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UNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALA

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACIA
ESCUELA DE QUÍMICA FARMACÉUTICA
DEPARTAMENTO DE FARMACOGNOSIA Y FITOQUÍMICA
CURSO DE FITOQUÍMICA
GLICÓSIDOS
DEFINICION:
Son compuestos que al ser hidrolizados dan origen a una porción que
es azúcar y otra que no lo es (aglicona o genina).

ESTRUCTURA:

El enlace glicosídico se forma por la deshidratación del azúcar y de la

aglicona. Un grupo hidroxilo de la aglicona se condensa con el hidroxilo
del hemiacetal del azúcar, formándose así un acetal interno. Si el grupo
OR de la aglicona se encuentra en el mismo sentido estérico que el
grupo CH2OH del carbono 5, la configuración se designa beta; si está en
sentido estérico opuesto, se designa alfa. Ejemplo:

CH3

Alfa-metil glucósido

En la naturaleza se encuentran solo las formas beta.

CARACTERISTICAS DE LOS GLICOSIDOS:

- Son en general muy ligeramente solubles en agua, y un poco más

solubles en etanol, metanol, o mezclas de ellos en agua.

- En las plantas, los glicósidos a menudo están acompañados de enzimas

capaces de hidrolizarlos, las cuales se localizan en el mismo tejido,
aunque en células diferentes.

- Los glicósidos son ópticamente activos, por lo que sus rotaciones

específicas contribuyen a su caracterización física.

FUNCION FISIOLOGICA:

Se cree que los glicósidos intervienen en los fenómenos de óxido-

reducción, así como en el crecimiento y fecundación de las plantas. Se
cree además que los glicósidos flavonoides protegen de la luz y rayos
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ultravioleta, y que debido a sus propiedades fungicidas también

protegen a la corteza de los árboles contra el ataque de parásitos.

CLASIFICACION:

En base a la estructura molecular de las agliconas, los glicósidos se

clasifican así:

1. Glicósidos fenólicos

2. Glicósidos cianogénicos

3. Saponinas: esteroidales y triterpénicas

4. Glicósidos cardiotónicos

1. GLICOSIDOS FENOLICOS:

Son en general compuestos relativamente polares, con cierta

solubilidad en agua, pudiendo ser detectados por el intenso color verde,
púrpura, azul o negro que producen cuando se les agrega una solución
acuosa o alcohólica de cloruro férrico. Debido a su naturaleza aromática
muestran intensa absorción en la región ultravioleta del espectro, lo cual
permite identificarlos y cuantificarlos.

1.1 DERIVADOS DEL ACIDO BENZOICO Y SALICILICO:

1.1.1 Salicina:

Al ser hidrolizada produce saligenina y glucosa. Se extrae de

varias especies de los
géneros Salix y Populus (Fam. Salicaceae). La salicina
tiene propiedades
antirreumáticas, con actividad semejante a la del ácido salicílico.

Salicina

1.1.2 Glucovainillina:
Se encuentra presente en especies del género Vanilla (Fam.
Orchidaceae), la cual,
mediante hidrólisis enzimática durante la maduración de los
frutos, genera vainillina
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y glucosa. La vainillina es bastante aromática, por lo que

se usa como agente
sazonante y aromatizante en las industrias farmacéuticas y de
alimentos.

CHO CHO

Glucosa-O OCH3 HOOCH3

Glucovainillina Vainillina

1.2 CUMARINAS:
Son compuestos ampliamente distribuidos en las plantas,
principalmente en las familias Umbeliferaceae y Rutaceae. Pueden
encontrarse en todas las partes de la planta, pero son más abundantes
en los frutos.

Cumarina: (Configuración C6C3 )

El nombre cumarina fue asignado originalmente a la estructura anotada

arriba: benzo-alfa-pirona. Dicho compuesto fue aislado por primera vez
en 1820 por Vogel de la Coumarona odorata (“árbol de la tonka”). A
pesar de haberse conocido desde esa época, los progresos hechos en
este campo fueron escasos hasta hace aproximadamente treinta y cinco
años. Las cumarinas han cobrado gran interés en años recientes debido
al amplio rango de actividad biológica que han mostrado. Ejemplo: el
dicumarol como anticoagulante y antibacterial; la novobiocina como
antibiótico, las aflatoxinas como hepatotóxicos y carcinogénicos;
algunas se usan como saborizantes y en perfumería.

