Manual Practicas Micalimentos PDF

Prcticas de Microbiologa de Alimentos (1 ITA)
MICROBIOLOGA
DE ALIMENTOS
(Guin de Prcticas)
1 INGENIERO TCNICO AGRCOLA

INDUSTRIAS AGRARIAS Y ALIMENTARIAS
CURSO 2005-2006
MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS (PRCTICAS)

Profesor: Cristina Solano Goi (Profesora Asociada)
e-mail: cristina.solano@unavarra.es
Tfno. Contacto: 948-168024
Direccin: Instituto de Agrobiotecnologa y Recursos Naturales. UPNA/CSIC
Objetivo
Se pretende conseguir que los alumnos conozcan:
.- las buenas prcticas de trabajo en el laboratorio de Microbiologa
.- aprender las tcnicas de preparacin de diferentes medios de cultivo
- familiarizarse con las tcnicas empleadas en Microbiologa para el cultivo y la
manipulacin de microorganismos en condiciones de esterilidad
.- familiarizarse con el manejo del microscopio ptico para la visualizacin de
microorganismos as como las tinciones ms habituales en el laboratorio de
Microbiologa
.- aprender otras tcnicas como las de transformacin bacteriana, infeccin de
bacterias con bacterifagos, as como aprender a realizar un antibiograma
.- determinar el grado de contaminacin microbiolgica de los alimentos. Ejemplo:
contenido de grmenes por gramo de alimento a 30 C
.- verificacin de las buenas prcticas de fabricacin (BFP). Ejemplo: recuento de
indicadores en alimentos procesados (coliformes, enterobacterias, grmenes totales,
etc.)
.- determinacin de microorganismos testigos de falta de higiene.
.- comprobacin de la salubridad de un alimento mediante la determinacin de la
ausencia o presencia de grmenes patgenos o toxinas que provocaran riesgos al
consumidor (Salmonella spp., Listeria monocytogenes, toxina estafiloccica, etc).
.- descripcin de tcnicas sencillas para estudiar el papel de los microorganismos en
la produccin de alimentos.
Metodologa
Lecciones prcticas en el laboratorio de Microbiologa (en grupos
reducidos). Cada grupo realizar las prcticas a lo largo de cuatro semanas (3 das
/semana; 2horas/da). La realizacin de las prcticas es obligatoria para aprobar la
asignatura.
Prcticas de Microbiologa General

Prctica 1: Preparacin de medios de cultivo y siembra de bacterias en medios
de cultivo. Esterilizacin.
Con esta prctica se pretende aprender las tcnicas de preparacin de
diferentes medios de cultivo, su esterilizacin y su almacenaje, as como la
importancia de los diferentes medios de cultivo y su uso. Adems tambin se
pretende que el alumno se familiarice con las tcnicas empleadas en
Microbiologa para el cultivo y la manipulacin de microorganismos en
condiciones de esterilidad.
Prctica 2: Obtencin de cultivos puros.
Con esta prctica se pretende estudiar las diferentes tcnicas de aislamiento
de un microorganismo a partir de una poblacin mixta para obtener un cultivo
puro.
Prctica 3: Cultivo de bacterias anaerobias.
El objetivo de esta prctica es conocer el fundamento y la tcnica ms
comnmente empleada en el aislamiento de bacterias anaerobias.
Prctica 4: Observacin de bacterias teidas. Tincin Simple y Tincin de
Gram.
Con esta prctica se pretende familiarizar al alumno con el manejo del
microscopio ptico para la visualizacin de microorganismos. Se observarn
preparaciones bacterianas bajo diferentes tcnicas de tincin que permitan
establecer diferencias morfolgicas y estructurales entre y dentro de los
microorganismos.
Prctica 5: Recuento del nmero de bacterias por mililitro de un cultivo lquido.

El objetivo de esta prctica es dar a conocer al alumno otra de las tcnicas de
obtencin de cultivo puros as como el aprendizaje para hacer diluciones y
recuentos bacterianos.
Prctica 6: Antibiograma.
El objetivo de esta prctica es estudiar qu son los antibiticos y cmo se
realiza la valoracin de la actividad antimicrobiana de un compuesto qumico
(antibitico) mediante la tcnica de Kirby-Bauer.
Prctica 7: Efecto de las altas temperaturas sobre el crecimiento microbiano
El objetivo de esta prctica consiste en estudiar el efecto y la resistencia de
un cultivo bacteriano a altas temperaturas.
Prctica 8: Transformacin bacteriana por resistencia a ampicilina.
En esta prctica se hablar de los fenmenos de transformacin,
conjugacin y transduccin y se realizar un ensayo de transformacin bacteriana por
adquisicin de plsmidos resistentes al antibitico ampicilina.
Prctica 9: Aislamiento y caractersticas de un bacterifago (virus de bacterias)

El objetivo de esta prctica consiste en visualizar la presencia de
bacterifagos a travs de las consecuencias de su ciclo infeccioso sobre bacterias de
Staphylococcus aureus.
Prctica 10: Observacin de levaduras.
El objetivo de esta prctica es el cultivo de diferentes levaduras y la
posterior identificacin de las mismas de acuerdo a sus caractersticas morfolgicas a
travs de su observacin al microscopio.
Prctica 11: Tincin de esporas.

En esta prctica se estudiar el gnero Bacillus por su capacidad para la
formacin de endosporas y se proceder a la realizacin de la correspondiente tincin
diferencial para poder visualizar al microscopio dichas estructuras.
Prctica 12: Tincin de cpsula.
En esta prctica se estudiarn las cpsulas bacterianas y se proceder a
una tincin diferencial para la visualizacin de la misma al microscopio.
Prcticas de Microbiologa de Alimentos

La gran versatilidad metablica de los microorganismos hace que los podamos
encontrar prcticamente en cualquier entorno. Los alimentos son fcilmente
colonizados (contaminados), ya sea de forma natural, en origen o durante el
procesamiento y la manipulacin. La multiplicacin de los microorganismos en el
alimento puede implicar desde una alteracin inapreciable hasta su deterioro
completo y puede ser, en cualquier caso, una va de transmisin de enfermedades.
Por el contrario, en otras ocasiones, la alteracin resulta beneficiosa debido a la
adquisicin de nuevas propiedades fisicoqumicas de inters organolptico o de
conservacin (que impidan la colonizacin por otros microorganismos).
Las siguientes prcticas se centran en la deteccin de microorganismos en el propio
alimento y adems se describen tcnicas sencillas para estudiar el papel de los
microorganismos en la produccin de alimentos.
Prctica 13: Anlisis microbiolgico de alimentos frescos-cocinados.

Investigar tanto la presencia de microorganismos patgenos que representan
un riesgo para la salud del consumidor como la de aquellos que producen
alteraciones en el alimento durante el periodo de conservacin. Para ello, se
realizarn los siguientes ensayos tras haber preparado convenientemente la muestra:
Preparacin de la muestra:
Tomar la muestra en condiciones aspticas. Para ello se pueden emplear
cubiertos y botes previamente esterilizados. Si transcurre un tiempo entre la
toma de muestra y el anlisis, se mantendr la muestra en refrigeracin.
Homogeneizacin del alimento. Emplearemos un homogeneizador comercial
de paletas para que la distribucin de los microorganismos en el medio sea
homognea. Se pesan 10g del alimento en una bolsa de plstico estril
(especial para el homogeneizador) y se aaden 90 ml de caldo de peptona
estril. El triturado de la muestra se realiza al menos durante 2 minutos,
aunque el tiempo depende de la consistencia del alimento.
Realizar una serie de diluciones decimales seriadas: en tubos con 9 ml de

caldo de peptona. En funcin de la carga microbiana esperada en el alimento
se realizan las diluciones que se crean convenientes.
NOTA: Al aadir 90 ml de caldo de peptona a los 10 g de muestra, se est
realizando la primera dilucin decimal (los 10g de la muestra van a implicar
aproximadamente 10 ml de volumen).
13-A
INVESTIGACIN DE MICROORGANISMOS INDICADORES

Recuento de microorganismos mesfilos totales
Recuento de enterobacterias en placa
Recuento de mohos y levaduras
13-B
DETERMINACIN
DE
INDICADORES
DE
FALTA
DE
HIGIENE
Recuento de coliformes totales en placa
Investigacin de Escherichia coli Presencia/Ausencia
Recuento de Staphylococcus coagulasa positivos
13-C INVESTIGACIN DE PATGENOS
Presencia de Salmonella
Presencia de Listeria monocytogenes
Prctica 14: Recuento de formas vegetativas y esporuladas

El objetivo de esta prctica consiste en determinar la presencia de esporas en
un alimento y confirmar su resistencia a las altas temperaturas.
14-A
RECUENTO DE FORMAS VEGETATIVAS
14-B
RECUENTO DE FORMAS ESPORULADAS AEROBIAS Y

ANAEROBIAS
Prctica 15: Anlisis microbiolgico de la contaminacin ambiental y de

manipuladores de alimentos
Determinar el grado de contaminacin ambiental y del propio manipulador
para estudiar la influencia en el nmero y tipo de microorganismos que luego pueden
desarrollarse en un alimento.
15-A
ANLISIS DEL AIRE
15-B
ANLISIS DE SUPERFICIES
15-C
ANLISIS DE MANIPULADORES
Prctica 16: Utilizacin de los microorganismos en la industria alimentaria

Descripcin de dos tcnicas sencillas para estudiar el papel de los
microorganismos en la produccin de alimentos.
16-A
PREPARACIN DE YOGUR
16-B
PREPARACIN DE CERVEZA
NORMAS GENERALES DE TRABAJO EN EL LABORATORIO DE

MICROBIOLOGIA
Un laboratorio de Microbiologa es un lugar convenientemente habilitado
donde se pueden manejar y examinar microorganismos. Este tipo de trabajo debe ser
llevado a cabo con una buena tcnica asptica, y por tanto se requiere un ambiente
limpio y ordenado y trabajar siempre en condiciones de esterilidad (en campanas
de esterilidad biolgica o en la proximidad de la llama de un mechero de alcohol o de
gas).
Aunque los microorganismos que se manipulen no sean considerados
patgenos, todos los cultivos de todos los microorganismos deben ser manejados con
precaucin por su potencial patogenicidad.
Es necesario cumplir dos REQUISITOS BSICOS:
1. Restringir la presencia de los microorganismos en estudio a sus
recipientes y medios de cultivo para evitar el riesgo de contaminarse uno mismo o a
un compaero.
2. Evitar que los microorganismos ambientales (presentes en piel, pelo,
aire, ropa, etc.) contaminen nuestras muestras.
Para mantener estas condiciones, es necesario respetar una serie de
NORMAS DE SEGURIDAD:
1. Es imprescindible el uso de bata de laboratorio.
2. Al iniciar y finalizar las prcticas, el estudiante se lavar las manos con agua y
jabn.
3. El lugar de trabajo debe estar siempre limpio y ordenado. Antes de comenzar cada
prctica es conveniente desinfectar la superficie de trabajo. Los desinfectantes
ms habituales para esto son la leja y el alcohol (etanol 96).
3. Los microorganismos deben manejarse siempre alrededor de la llama. Se deben
evitar los desplazamientos innecesarios por el laboratorio, ya que pueden crear
corrientes que originen contaminaciones o producir accidentes.
5. Durante las prcticas est prohibido comer, beber y fumar. Cuando se manipulan
microorganismos hay que evitar llevarse las manos a la boca, nariz, ojos, etc.
6. Libros, carpetas, abrigos y cualquier otro material que no se utilice en la

