EXTRACCIN Y VERIFICACIN DE LA ACTIVIDAD DE LA SUCCNICO DESHIDROGENASA CITOCROMO
OXIDASA Y EL EFECTO DE ALGUNOS INHIBIDORES MARIA CAMILA OJEDA ROJAS Marco Terico: Qu tipo de inhibicin efecta el Malonato en la accin de la succnico deshidrogenasa?
Efecta una inhibicion competitiva, la Succinato deshidrogenasa usando malonato que es un inhibidor de la respiracin celular, se une al sitio activo del succinato deshidrogenasa el cual va a acumular succinato, alfa-cetoglutarato y citrato.
Segn Hans Adolph Krebs se encuentra que la inhibicin especifica de la enzima Succinato deshidrogenasa con Malonato, anula el efecto cataltico de todos los cidos, con acumulacin de Succinato en forma proporcional a la cantidad aadida de acido. (Migel Angel Ordorica Vargas & Maria de la luz Velazquez Monroy) Succinato deshidrogenasa: Esta xido- reductasa cataliza la oxidacin del Succinato mediante la eliminacin estereoespecifica de dos tomos de hidrogeno, en forma de hidruro H - y protn H + , para formar el enlace trans del fumarato. La enzima es un complejo formado por cuatro subunidades, con FAD Y un Hemo tipo b como grupos prostticos, adems de 3 ncleos con Hierro y azufre. (Migel Angel Ordorica Vargas & Maria de la luz Velazquez Monroy)
La oxidacin de Succinato reduce el FAD a FADH 2 .
El FADH 2 se oxida transfiriendo los electrones, atraves de los complejos de hierro y azufre, hasta la Coenzima Q componente de la cadena respiratoria. La Succinato deshidrogenasa es inhibida por el Malonato, con estructura semejante al succinato, pero que nicamente tiene un metenilo (-CH 2 -) y no se puede oxidar por deshidrogenacion. Tambien la inhibe el Oxalacetato, que tampoco se puede deshidrogenar. La Succinato Deshidrogenasa est incluida en la membrana interna de la mitocondria, formando parte del complejo II de la cadena respiratoria. (Migel Angel Ordorica Vargas & Maria de la luz Velazquez Monroy)
Mecanismo de accin del cianuro sobre la citocromo oxidasa: Forma complejos estables con iones metlicos, teniendo una gran afinidad por el hierro frrico. El complejo que forma con el metal inactiva ciertas enzimas, siendo la mas importante la citocromo-oxidasa. La inhibicin de la citocromo-oxidasa produce anoxia citotxica y paso de la glucolisis aerobia a anaerobia. Se inhibe la transformacin del piruvato en el ciclo de Krebbs, resultando en hiperproduccin de lactato y acidosis metablica severa. (AVV, 2008) El empleo de espectrofotometra diferencial o la medida del consumo de oxgeno mediante un electrodo de oxgeno combinados con el empleo de compuestos exgenos que actuaban como inhibidores respiratorios o como donadores o aceptores artificiales de electrones ha sido de gran utilidad en el establecimiento de la secuencia de actuacin en la cadena respiratoria. Algunos de estos inhibidores son: Rotenona: producto vegetal de Sudamrica que se utiliza como insecticida que bloquea el flujo de electrones desde el NADH a la coenzima Q en el CI.. Amital: frmaco barbitrico que bloquea el flujo de electrones desde el NADH a la coenzima Q en el CI. Piericidina A: antibitico. Bloquea el flujo desde el NADH al CoQ en el Complejo 1, al inhibir el flujo de electrones desde los centros sulfofrricos al CoQ. Antimicina A: antibitico de Streptomyces que bloquea el flujo electrnico desde el cit bH a CoQ en el CIII. Se une a Qn, cerca del hemo bH por el lado de la matriz. Mioxitiazol: previene el flujo de electrones desde CoQH 2 a la protena Rieske en el CIII. Se une al sitio Qp, cerca del centro Rieske y del hemo bL al lado intermembranar de la membrana. Cianuro, Azida, Monoxido de carbono: Actan sobre la citocromo oxidasa, CIV. Cianuro y azida reaccionan con la forma oxidada del citocromo objeto y CO con la forma reducida.
Donadores y aceptores de electrones artificiales son compuesto que pueden ceder o captar electrones de la cadena respiratoria en reacciones espontneas no enzimticas: dinitrofenol (dnp) y carbonilcianida-p-trifluorometoxifenilhidrazona (fccp): desacoplante qumico que no afecta a la estructura mitocondrial. Son cidos dbiles con propiedades hidrofbicas, lo que les permite difundir a travs de las membranas mitocondriales. Despus de entrar en la matriz mitocondrial en forma protonada, pueden liberar el protn, disipando de esta forma el gradiente de protones formado por la cadena respiratoria. Ionforos: Compuestos como la valomicina permiten a los iones inorgnicos atravesar la membrana. Estos ionoforos desacoplan la cadena de transferencia de electrones de la fosforilacin oxidativa disipando la contribucin elctrica al gradiente electroqumico a travs de la membrana mitocondrial. El empleo de estos compuestos fue utilizado como mtodo para determinar la secuencia de transportadores de electrones en la cadena de transferencia de electrones mitocondrial.
