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TEMAS DE BACTERIOLOGA Y VIROLOGA MDICA

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Principales
mecanismos de
resistencia antibitica
R. Vignoli, V. Seija
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La resistencia bacteriana a los antibiticos es un tema amplio, que puede ser considerado
desde distintos ngulos. Queremos resaltar tres perspectivas fundamentales, pues conside-
ramos que el futuro mdico debe saber en todo momento a que nos estamos refiriendo en
cada uno de ellos, para darle la interpretacin correcta a la informacin que habitualmente
le llega a las manos, ya sea a travs de las comunicaciones cientficas, como de los informes
del laboratorio. De este modo podemos referirnos a mecanismos de resistencia individuales,
resistencia poblacional y resitencia poblacional en microorganismos que estn produciendo
una infeccin.
Resistencia individual: se refiere a la interaccin molecular entre una clula bacteriana
con todo su arsenal gentico y metablico, y un antibitico determinado.
Se estudian aqu las distintas herramientas con que cuenta una bacteria para evitar la
accin del antibitico en cuestin. Al referirnos a arsenal gentico y metablico queremos
sealar que no siempre es suficiente con que el microorganismo posea un gen que codifica un
mecanismo de resistencia en particular. Ese gen o esos genes deben ser expresados en cantidad
y calidad suficiente, y muchas veces deben interactuar distintos mecanismos de resistencia
para alcanzar la sobrevida bacteriana. Como ejemplo se puede destacar la expresin en E. coli
de su betalactamasa de clase C (tipo Amp-C). El gen que codifica para esta enzima capaz de
romper distintos antibiticos betalactmicos (ver ms adelante) se encuentra naturalmente
codificado en el cromosoma de dicha bacteria, sin embargo la expresin de esta enzima es
mnima debido a que este microorganismo carece del promotor natural (Amp-R ). De este
modo, si bien E. coli posee un gen capaz de producir un efectivo mecanismo de resistencia, su
escasa expresin (asociada a la accin residual de algn promotor que se encuentre corriente
arriba en el cromosoma bacteriano) hace que el microorganismo pueda comportarse como
sensible a ampicilina.
Resistencia poblacional: representa el comportamiento in vitro de un inculo bacteriano
preestablecido (una poblacin bacteriana) enfrentado a determinada concentracin de un
antibitico, por un perodo de tiempo determinado. Estos son los tipos de estudios que en
general se realizan en el laboratorio clnico. Los resultados finales de estos estudios darn un
informe de sensibilidad o resistencia, que son muy importantes para la orientacin teraputica
del paciente, pero que no siempre coinciden con el xito teraputico. As, en un paciente
que presenta una infeccin urinaria baja (cistitis) producida por una cepa de E. coli, en oca-
siones puede obtenerse un tratamiento eficaz con ampicilina, pese a que los estudios in vitro
muestran que es resistente a la misma. Esto es debido a que los betalactmicos se concentran
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ms de 100 veces en la vejiga que en el plasma, por lo que alcanzan niveles que exceden las
posibilidades de resistencia bacteriana. En el otro extremo, un coco grampositivo como S.
aureus o S. pneumoniae, que in vitro es sensible a eritromicina, no puede ser combatido con
este antibitico si se encuentra produciendo una bacteriemia, debido a que los macrlidos
alcanzan una concentracin plasmtica insuficiente.
Resistencia poblacional en microorganismos que estn produciendo una infeccin: en
este caso hablamos de eficacia teraputica y juegan otros factores, como el sitio de infeccin,
las propiedades farmacocinticas del antibitico (donde se encuentran includas la dosis y
el fraccionamiento diario del mismo), el estado inmunolgico del paciente, el tamao del
inculo bacteriano, etc. La recuperacin del estado de salud del paciente, es el parmetro
que determina la efectividad del tratamiento.
Estos tres conceptos forman peldaos de una escalera que se debe transitar para alcanzar
el objetivo final, que es la erradicacin de una enfermedad infecciosa de origen bacteriano,
en un paciente en particular. Dado que los antibiticos van a actuar directamente sobre el
microorganismo productor de la infeccin (y por defecto tambin contra la flora normal),
parece lgico pretender que el estudiante de medicina deba entender las bases de la interac-
cin antibitico-microorganismo, para que ms adelante en la carrera pueda disear planes
teraputicos con el menor costo posible. Solo por este captulo vamos a considerar que el
nico costo en cuestin es la aparicin de resistencia bacteriana.
Precisamente la interaccin antibitico-bacteria se refiere al juego entre los mecanismos
de accin de los antibiticos y los mecanismos de resistencia bacterianos.
El primer componente de este binomio ya fue analizado en el captulo 34, por lo que en esta
instancia nos referiremos a los mecanismos de resistencia bacterianos a los antibiticos.
Tipos de resistencia
La resistencia antibitica puede ser natural (intrnseca) o adquirida. La resistencia natural es
propia de cada familia, especie o grupo bacteriano. Por ejemplo, todos los grmenes gramne-
gativos son resistentes a la vancomicina, y esta situacin no es variable. La resistencia adqui-
rida es variable y es adquirida por una cepa de una especie bacteriana. As, existen cepas de
neumococo que han adquirido resistencia a la penicilina, cepas de Escherichia coli resistentes
a la ampicilina, cepas de estafilococos resistentes a la meticilina. Esta resistencia adquirida
es la que estudiamos en el laboratorio e informamos al clnico. La resistencia adquirida es
la que puede llevar a un fracaso teraputico cuando se utiliza un antibitico supuestamente
activo sobre el germen que produce la infeccin.