realizacin de la prctica deben estar apartados del lugar de trabajo.
7. Para deshacerse del material contaminado se utilizarn los recipientes adecuados,
que sern esterilizados posteriormente. Nunca se debe tirar nada contaminado
por la fregadera o a la basura comn.
8. Bajo ningn concepto debe sacarse ninguna muestra contaminada del laboratorio.
9. No se debe pipetear nunca con la boca. Utilizar siempre pipeteadores manuales.
10. En caso de accidente (ruptura de material, derramamiento de microorganismos,
etc.) se comunicar inmediatamente al instructor.
CALENDARIO DE PRCTICAS
1a SEMANA
1er DIA- prctica 1
Qu es un medio de cultivo en microbiologa?. Preparacin de medios de
cultivo generales, de enriquecimiento, selectivos y diferenciales
slido en placa
slido en tubo (slant)
lquido (caldo)
Esterilizacin: Diferentes tcnicas, aparatos y formas de trabajo para lograr la
esterilizacin del material y para desechar el material una vez contaminado.
2 DIA- prcticas 1, 2 y 3
-Siembra de los medios preparados el da anterior:
siembra de un cultivo en una placa de LB mediante agotamiento por estras.
siembra de tres cultivos mediante agotamiento por estras en una placa de
LB y otra de agar McConkey.
siembra de un caldo de LB.
siembra de dos cultivos en slant de TSI.
siembra de microorganismos ambientales a partir de objetos y superficies
para demostrar la ubicuidad de los microorganismos
siembra de levaduras en agar sabouraud: incubacin a temperatura ambiente.
Cultivo de bacterias en anaerobiosis: Utilizacin de la jarra de anaerobiosis
3er DIA- prctica 4. Resultados prcticas 1, 2 y 3.
Tincin de Gram: Cmo se realiza y cul es el objetivo de la misma
Ver los resultados del agotamiento por estras y del crecimiento en medio
lquido y slant. Diferencias entre medio de cultivo general, selectivo y
diferencial.
Comprobar la ubicuidad de los microorganismos
Ver el resultado del crecimiento en anaerobiosis.
10
2a SEMANA
1er DIA- prcticas 5, 6 y 7.

Dilucin de un caldo con E. coli para calcular el n de U.F.C./ ml.
Estudio del efecto de antibiticos sobre el crecimiento bacteriano mediante la
tcnica del Antibiograma (Cuantitativo y Cualitativo)
Efecto de las altas temperaturas sobre el crecimiento bacteriano
2o DIA- prcticas 8 y 9. Resultados prcticas 5, 6 y 7.
9 Transformacin bacteriana: Realizacin de la tcnica de transformacin de un
cultivo de E. coli (por resistencia a un antibitico) como ejemplo de transferencia
horizontal de DNA.
Estudio de un virus (bacterifagos): Cmo se pueden visualizar los virus. Ensayo
de infeccin de bacterias con virus en medio slido
Ver los resultados de las diluciones seriadas del caldo de E.coli y clculo del n
de U.F.C./ml.
Ver los resultados de los antibiogramas
Ver los resultados del efecto de las temperaturas sobre el crecimiento
bacteriano
3er DIA- prcticas 10, 11 y 12. Resultados prcticas 8 y 9.
Tincin de Esporas: Cmo se realiza y cul es el objetivo de la misma
Tincin de cpsula: Cmo se realiza y cul es el objetivo de la misma
Observacin de levaduras al microscopio: Diferencias entre organismos
procariotas y eucariotas al microscopio. Cmo es la clula levaduriforme.
Observacin de varias especies de levaduras al microscopio.
Ver el resultado de la transformacin bacteriana
Ver placas de lisis de los virus infectando a las bacterias en medio slido
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3a SEMANA
1er DIA- prctica 13-A-1, 13-A-2, 13-B-1, 13-B-2, 13-B-3, 16-B
Aprender a preparar, homogeneizar y diluir convenientemente la muestra a analizar para
el anlisis de alimentos frescos-cocinados. Comenzaremos por la investigacin de
microorganismos indicadores (mesfilos, enterobacterias) y la determinacin de
indicadores de falta de higiene (coliformes totales, Escherichia coli y Staphylococcus
coagulasa positivos).
Comprobar la transformacin de una suspensin de harina de malta que la levadura
Saccharomyces cerevisiae lleva a cabo mediante una fermentacin alcohlica para
dar lugar a cerveza.
Recuento de microorganismos mesfilos totales: Preparacin de la muestra. Siembra

de diluciones en PCA.
Recuento de Enterobacteriaceae: Preparacin de la muestra. Siembra de diluciones en
VRBG.
Recuento de coliformes totales en placa: Preparacin de la muestra. Siembra de
diluciones en VRBL.
Investigacin de Escherichia coli Presencia/Ausencia: Preparacin de la muestra.
Siembra de dilucin en caldo EC de doble concentracin.
Recuento de Staphylococcus coagulasa positivos: Preparacin de la muestra. Siembra
de diluciones en Agar Baird Parker.
Preparacin de cerveza: Preparacin de la suspensin de harina de malta, activacin de
las amilasas e inoculacin con Saccharomyces cerevisiae.
2 DIA- prctica 13-A-1, 13-A-2, 13-B-1, 13-B-2, 13-B-3
Recuento y tincin de Gram de colonias caractersticas. Pase de colonias caractersticas
a medios para su posterior identificacin mediante pruebas bioqumicas.
Recuento de microorganismos mesfilos totales: Recuento de placas. Tincin de
Gram de colonias con diferentes morfologas.
Recuento de Enterobacteriaceae: Recuento de placas y reconocimiento de colonias
caractersticas. Pase a agar nutritivo.
Recuento de coliformes totales en placa: Recuento de placas. Tincin de Gram de
colonias caractersticas.
Investigacin de Escherichia coli Presencia/Ausencia: Pase de tubos positivos de EC
a tubos con caldo de triptona.
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Recuento de Staphylococcus coagulasa positivos: Recuento de placas y

reconocimiento de colonias caractersticas. Pase de colonias tpicas y no tpicas a
BHI.
3er DIA- prctica 13-A-2, 13-A-3, 13-B-2, 13-B-3
Tincin de Gram de colonias caractersticas. Pruebas bioqumicas confirmatorias.
Investigacin de la presencia de mohos y levaduras.
Recuento de Enterobacteriaceae: Prueba de la oxidasa. Siembra en agar KIA. Tincin
de Gram.
Investigacin de Escherichia coli Presencia/Ausencia: Adicin de reactivo de Kovacs
y confirmacin.
Recuento de Staphylococcus coagulasa positivos: Adicin de plasma de conejo con
EDTA. Resultado de la prueba de la coagulasa.
Recuento de mohos y levaduras: Preparacin de la muestra. Siembra de diluciones en
OGA.
4a SEMANA
1er DIA- prctica 13-C-1, 13-C-2, 15-A, 15-B, 15-C
Anlisis de alimentos frescos-cocinados: investigacin de patgenos en alimentos como
posible causa de toxiinfecciones. Comenzaremos utilizando una muestra ya
preenriquecida y procederemos a enriquecer en medios lquidos selectivos.
Anlisis microbiolgico de la contaminacin ambiental y de manipuladores de
alimentos.
Presencia de Salmonella: Muestra preenriquecida en agua de peptona tamponada.
Enriquecimiento en caldo Mueller Kauffmann tetrationato y Rappaport-Vassiliadis
Soja.
Presencia de Listeria monocytogenes: Muestra preenriquecida en caldo Fraser-demi.
Enriquecimiento en caldo Fraser.
Anlisis del aire: Contaminacin en placas de PCA para determinacin de mesfilos
totales.
Anlisis de superficies no planas: Siembra mediante mtodo del hisopo en placas de
PCA y VRBG.
Anlisis de superficies planas por placas de contacto Rodac: Anlisis de la superficie
elegida con placas Rodac.
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Anlisis de manipuladores: Contaminacin en las manos y en el interior de la nariz.

Siembra en placas VRBG y Agar Manitol Sal.
13-A-2: Ver el resultado de la siembra de KIA a partir de colonias
caractersticas en el recuento de enterobacterias.
13-A-3: Recuento de colonias en placas OGA.
16-B: Comprobar el resultado de la fermentacin alcohlica.
2 DIA- prctica 13-C-1, 13-C-2, 15-A, 15-B, 15-C, 14-A, 14-B, 16-A
posible causa de toxiinfecciones. Continuaremos la prctica procediendo a aislar los
patgenos en medios selectivos.
Estudio de la resistencia de esporas a los procesos de conservacin utilizados en la
industria alimentaria mediante comparacin del recuento de formas vegetativas y
recuento formas esporuladas tras tratamiento de la muestra a 80 C.
Comprobar la transformacin de la leche que los microorganismos presentes en un
yogur llevan a cabo mediante una fermentacin lctica para dar lugar a otro yogur.
Presencia de Salmonella: Agotamiento en XLD y BGA.
Presencia de Listeria monocytogenes: Agotamiento en Oxford y Palcam.
Recuento de formas vegetativas: Preparacin de la muestra. Siembra de diluciones en
PCA.
Recuento de formas esporuladas aerobias y anaerobias: Calentar el mismo tubo de
muestra utilizado para el recuento de formas vegetativas. Siembra de diluciones en
PCA (recuento de esporos aerobios) y en Schaedler (recuento de esporos anaerobios).
Preparacin de yogur: Siembra de un tubo de leche con un cultivo iniciador.
15-A, 15-B, 15-C: Ver el resultado del anlisis microbiolgico de la

contaminacin ambiental y de manipuladores de alimentos.
3er DIA- prctica 13-C-1, 13-C-2, 14-A, 14-B, 16-A
posible causa de toxiinfecciones. Finalizaremos la prctica procediendo a realizar
pruebas bioqumicas especficas para la identificacin del patgeno y tincin de
Gram.
Identificacin de bacterias formadoras de esporas segn tincin de Gram y prueba de la
catalasa.
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Comprobar el resultado de la fermentacin lctica.

Presencia de Salmonella: Ensear galera API. Explicar pruebas serolgicas. Tincin
de Gram.
Presencia de Listeria monocytogenes: Explicar prueba de CAMP, iluminacin de
Henry. Realizar prueba catalasa y tincin de Gram.
Recuento de formas vegetativas, esporuladas aerobias y anaerobias: Discernir entre
los gneros Bacillus y Clostridium segn la prueba de la catalasa.
Preparacin de yogur: Tincin de Gram del cultivo iniciador y del yogur preparado.
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Prctica 1: PREPARACION DE MEDIOS Y SIEMBRA DE BACTERIAS EN

