Efecto del suero, saliva y temperatura en el crecimiento de

Escherichia coli



Materiales y mtodos

Para determinar el efecto del suero, la saliva y la temperatura en el crecimiento de
Escherichia coli (E. coli) se comenz por inocular 7ml de Luria Broth (LB) con una
colonia de E. coli y se incub a 37 por 16 horas. Luego de incubar la muestra por el
tiempo requerido se determin la absorbancia del cultivo a 630nm (A
630
) utilizando un
espectrofotmetro. Si la A
630
hubiese sido mayor de 1.5 se habra tenido que diluir la
muestra de 1:5-1:10 y se hubiese calculado la A
630
nuevamente. Para comenzar la curva
de crecimiento de E. coli en 50 ml de LB se calcul el volumen del inoculo utilizando la
frmula

. Este fue el cultivo original utilizado
para preparar las curvas de crecimiento de E. coli. Mientras tanto, una persona enjuag su
boca y deposit saliva en un envase. Se diluy 200 de saliva en 800 Phosphate-
Buffered Saline (PBS) para utilizar la saliva diluida en la muestras.
Se prepararon cuatro curvas de crecimiento de E. coli para 37 y 39 ,
respectivamente. La muestra A era el control negativo y 200 LB. D ms
B D, s 100 E. coli, p B , , 100 LB, C-100
de suero y la D-100 de saliva diluida. Rpidamente se tom la A
630
de las muestras, en
donde el valor de la absorbancia es para el primer tiempo, t = 0. Cada 30 minutos se
determin la A
630
de cada muestra por un total de 2 horas.

















Resultados









0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0.4
t=0 t=1
(30mins)
t=2
(60mins)
t=3
(90mins)
t=4
(120mins)
A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a

Tiempo
E. coli + LB
E. coli + suero
E. coli + saliva
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0.4
t=0 t=1
(30mins)
t=2
(60mins)
t=3
(90mins)
t=4
(120mins)
A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a

Tiempo
E. coli + LB
E. coli + suero
E. coli + saliva
Figura 2 Absorbancia a 630nm con relacin al tiempo para medir el crecimiento de E. coli a 37.
A travs de esta grafica podemos interpretar que E. coli tuvo mayor crecimiento en LB, seguido
por saliva, y luego suero.
Figura 1 Absorbancia a 630nm con relacin al tiempo para medir el crecimiento de E. coli a 39.
Hubo mayor crecimiento de E. coli en suero, seguido por LB, y luego en saliva.


Discusin

En presencia de un patgeno el cuerpo humano activa diferentes mecanismos de la
inmunidad innata que se complementan con el fin de prevenir la proliferacin de una
infeccin. En este experimento hemos demostrado que aunque 37 es la temperatura
ptima de crecimiento para E. coli, esta bacteria tambin es capaz de crecer a 39. El
crecimiento de la bacteria fue mayor en 39. Esto indica que la induccin de fiebre
representada por 39, como mecanismo del sistema inmunolgico para atacar patgenos,
no es suficiente para eliminar a E. coli.

E h shk sps de la bacteria E. coli es un mecanismo complejo que es
activado cuando aumenta la temperatura. Temperaturas que sobrepasan 37 amenazan la
estabilidad y homeostasis de la bacteria, lo que resulta en la actividad del factor sigma de
transcripcin 32 (RpH). Este factor de transcripcin activa una serie de protenas que
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0.4
t=0 t=1
(30mins)
t=2
(60mins)
t=3
(90mins)
t=4
(120mins)
A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a

Tiempo
39C E. coli + LB
39C E. coli + suero
39C E. coli + saliva
37C E. coli + LB
37C E. coli + suero
37C E. coli + saliva
39C 37C
Tiempo E. coli +
LB
E. coli +
suero
E. coli +
saliva
E. coli +
LB
E. coli +
suero
E. coli +
saliva
t=0 0.088 0.391 0.095 0.087 0.093 0.088
t=1 0.096 0.100 0.106 0.091 0.103 0.088
t=2 0.124 0.118 0.139 0.098 0.110 0.096
t=3 0.173 0.168 0.173 0.112 0.115 0.112
t=4 0.219 0.235 0.195 0.138 0.125 0.132
Tabla 1 Absorbancia de E. coli a 39C y 37C en LB, suero y saliva.

Figura 3 Absorbancia a 630nm con relacin al tiempo para medir el crecimiento de E. coli a 37y a 39.
permiten que E. coli se adapte al cambio trmico (1). Probablemente, al verse amenazada
la bacteria por el factor temperatura, sta opt por acelerar su replicacin como mtodo de
supervivencia.

