RECONOCIMIENTO DE PROTEINAS

Autores: NatalyYisel Meza Ortega Manuela Coral Ruiz Anny Bravo.

RESUMEN
Al presentar el laboratorio seguimos el procedimiento paso a paso para llegar a los
resultados obtenidos en el siguiente informe. La persona que dono la saliva hace un
procedimiento de limpieza bucal para despus tener en su boca 20 ml
aproximadamente de agua destilada, por un tiempo de 2 minutos hasta que exista una
cantidad considerable de amilasa salival para realizar la prueba, despus este es
depositado en un beaker. Tomamos 3 tubos de ensayo los cuales marcamos con los
siguientes nmeros: 0-40-100 y procedimos a agregar a cada uno 1 ml de almidn. A
dos de ellos los sometimos a bao mara y despus colocamos en ellos 0.5 ml de
amilasa salival despus se agita cada uno de ellos. Tomamos la placa colorimtrica y
a esta le aadimos 3 gotas de lugol en tres cavidades diferentes y colocamos en cada
uno de las cavidades 5 gotas de la sustancia de cada uno de los tubos utilizados
anteriormente.
A continuacin rotulamos tres tubos mas con los nmeros 3-7-10, al tubo tres le
agregamos 1 ml de almidn y 2 ml de amortiguador de pH 3, al tubo 7se le agrego 1
ml de almidn y 2 ml de amortiguados pH 7 y al tubo 10 1 ml de almidn y 2 ml de
amortiguador de pH 10. Despus estos tubos los dejamos en bao mara durante un
tiempo de 5 minutos, despus agregamos a cada uno de los tubos 0.5 ml de amilasa
salival posteriormente tomamos el tubo 3 y agregamos 5 gotas de esta solucin en la
placa de porcelana que contiene dos gotas de lugol y as sucesivamente repetimos
este mismo procedimiento con los tubos restantes.
Procedimos con la rotulacin de tres tubos de ensayo los cuales marcamos con los
nombres de amilasa, pepsina y ureasa. A cada uno de ellos agregamos 1 ml de
almidn y 2 ml de amortiguador de pH. Depositamos los tubos en el agua a la
temperatura requerida y despus de 5 minutos al tubo que se marco como amilasa
agregamos 0.5 ml de amilasa salival, al tubo marcado como pepsina, 0.54 ml de
pepsina y al tubo marcado como ureasa 0.5 ml de ureasa y despus procedimos a
ensayar con lugol, como lo hicimos con las sustancias de los anteriores tubos.
Finalmente rotulamos 3 tubos de ensayo como amilasa, mercurio y plomo, y a cada
uno agregamos 1 ml de almidn, 2 ml de amortiguador de pH al tubo rotulado como
mercurio le agregamos 1 ml de HgCl (cloruro de mercurio) y al tubo rotulado como pb
agregamos 1 ml de nitrato de plomo, depositamos los tubos en el agua a temperatura
optima. Esperamos 5 minutos y agregamos a cada tubo 0.5 ml de y se evalan los
resultados como se hizo anteriormente.

Palabras clave: enzimas, amilasa, actividad enzimtica, factores enzimticos.






INTRODUCCION
SALIVA
La saliva (tambin conocida
como baba) es un fluido orgnico
complejo producido por las glndulas
salivales en la cavidad bucal, y
directamente involucrada en la primera
fase de la digestin.
La saliva puede ser vehculo de
contagio de enfermedades en
humanos, como el herpes labial o
la mononucleosis.

PRODUCCION
Se estima que la boca est
humedecida por la produccin de entre
1 y 1.5 litros de saliva al da, durante la
vida de una persona se generan unos
34.000 litros. Esta cantidad de saliva es
variable ya que va disminuyendo
conforme avanzan los aos y debido a
diferentes tratamientos.
1

La produccin de saliva est
relacionada con el ciclo circadiano, de
tal manera que por la noche se segrega
una mnima cantidad de saliva.
La saliva es segregada por
las glndulas
salivares mayores partida y submaxila
r (80%- 90%)) en condiciones
estimuladas, mientras que
las glndulas sublinguales producen
solo el 5% del total. Las glndulas
menores son responsables
basicamente de la secrecin en reposo
y contribuyen al 5% al 10% del total de
saliva secretada.
2

La disminucin patolgica de saliva
recibe el nombre de hiposalivacin o
hiposialia, mientras que la sensacin
de sequedad bucal se
denomina xerostoma, y la produccin
excesiva, sialorrea.
La medicin de la produccin de la
saliva se llama sialometra.

