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Contenido
Diagnstico fitosanitario
Deteccin de -exotoxina por HPLC en cepas nativas de Bacillus thuringiensis por HPLC 255
Yamil Bar Robaina, Cecilia Linares Jimnez y Gonzalo Dieksmeier Corcuera
Diagnstico de fitonematodos en suelos de cultivos frutales 261
Ral Hernndez Hernndez, Gladis del Valln y Doris Hernndez
Aislamiento, identificacin y caracterizacin morfomtrica de aislados nativos de hongos mitospricos nativos
con potencialidad para el control de especies de insectos plaga 265
Orestes Elsegui Claro, Jess Jimnez Ramos y Aidanet Carr Prez
Ecologa
Dispersin, distribucin actual y nuevos reservorios de Frankliniella schultzei Trybom (Thysanoptera: Thripidae)
en Cuba 273
Santiago F. Jimnez Jimnez, Liuva Prez Lpez, Martha Toro, Criseida Granda, Amelia Mateo,
Hctor Sariol, Elisa Rodrguez, Rodney Prez, Roquelina Jimnez, ngel Prez-Alejo y Ranss Vzquez
Variabilidad de las isoenzimas esterasas de Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin 279
Mara E. Estrada Martnez y Dolores Pin Gmez
Control biolgico
Un medio simplificado a base de soya ms azcar turbinada de caa para la produccin del hongo acaropatgeno
Hirsutella nodulosa Petch en fase lquida 285
Reinaldo I. Cabrera, Marln Vega y Litzy Ayra
Estudio del efecto protector de Bacillus spp. sobre el desarrollo de la pudricin blanda de la papa
(Solanum tuberosum L.) 289
Yaritza Reinoso Pozo, Luis Casadess Romero, Armando Garca Surez, Ernesto Garca Prez
y Victoria Pazos lvarez-Rivera
Produccin de biomasa de Trichoderma harzianum por fermentacin lquida 295
Rosaima Garca, Mara A. Durn y Ramn Riera
Resea
Caracterizacin de Ralstonia solanacearum a travs del estudio de su diversidad gentica 299
Yelaine Tejeda Gmez
Comunicacin corta
Primer registro de cecidmido asociado a sntomas de roya en plantas medicinales en Cuba 305
Marlene M. Veita Rubio, Vctor M. Garca Infante, Danay Lpez Manes y Mara O. Lpez Mesa
Observaciones sobre enemigos naturales de la broca del caf (Hypothenemus hampei Ferrari) en Cuba 307
Luis L. Vzquez Moreno, Eleazar Blanco Jimnez, Orestes Elsegui Claro, Yaril Matienzo Brito
y Janet Alfonso Simonetti
Resumen de tesis
Diagnstico y saneamiento del Virus Dasheen Mosaic en malanga (Xanthosoma spp. y Colocasia esculenta (L.) Schott) 309
Janet Igarza Castro
Comportamiento y control de la enfermedad tizn de fuego causada por el hongo Corynespora cassiicola
(Berk. & Curt.) Wei. en el cultivo del pepino (Cucumis sativus L.) en sistemas de organopnicos
en la provincia de Camagey y su relacin con otros patgenos fngicos presentes en el cultivo 310
Carlos A. Ferrer Gonzlez
Phytosanitary diagnosis
Detection of -Exotoxin by HPLC in Native Strains of Bacillus thuringiensis 255
Yamil Bar Robaina, Cecilia Linares Jimnez and Gonzalo Dieksmeier Corcuera
Phytonematodes Diagnosis on Fruit Crop Soils 261
Ral Hernndez Hernndez, Gladis del Valln and Doris Hernndez
Isolation, Identification and Morphometric Characterization of Native Mitosporic Fungi with Potential
for the Control of Pest Insects Species 265
Orestes Elsegui Claro, Jess Jimnez Ramos and Aidanet Carr Prez
Ecology
Dispersion, Present Distribution and New Reservoirs of Frankliniella schultzei Trybom
(Thysanoptera: Thripidae) in Cuba 273
Santiago F. Jimnez Jimnez, Liuva Prez Lpez, Martha Toro, Criseida Granda, Amelia Mateo, Hctor Sariol,
Elisa Rodrguez, Rodney Prez, Roquelina Jimnez, ngel Prez-Alejo and Ranss Vzquez
Variability of Esterase Isoenzymes from Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin 279
Mara E. Estrada Martnez and Dolores Pin Gmez
Biological control
A Simplified Medium Based on Soy and Unrefined Sugar Cane for Liquid Phase Production of Fungus
Hirsutella nodulosa Petch Pathogen to Mites 285
Reinaldo I. Cabrera, Marln Vega and Litzy Ayra
Study of Protective Effect of Bacillus spp. on the Development of Potato Soft Rot (Solanum tuberosum L.) 289
Yaritza Reinoso Pozo, Luis Casadess Romero, Armando Garca Surez, Ernesto Garca Prez
and Victoria Pazos lvarez-Rivera
Production of Trichoderma harzianum Biomass by Liquid Fermentation 295
Rosaima Garca, Mara A. Durn and Ramn Riera
Review
Caracterization of Ralstonia solanacearum by the Study of its Genetic Diversity 299
Yelaine Tejeda Gmez
Short communication
First Record of Cecidomide Associate with Rust Symptoms in Cuban Medicinally Plants 305
Marlene M. Veita Rubio, Vctor M. Garca Infante, Danay Lpez Manes and Mara O. Lpez Mesa
Observations on Natural Enemies of Coffee Berry Borer (Hypothenemus hampei Ferrari) in Cuba 307
Luis L. Vzquez Moreno, Eleazar Blanco Jimnez, Orestes Elsegui Claro, Yaril Matienzo Brit
and Janet Alfonso Simonetti
Thesis abstract
Diagnostic and Sanitation of Dasheen Mosaic Virus in Xanthosoma spp. and Colocasia esculenta (L.) Schott 309
Janet Igarza Castro
Behavior and Control of Fire Blight Disease Caused by Fungus Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.)
Wei. in Cucumber Crop (Cucumis sativus L.) in Organoponic Systems of Camagey Province and its Relation
with others Fungi Pathogens Present in the Crop 310
Contents
fitosanidad/255
FITOSANIDAD vol. 10, no. 4, diciembre 2006
D
i
a
g
n
s
t
i
c
o

f
i
t
o
s
a
n
i
t
a
r
i
o
DETECCIN DE -EXOTOXINA EN CEPAS NATIVAS
DE BACILLUS THURINGIENSIS POR HPLC
Yamil Bar Robaina, Cecilia Linares Jimnez y Gonzalo Dieksmeier Corcuera
Instituto de Investigaciones de Sanidad Vegetal. Calle 110 no. 514 e/ 5.
a
B y 5.
a
F, Playa, Ciudad
de La Habana, CP 11600, ybaro@inisav.cu
RESUMEN
Se analiz por cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC) la
presencia de -exotoxina en nueve cepas de Bacillus thuringiensis,
pertenecientes a la coleccin del Instituto de Investigaciones de
Sanidad Vegetal. La concentracin de -exotoxina en el patrn fue
de 25 g.mL
1
, y en el producto comercial empleado como control
positivo fue de 6 g.mL
1
. En las cepas evaluadas solo la LBT9 y
LBT47 mostraron la presencia de este metabolito a concentraciones
de 34 y 4,5 g.mL
1
respectivamente.
Palabras claves: Bacillus thuringiensis, -exotoxina, cromatografa
lquida (HPLC), deteccin
ABSTRACT
The presence of -exotoxin in nine Bacillus thuringiensis strains
belonging to Plant Health Research Institute collection was analyzed
by high performance liquid chromatography (HPLC). -exotoxin
concentration in the standard was 25 g.mL
-1
, and in a commercial
product, used as positive control, was 6 g.mL
-1
. -exotoxin was only
detected in LBT9 with 34 g.mL
-1
and LBT47 with 4.5 g.mL
-1
, among
the strains proved.
Key words: Bacillus thuringiensis, -exotoxin, liquid chromatography
(HPLC), detection
INTRODUCCIN
Algunas cepas de Bacillus thuringiensis producen ade-
ms de la -endotoxinas o protenas Cry una exotoxina
termoestable denominada -exotoxina, la cual se se-
creta al medio de cultivo al inicio del proceso de
esporulacin. Esta molcula es un anlogo nucleotdico
de ADN con un peso molecular de 701 Da y se le atri-
buye accin insecticida contra diferentes rdenes de
insectos como Lepidpteros, Dpteros, Colepteros,
Hempteros, adems de caros, nematodos, proto-
zoarios y platelmintos [Hernndez et al., 2003].
Diversos mtodos como la cromatografa de intercam-
bio inico, electroforesis capilar, ELISA y la croma-
tografa lquida de alta resolucin (HPLC) se han des-
crito para la determinacin de la -exotoxina, como
alternativas al bioensayo tradicional con Musca domes-
tica, el cual resulta ms trabajoso, prolongado en el
tiempo y presenta algunas limitaciones como estima-
ciones inexactas de la potencia de la toxina impura y
poca reproducibilidad. De todos estos mtodos la RP-
HPLC se emplea ms frecuentemente para la deteccin y
cuantificacin de este metabolito [Gohar y Perchat, 2001].
El presente trabajo tuvo como objetivo detectar y cuan-
tificar la presencia de la -exotoxina en nueve cepas
cubanas de Bacillus thuringiensis.
MATERIALES Y MTODOS
Como material biolgico se emplearon nueve cepas de
B. thuringiensis pertenecientes a la coleccin del Insti-
tuto de Investigaciones de Sanidad Vegetal, las cuales
se seleccionaron de acuerdo con su serotipo flagelar, y la
toxicidad exhibida en el sobrenadante del cultivo este-
rilizado a 121C frente a un grupo de organismos plaga
(Tabla 1).
El estndar de -exotoxina I lo suministr el doctor Jorge
Ibarra (Laboratorio de Bioinsecticidas del Centro de
Bar y otros
256/fitosanidad
Investigacin y Estudios Avanzados del Instituto Poli-
tcnico Nacional de Mxico), obtenido a partir de la
cepa HD2 Berliner Bacillus thuringiensis var.
thuringiensis. La concentracin final de la solucin de
-exotoxina I inyectada en el HPLC fue de 25 g.mL
1
.
Como control positivo se utiliz un producto comercial
ruso que contiene -exotoxina, producido a partir de
una cepa de B. thuringiensis var. thuringiensis, y como
control negativo se tom la cepa HD1, estndar inter-
nacional de B. thuringiensis que no produce -exotoxina.
Las cepas se cultivaron en medio caldo triptona soya,
en zaranda orbital a 150 r.min
1
a una temperatura de
crecimiento de 30C durante 48 h hasta que se comple-
t el proceso de esporulacin.
Una vez transcurrido el tiempo de incubacin el cultivo
se centrifug 10 000 r.min
1
en centrifuga refrigerada
durante 20 min. El precipitado se descart y el
sobrenadante se trat en autoclave a 121C durante 15 min.
El pH de las muestras se ajust a 3 con cido fosfrico
85%. El sobrenadante se clarific por centrifugacin
a 10 000 r.min
1
y se guard a 20C hasta su uso.
El proceso de separacin se realiz segn Levinson et
al. (1990), para lo que se utiliz una columna LiChros-
pher RP-18 de fase reversa. La corrida se efecto a 30C
en 50 milimoles.L
1
de KH
2
PO
4
(pH 3) a una velocidad
de flujo de 2 mL.min
1
, con deteccin a 260 nm. El vo-
lumen de inyeccin fue de 100 L. Se emple un detec-
tor UV, inyector Rheodyne 7725i, bomba water 0,01A.
Para el anlisis de los cromatogramas se utiliz el soft-
ware EZChrom versin 6.8.
Con el objetivo de evaluar si la -exotoxina se elimina-
ba durante el procesamiento de la muestra, se adicio-
naron 100 L de -exotoxina estndar a la cepa LBT5
de B. thuringiensis una vez iniciado el crecimiento del
microorganismo y concluido su desarrollo. La croma-
tografa se desarroll en las condiciones descritas ante-
riormente.
RESULTADOS Y DISCUSIN
Segn los cromatogramas obtenidos en la deteccin de
-exotoxina para las cepas en estudio, se observ el
pico correspondiente al patrn de -exotoxina estndar
a una concentracin de 25 g.mL
1
(Fig. 1(A)). El pico
que se observa en la muestra patrn apareci a un tiem-
po de retencin de 11,33 min. El mismo pico apareci
en la muestra correspondiente al producto comercial
ruso a base de -exotoxina, cepa utilizada como testigo
positivo. Su concentracin fue de 6 g.mL
1
(Fig. 1(B)).
La exotoxina no se detect en la cepa HD1 estndar
internacional de B. thuringiensis var. kurstaki (Fig. 2),
la cual no produce esa exotoxina [Galn et al., 1994;
Glare y Callaghan, 2000].
En el resto de las cepas en estudio, solo se observ el
pico correspondiente a la -exotoxina en las cepas LBT9
(Fig. 3(A)) y LBT47 (Fig. 3(B)). Los niveles de pro-
duccin del metabolito en estas cepas fueron de 34 y
4,5 g.mL
1
respectivamente. En la cepa LBT7 tam-
bin se observ la presencia de un pico que pudiera co-
rresponder a la -exotoxina, ya que presenta uno simi-
lar al del patrn y un tiempo de retencin muy cercano.
Las cepas evaluadas presentan serotipos que estn infor-
mados en la literatura como productores de la -exo-
toxina [Galn et al., 1994; Glare y Callaghan, 2000];
sin embargo, estos resultados reafirman lo obtenido por
Levinson et al. (1990) y Hernndez y Ferr (2001), los
cuales mostraron que la produccin de la exotoxina
termoestable es ms una propiedad especfica de la cepa
de B. thuringiensis que una propiedad serotipo espec-
fica. Se ha probado adems que su presencia en una
cepa en particular no implica la produccin de la exo-
toxina por otras cepas pertenecientes al mismo se-
rovar.
Aunque los estudios que relacionan la produccin de la
-exotoxina y el tipo de serovar que presenta la cepa de
B. thuringiensis son muy escasos, y en la mayora de
ellos se incluyen muy pocas cepas, algunos autores plan-
tean que la produccin de -exotoxina est limitada a
ciertos serotipos flagelares presentes en las cepas de
B. thuringiensis [Hernndez y Ferr, 2001].
Tabla 1. Serotipos de las cepas
en estudio [Fernndez-Larrea, 1999]
Cepas Serotipo
LBT-4

kenyae (H4)
LBT-5 thuringiensis (H1)
LBT-7 kenyae (H4)
LBT-13

no determinado
LBT-25

israelensis (H14)
LBT-47

no determinado

fitosanidad/257
Deteccin de -exotoxina en cepas...
Figura 1. Cromatogramas obtenidos para el patrn de -exotoxina (25 g.mL
1
) (A) y para el producto comercial (6 g.mL
1
)
(control positivo) (B). Columna LiChrospher RP-18, 5 mm (250 x 4,6 mm), flujo 2 mL.min
1
, 260 nm, volumen de inyeccin
100 L, fase mvil KH
2
PO
4
, pH 3,0.
Figura 3. Cromatogramas obtenidos por HPLC para las cepas LBT9 34 g.mL
1
(A) y LBT47 4,5 g.mL
1
(B).
Columna LiChrospher RP-18, 5 mm (250 x 4,6 mm), flujo 2 mL.min
1
, 260 nm, volumen de inyeccin 100 L, fase
mvil KH
2
PO
4
, pH 3,0.
Figura 2. Cromatograma obtenido por HPLC para la cepa HD1 (control negativo). Columna
LiChrospher RP-18, 5 mm (250 x 4,6 mm), flujo 2 mL.min
1
, 260nm, volumen de inyeccin
100 L, fase mvil KH
2
PO
4
, pH 3,0.
Bar y otros
258/fitosanidad
La clasificacin de las cepas de B. thuringiensis en
serovares se desarroll sobre la base de los antgenos
flagelares; sin embargo, las bases genticas y bioqumicas
del sistema de antgenos flagelares an son desconocidas.
Esto hace especialmente difcil encontrar una relacin di-
recta entre los genes determinantes del serovar y otros
genes en B. thuringiensis, como los que determinan la sn-
tesis de -exotoxina [Hernndez et al., 2003]. En este es-
tudio no fue posible establecer esta relacin debido a que
se emplearon muy pocas cepas, y las dos que resultaron
positivas pertenecen a serotipos diferentes.
En estudios previos realizados en el Instituto de Inves-
tigaciones de Sanidad Vegetal se demostr que el
sobrenadante de cultivos obtenidos a partir de las ce-
pas estudiadas en este trabajo, y esterilizado a 121C,
presentaron actividad txica contra un grupo de orga-
nismos plaga como caros y nematodos [Mrquez et al.,
1999; 2003]; sin embargo, resulta interesante destacar
que no pudo observarse en cada una de ellas el pico
correspondiente a la -exotoxina. Estos resultados pu-
dieran tener explicacin con lo afirmado por Levinson
et al. (1990) en cuanto a que los patrones de aparicin
de la exotoxina termoestable sugieren que puede estar
involucrado solo un nico gen. La produccin de
exotoxina puede ser resultado de una sola reaccin
enzimtica, a partir de molculas precursoras presen-
tes tanto en las cepas Exo
+
como Exo
. Es probable
que estos precursores estn involucrados en el control
de la transcripcin de los genes de la esporulacin y no
como sugirieron Johnson y Peterson (1983) en la pro-
duccin de la exotoxina, lo que implicara que la -exo-
toxina no se produzca por todas las cepas de B. thu-
ringiensis.
Otra explicacin a la no deteccin del metabolito en las
restantes cepas pudo deberse tambin a niveles de con-
centracin bajos en el medio de fermentacin, a lo cual
se suma la presencia de molculas contaminantes en la
solucin que hace difcil su determinacin. Oehler et al.
(1982) emplearon una columna C
18
y como fase mvil
H
2
O y cido trifluoractico; sin embargo, el mtodo no
dio resultado debido a que los contaminantes del
sobrenadante del cultivo de B. thuringiensis coeluan
con la toxina, lo cual se considera que tambin pudo
ocurrir en los resultados presentes. Debido a esto y a
su pequea masa molecular, la utilizacin de un mto-
do altamente eficiente en el proceso de obtencin de la
exotoxina constituye un proceso clave para el recobra-
do y purificacin de la -exotoxina.
La adicin de -exotoxina estndar durante el proceso
de crecimiento de la cepa LBT 5 dio como resultado la
presencia del pico correspondiente a la -exotoxina a con-
centraciones de 0,42 g.mL
1
y 35,8 g.mL
1
(Figs. 4(A)
y (B)). Esto indica que la -exotoxina no se pierde du-
rante el proceso de obtencin previo a la cromatografa.
La adicin de -exotoxina estndar a un grupo de cepas
en estudio tambin la utilizaron Gohar y Perchat (2001)
para corroborar la presencia de la toxina. A este proce-
dimiento se le denomin mtodo del testigo externo.
Figura 4. Cromatogramas de la cepa LBT5 contaminada con -exotoxina estndar al inicio del cultivo (A) y una vez concluido el
procesamiento de la muestra (B). Columna LiChrospher RP-18, 5 mm (250 x 4,6 mm), flujo 2 mL.min
1
, 260 nm, volumen de
inyeccin 100 L, fase mvil KH
2
PO
4
, pH 3,0.
fitosanidad/259
Deteccin de -exotoxina en cepas...
Otra explicacin a la ausencia del pico tpico de la -exo-
toxina en las cepas LBT4, LBT5, LBT7, LBT12, LBT13,
LBT16 y LBT25 es la presencia de una segunda
exotoxina denominada tipo II, la cual se produce a concen-
traciones mucho ms bajas que la -exotoxina tipo I. Este
resultado fue corroborado por Levinson et al. (1990) al
identificar la -exotoxina tipo I en un grupo de cepas de
B. thuringiensis; sin embargo, no se pudo detectar en
una cepa de B. thuringiensis var. morrisoni, que exhibi
actividad txica en el sobrenadante esterilizado a 121C
contra Musca domestica, Diabotrica undecimpuntacta y
Leptinotarsa decemlinneata. El anlisis realizado por es-
tos autores dio como resultado la identificacin de este
nuevo tipo de exotoxina. Esta molcula es menos
hidrofbica y se sugiere que sea un anlogo de uracilo de
la exotoxina tipo I [Levinson et al., 1990].
La existencia de esta toxina aclar resultados confusos y
contradictorios reportados en la literatura. Igualmente
Gohar y Perchat (2001) lograron identificar la exotoxina
tipo II al emplear RP-HPLC, pero con la utilizacin pre-
via de precipitacin con solventes orgnicos y una
cromatografa de intercambio aninico. Estos autores con-
firman que resulta de vital importancia la preparacin
previa de la muestra para la deteccin y cuantificacin de
este metabolito, e indican que una alternativa promisoria
sera la utilizacin de deteccin fluorescente en lugar de
absorcin UV, lo que incrementara ampliamente la sensi-
bilidad y la selectividad de la determinacin.
CONCLUSIONES
Se detect la presencia de -exotoxina en las cepas
LBT9 y LBT47 a concentraciones de 34 g.mL
1
y
4,5 g.mL
1
respectivamente.
REFERENCIAS
Fernndez-Larrea, O.: Aislamiento, seleccin y estudio de cepas de
Bacillus thuringiensis para el control fitosanitario. Informe Final
PNCT, Biotecnologa Agrcola, INISAV, Cuba, 1999.
Galn, W.; K. Arvalo: Uso de un mtodo sencillo para deteccin de b-
exotoxina en cepas de Bacillus thuringiensis, South Western
Entomologist 19 (4):385-390, 1994.
Glare, T.; M. Callaghan: Bacillus thuringiensis: Biology, Ecology and
Safety, Eds. John Wiley and Sons, 2000.
Gohar, M.; S. Perchat: Sample Preparation for b-Exotoxin Determination
in Bacillus thuringiensis Cultures by Reversed-Phase High Perfor-
mance Liquid Chromatography, Anal. Biochem. 298:112-117, 2001.
Hernndez, C.; C. Martnez; H. Porcar; J. Ferr: Correlation Between
Serovars of Bacillus thuringiensis and Type I -Exotoxin Production,
J. Invertebr. Pathol. 82:57-62, 2003.
Hernndez, C.; J. Ferr: Larget-Thiry Update on the Detection of b-
Exotoxin in Bacillus thuringiensis by HPLC Analysis, J. Appl.
Microbiol. 90:643-647, 2001.
Johnson, D.; R. Peterson: Limitations of HPLC for the Detection of b-
Exotoxin in Cultures Filtrate of Bacillus thuringiensis, European
Journal of Appl. Microbiol. Biotechnol. 17:231-234, 1983.
Levinson, B.; K. Kasyan; S. Chiu; T. Curier; J. Gonzlez: Identification
of b-Exotoxin Production, Plasmids Encoding b-Exotoxin, and a New
Exotoxin in Bacillus thuringiensis by Using High Performance Liquid
Chromatographic, J. Bacteriol. 172:3172-3179, 1990.
Mrquez, Mara E.; Orietta Fernndez-Larrea; Lrida Almaguel: Pro-
duccin y evaluacin de cultivos de Bacillus thuringiensis (Berliner)
con efecto acaricida sobre P. latus (Banks.) (Acarina: Tarso-
nemidae), Fitosanidad. 3 (3):53-58, 1999.
Mrquez, Mara E.: Actividad nematicida de cepas de Bacillus
thuringiensis para el control de Meloidogyne incognita en Cuba
Tesis en opcin al ttulo acadmico de Maestro en Microbiologa Ge-
neral, Universidad de La Habana, 2003.
Oehler, D.; R. Gingrich; M. Haufler: High Performance Liquid
Chromatographic Determination of b-Exotoxin Produced by the Bacterium
Bacillus thuringiensis, J. of Agric. Food Chem. 30:407-408, 1982.
260/fitosanidad
fitosanidad/261
DIAGNSTICO DE FITONEMATODOS EN SUELOS
DE CULTIVOS FRUTALES
Ral Hernndez Hernndez
1
, Gladis del Valln
2
y Doris Hernndez
2
1
a
B y 5.
a
F, Playa, Ciudad
de La Habana, rhernandez@inisav.cu
2
Instituto de Investigaciones en Fruticultura Tropical. Ave 7.
a
no. 3005 e/ 30 y 32, Playa, Ciudad
de La Habana, CP 11300
RESUMEN
Se diagnosticaron campos agrcolas en fase de presiembra para
conocer los principales gneros de nematodos en suelos previamen-
te sembrados de pia (Ananas comosus Lin. Merr.), papaya (Carica
papaya Lin.), guayaba (Psidium guajava Lin.), aguacate (Persea ame-
ricana Lin.), mango (Manguifera indica Lin.) y uva (Vitis vinifera Lin.)
de las provincias de Ciudad de La Habana, La Habana, Ciego de
vila, Matanzas y el municipio especial de Isla de la Juventud. Para
la extraccin de los nematodos mviles se utiliz el mtodo de
Baermann, mientras el ndice de infestacin del suelo con el nematodo
de las agallas se valor mediante la prueba de la planta indicadora
con la contribucin de los agricultores. En todas las muestras de
suelo y races se observaron nematodos parsitos de plantas con
diversos niveles de densidad de poblacin. Los gneros detectados
con mayor frecuencia fueron Meloidogyne Goeldi (100%), Rotylen-
chulus Linford & Oliveira (72%), Helicotylenchus Steiner (33%) y
Pratylenchus Filipjev (22%). Las mayores densidades de poblacin
se correspondieron con los suelos que anteriormente haban sido
cultivados con guayaba.
Palabras claves: Meloidogyne, Rotylenchulus, Helicotylenchus,
Pratylenchus, guayaba, pia
ABSTRACT
Pre sowing agricultural fields which were planted with fruits as
pineapple (Ananas comosus Lin. Merr.), papaya (Carica papaya Lin.),
guava (Psidium guajava Lin.), avocado (Persea americana Lin.), man-
go (Manguifera indica Lin.) and grape fruit (Vitis vinifera Lin.) from four
provinces of Cuba and especial county Isla de la Juventud, were
nematolgically essayed in vitro, to know current status of nematodes
main genera. Motile nematodes extraction was achieved by using
Baermann method, while root-knot nematodes soil infestation was
valorised with indicator plant test and farmers contribution. Different
population densities of plant-parasites nematodes were detected in
all soil and roots samples. Most frequently nematodes were
Meloidogyne Goeldi (100%), Rotylenchulus Linford & Oliveira (72%),
Helicotylenchus Steiner (33%) y Pratylenchus Filipjev (22%). Soils
before cultivated with guava showed the highest nematode population.
Key words: Meloidogyne, Pratylenchus, Rotylenchulus, Helico-
tylenchus, guava, pineapple
INTRODUCCIN
En la agricultura cubana actual se incrementa el fo-
mento y la diversificacin de frutales, pero para lograr
cosechas productivas y consistentes es necesario enfren-
tarse a las plagas desde el vivero o ya en la plantacin.
Entre ellas se encuentran los nematodos parsitos que
pueden ocasionar prdidas de rendimiento entre 10 y
30% en los cultivos susceptibles [Fernndez, 1991;
INIFAP, 2002].
El fruticultor debe valerse del diagnstico nematolgico
para conocer el tipo y la cantidad de nematodos en el
suelo antes de sembrar o plantar, a fin de adoptar me-
didas preemergentes cuando se detectan poblaciones por
encima de los niveles que causan dao econmico. Por
esa razn el anlisis de laboratorio y campo proporcio-
na la ventaja de realizar tratamientos al suelo con un
ahorro en el costo de la estrategia de manejo [Stirling y
Kopittke, 2000]. Adems de lo sealado, se deben te-
ner en cuenta otros aspectos como la topografa y el
drenaje del campo, la eficacia del sistema de riego y la
capacitacin de los agricultores.
El presente trabajo muestra la situacin nematolgica
de diversos campos de produccin de frutales, lo que
permite facilitar la aplicacin del manejo preventivo de
nematodos en los campos evaluados.
Hernndez y otros
262/fitosanidad
MATERIALES Y MTODOS
Se realiz un diagnstico de nematodos en presiembra
en suelos que previamente estuvieron sembrados con
guayabo, en fincas de los municipios de Alquzar y
Bejucal en la provincia de La Habana; con mango y
aguacate en el municipio de La Lisa, de Ciudad de La
Habana; con pia en Ciego de vila, en la propia pro-
vincia; con papayo en Jagey Grande, en Matanzas, y
con uva en el municipio especial de Isla de la Juventud.
Para la evaluacin se establecieron parcelas entre 0,5 y
1,0 ha/campo, y en sus diagonales se tomaron porcio-
nes de suelo de un perfil entre 6 y 30 cm de profundi-
dad, con una piocha o pico, y siempre se desech el sue-
lo de los primeros 5 cm; el nmero de muestras para
cada parcela se determin a partir del producto del va-
lor del rea por 50, con aproximacin por exceso, de
acuerdo con la metodologa establecida por Fernndez
(1991). En los puntos donde exista vegetacin se ex-
trajeron entre 100 y 300 g de races que an no estuvie-
ran muertas, marchitas o con ataques de otros pat-
genos, conjuntamente con el suelo.
Las muestras se depositaron en una o varias bolsas de
polietileno negro identificadas por rea, campo, locali-
dad, provincia, cultivo, variedad, fecha de siembra o
cosecha, cultivo y variedad anterior, fecha del muestreo
y tcnico colector.
La extraccin de los estadios mviles de nematodos
se realiz de acuerdo con el mtodo de Baermann.
Se procesaron 18 muestras de 50 g cada una, y los
nematodos se recuperaron en viales de 15 mL, y
para la identificacin de los gneros se realizaron
observaciones al microscopio estereoscopio de acuer-
do con las claves taxonmicas [Siddiqi, 2000]. In-
mediatamente despus se realiz el conteo con un
contador manual y se calcul el promedio de ejem-
plares por muestra.
En las muestras de suelo colocadas en bolsas o mace-
tas se sembraron tres semillas pregerminadas de ca-
labaza (Cucurbita moschata Lin.) o pepino (Cucumis
sativus Lin.), a razn de tres bolsas o macetas por
muestra de suelo o materia orgnica, y se colocaron
sobre una superficie separada del suelo, a fin de evi-
tar la contaminacin por contacto con el suelo. Las
plantas se regaron e inspeccionaron peridicamente
durante 35 das de cultivo (en el verano) o 45 (en el
invierno); luego se extrajeron con sumo cuidado para
evitar que se partieran las races. La presencia de
nematodos se determin mediante inspeccin visual
de acuerdo con una escala de seis grados [Zeck, 1971;
Pntener, 1981]. A cada planta indicadora se le asig-
n un grado entre 0 y 5 (Tabla 1), y se calcul el pro-
medio del grado de agallamiento o ndice de agallas
del total de plantas evaluadas.
Tabla 1. Descripcin de las races de acuerdo con el grado de infestacin
con Meloidogyne spp.
Grado Descripcin
0 Races sin agallas
1 Pequeas agallas difciles de descubrir o distribuidas por todas las races
2 Desde numerosas agallas pequeas distribuidas en las races (algunas pueden
estar encadenadas entre s) hasta numerosas agallas de mayor tamao
3 Agallas presentes en 25-50% de las races contaminadas
4 Desde 75% de las races con agallas semejantes a tumoraciones, hasta la raz
casi totalmente contaminada (an la planta conserva su aspecto verde)
5 Desde la raz casi totalmente contaminada y reducida (la planta muestra
sntomas del dao) hasta el deterioro total por la muerte

