UNIVERSIDAD AUTNOMA DE GUERRERO UNIDAD ACADMICA DE CIENCIAS QUMICO-BIOLGICAS MANUAL DE PRACTICAS DE HEMATOLOGA PRCTICAS NO.

1 Y 2 TOMA DE MUESTRA SANGUNEA, PREPARACIN DE EXTENDIDOS DE SANGRE PERIFRICA Y TINCIN DE ROMANOWSKY OBJETIVOS: 1. Aplicar las tcnicas estandarizadas ms comunes en la obtencin de muestras de sangre perifrica con calidad analtica. 2. Realizar correctamente los extendidos de sangre perifrica e identificar las zonas caractersticas en estos 3. Explicar el fundamento de la tincin de Romanowsky INTRODUCCIN: La sangre es una suspensin, en la que aproximadamente el 50% del volumen total de esta corresponde al plasma y el otro 50% de este volumen corresponde a clulas que se encuentran suspendidas en el plasma. La obtencin de muestras de sangre para los estudios hematolgicos requiere de la aplicacin de las recomendaciones internacionales de control de calidad, que garanticen la integridad de la muestra. La puncin venosa es uno de los procedimientos ms comunes para extraer sangre, ya que posibilita la recoleccin de sangre venosa para posteriores anlisis de laboratorio, se requiere que el paciente est en condiciones basales (ayuno de 8 horas). Los sitos para puncin venosa son las venas del antebrazo y fosa antecubital; la vena baslica, ceflica y mediana del antebrazo y radial superficial, cubital superficial y mediana de la fosa antecubital. La obtencin de sangre capilar actualmente est limitada a estudios peditricos, anteriormente era el mtodo ideal de extraccin de sangre para realizar frotes sanguneos, ya que inmediatamente despus de la puncin se recoge en las laminillas para realizar los extendidos, sin que haya necesidad del uso de anticoagulantes que puedan alterar la el volumen de la sangre y morfologa celular. Para realizar los extendidos de sangre perifrica, se utiliza sangre venosa anticoagulada generalmente con EDTA (cido etilendiaminotetraactico) preferentemente en su forma seca analizados los extendidos antes de que transcurran 2 horas desde la extraccin de sangre, o bien sangre capilar directamente de la puncin al portaobjetos( es lo ideal). Es recomendable que la sangre anticoagulada sea utilizada inmediatamente para impedir alteraciones morfolgicas. El control de calidad en todas las fases del anlisis hematolgico es indispensable para lograr confiabilidad de los resultados, por lo que se recomienda obtener muestras de sangre con calidad analtica, siguiendo el protocolo para la toma de muestra que sea apropiada al estudio. La calidad de las extensiones de sangre es indispensable y esto depende del

anticoagulante usado, el tipo de sangre (venosa o capilar) con o sin anticoagulante. La tincin de Wright se fundamenta en la tincin de Romanowsky que consiste en una combinacin de azul de metileno y eosina. La accin combinada de estos colorantes produce el efecto de Romanowsky y da una coloracin prpura a los ncleos de los leucocitos y a los grnulos neutrfilos y una coloracin rosada a los eritrocitos. Los componentes principales causantes de este efecto son el azur B (un producto de oxidacin del azul de metileno) y la eosina Y. La amplia variacin en los colores y sombras observadas con la tincin de Romanowsky permiten distinciones sutiles de las caractersticas celulares. La naturaleza cida o bsica de las estructuras celulares determina su avidez por los componentes del colorante policromtico de Wright. MATERIAL: 1 gradilla Tubos de ensaye DE 13 X 100 mm con anticoagulante EDTA (3 por equipo) 1Pipeta automtica de 10 L con 5 puntas amarillas Lancetas estriles Portaobjetos limpios y desengrasados (segn recomendaciones) Jeringas o dispositivos para extraccin de sangre con tubos al vaco Torundas Torniquete o ligadura de 25 a 30 cm de largo Alcohol al 70% Gasas suficientes Etiquetas para identificar al paciente Contenedor de objetos punzo cortantes Puente para tincin Jabn de tocador para lavarse las manos Detergente lquido para lavado de material de vidrio Toallas de papel Franela o esponja Lpiz graso o crayola Reactivos: EDTA (cido etilendiaminotetraactico) Frasco gotero con colorante de Wright Metanol absoluto 100 mL Agua destilada pH 7 una piceta por equipo Amortiguador de fosfatos pH 6.4 100 mL (1 gotero) Solucin de hipoclorito al 5% para desinfeccin de mesas de trabajo. Material biolgico: Muestras de sangre anticoagulada con EDTA o sangre capilar Recomendaciones para limpieza de portaobjetos para extendidos de sangre. a) Lavar perfectamente los portaobjetos con detergente lquido y enjuagar con agua caliente b) Dejar escurrir en posicin vertical sobre papel absorbente c) Colocarlos en un frasco de vidrio de boca ancha y adicionar alcohol de 70 hasta cubrirlos d) Para utilizarlos retirarlos del frasco con una pinza y secarlos con gasa limpia hasta que no tengan restos de humedad

