de solución salina SR
estéril (excepto en el caso de bleomicina para el que debe usarse Medio 34; ver la sección Medios y Soluciones), usando una
varilla de vidrio doblada en ángulo estéril o perlas de vidrio estériles. Pipetear y transferir la suspensión a un frasco de vidrio
estéril. Ésta es la suspensión de recolección.
Diluir una cantidad apropiada de la suspensión de recolección con solución salina SR estéril. Usando el espectrofotómetro de
UV-visible, medir el % de transmitancia a 580 nm. El valor deseado es aproximadamente 25% de transmitancia a 580 nm. Este
valor se usa para estandarizar el volumen de suspensión de recolección agregado a la capa de agar para siembra.
Determinar durante la verificación del método, comenzando con los volúmenes sugeridos en la Tabla 3, las proporciones de
suspensión madre que se habrán de agregar al medio de inóculo que resulten en zonas satisfactorias de inhibición de aproxi-
madamente 14-16 mm de diámetro para la mediana de la concentración del estándar (5 3). [NOTA-Los tamaños de las zonas
fuera del intervalo de 11 a 19 mm no son adecuados, debido a que contribuyen a la variabilidad de la valoración.] Si el porcen-
taje de transmitancia de la dilución está por encima de 25%, se puede usar un cociente para normalizar la adición de microor-
ganismos a la capa de siembra. El factor de normalización se puede determinar dividiendo por 25 el porcentaje de transmitan-
cia obtenido de la dilución. Posteriormente, se puede multiplicar este cociente por la cantidad sugerida de inóculo para obte-
ner el volumen (ml) de suspensión de recolección que se requiere agregar a la capa de siembra. Ajustar la cantidad de inóculo
diariamente, si fuera necesario, para obtener una relación de concentración-respuesta óptima.
Alternativamente, determinar durante la verificación del método la proporción de suspensión de recolección que se habrá
de incorporar al inóculo, comenzando con los volúmenes indicados en la Tabla 3, que resulten en una demarcación satisfacto-
ria de las zonas de inhibición de aproximadamente 14-16 mm de diámetro para la mediana de la concentración del estándar
(5 3) y que produzcan una relación de concentración-respuesta reproducible. Preparar el inóculo agregando una porción de
suspensión madre a una cantidad suficiente de medio de agar que se ha fundido y enfriado a 45º-50º. Agitar la mezcla por
rotación suave sin crear burbujas hasta obtener una suspensión homogénea.
Tabla 3
Composición
Condiciones de Incubación Sugerida del lnóculo
Temperatu-
Númeroª ra Tiem- Cantidad
Antibiótico Organismo de Prueba ATCC Mediob (º) po Mediob (mL/100 mL)
Amfotericina B Saccharomyces cerevisiae 9763 19 29-31 48 h 19 1,0
Bacitracina Micrococcus luteus 10240 1 32-35 24 h 1 0,3
Bleomicina Mycobacterium smegmatis 607 36 36-37,5 48 h 35 1,0
Carbenicilinac Pseudomonas aeruginosa 25619 1 36-37,5 24 h 10 0,5
Cloxacilina Staphylococcus aureus 29737 1 32-35 24 h 1 0,1
Colistimetato Bordetella bronchiseptica 4617 1 32-35 24 h 10 0,1
Colistina Bordetella bronchiseptica 4617 1 32-35 24 h 10 0,1
Dihidroestreptomi- Según se re-
cina Bacillus subtilis 6633 32 32-35 5 días 5 quiera
Eritromicina Micrococcus luteus 9341 1 32-35 24 h 11 1,5
Gentamicina Staphylococcus epidermidis 12228 1 32-35 24 h 11 0,03
Nafcilina Staphylococcus aureus 29737 1 32-35 24 h 1 0,3
Neomicina Staphy/ococcus epidermidis 12228 1 32-35 24 h 11 0,4
Novobiocina Staphylococcus epidermidis 12228 1 32-35 24 h 1 4,0
Nistatina Saccharomyces cerevisiae 2601 19 29-31 48 h 19 1,0
Paromomicina Staphylococcus epidermidis 12228 1 32-35 24 h 11 2,0
Penicilina G Staphylococcus aureus 29737 1 32-35 24 h 1 1,0
Polimixina B Bordetel/a bronchiseptica 4617 1 32-35 24 h 10 0,1
Sisomicina Staphylococcus epidermidis 12228 1 32-35 24 h 11 0,03
Según se re-
Vancomicina Bacil/us subti/is 6633 32 32-35 5 días 8 quiera
ª American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas VA 20110-2209 (http://www.atcc.org)
b Ver Medios y Soluciones, Medios.
e Usar 0,5 ml de una dilución 1 :25 de la suspensión madre/l 00 ml de Medio 1O.
Análisis: Preparar la capa base para el número requerido de placas de Petri para la valoración, usando el medio y el volumen
mostrados en la Tabla 4. Dejar que se endurezca formando una capa base lisa de profundidad uniforme. Preparar la cantidad
apropiada de inóculo para la capa de siembra (Tabla 5), según se indica para el antibiótico correspondiente (Tabla 3), realizan-
do los ajustes necesarios basándose en el análisis de ensayo preparatorio. Inclinar la placa hacia atrás y hacia adelante para
esparcir el inóculo uniformemente sobre la superficie de la capa base y dejar que se endurezca.
Tabla 4 (capa base)

Volumen
Objetivo
Antibiótico Medioª (ml)
Amfotericina Bb - --
Bleomicina 35 10
Carbenicilina 9 21
Colistimetato 9 21
Colistina 9 21
Dihidroestreptomicina 5 21
Eritromicina 11 21
Gentamicina 11 21
Neomicina 11 21
Nistatinab - -
Paromomicina 11 21
Polimixina B 9 21
Sisomicina 11 21
Vancomicina 8 10
Todos los demás 2 21
ª Ver Medios y Soluciones, Medios.
b No se usa capa base.
[NOTA-La capa base se puede entibiar para facilitar la formación de una capa uniforme.]
Tabla 5 (capa de siembra)

