Escuela Politcnica del Ejrcito Cultivo de Tejidos Vegetales

2013-06-16

OBTENCIN DE CALLOS A PARTIR DE ZANAHORIA (Daucus carota)

AYALA, Christian. FREIRE, Viviana.

RESUMEN. Los callos son cmulos de clulas indiferenciadas que se dividen desordenadamente. Son una herramienta para varios procesos del cultivo de tejidos debido a su caracterstica de poder regenerar cualquier rgano. Para obtener callos a partir de raz de zanahoria (Daucus carota), se desinfectaron las muestras con detergente y cloro. Se obtuvieron los explantes de una zona cercana al cambium, para que de esta manera la proliferacin celular sea ms abundante. Los explantes fueron sembrados en un medio MS enriquecido con azcar, BAP y 2,4-D y se lo evalu durante 3 semanas. Al final de las tres semanas se encontr que el 22% de los explantes estaban contaminados. Y que el 69% ya haba iniciado con el proceso de formacin de callo. La falta de tiempo de cultivo evito que se obtengan callos completos ya que estos requieren de uno a tres meses de cultivo para aparecer. INTRODUCCIN. Los callos son masas celulares amorfas producto de la proliferacin de las clulas del parnquima. No presentan organizacin y son centros localizados de actividad meristmatica (Lallana y Lallana, 2003). Una de sus principales caractersticas es la facultad de poder diferenciarse dando lugar a la formacin de races, brotes y embriones capaces de regenerar nuevas plantas (Serrano y Piol, 1991). Existen dos tipos de callos: unos fuertemente lignificados, duros en textura y difciles de separar en trozos ms pequeos llamados callos no friables. Y aquellos que son ms frgiles y se separan fcilmente los cuales se denominan friables (Lallana y Lallana, 2003). En muchas especies los callos aparecen como producto de una herida a fin de regenerar las porciones perdidas de la planta. Pero mediante el uso de tcnicas de cultivo in vitro se puede inducir el aparecimiento de callos en distintos rganos y tejidos de varias especies vegetales (Dodd y Lorin, 1982 cit. por Lallana y Lallana, 1991). Para la produccin de callos el material vegetal comnmente utilizado es el cambium vascular, parnquima de reserva, periciclo de raz, cotiledones, mesfilo de la hoja y tejido provascular (Dodd y Lorin, 1982 cit. por Lallana y Lallana, 1991). Una relacin auxinas/citoquininas alta favorece la produccin de callos. Por lo tanto el material vegetal se siembra generalmente en medios ricos en auxinas como el 2,4-D (Dodd y Roberts, 1985 cit. por Badillo, et al., 2009).

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Los cultivos de callos son ampliamente usados en Biotecnologa, ya que son una herramienta que se aplica para la manipulacin gentica, tcnicas de micropropagacin, embriognesis y organognesis indirecta, y para la produccin de productos de inters comercial (McDonald, 1995 cit. por Badillo, et al., 2008). El uso de Daucus carota (zanahoria) para el cultivo de callos se ha realizado desde la realizacin de los primeros cultivos experimentales en 1939 (Lallana y Lallana, 2003). Stewart y Reinert (1958 cit. por Dodd y Roberts, 1985) as como Roca y Mroginski (1991) han establecido a la zanahoria como un organismo modelo para la produccin de callo. En esta prctica se usaran explantes de Daucus carota con el fin de inducir la formacin de callo en cultivo in vitro. MATERIALES Y MTODOS. Para la induccin de callos se usaron explantes obtenidos de races de zanahoria. Para esto se requiere que las zanahorias sean lo ms pequeas y delgadas posibles, y que al realizar un corte transversal se pueda observar el cambium. Para la desinfeccin se realiz un lavado en agua corriente, seguido de una inmersin por 15 minutos en una solucin de detergente al 1%. Se enjuagan las zanahorias y se las sumerge en una solucin de cloro al 5%

con 3 gotas de Tween 20. Finalmente se lleva las muestras sumergidas en cloro a la cmara y se realizan 3 lavados con agua estril. Para la siembra se obtiene un fino corte transversal de la zanahoria, asegurndose que se observe el cambium. Se divide el explante en cuatro pedazos triangulares asegurndose de eliminar todo el tejido quemado por el cloro. Se siembran cuatro explantes en cada frasco con medio MS enriquecido con 30 g de azcar, 0.5 mg/L de BAP y 3mg/L de 2,4-D. RESULTADOS. La siembra de los explantes de zanahoria se realiz el 22 d mayo, y se los evalo cada semana a fin de observar como avanzaba el cultivo de callos. La tabla completa de las observaciones semana a semana puede observarse en el Anexo 1. Durante la primera semana se pudo apreciar como la mayora de los explantes empez ensancharse y que en varios de ellos empezaron a proliferar las bacterias, como se observa en la Figura 1.

