NTC 4574

NORMA TCNICA
COLOMBIANA
NTC
4574
2007-03-21
MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS Y ALIMENTOS

PARA ANIMALES.
MTODO HORIZONTAL PARA LA DETECCIN DE
SALMONELLA SPP
E:
MICROBIOLOGY OF FOOD AND ANIMAL FEEDING

STUFFS. GENERAL GUIDANCE ON METHODS FOR THE
DETECTION OF SALMONELLA SPP
CORRESPONDENCIA:
esta norma es una adopcin

modificada (MOD) de la norma
ISO 6579:2002
DESCRIPTORES:
mtodo
horizontal,
mtodo
de
anlisis,
microbiologa,
anlisis
microbiolgico, deteccin, Salmonella,
alimentacin animal.
I.C.S.: 07.100.30
Editada por el Instituto Colombiano de Normas Tcnicas y Certificacin (ICONTEC)
Apartado 14237 Bogot, D.C. - Tel. (571) 6078888 - Fax (571) 2221435
Prohibida su reproduccin
Primera actualizacin
Editada 2007-03-28
PRLOGO
El Instituto Colombiano de Normas Tcnicas y Certificacin, ICONTEC, es el organismo

nacional de normalizacin, segn el Decreto 2269 de 1993.
ICONTEC es una entidad de carcter privado, sin nimo de lucro, cuya Misin es fundamental
para brindar soporte y desarrollo al productor y proteccin al consumidor. Colabora con el
sector gubernamental y apoya al sector privado del pas, para lograr ventajas competitivas en
los mercados interno y externo.
La representacin de todos los sectores involucrados en el proceso de Normalizacin Tcnica
est garantizada por los Comits Tcnicos y el perodo de Consulta Pblica, este ltimo
caracterizado por la participacin del pblico en general.
La NTC 4574 (Primera actualizacin) fue ratificada por el Consejo Directivo de 2007-03-21.
Esta norma est sujeta a ser actualizada permanentemente con el objeto de que responda en
todo momento a las necesidades y exigencias actuales.
A continuacin se relacionan las empresas que colaboraron en el estudio de esta norma a
travs de su participacin en el Comit Tcnico 25 Microbiologa.
ACEGRASAS S.A.
ALGARRA S.A.
ALIMENTOS POLAR S.A.
ALPINA PRODUCTOS ALIMENTICIOS. S.A.
ARCHIVO DE BOGOT
ASEBIOL LABORATORIO LTDA.
ASINAL LTDA
ASOCIACIN COLOMBIANA DE CIENCIA Y
TECNOLOGA
ASOCIACIN
DE
MICROBILOGOS
JAVERIANOS
BIANLISIS
BIOCONTROL LTDA.
BIOMERIEUX COLOMBIA
BIOQUILAB LTDA.
CALIDAD INDUSTRIAL LTDA.
CARULLA VIVERO S.A.
CERCAL LTDA.
COLFRIGOS S.A.
COLOMBINA S.A.
COMPAA NACIONAL DE CHOCOLATES S.A.
CORPORACIN PARA EL AVANCE DE LA
MICROBIOLOGA Y LA MICROSCOPA
MICROS
COSMTICA CCYTEC.
CREPES & WAFLES S.A.
DU PONT QUALICON
ENZIPAN DE COLOMBIA LTDA

FABRICA
DE
ESPECIAS
Y
CONDIMENTOS EL REY S.A.
FRIGORFICOS COLOMBIANOS S.A.
INDEPENDIENTE.
INDUSTRIA PRODUCTORA DE ACEITES
RENOVABLES
IVONNE BERNIER LABORATORIO LTDA.
JOHNSON DIVERSEY
KOYOMAD S.A.
LABCONTROL E.U.
LABFARVE
LABORATORIO
DE
FARMACOLOGA VEGETAL
LABORATORIO
DE
GENTICA
Y
BIOLOGA MOLECULAR
LABORATORIO EMICAL LTDA.
LABORATORIO GRAM
LABORATORIO MICROLAB LTDA.
LARKIN
LESNIAK E.U
MERCADEO
DE
ALIMENTOS
DE
COLOMBIA S.A.
MERCK S.A.
MICROBILOGOS ASOCIADOS LTDA.
NULAB LTDA.
QUIK LTDA.
QUMICOS Y REACTIVOS LTDA. QUIMIREL
SUIZO S.A.
UNIVERSIDAD DE LOS ANDES
UNIVERSIDAD MANUELA BELTRN
Adems de las anteriores, en Consulta Pblica el Proyecto se puso a consideracin de las
siguientes empresas:
ACEITES Y GRASAS VEGETALES S.A. V
AQUALAB
ASOCIACIN
COLOMBIANA
DE
MICROBIOLOGA
AVESCO S.A.
BAVARIA S.A.
BIOTRENDS LABORATORIOS
CENICAA
CENTROAGUAS S.A. E.S.P.
CERVECERA LEONA S.A.
CONGELAGRO
CONSULTORAS MICROBIOLGICAS
COOPERATIVA DE GANADEROS DE
CARTAGENA LTDA.
EMPRESA
DE
ACUEDUCTO
Y
ALCANTARILLADO DE BOGOT
FRIGORFICO GUADALUPE S.A.
HOSPITAL
DEPARTAMENTAL
DE
VILLAVICENCIO
INGENIO PICHICHI S.A.
INGENIO RIOPAILA
INSTITUTO COLOMBIANO AGROPECUARIO
ICA
INSTITUTO NACIONAL DE SALUD
INVIMA INSTITUTO NACIONAL DE
VIGILANCIA MDICA
LABORATORIO MICROBIOLGICO SIS

