UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS

CARRERA DE BIOQUMICA CLNICA

TEMA: IDENTIFICACIN DE BACILOS GRAM NEGATIVOS NO

FERMENTADORES

INTEGRANTES
NOEM CHANCUSI
CRISTINA GANCHALA
ANDREA MEDINA
PATRICIA SILVA
.

FECHA: 12-02-15

1. CARACTERSTICAS GENERALES
Este gran grupo de bacilos Gram Negativos No Fermentadores incluyen grmenes
pertenecientes a diferentes familias:
Pseudomonas
Flavobacterium
Alcalgenes
Acinetobacter
Acidovorax
Agrobacterium
Bordetella
Burkholderia
Chryseomonas
Empedobacter
Flavimonas
Moraxella
Roseomonas
Shewanella
Stenotrophomonas
Pero los gneros ms importantes son:
Pseudomonas
Acinetobacter
Stenotrophomonas
Burkholderia
Algunos de ellos desprovistos de grandes atributos de virulencia demostrables, no producen
enfermedad en el individuo sano pero pueden comportarse como oportunistas en enfermos
inmunodeprimidos.
Los bacilos Gram negativos No fermentadores son un grupo de microorganismos aerobios
estrictos, con flagelos polares, no son esporulados, no utilizan hidratos de carbono como fuente
de energa o los degradan a travs de vas metablicas diferentes de la fermentacin, son
generalmente oxidasa positiva. Se encuentran en el agua, fango, suelo, plantas, alimentos y
material patolgico.

2. CARACTERSTICAS PARA SU IDENTIFICACIN

Crecen en la mayora de agares

En agar sangre y chocolate crecen como colonias grandes y brillantes

En agar MacConkey, SS crecen como colonias grandes, transparentes, porque no
fermentan los carbohidratos presentes.
Crecen en TSI y LIA, pero no producen ningn cambio de color, no se desarrollan ni
acidifican la profundidad de estos medios
IDENTIFICACIN DE LAS ESPECIES MAS FRECUENTES
1.
2.
3.
4.

Pseudomonas
Acinetobacter
Burkholderia
Stenotrophomonas

CARACTERSTICAS ESPECFICAS

GNERO PSEUDOMONAS
Bacilos Gram negativos.
Ligeramente curvos.
Aerobios estrictos.
Cepas mviles (flagelos polares)
Citocromo Oxidasa positivo.
Utiliza la glucosa y otros hidratos de carbono.
Debido a que Pseudomonas tienen unos requerimientos nutricionales sencillos pueden
crecer fcilmente en los medios comunes de aislamiento, como el agar sangre y el agar
MacConkey.

a) PSEUDOMONA AERUGINOSA

Se desarrolla en todos los medios de cultivo.

Colonias grandes, olor a humedad y brillo metlico o azul-verdoso.
Coloracin de Gram: Bacilos Gram negativos, alargados
Produccin de Oxidasa: ( positivo). Coloracin azul
Siembra en agar hierro de Kligler: Imagen alcalina de color rojo en todo el tubo SH2 (-),
gas (-).
Motilidad: Crecimiento alrededor del sitio de inoculacin
En agar MacConkey: Colonias redondas, incoloras por no utilizacin de la lactosa.

Siembra en medios King A y King B para la produccin de pigmentos: Produccin de

pigmentos (piocianina y pioverdina).
Siembra en agar Cetrimide : Colonias redondas, lisas, de bordes regulares. Produccin
de pigmento verde (pioverdina)
En Agar sangre las colonias son de color gris y son beta hemolisis (Halo transparente
verdoso alrededor de las colonias).
OF Glucosa: Oxidativa
Produce pigmentacin verde relacionada con la sntesis de piocianina azul y fluorescena
amarilla, y un olor dulce caracterstico semejante al de las uvas.

GNERO

ACINETOBACTER

 Son bacilos o cocobacilos Gram negativos.

