ESCUELA SUPERIOR POLITÉCNICA DEL LITORAL

FACULTAD DE INGENIERÍA MECÁNICA Y CIENCIAS DE LA PRODUCCIÓN

INGENIERÍA EN ALIMENTOS

Laboratorio de Microbiología de Alimentos.

Guía Práctica de Curso

INOCUIDAD ALIMENTARIA
Segunda edición

Janella Hidalgo, MSc.

2020. ALIG-1039
TABLA DE CONTENIDO

TOMA DE MUESTRA................................................................................................................6
DETECCIÓN Y RECUENTO DE COLIFORMES TOTALES, FECALES Y
ESCHERICHIA COLI POR LA TÉCNICA DEL NÚMERO MÁS PROBABLE (NMP)...9
DETECCIÓN DE SALMONELLA SPP EN ALIMENTOS..................................................16
DETECCIÓN DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS EN ALIMENTOS..............................24
DETECCIÓN DE VIBRIO SPP EN ALIMENTOS EN ALIMENTOS...............................32
DETECCIÓN DE CLOSTRIDIUM PERFRINGES EN ALIMENTOS..............................39
DETECCIÓN DE LISTERIA SPP EN ALIMENTOS.......................................................43

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SEGURIDAD EN EL LABORATORIO

Un laboratorio de microbiología es un lugar convenientemente habilitado donde se

pueden manejar y examinar microorganismos. Este tipo de trabajo debe ser llevado a
cabo con una buena técnica aséptica y en condiciones de esterilidad; se requiere un
ambiente limpio y ordenado. En el Laboratorio de Microbiología encontraremos estas
condiciones en una cabina de flujo o en la proximidad de la llama de un mechero de
alcohol o de gas.

Todos cultivos de microorganismos deben ser manejados con precaución por su

potencial patogenicidad o peligrosidad a la salud y al ambiente. Por ello, es muy
importante tomar precauciones por nuestra propia integridad y la de nuestros
compañeros.

Es necesario cumplir dos requisitos básicos:

1. Restringir la presencia de los microorganismos en estudio a sus recipientes y medios
de cultivo, evitando el riesgo de contaminarse uno mismo o a un compañero.
2. Evitar que los microorganismos ambientales, presentes en la piel, aire, ropa,
etc.,contaminen nuestras muestras.

Para mantener estas condiciones es necesario respetar las siguientes normas de

seguridad:
1. Es obligatorio el uso de bata de laboratorio, gorro/cofia y zapatos cerrados. Las
piernas y los pies deben estar cubiertos, por lo que no se permitirán sandalias o
zapatillas. Se dispondrá, de ser necesario, ropa de protección como guantes y
mascarilla, lo cual dependerá de la práctica a realizarse.
2. Está prohibido el uso de joyas y uñas largas. En el caso de tener uñas pintadas
es obligatorio el uso de guantes.
3. Durante las prácticas está prohibido comer, beber, fumar o usar cualquier
aparato electrónico.
4. Libros, cuadernos, abrigos o cualquier otro material que no se utilice en la
realización de la práctica deben estar apartados del lugar de trabajo.
5. Al iniciar y finalizar las prácticas, es obligatorio lavarse correctamente las
manos con agua y jabón.
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6. El área de trabajo deberá estar siempre limpia y ordenada. Antes de comenzar
cada práctica es obligatorio desinfectar las superficies de trabajo con alcohol
(etanol).
7. Los microorganismos deberán manejarse siempre alrededor de la llama
(mechero). Se deben evitar los desplazamientos innecesarios por el laboratorio,
ya que se pueden crear corrientes que originen contaminaciones o producir
accidentes.
8. Tener cuidado con la manipulación del alcohol cerca de la llama del mechero.
9. Cuando se manipulan microorganismos hay que evitar llevarse las manos a la
boca, nariz, ojos o cualquier parte del cuerpo.
10. Para deshacerse del material contaminado se utilizarán los recipientes
adecuados, que serán esterilizados posteriormente. NUNCA se debe tirar nada
contaminado a un tacho de basura común o por el lavadero.
11. El material contaminado que se ha utilizado y no se prevé su inmediata
esterilización, deberá ser colocado en la refrigeradora destinada para medios
contaminados.
12. Bajo ningún concepto debe sacarse ninguna muestra contaminada del
laboratorio.
13. Nunca pipetear oralmente medios de cultivo esterilizados o cultivos
microbianos. Utilizar siempre pipetas con algodón terminal en la boca de la
misma.
14. Operar un instrumento o aparato solamente cuando se esté capacitado, de otra
manera, solicitar la ayuda del profesor, del ayudante o del técnico del
laboratorio, para adquirir la destreza necesaria.
15. Siempre dejar perfectamente limpios todos los equipos utilizados
(microscopios, balanzas analíticas, autoclave, etc.) y reportar al profesor
cualquier irregularidad en el funcionamiento.
16. El material que necesita ser incubado deberá ser rotulado adecuadamente.
17. Cuando utilice aparatos eléctricos esté alerta de cualquier eventualidad y no
manipularlos con las manos húmedas.
18. No utilizar material de vidrio que esté roto o con fisuras. Colocarlo en el tacho
de desechos de vidrio.
19. La autoclave puede ser utilizado previa capacitación sobre el adecuado uso del
equipo.

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 20. No se debe manipular material del cual no se sepa exactamente su procedencia.
21. Desinfectar cualquier material derramado inmediatamente con alcohol.
22. En caso de accidente (rotura de material, derramamiento de microorganismos o
medios, etc.) se comunicará de manera inmediata al profesor encargado de la
práctica.

En caso de dudas, preguntar al profesor

Los estudiantes que no trabajen de acuerdo con las instrucciones de seguridad serán
expulsados del laboratorio.

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TOMA DE MUESTRA

La toma de muestra según CODEX en su reglamento CE 882/2004 se realiza, a fin de

verificar, mediante análisis, si el producto cumple con la legislación sobre piensos y
alimentos. Dichos análisis y métodos de muestreo se realizarán de acuerdo con la
normativa vigente dentro del país (INEN 1529-2) o a falta de una norma nacional se
acogerán normas y protocolos internacionalmente reconocidos.

Estos muestreos pueden existir a lo largo de la cadena de producción como son:

preparación, almacenamiento, transporte, comercialización y expendio. Realizados
mediante un plan de muestreo donde constará el número de elementos que se debe
recoger y el número de elementos no conformes permitidos para el cumplimiento de las
normas del lote analizado.

La selección de estos planes dependerá de factores como la composición de la muestra

(presentación del producto), naturaleza del lote (tamaño, homogeneidad), naturaleza de
la característica a controlar (cualitativo o cuantitativo), naturaleza del control,
referencias de muestreo del producto a controlar, entre otras.

Para las evaluaciones microbiológicas la comisión internacional de especificaciones

microbiológicas -ICMSF- ha determinado dos tipos de muestreos; por atributos de dos y
tres clases. Los planes de muestreo por atributo de dos clases tienen un tamaño de
muestra (n) y un número de máximo de elementos no conformes (c) al contrario de los
planes de atributos de tres clases que presenta un límite de unidades pueden presentar no
conformidades entre m (nivel aceptable) y M (nivel inaceptable).

Además del muestreo a los alimentos y bebidas, también se pueden realizar

evaluaciones microbiológicas del ambiente, manipuladores de alimentos (superficies
vivas) y material en contacto con el alimento (superficies inertes). Estos muestreos de
superficie se dividen en método del hisopo utilizado en superficies regulares e
irregulares, método de la esponja para superficies de mayor área y finalmente el método
del enjuague para superficies vivas.

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Para finalizar cabe recordar que el personal que realice la toma de muestra para los
análisis microbiológicos debe considerar los siguientes aspectos para evitar la
contaminación de esta:
- El material de toma de muestra debe ser apropiado, descartable y estéril
- La vestimenta debe ser adecuada (uso de guantes y mascarillas)
- No deben dividir o manipular los envases innecesariamente
- Se debe utilizar contenedores para el transporte adecuado en función de la
naturaleza del alimento.
- Se debe respetar las condiciones de conservación (cadena de frio).
- Se debe etiquetar correctamente las muestras (fecha de recolección, lote,
nombre, lugar)

Objetivo
-Realizar correctamente la toma de muestras de superficie vivas e inertes para el análisis
los diferentes tipos de microorganismos por el método del hisopo.

