INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLGICAS

Laboratorio de Fermentaciones:
Extraccin y purificacin de enzimas de hongos

INFORME
OBJETIVO:
Realizar la extraccin y purificacin parcial de la invertasa de
Saccharomyces cerevisae.

RESULTADOS y CLCULOS:
a) Extraccin
1.- Elaborar un cuadro comparativo de la actividad enzimtica en el sobrenadante
y el paquete celular durante la extraccin.
Clculo de la actividad enzimtica:
*F.D. para c/muestra = 100
Act .enzim tica volum trica=

[ glucosa ]
|problema|
=[ glucosa ] =
x Con . glucosa x F . D. /t reacci n
|est| ndar
t reacci n

0.105
mol
x 2000
x 100
0.08
L
mol
Act .enzim tica volum trica Ssp=
=26250
10 min
L min
A continuacin se calcula la actividad enzimtica real, en la que se resta
la actividad enzimtica de la muestra control:
Act .enzim tica real Ssp= Act . enzim tica SspAct . enzim tica Ssc

Act .enzim tica real Ssp= [ 262500 ]

mol
mol
=26250
L min
L min

A continuacin se muestran los resultados obtenidos:

Cuadro 1. Comparativo de la actividad enzimtica del sobrenadante y el

paquete celular durante la extraccin.

Muestra
Ssp (1)
Ssp (2)
Ssc (1)
Scp (1)
Scp (2)
Scc (1)
Psp (1)
Psp (2)
Psc (1)
Pcp (1)
Pcp (2)
Pcc (1)
Estndar
glucosa
2mM (1)
Estndar
glucosa
2mM (1)
Blanco (1)

A540n
m
0.105
0.105
0
0.22
0.23
0
0.28
0.28
0.02
0.25
0.23
0.04

Extraccin
Act.
Promedi
enzimtica
o
(mol /L
min)
0.105

26250

0.22

55000

0.28

70000

0.02

5000

0.24

60000

0.04

10000

0.08

2000

Act. enzimtica real

(mol /L min)

26250

55000

65000

40000

0.08

0.08
0

En el siguiente cuadro se realiza una comparacin entre las muestras en

las que se utiliz cistena para la extraccin y en las que no.

2.- Determinar el % de liberacin de la enzima durante la extraccin.

A continuacin se muestra la comparacin entre los porcentajes de
liberacin:
Liberaci n Paquete=

PsPc
6500040000
x 100=
=38.46
Ps
65000

3.- Determinar la eficiencia de recuperacin de la enzima durante la

purificacin

b) Purificacin:
Cuadro 2. Comparacin de actividad enzimtica del extracto crudo
problema e invertasa problema durante la purificacin.
Purificacin
Muest
ra
ECP
IP
SP
ECC
IC
SC
EG
2mM

Nmero

Abs
540nm

1
2
1
2
1
2
1
1
1
1
2

0.270
0.250
0.300
0.310
0
0
0
0
0
0.100
0.098

Promed
io

[Act. enz.
vol.]
M/L min

0.260

52, 525.25

0.305

61, 616.16

0
0
0

0
0
0

0.099

2,000

Donde:
ECP extracto crudo problema
IP invertasa problema
SP sobrenadante problema
ECC extracto crudo control
IC invertasa control
SC sobrenadante control
EG estndar de glucosa
Primero se procede a calcular la actividad enzimtica volumtrica de la
purificacin, sabiendo que la concentracin del estndar de glucosa es
de 2,000 M, el F.D. de 100 y el tiempo de 10 min, con las siguientes
frmulas:
Ejemplo para Extracto Crudo Problema (ECP):
1)

[ Glucosa ] =

|problema|
x Con . glucosa x F . D . [ ] M / L
|est| ndar

[ Glucosa ] =

0.260
x 2,000 x 100=525,252.53 M /L
0.099

2)

Act .enzim tica volum trica=

[ glucosa ]
t reacci n

Anlisis de unidades juntando ambas ecuaciones (1) y (2) anteriores:

| |

Act .enzimtica vol .=

[Glucosa] [ ] M 1
M

[ ]
t reaccin
L min
Lmin

Act .enzimtica vol .=

525,252.53
M
=52,525.25[]
10
Lmin

Cuadro 3. Determinacin de la concentracin de protena en la

purificacin y actividad especfica enzimtica.
Purificacin
[Protena]
Muestr
a
ECP
IP
SP
EA

Numer
o

Abs
500nm

1
2
1
2
1
2
1
2

0.34
0.37
0.28
0.30
0.13
0.135
0.55
0.53

Promedio

mg/L

Act. enz.
esp.
M/min*mg
prot.

