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RESUMEN
Con la finalidad de inducir la formacin de callos, embriones somticos y regeneracin
de plntulas a partir de anteras de onoto, Bixa orellana L., se tomaron botones florales
mayores de 0,7 cm, con granos de polen uninucleados de 19 genotipos del campo
experimental del Instituto de Agronoma, Universidad Central de Venezuela. Las
anteras fueron sometidas a cinco regmenes de temperatura (8 C durante 0, 2, 4, 6 y
8 das) removidas aspticamente. Se evalu el efecto de tres medios de cultivo:
Murashige Skoog (MS) Nitsch y Nitsch y B5, con diferentes combinaciones de
reguladores de crecimiento: cido naftalenactico (ANA), Kinetina (Kin), 2,4dichlorophenoxiactico (2,4-D), Picloram (Pic), cido indolbutrico (AIB), 6bencilaminopurina (BA) y Thidiazuron (TDZ) solos o en combinacin, probndose
condiciones de iluminacin y oscuridad para cada tratamiento. En los casos donde se
utilizaron las sales MS suplementado con 4 mg l -1 de ANA y 2 mg l-1 de BA, bajo
oscuridad y a una temperatura de 30 1 C, para los genotipos identificados como
G1, 41 e I, se indujo la formacin de embriones somticos. No se observaron
diferencias en la respuesta de los tratamientos a cinco regmenes de temperatura. Por
otra parte, la germinacin de embriones hasta el desarrollo de plntulas se logr en el
medio MS, sacarosa (20 g l-1), sin regulador de crecimiento. El protocolo obtenido
permiti la regeneracin eficiente de plntulas mediante la embriognesis somtica a
partir de cultivo de anteras.
Palabras Clave: Antera; Bixa orellana; cultivo in vitro; embriognesis somtica;
embrin.
INTRODUCCIN
El onoto, Bixa orellana L., es una especie leosa tropical originaria de la cuenca
Amaznica con un amplio margen de adaptacin a suelos y climas tropicales (Smith y
Schultes, 1990). Presenta una gran variedad de usos como colorante natural y es
utilizado por empresas procesadoras de alimentos, cosmticos y ungentos, pues
resulta inofensivo para el consumo y aplicaciones en la piel (Arce, 1990).
Por ser una planta algama, surge el inconveniente de una amplia variabilidad en la
descendencia y en consecuencia desuniformidad al tiempo de la cosecha, en los
rendimientos y en la calidad del producto comercial. El uso de un programa de
Origen
25,37
26
G1, G6, G8, 21, 29, I
7, 8, 9, 10, 18
30, 40
Gurico
Mrida
Aragua
Sucre
Cojedes
35
41
44
Carabobo
Portuguesa
Nueva Esparta
Medios de cultivo
Para inducir la formacin de callo embriognico (medio I) se evalu el efecto de tres
medios de cultivo, a saber: MS (Murashige y Skoog, 1962), Nitsch y Nitsch (1969) y
B5 (Gamborg et al., 1968), suplementado con myo-inositol (100 mg l-1), tiamina-HCl
(0,1 mg l-1), cido nicotnico (0,5 mg l-1), piridoxina (0,5 mg l-1), casena hidrolizada
(250 mg l-1), sacarosa (20 a 160 g l-1), pH ajustado a 5,8 2 y solidificado con
Phytagel (2,5 g l-1). Asimismo, diferentes combinaciones de reguladores de
crecimiento: cido naftalenactico (ANA), Kinetina (Kin), 2,4-dichlorophenoxiactico
(2,4-D), Picloram (Pic), cido indolbutrico (AIB), 6-bencilaminopurina (BA) y
Thidiazuron (TDZ), observados en el Cuadro 2. Adicionalmente, se probaron tres
tiempos de cultivo en el medio I (21, 28 y 42 d), para determinar el tiempo ptimo de
induccin de callo embriognico.
Posteriormente, los callos embriognicos formados fueron transferidos a un medio de
induccin de embriones (medio II). El medio estuvo compuesto por las sales MS,
suplementado con myo-inositol (100 mg l-1), tiamina-HCl (0,1 mg l-1), cido nicotnico
(0,5 mg l-1), piridoxina (0,5 mg l-1), casena hidrolizada (250 mg l-1), sacarosa (60 g l1
), pH ajustado a 5,8 2 y solidificado con Phytagel (2,5 g l -1). Se probaron los
siguientes reguladores de crecimiento: BA (0,1 y 4,0 mg l -1), 2-ip (0,1 y 4,0 mg l-1),
Kin (0,1 y 4,0 mg l-1) y medio bsico.
