Gentica

Microbiana
Tamao de los genomas
Se puede expresar como
el nmero de bases por
molcula.
Una molcula con 1000
bases es una Kb de ADN.
Si el ADN es de doble
hlice, se habla de pares
de kilobases (Kpb).
1 vuelta de ADN tiene
aproximadamente 10 pb.
1 Kb tiene 100 vueltas
(0.34mm).
Caractersticas del genoma
procariote
Cromosoma circular.
10
5
-10
6
pb.
Haploide.
Aproximadamente 90%
codifica para protenas y el 10%
para regulacin.
Operones polignicos o
policistrnicos (que tienen
muchos genes estructurales) y
operones monocistrnicos.
Genoma de E. coli 4.64 millones
de pares de bases (4640 kb).
Organizacin del genoma
procariote
El ADN de E. coli tiene una longitud de 1 mm, unas 400 veces su tamao.
Se encuentra organizado en dominios (100) supererrollados, estabilizados
cada uno por protenas especficas.
ADN superenrollado
Superenrollamiento positivo: la doble hlice est sobrenrollada.
Superenrollamiento negativo: la doble hlice esta infraenrollada. Torsin
de la doble hlice sobre su eje en sentido opuesto a la doble hlice. Esta
es la forma ms comn en la naturaleza.
Topoisomerasas clase I.
Topoisomerasas clase II.
Superenrollamiento negativo
ADN-girasa (topoisomerasas clase II), presente en bacterias y muchas
arqueas.
En bacterias la ADN girasa es inhibida por quinolona (cido nalidxico),
fluoroquinolonas (ciprofloxacino) y novobiocina que tambin parece
inhibir a la ADN girasa en algunas especies de arqueas.
La Topoisomerasa I elimina el superenrollamiento y regresa la cadena al
estado relajado.
Caractersticas del genoma
eucariote
Cromosoma lineal
10
7
-10
9
pb
Haploide y diploide
La codificacin a protenas varia
entre el 3% en humanos y 70% en
levaduras .
Presencia de intrones (regiones
no codificantes) y exones
(regiones codificantes).
Organizacin del genoma
eucariote
Clases de elementos genticos
Organismo Elemento Tipo de cido
nucleco
Descripcin
Procariotas
Cromosoma ADN de doble
cadena
Muy largo, normalmente
circular
Eucariotas
Cromosoma ADN de doble
cadena
Muy largo, lineal
Todos
Plsmido* ADN de doble
cadena
Molcula extracromosmica
circular o lineal relativamente
corta
Todos
Elemento
transponible
ADN de doble
cadena
Siempre se encuentra inserto
en otra molcula de ADN
Mitocondrias y
cloroplastos
Genoma ADN de doble
cadena
De longitud media,
normalmente circular
Virus
Genoma ADN o ARN de
cadena doble o
sencilla
Circular (relativamente) o
lineal
*Los plsmidos son raros en eucariotas.
Brock. Biologa de los Microorganismos, 12 edicin, 2009
Dogma Central
Replicacin de ADN
Replicacin semiconservativa
Hebra original
Hebra nueva
Enzimas:
ADN polimerasa(E. coli). Sitetizan en direccin 5 3.
I. Replicacin en menor grado. Exonucleasa 5 3. Elimina al primer.
II. Participa en la reparacin del ADN.
III. La enzima principal de la replicacin.
IV. Participa en la reparacin del ADN.
V. Participa en la reparacin del ADN.
Primasa (RNA polimerasa)
Sintetiza un fragmento corto (cebador o primer) de 11 o 12 nucletidos de
ARN sobre la cadena de ADN.
Replicacin de ADN
Origen de la replicacin (solo uno en procariotas).
Helicasa de ADN.
ADN-girasa (topoisomerasa II).
Protenas de unin a ADN.
Holoenzima. Dos DNA-pol III en el replisoma.
ADN pol I.
ADN-Ligasa.
Replicacin en procariotes
Estructura Theta
Replicacin bidireccional.
Replicacin en
procariotes
~Plasmidos en Gram positivas.
~Algunos virus.
~Conjugacin.
Circulo rodante.
Cadena
continua
Cadena
discontinua
Replisoma
Nature Reviews Molecular Cell Biology 3, 859-870 (November 2002)
Esta compuesto por:
Dos copias de ADN-pol III,
Una helicasa y una primasa
(primosoma),
Protenas de unin a ADNss.
Protena que mantiene
juntas a las ADN-pol III y a la
helicasa.