LABORATOTORIO MICROBIOLGICO DE
BARRANQUILLA
LEVAPN S.A.
LLOREDA GRASAS S.A.
MEDIIMPLANTES LTDA.
MINISTERIO DE PROTECCIN SOCIAL
NESTL DE COLOMBIA S.A.
PASIFLORA COLOMBIANA S.A.
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
PRODUCTORA DE CONCENTRADOS Y
JUGOS DE FRUTA
PURIFICACIN Y ANLISIS DE FLUIDOS
LTDA.
QUIOS LTDA.
REPRESENTACIONES
BIOTECNOLGICAS LTDA.
RICA RONDO, INDUSTRIA NACIONAL
DE ALIMENTOS S.A.
SCHERING COLOMBIANA S.A.
TECNIMICRO LABORATORIO DE ANLISIS
UNIDAD ADMINISTRATIVA DE SALUD
PBLICA
UNIVERSIDAD CATLICA INGECAL
VIKINGOS S.A.
ICONTEC cuenta con un Centro de Informacin que pone a disposicin de los interesados
normas internacionales, regionales y nacionales y otros documentos relacionados.
DIRECCIN DE NORMALIZACIN
NORMA TCNICA COLOMBIANA
NTC 4574 (Primera actualizacin)
CONTENIDO
Pgina
1.
OBJETO .......................................................................................................................1
2.
REFERENCIAS NORMATIVAS ...................................................................................1
3.
DEFINICIN .................................................................................................................2
4.
PRINCIPIO....................................................................................................................2
4.1
GENERALIDADES.......................................................................................................2
4.2
PREENRIQUECIMIENTO EN MEDIO LQUIDO NO SELECTIVO ..............................2
4.3
ENRIQUECIMIENTO EN MEDIO LQUIDO SELECTIVO ..............................................
4.4
SIEMBRA EN MEDIO SELECTIVO .............................................................................2
4.5
CONFIRMACIN..........................................................................................................3
5.
MEDIOS DE CULTIVO, REACTIVOS Y ANTISUEROS ..............................................3
5.1
GENERALIDADES.......................................................................................................3
5.2
MEDIOS DE CULTIVOS Y REACTIVOS .....................................................................3
5.3
SUEROS .......................................................................................................................5
6.
EQUIPOS Y MATERIAL DE VIDRIO PARA LABORATORIO ...................................5
6.1
EQUIPO PARA ESTERILIZACIN EN SECO (HORNO) O ESTERILIZACIN

EN HMEDO (AUTOCLAVE) ......................................................................................5
6.2
INCUBADORA .............................................................................................................5
6.3
MEDIDOR DE pH .........................................................................................................5
6.4
FRASCOS PARA CULTIVO ........................................................................................5
6.5
TUBOS PARA CULTIVO..............................................................................................5
Pgina
6.6
PIPETAS GRADUADAS ..............................................................................................5
6.7
CAJAS DE PETRI ........................................................................................................6
6.8
BAO DE AGUA..........................................................................................................6
7.
MUESTREO..................................................................................................................6
8.
PREPARACIN DE LA MUESTRA PARA ENSAYO .................................................6
9.
PROCEDIMIENTO........................................................................................................6
9.1
MUESTRA PARA ENSAYO Y SUSPENSIONES INICIALES .....................................6
9.2
PREENRIQUECIMIENTO NO SELECTIVO.................................................................7
9.3
ENRIQUECIMIENTO SELECTIVO...............................................................................7
9.4
SIEMBRA EN MEDIO SELECTIVO .............................................................................7
9.5
CONFIRMACIN..........................................................................................................8
10.
EXPRESIN DE RESULTADOS ...............................................................................13
11.
INFORME DE ENSAYO .............................................................................................13
12.
ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD .......................................................................13
ANEXOS
ANEXO A (Normativo)
DIAGRAMA DE PROCEDIMIENTO.......................................................................................14
ANEXO B (Normativo)
COMPOSICIN Y PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS..................15
ANEXO C (Informativo)
COMPARACIN ENTRE EL MTODO DE LA ISO 6579:2002 Y LA AOAC VERSIN 2005....24
Pgina
ANEXO D (Informativo)
RESULTADOS DE LA PRUEBA INTERLABORATORIOS ..................................................25
ANEXO E (informativo)
CUADRO COMPARATIVO RESPECTO DE LAS MODIFICACIONES REALIZADAS
A LA NTC 4574 (primera actualizacin) Y SU DOCUMENTO DE REFERENCIA
LA ISO 6579 ................................................................................................................................27
TABLAS
Tabla 1. Interpretacin de las pruebas bioqumicas .........................................................11
Tabla 2. Interpretacin de las pruebas de confirmacin ..................................................12
Tabla C.1. Resultados de los anlisis de los datos obtenidos con muestras de
cuajada de queso fresco...........................................................................................................25
Tabla C.2. Resultados de los anlisis de los datos obtenidos con muestras
de huevo deshidratado en polvo.........................................................................................26
Tabla C.3. Resultados de los anlisis de los datos obtenidos con muestras
de carne cruda de pollo .......................................................................................................26
Tabla C.4. Resultados de los anlisis de los datos obtenidos con materiales
de referencia .........................................................................................................................26
MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS Y DE ALIMENTOS PARA ANIMALES.

