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Contenido

Diagnóstico fitosanitario

Detección de βββββ-exotoxina por HPLC en cepas nativas de Bacillus thuringiensis por HPLC Yamilé Baró Robaina, Cecilia Linares Jiménez y Gonzalo Dieksmeier Corcuera

255

Diagnóstico de fitonematodos en suelos de cultivos frutales Raúl Hernández Hernández, Gladis del Vallín y Doris Hernández

261

Aislamiento, identificación y caracterización morfométrica de aislados nativos de hongos mitospóricos nativos con potencialidad para el control de especies de insectos plaga Orestes Elósegui Claro, Jesús Jiménez Ramos y Aidanet Carr Pérez

265

 

Ecología

Dispersión, distribución actual y nuevos reservorios de Frankliniella schultzei Trybom (Thysanoptera: Thripidae) en Cuba Santiago F. Jiménez Jiménez, Liuva Pérez López, Martha Toro, Criseida Granda, Amelia Mateo, Héctor Sariol, Elisa Rodríguez, Rodney Pérez, Roquelina Jiménez, Ángel Pérez-Alejo y Ransés Vázquez

273

Variabilidad de las isoenzimas esterasas de Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin María E. Estrada Martínez y Dolores Piñón Gómez

279

Control biológico

Un medio simplificado a base de soya más azúcar turbinada de caña para la producción del hongo acaropatógeno Hirsutella nodulosa Petch en fase líquida Reinaldo I. Cabrera, Marlén Vega y Litzy Ayra

285

Estudio del efecto protector de Bacillus spp. sobre el desarrollo de la pudrición blanda de la papa (Solanum tuberosum L.) Yaritza Reinoso Pozo, Luis Casadesús Romero, Armando García Suárez, Ernesto García Pérez

289

y

Victoria Pazos Álvarez-Rivera

Producción de biomasa de Trichoderma harzianum por fermentación líquida Rosaima García, María A. Durán y Ramón Riera

295

 

Reseña

Caracterización de Ralstonia solanacearum a través del estudio de su diversidad genética Yelaine Tejeda Gómez

299

Comunicación corta

Primer registro de cecidómido asociado a síntomas de roya en plantas medicinales en Cuba Marlene M. Veitía Rubio, Víctor M. García Infante, Danay López Manes y María O. López Mesa

305

Observaciones sobre enemigos naturales de la broca del café (Hypothenemus hampei Ferrari) en Cuba Luis L. Vázquez Moreno, Eleazar Blanco Jiménez, Orestes Elósegui Claro, Yaril Matienzo Brito

307

y

Janet Alfonso Simonetti

Resumen de tesis

 

Diagnóstico y saneamiento del Virus Dasheen Mosaic en malanga (Xanthosoma spp. y Colocasia esculenta (L.) Schott) Janet Igarza Castro

309

Comportamiento y control de la enfermedad tizón de fuego causada por el hongo Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei. en el cultivo del pepino (Cucumis sativus L.) en sistemas de organopónicos en la provincia de Camagüey y su relación con otros patógenos fúngicos presentes en el cultivo Carlos A. Ferrer González

310

Contents

Phytosanitary diagnosis

Detection of βββββ-Exotoxin by HPLC in Native Strains of Bacillus thuringiensis Yamilé Baró Robaina, Cecilia Linares Jiménez and Gonzalo Dieksmeier Corcuera

255

Phytonematodes Diagnosis on Fruit Crop Soils Raúl Hernández Hernández, Gladis del Vallín and Doris Hernández

261

Isolation, Identification and Morphometric Characterization of Native Mitosporic Fungi with Potential for the Control of Pest Insects Species Orestes Elósegui Claro, Jesús Jiménez Ramos and Aidanet Carr Pérez

265

Ecology

Dispersion, Present Distribution and New Reservoirs of Frankliniella schultzei Trybom (Thysanoptera: Thripidae) in Cuba Santiago F. Jiménez Jiménez, Liuva Pérez López, Martha Toro, Criseida Granda, Amelia Mateo, Héctor Sariol, Elisa Rodríguez, Rodney Pérez, Roquelina Jiménez, Ángel Pérez-Alejo and Ransés Vázquez

273

Variability of Esterase Isoenzymes from Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin María E. Estrada Martínez and Dolores Piñón Gómez

279

Biological control

A Simplified Medium Based on Soy and Unrefined Sugar Cane for Liquid Phase Production of Fungus Hirsutella nodulosa Petch Pathogen to Mites Reinaldo I. Cabrera, Marlén Vega and Litzy Ayra

285

Study of Protective Effect of Bacillus spp. on the Development of Potato Soft Rot (Solanum tuberosum L.) Yaritza Reinoso Pozo, Luis Casadesús Romero, Armando García Suárez, Ernesto García Pérez and Victoria Pazos Álvarez-Rivera

289

Production of Trichoderma harzianum Biomass by Liquid Fermentation Rosaima García, María A. Durán and Ramón Riera

295

Review

Caracterization of Ralstonia solanacearum by the Study of its Genetic Diversity Yelaine Tejeda Gómez

299

Short communication

First Record of Cecidomide Associate with Rust Symptoms in Cuban Medicinally Plants Marlene M. Veitía Rubio, Víctor M. García Infante, Danay López Manes and María O. López Mesa

305

Observations on Natural Enemies of Coffee Berry Borer (Hypothenemus hampei Ferrari) in Cuba Luis L. Vázquez Moreno, Eleazar Blanco Jiménez, Orestes Elósegui Claro, Yaril Matienzo Brit and Janet Alfonso Simonetti

307

Thesis abstract

Diagnostic and Sanitation of Dasheen Mosaic Virus in Xanthosoma spp. and Colocasia esculenta (L.) Schott Janet Igarza Castro

309

Behavior and Control of Fire Blight Disease Caused by Fungus Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei. in Cucumber Crop (Cucumis sativus L.) in Organoponic Systems of Camagüey Province and its Relation with others Fungi Pathogens Present in the Crop Carlos A. Ferrer González

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FITOSANIDAD vol. 10, no. 4, diciembre 2006

Diagnóstico fitosanitario

DETECCIÓN DE βββββ-EXOTOXINA EN CEPAS NATIVAS DE BACILLUS THURINGIENSIS POR HPLC

Yamilé Baró Robaina, Cecilia Linares Jiménez y Gonzalo Dieksmeier Corcuera

Instituto de Investigaciones de Sanidad Vegetal. Calle 110 no. 514 e/ 5. a B y 5. a F, Playa, Ciudad de La Habana, CP 11600, ybaro@inisav.cu

RESUMEN

Se analizó por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) la presencia de β-exotoxina en nueve cepas de Bacillus thuringiensis, pertenecientes a la colección del Instituto de Investigaciones de Sanidad Vegetal. La concentración de β-exotoxina en el patrón fue de 25 µg.mL 1 , y en el producto comercial empleado como control positivo fue de 6 µg.mL 1 . En las cepas evaluadas solo la LBT9 y LBT47 mostraron la presencia de este metabolito a concentraciones de 34 y 4,5 µg.mL 1 respectivamente.

Palabras claves: Bacillus thuringiensis, β-exotoxina, cromatografía líquida (HPLC), detección

ABSTRACT

The presence of β-exotoxin in nine Bacillus thuringiensis strains belonging to Plant Health Research Institute collection was analyzed by high performance liquid chromatography (HPLC). β-exotoxin concentration in the standard was 25 µg.mL -1 , and in a commercial product, used as positive control, was 6 µg.mL -1 . β-exotoxin was only detected in LBT9 with 34 µg.mL -1 and LBT47 with 4.5 µg.mL -1 , among the strains proved.

Key words: Bacillus thuringiensis, β-exotoxin, liquid chromatography (HPLC), detection

INTRODUCCIÓN

Algunas cepas de Bacillus thuringiensis producen ade- más de la δ-endotoxinas o proteínas Cry una exotoxina termoestable denominada β-exotoxina, la cual se se- creta al medio de cultivo al inicio del proceso de esporulación. Esta molécula es un análogo nucleotídico de ADN con un peso molecular de 701 Da y se le atri- buye acción insecticida contra diferentes órdenes de insectos como Lepidópteros, Dípteros, Coleópteros, Hemípteros, además de ácaros, nematodos, proto- zoarios y platelmintos [Hernández et al., 2003].

Diversos métodos como la cromatografía de intercam- bio iónico, electroforesis capilar, ELISA y la croma- tografía líquida de alta resolución (HPLC) se han des- crito para la determinación de la β-exotoxina, como alternativas al bioensayo tradicional con Musca domes- tica, el cual resulta más trabajoso, prolongado en el tiempo y presenta algunas limitaciones como estima- ciones inexactas de la potencia de la toxina impura y

poca reproducibilidad. De todos estos métodos la RP- HPLC se emplea más frecuentemente para la detección y cuantificación de este metabolito [Gohar y Perchat, 2001].

El presente trabajo tuvo como objetivo detectar y cuan- tificar la presencia de la β-exotoxina en nueve cepas cubanas de Bacillus thuringiensis.

MATERIALES Y MÉTODOS

Como material biológico se emplearon nueve cepas de B. thuringiensis pertenecientes a la colección del Insti- tuto de Investigaciones de Sanidad Vegetal, las cuales se seleccionaron de acuerdo con su serotipo flagelar, y la toxicidad exhibida en el sobrenadante del cultivo este- rilizado a 121ºC frente a un grupo de organismos plaga (Tabla 1).

El estándar de β-exotoxina I lo suministró el doctor Jorge Ibarra (Laboratorio de Bioinsecticidas del Centro de

fitosanidad/255

Baró y otros

Investigación y Estudios Avanzados del Instituto Poli- técnico Nacional de México), obtenido a partir de la cepa HD2 Berliner Bacillus thuringiensis var. thuringiensis. La concentración final de la solución de β-exotoxina I inyectada en el HPLC fue de 25 µg.mL 1 . Como control positivo se utilizó un producto comercial ruso que contiene β-exotoxina, producido a partir de una cepa de B. thuringiensis var. thuringiensis, y como control negativo se tomó la cepa HD1, estándar inter- nacional de B. thuringiensis que no produce β-exotoxina.

Tabla 1. Serotipos de las cepas en estudio [Fernández-Larrea, 1999]

Cepas

Serotipo

LBT-4

kenyae (H4)

LBT-5

thuringiensis (H1)

LBT-7

kenyae (H4)

LBT-9

thuringiensis (H1)

LBT-12

thuringiensis (H1)

LBT-13

no determinado

LBT-16

thuringiensis (H1)

LBT-25

israelensis (H14)

LBT-47

no determinado

Las cepas se cultivaron en medio caldo triptona soya, en zaranda orbital a 150 r.min 1 a una temperatura de crecimiento de 30ºC durante 48 h hasta que se comple- tó el proceso de esporulación.

Una vez transcurrido el tiempo de incubación el cultivo se centrifugó 10 000 r.min 1 en centrifuga refrigerada durante 20 min. El precipitado se descartó y el sobrenadante se trató en autoclave a 121ºC durante 15 min. El pH de las muestras se ajustó a 3 con ácido fosfórico 85%. El sobrenadante se clarificó por centrifugación a 10 000 r.min 1 y se guardó a –20ºC hasta su uso.

El proceso de separación se realizó según Levinson et al. (1990), para lo que se utilizó una columna LiChros- pher RP-18 de fase reversa. La corrida se efectúo a 30ºC en 50 milimoles.L 1 de KH 2 PO 4 (pH 3) a una velocidad de flujo de 2 mL.min 1 , con detección a 260 nm. El vo- lumen de inyección fue de 100 µL. Se empleó un detec- tor UV, inyector Rheodyne 7725i, bomba water 0,01A. Para el análisis de los cromatogramas se utilizó el soft- ware EZChrom versión 6.8.