CARACTERISTICAS Y FUNCION
La saliva es un lquido transparente y
de viscosidad variable, lo cual se
atribuye al cido silico. Es inodora
como el agua.
La composicin y pH de la saliva varan
en funcin de los estmulos (como el
olor o la visin de la comida). El pH
salival normal oscila entre 6,5 y 7.
3

La composicin de la saliva es similar a
la del plasma y se caracteriza por los
siguientes componentes:
Agua: Representa un
99,5 %.
4

5
Permite que los
alimentos se disuelvan y se pueda
percibir su sabor a travs
del sentido del gusto.
Iones cloruro: Activan
la amilasa salival o ptialina.
Bicarbonato y fosfato: Neutralizan
el pH de los alimentos cidos y de
la corrosin bacteriana.
Moco:: El contenido de mucina,
glicoproteina fundamental de la
saliva, produce la viscosidad
necesaria para funciones
lubricantes y de formacin del bolo
alimenticio que facilita
la deglucin a lo largo del tubo
digestivo, sin daarlo.
6

Lisozima: Es una sustancia
antimicrobiana que destruye las
bacterias contenidas en los
alimentos, protegiendo en parte
losdientes de la caries y de las
infecciones.
Enzimas: Como la ptialina, que es
una amilasa que hidroliza
el almidn parcialmente en la boca,
comenzando la digestin de
loshidratos de carbono. La lipasa
lingual inicia tambin la digestin
de grasas.
6

Estaterina: Con un extremo amino
terminal muy cido, que inhibe la
precipitacin de fosfato clcico al
unirse a los cristales de
hidroxiapatita. Adems, tambin
tiene funcin antibacteriana y
antifngica.
Otras sustancias: La saliva
contiene
tambin inmunoglobulinas especfic
as, transferrina y lactoferrina. En el
2006 investigadores franceses del
Instituto pasteur identificaron una
sustancia en la saliva humana que
llamaron Opiorfina, similar a la
encontrada enb ratas y vacas, que
es hasta seis veces ms potente
que la morfina para calmar el
dolor.
7

2

Calcio:: La saliva est saturada de
Ca++, con lo que se evita que los
dientes lo pierdan y ayuda a digerir
el alimento.

LA AMILASA
denominada
tambin sacarasa o ptialina, es
un enzima hidrolasa que tiene la
funcin de catalizar la reaccin de
hidrlisis de los enlaces 1-4 del
componente -Amilosa al digerir
el glucgeno y el almidn para
formar azcares simples, se produce
principalmente en las glndulas
salivares (sobre todo en las glndulas
partidas) y en el pncreas. Tiene
actividad enzimtica a un pH de 7.
Cuando una de estas glndulas se
inflama, como en lapancreatitis,
aumenta la produccin de amilasa y
aparece elevado su nivel
en sangre(amilasemia). Fue la primera
enzima en ser identificada y aislada
por Anselme Payen en1833, quien la
bautiz en un principio con el nombre
de "diastasa".
El trabajo de una enzima puede verse
afectado por diversos factores, desde
el pH, la temperatura, iones metlicos,
y la concentracin del sustrato. En el
laboratorio se estudiaron todos estos
diversos factores comprobando que
una enzima se comporta de una
manera extraordinaria frente a los
procesos de hidrlisis del almidn.
La a-amilasa es una enzima proteica
que se encuentra en la saliva humana y
cataliza la degradacin del almidn,
que es un polisacrido de reserva
vegetal. El almidn est formado por
dos tipos de molculas: la amilosa y la
amilopectina ambos polisacridos de
glucosa. La amilosa se conforma por
cadenas lineales de glucosas unidas
por enlaces a- C1-C4, mientras que la
amilopectina tiene, adems de estos
ltimos enlaces, uniones C1 con C6,
formando cadenas ramificadas. La a-
amilasa rompe uniones C1-C4, tanto en
la amilasa como en la amilopectina,
dejando dextrinas lineales y
ramificadas (oligosacaridos) como
productos.
















MATERIALES Y METODOS
Materiales y reactivos:
2 Beaker de 100 mL
Gradilla con 12 tubos de ensayo
Cinta de enmascarar
Hielo
Termmetro
Pipeta de 2 mL
Agitador de vidrio
Placa colorimtrica
Gotero
Mechero y placa
150 mL de suspensin de
almidn
50 mL de reactivo de lugol
50 mL de solucin
amortiguadora de pH 3
100 mL de solucin
amortiguadora pH 7
50 mL de solucin
amortiguadora pH 10
10 mL de pepsina al 0,1%
10 mL de ureasa al 0,1%
10 mL de cloruro de Mercurio al
1%
10 mL de nitrato de plomo al 1%
Mtodos:
Preparacin de amilasa
salival
Influencia de la temperatura
sobre la actividad de la
amilasa salival
Influencia del pH en la
actividad enzimtica
Especificad de la enzima
Efecto de los iones
metlicos pesados sobre la
accin de la amilasa



