UNIVERSIDAD AUTNOMA DE COAHUILA ESCUELA DE CIENCIAS BIOLGICAS UNIDAD TORREN

MANUAL DE PRCTICAS DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGA GENERAL

ENERO-DICIEMBRE 2011

PREFACIO
Durante las ltimas dcadas, las clulas microbianas han proporcionado un modelo til para el estudio de los procesos de la vida, a causa de su diversidad, versatilidad y fcil manejo. Los estudios con microorganismos han contribuido en gran medida a lo que hoy se sabe de gentica, fisiologa y metabolismo. Los microorganismos han sido, adems, foco de creciente inters a causa de que pueden contribuir con soluciones a los principales problemas de la humanidad y en la bsqueda de la produccin de sus satisfactores. Es por eso, que la creciente importancia de la microbiologa, como ciencia bsica y aplicada, ha contribuido a aumentar el inters por su estudio por un gran nmero de estudiantes y profesionistas vinculados con el conocimiento y aplicacin de los microorganismos en procesos de la transformacin y en el rea de la salud pblica. Por consiguiente, te ofrezco el presente manual de laboratorio, con el fin de que te introduzcas en el interesante estudio del mundo de los microorganismos, desde sus principales tcnicas de tincin, hasta las tcnicas de cultivo de los microorganismos ms utilizadas por el hombre, que nos interesa conocer, estudiar y aplicar en los procesos que involucren su actividad biolgica. Esperando contar con tu invaluable apoyo para la aplicacin de las prcticas y la bsqueda del mejor resultado, te saluda tu amigo, LIC.BIOL. MANUEL RAMREZ PREZ, maestro de la materia de Microbiologa General.

NDICE Prctica 1: Esterilizacin de material de laboratorio ------------------------------------------Prctica 2: Control de microorganismos por medios fsicos y qumicos (Mtodo de vaciado en placa o placa vertida) -------------------Prctica 3: Uso del microscopio ptico y la lente de inmersin en aceite ------------------Prctica 4: Tincin simple y tincin diferencial de Gram -------------------------------------Prctica 5: Tincin cido-resistente y de la pared bacteriana --------------------------------4 6 8 11 13

Prctica 6: Clasificacin de los medios de cultivo en selectivos, enriquecidos, diferenciales y de enriquecimiento ---------------------------------------------------------------------- 16 Prctica 7: Tcnica de siembra por estras en medio slido y mtodo de la gota o de Miles y Misra -------------------------------------------------------------------------- 18 Prctica 8: Siembra de microorganismos en agar profundo, agar inclinado y extensin en placa ---------------------------------------------------------------------------- 20 Prctica 9: Determinacin del nmero ms probable (nmp) ------------------------------------- 22 Prctica 10: Estudio de la morfologa de levaduras y hongos, cultivo de hongos ------------- 24

Prctica 1

Fecha:______/______/______ ESTERILIZACIN DE MATERIAL DE LABORATORIO

OBJETIVO El estudiante conocer el manejo del material que va a esterilizarse antes y despus de su uso y aprender el manejo de la autoclave y/o olla de presin como equipo utilizado para la esterilizacin de material utilizado en el laboratorio microbiolgico. INTRODUCCIN En algunos casos, como sucede en el trabajo microbiolgico, el material con el que se trabaja necesita de una asepsia que no se consigue con la aplicacin de agentes qumicos. Es necesario, por consiguiente, recurrir al proceso de esterilizacin. Mediante ste, se logra matar cualquier espora o microorganismo, que pudiera interferir en nuestra labor provocando contaminaciones en los cultivos o infecciones en los organismos. Este proceso de esterilizar el material debe llevarse a cabo con gran responsabilidad y en forma meticulosa, sobre todo si se trabaja con seres humanos. Como mtodos principales de esterilizacin se utilizan el calor seco (mayor temperatura en hornos), el calor hmedo (menor temperatura en autoclaves), as como diferentes tipos de radiaciones, entre las cuales la luz ultravioleta que acta sobre cidos nucleicos es la ms frecuente. En estos casos, lo primero que debe hacerse es lavar el material, enjuagarlo con agua destilada; una vez seco, se envuelve con papel destrasa limpio, grueso, flexible, resistente a las temperaturas altas (como el papel manila, revolucin o canela) y en algunos casos a la humedad (hojas de estao o aluminio). Esto se hace para que al sacar el material de la esterilizacin se pueda conservar por un tiempo ilimitado en condiciones de asepsia. As solo debe desenvolverse cuando se vaya a usar, cuidar el nivel del agua en el autoclave. CONCEPTOS ANTECEDENTES Calor hmedo (autoclave) Calor seco (horno para esterilizar) Esterilizar Radiacin ultravioleta Esterilizacin a la flama Fenol PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL. EXPERIMENTO 1 PREPARACIN DEL MATERIAL 1.- Lave el material de laboratorio que se va a esterilizar con una solucin jabonosa 2.- Enjuague el material con agua corriente 3.- Enjuague el material con agua destilada perfectamente 4.- Escurra el material a esterilizar 4

5.- Envulvalo en papel para esterilizar segn lo indique su instructor 6.- Esterilice el material en el autoclave segn se lo indique su instructor PROCEDIMIENTO PARA LA ESTERILIZACIN EN AUTOCLAVE 1.- Asegrese que el agua introducida en el autoclave alcance el nivel de la placa metlica perforada o diafragma. 2.- Verifique el buen funcionamiento de la vlvula de seguridad. 3.- Disponga el material a esterilizar sobre la placa metlica o diafragma (conviene que no estn demasiado juntos con el fin de permitir el libre paso del vapor de agua). 4.- Recubrir los recipientes de papel de embalar que proteger a los algodones de que se manchen. 5.- Cerrar el autoclave teniendo cuidado de verificar el que la tapadera quede perfectamente acoplada sobre la junta de goma, una marca permite acoplar la tapadera siempre en la misma posicin, en aquellos casos en que no este sujeta mediante una charnela al cuerpo del aparato. 6.- Ajuste los bulones encontrados sin apretarlos. 7.- Caliente el autoclave manteniendo abierta la vlvula de purga, el aire se expulsa. 8.- Purgado el aparato (se manifiesta por la salida de un chorro de vapor de agua continuo) se cierra la vlvula. El manmetro indica el aumento de la presin en el interior del aparato. 9.- La esterilizacin termina cuando la temperatura deseada se ha mantenido durante un tiempo suficiente (por ejemplo 15 minutos a 121 C o 15 libras de presin), o la instruccin indicada en la etiqueta del medio de cultivo utilizado. 10.- Terminado el tiempo de esterilizacin se interrumpe el calentamiento de la autoclave y se espera hasta que la presin descienda a cero y solo entonces se restablece el equilibrio procedindose entonces a levantar la tapadera de la autoclave para sacar el material esterilizado, cuida de utilizar guantes de asbesto para retirar la canastilla de la camisa del autoclave. EXPERIMENTO 2 ESTERILIZACIN DE MATERIAL SUCIO 1.- Esterilice material sucio en la olla de presin (30 minutos de exposicin a 121 C o 15 libras de presin) 2.- Elimine el contenido en el vertedero si esta lquido, los medios de cultivo se desechan en la tina de basura, junto con el material de papel, aluminio u otros materiales que pueden tapar el vertedero. CUESTIONARIO 1.- Define esterilizacin. 2.- Investiga dos mtodos fsicos y dos qumicos que puedes utilizar para esterilizar material de laboratorio en microbiologa. 3.- Investiga la accin del fenol como desinfectante. 5