Materiales y Equipos
Medios y reactivos
- Agua peptonada al 0.1% (diluyente)
- Plate Count Agar
- Solución Salina 0.9% p/v (diluyente)
Equipos e instrumentos
- Hisopo
- Tubo de ensayo
- Caja Petri
Procedimiento
1. Humedecer el hisopo en tubo de ensayo la solución diluyente autoclavada con
10 mL y presionar ligeramente en la pared del tubo con un movimiento de
rotación para quitar el exceso de solución.
2. Con el hisopo inclinado en un ángulo de 30º, frotar 4 veces la superficie
delimitada (10cm x 10cm), cada una en dirección opuesta a la anterior. Asegurar
el hisopado en toda la superficie.
3. En el caso de utilizar la plantilla de 5cm x 5cm, repetir esta operación 3 veces
más, en lugares diferentes de la misma superficie, para obtener 100 cm2

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 4. Colocar el hisopo en el tubo con la solución diluyente, quebrando la parte del
hisopo que estuvo en contacto con los dedos del muestreador, la cual debe ser
eliminada.
5. Para superficies irregulares, en el caso de utensilios, se repetirá la operación con
3 utensilios más (total 4 como máximo), con el mismo hisopo, considerando el
área que está en contacto con el alimento o con la boca.

Resultados

Para el reporte de los resultados revisar la siguiente fuente:

https://www.saludarequipa.gob.pe/desa/archivos/Normas_Legales/alimentos/
RM_461_2007.pdf

Bibliografía.
- Tipos de muestreo para evaluaciones microbiológicas. Referencia online
incluida http://www.icmsf.org/. Fecha de acceso: 25/03/2019
- Plan muestral. Referencia online:
http://www.fao.org/uploads/media/Codex_2004_sampling_CAC_GL_50.pdf.
Fecha de acceso
- Puntos de muestreo en la cadena de producción
https://www.invima.gov.co/images/pdf/inspecion_y_vigilancia/direccion-
alimentos/Articulacion_Entidades_Territoriales_Salud/19-Manual-de-toma-de-
muestras-de-alimentos-y-bebidas-para-Entidades-Territoriales-de-Salud.pdf.
Fecha de acceso: 25/03/2019
- Guía Técnica para el Análisis Microbiológico de Superficies en Contacto con
Alimentos y Bebidas. Referencia online incluida:
http://www.sanipes.gob.pe/normativas/8_RM_461_2007_SUPERFICIES.pdf.
Fecha de acceso: 25/03/2019
- Guía general de muestro según Codex
http://www.fao.org/uploads/media/Codex_2004_sampling_CAC_GL_50.pdf.
Fecha de acceso: 25/03/2019

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DETECCIÓN Y RECUENTO DE COLIFORMES TOTALES, FECALES Y
ESCHERICHIA COLI POR LA TÉCNICA DEL NÚMERO MÁS PROBABLE
(NMP)

Los coliformes se definen como bacilos Gram negativos, aerobios o anaerobios

facultativos, no esporulados, capaz de fermentar lactosa y producir gas como resultado
de su metabolismo. Dentro del grupo de coliformes fecales se encuentra Escherichia
coli, microorganismo de hábitat típicamente intestinal y que puede fermentar lactosa
después de 48 h a 35 ºC. Entre las reacciones bioquímicas confirmatorias de esta
bacteria se encuentra la conversión de triptófano (alfa aminoácido) a indol (compuesto
orgánico aromático) e incapacidad para usar citrato como única fuente de carbono.

Un método utilizado para la determinación de E. coli es el número más probable

(NMP), estrategia eficiente para la estimación de las densidades poblaciones, el cual se
basa en encontrar crecimiento bacteriano en tubos con caldos enriquecidos y selectivos.
Además, de las pruebas bioquímicas confirmatorias IMViC*.

Los resultados de estas pruebas bioquímicas pueden ser divididos en negativas (2) y
positivas (2). La prueba de Voges Proskauer, detecta la fermentación butanodiólica en
como resultado del metabolismo bacteriano, esta prueba es negativa para E. coli. Así
también, la prueba de citrato es negativa para esta bacteria por la incapacidad para
utilizar el citrato sódico como única fuente de carbono del agar Simmmos. Este agar
cuenta con el indicador azul bromotimol cambiando de color verdoso a azul cuando la
bacteria inoculada puede creer y alcaliniza el medio con los metabolitos producidos.

Dentro de las pruebas positivas para E. coli se encuentran las pruebas de indol y rojo de
metilo. En la prueba de indol se observa la acción de la enzima triptofanasa presente en
E. coli, que hidroliza el aminoácido triptófano en indol y alanina. Para la prueba de rojo
de metilo, se muestra la reducción del pH en el medio como resultado de la producción
de los ácidos orgánicos generando un color rojo brillante en el medio cuando el rojo de
metilo es añadido.

*IMViC: Designación de la primera letra de las 4 pruebas bioquímicas, prueba de indol,

rojo de metilo, citrato, vogues proskauer

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Objetivo
 Determinar coliformes, coliformes fecales y E. coli a través de la normativa
NTE INEN 1529-8
Materiales y equipos
Medios y reactivos
- Agua de peptona para diluciones
- Caldo verde brillante:Brilliant Green Bile Lactose (BGBL)
- Agar eosina azul de metileno (EMB)
- Agar PCA
- Agua de triptona
- Agar citrato
- Reactivo de Kovac’s
Equipos e instrumentos
- Erlenmeyer
- Frascos de boca ancha de 250, 500,1000 mL con tapa rosca autoclavable
- Asa de inoculación
- Gradillas
- Balanza de capacidad
- Incubadora
- Autoclave
- Pipetas de 1, 5,10 mL
- Caja petri
- Tubos de ensayo
- Tubos Durhan
- Fundas estériles
- Stomacher
Muestra
- Jugo sin pausterizar

pág. 10
Procedimiento para determinación de coliformes totales. (Ver Ilustración 1)
1. Realizar las diluciones de la muestra en agua de peptona.
2. Transferir 1 mL de la primera dilución a cada uno de los tres tubos con 10 mL de
caldo BGBL.
3. Proceder de la misma manera con la dilución -2,-3.
4. Inocular con 1 mL de dilución inicial en los tubos de caldo verde brillante a 37°C
por 24 horas para para productos refrigerados incubar a 30±1 °C. De no observar
gas u opacidad incubar 24 horas más.
5. Después de la incubación revisar la producción de gas en los tubos Durham como
se indica en el esquema. Considerar presuntos positivos cuando al golpear la
delicadamente al tubo se desprendan burbujas. Recordar que la turbidez NO es
indicativa de prueba positiva
6. Agitar cada uno de los tubos presuntamente positivos y con un asa de inoculación a
partir de cada uno de ellos sembrar por estría en la superficie de placas individuales
secas de agar EMB.
7. Incubar las placas por 24±2 horas a 37°C ó 30°C
8. Al término de la incubación las colonias lactosa positivas las cuales son negras o
poseen centro oscuro con periferias transparentes incoloras o bien colonias
mucoides de color rosa naranja, confirman la presencia de coliformes.
9. De cada dilución anotar el número de tubos positivos confirmados en EMB y
reportar el NMP de coliformes.

10g muestra/90 mL Volumen de diluyente: 9 mL Volumen de BGBL: 10 mL

Ilustración 1. Esquema de trabajo para la determinación de coliformes total

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Si en ninguno de los tubos se observa producción de gas, se consideran como
NEGATIVOS y serán reportados como: AUSENCIA DE COLIFORMES
TOTALES en la muestra analizada.
Si los tubos durhan presentan burbujas o producción de gas los tubos son presuntos
POSITIVOS y deberá realizar las pruebas de CONFIRMACIÓN. Después de la
confirmación se deberá anotar el número de tubos positivos y establecer el código para
posteriormente hacer el cálculo de NMP.
Si todos los tubos dan negativos o todos positivos considerar la necesidad de repetir los
análisis.
Procedimiento para la determinación de coliformes fecales y e. coli mediante NMP.
(Ver Ilustración 2)

1. Introducir un asa
de muestreo a los
tubos positivos de
BGBL (presencia
de gas) e
inocularse
nuevamente en 10
mL de caldo EC/
BGBL.
2. Incubar en baño
maría o en
incubadora a 45
°C por 24 h. Si
no se observa
presencia de gas
dejar 24 horas
más.
a. Sembrar
por
estriación
en una
placa individual de EMB o VRB e incubar a 37°C por 24 horas.