Son aerobios estrictos inmviles .
Crecen bien en todos los medios de cultivo , siendo su temperatura ptima de
crecimiento de 33 a 35 C.
Citocromo oxidasa negativo.
Catalasa positivo.
Son no fermentadores de glucosa
Utilizan una amplia variedad de compuestos orgnicos como fuente de carbono.

b) ACINETOBACTER BAUMANNII
Es el no fermentador encontrado en segundo orden de frecuencia en los laboratorios
clnicos.
Es un patgeno oportunista.
Muestran una utilizacin rpida de la glucosa con produccin de cido.
Son multiresistentes a los antimicrobianos
Cocos o cocobacilos Gram negativo.
En agar MacConkey las colonias pueden tener un tinte ligeramente rosado.
Producen hemlisis en Agar sangre
No crecen en TSI.
Catalasa (positivo)
No reducen los nitratos a nitritos
No descarboxilan la lisina
Citocromo Oxidasa ( negativo).

GNERO STENOTROPHOMONAS

 Es un gnero que consta solo de una especie S. Maltophilia anteriormente Xanthomona

Maltophilia.
Buen desarrollo en Agar sangre y MacConkey.
Citocromo Oxidasa Negativa.
microorganismo de baja patogenicidad.
Su hbitat natural es el ambiente acutico.
Bacteria aerobia.
Metabolismo oxidativo.
Se desarrolla en forma rpida en los medios de cultivo
c) STENOTROPHOMONAS MALTOPHILIA
El diagnstico de laboratorio se determina en base al Gram.
Bacilos Gram negativos.
Otras pruebas adicionales incluyen la oxidacin de la glucosa y maltosa en medio OF,
decarboxilacin de la lisina, licuefaccin de la gelatina y produccin de H2S,
evidenciada con papel de acetato de plomo.
Lisina descarboxilasa positiva.
Algunas cepas producen pigmentos amarillos.
Citocromo Oxidasa negativa.
ADNasa positiva (prueba clave debe incubarse 72 horas para evitar falsos negativos)
Colonia caf verdosa en Agar sangre, generalmente no hemoltica.
Colonia amarilla verdosa en MacConkey.
Agar sangre

ADNasa

Tincin de Gram

ADNasa

GNERO

Antes pertenecan al
Pueden sobrevivir en

BURKHOLDERIA
gnero Pseudomonas cepacea.
ambientes hmedos.

Patgeno aislado en infecciones respiratorias en pacientes con enfermedad fibroqustica.

d) BURKHOLDERIA CEPACIA
Bacilo Gram negativo no fermentador de crecimiento muy lento.
Oxidasa: positivo dbil (93% de las cepas, el otro 7% es oxidasa negativo).
Mvil.
Pigmento: amarillo claro.
Causa septicemias nosocomiales y
otras infecciones

3. IMPORTANCIA CLNICA
Pseudomona aeruginosa , se trata de un grupo de bacilos aerbicos Gram negativos , no
fermentativos, cuyo papel patgeno se encuentra bien establecido .
Se encuentran ampliamente distribuidos en la naturaleza, en el agua, en el suelo e inclusive en el
jabn, adems de ser parte de la flora saprolitica de piel e intestinos en seres humanos y
animales de diversas especies.
Son mviles debido a la presencia de un flagelo polar. Poseen cilios que probablemente jueguen
un papel importante en la resistencia a la fagocitosis y les permite adherirse a las superficies
celulares, han recibido el nombre de bacilos piocianicos por su capacidad de producir
pigmentos, no afecta a individuos sanos se comportan como oportunistas en pacientes
inmunodeprimidos

