PRCTICA 20: ANLISIS DE SECUENCIAS

Ana Paulina Arvalo J. Rooselveth Andrs Samaniego.

TIPO: Terica

OBJETIVO:

Estudiar polimorfismos y su asociacin a enfermedades.

ACTIVIDADES:

Realizar bsqueda de informacin e identificacin de polimorfismos
asociados a enfermedades en las bases de datos especializadas.
Analizar secuencias e identificar los polimorfismos de inters, asignar el
genotipo a cada muestra y calcular las frecuencias allica y genotpica.
Calcular el equilibrio de Hardy-Weinberg.

INTRODUCCIN:

El genoma o secuencia completa de ADN de un organismo constituye la
informacin gentica heredable del ncleo celular, los plsmidos, la
mitocondria y cloroplastos. Secuenciar es determinar el orden en que se
enlazan las bases de dicha secuencia.

Los tremendos avances de las tcnicas de secuenciacin del ADN
permiten hoy en da leer el ADN a gran velocidad lo que ha llevado a
abordar proyectos a gran escala. La importancia del anlisis de una
secuencia de ADN es su uso en la deteccin de mutaciones, anlisis de
ADN fsiles, diagnstico de enfermedades genticas, identificacin de
especies, investigacin forense, anlisis de paternidad, entre otras.

Se conocen muchas enfermedades determinadas genticamente por
mutaciones o variantes denominadas de alta penetrancia, ya que los
portadores de la variante suelen manifestar la enfermedad con una alta
probabilidad. Estas variantes presentan baja frecuencia en la poblacin
general. En la actualidad ha crecido el inters en el estudio de los
polimorfismos de baja penetrancia, es decir aquellos que se dan en la
poblacin con mayor frecuencia y que influyen en el riesgo de padecer
una enfermedad, pero con baja probabilidad. Tambin se les denomina
variantes que confieren susceptibilidad gentica a la enfermedad, y para
que dicha variante gentica se exprese a menudo es necesaria una
exposicin.

Los estudios moleculares especficos por su parte pueden poner de
manifiesto si los polimorfismos son funcionales, y los estudios
epidemiolgicos son fundamentales para valorar si hay efectos en la salud
de la poblacin. En este sentido se han planteado varias metodologas
para el anlisis de los polimorfismos genticos como herramienta para
identificar genes que confieren susceptibilidad a presentar enfermedades.

MATERIALES Y MTODOS:

EQUIPO

- Computadora (conexin a internet)

DATOS

- Secuencias.

METODOLOGA

1. En las bases de datos especializadas identificar el polimorfismo de
estudio. Este punto es importante para conocer la ubicacin exacta
del polimorfismo a analizar y poder identificarlo posteriormente en sus
muestras. Los datos del polimorfismo sern proporcionados por el
tutor de la prctica. (ver Anexo 1)
2. Analizar las secuencias problema entregadas por el tutor e identificar
el polimorfismo de inters. Puede utilizar los programas disponibles en
la web: Codon Code Aligner, BioEdit, etc. (ver Anexo 2)
3. Asignar el genotipo de cada muestra. (ver Anexo 3)
4. Calcular las frecuencias allica y genotpica. (revisar prctica 19)
5. Calcular el equilibrio de Hardy-Weinberg y el OR con los datos
obtenidos en el paso anterior y los que sern proporcionados por el
tutor. (ver Anexo 4)

REPORTE DE LA PRCTICA:

RESULTADOS

Elaborar el reporte con la informacin obtenida acerca del polimorfismo.
Elaborar una tabla donde indique los genotipos, y el nmero de cada uno
de ellos.
Indicar las frecuencias genotpicas y allicas.
Indicar si existe o no equilibrio de Hardy-Weinberg.


DISCUSIN Y CONCLUSIONES


CUESTIONARIO:

1. En qu consiste el mtodo Sanger de secuenciacin del ADN?

2. Qu es el equilibrio de Hardy-Weinberg? Importancia de su
determinacin.


ANEXOS


ANEXO 1

IDENTIFICACN DE POLIMORFISMOS

La base de datos Ensembl ofrece una opcin sencilla de identificacin de
polimorfismos en la secuencia de un gen.

Segn el procedimiento Cmo descargar la secuencia de un gen en
Ensembl de la prctica 17 revise la secuencia del gen de inters. En este
ejemplo se realizar la identificacin del polimorfismo rs9282541 del gen
ABCA1.