Prctica 2

Fecha:______/______/______ CONTROL DE MICROORGANISMOS POR MEDIOS FSICOS Y QUMICOS

OBJETIVO El estudiante determinar el punto trmico letal de un microorganismo y determinar las propiedades bactericidas de un detergente comercial. INTRODUCCIN Las actividades enzimticas de los microorganismos, determinantes en la existencia de los mismos, son regulados en parte por la temperatura. Las temperaturas superiores a la mxima inhibe la actividad enzimtica y por ende el desarrollo microbiano, ocasionado por lo general efectos letales, en cambio temperaturas menores a la mnima ejerce una accin esttica, esto es, solo se inhibe su multiplicacin sin causarle necesariamente la muerte. Existen infinidad de productos qumicos comerciales empleados como sustancias germicidas. Su modo de accin es en unas conocida y desconocida para otros. Generalmente, sin embargo, bien pueden alterar la permeabilidad celular, la naturaleza coloidal del protoplasma o inhibir la actividad enzimtica. La evaluacin de la accin germicida de un producto se determina por lo general en comparacin con el coeficiente de fenol. Uno de los procedimientos de rutina para determinar el contenido bacteriano de muchos materiales diferentes es la tcnica de recuento en placa. Este procedimiento est basado en el supuesto de que cada clula visible desarrollar una colonia; de aqu que al nmero de colonias en la placa revelar el nmero de organismos contenidos en la muestra que son capaces de crecer bajo las condiciones especficas de incubacin. El espcimen se diluye para que una de las placas finales tenga entre 30 y 300 colonias. El nmero de colonias dentro de este rango da la ms adecuada aproximacin de la poblacin microbiana. Debido a que la poblacin en el espcimen original no se conoce de antemano, debe ser preparado y sembrado una serie de diluciones para obtener una placa dentro del rango citado anteriormente. CONCEPTOS ANTECEDENTES - Temperatura de muerte trmica - Actividad enzimtica - Bacteriosttico - Compuesto de amonio cuaternario - Fenol - Desinfectante PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL. EXPERIMENTO 1 CONTROL DE MICROORGANISMOS POR MEDIOS FSICOS 1.- A una serie de 4 tubos de ensaye de 16 x 150 mm que contengan 10 ml de agua estril, hacer una suspensin de microorganismos (Escherichia coli) y colocarla a bao mara a diferentes temperaturas 20 C, 45 C, 80 C y 100 C cada tubo por un trmino de 15 minutos. - Letalidad - Bactericida - Detergente - Iodoforo - Desinfeccin - Sanizante

2.- Despus tomar 1 ml de cada tubo y transferirlo a cada caja de petri estril (una caja por cada tubo utilizado), y agregar despus el medio de cultivo correspondiente (agar nutritivo), preparar cuatro tubos de ensaye de 16 x 150 con 15 ml de agar nutritivo cada uno de ellos. 3.- Homogenizar las cajas con la muestra y el agar como se lo indique su instructor, dejar solidificar las cajas e incubar las mismas en forma invertida en una estufa de incubacin a 35 C 2 por 24 hrs. 4.- Sacar las cajas de la incubacin y leer los resultados. EXPERIMENTO 2 CONTROL DE MICROORGANISMOS POR MEDIOS QUMICOS 1.- En un tubo de ensaye de 16 x 150 mm poner 10 ml de solucin salina estril y hacer una suspensin bacteriana con el microorganismos problema ( Escherichia coli). 2.- Preparar tres tubos de ensaye de 16 x 150 mm con 9 ml de solucin salina estril cada uno. 3.- De una muestra concentrada de detergente a utilizar tomar 1 ml con pipeta de 1 ml estril (esterilizar cuando menos 4 pipetas de 1 ml por muestra a probar), poner este mililitro en el primer tubo esta ser la dilucin 1: 10, de este dilucin tomar 1 ml y ponerlo en el segundo tubo, esta ser la dilucin 1.100 y de esta dilucin tomar 1 ml y ponerlo en el tubo 3, esta ser la dilucin 1. 1000. 4.- Para cada dilucin se tendr una caja de petri estril y un tubo de 16 x 150 ml con 15 ml de agar cuenta estandar de contenido por cada caja de petri, incluyendo una caja de petri para hacer una prueba con el detergente concentrado. 5.- De cada dilucin de microorganismo realizada se toma un ml de muestra y se coloca en el centro de cada caja de petri marcada con la dilucin correspondiente, se funde el agar de los tubos a bao mara y se baja su temperatura a 24 C aproximadamente, al tener esta temperatura se vierte cada tubo con agar en cada caja de petri correspondiente, se homogeniza y se deja solidificar el agar ya homogenizado con la muestra. 6.- Ya solidificadas las muestras se incuban por 24 horas a una temperatura de 35 C 2 en forma invertida para prevenir la evaporacin. 7.- Despus de este tiempo de incubacin, saque las cajas de la incubadora y registre sus resultados. CUESTIONARIO 1.- Por qu es importante la temperatura de incubacin? 2.- Por qu la utilizacin de los diferentes gradientes de temperatura aplicados a los microorganismos? 3.- Por qu es importante la dilucin de los microorganismos en 10-1, 10-2 y 10-3?