RECOMENDACIONES DE SEGURIDAD: 1.- ponerse la bata y despejar el rea de trabajo dejando sobre la mesa solo el material que va a utilizar en la prctica. 2.- desinfectar la mesa de trabajo con hipoclorito de sodio al 5% (cloro de uso domstico). 3.-seguir las recomendaciones universales para disminuir los riesgos al exponerse a productos biolgicos potencialmente contaminados, en la prctica clnica. Debido a que todos los pacientes pueden ser potenciales portadores de patologas que se transmiten por la va parenteral, sin tener un diagnstico objetivable, Las precauciones universales deben aplicarse en la prctica de la atencin de cualquier paciente en todo momento y en cualquier mbito de la atencin de salud, siendo esto lo que les confiere el carcter de Universales. a) Uso de gafas o tapabocas con visera durante la recoleccin de muestras con riesgo de salpicaduras procedentes de pacientes de con enfermedades infectocontagiosas. b) No re-enfundar agujas y desecharlas en el recipiente adecuado (o desechar la aguja y la jeringa en un galn destinado para tal fin, evitando la manipulacin. c) Preservar la tcnica asptica en la obtencin de muestras mediante procedimientos invasivos (venopuncin perifrica, catter central etc.) PROCEDIMIENTO PARA PUNCIN VENOSA 1.- Lavarse las manos perfectamente con agua y jabn. 2- Verificar la identidad del paciente; nombre y apellidos del paciente, edad, sexo, procedencia cuando proviene de otra institucin, tipo de muestra, diagnstico presuntivo, fecha y hora de toma de la muestra, medicacin (si el paciente est recibiendo tratamiento), tipo de estudio a realizar. Las muestras de los alumnos deben estar acompaadas de esta informacin. 3.- Preguntar al paciente si guard el ayuno adecuado (en caso necesario), preguntar la hora de la ltima ingesta. 4- Tranquilizar al paciente e informarle del procedimiento al que ser sometido. 5.-Colocar adecuadamente al paciente; sentado paralelamente a la mesa de trabajo, apoyar el brazo sobre la mesa colocando una almohadilla bajo el codo y la palma de la mano hacia .arriba. 6.-Verificar el material a utilizar; tubos, anticoagulante, jeringas torniquete, torundas etc. 7.-Pedir al paciente que abra y cierre el puo para palpar mejor las venas. 8.-Seleccionar una avena adecuada para la puncin. Evitar tomar la muestra en el brazo donde hay catter. No extraer sangre de la misma extremidad utilizada para la administracin intravenosa de medicamentos, lquidos o transfusiones. Si no existe otro sitio disponible, asegurarse que la puncin venosa se localiza por debajo del catter IV. Evitar las reas edematosas, paralizadas o el mismo lado de una masectoma, al igual que las infecciones y problemas cutneos. La puncin venosa causa infeccin, alteraciones circulatorias o retraso en la cicatrizacin.