Hasta hoy se conocen aproximadamente 800 cumarinas, de las

cuales sólo 35 carecen de oxígeno en posición 7. Las cumarinas están
biogenéticamente relacionadas con los flavonoides, ligninas, esteroides
y terpenoides.

1.3 QUINONAS:
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Son dicetonas insaturadas, que por reducción se convierten en

polifenoles, los que fácilmente las regeneran por oxidación. Son
pigmentos de plantas superiores, aislados también de hongos, líquenes,
animales marinos y ciertos insectos. Pueden ser de color amarillo, rojo o
marrón (castaño), pero si forman sales de hidroquinonas toman color
verde, azul o violeta. Algunas tienen propiedades antibióticas.

1.3.1 Benzoquinonas:

Las benzoquinonas se han encontrado con frecuencia en los

hongos, ejemplo: la muscarufina, presente
en Amanita muscaria.

Benzoquinona

1.3.2 Antraquinonas:

Son las quinonas más extensamente distribuidas en las plantas. Se

encuentran principalmente en las familias de las
Leguminosas, Rubiaceas, Ramnaceas, Poligonaceas, Ericaceas y
Liliaceas. Los derivados antraquinónicos se encuentran en las plantas
con acción purgante, como por ejemplo en la frángula,
ruibargo, hojas de sen y la cáscara sagrada. El colorante
presente en la cochinilla (insecto nativo de Centro América) es el
ácido carmínico, un glicósido antraquinónico.

Antraquinona:

1.4 FLAVONOIDES

Se les llama también antoxantinas. Son pigmentos vegetales, de

color amarillo o blanco, que poseen un esqueleto carbonado de 15
átomos (C6C3C6). Hasta hoy se conocen aproximadamente 900
flavonoides naturales. Se encuentran ampliamente distribuidos en las
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plantas, ya sea en forma libre o como glicósidos. No se encuentran en

algas, hongos o bacterias.

Núcleo básico de un flavonoide: FLAVONA

Tiene dos anillos aromáticos (A y B), unidos por una unidad de tres
carbonos que pueden o no formar un tercer anillo, que en caso de existir
se denomina C. Es frecuente encontrar diferentes azúcares enlazados a
una misma aglicona, y en diferentes posiciones, lo que hace aún mayor
el número de glicósidos conocidos.

USOS:

- Los flavonoides se utilizan como colorantes de lanas; las

polihidroxiflavonas se usan para conservar grasa o jugos de frutas (son
antioxidantes). La rotenona se usa como insecticida. Los glicósidos de
dihidrochalconas como edulcorantes.

- En medicina: contra la fragilidad capilar (ejemplo la rutina);

dilatadores de las coronarias (Crataegus y Arnica); como espasmolíticos,
antihepatotóxicos, coleréticos (que estimulan la secreción biliar), como
estrogénicos, diuréticos, antimicrobianos y fungicidas.

FUNCION FISIOLOGICA EN LAS PLANTAS:

Los flavonoides son estructuras ricas en grupos hidroxilo, por lo que

se unen fácilmente a las proteínas, convirtiéndose en potentes
inhibidores de algunos sistemas enzimáticos. Dan color amarillo a flores
y frutos, lo que atrae a mariposas y abejas, con lo cual ayudan a la
polinización. También hay flavonoides amargos, que pueden
proporcionar la manera de repeler los gusanos que se alimentan de las
hojas.

EJEMPLOS DE FLAVONOIDES:

1.4.1 Flavonas y Flavonoles:

Las flavonas son abundantes en familias herbáceas, tales como las

Compuestas, mientras que los flavonoles abundan en las
angiospermas leñosas.

Ejemplo de flavonas: apigenina (género Apium), Fam. Umbelliferaceae.

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Ejemplo de flavonoides: quercetina, quenferol y miricetina, presentes en

el género Quercus, familia Fagaceae.

Los flavonoles son las 3-hidroxi-flavonas.

Apigenina: flavona

1.4.2 Antocianinas:

El nombre antocianina proviene del griego anthos, que significa

flor, y kyanos, que quiere decir azul. Son pigmentos rojos y azules, a
diferencia de las antoxantinas, que son amarillas o blancas. Su
estructura química es SIMILAR a la de los flavonoides:

Antocianidinas: se llama así a las agliconas presentes en las

antocianinas. Ejemplo de las más comunes en la naturaleza:
pelargonidina, peonidina, cianidina, delfinidina.

Leucoantocianinas o Proantocianidinas: se llaman así las sustancias

capaces de convertirse en antocianidinas mediante calentamiento con
un ácido mineral.