0.355

6, 574.07

7.894

0.29

2, 685.19

22.95

0.133

1,231.48

0.54

500

-------

Donde:
EA estndar albmina
*Las abreviaturas de cada muestra se especifican debajo del Cuadro 2.

Se procede a realizar el clculo para la concentracin de protena similar

a la ecuacin (1) para el clculo de glucosa, sabiendo que ahora se
trabaja con albmina y su concentracin es igual a 0.5 mg/mL o 500
mg/L y los factores de dilucin para sobrenadante e invertasa de 10 y
para extracto crudo de 20:

Contina el mismo ejemplo de clculo para ECP:

[ Protena ] =

|problema|
x Con. albmina x F . D . [ ] mg/ L
|est| ndar

[ Protena ] =

0.355
x 500 x 20=6, 574.07 mg / L
0.54

Para calcular la actividad especfica enzimtica, se tiene la siguiente

frmula:
Act .especfica enzimtica .=

Act .esp . extracto crudo=

Act .esp .invertasa=

Act . volumetrica
M
L
M
[]
[]
[Proteina ]
Lmin mg prot
min mg prot .

52,525.25
=7.894
6,654.07

61, 616.16
=22.95
2, 685.19

Act .esp . sobrenadante=

0
=0
1,231.48

Finalmente calculamos el porcentaje de eficiencia de recuperacin de la

siguiente manera:

eficiencia de recuperacion=

Act . esp . inv . Act . esp . sob .

100
Act . esp .inv .

eficiencia de recuperacion=

22.950
100=1 00
22.95

4.- Determinar el grado de purificacin relativo de la invertasa.

Grado de purificacionrelativo=

Act . esp . invertasa

Act .esp . extracto crudo

Grado de purificacion lativo=

22.95
=2.907
7.894

DISCUSIN DE RESULTADOS:
En la presente prctica se determin la actividad de la enzima invertasa,
la cual es liberada de la pared celular de la levadura Saccharomyces
cerevisae mediante la adicin de cistena, aminocido que ayuda a
remover dicha enzima. La invertasa es una enzima que cataliza la
hidrlisis de sacarosa en glucosa y fructosa, productos de reaccin
conocidos como azcares invertidos por ser levorrotatorios mientras
que el sustrato sacarosa es dextrorrotatorio, de ah su nombre comn de
invertasa. Dicho esto, la forma en que se evala su actividad
enzimtica experimentalmente es mediante la determinacin de la
concentracin de glucosa y el desarrollo de color de los reactivos
posteriormente ledos espectrofotomtricamente.
La actividad de la invertasa es medida tanto en los sobrenadantes como
en los paquetes celulares, las cuales se expresan en el Cuadro 1. Ahora,
comparando los datos de la tabla de Sobrenadante problema con
cistena (Scp) y Sobrenadante problema sin cistena (Ssp), se comprueba
que el resultado fue acorde con lo esperado: la cistena ayuda a mejorar
el tiempo de extraccin de la enzima, por sta razn la actividad
enzimtica result mayor para el primer caso con cistena. Caso
contrario para los paquetes celulares, en los cuales la actividad
enzimtica result mayor para el Paquete problema sin cistena (Pcp)
que para el Paquete problema con cistena (Psp), esto es as ya que el
paquete celular sin cistena representa al microorganismo con la pared
celular intacta conteniendo en su interior a la enzima objeto de estudio,
invertasa. Complementariamente, al analizar y comparar los valores de
actividad enzimtica del sobrenadante problema con cistena (Scp) y el
paquete celular problema sin cistena (Psp), el Psp result con una

