Porque y para que conservar los cultivos?

El cultivo (cepa microbiana o viral, linea celular, etc), es el elemento vital de la

investigacin o produccin industrial

Conservar implica mantener la pureza, viabilidad y propiedades genticas del cultivo

durante un determinado perodo de tiempo

Consecuencias de una adecuada conservacin: estabilidad de las cepas de produccin,

reproducibilidad de la investigacin. Reposicin

Los tres objetivos de la conservacin:

1.-Mantenimiento del cultivo puro (PUREZA)
2.-Que est vivo (VIABILIDAD)
3.-gentica estable (ESTABILIDAD)

Esquema del proceso de conservacin y sus etapas crticas

CONSERVACIN EN PAPEL FILTRO

La conservacin en discos de papel de filtro se basada en la paralizacin del crecimiento celular por
la eliminacin del agua disponible para las clulas
El empleo de un soporte de papel para el mantenimiento de clulas en condiciones de ausencia de
agua es un procedimiento adecuado y sencillo, para conservar cepas. La tcnica consiste en
embeber tiras de papel de filtro con una suspensin densa de organismos en suero, glutamato de
sodio u otro agente, las mismas son posteriormente colocadas en tubos para su posterior secado bajo
vaco. De esta forma se han logrado conservar por perodos de hasta 2 aos a temperatura ambiente.
Para ello se utiliz un papel de filtro absorbente y estril que se impregn en una suspensin
bacteriana de clulas (108 esp/mL), se dej secar al aire en condiciones estriles y una vez secos los
discos se colocaron en tubos Eppendorf estriles a 4C
La conservacin en discos de papel de filtro se basada en la paralizacin del crecimiento celular por
la eliminacin del agua disponible para las clulas. Para ello se utiliz un papel de filtro absorbente
y estril que se impregn en una suspensin bacteriana de clulas (10 8 esp/mL), se dej secar al aire
en condiciones estriles y una vez secos los discos se colocaron en tubos Eppendorf estriles a 4C.

PROCEDIMIENTO

1. Se toma el papel filtro Watman No 4 y se recortan en crculo con ayuda de una

perforadora
2. Se toman los crculos de papel y se esterilizan en el autoclave por 15 min con la ayuda de
un pedazo de papel aluminio que las envuelve
3. Se prepara la suspensin del microorganismo ( hongo o bacteria) con agua destilada estril
4. Unas ves estriles los crculos de papel se colocan dentro de tobos eppendorf
aproximadamente de 5 a 7 crculos
5. Existen dos formas de agregar la suspensin:
a. Agregar directamente la suspensin al tubo eppendorf el cual mojara los crculos de
papel pero se correr el riesgo de agregar un exceso de suspensin, el cual retardara
el secado de los crculos en el desecador
b. Agregar la suspensin a los crculos, uno por uno tratando de no crear un exceso de
suspensin el cual nos retarde el secado (cuando se le agrega la suspensin uno por
uno el secado en el desecador en ms rpido ya que la cantidad de agua a eliminar
ser menor y el secado ser ms rpido)
6. Una vez hmedos los crculos se llevan al desecador con la tapa abierta para que pierdan
humedad todo esto en esterilidad por 2 a 3 semanas a 4 C.
7. Transcurrido el tiempo necesario para el secado de los crculos solo se aplican pruebas de
viabilidad.
8.

La viabilidad se determin a partir de su reactivacin en medio caldo nutriente (CN).

Forma en la que se colocan el papel

filtro con el microorganismo

El prximo paso fue la siembra por agotamiento en placas con AN, con el objetivo de obtener
colonias aisladas, comprobar la pureza macroscpica de los cultivos por observacin al microscopio
estereoscopio y describir las caractersticas morfoculturales de las colonias de acuerdo con forma,
tamao de las colonias, bordes, elevacin, color y textura comparada con la cepa de referencia. Se
seleccion una colonia de una cepa, se pasaron a tubos con cuas de AN y se incubaron durante 72
h a 30C; se realiz la tincin de Gram al cabo de 18 h para observar parmetros como la pureza
microscpica de los cultivos y forma de las clulas
La concentracin (esporas por mililitro) de cada una de las suspensiones bacterianas se determin
por el conteo de las esporas presentes en cada uno de los cuadrantes a evaluar de la cmara de
Neubauer (5 x 5) mediante la observacin en el microscopio ptico con contraste de fase 400x.
A partir de los cultivos sembrados en AN plano inclinado, se realizaron diluciones decimales hasta
llegar a 108 UFC. La viabilidad se cuantific por la produccin de colonias. Para ello se tom 1 mL
se aadieron en placas de Petri estriles, luego se realiz la siembra por adicin de 15 mL de medio
de cultivo AN. Cada placa se agit suavemente con el fin de lograr una mezcla homognea de la
suspensin bacteriana con el medio de cultivo y obtener colonias aisladas. Las placas se incubaron a
30C y posteriormente se cuentan las unidades formadoras de colonias a las 24, 48 y 72 h.
La concentracin se determin por la siguiente ecuacin:
C = XD 100 (UFC/mL)
DNDE:
X: Media del conteo de las colonias en las placas
D: Factor de dilucin = 1/dilucin
100: Para convertir de L a mL

Referencias
http://setas.org/cultivo-de-setas/cepas-hongos-en-papel-filtro/
http://www.science.oas.org/Simbio/mbio_ind/cap3_mi.pdf
http://redalyc.uaemex.mx/redalyc/pdf/2091/209122285007.pdf