Prctica 3

Fecha:______/______/______

USO DEL MICROSCOPIO PTICO Y LA LENTE DE INMERSIN EN ACEITE OBJETIVO El estudiante se familiarizar con el manejo y partes del microscopio ptico. El estudiante aprender a utilizar la lente de inmersin en aceite. INTRODUCCIN El microscopio ptico o compuesto es un aparato de precisin que consiste en una serie de lentes diseadas y acomodadas para proveer, en condiciones ptimas las mximas amplificaciones posibles que pueden ser de 1000 a 2000 veces (x) el dimetro del espcimen que se va a observar. Es necesario aclarar que casi siempre las mayores amplificaciones las obtienen los microscopistas con gran experiencia y con la ayuda de equipos auxiliares. La lente de inmersin en aceite se debe usar correctamente para obtener resultados seguros. El aceite de inmersin que ms se utiliza tiene las mismas caractersticas pticas (ndice de refraccin) que el vidrio. En consecuencia con este sistema, los rayos de la luz pasar directamente del portaobjetos al lente del objetivo de 100 X o lente de inmersin. Si no se utilizara dicho aceite los rayos de luz se refractaran (desviaran) debido al aire presente entre el portaobjetos y el objetivo, y entrara menos luz al microscopio. Si se siguen con sumo cuidado las instrucciones siguientes se debe obtener una buena iluminacin y observacin del espcimen en cuestin. CONCEPTOS ANTECEDENTES - Ocular - Platina - Condensador - Diafragma o iris - Tornillo micromtrico - Objetivo seco dbil - Objetivo de inmersin - Tubo del ocular - Frotis - Xileno - Portaobjetos - Tornillo Macromtrico - Objetivo seco fuerte - Ocular - Aceite de inmersin - Pie - Revolver

PROCEDIMIENTO PARA EL MANEJO Y ENFOQUE DEL MICROSCOPIO. 1.- Limpiar todos los lentes con el papel especial para ello 2.- Colocar el objetivo seco dbil (10X) en posicin debajo del tubo del cuerpo del microscopio. Sentir un chasquido cuando haya quedado bien colocado. 3.- Conectar la fuente de luz y encenderla 4.- Poner la preparacin del portaobjetos sobre la platina del microscopio y asegurarla con las pinzas o sujetadores correspondientes o cualquier otro medio adecuado. 5.- Acomodar la posicin de la preparacin que se va a examinar en la apertura central de la platina. 6.- Bajar el objetivo seco fuerte (40X) con la ayuda del tornillo macromtrico a aproximadamente medio centmetro por encima del cubreobjetos de la preparacin. 8

7.- Elevar el condensador al mximo con la ayuda del tornillo de ajuste del condensador. 8.- Observar por el ocular y luego mover la palanca del diafragma del iris de tal modo que ste se abra a su lmite mximo. Tal lmite se determina mirando por el ocular y observando los cambios en la intensidad de la luz al mismo tiempo que se manipula la palanca del iris; si la luz es demasiado brillante hacer los ajustes necesarios. 9.- A continuacin enfocar hacia arriba con el tornillo micromtrico hasta que el espcimen se observe con toda claridad, cuando el microscopio tiene un tubo de cuerpo en posicin fija, la platina se controla con los tornillos de ajuste respectivos. 10.- Para cambiar de objetivos (pasar de seco dbil a seco fuerte) no elevar el tubo del cuerpo del microscopio, sino simplemente hacer girar el objetivo deseado para colocarlo en su lugar. El microscopio debe permanecer en foco con cualquier objetivo y si as es en efecto se dice que posee la propiedad de ser par focal. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL. EXPERIMENTO 1 ENFOQUE DEL MICROSCOPIO Y OBSERVACIN CON OBJETIVOS SECO DBIL (10X) Y SECO FUERTE (40X) 1.- Limpiar el portaobjetos y cubreobjetos, en la forma que indique el instructor y colocar una gota de agua en el centro del portaobjetos. 2.- A continuacin cortar varias letras del peridico y asegurarse que por lo menos una de ellas sea e minscula. 3.- Colocar la serie de letras en la gota de agua y tapar la preparacin con un cubreobjetos. Con el fin de limitar la cantidad de burbujas de aire en esta preparacin, observar las siguientes indicaciones: a.- Poner el borde del cubreobjetos sobre la gota de agua del portaobjetos de tal manera que el fluido humedezca por completo el borde. b.- A continuacin colocar la aguja de inoculacin bajo el cubreobjetos y hacer descender este sobre el portaobjetos. 4.- Realizar el examen y hacer un dibujo de la letra (e) aproximadamente con las mismas dimensiones con que aparece en el portaobjetos. 5.- Examinar la preparacin bajo los objetivos seco dbil (10x) y seco fuerte (40X). 6.- Dibujar los campos del microscopio observados EXPERIMENTO 2 OBSERVACIN CON EL OBJETIVO DE INMERSIN (100X) 1.- Colocar en posicin el frotis sanguneo sobre la platina del microscopio. 2.- Elevar el tubo del cuerpo del microscopio y hacer girar el objetivo seco fuerte hasta colocarlo en posicin. 9

3.- Bajar el objetivo hasta acercarse al espcimen sin llegar a tocarlo. 4.- A continuacin, enfocar hacia arriba con el tornillo micromtrico hasta que el espcimen entre en el campo de visin. Nota.- Para localizar rpidamente el espcimen buscar siempre una regin que tenga un color o una intensidad diferente a otras partes del portaobjetos. 5.- Hacer los ajustes de iluminacin si es necesario. 6.- hacer girar hacia un lado el objetivo seco fuerte. 7..- Colocar una gota de aceite de inmersin sobre la preparacin y desplazar a su posicin la lente de inmersin en aceite. El objetivo debe tocar el aceite. 8.- Observar por el ocular y proceder como se indica en el paso 4. Nota.- Cuando se trabaja con frotis bacterianos la tendencia general es pasar por alto los pasos 2 al 4 y emplear directamente la lente de inmersin en aceite. Cuando esto se hace: a.- El aceite se coloca sobre el portaobjetos y b.- La lente se hace descender hasta el aceite sin llegar a tocar el portaobjetos. El enfoque se logra como se indica en los pasos 4 y 5. Para localizar bacterias en el portaobjetos se deben buscar zonas de color o caractersticas de intensidad distintas. 9.- Dibujar e identificar un campo representativo del frotis de sangre y frotis bacteriano. CUESTIONARIO 1.- Cul es la amplificacin total que se puede obtener con el objetivo seco dbil, seco fuerte y de inmersin? 2.- Qu sucedi con la orientacin original de la letra e cuando se movi el portaobjetos de la preparacin. a.- de lado a lado y b.- de arriba a abajo 3.- Establezca la diferencia entre poder de resolucin y par focal. 4.- Desarrolla el procedimiento para preparar un frotis bacteriano.