MEDIOS DE CULTIVO
Fundamento:
Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento
y otros componentes que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los
microorganismos. Puesto que la diversidad metablica de los microorganismos es
enorme, la variedad de medios de cultivo es tambin muy grande. La mayora de los
medios de cultivo se comercializan en forma de liofilizados que es preciso rehidratar.
La preparacin de un medio de cultivo se reduce en general a pesar la cantidad de
medio y redisolverla en agua destilada (libre de inhibidores del crecimiento)
siguiendo las instrucciones del fabricante. Las sustancias termolbiles se esterilizan
por filtracin y se aaden al resto de los componentes previamente esterilizados en el
autoclave.
Los constituyentes habituales de los medios de cultivo son:
1. Agar. Se utiliza como agente solidificante. Es un polisacrido que se obtiene
de ciertas algas marinas. Las bacterias no son capaces de
degradarlo.
2. Azcares. Son una fuente de carbono para los microorganismos. Los ms
empleados son la glucosa, la lactosa y la sacarosa.
3. Extractos. Son preparados de ciertos rganos o tejidos animales o vegetales
obtenidos con agua y calor. Ej.: extracto de carne, de levadura, de
malta, etc.
4. Peptonas. Son protenas hidrolizadas, se obtienen por digestin qumica o
enzimtica de protenas animales o vegetales.
5. Fluidos corporales. Sangre completa, sangre desfibrinada, plasma o suero
sanguneo son aadidos a los medios empleados para el cultivo de
algunos microorganismos patgenos.
6. Sistemas amortiguadores. Son sales que se aaden al medio para mantener
el pH dentro del rango ptimo del crecimiento bacteriano. Ej.:
fosfatos bisdicos o bipotsicos.
7. Indicadores de pH. Son indicadores cido-base que se aaden para detectar
cambios de pH en el medio.
8. Agentes reductores. Sustancias que se aaden al medio para crear las
condiciones que permitan el desarrollo de los grmenes
microaerfilos o anaerobios. Ej.: cistena y tioglicolato.
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9. Agentes selectivos. Sustancias como el cristal violeta, las sales biliares etc.
que a determinadas concentraciones en el medio actan como
agentes selectivos frente a determinados microorganismos.
Tipos de medios de cultivo.
Por su CONSISTENCIA:
a) Slidos. Son aquellos que contienen un agente solidificante entre sus
componentes, normalmente agar. Se preparan en placas de Petri o en tubos en slant
(tubos con la superficie del medio inclinada).
b) Lquidos. Se denominan caldos y se preparan en tubos o erlenmeyers.
Por su COMPOSICIN:
a) Medios generales. Permiten el desarrollo de una gran variedad de
microorganismos.
b) Medios de enriquecimiento. Favorecen el crecimiento de un determinado
grupo de microorganismos, sin llegar a inhibir totalmente el crecimiento del resto.
c) Medios selectivos. Permiten el crecimiento de un tipo de microorganismos
determinado, inhibiendo el desarrollo de los dems.
d) Medios diferenciales. Son aquellos en los que se pone de relieve alguna
propiedad que un determinado tipo de microorganismos posee.
Siembra de microorganismos
En trminos microbiolgicos se entiende por SIEMBRA el proceso
mediante el cual se lleva una porcin de una poblacin de microorganismos (inculo)
de un cultivo bacteriano a un medio nutritivo para su crecimiento.
PARA UNA CORRECTA REALIZACIN DE LA SIEMBRA SON
NECESARIAS CIERTAS CONDICIONES:
1) Que se lleve a cabo con instrumentos estriles sobre medios de cultivo estriles.
Para estudiar una bacteria determinada, es necesario destruir todos aquellos
microorganismos que pudieran encontrarse en el medio y en los instrumentos de
trabajo. Esto se consigue con la ESTERILIZACION, proceso que consiste en
conseguir que todos los microorganismos presentes mueran desde el punto de vista
microbiolgico.
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La esterilizacin
Se utilizan dos tipos principales de esterilizacin:
Por MTODOS FSICOS (calor, filtracin, radiaciones).
Por MTODOS QUMICOS (empleo de soluciones qumicas).
Los medios de cultivo se esterilizan en el AUTOCLAVE, el cual hace uso
del calor hmedo. El autoclave es un aparato que permite elevar la presin y la
temperatura con lo que se consigue un aumento en la temperatura de ebullicin del
agua. Normalmente, se lleva la presin a 1 atmsfera (por encima de la ambiental) lo
que corresponde a una temperatura interior de 126C, mantenindolo en estas
condiciones durante 20 minutos.
Todo el material de vidrio (pipetas, tubos, varillas.etc..) se esteriliza con
calor seco, siendo el "horno Pasteur" el aparato ms empleado (se somete a
temperaturas de 140-180 C durante 2h-3h).
En el caso de objetos metlicos, como el asa de siembra, que se esterilizan
en el momento de su utilizacin, se mantienen en la llama hasta que se pongan al
rojo, teniendo la precaucin de enfriarlos antes de su uso.
2) Que el inculo no se contamine, modifique o destruya:
Normalmente se emplea el calor directo, flameando las bocas de los tubos de
ensayo, matraces, pipeta, etc. antes y despus de su utilizacin, a pesar de estar
esterilizados previamente.
3) Que las condiciones ambientales durante el proceso sean lo ms prximas a la
esterilidad para evitar contaminaciones durante el manejo del instrumental y de los
medios de cultivo.
Esto se resuelve con el uso de cabinas estriles (con flujo de aire y luz
ultravioleta). Cuando no se dispone de ellas, se utiliza un mechero Bunsen que,
debido a que fuerza la circulacin del aire en sentido vertical y hacia arriba, es capaz
de crear un ambiente semiestril en la zona inmediata alrededor y debajo de la llama,
de forma que los riesgos de contaminacin disminuyen considerablemente.
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Material de la Prctica:
Mechero bunsen o similar
Asa de siembra
Tubos con cultivos bacterianos crecidos: Escherichia coli, Salmonella enteritidis,
Staphylococcus aureus.
Material a preparar por el alumno:
1 Tubo con medio lquido estril (caldo comn): Luria Bertani (LB)
2 Tubos con medio slido estril (agar inclinado): TSI
Placas: 4 placas LB agar; 1 placa agar McConkey; 1 placa agar Sabouraud.
Mtodos:
1) PREPARACIN DE MEDIOS
Preparacin de un medio slido en placa.
1. Pesar la cantidad de medio (si el preparado contiene agar debemos aadirlo a una
concentracin de 15 g/l.) y rehidratarlo con agua destilada en una botella.
2. Autoclavar la botella sin cerrar totalmente el tapn de rosca.
3. Sacar del autoclave, enroscar del todo el tapn e introducir la botella en un bao a
40C al menos durante 30 minutos.
4. Distribuir el medio en las placas de Petri que estn estriles dentro de una campana
de flujo laminar o en las proximidades del mechero, flameando bien la boca de la
botella para evitar las contaminaciones.
5. Dejar que el medio solidifique.
Preparacin de medio slido en tubo (slant).
1. Pesar el medio que contenga agar y rehidratar con agua destilada en un matraz.
2. Fundir el medio en un horno microondas o en una placa caliente. El medio debe
hervir hasta que se vuelva transparente.
3. Distribuir rpidamente el medio en los tubos antes de que comience a solidificar.
Para ello se emplear una pipeta y los tubos no se llenarn ms de un tercio de su
volumen.
4. Autoclavar.
5. Sacar del autoclave e inclinar los tubos sobre la poyata para obtener tubos con
medio en slant.
Preparacin de medio lquido en tubo (caldo).
1. Pesar y rehidratar el medio.
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2. Distribuirlo con una pipeta en los tubos ( sin llenarlos ms de 1/3 de su volumen).
3. Autoclavar.
4. Sacar del autoclave y dejar enfriar.
Todos los medios se guardan en nevera a 4C.
2) REALIZACIN DE LA SIEMBRA
1.- Marcar el material con el nombre de la pareja y grupo.
2.- Realizar la siembra, como sigue:
a) Siembra en medio lquido:
Se introduce el asa de siembra en el tubo con cultivo crecido y se toma un inculo
que se lleva al tubo estril con medio lquido (agitndola en el seno del medio),
tomando las precauciones mencionadas anteriormente.
b) Siembra en placa:
Dividida la placa en tres partes, sembrar en cada tercio el inculo tomado de los
cultivos crecidos. Se introduce el asa de siembra en el tubo con cultivo crecido y se
toma una gota de inculo que se extiende sobre el agar de la placa deslizando el asa
suavemente por su superficie en zig-zag.
c) Siembra en agar inclinado:
Se introduce el asa de siembra en el tubo con cultivo crecido y se toma un inculo
que se extiende sobre el agar inclinado deslizando el asa suavemente por su
superficie en zig-zag. En el caso del medio TSI, la siembra se deber realizar tanto en
superficie (aerobiosis) como en la profundidad del agar (anaerobiosis).
3) INCUBACIN de los medios sembrados a 37 C hasta que haya habido
crecimiento bacteriano.
4) OBSERVACIN DE LOS RESULTADOS:
En primer lugar, observar a simple vista diversas caractersticas como el
color y el borde de las colonias crecidas en el agar as como el olor y la turbidez del
medio ya que en algunos casos suelen ser tpicos de un determinado tipo de
microorganismo y pueden servir de ayuda a la hora de su identificacin.
El siguiente paso sera la observacin al microscopio, que ser objeto de otra
prctica.
20
Prctica 2: OBTENCION DE CULTIVOS PUROS

Introduccin
Un CULTIVO PURO es aquel que contiene una sola clase de
microorganismos. Para obtenerlo es necesario recurrir a las llamadas tcnicas de
aislamiento. Aunque existen otras, las tcnicas ms utilizadas emplean un medio de
cultivo slido, en el que los microorganismos generan colonias separadas.
Se puede demostrar que cada colonia procede de una sola clula o de un
grupo de clulas del mismo tipo si el microorganismo forma agregados. Por ello lo
ms correcto es hablar de unidades formadoras de colonias (UFC) al referirnos al
origen de una colonia. Por tanto, todas las bacterias de una colonia son genticamente
iguales y constituyen un clon.
En esta prctica emplearemos dos mtodos para obtener un cultivo puro:
Aislamiento por agotamiento por estras
Aislamiento por siembra de diluciones seriadas (que ser el objeto de
otra prctica ms adelante).
Agotamiento por estras.

Se trata de un mtodo rpido y simple de agotamiento progresivo y continuo del
inculo sobre un medio slido contenido en una placa de Petri. El objetivo es
obtener, a partir de un elevado nmero de bacterias, un nmero reducido de ellas
distribuidas individualmente sobre la superficie de la placa. Cada una de estas
bacterias originar una colonia.
Procedimiento:
1. Esterilizar el asa y enfriarla en las proximidades del mechero.
2. Tomar el inculo como se ha descrito anteriormente.
3. Transferir el inculo a un rea pequea de la superficie de la placa, prxima al
borde. Extenderlo formando estras muy juntas sobre la superficie de una porcin
pequea de la placa.
4. Flamear el asa y enfriarla. Rozar una vez con el asa las estras sembradas la
primera vez y realizar sobre una porcin virgen de la placa una segunda tanda de
estras que no toque la primera.
5. Flamear y enfriar el asa. Repetir la operacin descrita en el apartado anterior, pero
rozando al empezar la segunda tanda de estras.
6. Flamear el asa y cerrar la placa e incubar a 37C.
21
Prctica 3: CULTIVO DE BACTERIAS ANAEROBIAS

Las bacterias anaerobias se pueden cultivar eliminando el oxgeno del
medio ambiente o estableciendo un potencial rdox bajo, mediante la adicin de los
suficientes materiales reductores al medio de cultivo.
La proteccin de los cultivos anaerobios del oxgeno libre se puede
conseguir por varios mtodos diferentes, el ms empleado en clnica es sembrar la
bacteria en placas o tubos de cultivo e introducirlos en las llamadas jarras de
anaerobiosis donde se genera una atmsfera libre de oxgeno. Estas jarras constan de
un soporte para placas incluido en una cubeta transparente con tapa hermtica. Las
placas y los tubos sembrados se colocan dentro del soporte en el interior de la jarra
junto al sobre comercial abierto. Para crear la atmsfera anaerobia se utiliza el sobre
comercial que contiene una tableta de borohidrato sdico, otra de bicarbonato sdico
y cido ctrico y un catalizador de paladio. Cuando se aade agua al sobre, el
borohidrato sdico, bicarbonato sdico y cido ctrico reaccionan para formar
hidrgeno y dixido de carbono. El catalizador de paladio cataliza la reaccin entre el
hidrgeno y el oxgeno presente dentro de la jarra. Esta reaccin produce agua, que se
condensa en las paredes de la jarra. Para confirmar que la atmsfera es anaerobia se
coloca dentro de la jarra un papel indicador que contiene azul de metileno. ste es
azul en presencia de oxgeno y vira a blanco en un ambiente anaerobio.
Esquema tomado de :http://www.azc.uam.mx/cbi/quimica/microbiologia/p14.pdf
22
Prctica 4: OBSERVACIN DE BACTERIAS TEIDAS