A pH bajo, las antocianinas en solución se presentan de color rojo. Al

incrementarse el pH el color desaparece, con la formación de una
pseudobase. A un valor de pH mayor (cerca o mayor de 7) aparece un
color azul verdoso, debido al posible rompimiento de uno de sus anillos
aromáticos. A pH muy alto se rompe la estructura de la antocianina, de
manera irreversible.

1.5 BETACIANINAS:

Son pigmentos rojos aislados de la remolacha, Beta vulgaris, familia

Chenopodiaceae. Ejemplo: la betanina es el principal pigmento de la
remolacha. Antiguamente se les consideraba como flavonoides,
relacionados con las antocianinas, pero luego se encontró que contienen
nitrógeno y su estructura básica es distinta. Se ha observado que las
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betacianinas y las antocianinas se excluyen mutuamente, y no se

encuentran de manera conjunta en las mismas familias vegetales.

2. GLICOSIDOS CIANOGENICOS:

Muchas plantas contienen glicósidos que al hidrolizarse generan

ácido cianhídrico, ya que poseen un grupo nitrilo unido a la aglicona.
Ejemplo: la amigdalina, presente en la familia Rosaceae, incluyendo
las semillas de las almendras amargas (Prunus amigdalus, variedad
Amara), en las semillas de albaricoque (Prunus malus), y otras especies
del género Prunus: duraznos, ciruelas, cerezas.

La linamarina es una toxina extraída de la yuca común: Manihot

utilissima y Manihot esculenta (Fam. Euphorbiaceae).

Amigdalina

Muchos de estos glicósidos son derivados del nitrilo del ácido mandélico.
La porción azucarada puede ser mono- o di-sacárido. Si es un disacárido,
enzimas como la emulsina pueden hidrolizarlo así:

amigdalasa

Amigdalina + agua mandelonitrilo + 2 glucosas

Prunasa

Benzaldehído + HCN (gas)

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3. SAPONINAS:

Son poderosos agentes tensioactivos que forman espuma al ser

agitados con agua. Causan hemólisis a bajas concentraciones. Son
tóxicas para los peces, por lo que algunas plantas que las contienen
se utilizan para pescar. En base a la estructura química de la aglicona,
las saponinas pueden ser: esteroidales y triterpenoides.

Ambos tipos de saponinas son solubles en agua y etanol e insolubles

en éter. Mediante hidrólisis enzimática de las saponinas se obtienen
sus agliconas: las sapogeninas.

Las saponinas no son fáciles de aislar, por lo que muchas veces se

prefiere hidrolizar el extracto crudo de la planta y aislar la
sapogenina libre del azúcar. Durante muchos años se ha brindado
especial importancia al estudio de plantas que contienen saponinas con
el objeto de descubrir precursores de la cortisona. Esta sustancia fue
aislada originalmente de la corteza adrenal y luego sintetizada a partir
de los ácidos biliares del ganado. Luego se encontró que las
sapogeninas esteroidales podían constituir una fácil más fácil.

Se ha encontrado que los esteroides aislados de plantas más

importantes en la producción de cortisona son:

- Diosgenina y botogenina, del género Dioscorea.

- Sarsapogenina y smilagenina, del género Smilax.

- Sitosterol, de aceites crudos vegetales.

- Sarmentogenina, del género Strophantus.

También puede sintetizarse a partir de las saponinas esteroidales:

vitamina D, hormonas sexuales y anticonceptivos.

Biosíntesis de Saponinas:

Las llamadas saponinas neutras derivan de los esteroides, mientras que

las saponinas ácidas proceden de los triterpenoides:

Acetato RNúcleo esteroidal

C D

A B
Mevalonato O

C D

A B
O
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Escualeno

Núcleo
triterpenoide pentacíclico

El proceso principal de biosíntesis que da lugar a las sapogeninas es

similar, e incluye la condensación de subunidades de acetato, que
permiten la formación del hidrocarburo triterpenoide escualeno, que
origina esteroides en una dirección, y triterpenoides pentacíclicos en la
otra.

Las saponinas triterpenoides se encuentran ampliamente distribuidas

y constituyen la mayoría de las encontradas en la naturaleza. Entre las
plantas que contienen saponinas triterpenoides se encuentran: la
corteza de Quillaja saponaria (árbol de 18 m. de altura, procedente de
Chile, Perú y Bolivia); raíz de regaliz.