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Prctica 4

Fecha:______/______/______ TINCIN SIMPLE Y TINCIN DIFERENCIAL DE GRAM

OBJETIVO El estudiante conocer y aplicar los mtodos de tincin simple y diferencial de Gram. INTRODUCCIN Los tres colorantes ms comnmente usados en las tinciones microbiolgicas son la Fuscina Fenicada, el azul de metileno y el Violeta de genciana o Cristal violeta. Cualquiera de estas soluciones pueden ser empleadas sola o combinadas con otros colorantes y productos qumicos, en cualquiera de los muchos mtodos especiales de tincin. Los microbilogos dividen los colorantes en cidos, bsicos y neutros; con el uso de estos colorantes la mayora de las clulas bacterianas intactas se tien profundamente y uniformemente como en los ncleos de las clulas de vegetales y animales superiores. En las tinciones simples solamente se usa uno de estos tipos de colorantes para teir las estructuras celulares. El mtodo de coloracin diferencial de Christian Gram sirve para dividir las bacterias en dos grupos: a.- Los llamados organismos Gram positivos, que conservan el color morado del colorante de Cristal Violeta. b.- Los organismos Gram negativos, que pierden el color morado y se colorean de rojo por contrate con el colorante de Safranina. En consecuencia, la coloracin diferencial de Gram ayuda para la identificacin de bacterias desconocidas, ste mtodo de coloracin da mucha seguridad en el diagnstico de enfermedades infecciosas mediadas por bacterias. CONCEPTOS ANTECEDENTES - Colorante - Tincin - Coloracin diferencial - Diagnstico PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL PREPARACIN DE LAS MUESTRAS 1.- Los portaobjetos debern de limpiarse con jabn y agua, enjuagarse bien para liberarlos de residuos de jabn. 2.- Marque los portaobjetos de la siguiente manera: A.- Tincin simple B.- Tincin Gram Positiva C.- Tincin Gram Negativa 11 - Grupo cromgeno - Grupo auxocrmico - Frtis - Fijacin de un frtis

3.- Coloque una gota de solucin salina en el centro del rea marcada en el portaobjetos para preparar el frotis (el rea se marca con un marcador permanente de punta fina) 4.- Tome una asada del cultivo de E. coli y colquelo sobre la gota de solucin salina y distribyala bien en los portaobjetos A y C. 5.- Tome una asada del cultivo de Staphylococcus aureus y colquelo sobre la gota de solucin salina y distribyala bien en el rrea marcada en el portaobjetos B. 6.- Fije los frotis al calor indirectamente a la flama de un mechero, hasta que se observe seca la preparacin, evite que se caliente demasiado. EXPERIMENTO 1 TINCIN SIMPLE 1.- Al portaobjetos marcado con la letra A coloque dos o tres gotas del colorante de azul de metileno por 60 a 90 segundos. 2.- Despus de este tiempo, lave perfectamente bien con agua corriente (de la llave) procurando que el agua no peque de lleno en la preparacin del frotis. 3.- Seque la preparacin al aire 4.- Enfoque la preparacin al microscopio con los objetivos de 10X y 40X y observe la preparacin con el objetivo de 100X o de inmersin. 5.- Dibuje las imgenes vistas al microscopio y describa sus observaciones. EXPERIMENTO 2 TINCIN DIFERENCIAL DE CHRISTIAN GRAM 1.- A los portaobjetos marcados con By C, agregue de 3 a 5 gotas del colorante de cristal violeta de Gram por un trmino de 60 segundos. 2.- Lave la coloracin con agua corriente procurando que el chorro no peque de lleno sobre la muestra. 3.- Aada a la preparacin yodo de Gram por un trmino de 60 segundos y vuelva a lavar la preparacin. 4.- Decolore la muestra con el preparado de alcohol acetona al 50% (2 o 3 picetazos) y vuelva a lavar la preparacin. 5.- Por ltimo aada el colorante de contraste de Safranina de Gram por un trmino de 10 a 30 segundos. 6.- Lave y seque la muestra, observe con objetivo de inmersin. 7.- Dibuje las imgenes vistas al microscopio y describa sus observaciones. CUESTIONARIO 1.- Explique que es un colorante 2.- A que se denomina en un colorante el grupo cromgeno y el grupo auxocrmico 3.- En que consiste la tincin negativa de los microorganismos. 12

4.- Qu papel desempea la pared celular en la tincin de Christian Gram 5.- Pueden las clulas de levadura, animal y vegetal ser divididas en Gram positivas o Gram negativas? Prctica 5 Fecha:______/______/______ TINCIN CIDO-RESISTENTE Y DE LA PARED BACTERIANA OBJETIVO El estudiante aprender la tcnica que se utiliza para teir los microorganismos que pertenecen al grupo de los bacilos alcohol-cido resistentes y de la tincin de la pared bacteriana en el microorganismo Bacillus subtilis INTRODUCCIN La tincin cido resistente se llama as debido a la naturaleza cida del agente decolorante empleado (una solucin de HCl al 3% en alcohol etlico al 95%). Los organismos cido resistentes son capaces de retener el colorante primario a pesar de lo enrgico del procedimiento de decoloracin; los organismos cido resistentes son capaces de retener el colorante primario debido a que este colorante es ms soluble en las sustancias lipoides presentes en estos organismos, que en la solucin decolorante. Otra caracterstica de la tincin cida resistente es el empleo de calor como agente intensificador del colorante primario, de hecho el colorante primario es forzado a penetrar en la clula por medio de la aplicacin de calor hasta que el colorante empiece a vaporizarse, este procedimiento es necesario debido a que los miembros de este grupo, poseen una concentracin elevada de material graso en su citoplasma. La pared celular bacteriana es una estructura que delimita la clula bacteriana, que est situada sobre la membrana citoplasmtica, la cual, a su ves, recubre el citoplasma. Por su parte externa, la pared est rodeada por la cpsula, cuado sta existe o por la capa mucoide pericelular. Segn Knaysi (1951) la existencia de la pared celular fue sospechada hacia 1872 por Cohn, que atribuyo la resistencia dela clula bacteriana hacia la desintegracin por parte de cidos y lcalis, no la insolubilidad del citoplasma sino la existencia de una membrana que ejerca una accin protectora. La primera demostracin directa de la pared celular es debida Fischer (1894), el cual se sirvi para tal final del fenmeno de la plasmolisis, obtenindose una patente separacin de la pared celular del resto del cuerpo bacteriano. La propiedad fundamental de la pared celular es la rigidez; si no fuese as, las bacterias, por accin de las fuerzas de tensin superficial relativamente enormes, estaran obligadas a tomar nicamente la forma que corresponde a la mnima relacin entre la superficie y volumen, esto es, la forma esfrica, posee adems de la rigidez, otras importantes cualidades: la ductilidad y la elasticidad. El espesor de la pared celular presenta amplias diferencias, no solo en relacin con la especie bacteriana, sino tambin con el mtodo de medida; los valores medios que han sido obtenidos demuestran que la pared celular ocupa una parte considerable del volumen total del organismo bacteriano. Sus componentes principales son los hidratos de carbono (celulosa y hemicelulosa), algunas sustancias nitrogenadas (quitina), protenas, una fraccin lipdica y en los organismos Gram Positivos cidos teicoicos, a excepcin del magnesio, no ha sido demostrada la presencia de metales. CONCEPTOS ANTECEDENTES - Decolorante - Agente intensificador - Pared celular - Bacteria Gram negativa - Lpidos - Mycobacterium - Bacteria Gram positiva

