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APROVECHAMIENTO DE LAS CASCARAS DE MANGO COMO SOPORTE PARA LA PRODUCCIN DE POLISACARIDASAS Jos Juan Buenrostro-Figueroa1, Heliodoro de la Garza-Toledo1, Vrani Ibarra Junquera2 y Cristbal No Aguilar1*.
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Depto. De Investigacin en Alimentos. Facultad De Ciencias Qumicas. Universidad Autnoma de Coahuila. Bvd. Venustiano Carranza, 25000. Saltillo, Coahuila. 2 Facultad de Ciencias Qumicas. Universidad de Colima. Coquimatln, Colima. *Correo electrnico: cristobal.aguilar@mail.uadec.mx

RESUMEN En nuestro pas, el tratamiento adecuado de residuos agroindustriales puede evitar serios problemas de contaminacin. En este estudio se evalu la capacidad de produccin de un complejo enzimtico capaz de degradar los componentes celulares de cscaras de mango a partir de fermentacin en medio slido con el hongo Trichoderma T-II, usando como soporte y fuente de nutrientes cscaras de mango. Se encontr una alta actividad celulasa (7552.5382.14 unidades de endoglucanasa por litro) y, en menor proporcin, poligalacturonasa (1434.71258.18 unidades de poligalaturonasa por litro), debido a la composicin del soporte. Se observ una inhibicin en la actividad enzimtica por efecto de la sntesis de celobiosa y glucosa. El complejo enzimtico obtenido representa una alternativa en el aprovechamiento integral del fruto y puede ser empleado en el tratamiento enzimtico de pulpas de frutas. Palabras claves: Trichoderma, fermentacin medio slido, enzimas hidrliticas, cscara de mango. INTRODUCCIN El mango (Mangfera indica L.) es considerado uno de los frutos tropicales ms importantes a nivel mundial con una produccin superior a 31 millones de toneladas en 2007 (FAOSTAT; 2009). De acuerdo a Larrauri et al. (1996) el 35-60% del peso total del fruto corresponde a los productos de la transformacin, y son considerados un problema de eliminacin grave, principalmente la cscara (Ajila et al., 2010). En los ltimos aos se han buscado alternativas de produccin agrcola sustentable que permitan el aprovechamiento de los residuos agroindustriales. Recientemente se han encontrado reportes sobre el uso de cscaras para la produccin de biogs (Mahadevaswamy & Venkataraman, 1990 y Madhukara et al,. 1993), como fuente de compuestos bioactivos como polifenoles, carotenoides, vitaminas y fibra dietaria (Larrauri et al., 1997; Ajila et al., 2007). Asimismo, se ha incorporado en alimentos como fuente de fibra (Ajila et al., 2010) y evaluado su capacidad anticancergena (Kim et al., 2009). Sin embargo, existe poca informacin relacionada con el uso de cscaras de mango como fuente de inductores de enzimas industriales de la fermentacin de hongos. Mediante el uso de procesos de fermentacin es posible la produccin de compuestos de valor agregado. En este tipo de fermentacin los residuos son utilizados como fuente de carbono-energa (Pandey et al., 2000). La fermentacin con hongos se puede realizar mediante medio lquido (SmF) y medio slido (SSF). La SSF se caracteriza por que el microorganismo crece en una matriz slida en la ausencia o casi ausencia de agua libre en el sistema (Singhania et al., 2009). Debido a que la composicin del complejo enzimtico producido por la fermentacin de hongos, depende fuertemente de la lignocelulosa utilizada como sustrato, los microorganismos y las condiciones de cultivo (Uhlig, 1998 y Ovadn-Chacn & Waliszewski, 1998), existen reportes que describen la utilidad de la SSF al alcanzar un nivel especfico en la produccin de ciertas enzimas hidrolticas (Viniegra-Gonzlez et al., 2003; Dos Santos et al., 2004; Rodrguez & Sanromn, 2006 & Aguilar et al., 2008), tales como pectinasas, hemicelulasas y celulasas, necesarias para una hidrlisis enzimtica efectiva de residuos agroindustriales (de Siqueira et al., 2010). Las pectinasas son un grupo heterogneo de enzimas que hidrolizan las sustancias pcticas. Jayani et al. (2005) reportan una clasificacin de tal forma: protopectinasas, polygalatunosas, lyasas y pectinesterasas. Las enzimas pectonolticas pueden ser usadas en el tratamiento de residuos agrcolas y en la extraccin de jugos y su clarificacin.