Con el objetivo de evaluar si la β-exotoxina se elimina- ba durante el procesamiento de la muestra, se adicio-

naron 100 µL de β-exotoxina estándar a la cepa LBT5 de B. thuringiensis una vez iniciado el crecimiento del microorganismo y concluido su desarrollo. La croma- tografía se desarrolló en las condiciones descritas ante- riormente.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Según los cromatogramas obtenidos en la detección de β-exotoxina para las cepas en estudio, se observó el pico correspondiente al patrón de β-exotoxina estándar a una concentración de 25 µg.mL 1 (Fig. 1(A)). El pico que se observa en la muestra patrón apareció a un tiem- po de retención de 11,33 min. El mismo pico apareció en la muestra correspondiente al producto comercial ruso a base de β-exotoxina, cepa utilizada como testigo positivo. Su concentración fue de 6 µg.mL 1 (Fig. 1(B)). La exotoxina no se detectó en la cepa HD1 estándar internacional de B. thuringiensis var. kurstaki (Fig. 2), la cual no produce esa exotoxina [Galán et al., 1994; Glare y Callaghan, 2000].

En el resto de las cepas en estudio, solo se observó el pico correspondiente a la β-exotoxina en las cepas LBT9 (Fig. 3(A)) y LBT47 (Fig. 3(B)). Los niveles de pro- ducción del metabolito en estas cepas fueron de 34 y 4,5 µg.mL 1 respectivamente. En la cepa LBT7 tam- bién se observó la presencia de un pico que pudiera co- rresponder a la β-exotoxina, ya que presenta uno simi- lar al del patrón y un tiempo de retención muy cercano.

Las cepas evaluadas presentan serotipos que están infor- mados en la literatura como productores de la β-exo- toxina [Galán et al., 1994; Glare y Callaghan, 2000]; sin embargo, estos resultados reafirman lo obtenido por Levinson et al. (1990) y Hernández y Ferré (2001), los cuales mostraron que la producción de la exotoxina termoestable es más una propiedad específica de la cepa de B. thuringiensis que una propiedad serotipo especí- fica. Se ha probado además que su presencia en una cepa en particular no implica la producción de la exo- toxina por otras cepas pertenecientes al mismo se- rovar.

Aunque los estudios que relacionan la producción de la β-exotoxina y el tipo de serovar que presenta la cepa de B. thuringiensis son muy escasos, y en la mayoría de ellos se incluyen muy pocas cepas, algunos autores plan- tean que la producción de β-exotoxina está limitada a ciertos serotipos flagelares presentes en las cepas de B. thuringiensis [Hernández y Ferré, 2001].

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Detección de β-exotoxina en cepas

Detección de β -exotoxina en cepas Figura 1. Cromatogramas obtenidos para el patrón de β -exotoxina

Figura 1. Cromatogramas obtenidos para el patrón de β-exotoxina (25 µg.mL 1 ) (A) y para el producto comercial (6 µg.mL 1 ) (control positivo) (B). Columna LiChrospher RP-18, 5 mm (250 x 4,6 mm), flujo 2 mL.min 1 , λ 260 nm, volumen de inyección 100 µL, fase móvil KH 2 PO 4 , pH 3,0.

inyección 100 µL, fase móvil KH 2 PO 4 , pH 3,0. Figura 2 . Cromatograma

Figura 2. Cromatograma obtenido por HPLC para la cepa HD1 (control negativo). Columna LiChrospher RP-18, 5 mm (250 x 4,6 mm), flujo 2 mL.min 1 , λ 260nm, volumen de inyección 100 µL, fase móvil KH 2 PO 4 , pH 3,0.

100 µ L, fase móvil KH 2 PO 4 , pH 3,0. Figura 3. Cromatogramas obtenidos

Figura 3. Cromatogramas obtenidos por HPLC para las cepas LBT9 34 µg.mL 1 (A) y LBT47 4,5 µg.mL 1 (B). Columna LiChrospher RP-18, 5 mm (250 x 4,6 mm), flujo 2 mL.min 1 , λ 260 nm, volumen de inyección 100 µL, fase móvil KH 2 PO 4 , pH 3,0.

fitosanidad/257

Baró y otros

La clasificación de las cepas de B. thuringiensis en serovares se desarrolló sobre la base de los antígenos flagelares; sin embargo, las bases genéticas y bioquímicas del sistema de antígenos flagelares aún son desconocidas. Esto hace especialmente difícil encontrar una relación di- recta entre los genes determinantes del serovar y otros genes en B. thuringiensis, como los que determinan la sín- tesis de β-exotoxina [Hernández et al., 2003]. En este es- tudio no fue posible establecer esta relación debido a que se emplearon muy pocas cepas, y las dos que resultaron positivas pertenecen a serotipos diferentes.

En estudios previos realizados en el Instituto de Inves- tigaciones de Sanidad Vegetal se demostró que el sobrenadante de cultivos obtenidos a partir de las ce- pas estudiadas en este trabajo, y esterilizado a 121ºC, presentaron actividad tóxica contra un grupo de orga- nismos plaga como ácaros y nematodos [Márquez et al., 1999; 2003]; sin embargo, resulta interesante destacar que no pudo observarse en cada una de ellas el pico correspondiente a la β-exotoxina. Estos resultados pu- dieran tener explicación con lo afirmado por Levinson et al. (1990) en cuanto a que los patrones de aparición de la exotoxina termoestable sugieren que puede estar involucrado solo un único gen. La producción de exotoxina puede ser resultado de una sola reacción enzimática, a partir de moléculas precursoras presen- tes tanto en las cepas Exo + como Exo . Es probable que estos precursores estén involucrados en el control de la transcripción de los genes de la esporulación y no

como sugirieron Johnson y Peterson (1983) en la pro- ducción de la exotoxina, lo que implicaría que la β-exo- toxina no se produzca por todas las cepas de B. thu- ringiensis.

Otra explicación a la no detección del metabolito en las restantes cepas pudo deberse también a niveles de con- centración bajos en el medio de fermentación, a lo cual

se suma la presencia de moléculas contaminantes en la

solución que hace difícil su determinación. Oehler et al. (1982) emplearon una columna C 18 y como fase móvil

H 2 O y ácido trifluoracético; sin embargo, el método no

dio resultado debido a que los contaminantes del sobrenadante del cultivo de B. thuringiensis coeluían con la toxina, lo cual se considera que también pudo ocurrir en los resultados presentes. Debido a esto y a su pequeña masa molecular, la utilización de un méto- do altamente eficiente en el proceso de obtención de la exotoxina constituye un proceso clave para el recobra- do y purificación de la β-exotoxina.

La adición de β-exotoxina estándar durante el proceso de crecimiento de la cepa LBT 5 dio como resultado la presencia del pico correspondiente a la β-exotoxina a con- centraciones de 0,42 µg.mL 1 y 35,8 µg.mL 1 (Figs. 4(A)

y (B)). Esto indica que la β-exotoxina no se pierde du-

rante el proceso de obtención previo a la cromatografía. La adición de β-exotoxina estándar a un grupo de cepas en estudio también la utilizaron Gohar y Perchat (2001) para corroborar la presencia de la toxina. A este proce-

dimiento se le denominó método del testigo externo.

dimiento se le denominó método del testigo externo . Figura 4. Cromatogramas de la cepa LBT5

Figura 4. Cromatogramas de la cepa LBT5 contaminada con β-exotoxina estándar al inicio del cultivo (A) y una vez concluido el procesamiento de la muestra (B). Columna LiChrospher RP-18, 5 mm (250 x 4,6 mm), flujo 2 mL.min 1 , λ 260 nm, volumen de inyección 100 µL, fase móvil KH 2 PO 4 , pH 3,0.

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Detección de β-exotoxina en cepas

Otra explicación a la ausencia del pico típico de la β-exo- toxina en las cepas LBT4, LBT5, LBT7, LBT12, LBT13, LBT16 y LBT25 es la presencia de una segunda exotoxina denominada tipo II, la cual se produce a concen- traciones mucho más bajas que la β-exotoxina tipo I. Este resultado fue corroborado por Levinson et al. (1990) al identificar la β-exotoxina tipo I en un grupo de cepas de B. thuringiensis; sin embargo, no se pudo detectar en una cepa de B. thuringiensis var. morrisoni, que exhibió actividad tóxica en el sobrenadante esterilizado a 121ºC contra Musca domestica, Diabotrica undecimpuntacta y Leptinotarsa decemlinneata. El análisis realizado por es- tos autores dio como resultado la identificación de este nuevo tipo de exotoxina. Esta molécula es menos hidrofóbica y se sugiere que sea un análogo de uracilo de la exotoxina tipo I [Levinson et al., 1990].

La existencia de esta toxina aclaró resultados confusos y contradictorios reportados en la literatura. Igualmente Gohar y Perchat (2001) lograron identificar la exotoxina tipo II al emplear RP-HPLC, pero con la utilización pre- via de precipitación con solventes orgánicos y una cromatografía de intercambio aniónico. Estos autores con- firman que resulta de vital importancia la preparación previa de la muestra para la detección y cuantificación de este metabolito, e indican que una alternativa promisoria sería la utilización de detección fluorescente en lugar de absorción UV, lo que incrementaría ampliamente la sensi- bilidad y la selectividad de la determinación.

CONCLUSIONES

• Se detectó la presencia de β-exotoxina en las cepas LBT9 y LBT47 a concentraciones de 34 µg.mL 1 y 4,5 µg.mL 1 respectivamente.

REFERENCIAS

Fernández-Larrea, O.: «Aislamiento, selección y estudio de cepas de Bacillus thuringiensis para el control fitosanitario». Informe Final PNCT, Biotecnología Agrícola, INISAV, Cuba, 1999.

Galán, W.; K. Arévalo: «Uso de un método sencillo para detección de b- exotoxina en cepas de Bacillus thuringiensis», South Western Entomologist 19 (4):385-390, 1994.

Glare, T.; M. Callaghan: Bacillus thuringiensis: Biology, Ecology and Safety, Eds. John Wiley and Sons, 2000.

Gohar, M.; S. Perchat: «Sample Preparation for b-Exotoxin Determination in Bacillus thuringiensis Cultures by Reversed-Phase High Perfor- mance Liquid Chromatography», Anal. Biochem. 298:112-117, 2001.

Hernández, C.; C. Martínez; H. Porcar; J. Ferré: «Correlation Between Serovars of Bacillus thuringiensis and Type I â-Exotoxin Production», J. Invertebr. Pathol. 82:57-62, 2003.

Hernández, C.; J. Ferré: «Larget-Thiéry Update on the Detection of b- Exotoxin in Bacillus thuringiensis by HPLC Analysis», J. Appl. Microbiol. 90:643-647, 2001.

Johnson, D.; R. Peterson: «Limitations of HPLC for the Detection of b- Exotoxin in Cultures Filtrate of Bacillus thuringiensis», European Journal of Appl. Microbiol. Biotechnol. 17:231-234, 1983.

Levinson, B.; K. Kasyan; S. Chiu; T. Curier; J. González: «Identification of b-Exotoxin Production, Plasmids Encoding b-Exotoxin, and a New Exotoxin in Bacillus thuringiensis by Using High Performance Liquid Chromatographic», J. Bacteriol. 172:3172-3179, 1990.