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PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL EXPERIMENTO 1 TINCIN ALCOHOL CIDO RESISTENTE 1.- En un portaobjetos limpio y desengrasado marque un rea con el marcador permanente. 2.- Prepare un frote con el esputo autoclaveado. 3.- Seque el frote al aire y fjelo al calor. 4.- Coloque la preparacin sobre una tela de asbesto en el tripie de metal. 5.- Cubra la preparacin con el colorante de carbol fucsina de Ziehl Neelsen. 6.- Caliente la preparacin con el mechero a la llama lenta, procurando que se desprendan vapores y no hierva el colorante, evitando que el colorante se seque, agregue el colorante perdido continuamente. 7.- Continu calentando por 15 minutos, siempre agregando el colorante perdido. 8.- Despus de este perodo de tiempo, lave la preparacin con agua corriente hasta que se retire el exceso de colorante. 9.- Decolore su preparacin con el alcohol cido hasta que no se desprenda ms colorante. 10.- Lave la preparacin con agua corriente y despus agregue el colorante de contraste (azul de metileno) dejndolo actuar por 5 minutos. 11.- Lave la preparacin con agua corriente, seque al aire y examine con el objetivo de inmersin. 12.- Dibuje las imgenes vistas al microscopio y describa sus observaciones. EXPERIMENTO 2 TINCIN DE LA PARED DEL Bacillus subtilis 1.- Prepare un frote relativamente concentrado de B. Subtillis sobre un portaobjetos limpio y desengrasado. 2.- Antes de que la suspensin bacteriana se seque sobre el portaobjetos, cbrala directamente con la solucin fosfomolbdico y djelo reaccionar cuatro minutos. 3.- Incline completamente el portaobjetos sobre el fregadero para drenar totalmente el cido fosfomolbdico; luego agregue el colorante de verde de metilo directamente sobre el frote hmedo y djelo reaccionar durante cinco minutos. 4.- Lave suavemente en la llave. Es inevitable que al lavar en la llave, algo del material se desprenda del frote; trate de minimizar el desprendimiento, pero al mismo tiempo lave bien hasta que el agua ya no arrastre colorante. 5.- Seque al aire, despus examine con el objetivo de aceite de inmersin. 14

6.- Si tio correctamente, las paredes celulares aparecern de un verde obscuro azul, mientras que el citoplasma se vera de un verde claro bien incoloro. 7.- Con esta tincin es necesario examinar tres campos bien hasta encontrar al ms demostrativo. 8.- Dibuje las imgenes vistas al microscopio y describa sus observaciones. CUESTIONARIO 1.- Mencione y explique las caractersticas que se relacionan con las bacterias cido resistentes. 2.- Explique por qu se considera el bacilo de Hansen (M. leprae) un bacilo cido resistente. 3.- Qu sustancia o compuesto qumico podra utilizar junto con el colorante para suprimir la utilizacin del calor en la tcnica. 4.- Cul es funcin principal de la pared celular bacteriana? 5.- Cul es la formula del cido fosfomolbdico? 6.- Que funcin desempea el cido fosfomolbdico en la tcnica de tincin para paredes celulares? 7.- Cuales son las principales diferencias entre las paredes celulares de las bacterias Gram negativas y las Gram positivas?

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Prctica 6

Fecha:______/______/______

CLASIFICACIN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO EN SELECTIVOS, ENRIQUECIDOS, DIFERENCIALES Y DE ENRIQUECIMIENTO. OBJETIVO El estudiante aprender el manejo de los diferentes tipos de medios de cultivo, de acuerdo a su aplicacin, as mismo, aplicar las tcnicas correctas de preparacin de medios de cultivo y de siembra microbiolgica. INTRODUCCIN Las distintas mezclas de sustancias nutritivas empleadas en el laboratorio microbiolgico para el cultivo de microbios se denominan medios de cultivo. Existen muchos tipos de medios de cultivo que van desde los ms simples, como el agar nutritivo, hasta los agares ms complejos como los medios enriquecidos y selectivos. Los medios selectivos y diferenciales son los que utiliza el microbilogo para el cultivo primario de alguna muestra, a veces utiliza un medio preparado de modo que ponga de manifiesto las diferencias cuando se inicia el desarrollo entre aquellos organismos que se quieren estudiar y otros grmenes que puedan existir en la muestra; los medios especiales y enriquecidos son los que se preparan enriqueciendo caldo o agar simple con la adicin de carbohidratos, sangre, suero sanguneo, casena digerida, extracto de levadura u otras substancias nutritivas especiales. Los medios sintticos se utilizan para estudios precisos de nutricin y metabolismo; la mayora de los medios de cultivo utilizados se encuentran en el comercio en forma de polvos secos (deshidratados), los cuales se transforma fcilmente en medios de cultivo por la adicin de agua y su ulterior esterilizacin. Los medios lquidos (caldos) se preparan en tubos o matraces que se cubren con tapones de algodn o tapas especiales, un cultivo lquido puede ser transferido mediante una asa microbiolgica, un hisopo, una pipeta o una pipeta Pasteur; el lquido se deposita dentro del caldo o medio lquido. En este tipo de cultivos los microorganismos presentan un desarrollo particular que se manifiesta en la superficie o a travs de todo el lquido. CONCEPTOS ANTECEDENTES - Medio selectivo - Medio de enriquecimiento - Germen - Siembra microbiana PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL 1.- Lave y seque el material de vidrio y prepare las cajas de petri y tubos de ensaye de 16 x 150 mm con tapn de rosca para esterilizar. 2.- Cada equipo deber preparar los medios de cultivo que se van a utilizar en la prctica (Agar Eosina-Azul de Metileno, Agar S-110, Agar Base Sangre, Agar MacConkey, Caldo de Tioglicolato) de acuerdo a las indicaciones de su instructor. - Medio enriquecido - Microbio - Medio diferecial - Mezclas

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3.- Cada alumno preparar un tubo de 16 x 150 mm con tapn de rosca con 15 ml de cada medio de cultivo que se vaya a utilizar y esterilizar solo aquellos que lo requieran (ver indicaciones del empaque de cada medio) 4.- Despus de esterilizar el material de vidrio y medios de cultivo proceder a preparar una caja de petri con cada agar que se vaya a sembrar por la tcnica de estrias. Deje que los agares solidifiquen perfectamente. 5.- El caldo de tioglicolato mantngalo en el tubo con rosca hasta que se enfre a temperatura ambiente. 6.- Divida la superficie de la caja en tres regiones del mismo tamao y proceda a inocular la caja en cada rea marcada con el microorganismos que le corresponda: En la parte A.- Inocular por siembra recta con Salmonella sp. En la parte B.- Inocular por siembra recta con Escherichia coli En la parte C.- Inocular por siembra recta con Staphylococcus aureus 7.- En el tubo de ensaye con caldo de tioglicolato inocular con cualquier microorganismo que elija el estudiante. 8.- Rotula cada caja y tubo de ensaye con el nmero de equipo, grado y seccin. 9.- Incubar las cajas de petri inoculadas en forma investida a 35 C 2 por 24 horas, el tubo con caldo de tioglicolato incubarlo a la misma temperatura y tiempo, evitando que este se agite al observarlo. 10.- Al trmino de la incubacin hacer sus dibujos y observaciones para realizar su reporte. CUESTIONARIO 1.- Cules de los medios de cultivo empleados son diferenciales. Enriquecidos, de enriquecimiento y selectivos. 2.- Qu importancia tiene sta prctica para el estudio microbiolgico? 3.- Qu caractersticas tienen los microorganismos utilizados en este trabajo?