La ADN-girasa elimina el
superenrrollamiento.
Transcripcin
Promotores y Factor Sigma
Promotores: sitios en el ADN
que reconoce la ARN
polimerasa para iniciar las
transcripcin.
Factor sigma: cadena
sencilla (SS) un factor de
inicio de la transcripcin en
procariontes que permite la
unin especfica de la ARN
polimerasa al promotor de
un gen.
Hay diferentes factores
sigma que son activados en
respuesta a diversas
condiciones ambientales.
Transcripcin en eucariotes
Sntesis de
protenas
Elementos genticos no
cromosmicos
Plsmidos: DNA de doble cadena
circular, capaces de la replicacin
autnoma. Existen plsmidos lineales
en Borrelia burgdorferi y
Actinomicetos.
Elementos transponibles: Fragmentos
de ADN que cambian de lugar en el
genoma de un organismo. Presentes
en eucariontes y procariontes.
En procariontes hay 3 tipos:
~Secuencias de insercin
~Transposones
~Virus especiales
Plsmidos
Tamao: de 1Kpb a 1Mpb.
Estn presentes en determinado
nmero de copias por clula
(1-3 ms de 100)
En Gram negativas se replican
de modo similar al cromosoma.
Replicacin bidireccional
alrededor del crculo, aunque
algunas lo hacen unidireccional.
En Gram positivas se replican
por el mecanismo de crculo
rodante, tambin algunas Gram
negativas y arqueas.
Plsmidos
Episomas: pueden integrase al
cromosoma y se replican bajo el
control de este.
Plsmidos conjugativos: los que
dirigen su propia transferencia
mediante el contacto entre clulas.
La regin tra contiene genes que
codifican para transferencia y
replicacin.
Plsmidos no conjugativos: que no
pueden transferirse por s mismos a
otra clula.
Plsmidos crpticos: que solo se
sabe que se replican, no se sabe
qu otra funcin tienen.
Plsmido F (de fertilidad) de E. coli
Verde obscuro: genes de replicacin.
Verde claro: genes de transferencia conjugativa.
Amarillo: elementos transponibles.
Fenotipos conferidos por plsmidos
Fenotipo Organismos procariotas
Produccin de antibiticos Streptomyces
Conjugacin Amplio rango de bacterias
Funciones metablicas
Degradacin de octano, alcanfor y naftaleno
Degradacin de herbicidas
Formacin de acetona y butanol
Utilizacin de lactosa, sacarosa, citrato o urea
Produccin de pigmentos
Produccin de vesculas de gas
Pseudomonas
Alcaligenes
Clostridium
Enterobacterias
Erwinia, Staphylococcus
Halobacterias*
Resistencia
Resistencia a antibiticos
Resistencia a metales pesados
Amplio rango de bacterias
Amplio rango de bacterias
Virulencia
Formacin de tumores en plantas
Nodulacin y fijacin simbitica de nitrgeno
Produccin de bacteriocina y resistencia
Invasin de clulas animales
Coagulasa, hemolisina, enterotoxina
Toxinas y cpsula
Enterotoxina, antgeno K
Agrobacterium
Rhizobium
Amplio rango de bacterias
Salmonella, Shigella, Yersinia
Staphylococcus
Bacillus anthracis
Escherichia
*Arqueobacteria.
Brock. Biologa de los Microorganismos, 12 edicin, 2009
Plsmido conjugativo con
multirresistencia
Molecular structure of a circular,
conjugative multiresistance
plasmid from an Enterococcus
faecalis isolated from a raw
fermented sausage.
The molecule is made up of a
part originating from
Streptococcus (blue symbols)
and Enterococcus (black
symbols). Antibiotic resistance
genes are in white; the segment
responsible for conjugative
resistance transfer is indicated.
Insertion elements are shown as
boxes: they are potent tools to
excise and to insert genes into
DNA.
A total of 58 potential genes are
present. ( M. Teuber)
http://www.accessscience.com/popup.aspx?figID=YB030595FG0020&id=YB030595&name=figure
Elementos
transponibles en
bacterias
Secuencias de insercin
(IS). Segmentos cortos de
ADN, aproximadamente
1000 nucletidos, solo
contienen la informacin
gentica que la necesaria
para moverse de un lugar a
otro.
Transposones (Tn). Son ms
grandes y tienen genes
adicionales. Se replican
como parte del ADN.
Bacterifago Mu. Que es a
la vez un virus y un
transposn.