Gentica de la resistencia
Las bacterias son capaces de adquirir resistencia en funcin de su variabilidad gentica.
Nuevos mecanismos de resistencia pueden ser adquiridos mediante mutacin o mediante
transferencia de material gentico entre clulas bacterianas de especies relacionadas o diferen-
tes. Estos genes de resistencia pueden estar codificados en el material gentico cromosmico
o extracromosmico (plsmidos). Tener presente estos elementos tiene implicancias epide-
miolgicas e incluso en algunos casos teraputicas, como se ver ms adelante.
SISTEMATIZACIN
La gran mayora de los mecanismos de resistencia pueden agruparse en tres categoras.
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Inactivacin enzimtica: el principal mecanismo de inactivacin es la hidrlisis, como
sucede con las betalactamasas y los betalactmicos, pero tambin pueden ocurrir mo-
dificaciones no hidrolticas tales como las acetilaciones, adenilaciones o fosforilaciones
inactivantes de aminoglucsidos.
Modificaciones en el sitio blanco: existen diversas estrategias para alcanzar este objetivo.
Destacaremos algunas como ser: modificaciones en el gen que codifica el propio blanco
del antibitico, como por ejemplo las alteraciones en las PBP de Streptococcus pneumoniae
que confiere resistencia a penicilina e incluso a ceftriaxona; la adquisicin de genes que
codifiquen para sustitutos de los blancos originales, como PBP2 en Staphylococcus spp.
meticilinorresistentes o la dihidrofolato reductasa alternativa en las cepas resistentes a
trimetoprim.
Alteraciones de la permeabilidad: se pueden incluir aqu tres tipos.
1. Alteraciones de las membranas bacterianas: se ve fundamentalmente en gramnegati-
vos, donde la membrana externa de la envoltura celular rica en lpidos es impermeable
a las sustancias hidroflicas. De este modo dichas sustancias quedan confinadas a la
penetracin a travs de protenas transmembrana con funcin de porinas. Existen
algunas molculas de antibitico, como penicilina y vancomicina, que por su tamao
son incapaces de pasar a travs de las porinas de bacilos gramnegativos. La disminucin
de la expresin de dichas porinas puede disminuir el flujo de llegada del antibitico al
espacio periplsmico. Se considera que en este caso los niveles de resistencia alcanza-
dos no suelen ser suficientes como para conferir resistencia absoluta a un antibitico.
La ocurrencia simultnea de este mecanismo unido a otro, por ejemplo hidrlisis
enzimtica (an en niveles discretos), s puede conferir altos niveles de resistencia y
ocasionar fallos teraputicos.
2. Alteraciones en la entrada de antibiticos dependiente de energa, como ocurre en
la primera etapa de ingreso de los aminoglucsidos. (Ver ms adelante)
3. Aumento de la salida de antibiticos: la resistencia por eflujo es un mecanismo ines-
pecfico, que afecta a diferentes grupos de antibiticos como betalactmicos,
quinolonas, tetraciclinas y cloranfenicol. En gramnegativos estos sistemas en general se
encuentran constitudos por tres protenas: una de alto peso molecular asociada a la
membrana citoplasmtica, una con funcin de fusin de ambas membranas y una
porina asociada a la membrana externa. Dentro de los mltiples sistemas de eflujo, los
ms conocidos son Mex AB-Opr M, Mex CD-Opr J y Mex EF-OprN. Siendo Mex
A, Mex C y Mex E protenas homlogas de aproximadamente 110 kD asociadas a la
membrana citoplasmtica; Mex B, Mex D y Mex F protenas de aproximadamente
40 kD, responsables de la fusin de ambas membranas y por ltimo Opr M, J y N
porinas de membrana externa de aproximadamente 50 kD. Estos sistemas as consti-
tudos exportan molculas desde el citoplasma hacia fuera de la membrana externa.
En grampositivos se trata de una protena transmembrana con funcin ATPasa que
acta como bomba de eflujo.
A continuacin se considerarn los mecanismos de resistencia de los grupos de antibiticos
ms utilizados a nivel clnico.
MECANISMOS DE RESISTENCIA A LOS ANTIBITICOS QUE ACTAN SOBRE LA PARED
BACTERIANA
La pared bacteriana presenta la doble caracterstica de ser una estructura vital para los micro-
organismos que la poseen y exclusiva de estos. De manera que el diseo o hallazgo de molculas
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de antibiticos que actan a este nivel, constituye una herramienta poderosa y segura para
el combate de las infecciones bacterianas. Su principal funcin es de proteccin osmtica,
permitiendo la sobrevida bacteriana en diversas condiciones de osmolaridad, incluyendo los
cambios bruscos de un medio a otro. Esta funcin se lleva a cabo merced al peptidoglicano, que
acta como una armadura o malla envolviendo la bacteria, ofrecindole rigidez y estabilidad.