Se calcul la frecuencia de aparicin de los nematodos
por la divisin de la cantidad de muestras por gnero
detectado entre el total de muestras evaluadas expre-
sado en porciento.
En todas las reas diagnosticadas se detectaron
nematodos parsitos de plantas con diversos niveles de
fitosanidad/263
Diagnstico de fitonematodos...
densidad de poblacin, que en la mayora fueron bajos
o moderados, aunque en las muestras correspondien-
tes a los campos de Bejucal y Alquzar de la provincia
de La Habana previamente sembrados de guayaba los
niveles alcanzaron valores elevados o muy elevados (Ta-
bla 2).
Figura 1. Frecuencia de aparicin de los diferentes gneros de nematodos en cultivos frutcolas.
El anlisis de laboratorio revel que en los campos de
frutales en fase de presiembra los gneros ms frecuen-
tes fueron Meloidogyne y Rotylenchulus. Ambos estu-
vieron presentes en todos los cultivos en algunas de sus
estadios infectivos (Fig. 1), lo que permite asumir la
existencia de una estrecha asociacin entre estos orga-
nismos y los cultivos frutcolas. Estos resultados son
similares a los obtenidos en Venezuela por Petit (1990)
en los estudios de biodiversidad nematolgica. Los com-
plejos formados por estos gneros pudieran represen-
tar un peligro potencial, fundamentalmente para fru-
tales como el guayabo y la pia, debido a los daos que
pueden causar en su sistema radical, que limitan sensi-
blemente la absorcin de los nutrientes y por consi-
guiente el desarrollo y la productividad.
Helicotylenchus y Pratylenchus no estuvieron presen-
tes en las reas agrcolas que anteriormente se cultiva-
ron con aguacatero y uva; Helicotylenchus tampoco se
present en campos de papayo, y Patylenchus no se
detect en campos de mango (Tabla 2).
En general las mayores poblaciones de nematodos se
apreciaron en los campos de guayabo, con predo-
minancia de Meloidogyne sobre Pratylenchus, lo cual
coincide con Fernndez (1991), quien asever que este
cultivo es un buen hospedero de ambas especies, y que
las prdidas econmicas que ocasionan estos nematodos
pueden alcanzar 20 t/ha en plantaciones jvenes, segn
Surez et al. (1998) con valores mximos entre 48 y 57%
en plantaciones establecidas. Los daos incluso pue-
den ser an mayores en la fase de produccin, cuando
se emplean posturas contaminadas, pues la alimenta-
cin y reproduccin del nematodo tiene lugar desde el
mismo inicio del crecimiento del cultivo en la fase de
vivero. En este trabajo se observ una tendencia des-
cendente del ndice de agallamiento de Meloidogyne
desde la mxima densidad de poblacin hasta 240 J
2
/
250 g de suelo, a partir de la cual no se present una
infestacin visible en races (Tabla 2).
En las muestras de los suelos dedicados a la pia se
observaron poblaciones de Rotylenchulus y Meloidogyne.
Estos gneros de nematodos usualmente estn asocia-
dos al cultivo con una incidencia negativa en el desa-
rrollo de la planta y el rendimiento agrcola, por lo que
es muy til realizar el diagnstico nematolgico antes
de la siembra [Gandoy y Ortega, 1980; MINAGRI,
1989; Araya, 2006].
CONCLUSIONES
Meloidogyne y Rotylenchulus con 100 y 72% respecti-
vamente fueron los gneros de nematodos ms fre-
cuentes en las muestras de suelos de frutales en fase
de presiembra.
Los suelos procedentes del guayabo se distinguieron
notablemente por las elevadas densidades de pobla-
cin de Meloidogyne en comparacin con los de pia,
uva, papayo, mango y aguacatero.
Helicotylenchus y Pratylenchus no estuvieron pre-
sentes en las reas agrcolas anteriormente cultiva-
das con aguacatero y uva, mientras el primero tam-
poco estuvo en papayo y el segundo en mango.
Hernndez y otros
264/fitosanidad
Tabla 2. Fauna de nematodos parsitos de los cultivos frutales detectados. Individuos
por 250 g de suelo
Meloidogyne sp. Rotylenchu-
lus sp.
Municipio/
provincia
Unidad agrcola Cultivo
precedente
Variedad
J2 M G J4 M
Helicoty-
lenchus sp.
Pratylen-
chus sp.
2756 4 25
1305 2
620 1
Alquzar/
La Habana
Estacin
Experimental
de Fruticultura
Guayabo Enana EEA
18-40
305 0,3 100
240 0,3 50
130 0 15 5 15
110 0 10
Bejucal/
La Habana
Finca
La Milagrosa
Guayabo Enana EEA
18-40
100 0 40 35
Super
Hayden
70 0 10 5 Mango
Hyden 30 0 35 10 5
La Lisa/
Ciudad de La
Habana
Finca
de
autoconsumo
Aguacatero Catalina-
Govin
10 0 5
160 10 0 110 20 Espaola roja
5 0 5
Ciego de vila/
Ciego de vila
Empresa
de la Pia
Pia
Cayena lisa 53 5 0 85 10 5
Solosunrise 100 10 5 Jagey Grande/
Matanzas
Estacin
Experimental
de Fruticultura
Papayo
Maradol 60 5 0 5 5
140 0
90 0
Isla de la
Juventud
Finca orgnica Uva Aramn
30 0 200
J2: Larva infectiva del segundo estadio. M: Espcimen adulto macho.
G: Grado de infestacin con agallas. J4: Hembra adulta joven infectiva.

REFERENCIAS
Araya, M.; Comunicacin personal, 2006.
Fernndez, E. Los nematodos del gnero Meloidogyne Goeldi en el
cultivo de la guayaba (Psidium guajava L.) y su control. Tesis de
Doctorado en Ciencias Agrcolas, Instituto de Investigaciones de
Sanidad Vegetal, La Habana, 1991.
Gandoy, P.; J. Ortega: Nematodos parsitos del cultivo de la pia en
Cuba y posibilidades de su control, Ciencias de la Agricultura
7:19-28, 1980.
INIFAP: Control de nematodos fitoparsitos en pia. Ficha tecnolgica
por sistema tecnolgico, estado de Veracruz, Mxico, 2002.
http://www.inifap.gob.mx/contenido/innovaciones/innovaciones.
html#sanidad.
MINAGRI: Instructivo tcnico para el cultivo de la pia, Departamento
Independiente de Frutales. rea No Caera, Centro de Informacin y
Documentacin Agropecuaria, La Habana, 1989.
Petit, P.: Reconocimiento de nematodos fitoparsitos asociados a fru-
tales de importancia econmica en Venezuela, Fitopatol. Venez.
3(1):2-5, 1990.
Pntener, W.: Manual para ensayos de campo de proteccin vegetal,
2.
a
ed. revisada y ampliada, Documenta CIBA-GEIGY, Basilea, Suiza,
1981.
Siddiqi, M. R.: Tylenchida. Parasites of Plants and Insects, 2th Ed.,
CABI Publishing, Wallingford, Inglaterra, 2000.
Stirling, G. R.; R. Kopittke: Sampling Procedures and Damage
Thresholds for Root-Knot Nematode (Meloidogyne javanica) on
Pineapple, Aust. J. Exp. Agric. 40(7):1003-1010, 2000.
Surez, H. Z.; L. C. Rosales; M. S. Gonzlez: Nematodos asociados a
los frutales de importancia y su control. I: frutales perennes, Fonaiap
Divulga. 59:13-18, 1998.
Zeck, W. M.: El esquema de valoracin del ataque de cecidios
radiccolas, Pflanzenchutz Nacrichten Bayer 24(1):147-150, 1971.
fitosanidad/265
AISLAMIENTO, IDENTIFICACIN Y CARACTERIZACIN
MORFOMTRICA DE AISLADOS NATIVOS DE HONGOS
MITOSPRICOS CON POTENCIALIDAD PARA EL CONTROL
DE ESPECIES DE INSECTOS PLAGA
Orestes Elsegui Claro, Jess Jimnez Ramos y Aidanet Carr Prez
a
B y 5.
a
F, Playa, Ciudad de
La Habana, CP 11600
RESUMEN
Se realiz una prospeccin de hongos entomopatgenos a partir de
especies de insectos plaga sospechosos de micosis en cultivos de
gran importancia econmica y de muestras de suelo. De un total de
53 muestras se obtuvieron 17 tiles que correspondieron a 15 aisla-
dos de Beauveria bassiana (Bals.) Vuill., una de Paecilomyces lilacinus
Samson y una de Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorokin. El predo-
minio de aislados de Beauveria fue consecuencia en parte del amplio
rango de hospedantes de esta especie fngica y a la cantidad de
muestras procesadas que pertenecieron a Hypothenemus hampei
(broca del caf), donde este microorganismo es un patgeno muy
habitual. Solamente se obtuvo un aislado de hongo de las 15 mues-
tras de suelo procesadas mediante el trampeo con insectos patro-
nes. Todos los aislados se incorporaron a la Coleccin de Cepas de
Hongos Entomopatgenos del Instituto de Investigaciones de Sani-
dad Vegetal (INISAV), donde se registraron sus caractersticas
macroculturales, microculturales, origen y especie a que pertene-
cen, con el objetivo de conservarlos para futuros estudios como
agentes potenciales de biocontrol de insectos plaga.
Palabras claves: hongos entomopatgenos, hongos mitospricos, con-
trol biolgico, plagas
ABSTRACT
A screening for entomopathogenic fungi from both mycosis suspect
insect cadavers in crops of economical importance and soil samples
was carried out. Of a total out of 53 samples collected 17 resulted
successful which belonged to 15 isolates of Beauveria bassiana (Bals.)
Vuill., one of Paecilomyces lilacinus Samson and one of Metarhizium
anisopliae (Metsch.) Sorokin. The predominance of Beauveria isolates
was a consequence in part of the large amount of samples taken from
Hypothenemus hampei (coffee berry borer) where this microorganism
has been found as a very common pathogen as well as the broad host
range this fungal species exhibits in nature. Only one fungal isolate
of fifteen different soil samples tested by insect bait method was
obtained. All the isolates recovered were stored in the Plant Health
Research Institute (INISAV) Culture Collection being previously
recorded i n a datasheet wi th the mi cro and macro cul tural
characteristics, origin and species name, for further research for a
potential use as biological control agents of insect pests.
Key words: entomopathogenic fungi, mitosporic fungi, biological con-
trol, pests
INTRODUCCIN
Los hongos mitospricos estn catalogados como un
grupo mundialmente reconocido de agentes microbianos
a usarse tanto en los programas de control biolgico de
plagas como en los de manejo integrado de plagas (MIP).
Esto es debido a su forma de actuar, que es por contac-
to directo con la cutcula del hospedero y por la dispo-
nibilidad de tecnologas para producirlos masivamen-
te. Algunos gneros adems se pueden formular en
aceites y as aplicarse con tcnicas de volumen ultrabajo
[Bateman et al., 1993; Bateman et al., 1996].
Est demostrado que para llegar a obtener un produc-
to altamente efectivo para controlar una especie plaga
se debe partir de un amplio rango de aislados, seleccio-
nados en principio en cuanto a su virulencia. Los aisla-
dos que causan epizootias espectaculares, como es el
caso de algunos de los gneros fngicos imperfectos
entomopatognicos, son candidatos promisorios para
usarse en el control de plagas, siempre y cuando logren
clasificar sobre la base de otras caractersticas esencia-
les como son un nivel de especificidad de hospedante
estrecho, buena tolerancia a factores ambientales ad-
versos, facilidad de produccin, comportamiento en al-
macenaje adecuado y alta seguridad en mamferos
[Bateman et al., 1996].
Clsicamente hay tres vas de enriquecer el nmero de
aislados fngicos para utilizarse como candidatos en el
Elsegui y otros
266/fitosanidad
control biolgico de plagas. La primera es mediante el
aislamiento del hongo a partir de artrpodos y
nematodos micosados, la segunda a travs de muestras
de suelo y por ltimo directamente de las colecciones
de cultivo [Rhodes y Smith, 1992].
Una vez aislado el agente es necesaria una correcta iden-
tificacin. La identificacin tradicional por medio de
las caractersticas morfolgicas mantiene un peso rele-
vante, aunque se han introducido conceptos nuevos que
conllevan a algn tipo de marcador molecular que per-
mita, entre otras cosas, identificar al agente incluso
despus de su liberacin [Bridge y Arora, 1998 citados
por Bielikov et al., 2002].
En Cuba, dentro de los hongos entomopatgenos estn
autorizados a producirse masivamente solamente dos
cepas de Beauveria bassiana de las que una no es nati-
va, y la otra es de Metarhizium anisopliae. Para el caso
de Lecanicillium lecanii (syn. Verticillium lecanii) se
cuenta con dos cepas en la produccin, ambas forneas.
Por estas razones surge la necesidad de contar con ma-
yor cantidad de aislados e introducir nuevos en la pro-
duccin, que tengan ventajas como controladores de
determinadas plagas agrcolas con respecto a las que
ya se producen masivamente en el pas.
Los objetivos del trabajo fueron realizar aislamientos
de hongos patgenos a artrpodos (insectos), con nfa-
sis en especies plaga de relevancia econmica, identifi-
carlos taxonmicamente e incorporarlos a la Coleccin
de Hongos Entomopatgenos y Antagonistas del Ins-
tituto de Investigaciones de Sanidad Vegetal (INISAV)
para estudios posteriores.
MATERIALES Y MTODOS
En los Laboratorios Provinciales de Sanidad Vegetal
(LAPROSAV) y en el INISAV se recibieron muestras
que consistieron en individuos muertos pertenecientes a
la clase Insecta, sospechosos de micosis, segn sntomas
de momificacin y/o mecanizacin, o con esporulacin de
naturaleza fngica en la superficie cuticular; tambin se
recibieron muestras de suelo. Ambas muestras proce-
dan de zonas donde se haban observado epizootias y no
aplicado productos a base de hongos entomopatgenos,
de acuerdo con registros histricos de campo.
Para el aislamiento del hongo, que ya estaba esporulado
sobre los individuos colectados, se realizaron siembras
en placas Petri de 9 cm de dimetro, por agotamiento
en agar sabouraud dextrosa o agar papa dextrosa
(PDA) o agar extracto de malta (MEA), en presencia de
antibiticos, segn el mtodo descrito por Rhodes y
Smith (1992). Para los individuos sospechosos de mico-
sis se realizaron lavados con agua estril y desinfecciones
con NaHClO a 0,5% durante 1 min. Seguidamente se
realizaron dos lavados por agua estril y se colocaron en
cmaras hmedas incubadas a 28C por 7-9 das. A par-
tir del segundo da se observaron, y en los individuos
donde se detect emersin de micelio se realizaron trans-
ferencias bajo condiciones aspticas, con siembras por
agotamiento de acuerdo con el mtodo ya mencionado.
Para el aislamiento de hongos entomopatgenos con
Galleria mellonella se sigui el mtodo de trampeo des-
crito por Zimmermann en 1986 [citado por Sun, 2002]
con algunas modificaciones para este trabajo. Las mues-
tras de suelo se obtuvieron a partir de la seleccin de
una hectrea que fuese representativa de un agroeco-
sistema con registros de infecciones por hongos
entomopatgenos en insectos plaga. Se tomaron cinco
puntos al azar y de cada punto se colectaron 10
submuestras de 10 cm
3
de suelo cada una. El material
se coloc en bolsas oscuras y se homogenizaron en una
muestra nica en el laboratorio. Se vertieron 6-10 g de
suelo por placa Petri de 12 cm de dimetro y en cada
una se coloc un individuo de Galleria mellonella o
Corcyra cephalonica de primeros estadios larvales, como
insectos cebo o trampeadores. Las placas se observa-
ron a partir del segundo da hasta el noveno, con movi-
miento diario. Si en este intervalo ocurra la muerte se
proceda a la desinfeccin superficial, incubacin y ais-
lamiento del supuesto hongo de forma similar a lo ex-
plicado en el prrafo anterior para los individuos sos-
pechosos de micosis.
Las colonias obtenidas en placa se observaron al mi-
croscopio estereoscpico y se realizaron preparaciones
al microscopio ptico que se compararon con las des-
cripciones de gneros hifomicetos de Carmichael et al.
(1980) y Barnett y Hunter (1998). En caso de pertene-
cer el individuo a un gnero patognico de inters, se
realizaba un subcultivo en medio agarizado y se regis-
traba como un nuevo aislado de la coleccin; en caso
contrario las muestras procesadas se destruan. La iden-
tificacin del patgeno a nivel de especie se realiz con
ayuda de las descripciones de especies de hongos
entomopatgenos del CMI, de acuerdo con las caracte-
rsticas macro y microculturales [CMI, 1979].
Los aislados de hongos entomopatgenos obtenidos co-
rrespondieron a los gneros Beauveria, Paecilomyces y
Metarhizium, a los que se les estudiaron sus caracters-
ticas macro y microculturales ms notables (Tabla 1).
fitosanidad/267
Aislamiento, identificacin y caracterizacin...
Tabla 1. Aislados de hongos entomopatgenos obtenidos. Principales caractersticas macro y microculturales