Volumen
Objetivo
Antibiótico Medioª (ml)
Amfotericina B Referirse a la Tabla 3 8
Bleomicina 6
Nistatina 8
Todos los demás 4
ª Ver Medios y Soluciones, Medios.
Dejar caer seis cilindros de valoración sobre la superficie inoculada desde una altura de 12 mm, utilizando una guía mecánica
u otro dispositivo para asegurar el espaciado uniforme en un radio de 2,8 cm y tapar las placas para evitar la contaminación.
Llenar los seis cilindros en cada placa con diluciones de antibiótico que contengan los niveles de prueba (S 7-S5 y U3 ) especifica-
dos en el párrafo siguiente. Incubar las placas según se especifica en la Tabla 6 durante 16-18 horas y retirar los cilindros. Me-
dir y registrar el diámetro de cada zona de inhibición del crecimiento con una aproximación de O, 1 mm.
Tabla 6
Antibiótico Temperatura de Incubación(º)
Amfotericina B 29-31
Carbenicilina 36-37,5
Colistimetato 36-37,5
Colistina 36-37,5
Dihidroestreptomicina 36-37,5
Gentamicina 36-37,5
Neomicina 36-37,5
Novobiocina 34-36
Nistatina 29-31
Paromomicina 36-37,5
Polimixina B 36-37,5
Sisomicina 36-37,5
Vancomicina 36-37,5
Todos los demás 32-35
Se usarán durante la valoración los estándares (S 7-S5 ) y un solo nivel de prueba de la muestra (U 3 ) correspondiente a S3 de la
curva estándar, según se definen en Soluciones estándar y Soluciones muestra. Para derivar la curva estándar, llenar cilindros
alternos en tres placas con la dilución correspondiente a la mediana de la dilución de prueba (S 3) del estándar y cada uno de
98 (81) Antibióticos-Valoraciones Microbiológicas/ Pruebas Biológicos USP 37
los nueve cilindros remanentes con una de las otras cuatro diluciones de prueba del estándar. Repetir el proceso para las tres
diluciones de prueba del estándar. Para la muestra, llenar cilindros alternos en tres placas con la dilución correspondiente a la
mediana de la dilución de prueba (S) y llenar los nueve cilindros remanentes con la dilución de prueba correspondiente (U 3 )
de la muestra.
Método Turbidimétrico
Control de temperatura: Usar un equipo calificado y calibrado de manera apropiada para obtener los rangos de temperatu-
ra especificados en la Tabla 8. [NOTA-El control de la temperatura se puede lograr con circulación de aíre o agua. La mayor
capacidad térmica del agua representa cierta ventaja sobre el aire circulante.]
Espectrofotómetro: La medición de la absorbancia o transmitancía dentro de una banda de frecuencia muy estrecha requie-
re un espectrofotómetro adecuado en el que se pueda variar o restringir la longitud de onda usando filtros de 580 nm o 530
nm. Como alternativa, se puecfe usar un espectrofotómetro con longitud de onda variable y ajustar a una longitud de onda de
580 nm o 530 nm.
El instrumento se puede modificar de la siguiente manera:
1. Para que acepte el tubo en el que se lleva a cabo la incubación (ver Aparato a continuación).
2. Para que acepte una celda modificada equipada con un drenaje que facilite el cambio rápido del contenido.
3. Para que contenga una celda de flujo para un análisis de flujo continuo.
Ajustar automáticamente el instrumento a cero con un caldo no inoculado transparente, preparado según las especificacio-
nes de cada antibiótico, incluyendo la misma cantidad de dilución de prueba (incluyendo formaldehído sí se específica) que se
encuentra en cada muestra.
Durante la preparación de los ínóculos se puede medir tanto la absorbancía como la transmitancia.
Aparato: Tubos de ensayo de vidrio o plástico, p.ej., de 16 x 125 mm o de 18 x 150 mm. [NOTA-Usar tubos que tengan
una longitud, diámetro y espesor relativamente uniformes y que estén exentos de defectos y rayaduras en la superficie. En el
espectrofotómetro, usar tubos idénticos exentos de defectos y rayaduras. Limpiar los tubos minuciosamente para eliminar to-
dos los residuos de antibiótico y restos de soluciones de limpieza. Esterilizar los tubos antes de usar.]
Soluciones estándar: Para preparar una solución madre, disolver una cantidad del Estándar de Referencia USP de un antibió-
tico determinado o todo el contenido de un vial de Estándar de Referencia USP, cuando corresponda, en el disolvente especifi-
cado en la Tabla 7 y diluir hasta la concentración requerida. Almacenar a 2º-8º y usar dentro del periodo indicado. En el día de
la valoración, preparar a partir de la solución madre cinco o más diluciones de prueba, con un aumento de concentración en-
tre diluciones sucesivas, por lo general, en una proporción de 1 :1,25. [NOTA-Puede ser necesario usar relaciones más peque-
ñas para diluciones sucesivas de la solución madre para la valoración turbidímétrica.] Usar el diluyente final especificado de
manera tal que la mediana de los niveles del estándar (53 ) tenga la concentración sugerida en la Tabla 7.
Soluciones muestra: Asignar una potencia supuesta por unidad de peso o volumen a la muestra desconocida y, en el día de
la valoración, preparar una solución madre de la misma manera que se especifica para el Estándar de Referencia USP (Tabla 7).
Diluir la solución madre de la muestra en el diluyente final especificado a una concentración nominal igual a la mediana de la
concentración del estándar (SJ según se especifica en la Tabla 7.
Tabla 7
Concentra- Concentra- Usar Diluyen- Mediana de la
Disolvente ción Diluyente ción Dentro te Concentración
Antibiótico Inicial Inicial Adicional Madre Final de Final (S,)ª
Capreomicina Agua - - 1 mg/ml 7 días Agua 100 µg/ml
Cloranfenicol Alcohol 10 mg/ml Agua 1 mg/ml 30 días Agua 2,5 µg/ml
Clortetraciclina Ácido clorhídrico 0,01 N - - 1 mg/ml 4 días Agua 0,06 µg/ml
Dihidroestreptomicinab Agua - - 1 mg/ml 30 días Agua 30 µg/ml
Gramicidina Alcohol - - 1 mg/ml 30 días Alcohol 0,04 µg/ml
Neomicinab,d B.3c - - 100 µg/ml 14 días B.3c 1,0 µg/ml
Oxitetraciclina Ácido clorhídrico O, 1 N - - 1 mg/ml 4 días Agua 0,24 µg/ml
Tetraciclina Ácido clorhídrico O, 1 N - - 1 mg/ml 1 día Agua 0,24 µg/ml
Tioestreptona El mismo Dimetil
- -
Dimetil sulfóxido 1 U/ml día sulfóxido 0,80 U/ml
ª ¡1g en esta columna se refiere a µg de actividad.
b Se puede usar la valoración en cilindro-placa como un procedimiento alternativo.
e La letra B se refiere a la solución amortiguadora. Ver Medios y Soluciones, Soluciones amortiguadoras para una descripción de cada solución amortiguadora lista-
da en esta tabla.
d Diluir la solución madre de 100 pg/ml con Solución amortiguadora B.3 para obtener una solución con una concentración equivalente a 25 ,ug/ml de neomici-
na. Agregar 1,39; 1,67; 2,00; 2,40 y 2,88 ml de esta solución a sendos matraces volumétricos de 50 ml. Agregar 5,0 ml de ácido clorhídrico 0,01 Na cada
matraz, diluir con Solución amortiguadora B.3 a volumen y mezclar para obtener soluciones con concentraciones de 0,69; 0,83; 1,0; 1,2 y 1,44 ftg/ml de neomi-
cina. Usar estas soluciones para preparar la línea de respuesta estándar.
USP 37 Pruebas Biológicas/ (81 >Antibióticos-Valoraciones Microbiológicas 99
Tabla 7 (Continuación)
Concentra- Concentra- Usar Diluyen- Mediana de la
Disolvente ción Diluyente ción Dentro te Concentración
Antibiótico Inicial Inicial Adicional Madre Final de Final (S,)<l
Troleandomicina Alcohol isopropílico y agua El mismo
- -
(4:1) 1 mg/ml día Agua 25 pg/ml
Ti losina Metano! y
Metano! 10 mg/ml B.16' 1 mg/ml 30 días B.3' (1 :1) 4 ftg/ml
ª ,ug en esta columna se refiere a rtg de actividad.
b Se puede usar la valoración en cilindro-placa como un procedimiento alternativo.
' La letra B se refiere a la solución amortiguadora. Ver Medios y Soluciones, Soluciones amortiguadoras para una descripción de cada solución amortiguadora lista-
da en esta tabla.
d Diluir la solución madre de 100 fLg/mL con Solución amortiguadora B. 3 para obtener una solución con una concentración equivalente a 25 pg/ml de neomici-
na. Agregar 1,39; 1,67; 2,00; 2,40 y 2,88 ml de esta solución a sendos matraces volumétricos de 50 ml. Agregar 5,0 ml de ácido clorhídrico 0,01 Na cada
matraz, diluir con Solución amortiguadora 8.3 a volumen y mezclar para obtener soluciones con concentraciones de 0,69; 0,83; 1,0; 1,2 y 1,44 ftg/ml de neomi-
cina. Usar estas soluciones para preparar la línea de respuesta estándar.
lnóculos: Suspender el organismo de prueba obtenido de un cultivo o cultivo inclinado (slant) recientes en 3 ml de solución
salina SR estéril. Se pueden usar perlas de vidrio para facilitar la suspensión. Enterococcus hirae (ATCC 10541) y 5taphylococcus
aureus (ATCC 9144) se cultivan en un medio líquido, no en agar. Esparcir la suspensión salina sobre la superficie de dos o más
placas de agar (cubriendo toda la superficie) o sobre la superficie de un frasco Roux que contenga 250 ml del medio especifi-
cado (ver la Tabla 8). Incubar durante el tiempo y a la temperatura especificados en la Tabla 8, o hasta que el crecimiento sea
evidente.
Después de incubar, recolectar el organismo de las placas o frasco Roux con aproximadamente 50 ml de solución salina SR
estéril, usando una varilla de vidrio doblada en ángulo estéril o perlas de vidrio estériles. Pipetear y transferir la suspensión a un
frasco de vidrio estéril. Ésta es la suspensión de recolección.
Determinar durante la verificación del método la cantidad de suspensión de recolección que se usará como el inóculo, co-
menzando con el volumen sugerido en la Tabla 8. Preparar también una 53 extra como una prueba de crecimiento. Incubar las
pruebas de ensayo durante los tiempos indicados en la Tabla 7 7. Ajustar la cantidad de inóculo a diario, si fuera necesario, para
obtener la relación de concentración-respuesta óptima a partir del organismo de prueba en los tubos de valoración. Una vez
completados los periodos de incubación especificados, los tubos que contienen la mediana de la concentración del estándar
deben presentar los valores de absorbancia especificados en la Tabla 9. Determinar la duración exacta de la incubación, obser-
vando el crecimiento en la concentración de referencia (mediana de la concentración) del estándar (5 3).
Tabla 8
Composición
Condiciones de Incubación Sugerida del lnóculo
Tempera-
Número Me- tura Tiem- Cantidad
Antibiótico Organismo de prueba ATCca diob (º) po Mediob (ml/100 ml)
Capreomicina Klebsiel/a pneumoniae 10031 1 36-37,5 16-24 h 3 0,05
Cloranfenicol Escherichia co/i 10536 1 32-35 24 h 3 0,7
Clortetraciclina Staphylococcus aureus 29737 1 32-35 24 h 3 0,1
Dihidroestreptomicina Klebsiella pneumoniae 10031 1 36-37,5 16-24 h 3 0,1
Gramicidina Enterococcus hirae 10541 3 36-37,5 16-18 h 3 1,0
Neomicina Klebsiel/a pneumoniae 10031 1 36-37,5 16-24 h 39 2
Oxitetraciclina Staphylococcus aureus 29737 1 32-35 24 h 3 0,1
Tetraciclina Staphylococcus aureus 29737 1 32-35 24 h 3 0,1
Tioestreptona Enterococcus hirae 10541 40 36-37,5 18-24 h 41 0,2
Troleandomicina Klebsiella pneumoniae 10031 1 36-37,5 16-24 h 3 0,1
Tilosina Staphylococcus aureus 9144 3 35-39 16-18 h 39 2-3
ª American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas VA 20110-2209 (http://www.atcc.org)
b Ver Medios y Soluciones, Medios.
Tabla 9
Absorbancia,
Antibiótico No menos de (u.a.)
Capreomicina 0,4
Clortetraciclina 0,35
Gramicidina 0,35
Tetraciclina 0,35
Todas los demás 0,3
Análisis: En el día de la valoración, preparar la concentración necesaria de antibiótico, diluyendo soluciones madre del están-
dar y de cada una de las muestras, según se especifica en Soluciones estándar y Soluciones muestra. Preparar cinco niveles de
prueba, cada uno por triplicado, del estándar (5 7-55 ) y un solo nivel de prueba (U 3 ), también por triplicado, de hasta 20 mues-
tras correspondientes a 53 (mediana de la concentración) del estándar.
Tabla 10
Volumen de
Dilución de Volumen de
Prueba lnóculo
Antibiótico (ml) (ml)
Gramicidina 0,10 9,0
Tioestreptona 0,10 10,0
Tilosina 0,10 9,0
Todos los demás 1,0 9,0
Colocar los tubos en gradillas para tubos de ensayo u otro portador. Incluir en cada gradilla 1-2 tubos de control que con-
tengan 1 ml del diluyente de prueba (ver la Tabla 7) pero sin antibiótico. Agregar los volúmenes de las diluciones de prueba
del estándar y de la muestra, según se indica en la Tabla 7O. Distribuir aleatoriamente un set completo, incluyendo los contro-
les, en una gradilla para tubos. Agregar el volumen de inóculo especificado en la Tabla 7O a cada tubo en la gradilla, uno por
vez, y colocar la gradilla completada inmediatamente en una incubadora o un baño de agua mantenidos a la temperatura
especificada en la Tabla 8 y durante el tiempo especificado en la Tabla 7 7.
Tabla 11
Tiempo de Incubación
Antibiótico (h)
Capreomicina 3-4
Cloranfenicol 3-4
Cicloserina 3-4
Dihidroestreptomicina 3-4
Estreptomicina 3-4
Troleandomicina 3-4
Tilosina 3-5
Todos los demás 4-5
Después de la incubación, inhibir inmediatamente el crecimiento del organismo, agregando 0,5 ml de formaldehído diluido
a cada tubo, excepto para tilosina. Para tilosina, calentar la gradilla en un baño de agua a 80º-90º durante 2-6 minutos o en
un baño de vapor durante 5-1 O minutos y llevar a temperatura ambiente. Leer la absorbancia o la transmitancia a 530 ó 580
nm, analizando una gradilla cada vez.
Medios y Soluciones
Los medios requeridos para la preparación de los inóculos de los organismos de prueba se preparan con los ingredientes
listados en esta sección. Se permiten pequeñas modificaciones de los ingredientes individuales; asimismo, se pueden usar me-
dios deshidratados reconstituidos, siempre que los medios resultantes tengan propiedades promotoras de crecimiento equiva-
lentes o superiores y que produzcan una curva de respuesta estándar similar.
Medios: Disolver los ingredientes en agua para obtener 1 L y ajustar las soluciones con hidróxido de sodio 1 N o ácido clorhí-
drico 1 N, según se requiera, de modo que, después de la esterilización con vapor, el pH sea el especificado.
Medio 1
Peptona 6,0 g
Digerido pancreático de caseína 4,0 g
Extracto de levadura 3,0 g
Extracto de carne 1,5 g
Dextrosa 1,0 g
Agar 15,0 g
Agua 1000 ml
pH después de la esterilización 6,6 ± 0,1
USP 37 Pruebas Biológicos/ (81) Antibióticos-Valoraciones Microbiológicas 101
Medlo2
Peptona 6,0 q
Agar 15,0 g
Agua 1000 ml
Medio 3
Peptona 5,0 g
Dextrosa 1,0 g
Fosfato monobásico de potasio 1,32 g
Agua 1000 ml
Medio4
Peptona 6,0 g
Dextrosa 1,0 g
Agar 15,0 g
Agua 1000 ml
Medlo5
Peptona 6,0 g
Agar 15,0 g
Agua 1000 ml
pH después de la esterilización 7,9 ±0,1
Medlo8
Peptona 6,0 g
Agar 15,0 g
Agua 1000 ml
Medlo9
Digerido papaínico de soja 3,0g
Fosfato dibásico de potasio 2,5 g
Dextrosa 2,5 g
Agar 20,0 g
Agua 1000 ml
Medio 10
Digerido pancreático de caseína - ---------
17,0 g
Digerido papaínico de soja 3,0 g
Fosfato dibásico de potasio 2,5 g
Dextrosa 2,5 g
Agar 12,0 g
Agua 1000 ml
Polisorbato 80 (agregado después de calentar a ebullición el medio para disolver el agar) 10 ml
Medio 11
Peptona 6,0 g
Dextrosa 1,0 g
Agar 15,0 g
Agua 1000 ml
Medio 13
Peptona 10,0 g
Dextrosa 20,0 g
Agua 1000 ml
Medio 19
Peptona 9,4 g
Dextrosa 10,0 g
Agar 23,5 g
Agua 1000 ml
pH después de la esterilización 6,1±0,1
Medio 32
Peptona 6,0 g
Sulfato de manganeso 0,3 g
Dextrosa 1,0 g
Agar 15,0 g
Agua 1000 ml
Medio 34
Glicerol 10,0 g
Peptona 10,0 g
Agua 1000 ml
USP 37 Pruebas Biológicos J (81) Antibióticos-Valoraciones Microbiológicas 103
Medio 35
Glicerol 10,0 g
-·--- ----------------
Peptona 10,0 g
Agar 17,0 g
Agua 1000 ml
Medio 36
Digerido papaínico de soja 5,0 g
Agar 15,0 g
Agua 1000 ml
Medio 39
Peptona 5,0 g
Dextrosa 1,0 g
Agua 1000 ml
Medio40
Poli peptona 5,0 g
Dextrosa 10,0 g
Polisorbato 80 0,1 g
Agar 10,0 g
Agua 1000 ml
Medio 41
Dextrosa 20,0 g
Citrato de sodio 10,0 g
Agua 1000 ml
Soluciones
Soluciones amortiguadoras: Preparar según se indica en la Tabla 72 o por otros medios adecuados. Las soluciones amor-
tiguadoras se esterilizan después de su preparación; el pH especificado en cada caso es el pH después de la esterilización.
Tabla 12. Soluciones amortiguadoras