MTODO HORIZONTAL PARA LA DETECCIN DE SALMONELLA SPP.
ADVERTENCIA Para proteger la salud del personal de laboratorio, es esencial que los ensayos de laboratorio para
detectar Salmonella spp. sean nicamente ejecutados en laboratorios apropiadamente equipados, bajo la
supervisin de un microbilogo, un microbilogo experimentado, o ambos, y que se tenga un gran cuidado en la
disposicin de todos los materiales incubados.
1.
OBJETO
Esta norma describe los mtodos horizontales para la deteccin de Salmonella spp.
Sujeta a las limitaciones indicadas al comienzo de esta norma, se aplica a productos para
consumo humano y para alimentacin animal, las muestras ambientales en el rea de la
produccin y manipulacin de alimentos.
La temperatura de incubacin (35 C 2 C) se acordar entre las partes involucradas y se
debe especificar en el reporte del ensayo.
2.
REFERENCIAS NORMATIVAS
Los siguientes documentos normativos referenciados son indispensables para la aplicacin de

este documento normativo. Para referencias fechadas, se aplica nicamente la edicin citada.
Para referencias no fechadas, se aplica la ltima edicin del documento normativo
referenciado. (incluida cualquier correccin).
NTC 4092, Microbiologa de alimentos y de alimentos para animales. Reglas generales para los
anlisis microbiolgicos. (ISO 7218).
NTC 4491-1, Microbiologa de alimentos y de alimentos para animales. Preparacin de
muestras para ensayo, suspensiones iniciales y diluciones decimales para los anlisis
microbiolgicos. Parte 1. Reglas generales para la preparacin de la suspensin inicial y de
diluciones decimales. (ISO 6887).
NTC 5395, Agua para uso en anlisis de laboratorio. Especificacin y mtodos de anlisis.
GTC 78, Microbiologa de alimentos y alimentos para animales. gua para la preparacin y
produccin de medios de cultivo. Gua general para el aseguramiento de la calidad para la
preparacin de los medios de cultivo en el laboratorio.
1 de 33

