UNIVERSIDAD TÉCNICA DE AMBATO

FACULTAD DE CIENCIA E INGENIERÍA EN ALIMENTOS

CARRERA DE INGENIERÍA BIOQUÍMICA
LABORATORIO DE BIOPROCESOS

Profesor: Dr. Ramiro Velastegui Ph. D.

Ayudante: Egdo. Lenin Sarabia
Semestre: Séptimo Práctica: 09

Tema: “SEPARACIÓN DE PIGMENTOS VEGETALES MEDIANTE CROMATOGRAFÍA EN

PAPEL”

1. INTRODUCCIÓN

Cuando se observa una hoja, el pigmento clorofila es usualmente el único pigmento que parece estar
presente. De hecho, la clorofila es solamente uno de varios tipos de pigmentos presentes en las hojas y uno
de tantos pigmentos que están involucrados en el proceso de fotosíntesis. Una vez removidos de la hoja, los
pigmentos fotosintéticos pueden ser separados uno de otro e identificados mediante cromatografía.
La cromatografía es un método usado principalmente para la separación de los componentes de una muestra
en la cual los componentes son distribuidos entre dos fases una de las cuales es estacionario, mientras que la
otra es móvil. La fase estacionaria puede ser sólido o líquido soportado en un sólido o en un gel (matriz). La
fase estacionaria puede ser empaquetada en una columna extendida en una capa, distribuida como una
película.
La cromatografía en papel tiene como soporte un papel de celulosa y es un proceso muy utilizado en los
laboratorios para realizar análisis cualitativos ya que pese a no ser una técnica muy potente no requiere de
ningún tipo de equipamiento.
La fase estacionaria está constituida por una tira de papel de filtro. La muestra se deposita en un extremo
colocando pequeñas gotas de la solución y evaporando el solvente. Luego el disolvente utilizado como fase
móvil se hace ascender por capilaridad. Esto es, se coloca la tira de papel verticalmente y con la muestra del
lado de abajo dentro de un recipiente que contiene fase móvil en el fondo.
Después de unos minutos cuando el solvente deja de ascender o ha llegado al extremo se retira el papel y
seca. Si el solvente elegido fue adecuado y las sustancias tienen color propio se verán las manchas de
distinto color separadas. Cuando los componentes no tienen color propio el papel se somete a procesos de
revelado. Hay varios factores de los cuales depende una cromatografía eficaz la elección del solvente y la del
papel filtro.

2. OBJETIVOS
2.1. Separar pigmentos de muestras vegetales mediante cromatografía en papel.
2.2. Identificar pigmentos presentes en hojas de vegetales.

3. MATERIALES
 Jarra cromatográfica
 Mortero y pistilo
 Espinaca
 Papel filtro
  Solvente para cromatografía (90% Isopropyl Alcohol)
 Regla
 Tubos capilares
 Calculadora

4. PROCEDIMIENTO

Preparación de la solución:
1. Coloque hojas de espinaca en el mortero y añada aproximadamente 5 ml de alcohol isopropilico al 90%.
2. Macere fuertemente la mezcla de espinaca/alcohol para desarrollar un líquido concentrado.
Preparación del cromatograma:
1. Cortar la base del papel filtro de manera que forme la punta de un triángulo.
2. Dibujar una línea a través del papel 1 cm arriba de la punta del triangulo. Esta es la línea de inicio.
3. Usando un tubo capilar transferir una gota de la solución de pigmento verde al centro de la línea de
inicio.
4. Vierta aproximadamente 1 cm de solvente para cromatografía en la jarra cromatográfica.
5. Coloque los papeles en las jarras cromatográficas de manera que las puntas del triángulo toque el
solvente. No sumerja la línea de pigmento abajo del nivel del solvente.
6. Permitir que el solvente ascienda por alrededor de 15 minutos o hasta que la línea de solvente se
acerque al final del papel.
7. Cuando la línea de solvente está cerca de 1 cm del fin del papel. Remueva el papel del solvente y
marque el punto mas lejano de avance del solvente antes que éste se evapore.
8. Permita que el papel filtro se seque, y observe el cromatograma. Algunos de los posibles colores y
pigmentos que estos representan son:
o Amarillo claro - carotenos
o Amarillo - xantofilas
o Verde brillante – clorofila a
o Amarillo-verde – clorofila b
o Rojo - antocianinas
9. Mida la distancia desde el punto de inicio hasta el final de desplazamiento del pigmento de cada uno
de ellos. Apunte estás mediciones en la siguiente tabla y calcule los valores Rf para cada uno de los
pigmentos, de acuerdo a la siguiente fórmula:

Rf = distancia recorrida por el pigmento desde la línea de inicio

Distancia recorrida por el solvente

 Pigmentos de Hoja de Espinaca

Distancia
Línea Color Pigmento probable recorrida desde Valor Rf
el inicio
1
2
3
4
5 (solvente)

5. RESULTADOS
1. Presente los cromatogramas desarrollados en práctica.
2. ¿Cuántos pigmentos fueron encontrados en la hoja de espinaca?
3. ¿Cuál de estos pigmentos puede ser considerado el más polar? Explique
4. Explique: ¿Por qué hay diferencias en el desplazamiento de los pigmentos de la hoja de espinaca?

6. CUESTIONARIO
1. Suponga que hay dos compuestos, A y B, en una mezcla. La afinidad química de A por la fase
estacionario es menor que la afinidad de B, y la afinidad química de A por la fase móvil es más
grande que la afinidad de B. Si la mezcla es sujeta a papel cromatográfico, ¿Cuál sustancia se habrá
desplazado mucho más al finalizar el experimento? ¿Cuál sustancia tundra el valor Rf más largo?
Explique cada respuesta.
2. Indique otras aplicaciones de cromatografía en papel además de separar y observar pigmentos
vegetales.
3. Algunos árboles tienen hojas que son verdes en el verano y rojas, amarillas o naranjas en otoño.
¿Dónde están estos colores durante el verano? ¿Cómo pueden de repente aparecer en otoño?

7. BIBLIOGRAFÍA
 CSUN, “Separation of Plant Pigments by Paper Chromatograph”, disponible en:
http://www.csun.edu/chemistry/documents/Paperchrom.pdf
 Paper Chromatography: Chloroplast & Pigment Analysis, disponible en:
http://www.chemtopics.com/unit06/pchrom.pdf