Volumen de Hidróxido
Concentración de de
Concentración de Fosfato Fosfato Potasio
Dibásico de Potasio Monobásico de Potasio 10 N pH después de la
Solución amortiguadora (g/L) (g/L) (ml) Esterilizaciónª
Solución amortiguadora B.1 (1 %, 2 8 - 6,0 ± 0,05
pH 6,0)
Solución amortiguadora B.3(O,1 16,73 0,523 - 8,0 ± 0,1
M, pH 8,0)
Solución amortiguadora B.4 (O, 1 - 13,61 - 4,5 ± 0,05
M, pH 4,5)
Solución amortiguadora B.6 20 80 - 6,0 ± 0,05
(1 0%, pH 6,0)
Solución amortiguadora B.1 O 35 - 2 10,5 ± 0,1
(0,2 M, pH 10,5)
Solución amortiguadora B.16 13,6 4 - 7,0 ± 0,2
(O, 1 M, pH 7,0)
ª Ajustar el pH con ácido fosfórico 18 N o hidróxido de potasio 1O N.
Otras soluciones: Ver Reactivos, Indicadores y Soluciones.

Agua: Usar Agua Purificada.
Solución salina: Usar Solución salina SR.
Formaldehído diluido: Solución de formaldehído y agua (1 :3)
Cálculos
Introducción: La potencia del antibiótico se calcula mediante la interpolación de una recta estándar o patrón obtenida por
transformación logarítmica y ajustada por cuadrados mínimos (ver los detalles sobre los cálculos a continuación). El analista
debe considerar tres conceptos esenciales al interpretar los resultados de potencia del antibiótico:
1. Las relaciones biológicas de concentración-respuesta por lo general no son lineales. El método de potencia del antibiótico
permite ajustar los datos a una línea recta, evaluando un intervalo de concentración estrecho en el que los resultados se
acercan a la linealidad. Los resultados de la valoración se considerarán válidos únicamente si la potencia calculada es
80%-125% de la potencia asumida al preparar la solución madre de la muestra. Cuando la potencia calculada está fuera
del intervalo de 80%-125%, el resultado para la muestra puede quedar fuera del intervalo de concentración estrecho en
el que se ha establecido la linealidad, en cuyo caso, se debe ajustar la potencia asumida de la muestra según corresponda
y repetir la valoración para obtener un resultado válido.
2. El medio más efectivo para reducir la variabilidad del valor de informe (la media geométrica de la potencia de todos los
ensayos y duplicados) son los ensayos independientes del procedimiento de valoración. El resultado combinado de una
serie de valoraciones independientes más pequeñas realizadas a lo largo de varios días es una estimación de potencia más
confiable que la obtenida de una sola valoración grande con el mismo número total placas o tubos. Se requieren tres o
más valoraciones independientes para determinaciones de potencia de antibióticos.
3. El número de valoraciones requeridas para obtener una estimación confiable de potencia del antibiótico depende del in-
tervalo de especificación requerido y de la variabilidad de la valoración. El cálculo del límite de confianza descrito a conti-
nuación se determina a partir de varios logaritmos de las potencias que son aproximadamente iguales en precisión. Si el
valor calculado para la amplitud del intervalo de confianza, W, es demasiado amplio, no será posible tomar una decisión
útil con respecto a si la potencia cumple con su especificación.
El laboratorio debe determinar de antemano en sus procedimientos operativos estándar un valor máximo aceptable para la
amplitud del intervalo de confianza. El valor máximo se debe determinar durante el desarrollo y confirmarse durante la valida-
ción o la verificación. Si el intervalo de confianza calculado excede este límite, el analista debe llevar a cabo determinaciones
de potencia independientes adicionales para cumplir con el requisito del límite. Se debe tomar en cuenta que la decisión de
realizar determinaciones adicionales no depende de la potencia estimada, sino únicamente de la incertidumbre en dicha esti-
mación, según lo determina la amplitud del intervalo de confianza. La variabilidad de la valoración tiene un impacto mayor en
el límite de confianza calculado que el número de determinaciones de potencia independientes. Como resultado, el analista
debe considerar primeramente reducir la variabilidad en la medida de lo posible antes de realizar determinaciones de potencia.
Las siguientes secciones describen los cálculos para determinar la potencia de los antibióticos, así como la realización del
cálculo de límite de confianza. Asimismo, se presentan métodos para calcular el error estándar con el propósito de obtener
estimaciones de la varianza de la valoración. Cuando se usan logaritmos, resulta aceptable cualquier base logarítmica. El Apén-
dice 1 proporciona fórmulas para cálculos manuales cuando las concentraciones están equitativamente espaciadas en la escala
logarítmica. Se pueden usar métodos estadísticos alternativos siempre que se validen adecuadamente.
Valoración en cilindro-placa: Esta sección detalla el análisis de datos de muestra y la determinación de la potencia de una
muestra desconocida, usando la valoración en cilindro-placa.
Datos de muestra: La Tabla 73 presenta los datos de una valoración que se usarán a manera de ejemplo a lo largo de esta
sección. Para cada una de las 12 placas, las zonas 1, 3 y 5 corresponden a la concentración de referencia y las otras tres zonas
son para una de las otras cuatro concentraciones, según se indican. Las otras columnas son necesarias para los cálculos y se
explican más adelante.
Paso 1: Realizar los cálculos iniciales y la verificación de aptitud de variabilidad.
Para cada conjunto de tres placas, promediar los nueve valores de referencia y promediar los nueve valores estándar.
Ejemplo (ver la Tabla 73)
15,867 = X(l 6, 1; 15,6; ... ; 15,8)
14,167=X(14,6;14,1; ... ; 14,8)
Para cada conjunto de tres placas, determinar la desviación estándar de los nueve valores de referencia y de la desviación es-
tándar de los nueve valores estándar. Para cada desviación estándar, determinar la desviación estándar relativa correspondien-
te.
Ejemplo: (ver la Tabla 73)
0,200 = cr(l 6, 1, ... , 15,8)
1,30/o = (0,200/15,867) X 100
0,324 = cr(l 4,6, ... , 14, 1)
2,30/o = (0,324/14,167) X 100
Para el criterio de aptitud de variabilidad, cada laboratorio debe determinar un valor máximo aceptable para la desviación es-
tándar relativa. Si alguna de las ocho desviaciones estándar relativas (cuatro para la referencia y cuatro para el estándar) sobre-
pasan este máximo predeterminado, los datos de la valoración no serán adecuados y deben desecharse. [NOTA-El límite suge-
rido para la desviación estándar relativa es no más de 10%.]
Paso 2: Realizar una corrección de variación entre placas.
Esta corrección se aplica para convertir la medición de zona promedio obtenida para cada concentración al valor que se ob-
tendría si la medición de la concentración de referencia promedio para dicho conjunto de tres placas repetidas fuera la misma
que el valor del punto de corrección:
Xc = media corregida del estándar