Para observar las bacterias teidas es necesario, en primer lugar, hacer un
frotis de las bacterias y fijarlo.
Para hacer un frotis, cuando se parte de un cultivo de bacterias en medio
lquido, se toma una o varias cargas directamente con el asa y se extienden sobre el
portaobjetos. Si se parte de un cultivo en medio slido, debe depositarse previamente
una gota de agua sobre el portaobjetos. A continuacin, se toma con el asa una
pequea parte de la colonia y se dispersa en la gota de agua, realizndose la extensin
como en el caso anterior.
La fijacin tiene por objeto provocar modificaciones en la composicin
fsico-qumica de la bacteria (coagulacin de las protenas, etc.) de forma que sta
conserve definitivamente una estructura similar a la que tena en vivo, sin deformarse
como consecuencia de los tratamientos a que se ver sometida durante la tincin. Por
otra parte la fijacin impide el arrastre de los microorganismos al quedar estos
adheridos al portaobjetos y hace que la pared celular sea ms permeable a los
colorantes.
Para la fijacin pueden utilizarse agentes qumicos (formol, metanol) o el
calor. Nosotros emplearemos el calor, y para ello el frotis, una vez seco, se pasa dos o
tres veces sobre la llama, con la preparacin hacia arriba, para no quemarla. Hay que
procurar que el calor nunca sea excesivo, pues se alteraran las estructuras de la
bacteria: en ningn momento el portaobjetos, colocado sobre el dorso de la mano,
debe quemar.
Material:
Portaobjetos.
Mechero Bunsen.
Asa de siembra.
Tubos con cultivos de bacterias Gram-positivas y Gram-negativas.
Cubetas de tincin o similar.
Colorantes para las tinciones: Cristal violeta, Lugol, Alcohol-Acetona (1:1) y
Safranina.
Mtodo:
1) Realizacin del frotis y la fijacin de los diferentes cultivos de bacterias Se
proceder tal y como se ha descrito anteriormente.
23
2) Tinciones:
A) La TINCIN SIMPLE es la tincin en que se utiliza un solo colorante.
Como colorantes utilizaremos el azul de metileno o la safranina, ambos de
naturaleza bsica. La tcnica es la siguiente:
1. Hacer el frotis, secarlo y fijarlo.
2. Cubrir con colorante la preparacin y dejarlo actuar durante un minuto.
3. Lavar suavemente con agua destilada para eliminar el exceso de colorante.
4. Secar al aire y observar al microscopio con el objetivo de inmersin (100x)
empleando el aceite apropiado.
Esta tcnica permite observar la morfologa y tamao de las bacterias, as como los
tipos de agrupaciones que forman.
B) La TINCIN DE GRAM es la tincin diferencial ms utilizada en
Bacteriologa pues permite separar las bacterias en dos grandes grupos, las Grampositivas y las Gram-negativas. La tincin de Gram requiere cuatro soluciones:
1. Primer colorante. Es un colorante bsico que en contacto con las clulas
cargadas negativamente, reacciona con ellas colorendolas. El ms
utilizado es el cristal violeta.
2. Solucin mordiente. Fija las tinciones y aumenta la afinidad entre el
colorante y las clulas. Los mordientes empleados suelen ser sales
metlicas, cidos o bases, como, por ejemplo, una solucin diluida de
yodo.
3. Agente decolorante. Es un disolvente orgnico, por ejemplo, alcoholacetona (1:1).
4. Colorante de contraste. Es un colorante bsico de distinto color que el
primer colorante, como, por ejemplo, la safranina. Los dos grupos
bacterianos a los que anteriormente nos referamos difieren en el color con
el que finalmente aparecen. Las bacterias Gram positivas se teirn de azul
por el cristal violeta y no perdern esta coloracin durante los pasos
sucesivos. Las bacterias Gram negativas perdern la coloracin inicial del
cristal violeta en los siguientes pasos y se teirn de rosa debido a la
safranina. La diferencia est determinada por la composicin de su
envoltura celular. Las bacterias gram positivas poseen una malla de
peptidoglicano en su parte ms externa, mientras que las bacterias gram
negativas, recubriendo una fina capa de peptidoglicano, presentan una
membrana externa que envuelve toda la clula.
24
El mtodo de tincin es el siguiente:

1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Se prepara el frotis, se seca y se fija.

Se cubre con cristal violeta durante un minuto.
Lavar suavemente con agua destilada para eliminar el exceso de colorante.
Se traza con lugol un minuto. El lugol acta como mordiente aumentando la
afinidad del colorante por la bacteria.
Lavar con agua el exceso de lugol.
Se gotea alcohol-acetona de forma continua hasta que la preparacin deje de
perder color y se lava enseguida con agua abundante.
Se cubre la preparacin con un colorante de contraste, como la safranina,
durante un minuto.
Se lava con agua y se seca al aire, observndose a continuacin con el
objetivo de inmersin.
3) Observacin de las tinciones de bacterias al microscopio.

Las bacterias Gram-positivas presentarn una coloracin violeta mientras
que las Gram-negativas la presentarn roja o rosa. La identificacin de las bacterias
Gram-positivas puede ser problemtica, solamente cuando las bacterias Grampositivas se encuentran en crecimiento exponencial (cultivos jvenes) la reaccin es
clara; en fase estacionaria (cultivos viejos) las bacterias Gram-positivas pueden
parecer Gram-negativas.
25
Prctica 5: RECUENTO DEL NMERO DE BACTERIAS POR MILILITRO

Introduccin
El mtodo que vamos a utilizar consiste en realizar diluciones sucesivas
de la muestra en condiciones de esterilidad con objeto de sembrar despus cantidades
conocidas de las mismas en una serie de placas de petri. Considerando que alguna de
las diluciones ser tal que al distribuir una parte de ella en la placa, originar colonias
separadas. Contando el nmero de colonias, el volumen sembrado en la placa y la
dilucin correspondiente, podremos calcular el nmero de unidades formadoras de
colonias presentes en la muestra inicial.
Material
- Muestra
- Pipetas automticas.
- Tubos eppendorf.
- Placas de agar LB.
Mtodo
A partir de la muestra hacer una serie de 4 diluciones decimales en condiciones de
esterilidad.
-2
-4
-6
-8
Extender 25 l de las diluciones 10 , 10 , 10 y 10 en una placa e incubar toda la
noche. A partir del nmero de colonias presentes en cada dilucin, calcular el nmero
de bacterias por ml en el cultivo original.
26
Prctica 6: ANTIBIOGRAMA
Introduccin
En nuestros das han sido puestos a nuestra disposicin para la lucha
contra las enfermedades bacterianas gran cantidad de agentes antibacterianos.
Los antibiticos son sustancias qumicas producidas por
microorganismos o derivados semisintticos de stas, mientras que los
quimioterpicos son productos de sntesis qumica, pero ambos tienen la propiedad
de estar dotados de actividad antibacteriana.
Todas las bacterias no tienen la misma sensibilidad a los distintos
antibacterianos. La evaluacin de esta sensibilidad nos va a ayudar en la seleccin del
compuesto ms adecuado para el tratamiento de una infeccin bacteriana. Las
pruebas ms utilizadas para evaluar la sensibilidad de una bacteria a un agente
antibacteriano estn basadas en el enfrentamiento in vitro de la bacteria con distintas
concentraciones del agente.
Concentracin mnima inhibitoria (CMI) se define como la menor
concentracin de antimicrobiano capaz de inhibir el desarrollo de una
cepa bacteriana dada.
Concentracin mnima bactericida (CMB) se define como la
menor concentracin de antimicrobiano capaz de destruir una cepa
bacteriana dada.
Fundamento
El antibiograma por el mtodo de difusin en agar es una prueba en la
que se enfrenta la bacteria inoculada sobre la superficie de un medio de agar con una
solucin antibitica absorbida en discos de papel de filtro. Este mtodo est
estandarizado y los halos de inhibicin han sido obtenidos correlacionndolos con las
CMI y aparecen en unas tablas.
Hay varios factores que afectan al halo de inhibicin: la carga del
antibitico en los discos, la difusin del antibitico en el medio de cultivo, el tamao
del inculo bacteriano, la composicin y grosor del medio de cultivo, la velocidad del
crecimiento bacteriano y el tiempo de incubacin.
Los discos de antibiticos son adquiridos comercialmente. Deben
contener la cantidad establecida de antibitico y ser conservados a 4C protegidos de
la humedad.
El inculo bacteriano debe tener una turbidez similar al 0,5 de la escala
8
de McFarland, aproximadamente 10 UFC/ml y ser preparado en solucin salina
estril o caldo de cultivo.
27
Objetivos
Determinar la sensibilidad bacteriana a distintos antibiticos utilizando
metodologa sencilla y asequible a cualquier laboratorio de Microbiologa.
una
Material necesario
- Cultivo puro de Staphylococcus aureus y Escherichia coli.
- Placas de LB agar.
- Discos comerciales de antibiticos.
- Hisopos estriles
- Pinzas de laboratorio.
Realizacin
1. Preparacin del inculo. Partiendo de un cultivo puro tomar con el asa de siembra
X colonias de la bacteria e introducirlas en el caldo de cultivo. La turbidez del
inculo debe equivaler al estndar 0,5 de McFarland.
2. Inocular la superficie de una placa de agar con el hisopo pasndolo uniformemente
por toda la superficie en tres direcciones. Por ltimo, pasar el hisopo por el reborde
de la placa de agar. Dejar secar 5 minutos. Colocar los discos de antibiticos sobre la
superficie del agar utilizando unas pinzas estriles y apretndolos suavemente sobre
la superficie del agar. Los discos no deben estar a menos de 15 mm de los bordes de
la placa y lo bastante separados entre ellos para que no se superpongan sus zonas de
inhibicin. Dejar las placas 15 minutos a temperatura ambiente para que comiencen a
difundir los antibiticos.
3. Incubar la placa en posicin invertida a 37C durante 18-24 horas.
4. Medir los dimetros de los halos de inhibicin con una regla.
Ensayo cualitativo: un mismo cultivo se enfrenta a distintas soluciones antibiticas.
Ensayo cuantitativo: un mismo cultivo se enfrenta a un slo antibitico, preparado a
distintas concentraciones.
28
Esquema: preparacin de los discos impregnados de antibitico para realizar un

antibiograma. Tomado de http://personales.ya.com/erfac/practi/microbi3.htm
Interpretacin de los resultados

Los dimetros de los halos de inhibicin se traducen a las categoras de
resistente (R), intermedio (I), moderadamente sensible (MS) o sensible (S).
Tomado de http://personales.ya.com/erfac/practi/antibio4.jpg
29
Prctica 7: EFECTO DE LAS ALTAS TEMPERATURAS SOBRE EL