Márquez, María E.; Orietta Fernández-Larrea; Lérida Almaguel: «Pro- ducción y evaluación de cultivos de Bacillus thuringiensis (Berliner) con efecto acaricida sobre P. latus (Banks.) (Acarina: Tarso- nemidae)», Fitosanidad. 3 (3):53-58, 1999.

Márquez, María E.: «Actividad nematicida de cepas de Bacillus thuringiensis para el control de Meloidogyne incognita en Cuba» Tesis en opción al título académico de Maestro en Microbiología Ge- neral, Universidad de La Habana, 2003.

Oehler, D.; R. Gingrich; M. Haufler: «High Performance Liquid Chromatographic Determination of b-Exotoxin Produced by the Bacterium Bacillus thuringiensis», J. of Agric. Food Chem. 30:407-408, 1982.

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FITOSANIDAD vol. 10, no. 4, diciembre 2006

DIAGNÓSTICO DE FITONEMATODOS EN SUELOS DE CULTIVOS FRUTALES

Raúl Hernández Hernández 1 , Gladis del Vallín 2 y Doris Hernández 2

1 Instituto de Investigaciones de Sanidad Vegetal. Calle 110 no. 514 e/ 5. a B y 5. a F, Playa, Ciudad de La Habana, rhernandez@inisav.cu 2 Instituto de Investigaciones en Fruticultura Tropical. Ave 7. a no. 3005 e/ 30 y 32, Playa, Ciudad de La Habana, CP 11300

RESUMEN

Se diagnosticaron campos agrícolas en fase de presiembra para conocer los principales géneros de nematodos en suelos previamen- te sembrados de piña (Ananas comosus Lin. Merr.), papaya (Carica papaya Lin.), guayaba (Psidium guajava Lin.), aguacate (Persea ame- ricana Lin.), mango (Manguifera indica Lin.) y uva (Vitis vinifera Lin.) de las provincias de Ciudad de La Habana, La Habana, Ciego de Ávila, Matanzas y el municipio especial de Isla de la Juventud. Para la extracción de los nematodos móviles se utilizó el método de Baermann, mientras el índice de infestación del suelo con el nematodo de las agallas se valoró mediante la prueba de la planta indicadora con la contribución de los agricultores. En todas las muestras de suelo y raíces se observaron nematodos parásitos de plantas con diversos niveles de densidad de población. Los géneros detectados con mayor frecuencia fueron Meloidogyne Goeldi (100%), Rotylen- chulus Linford & Oliveira (72%), Helicotylenchus Steiner (33%) y Pratylenchus Filipjev (22%). Las mayores densidades de población se correspondieron con los suelos que anteriormente habían sido cultivados con guayaba.

Palabras claves: Meloidogyne, Rotylenchulus, Helicotylenchus, Pratylenchus, guayaba, piña

ABSTRACT

Pre sowing agricultural fields which were planted with fruits as pineapple (Ananas comosus Lin. Merr.), papaya (Carica papaya Lin.), guava (Psidium guajava Lin.), avocado (Persea americana Lin.), man- go (Manguifera indica Lin.) and grape fruit (Vitis vinifera Lin.) from four provinces of Cuba and especial county Isla de la Juventud, were nematolgically essayed in vitro, to know current status of nematodes main genera. Motile nematodes extraction was achieved by using Baermann method, while root-knot nematodes soil infestation was valorised with indicator plant test and farmers contribution. Different population densities of plant-parasites nematodes were detected in all soil and roots samples. Most frequently nematodes were Meloidogyne Goeldi (100%), Rotylenchulus Linford & Oliveira (72%), Helicotylenchus Steiner (33%) y Pratylenchus Filipjev (22%). Soils before cultivated with guava showed the highest nematode population.

Key words: Meloidogyne, Pratylenchus, Rotylenchulus, Helico- tylenchus, guava, pineapple

INTRODUCCIÓN

En la agricultura cubana actual se incrementa el fo- mento y la diversificación de frutales, pero para lograr cosechas productivas y consistentes es necesario enfren- tarse a las plagas desde el vivero o ya en la plantación. Entre ellas se encuentran los nematodos parásitos que pueden ocasionar pérdidas de rendimiento entre 10 y 30% en los cultivos susceptibles [Fernández, 1991; INIFAP, 2002].

El fruticultor debe valerse del diagnóstico nematológico para conocer el tipo y la cantidad de nematodos en el suelo antes de sembrar o plantar, a fin de adoptar me- didas preemergentes cuando se detectan poblaciones por

encima de los niveles que causan daño económico. Por esa razón el análisis de laboratorio y campo proporcio- na la ventaja de realizar tratamientos al suelo con un ahorro en el costo de la estrategia de manejo [Stirling y Kopittke, 2000]. Además de lo señalado, se deben te- ner en cuenta otros aspectos como la topografía y el drenaje del campo, la eficacia del sistema de riego y la capacitación de los agricultores.

El presente trabajo muestra la situación nematológica de diversos campos de producción de frutales, lo que permite facilitar la aplicación del manejo preventivo de nematodos en los campos evaluados.

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Hernández y otros

MATERIALES Y MÉTODOS

Se realizó un diagnóstico de nematodos en presiembra en suelos que previamente estuvieron sembrados con guayabo, en fincas de los municipios de Alquízar y Bejucal en la provincia de La Habana; con mango y aguacate en el municipio de La Lisa, de Ciudad de La Habana; con piña en Ciego de Ávila, en la propia pro- vincia; con papayo en Jagüey Grande, en Matanzas, y con uva en el municipio especial de Isla de la Juventud.

Para la evaluación se establecieron parcelas entre 0,5 y 1,0 ha/campo, y en sus diagonales se tomaron porcio- nes de suelo de un perfil entre 6 y 30 cm de profundi- dad, con una piocha o pico, y siempre se desechó el sue- lo de los primeros 5 cm; el número de muestras para cada parcela se determinó a partir del producto del va- lor del área por 50, con aproximación por exceso, de acuerdo con la metodología establecida por Fernández (1991). En los puntos donde existía vegetación se ex- trajeron entre 100 y 300 g de raíces que aún no estuvie- ran muertas, marchitas o con ataques de otros pató- genos, conjuntamente con el suelo.

Las muestras se depositaron en una o varias bolsas de polietileno negro identificadas por área, campo, locali- dad, provincia, cultivo, variedad, fecha de siembra o cosecha, cultivo y variedad anterior, fecha del muestreo y técnico colector.

La extracción de los estadios móviles de nematodos se realizó de acuerdo con el método de Baermann. Se procesaron 18 muestras de 50 g cada una, y los nematodos se recuperaron en viales de 15 mL, y para la identificación de los géneros se realizaron observaciones al microscopio estereoscopio de acuer- do con las claves taxonómicas [Siddiqi, 2000]. In- mediatamente después se realizó el conteo con un contador manual y se calculó el promedio de ejem- plares por muestra.

En las muestras de suelo colocadas en bolsas o mace- tas se sembraron tres semillas pregerminadas de ca- labaza (Cucurbita moschata Lin.) o pepino (Cucumis sativus Lin.), a razón de tres bolsas o macetas por muestra de suelo o materia orgánica, y se colocaron sobre una superficie separada del suelo, a fin de evi- tar la contaminación por contacto con el suelo. Las plantas se regaron e inspeccionaron periódicamente durante 35 días de cultivo (en el verano) o 45 (en el invierno); luego se extrajeron con sumo cuidado para evitar que se partieran las raíces. La presencia de nematodos se determinó mediante inspección visual de acuerdo con una escala de seis grados [Zeck, 1971; Püntener, 1981]. A cada planta indicadora se le asig- nó un grado entre 0 y 5 (Tabla 1), y se calculó el pro- medio del grado de agallamiento o índice de agallas del total de plantas evaluadas.

Tabla 1. Descripción de las raíces de acuerdo con el grado de infestación con Meloidogyne spp.

Grado

Descripción

0

Raíces sin agallas

1

Pequeñas agallas difíciles de descubrir o distribuidas por todas las raíces

2

Desde numerosas agallas pequeñas distribuidas en las raíces (algunas pueden estar encadenadas entre sí) hasta numerosas agallas de mayor tamaño

3

Agallas presentes en 25-50% de las raíces contaminadas

4

Desde 75% de las raíces con agallas semejantes a tumoraciones, hasta la raíz casi totalmente contaminada (aún la planta conserva su aspecto verde)

5

Desde la raíz casi totalmente contaminada y reducida (la planta muestra síntomas del daño) hasta el deterioro total por la muerte

Se calculó la frecuencia de aparición de los nematodos por la división de la cantidad de muestras por género detectado entre el total de muestras evaluadas expre- sado en porciento.

262/fitosanidad

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

En todas las áreas diagnosticadas se detectaron nematodos parásitos de plantas con diversos niveles de

Diagnóstico de fitonematodos

densidad de población, que en la mayoría fueron bajos o moderados, aunque en las muestras correspondien- tes a los campos de Bejucal y Alquízar de la provincia

de La Habana previamente sembrados de guayaba los niveles alcanzaron valores elevados o muy elevados (Ta- bla 2).

alcanzaron valores elevados o muy elevados ( Ta- bla 2 ). Figura 1. Frecuencia de aparición

Figura 1. Frecuencia de aparición de los diferentes géneros de nematodos en cultivos frutícolas.

El análisis de laboratorio reveló que en los campos de frutales en fase de presiembra los géneros más frecuen- tes fueron Meloidogyne y Rotylenchulus. Ambos estu- vieron presentes en todos los cultivos en algunas de sus estadios infectivos (Fig. 1), lo que permite asumir la existencia de una estrecha asociación entre estos orga- nismos y los cultivos frutícolas. Estos resultados son similares a los obtenidos en Venezuela por Petit (1990) en los estudios de biodiversidad nematológica. Los com- plejos formados por estos géneros pudieran represen- tar un peligro potencial, fundamentalmente para fru- tales como el guayabo y la piña, debido a los daños que pueden causar en su sistema radical, que limitan sensi- blemente la absorción de los nutrientes y por consi- guiente el desarrollo y la productividad.

Helicotylenchus y Pratylenchus no estuvieron presen- tes en las áreas agrícolas que anteriormente se cultiva- ron con aguacatero y uva; Helicotylenchus tampoco se presentó en campos de papayo, y Patylenchus no se detectó en campos de mango (Tabla 2).

En general las mayores poblaciones de nematodos se apreciaron en los campos de guayabo, con predo- minancia de Meloidogyne sobre Pratylenchus, lo cual coincide con Fernández (1991), quien aseveró que este cultivo es un buen hospedero de ambas especies, y que las pérdidas económicas que ocasionan estos nematodos pueden alcanzar 20 t/ha en plantaciones jóvenes, según Suárez et al. (1998) con valores máximos entre 48 y 57% en plantaciones establecidas. Los daños incluso pue- den ser aún mayores en la fase de producción, cuando

se emplean posturas contaminadas, pues la alimenta- ción y reproducción del nematodo tiene lugar desde el mismo inicio del crecimiento del cultivo en la fase de vivero. En este trabajo se observó una tendencia des- cendente del índice de agallamiento de Meloidogyne desde la máxima densidad de población hasta 240 J 2 / 250 g de suelo, a partir de la cual no se presentó una infestación visible en raíces (Tabla 2).

En las muestras de los suelos dedicados a la piña se observaron poblaciones de Rotylenchulus y Meloidogyne. Estos géneros de nematodos usualmente están asocia- dos al cultivo con una incidencia negativa en el desa- rrollo de la planta y el rendimiento agrícola, por lo que es muy útil realizar el diagnóstico nematológico antes de la siembra [Gandoy y Ortega, 1980; MINAGRI, 1989; Araya, 2006].