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Prctica 7

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TCNICA DE SIEMBRA POR ESTRIAS EN MEDIO SLIDO Y MTODO DE LA GOTA O DE MILES Y MISRA OBJETIVO El estudiante aprender las tcnicas de siembra por estras en la superficie del agar para el aislamiento de colonias microbianas y el mtodo de Miles y Misra. INTRODUCCIN Los cultivos en agar u otro medio slido realizados en cajas de petri se llaman cultivos en placa, con frecuencia cuando aludimos a la caja de petri la llamamos simplemente placa. La placa por estras se inicia cuando el medio de agar estril fundido y enfriado se vierte primero en una caja de petri estril y se deja que se solidifique completamente, despus se siembra sobre la superficie del agar slido, haciendo sobre ella con el asa bacteriolgica estras, en este caso, el crecimiento slo se producir en la superficie de la placa. Algunas veces se siembra en una placa de agar, haciendo estras y luego se trasvasa una pequea cantidad de agar fundido estril, para formar una capa delgada sobre la superficie sembrada, este cultivo en placa vertida y por estras es muy apropiado para ciertos estreptococos parsitos y otras bacterias microaerfilas. El mtodo de Miles y Misra consiste en colocar un nmero determinado de gotas de la muestra diluida sobre las placas de agar seco, despus de que las gotas son totalmente absorbidas por el agar, se invierten las placas y se incuban. Despus de la incubacin se seleccionan las placas que tengan colonias aisladas en el rea en que se colocaron las gotas, de preferencia aquellas que contengan menos de 40 colonias por gota (el ideal es de 10 a 20) CONCEPTOS ANTECEDENTES - Caja de petri - Agar Agar - Microorganismos mesoflicos aerobios - Colonia microbiana PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL EXPERIMENTO 1.- ESTRIADO EN PLACA 1.- Lave y esterilice una caja petri por miembro del equipo, posteriormente agregue 15 ml del agar estril a utilizar, el agar fue preparado previamente con las indicaciones de su instructor. 2.- Permita que se enfri el medio de cultivo hasta unos 42 C antes de verterlo en las cajas de petri. 3.- Cubra la caja de petri con la tapa inmediatamente despus de haber agregado el agar, djela sobre la mesa de trabajo hasta que solidifique. 4.- Inocule la caja, dibuje con el asa una serie de lneas estriadas sobre la superficie del agar (segn se lo indique su instructor) 5.- Debe tener cuidado de no penetrar la superficie del agar durante el sembrado. 18 - Microorganismo microaerfilo - Medio estril - Dilucin

6.- etiquete la caja de petri con el nombre de cada integrante del equipo, del grado y seccin, incube las caja en forma investida a 35 C 2 durante 24 horas. 7.- Al trmino de este tiempo saque las cajas de la incubadora, observe el crecimiento de las cajas e identifique las caractersticas de cada colonia que observe. 8.- Haga sus dibujos y observaciones para realizar su reporte. EXPERIMENTO 2.- MTODO DE MILES Y MISRA 1.- Con un marcador dividir la parte externa inferior de las 2 cajas de Perti con agar EMB en seis sectores. 2.- Marcar tres secciones de una caja con la dilucin 10-1 y los otros tres con 10-2, tres sectores de la segunda caja con la dilucin 10-3 y los otros tres con la 10-4 3.- Con una de las pipetas Pasteur, tomar una muestra de la dilucin 10-4, levantar la tapa de la caja, colocar la pipeta en posicin vertical y a una altura aproximada de 2 cm sobre la superficie del medio de cultivo, dejar caer una gota en el centro de cada uno de los tres sectores que corresponden a esa dilucin. 4.- Con otra pipeta inocular por triplicado la dilucin 10-3 en los otros tres sectores, cuidando de colocar la pipeta en cada ocasin en posicin vertical y a la altura indicada. 5.- Inocular la segunda caja con las diluciones 10-2 y 10-1. 6.- Dejar que las gotas se absorban en el medio, invertir las cajas e incubar a la temperatura y durante el tiempo adecuado para los microorganismos que se desea cuantificar, 35 2 por 24 hrs. 7.- Despus de la incubacin, seleccionar los sectores que presenten entre 20 y 30 colonias y proceder a la cuantificacin de las mismas. 8.- Calcular el nmero de bacterias por mililitro o gramo de la muestra con la siguiente frmula: N x f Nmero de bacterias por ml = --------------------V En donde N = nmero promedio de colonias f = inverso del factor de ilucin v = volumen de la gota CUESTIONARIO 1.- Qu importancia tiene para la microbiologa la tcnica de aislamiento por estras? 2.- Qu importancia tiene para la microbiologa la tcnica de placa vertida? 3.- Qu otro tipo de tcnica de aislamiento puede desarrollar usted? 4.- Investigue la importancia que tiene el anlisis de Miles y Misra para la microbiologa.

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Prctica 8

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SIEMBRA DE MICROORGANISMOS EN AGAR PROFUNDO, AGAR INCLINADO Y EXTENSIN EN PLACA OBJETIVO El estudiante aprender las tcnicas de siembra microbiana en agares preparados en tubo de ensaye y caja de Petri. INTRODUCCIN Cultivar un microorganismo significa promover intencionalmente el desarrollo de ste en medios de cultivo y condiciones de laboratorio controladas; para ello los medios de cultivo se pueden preparar en caja de petri o tubos de ensayo. Los medios semislidos se preparan en tubos, se inoculan con aguja (asa recta) o con pipeta; en este ltimo caso es necesario calentar el medio (bao mara) y cuando se encuentra en estado lquido y a una temperatura de 42 C se agrega el inculo, se homogeniza y se deja solidificar. Estos medios se emplean para estudiar la movilidad de los microorganismos y para favorecer la separacin de microorganismos con diferentes requerimientos de oxgeno. Los medios slidos se preparan en tubos, despus de esterilizarlos, estos se inclinan sobre una hilera de pipetas de 5 ml para desarrollar el pico de flauta o inclinacin del agar, la siembra se realiza con el asa bacteriolgica rayando la superficie del agar y con suavidad, tratando de que las colonias se desarrollen en forma aislada. Para la extensin en superficie se emplean placas con el medio slido adecuado, sobre estas se coloca un pequeo volumen de la muestra, el que se mide con una asa calibrada o con una microjeringa y se extiende sobre la superficie con el asa de Drigalski. CONCEPTOS ANTECEDENTES - Siembra microbiana - Colonia microbiana - Agar inclinado - Inculo - Agar semislido