Elementos de Insercin
Secuencia de Insercin o Elemento de Insercin (IS): los transposones
simples contienen una secuencia central con informacin para la
transposasa y en los extremos una secuencia repetida en orden inverso
de entre 10 y 50 pb.
Esta secuencia repetida en orden inverso no es necesariamente
idntica, aunque muy parecida.
Cuando un transposn simple se integra en un determinado punto del
ADN aparece una repeticin directa de la secuencia diana (5-12 pb).
Video: http://classes.midlandstech.edu/carterp/Courses/bio225/chap08/lecture6.htm
Transposones compuestos
Contienen un elemento
de insercin (IS) en
cada extremo en orden
directo o inverso y una
regin central que
adems suele contener
informacin de otro
tipo. Por ejemplo, los
factores de
transferencia de
resistencia (RTF), poseen
informacin en la zona
central para resistencia
a antibiticos.
http://www.mun.ca/biochem/courses/3107/Topics/Mobile_elements.html
Transposones conservativos
Elementos Tn5
Transposones
replicativos
Elementos Tn3
La transposicin es hecha por un
proceso que involucra la replicacin del
elementos transponible.
La transposasa codificada en el
elemento participa en la interaccin del
elemento y el potencial sitio de insercin.
Durante la interaccin el elemento es
replicado y una copia es insertada en un
nuevo sitio y la otra permanece en el sitio
original con la participacin de la enzima
resolvasa.
Bacteriofago Mu
Su genoma es lineal, con un tamao variable de 38-39 Kb.
Los productos de los genes a y b codifican para la protena A
(transposasa) y para la protena B (resolvasa).
La expresin de los genes es reprimida por el producto del gen c. La
transposicin requiere de dos secuencias terminales de Mu, attL y attR
(algunas veces llamado MuL y MuR).
Bacteriofago Mu
El DNA viral incluye, adems del genoma del virus, DNA bacteriano en los
extremos. El fragmento del genoma bacteriano es variable, en el extremo
izquierdo puede tener una longitud de 50-150 bases y en el derecho de
1000 a 2000 bases.
Se produce la escisin del fago del cromosoma bacteriano. Primero se
produce un corte a la izquierda que incluye parte del DNA bacteriano
adyacente, comienza a encapsidarse y una vez llenada la cabeza del
virus se produce el segundo corte a la derecha y tambin tiene DNA
bacteriano (1000-2000 bases).
En el fragmento extra
derecho del cromosoma
bacteriano puede incluirse
un gen completo de la
bacteria con lo que al
infectar a otra clula
puede introducir un gen de
una bacteria a otra.
Elementos genticos mviles
Nature Reviews Microbiology 2, 123-140 (February 2004)
Los factores de
virulencia pueden
estar codificados en
elementos genticos
mviles.
Nature Reviews Microbiology 4: 3645, 2006
Transferencia horizontal de
genes en bacterias
Mecanismos de transferencia
Conjugacin
Transferencia de material gentico por contacto clula-clula.
Plsmido conjugativo F o factor de fertilidad.
100kb.
Replicacin autnoma.
Formacin del pili sexual.
Funciones de conjugacin.
Contiene secuencias de insercin.
Episoma.
Una a tres copias.
Regin tra (E. coli)
Aproximadamente 25 genes.
14 corresponden a la formacin del pili sexual
TraA corresponde a la pilina.
En la punta TraN y TraG interactan con OmpA.
TraD forma el poro.
TraY (protena de unin a ADN) se une a oriT y permite la unin de TraI.
TraI endonucleasa/helicasa desenrolla y gua la transferencia.
Sistema de Secrecin tipo IV
Nature Reviews Microbiology 1, 137-149 (November 2003)
Transferencia por conjugacin
F
+
F
-
F
+
F
+
F
+
F
+
F
-
Modelo del crculo rodante.
Clulas Hfr
(High frequency of recombination)
Ruptura del cromosoma
Hfr en el origen de la
transferencia.
Integracin del
plsmido F para formar
la cepa Hfr
Conjugacin en otras clulas
Plsmidos autotransmisibles.
No hay presencia de pili sexual.
Se ha demostrado en
Streptococcus, Enterococcus,
Bacillus, Clostridiumy
Streptomyces.
Conjugative Plasmid Transfer in Gram-Positive Bacteria
Microbiol Mol Biol Rev. Jun 2003; 67(2): 277301.
Abstract.