CONCLUSIONES

Meloidogyne y Rotylenchulus con 100 y 72% respecti- vamente fueron los géneros de nematodos más fre- cuentes en las muestras de suelos de frutales en fase de presiembra.

• Los suelos procedentes del guayabo se distinguieron notablemente por las elevadas densidades de pobla- ción de Meloidogyne en comparación con los de piña, uva, papayo, mango y aguacatero.

Helicotylenchus y Pratylenchus no estuvieron pre- sentes en las áreas agrícolas anteriormente cultiva- das con aguacatero y uva, mientras el primero tam- poco estuvo en papayo y el segundo en mango.

fitosanidad/263

Hernández y otros

Tabla 2. Fauna de nematodos parásitos de los cultivos frutales detectados. Individuos por 250 g de suelo

Municipio/

Unidad agrícola

Cultivo

Variedad

Meloidogyne sp.

Rotylenchu-

Helicoty-

Pratylen-

provincia

precedente

 

lus sp.

lenchus sp.

chus sp.

J

2

M

G

J

4

M

Alquízar/

Estación

Guayabo

Enana EEA

2756

 

4

     

25

La Habana

Experimental

18-40

             

1305

 

2

       
 

de Fruticultura

 

620

 

1

       

305

 

0,3

100

     

Bejucal/

Finca

Guayabo

Enana EEA

240

 

0,3

50

     

La Habana

La Milagrosa

18-40

130

 

0

15

5

15

 

110

 

0

10

     

100

 

0

40

 

35

 

La Lisa/ Ciudad de La Habana

Finca

Mango

Super

70

 

0

10

 

5

 

de

Hayden

autoconsumo

Hyden

30

 

0

35

10

5

 
 

Aguacatero

Catalina-

10

 

0

5

     

Govin

Ciego de Ávila/ Ciego de Ávila

Empresa de la Piña

Piña

Española roja

160

10

0

110

 

20

 
 

5

0

5

     
   

Cayena lisa

53

5

0

85

 

10

5

Jagüey Grande/

Estación

Papayo

Solosunrise

100

10

       

5

Matanzas

Experimental

Maradol

60

5

0

5

   

5

de Fruticultura

Isla de la Juventud

Finca orgánica

Uva

Aramón

140

 

0

       

90

 

0

       
30 0 200
30 0
200

J2: Larva infectiva del segundo estadio. G: Grado de infestación con agallas.

M: Espécimen adulto macho. J4: Hembra adulta joven infectiva.

REFERENCIAS

Araya, M.; Comunicación personal, 2006.

Fernández, E. «Los nematodos del género Meloidogyne Goeldi en el cultivo de la guayaba (Psidium guajava L.) y su control». Tesis de Doctorado en Ciencias Agrícolas, Instituto de Investigaciones de Sanidad Vegetal, La Habana, 1991.

Gandoy, P.; J. Ortega: «Nematodos parásitos del cultivo de la piña en Cuba y posibilidades de su control», Ciencias de la Agricultura 7:19-28, 1980.

INIFAP: «Control de nematodos fitoparásitos en piña. Ficha tecnológica por sistema tecnológico», estado de Veracruz, México, 2002.

http://www.inifap.gob.mx/contenido/innovaciones/innovaciones.

html#sanidad.

MINAGRI: Instructivo técnico para el cultivo de la piña, Departamento Independiente de Frutales. Área No Cañera, Centro de Información y Documentación Agropecuaria, La Habana, 1989.

Petit, P.: «Reconocimiento de nematodos fitoparásitos asociados a fru- tales de importancia económica en Venezuela», Fitopatol. Venez. 3(1):2-5, 1990.

Püntener, W.: Manual para ensayos de campo de protección vegetal, 2. a ed. revisada y ampliada, Documenta CIBA-GEIGY, Basilea, Suiza,

1981.

Siddiqi, M. R.: Tylenchida. Parasites of Plants and Insects, 2th Ed., CABI Publishing, Wallingford, Inglaterra, 2000.

Stirling, G. R.; R. Kopittke: «Sampling Procedures and Damage Thresholds for Root-Knot Nematode (Meloidogyne javanica) on Pineapple», Aust. J. Exp. Agric. 40(7):1003-1010, 2000.

Suárez, H. Z.; L. C. Rosales; M. S. González: «Nematodos asociados a los frutales de importancia y su control. I: frutales perennes», Fonaiap Divulga. 59:13-18, 1998.

Zeck, W. M.: «El esquema de valoración del ataque de cecidios radicícolas», Pflanzenchutz Nacrichten Bayer 24(1):147-150, 1971.

264/fitosanidad

FITOSANIDAD vol. 10, no. 4, diciembre 2006

AISLAMIENTO, IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN MORFOMÉTRICA DE AISLADOS NATIVOS DE HONGOS MITOSPÓRICOS CON POTENCIALIDAD PARA EL CONTROL DE ESPECIES DE INSECTOS PLAGA

Orestes Elósegui Claro, Jesús Jiménez Ramos y Aidanet Carr Pérez

Instituto de Investigaciones de Sanidad Vegetal. Calle 110 no. 514 e/ 5. a B y 5. a F, Playa, Ciudad de La Habana, CP 11600

RESUMEN

Se realizó una prospección de hongos entomopatógenos a partir de especies de insectos plaga sospechosos de micosis en cultivos de gran importancia económica y de muestras de suelo. De un total de 53 muestras se obtuvieron 17 útiles que correspondieron a 15 aisla- dos de Beauveria bassiana (Bals.) Vuill., una de Paecilomyces lilacinus Samson y una de Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorokin. El predo- minio de aislados de Beauveria fue consecuencia en parte del amplio rango de hospedantes de esta especie fúngica y a la cantidad de muestras procesadas que pertenecieron a Hypothenemus hampei (broca del café), donde este microorganismo es un patógeno muy habitual. Solamente se obtuvo un aislado de hongo de las 15 mues- tras de suelo procesadas mediante el trampeo con insectos patro- nes. Todos los aislados se incorporaron a la Colección de Cepas de Hongos Entomopatógenos del Instituto de Investigaciones de Sani- dad Vegetal (INISAV), donde se registraron sus características macroculturales, microculturales, origen y especie a que pertene- cen, con el objetivo de conservarlos para futuros estudios como agentes potenciales de biocontrol de insectos plaga.

Palabras claves: hongos entomopatógenos, hongos mitospóricos, con- trol biológico, plagas

ABSTRACT

A screening for entomopathogenic fungi from both mycosis suspect

insect cadavers in crops of economical importance and soil samples

was carried out. Of a total out of 53 samples collected 17 resulted successful which belonged to 15 isolates of Beauveria bassiana (Bals.) Vuill., one of Paecilomyces lilacinus Samson and one of Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorokin. The predominance of Beauveria isolates was a consequence in part of the large amount of samples taken from Hypothenemus hampei (coffee berry borer) where this microorganism has been found as a very common pathogen as well as the broad host range this fungal species exhibits in nature. Only one fungal isolate

of fifteen different soil samples tested by insect bait method was

obtained. All the isolates recovered were stored in the Plant Health Research Institute (INISAV) Culture Collection being previously recorded in a datasheet with the micro and macro cultural characteristics, origin and species name, for further research for a potential use as biological control agents of insect pests.

Key words: entomopathogenic fungi, mitosporic fungi, biological con- trol, pests

INTRODUCCIÓN

Los hongos mitospóricos están catalogados como un grupo mundialmente reconocido de agentes microbianos a usarse tanto en los programas de control biológico de plagas como en los de manejo integrado de plagas (MIP). Esto es debido a su forma de actuar, que es por contac- to directo con la cutícula del hospedero y por la dispo- nibilidad de tecnologías para producirlos masivamen- te. Algunos géneros además se pueden formular en aceites y así aplicarse con técnicas de volumen ultrabajo [Bateman et al., 1993; Bateman et al., 1996].

Está demostrado que para llegar a obtener un produc- to altamente efectivo para controlar una especie plaga se debe partir de un amplio rango de aislados, seleccio-

nados en principio en cuanto a su virulencia. Los aisla- dos que causan epizootias espectaculares, como es el caso de algunos de los géneros fúngicos imperfectos entomopatogénicos, son candidatos promisorios para usarse en el control de plagas, siempre y cuando logren clasificar sobre la base de otras características esencia- les como son un nivel de especificidad de hospedante estrecho, buena tolerancia a factores ambientales ad- versos, facilidad de producción, comportamiento en al- macenaje adecuado y alta seguridad en mamíferos [Bateman et al., 1996].

Clásicamente hay tres vías de enriquecer el número de aislados fúngicos para utilizarse como candidatos en el

fitosanidad/265

Elósegui y otros

control biológico de plagas. La primera es mediante el aislamiento del hongo a partir de artrópodos y nematodos micosados, la segunda a través de muestras de suelo y por último directamente de las colecciones de cultivo [Rhodes y Smith, 1992].

Una vez aislado el agente es necesaria una correcta iden- tificación. La identificación tradicional por medio de las características morfológicas mantiene un peso rele- vante, aunque se han introducido conceptos nuevos que conllevan a algún tipo de marcador molecular que per- mita, entre otras cosas, identificar al agente incluso después de su liberación [Bridge y Arora, 1998 citados por Bieliková et al., 2002].

En Cuba, dentro de los hongos entomopatógenos están autorizados a producirse masivamente solamente dos cepas de Beauveria bassiana de las que una no es nati- va, y la otra es de Metarhizium anisopliae. Para el caso de Lecanicillium lecanii (syn. Verticillium lecanii) se cuenta con dos cepas en la producción, ambas foráneas. Por estas razones surge la necesidad de contar con ma- yor cantidad de aislados e introducir nuevos en la pro- ducción, que tengan ventajas como controladores de determinadas plagas agrícolas con respecto a las que ya se producen masivamente en el país.

Los objetivos del trabajo fueron realizar aislamientos de hongos patógenos a artrópodos (insectos), con énfa- sis en especies plaga de relevancia económica, identifi- carlos taxonómicamente e incorporarlos a la Colección de Hongos Entomopatógenos y Antagonistas del Ins- tituto de Investigaciones de Sanidad Vegetal (INISAV) para estudios posteriores.

MATERIALES Y MÉTODOS

En los Laboratorios Provinciales de Sanidad Vegetal (LAPROSAV) y en el INISAV se recibieron muestras que consistieron en individuos muertos pertenecientes a la clase Insecta, sospechosos de micosis, según síntomas de momificación y/o mecanización, o con esporulación de naturaleza fúngica en la superficie cuticular; también se recibieron muestras de suelo. Ambas muestras proce- dían de zonas donde se habían observado epizootias y no aplicado productos a base de hongos entomopatógenos, de acuerdo con registros históricos de campo.

Para el aislamiento del hongo, que ya estaba esporulado sobre los individuos colectados, se realizaron siembras en placas Petri de 9 cm de diámetro, por agotamiento en agar sabouraud dextrosa o agar papa dextrosa (PDA) o agar extracto de malta (MEA), en presencia de antibióticos, según el método descrito por Rhodes y

Smith (1992). Para los individuos sospechosos de mico- sis se realizaron lavados con agua estéril y desinfecciones con NaHClO a 0,5% durante 1 min. Seguidamente se realizaron dos lavados por agua estéril y se colocaron en cámaras húmedas incubadas a 28ºC por 7-9 días. A par- tir del segundo día se observaron, y en los individuos donde se detectó emersión de micelio se realizaron trans- ferencias bajo condiciones asépticas, con siembras por agotamiento de acuerdo con el método ya mencionado.