Aislado
(nmero de
registro de origen)
Origen Identificacin
Caractersticas
macroculturales
Caractersticas
microculturales
Bb-102 Metamasius
hemipterus
ceriseus
(coleptero),
Matanzas
Beauveria
bassiana
En PDA colonias al inicio
blancas afieltradas que con el
tiempo se tornan crema
polvorientas. Reverso amarillo
ligero
Clulas conidigenas muy tpi-
cas de la especie, con bases glo-
bosas. 2,0-3,0 (2,3 m) x 2,0-2,5
(2,1 m). Conidios hialinos,
globosos a subglobosos1,0-2,5
(1,9 m) x 1,0-2,0 (1,7 m)
Bb-103 Metamasius
hemipterus
(coleptero),
Santiago
de Cuba
Beauveria
bassiana
En PDA colonias algodonosas
y blancas al inicio que se
tornan crema y polvorientas
con el tiempo. Reverso amarillo
ligero
Muy abundantes conidioforos
con grupos densos de clulas
fialdicas. Clulas conidigenas
globosas unas y otras en forma
de botella con formas interme-
dias, 1,5-3,0 (2,7 m) x 2,0-3,0
(22 m). Conidios hialinos, a
veces con un pice muy
definido, globosos a elipsoidales
1,5-3,0 (2,3 m) x 1,5-3,0
(21 m)
Bb-105 Hypothenemus
hampei
(coleptero),
cafetal, zona
montaosa,
Granma

Beauveria
bassiana
Colonias en PDA que al inicio
son blancas y algodonosas y se
tornan beis claro y ligeramente
polvorientas, segn esporulan
con el tiempo. Reverso amarillo
ligero
Clulas conidigenas muy tpi-
cas de la especie, con bases glo-
bosas. 2,0-3,0 (2,3 m) x 2,0-2,5
(2,2 m). Conidios muy homo-
gneos, hialinos, globosos,
algunos subglobosos,
2,0-2,0 m
Bb-106

Hypothenemus
hampei
(coleptero),
caf, zona
montaosa,
Granma
Beauveria
bassiana
tornan crema claro y
ligeramente polvorientas segn
esporulan con el tiempo.
Algunos coremios. Reverso
amarillo ligero
Clulas conidigenas globosas unas
y otras en forma de botella con
formas intermedias, 2,0-3,5
(2,3 m) x 1,0-2,5 (1,9 m).
Conidios hialinos, globosos a
subglobosos1,5-2,0
(1,9 m)x1,0-2,0 (1,7m)
Bb-107

Hypothenemus
hampei
(coleptero),
caf, zona
montaosa,
Granma
Beauveria
bassiana
tornan beis claro y ligeramente
polvorientas segn esporulan
con el tiempo. Algunos
coremios Reverso amarillo
ligero
Clulas conidigenas globosas
unas y otras en forma de botella
con formas intermedias, 2,0-3,5
(2,3 m) x 1,0-2,5 (1,9 m).
Conidios hialinos, globosos a
subglobosos1,5-2,0 (1,9 m) x
1,0-2,0 (1,7m)
Bb-SP Spodoptera
frugiperda
(lepidptero),
maz,
Camagey
Beauveria
bassiana
En PDA colonias algodonosas
y blancas al inicio que se
tornan beis y ligeramente
polvorientas con el tiempo.
Reverso miel
Clulas conidigenas muy
tpicas de la especie, con bases
globosas, 2,0-3,0
(2,4 m) x 2,0-2,5 (2,3 m).
Conidios muy homogneos, hia-
linos, globosos, algunos ligera-
mente subglobosos, 2,0-2,0 m

Elsegui y otros
268/fitosanidad
Bb-200603 Hypothenemus
hampei
(coleptero),
caf, zona
montaosa,
Holgun
Beauveria
bassiana
Colonias en MEA que al inicio
tornan beis y polvorientas
segn esporulan con el tiempo.
Reverso amarillo claro
Clulas conidigenas,
predominan las de forma de bo-
tella, 3,0-4,0 (3,3 m) x 3,0-2,0
(2,3 m). Conidios variables,
aunque predominan formas
elipsoidales, base apiculada en
ocasiones, hialinos, 2,0-3,0
(2,3 m) x 2,0-3,0 (23 m)
Bb-cepa2 Hypothenemus
hampei
(coleptero),
caf, zona
montaosa,
Santiago de
Cuba
Beauveria
bassiana
Reverso amarillo plido
Clulas conidigenas tpicas de
la especie, con bases globosas,
2,0-3,0 (2,2 m) x 2,0-2,5 (2,3 m).
Conidios globosos a subglobo-
sos, hialinos, algunos apicu-
lados, 2,0-2,5(2,2 m) x 1,5-2,0
(1,8 m)
hampei
(coleptero),
caf, zona
montaosa,
Santiago de
Cuba
Beauveria
bassiana
Reverso amarillo muy plido
2,0-3,0 (2,3 m) x 2,0-2,5 (2,4 m).
Conidios subglobosos a
ligeramente elipsoidales,
predominando estos ltimos,
hialinos, 2,0-3,0 (2,6 m) x 2,0
hampei
(coleptero),
caf, zona
montaosa,
Santiago de
Cuba
Beauveria
bassiana
tornan beis claro y polvorientas
Clulas conidigenas
predominan las de forma de
botella, 3,0-4,0 (3,2) x 3,0-2,0
(2,4 m). Conidios, predominan
formas elipsoidales, algunos
globosos a subglobosos,
hialinos, en ocasiones
apiculados, 2,0-3,0
(2,5 m) x 2,0-2,5 (2,2 m)
hampei
(coleptero),
caf, zona
montaosa,
Santiago de
Cuba
Beauveria
bassiana
tornan beis claro y polvorientas
Tendencia discreta a formar
coremios. Reverso amarillo
miel
Clulas conidigenas, predominan
las de forma de botella, 3,0-4,0 (3,3)
x 3,0-2,0 (2,5 m). Conidios,
predominan formas elipsoidales
con pice definido, algunos
subglobosos, hialinos, 2,0-3,0
(2,6 m) x 2,0
hampei
(coleptero),
caf, Guam,
Santiago de
Cuba
Beauveria
bassiana
tornan beis medio y polvo-
rientas segn esporulan con el
tiempo. Tendencia a formar
coremios. Reverso amarillo
2,0-3,0 (2,3 m) x 2,0-2,5 (2,4 m).
Conidios globosos a subglobosos
ligeramente, hialinos, 2,0 x2,0 m
Bb-SIM Hypothenemus
hampei
(coleptero), caf,
Tercer Frente,
Santiago de Cuba
Beauveria
bassiana
tornan beis plido y polvorien-
tas segn esporulan con el tiem-
po. Reverso amarillo plido
Clulas conidigenas con bases
globosas, 2,0-3,0
(2,1 m) x 2,0-2,5 (2,4 m).
ligeramente elpticos, hialinos,
2,0-3,0 (2,3) x 1,5-2,5 (2,1) m
fitosanidad/269
Bb-SL Hypothenemus
hampei
(coleptero),
caf,
San Luis,
Santiago de
Cuba
Beauveria
bassiana
tornan beis plido y
ligeramente polvorientas segn
Tendencia a formar coremios.
Clulas conidigenas predo-
minan las de forma de botella
3,0-4,0(3,3) x 3,0-2,0 (2,7 m).
ligeramente elpticos y hasta
elipsoidales, hialinos,2,0-3,0
(2,3) x 2,0 m
Bb-Inv Cylas
formicarius
(coleptero),
boniato,
Camagey
Beauveria
bassiana
tornan beis plido y
ligeramente costrosas segn
Clulas conidigenas predominan
las de forma de botella, 3,0-4,0
(3,4) x 3,0-2,0 (2,8 m). Conidios
ligeramente elpticos hasta
elipsoidales, pice discreto,
hialinos, 2,0-3,0 (2,5) x 1,0-2,0
(1,6) m
hampei
(coleptero),
caf,
Los Llanos,
Guisa, Granma
Beauveria
bassiana
Reverso amarillo
Clulas conidigenas con bases
globosas, 2,0-3,0 (2,2 m) x 2,0-
2,5 (2,3 m). Conidios globosos a
subglobosos, hialinos, 1,5-2,0
(1,8) x 2,0m
Pl-01M2 Hypothenemus
hampei, caf,
Santiago de Cuba
Pae c i l omyces
l i l aci nus
Colonias en PDA al inicio
blanco lanoso que se tornan
violeta griscea con la edad y
con micelio areo irregular.
Reverso vinceo
Conidioforos solos o en grupos,
forman sinemas con verticilos
de hasta seis filides, con la
edad se tornan rugosos. Clulas
conidigenas tpicas, 7,0-13,0
(9,5 m) x 1,5-3,0 (2,8 m).
Conidios catenulados, gris-violeta
claro, elipsoidales a fusiformes,
algunos con un pice, 1,5-3,0
(2,2 m) x 1,5-3,0 (2,4 m)
Ma-30 Muestra de
suelo (insecto
trampa Galleria
mellonella), IPA
Villena, La
Habana
Metarhizium
anisopliae
Colonias en PDA blancas y
algodonosas al inicio que se
tornan amarillo verdoso y
finalmente verde olivo oscuro y
costroso con zonas con micelio
areo abundante blanquecino.
Reverso amarillo intenso
Patrn conidioforo tpico de la
especie con verticilos de 2-3
ramas cada uno, con tonos
verde olivo oscuro que aclara al
pice.
Clulas conidigenas 6,0-10,0
(8,1 m) x 2,0-2,5 (2,1 m).
Conidios subhialinos a
ligeramente verdes, cilndricos
a ligeramente elipsoidales,
5,0-8,5 (6,6 m) x 2,0-3,0
(2,4 m)

De un total de 53 muestras procesadas de las que 15
fueron de suelo de zonas donde se haban observado
epizootias, 17 resultaron muestras exitosas. De los ais-
lados obtenidos solamente uno correspondi a una
muestra de suelo, que fue obtenido por trampeo con
larvas de Galleria mellonella (Fig. 1).
Con respecto a las especies de inters detectadas se puede
observar que hubo una predominancia de aislados per-
tenecientes a la especie Beauveria bassiana (Balsamo)
Vuillemin (Tabla 1, Fig. 2).
En contraste, solo se obtuvo un aislado de Metarhizium
anisopliae (Metschnikoff) Sorokin y otro de Paecilomy-
ces lilacinus (Thom.) Samson (Fig. 1).
Este comportamiento se puede atribuir a la efectivi-
dad del mtodo de trampeo con insectos susceptibles,
donde se requiere de una cantidad de propgulos via-
bles que garantice la infeccin, los que deben ser del
orden de 10
4
unidades por insecto como mnimo segn
Bateman et al. (1996) y Moore y Caudwell (1997). Se
sabe que el establecimiento de poblaciones de hongos
Elsegui y otros
270/fitosanidad
entomopatgenos en el suelo est determinado tanto
por las propiedades fsicas y qumicas de cada suelo
como por las de la cepa fngica en cuestin [Rhodes y
Smith, 1992]. Tambin existe la posibilidad de que los
microorganismos competidores con su produccin de
metabolitos activos afecten la viabilidad de estos
propgulos fngicos deseados [Jenkins y Grzywacz,
2000]. Por ello, el trampeo puede fallar si no existe una
concentracin alta de esporas viables del microorga-
nismo de inters en el suelo
Figura 1. Larva momificada de Galleria mellonella en cmara hmeda infectado con el aislado Ma-30 de
Metarhizium anisopliae a partir de muestra de suelo. Ntese la emersin temprana del micelio en blanco.
Figura 2. Colonia de Beauveria bassiana aislado Bb-105 obtenido de Hypothenemus hampei.
Sun (2002) logr 6,7% de xito para Metarhizium y
10% de xito para Beauveria en trampeos con el termite
Coptotermes formosanus, a partir de 90 muestras origi-
nales de suelo, porcentajes superiores de xito con res-
pecto al procesamiento de termites muertos sospecho-
sos de micosis; sin embargo, Zimmermann (1986) [citado
por Sun, 2002] se refiere al mtodo de trampeo con
Galleria como uno de los ms exitosos para detectar
entomopatgenos en termites.
Por otro lado, Dhoj et al. (2006) recomiendan tambin
el mtodo de trampeo con Galleria en contacto con
muestras de suelo, porque fundamentalmente es el que
lleva poca especializacion y el tiempo del ensayo es cor-
to con un porcentaje de xito alrededor de 75% para
fitosanidad/271
aislar Beavuveria y Metarhizium. Estos mismos auto-
res usaron 15 g de suelo aproximadamente por cada
individuo de Galleria y pusieron en contacto con el sue-
lo al insecto trampeador hasta 18 das; sin embargo, en
este trabajo se obtuvo una sola muestra de suelo til
por trampeo con Galleria, lo que represent 7% de xi-
to. Este comportamiento puede deberse a que la canti-
dad de suelo por individuo fue de 6-10 g, y el tiempo en
contacto con este solo fue de nueve das, adems de que
la cantidad de propgulos del hongo de inters presen-
te en el suelo es muy variable y depende de condiciones
especficas de cada ecosistema (Tabla 1 y Fig. 1).
Un mtodo ms efectivo para obtener nuevos aislados
de hongos es el aislamiento de colonias fngicas nicas
(ufc) a partir de muestras de suelo por diluciones
seriadas, segn procedimiento detallado por Lecuona
(1996). No obstante, es ampliamente aceptado que este
mtodo es muy caro y se prefiere usar en el aislamiento
y seleccin de especies bacterianas, como por ejemplo
Bacillus thuringiensis [Johnson y Bishop, 1996], de ah
que se decidiera no emplearlo para enriquecer el nme-
ro de aislados de la Coleccin de Hongos Entomopa-
tgenos del INISAV.
El porcentaje de xito obtenido en este trabajo para
las muestras de insectos sospechosos de micosis o con
una evidente fue de 42%. Jackson et al. (2000) plan-
tean que aunque este mtodo de aislamiento directo
conlleva mucho tiempo de muestreo en campo y expe-
riencia, la realidad es que entre los ms exitosos agen-
tes de control con microorganismos se encuentran
aquellos aislados obtenidos directamente de los insec-
tos hospederos, y no de las colecciones de cultivos o de
mtodos indirectos a travs de medios de cultivo se-
lectivos.
La frecuencia alta de aparicin de Beauveria bassiana
se debi al amplio rango de hospedantes de este pat-
geno, adems de que la mayora de los aislamientos se
hicieron a partir de Hypothenemus hampei (broca del
caf), y se conoce que esta especie fngica regularmen-
te se ha encontrado que atacan las poblaciones del in-
secto de forma natural en los cafetales. De hecho, es
esta la razn de que sea uno de los entomopatgenos
ms estudiados para el control de esta plaga [Bustillo
et al., 1999].
Beauveria bassiana (Bals.) Vuill. as como Metarhizium
anisopliae (Metsch.) Sorok. y Metarhizium flavoviride
Gams and Rozsypal estn entre los hongos entomo-
patgenos ms usualmente encontrados en la natura-
leza. Por ello, colecciones de cultivo internacionalmente
reconocidas cuentan con varios cientos de aislados de
estas tres especies como la Coleccin de Hongos
Entomopatgenos para Investigaciones Agrcolas del
Departamento de Agricultura de Estados Unidos
(ARCEF), la ATCC (American Type Culture Collection)
y la Coleccin del IMI (International Mycological
Institute) en el Reino Unido [Humber, 1992; Bateman
et al., 1996]. En Cuba ms del 85% de la Coleccin de
Hongos Entomopatgenos del INISAV est represen-
tada por aislados de Beauveria y Metarhizium.
En relacin con el aislamiento de Paecilomyces lilacinus
obtenido de Hypothenemus hampei se sabe que este
hongo se encuentra comnmente en las cras de broca
en laboratorio, donde es posible que las condiciones de
hacinamiento, la alta humedad relativa y la falta de
desinfeccin de las cerezas favorezcan la invasin de esta
especie para atacar a la broca, si bien en la planta de
caf en el campo no se ha encontrado [Posada et al.,
1998]. Tambin es cierto que P. lilacinus est cataloga-
do como hongo entomopatgeno oportunista y se ha
usado exitosamente en el control de nematodos
fitopatgenos [Lpez, 1995]. Por esta razn se decidi
incorporarlo a la Coleccin de Hongos Entomo-
patgenos del INISAV para futuras investigaciones.
Los productos exitosos a base de hongos desarrollados
en el mercado han surgido a partir de un monitoreo de
aislados obtenidos de las regiones geogrficas y
agroecosistemas, donde est el organismo plaga por
controlar, as como de las colecciones de cultivos.
Bateman et al. (1996) reportaron la seleccin de una
sola cepa de M. anisopliae, despus de haber ensayado
159 aislados de Beauveria y Metarhizium contra
Schistocerca gregaria (langosta del desierto). Esto con-
firma la necesidad de contar con abundante cantidad
de aislados de los ms diversos orgenes cuando se pre-
cisa obtener agentes microbianos efectivos como
biocontroladores de plagas [Bateman et al., 1996;
Jenkins y Grzywacz, 2003].
Como se puede apreciar, de acuerdo con las caracters-
ticas macro y microculturales, para los aislados de
Beauveria existi una alta similitud, por lo que una
separacin entre estos por los mtodos tradicionales
morfomtricos no es factible (Tabla 1). Para lograr la
distincin entre aislados hay que recurrir a mtodos de
biologa molecular como RFLP y PCR-RAPDS [Brid-
ge et al., 1993; Bridge y Arora, 1998; Bielikova et al.,
2002]. Estos mtodos moleculares tambin se usan como
una forma altamente reproducible de reconocer cada
Elsegui y otros
272/fitosanidad
aislado para patentar, registrar los productos y
monitorear tanto su destino en el ecosistema donde se
libere como las posibles interacciones negativas que
puedan existir entre el aislado liberado y el resto de los
aislados de la misma especie [Jenkins y Grzywacz, 2000;
Bielikova et al., 2002].
Finalmente todos los aislados de inters obtenidos se
incorporaron al banco de cepas de hongos entomo-
patgenos, y en la base de datos de esa coleccin se re-
gistraron las caractersticas macroculturales, micro-
culturales, origen y especie a que pertenecen, con el
objetivo de conservarlos como agentes potenciales de
biocontrol de insectos plaga para futuros estudios.
CONCLUSIONES
Se obtuvieron 17 nuevos aislados de hongos ento-
mopatgenos de los que uno fue de Metarhizium
anisopliae, uno de Paecilomyces lilacinus y el resto
de Beauveria bassiana.
El mtodo de aislamiento directo a partir de insec-
tos micosados tuvo 42% de efectividad.
El mtodo de aislamiento a partir de muestras de
suelo de hongos entomopatgenos mediante trampeo
con larvas de Galleria y Corcyra fue muy inefectivo,
con 7% de xito solamente.
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fitosanidad/273
DISPERSIN, DISTRIBUCIN ACTUAL Y NUEVOS
RESERVORIOS DE FRANKLINIELLA SCHULTZEI TRYBOM
(THYSANOPTERA: THRIPIDAE) EN CUBA
Santiago F. Jimnez Jimnez,
1
Liuva Prez Lpez,
2
Martha Toro,
3
Criseida Granda,
4
Amelia Mateo,
5
Hctor Sariol,
6
Elisa Rodrguez,
7
Rodney Prez,
8
Roquelina Jimnez,
9
ngel Prez-Alejo
10
y Ranss
Vzquez
11
1
a
B y 5.
a
F, Playa, Ciudad
de La Habana, CP 11600, sjimenez@inisav.cu
2
Centro Nacional de Sanidad Vegetal. Laboratorio Central de Cuarentena Vegetal. Ayuntamiento 231
e/ San Pedro y Lombillo, Plaza de la Revolucin, Ciudad de La Habana
3
Laboratorio Provincial de Sanidad Vegetal. Carretera a Santiago de Cuba Km 2, Guantnamo
4
Laboratorio Provincial de Sanidad Vegetal. Carretera Siboney Km 6, Ternerito Lindo, Santiago de Cuba
5
Laboratorio Provincial de Sanidad Vegetal. Prolongacin de Carb 40, Alturas de Perera y calle
Holgun, Holgun.
6
Laboratorio Provincial de Sanidad Vegetal. Carretera Central va Santiago de Cuba Km 3, Bayamo,
Granma
7
Laboratorio Provincial de Sanidad Vegetal. Genaro Rojas 86 e/ Marcelino Diguez y Antonio Barrera,
Las Tunas, CP 75200.
8
Laboratorio Provincial de Sanidad Vegetal. Ave Finlay Km 2 e/ Planta de Nitrgeno y Circunvalacin
Norte, Camagey
9
Laboratorio Provincial de Sanidad Vegetal. Carretera Palmira Km 4, Cienfuegos
10
Laboratorio Provincial de Sanidad Vegetal. Carretera Maleza Km 2, Santa Clara, Villa Clara
11
Instituto de Meteorologa. Apdo. 17032, Habana 17, Ciudad de La Habana, CP 11700
RESUMEN
Durante el perodo 2001-2006 se realizaron muestreos en diferentes
provincias de Cuba que permitieron actualizar la situacin de F.
schultzei en relacin con el grado de dispersin logrado por la espe-
cie, as como las plantas que le sirven de reservorios y su distribu-
cin. Se detect la presencia de esta especie de trips en la mayora
de las provincias del pas, y se reconoci que su mayor distribucin
la alcanza en la regin oriental, especialmente en Camagey, Granma,
Holgun, Santiago de Cuba y Guantnamo. Las especies botnicas
sobre los que se detect F. schultzei alcanzaron la cifra de 94, de las
cuales 84 se informan por primera vez para el pas. No obstante, el
insecto se detect de forma mayoritaria solamente sobre 24 espe-
cies de plantas, bsicamente vegetales, hortalizas y ornamentales.
El mayor nmero de detecciones correspondi a las rosas de dife-
rentes colores, y se realiz tambin un nmero considerable de ellas
sobre quimbomb, abrojo, margaritas japonesas, lirios, espinaca,
tomate, claveles, calabaza, carol, berenjena y habichuelas, lo que
apunta a las preferencias de F. schultzei. Debido a la posibilidad de
infectarse con tospovirus, que presentan algunas de estas especies
de plantas, y dada la capacidad vectora de estos patgenos demos-
trada por este trips en numerosos pases, incluidos algunos de este
hemisferio, se considera que son ellas las que actualmente poseen
el mayor peligro potencial de resultar afectadas por esas enfermeda-
des virales.
Palabras claves: distribucin, Frankliniella schultzei, reservorios,
trips
ABSTRACT
Samplings in different provinces of Cuba were carried out during the
period 2001-2006 that allowed upgrading the status of F. schultzei in
relation with the dispersion grade achieved by the species, as well as
the plants that serve it as reservoirs and their distribution. The presence
of this trips species was detected in most of the provinces and it was
recognized that its biggest distribution is reached in the oriental
region, especially in Camagey, Granma, Holgun, Santiago de Cuba
and Guantnamo. Botanical species on those F. schultzei was detected
reached the figure of 94 and 84 of them are informed the first time for
the country. Nevertheless, the insect was only detected in a majority
way on 24 species of plants, basically vegetables and ornamentals.
The biggest number of detections corresponded to different colours
roses, and a considerable number of them on quimbomb (ladys
fingers), thistle, Japanese daisies, irises, spinach, tomato, carnations,
pumpkin, carol, eggplant and kidney beans, what points out to the
preferences of F. schultzei. Keeping in mind the possibility to be
infected with tospovirus that present some of these species of plants
and given the vector capacity of these patogens demonstrated by
this thrips in numerous countries, including some of our hemisphere, it
is considered they possess the biggest danger potential to be affected
by this viral group at the moment.
Key words: distribution, Frankliniella schultzei, reservoirs, thrips
E
c
o
l
o
g
a
Jimnez y otros
274/fitosanidad
INTRODUCCIN
Frankliniella schultzei Trybom (Thysanoptera:
Thripidae) es una especie de trips que, adems de
fitfago, se incluye entre las confirmadas como vectores
de tospovirus [Mound, 2002], razn que la convierte en
un insecto plaga doblemente peligroso.
Segn Vierbergen y Mantel, 1991 [citados por
Kormelink et al., 1998], F. schultzei se distribuye en los
trpicos, extendida a lo largo de frica, Asia, Austra-
lia, Caribe, Pacfico y Amrica del Sur. Tambin se in-
forma en la Florida y en zonas de clima templado (in-
troducida) como Gran Bretaa, Italia y Pases Bajos.
Palmer et al. (1992) le atribuyen hbitos polfagos (flo-
res), y la informan en aj chile, algodn, compuestas,
cebolla, sorgo y tomate, entre otras.
En Cuba Suris et al. (2001) realizaron el primer informe
de la presencia de F. schultzei en sus formas clara y oscu-
ra sobre los cultivos de papa y tomate. Posteriormente
Prez et al. (2004) confirmaron su presencia y la infor-
maron sobre Phaseolus vulgaris L. (habichuela) y Cucumis
sativus L. (pepino). En ambos casos los autores se refie-
ren a muestras colectadas en provincias de la zona occi-
dental del pas (La Habana y Ciudad de La Habana), y
mencionan una baja intensidad de la especie.
La forma oscura de F. schultzei est reconocida como
vector de los cuatro tospovirus Tomato Spotted Wilt
Virus (TSWV) [Samuel et al., 1930; Sakimura, 1969;
Wijkamp et al., 1995], Tomato Chlorotic Spot Virus
(TCSV), Groundnut Ringspot Virus (GRSV) [Wijkamp
et al., 1995] y Chrysanthemum Stem Necrosis Virus
(CSNV) [Nagata y de vila, 2000]. Esta forma oscura
est extendida a lo largo de Amrica del Sur y se indica
como un vector importante de tospovirus en Brasil (De
vila et al., 1998) y Argentina [Williams et al., 2001].
Ms recientemente Sakurai (2004) demostr tambin que
la forma oscura de F. schultzei, originaria de Paraguay,
puede transmitir TSWV eficazmente, y puede ser un
vector importante del virus en los campos de tomate.
Este trabajo se realiz como una contribucin al cono-
cimiento del grado de dispersin, la distribucin actual
y la diversidad de hospedantes que posee F. schultzei
en Cuba, dado el peligro potencial que representa esta
especie, ms que como fitfago, como vector de enfer-
medades virales, particularmente de tospovirus.
MATERIALES Y MTODOS
El trabajo se llev a cabo en dos etapas durante el pe-
rodo comprendido entre los aos 2001-2006, y mediante
muestreos efectuados en las diferentes provincias del
pas, en los que se realiz la inspeccin local de reas
sembradas con plantas ornamentales (jardines doms-
ticos, jardines botnicos, jardines de instalaciones vin-
culadas al turismo y otros); reas productoras de cul-
tivos en empresas y cooperativas agrcolas; semilleros
y viveros; reas de floricultura; huertos intensivos,
organopnicos y cultivos protegidos y reas citrcolas.
En la primera etapa, que comprendi del 2001 al 2003,
los muestreos mensuales se realizaron en el perodo com-
prendido entre septiembre y marzo, y se tom una
muestra compuesta por no menos de 10 especies bot-
nicas por provincia. En la segunda etapa, entre el 2004
y el 2006, los muestreos se extendieron a lo largo de
todo el ao, y en cada inspeccin mensual se observa-
ron no menos de 20 especies botnicas.
En los dos perodos se revisaron vegetales, hortalizas,
viandas, frutales, ornamentales y otras. Las muestras
estuvieron compuestas tanto de hojas como de hojas y
flores, segn el caso. Cada una de ellas, despus de co-
lectada, se introdujo de modo independiente en bolsas
plsticas que se identificaron de acuerdo con el sitio de
procedencia y la fecha de muestreo.
El material vegetal con los trips se revis en las Esta-
ciones Territoriales de Proteccin de Plantas (ETPP)
de las diferentes provincias, con la finalidad de extraer
de cada muestra los especmenes presentes e introdu-
cirlos en viales con alcohol al 70%, en los que se anot,
para cada caso, el hospedante, el sitio de procedencia
de la muestra y la fecha en que se obtuvo. Posterior-
mente los viales se enviaron a los Laboratorios Provin-
ciales de Sanidad Vegetal (LAPROSAV) para su iden-
tificacin y/o al Laboratorio Central de Cuarentena
para su identificacin y/o confirmacin, segn corres-
pondiera. Para la ejecucin del diagnstico se utiliza-
ron las claves de Palmer et al. (1992), Mound y Marullo
(1996), Rodrguez et al. (1997) y Mound y Kibby (1998).
En la mapificacin de las muestras con detecciones de
F. schultzei se utiliz el Sistema de Cuadrantes
Cartogrficos [CNSV, 1997], segn su versin digita-
lizada [Vzquez et al., 2003]. Todo el trabajo se realiz
en estrecha relacin con la encuesta nacional de espe-
cies peligrosas de trips, que patrocina el Centro Nacio-
nal de Sanidad Vegetal.
Durante el perodo comprendido entre el 2001 y el 2003,
de un total de 4818 muestras positivas para trips, solo
se identific F. schultzei en 33 de las muestras revisadas,
fitosanidad/275
Dispersin, distribucin actual...
y estas correspondieron al ltimo ao de ese trienio.
Procedan fundamentalmente de las provincias de
Guantnamo y Holgun, en el oriente de Cuba (Tabla 1).
Este resultado constituy la primera evidencia del co-
mienzo de la dispersin de la especie, cuya presencia en
el pas, hasta ese momento, se limitaba a las provincias
habaneras [Suris et al., 2001].
Del total de las muestras obtenidas en el perodo com-
prendido entre el 2004 y el 2006 se realizaron 313
detecciones de F. schultzei, lo que demostr un nota-
ble incremento respecto al perodo precedente, as como
una mayor distribucin por diferentes provincias del
pas (Tabla 1), con la mayor abundancia en la regin
oriental.
Tabla 1. Dispersin de F. schultzei en el pas (perodo 2001-2006)
Perodo I Perodo II
Provincias
2001 2002 2003 2004 2005 2006
Pinar del Ro 0 0 0 0 0 1
La Habana 0 0 0 0 0 13
Ciudad de La Habana 0 0 0 0 0 6
Matanzas 0 0 0 0 0 2
Villa Clara 0 0 1 0 0 0
Cienfuegos 0 0 0 0 0 4
Sancti Spritus 0 0 0 0 0 0
Ciego de vila 0 0 0 0 0 0
Camagey 0 0 0 0 24 0
Las Tunas 0 0 0 1 0 0
Granma 0 0 2 4 8 2
Holgun 0 0 9 7 48 14
Santiago de Cuba 0 0 0 16 50 54
Guantnamo 0 0 21 37 22 0
Total 0 0 33 65 152 96