Conjugative transfer of bacterial plasmids is the most efficient way of horizontal gene spread,
and it is therefore considered one of the major reasons for the increase in the number of
bacteria exhibiting multiple-antibiotic resistance. Thus, conjugation and spread of antibiotic
resistance represents a severe problem in antibiotic treatment, especially of
immunosuppressed patients and in intensive care units. While conjugation in gram-negative
bacteria has been studied in great detail over the last decades, the transfer mechanisms of
antibiotic resistance plasmids in gram-positive bacteria remained obscure. In the last few years,
the entire nucleotide sequences of several large conjugative plasmids from gram-positive
bacteria have been determined. Sequence analyses and data bank comparisons of their
putative transfer (tra) regions have revealed significant similarities to tra regions of plasmids
from gram-negative bacteria with regard to the respective DNA relaxases and their targets,
the origins of transfer (oriT), and putative nucleoside triphosphatases NTP-ases with homologies
to type IV secretion systems. In contrast, a single gene encoding a septal DNA translocator
protein is involved in plasmid transfer between micelle-forming streptomycetes. Based on these
clues, we propose the existence of two fundamentally different plasmid-mediated conjugative
mechanisms in gram-positive microorganisms, namely, the mechanism taking place in
unicellular gram-positive bacteria, which is functionally similar to that in gram-negative
bacteria, and a second type that occurs in multicellular gram-positive bacteria, which seems
to be characterized by double-stranded DNA transfer.
Model for conjugative plasmid transfer in Streptomyces. The hyphal tips of a plasmid-
carrying donor and a recipient mycelium grow together without the need for a plasmid-
encoded aggregation system. In the presence of a Tra protein, the hyphae fuse. Tra
multimers form a ring-shaped structure around the double-stranded plasmid (lower inset).
Depending on ATP hydrolysis, the unprocessed plasmid molecule is translocated through the
Tra pore into the recipient. The newly incoming plasmid is subsequently distributed to the
neighboring mycelial compartments via the hydrophobic Spd proteins, which form a pore-
like structure in the septal crosswalls (upper inset). This plasmid spreading is manifested by
the formation of pock-like inhibition zones (Fig. (Fig.66).
Microbiol Mol Biol Rev. Jun 2003; 67(2): 277301.
Conjugacin en otras clulas
Agrobacteriumtumefaciens
transfiere parte del plsmido Ti a
plantas (T-DNA) a la planta donde
se producen auxinas y citocinas
(producen un tumor), y opinas
(derivados de aminocidos), que
sirven como fuente de energa a
A. tumefaciens.
Agrobacterium tumefaciens
Transformacin
http://iescarin.educa.aragon.es/estatica/depart/biogeo/varios/BiologiaCurtis/
Involucra la adquisicin de AND
libre del medio extracelular, y la
competencia gentica es la
habilidad de llevar a cabo la
transformacin.
Experimento de Griffith con
Streptococcus pneumoniae.
Competencia
Natural
Streptococcus pneumoniae. Durante
el crecimiento se produce la protena
CSP (competence-estimulating
peptide), se forma el translocasoma
que incluye la endonucleasa EndA
que degrada una cadena y facilita la
entrada de una hebra.
Bacillus subtillis. Las clulas producen
un pptido, bajo ciertas condiciones
de estrs (alta densidad celular) la
acumulacin induce la competencia
en las clulas.
Bacterias Gram negativas
Haemophilus influenzae y Neisseria sp.
El transporte ocurre cuando
secuencias especficas DUS (DNA
uptake sequences ) son detectadas
por receptores.
Inducida
Electroporacin
CaCl
2
y bajas temperaturas.
SSTII y competencia
Nature Reviews Microbiology 2, 241-249 (March 2004)
Transformacin
natural
Figure 2 | The natural transformation of
recipient bacteria and selection of
transformants. The steps involved in this
process include the release of extracellular
DNA into the environment and the uptake
of DNA into the cytoplasm of the recipient
bacterial cell that has developed a
regulated physiological state of
competence. Following uptake, for the
transferred DNA to persist it must integrate
into the bacterial genome through
homologous recombination or by
sequence-independent, illegitimate
recombination. Plasmids that succeed in
reconstituting a replication-proficient form
do not need to integrate into the host
genome. Modified with permission from REF.
159 (1998) Blackwell Publishing, and REF.
160 (1998) Elsevier
Nature Reviews Microbiology 3, 711-721 (September 2005)
Transduccin
http://iescarin.educa.aragon.es/estatica/depart/biogeo/varios/BiologiaCurtis/
Experimento de Hershey-Chase.