Entre las fuentes ricas de saponinas esteroidales se encuentran

especies de las familias Dioscoreaceae, Liliaceae y Escrofularaceae.
Ejemplo: digitonina (Digitalis purpurea y Digitalis lanata), gitogina (D.
Purpurea), sarsapogenina (raíz de sarsaparrilla), semillas de soya y el
ginseng.

4. GLICOSIDOS CARDIOTONICOS:

Se han aislado de las angiospermas principalmente, debido a su

abundancia en este tipo de plantas. Se caracterizan porque presentan
grupos hidroxilo en el carbono 3 y 14. Tienen un anillo lactónico no
saturado en el carbono 17, el cual puede ser pentagonal o hexagonal,
dando así origen a dos tipos de agliconas cardiotónicas: cardenólidos,
que incluyen anillos lactónicos de 5 miembros y un esqueleto de 23
átomos de carbono, y los bufanólidos o bufadienólidos, con anillo
lactónico de 6 miembros y un esqueleto de 24 átomos de carbono. Estos
últimos se han llamado así debido a que están contenidos en el veneno
del sapo común (género Bufus), aunque también se hallan en especies
vegetales.

Ejemplo:
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Cardenólido Bufadienólido

EXTRACCION, ANALISIS Y CARACTERIZACION DE GLICOSIDOS:

Siendo los glicósidos sustancias con núcleo estructural muy diverso,

sus solubilidades varían, por lo que los métodos de separación y
purificación son también distintos. Sin embargo, por lo general el
solvente a emplear para la extracción inicial es etanol o metanol con
agua.

INACTIVACION DE ENZIMAS:

Los glicósidos se encuentran muchas veces acompañados de

enzimas capaces de hidrolizarlos. Para evitar esto deben inactivarse
previamente a la extracción, lo cual se logra mediante:

a. Tratamiento de la planta con vapor de agua.

b. Poniendo el material fresco o seco en agua caliente, o hirviéndolo en

alcohol por 15 min.

c. Tratando el material vegetal con ácido a pH 1 ó 2, en frío.

d. Realizando la extracción inicial a temperatura muy baja.

EXTRACCION GENERAL:

El material vegetal se extrae con alcohol en caliente, y luego se

enfría. Con esto quedan los heterósidos cristalizados.

EXTRACCION DE GLICOSIDOS FENOLICOS:

Se puede primero separar las materias resinosas, ceras, grasas, etc,

tratando el material vegetal con éter de petróleo o cloroformo. Luego el
residuo se macera con alcohol diluido durante varias horas. El macerado
se trata con solución de acetato de plomo, para precipitar las impurezas,
dejando los glicósidos en solución. Luego se filtra, y el filtrado (glicósidos
más exceso de plomo) se trata con una corriente de ácido sulfhídrico,
que precipita el plomo como sulfuro, el cual es removido por filtración.
Los cristales de glicósidos se obtienen mediante evaporación del filtrado.
Posteriormente puede hidrolizarse para determinar la naturaleza del
azúcar y de la aglicona.
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La extracción inicial de los glicósidos fenólicos también puede

hacerse de manera más eficiente mediante soxhlet, empleando
sucesivamente varios solventes de diferente polaridad, así: éter de
petróleo, cloroformo y éter dietílico. Estos permiten eliminar los lípidos,
la clorofila y los carotenoides. Posteriormente se continúa extrayendo
con acetato de etilo, acetona y alcohol. Estos últimos aíslan los
glicósidos, los cuales se someten a recristalización con algún solvente
apropiado.

CUANTIFICACION GENERAL DE GLICOSIDOS:

Para valorar los glicósidos se aprovecha la capacidad que tienen los

ácidos de liberar los azúcares reductores. Se usa ácido sulfúrico al 2-5%
o ácido clorhídrico 1 ó 2 N durante algunas horas, en baño de María
hirviendo. A veces la aglicona precipita y se recoge con un solvente más
denso que el agua. Otras veces se obtiene mediante extracción de la
solución acuosa resultante de la hidrólisis, con un solvente no miscible,
como por ejemplo el éter o cloroformo, que luego es evaporado. La
fracción acuosa ácida se neutraliza con carbonato de bario, y en ella se
pueden caracterizar los azúcares reductores.

ANALISIS DE GLICOSIDOS FENOLICOS:

- DETECCION:

Los fenoles rara vez se encuentran en forma libre en las plantas. Es

por ello que generalmente se aíslan mediante hidrólisis. Los glicósidos
fenólicos son muy sensibles a la oxidación enzimática, debido a la acción
de las fenolasas. Esto se evita aislándolos de los tejidos con alcohol
caliente.