La ubicacin de las muestras segn el sistema de cua-
drantes cartogrficos permite visualizar el grado de
dispersin alcanzado por F. schultzei a lo largo del pas
en el curso de los aos que comprendi el trabajo. En
el mapa se aprecia que la especie se distribuye mayor-
mente en las provincias de la regin oriental de Cuba,
bsicamente Camagey, Granma, Holgun, Santiago
de Cuba y Guantnamo, donde se localiza la mayor
cantidad de cuadrantes en los que se ha detectado la
presencia de la especie (Fig. 1).
En relacin con los reservorios de F. schultzei, du-
rante el estudio se detect la presencia del insecto en
93 especies botnicas, de las cuales ocho ya haban
sido informadas anteriormente: Lycopersicum lyco-
persici Mill. [Surs et al., 2001], Vigna sesquipedalis
F. (habichuela), Cucumis sativus L. [Prez et al.,
2004], Allium sativum L., Beta vulgaris L., Capsicum
annum L., Portulaca oleracea L. y Argemone mexica-
na L. [Gonzlez y Surs, 2005]. Esto significa que se
informan 85 nuevos reservorios de la especie para el
pas (Tabla 2).
La mayor preferencia de F. schultzei, segn la frecuen-
cia de deteccin registrada, se muestra en la Tabla 3,
donde se relacionan las 24 especies de plantas sobre las
cuales la especie se detect en un nmero de muestras
mayor o igual a cuatro. Entre ellas se incluyen funda-
mentalmente vegetales, hortalizas y ornamentales. De
todas las referidas, el mayor nmero de detecciones se
produjo sobre quimbomb (7), abrojo y margaritas
japonesas (8), lirios (9), espinaca (11), tomate (12),
claveles (13), calabaza (15), carol y berenjena (16),
habichuela (19), y entre todas se destacaron las rosas
de diferentes colores con 42 detecciones en cinco pro-
vincias del pas.
En consideracin a la posibilidad de infectarse con
tospovirus que presentan algunas de estas especies de
plantas, y dada la capacidad vectora de estos patgenos
demostrada por F. schultzei en numerosos pases y b-
sicamente en este hemisferio norte [De vila et al., 1998;
Williams et al., 2001; Sakurai, 2004], se considera que
en Cuba son ellas las que, actualmente, poseen el ma-
yor peligro potencial de resultar afectadas por dichas
enfermedades virales.
Jimnez y otros
276/fitosanidad
Tabla 2. Relacin de especies de plantas encontradas como nuevos
reservorios de F. schultzei en Cuba
Nombre cientfico Nombre comn
Acalypha sp. Rabo de gato
Allamanda cathartica Lin. Alamanda
Allium cepa Lin. Cebolla
Allium schoenoprassum Lin. Cebollino
Althaea rosea Car. Varita de San Jos
Amaranthus spinosus, Lin. Bledo espinoso
Angelonia cubensis Robinson Nomeolvides malva
Argyreia nervosa Boj. Cordn de seda
Bastardia viscosa (L.) Malva bruja
Begonia sp. Begonia
Benincasa hispida Cong. Calabaza china
Beta vulgaris L. var. cicla Acelga
Bidens pilosa L. Romerillo
Cajanus indicus Spreg Frijol guandul
Calendula officinalis Lin. Marigol
Callotropis procera (Ait.) R. Br. Algodn de seda
Capsicum frutescens L. Aj
Cassia fistula Caandonga
Cestrum nocturnum Lin. Galn de noche
Citrullus vulgaris Schrad. Meln
Codiaeum variegatum Blume. Croton
Crinum sp. Lirio flor
Cucurbita pepo L. Calabaza
Dahlia coccinea Cav. Dalia malva
Datura metel L. Clarn
Daucus carota sativa D. C. Zanahoria
Dianthus caryophyllus L. Clavel
Gardenia jasminoides Ellis Jazmn del cabo (gardenia)
Gerbera jamesonii Hort. Margarita japonesa
Gliricidia sepium L. Jpiter
Gossypium hirsutum L. Algodn
Helianthus annuus Lin. Girasol
Helychrysum bracteatum Andr. Siempreviva
Hibiscus esculentus L. Quimbomb
Hibiscus rosa-sinensis Lin. Marpacfico
Hibiscus sp. Hibiscus, Marpacfico
Tabla 3. Especies botnicas sobre las que se detect F. schultzei en cuatro o ms ocasiones y procedencia
de las muestras
Nombre comn Nombre cientfico Procedencia
Cebolla A. cepa Guantnamo
Acelga B. vulgaris var. cicla Holgun, Santiago de Cuba, Guantnamo
Romerillo B. pilosa Ciudad de La Habana, Holgun, Guantnamo
Meln C. vulgaris Holgun
Lirio flor Crinum sp. Santiago de Cuba
Pepino C. sativus Holgun, Guantnamo
Calabaza C. pepo Camagey, Holgun, Santiago de Cuba, Guantnamo
fitosanidad/277
Dispersin, distribucin actual...
Dalia D. coccinea Granma, Santiago de Cuba
Clavel D. caryophyllus La Habana, Holgun
Margarita japonesa G. jamesonii Cienfuegos, Camagey, Santiago de Cuba
Quimbombo H. esculentus Holgun, Guantnamo
Marpacfico H. rosa-sinensis Matanzas, Camagey, Santiago de Cuba
Jazmn Jasminum sp. Holgun, Santiago de Cuba
Lechuga L. sativa Ciudad de La Habana, Holgun, Santiago de Cuba
Tomate L. lycopercisi Holgun, Santiago de Cuba, Guantnamo
Frijol Phaseolus sp. Holgun, Guantnamo
Rosa Rosa sp. Ciudad de La Habana, Las Tunas, Granma, Santiago de Cuba,
Guantnamo
Berenjena S. melongena Santiago de Cuba, Guantnamo
Espinaca S. oleracea Holgun, Santiago de Cuba, Guantnamo
Carol T. erecta Pinar del Ro, La Habana, Santiago de Cuba, Guantnamo
Copeta T. patula Holgun
Abrojo terrestre T. cistoides Santiago de Cuba
Habichuela V. sesquipedalis Villa Clara, Holgun, Santiago de Cuba, Guantnamo
Vicaria V. rosea Santiago de Cuba

Figura 1. Distribucin por cuadrantes cartogrficos de F. schultzei en Cuba segn la ubicacin geogrfica de sus reservorios (2001-2006).
CONCLUSIONES
F. schultzei se dispers a lo largo de Cuba entre el
2001 y el 2006, y diversific sus reservorios hasta
alcanzar la cifra de 92 especies botnicas.
La ms amplia distribucin de la especie se registr
en los territorios de las provincias de Camagey,
Granma, Holgun, Santiago de Cuba y Guantnamo.
Se informan 84 especies de plantas que constituyen
nuevos reservorios de F. schultzei para Cuba, entre
las cuales quimbomb, abrojo, margaritas japone-
sas, lirios, espinaca, tomate, claveles, calabaza, carol,
berenjena, habichuela y especialmente las rosas re-
sultan preferidas por el insecto.
REFERENCIAS
CNSV: Vigilancia fitosanitaria por cuadrantes cartogrficos, Centro Nacio-
nal de Sanidad Vegetal, Ministerio de la Agricultura, La Habana, 1997.
Jimnez y otros
278/fitosanidad
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fitosanidad/279
VARIABILIDAD DE LAS ISOENZIMAS ESTERASAS DE BEAUVERIA
BASSIANA (BALSAMO) VUILLEMIN
Mara E. Estrada Martnez y Dolores Pin Gmez
Instituto Nacional de Investigaciones de la Caa de Azcar. Carretera CAI Manuel Martnez Prieto
Km 2, Boyeros, Ciudad de La Habana, CP 19390, fax: (53-7) 260 2571, meem@inica.edu.cu
RESUMEN
Se determin la variabilidad de las isoenzimas esterasas del
hifomiceto entomopatgeno Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin
mediante electroforesis vertical en gel de poliacrilamida a 8,5%. Se
analizaron los zimogramas de 21 aislamientos de diferentes orge-
nes geogrficos y entomolgicos. A partir de la matriz de los datos
originales se calcul la distancia gentica y se realiz el anlisis de
agrupamiento de los individuos mediante el mtodo de los promedios
de las distancias no ponderadas. La presencia de 24 bandas diferen-
ciales y de seis grupos de diversidad molecular evidenciaron la va-
riabilidad gentica de B. bassiana para el sistema enzimtico estu-
diado.
Palabras claves: Beauveria bassiana, variabilidad, esterasas, Diatraea
saccharalis, caa de azcar
ABSTRACT
Isoenzyme esterases variability of hyphomycete fungus Beauveria
bassiana (Balsamo) Vuillemin was determinated by means vertical
electrophoresis on 8.5% polyacrylamide gel. Twenty one isolates from
different geographical and entomology origin groups were analyzed.
Starting from the matrix of the original data the genetic distance was
calculated. The analysis of individuals cluster was carried out by
means of the unweighted pairgroup method, arithmetic average. The
presence of 24 differential bands and six groups of molecular diversity
evidenced the genetic variability of B. bassiana for the studied
enzymatic system.
Keys words: Beauveria bassiana, variability, esterases, Diatraea
saccharalis, sugar cane
INTRODUCCIN
Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin es un hi-
fomiceto entomopatgeno ampliamente utilizado en la
lucha biolgica contra los insectos plaga de los cultivos
agrcolas [Moino et al., 2002; Senz de Cabezn et al.,
2003; Estrada et al., 2004; Kauffman et al., 2005]. En
Cuba se utiliza para disminuir las poblaciones larvales
de Diatraea saccharalis (Lepidoptera: Cambridae), ba-
rrenador de la caa de azcar (Saccharum sp. hbrido).
El estudio de las isoenzimas esterasas contribuye al
conocimiento de la variabilidad gentica de diferen-
tes especies entomopatgenas [Estrada et al., 1997;
Bruce et al., 2003]. Este anlisis permite establecer
diferencias no detectables desde el punto de vista
morfolgico.
El inters agronmico y ecolgico de las aplicaciones de
B. bassiana en el cultivo de la caa de azcar precisa
conocer las diferencias isoenzimticas entre los aisla-
mientos del hifomiceto, de forma tal que estos puedan
ser identificados luego de su aplicacin en el agroe-
cosistema caero. En este sentido en el presente tra-
bajo se determina la variabilidad de las isoenzimas
esterasas de B. bassiana, sistema enzimtico repor-
tado polimorfo para esta especie [Fernandes et al.,
2006].
MATERIALES Y MTODOS
Se analizaron 21 aislamientos (Tabla 1) de B. bassiana,
los cuales se cultivaron en 50 mL de medio de cultivo
esttico Adamek (1965) e incubados a 25
o
C durante
siete das.
El micelio obtenido se pes hmedo y seco, despus de
filtrarlo por papel Filtrak 390 y llevarlo a sequedad a
temperatura ambiente durante tres das. Un gramo del
secado se macer con tampn fosfato a pH = 6,5 con
sacarosa a 20% en una proporcin de 1:3. El macerado
se centrifug a 10 000 rpm durante 10 min.
Estrada y Pin
280/fitosanidad
Se realizaron seis extracciones para cada aislamiento,
las que se examinaron comparativamente por electro-
foresis vertical en gel de poliacrilamida a 8,5%. La
electroforesis se realiz entre 50-60 mA durante 4 h.
Para el revelado de los geles se utilizaron como sustratos
y -naftil acetato, y se analizaron visualmente, para
lo cual se tuvo en cuenta el nmero y la posicin de las
bandas de cada aislamiento. Las movilidades relativas
de las manchas se calcularon a partir del punto de apli-
cacin como:
Rf = Movilidad de la mancha / Movilidad del frente de corrida
Cada banda enzimtica se consider como una varia-
ble cualitativa presente (1) o ausente (0). Se utiliz el
programa NTSYS versin 2.01, y a partir de la ma-
triz de los datos originales se calcul la distancia
gentica mediante el coeficiente de similitud SM y se
realiz el anlisis de agrupamiento de los individuos
Tabla 1. Relacin de los aislamientos de Beauveria bassiana
(Bals.) Vuill. utilizados en el trabajo
Aislamientos Pas de origen Hospedante de origen
1 Cuba Diatraea saccharalis
5 Francia Leptinotarsa decemlineata
7 Guadalupe Insecta
8 Estados Unidos Artiples flloridus
12 Francia Sitona discoideus
14 Cuba Insecta
18 Cuba Hysipyla grandella
20 India Insecta
21 Bulgaria Insecta

por el mtodo de los promedios de las distancias no
ponderadas (Unweighted Pair-Group Method,
Arithmetic Average). Los patrones de marcadores
moleculares se determinaron segn Cornide et al.
(2000).
La Fig. 1 corresponde a los zimogramas para esterasas
de los 21 aislamientos de B. bassiana estudiados. Se apre-
cia un total de 41 bandas. De ellas 24 son polimrficas,
es decir, son bandas nicas para diferentes aislamientos
que representan 58,53% del total de las bandas revela-
das. La presencia de 18 patrones de bandas evidencia el
polimorfismo para esterasas de B. bassiana, lo que ha
sido demostrado por diferentes autores para esta espe-
cie entomopatgena [Liu et al., 2003; Meyling y Eilenberg,
2005].
fitosanidad/281
Variabilidad de las isoenzimas...
Figura 1. Zimograma para esterasas de 21 aislamientos de Beauveria bassiana (Bals.) Vuill.
(1-41: bandas; I-XVIII: patrones)
De acuerdo con lo obtenido mediante el anlisis de agru-
pamiento de los 21 aislamientos de B. bassiana estu-
diados, se formaron seis grupos de diversidad molecular
(I, II, III, IV, V y VI) (Fig. 2), donde los aislamientos
no aparecen agrupados por su origen geogrfico y
entomolgico.
La presencia de bandas diferenciales (Tabla 2) permiti
distinguir las bandas de los grupos de diversidad
molecular. As, por ejemplo, en el grupo I, formado por
los aislamientos 1, 3, 18, 2, 4 y 5, se puede diferenciar
el aislamiento 3 del 5 por la presencia de las bandas
B14 y B34 en el primero, y la ausencia en el segundo.
En el grupo II se evidencia la presencia de bandas dife-
renciales entre los aislamientos que conforman en este
grupo. En el caso del grupo III los aislamientos 11 y 12
se identifican del resto de los aislamientos por presen-
tar las bandas B11, B25 y B35; sin embargo, estos ais-
lamientos no pudieron diferenciarse entre s. El resto
de los aislamientos que conforman los grupos IV, V y
VI presentaron bandas diferenciales que permitieron
identificarlos entre s.
Estrada y Pin
282/fitosanidad
Figura 2. Anlisis de agrupamiento de los 21 aislamientos
de B. bassiana basado en la matriz de similitud.
Tabla 2. Patrones de descriptores moleculares de los aislamientos de B. bassiana con
isoenzimas esterasas
Grupos de
diversidad
molecular
Aislamientos B11 B12 B25 B28 B35 B38 B39 B41
I 1 0 1 0 0 1 0 0 0
3 0 1 0 0 0 0 0 0
18 0 1 0 0 0 0 0 0
2 0 1 0 0 0 0 0 0
4 0 1 0 1 0 0 0 0
5 0 0 0 0 0 0 0 0
II 6 0 0 0 1 1 0 1 0
7 0 0 0 1 0 0 1 0
15 0 0 0 1 0 0 1 0
19 0 0 0 1 0 0 0 1
20 0 0 0 1 0 0 0 1
8 0 0 0 1 0 0 1 0
13 1 0 0 1 0 0 0 0
9 0 0 0 0 0 1 0 0
10 0 0 0 1 0 1 0 1
III 11 1 0 1 0 1 0 0 0
12 1 0 1 0 1 0 0 0
IV 16 0 0 0 0 0 0 1 0
17 0 0 0 0 0 0 0 0
V 21 0 0 0 0 0 0 0 0
VI 14 0 0 0 0 0 0 0 0