Transferencia de marcadores
genticos bacterianos de una
clula a otra por medio de
bacterifagos.
Transduccin generalizada
(cualquier fragmento) y
especializada (secuencias
especficas).
Ciclo ltico y lisognico de un
bacterifago
Figure 3 | Genes and components of tailed phages. The main components of the lambdoid
phage family and the conserved order of the genes for these components is shown. Heads
(or capsids), tails and fibres are composed of several proteins, some of which interact tightly
with a defined chronology during morphogenesis. This is probably why the order of some
genes is conserved although their sequences display no detectable similarity. Global analysis
of phage genome sequences should allow the identification of the building blocks and the
rules that govern their combination into functional phages. Component genes and their
protein products include: Nu1, terminase small subunit; A, terminase large subunit; W, head
stabilization; B, portal protein; C, capsid component; Nu3, scaffold protein; D, head-DNA
stabilization; E, major head protein; FI, DNA maturation; FII, head stabilization; ZH, tail
components; M, L, K and I, tail assembly proteins; J, tail tip, host specificity; lom, outer
membrane protein; stf and tfa, tail fibre proteins. Modified with permission from REF. 88
1992 Academic Press.
Nature Reviews Microbiology 3, 722-732 (September 2005)
Transduccin generalizada
Bacterifago p22
Transduccin especializada
Bacteriofago l
Recombinacin
La recombinacin es el
proceso por el que la
informacin gentica se
ve redistribuida, tras la
transferencia de material
gentico externo al
interno.
La recombinacin permite
intercambiar grandes
conjuntos de genes,
suministrando una fuente
de variacin y seleccin
para la evolucin, ms
rpida que la mutacin.
http://www.ugr.es/~eianez/Microbiologia/17transforma.htm
Recombinacin homloga
Implica la ruptura fsica y posterior unin de hebras de ADN de forma tal
que se intercambia el contenido de ADN resultando en dos hebras
distintas.
Ocurre en zonas con alta homologa en sitios distintos del genoma.
Permite reparar cromosomas daados durante la replicacin
(mantenimiento de informacin).
Depende de la intervencin de un equipo enzimtico caracterstico,
en el que la protena RecA (o equivalente) es central en el proceso.
Mecanismo de
recombinacin
homloga
Ruptura de la hebra (endonucleasa).
Protenas de unin a ADNss.
Invasin del extremo 3OH en zonas de homologa
(helicasa).
RecBCD en E. coli (endonucleasa y helicasa).
Unin de RecA (invasin).
Movimientos de la horquilla de recombinacin.
Intermediario de Holliday.
Resolucin de la cruz de
Holliday por resolvasas
(cortan y pegan).
Productos: parches o
empalmes.
RecA se une a una simple hebra y una doble hebra.
La formacin de una triple hlice permite identificar la regin de
homologa
Mecanismo de recombinacin
homloga
Recombinacin especfica
(no-homloga)
Recombinacin especfica ilegtima: fenmenos de transposicin
~No depende de homologas.
~Es independiente de RecA.
~El elemento transponible codifica para la transposasa.
~Muchos elementos transponibles (pero no todos) poseen un mecanismo
replicativo.
Recombinacin especfica legtima
(conservativa)
~Requiere cortas secuencias de
homologa (sitio-especfica), que son
reconocidas por protenas especficas.
~Es independiente de RecA.
~Tpica la integracin de fagos en sitios
concretos del genoma de bacterias
hospederas.
Aplicaciones de la gentica
microbiana
Modificacin de
plantas
Produccin de insulina
Mutacin
Mutaciones
espontneas. Se dan
manera natural por
radiaciones, radicales
de oxgeno y por
replicacin.
Mutaciones
inducidas. Son
generalmente
producidas por
mutgenos o agentes
fsicos.
Es una modificacin heredable en la secuencia de bases del genoma.
Fenotipos
bacterianos
Utilizacin de fuentes de carbono
y energa. Capacidad de las
bacterias para utilizar
determinados sustratos como
galactosa (gal
-
/gal
+
),
lactosa (lac
-
/lac
+
), etc.
Resistencia/Susceptibilidad.
Capacidad de crecen en
presencia de inhibidores, como
antibiticos como estreptomicina
(str
R
/str
S
), ampicilina (amp
R
/amp
S
),
kanamicina (kan
R
/kan
S
), etc.