CRECIMIENTO MICROBIANO
Fundamento
Las altas temperaturas provocan efectos letales o subletales sobre los
microorganismos. Una bacteria sometida a una temperatura superior a la que normalmente
crece, sufre, en primer lugar, daos en sus protenas y cidos nucleicos. Estos primeros
daos impiden que la bacteria se reproduzca y, por consiguiente, forme una colonia sobre un
medio de cultivo adecuado. Sin embargo, si el tratamiento es corto en duracin y se efecta a
una temperatura no excesivamente alta, los daos que la bacteria sufre son reparables y, por
eso, se habla de efectos subletales. Cuando el tratamiento es ms fuerte, en temperatura o en
duracin, los daos se hacen irreparables y la bacteria pierde de forma irreversible su
capacidad de formar colonias. Se habla entonces de efecto letal.
Material necesario
3 matraces con un cultivo de la bacteria problema.
1 placa de Petri de agar LB.
Micropipeta y puntas estriles.
Mechero Bunsen.
Bao termosttico a 60C.
Realizacin
Se dispondr de tres matraces con un cultivo de la bacteria problema y de una placa
de Petri con agar LB.
1.- Separar la placa en tres partes iguales con el marcador de vidrio y nombrar cada parte con
el tiempo de incubacin a estudiar. Es decir 0, 15 y 30 minutos.
2.- Tomar, con una punta estril, 25 l de uno de los cultivos y extenderlos sobre la parte de
la superficie de la placa correspondiente al tiempo t=0.
3.- Colocar los otros dos matraces en el bao de agua e incubar a 60C.
4.- A t= 15 y 30 minutos tomar 25 l de muestra del matraz que corresponda y extenderlos
sobre la parte de la placa correspondiente.
5.- Incubar la placa a 37C durante una noche.
6.- Al da siguiente, hacer un recuento de las colonias a los diferentes tiempos (a t=0 ser
imposible porque se tratar de un csped).
30
Prctica 8: TRANSFORMACION BACTERIANA POR RESISTENCIA A

AMPICILINA
Las bacterias pueden transmitir la informacin gentica verticalmente (de
"madres" a "hijas") o de una manera horizontal (entre bacterias que coexisten al
mismo tiempo).
La transferencia vertical se realiza mediante el proceso de divisin celular
y el reparto equitativo del cromosoma bacteriano replicado. La transferencia
horizontal se realiza entre clulas vecinas y es el mecanismo a travs del cual las
bacterias diseminan los genes de resistencia a antibiticos. Los vehculos mediante
los cuales se transfiere el DNA horizontalmente son los plsmidos o los fagos. Un
plsmido es un elemento extracromosmico con capacidad de autoreplicacin y los
fagos son virus de bacterias.
Los mecanismos de la transferencia horizontal son:
1.-La TRANSFORMACION: por este mecanismo una clula es capaz de tomar un
fragmento de ADN del medio extracelular y expresar los genes en l
contenidos.
2.-La CONJUGACION: las bacterias capaces de formar el "pelo F" pueden
transferir una copia de parte de su cromosoma a otra bacteria receptora. Es un
procedimiento de transmisin sexual de informacin gentica.
3.-La TRANSDUCCION: cuando un virus que infecta una bacteria de forma que el
ADN viral est integrado en el de la bacteria (ciclo lisognico) se escinde del
cromosoma bacteriano (pasa a ciclo ltico) puede llevarse consigo parte del
genoma bacteriano e integrarlo en el cromosoma de una nueva bacteria a la que
infecte.
31
Esquemas tomados de: http://personales.ya.com/erfac/practi/antibio4.jpg

Para que se produzca la transformacin de un bacteria sta debe
encontrarse en un estado fisiolgico especial denominado "competencia". Las clulas
competentes son aquellas susceptibles de ser transformadas y, por lo tanto, tomar un
ADN externo e introducirlo en su citoplasma. El ADN asimilado de esta forma puede
expresar sus genes en la bacteria transformada. Si este ADN externo tiene un origen
de replicacin funcional en la bacteria competente puede perpetuarse al pasar a las
clulas hijas (plsmidos).
Objetivo
Demostrar como podemos conferir a una bacteria la resistencia a un antibitico
mediante transformacin con DNA exgeno.
Material:
1 placa de Petri con medio de agar LB con ampicilina.
1 tubo eppendorf conteniendo 100 l de clulas de E. coli competentes.
1 tubo eppendorf conteniendo 1g de plsmido pGEMt portador de un gen de
resistencia a ampicilina.
1 pipeta de 01 ml limpia.
Metodologa
A.-Preparacin de clulas competentes: Las clulas de E. coli se cultivan en medio
LB y cuando estn en fase exponencial se centrifugan y se resuspenden en una
disolucin de CaCl2 50 mM. La concentracin de las clulas es 10 veces la inicial.
32
B.-Transformacin
1. Dividir la placa de Petri en dos mitades con el marcador de vidrio.
2. Extender con la punta de la pipeta 50 l de las clulas competentes en una
mitad de la placa.
3. Aadir el resto de las clulas sobre el ADN del segundo tubo.
4. Mantener 20 minutos en hielo.
5. Colocar el ADN con las clulas a 42 durante 1 minuto.
6. Poner la mezcla en hielo durante 5 minutos.
7. Incubar las clulas a 37C durante 15 minutos.
8. Extender las clulas transformadas en la segunda mitad de la placa.
9. Incubar 20 horas a 37C
Observacin y discusin de resultados.
Se observar que algunas de las clulas tratadas han adquirido resistencia
a ampicilina como se puede comprobar por la aparicin de colonias en la placa en
que se sembraron.
33
Prctica
9:
AISLAMIENTO
CARACTERISTICAS
DE
UN
BACTERIOFAGO (VIRUS DE BACTERIAS)

Los virus son demasiado pequeos para poder ser vistos con el
microscopio ptico y nicamente son visibles gracias al mayor poder de resolucin
que ofrece el microscopio electrnico. Los virus estn compuestos de un genoma,
bien en forma de DNA o RNA, y de protenas. Son parsitos obligados y necesitan de
la maquinaria metablica de la clula husped para la replicacin de su material
gentico. En esencia un virus consta de cido nucleico rodeado por una cubierta de
protena, llamada cpsida.
Los bacterifagos son virus de bacterias que presentan todas las

caractersticas de estructura y ciclo vital que presentan los virus animales o vegetales.
Se han descubierto especies de bacterifagos que atacan selectivamente a
prcticamente todas las bacterias importantes conocidas. El bacteriofago Lamba ()
es uno de los bacterifagos ms estudiados de los especficos de E. coli. Infecta la
clula unindose al receptor de la maltosa (protena que permite que la maltosa entre
34
en la clula) y una vez unido inyecta su ADN de cadena doble en la clula bacteriana.
En el interior de la bacteria este ADN puede o bien integrarse en el cromosoma
bacteriano y sus genes quedan reprimidos, o bien se expresar sus genes y sintetizar
nuevos fagos. En el primer caso se habla de ciclo lisognico y en el segundo de ciclo
ltico.
Objetivo
La presencia de virus pasara desapercibida a no ser por el hecho de que son agentes
infecciosos y que se hacen evidentes a travs de los sntomas de las enfermedades
que producen. El objetivo de la prctica consiste en visualizar la presencia de
bacterifagos a travs de las consecuencias de su ciclo infeccioso.
Material
Dos placas de medio phage base precalentadas a 37C.
Dos tubos de vidrio con 300 l de bacterias Staphylococcus aureus 8325-4
competentes diluidas en phage broth.
10 ml de phage top agar a 55 C.
Eppendorf con 200 l del fago 85 diluido en phage broth.
Pipeta automtica
Pipeta de 5 ml estril
Pipeteador automtico
Metodologa
Tomar un tubo con 300 l de clulas competentes y aadirles 200 l de una dilucin
del fago. Mezclar por agitacin. A partir de aqu, hacer lo mismo con el tubo con 300
l de clulas competentes al que no le hemos aadido el fago.
Incubar 30 min a temperatura ambiente.
Aadir 5 ml de phage top agar a 55 C. IMMEDIATAMENTE mezclar y aadir
sobre la placa de phage base precalentada a 37C.
Dejar solidificar y meter en la estufa a 37C.
35
Prctica 10: IDENTIFICACION DE LEVADURAS

Introduccin
Las levaduras son hongos de talo unicelular, capaces de reproducirse
asexualmente por gemacin o fisin. La mayora se reproducen asexualmente por
gemacin polar o multilateral, proceso durante el cual se forma en la periferia de la
clula, una protuberancia (yema) que aumenta de tamao hasta que finalmente se
desprende de la pared celular, constituyendo una nueva levadura. Unas pocas
especies se multiplican por escisin.
Algunas especies pueden formar micelio, y la mayora de ellas fermentan
uno o varios azcares. Intervienen en fermentaciones beneficiosas como la
fabricacin del pan, vino, cerveza y quesos. Tambin pueden intervenir en
alteraciones de zumos y frutas, miel, almbares, jaleas, carnes, vino, cerveza y otros
alimentos.
Su identificacin se basa en criterios morfolgicos y fisiolgicos. En esta
prctica nos centraremos en la identificacin de levaduras siguiendo pruebas
morfolgicas lo que nos permitir aproximarnos al gnero al que pertenecen teniendo
en cuenta que la identificacin definitiva se hace en base a pruebas bioqumicas.
Definimos algunos trminos habituales en micologa.
1. Blastospora: Clula fngica que se forma como consecuencia de un proceso de
gemacin.
2. Clamidospora: Espora esfrica formada en las hifas, ya sea en posicin intercalar
o terminal, de pared gruesa y cuyo dimetro es mayor que el de los filamentos en los
que se forma.
3. Micelio: Conjunto de hifas o filamentos de un hongo.
Las pruebas morfolgicas utilizadas para la identificacin de levaduras son:
Aspecto de las colonias.
Observacin microscpica de los cultivos.
Microscpicamente, es difcil distinguir en cultivos sobre agar las colonias de
levaduras de las bacterianas. La mayor parte son blanquecinas y algunas cremosas o
rosadas.
Objetivos
1. Observar colonias de diferentes especies de levaduras.
2. Poner de manifiesto las principales caractersticas microscpicas de las levaduras,
tales como presencia de micelio, blastosporas y clamidosporas.
36
Material necesario.
1. Cultivos puros en agar Sabouraud de:
Candida pseudotropicalis
Saccharomyces cerevisiae
Realizacin
1. Observar el aspecto de las colonias de las dos especies de levaduras.
2. Inocular las placas de agar Sabouraud. A partir de los cultivos puros se
inoculan las dos levaduras en una misma placa de Sabouraud. Para ello se
toma una pequea parte de una colonia aislada y se realizan estras en una
porcin de la placa. Se incuban las placas durante tres das a temperatura
ambiente.
3. Colocar una gota de agua en un portaobjetos limpio y con el asa de siembra
previamente flameada transferir una pequea cantidad del cultivo en medio
slido a la gota. Remover hasta formar una suspensin homognea. Colocar
un cubreobjetos
4. Observacin microscpica de los cultivos. Se emplear el objetivo X10.
37
Prctica 11: TINCIN DE ESPORAS

Fundamento:
Las especies de los gneros Bacillus y Clostridium tienen la propiedad de
formar endosporas que son formas de resistencia capaces de sobrevivir a altas
temperaturas y medios adversos. Se producen cuando las condiciones ambientales
son desfavorables (agotamiento de los nutrientes, temperaturas extremas, radiaciones,
compuestos txicos, etc.), formndose una espora por cada forma vegetativa. Al
finalizar el proceso de esporognesis, la clula vegetativa se lisa y libera la espora al
exterior. Cuando el ambiente es favorable, la espora germina generando una nueva
forma vegetativa. La capacidad de germinar perdura durante aos. La formacin de
endosporas es un carcter de gran importancia en la biologa de un microorganismo.
La pared celular de la endospora presenta distinto comportamiento que la membrana
bacteriana frente a la tincin, por lo que se utilizan tcnicas especiales de coloracin
con verde malaquita o fucsina bsica (en caliente) como colorantes.
Material:
-Cultivo de Bacillus en medio slido.
-Portaobjetos.
-Asa de siembra.
-Mechero Bunsen.
-Papel de filtro.
-Verde malaquita (solucin acuosa al 2%).
-Safranina.
-Microscopio.
Mtodo:
1. Hacer un frotis de cultivo en medio slido (preferentemente de al menos 48 horas)
de Bacillus sphaericus y Bacillus thuringiensis. Secar al aire y fijar con calor.
2. Colocar el porta sobre un trpode y cubrir la preparacin con papel de filtro de
aproximadamente el mismo tamao que la extensin (tienen por objeto mantener
hmeda la preparacin y evitar que los bordes del porta se manchen de colorante).
3. Aadir la solucin de verde malaquita (solucin acuosa al 2%), calentar con el
mechero nuevamente, sin que llegue a hervir, hasta la emisin de vapores blancos.
38
Continuar calentando durante 5 minutos. Aadir ms colorante si ste se evapora. Es

importante que la muestra no se seque.
4. Lavar con agua intensamente y quitar el papel de filtro.
5. Teir con safranina (como colorante de contraste) durante 1 minuto.
6. Lavar con agua, secar y observar al microscopio con objetivo de inmersin.
Se ver la endospora teida de color verde y las clulas vegetativas de color rojo.
Interpretacin de los resultados:
La posicin y la morfologa de la endospora en el interior de la bacteria
constituyen un carcter taxonmico til para diferenciar especies dentro de un mismo
gnero. Por ejemplo, Bacillus sphaericus posee una endospora esfrica con
localizacin terminal y deformante de la clula vegetativa, por lo que suele ser
denominada en palillo de tambor. Bacillus thuringiensis tiene localizada la
endospora elipsoidal en el centro de la clula vegetativa, lo que provoca un
abombamiento caracterstico denominado en huso.
39
Prctica 12: TINCIN DE CPSULA