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La celulosa y la hemicelulosa son los principales polisacridos de la pared celular de las plantas, y pueden ser fcilmente degradados a azcares fermentables por enzimas secretadas por hongos filamentosos (Rodrguez & Pieros, 2007), principalmente del gnero Aspergillus y Trichoderma, siendo el ltimo el ms estudiado (Agamez et al., 2008). Las enzimas celulolticas son un sistema complejo de enzimas compuesto de exo--1,4-glucanasas (EC 3.2.1.91), endo--1,4-glucanasas (EC 3.2.1.4) y -glucosidasas (EC 3.2.1.21), que acta sinrgicamente para degradar el sustrato de celulosa y otros oligosacridos a glucosa (Faria et al., 2008 & Briwani et al., 2010). De esta forma se obtienen azcares que pueden ser utilizados para la produccin de etanol.

MATERIALES Y MTODOS Microorganismos Se emple una cepa de Trichoderma sp. proporcionada por el CISEF, denominada Trichoderma II (Coleccin DIA-UAdeC), la cual se encontraba en una solucin crioprotectora (mezcla de glicerol al 10 % y leche descremada al 9 %, v/v) a -55 C. Se tomaron 50 L de la cepa almacenada y se inocularon en matraces Erlenmeyer con 50 mL de agar dextrosa papa (PDA) preparado previamente. Se procedi a incubar durante 3 das a 30 C. Transcurrido el tiempo se observ la produccin de esporas, las cuales se cosecharon con 20 mL de una solucin de Tween 80 al 0.01 % y se hizo el conteo en una cmara de Neubauer. Obtencin de la cscara de mango Las cscaras fueron obtenidas de frutos de mango comprados en un mercado local de la ciudad de Saltillo, Coahuila, Mx. Los frutos fueron lavados, pelados, cortados, y la cscara se deshidrat a 60 C durante 72 horas, hasta observar un peso constante en las muestras. Las cscaras deshidratadas fueron pulverizados en un molino (TURBOMIX-Moulinex), posteriormente se tamizaron por una malla de 0.038 mm para obtener un tamao de partcula uniforme. Se llevaron a cabo anlisis de fibra detergente neutra y cida por el mtodo de Van Soest (Van Soest & Wine, 1968; Van Soest, 1987). Condiciones de cultivo Para la produccin del complejo enzimtico se utiliz fermentacin en estado slido (SSF). La composicin del medio de cultivo usado se describe a continuacin [g/L]: (NH4) 2SO4 [4,38], MgSO4 7H2O [0,44], CaCl2 7H2O [0,044], MnCl2 6H2O [0,009], NaMoO4 2H2O [0,004] y FeSO4 7H2O [0,06]. El pH del medio de cultivo se ajusto a 5.5. La fuente de carbono e inductor empleada fue cscara de mango (CM) en polvo. Los reactores fueron matraces Erlenmeyer de 250 mL, a los cuales se le vertieron 3 g de soporte (CM) por cada 7 mL de medio de cultivo, obteniendo de esta manera una humedad inicial del 70%. Posteriormente se les inocul 1.2x108 esporas/mL y se incubaron a 30 C durante 48 h. Al final del tiempo de fermentacin, se aadieron 11 mL de agua destilada a cada biorreactor, se agit y filtr con algodn. Despus de esto el extracto se filtr con membranas Millipore de 0.45 m para eliminar las impurezas, clulas o esporas de hongo. El sistema fue evaluado por triplicado. Concentracin de extractos crudos La concentracin de los extractos enzimticos se realiz con membranas de dilisis con un tamao de poro de 10 Kda (Sigma), sobre una charola con polietilenglicol 6000 a 4 C durante 24 h, girando la membrana continuamente para que estuviera en contacto toda la superficie con el polietilenglicol. Consumido el tiempo, los extractos concentrados fueron transferidos a tubos de 1.5 mL y se almacenaron en refrigeracin para el anlisis de la actividad enzimtica y el contenido de protenas. Actividad enzimtica Las actividades celulasa y poligalcturonasa se determinaron despus de la liberacin de azcares reductores con el mtodo reportado por Somogy (1952) y modificado por Nelson (1994), En tubos de ensaye se prepararon las siguientes soluciones, para medir la actividad endo--1,4 glucanasa: blanco de muestra (200 L de sustrato (Carboximetilcelulosa) ms 50 L de buffer de citratos 0.05M (pH=5); mezcla de reaccin (200 L de sustrato + 50 L de extracto enzimtico) y buffer citratos como control. Se midi por absorbancia a 660 nm. Para el ensayo de la actividad poligalacturonasa se us como sustrato cido poligalacturnico, Una unidad enzimtica se considera como la cantidad de enzima capaz de liberar 1 mol de azcares reductores por minuto en condiciones de ensayo. Determinacin de protena extracelular El contenido de protena soluble presente en el extracto dializado se evalu de acuerdo al mtodo de Bradford (1976), colocando en tubos de ensaye 500 L de muestra, a los cuales se les agreg 500 L de reactivo de Bradford. La mezcla se dej reposar durante 20 min y se procedi a leer las muestras en un espectrofotmetro UV-Visible a 595 nm, usando albmina srica bovina como referencia.