Para el aislamiento de hongos entomopatógenos con Galleria mellonella se siguió el método de trampeo des- crito por Zimmermann en 1986 [citado por Sun, 2002] con algunas modificaciones para este trabajo. Las mues- tras de suelo se obtuvieron a partir de la selección de una hectárea que fuese representativa de un agroeco- sistema con registros de infecciones por hongos entomopatógenos en insectos plaga. Se tomaron cinco puntos al azar y de cada punto se colectaron 10 submuestras de 10 cm 3 de suelo cada una. El material se colocó en bolsas oscuras y se homogenizaron en una muestra única en el laboratorio. Se vertieron 6-10 g de suelo por placa Petri de 12 cm de diámetro y en cada una se colocó un individuo de Galleria mellonella o Corcyra cephalonica de primeros estadios larvales, como insectos cebo o trampeadores. Las placas se observa- ron a partir del segundo día hasta el noveno, con movi- miento diario. Si en este intervalo ocurría la muerte se procedía a la desinfección superficial, incubación y ais- lamiento del supuesto hongo de forma similar a lo ex- plicado en el párrafo anterior para los individuos sos- pechosos de micosis.

Las colonias obtenidas en placa se observaron al mi- croscopio estereoscópico y se realizaron preparaciones al microscopio óptico que se compararon con las des- cripciones de géneros hifomicetos de Carmichael et al. (1980) y Barnett y Hunter (1998). En caso de pertene- cer el individuo a un género patogénico de interés, se realizaba un subcultivo en medio agarizado y se regis- traba como un nuevo aislado de la colección; en caso contrario las muestras procesadas se destruían. La iden- tificación del patógeno a nivel de especie se realizó con ayuda de las descripciones de especies de hongos entomopatógenos del CMI, de acuerdo con las caracte- rísticas macro y microculturales [CMI, 1979].

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Los aislados de hongos entomopatógenos obtenidos co- rrespondieron a los géneros Beauveria, Paecilomyces y Metarhizium, a los que se les estudiaron sus caracterís- ticas macro y microculturales más notables (Tabla 1).

266/fitosanidad

Aislamiento, identificación y caracterización

Tabla 1. Aislados de hongos entomopatógenos obtenidos. Principales características macro y microculturales

Aislado (número de registro de origen)

     

Características

Características

Origen

Identificación

macroculturales

microculturales

Bb-102

Metamasius

Beauveria

En PDA colonias al inicio

Células conidiógenas muy típi- cas de la especie, con bases glo- bosas. 2,0-3,0 (2,3 µm) x 2,0-2,5 (2,1 µm). Conidios hialinos,

hemipterus

bassiana

blancas afieltradas que con el tiempo se tornan crema polvorientas. Reverso amarillo

ceriseus

(coleóptero),

Matanzas

ligero

globosos a subglobosos1,0-2,5 (1,9 µm) x 1,0-2,0 (1,7 µm)

Bb-103

Metamasius

Beauveria

En PDA colonias algodonosas

Muy abundantes conidioforos

hemipterus

bassiana

y

blancas al inicio que se

con grupos densos de células fialídicas. Células conidiógenas globosas unas y otras en forma

(coleóptero),

tornan crema y polvorientas

Santiago

con el tiempo. Reverso amarillo

de Cuba

ligero

de botella con formas interme- dias, 1,5-3,0 (2,7 µm) x 2,0-3,0 (22 µm). Conidios hialinos, a veces con un ápice muy definido, globosos a elipsoidales 1,5-3,0 (2,3 µm) x 1,5-3,0 (21 µm)

Bb-105

Hypothenemus

Beauveria

Colonias en PDA que al inicio son blancas y algodonosas y se

Células conidiógenas muy típi- cas de la especie, con bases glo- bosas. 2,0-3,0 (2,3 µm) x 2,0-2,5 (2,2 µm). Conidios muy homo- géneos, hialinos, globosos,

hampei

bassiana

(coleóptero),

tornan beis claro y ligeramente polvorientas, según esporulan con el tiempo. Reverso amarillo

cafetal, zona

montañosa,

Granma

ligero

algunos subglobosos, 2,0-2,0 µm

Bb-106

Hypothenemus

Beauveria

Colonias en PDA que al inicio son blancas y algodonosas y se tornan crema claro y ligeramente polvorientas según esporulan con el tiempo. Algunos coremios. Reverso amarillo ligero

Células conidiógenas globosas unas y otras en forma de botella con formas intermedias, 2,0-3,5 (2,3 µm) x 1,0-2,5 (1,9 µm). Conidios hialinos, globosos a

hampei

bassiana

(coleóptero),

café, zona

montañosa,

Granma

subglobosos1,5-2,0

(1,9 µm)x1,0-2,0 (1,7µm)

Bb-107

Hypothenemus

Beauveria

Colonias en PDA que al inicio son blancas y algodonosas y se tornan beis claro y ligeramente polvorientas según esporulan con el tiempo. Algunos coremios Reverso amarillo

Células conidiógenas globosas unas y otras en forma de botella con formas intermedias, 2,0-3,5 (2,3 µm) x 1,0-2,5 (1,9 µm). Conidios hialinos, globosos a subglobosos1,5-2,0 (1,9 µm) x

hampei

bassiana

(coleóptero),

café, zona

montañosa,

Granma

ligero

1,0-2,0 (1,7µm)

Bb-SP

Spodoptera

Beauveria

En PDA colonias algodonosas

Células conidiógenas muy

frugiperda

bassiana

y

blancas al inicio que se

típicas de la especie, con bases globosas, 2,0-3,0 (2,4 µm) x 2,0-2,5 (2,3 µm). Conidios muy homogéneos, hia- linos, globosos, algunos ligera- mente subglobosos, 2,0-2,0 µm

(lepidóptero),

tornan beis y ligeramente polvorientas con el tiempo. Reverso miel

maíz,

Camagüey

fitosanidad/267

Elósegui y otros

 

Bb-200603

Hypothenemus

Beauveria

Colonias en MEA que al inicio son blancas y algodonosas y se tornan beis y polvorientas según esporulan con el tiempo. Reverso amarillo claro

Células conidiógenas, predominan las de forma de bo- tella, 3,0-4,0 (3,3 µm) x 3,0-2,0 (2,3 µm). Conidios variables, aunque predominan formas elipsoidales, base apiculada en ocasiones, hialinos, 2,0-3,0 (2,3 µm) x 2,0-3,0 (23 µm)

hampei

bassiana

(coleóptero),

café, zona

montañosa,

Holguín

 

Bb-cepa2

Hypothenemus

Beauveria

Colonias en MEA que al inicio son blancas y algodonosas y se tornan beis y polvorientas según esporulan con el tiempo. Reverso amarillo pálido

Células conidiógenas típicas de la especie, con bases globosas, 2,0-3,0 (2,2 µm) x 2,0-2,5 (2,3 µm). Conidios globosos a subglobo- sos, hialinos, algunos apicu- lados, 2,0-2,5(2,2 µm) x 1,5-2,0 (1,8 µm)

hampei

bassiana

(coleóptero),

café, zona

montañosa,

Santiago de

 

Cuba

Bb-cepa3

Hypothenemus

Beauveria

Colonias en MEA que al inicio son blancas y algodonosas y se tornan beis y polvorientas según esporulan con el tiempo. Reverso amarillo muy pálido

Células conidiógenas típicas de la especie, con bases globosas, 2,0-3,0 (2,3 µm) x 2,0-2,5 (2,4 µm). Conidios subglobosos a ligeramente elipsoidales, predominando estos últimos, hialinos, 2,0-3,0 (2,6 µm) x 2,0

hampei

bassiana

(coleóptero),

café, zona

montañosa,

Santiago de

 

Cuba

Bb-cepa4

Hypothenemus

Beauveria

Colonias en MEA que al inicio son blancas y algodonosas y se tornan beis claro y polvorientas según esporulan con el tiempo. Reverso amarillo pálido

Células conidiógenas predominan las de forma de botella, 3,0-4,0 (3,2) x 3,0-2,0 (2,4 µm). Conidios, predominan formas elipsoidales, algunos globosos a subglobosos, hialinos, en ocasiones apiculados, 2,0-3,0 (2,5 µm) x 2,0-2,5 (2,2 µm)

hampei

bassiana

(coleóptero),

café, zona

montañosa,

Santiago de

 

Cuba

Bb-cepa5

Hypothenemus

Beauveria

Colonias en MEA que al inicio son blancas y algodonosas y se tornan beis claro y polvorientas según esporulan con el tiempo. Tendencia discreta a formar coremios. Reverso amarillo miel

Células conidiógenas, predominan las de forma de botella, 3,0-4,0 (3,3) x 3,0-2,0 (2,5 µm). Conidios, predominan formas elipsoidales con ápice definido, algunos subglobosos, hialinos, 2,0-3,0 (2,6 µm) x 2,0

hampei

bassiana

(coleóptero),

café, zona

montañosa,

Santiago de

Cuba

Bb-1234

Hypothenemus

Beauveria

Colonias en MEA que al inicio son blancas y algodonosas y se tornan beis medio y polvo- rientas según esporulan con el tiempo. Tendencia a formar coremios. Reverso amarillo

Células conidiógenas típicas de la especie, con bases globosas, 2,0-3,0 (2,3 µm) x 2,0-2,5 (2,4 µm). Conidios globosos a subglobosos ligeramente, hialinos, 2,0 x2,0 µm

hampei

bassiana

(coleóptero),

café, Guamá,

Santiago de

Cuba

 

Bb-SIM

Hypothenemus hampei (coleóptero), café, Tercer Frente, Santiago de Cuba

Beauveria

Colonias en MEA que al inicio son blancas y algodonosas y se tornan beis pálido y polvorien- tas según esporulan con el tiem- po. Reverso amarillo pálido

Células conidiógenas con bases globosas, 2,0-3,0 (2,1 µm) x 2,0-2,5 (2,4 µm). Conidios subglobosos a ligeramente elípticos, hialinos, 2,0-3,0 (2,3) x 1,5-2,5 (2,1) µm

bassiana

268/fitosanidad

 

Aislamiento, identificación y caracterización

Bb-SL

Hypothenemus

Beauveria

Colonias en MEA que al inicio son blancas y algodonosas y se tornan beis pálido y ligeramente polvorientas según esporulan con el tiempo. Tendencia a formar coremios. Reverso amarillo pálido

Células conidiógenas predo- minan las de forma de botella 3,0-4,0(3,3) x 3,0-2,0 (2,7 µm). Conidios subglobosos a ligeramente elípticos y hasta elipsoidales, hialinos,2,0-3,0 (2,3) x 2,0 µm

hampei

bassiana

(coleóptero),

café,

San Luis,

Santiago de

Cuba

Bb-Inv

Cylas

Beauveria

Colonias en PDA que al inicio son blancas y algodonosas y se tornan beis pálido y ligeramente costrosas según esporulan con el tiempo. Reverso amarillo pálido

Células conidiógenas predominan las de forma de botella, 3,0-4,0 (3,4) x 3,0-2,0 (2,8 µm). Conidios ligeramente elípticos hasta elipsoidales, ápice discreto, hialinos, 2,0-3,0 (2,5) x 1,0-2,0 (1,6) µm

formicarius

bassiana

(coleóptero),

boniato,

Camagüey

Bb-1212

Hypothenemus

Beauveria

Colonias en PDA que al inicio son blancas y algodonosas y se tornan beis y polvorientas según esporulan con el tiempo. Reverso amarillo