Posteriormente el extracto alcohólico de la planta se somete a

hidrólisis ácida o alcalina. La hidrólisis ácida se hace con ácido
clorhídrico 2 M durante media hora, en caliente. Luego se enfría y filtra.
La hidrólisis alcalina se realiza con hidróxido de sodio 2 M a temperatura
ambiente, durante 4 hr.

Para detectar ácidos fenólicos puede utilizarse cromatografía en capa

fina, con reactivo de Gibbs como revelador (2,6-dicloroquinona-
cloroimida al 2% en cloroformo), y luego rociando hidróxido de amonio
diluido. Se debe observar manchas azules.

Los fenoles pueden detectarse con solución acuosa o alcohólica de

cloruro férrico al 1% más 1% de ferricianuro de potasio. La mayoría de
compuestos fenólicos, sobre todo los flavonoides, pueden identificarse
mediante cromatografía en capa fina, ya que fluorescen bajo luz
ultravioleta. Dicha fluorescencia se intensifica por la acción de vapores
amoniacales. También es útil como revelador el reactivo de “productos
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naturales”: difenil-boril-oxietilamina al 1% en metanol, y luego polietilen-

glicol 4000 al 5% en etanol. Luego se observa la fluorescencia bajo luz
U.V.. Pueden detectarse bandas de color amarillo, azul o verde.

Un reactivo que brinda información más específica sobre el tipo de

fenoles presentes es el de Folin (tungstato de sodio, agua, ácido
fosfomolíbdico y ácido fosfórico). Este reactivo colorea de azul o gris los
fenoles con núcleo catecólico (tiene 2 grupos OH en posición “orto”) o
hidroquinonas al exponer la placa a vapores amoniacales.

PURIFICACION DE EXTRACTOS FENOLICOS:

Al prepararse un extracto vegetal que contenga glicósidos fenólicos,

pueden hallarse también presentes azúcares, ácidos, sales, etc., que
podrían interferir en la cromatografía. Para evitar esto puede purificarse
calentando varias veces con pequeñas cantidades de agua. Las
fracciones acuosas se combinan y agitan con n-propanol. La mezcla se
satura con cloruro de sodio, con lo que el n-propanol se separa,
quedando en la parte superior, la cual contiene la mayoría de glicósidos
fenólicos.

Otro método de purificación consiste en emplear resinas de

intercambio catiónico, como por ejemplo la amberlita IRC-50 y Dower I-
XII.

CROMATOGRAFIA Y ESPECTROFOTOMETRIA:

- El solvente más usado para elución en cromatografía es el etanol al

70%. Para las antocianinas se requiere pH ácido. Esto se logra
usando metanol conteniendo ácido clorhídrico al 0.1% ó ácido
acético al 15%.

- La absorción en el ultravioleta se emplea bastante en la determinación

de fenoles totales (a 270nm). Sin embargo, la absorción de los fenoles
naturales se ve afectada por muchos factores, tales como el tipo de
solvente y el pH, por lo que debe especificarse las condiciones estándar
bajo las cuales se trabajó.

CUANTIFICACION DE FENOLES TOTALES:

El permanganato de potasio oxida los fenoles en frío, característica

que se aprovecha para valorar los fenoles totales. Sin embargo, se ha
reportado que éste no es un buen método, ya que solo se oxidan los
difenoles “orto”y “para”, y NO los “meta-difenoles”. Además, otras
sustancias NO FENOLICAS, pero con dobles enlaces, tales como el ácido
cinámico, sí pueden reaccionar.

Este problema se resuelve con el reactivo de Folin-Denis, que permite

reducir estos ácidos y a la vez oxidar todos los fenoles, obteniéndose
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color azul, debido a los óxidos de tungsteno y molibdeno. Para efectuar

la cuantificación se toma una alícuota que contenga la sustancia
fenólica, se hace reaccionar con el reactivo de Folin más una solución de
carbonato de sodio, y luego de agitar se mide la absorbancia a 730-760
nm.

Extracción y aislamiento de flavonoides:

Mat. Vegetal + etanol

Macerar en frío/72 hr.

Extracto alcohólico
Filtrar
Residuo Filtrado

Concentrar (B. María)

Solución homogénea

PbOAC 0.1 M, reposar/24hr

Precipitado

Solución amarilla

Rotavapor

Fase acuosa Etanol

Acetato de etilo, filtrar, concentrar

Cromatografiar en columna abierta con gel de sílice.