X5 = media original del estándar
XR = media de la referencia
P = punto de corrección
Ejemplo: Para el primer conjunto de tres placas en la Tabla 13 (5 1), la corrección es:
14,022=14,167-(15,867-15,722) = 14,167-0,145
Paso 3: Determinar la línea de la curva estándar.
Generar la línea de la curva estándar, graficando las mediciones corregidas de la zona en función del logaritmo de los valores
de concentración estándar. Calcular la ecuación de la línea de la curva estándar, realizando una regresión lineal no ponderada
estándar sobre estos valores, usando software adecuado o los cálculos manuales del Apéndice 1. [NOTA-Usar el logaritmo na-
tural o el logaritmo en base 1 O para graficar la curva estándar y determinar la ecuación de regresión; ambos proporcionan el
mismo resultado de prueba final.] Cada laboratorio debe determinar un valor mínimo del coeficiente de determinación (%R2)
para una regresión aceptable. La regresión es aceptable sólo si la o/oR2 obtenida excede este valor predeterminado. [NOTA-El
límite sugerido para el coeficiente porcentual de determinación es no menos de 95%.]
. .
. -~u
X ' >o m
m - ~ m~
Tabla 13. Datos de Muestra (Valoración en Cilindro-Placa)

o
Están-
Repetí-
ción
Referencia (5,) Media Media °'
00
Zona de la Muestra
dar de Pla- Zona 1 Zona 3 Zona 5 Media 2 Zona 4 Zona 6 Media Corregida
(U/ml) Concentración ca (mm) (mm) (mm) (mm) SD O/oRSD (mm) (mm) (mm) (mm) so O/oRSD (mm) )>
::i
51 3,20 1 16, 1 15,6 15,8 15,867 0,200 1,3 14,6 14,1 13,5 14,167 0,324 2,3 14,022 é:t.
0-
2 16,0 15,9 16,2 14,5 14, 1 14,4 (5;
é:t.
3 15,7 15,7 15,8 14,0 14,2 14, 1 n
oV1
5z 4,00 1 15,8 15,6 15,5 15,567 0,158 1,0 14,7 15,1 14,8 14,833 0,265 1,8 14,989
~
1
2 15,7 15,5 15,6 14,7 14,9 15,2

!:»
3 15,7 15,4 15,3 14,8 15,0 14,3 o....,
!:»
54 6,25 1 15,6 15,8 16,0 15, 789 0,169 1, 1 16,6 16,8 16,3 16,578 0,233 1,4 16,511 n
(5'
2 15,8 15,6 15,7 16,6 16,5 16,2 ::i
(1)
3 16, 1 15,7 15,8 16,9 16,5 16,8 V\
7,8125 1 15,6 15,6 15,5 15,667 0,141 0,9 17,3 17,0 17,0 17, 167 0,224 1, 3 17,222
!:;::
55 ;:;·
....,
2 15,6 15,7 15,5 17,3 17,4 17,2 o
15,9 15,8
o-
3 15,8 17,3 17,3 16,7 0·
U3 desconocida 1 15,7 15,8 15,7

15,722ª
15,678 0,179 1, 1 15,3 15,8 15,7 15,4781 0,307 2,0 15,522 °'
lD
n
!:»
V\
2 15,9 15,7 15,7 15,8 15,8 15,5 -.--._
3 15,5 15,8 15,3
2"
15,2 15, 1 15, 1 i
ªÉste es el valor de la media de referencia general, referida más adelante como el "punto de corrección". '1l
(J-
Q
V1
O:l
a·
~
§'
V1
eVl
v
w
',J
-
Ejemplo: La Tabla 74 resume la porción de la Tabla 73 requerida para esta parte del cálculo.
Conjunto de
Estándares
Tabla 14 - - - - -
Mediciones de la
Zona Corregida
(mm)
--- --- -
-i--_ Concentración
(U/ml)
5 14,022 3,2
5? 14,989 4,0
Referencia ( 5 ,) 15,722 5
54 16,511 6,25
5, 17,222 7,8125
Resultados de la regresión lineal

Línea de la curva estándar:
Z = [3,551 X ln(C)] + 9,978
Z = medición de zona corregida

C = concentración
%R2 = 99,7
Determinación de potencia de la muestra: Para estimar la potencia de la muestra desconocida, promediar las medicio-
nes de la zona del estándar y las mediciones de la zona de la muestra en las tres placas usadas. Corregir por variación entre
placas, usando el punto de corrección determinado anteriormente para obtener un promedio corregido para la muestra desco-
nocida, V. [NOTA-Un método alternativo aceptable al uso del punto de corrección consiste en corregir usando el valor en la
línea de regresión estimada correspondiente al logaritmo de la concentración de Sy] Usar la medición de zona promedio co-
rregida en la ecuación de la línea de la curva estándar para determinar el logaritmo de la concentración de la muestra, Lu,
mediante:
Lu =(V- a)/b
a= intersección de la línea de regresión
b = pendiente de la línea de regresión
Para obtener la potencia de la muestra desconocida, tomar el antilogaritmo de Lu y multiplicar el resultado por cualquier
factor de dilución aplicable. Este valor también se puede expresar como porcentaje del valor de la concentración de referencia.
Ejemplo: Medición corregida de la zona de la muestra (Tabla 73) = 15,522
Logaritmo natural de la concentración de la muestra:
Lu = (15,522 - 9, 978)/3,551 = 1,561
Concentración de la muestra:
Cu= e1,s61 = 4,765
Porcentaje de concentración de referencia:
Resultado= (4,765/5,000) x 100 = 95,3%
Valoración turbidimétrica: Esta sección detalla el análisis de los datos de.muestra y la determinación de la potencia de una
muestra desconocida usando la valoración turbidimétrica. El método asume que los tubos se distribuyen en forma aleatoria
dentro del bloque de calentamiento u otro dispositivo de control de temperatura. Si el dispositivo tiene un perfil de tempera-
tura que no es uniforme, se prefiere un diseño en bloques aleatorizados. En dicho diseño, la gradilla se divide en áreas (blo-
ques) de temperatura relativamente uniforme y en cada área se coloca al menos un tubo de cada concentración del Estándar y
de cada muestra desconocida. El análisis de datos del diseño en bloques aleatorizados es diferente del siguiente.
Datos de muestra: La Tabla 75 presenta los datos de una valoración que se usarán como ejemplo a lo largo de esta sec-
ción. Se requieren otras columnas para los cálculos, las cuales se explican a continuación.
Tabla 15. Datos de Muestra (Valoración Turbidimétrica)
Concentración Absorbancia Promedio Desviación
Estándar (µg/ml) Repetición (u.a.) (u.a.) Estándar
1 0,8545
2 0,8422
5, 64 3 0,8495 0,8487 0,0062
1 0,8142
2 0,8273
5, 80 3 0,8392 0,8269 0,0125
Tabla 15. Datos de Muestra (Valoración Turbldlmétrlca) (Continuación)

Concentración Absorbancia Promedio Desviación
Estándar (µg/ml) Repetición (u.a.) (u.a.) Estándar
1 0,6284
2 0,6947
5, 100 3 0,7563 0,6931 0,0640
1 0,6933
2 0,6850
s, 125 3 0,6699 0,6827 0,0119
1 0,5299
2 0,5779
s 156 3 0,5316 0,5465 0,0272
1 0,7130
2 0,7960
u, desconocida 3 0,7201 0,7430 0,0460
Paso 1: Realizar los cálculos iniciales y la verificación de aptitud de variabilidad.