9.- Desinfectar el sitio de puncin con una torunda con alcohol al 70%, con movimientos en espiral comenzando por el sitio que se puncionar y prosiguiendo hacia fuera, dejar que la zona se seque y no tocar con ningn objeto que no haya sido esterilizado previamente. 10.- Aplicar el torniquete varios centmetros arriba de la zona de puncin, este no se dejar ms de un minuto. 11.- Fijar firmemente la vena por encima y por debajo del sitio de puncin con ayuda de los dedos pulgar y medio o ndice y pulgar de la mano izquierda. 12.- Realizar la venopuncin; a) Penetrar a travs de la piel con la aguja formando un ngulo de 15 entre el brazo y la aguja con el bisel hacia arriba, seguir la direccin de la vena con la aguja. b) Introducir la guja con suavidad pero con rapidez para reducir las molestias al paciente. c) Si se usa jeringa, tirar del mbolo hacia atrs con tensin lenta y uniforme, a medida que la sangre fluye en su interior, este movimiento no debe ser muy rpido ya que se puede bemolizar la sangre o colapsar la vena. d) Si se utilizan tubos al vaco, en cuanto la aguja haya penetrado la vena, se dirigir el tubo todo lo posible hacia delante en el dispositivo de sujecin, al mismo tiempo sujetar tenuemente la aguja en su lugar. Se debe permitir que el tubo al vaci se llene hasta la marca indicada. 13.-Retirar la ligadura tirando del extremo doblado despus de obtener el volumen de sangre deseado. 14.-Colocar un pedazo de algodn seco sobre la parte donde se encuentra oculta la aguja. Sacar la aguja con un movimiento rpido y depositarla en el recipiente de metal con desinfectante. 15.-Pedir al paciente que presione firmemente el algodn durante 3 minutos, con el brazo extendido. No se recomienda que se flexione el brazo a causa del riesgo que se forme un hematoma. 16.-Mezclar por inversin suave la sangre 15 veces (cuando el tubo colector tiene anticoagulante). 17.-Si la hemorragia de la puncin contina durante un tiempo prolongado, eleve el rea y aplique una curacin con presin. Observe al paciente y verifique si no ha ingerido anticoagulante o cido acetilsaliclico. Si el paciente se marea o tiende al desmayo, haga que coloque la cabeza entre las rodillas o se acueste y pdale respirar profundamente. Aplique una toalla fra en al cabeza o parte posterior del cuello. En caso que permanezca inconsciente, notifique de inmediato al mdico tratante. 18.-Los hematomas se previenen con una tcnica adecuada que consiste en evitar que la aguja atraviese la vena, liberar el torniquete antes de extraer la aguja, aplicacin de suficiente presin sobre el sitio de la puncin y al mantener la extremidad extendida hasta que se detenga la hemorragia.

PROCEDIMIENTO PARA PUNCION CAPILAR: 1.-Si la puncin se realizar a un RN ste debe ser inmovilizado 2.-seleccionar el sitio de puncin 3.- en adultos el sitio adecuado para la puncin capilar es el pulpejo del dedo mediano o anular, cerca del borde, en nios el lbulo de la oreja, y en RN el taln del pie 4.-Se recomienda el lavado clnico de manos y uso de guantes si es necesario 5.-realizar la asepsia de la zona 6.-introducir la lanceta de 2 a 2.5 mm con un movimiento rpido 7.-presionar para extraer la cantidad necesaria de sangre desechando la primera gota 8.-depositar la muestra en capilar o laminilla. 9.-realizar hemostasis en el sitio de puncin y proteger con gasa estril 10.- verificar confort del RN 11.- si se presenta dificultades durante la puncin se recomienda repetirla, sobre todo cuando la muestra es insuficiente y se ha exprimido excesivamente la zona de puncin, ya que puede sufrir una hemodilucin por el lquido hstico.