CARACTERIZACION:

- Los flavonoides son generalmente solubles en agua y alcohol, e

insolubles en éter, cloroformo y benceno. Son solubles en álcali, dando
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soluciones amarillas que se oscurecen al aire. En medio ácido se

decoloran y precipitan.

- La reacción más usual para detectar flavonoides es la de Shinoda: al

extracto alcohólico se le añade un pequeño trozo de magnesio y unas
pocas gotas de ácido clorhídrico concentrado. Las flavonas se
colorean de naranja, los flavonoles de rojo cerezo y las flavanonas de
rojo violáceo. Las isoflavonas y chalconas no se colorean. Las
chalconas son el primer tipo de flavonoides que se forman a lo largo
de su biosíntesis. A partir de ellas derivan otras clases.

- Prueba de Marini-Bettolo: con solución de cloruro de antimonio en

tetracloruro de carbono, los flavonoides dan colores característicos, o
pueden formar precipitados. Ejemplo: las flavonas dan precipitado
amarillo o anaranjado, mientras que las chalconas, rojo obscuro o
violeta.

- En algunos casos pueden hacerse pruebas directamente sobre el

material vegetal. Ejemplo: si los pétalos blancos de una flor se exponen
a vapores de amoníaco y se tornan amarillos, indica la presencia de
flavonas y flavonoles. Si viran de amarillo a rojo, hay presencia de
chalconas y auronas.

TECNICAS CROMATOGRAFICAS:

- Se utiliza con frecuencia cromatografía en capa fina, empleando como

adsorbentes celulosa, sílica gel y poliamida, pero puede también
emplearse cromatografía en papel. La detección de los flavonoides
en ambos tipos de cromatografía puede hacerse usando lámpara de luz
ultravioleta, observándose manchas fluorescentes azules, rosadas,
anaranjadas, púrpuras y otras, que pueden cambiar tanto de color
como de intensidad luego de su exposición a vapores de amoníaco o
al reactivo de “Productos Naturales”. Se cuenta con información que
permite deducir la posible estructura del flavonoide, en base al color
observado antes y después de añadir amoníaco.

- La cromatografía en columna se emplea comúnmente para

purificaciones preliminares y para separar grandes cantidades de
flavonoides a partir de extractos vegetales. Se emplean los mismos
adsorbentes que en la cromatografía en capa fina. También puede
usarse gel de Sephadex.
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- La cromatografía líquida de alta resolución es muy utilizada para

realizar separaciones a pequeña escala. Conlleva la ventaja de que
es una técnica muy sensible y precisa, que permite obtener resultados
cuali-cuantitativos en unos pocos minutos.

TECNICAS ESPECTROMETRICAS:

El método más usual para analizar la estructura de un flavonoide es la

observación en ultravioleta y visible. Esto se hace tanto para identificar
el tipo de flavonoide, como para establecer el modelo de oxigenación.

Los espectros de absorción de los flavonoides se determinan

comúnmente en solución metanólica. El espectro típico consta de dos
máximos de absorción en los rangos de 240 a 285 nm y 300 a 550 nm.
La variación de estos rangos depende del modelo de oxigenación y del
grado de sustitución de los hidroxilos.

La identificación del flavonoide y su modelo de oxigenación se facilita

empleando “reactivos de desplazamiento”. Estos se hacen reaccionar
con el flavonoide, y provocan desplazamiento característico de los picos
de absorción, lo cual proporciona información adicional sobre la
estructura. Ejemplo:

- El acetato de sodio ioniza únicamente el grupo hidroxilo más ácido del

flavonoide, lo cual se aprovecha para detectar un grupo OH en posición
7.

- El cloruro de aluminio forma complejos con grupos orto-hidroxilos y con

grupos hidroxil- cetona vecinos. El complejo formado con grupos o-
hidroxilos es lábil en presencia de ácido, por lo que desaparece al
añadir ácido clorhídrico. Por el contrario, el complejo formado con
grupos hidroxil-cetona es estable.

- Infrarrojo: se usa muy poco en el análisis de flavonoides, debido a que

los espectros ultravioleta brindan mayor información. Sin embargo,
la absorción del grupo carbonilo (entre 1680 y 1640 nm), el anillo
aromático (entre 1600 a 1500), y la de los grupos o-hidroxi-cetona
(entre 3500 a 3200 nm) pueden ser útiles.