Si la secuencia del gen se muestra como en la imagen siguiente debe
configurar la pgina para que se muestren las variantes genticas.



En el men de la izquierda seleccionar Configure this page, y se abrir una
ventana.



En la pestaa desplegable de la opcin Show variations, seleccionar Yes
and show links y aceptar en el visto de la parte superior derecha. La
pgina se actualizar y mostrar las variaciones marcadas con colores en
la secuencia del gen. En los links de la derecha encontrar informacin
sobre cada variante.




Para facilitar la identificacin del polimorfismo de este ejemplo se coloc
en el buscador de la pgina el nombre (rs9282541).



En este caso el polimorfismo de inters es el segundo de la lnea, denotado
por la letra Y. Esta variante corresponde al cambio de una C por una T
(esta informacin la obtiene al colocar el puntero sobre el polimorfismo), y
si da clic obtendr ms informacin sobre el polimorfismo sobre los
fenotipos asociados, los cambios en la protena y las frecuencias
reportadas segn grupos poblacionales.





Para facilitar los pasos siguientes de la prctica, copie el fragmento de la
secuencia donde se ubica el polimorfismo en estudio (sealado con el
crculo rojo).



ANEXO 2

ANLISIS DE SECUENCIAS

Existen varios programas disponibles en la web para analizar secuencias. En
este caso se utilizar BioEdit. En el siguiente link encontrar los archivos de
descarga e instalacin del programa en su computador
http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html

Ahora podr abrir los archivos de secuencias entregadas por el tutor.



Como usted conoce la posicin del polimorfismo podr identificar cual es
la base que corresponde al cambio estudiado (la secuencia mostrada a
continuacin presenta C, y se trata de un homocigoto C/C).











ANEXO 3

COMO ASIGNAR EL GENOTIPO

Previa a la asignacin del genotipo por secuenciacin se debe tener claro
lo siguiente:

El termino genotipo se usa cuando nos vamos a referir a un gen en
particular y a su combinacin de alelos (EE, Ee o ee). Cuando un genotipo
est constituido por dos alelos idnticos (EE o ee) se dice que el individuo
es homocigoto; cuando los alelos son diferentes (Ee) se usa el trmino
heterocigoto.

En la secuencia cada nucletido est identificado por un color (A, G, C, T).

Para este ejemplo se utiliza el polimorfismo rs2230806 del gen ABCA1. Las
grficas siguientes muestras dos secuencias homocigotas. En el primer caso
se trata de un homocigoto par el alelo de referencia (G), el segundo es un
homocigoto para el alelo alternativo (A).





En un heterocigoto se observa la presencia de dos picos (G, A) en la misma
posicin.


Por lo tanto el genotipo para estos tres casos sera: G/G, A/A y G/A,
respectivamente.

ANEXO 4

CLCULO DEL EQUILIBRIO DE HARDY WEINBERG Y OR

El programa SNPstats (http://bioinfo.iconcologia.net/SNPstats_web) es una
herramienta desarrollada para el estudio de polimorfismos. Este programa
permite realizar el clculo de las frecuencias allicas, genotpicas, el
equilibrio de Hardy Weinberg, adems, permite realizar anlisis de
asociacin entre el polimorfismo y una variable de respuesta.

Paso 1: datos. La base de datos para el anlisis ser entregada por su tutor
de prctica. Ingresarla segn las indicaciones del programa
(http://bioinfo.iconcologia.net/snpstats/start.htm).

Paso 2: pre-procesado de datos. Seleccionar en la pantalla cul es la
variable de respuesta, el polimorfismo a analizar y las variables de ajuste
segn considere.



Paso 3: Procesamiento de datos. En la pantalla seleccionar los parmetros
a calcular.



Paso 4: Resultados. Los resultados deben indicarse y comentarse en el
reporte de la prctica. Revisar el tutorial del programa.




REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS:

1. Iniesta, R., Guin, E. & Moreno, V. Anlisis estadstico de polimorfismos
genticos en estudios epidemiolgicos. Gaceta Sanitaria 19, 333341
(2005).
2. Trelles, O. Secuenciacin del ADN. at http://ocw.unia.es/ciencias-de-
la-vida/bioinformatica-basica/materiales/bloque-4/04-1-Sequencing-
1-2_Lectura del ADN de los organismos.pdf
3. Manual de secuenciacin. 115 at
<http://www.uco.es/servicios/scai/impresos/GEN/Manual de
Secuenciacion.pdf>