Sin embargo, para entender tanto el mecanismo de accin de los betalactmicos como sus
mecanismos de resistencia, es necesario considerar no solo la estructura del peptidoglicn,
sino tambin todo el mecanismo biosinttico del mismo, el cual se encuentra acoplado al
crecimiento bacteriano y a la regulacin de diversos mecanismos de resistencia.
Peptidoglican o murena
Estructura: el peptidoglicn se puede dividir en dos regiones.
1. Un polmero de aminoazcares orientado en sentido transversal, compuesto por la unin
cclica y repetitiva de un dmero de N acetilglucosamina (NacGlc) y cido N acetilmur-
mico (NacMur), mediado por uniones 1-4.
2. Una fraccin peptdica que est formada por un pentapptido que se encuentra unido
covalentemente a la molcula del NacMur y que clsicamente se constituye por L-alanina
(Lala)-D-glutmico-(Dglu) Ac mesodi aminopimlico(mDAP) (en bacilos gramnega-
tivos) o L- Lysina(L-Lys) en grampositivos y un dipptido terminal D alanil-D-alanina
(Dala-Dala). La estructura compuesta como NacGlc-NacMur pentapptido constituye
el peptidoglicn precursor. (Figura 1)
Entre las unidades peptdicas se produce el entrecruzamiento longitudinal que le otorga
funcionalidad al polmero. Este entrecruzamiento se da de modo tal, que en bacilos gramne-
gativos se realiza mayoritariamente entre la Dala ubicada en la posicin cuatro y el mDAP.
Mientras que los grampositivos utilizan un pentapptido de glicina, para unir Dala a Lys. Este
entrecruzamiento tridimencional, le da la rigidez a la molcula de peptidoglicn, le permite
Figura 1. Esquema de los Componentes del Peptidoglican
NacGlc
NacMur
Lnlace b l- 4
L-alanina
D-glutamico
Ac.meso DAP
D-alanina
D-alanina
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cumplir con sus funciones principales (mantenimiento de la presin osmtica, determinacin
de la forma bacteriana y participacin en la elongacin y divisin celular).
Biosntesis: la sntesis de esta estructura, se puede dividir en tres grandes pasos.
1. Intracitoplasmtico, dependiente de ATP donde se constituye el precursor NacGlc- Na-
cMur pentapptido unido a UDP (uridin di fosfato).
2. La segunda etapa es intramembranal y consiste en la unin mediante un enlace de piro-
fosfato del precursor, a un lpido transportador (bactoprenol) y la transposicin hacia el
espacio periplsmico.
3. La tercer y ltima etapa es periplsmica y consiste bsicamente en dos pasos, la elongacin
del peptidoglicn preexistente y el entrecruzamiento de las cadenas peptdicas.
Etapa citoplasmtica: una vez sintetizado el UDP-Nac-Mur como producto derivado de
la reduccin del UDP-Nac-Glc, comienza la fase del ensamblaje del componente peptdico.
Esto se produce mediante uniones secuenciales y consecutivas, mediadas por ligasas, que van
agregando la L-alanina, luego el D-glutmico y como tercer paso el cido mesodiaminopi-
mlico o la L-lisina respectivamente, si se trata de gramnegativos o grampositivos (figura 2).
El ltimo dipptido (D-alanil-D-alanina) se introduce ya preformado. Si bien esto parece un
detalle insignificante, es este dipptido el que interacta con las transpeptidasas o protenas
de unin a penicilina (PBP) permitiendo el entrecruzamiento del peptidoglicn, es la estruc-
tura que simulan los betalactmicos para ejercer su efecto y es el sitio blanco de accin de
los glicopptidos, como vancomicina. (Ver figura 2)
El ingreso de alanina a la clula bacteriana se produce a travs de porinas especficas para
dicho aminocido, que permiten el ingreso tanto de las formas D como L alanina. Una vez
Figura 2. Esquema de los Componentes del Peptidoglican
DGlu
L-Lys
UDP-Nac
UDP-Nac Mur
Ligasa
L-Ala
L-Ala
L-Ala
Ligasa
Ligasa
Ligasa
Ligasa
DGlu
UDP-Nac Mur
L-Ala
D-Ala
D-Ala
D-Ala
D-Ala
D-Ala
Pacemasa
UDP-Nac Glc
Transferasa
UDP-Nac Glc-3-LP
Peductasa
DGlu
UDP-Nac Mur
L-Ala
L-Lys
DGlu
UDP-Nac Mur
L-Ala
L-Lys
D-Ala
D-Ala
D-Ala
L-Ala
Pig2: Ltapa citoplasmica de la s ntesis del peptidoglican
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en el interior de la clula, una racemasa, convierte parte de las formas L en D, y finalmente
una ligasa especfica produce los dipptidos D-ala-D-ala que completan el pentapptido. Este
compuesto (UDP-Nac-Mur-pentapptido) que es hidrosoluble, se une a la cara interna de la
membrana citoplasmtica, y mediante una unin dependiente de energa mediada por una
translocasa I, se relaciona al lpido transportador denominado bactoprenol, dando comienzo
a la etapa transmembrana (figura 3).