Bandas diferenciales entre grupos de diversidad molecular.
Bandas diferenciales entre aislamientos de un mismo grupo de diversidad molecular.

fitosanidad/283
Variabilidad de las isoenzimas...
La caracterizacin basada en el estudio de las isoenzimas
esterasas evidenci la variabilidad gentica de B. bassia-
na y permiti contar con otro criterio para diferenciar
los aislamientos del hifomiceto por sus patrones de
bandas, lo que resulta de utilidad prctica para la co-
leccin de microorganismos entomopatgenos.
La determinacin de un carcter discriminante para
B. bassiana a partir de las bandas diferenciales resulta
de inters agronmico, pues fue posible diferenciar el
aislamiento 3 que se aplica en el cultivo de la caa de
azcar del 5 que se aplica en la agricultura no caera.
Como B. bassiana se ha aislado a partir de larvas y
crislidas de D. saccharalis colectadas en diferentes
partes de la planta y a partir de muestras de suelo (Ta-
bla 1), la evaluacin de la aplicacin del aislamiento 3
en el campo requiere de su caracterizacin para la dife-
renciacin de los aislamientos que aparecen natural-
mente en el agroecosistema caero.
Generalmente los patrones isoenzimticos no se
correlacionan con los insectos hospedantes, con el pas
de origen ni con otro carcter. Ellos pueden emplearse
como marcadores individuales, y se han utilizados para
conocer la estabilidad gentica de especies de hifomicetos
entomopatgenos sometidas a diferentes presiones de
seleccin [Rakotoniainy et al., 1994].
El conocimiento de la variabilidad de las isoenzimas
esterasas constituye una herramienta para la caracte-
rizacin de los aislamientos de B. bassiana en el Pro-
grama Nacional de Lucha Biolgica contra el barrena-
dor de la caa de azcar D. saccharalis.
CONCLUSIONES
La caracterizacin basada en el estudio de las
isoenzimas esterasas evidenci la variabilidad gentica
de B. bassiana y permiti contar con otro criterio
para diferenciar los aislamientos del hifomiceto por
sus patrones de bandas.
Fue posible diferenciar el aislamiento 3, que se aplica
en el cultivo de la caa de azcar, del aislamiento 5
que se aplica en la agricultura no caera.
La evaluacin de la aplicacin del aislamiento 3 en el
campo requiere de su caracterizacin para la dife-
renciacin de los aislamientos que aparecen natural-
mente en el agroecosistema caero.
REFERENCIAS
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Estrada y Pin
284/fitosanidad
fitosanidad/285
C
o
n
t
r
o
l

b
i
o
l
g
i
c
o
UN MEDIO SIMPLIFICADO A BASE DE SOYA MS AZCAR
TURBINADA DE CAA PARA LA PRODUCCIN DEL HONGO
ACAROPATGENO HIRSUTELLA NODULOSA PETCH
EN FASE LQUIDA
Reinaldo I. Cabrera,
1
Marln Vega
2
y Litzy Ayra
1
1
Instituto de Investigaciones de Fruticultura Tropical. Ave 7.
a
no. 3005 e/ 30 y 32, Playa, Ciudad
de La Habana, entomopatogeno@iift.cu.
2
Instituto de Investigaciones del Arroz. Autopista Novia del Medioda Km 16, Bauta, La Habana,
iiarroz@bauta.esihabana.cu; iiarroz@sba.esihabana.cu
RESUMEN
El hongo Hirsutella nodulosa Petch resulta un importante enemigo
natural de muchos caros fitfagos. Para su produccin como
bioplaguicida es muy necesaria la determinacin de un medio de
cultivo sencillo, econmico y eficiente. Se ensayaron cinco concen-
traciones de soya (6, 8, 10, 12 y 14% p/v) con dos de azcar turbinada
de caa (3 y 4% p/v). Cada combinacin se distribuy por separado
en tres erlenmeyers de 300 mL con 100 mL de medio cada uno, y
previa esterilizacin en autoclave a 121
o
C durante 25 min; se inocu-
laron con una suspensin micelial del hongo a 3% v/v para su fer-
mentacin durante cuatro das en zaranda de produccin continua a
27 1
o
C y 180 rpm como ocurri con el inculo. Seguidamente se
recuper cada biomasa en papel de filtro por filtracin al vaco y se
coloc en una estufa a 60
o
C durante 24 h para determinar su peso
seco en balanza analtica. Los resultados se analizaron mediante un
ANOVA de clasificacin doble, previa transformacin de los datos en
1 + x , y las medias se compararon entre s por la prueba de rangos
mltiples de Duncan para p < 0,05. La mejor combinacin de soya
ms azcar fue la de 14 y 3% p/v respectivamente, con resultados
que alcanzaron hasta un promedio de 1,14 g (peso seco de micelio)
por cada 100 mL de medio, lo que permite considerarlo econmico y
eficiente para la produccin a gran escala de este acaropatgeno y
como la primera experiencia en Cuba.
Palabras claves: Glicine max, Hirsutella nodulosa, cultivo sumergi-
do, azcar de caa
ABSTRACT
The fungus Hirsutella nodulosa Petch is an important natural enemy of
many phytophague mites and it is very necessary the determination of
a simple, economic and efficient culture medium for its production as
bioplaguicide. Five soybean concentrations have been assayed (6;
8; 10; 12 and 14% w/v) with turbinated cane sugar (3 and 4% w/v).
Each combination has been distributed separately in three erlenmeyers
of 300 mL with 100 mL of medium each one. They have been sterilized
in autoclave at 121C during 25 min and inoculated with a micelial
suspension of the fungus at 3% v/v. They were fermented four days
with a continuous shaker at 27 1C and 180 rpm as well as the
inoculum. Each biomass was recovered on fitter paper by vacuum
filtration. They were put in an oven at 60C during 24 h to determine
dry weight by analytical balance. The results were analyzed by an
ANOVA of double classification, previous data transformation in 1 + x .
Means were compared by Duncan Multiple Range Test for p < 0.05.
The best combination of soybean plus sugar was 14 and 3% w/v
respectively, with a mean up to 1.14 g (dry weight of mycelium) by
each 100 mL of medium. This result allows considering it as economic
and efficient for the great scale production of this mite pathogen and
which the first Cuban experience.
Key words: Glicine max, Hirsutella nodulosa, submerge culture, cane
sugar
INTRODUCCIN
Las investigaciones realizadas en Cuba y otros pases
con el hongo Hirsutella nodulosa Petch, al que se le con-
sidera un importante enemigo natural de muchos caros
fitfagos [Cabrera y Domnguez, 1987 y 1987a; Minter
y Brady, 1980], han motivado el inters por su utiliza-
cin como bioacaricida.
La llegada al pas del caro tarsonmido del arroz
Steneotarsonemus spinki Smiley a finales de 1997 [Ra-
mos et al., 1998] y los estudios de H. nodulosa como
enemigo natural de este caro en Cuba y Sri Lanka
[Cabrera et al., 2002 y 2005], as como lo difcil que
resulta su control por la va de la lucha qumica [Ca-
Cabrera y otros
286/fitosanidad
brera et al., 2002a], potenciaron la necesidad de pro-
fundizar en la posible utilizacin de H. nodulosa en los
programas de control biolgico y manejo integrado con-
tra esta y otras plagas. Para ello se requiere disponer,
en primer lugar, de un medio de cultivo y una tecnolo-
ga barata que permitan la produccin de este aca-
ropatgeno a gran escala y en las cantidades requeri-
das para tales fines.
El presente trabajo ofrece los primeros resultados en
Cuba sobre la bsqueda de un medio simplificado, eco-
nmico y eficiente para la produccin del hongo H. no-
dulosa en fase lquida y su importancia en la multipli-
cacin acelerada de este control biolgico.
MATERIALES Y MTODOS
Para la determinacin del medio se pesaron por separa-
do 36, 48, 60, 72 y 84 g de soya en grano (Glycine max
(Lin.) Merr.) y se echaron en erlenmeyers de 2 L con
500 mL de agua destilada para su coccin en autoclave
a 121
o
C durante 35 min. Luego el contenido de cada
recipiente se bati en una batidora licuadora durante
20 s y se filtraron separadamente por un pao de lien-
zo, con presin manual para la extraccin de cada par-
te lquida, las que se enrazaron con agua destilada a
600 mL para que la soya quedara a 6, 8, 10, 12 y 14% p/v,
respectivamente.
A los primeros 300 mL con cada concentracin de soya
se le adicion entonces el azcar turbinada de caa a
3% p/v y a los 300 restantes a 4% p/v, y se filtraron al
vaco por papel de filtro Whatmann no.1. Seguidamen-
te se vertieron por separado 100 mL de cada una de las
combinaciones de nutrientes a las diferentes concen-
traciones en erlenmeyers de 300 mL, y se esterilizaron
a 121
o
C durante 25 min. En las tres repeticiones que
tuvo el ensayo, el pH fluctu entre 5,8 y 7.
Como inculo al 3% v/v se utiliz una cepa de H. nodulosa
recin aislada del caro S. spinki y reproducida durante
96 h en medio H [McCoy et al.,1972, citado por Cabrera,
2001], colocado en zaranda de produccin continua a
180 rpm y una temperatura de 27 1
o
C.
Transcurridos los primeros cuatro das de fermenta-
cin, bajo las mismas condiciones antes sealadas se
recuper por filtracin al vaco la biomasa producida
en cada medio, y estas se colocaron en estufa a 60
o
C
durante 24 h para luego determinar, en balanza analti-
ca, la produccin micelial que se obtuvo en cada er-
lenmeyer.
Todo el trabajo se realiz bajo un diseo de bloques al
azar, en mesa de flujo laminar y con pro pipeta automti-
ca. Para el anlisis de los resultados se utiliz un ANOVA
de clasificacin doble, previa transformacin de los datos
en , y las medias se compararon entre s por la
prueba de rangos mltiples de Duncan para p < 0,05.
Se logr la determinacin de un medio de cultivo con
buenas caractersticas para su utilizacin en la produc-
cin de H. nodulosa en fase lquida, y cuyos resultados
superan significativamente a los del testigo, sin la pre-
sencia de la conidiacin del hongo en los medios lqui-
dos ensayados, pero s una abundante biomasa en las
diferentes combinaciones de soya ms azcar formada
por sus micelios y conidiforos.
Se presentaron diferencias significativas para p < 0,05
entre el testigo y todas las concentraciones de soya ms
azcar, as como entre algunas de las combinaciones de
estas fuentes de nutrientes, con los mayores resultados
a medida que se incrementaba el contenido de soya (Fig. 1).
La dinmica de desarrollo de este acaropatgeno en las
combinaciones de nutrientes ensayadas fue muy rpi-
da en lo que respecta a la produccin de biomasa
micelial, la que alcanz hasta un promedio de 1,14 g
(peso seco) por cada 100 mL de medio a los cuatro das
de fermentacin a 27 1
o
C y 180 rpm. La mejor com-
binacin de soya ms azcar turbinada de caa fue la
de 14% p/v y 3% p/v respectivamente.
La seleccin de los medios de cultivos a partir de
sustratos naturales y sus buenos resultados no solo
dependern de su riqueza nutricional, ya sea en nitr-
geno, carbono u otros elementos, sino adems de las
caractersticas del medio como viscosidad, turbidez y
pH entre otras, segn sealara Cabrera (2001).
El procedimiento metodolgico utilizado para la extrac-
cin de elementos como el nitrgeno a partir de la soya
fue similar al desarrollado por Cabrera (2001); result
eficaz, lo que permiti disponer de un medio simplifica-
do, eficiente y econmico para la reproduccin de H. no-
dulosa, una vez combinada la soya con el azcar
turbinada de caa como fuente de carbono. La ausen-
cia de conidias en este caso no es consecuencia de los
medios utilizados, sino de que este acaropatgeno no
presenta conidiacin en cultivo lquido, como ocurre con
la mayora de las cepas de H. thompsonii [Cabrera,
2001].
1 + x
fitosanidad/287
Un medio simplificado a base de soya...
Figura 1. Produccin de biomasa de H. nodulosa en diferentes concentraciones de soya
y azcar turbinada de caa ms un testigo.
Como se aprecia en la Fig. 1, se presentaron diferencias
significativas entre el testigo y todas las concentracio-
nes de soya, en lo que a la produccin de biomasa micelial
se refiere. Ello confirma la importancia del nitrgeno
orgnico en el desarrollo micelial de H. nodulosa, como
se seal para H. thompsonii por Cabrera (2001).
La posibilidad de sustituir el extracto de levadura y la
peptona como fuentes portadoras de nitrgeno por la
soya, as como la glucosa y la sacarosa, portadoras de
carbono, por el azcar turbinada de caa, permite dis-
poner de un medio de cultivo mucho ms econmico y
eficiente para la produccin de H. nodulosa, con rendi-
mientos de hasta 1,14 g de biomasa (peso seco) por cada
100 mL de medio a las 96 h de fermentacin. Esta cons-
tituye la primera vez que en Cuba se realizan estudios
para la bsqueda de un medio simplificado para la pro-
duccin de este hongo en fase lquida, y cuyos resulta-
dos son de vital importancia para la produccin acele-
rada de este control biolgico si se toma en consideracin
su lento crecimiento tanto en fase slida como lquida.
CONCLUSIONES
El medio a base de soya 14% p/v ms azcar de caa
turbinada a 3% p/v resulta el ms eficiente y econ-
mico para la produccin masiva del hongo H.
nodulosa en fase lquida, lo que valida su utilizacin
a gran escala.
Las diferentes concentraciones de soya ms azcar
que se ensayaron permitieron una buena dinmica
de desarrollo del hongo con resultados, en todos los
casos, superiores a los del testigo.
H. nodulosa produce una abundante masa micelial
en el medio antes sealado, y en ninguno de los casos
se observ la presencia de conidias.
REFERENCIAS
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parsito para el caro del cocotero Eriphyes guerreronis, Cienc. y
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288/fitosanidad
fitosanidad/289
ESTUDIO DEL EFECTO PROTECTOR DE BACILLUS SPP.
SOBRE EL DESARROLLO DE LA PUDRICIN BLANDA
DE LA PAPA (SOLANUM TUBEROSUM L.)
Yaritza Reinoso Pozo,
1
Luis Casadess Romero,
1
Armando Garca Surez,
2
Ernesto Garca Prez
1
y
Victoria Pazos lvarez-Rivera
1
1
Facultad de Biologa, Departamento de Microbiologa y Virologa. Calle 25 no. 455 e/ I y J, Plaza
de la Revolucin, Ciudad de La Habana, CP 10400, yreinoso@fbio.uh.cu
2
Laboratorio Central de Cuarentena Vegetal, Centro Nacional de Sanidad Vegetal. Ayuntamiento 231
e/ Lombillo y San Pedro, Plaza de la Revolucin, Ciudad de La Habana, CP 10400
RESUMEN
La pudricin blanda bacteriana, causada por Pectobacterium
carotovorum, ocurre en una amplia variedad de cultivos y es una de
las ms severas enfermedades poscosecha de la papa (Solanum
tuberosum L.) en el mundo entero. El control de esta enfermedad se
basa fundamentalmente en la aplicacin de qumicos que contami-
nan el medio ambiente y deterioran la salud humana. Una de las
alternativas ecolgicas adoptadas es el uso de microorganismos
como agentes de control biolgico, entre los que se encuentran los
miembros del gnero Bacillus. El objetivo del presente trabajo fue
determinar el efecto protector de 23 cepas de Bacillus sp. sobre el
desarrollo de la pudricin blanda de la papa. Para ello se trataron
rodajas de papa con cultivos bacterianos de 24 h y posteriormente se
inocularon con una cepa de P. carotovorum a dos concentraciones
diferentes. Las rodajas se mantuvieron durante 24 h en condiciones
de temperatura y humedad favorables para el desarrollo de la
pudricin. Transcurrido este tiempo se evalu la efectividad de los
tratamientos respecto a los controles no tratados, y se tuvo en cuenta
la aparicin o no de los sntomas caractersticos de la enfermedad.
Las cepas G15, G19 y G25 solamente tuvieron efecto protector en las
rodajas tratadas con la menor concentracin de P. carotovorum, mien-
tras que B1, G10, Q7 y Q18 inhibieron el desarrollo de la pudricin en
las dos variantes analizadas. El resto de las cepas estudiadas no
mostr proteccin, y en algunos casos se observ un incremento en
la severidad de las lesiones.
Pal abras cl aves: Baci l l us, control bi ol gi co, Pectobacteri um
carotovorum, Solanum tuberosum
ABSTRACT
Bacterial soft rot, caused by Pectobacterium carotovorum, happens in
a wide variety of cultivations and it is one of the most severe postharvest
diseases of potato (Solanum tuberosum L.) in the world. The control is
based fundamentally on the application of chemical products that
contaminate the environment and deteriorate human health. One of
the ecological alternatives adopted in this sense is the use of
microorganisms as biological control agents, the members of genera
Bacillus are among them. The objective of the present work was to
determine the protective effect of 23 Bacillus sp. strains on the
development of the potato soft rot. Potato slices were treated with 24 h
growth bacterial cultures and were inoculated with a strain of P.
carotovorum, using two different concentrations. The slices stayed
during 24 h in conditions of temperature and favourable humidity for
the development of the soft rot. Lapsed this time the effectiveness of
the treatments was evaluated in comparison with non treated controls
observing the appearance or not of disease characteristic symptoms.
G15, G19 and G25 strains only had protective effect in the slices tried
with the smallest concentration of P. carotovorum. While B1, G10, Q7
and Q18 inhibited soft rot development in two analyzed variants. The
rest of the studied strains did not show protection, so an increment in
lesions severity was observed in some cases.
Key words: Bacillus, biological control, Pectobacterium carotovorum,
Solanum tuberosum
INTRODUCCIN
La papa (Solanum tuberosum L.) ocupa el cuarto lugar
entre los diez cultivos de mayor importancia en el mun-
do, superada nicamente por el trigo, el arroz y el maz.
Su produccin anual asciende a ms de doscientos mi-
llones de toneladas que repercuten en la alimentacin
de gran parte de la poblacin mundial [Estvez et al.,
2001]. En la produccin de papa el cultivo puede afec-
tarse por una serie de factores biticos y abiticos que
disminuyen el rendimiento y calidad de las cosechas,
en especial por la presencia de daos en los tubrculos.
Los factores biticos de mayor importancia son la pre-
sencia de plagas y enfermedades que generan elevados
costos de manejo y control [Gregory y Andrade, 1996].
Las condiciones tropicales y hmedas resultan poco
favorables para el cultivo de la papa debido a que es
propenso a infectarse con numerosos microorganismos
patgenos fngicos y bacterianos, adems de las difi-
cultades que se presentan para conservar los tubrcu-
Reinoso y otros
290/fitosanidad
los. Las enfermedades bacterianas de la papa provocan
generalmente pudriciones hmedas y pueden ser origina-
das por microorganismos pertenecientes a variados gne-
ros [MINAGRI, 2000]. En Cuba la pudricin blanda, cau-
sada por Pectobacterium carotovorum, Dickeya chrysanthemi
y Pectobacterium atrosepticum, es una de las enfermeda-
des bacterianas que se presenta con mayor incidencia en
el campo, y las prdidas durante el almacenamiento de
los tubrculos son considerables [Galn, 2004].
El control de estos patgenos se dificulta mucho debi-
do a que la enfermedad se puede presentar en diferen-
tes etapas del desarrollo de la planta. Estas bacterias
adems pueden sobrevivir en el suelo, el agua de riego
y la maquinaria agrcola. Por el momento el control de
la calidad fitosanitaria de los tubrculos-semilla y la
aplicacin de productos qumicos son medidas que con-
tribuyen a disminuir los daos [Galn, 2004].
Actualmente se aboga por el uso de prcticas agrcolas
ecolgicas como el control biolgico mediante el uso de
microorganismos antagonistas, los cuales pueden limi-
tar la iniciacin y propagacin de las enfermedades
causadas por patgenos vegetales mediante mecanis-
mos de competencia, antibiosis, induccin de resisten-
cia, entre otros [Fernndez-Larrea, 2001].
Varias especies de los gneros Bacillus, Paenibacillus y
Brevibacillus producen sustancias antimicrobianas, de
las cuales se han descrito ms de de setenta antibiticos
de bajo peso molecular y naturaleza polipeptdica, en-
tre las cuales B. subtilis, B. licheniformis, B. pumilus,
B. circulans, B. cereus, Brevibacillus laterosporus y
Paenibacillus polymyxa son los mayores productores.
Los metabolitos secundarios producidos por algunas
de estas especies inhiben el crecimiento de bacterias y
hongos, por lo que se ha sugerido su uso como un mto-
do suplementario para la proteccin de las plantas con-
tra microorganismos fitopatgenos [Fldes et al., 2000].
El objetivo de este trabajo fue determinar el efecto pro-
tector de diferentes cepas del gnero Bacillus sobre el
desarrollo de la pudricin blanda de la papa.
MATERIALES Y MTODOS
Se utilizaron como material biolgico 23 cepas del g-
nero Bacillus conservadas en agar nutriente (Biocen) y
aisladas de suelos procedentes de regiones paperas de
diferentes municipios de la provincia de La Habana
(Tabla 1). Estas cepas se seleccionaron en considera-
cin a su actividad antagnica in vitro frente a cepas de
Pectobacterium carotovorum, Dickeya chrysanthemi y
Pectobacterium atrosepticum (datos no publicados). Se
emple adems la cepa P. carotovorum 2046 conservada
en medio GYCA (glucosa, extracto de levadura, carbo-
nato de calcio, agar).
Para el crecimiento de las especies del gnero Bacillus se
utilizaron frascos erlenmeyers de 1 L de capacidad con
100 mL de medio caldo nutriente (Biocen). Los frascos se
inocularon con una suspensin bacteriana correspondiente
a un valor de 0,5 en la escala de Mac Farland (1 x 10
8
ufc/mL)
preparada a partir de cultivos de 24 h de crecimiento en
agar nutriente. Los cultivos se colocaron en zaranda orbital
termostatada durante 24 h a 30
o
C y 120 rpm.
Tabla 1. Procedencia de las cepas del gnero Bacillus utilizadas