Para cada concentración (incluyendo la muestra), promediar los tres valores de absorbancia.
Ejemplo: Ver 5 1 en la Tabla 75.
0,8487 = X(0,8545; 0,8422; 0,8495)
Para cada concentración, determinar la desviación estándar de las tres lecturas y una desviación estándar combinada para to-
das las concentraciones.
Ejemplo: Ver 51 en la Tabla 75.
0,0125 = 50(0,8545; 0,8422; 0,8495)
El valor combinado se calcula tomando la raíz cuadrada del promedio de las cinco varianzas:
0,0325 = {[(0,0062)2 + (0,0125) 2 + (0,0640) 2 + (0,0119) 2 + (0,0272)2)/5}1/2
Para el criterio de aptitud de variabilidad, cada laboratorio debe determinar una desviación estándar combinada máxima acep-
table. Si la desviación estándar combinada excede este máximo predeterminado, los datos de valoración no son adecuados y
se deben descartar. [NOTA-El límite sugerido para la desviación estándar combinada es no más de 10% del valor de absor-
bancia promedio a través de las cinco concentraciones.] Si el número de determinaciones repetidas por concentración es al
menos cinco, entonces se puede calcular una desviación estándar relativa para cada concentración después de verificar valores
atípicos y comparar con una desviación estándar relativa máxima aceptable. [NOTA-El límite sugerido para la desviación es-
tándar relativa es no más de 10%.]
Paso 2: Determinar la línea de la curva estándar.
Generar la línea de la curva estándar, graficando los valores de absorbancia promedio en función del logaritmo de los valo-
res de concentración del estándar. Calcular la ecuación de la línea de la curva estándar, realizando una regresión lineal no pon-
derada sobre estos valores usando software apropiado o los cálculos manuales del Apéndice 7. [NOTA-Usar el logaritmo natu-
ral o el logaritmo en base 1 O para graficar la curva estándar y determinar la ecuación de regresión; ambos proporcionan el
mismo resultado de prueba final.] Cada laboratorio debe determinar un valor mínimo del coeficiente porcentual de determina-
ción (%R 2) para una regresión aceptable. La regresión es aceptable únicamente si el valor %R2 obtenido excede este valor pre-
determinado. [NOTA-El límite sugerido para el coeficiente porcentual de determinación es no menos de 90%.]
Ejemplo: La Tabla 76 resume la porción de la Tabla 75 requerida para esta parte del cálculo.
Tabla 16
Valores Promedio de
Conjunto de Absorbancia Concentración
Estándares (u.a.) (µg/ml)
s, 0,8487 64
s, 0,8269 80
5, 0,6931 100
54 0,6827 125
5, 0,5465 156
Resultados de la regresión lineal

Línea de la curva estándar:
Absorbancia = 2,2665 - [0,7735 x log 10 (concentración)]
%R2 = 93,0%
Determinación de potencia de la muestra: Para estimar la potencia de la muestra desconocida, promediar las tres medi-
ciones de absorbancia para obtener un promedio para la muestra desconocida, V. Usar esta medición promedio en la ecuación
de la línea de la curva estándar para determinar el logaritmo de la concentración de la muestra desconocida, Lu, mediante:
Lu =(V- a)/b
a= intersección de la línea de regresión

b = pendiente de la línea de regresión
Para obtener la potencia de la muestra desconocida, tomar el antilogaritmo de Lu y multiplicar el resultado por cualquier
factor de dilución aplicable. Este valor también se puede expresar como porcentaje del valor de la concentración de referencia.
Ejemplo: Absorbancia promedio de la muestra (Tabla 75) = 0,7430.
log 10 (Cu) = (0,7430 - 2,2665)/(- 0,7735) = 1,9696
Cu= 101,9696 = 93,2
Porcentaje de concentración de referencia = (93,2/100,0) x 100 = 93,2%
Cu= concentración de la muestra

Límites de confianza y combinación de los cálculos de las valoraciones: Debido a la variabilidad entre valoraciones, se
requieren tres o más determinaciones independientes para una estimación confiable de la potencia de la muestra. Para cada
determinación independiente, comenzar con soluciones madre y diluciones de prueba tanto del Estándar como de la muestra,
preparadas por separado, y repetir la valoración de una muestra determinada otro día.
Usando un conjunto de al menos tres determinaciones de la potencia desconocida, usar el método del Apéndice 2 para verifi-
car valores atípicos. Esta determinación debe realizarse en la escala logarítmica.
Para obtener una estimación combinada de la potencia desconocida, calcular el promedio, M, y la desviación estándar de los
logaritmos de las potencias aceptadas. [NOTA-Usar el logaritmo natural o el logaritmo en base 1O.] Determinar el intervalo de
confianza para la potencia, según se indica a continuación:
antilog[M - t(0,05, N - 1) x SO/-../N], antilog[M + t(0,05, N - 1) x SO /-../N]
M= promedio
SO= desviación estándar
N = número de valoraciones
t(0,05, N-1) = el punto del 5% de dos colas de una distribución t de Student con N-1 grados de libertad
NOTA-El valor t está disponible en hojas de cálculos, textos estadísticos y software estadístico.
W = antilog{[t(0,05, N - 1) x SO/-../N]}
W = mitad de la amplitud del intervalo de confianza
Comparar la mitad de la amplitud del intervalo de confianza con un valor máximo predeterminado aceptable. Si la mitad de
la amplitud es mayor que el límite de aceptación, continuar con valoraciones adicionales.
Ejemplo: Suponer que la muestra se valora cuatro veces, con resultados de potencia en la escala logarítmica natural de
1,561; 1,444; 1,517 y 1,535. Entonces:
N=4
M = X(l ,561; 1,444; 1,517; 1,535) = 1,514
SO= cr(l,561; 1,444; 1,517; 1,535) = 0,050
t = 3, 182
El intervalo de confianza en la escala logarítmica es
1,514 ± (3, 182 X 0,050/-../4) = (1,434, 1,594)
Tomando antilogaritmos, la potencia estimada es
ei,514 = 4,546
con un intervalo de confianza de 95% para la potencia de e1·434, e1·594 =(4,197; 4,924)
La mitad de la amplitud del intervalo de confianza para comparar con un valor de aceptación es el cociente 4,924/4,546 =
1,083.
11 O (81 >Antibióticos-Valoraciones Microbiológicas/ Pruebas Biológicas USP 37
Apéndice 1. Fórmulas para Cálculos Manuales de Regresión y Concentración de la Muestra

Cuando las concentraciones están igualmente espaciadas en la escala logarítmica, los cálculos se pueden realizar usando la
siguiente fórmula. Donde:
:Sk = media de la medición de zona corregida (valoración en cilindro-placa) o valor de absorbancia promedio (valoración
turbidimétrica) para el conjunto estándar k
k = 1, 2, 3, 4, 5
:S = media de los cinco valores :Sk
Lk = logaritmo de la concentración k correspondiente. [NOTA-Usar el logaritmo natural o el logaritmo en base 1O.] La
pendiente de la línea de regresión se calcula mediante:
b= (Ya/to - Y baja)/ (X alta - Xba¡o)
Yalta = 1/s(3:S5 + 2)4 + )3 - :S¡)
Ybajo = '/s(3:S¡ + 2)2 + )3 - :Ss)

Xaua = Ls
Xbafa = L1
Combinar y simplificar a:
El logaritmo de la concentración de la muestra se halla usando:
Lu = Lreferencio + [ (D - :S)/ b]
Por ejemplo, usando los datos para la valoración en cilindro-placa en la Tabla 73 y logaritmos naturales:
b = [(4X17,222) + (2X16,511)- (2X14,989)- (4X14,020)]/{5[1n(7,81)] - ln(3,2)} = 3,551
:s = (14,020 + 14,989 + 15,722 + 16,511 + 17,222)/5 = 15,693
Logaritmo natural de la concentración de la muestra = ln(5) + [(15,522 - 15,693)/3,551] = 1,561

Concentración de la muestra= e1.s61 = 4,765
Apéndice 2: Procedimiento para Verificar Valores Atípicos; Rechazo de Mediciones

Atípicas o Aberrantes
Toda medición que sea claramente cuestionable debido a una falla en el procedimiento de valoración deberá ser rechazada,
sin importar si se descubre durante el procedimiento de medición o tabulación. El rechazo o la retención arbitrarios de una
medición aparentemente aberrante puede representar una fuente seria de sesgo. Por lo general, el rechazo de mediciones que
se basa únicamente en su magnitud relativa es un procedimiento que debe usarse con poca frecuencia.
Toda medición de potencia sospechada, o atípica, se puede analizar en función del criterio siguiente, el cual se basa en la
variación dentro de un solo grupo de mediciones supuestamente equivalentes a partir de una distribución normal. En prome-
dio, el criterio rechazará una observación válida una vez cada 25 ensayos o una vez cada 50 ensayos. Designar las mediciones
en orden de magnitud de y 1 a yN, donde y¡ es el posible valor atípico, y N es el número de mediciones en el grupo. Calcular la
brecha (gap) relativa usando la Tabla A2- 7, Prueba para Detectar Mediciones Atípicas y las fórmulas siguientes:
Cuando N = 3 a 7:
Cuando N = 8 a 1O:
Cuando N = 11 a 13:
Si G7, G2 , o G3, según corresponda, excede el valor crítico en la Tabla A2- 7, Prueba para Detectar Mediciones Atípicas, para la
N observada, existe una base estadística para omitir la(s) medición(es) atípica(s).
USP 37 Pruebas Biológicas/ (85) Prueba de Endotoxinas Bacterianas 111
Tabla A2-1. Prueba para Detectar Mediciones Atípicas