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Contaminacin
22% 78% Contaminacin bacteriana 0% Contaminacin con hongos Sin contaminacin

Grfica 1. Contaminacin en explantes luego de tres semanas.

los

Figura 1. A) Contaminacin bacteriana en los explantes. B) Explantes hinchados.

Durante la segunda y tercera semana se observ como los explantes seguan creciendo y se iniciaba la formacin de callo. Algunos tomaron una ligera coloracin verdosa (ver Figura 2).

En cuanto a la diferenciacin de los explantes al final de las 3 semanas se obtuvo que el 69% de los explantes inici el proceso de formacin de callo.

Desdiferenciacin
0% 6% Sin cambios Ensanchamiento 25% 69% Formacin parcial de callo Formacin total de callo

Grfica 1. Desdiferenciacin de los explantes luego de tres semanas.

Ninguno de los explantes formo callo totalmente. A B DISCUSIN.

Figura 2. A) Explante de 3 semanas con inicios de formacin de callo. B) Explantes muy crecidos a las 3 semanas.

Como se puede observar en la Grfica 1 al final de las tres semanas que se mantuvo el cultivo de callos, se obtuvo que la mayora de los explantes (78%) no presentaron contaminacin.
3

Como se observa en la Grfica 2 no se obtuvo formacin total de callo en ninguno de los explantes. Debido, que para la obtencin callos a partir de Daucus carota, se necesita de entre uno a tres meses de cultivo (Dodd y Roberts, 1985).

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Como en este caso los cultivos se mantuvieron por tres semanas y por este motivo solo se pudo observar el aparecimiento de callos parciales. El crecimiento de los callos depende de la zona de toma del explante. Explantes del floema dan lugar a un crecimiento muy pobre. Explantes obtenidos de zonas cercanas al cambium son los que presentan una gran proliferacin (Gautheret, 1959 cit. por Dodd y Roberts, 1985). Como se observa en la Figura 2, en el recuadro B, los explantes obtenidos de una zona cercana al cambium han adquirido un tamao considerable, y de mantener el cultivo por ms tiempo se hubiera esperado la obtencin de callos de gran tamao. La induccin de callos en zanahoria puede dar como resultado la obtencin de callos friables o no friables, siendo siempre preferible un callo friable que presenta mayor facilidad para trabajar (Dodd y Roberts, 1985). En esta ocasin el pequeo tamao de los callos obtenidos dificulta discernir si se trata de un callo friable o no friable, aunque el callo de color verdoso de la Figura 2, recuadro A, tena la apariencia de corresponder a un callo friable. La presencia de una punta de color verdosa en este explante se debe a que este se encontraba cerca de alguna fuente de luz, lo que provoco la activacin de la clorofila (Lallana y Lallana, 2003).

Los callos crecen generalmente de manera lenta y para evitar que les falten los nutrientes deben realizarse subcultivos cada 28 das (en el caso de zanahoria) (SEDICI, S/A). Es importante tener en cuenta el tamao del inculo al momento del subcultivo, ya que porciones muy reducidas de callo, ocasionaran una tasa de crecimiento muy baja (Lallana y Lallana, 2003). CONCLUSIONES A fin de obtener una buena proliferacin de callo en es necesario obtener un buen explante. En el caso de Daucus carota el mejor crecimiento de callo se logra con explantes de zonas cercanas al cambium. Al final de las tres semanas se encontr que el 22% de los explantes se contaminaron con bacterias y que el 69% ya se encontraban en proceso de formacin de callo. Se obtuvo tan solo inicios de formacin de callo y callos parciales debido a que los explantes fueron cultivados durante tres semanas, y la formacin de callos requiere de uno a tres meses. BIBLIOGRAFA ROCA, W. MROGINSKI, L. (1991). Cultivo de Tejidos en la Agricultura: fundamentos y aplicaciones. CIAT. Cal, Colombia, LALLANA, V. LALLANA, M. (2003). Manual de Prcticas de Fisiologa Vegetal. Facultad de Ciencias Agropecuarias. Universidad Nacional de Entre Ros. Entre Ros, Argentina.