Fundamento
La cpsula se puede definir como una estructura superficial que presentan

muchas bacterias en sus ambientes naturales, consistente en una acumulacin de
material mucoso o viscoso, situado externamente respecto de la pared celular.
Las cpsulas se pueden clasificar en funcin del grado de asociacin con
la superficie celular, o por su consistencia:
Cpsula rgida: con suficiente consistencia estructural como para evitar la

entrada de partculas como las de tinta china o nigrosina. Suele tener un
lmite exterior definido.
Cpsula flexible: poca consistencia, de modo que no excluye partculas.
Adems, es deformable y carente de lmites precisos.
Cpsula integral: ntimamente asociada con la superficie celular, con la pared
celular
Cpsula perifrica: asociada a la superficie celular slo en determinadas
condiciones, pero finalmente se dispersa al medio exterior.
Hay una cierta confusin en la nomenclatura de las cpsulas. Por eso cabe destacar
que CPSULAS en sentido estricto son aquellas de tipo rgido e integral. Capas
mucilaginosas son las de tipo flexible y perifrico.
Las cpsulas son estructuras inertes no vivas, carentes de papel activo (metablico)
pero que confieren a las bacterias importantes propiedades:
Adhesin a otras clulas: microcolonias y consorcios
Adhesin a sustratos inertes o vivos: colonizacin de sus nichos

ecolgicos (p. ej. Tejidos de organismos superiores)
Proteccin contra agentes antibacterianos
La estructura es a base de una matriz muy hidratada, con una ordenacin regular
radial, o a veces en lminas concntricas. El material capsular se compone de
40
macromolculas asimtricas que, en muchos casos constan de una serie de unidades

repetitivas: polisacridos o polipptidos.
Material
-
Cepas bacterianas: Klebsiella en medio lquido
Tinta china
Portaobjetos y cubreobjetos
Microscopio ptico
Mtodo
La observacin a microscopa ptica en fresco es difcil, ya que su ndice de
refraccin es similar al del medio. Se recurre a tincin negativa por medio de
nigrosina o tinta china.
1. Colocar una gota del medio con la bacteria en un portaobjetos, aadir una
gota de tinta china y mezclar bien.
2. Colocar suavemente un cubreobjetos sobre la suspensin de clulas con tinta
china. Evitar que se formen burbujas.
3. Colocar los portaobjetos con los cubreobjetos entre dos papeles absorbentes.
Presionar con los dedos sobre el portaobjetos. El exceso de suspensin ser
absorbido por los papeles.
4. Tirar el papel en un contenedor para material contaminado y lavarse las
manos con jabn.
5. Observar al microscopio, se debe de ver la clula teida de negro y la cpsula
en blanco. Trabajar con el diafragma del condensador cerrado para aumentar
el contraste de las clulas.
41
Prctica 13: ANLISIS MICROBIOLGICO DE ALIMENTOS FRESCOSCOCINADOS

Los alimentos son fcilmente colonizados (contaminados), ya sea de forma natural,
en origen o durante el procesamiento y la manipulacin. La multiplicacin de los
microorganismos en el alimento puede implicar desde una alteracin inapreciable
hasta su deterioro completo y puede ser, en cualquier caso, una va de transmisin de
enfermedades. Por lo tanto, el alimento puede ser vehculo de microorganismos
patgenos o de sus toxinas, con riesgo para el consumidor.
En esta prctica nos centraremos en algunas bacterias y hongos que pueden ser causa
tanto de toxiinfecciones, al ser ingeridas por el hombre, como de alteraciones
durante la conservacin del alimento.
13-A:
INVESTIGACIN DE MICROORGANISMOS INDICADORES
13-A-1. Recuento de microorganismos mesfilos totales (NF EN ISO 4833)

La determinacin de este grupo nos da idea de la calidad de la materia prima y del
proceso de elaboracin del producto. Cifras altas en este recuento pueden indicar un
proceso de alteracin del alimento, aunque no necesariamente hay que relacionarlo
con la presencia de grmenes patgenos.
Material
Muestra
Balanza de precisin
Pipetas automticas de 1 y 0,1 ml
Placas de Petri estriles vacas
PCA fundido estril para recuento en placa
Mtodo
1. Aadir con pipetas estriles, a partir de tres de las diluciones decimales (10 -2,
10 -3, 10 -4), 1 ml/placa a una serie de tres placas de Petri vacas estriles.
2. Verter en cada placa unos 20 ml de medio PCA fundido y atemperado a 4550 C.
3. Incubar durante 24 h-72 h a 30 C. Recuento de placas en las que el nmero
de colonias est comprendido entre 30 y 300. Clculo de ufc/gramo.
4. Tincin de Gram de colonias con diferentes morfologas.
42
13-A-2. Recuento de Enterobacteriaceae (NF EN ISO 7402)

Las bacterias pertenecientes a la familia Enerobacteriaceae son bacilos Gram
negativos que se caracterizan por ser:
. Bacilos Gram negativos
. Citocromo c oxidasa negativos
. Fermentadores de la glucosa
. Reductores de nitratos a nitritos
Se aslan del intestino del hombre y de los animales, y su presencia en los alimentos
en niveles altos hace pensar en una elaboracin inadecuada y/o contaminacin
posterior. En esta prctica se hace un recuento de Enterobacteriaceae totales sin
llegar a identificar los gneros.
Material
Muestra
Balanza de precisin
VRBG fundido para recuento en placa
Placas de agar nutritivo
Tubos KIA
Reactivo tetrametil-p-fenilendiamonio
Mtodo
1. Aadir con pipetas estriles, a partir de dos de las diluciones decimales y por
duplicado (10 -2, 10 -3), 1 ml/placa a placas de Petri vacas estriles.
2. Verter en cada placa unos 20 ml de medio VRBG fundido y atemperado a 4550 C (este medio de cultivo no se autoclava).
3. Incubar durante 24 h a 37 C. Recuento de placas en las que el nmero de
colonias est comprendido entre 30 y 300. Las colonias caractersticas son de
color violeta con un halo de precipitacin alrededor.
4. Confirmar las colonias tpicas aisladas mediante pase a agar nutritivo
(incubacin 24h a 37 C) y a partir de ah, realizar la prueba de la oxidasa y
siembra en agar KIA y tincin de Gram. Clculo de ufc/gramo.
13-A-3. Recuento de Mohos y levaduras (NF ISO 7954:1988)

Se investiga la presencia de mohos y levaduras por ser potencialmente productores
de micotoxinas y porque pueden llevar a cabo procesos de alteracin del alimento.
43
En esta prctica se asla en medio selectivo OGA que lleva incorporado el antibitico
oxitetraciclina, el cual inhibe de forma eficaz el crecimiento bacteriano.
Material
Muestra
Balanza de precisin
Placas de Petri con medio OGA
Mtodo
10 -3, 10 -4), 0,1 ml/placa a placas con medio OGA.
2. Incubar durante 5 das a 25 C. Recuento de placas en las que el nmero de
colonias est comprendido entre 30 y 300. Clculo de ufc/gramo.
13-B: DETERMINACIN DE INDICADORES DE FALTA DE HIGIENE
13-B-1. Recuento de coliformes totales en placa (NF ISO 4832,1991)

Los coliformes es un grupo perteneciente a las enterobacterias que adems de
fermentar la glucosa tambin fermenta la lactosa. A este grupo pertenece E. coli que
es un indicador de contaminacin fecal.
Caractersticas estructurales y fisiolgicas de los coliformes:
. Bacilos Gram Negativos
. Citocromo C oxidasa negativos
. Fermentadores de la lactosa
Material
Muestra
Balanza de precisin
Placas de Petri con medio VRBL
Mtodo
10 -3, 10 -4), 1 ml/placa a placas de Petri vacas estriles.
2. Verter en cada placa unos 20 ml de medio VRBL fundido y atemperado a 4550 C (este medio de cultivo no se autoclava).
44
3. Incubar durante 24 horas a 37 C. Recuento de placas en las que el nmero de

colonias est comprendido entre 30 y 300. Tincin de Gram. Clculo de
ufc/gramo.
13-B-2. Investigacin de Escherichia coli Presencia/Ausencia

Escherichia coli pertenece a la familia Enterobacteriaceae y dentro de ella al grupo
coliformes, que se caracteriza por fermentar la lactosa con produccin de cido y gas
a 37C. Adems, esta bacteria es capaz de llevar a cabo dicha fermentacin a 44C.
Es de inters su investigacin en alimentos por ser indicador de contaminacin
fecal, que implica una mala manipulacin del producto.
Caractersticas estructurales y fisiolgicas:
. Fermentadores de la lactosa
. Productores de indol a 44C
Material
Muestra
Balanza de precisin
Tubos con caldo EC con campana
Tubos con caldo de triptona
Reactivo de Kovacs
Mtodo
1. Siembra de 10 ml de muestra (dilucin 10-1) en 10 ml de caldo EC de doble
concentracin con campana, precalentados a 44C.
2. Incubar los tubos 24-48 horas a 44C.
3. Considerar positivos los tubos que presenten al menos un 10% de gas en la
campana.
4. Confirmar los tubos positivos de EC mediante pase de 0,1 ml a tubos con
caldo de triptona, para realizar la prueba del indol. Incubar los tubos a 44C
durante 24-48 horas.
5. Aadir reactivo de Kovacs para revelar la presencia de indol.
45
13-B-3. Recuento de Staphylococcus coagulasa positivos (ISO 6888,1999)

Staphylococcus aureus pertenece a la familia Micrococaceae y es coco Gram
positivo, catalasa positivo y anaerobio facultativo, que se caracteriza por la presencia
de coagulasa (coagula soluciones de plasma). Es un germen ubicuo que se encuentra
en la piel y cavidad nasofarngea del hombre y de numerosas especies animales,
especialmente en las mamas de vacas y ovejas de donde contamina leche y otros
alimentos. Esta bacteria es el agente etiolgico de la intoxicacin estafiloccica,
aunque no todas las cepas de esta especie son enterotoxignicas (capacidad de formar
enterotoxinas).
. Coco Gram positivo
. Aerobio-anaerobio facultativo
. Catalasa positivo
. Coagulasa positivo
. Fermenta el manitol
. Posee enzima lecitinasa
Material
Muestra
Balanza de precisin
Placas de Petri con medio agar Baird Parker
Tubos con caldo BHI y tubos con plasma de conejo/EDTA
Mtodo
10 -3, 10 -4), 0,1 ml/placa a placas con medio Agar Baird Parker.
2. Incubar durante 24-48 horas a 37 C. Recuento de placas en las que el nmero
de colonias est comprendido entre 15-150 (tpicas y no tpicas).
3. Confirmar tres colonias tpicas y 3 no tpicas mediante siembra en caldo BHI.
Incubar los tubos a 37C durante 24 horas.
4. Aadir 0,1 ml a tubos estriles que contienen 0,3 ml de plasma de conejo con
EDTA. Incubar durante 4-6 horas para observar la aparicin del medio
solidificado por la accin del enzima coagulasa
5. Los resultados Staphylococcus coagulasa + se expresan como ufc/g o ml
multiplicando el nmero de colonias confirmadas positivas, por 10 (porque
hemos sembrado 0,1 ml por placa) y por el factor de dilucin.
46
13-C:
INVESTIGACIN DE PATGENOS
Su presencia en los alimentos indica que estos pueden ser causa de toxiinfecciones al
ser ingeridos por el hombre.
13-C-1. Presencia de Salmonella (NF EN ISO 6579,2002)