pág. 12
 3. Tomar 2 a 3 colonias típicas (negras o nucleada con brillo verde metálico de 2 a
3 mm de diámetro) y sembrar en tubos con agar inclinado de PCA a 35-37°C por
24 horas.
4. De las colonias aisladas en los medios citado aplicar tinción Gram a las colonias
que seas Gram
Ilustración 2. Esquema gráfico de la determinación de
coliformes totales, fecales y E. coli (–) no
esporulados y
utilizarlos para para las pruebas IMViC
Prueba de indol
5. Introducir un asa de muestreo a los tubos positivos (presencia de
gas) e inocularse en 3 mL de caldo de triptona para la prueba de
indol.
6. Incubar a 45 °C por 48 h
7. Agregar 0.5 mL del reactivo de Kovacs y esperar (1 min) la
presencia del color rojo en la fase alcohólica indica la
producción de indol, siendo positivo el resultado.
Prueba de rojo de metilo
8. Subcultivar las colonias aisladas con un asa de muestreo a un
tubo con caldo MR-VP. Incubar por 24 h a 35-37 °C.
9. Agregar 3 gotas de la solución de rojo de metilo, mezclar bien y
esperar la presencia de un color rojo para un resultado positivo o
amarillo para un resultado negativo.
Prueba de Voges Proskauer
10. Subcultivar las colonias aisladas con un asa de muestreo a un
tubo con caldo MR-VP. Incubar por 24 h a 35-37 °C.
11. Agregar 2 gotas de solución de creatina al 0.5 %, 3 gotas de
solución de alfa naftol mezclar bien y esperar la presencia de un
color rojo para un resultado positivo o amarillo para un resultado
negativo.
Prueba para la utilización de Citrato de Simmons
12. Sembrar en un tubo de citrato de Simmons inclinado con un asa
13. Incubar a 37 °C por 24 h. Cuando el viraje de color del medio es
de verde a azul la prueba es positiva caso contrario es negativa.

pág. 13
 Nota: Considerar como positivas a las
muestras con presencia de gas en el caldo EC
y que cumplan con los resultados de E. coli a
las pruebas IMViC de la la Ilustración 3

Ilustración 3. Tabla de resultados de prueba IMViC para E. coli

Resultados.
El informe del análisis debe detallar:
- Los resultados como NMP/g o cm 3. Se deberá buscar las combinaciones
obtenidas en la Ilustración 3. De tener muestras con alta carga microbiana,
realizar mayores diluciones y multiplicar por 10 el resultado acorde la dilución
aumenta. De tener muestras con baja carga microbiana, utilizar disoluciones más
concentradas y dividir para 10 el resultado cuando la disolución reduce.

- Toda la información necesaria para la identificación completa de la muestra;

Ilustración 4. Índice de NMP de bacterias cuando se utiliza tres alícuotas de 1 mL por dilución.

pág. 14
 - El método empleado, haciendo referencia a esta norma nacional, es decir NTE
INEN 1529-8;
- Todos los detalles experimentales no descritos en esta norma nacional, o
considerados opcionales, junto con los detalles de todo tipo de incidencias que
pudieran haber influido sobre el(los) resultado(s);
- Se deberá reportar como presencia o ausencia de E. coli presuntiva en la porción
de ensayo, especificando la masa en gramos o el volumen en mililitros de la
muestra de ensayo.

Bibliografía
- Control microbiológico de los alimentos. Detección y recuento de Escherichia
coli presuntiva por la técnica del número más probable. NTE INEN 1529-8-
Primera revisión 2016-09. Referencia incluida en la página del Servicio
Ecuatoriano de Normalización INEN.
http://181.112.149.204/buzon/normas/nte_inen_1529-8-1.pdf. Fecha de acceso
16/05/2019

pág. 15
DETECCIÓN DE SALMONELLA SPP EN ALIMENTOS

Salmonella es una bacteria que proviene de la familia de Enterobacteriacea, es un bacilo

gram (-) con un diámetro entre 0.7 a 1.5 mm y 2 a 5 mm de longitud. Esta bacteria puede
crece en un rango de 7 y 48 ºC. La mayoría de estas bacterias presentan flagelos
perítricos* y son anaerobias facultativas, no encapsuladas y no esporuladas. Se
caracterizan por una gran diversidad bioquímica y serológicas. El género Salmonella se
divide en dos especies: entéricas y bongori [1]

El método tradicional para la detección de Salmonella según la ISO 6519:201 en

alimentos consiste en 5 pasos básicos, preenriquecimiento, enriquecimiento aislamiento,
pre-confirmación y confirmación bioquímica. En el pre-enriquecimiento del medio para
que las células de Salmonella puedan tener una condición fisiológica más estable, ya
que estas generalmente se encuentran debilitadas y frecuentemente en números
pequeños y acompañados de un gran número de bacterias miembros de las
Enterobacteriaceae en los alimentos. En el enriquecimiento selectivo se logra
incrementar la población de Salmonella e inhibir otros microorganismos presentes en la
muestra. Después de esto, se realiza un aislamiento diferencial mediante la incubación
en medios sólidos como los agares selectivos y su posterior identificación bioquímica
que permitirá la eliminación de cultivos sospechosos falsos y como parte final del se
realizará la serotipificación donde se establece que microorganismo es específicamente
mediante técnicas inmunológicas (antígeno anticuerpo).

En la siguiente práctica aplicaremos la técnica de detección de Salmonella ssp basada en

la norma INEN 1529-15:2013. Se realizará el pre-enriquecimiento, selección y
confirmación bioquímica de la bacteria aisladas en el medio.
*Rodeado de pelos.

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Objetivo
 Determinar Salmonella ssp. en alimentos mediante la norma INEN 1529-
15:2013.
Materiales y Equipos
Medios y reactivos
- Agua de peptona salina 3%(p/v)
- Reactivo de Kovacs
- Rojo de metilo
- Agar verde brillante (VB), Agar de xilosa lisina desoxicolato (XLD)/BPLS,
Agar para Salmonella y Shigella (SS)
- Agar citrato de Simmons
- Agar de tres azucares (TSI)
- Agar de nutritivo, medio de SIM (para sulfuro indol y movilidad)
Equipos e instrumentos
- Erlenmeyer
- Frascos de boca ancha de 250, 500,1000 mL con tapa rosca autoclavable
- Asa de inoculación
- Gradillas
- Fundas estériles
- Stomacher
- Balanza de capacidad
- Incubadora
- Autoclave
- Pipetas de 1, 5,10 mL
- Caja petri
- Tubos de ensayo
- Tubos Durhan
- Microscopio
Muestra

- Mayonesa casera

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Procedimiento (Ver Ilustración 5)
Preparación de la muestra
1. Pesar 25 g de muestra en
una bolsa de stomacher
estéril
2. Verter 225.0 mL de agua
de peptona con el 3% de
cloruro de sodio en la
bolsa (el diluyente puede
variar dependiendo de la
muestra). En práctica se
utilizará cualquiera de las
siguientes muestras,
productos del mar,
pescado, carnes, huevos
pasteurizados, gelatinas,
vegetales, quesos, ensalada
de huevo, mayonesa
Ilustración 5. Esquema gráfico de la determinación de
Salmonella spp. casera.
3. Homogeneizar la
stomacher
4. Transferir asépticamente la mezcla homogeneizada a un recipiente estéril de boca
ancha con tapón de rosca y dejar reposar por 60.0 min. a temperatura ambiente con
la tapa perfectamente cerrada
5. Mezclar bien y determinar el pH de la muestra con papel pH
6. Ajustar si es necesario, a un pH de 6.8±0.2 con NaOH 1N o HCl 1N estériles.
7. Mezclar y cerrar suavemente la tapa del matraz
8. Incubar la muestra homogénea a 35±2 ℃ durante 16-20 h
Enriquecimiento selectivo
9. Cerrar firmemente el tapón de rosca de los matraces con los cultivos de pre-
enriquecimiento y agitar suavemente
10. Transferir 1 mL del cultivo de pre-enriquecimiento (con una pipeta de vidrio de
estéril) a un tubo de ensayo con 10 mL de caldo Vassiliadis-Rappaport (en
sustitución del caldo tetrationato) como medio de enriquecimiento.

pág. 18
11. Incubar los tubos inoculados a 43℃ durante 24-48h.
Aislamiento diferencial
12. Homogeneizar el tubo con caldo de enriquecimiento ya incubado
13. Tomar una muestra del cultivo anterior con asa microbiológica estéril y sembrar en
estría por agotamiento en cuadrantes en cajas de Petri, en cada uno de los siguientes
medios selectivos:
a) Agar BPLS
b) Agar verde-brillante rojo fenol (BG)
c) Agar XLD
14. Incubar las cajas ya sembradas en posición invertida a 35±2 ℃ durante 24 h. Si no
hay crecimiento dejar 24 h más
15. Observar las características macroscópicas de las colonias en los medios sólidos
selectivos del primer subcultivo. Ver Tabla 1
Tabla 1. Características de las colonias típicas de Salmonella spp. en medios sólidos selectivos

Medio selectivo Color antes de la Características coloniales de Salmonella spp

inoculación
Agar verde brillante Rojo marrón Lactosa y sacarosa - : Rosas o rojas, pueden ser
(BG) transparentes, rodeadas de medio enrojecido.
(Salmonella typhimurium)
Nota: Lactosa y sacarosa+: son verdes amarillentas
o verdes con halos amarillo. Ejemplo: E. coli,
Citrobacter, Klebsiela.
Agar BPLS Rojiso/Anaranjado Lactosa y sacarosa -: Rosas
Nota: Lactosa y sacarosa+: son amarillas

Agar Xilosa Lisina Claro, color rojo Colonias rosadas con halos rojos
Desoxicolato (XLD) brillante