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL A.- SIEMBRA POR EXTENSIN EN PLACA DE AGAR 1.- Preparar tres cajas de Petri con agar nutritivo, dejar solidificar el medio. 2.- De la dilucin 10-1 tomar 0.1 ml de ella con una pipeta y dejarla en el centro de la caja marcada con la dilucin 10-1, hacer lo mismo con las diluciones 10-2 y 10-3, colocarlas en el centro de sus cajas correspondientes. 3. A continuacin con el asa de Drigalski extender cada una de las muestras sobre la superficie del medio, hacerlo de tal manera que se este seguro de una homogenizacin en el medio. 4.- Esperar un momento hasta que se haya absorbido la muestra extendida en el medio. 5.- Invertir las cajas e incubar a 35 2 por 24 hrs. 6.- Despus de este tiempo contar el nmero de colonias desarrolladas en la superficie y calcular el nmero de 20

microorganismos por mililitro de la muestra. B.- SIEMBRA POR PICADURA (AGAR PROFUNDO) 1.- Siga las instrucciones anteriores (siembra en medio lquido), coloque en un tubo con agar semislido e inoclelo con el asa recta. C.- SIEMBRA EN UN MEDIO INCLINADO (AGAR EN PICO DE FLAUTA) 1.- Siga las instrucciones anteriores y en los tubos que contienen el agar inclinado, inocule el microorganismo problema con el asa bacteriolgica, siembre por estras (siga las instrucciones de su instructor para el sembrado) 12.- Al finalizar las tcnicas A, B y C los tubos inoculados se incuban a 35 C 2 en forma vertical, realizando sus observaciones a las 24 horas. CUESTIONARIO 1.- Qu ventajas y desventajas presentan las tcnicas empleadas en esta prctica.

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Prctica 9

Fecha:______/______/______ DETERMINACIN DEL NMERO MS PROBABLE (NMP)

OBJETIVO El estudiante aprender la tcnica de determinacin de nmero ms probable (NMP) para la identificacin de organismos coliformes en cualquier muestra problema en la que se desee conocer la carga microbiana de estas bacterias INTRODUCCIN En la tcnica del NMP (tambin denominada prueba de fermentacin por tubos mltiples), las bacterias coliformes pueden aislarse y enumerarse usando medios selectivos y tcnicas de dilucin standard y placa. La identificacin de bacterias coliformes especficas en los alimentos y muestras de agua, por lo general, no se requiere, sino que normalmente se enumeran como coliformes totales y posiblemente como coliformes fecales, en medios de cultivos lquidos, usando la tcnica del NMP. Esta tcnica requiere de diluciones decimales previas, y siendo un mtodo de probabilidad estadstica, no es una enumeracin de la poblacin como tal, sino que es una estimacin del nmero de microorganismos, nos dan el resultado observado en una prueba de fermentacin por tubo mltiple de la muestra. Puesto que el NMP es una estimacin basada en la probabilidad estadstica, el grado de seguridad o confiabilidad de la estimacin, aumenta con el nmero de rplicas de los tubos inoculados, de cada dislucin. Las tablas del NMP en un conjunto de tubos que resulten positivos, da un lmite de confiabilidad del 95%. La seleccin de la serie de 3, 4 5 tubos, generalmente se determina por los propsitos y la muestra a analizar. La U. S. Public Health Service, requiere de un mnimo de una serie de 5 tubos por dilucin, para el examen bacteriolgico de la calidad de agua potable. Por otro lado, a veces, se acepta una serie de 3 tubos, como mnimo, para otros exmenes de agua o alimentos. Generalmente las inoculaciones son de 10, 1.0 y 0.1 gramos o mililitros de la muestra por tubo, en una serie, no obstante se pueden utilizar diluciones decimales, usndose el factor de dilucin o conversin apropiado. Al seleccionar cuidadosamente el medio de cultivo y el resultado especfico, el cual es una indicacin de que el microorganismo est presente en la muestra, se puede realizar el anlisis de NMP, aunque existan otros microorganismos. Por ejemplo, los coliformes se pueden estimar por el crecimiento y la produccin de gas durante la fermentacin de caldo lactosado, despus de incubarse a 35 C 2 durante 24 horas. CONCEPTOS ANTECEDENTES - Caldo lactosado - Fermentacin de lactosa - Coliformes - Agua residual

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL A.- PPRUEBA PRESUNTIVA.- SIEMBRA EN UN MEDIO LQUIDO (CALDO LACTOSADO) EN TUBOS DE 18 X 150 mm CON TUBO DE FERMENTACIN DE DURHAN 1.- En una gradilla prepare tres series de 3 tubos de ensaye de 18 x 150mm con tapn de rosca que contengan 10 ml de caldo lactosado y un tubo de fermentacin de durhan invertido. La primer serie de 3 tubos debern estar preparados a una doble concentracin de caldo lactosado.

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Nota.- Poner atencin a las indicaciones del instructor para preparar estos tubos con su campana de fermentacin. 2.- De la muestra problema homogenizada, con una pipeta de 10 ml estril, transferir 10 ml de ella a cada tubo de la primera serie preparada a doble concentracin de caldo lactosado. 3.- Con la misma pipeta, trasfiera 1 ml de la muestra a cada tubo de la segunda serie de tubos preparados con caldo lactosado a concentracin sencilla. 4.- Con una pipeta de 1 ml estril, transfiera 0.1 ml de la muestra a cada uno de los tubos de la tercera serie preparados con caldo lactosado a concentracin sencilla. 5.- Incube los tubos durante 24 a 48 horas a 35 C 2, la presencia de gas en el tubo de durhan (campana de fermentacin) en cualquier cantidad de tubos dentro de las 48 horas siguientes hace la prueba positiva. B.- PRUEBA CONFIRMATORIA PARA GRUPO COLIFORME 1.- Sub cultive todos los tubos positivos de caldo lactosado que muestren gas dentro de las 48 horas en caldo bilis verde brillante por medio de 2 o 3 asadas. 2.- Incube todos los tubos de caldo bilis verde brillante a 35 C 2 por 48 horas. 3.- Registre todos los tubos de caldo bilis verde brillante que muestren gas y refiera a las tablas NMP. Reporte los resultados como NMP confirmado de bacterias coliformes por gramo o mililitro de muestra. CUESTIONARIO 1.- Qu ventajas y desventajas presentan la tcnica empleada en esta prctica?