Etapa transmembrana: de esta manera se genera el lpido I (que es la unin del bacto-
prenol a travs de un enlace de pirofosfato al Nac-Mur-penta). Con esta unin se consigue
enmascarar la hidrosolubilidad del peptidoglicn, de manera que pueda atravesar la bicapa
lipdica. La translocasa II es responsable del agregado del Nac-Glc, constituyndose as el
lpido II (figura 3). La trasposicin del lpido II ocurre entonces de un modo an no diluci-
dado, promoviendo la colocacin del precursor del peptidoglicano, ahora asomando hacia
el espacio periplsmico.
Etapa periplsmica: fundamentalmente se producen tres pasos, la transglicosilacin, la
separacin del lpido transportador y el entrecruzamiento peptdico (transpeptidacin). La
Figura 3. Esquema de los Componentes del Peptidoglican
Ltapa intramembranal
l) UDP Nac- penta
2) Nac-Mur penta
NacGlc Nac-Mur penta
P-bactoprenol
5)bactoprenol-P-P
4)bactoprenol-P-P
P-P-bactoprenol(l pido |)
P-P-bactoprenol(l pido ||)
UDP
UMP
Translocasa |
Tunicamisina
Translocasa ||
Nisina
UDP-NacGlc
UMP
3)
Citoplasma
Pl
Pirofosfatasa
8acitracina
Membrana
MG--MG--MG--MG
Transglicosilasa
Nac-Mur-Nac Glc penta
Periplasma
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primera y la ltima la realizan enzimas con actividad transglicosilasa y transpeptidasa (ms
conocidas como PBP de Penicilin Binding Protein), que se encuentran ubicadas en la mem-
brana citoplasmtica con su sitio activo hacia el espacio periplsmico. Las principales PBP
denominadas en general PBP I, II y III (debido a que son las de mayor peso molecular), tienen
en sus extremos carboxi y amino terminal las funciones transpeptidasas y transglicosilasas. Sin
embargo, solo la funcin de transpeptidasa es inhibible por betalactmicos. La separacin del
lpido II se produce por accin de una pirofosfatasa que rompe el enlace pirofosfato, dejando
al bactoprenol libre para comenzar otra vez el ciclo (figura 3).
Las transpeptidasas reconocen la estructura estereoqumica del dipptido Dala-Dala, y
mediante clivaje de la ltima alanina liberan la energa necesaria para realizar el entrecruza-
miento con el mDAP en gramnegativos o el puente peptdico intermediario de los grampo-
sitivos. La regulacin de este mecanismo de sntesis es de modo tal, que la inhibicin de la
transpeptidacin inhibe todo el mecanismo de sntesis de pared.
MECANISMOS DE RESISTENCIA A BETALACTMICOS
Los tres grandes mecanismos ya descritos pueden ponerse en juego; trastornos en la permeabi-
lidad, alteracin del sitio blanco de accin e hidrlisis enzimtica.
Los trastornos de permeabilidad se corresponden fundamentalmente con la disminucin
de la expresin de porinas. Como ya se ha dicho, no es un mecanismo que por s mismo
promueva altos niveles de resistencia, pero puede ser muy importante en conjuncin con
distintos tipos de betalactamasas.
Modificacin del sitio blanco de accin: como ya fue dicho, el sitio blanco de los beta-
lactmicos son las diferentes PBP. La informacin gentica de estas protenas se encuentra
codificada en el genoma bacteriano y no en plsmidos. Sin embargo, elementos que regulan la
expresin de esos genes s puede ser codificada en un plsmido. Pueden distinguirse distintas
alternativas para que se produzca una PBP que presente menor afinidad por los antibiticos. La
expresin de un gen alternativo, que codifique una PBP bsicamente distinta a la existente, es
el caso de S. aureus meticilinorresistente, donde la expresin del gen mecA produce una PBP
alternativa PBP2 que es menos afin a la totalidad de los betalactmicos. Con esto se quiere
decir que la expresin del gen mecA genera la resistencia a la totalidad de los betalactmicos,
independientemente de los resultados in vitro. Este sera el tpico caso donde la regulacin
es mediada por plsmidos.
Formacin de genes mosaico, por incorporacin de fragmentos de material gentico de otro
microorganismo: este proceso generado por transformacin y recombinacin homloga, genera
genes en parches, cuya secuencia queda constituda en parte por la informacin preexistente,
y en parte por la recientemente adquirida. Ejemplos de esto son algunas de las PBP de S.
pneumoniae resistente a penicilina y las PBP modificadas de Neisseria gonorrhoeae, donde se
han detectado fragmentos con secuencias de alta homologa con las PBP de N. lactmica.