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RESULTADOS En este trabajo, una cepa de Trichoderma fue cultiva bajo condiciones de SSF para la produccin de un complejo enzimtico, utilizando CM como fuente de carbono e inductores. En el cuadro 1 se presenta el contenido de polisacridos presentes en la cscara de mango var. Haden. Cuadro 1. Contenido de Polisacridos presentes en cscara de mango Componente Contenido (%) FDN 16.710.09 FDA 13.540.14 Lignina 1.340.21 Celulosa 9.810.12 FDN= Fibra detergente neutra FDA= Fibra detergente cida Media de tres repeticiones error estndar Los valores de fibra obtenidos son similares a los reportados en estudio similar con mango obbo (16.36%) (Snchez-Guzmn, 2007). En cuanto al contenido de celulosa (9.810.12) se mostr ms bajo comparado con el reportado por Meja-Giraldo et al (2007) de 14.21%, encontrado en cscara y residuos de pulpa, lo que permite suponer el valor de celulosa mayor. Sin embargo, es posible apreciar que el contenido de fibra es alto, lo que hace que sea un material de excelentes condiciones para la obtencin de metabolitos de inters. En el cuadro 2 se muestran los valores de actividad enzimtica encontrados en el extracto crudo. Cuadro 2. Actividad celulasa y poligalacturonasa de extracto de SSF con Trichoderma T-II Enzima Expresin enzimtica (U/L) Celulasa (endoglucanasa) Poligalacturonasa 7552.5382.14 1434.71258.18

Media de tres repeticiones error estndar Los resultados obtenidos demuestran que el hongo Trichoderma T=II fue capaz de reproducirse, crecer y producir un complejo enzimtico para degradar la pared celular de las cscaras de mango. Estudios recientes han descrito la produccin de complejos enzimticos con actividad celulasa y poligalaturonasa, a partir de cscara de palma (Rodrguez & Pieros, 2007), aserrn (Campos et al., 2001), cscaras de arroz (Agamez-Ramos et al., 2008), cscara de manzana, mandarina y pltano (Elisashvili et al., 2008). Los valores expresados de actividad celulasa son superiores a los de actividad poligalacturonasa, debido a la composicin de las cscaras de mango, lo que induce al hongo a producir celulasas en mayor cantidad y de la misma forma inhibe a la produccin de poligalacturonasas. Las condiciones empleadas en la fermentacin son similares a las usadas por Latifian et al. (2007), quienes reportan que usando una cepa del gnero Trichoderma en SSF a pH 5, una humedad del 70 %, 30% de slidos y a 30 C se obtiene la mayor actividad enzimtica. En un trabajo similar usando como sustrato cscaras de mango adicionado con diferentes concentraciones de celobiosa en SSF, Couri et al (2000) encontraron que al adicionar 0.2 % de celobiosa se present un incremento en la actividad celulasa de 1400 a 2780 U/L, mientras que la actividad poligalacturonasa no present cambios significativos, despus de 72 h de fermentacin. Sukumaran et al (2009) report actividades endoglucanasas de 45,220 y 196,150 U/L utilizando T. reesei RUT C30 y Aspergillus niger MTCC 7956, respectivamente, ambas cultivadas en salvado de trigo. Faria et al (2008) reportaron valores de 1533 U/L, usando pasta de celulosa de eucalipto fermentado con Echinolatum Penicillium. En la produccin de poligalacturonasa usando como inductor una mezcla de bagazo de naranja y fibra de trigo, Silva et al. (2005) reportan valores de 89 U/L, a una humedad inicial del 70% usando Penicillium viridicatum RFC3. En un anlisis del efecto del tiempo de reaccin sobre la expresin enzimtica poligalacturonasa, los resultados se muestran en el cuadro 3.