Otras caractersticas como
morfologa colonial y pruebas
bioqumicas tambin se emplean.
Las cepas silvestres son prottrofas
(crecimiento en medio mnimo), se
pueden identificar mutantes
auxtrofas incapaces de sintetizar
algn metabolito esencial, por lo que
este debe ser aadido al medio
como biotina (bio
-
), arginina(arg
-
),
metionina (met
-
), etc.
Mutaciones
Mutaciones puntuales. Un par de bases
remplaza a otro.
Transiciones, una pirimidina (o purina) es
substituida por otra. C por T A por G.
Transversiones, una pirimidina es
remplazada por una purina o viceversa.
C(T) por A o G bien A(G) por C o T.
Mutaciones por insercin. Adicin de
bases a una secuencia.
Mutaciones por delecin. Prdida de
bases en una secuencia.
Mutaciones (consecuencias)
Mutaciones silenciosas. Protenas completas con aa iguales.
Mutaciones de cambio de sentido. Protenas completas con aa
incorrectos.
Mutaciones sin sentido. Terminacin temprana por aparicin de un
triplete de terminacin.
Mutaciones polares. Ocurren en un opern por una mutacin sin
sentido, afecta la sntesis de protenas alejadas.
Mecanismos pre replicativos
Reparacin fotoenzimtica
(fotorreactivacin)
Reparacin por escisin y resntesis
Mecanismos post replicativos
Reparacin posterior a la replicacin
Reparacin por recombinacin
Reparacin inducible propensa a error
(SOS)
Mecanismos de reparacin de
los fotoproductos del ADN
Reparacin del ADN
Nature Reviews Microbiology
4, 826-836 (November 2006)
Fotorreactivacin
Sistema de reparacin directa de los
daos producidos por la luz UV (200-
300nm). La luz UV produce dmeros de
pirimidinas, fundamentalmente dmeros
de Timinas.
El enzima Fotoliasa codificada por el
gen phr reconoce en la oscuridad los
dmeros de Timina y se une a ellos, y
cuando se expone a la luz (mediante un
fotn) deshace el dmero de Timinas.
Moat, 2003
Nature 421, 436-440 (23 January 2003)
Reparacin por escisin de
nucletidos
La Endonucleasa UvrABC es
una escilnucleasa codificada
por los genes uvrA, uvrB y uvrC
que corta el ADN.
La Helicasa II de ADN separa
las dos hlices y retira 12
nucletidos.
La ADN polimerasa I rellena el
hueco producido por la
Helicasa II y la Ligasa sella los
extremos.
http://www.ucm.es/info/genetica/grupod/Mutacion/mutacion.htm
Reparacin post replicativa
Reparacin posterior a
la replicacin
Reparacin por
recombinacin
Nature 421, 436-440 (23 January 2003)
Reparacin de apareamientos
incorrectos
La reparacin de
apareamientos
incorrectos posterior a la
replicacin requiere la
existencia de un sistema
que sea capaz de realizar
las siguientes operaciones:
Reconocer las bases mal
apareadas.
Determinar cual de las
dos bases es la incorrecta.
Eliminar la base
incorrecta y sintetizar.
http://www.ucm.es/info/genetica/grupod/Mutacion/mutacion.htm
Reparacin por recombinacin
Cuando la ADN-polimerasa-III
bacteriana se encuentra, en la cadena
que est usando como molde, con un
dmero de pirimidina, deja de replicar esa
zona, y salta unos 1000 nucletidos ms
adelante para seguir la replicacin y deja
una mella de unos 1000 nucletidos.
Esta discontinuidad (llamada mella post
replicativa) se puede rellenar por el
mecanismo de reparacin por
recombinacin general, recurriendo a la
protena RecA, que verifica una
recombinacin con la hebra parental
homloga intacta.
http://www.mun.ca/biochem/courses/3107/Topics/Repair.html
Mecanismo de la reparacin
por recombinacin
Numerosas unidades de
protena RecA recubren la
zona de cadena sencilla de la
mella post-replicativa,
formando estructuras
helicoidales.
La protena RecA promueve
emparejamiento homlogo de
la cadena sencilla a la que
recubre con la doble cadena
hermana intacta.
Se produce un intercambio
recproco de cadenas.
Mecanismo de la reparacin
por recombinacin
El extremo 3'-OH libre de la cadena
daada sirve de cebador a la ADN-
polimerasa-I, que sintetiza ADN nuevo
usando como molde la cadena
complementaria intacta del dplex.