La importancia clnica Pseudomonas aeruginosa, es bien conocida ya que es agente causal de

otitis media. Oftalmitis, infeccin de heridas, bacteriuria, neumona y bactermia . Causa una
alta mortalidad en los pacientes con compromiso inmunolgico, quemado, oncolgico o
aquellos que son cometidos a instrumentacin o manipulaciones. En los hospitales, la
transmisin de pacientes a pacientes por las manos del personal es ms importante que la
diseminacin area.
Pseudomona no aeruginosa consideradas como un solo grupo ( especies=sp ), solo
ocasionalmente causan infecciones oportunistas aunque puedan observarse con heridas , ulceras
delos pies y bacteriuria . Estas especies aunque se aslan con frecuencia, solo ocasionalmente
estn implicadas en enfermedades, su susceptibilidad los antibiticos es mayor que las cepas
aeuriginosa es superior a las de otras Pseudomonas sp es conveniente considerar:
a) Que existe una relacin directa entre la relacin de piocianina y el potencial patgeno y
el potencial patgeno ya , que este pigmento afecta la utilizacin del oxgeno no por
parte de las clulas infectadas incluidos los leucocitos, los cuales como consecuencia
fagocitan inadecuadamente.
b) Que Pseudomona aeuriginosa son considerablemente ms resistentes a los antibiticos y
por lo tanto pueden comportarse como oportunistas con mayor facilidad

4. MEDIOS DE CULTIVO PARA NO

FERMENTADORES
AGAR CETRIMIDA
USO:
Es un medio utilizado para el aislamiento selectivo de
Pseudomonas aeruginosa y de otras especies del
gnero.
FUNDAMENTO:
Su formulacin permite el crecimiento selectivo de Pseudomonas aeruginosa y estimula la
produccin de pigmentos. En este medio muy semejante al King A, en el cual la peptona de
gelatina aporta los nutrientes para el desarrollo microbiano. El cloruro de magnesio y el sulfato
de potasio promueven la formacin de piocianina, pioverdina, piomelina y fluorescena de P.
aeruginosa. La cetrimida es un detergente catinico que acta como agente inhibidor, libera el
nitrgeno y el fosforo de las clulas de casi toda la flora acompaante, aunque inhibe tambin
algunas especie Pseudomonas. El agar es el agente gelificante.
INSTRUCCIONES

Suspender 45.3 g del polvo en 1 litro de agua purificada. Agregar 10ml de glicerina. Dejar
reposar 5 minutos. Calentar agitando frecuentemente hervir durante 1 minuto para disolucin
total.
Distribuir en tubo u otros recipientes apropiaos y esterilizar en autoclave a 121 C durante 15
minutos.
CARACTERSTICAS
Medio de cultivo deshidratado: color beige claro, homogneo, libre deslizamiento.
Medio de cultivo preparado: color mbar claro.
PROCEDIMIENTO
Siembra
En superficie, por inoculacin directa de la muestra estriando a partir de un caldo de
enriquecimiento por ejemplo cerebro corazn Infusin o Triptena Soya Caldo.
Incubacin:
En anaerobiosis, a 35-37 C durante 24-48 horas.
INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOS
Observa el crecimiento microbiano, las caractersticas de las colonias y la produccin de
pigmentos.
La presencia de un color verde azulado corresponde a produccin de piocianina, mientras que
un color verde corresponde a la produccin de pioverdina y color rosa claro, rojizo marrn
oscuro corresponde a la produccin de piorrubina.
Examinar las placas bajo luz ultravioleta, ya que la produccin de fluorescena se observa de
color amarillo verdoso brillante que difunde en el agar a partir del crecimiento microbiano.

PSEUDOMONA AGAR F
USO:
Medio de cultivo utilizado para el aislamiento, la deteccin y la diferenciacin de especies de
Pseudomonas en base a la produccin de fluorescena. Conocido tambin como medio King B y
Flo Agar
FUNDAMENTO:

En el medio de cultivo, la triptena y la peptona de carne aportan los nutrientes necesarios para
el desarrollo bacteriano, la glicerina favorece la produccin de pigmentos, la concentracin de
fosfato dipotsico estimula la produccin de fluorescena e inhibe la produccin de piocianina y
piorrubina. El sulfato de magnesio provee los cationes necesarios que incrementan la
produccin de fluorescena y e agar es el agente solidificante.

CARACTERSTICAS DEL MEDIO:

Medio de cultivo color mbar claro.