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Prctica 10

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ESTUDIO DE LA MORFOLOGA DE LEVADURAS Y HONGOS, CULTIVO DE HONGOS OBJETIVO Observar la morfologa general de la levadura Sacharomyces cerevisiae y las estructuras anatmicas bsicas de los hongos imperfectos, as como su cultivo. INTRODUCCIN Entre mohos y levaduras no hay una distincin patente, se han definido las levaduras como hongos cuya forma corriente y dominante de crecimiento es unicelular. Las clulas de levadura son esfricas, elpticas y cilndricas, su tamao varia notablemente. El protoplasma de la clula de levadura est incluido en una pared celular y por una membrana citoplasmtica, y contiene un ncleo, una gran vacuola y numerosos grnulos y glbulos de grasa; no se encuentran flagelos u otros rganos de locomocin. La pared celular est compuesta por una membrana externa densa, y una capa menos densa; la parte interna de la pared a su vez se subdivide en tres capas. El ncleo es menor de una milimicra de dimetro; prcticamente no se conoce su estructura interna; el protoplasma de las clulas jvenes en crecimiento prcticamente carece de grnulos y glbulos de sustancias de reserva, pero ulteriormente, al terminar el crecimiento se acumulan gran nmero de ellos, en el protoplasma de la levadura se han observado grnulos de protenas. La gran vacuola paranuclear contiene una solucin o suspensin de volutina, que tambin se encuentra en hongos superiores y en bacterias; la volutina puede faltar en cultivos muy recientes, abunda en los cultivos antiguos y desaparece durante la formacin de esporas. Las levaduras se dividen naturalmente en dos grupos, segn sus mtodos de reproduccin; un grupo de divide o reproduce por germinacin y formacin de esporas y el otro por gemacin; el primero pertenece a los Ascomicetos y los segundos a los Hongos imperfectos Las levaduras tienen gran importancia Industrial, suelen utilizarse en la preparacin de bebidas alcohlicas (Saccharomyces cerevisiae), en la preparacin de leches fermentadas y en la produccin de algunos quesos, entre otros usos. Las talofitas suelen dividirse en tres grupos: 1)algas, 2)hongos y 3)lquenes. Los hongos muchas veces son filamentosos, por lo menos en estructura microscpica, a veces unicelulares; hay cinco clases principales de ellos: Myxomycetes, Phycomycetes, Ascomycetes, Basidiomycetes y Deuteromycetes u hongos imperfectos; los trminos mohos y levaduras no tienen significacin taxonmica. Son denominaciones corrientes para formas que no pueden definirse netamente. Suelen describirse los mohos como hongos filamentosos multicelulares en que los filamentos, hifas, se ramifican y a veces se unen para formar una masa enmaraada; cualquier parte grande de la misma se conoce como micelio; suelen distinguirse dos tipos de hifas fecundas. Muchas hifas de mohos estn divididas por tabiques transversales o septa en clulas independientes, y cada una de ellas contienen uno o ms ncleos, las hifas de otos mohos son poco tabicadas y son esencialmente tubos largos que contienen protoplasma con numerosos ncleos dispersos, donde se pueden observar corrientes protoplasmticas activas, son las hifas cenocticas. Las clulas de mohos individuales poseen paredes rgidas que rodean al citoplasma; el protoplasma est incluido en una membrana citoplsmica semipermeable y contiene uno o ms ncleos pequeos, adems de vacuolas, grnulos y gotitas. Las clulas del moho suelen ser cilndricas y su tamao es variable, no se ha observado fcilmente el ncleo de los mohos; se necesita emplear para ello mtodos especiales de coloracin. El crecimiento de los mohos de inicia por germinacin de una espora o aumento de tamao de cualquier fragmento de hifa que llega a un substrato adecuado que tengo circunstancias apropiadas de temperatura, humedad y aire. El crecimiento es rpido en un medio favorable, algunas especies crecen ms lentamente y necesitan una o dos semanas para producir colonias. 24

Algunos mohos crecen abundantemente y producen un micelio algodonoso que llena cualquier recipiente que lo contenga. El crecimiento del micelio, de los mohos continua indefinidamente en medio favorable; las hifas antiguas mueren y se desintegran y aparecen nuevas. | CONCEPTOS ANTECEDENTES -Hongos -Conidio -Moho -Fermentacin -Hifa -Micelio -Septo -Levadura

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL PARTE 1 1.- Prepare un frote de regular densidad con las clulas de levadura en aguas destilada seque al aire. 2.- Fije a la flama muy suavemente. 3.- Bae la preparacin durante un minuto con la solucin de etanol al 40%. Lave con agua corriente. 4.- Bae el frote con solucin de KOH 0.1M y djelo reaccionar por una hora; s s empieza a deshidratar, agregue ms KOH, lave con agua corriente. 5.- Aplique a la preparacin el azul de toluidina por dos minutos. 6.- Lave con etanol al 10%, sacuda el exceso de alcohol y seque al aire. 7. - Prepare un segundo portaobjetos como el anterior pero preceda nicamente hasta l tercer paso. 8.- Aplique el azul de toluidina por dos minutos y contine como en el primer frote. 9.- Compare ambas preparaciones. 10.- Examine las preparaciones con el objetivo de inmersin y dibjelas. 11.- Los ncleos se tien de azul oscuro rosa y el citoplasma de un rosa mucho ms claro. 12.- Prepare un montaje hmedo usando Yodo de Gram. en vez de agua. 13.- Trate de detectar los grnulos y las estructuras internas tales como grandes vacuolas. 14.- Observe con el objetivo de alto poder en seco y con el de inmersin. PARTE 2 1.- Vierta el medio de cultivo Agar Sabouraud y Agar Patata Dextrosa (PDA) en las cajas Petri estriles 2.- Djelos que solidifiquen 25

3. - Inocule las placas de agar con la muestra contaminada de los hongos que se va a estudiar (se recomienda de algn alimento) 4.- Incubar las cajas inoculadas a 35 C durante 48 hrs. 5.- Prepare montajes hmedos con los hongos que hayan crecido en las placas de agar 6.- Use KOH al 10% y colorante de Azul Algodn Lactofenol 7.- Observe al microscopio en objetivo seco fuerte y de inmersin 8.- Dibuje sus resultados en lo referente al tipo de hifas y cuerpos reproductivos, as como las caractersticas del crecimiento en la placa, forma y coloracin. CUESTIONARIO 1.- En que radica la importancia del estudio de las levaduras? 2.- Investigue algunos de los usos comerciales de las levaduras 3.- Investiga las formas de reproduccin de las levaduras. 4.- Qu importancia tiene el estudio de la presencia de hongos en un alimento? 5.- Cules son las estructuras principales de los hongos? 6.- Cree usted que existen hongos en el aire? Explique

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