Luria Broth es un medio de cultivo comnmente utilizado ya que da un buen
rendimiento de la bacteria y permite su rpido crecimiento. El crecimiento de E. coli
decrece al agotar los recursos de carbono, ya que son catabolizados en amino cidos.
Segn Guennadi Sezonov, et al., la fase exponencial del crecimiento de E. coli llega a su
fin, dependiendo de la cepa, cuando la absorbancia a 600nm (aproximadamente) se
encuentra entre 0.6 y 1.0. Esto explica porque en todos los intervalos de tiempo a 37 y a
39 el crecimiento de E. coli era visiblemente ascendente. Si el experimento hubiese sido
de mayor duracin hubisemos podido observar la fase estacionaria del crecimiento, lo
que hubiese demostrado la escasez de recursos en un tiempo fijo con respecto a la cantidad
de LB utilizado (2).

El suero contiene una serie de enzimas proteolticas del complemento que activan
la respuesta del sistema inmunolgico innato para atacar al patgeno (3). Sin embargo, E.
coli tuvo mayor crecimiento en suero, comparado con saliva a 39. Este comportamiento
puede ser justificado tomando en cuenta la cantidad de suero, la condicin del suero y la
cepa de E. coli. El suero es capaz de inhibir el crecimiento de E. coli en grandes
s, p , mz 100 s + 100 E. coli, la cantidad de suero no
fue suficiente para atacar a la bacteria. El tiempo de replicacin de la bacteria es mucho
mayor que el tiempo en el que el suero puede hacer efecto sobre el patgeno, de manera
que al pasar el tiempo la bacteria se continu replicando, al mismo tiempo que la actividad
inhibitoria del suero se fue agotando. Esto explica porque en la Figura 2 el crecimiento de
E. coli en suero comienza a decaer, pero luego de los 30 minutos comienza a ascender. La
condicin del suero vara dependiendo del individuo. Al desconocer las condiciones en las
que se encontraba el individuo que aport el suero, podemos dudar de la capacidad
inhibitoria del suero. Por otro lado, se sabe de diferentes cepas de E. coli que expresan
proteasas capaces de inhibir los efectos del suero. Por ejemplo, E. coli bacteremia expresa
la proteasa PRC que evita que las protenas del suero interacten con el patgeno, de
manera que aumenta la probabilidad de supervivencia al ataque inmunolgico (3).

La saliva es un medio rico en lisozimas y pptidos antimicrobianos que evitan el
crecimiento de patgenos. En la saliva, tambin, se encuentra parte de la flora bucal
responsable de producir radicales libre de oxgeno en presencia de E. coli (4). El
comportamiento del patgeno en este medio revela que la cantidad de saliva utilizada en el
experimento fue suficiente para inhibir, hasta cierto punto, el crecimiento de E. coli, pero
no completamente. Esto se debe a que esta bacteria expresa una serie de inhibidores de
lisozimas, entre otras molculas, que promueven la supervivencia y el crecimiento de E.
coli. Un ejemplo de un inhibidor de lisozimas, expresado por E. coli, es Ivy (5).

En conclusin, E. coli es capaz de crecer a 37 y 39. Sin embargo, hubo mayor
crecimiento a 39, en comparacin con 37 (temperatura ptima de crecimiento). Los
datos recopilados indican que un aumento en temperatura, que simula fiebre en humanos,
no es suficiente para eliminar a E. coli. Esta bacteria recurre a diferentes mecanismos para
combatir el ataque del sistema inmunolgico innato, lo cual aumenta las probabilidades de
resistencia y supervivencia bajo condiciones adversas. Debido a las limitaciones de este
experimento los resultados obtenidos no representan por completo el comportamiento de
E. coli en su temperatura ptima (37) o al inducir fiebre (39). Para entender mejor
como funciona la respuesta inmunolgica innata en humanos habra que alterar las
variables de experimento, por ejemplo, aumentar las cantidades del medio, la duracin de
experimento, exponer diferentes cepas de E. coli, probar las condiciones de la saliva y el
suero, entre otro factores.

Referencias

1. Meyer, A.S., and T. A. Baker. 2011. Proteolysis in the Escherichia coli heat shock
response: A player at many levels. Curr Opin Microbiol. 14(2): 194-199.

2. Sezonov, G., D. Joseleau-Petit, and R.D'Ari. 2007. Escherichia coli Physiology in
Luria-Bertani Broth. J Bacteriol. 189:8746-8749

3. Wang, C-Y., S-W. Wang, and C-H. 2012. Teng. Prc Contributes to Escherichia
coli Evasion of Classical Complement-Mediated Serum Killing. Infect Immun.
80:3399-3409

4. He, X., Y. Tian, and W. Shi. 2010. Oral-Derived Bacterial Flora Defends Its
Domain by Recognizing and Killing IntrudersA Molecular Analysis Using
Escherichia coli as a Model Intestinal Bacterium. Microb Ecol. 60 (3): 655-664

5. Deckers, D., D. Vanlint, and C. W. Michiels. 2008. Role of the Lysozyme
Inhibitor Ivy in Growth or Survival of Escherichia coli and Pseudomonas
aeruginosa Bacteria in Hen Egg White and in Human Saliva and Breast Milk. Appl
Environ Microbiol. 74(14): 44344439