Salmonella es una enterobacteria patgena causante de importantes trastornos
gastrointestinales, por lo que resulta de inters su investigacin en Microbiologa de
los alimentos. La legislacin espaola actual no admite la presencia de esta bacteria
en los alimentos, por lo que se lleva a cabo un anlisis de presencia o ausencia.
Los animales son el reservorio principal de la enfermedad humana, excepto para las
bacterias responsables de las fiebres tifoidea y paratifoidea en las que el nico
reservorio es el hombre. La manifestacin de la enfermedad puede ser subclnica
(portadores asintomticos) o bien producir cuadros de enteritis, septicemia o fiebre
intestinal.
La transmisin se lleva a cabo por ingestin de alimentos contaminados
(especialmente pollos, huevos y productos lcteos).
Control: Preparacin y refrigeracin adecuadas de los alimentos. Mejora de la
higiene.
. No forman esporas
. Anaerobios facultativos
. Catalasa positivos
. No fermentadores de la lactosa
. Mviles por flagelos peritricos, excepto S. typhi y S. paratyphi.
. Requerimientos nutricionales simples
. No tienen actividad ureasa
. Son lisina y ornitina positivos
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Material
Muestra
Balanza de precisin
Agua de peptona tamponada (BPW)
Placas de Petri con medio XLD
Placas de Petri con medio BGA
Tubos con caldo Mueller Kauffmann tetrationato
Tubos con caldo Rappaport-Vassiliadis Soja
Mtodo
1. Preenriquecimiento: Pesar 25 g del alimento en una bolsa de plstico estril
y aadir 225 ml de agua de peptona tamponada (BPW). Homogeneizar con el
stomacher. Incubar la bolsa 16-18 horas a 37 C.
2. Enriquecimiento en medios lquidos selectivos: Aadir con pipeta estril,
1ml de la muestra preenriquecida a 10 ml de caldo Mueller Kauffmann
tetrationato e incubar a 37 C durante 24 horas. Por separado, aadir 0,1 ml
de la muestra preenriquecida a un tubo con 10 ml de Rappaport-Vassiliadis
Soja en incubarlo a 42 C durante 24 horas.
3. Aislamiento
en
medios
slidos
selectivos:
agitar
los
caldos
de
enriquecimiento y a partir de cada uno de ellos, realizar un agotamiento por

estras en medio selectivos para Salmonella (XLD y BGA). Incubar las placas
a 37C durante 24-48 horas.
Nota: Salmonella crece en XLD formando colonias rosas con centro negro
salmn. En BGA las colonias de Salmonella son rosas transparentes, virando el
medio a un rosa intenso.
4. Confirmacin bioqumica y serolgica: Si se considera conveniente, se
pueden realizar a partir de las colonias presuntivas de Salmonella pruebas
confirmativas bioqumicas y/o serolgicas
13-C-2. Presencia de Listeria monocytogenes (NF EN ISO 11290-1, 1997)

Listeria es una bacteria ubicua que se encuentra principalmente en los pastos, desde
donde contamina vegetales y animales y posteriormente alimentos. Por ser una
bacteria psicotrofa y osmotolerante es capaz de multiplicarse en condiciones en las
que otros microorganismos quedan inhibidos. El gnero Listeria incluye 7 especies,
de las cuales la nica patgena para el hombre el L. monocytogenes.
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. Bacilos Gram positivos

. Oxidasa negativos
. Esculina positivos
. Catalasa positivos
. Mviles
. Sulfhdrico negativos
Las distintas especies se pueden diferenciar por:
. Hemlisis
. Prueba de CAMP
. Produccin de cido a partir de xilosa
. Produccin de cido a partir de ramnosa
Material
Muestra
Balanza de precisin
caldo Fraser demi
caldo Fraser
Placas de Petri con medio Oxford
Placas de Petri con medio Palcam
Mtodo
1. Preenriquecimiento: Pesar 25 g del alimento en una bolsa de plstico estril
y aadir 225 ml de caldo Fraser demi. Homogeneizar con el stomacher.
Incubar la bolsa 24 horas a 30 C.
2. Enriquecimiento en medios lquidos selectivos: Aadir con pipeta estril,
0,1 ml de la muestra preenriquecida a un tubo con 10 ml de caldo Fraser e
incubarlo a 37 C durante 24 horas. Los tubos que contienen Listeria se
ponen de color negro.
3. Aislamiento en medios slidos selectivos: agitar el tubo de Fraser y realizar
un agotamiento por estras en medio selectivos para Listeria (Oxford y
Palcam). Incubar las placas a 37C durante 24-48 horas.
Nota: Listeria crece en Palcam formando colonias pequeas, negras-grisceas,
rodeadas de un halo negro y deprimidas en el centro. En Oxford las colonias de
Listeria son verde grisceas, a veces con centro negro y rodeadas de halo negro y
deprimidas en el centro.
49
4. Confirmacin bioqumica: Para confirmar las colonias sospechosas como

pertenecientes al gnero Listeria, se realizarn las siguientes pruebas:
iluminacin de Henry (positiva), tincin de Gram (bacilo Gram positivo) y
catalasa (positivo). Si las pruebas son positivas continuar la identificacin de
la especie. L. monocytogenes es hemoltica, CAMP positiva, y fermenta la
ramnosa, pero no la xilosa.
50
Prctica 14: RECUENTO DE FORMAS VEGETATIVAS Y ESPORULADAS

Algunas bacterias productoras de esporas (Bacillus, Clostridium) resisten algunos
procesos de conservacin utilizados en la industria alimentaria en los que las formas
vegetativas se destruyen y son causa de alteraciones. Tambin especies de estos
gneros provocan enfermedades alimentarias.
14-A RECUENTO DE FORMAS VEGETATIVAS

Material
Muestra
Balanza de precisin
Pipetas automticas de 1
PCA fundido para recuento en placa
Mtodo
1. Aadir con pipetas estriles, a partir de las diluciones 10 -1 y 10 -2 1 ml/placa a
placas de Petri vacas estriles.
2. Verter en cada placa unos 20 ml de medio PCA fundido y atemperado a 4550 C.
3. Incubar durante 24 h a 37 C. Recuento de placas en las que el nmero de
colonias est comprendido entre 30 y 300. Tincin de Gram y de esporas de
los distintos tipos de colonias.
14-B RECUENTO
DE
FORMAS
ESPORULADAS
ANAEROBIAS
Material
Muestra
Balanza de precisin
Pipetas automticas de 1
PCA fundido para recuento en placa
Medio Schaedler fundido para recuento en placa
Jarra de anaerobiosis
51
AEROBIAS
Mtodo
1. Calentar el tubo de muestra (dilucin 10 -1) a 80 C en el bao durante 10
minutos. Este tratamiento trmico destruye las formas vegetativas pero lo
resisten las esporas.
2. Hacer una dilucin decimal en caldo de peptona del tubo previamente
sometido a calor.
3. Aadir con pipetas estriles, a partir de las diluciones 10 -1 y 10 -2 1 ml/placa a
placas de Petri vacas estriles.
4. Verter en cada placa unos 20 ml de medio PCA fundido y atemperado a 4550 C (para recuento de esporos aerobios) o de medio Schaedler fundido y
atemperado a 45-50 C (para recuento de esporos anaerobios. En este caso
aadir doble capa).
5. Incubar durante 24 h a 37 C. Las placas de anaerobios se incuban en una
jarra de anaerobiosis. Recuento de placas en las que el nmero de colonias
est comprendido entre 30 y 300. Comparacin con el recuento de aerobios
mesfilos. Tincin de Gram y esporas.
52
Prctica 15: ANLISIS MICROBIOLGICO DE LA CONTAMINACIN

AMBIENTAL Y DE MANIPULADORES DE ALIMENTOS
Los microorganismos se encuentran presentes en todos los ambientes: en el aire, en
el agua, en la superficie de los objetos e incluso sobre nuestra piel. Cuando el tema a
tratar es la microbiologa de alimentos, es importante determinar el grado de
contaminacin ambiental, ya que las condiciones higinicas del lugar de trabajo
(utensilios, superficies, etc.) y del propio manipulador van a influir en el nmero y
tipo de microorganismos del alimento.
15-A ANLISIS DEL AIRE

El aire, adems de partculas en suspensin, es portador de bacterias o sus esporas.
Por ello, puede ser causa tanto de contaminacin de alimentos y superficies como de
infecciones en el hombre (patologas respiratorias, etc.). Existen distintos mtodos
para el anlisis del aire: sedimentacin, filtracin, choque en lquidos y precipitacin
electrosttica, entre otros. En esta prctica vamos a explicar el primero, por ser uno
de los mtodos ms empleados. El mtodo de sedimentacin en placa es uno de los
ms sencillos para la determinacin de microorganismos del aire. A pesar de ello, los
resultados obtenidos son orientativos de las cifras de microorganismos presentes en
el aire, ya que estos niveles varan en funcin de las corrientes de aire y del tamao
de las partculas en suspensin.
Material
Placas de PCA
Mtodo
1. Destapar la placa de PCA en el lugar cuyo nivel de contaminacin se desee
examinar durante diferentes intervalos de tiempo: 0,5; 1; 1,5 horas.
2. Tapar las placas e incubar durante 24-48 horas a 37 C.
3. Determinar el nmero de aerobios mesfilos totales ambientales.
15-B ANLISIS DE SUPERFICIES

Para llevar a cabo una correcta manipulacin de los alimentos es necesario mantener
una limpieza adecuada tanto en las superficies de trabajo como en los utensilios que
53
hay que emplear. A no ser que los alimentos hayan sido esterilizados, todos los
productos llevarn microorganismos. En la manipulacin, el envasado y el
almacenaje de los alimentos, estos microorganismos deben mantenerse en todo
momento en niveles que aseguren la calidad microbiolgica del alimento. El objetivo
de los anlisis microbiolgicos de superficies es comprobar el estado higinico del
lugar de trabajo, de modo que evitemos contaminaciones cruzadas durante el
procesado de los alimentos. Existen distintos mtodos para el examen microbiolgico
de las superficies: mtodo del hisopo, de la placa de contacto, de la jeringa de agar,
de la lengeta (o pelcula pegajosa), etc. En esta prctica se describen el mtodo del
hisopo (para el estudio de superficies no planas) y el de placa de contacto Rodac
(para el estudio de superficies planas).
15-B-1. Anlisis de superficies no planas (mtodo del hisopo)