PROCEDIMIENTO:
Siembra:
A partir de un cultivo puro de 18-24 horas, del cual se sospecha la presencia de Pseudomona
spp, tomar una colonia y estriar la superficie del medio.
Incubacin:
En anaerobiosis, a 35-37C durante 24-48horas.
Si no se observa crecimiento, reincubar a 25-30C, o dejar a 22C y observar diariamente hasta 7
das.
INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOS:
Examinar las colonias bajo luz ultravioleta, a 260nm.
Se considera un resultado positivo la observacin de fluorescena, que es un pigmento de color
amarillo-verdoso fluorescente que rodea la colonia o que se extiende por todo el medio de
cultivo debido a fenmenos de difusin.

PSEUDOMONA AGAR P

USO:
Medio de cultivo utilizado para el aislamiento, la deteccin y la diferenciacin de especies de
Pseudomonas en base a la produccin de piocianina. Conocido tambin como medio King A y
Tech Agar.
FUNDAMENTO:
En el medio de cultivo, la peptona de la gelatina aporta los nutrientes necesarios para el
desarrollo bacteriano, la glicerina favorece la produccin de pigmentos, las sales de magnesio y
potasio estimulan la produccin de piocianina y piorrubina e inhiben la produccin de
fluorescena. El agar es el agente solidificante.

INSTRUCCIONES

Suspender 46.4g del polvo en 1 litro de agua purificada. Agregar 10ml de glicerina. Calentar con
agitacin constante para homogenizar el producto. Llevar a ebullicin para que se disuelva por
completo.
Distribuir en tubos u otros recipientes apropiados y esterilizar en autoclave a 121C durante 15
minutos.
Colocar los tubos en posicin inclinada para solidificar el medio de cultivo (pico de flauta).
Tambin puede distribuirse en cajas Petri estriles.
CARACTERTICAS DEL PRODUCTO:
Medio de cultivo deshidratado: color beige, homogneo, libre deslizamiento.
Medio de cultivo preparado: color mbar claro.
PROCEDIMIENTO:
Siembra:
A partir de un cultivo puro de 18-24horas, del cual se sospeche la presencia de Pseudomonas
spp, tomar una colonia y estriar la superficie del medio.

5. PRUEBAS BIOQUMICAS
OXIDASA
Los citocromos son hemoprotenas que contienen hierro y actan como ltimo eslabn de la
cadena de la respiracin aerobia, transfiriendo electrones (H 2) al oxgeno. El sistema Citocromo
oxidasa se encuentra en microorganismos aerobios o microorganismos aerfilos y anaerobios
facultativos. La prueba para detectar la presencia de oxidasa puede realizar cubriendo las
colonias bacterianas en la superficie del agar con el reactivo clorhidrato de tetrametil p-

fenilendiamina al 1%. Una alternativa es frotar una muestra de la colonia bacteriana sobre un
papel filtro impregnado con el reactivo. En estado reducido es incoloro pero cuando se oxida
vira a purpura.

OF Glucosa
Para la mayora de las bacterias de importancia clnica implica la utilizacin de sustratos como
hidratos de carbono. Para la identificacin de diversas bacterias es importante determinar si la
utilizacin del sustrato es oxidativo o fermentativo. El proceso oxidativo requiere oxigeno el
fermentador no.
El proceso oxidativo fermentativo se logra con el medio O-F que contiene concentraciones
bajas de peptona y un sustrato con un nico hidrato de carbono como glucosa. El
microorganismo que se desea identificar se siembra en dos tubos O-F con glucosa uno de los
cuales se cubre luego con aceite mineral para impedir el ingreso de Oxigeno.
El indicador de pH para la prueba O-F y los cambios de color que sufren en condiciones acidas
son azul de bromo timol (que cambia de verde a amarillo). Cuando se determina la produccin
de cido en ambos tubos el microorganismo se identifica como fermentadores de la glucosa
Porque la fermentacin puede producirse con oxgeno o sin l. Si el cido solo se detecta en el
tubo en aerobiosis (abierto) se considera que el microorganismo oxida la glucosa.
Algunos microorganismos no utilizan la glucosa como sustrato y no se observa la presencia de
cido en ninguno de los tubos.