- Resonancia magnética nuclear: los espectros de RMN de flavonoides

han cobrado mayor importancia en años recientes para
determinación de estructuras. Es común en este caso también el uso de
“reactivos de desplazamiento”.
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- Espectrometría de masas: posee la ventaja de que requiere muy poca

cantidad de muestra. Para el análisis de resultados se toma en cuenta
los pesos moleculares de los distintos núcleos básicos de los
flavonoides. Ejemplo: 222 para flavonas, isoflavonas y auronas, 224 para
flavanonas y chalconas, 238 para flavonoles, etc.

ANTOCIANINAS:

Son solubles en agua e insolubles en los solventes orgánicos. Pueden

separarse mediante precipitación, bajo la forma de picratos. También
pueden precipitarse como cloruros mediante ebullición con ácido
clorhídrico al 20%.

DIFERENCIACION DE BETACIANINAS Y ANTOCIANINAS:

- Calentando con ácido clorhídrico 2 M por 5 minutos, a 100 grados

centígrados. Las betacianinas se decoloran, mientras que las
antocianinas no, y pueden ser extraídas con alcohol amílico.

- Añadiendo hidróxido de sodio 2 M, gota a gota, las betacianinas viran a

amarillo. Las antocianinas cambian a azul verdoso y luego se
decoloran.

- Haciendo electroforesis en papel, a pH ácido (2-4): las betacianinas

migran al ánodo, y las antocianinas al cátodo.

- Mediante cromatografía, usando como fase móvil butanol-ácido

acético-agua. Las betacianinas tienen Rf muy bajos (0-0.1), mientras que
las antocianinas tienen Rf moderados (0.1-0.4).

- El espectro visible en metanol-ácido clorhídrico presenta un rango

máximo de 505-535 nm para las antocianinas, y 532-554 nm para las
betacianinas.

QUINONAS:

Son sólidos cristalinos amarillos, anaranjados o rojos, poco solubles

en agua y solubles en solventes orgánicos. Es por ello que pueden
extraerse con éter de petróleo, junto con clorofila y carotenos. Al
hacerse cromatografía en capa fina se diferencian por su Rf.

Las benzoquinonas y naftoquinonas actúan como oxidantes.

Generalmente el grupo carbonilo de las quinonas no reacciona con los
reactivos usuales de la función cetona.

Las quinonas se solubilizan en álcalis, dando coloraciones que van

desde el anaranjado al rojo o violeta, lo cual se aprovecha para su
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análisis espectrofotométrico, en la región visible. Para ello se macera el

material vegetal con un solvente orgánico inmiscible con el agua
(ejemplo: benceno, cloroformo o éter), se filtra, y se agita con una
solución acuosa alcalina (hidróxido de amonio al 10% (reacción de
Bornträger). Un resultado positivo está indicado por una coloración
rosada en la fase alcalina (si hay poca cantidad de antraquinonas, pero
puede ser de color anaranjado, rojo o violeta si hay alta concentración).

Las quinonas pueden separarse entre sí, así como de los carotenos y
clorofila mediante cromatografía en capa fina o en papel. Como
reveladores se puede emplear hidróxido de potasio al 10% en metanol
(se ven manchas rojas, violetas, púrpuras o verdes). También puede
usarse HPLC para aislar quinonas.

Puesto que las quinonas son coloreadas, pueden ser detectadas en la

región visible; sin embargo, el análisis bajo la luz ultravioleta es más
sensible. Así puede diferenciarse a las antraquinonas de otras quinonas,
ya que las primeras presentan 4 ó 5 bandas de absorción en el
ultravioleta. Por lo menos tres de ellas caen entre 215 y 300 nm, y la
otra, por encima de los 430 nm.

En el infrarrojo pueden detectarse las bandas características fuertes

de los grupos carbonilo.

Con la espectrometría de masas puede reconocerse a las quinonas

por la facilidad con que pierden las dos moléculas de carbonilo.

CUMARINAS:

La cumarina y sus glicósidos derivan de la benzo-alfa-pirona. La

cumarina se ha encontrado en unas 150 especies, pertenecientes a más
de 30 familias. Su olor es el característico del heno fresco. El “haba
tonka”(Coumarona odorata; las semillas de este árbol de Guyana y
Brasil se usan en perfumería) contiene 1 a 3% de cumarina. La ruda
contiene 10 derivados cumarínicos. Las distintas especies de canela
contienen cumarina no sustituida (C. ceylanicum es la que tiene menos),
además la raíz de avena, de Jalapa, belladona, hojas de tabaco y
estramonio contienen 7-hidroxi, 6-metoxi-cumarina (escopoletina).