Fichas tcnicas:
Nombre Formula Aspecto Peligrosida d Primeros auxilios y medidas de higiene Informacin adicional Buffer de Fosfatos -- Forma: Lquida Color: Amarillo Olor: Inodoro No txico, anticorrosi vo. No presenta ninguna peligrosida d para la salud significativ a. Inhalacin: coloque en un lugar con ventilacin, respiracin artificial en caso de ser necesario. Piel: Lavar con abundante agua. Ojos: Enjuagar con abundante agua manteniendo los parpados bien abiertos. Consultar medico. Ingestin: Hacer que el afectado beba mucha agua. Para usos de laboratorio, anlisis, investigacin y qumica fina. p fenilendiamina C 6 H 8 N 2 /C 6 H 4 (NH 2 ) 2 Cristales blancos a ligeramente rojos. (N)
(C)
Inhalacin: Aire limpio y someter atencin medica. Piel: Quitar la ropa contaminada y lavar con abundante agua. Ingestin: Enjuagar la boca y someter a atencin medica. Se utiliza para fabricar tintes para el pelo y otras tinturas, poliuretano, revelado de fotografas Succinato de sodio (CH 2 COONa) 2 .6H 2 O Solido Blanco inodoro. -- Inhalacin: Trasladar a la persona al aire libre. Piel: Lavar abundantemente con agua. Quitarse las ropas contaminadas. Ojos: Lavar con agua abundante manteniendo los prpados abiertos. Ingestin: Beber agua abundante. Provocar el vmito. En caso de malestar, pedir atencin mdica. En caso de prdida del conocimiento nunca dar a beber ni provocar el vmito. Cianuro de potasio KCN Terrones amorfos o masa cristalina de color blanco. Sin olor cuando esta seco. (Xn)
(N)
Inhalacin: Trasladar al aire fresco, si no respira dar respiracin artificial, si respira con dificultad suministrar oxigeno. Ingestin: Lavar la boca con agua, no dar nada de beber ni inducir el vomito. Piel: Retirar ropa contaminada lavar la zona afectada con abundante agua. Ojos: Lavar con abundante agua Mnimo durante 15 min.
Estable si esta seco. En presencia de aire o humedad se descompone para formar cianuro de hidrogeno. Azida de sodio NaN 3 Solido, blanco, inodoro. (C)
(N)
(Xn)
Inhalacin: aire fresco. Tras parada respiratoria: Inmediatamente proceder a respiracin instrumental. En su caso, aplicar oxgeno. Piel: aclarar con abundante agua. Eliminar inmediatamente la ropa contaminada. Ojos: Aclarar con abundante agua, manteniendo abiertos los prpados. Ingestin: estando consciente, beber abundante agua, provocar vmito, administrar carbn activo (20 - 40 g de suspensin al 10%). Llamar inmediatamente al mdico. Mantener seco el lugar de trabajo. La sustancia no debe entrar en contacto con agua.
Malonato de sodio C 3 H 2 Na 2 O 4 Polvo, cristalino blanco, inodoro. Sustancia no peligrosa. Inhalacin: Ir al aire fresco. En caso de asfixia proceder a la respiracin artificial. En caso de que persista el malestar, pedir atencin mdica. Piel: Lavar abundantemente con agua y jabn. Quitarse las ropas contaminadas. Ojos: Lavar con agua abundante (mnimo durante 15 minutos), manteniendo los prpados abiertos. Pedir atencin mdica. Ingestin: Enjuagarse inmediatamente la boca. Por ingestin de grandes cantidades: En caso de malestar, pedir atencin mdica. Asegurar una buena ventilacin y renovacin de aire del local. Oxalato de sodio C 2 Na 2 O 4 Solido, blanco, inodoro (Xn)
(C)
Inhalacin: aire fresco. Piel: aclarar con abundante agua. Eliminar ropa contaminada. Llamar al mdico. Ojos: Aclarar con abundante agua, manteniendo abiertos los prpados. Ingestin: hacer beber inmediatamente agua abundante. Llamar al mdico. Evitar la penetracin del agua de extincin en acuferos superficiales o subterrneos. (Hojas de datos de Seguridad, 2005)
Procedimiento:
Extraccin y preparacin de las enzimas y coenzimas Pesar una muestra de 6g de tejido
Colocarla en un mortero
Enfriar en bao con hielo
Macerar Adicionando buffer de fosfatos
Centrifugar por 5 minutos
Transferir el sobrenadante a un erlenmeyer pequeo
Mantenerlo en bao de hielo todo el tiempo
Seguimiento de la reaccin catalizada por la citocromo oxidasa. Hiptesis:
4 Tubos de ensayo Preparar una serie de tubos segn la tabla
con arena lavada Cuidadosamente hasta formar una pasta suave Poco a poco, hasta completar un volumen de aproximadamente 18 mL. a 1500 rpm Identificado como extracto enzimtico Hasta el momento de usarlo.
Registre el tiempo necesario para que se presente la decoloracin
termostatado a 37 o C durante 10 minutos djelos en reposo Tomando como el momento cero aquel en el que se adiciona la enzima Bibliografa:
AVV, A. (16 de Febrero de 2008). Intoxicacion por Cianuro. Recuperado el 10 de noviembre de 2013, de http://es.slideshare.net/ALVARO_AAV/intoxicacin-por-cianuro Hojas de datos de Seguridad. (21 de Marzo de 2005). Recuperado el 10 de Noviembre de 2013, de http://www.cisproquim.org.co/HOJAS_SEGURIDAD/Cianuro_de_potasio.pdf Migel Angel Ordorica Vargas & Maria de la luz Velazquez Monroy. (s.f.). Ciclo del cido Ctrico. Recuperado el 10 de Noviembre de 2013, de http://www.bioquimica.dogsleep.net/Teoria/archivos/Unidad62.pdf