RESULTADOS
1
INFLUENCIADE LA
TEMPERATURA SOBRE LA
ACTIVIDAD DE LA AMILASA
SALIVAL
Ro
tu
lo
Tipo de
bao
(10 min)
Color
resultante
T

I
d
e
a
l
0 Bao de
Hielo
Azul
oscuro

40 Bao
mara T
entre (35
y 40 C)
Amarillo
ocre

X
100 Bao
mara a
ebullicin
Azul
oscuro


2
INFLUENCIA DE LA
TEMPERATURA SOBRE LA
ACTIVIDAD DE LA AMILASA
SALIVAL
R
o
t
u
l
o
Amortig
uador
de
pH
Color
resultante

pH

op
ti
mo
3 3 Azul
oscuro

7 7 Amarillo
ocre
X
1
0
10 Caf
oscuro







3
ESPECIFICIDAD DE LA
ENZIMA
rotulo Color
resultante
Rx
(positiva)
amilasa Amarillo
ocre
X
Pepsina negro

ureasa
negro

4
EFECTO DE LOS IONES
METALICOS PESADOS
SOBRE LA ACCIN AMILASA
rotul
o
Reactivo
adicional
Color
resulta
nte
R
x
Amil
asa
_________ amarillo X
Hg 1 mL de
HgCl
Azul
oscuro

Pb 1 mL de
nitrato de
plomo
(Pb(NO
3
)
2
)
negro


EVICENCIA DE LOS
RESULTADOS
- Influencia de pH en la
actividad enzimtica

- Efecto de los iones
metlicos pesados sobre la
accin de la amilasa.













- Especificidad de la enzima







ANALISIS DE LOS
RESULTADOS

La -amilasa es una enzima
proteica que se encuentra en
la saliva humana y cataliza la
degradacin del almidn, que
es un polisacrido de reserva
vegetal. El almidn est
formado por dos tipos de
molculas: la amilosa y la
amilopectina, ambos
polisacridos de glucosa. La
amilosa se conforma por
cadenas lineales de glucosas
unidas por enlaces - C1-C4,
mientras que la amilopectina
tiene, adems de estos
ltimos enlaces, uniones C1
con C6, formando cadenas
ramificadas. La -amilasa
rompe uniones C1-C4, tanto
en la amilasa como en la
amilopectina, dejando extrinas
lineales y ramificadas
(oligosacridos) como
productos.
Para medir la actividad
enzimtica de la -amilasa, se
utilizar un test colorimtrico
que detecta el almidn. Para
ello se contar con una
solucin de lugol, ya que el
Hg Pb
Amilasa
3 7
10
Amilasa
Pepsina
Ureasa
almidn en presencia de esta
solucin adquiere una
coloracin azulada
caracterstica. Esto tiene una
explicacin fsica: el lugol se
coloca en el interior de la
hlice que forma la amilosa
(en las regiones hidrofbicas),
formando un complejo de
color azul. Cuando la -
amilasa acta, degrada la
amilosa, se desintegra la hlice
y por tanto en presencia de
lugol ya no dar una coloracin
azul, sino un color amarillo
ocre.
1
.
En este laboratorio mediremos
la desaparicin de sustrato
(evidenciada por el test
colorimtrico) para determinar
la actividad de la enzima.
Adems, analizaremos cmo
afectan las distintas
condiciones en que acta la
enzima. En la primera parte del
laboratorio se estudi la
influencia de la temperatura
sobre la actividad de la amilasa
salival en el cual se rotulo 3
tubos de ensayo como 0, 40 y
100 que corresponden a la
temperatura a la que se someti
1 mL de almidn al 0.5%, que
despus de 10 minutos se
adiciono 0.5 mL de amilasa
salival, como se puede observar
el factor que afecta la actividad
es la temperatura, la velocidad
de muchas reacciones
enzimticas se duplica
aproximadamente por cada
10C que aumenta la
temperatura. Como la funcin
enzimtica depende de la
estructura terciaria (o
cuaternaria) la actividad de la
enzima puede llegar a
desaparecer si se producen
cambios notables de
temperatura. La mayora de las
enzimas se inactivan a T
comprendidas entre 50 y
60C
2
. Por lo tanto en nuestro
caso la temperatura ptima es
de 40 C.
Enseguida se estudio la
influencia del pH en la actividad
enzimtica con almidn
aadiendo 2 mL de
amortiguador de pH 3, 7,10.
La mayora de los enzimas son
muy sensibles a los cambios de
pH. Desviaciones de pocas
dcimas por encima o por
debajo del pH ptimo pueden
afectar drsticamente su
actividad.
El pH alto o bajo se puede
producir la desnaturalizacin de
la enzima y en consecuencia su
inactivacin
3
.
El pH Tambin afecta la forma
y por lo tanto la tasa de
reaccin, cada enzima tiene un
pH ptimo. ste est entre pH 6
- 8 para la mayora de las
enzimas
4
, como en este caso
que es de 7 donde se desarrolla
la intensidad mxima de la
actividad de la enzima y en el
prueba se obtuvo un color
amarillo ocre que confirma que
es optimo.
En la prueba de especificidad
enzimtica se rotulo tres tubos
como amilasa, pepsina y ureasa
y a cada uno se le agrego 1 mL
de almidn, despus de
someter a un bao de
temperatura optima (40C)y
esperar 5 minutos se agreg
0,5 mL de la enzima
correspondiente a cada tubo al
que se les realizo la prueba
colorimtrica donde la amilasa
sali positivo con color amarillo
y la pepsina y la ureasa
negativo con color negro.
Las enzimas son muy
especficas, discriminando
fcilmente entre sustratos con
estructuras muy similares como
en el caso de la pepsina y la
ureasa donde la coloracin
indica que no hay actividad
enzimtica porque la pepsina es
una enzima que interviene en la
digestin de protenas, por lo
tanto no acta cuando el
sustrato es almidn el cual es
un polisacrido de reserva
tpico de las plantas; en cuanto
a la ureasa es una enzima que
degrada la urea en amoniaco y
no dara el caso con el almidn.
Y se comprueba que la -
amilasa ( (1-4)-glucan-4-
glucanohidrolasa) acta sobre
la -amilosa en donde hidroliza
al azar los enlaces (1-4)
formando una mescla de de
glucosa y maltosa
libresdndonos una coloracin
amarilla en la placa
colorimtrica.
Y en el efecto de los metales
pesados sobre la amilasa salival
Los iones metlicos inhiben la
actividad enzimtica esto se
debe a que cambian la
naturaleza del centro activo
impidiendo la formacin del
complejo enzima sustrato.
Adems los metales, pueden
participar como catalizadoras
para reacciones no deseadas
como por ejemplo facilitar
reacciones de oxido reduccin
del ion metlico.