16. Almacenar en refrigeración de 5 a 8°C, las placas con medios selectivos por si es
necesario tomar más colonias.
17. Seleccionar al menos 2 colonias sospechosas de cada medio selectivo y realizar una
tinción de Gram a las colonias sospechosas

pág. 19
18. Registrar las características morfológicas tanto macroscópicas como microscópicas;
anotando la forma de la colonia, su color, color del medio circundante, morfología
al Gram, etc
19. Realizar una purificación de las colonias seleccionadas, sembrando nuevamente en
estría por agotamiento en un medio idéntico del que se tomó la colonia
Pre-confirmación bioquímica.
20. Registrar las características del medio agar triple azúcar hierro (TSI) o lysine iron
agar (LIA) antes de la inoculación (color del medio).
21. Por duplicado tomar suavemente una porción del centro de la colonia con asa
bacteriológica recta y estéril e inocular por picadura y estría en un tubo con agar
triple azúcar hierro (TSI) agar lysine iron agar (LIA) inclinado.
22. Incubar el medio TSI y LIA a 35±2 °C durante 24 h y 48 h respectivamente.
Para la interpretación de los resultados consultar la siguiente tabla.
Tabla 2. Reacciones típicas en los agares TSI y LIA

Agar TSI Agar LIA

Amarilla: Fermentación de glucosa Púrpura: reacción alcalina por

descarboxilación de la lisina

Burbujas o grietas en el agar: formación de Ennegrecimiento: producción de H2S

gas (S. tiphi y S. gallinarum no producen
gas)

Ennegrecimiento: Producción de ácido

sulfhídrico

Roja o inalterada: reacción alcalina sin

fermentación de lactosa o sacarosa

Confirmación bioquímica
23. A partir de los cultivos que presentan reacciones de presunta salmonella en agar
TSI Y LIA, realizar las siguientes pruebas:
a) Voges-Proskauer
b) Indol
c) Citrato

pág. 20
24. Para la prueba de Voges-Proskauer, en un tubo de caldo glucosa fosfato (caldo MR-
VP) el cultivo en análisis; incubar a 37°C por 24 a 48 h. Después de este periodo,
añadir:
a) Solución alcohólica de ɖ naftol al 5-6%: 3 gotas
b) Solución de KOH al 40%: 2 gotas
c) Solución de creatinina al 5%: 2 gotas (opcional; acelera la reacción)
d) Leer el resultado después de 4 horas. Si el medio presenta un color rosa- rojo
rubí es positivo. Con frecuencia se puede apreciar la reacción positiva a los 15
min.
25. Para la prueba de indol, en un tubo con 3 mL de agua de triptona sembrar una
colonia aislada de los agares e incubar a 37°C por 24 horas. Salmonella es
negativa para esta prueba
26. Para la prueba de utilización de citrato, sembrar en estría sobre la superficie
inclinada de agar citrato de Simmons. Incubar de 24 a 48 horas a 37°C. El cambio
del color del medio a un azul fuerte indica una reacción negativa. Salmonella es
positiva para esta prueba

Resultados
- Si en ninguna placa de agar selectivo sembrada con el cultivo de
enriquecimiento selectivo, se desarrolla colonia aluna de Salmonella, reportar:
“AUSENCIA de Salmonella spp en 25g (u otra cantidad) de muestra examinada;
el medio sólido selectivo secundario fue (Agar SS…)”.
- Si a partir de uno, o de ambos medios de enriquecimiento selectivo, se aisla
Salmonella en las placas de agar selectivo, reportar: “Presencia de Salmonella
spp en 25 g (u otra cantidad) de muestra examinada, el medio de
enriquecimiento selectivo fue…; el medio sólido selectivo secundario fue…; las
pruebas bioquímicas realizadas fueron…; los antisueros con que se aglutino
fueron: la marca…”
- Se debe reportar en el informe del ensayo, la norma de referencia y el nombre
exacto del centro donde se identificó la cepa.
- Indicar cualquier condición no especificada en esta norma o considerada como
opcional. El reporte debe incluir todos los detalles necesarios para la completa
identificación de la muestra.
Bibliografía.

pág. 21
 - Salmonella característica. Referencia incluida en la página Wikipedia,
https://es.wikipedia.org/wiki/Salmonella.Fecha de acceso 16/05/2019

- Control microbiológico de los alimentos. Salmonella método de detección

presuntiva NTE INEN 1529-15:2013 Primera revisión. Referencia online
incluida en la página del Servicio Ecuatoriano de Normalización INEN.
https://ia801903.us.archive.org/21/items/ec.nte.1529.15.1996/ec.nte.152
9.15.1996.pdf. Fecha de acceso 16/05/2019

- Lectura sugerida:
- https://www.who.int/es/news-room/fact-sheets/detail/salmonella-(non-typhoidal)
Anexo
Detección e identificación de Salmonella, pruebas bioquímicas
Resultado Resultado
Prueba Interpretación
Positivo Negativo Salmonella
Lactosa y
Pico amarillo Pico rojo -
sacarosa
Glucosa
Fondo amarillo Fondo rojo +
(TSI)

H2S y Sin
Ennegrecimiento
Producción ennegrecimiento +
y gas
de gas (TSI) sin gas

Color rojo fuerte Color amarillo en

Indol -
en la superficie la superficie

Voges Sin cambio de

Rosa a rojo -
Proskauer color

pág. 22
 Rojo de
rojo Amarillo +
metilo

Sin crecimiento,
Citrato de
Crecimiento, azul sin cambio de V
Simmons
color

Colonias
Colonias rosadas
BPLS amarillas con +
con halos rojos
halos rojos

Ejemplos de reacciones de Triple Sugar Iron (TSI) Agar

Nombre de
Pico Fondo Gas H2S Interpretación
microorganismo

Shigella Alcalino Ácido - -

Salmonella Alcalino Ácido + +

Pseudomonas Alcalino Alcalino - -

pág. 23
DETECCIÓN DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS EN ALIMENTOS.

Staphylococcus aureus es una bacteria Gram positiva, anaeróbia facultativa, catalasa y

coagulasa positiva; se presenta en forma de cocos y se observa como un racimo de uvas.
Esta bacteria se encuentra en las fosas nasales, piel y pelaje de animales de sangre
caliente, así como también en aproximadamente el 50% de la población. Debido a sus
caracteristicas, la mayor incidencia de esta bacteria ocurre dentro de los productos
alimenticios que requieren una mayor manipulación durante su proceso como por
ejemplo el queso. Algunos de los síntomas por la intoxicación alimentaria con esta
bacteria son calambres abdominales, nausea, vómitos y a veces diarrea presentándose en
un rango de 30 minutos u 8 horas.

Para su detección y cuantificación se utiliza el agar selectivo Baird-Parker. Este método

se basa en el acentuado paralelismo que existe entre la producción de coagulasa por
parte del S.aureus y su capacidad de utilizar la lipoproteína de la yema de huevo y de
reducir el telurito a teluro. Las cepas que presenten una reacción negativa de la
coagulasa, o débilmente positiva, pueden ser distinguidas de otras bacterias mediante un
ensayo adicional, por ejemplo, la detección de termonucleasa. La sensibilidad de esta
prueba es alrededor de102UFC/g para muestras sólidas y 10 UFC/ mL para muestras
líquidas.

Las colonias se caracterizan por ser de forma regular, negras u oscuras intensas,
brillantes,
convexas, con un estrecho borde blanco, rodeadas por un halo de medio transparente.
Las
colonias atípicas de S. aureus yema de huevo negativas son sin halo transparente.