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Cuadro 3. Efecto del tiempo de reaccin en la expresin enzimtica poligalacturonasa Tiempo (h) Act. Poligalacturonasa (U/L) 0 60 120 180 0 1434.71258.18 379.08121.50 234.8225.31

Es posible apreciar que la mayor actividad poligalacturonasa es expresada a los 60 min de reaccin, a medida que pasa el tiempo, la expresin enzimtica sufre una cada hasta llegar a los 234.82 U/L, a los 180 min. Lo anterior puede ser ocasionado a la sntesis de celobiosa y glucosa ejercida por la accin de las celulasas presentes en el extracto, que provoca una inhibicin en la actividad enzimtica (Andri et al., 2010). CONCLUSIONES Es posible producir un complejo enzimtico celuloltico a partir del hongo Trichoderma II por SSF con alta actividad endoglucanasa y poligalacturonasa, utilizando como fuente de carbono e inductor cscaras de mango, otorgndole de esta manera una alternativa ms para el aprovechamiento integral de este fruto. AGRADECIMIENTOS En este presente trabajo se cont con el apoyo del Departamento de Investigacin en Alimentos de la Universidad Autnoma de Coahuila. Gracias al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologa (CONACYT) por la beca de estudiante de postgrado a Buenrostro-Figueroa. REFERENCIAS Agamez-Ramos EJ, Zapata-Navarro RI, Oviedo-Zumaque LE y Barrera-Violeth JL. 2008. Evaluating solid fermentation processes and substrates for producing Trichoderma sp. spores. Rev. Colomb. Biotecnol. 10: 23-34. Aguilar CN, Gutirrez-Snchez G, Prado-Barragn L, Rodrguez-Herrera R, Martnez-Hernndez JL y ContrerasEsquivel JC. 2008. Perspectives of Solid State Fermentation for Production of Food Enzymes. Amer. J. Biochem. Biotechnol. 4: 354-366. Ajila CM, Aalami M, Leelavathi K y Prasada-Rao UJS. 2010. Mango peel powder: A potential source of antioxidant and dietary fiber in macaroni preparations. Innovative Food Science and Emerging Technologies 11: 219224. doi:10.1016/j.ifset.2009.10.004. Ajila CM, Naidu KA, Bhat SG y Prasada-Rao UJS. 2007. Bioactive compounds and antioxidant potential of mango peel extract. Food Chemistry 105: 982-988. Doi:10.1016/j.foodchem.2007.04.052 Andri P, Meyer AS, Jensen PA y Dam-Johansen. 2010. Reactor design for minimizing product inhibition during enzymatic lignocellulose hydrolysis: I. Signicance and mechanism of cellobiose and glucose inhibition on cellulolytic enzymes. Biotechnology Advances. doi:10.1016/j.biotechadv.2010.01.003 Bradford M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72: 248-254. Brijwani K, Oberoi HS y Vadlani PV. 2010. Production of a cellulolytic enzyme system in mixed-culture solid-state fermentation of soybean hulls supplemented with wheat bran. Proc. Biochem. 45: 120-128. doi:10.1016/j.procbio.2009.08.015. Campos SM, Gonzlez MA, Mas DS, lvarez GL y Cabeza PD. 2001. Influencia de algunos parmetros en la fermentacin en estado slido del hongo Trichoderma viride. Tecnologa Qumica XXI 1: 82-87. Couri S, da Costa-Terzi S, Saavedra-Pinto GA, Pereira-Freitas S y Augusto-da Costa AC. 2000. Hydrolitic enzyme production in solid state fermentation by Aspergillus niger 3T5B8. Proc. Biochem. 36: 255-261. de Siqueira FG, de Siqueira EG, Duque JPM, Luciano SMH, Andreaus J, Aparecida C, Batista LR y Ferreira FEX. 2010. The potential of agro-industrial residues for production of holocellulase from lamentous fungi. International Biodeterioration & Biodegradation 64: 20-26. doi:10.1016/j.ibiod.2009.10.002. Dos Santos MM, Souza da Rosa A, Dal Boit S, Mitchell DA y Krieger N. 2004. Thermal denaturation: is solid-state fermentation really a good technology for the production of enzymes?. Biores. Technol. 93: 261-268. Elisashvili V, Penninckx M, Kachklishvili E, Tsiklauri N, Metreveli E, Kharziani T y Kvesitadze G. 2008. Lentinus edodes and Pleurotus species lignocellulolytic enzymes activity in submerged and solid-state fermentation of lignocellulosic wastes of different composition. Biores. Technol. 99: 457-462.

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