En las muestras de una población normal, las brechas iguales o mayores que los valores siguientes de G1, G2 y G3 ocurren con una probabilidad de P
= 0,01, cuando las mediciones atípicas pueden ocurrir únicamente en un extremo; o con P = 0,02, cuando éstas pueden ocurrir en cualquiera de los
extremos.
N 1 3 1 4 1 5 1 6 1 7
G1 1 0,987 1 0,889 1 0,781 1 0,698 1 0,637
N 1 8 1 9 1 10 1 1
G, 1 0,681 1 0,634 1 0,597 1 1
N 1 11 1 12 1 13 1 1
G, 1 0,674 1 0,643 1 0,617 1 1
Ejemplo: Potencias estimadas de la muestra en escala logarítmica = 1,561; 1,444; 1,51 7; 1,5 35
Verificar la potencia más baja para la medición atípica:
G1 = (1,517 -1,444)/(1,561 - 1,444) = 0,624<0,889
Por lo tanto, 1,444 no es una medición atípica.

Verificar la potencia más alta para la medición atípica:
G1 = (1,561 - 1,535)/(1,561 - 1,444) = 0,222 < 0,889
Por lo tanto, 1,561 no es una medición atípica.

Las potencias atípicas deben marcarse como valores atípicos y deben excluirse de los cálculos de la valoración. No se puede
excluir más de una potencia como medición atípica.
(85) PRUEBA DE ENDOTOXINAS BACTERIANAS
•Partes de este capítulo general han sido armonizadas con los textos correspondientes de la Farmacopea Europea y/o de la
Farmacopea japonesa. Aquellas partes que no han sido armonizadas están marcadas con los símbolos (•.) para especificar dicha
situación .•
La Prueba de Endotoxinas Bacterianas (PEB) es una prueba para detectar o cuantificar endotoxinas de bacterias gramnegati-
vas usando un lisado de amebocitos del cangrejo herradura (Limulus polyphemus o Tachypleus tridentatus).
Hay tres técnicas para esta prueba: la técnica de coagulación (gel-clot), la cual está basada en la formación de gel; la técnica
turbidimétrica, basada en la producción de turbidez después de la ruptura de uniones de un sustrato endógeno; y la técnica
cromogénica que se basa en el desarrollo de color después de la ruptura de un complejo sintético péptido-cromógeno. Efec-
tuar la prueba con cualquiera de las tres técnicas. En caso de duda o controversia, la decisión final se toma basándose en la
prueba de límite de coagulación, a menos que se indique algo diferente en la monografía del producto en análisis. La prueba
se efectúa de forma tal que se evite la contaminación por endotoxinas.
APARATOS
Eliminar los pirógenos de todo el material de vidrio y otros materiales termoestables en un horno de aire caliente, mediante
un proceso validado.• 1 • Habitualmente se usan 30 minutos a 250º como tiempo y temperatura mínimos. Si se emplean mate-
riales de plástico, tales como microplacas y puntas de pipetas para pipeteadores automáticos, usar los que han demostrado
estar exentos de endotoxinas detectables y no interferir con la prueba. [NOTA-En este capítulo, el término "tubo" incluye cual-
quier otro receptáculo, como por ejemplo los pocillos de las placas de microtitulación.]
REACTIVOS Y SOLUCIONES DE PRUEBA
Usado de Amebocitos-Un producto liofilizado obtenido a partir de un lisado de amebocitos (leucocitos) del cangrejo he-
rradura (Limulus polyphemus o Tachypleus tridentatus). Este reactivo se refiere sólo a un producto fabricado de conformidad con
las reglamentaciones de la autoridad competente. [NOTA-El Lisado de Amebocitos reacciona con algunos j:i-glucanos además
de reaccionar con las endotoxinas. Existen preparaciones de Lisado de Amebocitos que no reaccionan con los glucanos: se pre-
• 1Para una prueba de validez del procedimiento para inactivar endotoxinas, ver Esterilización por Calor Seco en Esterilización y Garantía de Esterilidad de Artículos
Farmacopeicos (1211 ). Usar un Usado SR con una sensibilidad no menor de O, 15 Unidades de Endotoxina por ml .•
112 (85) Prueba de Endotoxinas Bacterianas / Pruebas Biológicas USP 37
paran retirando del Lisado de Amebocitos el factor G que reacciona con los glucanos o inhibiendo el sistema de reacción del
factor G del Lisado de Amebocitos. Se pueden usar para pruebas de endotoxinas en presencia de glucanos.]
Agua para Prueba de Endotoxinas Bacterianas (PEB)-Usar Agua para Inyección o agua producida por otros procedi-
mientos y que no reaccione con el lisado empleado, en el límite de detección del reactivo.
Usado SR-Disolver con agitación suave el Lisado de Amebocitos en Agua para PEB o en un amortiguador recomendado por
el fabricante del lisado. Almacenar el lisado reconstituido, refrigerado o congelado, de acuerdo con las especificaciones del fa-
bricante.
PREPARACIÓN DE LAS SOLUCIONES

Solución Madre del Estándar de Endotoxina-Preparar una Solución Madre del Estándar de Endotoxina a partir de un Es-
tándar de Referencia de Endotoxina USP que haya sido calibrado con el Estándar Internacional para Endotoxinas vigente de la
OMS. Seguir las especificaciones en el prospecto del empaque y en la etiqueta para la preparación y almacenamiento de la
Solución Madre del Estándar de Endotoxina. El contenido de endotoxina se expresa en Unidades de Endotoxina (UE). [NOTA-
Una Unidad USP de Endotoxina (UE) es igual a una Unidad Internacional (UI) de endotoxina.]
Soluciones Estándar de Endotoxina-Después de mezclar vigorosamente la Solución Madre del Estándar de Endotoxina,
preparar las diluciones seriales apropiadas de la Solución Estándar de Endotoxina, usando Agua para PEB. Usar las diluciones tan
pronto como sea posible para evitar la pérdida de actividad por adsorción.
Soluciones Muestra-Preparar las Soluciones Muestra disolviendo o diluyendo los medicamentos, usando Agua para PEB.
Algunas sustancias o preparaciones se pueden disolver o diluir adecuadamente en otras soluciones acuosas. Si fuera necesario,
ajustar el pH de la solución (o de la dilución) a examinar de modo que el pH de la mezcla del lisado y la Solución Muestra se
encuentre dentro del intervalo de pH especificado por el fabricante del lisado, por lo general entre 6,0-8,0. El pH se puede
ajustar con un ácido, una base o una solución amortiguadora adecuada según lo recomiende el fabricante del lisado. Los áci-
dos y las bases se pueden preparar a partir de concentrados o sólidos con Agua para PEB en recipientes exentos de endotoxinas
detectables. Las soluciones amortiguadoras se deben validar para garantizar que están exentas de endotoxinas y otros factores
de interferencia detectables.
DETERMINACIÓN DE LA MÁXIMA DILUCIÓN VÁLIDA (MDV)

