Documentos de Académico
Documentos de Profesional
Documentos de Cultura
1 Fundamento
Se basa en la extraccin de al tiamina por un tratamiento enzimtico, hidrolisis
acida, seguido de purificacin, oxidacin a tiocromo (compuesto fluorescente
cuya fluorescencia es directamente proporcional a la concentracin de tiamina
presente en la muestra) y posterior identificacin y cuantificacin por
cromatografa liquida isocrtica en fase inversa con detector de fluorescencia,
ajustada a una longitud de onda de excitacin de 365nm y emisin de 436nm. 1
Estructura qumica
La estructura qumica de la tiamina o vitamina B1 consta de un ncleo
pirimidinico y otro tiazolico, unidos por un puente metilenico. 2
Tiamina
Pirofosfato de tiamina
1.1 Materiales
1.2 Equipos
Balanza analtica
Bao termorregulado con agitacin magntica y rangos de T de 40c a
50C
Bao termorregulado entre 80C a 90C
Cromatgrafo liquido de alta resolucin con detector de fluorescencia
bomba cuaternaria o isocrtica, autosampler o inyector manual y
software adecuado.
1.3 Reactivos
2. Mtodos
2.1 Mtodo fluorometrico-HPLC
El mtodo ms ampliamente utilizado para la determinacin de la vitamina B1,
incluye una hidrlisis cida seguida por una defosforilacin enzimtica de los
steres y la cuantificacin de la tiamina liberada. La medicin de la vitamina B\
en el extracto final se realiza mediante fiuorometra despus oxidar a tiocromo
que es un compuesto fluorescente. Ms recientemente, se han publicado
procedimientos por HPLC que se utilizan para cuantificar, el propio tiocromo o a
travs de una derivatizacin postcolumna
La muestra (hasta 25 g) es hidrolizada utilizando cido sulfrico 0,1 M durante
15 min a 121C. El pH de la mezcla enfriada se ajusta a 4,5 a travs de la
adicin de buffer acetato. Se agregan 500 mg de Takadiastasa y la suspensin
se incuba al menos por 20 minutos a 45C. Debe mencionarse que las
condiciones de incubacin dependen del tipo de enzima y del lote utilizado, as
como tambin del tipo de muestra y pueden variar considerablemente.
El extracto puede ser purificado si es necesario a travs de una columna de
intercambio inico, como Amberlite CG 50 (100-200 mesh). La tiamina es
retenida en el intercambio inico y luego es eluda con cido clorhdrico 0,15 M.
El eluido se ajusta a un volumen definido con cido clorhdrico (0,15 M).
Alcuotas de esta solucin se mezclan con isobutanol, una solucin de hidrxido
de sodio (50%), una solucin de hexa-cianoferrato de potasio (5%) y se agita
vigorosamente durante 60 segundos. En una serie paralela con los mismos
reactivos, se prepara un blanco bloqueando la reaccin a travs de la adicin
de cloruro de benceno-sulfonilo. Se agrega cloruro de sodio despus de la
oxidacin para optimizar la extraccin. Despus de la centrifugacin se toman
10 ml del extracto de isobutanol, se mezcla con 0,5 ml de etanol y se mide la
fluorescencia en contra del blanco. Es importante seguir exactamente el
protocolo para obtener resultados reproducibles. 3
2.2 Preparacin de la muestra
La vitamina B1 no es sensible a la luz; en cambio el tiocromo que es el
producto de la oxidacin si es fotosensible, por lo cual se debe utilizar material
mbar o color marrn durante la etapa de oxidacin.
Columna : C18 o RP-18 (5um) 125 x 4,6mm y Pre Columna RP -18 (5 um)
4-4
Fase mvil : 6.3.7
Inyeccin : 20 uL
Flujo o caudal: 0,8 mL / min.
Detector : Espectrofluormetro, Excitacin: 365 nm y Emisin 436 nm