Objetivo

● Aplicar el método para la determinación de Staphylococcus aureus en alimentos

mediante la norma NTE INEN 1529-14:2013

Materiales y equipos
Medios y reactivos

pág. 24
 - Agua peptona al 0,1 %
- Agar Baird Parker
- Caldo infusión cerebro corazón (ICC) o caldo triptona soja (TSB).
- Caldo modificado Giolitti y Cantoni
- Agar azul de O-toluidina-DNA (ácido desoxirribonucleico)
Equipos e instrumetos
- Estufa de secado
- Incubadoras a 37°C y 43°C.
- Tubos de ensayo
- Tubos de ensayo de 120 mm x 12 mm
- Tubos de 75 mm x 7 mm
- Tubos capilares de 3 mm de diámetro.
- Varillas de vidrio en forma de L
- Placas Petri
- Aguja de inoculación
Muestra
- 100 g. Queso
Procedimiento
1. Si la muestra es líquida, transferir con una pipeta estéril 0.1 mL de muestra a
cada una de las dos placas de agar Baird Parker. De ser necesario diluir la
muestra.
2. En el caso de otros productos transferir con una pipeta estéril 0.1 mL de la
dilución -1, a cada una de las dos placas de agar Baird Parker.
3. Repetir el procedimiento para la dilución 10-2 y para otras diluciones decimales
si es necesario.
4. Si se conoce que el producto, puede poseer un bajo conteo de estafilococos
coagulasa positivos, de los límites de detección; se puede inocular 1,0 ml de
la muestra, si es líquido, o 1,0 ml de la suspensión inicial para otros productos,
ya sea en la superficie de una placa de agar grandes (140 mm).
5. Extender la muestra sobre toda la superficie de la placa utilizando el asa de
drigalski tratando de no tocar los lados del plato

pág. 25
6. Dejar que las placas se sequen con sus tapas durante alrededor de 15 min en el
laboratorio temperatura.
7. Invertir de las e incubar entre 35-37°C durante 24 h ± 2 h. A excepción de
productos fermentados o madurados que se incuban a 42°C durante 18 a 40 h.
Recuento de las colonias de S. aureus presuntivos
8. Elegir las placas de dos diluciones consecutivas que contengan entre 15 y 150
colonias típicas y/o atípicas. Las colonias típicas son negras u oscuras intensas,
convexas, con un estrecho borde blanco, rodeadas por un halo de medio
transparente. Las colonias atípicas son sin halo transparente.
9. Contar las colonias sospechosas típicas o atípicas y, si una misma placa hay
desarrollo de estos dos tipos, contarlas separadamente. Desechar las placas que
en más de la mitad de la superficie presentan crecimiento invasivo. Si menos de
la mitad de la superficie está cubierta, contar las colonias en la parte clara y
extrapolar de tal manera que, el número corresponda a la superficie total de la
placa.
Selección y purificación de colonias
10. En la ilustración 6 se encuentra el número de colonias que se deberán confirmar
bioquímicamente del total de colonia. El número resultante como mínimo 3, será
el número de colonias que serán inoculadas individualmente en tubos que
contenga aproximadamente 5 cm³ de caldo infusión cerebro corazón (ICC) o
caldo soya triptona (TSB).

Ilustración 6. Número de colonias a evaluar bioquímicamente dependiendo del número

pág. 26de
colonias.
 11. Si una misma placa tiene colonias típicas y atípicas contar por separado tomar la
raíz cuadrada del total de cada tipo de colonias contadas para la su purificación.
12. Incubar los tubos de ICC inoculados a 43°C ± 1°C durante (6 a 18) h.
13. De los tubos que presenten crecimiento, hacer un frotis y teñirlo por el método
de Gram. Verificar la presencia de solo cocos Gram positivos agrupados en
racimo.
14. Con cada uno de estos cultivos, realizar la prueba de la coagulasa y
termonucleasa, numeral

Prueba de la coagulasa
14. Inocular individualmente 0,1 cm³ con un asa uno de los cultivos de presuntos S.
aureus en tubos de ensayos que contengan 0,5 cm³ de plasma –EDTA de conejo.
15. Realizar un tubo control, pipetear 0,1 cm³ del caldo cerebro corazón y 0,5 cm³
de plasma.
16. Incubar los tubos en un baño de agua de (35 a 37)°C por (4 a 6)h.
17. A cada hora, inclinar delicadamente los tubos y observar la presencia de
coágulos.
18. Si al inclinar el tubo, casi horizontalmente, sobresale un coágulo, considerar que
la prueba es positiva 2 +. La formación de un coágulo bien diferenciado que
ocupe más de los ¾ del volumen original del líquido constituye una prueba de la
coagulasa positiva 3 +. Se tiene una prueba de la
coagulasa positiva 4 +, cuando la coagulación es total y
el coágulo no se disloca al invertir el tubo, siendo
necesario agitar el tubo delicadamente.
19. Diferenciar los coágulos verdaderos de los falsos,
agitando suavemente el tubo para que los seudo coágulos
se deshagan. En el tubo control, el plasma debe
permanecer inalterado.
20. Considerar como S. aureus coagulasa positivos a
aquellos que han producido una coagulación de 3 + o 4 +.
Prueba de la termonucleasa
21. Distribuir en portaobjetos aproximadamente 3 cm³ de agar azul de toluidina O-
ácido desoxirribonucleico (DNA) fundido o volúmenes de 10 cm³ en placas Petri
de 9 cm de diámetro.

pág. 27
 22. Dejar solidificar el agar.
23. Con un capilar estéril, hacer orificios de 3 mm de diámetro;(en cada portaobjetos
puede caber 10 a 12 orificios).
24. Calentar los cultivos en ICC en baño de agua hirviente durante 15 minutos.
Utilizando pipetas Pasteur o tubos capilares, depositar pequeñas alícuotas de
estos cultivos en cada orificio.
25. Incubar las placas o los portaobjetos entre 35 y 37°C, en ambiente húmedo,
durante 4 h.
26. La reacción es positiva, cuando alrededor de los pocitos aparece un halo rosa
brillante fuerte de al menos 1 mm de ancho.
Reporte de UFC
En cada placa, calcular el número de S.aureus relacionando el número de colonias
típicas sometidas a confirmación que dieron coagulasa positiva con el total de las
colonias típicas contadas. Si en las placas seleccionadas para el recuento se han
desarrollado colonias típicas y atípicas, realizar los cálculos por separado, luego, sumar
estos dos valores para obtener el número de S. aureus por placa.

Cuando por lo menos el 80% de las colonias típicas y atípicas sometidas a confirmación
son coagulasa positiva, tomar el número de S. aureus presuntivo contado como el
número de S.aereus por placa.

Cálculo del número, (N) de unidades formadoras de colonias (UFC), de S. aereus por
mL o gramo de muestra.

En donde:
N= suma de las colonias de S. aureus calculadas en todas las placas elegidas
n1 = número de placas contadas de la primera dilución seleccionada
n2 = número de placas contadas de la segunda dilución seleccionada;
d = dilución de la cual se obtuvieron los primeros recuentos, por ejemplo 10-2;
V = volumen del inóculo sembrado en cada placa.

pág. 28
Ejemplo: Volumen sembrado: 0,1mL
Dilución 10-2:
Placa a) 120 colonias típicas y 20 atípicas;
Placa b) 100 colonias típicas y 30 atípicas
Dilución 10-3:
Placa a) 20 colonias típicas y cero atípicas
Placa b) 15 colonias típicas y cero atípicas
Cálculo:
a) Dilución 10-2:
Placa a: 120 típicas y 20 atípicas: Siete de las 11 colonias típicas seleccionadas, fueron
coagulasa positiva, por tanto, 76 colonias son consideradas de S. aureus.
Dos de las cinco colonias atípicas seleccionadas fueron coagulasa positiva, luego, ocho
de las 20 colonias típicas son consideradas S. aureus.
Total de colonias, típicas y atípicas: 76 + 8=84
Placa b: 100 típicas y 30 atípicas
Total de colonias, típicas y atípicas: 60 + 12 = 72

b) Dilución 10-3:
Placa a: 20 colonias típicas y cero atípicas: Tres de las cinco colonias seleccionadas
fueron coagulasa positiva, luego, 12 de las 20 colonias son consideradas de S. aereus. -
Total de colonias típicas: 12
Placa b: 15 colonias típicas y cero atípicas: - Cuatro de las cinco colonias (80%) fueron
coagulasa positiva, luego, las 15 son consideradas de S. aureus.
Total de colonias típicas: 15

84 +72+12+15
N= = 9,2 x 104
0.1(2+0.1∗2)∗10−2

Estimación de números pequeños

a) Productos líquidos:
Si en las placas sembradas con muestra no diluida (producto original líquido) se han
desarrollado menos de 15 colonias de S. aureus, realizar los cálculos utilizando la
siguiente fórmula:

pág. 29
Donde
NE = número estimado de colonias por mL o gramo de muestra;
m = media de las colonias confirmadas en ambas placas
Vi = volumen inoculado.
b) Para productos sólidos: si las placas sembradas con la dilución (suspensión) más
concentrada presentan menos de 15 colonias de S. áureus, realizar los cálculos con la
siguiente fórmula:

En donde: f = factor de dilución (valor inverso de la dilución de la muestra)

Resultados
- Presentar el resultado como número, N, de unidades formadoras de colonias,
UFC, de Staphylococcus aereus por cm³ o g de muestra utilizando solo dos
cifras significativas multiplicadas por 10 x,, donde x es la respectiva potencia de
10.