La máxima dilución válida es la dilución máxima permisible de una muestra a la que se le puede determinar el límite de
endotoxina. Determinar la MDV a partir de la siguiente ecuación:
MDV =(límite de endotoxina x concentración de la Solución Muestra)/(/...)
Límite de Endotoxina-EI límite de endotoxina para medicamentos de administración parenteral, definido según la dosis,
es igual a K/M• 2 . , donde K es la dosis pirogénica umbral de endotoxina por kg de peso corporal y Mes igual a la dosis máxima
recomendada del producto, en bolo, por kg de peso corporal. Cuando el producto se va a inyectar a intervalos frecuentes o
por infusión continua, Mes la dosis máxima total administrada durante un periodo de una hora. El límite de endotoxinas para
los medicamentos de administración parenteral se especifica en la monografía individual en unidades como UE/mL, UE/mg,
UE/Unidad de actividad biológica, etc.
Concentración de la Solución Muestra-
mg/mL: en el caso del límite de endotoxina especificado por peso (UE/mg);
Unidades/mL: en el caso del límite de endotoxina especificado por unidad d~ actividad biológica (UE/Unidad);
mL/mL: cuando el límite de endotoxina se especifica por volumen (UE/mL).
'A: la sensibilidad declarada en la Técnica de Coagulación (UE/mL) o la concentración más baja usada en la curva estándar
para la Técnica Turbidimétrica o la Técnica Cromogénica.
TÉCNICA DE COAGULACIÓN
La técnica de coagulación se usa para detectar o cuantificar endotoxinas basándose en la coagulación del lisado empleado
como reactivo en presencia de endotoxina. La concentración mínima de endotoxina requerida para hacer que el lisado se coa-
gule en las condiciones estándar es la sensibilidad declarada del lisado empleado como reactivo. Para garantizar tanto la preci-
sión como la validez de la prueba, efectuar las pruebas para confirmar la sensibilidad declarada del lisado y para determinar
factores de interferencia según se describe en Pruebas Preparatorias.
• 2 K es 5 UE-USP/kg de peso corporal para cualquier vía de administración distinta de la intratecal (para la cual K es 0,2 UE-USP/kg de peso corporal). En el caso de
productos radiofarmacéuticos que no se administren por vía intratecal, el límite de endotoxina se calcula como 175 UE/V, donde Ves la dosis máxima recomenda-
da en ml. En el caso de radiofármacos administrados por vía intratecal, el límite de endotoxina se obtiene mediante la fórmula 14 UE/V. Para formulaciones (por lo
general productos oncológicos) que se administran por metro cuadrado de superficie corporal, la fórmula es K/M, donde K = 100 UE/m 2 y Mes la dosis
máxima/m2 .•
USP 37 Pruebas Biológicas/ (85) Prueba de Endotoxinas Bacterianas 11 3
Pruebas Preparatorias
Prueba de Confirmación de la Sensibilidad Declarada del Usado-Confirmar en cuatro determinaciones repetidas la sen-
sibilidad declarada, A., expresada en UE/mL del lisado antes de usarlo en la prueba. La prueba de confirmación de sensibilidad
del lisado se debe llevar a cabo cuando se usa una partida nueva de lisado o cuando hay algún cambio en las condiciones de la
prueba que pueda afectar el resultado. Preparar soluciones estándar con al menos cuatro concentraciones equivalentes a 2A., A.,
0,5A. y 0,25A., diluyendo el ER Endotoxina USP con Agua para PEB.
Mezclar un volumen del Lisado SR con un volumen igual (como por ejemplo alícuotas de O, 1 mL) de una de las Soluciones
Estándar de Endotoxina en cada tubo de ensayo. Cuando se usen viales o ampollas de prueba individuales que contengan lisa-
do liofilizado, agregar directamente las soluciones al vial o a la ampolla. Incubar la mezcla de reacción durante un período
constante según las instrucciones del fabricante del lisado (habitualmente a 37 ± 1ºdurante 60 ± 2 minutos), evitando vibracio-
nes. Para analizar la integridad del gel, sacar uno a uno los tubos directamente de la incubadora y con un único movimiento
suave, invertirlos aproximadamente a 180º. Si se ha formado un gel firme que permanece en su lugar después de invertir los
tubos, registrar el resultado como positivo. Un resultado es negativo si no se forma un gel intacto. La prueba se considera váli-
da cuando la concentración más baja de las soluciones estándar presenta un resultado negativo en todas las pruebas repetidas.
El punto final es la concentración más baja en la serie de concentraciones decrecientes de endotoxina estándar que coagula
el lisado. Determinar la media geométrica del punto final calculando la media de los logaritmos de las concentraciones en el
punto final de la serie de cuatro determinaciones repetidas y calculando luego el antilogaritmo de la media, según se indica en
la siguiente fórmula:
media geométrica de la concentración en el punto final = antilogaritmo (L,e/f)
donde 'I,e es la suma de los logaritmos de las concentraciones en el punto final de la serie de diluciones utilizadas, y fes el
número de tubos de ensayo repetidos. La media geométrica de la concentración en el punto final es la sensibilidad medida del
lisado (en UE/mL). Si no es menor de 0,5A- y no es mayor de 2A, se confirma la sensibilidad declarada y se usa en las pruebas
realizadas con este lisado.
Prueba de Factores de Interferencia-Por lo general, preparar soluciones (A-D) como se muestra en la Tabla 7, y efectuar
la prueba de inhibición o potenciación en las Soluciones Muestra con una dilución menor que la máxima dilución válida (MDV),
que no contenga endotoxinas detectables, procediendo según se describe en Prueba de Confirmación de Ja Sensibilidad Declara-
da del Lisado. La media geométrica de las concentraciones en el punto final de las Soluciones By C se determina usando la
fórmula descrita en la Prueba de Confirmación de Ja Sensibilidad Declarada del Lisado. La prueba de factores de interferencia de-
berá repetirse siempre que se presenten cambios en alguna de las condiciones que pudieran influir en el resultado de la prue-
ba.
Tabla 1. Preparación de Soluciones para la Prueba de Inhibición/Potenciación para Técnicas de Coagulación
Concentración de Endotoxina/
Solución a la que se Agrega Factor de Concentración Número de
Solución Endotoxina Diluyente Dilución de Endotoxina Repeticiones
Aª Ninguna/Solución Muestra - - - 4
Bb 2A/ Solución Muestra Solución Muestra 1 2A 4
2 n 4
4 0,5/,. 4
8 0,25/,. 4
ce 2A/Agua para PEB Agua para PEB 1 2A 2
2 n 2
4 0,5/,. 2
8 0,25/,. 2
Dd Ninguna/Agua para PEB - - - 2
ª Solución A: Una Solución Muestra de la preparación en análisis que esté exenta de endotoxinas detectables.
b Solución B: Prueba de interferencia.
e Solución C: Control para sensibilidad declarada del lisado.
d Solución D: Control negativo de Agua para PEB
Esta prueba se considera válida cuando todas las determinaciones repetidas de las Soluciones A y D no muestran ninguna
reacción y el resultado de la Solución C confirma la sensibilidad declarada.
Si la sensibilidad del lisado determinada en presencia de la Solución B no es menor de 0,5A- y no es mayor de 2A, la Solución
Muestra no contiene factores que interfieran en las condiciones experimentales usadas. En caso contrario, la Solución Muestra a
examinar interfiere con la prueba.
Si la muestra en análisis no cumple con la prueba a una dilución menor que la MDV, se debe repetir la prueba empleando
una dilución mayor que no exceda la MDV. El uso de un lisado de mayor sensibilidad permite una dilución mayor de la mues-
tra a examinar y esto puede contribuir a la eliminación de la interferencia.
La interferencia se puede resolver mediante un tratamiento adecuado, como filtración, neutralización, diálisis o calentamien-
to. Para establecer que el tratamiento elegido elimina eficazmente la interferencia sin pérdida de endotoxinas, realizar la valo-
ración descrita anteriormente, utilizando la preparación a examinar, a la que se ha agregado Estándar de Endotoxina y se ha
sometido al tratamiento seleccionado.
Prueba de Límite
Procedimiento-Preparar las Soluciones A, B, C y D según se indica en la Tabla 2 y llevar a cabo la prueba en estas solucio-
nes siguiendo el procedimiento indicado anteriormente en la Prueba de Confirmación de la Sensibilidad Declarada del Lisado en
Pruebas Preparatorias.
Tabla 2. Preparación de Soluciones para la Prueba de Límite de Coagulación
Concentración de Endotoxina/
Solución a la que se Agrega
Solución* Endotoxina Número de Repeticiones
A Ninguna/ Solución Muestra Diluida 2
B 2ic/ Solución Muestra Diluida 2
e 2A/ Agua para PEB 2
D Ninguna/Agua para PEB 2
* Preparar la Solución A y la Solución B de control positivo del producto utilizando una dilución no mayor que la MDV y tratamientos según se indica en la Prueba
de Factores de Interferencia en Pruebas Preparatorias. Las Soluciones By C de control positivo contienen la Solución Estándar de Endotoxina a una concentración que
corresponde al doble de la sensibilidad declarada del lisado. La Solución D de control negativo consiste en Agua para PEB.
Interpretación-La prueba se considera válida cuando ambas determinaciones repetidas de las Soluciones By C son positi-
vas y las de la Solución D son negativas. Cuando se obtiene un resultado negativo para ambas determinaciones repetidas de la
Solución A, la preparación en análisis cumple con la prueba. Cuando se obtiene un resultado positivo para ambas determinacio-
nes repetidas de la Solución A, la preparación en análisis no cumple con la prueba.
Cuando se obtiene un resultado positivo para una de las determinaciones de la Solución A y un resultado negativo para la
otra, repetir la prueba. En la repetición, la preparación en análisis cumple con la prueba si se obtiene un resultado negativo en
ambas determinaciones repetidas de la Solución A. La preparación no cumple con la prueba si se obtiene un resultado positivo
para una o ambas determinaciones repetidas de la Solución A. Sin embargo, si la preparación no cumple con la prueba a una
dilución menor que la MDV, se puede repetir la prueba empleando una dilución mayor que no exceda la MDV.
Prueba Cuantitativa
Procedimiento-La prueba cuantifica endotoxinas bacterianas en las Soluciones Muestra por valoración volumétrica hasta
un punto final. Preparar Soluciones A, B, C y D según se indica en la Tabla 3 y analizar siguiendo el procedimiento en la Prueba
de Confirmación de la Sensibilidad Declarada del Lisado en Pruebas Preparatorias.
Tabla 3. Preparación de Soluciones para la Prueba de Coagulación
Factor
Concentración de Endotoxina/ de
Solución a la cual se Agrega Dllu- Concentración Número de
Solución Endotoxina Diluyente ción de Endotoxina Repeticiones
Aª Ninguna/ Solución Muestra Agua para PEB 1 - 2
2 - 2
4 - 2
8 - 2
Bb 2A./ Solución Muestra - 1 2A 2
(' 21./ Agua para PEB Agua para PEB 1 2A 2
2 n 2
4 0,51. 2
8 0,25A. 2
Dd Ninguna/Agua para PEB - - - 2
ªSolución A: Solución Muestra en análisis a la dilución, que no debe exceder la MDV, con la cual se completó la Prueba de Factores de Interferencia. Las diluciones
subsiguientes de la Solución Muestra no deben exceder la MDV. Usar Agua para PEB para efectuar una serie de diluciones en cuatro tubos que contengan la
Solución Muestra en análisis a concentraciones de 1, 1/2, 1/,, y 1/, con respecto a la concentración usada en la Prueba de Factores de Interferencia. Se pueden usar
otras diluciones hasta la MDV, según sea necesario.
b Solución 8: Solución A que contenga endotoxina estándar a una concentración de 2). (control positivo del producto).
' Solución C: Dos series repetidas de cuatro tubos de Agua para PEB que contengan la endotoxina estándar a una concentración de 2i., l., 0,5)., y 0,25)., respecti-
vamente.
d Solución D: Agua para PEB (control negativo).
USP 37 Pruebas Biológicas/ (85) Prueba de Endotoxinas Bacterianas 115
Cálculo e Interpretación-La prueba se considera válida cuando se cumplen las tres condiciones siguientes: (1) ambas de-
terminaciones repetidas de la Solución D de control negativo son negativas; (2) ambas determinaciones repetidas de la Solución
B de control positivo del producto son positivas; y (3) la media geométrica de la concentración en el punto final de la Solución
e está comprendida en el intervalo de 0,5}. a n.
Para determinar la concentración de endotoxinas de la Solución A, calcular la concentración en el punto final para cada repe-
tición multiplicando cada factor de dilución del punto final por A. La concentración de endotoxinas en la Solución Muestra es la
concentración en el punto final de las repeticiones. Si la prueba se realiza con una Solución Muestra diluida, calcular la concen-
tración de endotoxinas en la Solución Muestra original multiplicando por el factor de dilución. Si ninguna de las diluciones de la
Solución Muestra es positiva en un ensayo válido, informar la concentración de endotoxina como menor que A (si se analizó la
muestra diluida, informar como menor que A multiplicado por el factor de dilución más bajo de la muestra). Si todas las dilu-
ciones son positivas, la concentración de endotoxina se informa como igual o mayor que el factor de dilución mayor por A
(p.ej., el factor de dilución inicial multiplicado por 8 y por A en la Tabla 3).
La preparación cumple con los requisitos de la prueba si la concentración de endotoxinas en ambas determinaciones repeti-
das es menor que la especificada en la monografía individual.
TÉCNICAS FOTOMÉTRICAS CUANTITATIVAS
Técnica Turbidimétrica
Esta técnica es una valoración fotométrica que mide los incrementos en turbidez del reactante. Dependiendo del principio
empleado en la valoración, esta técnica se puede clasificar como valoración turbidimétrica de punto final o valoración turbidi-
métrica cinética. La valoración turbidimétrica de punto final se basa en la relación cuantitativa entre la concentración de endo-
toxinas y la turbidez (absorbancia o transmisión) de la mezcla de reacción al término de un período de incubación. La valora-
ción turbidimétrica cinética es un método para medir el tiempo necesario para alcanzar una absorbancia o transmisión prede-
terminada de la mezcla de reacción (tiempo de iniciación) o la velocidad de desarrollo de turbidez. La prueba se efectúa a la
temperatura de incubación recomendada por el fabricante del lisado (por lo general 37 ± 1º).
Técnica Cromogénica
Esta técnica es una valoración para medir el cromóforo liberado de un péptido cromogénico adecuado por la reacción de las
endotoxinas con el lisado. Dependiendo del principio empleado en la valoración, esta técnica se puede clasificar como valora-
ción cromogénica de punto final o valoración cromogénica cinética. La valoración cromogénica de punto final se basa en la
relación cuantitativa entre la concentración de endotoxinas y la liberación del cromóforo al término de un período de incuba-
ción. La valoración cromogénica cinética es un método para medir el tiempo (tiempo de iniciación) necesario para alcanzar
una absorbancia predeterminada de la mezcla de reacción o la velocidad de desarrollo de color. La prueba se efectúa a la tem-
peratura de incubación recomendada por el fabricante del lisado (por lo general 37 ± 1º).
Pruebas Preparatorias
Con el fin de garantizar la precisión o validez de las técnicas turbidimétricas y cromogénicas, se realizan las pruebas prepara-
torias para verificar que los criterios para la curva estándar son válidos y que la solución muestra no interfiere con la prueba.
Cuando cambian las condiciones que pueden influir en el resultado de la prueba es necesaria la validación del método de
prueba.
Garantía de los Criterios para la Curva Estándar-La prueba se debe efectuar para cada lote de lisado empleado como
reactivo. Utilizando la Solución Estándar de Endotoxina, preparar por lo menos tres concentraciones de endotoxina dentro del
intervalo indicado por el fabricante del lisado para generar la curva estándar. Realizar la valoración usando por lo menos tres
determinaciones repetidas de cada concentración de endotoxina estándar, siguiendo las instrucciones del fabricante del lisado
(con respecto a relaciones de volumen, tiempo de incubación, temperatura, pH, etc.). Si el intervalo deseado en los métodos
cinéticos es mayor de dos logaritmos, se deben incluir estándares adicionales para que cada aumento logarítmico esté com-
prendido en el intervalo de la curva estándar. El valor absoluto del coeficiente de correlación, r, debe ser mayor o igual a
0,980 para el intervalo establecido de concentraciones de endotoxina.
Prueba para Factores de Interferencia-Seleccionar una concentración de endotoxina en o cerca del centro de la curva
estándar de endotoxina. Preparar las Soluciones A, B, C y O según se indica en la Tabla 4. Llevar a cabo la prueba en las Solucio-
nes A, B, C y O al menos por duplicado, de acuerdo con las instrucciones del lisado empleado, por ejemplo, en lo que respecta
al volumen entre la Solución Muestra y el Lisado SR, la relación de volumen de la Solución Muestra y el Lisado SR, el tiempo de
incubación, etc.
1
Tabla 4. Preparación de Soluciones para la Prueba de Inhibición/Potenciación para Técnicas Fotométricas