Hidrlisis enzimtica: este mecanismo implica la inactivacin de los betalactmicos
como consecuencia de la accin de enzimas que reciben el nombre de betalactamasas, y es
el principal mecanismo de resistencia a betalactmicos. Estas enzimas son un claro ejemplo
de la plasticidad de la gentica bacteriana. Probablemente originadas de un reducido grupo
de enzimas cromosmicas, constituyen hoy una familia de protenas de gran disimilitud, que
ha requerido numerosas clasificaciones con el intento de poderlas agrupar. Las evidencias
disponibles tienden a asignarle en un comienzo, alguna funcin particular en la sntesis de
pared, sobre todo en bacterias gramnegativas. Estas hiptesis surgen de experimentos realizados
en Salmonella, la cual no codifica en su cromosoma betalactamasas de clase C. Cuando se
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introduce en una Salmonella un plsmido que codifica una betalactamasa de clase C (tpica-
mente cromosmica), se observan en el microorganismo alteracines morfolgicas, retardo
en la velocidad de crecimiento y disminucin de su virulencia. Estas enzimas destruyen por
hidrlisis, penicilinas, cefalosporinas y carbapenemes. La mayora de estas enzimas actan a
travs de la formacin de un complejo acilpenicilina (merced a la presencia de una serina en
la posicin 70) que se hidroliza rpidamente, regenerando la enzima. Estas enzimas forman
parte de un amplio grupo de protenas denominadas serinproteasas.
Clasificacin de las betalactamasas
Basndose en datos de secuencia parcial del ADN de las betalactamasas, Ambler en 1980
propone clasificarlas en cuatro clases: A, B, C y D. Las enzimas de clase A, cuyo prototipo es la
enzima TEM-1, (actualmente presente en ms del 50% de los aislamientos de enterobacterias
en general), estn codificadas en plsmidos y su peso molecular oscila entre 25 y 30 kD, al
igual que las de clase B y D.
Las enzimas de clase C, estn generalmente codificadas en el cromosoma bacteriano y
son tpicamente inducibles por betalactmicos. Se trata de protenas que presentan unos 100
aminocidos ms que la de los otros grupos, por lo que su peso molecular suele rondar los 40
kD o ms. En algunas especies, la regin reguladora del gen ha desaparecido, y en consecuencia
la enzima se expresa constitutivamente.
Las enzimas de clase B requieren zinc para su actividad y son consideradas por ello me-
talo betalactamasas. En general son plasmdicas, inhibibles por EDTA, incluyndose aqu las
enzimas que confieren resistencia a los carbapenemes.
Las enzimas de clase D constituyen un grupo reducido de enzimas plasmdicas, con
actividad incrementada sobre oxacilina (OXA-1), inhibibles por iones cloruros y de forma
variable por inhibidores del tipo cido clavulnico o sulbactam. Estas enzimas, al igual que
lo observado en las enzimas de clase A, han ampliado su espectro de accin mediado por
mutaciones puntuales a partir de enzimas con actividad reducida a penicilinas como es el caso
de las OXA derivadas. En 1995 Bush, Jacob y Medeiros proponen una clasificacin funcional
para las betalactamasas. Esta se basa en el peso molecular de la enzima, su punto isoelctrico
(pI), el perfil de sustrato y la propiedad de ser inhibidas por la presencia de cido clavulnico
o EDTA. En base a este esquema surgen cuatro grupos funcionales que se correlacionan bien
con la clasificacin de Ambler, denominndose: 1, 2, 3 y 4.
Las del grupo 1 corresponden a enzimas con accin cefalosporinasa, no inhibibles ni por
cido clavulnico ni por EDTA, y que se correlacionan con las enzimas cromosmicas de
bacilos gramnegativos de tipo AmpC.
Las del grupo 2 estn constitudas por penicilinasas y cefalosporinasas inhibibles por cido
clavulnico, y coinciden mayoritariamente con el tipo A de Ambler.
Las del grupo 3 son inhibibles por EDTA pero no por cido clavulnico, se corresponden
con las metaloenzimas de tipo B.
Por ltimo, un grupo poco importante no descrito por Ambler, las del grupo 4, que incluye
penicilinasas no inhibibles por cido clavulnico encontradas en Pseudomonas cepacia.
Las betalactamasas son protenas globulares que presentan una masa 100 veces superior a
su substrato. En este contexto, una vez que el antibitico ingresa al sitio activo, son muchas
las interacciones qumicas que se producen entre ambas molculas. As, en las serin betalac-
tamasas, el oxgeno con carga negativa del grupo carbonilo de los betalactmicos es atacado
por los grupos amino (de carga positiva) de la serina 70 y una alanina que se encuentra
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ALA 237
N
H
N
H
OH
SLP 70
ALA 237
N
H
N
H
OH
SLP 70
O
C
O
C
PCO - NH
PCO - NH
N
CH3
COO
N
CH3
COO
K + K
K +
S
ALA 237
N
H
N
H
H O
SLP 70
O
C
PCO - NH
N
CH3
CH3
COO
COO
COO
K +
S
S
ALA 237
N
H
N
H
SLP 70
H
PCO - NH
N
S
OH
Pig 4.
prxima. Se forma as mediante un enlace covalente irreversible, un complejo acilpenicilina
(acilacin). Estas interacciones generan un efecto de tensin sobre el grupo carbonilo,
que tiende a romper el grupo amida del anillo betalactmico. La ntima proximidad que se
genera entre el grupo hidroxilo de la serina 70 y el grupo amida del anillo culmina la accin,
generando la hidrlisis del betalactmico. La presencia de una molcula de agua en el sitio
activo de estas enzimas produce la liberacin del antibitico (deacilacin), devolviendo la
actividad enzimtica (figura 4).