Ligacin e isomerizacin espontneas, que
produce la estructura de Holliday.
Resolucin de los dos sobrecruzamientos
por sendas roturas y religaciones, lo cual
genera dos dobles hlices ininterrumpidas.
Como se ve en la figura, uno de estos
dplex lleva el dmero de pirimidina, y el
otro es una doble cadena intacta, aunque
parte de ella contiene ADN de nueva
sntesis.
http://www.abcam.com/index.html?pag
econfig=resource&rid=10760&pid=10026
Reparacin SOS
Cuando la ADN polimerasa III
encuentra un dmero de Timina (T)
producido por luz UV no sabe que
nucletido poner saltando la regin y
dejando un hueco.
Como consecuencia esa regin
queda como ADN de hlice sencilla.
Debido a que la luz UV produce
muchos dmeros de Timina, se produce
un bloqueo en la replicacin y para
evitar que la clula muera y pueda
replicarse se dispara el sistema de
emergencia SOS.
Reparacin SOS
El ADN de hlice sencilla activa a la
protena RecA que a su vez
interacciona con la protena LexA. La
protena LexA es un represor de los
genes uvrA, uvrB, uvrD, sulA y sulB.
Todos estos genes tienen en el
promotor una secuencia denominada
caja SOS.
La protena LexA normalmente
impide la transcripcin o expresin de
los genes citados anteriormente, pero
cuando interacciona con la protena
RecA deja de impedir la expresin de
estos genes, pudindose sintetizar las
protenas correspondientes y reparar
los daos producidos por la luz UV.
Reparacin SOS
Prueba de Ames
La prueba de Ames se utiliza para determinar si un agente qumico
determinado es mutagnico (y por tanto probablemente carcinognico).
Se basa en determinar si un supuesto mutgeno es capaz de revertir un
auxtrofo - esto es, la cepa auxtrofa muta de nuevo para crecer sin una
sustancia que previamente requera.
Ames Assay
The suspected mutagen is mixed with the homogenate, where it is
metabolized to its reactive form, and then an appropriate tester
strain of Salmonella typhimuriumis added to the mix. The
activated mutagen enters the bacteriumand reacts with DNA to
cause mutations; mutations in the operon for histidine biosynthesis
that restore function ("reversions") allow the bacteriumto grow on
histidine-deficient medium, and result in visible colonies on the
assay plate. The greater the number of colonies, the more
mutagenic the chemical
In a standard Ames
assay a rat liver
homogenate is used to
provide the
cytochromes P450
necessary for activation
of mutagens to their
reactive forms.
Control de la Transcripcin
Sistemas inducibles. Cuando el sustrato sobre el que va actuar la enzima
provoca la sntesis del enzima. Al efecto del sustrato se le denomina
induccin positiva. Al compuesto que desencadena la sntesis del enzima
se le denomina Inductor.
Los sistemas inducibles se corresponden a procesos catablicos de
degradacin, por ejemplo, el opern lactosa, el opern arabinosa, el
opern maltosa. Se trata de sistemas enzimticos encargados de
degradar la lactosa, arabinosa, maltosa, etc.
Sistemas represibles. cuando el producto final de la reaccin que cataliza
el enzima impide la sntesis de la misma. Este fenmeno recibe el nombre
de induccin negativa. Al compuesto que impide la sntesis del enzima se
le denomina correpresor.
Los sistemas represibles se corresponden con procesos sntesis o
Anabolismo, por ejemplo el opern triptfano y el opern histina. Se trata
de las rutas metablicas que conducen a la sntesis de triptfano y sntesis
de histidina.
Control Positivo y control Negativo
Control positivo. Se dice que un sistema est bajo control positivo
cuando el producto del gen regulador activa la expresin de los genes,
acta como un activador.
Control negativo. Se dice que un sistema est bajo control negativo
cuando el producto del gen regulador reprime o impide la expresin de
los genes, acta como un represor.
The Nobel Prize in Physiology or Medicine
1965 was awarded jointly to Franois Jacob,
Andr Lwoff and Jacques Monod "for their
discoveries concerning genetic control of
enzyme and virus synthesis".
Franois Jacob Jacques Monod
Elementos del Opern
Un Opern es grupo de genes estructurales cuya expresin est regulada por los mismos
elementos de control (promotor y operador) y genes reguladores.