Cepas Procedencia Cepas Procedencia
G1 Municipio de Gines G29 Municipio de Gines
G2 Municipio de Gines G30 Municipio de Gines
G10 Municipio de Gines Q6 Municipio de Quivicn
G17 Municipio de Gines S1 Municipio de San Jos
G18 Municipio de Gines B1 Municipio de Gines
G25 Municipio de Gines

fitosanidad/291
Estudio del efecto protector...
El inculo de P. carotovorum se obtuvo a partir de culti-
vos de 24 h de la bacteria fitopatgena en medio GYCA.
Con agua destilada estril se prepararon suspensiones
ajustadas a un valor de densidad ptica de 0,05 y 0,1
respectivamente, a una longitud de onda de 580 nm.
Tubrculos-semilla certificados de la variedad Spunta
procedentes de Holanda se desinfectaron superficial-
mente con alcohol 70%, luego se sumergieron en
hipoclorito de sodio a 3% durante 3 min, se lavaron
con abundante agua destilada estril y se colocaron en
un flujo laminar durante 1 h. Rodajas de papa de 1 cm
de grosor se sumergieron durante 1 min en los cultivos
de Bacillus spp. Las rodajas tratadas se colocaron en el
flujo laminar durante 30 min para eliminar la hume-
dad superficial. Posteriormente se inocularon con 10 L
de las suspensiones preparadas de la cepa Pectobacterium
carotovorum 2046. Cada rodaja se inocul en tres pun-
tos diferentes, y se emplearon como controles rodajas
sin tratar inoculadas con la bacteria fitopatgena y
previamente sumergidas en agua destilada estril y
rodajas tratadas con cultivos de Bacillus spp. sin ino-
cular. Se utilizaron seis rodajas por tratamiento y se
colocaron en placas Petri con papel de filtro humedeci-
do con agua destilada estril y se incubaron a 30
o
C du-
rante 24 h. Transcurrido este tiempo se determin la
efectividad de los tratamientos mediante inspeccin
visual y observacin de la aparicin o no de sntomas
caractersticos de la enfermedad.
El control biolgico de P. carotovorum mediante espe-
cies de microorganismos antagonistas se ha estudiado
por varios grupos de investigacin debido al amplio ran-
go hospedero y a la gran importancia econmica que
poseen los cultivos que esta bacteria puede afectar. Se
han utilizado como alternativas el empleo de Erwinia
herbicola [Vanneste et al., 1995], Pseudomonas fluo-
rescens [Abdel-Alim et al., 2001] y Trichoderma hamatum
[Blom, 2001]; sin embargo, los resultados ms
promisorios han sido in vitro e in vivo, con especies del
gnero Bacillus productores de sustancias con activi-
dad antibacteriana [Bernal et al., 2002] [Sharga y Lyon,
1998] [Abdel-Alim et al., 2001].
En el estudio realizado el tratamiento de las rodajas de
papa con las cepas B1, G10, Q7 y Q18 previno total-
mente el desarrollo de la pudricin blanda en todas las
variantes del experimento (Fig. 1).
Figura 1. Efecto protector de la cepa G10 en rodajas de papa inoculadas con la mayor
concentracin de la cepa P. carotovorum 2046. A la derecha se muestran los controles de
P. carotovorum 2046 y G10.
En experimentos realizados por otros autores se han
producido resultados similares. Tal es el caso de Sharga
y Lyon (1998), quienes emplearon una cepa de Bacillus
subtilis productora de antibiticos para tratar rodajas
de papa y races de la planta, con el objetivo de inhibir
el desarrollo de la pudricin blanda ocasionada por P. ca-
rotovorum y P. atrosepticum. Estos autores solamente
emplearon en los tratamientos suspensiones de la cepa
Reinoso y otros
292/fitosanidad
antagonista preparadas con agua y no los cultivos l-
quidos como en este trabajo. Es por esto quizs que
solamente hubo resultados positivos, que se traducen
en la disminucin de la severidad de las lesiones cuan-
do emplearon una alta concentracin de Bacillus
subtilis, mientras que en este estudio se pudo evitar
completamente la aparicin de lesiones caractersticas
de la pudricin blanda con las cepas antes menciona-
das, lo cual pudiera deberse a la accin antibacteriana
de los metabolitos producidos por estos aislados
bacterianos que son excretados al medio de cultivo.
Las cepas B2, G15 y G25 solamente mostraron efecto
protector en aquellas rodajas inoculadas con la menor
concentracin de P. carotovorum (Fig. 2). Esta diferen-
cia respecto a los resultados con las cepas B1, G10, Q7
y Q18 puede estar relacionada con la produccin de
metabolitos antibacterianos de menor actividad biol-
gica inhibitoria, cuya accin se ve limitada por la densi-
dad de bacterias fitopatgenas presentes en el medio al
que son vertidos. Tambin es posible que la produccin
de estos compuestos en las cepas antes mencionadas co-
mience en etapas ms tardas del crecimiento, por lo que
en el momento de tratar las rodajas sus concentraciones
en el medio de cultivo no son suficientes como para lo-
grar un efecto igual al obtenido con B1, G10, Q7 y Q18.
De hecho se plantea que la produccin de sustancias con
actividad antimicrobiana por parte de especies del gne-
ro Bacillus est muy relacionada con la fase estacionaria
del crecimiento microbiano y en particular con la etapa
de esporulacin [Schallmey et al., 2004].
Figura 2. Efecto protector de la cepa B2 en rodajas de papa
inoculadas con la menor concentracin de la cepa P. carotovorum
2046. A la derecha se muestran los controles de P. carotovorum
2046 y B2.
El resto de las cepas de Bacillus spp. estudiadas no
inhibieron el desarrollo de la pudricin blanda. Algu-
nas como G11, G12 y G14 provocaron cambios de colo-
racin de color beis a pardo oscuro en las rodajas trata-
das, aunque no se observaron sntomas de pudricin
blanda. La cepa B4 produjo modificaciones drsticas
en las rodajas tratadas y el control; se observaron cam-
bios de color de beis a marrn con presencia de fetidez
y una gran maceracin del tejido del tubrculo. Con
anterioridad otros autores han aislado algunas espe-
cies del gnero Bacillus, productoras de enzimas
pectinolticas y proteolticas, causantes de la pudricin
blanda en algunos cultivos [US EPA, 1997] [Kararah
et al., 1985].
fitosanidad/293
Estudio del efecto protector...
CONCLUSIONES
Las cepas B1, G10, Q7 y Q18 inhibieron el desarrollo
de la pudricin blanda en las rodajas inoculadas con
ambas concentraciones de P. carotovorum utilizadas.
Las cepas B2, G15 y G25 solamente tuvieron efecto
protector en las rodajas inoculadas con la menor con-
centracin de P. carotovorum.
La cepa B4 produjo un incremento en la severidad
de los sntomas de la enfermedad.
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Schallmey, M.; A. Singh; O. Ward: Development in the Use of Bacillus
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Vanneste, J.; J. Perry; L. Perry-Meyer; R. Bedford: Erwinia herbicola
Eh252 as a Biological Control Agent of Bacterial Soft Rot on Potatoes,
NZPPS Paper 12:13-16, 1995.
294/fitosanidad
Normas Editoriales
Fitosanidad tiene como objetivo divulgar
de forma sistemtica el quehacer de los
investigadores y especialistas del Insti-
tuto de Investigaciones de Sanidad Ve-
getal, as como de otros centros del pas
o extranjeros, vinculados al trabajo de
la sanidad vegetal.
El Comit Editorial de esta publicacin,
que se edita trimestralmente, agradece
el envo de colaboraciones y observa-
ciones que ayuden a hacer mejor nues-
tra labor.
Los artculos deben reflejar los resulta-
dos de investigaciones bsicas o de apli-
cacin prctica, asimismo aquellos que
se encuentren en proceso de extensin
o generalizacin.
Igualmente resultan de importancia los
trabajos en que se comuniquen nuevos
procedimientos o innovaciones, as
como los que aborden temas novedosos.
Tipo de artculos
La revista acepta manuscritos origina-
les (inditos) en cualquiera de las espe-
cialidades directa e indirectamente vin-
culadas a la sanidad vegetal. Estos
pueden ser: artculos cientficos, rese-
as, comunicaciones cortas, resmenes
de tesis, informes tcnicos. Los artcu-
los cientficos no deben exceder de sie-
te cuartillas, las reseas de quince, las
comunicaciones de dos y los informes
tcnicos de cinco.
Lenguaje
El lenguaje oficial de la revista es espa-
ol, aunque excepcionalmente se acep-
tarn contribuciones en ingls, francs
y portugus. El estilo de escritura debe
ser totalmente impersonal, con criterio
de exactitud, brevedad y prrafos cor-
tos. Debe utilizarse el sistema mtrico
decimal. Los nombres cientficos se es-
cribirn completos, incluyendo el autor,
y siguiendo los cdigos internacionales
(ejemplo: Leucoptera coffeella Guerin
Meneville). Si es necesario utilizarlos en
varias partes del texto, entonces se es-
cribirn completos la primera vez que
aparezcan y luego se abrevian (ejemplo:
L. coffeella). Se escriben en cursiva o se
subrayan.
Estructura de los artculos
Los artculos cientficos tendrn la es-
tructura siguiente: ttulo, autor(es),
afiliacin de los autores, resumen y
palabras claves (espaol e ingls), intro-
duccin, materiales y mtodos, resulta-
dos y discusin, conclusiones (si las
hubiera), agradecimientos (si los hubie-
ra), referencias.
Las reseas adoptarn la siguiente es-
tructura: ttulo, autor(es), afiliacin de
los autores, resumen y palabras claves
(espaol e ingls), introduccin, el con-
tenido se estructura a criterio del au-
tor, agradecimientos (si los hubiera),
referencias.
Las comunicaciones cortas incluirn: t-
tulo, autor(es), afiliacin de los auto-
res, texto de la comunicacin, incluyen-
do las referencias principales.
La estructura de los informes tcnicos
ser: ttulo, autor(es), afiliacin de los
autores, resumen y palabras claves (es-
paol e ingls), introduccin, desarro-
llo y referencias.
Elaboracin del texto
El ttulo debe ser claro y conciso, pro-
curando que no sea extenso. Debe te-
ner correspondencia con el contenido.
No se incluirn abreviaturas.
De los autores se escribirn nombres y
dos apellidos. Si el autor tiene un se-
gundo nombre, este se abrevia con la
inicial. La afiliacin de los autores se
escribir con su nombre completo, las
siglas slo se emplearn entre parnte-
sis, si lo consideran necesario. Debe in-
cluirse la direccin postal, fax y correo
electrnico si los posee.
El resumen no debe exceder de 250 pa-
labras, y debe tener una sntesis de los
mtodos y resultados, mencionndose
los nombres cientficos completos y
valores cuantitativos de los resultados,
es decir, debe tener el contenido sufi-
ciente de forma comprimida.
Las palabras claves son aquellas que per-
miten identificar el contenido del art-
culo y que facilitan la identificacin en
los ndices de materia. Debe incluir las
taxas de los entes biolgicos.
La introduccin debe tener una breve
referencia de los antecedentes especfi-
cos del trabajo, as como una revisin
breve de las referencias ms recientes
que se relacionan con el tema que se
presenta. Tambin se incluir el objeti-
vo del trabajo.
Los materiales y mtodos deben ser cla-
ros y concretos, se redactarn segn un
orden lgico de los mtodos empleados.
De igual forma se escribirn claramente
los procedimientos analticos y estadsti-
cos utilizados. Se pueden citar los mto-
dos y procedimientos, siempre que ha-
yan sido publicados en revistas cientficas.
Los resultados se pueden expresar apo-
yados en tablas y/o figuras, con una dis-
cusin a partir de referencias actuales.
Deben presentarse de manera lgica,
interpretando las conclusiones. Las fi-
guras se deben elaborar solamente en
Word u otro programa compatible.
Las referencias slo sern de publica-
ciones disponibles en las bibliotecas, y
se presentarn en orden alfabtico. Se
colocar el primer apellido del autor
principal y luego las iniciales de los nom-
bres; para los dems autores, primero
la inicial y luego los apellidos, en todos
los casos separados por comas. Cuando
una obra lleve ms de tres autores, se
pondr el apellido y nombre del prime-
ro y a continuacin et al. (en cursiva). A
continuacin, el ttulo del artculo, el
nombre de la revista, as como volumen,
nmero, pginas y ao. En el caso de
los libros y folletos, despus del ttulo,
nmero de la edicin, lugar de la publi-
cacin (ciudad), casa editorial y pgi-
nas. Los ttulos de los artculos y po-
nencias se entrecomillarn, mientras
que los referidos a libros y publicacio-
nes peridicas irn en cursiva, o en su
defecto subrayados. En el texto las refe-
rencias se citan con el apellido del pri-
mer autor y el ao entre parntesis; ms
de un autor se anota como et al.
Envo de manuscritos
Deben entregarse un original mecano-
grafiado, a doble espacio, en papel blan-
co tamao 28 x 21,5 cm, utilizando una
sola cara, con mrgenes de dos centme-
tros a los lados y tres en la parte supe-
rior e inferior. Cada cuartilla debe ser
enumerada. La letra que ha de utilizarse
debe ser Arial, con puntaje 11. Adems,
debe entregar una copia en disquete,
utilizando el procesador de texto Word,
ya que el consejo de redaccin no dispo-
ne de capacidades para mecanografiar los
artculos. Se acepta el envo de manus-
critos por correo electrnico, como do-
cumentos adjuntos al mensaje o carta de
presentacin, siempre que no posean fi-
guras. Los manuscritos se enviarn a:
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Vegetal. Calle 110 no. 514 e/ 5a.B y 5a.F,
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tn acompaados de la Declaracin del
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electrnico: lvazquez@inisav.cu
Revisin de los manuscritos
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rial sern sometidos a un proceso de
arbitraje y correccin de estilo. Los au-
tores colaborarn con los rbitros y co-
rrectores a evacuar cualquier duda al
respecto y efectuar, si es preciso, las
modificaciones que se le sugieran. El
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de aprobar o rechazar los trabajos pro-
puestos, lo cual ser notificado oportu-
namente a los interesados.
fitosanidad/295
PRODUCCIN DE BIOMASA DE TRICHODERMA HARZIANUM
POR FERMENTACIN LQUIDA
Rosaima Garca,
1
Mara A. Durn
1
y Ramn Riera
2
1
Instituto Nacional de Investigaciones Agrcolas. Mrida, Venezuela, AP 25, telf. 0251-2630090,
rgcrespo@inia.gov.ve.
2
Servicio Autnomo de Sanidad Agropecuaria. Mrida, Venezuela
RESUMEN
Con el objeto de mejorar la eficiencia en la produccin masiva de
Trichoderma harzianum Rifai se evalu la metodologa de produccin
por fermentacin lquida esttica en forma artesanal. Para ello se
utiliz como sustrato melaza de trapiche de caa panelera fresca y
levadura panadera granulada (Saccharomyces cerevisiae). Se usa-
ron frascos de vidrio transparente de 500 mL donde se colocaron 100 mL
de solucin de melaza a 5%, se llev a 200 mL con agua destilada y
se ajust el pH a 5,5. Se esterilizaron en autoclave a 121C y 15 PSI
por 20 min, se dejaron reposar 24 h y luego se agreg 10 g de levadu-
ra (5%). Se inocul con 5 mL de suspensiones de conidios de
Trichoderma harzianum (1 x 10
10
ufc), se agitaron e incubaron en
forma esttica inclinada durante 14 das hasta obtener la produccin
completa de conidios. Se encontr desarrollo de diferentes estructu-
ras o biomasa del hongo (micelio, conidios y clamidosporas) a partir
de dos das. La produccin de conidios se complet entre 8-14
das, de acuerdo con la cepa T
12
= 1,8 x 10
9
ufc, T
3
= 5,8 x 10
8
ufc,
IUTE = 5,4 x 10
8
ufc, Natibiol = 4,2 x 10
8
ufc, T
8
= 5,8 x 10
8
ufc, Inprodi-
ca = 6,4 x 10
8
ufc, T
2
= 3,0 x 10
8
ufc, T
11
= 2,8 x 10
8
ufc, T
1
= 2,6 x 10
8
ufc
y Bioagrcola = 5 x 10
7
ufc. Con este proceso se acelera la obtencin
de inculo del hongo para el proceso de produccin, lo que se logra
antes de tres das en relacin con la produccin normal de conidios
por fermentacin slida usados para resuspender y aplicar como
inculo, el cual se alcanza entre seis y siete das.
Palabras claves: biomasa, Trichoderma, fermentacin lquida
ABSTRACT
In order to improve the efficiency of Trichoderma harzianum massive
production a methodology by static liquid fermentation in handmade
form was evaluated. French brown sugar loaf cane molasses and
granulated Bakery yeast (Saccharomyces cerevisiae) were utilized
as substratum. In glass bottles of 500 mL were place 100 mL of 5%
molasses solution, it was added distilled water to 200 mL, and pH was
adjusted to 5.5. These were sterilized in autoclave at 121C and 15
PSI for 20 minutes, putting at rest for 24 h and then were added 10 g of
yeast (5%). The inoculation was made with 5 mL of Trichoderma
harzianum conidia suspensions (1 x 10
10
ufc), shaked and incubated
in inclined static form during 14 days until getting complete production
of conidia. Develop of different structures or fungus biomass
(mycelium, conidia and clamidosphora) since two days was found.
Conidia production finished between 8 and 14 days, in accordance
with strain T
12
= 1.8 x 10
9
ufc, T
3
= 5.8 x 10
8
ufc, IUTE = 5.4 x 10
8
ufc,
Natibiol = 4.2 x 10
8
ufc, T
8
= 5.8 x 10
8
ufc, Inprodica = 6.4 x 10
8
ufc, T
2
=
3.0 x 10
8
ufc, T
11
= 2.8 x 10
8
ufc, T
1
= 2.6 x 10
8
ufc and Bioagrcola = 5 x 10
7
ufc. With this process is speeded up the obtaining of fungus inoculums
for the production process, and it is obtained before three days with
regard to normal conidia production by solid fermentation used to
resuspend and apply as inoculums, which is reached between six
and seven days.
Key words: biomass, Trichoderma, liquid fermentation
INTRODUCCIN
La versatilidad, adaptabilidad y la fcil manipulacin
de las especies del hongo Trichoderma permite su uso
efectivo en el control biolgico. Trichoderma spp. pro-
duce tres tipos de propgalos como son hifas, cla-
midosporas y conidios, que son activas contra
fitopatgenos en diferentes fases del ciclo de vida, des-
de la germinacin de las esporas hasta la esporulacin
[Fernndez-Larrea, 2002].
De acuerdo con Fernndez-Larrea (2002) existen dife-
rentes formulaciones de hongos antagonistas, las cua-
les se usan en dependencia del mecanismo de accin para
uso comercial; pero el material seco es el preferido, de-
bido a que uno de los aspectos ms importante en la
comercializacin es el peso y la manipulacin de los pro-
ductos. Las hifas son poco resistentes al secado, por lo
que se trabaja en las formulaciones de las formas
reproductoras (conidios y clamidosporas) como polvos
humedecibles, polvos secos, formulaciones en aceite y
encapsulados que contienen el hongo.
Los conidios son ms resistentes que las clamidosporas
y se producen en mayor cantidad por diferentes vas:
sobre soporte slido y en cultivos lquidos estticos y
Garca y otros
296/fitosanidad
agitados, aunque ms dbil debido a que la pared celu-
lar es ms delgada, de tal manera que son menos resis-
tentes a las condiciones adversas del ambiente, como
los rayos ultravioletas del sol y a la tecnologa de apli-
cacin, ya que se puede romper ms rpidamente y
daarse antes de realizar su efecto de biocontrol.
Sin embargo, la produccin de Trichoderma lquido re-
presenta una alternativa para cuando la demanda es alta,
ya que de esta manera se acelera el proceso de produc-
cin masiva y se obtiene el producto en un tiempo ms
corto, con mayor cantidad y variedad de propgalos, lo
cual indiscutiblemente aumenta su eficiencia.
Por otro lado, una de las formas de acelerar el proceso de
produccin es el uso de mtodos combinados, es decir, a
travs de fermentacin bifsica, en que se utiliza un pro-
ceso de fermentacin lquida para la obtencin de un buen
inculo que luego se inocula sobre sustratos slidos.
Estudios realizados por Wei Lin et al. (2006) demues-
tran que en el proceso de fermentacin lquida de T. har-
zianum se obtienen sustancias promotoras de crecimien-
to (cido indolactico, cido giberlico, citoquininas y
vitaminas), las cuales son una clase de pptido. Cuan-
do aplicaron T. harzianum sobre la rizsfera de plan-
tas inoculadas con bacterias fijadoras de nitrgeno se
logr un aumento del tamao de los ndulos radiculares
y se produjo un incremento en la eficiencia de la fija-
cin de nitrgeno.
El mtodo ms comnmente utilizado en Venezuela
para la produccin masiva del hongo Trichoderma es
por fermentacin slida monobsica, con el uso de
sustrato alimenticio slido tanto para la produccin de
inculo como para la obtencin final del biopreparado.
En otros casos se obtienen formulaciones lquidas por
resuspensin de los conidios proveniente de una fermen-
tacin slida [Zambrano, 2005].
El presente trabajo tuvo por objetivo evaluar la meto-
dologa de produccin lquida esttica en forma
artesanal mediante el uso de melaza de caa panelera,
obtenida en la zona (estado de Mrida), ms levadura
panadera como sustrato alimenticio lquido para la ob-
tencin del inculo del hongo T. harzianum, a fin de
mejorar la eficiencia en tiempo y produccin de biomasa
dentro del proceso de produccin masiva.
MATERIALES Y MTODOS
Se utilizaron 10 cepas de T. harzianum pertenecientes a
la Coleccin de Hongos Antagonistas del Laboratorio
de Fitopatologa del Instituto Nacional de Investiga-
ciones Agrcolas del estado de Mrida (INIA-Mrida).
Para iniciar el trabajo se hizo una reactivacin de las
cepas; se sembr por duplicado en el medio de cultivo
agar papa dextrosa (PDA) y se incubaron a 27
o
C de
tres a cinco das. Las cepas de T. harzianum utilizadas
fueron siete no comerciales (T
1
, T
2
,