Figura 4. Esquematizacin de Funcionamiento de las Serin -lactamasas. Se esquematiza la
interaccin -lactamasa- -lactmico. La enzima esta representada por los extremos amino
de la alanina 273 y la serina 70, as como el grupo hidroxilo de esta ltima. La primera in-
teraccin E S es todava reversible y se representa por K+1 y K-1. Una vez que se produce
la acilacin representado por K+2 la reaccin es irreversible. Cuando la enzima es activa
sobre el sustrato, la reaccin culmina con la deacilacin (k+3), con la consiguiente liber-
acin del antibitico hidrolizado y la recuperacin de la actividad enzimtica. Sin embargo
cuando la enzima no es capaz de hidrolizar al sustrato, la reaccin se detiene a este nivel,
producindose la inactivacin de la misma. Esto es lo que ocurre con los inhibidores del
tipo del Sulbactam o cido clavulnico
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METALO BETALACTAMASAS (DE CLASE B)
Se trata de una familia de enzimas de gran diversidad gentica, con porcentajes de identidad
de secuencia de entre el 20% y 40%. Sin embargo, se encuentra un motivo conservado dado
por cuatro residuos de histidina (H), una aspargina (D) y una cistena (C), que se ubican
segn una secuencia consenso HXHXD(X)
55-74
H(X)
18-24
C(X)
37-41
H, lo cual se corresponde a
los ligandos con dos tomos de Zinc ++. El mecanismo de accin de estas enzimas difiere de
las serin proteasas, ya que en este caso no se producen uniones covalentes entre la enzima y el
sustrato. Aqu cada tomo de Zn++ acta polarizando distintas estructuras del anillo betalac-
tmico. As el Zn++(1) acta polarizando el grupo carbonil de dicho anillo, produciendo un
hueco oxianinico que favorece la hidrlisis. El Zn++(2) queda dispuesto prximo al N del
anillo, lo que sugiere que interactuara con el grupo amida de modo de estabilizar el sustrato
durante el ataque nucleoflico y favorecer luego el recambio de sustrato de la enzima.
Desde el punto de vista mdico, existen dos aspectos importantes para clasificar las be-
talactamasas; ellos son la ubicacin de los genes (cromosmicos o plasmdicos) y el espectro
de accin. En base a esta informacin se pueden realizar ciertas generalizaciones.
Al referirnos a betalactamasas plasmdicas nos referiremos fundamentalmente a las de
clase A, que son las serin enzimas que clsicamente se encuentran en plsmidos, mientras que
las cromosmicas sern las de clase C. De todas maneras debe saberse que desde hace unos
aos atrs no es infrecuente la deteccin de betalactamasas de clase C en plsmidos.
Principales betalactamasas plasmdicas
En los grampositivos son fundamentalmente penicilinasas, sin incluir accin sobre cefalos-
porinas. Las betalactamasas en bacilos gramnegativos, originalmente posean un espectro
ms reducido de accin que las cromosmicas, pero eran ms eficaces. La presencia de una
estructura a manera de compuerta (denominado bucle omega) relacionada con el ptimo
enfrentamiento entre el anillo betalactmico y la molcula de agua ya mencionada, res-
tringa a su vez la llegada al sitio activo de molculas ms grandes. Estas primeras enzimas
denominadas betalactamasas de espectro ampliado (BLEA), tienen accin sobre penicilinas
y cefalosporinas de primera generacin. El agregado de cadenas laterales grandes a nivel del
carbono 7 del anillo cefalospornico, evita la entrada de estos antibiticos al sitio activo de
las (BLEA) y define a las cefalosporinas de tercera generacin. Mutaciones generalmente
en dos pasos, generaron la aparicin de betalactamasas de espectro expandido (BLEE), con
accin sobre cefalosporinas de tercera generacin. (Ver figura 5) Para la generacin de una
BLEE a partir de una BLEA, una primer mutacin implica la apertura del bucle omega, con la
consiguiente prdida de la eficacia (disminucin de Vmax). Una segunda mutacin reajusta
la molcula de agua al anillo betalactmico. La sustitucin de dos aminocidos es suficiente
para producir estos cambios.
Por lo dicho, las betalactamasas plasmdicas ofrecen al menos dos motivos de alerta: su
fcil diseminacin inter e intraespecie, y su alta variabilidad con el consiguiente aumento
del espectro de accin. La mayora de las transformaciones se dan a nivel intrahospitalario,
donde las cepas pasan de paciente en paciente y las enzimas de germen en germen, hasta
que las mutaciones ocurren.
Otro elemento importante de las betalactamasas plasmdicas es su capacidad de interactuar
con los inhibidores de betalactamasas tipo sulbactam. Estas molculas con anillo betalact-
mico pero casi sin actividad antibitica, tienen la capacidad de una vez acilados, interactuar
con residuos enzimticos (arginina 244) que generan un total desenfoque entre la molcula
de agua y el anillo betalactmico. El resultado es una actividad suicida donde se impide la
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deacilacin. La estructura con la que actan los inhibidores no se encuentra presente en las
betalactamasas cromosmicas.