Una vez que ocurri la formacin de embriones en el medio II (a los dos meses de
cultivo aproximadamente), se seleccionaron aquellos que estuvieran en estado globular
transfirindose individualmente a un medio sin reguladores (medio III). El mismo
estuvo conformado por las sales MS y vitaminas, suplementado con sacarosa (20 g l -1),
ajustando el pH a 5,8 2. La transferencia a medio fresco se mantuvo durante ocho
meses con subcultivos en el mismo medio cada 60 d, para un total de cuatro
subcultivos.
Los embriones en estado de torpedo y cotiledonar obtenidos en el medio III fueron
colocados en un medio de germinacin de embriones (medio IV) que contena las sales
MS y vitaminas (a la mitad de su concentracin), sacarosa (20 g l -1) y pH ajustado a
5,8 2; probndose tres reguladores de crecimiento, combinados de la siguiente
forma: AIB (0,1 y 1,0 mg l-1) + BA (0,1y 1,0 mg l-1); AIA (0,1 y 1,0 mg l-1) + BA (0,1
y 1,0 mg l-1) y AIB (0,1 mg l-1) solo y medio bsico sin regulador de crecimiento.
Cuadro 2. Composicin del medio de cultivo utilizado para la
induccin de callo embriognico a partir de anteras de onoto.
Reguladores de crecimiento (mg l-1)
Medio
.
..
.
.
ANA
BA
AIB
AIA
TDZ
Kim
2,4-d
Pic
4
..
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1
2
..
.
2
.
..
3
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0,1
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Murashige
y Skoog
(1962)
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Gamborg
et. al.
(1968)
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1
5
5
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4
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6
2
6
2
3
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2
6
2
6
1,5
3
1,5
3
1,5
3
2
4
2
4
.
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4
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0
0,5.
1,5
3
0
0,5
1,5
3
.
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3
3
4
4
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1,5
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0,5
0,5
1
1
1,5
1,5
3
3
4
4
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0,5
0,5
0,5
0,5
1,5
1,5
1,5
1,5
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1
0,5
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1
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Siembra
Con la ayuda de un bistur y agujas de diseccin se eliminaron los filamentos del
androceo sembrando las anteras, bien sea completas o separadas (tecas), en cpsulas
de Petri que contenan 30 ml de medio. Cada cpsula contaba con 10 explantes e igual
cantidad de repeticiones. Ambos tipos de explantes fueron incubados en los medios de
cultivo (medio I), colocados en diferentes cmaras de crecimiento bajo iluminacin (32
mol m2s-1 con un fotoperodo de 12 horas y 23 3 C) y de oscuridad a 30 1 C.
La induccin de los embriones somticos, transferencia y germinacin (medios II, III y
IV) se llev a cabo bajo condiciones de iluminacin de 32,5 mol m-2 s-1 con un
fotoperodo de 12 h, temperaturas en un rango entre 20 y 27 C y una humedad
relativa de 60 a 70%.
Fueron evaluados aspectos cualitativos y cuantitativos: dentro de las variables
cualitativas se consider la textura, color y forma de los callos, tambin la descripcin
morfolgica de los embriones y plntulas tanto normales como anormales. Dentro de
las variables cuantitativas se evalu el nmero de anteras que produjeron callos
(porcentaje de eficiencia), el nmero de embriones en estado globular, torpedo y
cotiledonar, tambin el nmero de embriones normales y anormales y el nmero de
plntulas obtenidas a partir de los embriones somticos.
RESULTADOS Y DISCUSIN
Tiempo en
medio de
induccin de
callo
(das)
Embriones normales
Subcultivo
21
(183 normales
24 anormales)
1
2
3
4
40
31
8
28
(239 normales
54 anormales)
1
2
3
4
42
45
9
Globular Torpedo
(g)
(t)
Cotiledonar
Total
(c)
16
16
1
37
.
8
21
35
10
Embriones
anormales
16
2
4
12
72
49
5
57
20
4
5
39
8
17
55
105
43
36
41
13
-
Total (t + c) = 247
Por otra parte, las incompletas, fueron de dos tipos, 14 con presencia del eje caulinar
sin formacin de races, con una longitud promedio de 2,25 cm y 3 hojas (Figura 5c) y
28 con formacin de raz principal sin el eje caulinar promedio de 3,75 cm de largo
(Figura 5d, e). La falta de un meristema apical y un polo radicular es comn en los
embriones somticos, tanto en dicotiledneas como en monocotiledneas (Barwale et
al., 1986) y ello est asociado con una supresin del desarrollo (Goebel-Tourand et
al.,1993).