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SERRANO, M. PIOL, M. (1991). Biotecnologa Vegetal. Sntesis Editorial. BADILLO, J. OLIVER, M. MORENO, K. PACHECO, V. CORTES, H. (2009). Manual de Laboratorio de Cultivo de Tejidos. Departamento de Bioprocesos. Instituto Politcnico Nacional. Mxico D.F., Mxico. DODD, J. ROBERTS, L. (1958). Experiments in Plant Tissue Culture. Segunda Edicin. Cambridge University Press. USA. SEDICI, Cultivo in vitro. Universidad Nacional de La Plata. Buenos Aires, Argentina. .

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ANEXO 1

EVALUACIN SEMANAL DE LOS CULTIVOS DE CALLO DE Daucus carota FECHA DE EVALUACIN: 28-05-2013 CONTAMINACIN EXPLANTE DESDIFERENCIACIN* (HONGO O BACTERIA) Raz 1 Bacteriana 0 Raz 2 Bacteriana 1 Raz 3 No contaminacin 0 Raz 4 No contaminacin 0 Raz 1 Bacteriana 1 Raz 2 Bacteriana 1 Raz 3 No contaminacin 1 Raz 4 No contaminacin 1 Raz 1 No contaminacin 1 Raz 2 No contaminacin 1 Raz 3 No contaminacin 1 Raz 4 No contaminacin 1 Raz 1 No contaminacin 1 Raz 2 No contaminacin 1 Raz 3 No contaminacin 1 Raz 4 No contaminacin 1

N DE FRASCO

OBSERVACIONES Presencia de tejido necrosado por el cloro Ninguna Ninguna Ninguna Ninguna Ninguna Ninguna Ninguna Ninguna Ninguna Ninguna Ninguna Ninguna

* Escala 0 ningn cambio, 1 inicio de encorvamiento del explante o ensanchamiento, 2 formacin parcial de callo, 3 formacin compl eta de callo

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EVALUACIN SEMANAL DE LOS CULTIVOS DE CALLO DE Daucus carota (cont.) FECHA DE EVALUACIN: 07-06-2013 CONTAMINACIN EXPLANTE DESDIFERENCIACIN* (HONGO O BACTERIA) Raz 1 Bacteriana 1 Raz 2 Bacteriana 1 Raz 3 No contaminacin 1 Raz 4 No contaminacin 0 Raz 1 Bacteriana 1 Raz 2 Bacteriana 1 Raz 3 No contaminacin 1 Raz 4 Raz 1 Raz 2 Raz 3 Raz 4 Raz 1 Raz 2 Raz 3 Raz 4 No contaminacin No contaminacin No contaminacin No contaminacin No contaminacin No contaminacin No contaminacin No contaminacin No contaminacin 2 2 2 2 1 1 2 1 2

N DE FRASCO

OBSERVACIONES Presencia de tejido necrosado por el cloro Ninguna Ninguna Ninguna El explante presenta coloracin verdosa en una punta Ligera coloracin verde

Ligera coloracin verde

* Escala 0 ningn cambio, 1 inicio de encorvamiento del explante o ensanchamiento, 2 formacin parcial de callo, 3 formacin completa de callo

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EVALUACIN SEMANAL DE LOS CULTIVOS DE CALLO DE Daucus carota (cont.) FECHA DE EVALUACIN: 10-06-2013 CONTAMINACIN EXPLANTE DESDIFERENCIACIN* (HONGO O BACTERIA) Raz 1 Bacteriana 1 Raz 2 Bacteriana 1 Raz 3 No contaminacin 1 Raz 4 No contaminacin 0 Raz 1 Bacteriana 1 Raz 2 Bacteriana 2 Raz 3 No contaminacin 2 Raz 4 Raz 1 Raz 2 Raz 3 Raz 4 Raz 1 Raz 2 Raz 3 Raz 4 No contaminacin No contaminacin No contaminacin No contaminacin No contaminacin No contaminacin No contaminacin No contaminacin No contaminacin 2 2 2 2 2 2 2 2 2

N DE FRASCO

OBSERVACIONES Presencia de tejido necrosado por el cloro Ninguna Ninguna Ninguna El explante presenta coloracin verdosa en una punta Ligera coloracin verde

Ligera coloracin verde

* Escala 0 ningn cambio, 1 inicio de encorvamiento del explante o ensanchamiento, 2 formacin parcial de callo, 3 formacin completa de callo