Solución a la cual se Agrega
Solución Concentración de Endotoxina Endotoxina Número de Repeticiones
Aª Ninguna Solución Muestra No menos de 2
Bb Concentración central de la curva estándar Solución Muestra No menos de 2
ce Al menos 3 concentraciones (la concentración más baja se Agua para PEB No menos de 2 para cada una
denomina /,)
Dd Ninguna Agua para PEB No menos de 2
ª Solución A: Solución Muestra se puede diluir sin que exceda la MDV.
b Solución B: La preparación en análisis a la misma dilución que la Solución A, que contenga endotoxina agregada a una concentración igual o cercana a la
concentración central de la curva estándar.
e Solución C: La endotoxina estándar a las concentraciones usadas en la validación del método descrito para Garantía de Criterios para la Curva Estándar en
Pruebas Preparatorias (controles positivos).
d Solución O: Aqua para PEB (control negativo).
La prueba se considera válida cuando se cumplen las condiciones siguientes.

1 . El valor absoluto del coeficiente de correlación de la curva estándar generada usando la Solución Ces mayor o igual a
0,980.
2. El resultado de la Solución D no excede el límite del valor del blanco requerido en la descripción del lisado empleado co-
mo reactivo o es menor que el límite de detección de endotoxina del lisado empleado como reactivo.
Calcular la recuperación media de la endotoxina agregada restando la concentración media de endotoxina en la solución, si
la hubiera (Solución A, Tabla 4), de la que contiene la endotoxina agregada (Solución B, Tabla 4). Para considerar que no pre-
senta factores que interfieran con la valoración en las condiciones de la prueba, la concentración medida de endotoxina agre-
gada a la Solución Muestra debe estar entre 50%-200% de la concentración conocida de endotoxina agregada después de
restar la endotoxina detectada en la solución sin endotoxina agregada.
Cuando la recuperación de endotoxina se encuentra fuera de los intervalos especificados, se considera que la Solución Mues-
tra en análisis contiene factores de interferencia. Luego, repetir la prueba usando una dilución mayor que no exceda la MDV.
Además, la interferencia de la Solución Muestra o de la Solución Muestra diluida que no exceda la MDV se puede eliminar me-
diante un tratamiento validado apropiado, como filtración, neutralización, diálisis o calentamiento. Para establecer que el trata-
miento elegido elimina eficazmente la interferencia sin pérdida de endotoxinas, realizar la valoración descrita anteriormente
utilizando la preparación a examinar, a la que se ha agregado Endotoxina Estándar y se ha sometido posteriormente al trata-
miento seleccionado.
Procedimiento de Prueba
Seguir el procedimiento descrito anteriormente para Prueba de Factores de Interferencia en Pruebas Preparatorias.
Cálculo
Calcular la concentración de endotoxina de cada una de las determinaciones repetidas de la Solución A usando la curva es-
tándar generada con la Solución C de control positivo. La prueba se considera válida cuando se cumplen las tres condiciones
siguientes.
1. Los resultados de la Solución C de control cumplen con los requisitos de validación definidos en Garantía de Criterios para
la Curva Estándar, en Pruebas Preparatorias. ·
2. La recuperación de endotoxina, calculada a partir de la concentración encontrada en la Solución B después de restar la
concentración de endotoxina encontrada en la Solución A está dentro del intervalo de 50%-200%.
3. El resultado de la Solución D de control negativo no excede el límite del valor del blanco requerido en la descripción del
lisado empleado o es menor que el límite de detección de endotoxina del lisado empleado como reactivo.
1nterpretación
En las valoraciones fotométricas, la preparación en análisis cumple con la prueba si la concentración media de endotoxinas
de las determinaciones repetidas de la Solución A, después de la corrección por dilución y concentración, es menor que el lími-
te de endotoxina para el producto.

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Caldo Sabouraud Dextrosa

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~ Medio Reforzado para Clostridios

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Prueba para Micoplasmas en el Artículo o Material de Prueba

Interpretación de los Resultados

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NOTA-Esta sección se proporciona como información.

Caldo de infusión de Corazón Vacuno

Solución Salina Balanceada de Hanks (modificada)

MÉTODO DE CULTIVO DE CÉLULAS INDICADORAS

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NOTA-Lo siguiente se proporciona como información.