EXTRACCION:

La extracción de las cumarinas puede realizarse sobre el material

vegetal fresco o seco, con solventes de diferentes polaridades,
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dependiendo de las estructuras de las cumarinas. Puede utilizarse

solventes diversos, tales como etanol, éter sulfúrico o de petróleo,
acetona, etc. La extracción se hace con soxhlet, el extracto obtenido se
concentra, obteniéndose así cristales al dejar en reposo, o en
refrigeración. Se pueden recristalizar con una mezcla de etanol-éter y
luego se purifican mediante cromatografía.

SEPARACION CROMATOGRAFICA Y DETECCION:

Se utiliza ampliamente la cromatografía en columna, empleando

como adsorbentes la sílica gel o la alúmina “neutra o ácida”. Se prefiere
NO USAR alúmina BASICA, ya que degrada las cumarinas. También se
usa bastante la cromatografía en capa fina, para lo cual la mezcla sílica
gel y celulosa incrementa la sensibilidad y resolución.

Los componentes se detectan bajo luz U.V. de 365 nm antes y

después de asperjar con hidróxido de potasio al 5 ó 10% en etanol. Las
cumarinas muestran intensa fluorescencia. Esta es la propiedad física
más usual para reconocer una cumarina. En base al color que muestren,
puede asignarse tentativamente ciertas características a las cumarinas:

- Fluorescencia púrpura: característica de 7-alcoxicumarina.

- Fluorescencia celeste: 7-hidroxi-cumarina y 5,7-dioxigenadas.

- Fluorescencia amarillo opaca u ocre: furanocumarina.

- Amarillo-verdoso: cumarina no sustituída, pero antes es necesario

añadir hidróxido de potasio.

La intensificación de la fluorescencia por tratamiento del

cromatograma con vapores de amoníaco es indicio de grupos fenólicos
en la cumarina. La detección de las cumarinas puede hacerse también
con otros reveladores, pero ninguno de ellos es específico.

Para detectar grupos fenólicos se emplea solución acuosa de cloruro

férrico al 1%, con lo que los grupos hidroxilo dan color azul o verdoso. La
adición de reactivo de Benedict a las cumarinas o flavonoides con
grupos hidroxilo reactivos hace que la fluorescencia desaparezca total o
parcialmente.

A diferencia de las hidroxicumarinas, las furano-cumarinas son por lo

general solubles en lípidos, y pueden extraerse con éter de petróleo.
Puesto que pueden encontrarse a veces formando glicósidos, es
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necesario antes hidrolizarlos con ácido. Comúnmente pueden separarse

mediante cromatografía en capa fina en sílica gel, usando como fase
móvil cloroformo, cloroformo + 1.5% etanol o éter-benceno (1:1). Esto
toma entre 1 a 2 horas. Se detectan bajo luz UV como manchas azules,
amarillas, verdes, violetas o cafés. La intensidad de la fluorescencia
aumenta al adicionar hidróxido de potasio al 10%.

- HPLC:

Resulta ventajoso porque las separaciones son más rápidas y

efectivas. Se ha utilizado por ejemplo para separar una mezcla de
furano-cumarinas del perejil, así como para fraccionar algunas
cumarinas de cítricos.

TECNICAS ESPECTROMETRICAS:

Para dilucidar la estructura química de una cumarina nueva se debe

1) identificar primero los diferentes grupos sustituyentes, y 2)
determinar su ubicación en el núcleo de la cumarina. Bandas de
absorción U.V. características de las cumarinas: 274 y 311 nm, que
corresponden a los anillos de benceno y pirona respectivamente.

Para obtener información respecto a la orientación de determinados

grupos funcionales, sobre todo hidroxilos, puede utilizarse “reactivos de
desplazamiento”, que producen cambios espectrales. Ejemplo: se hace
reaccionar a las cumarinas con hidróxido de sodio, acetato de sodio,
ácido bórico o cloruro de aluminio.

ESPECTRO i.r.:

Puede encontrarse bandas características de la pirona en la región

comprendida entre 1715 y 1745 cm a la -1. Los grupos hidroxilo y
carbonilo también muestran bandas características.

RESONANCIA MAGNETICA NUCLEAR:

También se emplean reactivos de desplazamiento.

ESPECTROMETRIA DE MASAS:

Las cumarinas producen un fuerte ion molecular a un valor de m/e de

146 (76%), y un pico base a m/e de 118 (100%) (28 unidades menos por
la pérdida de monóxido de carbono del anillo de pirona.