CONCLUSIONES

- La mejor actividad
enzimtica que se obtuvo es
a una temperatura de 40C,
debido a que se encuentra
establecida en la literatura
como optima. Por esta razn
se concluye que la enzima
estuvo en su mxima
actividad y funcionamiento.
- Con el desarrollo
experimental de la presente
practica nos pudimos
percatar de que la variacin
de una enzima en su
metabolismo depende
directamente de los factores
de factores fisicoqumicos.
- Se puede mencionar que
hay sustancias encargadas
de inhibir las reacciones de
sustrato con enzima, como
los metales pesados, un
ejemplo de ello son la plata
y el mercurio.
- Con esta investigacin se
puede concluir que la accin
de la amilasa salival es
bastante buena y, sobre
todo, rpida en ayuda de
una temperatura similar a la
temperatura corporal, ya
que sin ella la actividad
enzimtica se desfavorece y
la protena se puede
desnaturalizar o perder su
actividad.

RECOMENDACIONES
No pipetear los reactivos con la
boca ya que estos pueden ser
txicos y causar dao en el
organismo.
Mantener los reactivos en la
cmara de aire ya que estos
expulsan unos gases que
pueden ser perjudiciales para la
salud.
Lavar muy bien la boca antes y
no haber comido ningn
alimento si se es voluntario para
donar la saliva.
Hacer buches con agua de grifo
para eliminar cualquier residuo
de comida que pueda quedar
localizado en la boca y de esta
manera obtener mejores
resultados.
Lavar muy bien la placa
colorimtrica antes de usarla
para que los resultados sean
exactos y no aparezcan falsos
positiva.

CIBERGRAFIA

1. Actividad enzimtica de la
amilasa, tomado el 26 de
octubre a las 3:31 pm de,
http://www.monografias.com/tra
bajos-pdf900/actividad-
enzimatica-amilasa/actividad-
enzimatica-amilasa.pdf
2. FACTORES QUE REGULAN LA
ACTIVIDAD ENZIMTICA tomado el
26 de octubre a las 4:10 pm
de,http://www.slideshare.net/cipr
esdecartagena/factores-que-
regulan-la-actividad-enzimtica-
5852800
3. libro botanica online, enzimas,
tomado el 26 de octubre a las
4:12 pm de,
http://www.forest.ula.ve/~rubenh
g/enzimas/index.html
4. Planta Piloto de
Fermentaciones
Departamento de Biotecnologa
Efecto del pH en la actividad
enzimtica tomado el 26 de
octubre a las 4:23 pm de,
http://docencia.izt.uam.mx/sgpe/
files/users/uami/sho/Tema_5b_
pH.pdf