actividad mayor que el Scp, por lo cual, podemos decir que la extraccin
de la invertasa no se realiz en su totalidad, o dicho de otra manera, si
el paquete celular sin cistena tena su pared celular intacta entonces la
enzima an se encontraba adherida completamente a ella, por lo cual su
actividad enzimtica debera forzosamente ser mayor a la del paquete
celular con cistena (invertasa residual) y a la del sobrenadante con
cistena (invertasa liberada), lo que efectivamente ocurri. El orden de
actividad enzimtica de manera ascendente debera ser el siguiente:
1. Paquete celular sin cistena contiene a la invertasa en su
totalidad
2. Sobrenadante con cistena contiene a la invertasa liberada
3. Paquete celular con cistena contiene a la invertasa que no logr
ser extrada de la pared celular
4. Sobrenadante sin cistena no debera contener invertasa
Por otra parte, en el punto nmero 2, se reporta el resultado del
porcentaje de liberacin de la enzima en el paquete celular, el cual nos
indica la cantidad en por ciento de enzima invertasa que fue liberada de
la pared celular, la cual fue casi del 40% con un valor especfico del
38.46 %. Durante esta etapa experimental, solo cerca del 40% de la
invertasa total pudo ser extrada quedando liberada en el sobrenadante
con cistena, mientras que el 60% restante queda en la matriz
extracelular.
Para la purificacin de la enzima, se hizo empleo del sobrenadante con
cistena durante la extraccin, catalogndolo como extracto crudo, el
cual fue tratado con etanol para precipitar a la protena enzimtica. Este
precipitado se disolvi con regulador Tris-HCl y se le determin la
actividad de invertasa y la concentracin de protena tanto al
precipitado disuelto como al sobrenadante de ste. Los resultados de la
actividad de invertasa expresan como actividad especfica enzimtica el
cual nos da un indicativo de la pureza de la enzima. Como estndar para
la medicin de este parmetro se emplea a la albmina como protena.
En el Cuadro 2 se presentan las actividades enzimticas volumtricas,
las cuales resultaron mayores para la prueba de Invertasa que para el
Extracto Crudo, resultando favorable esta tendencia ya que aunque el
Extracto Crudo presentaba a la enzima invertasa, no se encontraba
purificada ni concentrada como en el precipitado de Invertasa. Para el
Sobrenadante es lgico obtener resultados de nula actividad enzimtica
despus de la purificacin.
En el Cuadro 3 se comparan las actividades especficas enzimticas
(grado de pureza) tanto para el Extracto Crudo, que se compone de la
enzima invertasa liberada despus de la extraccin; la Invertasa, que es

el precipitado y el Sobrenadante, que simplemente es el lavado del

precipitado. En la columna nmero cinco de dicho Cuadro se tabulan los
resultados de concentracin de protena, obteniendo mayores
concentraciones para el Extracto Crudo, despus para la Invertasa
precipitada y finalmente para el Sobrenadante; esto nos indica que
haba una mayor cantidad de protena presente en el extracto crudo a
pesar que la enzima Invertasa se encontraba concentrada, sin embargo,
no sabemos si algunas otras protenas aparte de la invertasa se
encontraban presentes en el extracto crudo despus de la liberacin con
el tratamiento de cistena, pudiendo ser ste el caso. Para el
sobrenadante se obtuvo una concentracin de protena tal que pudiera
igualmente como en el caso anterior, deberse a protenas que no eran
de nuestro inters. Empero, para la columna 5, las actividades
enzimticas especficas resultaron mayores para la Invertasa con una
pureza de 22.95 M/min*mg prot, traducido en un mayor grado de
pureza de dicha enzima ya que se encontraba concentrada en un
precipitado; seguida de el Extracto Crudo el cual pudo an contener
rastros de la enzima de estudio con una pureza del 7.894 M/min*mg
prot.; para el caso del Sobrenadante se obtuvo cero de actividad
enzimtica especfica (cero de enzima invertasa) por la misma
explicacin mencionada en el prrafo anterior para la misma condicin.

CONCLUSIONES:

Se realiz de manera adecuada la extraccin y purificacin de la

enzima invertasa para la levadura Saccharomyces cerevisae.
El aminocido cistena funciona como un potencial agente
liberador de las enzimas extracelulares de levaduras facilitando su
extraccin.
Durante la extraccin no se logr obtener a toda la enzima
invertasa localizada extracelularmente y se obtuvo un porcentaje
de liberacin para dicha encima del 38.46%.

 El empleo de etanol para la purificacin de la enzima invertasa

cumple con su propsito de precipitante aunque no se logre
precipitar a toda la enzima en el medio con un grado de
purificacin relativo de invertasa del 2.907.