 Reduccin de Nitratos a Nitritos

La capacidad de un microorganismo para reducir los nitratos a nitritos es una caracterstica

importante para identificar y diferenciar especies de muchos microorganismos. Los
microorganismos que reducen los nitratos pueden extraer oxigeno de los nitratos para formar
nitritos y otros productos de reduccin. La presencia de nitritos en el medio de prueba se detecta
por el agregado - naftilamina y cido sulfanilico con formacin de un color rojo de diazonio
p- sulfobenzenoazo- - naftilamina.

Hidrolisis esculina

El medio de esculina sin bilis es til para diferenciar especies de bacilos no fermentadores. La
esculina es un glcido sustituido que puede ser hidrolizado por ciertas bacterias para producir
glucosa y esculetina. La esculina es un compuesto fluorescente bajo la luz UV a 360 nm.
Cuando hidrolisa la esculina la fluorescencia se pierde y el medio vira a negro debido a la
reaccin de esculetina con iones frricos presentes en el medio.
Composicin:
Esculina 1g
Citrato frrico 0,5g
Agar infusin corazn 4g
Agua destilada 1L

PRUEBA DE LICUEFACCION DE LA GELATINA

PRINCIPIO
Determinar la capacidad de un microorganismo de producir enzimas de tipo proteoltico
(gelatinasas) que licuan/ hidrolizan la gelatina o muestran cambios caractersticos debido a los
productos de degradacin.
BIOQUMICA

La gelatina, una protena derivada del colgeno animal, se incorpora a diferentes medios de
cultivo para determinar la capacidad de un microorganismo de producir enzimas proteolticas
(proteinasas), detectadas por gestin o licuefaccin de la gelatina. Las enzimas capaces de
producir gelatinosis se denominan gelatinasas.
Estas enzimas proteolticas a menudo son importantes factores de virulencia de algunos
microorganismos.
Las protenas naturales son demasiado grandes para entrar en una clula bacteriana; por ende;
para que una clula pueda usar las protenas, estas primero deben ser catabolizadas a
componentes ms pequeos.
Ciertas bacterias segregan gelatinasas exocelulares para degradar las protenas y esta capacidad
ayuda a la identificacin bacteriana.
Este catabolismo de las protenas por parte de las gelatinasas es un proceso de dos pasos, el
resultado final es una mezcla de aminocidos aislados.
Gelatinas
Protena + H2O as
Proteasa
s
Gelatinasa
Polipptidos + H2O
s Proteasa
Medio de Cultivo: Gelatina nutritiva.
s

Polipptidos

Aminocidos individuales

Composicin:
a)
b)
c)
d)

Extracto de carne.
Peptona.
Gelatina.
Agua Destilada.

Consistencia del medio:

Semislido.
Inoculacin:
Picadura en posicin vertical hasta una profundidad de 2.5 cm, inculo denso
Condiciones de incubacin:
Tiempo: 18-24 horas.
Temperatura: 35-37 C

Al trmino de la incubacin se coloca el tubo en un refrigerador o bao de hielo durante dos

horas para determinar si se ha producido o no la digestin de la gelatina (licuefaccin).

Resultados:

Interpretacin:
Positivo: Medio licuado (estado lquido)
Negativo: Medio slido.
El medio de gelatina nutritiva para puncin no es conveniente para las pruebas de rutina de la
actividad gelatinasa, dado que muchas especies requieren de una incubacin prolongada antes
de que aparezcan muestras de licuefaccin.
En los mtodos diagnsticos de rutina para identificar bacterias, la duracin de la incubacin
deber alcanzar un perodo razonable.
Reporte de resultados:
Positivo: (+)
Negativo: (-)

BIBLIOGRAFA:

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ESQUEMA DE IDENTIFICACIN