- Si las placas inoculadas con la dilución o suspensión más concentrada no

contienen colonias, expresar los resultados como: número estimado NE de UFC
1
de S.aureus menor que (<) 1,0 * * factor de dilución“f”. Por ejemplo: si se
Vi
sembró alícuotas de 0,1 cm³ de la dilución 10-1, expresar el resultado así:

- Si no hay desarrollo de colonias de S. aureus en las placas inoculadas con

alícuotas no diluidas (producto original liquido), expresar el resultado como:
- NE de UFC de S. aureus < 1,0 x 1/Vi. Por ejemplo: si se sembro directamente
0.1 de la muestra sin diluir

pág. 30
 - Si las placas sembradas con la dilución menos concentrada (productos sólidos o
líquidos) presentan más de 150 colonias confirmadas, expresar el resultado de la
siguiente manera:

Bibliografía
- Control microbiológico de los alimentos Staphylococcus aureus. Recuento en
placa de siembra por extensión en superficie NTE INEN 1529-14: Referencia
online incluida en https://archive.org/details/ec.nte.1529.14.1998/page/n5.
Fecha de acceso: 16/05/2019

- Staphylococcus aureus y intoxicacion alimentaria. Referencia online incluida en

https://www.researchgate.net/profile/Yves_Le_Loir/publication/303175605_Sta
phylococcal_Food_Poisoning/links/5774f26208aeb9427e257cca.pdf. Fecha de
acceso: 16/05/2019

pág. 31
DETECCIÓN DE VIBRIO SPP EN ALIMENTOS

Entre los alimentos involucrados en ETA’s que están contaminados por V. cholerae
resaltan los moluscos bivalvos, así como los crustáceos y los pescados frescos-
refrigerados y congelados. Estos productos pueden generar enfermedades a los
consumidores debido a que desde su origen están sometidos a contaminación
microbiológica y química entre otras, sumado a la forma de consumo que en muchos
casos es cruda.

El cólera es una enfermedad relacionada con el abastecimiento de aguas con poca

higiene, o bien de los alimentos provenientes de aguas contaminadas con materia fecal y
que se consumen crudos. También puede aparecer V. cholerae O1 en moluscos
bivalvos, crustáceos o pescados que se obtienen de aguas no contaminadas en donde el
microorganismo forma parte del microbiota autóctono.

La enfermedad del cólera fue descrita por primera ocasión por Pacini en 1854. Esta se
presenta por la ingesta de la bacteria viable, la cual se establece en el intestino delgado y
libera una toxina termolábil. La producción de esta toxina provoca diarrea acuosa
causando los síntomas característicos del cólera que pueden ser desde una diarrea
acuosa ligera, hasta una diarrea severa con aspecto de “agua de arroz”. El
establecimiento de la enfermedad por lo general es repentino, con periodos de
incubación que varían entre las 6 h. y los 5 días.

Mediante estudios en personas voluntarias saludables, se ha demostrado que la dosis

infectiva necesaria para provocar la enfermedad es aproximadamente de un millón de
organismos, y se ha concluido que una vez adquirido el cólera la administración de
tetraciclina, así como de antiácidos, mejora rápidamente el curso de la enfermedad.

El género Vibrio incluye a los bacilos rectos o curvos gramnegativos, oxidasa positivos
(excepto las especies metschnikovii y gazogenes), anaerobios o anaerobios facultativos.
Muchas especies de Vibrio spp. son patógenas para humanos y están implicadas en
toxiinfecciones transmitidas por alimentos. La mayoría de los microorganismos que
pertenecen a este género no crecen en medios sin cloruro de sodio a excepción de V.

pág. 32
cholerae y V. mimicus, por lo tanto, debido a esta característica no es considerado un
Vibrio halofílico, aunque requieran trazas del ión sodio para su crecimiento.

Los microorganismos pertenecientes al género Vibrio que son causantes de

enfermedades gastrointestinales transmitidas por alimentos son V. parahaemolyticus y
V. vulnificus. V. parahaemolyticus es una bacteria halofílica encontradas normalmente
con microbiota normal de aguas y animales estuarios. El microorganismo tiene una
distribución mundial en ambientes estuarios y costeros, y se ha aislado de muchas
especies de pescados, mariscos y crustáceos. V. vulnificus es una bacteria halofílica
encontrada en ambientes estuarios y es fenotípicamente similar a V. parahaemolyticus.
Esta bacteria causa enfermedades transmitidas por alimentos y en heridas, cualquiera de
éstas puede progresar rápidamente hasta una septicemia mortal. Los moluscos bivalvos
crudos son la principal fuente de transmisión alimentaria del V. vulnificus.
Otros Vibrio spp. halofílicos, V. fluvialis, V. hollisae, V. alginolyticus, V. furnissii y V.
metschnikovii, se han asociado con gastroenteritis y están presentes en ambientes
estuarios junto con otras especies patógenas y no patógenas de Vibrio.

El método de determinación de Vibrio spp describe un esquema general que consiste en

un enriquecimiento a diferentes temperaturas, dependiendo del tipo de alimento que se
desee analizar, donde se pretende incrementar las poblaciones de Vibrio e inhibir otros
microorganismos presentes en la muestra. Seguido de un aislamiento diferencial en
medio sólido selectivo, el cual restringe el crecimiento de otros géneros diferentes a
Vibrio, permitiendo el reconocimiento de colonias sospechosas de la especie Vibrio
cholerae para luego realizar la purificación de las colonias características sospechosas
de pertenecer a la especie cholerae, se purifican en medios no selectivos. Finalmente se
realiza la identificación bioquímica y pruebas serológicas que permite la identificación
de los cultivos de V. cholerae.

Objetivo
 Aplicar el método el procedimiento para la determinación de Vibrio ssp en
alimentos de acuerdo con la Norma Oficial Mexicana.

pág. 33
Materiales y Equipos.
Medios y reactivos
- Agua de peptona alcalina (APA) 1% P/V
- Agar tiosulfato-citrato-bilis-sacarosa (TCBS)
- Agar soya tripticasa con 2% de NaCl
- Agar gelatina
- Agar triple-azúcar-hierro (TSI)
- Reactivo de Kovac’s
- Reactivo oxidasa
- Colorantes necesarios para la tinción de Gram
- Aceite de inmersión
Equipos e instrumentos
- Stomacher
- Fundas estériles
- Pipeta estéril con algodón de 1.0, 5.0 y 10.0 mL
- Baño de maría
- Incubadora
- Balanza
- Cucharas estériles
- Asas bacteriológicas
Procedimiento
1. Realizar el enriquecimiento e incubación dependiendo el tipo de muestra a procesar,
Ver Tabla 3
Tabla 3. Enriquecimiento, temperatura de incubación y número de diluciones según la naturaleza
de la muestra para la determinación de Vibrio spp.

Temperatura de
Tipo de pre-incubación
Preparación de la muestra
muestra 35-37°C/ 42 °C/24 h
24h

Agua y 25 mL de muestra en 225 mL de APA. X X

hielo
Crustáceos, Realizar una mezcla con 10 crustáceos y un peso X X
frescos, aproximado de 250 g c/u. 3 3

refrigerados De cada mezcla tomar 25g y colocar 225 mL de APA. diluciones diluciones

o Homogeneizar 2 min.

pág. 34
 congelados De cada mezcla realizar 2 diluciones más en 9 o 90
mL de APA
Pescados Tomar carne del área de las vísceras incluyendo estas. X ------------
frescos, 25 g de la muestra en 225 mL de APA. Homogeneizar 3

congelados 2 min. diluciones

o Realizar 2 diluciones más en 9 o 90 mL de APA

refrigerados
Moluscos Desconchar 10-12 moluscos (carne y líquido). 50.0 g X X
bivalvos, de la muestra en 450 mL de APA. Homogeneizar 2 3 3

frescos, min diluciones diluciones

refrigerados Dividir en 2 matraces estériles.

o Realizar 2 diluciones mas en 9 o 90 mL de APA
congelados

Queso de A 50 g de queso en cubos de aproximadamente 6 mm X ------------

suero y pasar a vasos de 2 litros. 6

Añadir de 800 a 1000 mL de solución hirviente de diluciones

ácido fosfórico (1:40)

Agitar continuamente a baja velocidad por 20 min
hasta disolver la muestra.
En caso de obstrucción agregar al agua de lavado una
solución alcalina (hidróxido de sodio al 5 % o ácido
fosfórico 1:40 o alcohol caliente) hasta que el filtro
quede limpio.