Los genes estructurales llevan informacin para polipptidos. Se trata de los genes cuya expresin
est regulada. Los operones bacterianos suelen contener varios genes estructurales, son
polignicos o policistrnicos. Hay algunos operones bacterianos que tienen un solo gene
estructural. Los operones eucariticos suelen contener un slo gen estructural siendo
monocistrnicos.
El promotor (P) se trata de un elemento de control que es una regin del ADN con una secuencia
que es reconocida por la ARN polimerasa para comenzar la transcripcin. Se encuentra
inmediatamente antes de los genes estructurales.
El operador (O) se trata de otro elemento de control que es una regin del ADN con una
secuencia que es reconocida por la protena reguladora. El operador se sita entre la regin
promotora y los genes estructurales.
El gen regulador (i) secuencia de ADN que codifica para la protena reguladora que reconoce la
secuencia de la regin del operador. El gen regulador est cerca de los genes estructurales del
opern pero no est inmediatamente al lado.
Protena reguladora. Protena codificada por el gen regulador. Est protena se une a la regin
del operador.
Inductor. Sustrato o compuesto cuya presencia induce la expresin de los genes.
Opern Lac
Genes
estructurales
El gen z+. Codifica para la b-galactosidasa que cataliza la hidrlisis de
la lactosa en glucosa ms galactosa.
El gen y+. Codifica para la galactsido permeasa que transporta b-
galactsidos al interior de la clula bacteriana.
El gen a+. Codifica para la tiogalactsido transacetilasa que cataliza la
transferencia del grupo acetil del acetil Coenzima A al 6-OH de un
aceptor tiogalactsido. Este gen no est relacionado con el
metabolismo de la lactosa, sino en el metabolismo de ciertos b-
galactsidos diferentes a la lactosa.
Opern Lac
Sin lactosa
Opern Lac
Con lactosa (alolactosa)
Efecto de la glucosa
AMPc
CRP (Receptora de AMPc o protena
activadora de catabolitos)
En un medio sin glucosa pero con
lactosa los niveles de AMPc son altos.
La protena CRP tiene sitios de unin
para el ADN y para el AMPc. El
complejo AMPc-CAP se une a una
zona cercana al promotor lac, y
favorece la unin de la ARN
polimerasa al promotor, aumentando
la transcripcin hasta 50 veces. Se ha
demostrado que el AMPc y la CAP
contribuyen a al iniciacin de la
transcripcin, ayudando al
reconocimiento del sitio de iniciacin
por la ARN polimerasa.
Mutantes
Mutantes constitutivos. Son aquellos en los que siempre se expresan o
transcriben los genes del opern lactosa, independientemente de si est o
no est presente el inductor.
Mutantes del Promotor (O
O
). Estos mutantes presentan una alteracin en
la secuencia de bases nitrogenadas de la regin promotora, como
consecuencia la ARN-polimerasa no reconoce la secuencia promotora y,
por consiguiente, no se produce la transcripcin de los genes estructurales.
Los mutantes que afectan a la adenilato ciclasa, enzima que transforma
el ATP en AMPc, muestran niveles muy bajos de expresin de los genes del
opern lactosa, debido a que los niveles de AMPc son muy bajos en
ausencia de glucosa.
Los mutantes que afectan a la protena CRP o CAP tambin presentan
niveles muy bajos de expresin de los genes del opern lactosa en
ausencia de glucosa.
Opern de Triptfano
El opern triptfano (opern trp) es un sistema de tipo represible, ya
que el aminocido triptfano (Correpresor) impide la expresin de los
genes necesarios para su propia sntesis cuando hay niveles elevados de
triptfano. Sin embargo, en ausencia de triptfano o a niveles muy bajos
se transcriben los genes del opern trp.
Genes estructurales. existen cinco genes estructurales en el siguiente
orden trpE-trpD-trpC-trpB-trpA.
Elementos de control. promotor (P) y operador (O). El promotor y el
operador estn al lado de los genes estructurales y en el siguiente orden:
P O trpE-trpD-trpC-trpB-trpA. Las enzimas codificadas por estos cinco
genes estructurales actan en la ruta metablica de sntesis del
triptfano en el mismo orden en el que se encuentran los genes en el
cromosoma.
Opern de Triptfano
Gen regulador trpR. Codifica para la protena reguladora. Este gen se
encuentra en otra regin del cromosoma bacteriano aunque no muy
lejos del opern.
Correpresor: triptfano.
Opern de Triptfano
Opern de Triptfano
Sin triptfano
Opern de Triptfano
Con triptfano