PROCEDIMIENTO PARA REALIZAR LOS EXTENDIDOS DE SANGRE PERIFRICA 1. Desengrasar los cubreobjetos para las extensiones de sangre perifrica. 2. Obtener la muestra de sangre con anticoagulante EDTA o sangre capilar. 3. Homogenizar perfectamente la muestra por inversin 15 veces 4. Realizar el frotis por la tcnica de los dos portaobjetos que se describe en seguida:

a. Depositar una pequea gota de sangre (aproximadamente 5 L) en el extremo de un portaobjetos limpio y libre de grasa. b. Con el borde de otro portaobjetos a 45, tocar la gota, esperar a que la sangre se distribuya por capilaridad (sin permitir que la sangre toque los extremos del portaobjetos que se desliza) y despus deslizar suavemente pero con suficiente rapidez el portaobjetos sobre el otro en sentido longitudinal hasta que la gota quede bien extendida sobre la superficie del primer portaobjetos. c. El grosor de la extensin sangunea puede variar segn sea el ngulo que se forma entre los dos portaobjetos, si es superior a 45, la extensin ser gruesa y corta; si es inferior a 45 ser larga y fina. d. Dejar secar el frotis de 15 a 20 minutos a temperatura ambiente en posicin horizontal. e. Comprobar la distribucin de las clulas (con ayuda del microscopio con el objetivo de 10X) e identificar las tres zonas en los frotis antes de teir.

TINCIN DE WRIGHT 1. Colocar los extendidos en un plano horizontal en el puente para tincin con la extensin de sangre hacia arriba 2. Cubrir toda la superficie de la preparacin con Wright. Esperar de 3 a 5 minutos (el tiempo ptimo es determinado por ensayo y error). 3. Agregar un volumen igual de solucin amortiguadora (pH 6.4) o en su defecto agua de destilada de pH 7 con resultados igualmente

4.

5. 6. 7.

buenos. La cantidad de agua o buffer debe ser suficiente para cubrir la lmina completamente, pero no en exceso. Soplar suavemente el extendido con una pipeta de plstico para mezclar hasta obtener una pelcula uniforme de apariencia metlica verdosa. Esperar de 7 a 15 minutos (dependiendo de la maduracin del colorante). Lavar el colorante con agua corriente manteniendo los extendidos en posicin horizontal. El lavado debe ser rpido (5 - 30 segundos) para evitar la precipitacin del colorante sobre la superficie del extendido. Dejar secar al aire. Quitar con una gasa o algodn humedecido en alcohol, el colorante que queda adherido al dorso del portaobjetos, teniendo cuidado de que el alcohol no tenga contacto con la superficie coloreada.

TINCIN DE GIEMSA 1. Despus de realizar el extendido de sangre perifrica, dejar secar el frotis de 15 a 20 minutos 2. Fijar el extendido con 3 a 4 gotas de metanol absoluto por 3 minutos 3. Preparar en un tubo de ensayo una solucin con una proporcin de 1:9 con Giemsa y tampn PBS (1ml Giemsa y 9 ml PBS). 4. Cubrir la preparacin o sumergirla en la solucin preparada durante 10 minutos. 5. Lavar el portaobjetos con agua destilada. 6. Dejar secar. 7. Aplicar el cubreobjetos cuando sea necesario) sobre la preparacin. 8. Listo para su observacin en el microscopio. CUESTIONARIO 1. Explica en que radica el efecto anticoagulante del EDTA 2. Describe la frmula de la sal disdica del cido etilendiamiotetraactico(EDTA) 3. Menciona las ventajas del uso del EDTA 4. Cules son las zonas caractersticas de un extendido de sangre perifrica? 5. Cules estructuras celulares tienen afinidad por la eosina del colorante de Wright, de que color se tien y en que se fundamenta tal afinidad? 6. Menciona que estructuras tienen afinidad por el azul de metileno componente del colorante de Wright, el color que adquieren y explica el fundamento de esta afinidad 7. Cules pueden ser las causas de error en la tincin de extendidos sanguneos? 8. Cul es la funcin del Buffer en la tincin de Wright?

BIBLIOGRAFIA
1. McKenzie S.B. Hematologa Clnica, Segunda edicin, Editorial El Manual Moderno. 2000.

2. Gmez-Almaguer D., Manual de Hematologa Clnica, Segunda Edicin, Ediciones Cullar. 2000. 3. Vives y Aguilar. Manual de Tcnicas de Laboratorio en Hematologa, Segunda Edicin, Editorial masson, S.A.2006.