Helados y Pesar 25 g de muestra en 225 ml de APA y X -----------

bases para homogenizar por 2 min a máxima velocidad. 6
helado De cada mezcla realizar 2 diluciones más en 9 o 90 diluciones
mL de APA

2. Transferir el inóculo a una placa de agar TCBS con la ayuda de un asa

bacteriológica y realizar estrías por agotamiento.

pág. 35
3. Incubar a una temperatura de 35-37ºC durante 18 a 24 h.
4. Revisar y examinar las características coloniales. V. cholerae (El
Tor y Clásico) son grandes, lisas, amarillas (positivas para la
fermentación de la sacarosa) y ligeramente achatadas, con el
centro opaco y los bordes translúcidos
Nota: Las especies de Vibrio no producen colonias pequeñas de color crema en agar
TCBS, en cambio las colonias de V. mimicus, que están estrechamente relacionadas con
V. cholerae, son verdes (sacarosa negativa). La mayoría de las demás especies de Vibrio
crecen en agar TCBS y producen colonias amarillas y verdes.
5. Seleccionar por lo menos 3 colonias sospechosas aislarlas en agar soya tripticasa
con 2% de NaCl
6. Incubar a 35-37°C durante 12-18 h.
7. Tomar una de las colonias que crecieron en el agar soya tripticasa 2% de NaCl e
inocularla en el agar gelatina con el fin de garantizar la pureza de las colonias antes
de las pruebas bioquímicas.
8. Incubar a 35-37°C durante 24 h.
Prueba de oxidasa
9. Tomar suavemente una porción del cultivo desarrollado en el agar
soya tripticasa y depositarlo en un papel filtro humedecido con
algunas gotas de reactivo de oxidasa. Vibrio cholerae es positiva para
esta prueba en caso de existir presencia de este microorganismo el papel filtro se
tornará violeta.
Carbohidratos fermentables
10. Registrar las características del medio TSI antes de la inoculación (color del medio).
11. Tomar suavemente una porción del centro de una colonia con asa bacteriológica
recta
12. Inocular por picadura en un tubo con agar inclinado en triple azúcar hierro (TSI)
13. Incubar a 35-37°C por 18 a 24 h.
Prueba de halófila
14. Del cultivo desarrollado TSI, tomar una colonia con asa bacteriológica suspender el
inóculo en un tubo con:
- Caldo triptona con NaCl al 0% (T1N0)
- Caldo triptona con NaCl al 3% (T1N3)
- Caldo triptona con NaCl al 6% (T1N6).

pág. 36
15. Incubar los tubos a 37°C durante 18 a 24 h.
Nota: Vibrio cholera crecerá en concentraciones de 0 y 3 % de NaCl y no crecen en
6%. Algunos géneros de bacterias que no son Vibrio presentan reacciones similares a las
que presenta V. cholerae en TSI. Sin embargo, no crecen con concentraciones de 3 % de
NaCl. Todas las especies de Vibrio spp crecen en concentraciones de 3%.
16. Revisar las características de V. cholerae en la Tabla 4 para la interpretación de los
resultados de las pruebas realizadas.
Tabla 4. Características para la identificación de Vibrio cholerae

Caracterísica Vibrio cholerae

Morfología Bacilo Gram negativo (pueden ser
curvos)
TSI Superficie: Acida/ Fondo: Acida. Agar
totalmente amarillo. TSI:(A/A)
Raramente superficie alcalina y fondo
acido( agar rojo en la superficie y
amarillo en fondo) estas son
características de V. parahaemolyticus
TSI (K/A)
Prueba de oxidación-fermentación Fermentación + oxidación +
Citocromo oxidasa +
Crecimiento a 42°C +
Prueba de halófilia con NaCl 0% +
3% +
> 6% negativo.
V. parahaemolyticus crece en 3 y 6%
Fermentación de sacarosa +
Fermentacion de arabinosa -

Resultados
- Reportar presencia o ausencia de Vibrio spp o la especie identificada en 25.0 ó
50.0 g de alimento (según sea el caso) ó en 25.0 g ó mL de la muestra utilizada.

Bibliografía

pág. 37
- Nota: Este procedimiento fue obtenido de la referencia online:
http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/patogNOMVibrio_17366.pdf, cuyas
referencias fueron:
- Norma Oficial Mexicana NOM-027-SSA1-1993. Bienes y Servicios. Productos
de la pesca. Pescados Frescos Refrigerados y Congelados. Especificaciones
sanitarias. México.
- Norma Oficial Mexicana NOM-031-SSA1-1993. Bienes y Servicios. Productos
de la pesca. Moluscos Bivalvos Frescos Refrigerados y Congelados.
Especificaciones sanitarias. México.

- Apéndice B. Norma Oficial Mexicana NOM-041-SSA1-1993. Bienes y

Servicios. Agua purificada envasada. Especificaciones sanitarias. México.
- Food and Drug Administration (2003) “Bacteriological Analytical Manual”. 9th
ed. Arlington, VA: AOAC.

- Kaysner C. A., & De Paola A. Jr. (2001) “Vibrio”. In: Compendium of Methods
for the Microbiological Examination of Foods. 4th ed. Downs F.P. & Ito K.
(Eds.) APHA. Washington. 405-420.

- International Commission on Microbiological. Specifications of Foods (2005)

“Microorganisms in Foods 6” Chapman & Hall. 2nd ed

pág. 38
DETECCIÓN DE CLOSTRIDIUM PERFRINGES EN ALIMENTOS

Clostridium perfringens es una bacrteria Gram + y uno de los patógenos bacterianos

ampliamente distribuidos en el ambiente gracias a su capacidad de formar esporas, se
encuentra comúnmente formando parte de la microflora del intestino de humanos y
animales. Esta bacteria puede producir una toxiinfección alimentaria cuando se ingiere
un gran número de células de esta bacteria (por encima de 10 8), debido la liberación de
endotoxinas en el intestino. En personas sanas produce una enfermedad leve y de corta
duración, causando principalmente diarrea y dolores abdominales. La toxiinfección por
C. perfringens es reconocida como una de las Enfermedades de Transmisión
Alimentaria (ETA) más comunes, responsable de aproximadamente el 20% de los casos
anuales de intoxicación por alimentos.

Esta bacteria puede ser detectada en una amplia gama de alimentos crudos, como
resultado de contaminación de la tierra o de materia fecal. Puede encontrarse en carnes
crudas, pescados, sopas y salsas deshidratadas, leche, gelatina, pasta, harina, soja,
vegetales crudos y especias. Las toxiinfecciones causadas por C. perfringens se asocian
comúnmente a platos cárnicos de res cocinada, aves, alimentos secos o precocidos; al
crecer rápidamente en ausencia de oxígeno, este microorganismo se encuentra
habitualmente en el fondo de estofados o en el centro de grandes piezas de carnes y
aves. En aquellas cepas termo resistentes, el calor de la cocción proporciona un choque
térmico necesario para la activación y germinación de las esporas, y a la vez reduce los
niveles de oxígeno proporcionando un ambiente óptimo para el crecimiento de las
células vegetativas.

Las técnicas de identificación de C. perfringens se basan en el cultivo en medio

selectivo de sulfito-cicloserina (SC), en el que aparece en forma de colonias
características con precipitado negro, causado por la reducción de sulfito a sulfuro
incubadas en anaerobiosis a 44°C por 18+/-2h. Luego se seleccionan colonias para
realizar pruebas complementarias como tinción Gram, movilidad y/o indol, según la
guía de laboratorio de microbiología del FSIS

pág. 39
Objetivo
 Determinar Clostridium perfringens en alimentos basándonos en la guía de
laboratorio de microbiología del Food Safety and Inspection Service of United
States Department of Agriculture
Materiales y Equipos
Medios y reactivos
- Agar peptona 0.1%
- Agar Triptosa Sulfito Cicloserina (TSC)
- Tioglicolato fluido caldo
- Lactosa gelatina medio
- Medio SIM ó Movilidad de nitrato medio
- Reactivo de Kovacs.
Equipos e instrumentos
- Jarras anaeróbicas
- Pipetas y Micropipetas
- Incubador 46 °C
- Contador de colonias
- Asa bacteriológica
Procedimiento
1. Pesar 25 g de muestra en una funda estéril y agregar 225 mL de agua de peptona
2. Homogenizar la muestra con la ayuda del stomacher.
3. Realizar diluciones seriadas hasta 10-6
4. Añadir 0.1 mL de inoculo de las diluciones realizadas sobre en las placas de
TSC (placas con 6-7 mL TSC con yema de huevo)
5. Esparcir el inoculo con el “hockey stick” o asa drigalski estéril.
6. Después que el agar absorba el inoculo añadir aproximadamente 10 mL de TSC
(libre de yema de huevo) temperado entre 50 y 55°C.
7. Incubar en la jarra anaeróbica a 46°C por 16 a 18 h.
8. Después de la incubación cuente las colonias negras con un halo opaco alrededor
de estas de 2-4 mm.
9. Multiplique el número de colonias por 10 y el factor de dilución total para tener
el número total. Cuenta las placas de TSC que muestren 20-200 colonias