T
3
, T
8
, T
11
, T
12
,
IUTE)

y tres comerciales (Natibiol, Inprodica y
Bioagrcola). La produccin del inculo del hongo en
forma lquida se realiz a partir de una solucin de 100 mL
de melaza a 5%, que se afor a 2000 mL con agua des-
tilada, y se ajust a pH 5,5. La solucin se dispens en
frascos de vidrio de 500 mL, en una cantidad de 200 mL
por frasco y se esteriliz en autoclave a 121C y 15 PSI
por 20 min, se dejaron reposar 24 h y entonces se le
aadi 5% de levadura (Saccharomyces cerevisiae) en
forma asptica bajo la cmara de flujo laminar.
La produccin del hongo en forma lquida se llev a cabo
a partir de una solucin de 100 mL de melaza de trapi-
che de caa panelera fresca a 5% que se diluy a 2000 mL
de agua destilada y se ajust el pH a 5,5. La solucin se
dispens en frascos de vidrio de 500 mL, a razn de 200
mL por frasco, se esteriliz en autoclave a 121
o
C, 15 PSI
por 20 min y se dejaron reposar 24 h; luego se le aadi
5% de levadura (Saccharomyces cerevisiae) en forma
asptica bajo la cmara de flujo laminar.
A las placas de Petri con los cultivos de Trichoderma se
les agregaron 10 mL de agua destilada estril, se agit
un poco, se tomaron 5 mL de suspensiones de conidios
de cada cepa (1 x 10
10
ufc) y se inocul en cada frasco
que contena la solucin de melaza ms levadura.
Una vez inoculados los frascos con la melaza se taparon
con algodn y papel aluminio, y sellaron con parafilm
para proporcionarles condiciones aspticas. Se some-
tieron a agitacin y se incubaron en forma esttica in-
clinada durante 14 das hasta obtener la produccin
completa de conidios. Cada tratamiento se repiti diez
veces. Las observaciones se hicieron todos los das para
detectar tipo de estructuras producidas y luego medir
las cantidades.
La determinacin de la concentracin de conidios por
mililitros se realiz en cmara de Newbauer por medio
del microscopio ptico y un objetivo de 40X, en una di-
lucin de 10
2
, y se calcul por la frmula [Lecuona, 1996]:
Concentracin (ufc.mL = Nmero de conidios x 4 x 10
6
x dilucin)
Se realizaron observaciones directas al microscopio p-
tico de muestras tomadas a las 24 h de incubacin de
fitosanidad/297
Produccin de biomasa de Trichoderma...
las siembras realizadas en placas con PDA para des-
cartar las posibles contaminaciones. Los datos sobre
concentracin de conidios se analizaron a travs del
programa Estadstica 6.0.
En la Tabla 1 se observan los resultados sobre produc-
cin de biomasa de Trichoderma bajo fermentacin l-
quida. Se encontr que todas las cepas lograron produ-
cir biomasa del hongo a partir de dos das. La produccin
de conidios se alcanz entre 8-14 das. Hubo alta pro-
duccin de micelios y clamidosporas, y adems se en-
contr una alta concentracin de conidios que vari
desde 5,7 x 10
7
en la cepa comercial Bioagrcola hasta
1,81 x 10
9
ufc/mL. Se obtuvieron diferencias significa-
tivas entre las cepas en cuanto a produccin de conidios.
Tambin se observaron diferencias en forma cualitati-
vas en cuanto a la produccin de micelios y clami-
dosporas.
De acuerdo con la prueba de medias de LDS a 5%, to-
das las cepas tuvieron diferentes comportamientos en
cuanto a produccin de conidios. La que present mejor
produccin fue T
12
, seguida de la comercial Inprodica,
T
8
y IUTE. Se encontraron tambin diferencias signi-
ficativas en el tiempo necesario para la obtencin final
de conidios. Estas mismas cepas alcanzaron la produc-
cin en solo ocho das, que fue la ms rpida, seguidas
de T
8
, T
2
y T
3
que lo lograron en diez. Las dems nece-
sitaron entre 12 y 14 das.
Lo anterior indica que existe una alta variacin en cuan-
to a la obtencin final de estructuras reproductivas de
Trichoderma cuando se usa medio lquido, y que ello
est estrechamente relacionado con el comportamiento
de la cepa a pesar de que todas son T. harzianum.
Trabajos similares se han realizado en Cuba para la
obtencin de Trichoderma por fermentacin lquida con
el uso de melaza de caa de azcar y levadura torula, y
se logr producir una concentracin de 2-3 x 10
8
conid./mL
[Fernndez-Larrea, 2002; Fernndez-Larrea et al., 1992;
Stefanova et al., 1999].
Asimismo Prakash y Lumsden (2006), con el objeto de
obtener un preinculo lquido de especies de Tricho-
derma utilizaron 0,3 g melaza y 0,05 g extracto de leva-
dura en 100 mL de agua, y lograron una produccin de
10
3
-10
8
ufc. En tanto, en el proceso de produccin de
biomasa, cuando utilizaron 2,5 g de extracto de leva-
dura y 500 mL de melaza en 1 L de agua, lograron una
produccin de 10
6
a 10
7
clamidosporas/mL.
Tabla 1. Produccin de biomasa y conidios de diferentes cepas de T. harzianum
bajo fermentacin lquida
Cepas
Produccin
de micelios
Tiempo
(das)
Produccin de
clamidosporas
Tiempo
(das)
Produccin
de conidios
Tiempo
(das)
T12

+++ 2 ++ 7 1,81 x 10
9
a

8
Cepa comercial
Inprodica
+ 2 + 8 6,4 x 10
8
b 12
T3 ++ 2 ++ 8 5,8 x 10
8
c 10
T8 +++ 2 ++ 8 5,8 x 10
8
c 10
IUTE ++ 2 ++ 8 5,4 x 10
8
d 8
Cepa comercial
Biogrcola
++ 3 + 8 5,0 x 10
7
e 14
Cepa comercial
Natibiol
++ 3 ++ 8 4,2 x 10
8
f 14
T2 +++ 2 + 9 3,0 x 10
8
g 10
T11 ++ 2 + 9 2,8 x 10
8
h 14
T1 ++ 2 + 10 2,6 x 10
8
i 14
CV 4,4%
Sx 0,378
Letras distintas son diferentes en la prueba de LSD con probabilidad menor o igual a 5%.

Garca y otros
298/fitosanidad
CONCLUSIONES
La produccin de biomasa del hongo T. harzianum a
travs del proceso de fermentacin lquida es varia-
ble, depende del comportamiento de la cepa, por lo
que se requiere realizar pruebas preliminares antes
de aplicar este mtodo para reproduccin de una cepa
en forma masiva.
La melaza de trapiche panelera fresca y levadura de
cerveza, probada por primera vez en Venezuela como
suplementos nutricionales de T. harzianum para la ob-
tencin de biomasa por fermentacin lquida, result
exitosa. Se desarrollaron estructuras reproductivas del
hongo: micelio, clamidosporas y conidios. Se requiere
validar el mtodo a mayor escala.
Debido a la alta cantidad de estructuras reproduc-
tivas obtenidas por este mtodo de fermentacin l-
quida, se puede recomendar su utilizacin en la fase
de preparacin de inculo dentro del proceso de pro-
duccin para agilizarlo, as como para la produccin
final de propgalos a utilizar en campo para el
biocontrol de enfermedades de plantas.
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zuela. Memorias del Curso-Taller Control Biolgico: Herramienta
Bsica en Una Agricultura Sostenible, Trujillo, 29 y 30 de septiembre
del 2005.
fitosanidad/299
R
e
s
e
a
CARACTERIZACIN DE RALSTONIA SOLANACEARUM
A TRAVS DEL ESTUDIO DE SU DIVERSIDAD GENTICA
Yelaine Tejeda Gmez
a
B y 5.
a
F, Playa, Ciudad
de La Habana, CP 11600, ytejeda@inisav.cu
RESUMEN
La bacteria fitopatgena Ralstonia solanacearum es causante de la
marchitez bacteriana en diversos cultivos de importancia econmica
en regiones de clima tropical y subtropical, as como en diversos
pases de clima templado. La especie constituye una unidad
taxonmicamente compleja en la que las cepas muestran una amplia
diversidad a nivel fisiolgico, serolgico, gentico y de rango de
hospedantes. El anlisis por RFLP proporciona un nuevo esquema
de clasificacin al dividir la especie en los grupos Asiaticum y
Americanum, en relacin con el origen geogrfico de las cepas. A
partir de estos anlisis preliminares se ha incrementado el empleo y
desarrollo de las tcnicas moleculares para el estudio de la diversi-
dad gentica dentro de esta especie bacteriana. En el presente tra-
bajo se destacan los principales aportes que, con el empleo de tc-
nicas moleculares, han realizado varios grupos de investigacin a la
comprensin de las relaciones filogenticas y evolutivas entre las
cepas.
Palabras claves: Ralstonia solanacearum, bacteria, diversidad
gentica
ABSTRACT
Ralstonia solanacearum causes bacterial wilt in many important crops
in tropical and subtropical regions, and some mild climate countries.
The species is taxonomically complex and the strains show a high
diversity at different levels as physiological, serological, genetic, and
host range. RFLP analysis has provided a new classification system
in which the species is divided in Americanum and Asiaticum groups,
related to the geographic origin of the strains. Since these preliminary
investigations were performed, the development of molecular
techniques in the study of Ralstonia solanacearum genetic diversity
has increased. In this paper, the most outstanding contributions of
vari ous researches groups i n thi s fi el d are outl i ned. These
investigations have improved the comprehension of phylogenetic and
evolutionary relationships among Ralstonia solanacearum strains.
Key words: Ralstonia solanacearum, bacteria, genetic diversity
INTRODUCCIN
La bacteria fitopatgena Ralstonia solanacearum es
causante de la marchitez bacteriana en diversos culti-
vos en regiones de clima tropical y subtropical
[Kelman, 1953], as como en algunos pases de clima
templado [Hayward, 1991; Janse, 1996]. La enferme-
dad afecta a varios cientos de especies vegetales dis-
tribuidas en ms de cincuenta familias [Hayward,
1994]. Dentro de ellas se encuentran cultivos de im-
portancia econmica como papa (Solanum tuberosum,
Sw.), tabaco (Nicotiana tabacum, Lin.), tomate
(Licopersicum esculentum, Mill.), pimiento (Capsicum
annuum, L.), pltano y banano (Musa sp.), berenje-
na (Solanum melongena, L.), adems de numerosas
plantas ornamentales, medicinales, malezas y algu-
nas especies silvestres [Kelman, 1953].
Ralstonia solanacearum es una especie heterognea que
se encuentra poco relacionada filogenticamente con
otros grupos del gnero Pseudomonas. Las nicas espe-
cies que muestran relacin con ella son P. picketii pat-
geno ocasional en humanos y P. syzygii, causante del
marchitamiento del clavo de olor en Sumatra [Seal et
al., 1993; Taghavi et al., 1996]. Las evidencias sugieren
que R. solanacearum es una especie que surgi tempra-
no en la historia geolgica, posiblemente como un pa-
tgeno de los ancestros de las plantas modernas
[Sequeira, 1994]. Buddenhagen y Kelman (1964) con-
cluyeron que las cepas de R. solanacearum son el pro-
ducto de un largo proceso evolutivo que se ha produci-
do de manera independiente en varias reas geogrficas
y en diferentes hospederos. Esta hiptesis se ha confir-
Tejeda Gmez
300/fitosanidad
mado por estudios del material gentico [Cook et al.,
1989].
La especie R.solanacearum constituye una unidad
taxonmicamente compleja en la que las cepas mues-
tran una amplia diversidad a diferentes niveles: fisiol-
gico, serolgico, gentico y de rango de hospedantes. El
gran nmero de cepas de R. solanacearum existente en
todo el mundo dificulta el establecimiento de criterios
para la diferenciacin de cepas, aspecto esencial para el
trabajo de los taxnomos y del personal de cuarentena.
Con el objetivo de describir esta variabilidad intra-
especfica se han propuesto diversos sistemas de clasi-
ficacin.
Se conocen cinco razas de R. solanacearum cuya separa-
cin est basada en el rango de los hospedantes y la
habilidad para sobrevivir bajo diferentes condiciones
ambientales [Buddenhagen et al., 1962; He et al., 1983;
Buddenhagen, 1985; Pegg y Moffett, 1971]. La utiliza-
cin de tres disacridos y/u oxidacin de tres hexosa
alcoholes ha permitido la separacin de los aislamien-
tos en seis biovares [Hayward, 1964; He et al., 1983;
Hayward et al., 1990]. El sistema de clasificacin en
razas y biovares es confuso, pues cada biovar contiene
cepas con diferentes rangos de hospedantes, y varias
razas contienen una amplia diversidad de cepas perte-
necientes a diferentes biovares. Solo existe correspon-
dencia entre la raza 3 y el biovar 2. El anlisis de cidos
grasos [Janse, 1991] y del perfil de protenas [Dianese
et al., 1994] no ha logrado esclarecer las relaciones en-
tre las cepas ni el establecimiento de un criterio de cla-
sificacin uniforme. Esto hace que los mtodos tradi-
cionales de clasificacin no sean lo suficientemente
efectivos [Poussier et al., 1999; Sequeira, 1994].
Estas dificultades condujeron a la bsqueda de un nue-
vo sistema de clasificacin basado en el anlisis del ma-
terial gentico. Muchas de las tcnicas moleculares em-
pleadas en la actualidad tienen como fundamento comn
la separacin de fragmentos de ADN de diferentes pesos
moleculares. El resultado electrofortico se representa
por un patrn de bandas en un gel. Estos patrones sue-
len ser muy complejos y de difcil interpretacin.
Entre las tcnicas utilizadas para el estudio de R. sola-
nacearum se encuentran el polimorfismo de longitud de
fragmentos de restriccin (Restriction Fragment Length
Polymorphism (RFLP)) en sus dos variantes: Southern
blotting-RFLP y PCR-RFLP, el ADN polimrfico
aleatoriamente amplificado (Random Amplified
Polymorphic DNA or Arbitrary Primed PCR, RAPD),
el Rep-PCR, el polimorfismo de longitud de fragmen-
tos amplificados (Amplified Fragment Length
Polymorphism (AFLP)) y la secuenciacin de regiones
especficas del genoma. El empleo de cada una de ellas
ha contribuido a una caracterizacin y diferenciacin
ms acertadas de las cepas. El anlisis a nivel gentico
de las cepas ofrece la posibilidad de estudiar las rela-
ciones filogenticas y evolutivas entre ellas.
Contribucin de los estudios de diversidad gentica
a la diferenciacin intraespecfica de las cepas
de Ralstonia solanacearum
Los primeros trabajos que constituyeron un hito en el
estudio de la diversidad gentica del patgeno fueron
reportados por Cook et al. (1989) y Cook y Sequeira
(1994). Estos investigadores utilizaron el Southern
blotting-RFLP con nueve sondas, lo que les permiti
detectar y localizar secuencias especficas en el ADN,
las cuales contenan informacin esencial para la viru-
lencia y la respuesta de hipersensibilidad. Estas secuen-
cias se sometieron a digestin con enzimas de restric-
cin especficas. La ubicacin de los sitios de corte para
una enzima de restriccin determinada dentro de un
locus de inters puede variar de una cepa a otra, y traer
como resultado fragmentos que difieren en tamao en
cepas diferentes [Olive y Bean, 1999]. El anlisis de los
patrones electroforticos obtenidos por este procedi-
miento posibilit establecer la existencia de dos grupos
o divisiones con un coeficiente de similitud de 13,5%:
la divisin I, que incluy los biovares 3, 4 y 5, y la divi-
sin II, formada por las cepas de biovares 1, 2 y N2.
Dentro de cada divisin los coeficientes de similitud
resultaron ser muy elevados, y fueron mayores den-
tro de la divisin I. Ms del 90% de las cepas de la
divisin I procedan de Asia y Australia (divisin
Asiaticum), mientras que 98% de las cepas de la divi-
sin II eran originarias de las Amricas (divisin
Americanum).
Estas divisiones se han confirmado por anlisis de la
secuencia del gen que codifica para el ARN ribosomal
16 S [Li et al., 1993; Seal et al., 1993; Taghavi et al.,
1996]. El anlisis de esta secuencia permiti estudiar
las relaciones filogenticas y evolutivas entre los
microorganismos, dado su elevado contenido infor-
macional, su naturaleza conservativa, su distribucin
universal y la accesibilidad de las secuencias en bancos
de genes [Woese, 1987]. Las secuencias de los genes que
codifican para el ARNr 16S son por lo general especfi-
cas para cada especie y estn presentes en mltiples
fitosanidad/301
Caracterizacin de Ralstonia...
copias en el genoma, lo que las hace excelentes para la
identificacin de bacterias a nivel de especie. Taghavi et
al. (1996) demostraron la existencia de dos subdivisiones
dentro de la divisin Americanum: la 2b, que contiene
aislamientos pertenecientes a los biovares 1, 2 y N2
procedentes de Indonesia, y la 2a que incluye el resto
de las cepas de biovares 1, 2 y N2. En este trabajo se
report una cepa biovar 2 atpica, similar a las cepas de
biovares 3 y 4 estudiadas, por lo que se agrup dentro
de la subdivisin Asiaticum.
Fegan et al. (1998) realizaron el anlisis de la secuencia
de la regin intergnica 16S-23S RNA. Dada la elevada
similitud de secuencia de los genes que codifican para
ARNr 16S en las cepas de R. solanacearum, resulta ms
factible el anlisis de la regin espaciadora entre 16S y
23S, que produce informacin filogentica ms valiosa
al ser mayor su grado de variabilidad entre diferentes
cepas [Barry et al., 1991; Leblond-Bourget et al., 1996].
En este trabajo se analizaron adems las secuencias de
los genes que codifican para las enzimas poli-
galacturonasa y endoglucanasa. En todos los casos se
confirm el sistema de clasificacin obtenido por
Taghavi et al. (1996).
El anlisis PCR-RFLP de diferentes regiones del
genoma bacteriano demostr tambin la existencia de
las divisiones Asiaticum y Americanum [Gilling et al.,
1993]. Poussier et al. (1999), por medio del PCR-RFLP,
analizaron regiones del gen hrp relacionado con la res-
puesta de hipersensibilidad, y tuvieron resultados ma-
yormente consistentes con lo reportado por Cook et al.
(1989); sin embargo, encontraron que las cepas biovar 1
del sur de frica quedaban agrupadas en una subdivi-
sin diferente, la cual posea mayor homologa con las
cepas de la divisin Asiaticum que con las de la divi-
sin Americanum. Para esclarecer las relaciones entre
las cepas biovar 1 del sur de frica y otras cepas de R. sola-
nacearum ampliaron el estudio con la inclusin de 59
cepas, dentro de las que se encontraban las de biovares
N2 y 5, as como nuevas cepas africanas.
Como resultado de estas nuevas investigaciones,
Poussier et al. (2000) reportaron por primera vez el
empleo de la tcnica AFLP para el anlisis de una co-
leccin de cepas internacionales dentro de un estudio
de diversidad gentica. Este mtodo pertenece a la ca-
tegora de las tcnicas de amplificacin selectiva de frag-
mentos de restriccin, basadas en la ligazn de
adaptadores a fragmentos de restriccin genmicos se-
guido de una amplificacin por PCR con cebadores es-
pecficos para los adaptadores [Olive y Bean, 1999].

El
AFLP permiti una fina discriminacin entre los ais-
lamientos y logr diferenciar cepas que resultaron
indistinguibles por PCR-RFLP. De las 96 cepas anali-
zadas por AFLP se obtuvieron 60 patrones diferentes,
y se observ el 95% de polimorfismo en las bandas,
mientras que en el anlisis por PCR-RFLP, de 178 ce-
pas se obtuvieron 20 patrones diferentes. Incluso al
compararse con lo obtenido por Cook et al. (1989, 1991)
y Cook y Sequeira (1994), donde se produjeron 46 perfi-
les diferentes a partir de 164

cepas analizadas, se
demuestra que el AFLP tiene un nivel de resolu-
cin superior para la diferenciacin intraespecfica
de R.solanacearum. El AFLP posibilit una separa-
cin ms definida entre cepas de biovar 2 y N2, y tam-
bin entre cepas de biovares 3, 4 y 5. El AFLP y el
PCR-RFLP confirmaron que el biovar 2 es el menos
diverso genticamente entre todos los biovares [Cook et
al., 1989; Cook y Sequeira, 1994; Smith