Células conidiógenas con bases globosas, 2,0-3,0 (2,2 µm) x 2,0- 2,5 (2,3 µm). Conidios globosos a subglobosos, hialinos, 1,5-2,0 (1,8) x 2,0µm

hampei

bassiana

(coleóptero),

café,

Los Llanos,

Guisa, Granma

   

Pl-01M2

Hypothenemus hampei, café, Santiago de Cuba

Paecilomyces

Colonias en PDA al inicio blanco lanoso que se tornan violeta grisácea con la edad y con micelio aéreo irregular. Reverso vináceo

Conidioforos solos o en grupos, forman sinemas con verticilos de hasta seis fiálides, con la edad se tornan rugosos. Células conidiógenas típicas, 7,0-13,0 (9,5 µm) x 1,5-3,0 (2,8 µm). Conidios catenulados, gris-violeta claro, elipsoidales a fusiformes, algunos con un ápice, 1,5-3,0 (2,2 µm) x 1,5-3,0 (2,4 µm)

lilacinus

Ma-30

Muestra de

Metarhizium

Colonias en PDA blancas y algodonosas al inicio que se tornan amarillo verdoso y finalmente verde olivo oscuro y costroso con zonas con micelio aéreo abundante blanquecino. Reverso amarillo intenso

Patrón conidioforo típico de la especie con verticilos de 2-3 ramas cada uno, con tonos verde olivo oscuro que aclara al ápice. Células conidiógenas 6,0-10,0 (8,1 µm) x 2,0-2,5 (2,1 µm). Conidios subhialinos a ligeramente verdes, cilíndricos a ligeramente elipsoidales, 5,0-8,5 (6,6 µm) x 2,0-3,0 (2,4 µm)

suelo (insecto

anisopliae

trampa Galleria

mellonella), IPA

Villena, La

Habana

De un total de 53 muestras procesadas de las que 15 fueron de suelo de zonas donde se habían observado epizootias, 17 resultaron muestras exitosas. De los ais- lados obtenidos solamente uno correspondió a una muestra de suelo, que fue obtenido por trampeo con larvas de Galleria mellonella (Fig. 1).

Con respecto a las especies de interés detectadas se puede observar que hubo una predominancia de aislados per- tenecientes a la especie Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin (Tabla 1, Fig. 2).

En contraste, solo se obtuvo un aislado de Metarhizium anisopliae (Metschnikoff) Sorokin y otro de Paecilomy- ces lilacinus (Thom.) Samson (Fig. 1).

Este comportamiento se puede atribuir a la efectivi- dad del método de trampeo con insectos susceptibles, donde se requiere de una cantidad de propágulos via- bles que garantice la infección, los que deben ser del orden de 10 4 unidades por insecto como mínimo según Bateman et al. (1996) y Moore y Caudwell (1997). Se sabe que el establecimiento de poblaciones de hongos

fitosanidad/269

Elósegui y otros

entomopatógenos en el suelo está determinado tanto por las propiedades físicas y químicas de cada suelo como por las de la cepa fúngica en cuestión [Rhodes y Smith, 1992]. También existe la posibilidad de que los microorganismos competidores con su producción de

metabolitos activos afecten la viabilidad de estos propágulos fúngicos deseados [Jenkins y Grzywacz, 2000]. Por ello, el trampeo puede fallar si no existe una concentración alta de esporas viables del microorga- nismo de interés en el suelo

viables del microorga- nismo de interés en el suelo Figura 1 . Larva momificada de Galleria

Figura 1. Larva momificada de Galleria mellonella en cámara húmeda infectado con el aislado Ma-30 de Metarhizium anisopliae a partir de muestra de suelo. Nótese la emersión temprana del micelio en blanco.

suelo. Nótese la emersión temprana del micelio en blanco. Figura 2. Colonia de Beauveria bassiana aislado

Figura 2. Colonia de Beauveria bassiana aislado Bb-105 obtenido de Hypothenemus hampei.

Sun (2002) logró 6,7% de éxito para Metarhizium y 10% de éxito para Beauveria en trampeos con el termite Coptotermes formosanus, a partir de 90 muestras origi- nales de suelo, porcentajes superiores de éxito con res- pecto al procesamiento de termites muertos sospecho- sos de micosis; sin embargo, Zimmermann (1986) [citado por Sun, 2002] se refiere al método de trampeo con

270/fitosanidad

Galleria como uno de los más exitosos para detectar entomopatógenos en termites. Por otro lado, Dhoj et al. (2006) recomiendan también el método de trampeo con Galleria en contacto con muestras de suelo, porque fundamentalmente es el que lleva poca especializacion y el tiempo del ensayo es cor- to con un porcentaje de éxito alrededor de 75% para

Aislamiento, identificación y caracterización

aislar Beavuveria y Metarhizium. Estos mismos auto- res usaron 15 g de suelo aproximadamente por cada individuo de Galleria y pusieron en contacto con el sue- lo al insecto trampeador hasta 18 días; sin embargo, en este trabajo se obtuvo una sola muestra de suelo útil por trampeo con Galleria, lo que representó 7% de éxi- to. Este comportamiento puede deberse a que la canti- dad de suelo por individuo fue de 6-10 g, y el tiempo en contacto con este solo fue de nueve días, además de que la cantidad de propágulos del hongo de interés presen- te en el suelo es muy variable y depende de condiciones específicas de cada ecosistema (Tabla 1 y Fig. 1).

Un método más efectivo para obtener nuevos aislados de hongos es el aislamiento de colonias fúngicas únicas (ufc) a partir de muestras de suelo por diluciones seriadas, según procedimiento detallado por Lecuona (1996). No obstante, es ampliamente aceptado que este método es muy caro y se prefiere usar en el aislamiento y selección de especies bacterianas, como por ejemplo Bacillus thuringiensis [Johnson y Bishop, 1996], de ahí que se decidiera no emplearlo para enriquecer el núme- ro de aislados de la Colección de Hongos Entomopa- tógenos del INISAV.

El porcentaje de éxito obtenido en este trabajo para las muestras de insectos sospechosos de micosis o con una evidente fue de 42%. Jackson et al. (2000) plan- tean que aunque este método de aislamiento directo conlleva mucho tiempo de muestreo en campo y expe- riencia, la realidad es que entre los más exitosos agen- tes de control con microorganismos se encuentran aquellos aislados obtenidos directamente de los insec- tos hospederos, y no de las colecciones de cultivos o de métodos indirectos a través de medios de cultivo se- lectivos.

La frecuencia alta de aparición de Beauveria bassiana se debió al amplio rango de hospedantes de este pató- geno, además de que la mayoría de los aislamientos se hicieron a partir de Hypothenemus hampei (broca del café), y se conoce que esta especie fúngica regularmen- te se ha encontrado que atacan las poblaciones del in- secto de forma natural en los cafetales. De hecho, es esta la razón de que sea uno de los entomopatógenos más estudiados para el control de esta plaga [Bustillo et al., 1999].

Beauveria bassiana (Bals.) Vuill. así como Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorok. y Metarhizium flavoviride Gams and Rozsypal están entre los hongos entomo- patógenos más usualmente encontrados en la natura-

leza. Por ello, colecciones de cultivo internacionalmente reconocidas cuentan con varios cientos de aislados de estas tres especies como la Colección de Hongos Entomopatógenos para Investigaciones Agrícolas del Departamento de Agricultura de Estados Unidos (ARCEF), la ATCC (American Type Culture Collection) y la Colección del IMI (International Mycological Institute) en el Reino Unido [Humber, 1992; Bateman et al., 1996]. En Cuba más del 85% de la Colección de Hongos Entomopatógenos del INISAV está represen- tada por aislados de Beauveria y Metarhizium.

En relación con el aislamiento de Paecilomyces lilacinus obtenido de Hypothenemus hampei se sabe que este hongo se encuentra comúnmente en las crías de broca en laboratorio, donde es posible que las condiciones de hacinamiento, la alta humedad relativa y la falta de desinfección de las cerezas favorezcan la invasión de esta especie para atacar a la broca, si bien en la planta de café en el campo no se ha encontrado [Posada et al., 1998]. También es cierto que P. lilacinus está cataloga- do como hongo entomopatógeno oportunista y se ha usado exitosamente en el control de nematodos fitopatógenos [López, 1995]. Por esta razón se decidió incorporarlo a la Colección de Hongos Entomo- patógenos del INISAV para futuras investigaciones.

Los productos exitosos a base de hongos desarrollados en el mercado han surgido a partir de un monitoreo de aislados obtenidos de las regiones geográficas y agroecosistemas, donde está el organismo plaga por controlar, así como de las colecciones de cultivos. Bateman et al. (1996) reportaron la selección de una sola cepa de M. anisopliae, después de haber ensayado 159 aislados de Beauveria y Metarhizium contra Schistocerca gregaria (langosta del desierto). Esto con- firma la necesidad de contar con abundante cantidad de aislados de los más diversos orígenes cuando se pre- cisa obtener agentes microbianos efectivos como biocontroladores de plagas [Bateman et al., 1996; Jenkins y Grzywacz, 2003].

Como se puede apreciar, de acuerdo con las caracterís- ticas macro y microculturales, para los aislados de Beauveria existió una alta similitud, por lo que una separación entre estos por los métodos tradicionales morfométricos no es factible (Tabla 1). Para lograr la distinción entre aislados hay que recurrir a métodos de biología molecular como RFLP y PCR-RAPDS [Brid- ge et al., 1993; Bridge y Arora, 1998; Bielikova et al., 2002]. Estos métodos moleculares también se usan como una forma altamente reproducible de reconocer cada

fitosanidad/271

Elósegui y otros

aislado para patentar, registrar los productos y monitorear tanto su destino en el ecosistema donde se libere como las posibles interacciones negativas que puedan existir entre el aislado liberado y el resto de los aislados de la misma especie [Jenkins y Grzywacz, 2000; Bielikova et al., 2002].

Finalmente todos los aislados de interés obtenidos se incorporaron al banco de cepas de hongos entomo- patógenos, y en la base de datos de esa colección se re- gistraron las características macroculturales, micro- culturales, origen y especie a que pertenecen, con el objetivo de conservarlos como agentes potenciales de biocontrol de insectos plaga para futuros estudios.

CONCLUSIONES

• Se obtuvieron 17 nuevos aislados de hongos ento- mopatógenos de los que uno fue de Metarhizium anisopliae, uno de Paecilomyces lilacinus y el resto de Beauveria bassiana.

• El método de aislamiento directo a partir de insec- tos micosados tuvo 42% de efectividad.

• El método de aislamiento a partir de muestras de suelo de hongos entomopatógenos mediante trampeo con larvas de Galleria y Corcyra fue muy inefectivo, con 7% de éxito solamente.

REFERENCIAS

Barnett, H. L.; B. B. Hunter: Illustrated Genera of Imperfect Fungi, 4 th Edition, The American Phytopahological Society Press, 1998.

Bateman, R.; M. Carey; D. Moore; C. Prior: «The Enhanced Infectivity of Metarhizium flavoviride in Oil Formulations to Desert Locusts at Low Humidities», Annals of Applied Biology 122:145-52, 1993.

Bateman, R; M. Carey; D. Batt; C. Prior; Y. Abraham; D. Moore; N. E. Jenkins; J. Fenlon: «Screening for Virulent Isolates of Entomopa- thogenic Fungi Against the Dessert Locust Schistocerca gregaria (Forskal)», Biocontrol Science and Technology 6:549-60, 1996.

Bieliková, L.; Z. Landa; L. S. Osborne; V. Èurn: «Characterization and Identification of Entomopathogenic and Mycoparasitic Fungi Using RAPD-PCR Technique», Plant Protection Science 38 (1):1-12, 2002.