Betalactamasas cromosmicas: como ya se dijo no son inhibibles. La ausencia de bucle
omega sella su perfil de actividad. No restringen la llegada de cefalosporinas, por lo tanto son
cefalosporinasas, pero por la misma razn no son altamente eficientes. Confieren resistencia
a cefalosporinas de segunda generacin, y dependiendo de su cantidad, tambin son capaces
de conferir resistencia a cefalosporinas de tercera generacin. Su mecanismo de expresin
est estrechamente relacionado a la sntesis y reciclaje del peptidoglicn, que acta a travs
de un promotor que en condiciones normales se encuentra inhibido. La ausencia de dicho
promotor, impide la expresin de la betalactamasa y es lo que sucede con E. coli, donde an
teniendo el gen que la codifica, no es posible provocar su induccin.
Resistencia a glicopptidos
Se trata de mecanismos complejos que involucran por lo menos cinco genes, algunos de ellos
sobrepuestos parcialmente. El efecto final es la sntesis de un peptidoglican que presenta un
pentapptido que culmina en Dala-Dlactato (Dlac) o Dala-Dserina (Dser).
Este producto no se une a vancomicina. Si bien las resistencias a vancomicina y teico-
planina pueden estar relacionadas, no se comprende tan bien la resistencia a este ltimo. Se
describir por lo tanto la resistencia a vancomicina.
Se trata de un mecanismo inducible, que requiere la presencia de este antibitico.
Hasta el momento se conocen cinco fenotipos de resistencia, correspondientes a cinco
Figura 5. Representacin esquemtica de la estructura de diferentes tipos de -lactama-
sas. A, B y C muestran una de las etapas evolutivas de una -lactamasa de clase A desde
una BLEA a una BLEE en dos eventos de mutaciones puntuales. D: -lactamasa de clase
C. La ausencia de bucle omega y de la estructura que contiene la arg 244, determinan
su espectro de accin: cefalosporinasas no inhibibles por sulbactam, cido clavulnico o
tazobactam.
Bucle omega
A) BLEA
B) Primer paso
de mutacin.
C) Segundo paso
de mutacin.
( BLEE )
D) - Lactamasa
de clase C
ARG
244
ARG
244
ARG
244
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660
grupos de genes distintos, denominados VanA a la E. Se explicar brevemente el funciona-
miento del sisytema vanA, por ser el ms estudiado. Los otros fenotipos involucran algunas
variantes menores.
El mecanismo se pone en funcionamiento mediante un sistema de traduccin de seales
de dos componentes: un pptido transmembrana denominado vanS y un segundo mensajero
llamado vanR. vanS consiste en una histidinproteinquinasa, que contiene un residuo de
histidina autofosforilable bajo un estmulo ambiental. No se sabe cual es el estmulo exacto,
pero podra estar relacionado a la inactivacin de las transpeptidasas y transglicosilasas. Por lo
tanto la vancomicina actuara de forma indirecta. Una vez fosforilada vanS, el grupo fosfato
es traspasado a un residuo aspartato presente en vanR. VanR fosforilada posee un dominio
de unin a ADN, donde acta como promotor del conjunto completo de genes del fenotipo
VanA (figura 6).
Adems de vanR y vanS, son necesarias tres protenas ms relacionadas con otros tantos
genes. Estos son vanA, vanH y vanX. El gen vanA codifica una ligasa alternativa a la que
normalmente genera el dipptido Dala-Dala. Esta nueva ligasa une Dala a un ligando ines-
pecfico. Precisamente el gen vanH codifica una protena con actividad deshidrogenasa que
suministra el ligando para vanA. VanH genera D lactato a partir de piruvato. Para que la
sustitucin del dipptido sea efectiva, deben eliminarse los dipptidos Dala-Dala que conti-
nen formandose por va normal. VanX codifica una dd dipeptidasa que cliva los dipptidos
Dala-Dala antes que se incorporen al precursor del peptidoglicn, pero no Dala-Dlactato.
Estos cinco genes vanS, vanR, vanA, vanH y vanX, son imprescindibles para la produccin de
la resistencia a vancomicina. Pueden encontrarse dos genes adicionales, vanY y vanZ. VanY
codifica una ddcarboxipeptidasa que separa la ltima Dalanina del precursor ya formado, por
lo que complementara la accin de vanX.
Figura 7. Organizacin de los genes responsables del genotipo Van A y
funciones de las protenas correspondientes
VAN S
?
VAN R
P
P
van R van S van H van A van X van Y van Z
Deshidrogenasa
Piruvato - Lactato
dd dipeptidasa
d- ala d-ala
dd- carboxipeptidasa Ligasa Dala-- X
VAN S VAN S VAN S
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Por ltimo vanZ confiere resistencia a teicoplanina, por un mecanismo no dependiente
de la modificacin del pentapptido, an desconocido.
La codificacin de estos genes esta asociada a un trasposn, y se la encuentra tanto en
el cromosoma como en plsmidos. Este tipo de resistencia se corresponde con cambios en
el sitio blanco.