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10. Seleccione 10 colonias negras de las placas de TSC e inocula cada colonia en un
tubo de caldo de tioglicolato fluido recién desairado y enfriado
11. Incube a 35 °C durante 18-24 h ó 4 h en baño maría a 46°C.
12. Realizar tinción Gram en cada tubo inoculado. Clostridium perfringes es un
bacilo Gram positivo corto y grueso.
13. Para la prueba en caldo de hierro inocular 1 ml de cultivo de tioglicolato
fluido con abundante crecimiento en caldo de leche de hierro.
14. Incubar a 46°C en baño de maría durante 2 horas.
15. Verificar la presencia de "fermentación tormentosa" la cual se caracteriza por
una rápida coagulación de la leche y la formación de una masa esponjosa que
generalmente se eleva por encima de la superficie media.
16. Mantener los tubos positivos y revisarlos después de 5 horas. De no presentar
fermentación tormentosa es poco probable que se trate de cultivos de C.
perfringens.
Pruebas confirmatorias
17. De los tubos de tioglicolato fluido tomar la muestra con el asa de inoculación
recta estéril e inocular en cada tubo con medio SIM o Movilidad nitrato. Si se
encuentra utilizando el medio de movilidad nitrato debe adicionar 0.5 % de
glicerol y galactosa respectivamente
18. Incubar a 35°C por 24 h y revisar la movilidad. Como C. perfringes no es móvil
el crecimiento será en la línea de inoculación. La reducción de nitratos a nitritos
se ve mediante el cambio de color del medio a naranja. Esta prueba se puede
hacer tomando una gota de tubos de tioglicolato inoculados y añadirle zinc en
polvo, C. perfringes es positivo para esta prueba.
19. Tomar la muestra con el asa de inoculación recta estéril de los tubos de
tioglicolato fluido e inocular en cada tubo con medio lactosa-gelatina.
20. Incubar los medios inoculados por 24 horas a 35°C. Examinar la presencia de
gas y el cambio de coloración (rojo a amarillo) en el medio de cultivo de lactosa-
gelatina, lo que indica la fermentación de la lactosa.
21. Verificar la licuefacción de la gelatina después incubación inclinando los tubos.
22. Revisar las características de C. perfringes en la siguiente tabla para calcular la
porción de colonias positivas
Tabla 5. Características de C. perfringes.

Prueba C.
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 perfringes
Movilidad -
Producción de H2S +
Licuefacción de la +
gelatina
Reducción de nitratos +/-
Fermentación de lactosa +

Resultado
- Realiza el promedio de las placas emparejadas contadas y calcula UFC/g o mL.
Luego multiplica por la porción de colonias confirmada.

- En el informe debes indicar el número de colonias con dos cifras significativas

(UFC/g) e indicar la norma de referencia, temperatura de incubación y todas las
condiciones operativas no especificadas en esta norma o aquellas consideradas
como opcionales y los incidentes que puedan haber influenciado en el resultado.

Bibliografía
- Departamento de agricultura de los Estados Unidos. Seguridad alimentaria y
servicio de inspección. Referencia online incluida
en:https://www.fsis.usda.gov/wps/wcm/connect/87a04da8-5c60-4983-84a5-
8b4d0b24db87/Mlgchp13.pdf?MOD=AJPERES. Fecha de acceso: 26/03/2020

- Administración Nacional de Medicamentos Alimentos y Tecnología Médica,

Referencia online incluida en
http://www.anmat.gov.ar/webanmat/Publicaciones/FT_Clostridium_perfringens.
pdf. Fecha de acceso: 15/07/2019

pág. 42
DETECCIÓN DE LISTERIA SPP EN ALIMENTOS

Listeria es una bacteria Gram positiva, catalasa positiva y anaerobia facultativa, que
puede encontrarse tanto en el ambiente agrícola (suelo, plantas y agua) como en el del
procesamiento de alimentos. Listeria es resistente a varias condiciones ambientales,
tales como temperatura (0-45°C), salinidad (20%) o acidez alta (Ryser and Marth,
1991); crece usualmente en condiciones de oxígeno bajo y a temperaturas de
refrigeración, y sobrevive períodos largos en el medio ambiente, en los alimentos, en la
planta procesadora, y en la refrigeradora casera. Aunque está presente frecuentemente
en alimentos crudos de origen tanto animal como de plantas, también puede estar
presente en alimentos cocidos debido a contaminación posterior al procesamiento.
Listeria monocytogenes es la especie del genero Listeria responsable de enfermedades
transmitidas por alimentos habiendo sido aislada en alimentos como leche fluida cruda y
pasteurizada, quesos (en particular las variedades blandas), helado, verduras crudas,
chorizos fermentados de carne cruda, carne cruda y cocida de ave de corral, carnes
crudas (todos tipos) y pescado crudo y ahumado (Farber and Peterkin, 1991; Ryser and
Marth, 1991). A pesar de que L. monocytogenes puede encontrarse inicialmente en un
alimento contaminado en un nivel bajo, este microorganismo puede multiplicarse
durante el almacenamiento, incluyendo temperaturas de frigorífico.

Está bien establecido que la ingestión del L. monocytogenes puede ocasionar

enfermedad grave en los seres humanos, i.e., la listeriosis (Rocurt and Cossart, 1997;
Farber and Peterkin. 1991; Ryser and Marth, 1991). La mayoría de los casos de
listeriosis ocurren en mujeres embarazadas o en individuos con una enfermedad que los
predispone (por ejemplo, alcoholismo, diabetes, cirrosis del hígado) o con el sistema
inmunológico alterado como resultado ya sea por una enfermedad (como el SIDA) o de
tratamientos inmunosupresores para una malignidad o un transplante de órgano (Rocurt
and Cossart, 1997): ocasionando en estos individuos inmunodeprimidos meningitis,
septicemia y abortos. Sin embargo, en personas sanas los síntomas pueden presentarse
como gastoenteristis febril leve, con fatiga, mialgia dentro de las 9 a 32 horas.

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Objetivo
 Determinar Listeria spp en alimentos según el procedimiento de la red nacional
de laboratorios oficiales de análisis de alimentos de Argentina basado en la
FDA-DAM: 2011

Materiales y equipos
Medios y reactivos
- BLED
- Agar Oxorfd
- Agar y caldo soya tripticasa-0.6% extracto de levadura
- Colorantes para tinción Gram
- Peróxido de hidrogeno
Equipos e instrumentos
- Baño María a 50 °C
- Stomacher
- Fundas plásticas estériles
- Placas de Petri estériles
- Pipetas de 1 ml estériles
- Matraz Erlenmeyer
- Espátulas
- Balanza
- Asa de inoculación
- Incubadora
Muestras
- Pescado crudo

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Procedimiento
Este procedimiento ha sido extraído y modificado de la red nacional de laboratorios
oficiales de Análisis de Alimentos de Argentina.
1. Realizar la primera dilución, 25 g o 25 mL
de la muestra en 225 mL de BLEB en una funda
estéril
2. Mezclar cuidadosamente la solución utilizando el
stomacher
3. Incubar a 30 °C a 4h.
4. Asépticamente adicionar las 3 soluciones
esterilizadas para obtener 10 mg/L acriflavina, 40
mg/L cycloheximida and 50 mg/L ácido
nalidíxico sódico
5. Tomar una muestra con el asa bacteriológica y
realizar la siembra por estría en el agar
selectivo OXA
6. Ilustración 7. Diagrama de flujo del procedimiento para la detección de Incubar las placas a 35±
Listeria monocytogenes en alimentos
2 °C
7. Examinar las placas y contar las colonias
típicas de Listeria ssp. Las colonias son pequeñas
de alrededor 1 mm y tienen un halo de
oscurecimiento debido a la hidrólisis de la esculina.
8. Seleccionar 5 o más colonias típicas sembrar por estriado en agar TSA-YE para
aislamiento de las colonias sospechosas.
9. Incubar a 30°C durante 24 h –48 h.
10. Realizar tinción Gram. Listeria spp. se presen ta como bacilos Gram positivos,
cortos y delgados. Las demás pruebas también deberán realizarse

Prueba de movilidad

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11. Tomar una colonia típica de una placa incubada a una temperatura de 30 °C o
menor preparar una solución densa en solución fisiológica al 0.85%.
12. Observar en el microscopio la solución realizada, Listeria spp. se presenta como
bacilos cortos, delgados y con movimientos característicos en tumbos.
Prueba de la catalasa
13. Suspender una gota de peróxido de hidrogeno al 3% sobre un portaobjeto
14. Tomar una colonia y realizar un frotis con la solución de peróxido. La reacción
positiva se ve por la formación de burbujas de gas.

Resultados
- De acuerdo con la interpretación de resultados, indicar presencia o ausencia de
Listeria spp en la cantidad de muestra analizada (por gramos o mililitros para
muestras líquidas).

Bibliografía.
- Análisis de alimentos del gobierno de Argentina. Referencia
online:http://www.anmat.gov.ar/renaloa/docs/Analisis_microbiologico_de_los_a
limentos_Vol_I.pdf. Fecha de acceso: 15/07/2019

- Programa conjunto FAO/OMS sobre las normas alimentarias comité del

CODEX sobre la higiene de los alimentos. Referencia online
incluida:http://www.fao.org/tempref/codex/meetings/ccfh/ccfh32/fh99_10s.pdf.
Fecha de acceso: 15/07/2019

- Determinación y enumeración de Listeria monocytogenes en alimentos,

Referencia online:https://www.fda.gov/food/laboratory-methods-food/bam-
detection-and-enumeration-listeria-monocytogenes. Fecha de acceso:
27/04/2020

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