et al., 1995; Van
Der Wolf et al., 1998; Thammakijjawat, 2001].
Pese a que los estudios llevados a cabo por Poussier et
al. (2000) confirmaron la clasificacin ofrecida por Cook
et al. (1989), se encontraron excepciones en este esque-
ma. Los resultados confirmaron la presencia de una
subdivisin formada por cepas biovar 1 del sur de fri-
ca. Aunque el anlisis por PCR-RFLP mostr una
mayor homologa entre estas cepas y las cepas biovar 1
de la divisin Asiaticum, el anlisis por AFLP y la
secuenciacin de genes para ARNr 16S arrojaron un
resultado opuesto. Las cepas biovar 1 del sur de frica
fueron por lo tanto incluidas en una nueva subdivisin
2c con respecto a lo reportado por Taghavi et al.
(1996). La explicacin ms probable a la diferencia exis-
tente entre las cepas biovar 1 africanas y americanas es
un desarrollo evolutivo diferenciado debido a la sepa-
racin geogrfica. Otros aislamientos africanos que
pertenecen a la divisin Americanum pueden haber sido
introducidas al continente africano por medio de inter-
cambios comerciales.
No obstante la gran cantidad de investigaciones que
apoyaron y enriquecieron los estudios preliminares de
Cook y colaboradores, el anlisis de nuevos aislamien-
tos aport resultados que demuestran el elevado grado
de complejidad taxonmica de esta especie bacteriana.
En 1998 Tsuchiya y Horita reportaron el anlisis de 64
cepas japonesas por medio de diferentes tcnicas
moleculares: el Southern blotting-RFLP con cuatro
sondas especficas para DNAr 23S y 16S (tambin co-
Tejeda Gmez
302/fitosanidad
nocido como ribotyping), el PCR-RFLP y el Rep-PCR.
Las cepas analizadas correspondan a raza 1 (biovares
1, 2, 3 y 4) y raza 3 (biovar 2). Segn el esquema de
clasificacin de Cook et al. (1989), las cepas raza 1 de-
ban pertenecer a la divisin Asiaticum y las cepas raza 3
a la divisin Americanum. Como resultado del empleo
de las tcnicas mencionadas anteriormente se logr
obtener una clara diferenciacin entre las cepas de raza
1 y raza 3. Con Southern blotting-RFLP el coeficiente
de similitud entre raza 1 y 3 fue de 15,4%, y dentro de
la raza 1 de 75,5%. Los patrones electroforticos obte-
nidos a partir de cepas raza 1 (biovares 1, 2, 3 y 4)
fueron similares a los patrones de los biovares 3, 4 y 5
de la divisin Asiaticum. Los patrones de las cepas raza
3/biovar 2 fueron similares a los de las cepas biovar 1 de
la divisin Americanum, lo que apoya la hiptesis plan-
teada por Buddenhagen (1985), quien sugiri que la raza
3 se origin en la regin andina de Sudamrica, de don-
de es originaria la papa, su principal hospedante, y que
la aparicin de raza 3 fuera de esta regin es resultado
del comercio internacional. La distribucin de las ce-
pas japonesas raza 1 (biovares 1 y 2) no se corresponde
con lo reportado por Cook et al. (1989). Las nueve ce-
pas japonesas raza 1/biovar 2 resultaron ser homog-
neas a la cepa atpica perteneciente a la divisin
Asiaticum reportada por Taghavi et al. (1996). Con res-
pecto a las cepas raza 1/biovar 1, fueron semejantes a
las cepas japonesas raza 1/biovar 4, y no a los biovares
1 americanos. Estas cepas pueden ser mutantes de raza
1/biovar 4 que perdieron la capacidad de degradar las
tres hexosas alcoholes.
Thammakijjawat et al. (2001) realizaron el anlisis
PCR-RFLP de cepas tailandesas y otras internaciona-
les tuvieron con Cook et al. (1989) resultados consis-
tentes. Las excepciones fueron dos cepas biovar 1
atpicas y tres cepas biovar N2 de Japn, que se agru-
paron dentro de la divisin Asiaticum. Excepciones de
este tipo fueron reportadas por Horita y Tsuchiya
(2001).
Aunque actualmente existe una mejor comprensin de
la diversidad intraespecfica de la bacteria R.sola-
nacearum, las investigaciones en este campo continan
con la bsqueda de nuevas metodologas de mayor sen-
sibilidad. Lee et al. (2001) reportaron el aislamiento de
una secuencia de insercin IS1405 a partir de una
cepa de raza 1. Este tipo de secuencia constituye un
componente importante de la mayora de los genomas
bacterianos. Las mutaciones y reordenamientos pro-
vocados por las secuencias de insercin es uno de los
mecanismos ms importantes en la generacin de di-
versidad gentica [Galas et al., 1989]. En algunos casos
la localizacin de secuencias de insercin especficas en
sitios definidos del cromosoma es lo suficientemente
estable como para permitir su anlisis por RFLP
[Mahillon y Chandler, 1998]. La caracterizacin
molecular de cepas con el uso de secuencias de insercin
puede reflejar mejor la organizacin del genoma
bacteriano que la bsqueda de diferencias en las se-
cuencias [Lee et al., 2001]. En este trabajo la IS1405 se
emple como sonda en un anlisis por RFLP, lo que
permiti clasificar cepas de raza 1 de Taiwn.
El estudio de la diversidad gentica entre las cepas de
R. solanacearum no solo permiti conocer ms clara-
mente las relaciones filogenticas y evolutivas entre
ellas, sino que proporcionaron nuevas herramientas
para el esclarecimiento de numerosas interrogantes
como la posible correlacin entre diversidad gentica y
la virulencia de las cepas [Darrase et al., 1998].
CONCLUSIONES
Los mtodos de estudio de la diversidad gentica de
R. solanacearum se han desarrollado vertiginosamen-
te desde finales del pasado siglo a partir de los estu-
dios preliminares realizados en este campo, los que
lograron suministrar un sistema de clasificacin con
el empleo del RFLP que fue de gran utilidad para
estudios posteriores.
El sistema de clasificacin se ha corroborado por los
resultados de otros investigadores, y se ha enrique-
cido en el transcurso de los aos con la definicin de
nuevas subdivisiones.
Los mtodos moleculares para la caracterizacin
gentica han probado ser imprescindibles, reflejado
en su amplia adopcin por diversos grupos de inves-
tigacin y los resultados promisorios de su empleo.
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fitosanidad/305
PRIMER REGISTRO DE CECIDMIDO ASOCIADO A SNTOMAS
DE ROYA EN PLANTAS MEDICINALES EN CUBA
Marlene M. Veita Rubio, Vctor M. Garca Infante, Danay Lpez Manes y Mara O. Lpez Mesa
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B y 5.
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F, Playa, Ciudad
En los cultivos de plantas medicinales como tilo (Justi-
cia pectoralis Jacq.), calndula (Calendula officinalis L.)
y verbena cimarrona (Stachytarpheta jamaicensis (L.)
Vahl.) se asocian numerosos patgenos fngicos, entre
los cuales estn los que ocasionan el sntoma denomi-
nado roya.
En Cuba se informa sobre tilo a Puccinia sp. [Fornet y
Gutirrez, 1984] y Puccinia justiciae, del cual se des-
criben sus sntomas, as como su importancia en las
condiciones de la Granja Estatal de Plantas Medicina-
les en Alquzar [Veita et al., 2003]. En calndula se ha
registrado a Puccinia melampodii Diet. & How. en Cuba
[Acosta, 1995] y en el resto del mundo [Farr et al., 1995].
En verbena cimarrona es de importancia Puccinia
urbaniana P. Henn. por el nmero de reas donde se
presenta y los sntomas que provoca en las condiciones
del pas [Veita et al., 2003]. Con anterioridad se regis-
tr en este cultivo por Secades et al. (1989), quienes
describen sus sntomas. Acosta (1995) lo menciona como
un patgeno de importancia porque sus daos intensos
los causa en el follaje y los tallos, que son las partes
utilizadas para fines medicinales.
En colectas realizadas en reas de produccin de plan-
tas medicinales y en patios particulares en los munici-
pios de Alquzar y San Antonio de los Baos, en la
provincia de La Habana, y en la de Cienfuegos, se en-
contr en la mayora de las ocasiones las larvas de un
cecidmido (Diptera: Cecidomyiidae) cuando se alimen-
taba de las pstulas ocasionadas por especies de
Puccinia (Fig. 1).
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Figura 1. Larvas de cecidmido asociado a pstulas de roya (Puccinia urbaniana) en
verbena cimarrona (Stachytarpheta jamaicensis).
Veita y otros
306/fitosanidad
En ms del 50% de las observaciones efectuadas para
este trabajo, la alta poblacin de larvas coincidi con la
elevada infestacin por roya (Tabla 1). En verbena ci-
marrona se encontraron hasta nueve larvas asociadas a
los sntomas y de una a tres por pstula en tilo.
Segn Alayo y Garcs (1989), en Cuba se mencionan las
especies Neolasioptera Felt, Ctenodactylomyia Felt,
Bruggmannia Tavares, Johnsonomyia Felt, Meinertomyia
Felt y Retinodiplosis Keiffer, aunque no se descarta la
presencia de otras especies en el resto de las Antillas.
Nieves-Aldrey (1998) refiere que los cecidmidos com-
prenden especies micfagas y zofagas. Asimismo
Barranco (2003) menciona especies de cecidmidos que
viven en asociacin con ciertos hongos.
Tabla 1. Localidades donde se detect la presencia de cecidmido asociado a pstulas de roya
Lugar Cultivo Ocurrencia
Roya Cecidmido
Tilo +++ ++ Granja Estatal de Plantas
Medicinales Valle Grande, en
Alquzar
Calndula + +
Tilo + Divisin Experimental del
Instituto de Investigaciones de
Sanidad Vegetal
Verbena cimarrona +++ ++
Patio en Guanmar, Alquzar Verbena cimarrona +++ ++
Tilo (en parcelas) ++ +
Tilo (en vivero a la sombra) +++ ++
Estacin Experimental de Plantas
Medicinales Dr. J. T. Roig, en San
Antonio de los Baos
Verbena cimarrona (en vivero a la
sombra)
+
Huerto de plantas medicinales del
Instituto Politcnico Agropecuario
O. Jimnez, en Lajas, Cienfuegos
Verbena cimarrona +++ ++

Leyenda para poblacin de cecidmido:
No se observan larvas.
+ Se observa una larva en una mancha por hoja.
++ Se observa ms de una larva en varias manchas por hoja.
Leyenda para infestacin por roya:
+ Ligera incidencia de roya en algunas plantas en el campo.
++ Incidencia media: plantas con ms del 25% y hasta el 50% del follaje con sntomas.
+++ Incidencia alta de plantas con ms del 50% del follaje con sntomas de roya.

REFERENCIAS
Acosta, L.: Proporcinese salud: cultive plantas medicinales,
Ed. Cientfico-Tcnica, La Habana, 1995.
Alayo, P.; G. Garcs: Introduccin al estudio del orden Diptera en
Cuba, Ed. Oriente, Santiago de Cuba, 1989.
Barranco, P. V.: Dpteros de inters agronmico. Agromcidos plaga
de cultivos hortcolas intensivos, Bol. SEA 33: 293-307, 2003. Dis-
ponible en http://entomologia.rediris.es/aracnet/e2/11/21/
Farr, D. F.; G. F. Bills; G. P. Chamuris; A. Y. Rossman: Fungi on Plants and
Plants Products in the United States, APS Press, St. Paul, Minn., EE.UU.,
1995.
Fornet, E.; C. Gutirrez: Sobre la micoflora de plantas medicinales II,
revista Plantas Medicinales 4:10-13, Cuba, 1984.
Nieves-Aldrey, J. L. Insectos que inducen la formacin de agallas en
las plantas: una fascinante interaccin ecolgica y evolutiva, Bole-
tn SEA 23:3-12, 1998.
Secades, M.; C. Gutirrez; I. de la Osa; M. Martnez: Hongos patgenos en
plantas medicinales IV, Revista Cubana de Farmacia 23 (1-2):173-177,
enero-agosto, 1989.
Veita, M. et al.: Incidencia, comportamiento y control de plagas en los
cultivos de calndula (Calendula officinalis L.), tilo (Justicia pectoralis)
y verbena (Staquitarpheta jamaicensis). Informe Final de Proyecto,
Divisin Experimental del INISAV, Alquzar, La Habana, enero del 2003.
fitosanidad/307
OBSERVACIONES SOBRE ENEMIGOS NATURALES DE LA BROCA
DEL CAF (HYPOTHENEMUS HAMPEI FERRARI) EN CUBA
Luis L. Vzquez Moreno,
1
Eleazar Blanco Jimnez,
2
Orestes Elsegui Claro,
1
Yaril Matienzo Brito
1
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Janet Alfonso Simonetti
1
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B y 5.
a
F, Playa, Ciudad
2
Instituto de Ecologa y Sistemtica. Carretera de Varona Km 3, Capdevila, Boyeros, AP 8029, Ciudad
La broca del caf (Hypothenemus hampei Ferrari)
(Coleoptera: Scolytidae) est considerada como una de
las principales plagas del cultivo del cafeto en el mundo
[Le Pelley, 1968; Baker, 1999] debido a los daos direc-
tos que ocasiona al fruto de esta planta, el nivel tan
elevado de sus poblaciones, las dificultades para reali-
zar un control eficiente y las limitaciones para la
comercializacin del caf afectado, entre otras [Jaramillo
et al., 2006].
En frica, regin de origen de H. hampei, se han estu-
diado diversas especies de enemigos naturales, las que
se han utilizado exitosamente en programas de control
biolgico clsico en otras regiones del mundo, princi-
palmente los parasitoides Cephalonomia stephanoderis
Betrem (Hymenoptera: Bethylidae), Heterospilus
coffeicola Schenedeken (Hymenoptera: Braconidae),
Phymastichus coffea La Salle (Hymenoptera: Eulo-
phidae) y el hongo entomopatgeno Beauveria basiana
(Balsamo) Vuillemin (Hyphomycetes: Moniliales), en-
tre otros [Baker, 1999; Vega et al., 1999].
Con el propsito de conocer la ocurrencia de enemigos
naturales en poblaciones de H. hampei bajo las condi-
ciones de cafetales en Cuba, se realizaron observaciones
en frutos perforados en las localidades de Buey Arriba,
Granma (agosto de 1998), Trinidad, Sancti Spritus (fe-
brero del 2006) y Baha Honda, Pinar del Ro (2005, 2006).
Como entomopatgeno solamente se observ a B. bassia-
na (Fig. 1) que se haba detectado anteriormente como
causante de una epizootia en Buey Arriba, Granma
[Mario Garca, comunicacin personal]. Posteriormen-
te esta patologa se ha manifestado en todos los muni-
cipios cafetaleros del pas, entre uno y tres aos des-
pus de la deteccin de H. hampei en esos territorios.
En observaciones realizadas en campos de cafeto donde
se manifestaba esta epizootia en Baha Honda, en Pinar
del Ro, se pudo comprobar que los campos donde exis-
ta sombra de rboles de mayor porte y mixta (Theobroma
cacao, Citrus spp., Mangifera indica, Musa spp. y otros),
la enfermedad se manifestaba ms intensa y prolonga-
da, en comparacin con los campos donde la sombra era
de menor porte y de una especie (Gliricidia sepium).
La epizootia por este hongo entomopatgeno se ha ob-
servado igualmente en otros pases cafetaleros como
Mxico [Barrera et al., 1990] y Colombia [Bustillo et
al., 1998; 2002], entre otros, donde se refiere que su
manifestacin es de forma variada en los diferentes aos,
la que depende de las condiciones climticas. Se consi-
dera que varios aos despus de su introduccin en
Colombia, es el principal factor de mortalidad natural
de H. hampei.
Como predadores, los ms comunes han sido las hor-
migas Pheidole megacephala (F.), Wasmania auropunctata
Roger, Solenopsis geminata (F.) y Pseudomyrmex sp.
(Hymenoptera: Formicidae), insectos que se introdu-
cen en las perforaciones en la etapa en que predominan
los estados inmaduros de la broca, los que devora, y en
muchos casos realizan sus nidos en el interior del fruto,
donde adems come sus partes, que estn necrosadas o
donde crecen hongos saprfitos.
Otros predadores que se han encontrado en muy bajas
poblaciones han sido Laemophloeus sp. (Coleoptera:
Laemophloeidae) y Cathartus sp. (Coleoptera: Cucuji-
dae), cuyas larvas devoran los huevos y las larvas del
primer estadio de H. hampei, principalmente las que
habitan en frutos donde existen altas poblaciones de la
plaga y en etapas finales del perodo de fructificacin.
Vzquez y otros
308/fitosanidad
Tambin se realiz un hallazgo de una chinchita
predadora de la familia Anthocoridae (Hemiptera), la
que al parecer picaba y chupaba la hemolinfa de las
larvas de H. hampei, pues estas se observaron defor-
mes y muertas en el interior de las perforaciones.
Estos son los primeros informes de tales enemigos na-
turales de H. hampei bajo las condiciones de Cuba, y
sobre los cuales existen algunos antecedentes en otros
pases, pues Vega et al. (1999) refiri hallazgos de varias
especies de estas familias en Togo y Costa de Ivore en
frica, pero sin atribuirle importancia en la regulacin
de las poblaciones de esta plaga en esa regin.
Igualmente en Colombia, Bustillo et al. (2002) encon-
traron hormigas de los gneros Solenopsis, Pheidole,
Wasmannia, Paratrechina, Crematogaster, Brachymyrmex
y Prenolepis, as como el cucjido Cathartus quadricollis
(Gurin-Mneville) y un antocrido no identificado,
asociados a perforaciones de H. hampei, los que obser-
varon con actividad como predadores de inmaduros.
En la bsqueda de la posible existencia de parasitoides,
en 1998 se hallaron cuatro especies de las familias
Bethylidae y Encyrtidae (Hymenoptera) que emer-
gieron de frutos donde haba adultos e inmaduros de
H. hampei en plantaciones de Buey Arriba, Granma.
Aunque estos parasitoides no se lograron identificar,
pueden ser nuevas especies de enemigos naturales de
Figura 1. Corte de un fruto de caf donde se aprecia la
hembra adulta de H. hampei infectada con B. bassiana.
otras especies de Hypothenemus, que habitan en los
ecosistemas donde se cultiva cafeto en el pas.
De la familia Encyrtidae se ha descubierto a Coccidoc-
tonus sp. en Togo y un Anagyrini en Costa de Ivore, mien-
tras que de la familia Bethylidae hay informes en frica
de parasitoides de los gneros Prorops, Cephalonomia y
Goniozus, los dos primeros utilizados en programas de
control biolgico clsico [Vega et al., 1999].
REFERENCIAS
Baker, P. S.: La broca del caf en Colombia. Informe Final del Proyec-
to MIP para el caf DFID-CENICAFE-CABI BIOSCIENCE (CNTR 93/
1536A), Chinchin, Colombia, 1999.
Barrera, J. F.; D. Moore; Y. J. Abraham; S. T. Murphy; C. Prior: Biological
Control of the Coffee Berry Borer, Hypothenemus hampei, in Mexico
and Possibilities for Further Action, Brighton Crop Protection Conf.
Pests and Diseases, 1990, pp. 391-396.
Bustillo, A. E.; R. Crdenas; D. Villalba; P. Benavides; J. Orozco; F. J.
Posada: Manejo integrado de la broca del caf, Hypothenemus
hampei (Ferrari) en Colombia, Chinchin, Cenicaf, 1998.
Bustillo, A.; R. Crdenas; F. J. Posada: Natural Enemies and Competitors
of Hypothenemus hampei (Ferrari) (Coleoptera: Scolytidae) in Co-
lombia, Neotropical Entomology 31(4):635-639, Oct./Dec. 2002.
Jaramillo, J.; C. Borgemeister; P. Baker: Coffee Berry Borer
Hypothenemus hampei (Coleoptera: Curculionidae): Searching for
Sustainable Control Strategies, Bulletin of Entomological Research.
96 (3):223-233, 2006.
Le Pelley, R. H.: Pests of Coffee, Longmans, Londres, 1968.
Vega, F. E.; G. Mercadier; A. Damon; A. Kirt: Natural Enemies of the
Coffee Berry Borer, Hypothenemus hampei (Ferrari) (Coleoptera:
Scolytidae) in Togo and Cote d Ivoire and Other Insects Associated
with Coffee Beans, African Entomology 7 (2):243-248, 1999.
fitosanidad/309
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DIAGNSTICO Y SANEAMIENTO DEL VIRUS DASHEEN
MOSAIC EN MALANGA (XANTHOSOMA SPP. Y COLOCASIA
ESCULENTA (L.) SCHOTT)
Janet Igarza Castro
Laboratorio de Biotecnologa Vegetal. Centro de Investigaciones y Servicios Ambientales y Tecnolgicos
del CITMA. Carretera a Mayabe, Jardn Botnico, Holgun, Cuba
Tesis presentada en opcin al grado acadmico de Mster en Biotecnologa Vegetal.
El cultivo de la malanga es de gran importancia econmi-
ca en nuestro pas. La propagacin acelerada por vas
biotecnolgicas de clones de inters comercial es uno de
los principales retos en la agricultura, pero este cultivo se
ha visto afectado por la enfermedad viral conocida como
Dasheen Mosaic Virus (DMV), lo que disminuye los ren-
dimientos. Para la obtencin de plantas libres del virus se
aplican tcnicas de saneamiento y se confirman con otras
de diagnstico, por lo que en esta investigacin se compa-
ran distintas tcnicas para la eliminacin de virus como
son la extraccin de meristemos, la termoterapia, la
electroterapia y la quimioterapia en los clones Mxico 8 y
Camern 14, para conocer su efectividad en la obtencin
de plantas libres al DMV, y se confirman con la utiliza-
cin de diagnsticos de alta sensibilidad.
Los resultados permitieron confirmar la efectividad
de la electroterapia 5 y 10 vol/5 min y la quimiotera-
pia 3 mg/L. El diagnstico inmunoqumico utilizado,
con grandes ventajas sobre otros tipos de anlisis, tie-
ne un lmite de sensibilidad que puede permitir el esca-
pe de material enfermo; pero con la introduccin de
tcnicas moleculares se pueden detectar concentracio-
nes virales nfimas en vitroplantas sanas. En la pre-
sente investigacin se realiza la deteccin del DMV por
RT-PCR, la cual servir de base para la aplicacin fu-
tura de una tcnica confirmativa de mayor sensibili-
dad durante el saneamiento. Finalmente se propone una
metodologa de diagnstico y saneamiento al DMV que
permite la introduccin de lneas puras en biofbricas
para su propagacin en campo.
310/fitosanidad
COMPORTAMIENTO Y CONTROL DE LA ENFERMEDAD TIZN
DE FUEGO CAUSADA POR EL HONGO CORYNESPORA
CASSIICOLA (BERK. & CURT.) WEI. EN EL CULTIVO DEL PEPINO
(CUCUMIS SATIVUS L.) EN SISTEMAS DE ORGANOPNICOS
EN LA PROVINCIA DE CAMAGEY Y SU RELACIN
CON OTROS PATGENOS FNGICOS PRESENTES EN EL CULTIVO
Laboratorio Provincial de Sanidad Vegetal. Ave Finlay Km 2 e/ Planta de Nitrgeno y Circunvalacin
Norte, Reparto Puerto Prncipe, Camagey, Cuba, sanivecm@enet.cu
Tesis en opcin al grado acadmico de Mster en Hortalizas.
La necesidad de implementar un sistema de manejo de
la enfermedad tizn de fuego del pepino, causado por el
hongo Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei. den-
tro de una agricultura sostenible, implica la bsqueda
del conocimiento de aspectos relacionados con la inci-
dencia, comportamiento y control que permitan trazar
estrategias en la solucin de esta problemtica. Se rea-
lizaron investigaciones para determinar la importancia
de C. cassiicola en comparacin con otros patgenos
fngicos presentes en el cultivo, su comportamiento y
control en los organopnicos de la Empresa de Cultivos
Varios de Camagey y en el Laboratorio Provincial de
Sanidad Vegetal durante el perodo 2001 a 2003. Se de-
termin que los hongos causantes de afectaciones en
este cultivo son Pseudoperonospora cubensis (Berk. &
Curt.) Rostow con 10%, Collectotrichum lagenarium
(Pass.) Ell & Halst y Alternaria cucumerina (Ell. & Ev.)
S. A. Elliott con 1% cada uno, y C. cassIicola como el
de mayor importancia con 100% de incidencia y afec-
taciones de 85%. Su comportamiento se caracteriz por
la permanencia durante todo el ciclo del cultivo con un
incremento a medida que avanza la edad fenolgica de
la plantacin, aspecto estrechamente relacionado con los
cambios climticos dentro de los cuales el efecto de la tem-
peratura mxima entre 28 y 30
o
C, y la humedad relativa
media superior a 80% resultaron favorables para el desa-
rrollo de esta enfermedad. El crecimiento micelial y la
esporulacin del hongo en condiciones in vitro coinciden
con temperaturas de 30
o
C. La mayor circulacin y distri-
bucin de los conidios en condiciones naturales se observa
a las diez de la maana. Los ensayos de sensibilidad de
C. cassiicola ante diferentes productos fungicidas en con-
diciones de laboratorio y campo arrojaron mejores resul-
tados de inhibicin del crecimiento de las colonias y del
control de la enfermedad con mancozeb PH 80% y
benomyl PH 80% a 5 ppm y 2 kg/ha i. a. El control biol-
gico con Trichoderma harzianum R. (cepa A-34) a dosis de
10 kg/ha y del producto natural hidrato de cal a dosis de
5 kg/ha en tratamientos foliares, alcanzaron eficacias de
42 y 47% respectivamente, e incrementaron los rendimien-
tos en 50%. Todos estos resultados fueron utilizados en la
elaboracin de estrategias de control de la enfermedad con
vistas a su inclusin en un esquema de manejo integrado
para el control de C. cassiicola en el cultivo del pepino.

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