Bridge, P. D.; M. A. J. Williams; C. Prior; R. R. M. Paterson: «Morphological, Biochemical, and Molecular Characteristics of Metarhizium anisopliae and M. flavoviride», J. Gen. Microbiol.139:1163-1169, 1993.

Bridge, P. D.; D. K. Arora: «PCR for Species Definition», Applicatios of PCR in Mycology, CAB International, Wallingford, 1998, pp. 63-84.

Bustillo, A.; M. Bernal; P. Benavides; B. Chaves: «Dynamics of Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae Infecting Hypothenemus hampei (Coleoptera: Scolytidae) Population Emerging from Fallen Coffee Berries», Fla. Entomol. 82:491-498, 1999.

Carmichael, J. W.; W. B. Kendrick; I. L. Connors; L. Sigler: Genera of Hyphomycetes, Univ. Alberta Press, Edmonton, Canada, 1980.

CMI: Descriptions of Pathogenic Fungi and Bacteria. The Cambrian News, Commonwealth Agricultural Bureaux, Surrey, Inglaterra, 1979.

Dhoj, Y.; S. Keller; P. Nagel: «Pathogenicity of Entomopathogenic Fungi to White Grubs of Maize Based Cropping System in Nepal. Inauguraldissertation zur Erlangung der Würde eines Doktors der Philosophie vorgelegt der Philosophisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der Universität Basel, June 2006, http://www.umad.de/

infos/cleanair13/pdf/full_348.pdf.

Humber, R. A.: «Collection of Entomopathogenic Fungi Cultures, Catalo- gue of Strains 1992», USDA Agricultural Research Service ARS-110, Plant Portection Research Unit, Ithaca, New York, 1992.

Jackson, T. A.; S. B. Alves; R. M. Pereira: «Success in Biological Control of Soil-Dwelling Insects by Pathogens and Nematodes», Biological Control: Measures of Success, Kluwer Academic Public Publishers, Boston, EE.UU., 2000, pp. 271-296.

Jenkins, N. E.; D. Grzywacz: «Quality Control of Fungal and Viral Biocontrol Agents-Assurance of Product Performance», Biocontrol Science and Technology 10:753-777, 2000.

––––: «Towards the Standardization of Quality Control of Fungal and Viral Biocontrol Agents», Quality Control and Production of Biological Control Agents: Theory and Testing Procedures, CAB International,

2003.

Johnson, C.; A. H. Bishop: «A Technique for the Effective Enrichment and Isolation of Bacillus thuringiensis», FEMS Microbiology Letters142:173-177, 1996.

Lecuona, R.: Microorganismos patógenos empleados en el control de insectos plaga, Talleres Gráficos Mariano Mas, Buenos Aires, 1996.

López, Miriam: «Paecilomyces lilacinus (Thom) Samson: caracteriza- ción, reproducción y obtención de un biopreparado con efecto nematicida». Tesis en opción al grado científico de Doctor en Cien- cias Agrícolas, INISAV, La Habana, 1995.

Moore, D.; R. W. Caudwell: «Formulation of Entomopathogens for the Control of Grasshoppers and Locusts, Memoirs of the Entomological Society of Canada 171:49-67, 1997.

Posada, F. F.; M. P. Marín; S. M. Pérez: « Paecilomyces lilacinus , ene- migo natural de adultos de Hypothenemus hampei», Cenicafé (Co- lombia): 49(1):72-77, 1998.

Rhodes, D. J.; J. D. Smith: «Techniques for Quantifying the Ecological and Pathological Characteristics of Entomopathogenic Fungal Strains». Proceedings of the Brighton Crop Protection Conference- Pests and Diseases, 351-356, 1992

Sun, Jianzhong: «Screening and Characterization of Pathogenic Fungi for Possible Control of Coptotermes formosanus». A Dissertation Submitted to the Graduate Faculty of the Louisiana State University and Agricultural and Mechanical College in partial fulfilment of the requirements for the degree of Doctor of Philosophy in The Department of Entomology, May, 2002, http://etd.lsu.edu/docs/submitted/etd-

0415102-230223/unrestricted/Sun_dis.pdf

272/fitosanidad

FITOSANIDAD vol. 10, no. 4, diciembre 2006

Ecología

DISPERSIÓN, DISTRIBUCIÓN ACTUAL Y NUEVOS RESERVORIOS DE FRANKLINIELLA SCHULTZEI TRYBOM (THYSANOPTERA: THRIPIDAE) EN CUBA

Santiago F. Jiménez Jiménez, 1 Liuva Pérez López, 2 Martha Toro, 3 Criseida Granda, 4 Amelia Mateo, 5 Héctor Sariol, 6 Elisa Rodríguez, 7 Rodney Pérez, 8 Roquelina Jiménez, 9 Ángel Pérez-Alejo 10 y Ransés Vázquez 11

Instituto de Investigaciones de Sanidad Vegetal. Calle 110 no. 514 e/ 5. a B y 5. a F, Playa, Ciudad de La Habana, CP 11600, sjimenez@inisav.cu

1

2

3

4

5

6

7

8

9

Centro Nacional de Sanidad Vegetal. Laboratorio Central de Cuarentena Vegetal. Ayuntamiento 231 e/ San Pedro y Lombillo, Plaza de la Revolución, Ciudad de La Habana

Laboratorio Provincial de Sanidad Vegetal. Carretera a Santiago de Cuba Km 2½, Guantánamo

Laboratorio Provincial de Sanidad Vegetal. Carretera Siboney Km 6, Ternerito Lindo, Santiago de Cuba

Laboratorio Provincial de Sanidad Vegetal. Prolongación de Carbó 40, Alturas de Perera y calle Holguín, Holguín.

Laboratorio Provincial de Sanidad Vegetal. Carretera Central vía Santiago de Cuba Km 3½, Bayamo, Granma

Laboratorio Provincial de Sanidad Vegetal. Genaro Rojas 86 e/ Marcelino Diéguez y Antonio Barrera, Las Tunas, CP 75200.

Laboratorio Provincial de Sanidad Vegetal. Ave Finlay Km 2½ e/ Planta de Nitrógeno y Circunvalación Norte, Camagüey

Laboratorio Provincial de Sanidad Vegetal. Carretera Palmira Km 4, Cienfuegos

10 Laboratorio Provincial de Sanidad Vegetal. Carretera Maleza Km 2½, Santa Clara, Villa Clara

11 Instituto de Meteorología. Apdo. 17032, Habana 17, Ciudad de La Habana, CP 11700

RESUMEN

Durante el período 2001-2006 se realizaron muestreos en diferentes provincias de Cuba que permitieron actualizar la situación de F. schultzei en relación con el grado de dispersión logrado por la espe- cie, así como las plantas que le sirven de reservorios y su distribu- ción. Se detectó la presencia de esta especie de trips en la mayoría de las provincias del país, y se reconoció que su mayor distribución la alcanza en la región oriental, especialmente en Camagüey, Granma, Holguín, Santiago de Cuba y Guantánamo. Las especies botánicas sobre los que se detectó F. schultzei alcanzaron la cifra de 94, de las cuales 84 se informan por primera vez para el país. No obstante, el insecto se detectó de forma mayoritaria solamente sobre 24 espe- cies de plantas, básicamente vegetales, hortalizas y ornamentales. El mayor número de detecciones correspondió a las rosas de dife- rentes colores, y se realizó también un número considerable de ellas sobre quimbombó, abrojo, margaritas japonesas, lirios, espinaca, tomate, claveles, calabaza, carolá, berenjena y habichuelas, lo que apunta a las preferencias de F. schultzei . Debido a la posibilidad de infectarse con tospovirus, que presentan algunas de estas especies de plantas, y dada la capacidad vectora de estos patógenos –demos- trada por este trips en numerosos países, incluidos algunos de este hemisferio–, se considera que son ellas las que actualmente poseen el mayor peligro potencial de resultar afectadas por esas enfermeda- des virales.

Palabras claves: distribución, Frankliniella schultzei, reservorios, trips

ABSTRACT

Samplings in different provinces of Cuba were carried out during the period 2001-2006 that allowed upgrading the status of F. schultzei in relation with the dispersion grade achieved by the species, as well as the plants that serve it as reservoirs and their distribution. The presence of this trips species was detected in most of the provinces and it was recognized that its biggest distribution is reached in the oriental region, especially in Camagüey, Granma, Holguín, Santiago de Cuba and Guantánamo. Botanical species on those F. schultzei was detected reached the figure of 94 and 84 of them are informed the first time for the country. Nevertheless, the insect was only detected in a majority way on 24 species of plants, basically vegetables and ornamentals. The biggest number of detections corresponded to different colours roses, and a considerable number of them on quimbombó (lady’s fingers), thistle, Japanese daisies, irises, spinach, tomato, carnations, pumpkin, carolá, eggplant and kidney beans, what points out to the preferences of F. schultzei . Keeping in mind the possibility to be infected with tospovirus that present some of these species of plants and given the vector capacity of these patogens –demonstrated by this thrips in numerous countries, including some of our hemisphere–, it is considered they possess the biggest danger potential to be affected by this viral group at the moment.

Key words: distribution, Frankliniella schultzei, reservoirs, thrips

fitosanidad/273

Jiménez y otros

INTRODUCCIÓN

Frankliniella schultzei Trybom (Thysanoptera:

Thripidae) es una especie de trips que, además de fitófago, se incluye entre las confirmadas como vectores de tospovirus [Mound, 2002], razón que la convierte en un insecto plaga doblemente peligroso.

Según Vierbergen y Mantel, 1991 [citados por Kormelink et al., 1998], F. schultzei se distribuye en los trópicos, extendida a lo largo de África, Asia, Austra- lia, Caribe, Pacífico y América del Sur. También se in- forma en la Florida y en zonas de clima templado (in- troducida) como Gran Bretaña, Italia y Países Bajos. Palmer et al. (1992) le atribuyen hábitos polífagos (flo- res), y la informan en ají chile, algodón, compuestas, cebolla, sorgo y tomate, entre otras.

En Cuba Suris et al. (2001) realizaron el primer informe de la presencia de F. schultzei en sus formas clara y oscu- ra sobre los cultivos de papa y tomate. Posteriormente Pérez et al. (2004) confirmaron su presencia y la infor- maron sobre Phaseolus vulgaris L. (habichuela) y Cucumis sativus L. (pepino). En ambos casos los autores se refie- ren a muestras colectadas en provincias de la zona occi- dental del país (La Habana y Ciudad de La Habana), y mencionan una baja intensidad de la especie.

La forma oscura de F. schultzei está reconocida como vector de los cuatro tospovirus Tomato Spotted Wilt Virus (TSWV) [Samuel et al., 1930; Sakimura, 1969; Wijkamp et al., 1995], Tomato Chlorotic Spot Virus (TCSV), Groundnut Ringspot Virus (GRSV) [Wijkamp et al., 1995] y Chrysanthemum Stem Necrosis Virus (CSNV) [Nagata y de Ávila, 2000]. Esta forma oscura

está extendida a lo largo de América del Sur y se indica como un vector importante de tospovirus en Brasil (De Ávila et al., 1998) y Argentina [Williams et al., 2001]. Más recientemente Sakurai (2004) demostró también que

la forma oscura de F. schultzei, originaria de Paraguay,

puede transmitir TSWV eficazmente, y puede ser un vector importante del virus en los campos de tomate.

Este trabajo se realizó como una contribución al cono-

cimiento del grado de dispersión, la distribución actual

y la diversidad de hospedantes que posee F. schultzei

en Cuba, dado el peligro potencial que representa esta

especie, más que como fitófago, como vector de enfer- medades virales, particularmente de tospovirus.