Este sistema es el ms antiguo y el ms utilizado en el examen microbiolgico de
superficies, ya que sirve para el anlisis tanto de superficies planas como no planas.
Es especialmente recomendado para analizar superficies de aparatos y utensilios
(mquinas picadoras de carne, cubiertos, etc.). Adems, se pueden estudiar
superficies muy contaminadas, ya que a partir de la solucin salina estril es posible
realizar las diluciones decimales precisas.
Material
Plantilla de papel de aluminio estril
Hisopo estril
10 ml de solucin salina estril
Placa de PCA y VRBG
Mtodo
1. Delimitar la superficie que se va a analizar mediante una plantilla de papel de
aluminio estril con una abertura de dimensiones conocidas (ej. 9 cm2).
2. Humedecer el hisopo estril en una solucin de 10 ml de solucin salina
estril y restregar varias veces sobre la superficie delimitada por la plantilla.
3. Introducir de nuevo el hisopo en el tubo con solucin salina estril y dejar
durante 15-30 min de manera que los microorganismos se liberen del algodn
al caldo.
4. Sembrar 0,1 ml de dicho caldo en una placa PCA y VRBG.
5. Incubar durante 24-48 horas a 37 C. El resultado se expresa en ufc/9 cm2
54
15-B-2. Anlisis de superficies planas por placas de contacto (RODAC: replicate

organisms direct agar contact)
Material
Placas Rodac
Medio PCA fundido y atemperado a 55C
Mtodo
1. El medio PCA, una vez fundido y atemperado a 55C, se vierte en las placas
de manera que sobresalga del borde de la placa para facilitar el contacto con
la superficie a examinar.
2. Presionar suavemente la placa sobre la superficie elegida.
3. Incubar durante 24-48 horas a 37 C. La superficie delimitada por las placas
es de 25 cm2, por lo que el resultado se expresa en ufc/25 cm2
Nota: el principal inconveniente de este mtodo es su ineficacia en superficies muy
contaminadas y la posibilidad de no recuperar todos los microorganismos presentes
en la superficie. Sin embargo, se obtienen buenos resultados en los casos en los que
la carga microbiana es baja.
15-C ANLISIS DE MANIPULADORES

Un alimento puede estar contaminado en su origen o bien puede ser el manipulador
quien lo contamine durante el procesado. Consideramos normal que el manipulador
tenga una abundante carga microbiana en su piel, pero nunca debern aislarse de ella
bacterias patgenas o que indiquen poca higiene. Por lo tanto, resulta evidente la
necesidad de que el manipulador mantenga unas perfectas condiciones de higiene
durante el procesado de los alimentos. El objeto de un anlisis de manipuladores es
comprobar que la persona que procesa el alimento no es una fuente de contaminacin
de ste. Se pueden estudiar: manos, uas y fosas nasales.
Material
Hisopo estril
Placa de VRBG y Agar Manitol Sal.
Mtodo
1. Para realizar esta prctica el alumno no se lavar las manos. Pasar los dedos
por la mitad de la superficie de una placa de VRBG.
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2. Lavarse las manos con un desinfectante y volver a pasar los dedos por la
mitad restante de la placa.
3. Tomar con un hisopo estril muestra del interior de la nariz y sembrar el
hisopo sobre la placa de Agar Manitol Sal.
4. Incubar durante 24 horas a 37 C.
5. Observar el crecimento de las colonias caractersticas en cada medio de
cultivo: colonias violetas con halo del mismo color en el caso de
Enterobacteriaceae en placas de VRBG y amarillas en el de Staphylococcus
aureus en placas de agar manitol sal (Staphylococcus epidermidis y
Staphylococcus saprophyticus dan lugar a colonias blancas).
56
Prctica 16: UTILIZACIN DE LOS MICROORGANISMOS EN LA

INDUSTRIA ALIMENTARIA
No todos los microorganismos son patgenos o alterantes, sino que algunos de ellos
pueden ser aprovechados por el hombre en la fabricacin de diferentes productos.
ste es el caso de las levaduras que se emplean por ejemplo, en la elaboracin del
pan y bebidas alcohlicas como vino y cerveza. Tambin se utilizan bacterias en la
fabricacin de productos lcteos, embutidos, etc.
El objetivo de esta prctica consiste en comprobar la transformacin que algunos
microorganismos llevan a cabo sobre diferentes materias primas para dar lugar a
productos aprovechables para la alimentacin humana. Se propone la realizacin de
dos tipos de fermentacin que se caracterizan por subproductos finales, de ah los
nombres de fermentacin lctica y fermentacin alcohlica.
16-A PREPARACIN DE YOGUR

La fermentacin lctica es producida por bacterias capaces de transformar azcares
en cido lctico, disminuyendo de tal manera el pH del medio, que impiden el
crecimiento de otros microorganismos. De este modo, la fabricacin de yogur y de
otros productos lcteos fermentados tuvo su origen como un mtodo de conservacin
de la leche. La leche fresca tiene un pH de aproximadamente 6,6. A este pH, la
casena (protena de la leche) est formando una suspensin coloidal de caseinato
clcico. Conforme las bacterias lcticas van fermentando los azcares, con
produccin de cido lctico, el pH disminuye y, al llegar a 4,6 la casena se
desnaturaliza y la leche se coagula formando un producto semislido, que es el
yogur.
Material
2 tubos estriles con 5 ml de leche pasteurizada
yogur comercial
Mtodo
1. Inocular uno de los tubos mediante el asa de siembra con el cultivo iniciador
de la fermentacin procedente de un yogur comercial. El otro tubo no se
inocula y queda como control.
57
2. Incubar los dos tubos durante 16 horas a 46-48 C para favorecer el

crecimiento de estas bacterias, ya que son termfilas. Nota: tambin se
pueden incubar a 37 C durante 24 horas.
3. Comprobar que se ha producido una fermentacin lctica si la leche ha
coagulado en el tubo inoculado. En el tubo control no inoculado se mantienen
las caractersticas iniciales: la leche es lquida.
4. Mediante tincin de Gram se confirma la presencia de bacilos y cocos
responsables de la fermentacin. En el tubo control no se observa ninguna
bacteria.
Fermentacin lctica
16-A PREPARACIN DE CERVEZA

La cerveza es el producto que se obtiene de una fermentacin alcohlica llevada a
cabo por levaduras sobre distintos cereales: cebada, maz, arroz. Estos cereales
contienen almidn que no es fermentable por levaduras, por lo que previamente debe
ser hidrolizado a azcares ms sencillos: glucosa y maltosa. La harina de malta es la
cebada germinada y contiene gran cantidad de amilasas, enzimas responsables de la
hidrlisis del almidn. La activacin de estas enzimas se produce a 75 C, actuando
58
sobre el almidn para romperlo en sus azcares fermentables. De esta forma, la

levadura puede llevar a cabo la fermentacin alcohlica para dar Co2 y etanol.
Material
2 tubos con harina de malta al 5%
Saccharomyces cerevisiae
Mtodo
1. Preparar en un vaso de precipitados una suspensin en agua de harina de
malta al 5%. Es necesario mantener la suspensin en agitacin, ya que la
harina no es perfectamente soluble en agua.
2. Llenar dos tubos de tapn de rosca prcticamente hasta el borde, de manera
que se genere una atmsfera microaerfila.
3. Incubar los dos tubos durante 1 hora a 75 C para que se activen las amilasas
y rompan el almidn.
4. Esterilizar en autoclave a 121 C durante 10 min para eliminar los posibles
microorganismos presentes y asegurar que la fermentacin se debe
nicamente a la levadura.
5. Una vez enfriados los tubos a temperatura ambiente, inocular uno de ellos con
Saccharomyces cerevisiae mientras que el otro tubo no se modifica en
absoluto (tubo control). Nota: el inculo se prepara resuspendiendo 29 mg de
levadura en 1 ml de solucin salina estril.
6. Incubar los dos tubos a temperatura ambiente durante varios das. En funcin
del inculo aadido vara el tiempo necesario para la produccin de la
cerveza.
7. Solamente en el tubo que contiene la levadura se producir la fermentacin
alcohlica, que se visualiza mediante la aparicin de burbujas de CO2. Nota:
la cerveza as obtenida se puede filtrar y beber, aunque su sabor no es el de
una cerveza comercial, ya que no se le ha aadido lpulo.
Fermentacin alcohlica
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PRUEBAS BIOQUMICAS
Prueba de la citocromo c oxidasa: Los citocromos son protenas que forman

parte de algunas cadenas transportadoras de electrones, propias del metabolismo
respirador. Esta prueba permite diferenciar bacterias como por ejemplo
Enterobacterias (carecen del citocromo c) del gnero Pseudomonas (poseen
citocromo c).
Procedimiento: Aadir en un papel unas gotas del colorante tetrametil-pfenilendiamonio (incoloro). Coger con un palillo unas cuantas colonias aisladas
en placa y mezclar con el colorante. El colorante se oxida rpidamente en
presencia del citocromo c produciendo formas coloreadas (azul). Si la prueba es
negativa no habr viraje (conviene utilizar controles positivo y negativo).
Prueba del indol: esta prueba se emplea para detectar la presencia de la enzima
triptofanasa en las bacterias y nos permite distinguir E. coli (indol+) de los otros
coliformes (indol-). Esta enzima degrada el aminocido triptfano a indol, que es
el compuesto que se detecta en este ensayo.
Procedimiento: inocular un caldo de triptona + NaCl al 0,5 % (este digerido de
protenas animales es especialmente rico en triptfano) con una colonia. Incubar a
37 C durante 24 horas. Aadir el reactivo de Kovacs: si se produce un anillo de
color rojo en la superficie del caldo, la prueba ser considerada positiva.
El reactivo de Kovacs contiene p-dimetilaminobenzaldehido, que puede
reaccionar tanto con el indol como con el triptfano, produciendo compuestos de
coloracin
rojiza.
Para
evitar
la
interferencia
del
triptfano,
el
p-
dimetilaminobenzaldehido est disuelto en alcohol isoamlico inmiscible en agua.

A diferencia del triptfano, el indol es soluble en alcohol isoamlico, y por tanto,
slo l reaccionar con el aldehdo produciendo el anillo coloreado.
Galera API 10S: es una galera de varias pruebas bioqumicas simultneas que
identificarn/confirmarn la enterobacteria que hemos aislado del producto
alimenticio.
Procedimiento: Aadir agua a la cmara de incubacin (5 ml aproximadamente).
Coger 5 colonias y resuspender en 5 ml de agua destilada estril (esto da una
turbidez aproximada de 0,5 en la escala de Mc Farland). Rellenar los pocillos del
60
API (no la cpula) con una pipeta Pasteur. El smbolo significa que el pocillo ha
de llenarse hasta arriba. El signo _ significa que hay que poner vaselina en la
cpula del pocillo. Incubar a 37 C durante 24 horas.
Lectura del API: hay que apuntar en una plantilla en qu pocillos la prueba
correspondiente ha sido positiva o negativa (esto se sabe porque ha habido un
cambio de color, la aparicin de un precipitado, etc.). La prueba de indol y la de
fenilalanina
necesitan reactivos apropiados
(Kovacs y
cloruro
frrico
respectivamente). Una vez reveladas las pruebas hay que sumar los nmeros que
hay debajo de los pocillos positivos en la plantilla. Como stos se encuentran
agrupados de tres en tres, finalmente obtenemos una serie de nmeros o cdigo
que nos permitir identificar la bacteria.
Prueba de CAMP: Permite distinguir la especie de Listeria que hemos aislado,

ya que L. monocytogenes potencia la -hemlisis producida por S. aureus,
mientras que L. innocua no.
Procedimiento: sembrar en una placa de agar sangre una estra vertical de una
cepa beta-hemoltica de S. aureus. En una de las dos mitades, sembrar las cepas
control de dentro hacia fuera (sin llegar a tocar la estra central) en dos estras
perpendiculares a la estra de S. aureus. En la otra mitad, sembrar una estra de la
muestra. Incubar a 37 C durante 24 horas. Si la cepa aislada es CAMP positiva,
se observar una potenciacin de la hemlisis en la zona de interseccin, con
forma en punta de flecha.
61

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