QUINOLONAS E INHIBICIN DE LA REPLICACIN DEL ADN
Mecanismo de resistencia: bsicamente son de dos tipos, por alteracin del sitio blanco y por
alteracin de la permeabilidad. En los ltimos aos se ha descrito un mecanismo de resistencia
plasmdico y trasmisible, que consiste en la accin de una protena producto del gen qnr, que
actuara bloqueando el sitio blanco de accin. Las alteracines del sitio blanco se producen
por mutacin espontnea a nivel cromosmico por alteracin de una de las subunidaddes
de la enzima denominada A (la ADN girasa est constituda por dos subunidades A y dos
subunidades B). Estas enzimas mutadas tienen menor afinidad por el antibitico. La aparicin
de una mutacin puntual tiene una probabilidad de ocurrencia de 1x10
-6
a 1x10
-9
y es en s un
fenmeno estocstico, independiente de la presencia de antibiticos. La presin de seleccin
que ejercen estos, favorecen la diseminacin y prevalencia de aquellas cepas ms adaptadas
a las condiciones que le impone el frmaco.
Las alteraciones de premeabilidad incluyen la modificacin de expresin de porinas y un
sistema de bombas de eflujo que promueve la excrecin del frmaco hacia el medio extrace-
lular. Estas bombas descritas primero para grampositivos, tambin se hallan en gramnegativos
asociadas a porinas de la membrana externa, lo que genera un canal directo entre el citoplas-
ma y el exterior, evitando el espacio periplsmico. La energa de activacin depende de un
contratransporte de protones, y como ya se ha dicho, constituyen un mecanismo inespecfi-
co de multirresistencia, que incluye resistencia a tetraciclinas, eritromicina, cloranfenicol y
quinolonas. Este sistema es habitualmente utilizado por las bactrerias para la exportacin de
diversas sustancias como toxinas (por ejemplo hemolisinas) y siderforos.
AMINOGLUCSIDOS
Mecanismos de resistencia: los tres grandes mecanismos de resistencia ya nombrados son
encontrados contra estos antibiticos. El ms importante es la inactivacin enzimtica, se-
guido por alteracin de la permeabilidad y lejos en tercer lugar, limitado a la estreptomicina
y la espectinomicina, puede observarse una mutacin puntual en el sitio de accin de estos
agentes, la protena de la subunidad 30s denominada protena S12.
Inactivacin enzimtica: diversas enzimas pueden inactivar estos antibiticos por accin a
distintos niveles. As, pueden acetilar, adenilar o fosforilar, por intermedio de acetiltransferasas,
adeniltransferasas y fosfotransferasas. Estas enzimas tienen un perfil diferente de aminoglu-
csidos sobre los que actan, pero la presencia de ms de una enzima dificulta este anlisis,
incluyendo la aparicin de enzimas bifuncionales como las presentes en enterococos que poseen
actividad de acetil y fosforiltransferasas. Las enzimas pueden ser cromosmicas o plasmdicas
y se expresan constitutivamente, independientemente de la presencia de antibitico.
La inactivacion enzimtica se produce en el proceso de transporte del antibitico hacia
el interior de la clula para alcanzar el ribosoma. La resistencia a cada aminoglucsido es el
resultado del balance entre dos velocidades: la de captacin intracelular y la de inactivacin
enzimtica. La velocidad de inactivacin depende de la afinidad de la enzima por el anti-
bitico. La resistencia a los aminoglucsidos tiene una incidencia variable a nivel mundial,
debido al predominio diferente de las enzimas inactivantes como consecuencia de la presin
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de seleccin ejercida por el uso de determinados aminoglucsidos. El predominio de enzimas
que inactivan la estreptomicina y kanamicina ha llevado a desplazar el uso de estos frmacos.
En general la mayor incidencia de resistencia se da en enterobacterias.
Alteraciones de la permeabilidad: los aminoglucsidos entran a la clula bacteriana por
un mecanismo complejo que implica la adherencia a molculas de carga negativa, como
residuos del LPS, cabezas polares de fosfolpidos y protenas aninicas de membrana externa.
Luego de esta adherencia por rearreglo del LPS se produce la entrada al espacio periplsmico
del agente. Al llegar a la membrana citoplsmica se produce el ingreso al citoplasma, por un
sistema de trasporte acoplado al gradiente protnico. Dicho gradiente depende de la actividad
de las cadenas respiratorias aerobias, lo cual explica la inactividad de estos agentes frente a
anaerobios. Precisamente las modificaciones de este gradiente electroqumico, dificultan la
entrada del agente a la clula. Mutaciones cromosmicas espontneas, generan alteraciones
de este potencial o de la cadena de electrones.
MACRLIDOS
Mecanismos de resistencia: bsicamente implican los grandes mecanismos ya mencionados.
En bacilos gramnegativos donde el frmaco no es muy activo, se observan trastornos en
la permeabilidad. El mecanismo de eflujo activo ya ha sido mencionado y es mediado por
plsmidos. Dos tipos de alteraciones del sitio blanco pueden producir resistencia a macrli-
dos: a) mutaciones puntuales a nivel cromosmico de la protena L15; b) induccin de una
enzima metilante que metila el ARNr 23s de la subunidad mayor, lo que altera la afinidad
del receptor no solo por los macrlidos, sino tambin por lincomicinas y estreptograminas.
Estos antibiticos son qumicamente diferentes pero comparten mecanismos de accin y de
resistencia, as como cierto espectro de accin. Este mecanismo puede encontrarse asociado
a plsmidos y trasposones.
Por ltimo, se ha detectado inactivacin enzimtica por esterasas o fosfotransferasas
fundamentalmente en enterobacterias, aunque se desconoce su importancia clnica.
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