MATERIALES Y MÉTODOS

El trabajo se llevó a cabo en dos etapas durante el pe- ríodo comprendido entre los años 2001-2006, y mediante

muestreos efectuados en las diferentes provincias del país, en los que se realizó la inspección local de áreas sembradas con plantas ornamentales (jardines domés-

ticos, jardines botánicos, jardines de instalaciones vin- culadas al turismo y otros); áreas productoras de cul- tivos en empresas y cooperativas agrícolas; semilleros

y viveros; áreas de floricultura; huertos intensivos,

organopónicos y cultivos protegidos y áreas citrícolas.

En la primera etapa, que comprendió del 2001 al 2003,

los muestreos mensuales se realizaron en el período com- prendido entre septiembre y marzo, y se tomó una muestra compuesta por no menos de 10 especies botá- nicas por provincia. En la segunda etapa, entre el 2004

y el 2006, los muestreos se extendieron a lo largo de

todo el año, y en cada inspección mensual se observa- ron no menos de 20 especies botánicas.

En los dos períodos se revisaron vegetales, hortalizas, viandas, frutales, ornamentales y otras. Las muestras estuvieron compuestas tanto de hojas como de hojas y flores, según el caso. Cada una de ellas, después de co- lectada, se introdujo de modo independiente en bolsas plásticas que se identificaron de acuerdo con el sitio de procedencia y la fecha de muestreo.

El material vegetal con los trips se revisó en las Esta- ciones Territoriales de Protección de Plantas (ETPP) de las diferentes provincias, con la finalidad de extraer de cada muestra los especímenes presentes e introdu- cirlos en viales con alcohol al 70%, en los que se anotó, para cada caso, el hospedante, el sitio de procedencia de la muestra y la fecha en que se obtuvo. Posterior- mente los viales se enviaron a los Laboratorios Provin- ciales de Sanidad Vegetal (LAPROSAV) para su iden- tificación y/o al Laboratorio Central de Cuarentena para su identificación y/o confirmación, según corres- pondiera. Para la ejecución del diagnóstico se utiliza- ron las claves de Palmer et al. (1992), Mound y Marullo (1996), Rodríguez et al. (1997) y Mound y Kibby (1998).

En la mapificación de las muestras con detecciones de F. schultzei se utilizó el Sistema de Cuadrantes Cartográficos [CNSV, 1997], según su versión digita- lizada [Vázquez et al., 2003]. Todo el trabajo se realizó en estrecha relación con la encuesta nacional de espe- cies peligrosas de trips, que patrocina el Centro Nacio- nal de Sanidad Vegetal.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Durante el período comprendido entre el 2001 y el 2003, de un total de 4818 muestras positivas para trips, solo

se identificó F. schultzei en 33 de las muestras revisadas,

274/fitosanidad

Dispersión, distribución actual

y estas correspondieron al último año de ese trienio.

Procedían fundamentalmente de las provincias de Guantánamo y Holguín, en el oriente de Cuba (Tabla 1).

Este resultado constituyó la primera evidencia del co-

mienzo de la dispersión de la especie, cuya presencia en

el país, hasta ese momento, se limitaba a las provincias

habaneras [Suris et al., 2001].

Del total de las muestras obtenidas en el período com- prendido entre el 2004 y el 2006 se realizaron 313 detecciones de F. schultzei, lo que demostró un nota- ble incremento respecto al período precedente, así como una mayor distribución por diferentes provincias del país (Tabla 1), con la mayor abundancia en la región oriental.

Tabla 1. Dispersión de F. schultzei en el país (período 2001-2006)

Provincias

 

Período I

 

Período II

2001

2002

2003

2004

2005

2006

Pinar del Río

0

0

0

0

0

1

La Habana

0

0

0

0

0

13

Ciudad de La Habana

0

0

0

0

0

6

Matanzas

0

0

0

0

0

2

Villa Clara

0

0

1

0

0

0

Cienfuegos

0

0

0

0

0

4

Sancti Spíritus

0

0

0

0

0

0

Ciego de Ávila

0

0

0

0

0

0

Camagüey

0

0

0

0

24

0

Las Tunas

0

0

0

1

0

0

Granma

0

0

2

4

8

2

Holguín

0

0

9

7

48

14

Santiago de Cuba

0

0

0

16

50

54

Guantánamo

0

0

21

37

22

0

Total

0

0

33

65

152

96

La ubicación de las muestras según el sistema de cua- drantes cartográficos permite visualizar el grado de

dispersión alcanzado por F. schultzei a lo largo del país en el curso de los años que comprendió el trabajo. En

el mapa se aprecia que la especie se distribuye mayor-

mente en las provincias de la región oriental de Cuba, básicamente Camagüey, Granma, Holguín, Santiago

de Cuba y Guantánamo, donde se localiza la mayor cantidad de cuadrantes en los que se ha detectado la presencia de la especie (Fig. 1).

En relación con los reservorios de F. schultzei, du- rante el estudio se detectó la presencia del insecto en 93 especies botánicas, de las cuales ocho ya habían sido informadas anteriormente: Lycopersicum lyco- persici Mill. [Surís et al., 2001], Vigna sesquipedalis F. (habichuela), Cucumis sativus L. [Pérez et al., 2004], Allium sativum L., Beta vulgaris L., Capsicum annum L., Portulaca oleracea L. y Argemone mexica- na L. [González y Surís, 2005]. Esto significa que se informan 85 nuevos reservorios de la especie para el país (Tabla 2).

La mayor preferencia de F. schultzei, según la frecuen- cia de detección registrada, se muestra en la Tabla 3, donde se relacionan las 24 especies de plantas sobre las cuales la especie se detectó en un número de muestras mayor o igual a cuatro. Entre ellas se incluyen funda- mentalmente vegetales, hortalizas y ornamentales. De todas las referidas, el mayor número de detecciones se produjo sobre quimbombó (7), abrojo y margaritas japonesas (8), lirios (9), espinaca (11), tomate (12), claveles (13), calabaza (15), carolá y berenjena (16), habichuela (19), y entre todas se destacaron las rosas de diferentes colores con 42 detecciones en cinco pro- vincias del país.

En consideración a la posibilidad de infectarse con tospovirus que presentan algunas de estas especies de plantas, y dada la capacidad vectora de estos patógenos demostrada por F. schultzei en numerosos países y bá- sicamente en este hemisferio norte [De Ávila et al., 1998; Williams et al., 2001; Sakurai, 2004], se considera que en Cuba son ellas las que, actualmente, poseen el ma- yor peligro potencial de resultar afectadas por dichas enfermedades virales.

fitosanidad/275

Jiménez y otros

Tabla 2. Relación de especies de plantas encontradas como nuevos reservorios de F. schultzei en Cuba

Nombre científico

Nombre común

Acalypha sp.

Rabo de gato

Allamanda cathartica Lin.

Alamanda

Allium cepa Lin.

Cebolla

Allium schoenoprassum Lin.

Cebollino

Althaea rosea Car.

Varita de San José

Amaranthus spinosus, Lin.

Bledo espinoso

Angelonia cubensis Robinson

Nomeolvides malva

Argyreia nervosa Boj.

Cordón de seda

Bastardia viscosa (L.)

Malva bruja

Begonia sp.

Begonia

Benincasa hispida Cong.

Calabaza china

Beta vulgaris L. var. cicla

Acelga

Bidens pilosa L.

Romerillo

Cajanus indicus Spreg

Frijol guandul

Calendula officinalis Lin.

Marigol

Callotropis procera (Ait.) R. Br.

Algodón de seda

Capsicum frutescens L.

Ají

Cassia fistula

Cañandonga

Cestrum nocturnum Lin.

Galán de noche

Citrullus vulgaris Schrad.

Melón

Codiaeum variegatum Blume.

Croton

Crinum sp.

Lirio flor

Cucurbita pepo L.

Calabaza

Dahlia coccinea Cav.

Dalia malva

Datura metel L.

Clarín

Daucus carota sativa D. C.

Zanahoria

Dianthus caryophyllus L.

Clavel

Gardenia jasminoides Ellis

Jazmín del cabo (gardenia)

Gerbera jamesonii Hort.

Margarita japonesa

Gliricidia sepium L.

Júpiter

Gossypium hirsutum L.

Algodón

Helianthus annuus Lin.

Girasol

Helychrysum bracteatum Andr.

Siempreviva

Hibiscus esculentus L.

Quimbombó

Hibiscus rosa-sinensis Lin.

Marpacífico

Hibiscus sp.

Hibiscus, Marpacífico

Tabla 3. Especies botánicas sobre las que se detectó F. schultzei en cuatro o más ocasiones y procedencia de las muestras

Nombre común

 

Nombre científico

Procedencia

Cebolla

A.

cepa

Guantánamo

Acelga

B.

vulgaris var. cicla

Holguín, Santiago de Cuba, Guantánamo

Romerillo

B.

pilosa

Ciudad de La Habana, Holguín, Guantánamo

Melón

C.

vulgaris

Holguín

Lirio flor

Crinum sp.

Santiago de Cuba

Pepino

C.

sativus

Holguín, Guantánamo

Calabaza

C.

pepo

Camagüey, Holguín, Santiago de Cuba, Guantánamo

276/fitosanidad

Dispersión, distribución actual

Dalia

D.

coccinea

Granma, Santiago de Cuba

Clavel

D.

caryophyllus

La Habana, Holguín

Margarita japonesa

G. jamesonii

Cienfuegos, Camagüey, Santiago de Cuba

Quimbombo

H.

esculentus

Holguín, Guantánamo

Marpacífico

H.

rosa-sinensis

Matanzas, Camagüey, Santiago de Cuba

Jazmín

Jasminum sp.

Holguín, Santiago de Cuba

Lechuga

L.

sativa

Ciudad de La Habana, Holguín, Santiago de Cuba

Tomate

L.

lycopercisi

Holguín, Santiago de Cuba, Guantánamo

Frijol

Phaseolus sp.

Holguín, Guantánamo

Rosa

Rosa sp.

Ciudad de La Habana, Las Tunas, Granma, Santiago de Cuba, Guantánamo

Berenjena

S.

melongena

Santiago de Cuba, Guantánamo

Espinaca

S.

oleracea

Holguín, Santiago de Cuba, Guantánamo

Carolá

T.

erecta

Pinar del Río, La Habana, Santiago de Cuba, Guantánamo

Copetúa

T.

patula

Holguín

Abrojo terrestre

T.

cistoides

Santiago de Cuba

Habichuela

V.

sesquipedalis

Villa Clara, Holguín, Santiago de Cuba, Guantánamo

Vicaria

V.

rosea

Santiago de Cuba

Guantánamo Vicaria V. rosea Santiago de Cuba Figura 1. Distribución por cuadrantes cartográficos de

Figura 1. Distribución por cuadrantes cartográficos de F. schultzei en Cuba según la ubicación geográfica de sus reservorios (2001-2006).

CONCLUSIONES

F. schultzei se dispersó a lo largo de Cuba entre el 2001 y el 2006, y diversificó sus reservorios hasta alcanzar la cifra de 92 especies botánicas.

• La más amplia distribución de la especie se registró en los territorios de las provincias de Camagüey, Granma, Holguín, Santiago de Cuba y Guantánamo.

• Se informan 84 especies de plantas que constituyen nuevos reservorios de F. schultzei para Cuba, entre

las cuales quimbombó, abrojo, margaritas japone- sas, lirios, espinaca, tomate, claveles, calabaza, carolá, berenjena, habichuela y especialmente las rosas re- sultan preferidas por el insecto.

REFERENCIAS