3.
DEFINICIN
Para los propsitos de esta norma se aplican las siguientes definiciones.

3.1 Salmonella spp. Bacteria gram negativa que forma colonias tpicas sobre un medio
selectivo, el cual exhibe caractersticas bioqumicas y serolgicas descritas en la presente
norma.
3.2 Deteccin de Salmonella spp. Determinacin de la presencia o ausencia de Salmonella
spp., en una muestra particular de producto, cuando los ensayos son realizados de acuerdo
con la presente norma.
4.
PRINCIPIO
4.1
GENERALIDADES
Para la deteccin de Salmonella spp. se necesitan cuatro etapas sucesivas (vase tambin el
Anexo A).
NOTA
Salmonella spp. puede estar presente en bajas concentraciones y est frecuentemente acompaada por
otros microorganismos. Por tanto, es necesario un preenriquecimiento no selectivo y posteriormente realizar un
enriquecimiento selectivo.
NOTA La determinacin de Salmonella puede realizarse tambin por los siguientes mtodos: siembra en membranas
hidrofbicas, PCR, inmunofluorescencia (VIDAS) o cualquier otro mtodo bsqueda.
4.2
PREENRIQUECIMIENTO EN MEDIO LQUIDO NO SELECTIVO
Se inocula en solucin buferada, agua peptonada tamponada o caldo lactosado con la muestra
para ensayo, y se incuba a 37 C 1 C por 18 h +/2 h.
Para ciertos productos alimenticios es necesario emplear otros procedimientos de
preenriquecimiento. Vase el numeral 9.1.2.
4.3
ENRIQUECIMIENTO EN MEDIO LQUIDO SELECTIVO
Se inocula 0,1 ml del medio de preenriquecimiento (vase numeral 4.2) en 10 ml del medio
Rappaport Vassiliadis/medio verde malaquita (medio RVS) (o medio selenito segn AOAC
967.25 p. 109) y 1,0 ml del medio de preenriquecimiento (vase el numeral 4.2) en el medio
Tetrationate Mueller Kauffmann (medio MKTTn).
El caldo RVS se incuba a 41,5 C 1,0 C durante 24 h 3 h y el caldo MKTTn se incuba a
37 C 1 C durante 24 h 3 h.
4.4
SIEMBRA EN MEDIO SELECTIVO
A partir de los caldos de enriquecimiento lquido obtenidos en el numeral 4.3, se inoculan como
mnimo dos medios selectivos slidos:
-
Xilosa Lisina Desoxicolato (XLD),
y cualquier otro medio selectivo complementario al XLD y que sea especialmente adecuado
para el aislamiento de cepas de Salmonella lactosa positivas y Salmonella typhi y paratyphi; el
medio se deja a la eleccin del laboratorio:
2
EJEMPLO
-
agar Rambach
gar Hektoen
agar McConkey
agar bismuto sulfito
agar Salmonella -Shigella(SS)
agar verde brillante
agares cromognicos selectivos o diferenciales para Salmonella
El agar XLD se incuba a 37 C 1 C y se examina despus de 24 h 3 h. El segundo agar

selectivo se incuba a 37 C 1 C, y se examina despus de 24 h 3 h o segn las
indicaciones del fabricante del medio de cultivo, si es necesario, despus de 48 h para verificar
la presencia de colonias las cuales, a partir de sus caractersticas, se consideran presuntivas
de ser Salmonella spp.
4.5
CONFIRMACIN
Se subcultivan las colonias de Salmonella spp. presuntivas aisladas como se describe en el

numeral 4.4, y se confirman mediante ensayos bioqumicos y serolgicos apropiados.
5.
MEDIOS DE CULTIVO, REACTIVOS Y ANTISUEROS
5.1
GENERALIDADES
Para la prctica actual de laboratorio vase la NTC 4092 (ISO 7218).

NOTA
5.2
Se pueden emplear reactivos listos para usar, preparados comercialmente.
MEDIOS DE CULTIVOS Y REACTIVOS
NOTA
Debido al gran nmero de medios de cultivo y de reactivos, se considera preferible, para la claridad del
texto, dar su composicin y preparacin en el Anexo B.
5.2.1
Medio de preenriquecimiento no selectivo: Solucin buffer, agua peptonada

tamponada o caldo lactosado
Vase el numeral B.1.

5.2.2
Primer medio de enriquecimiento selectivo: Rappaport. Vassiliadis/medio verde

malaquita (medio RVS)

5.2.3
Segundo medio de enriquecimiento selectivo Tetrationate Mueller Kauffmann

(medio MKTTn).

5.2.4
Medios slidos selectivos en placa para aislamiento
5.2.4.1 Primer medio

Agar Xilosa Lisina Desoxicolato (agar XLD). Vase el Anexo B.4.
5.2.4.2 Segundo medio
La eleccin del segundo medio se deja a criterio del laboratorio de anlisis. Es conveniente
seguir de manera precisa las instrucciones del fabricante en lo referente a su preparacin.
-
agar Rambach
agar Hektoen
agar McConkey
agar Salmonella Shigella (SS)
agares cromognicos selectivos o diferenciales para Salmonella.
Vase el literal B.5.

5.2.5
Agar Nutritivo
Vase el literal B.6

5.2.6
Tres azcares / Agar hierro (Agar TSI)

5.2.7
Caldo Urea (Christensen)

5.2.8
Medio de la descarboxilacin de L-Lisina (LIA)

5.2.9
Reactivo para la reaccin Voges- Proskauer (VP)

5.2.10 Reactivos para la reaccin de Indol
5.2.11 Agar nutritivo semislido (movilidad).
4
5.2.12 Disolucin salina fisiolgica

5.2.13 Caldo selenito cistina
5.3
SUEROS
Se encuentran disponibles comercialmente varios tipos de sueros que contienen anticuerpos

frente a uno o varios antgenos O; es decir, antisueros que contienen uno o ms grupos O
(denominados sueros anti O monovalentes o polivalentes), suero anti Vi, y antisueros que
contienen anticuerpos frente a uno o varios factores H (denominados sueros anti H
monovalentes o polivalentes).
Conviene hacer todos los esfuerzos para asegurarse que los antisueros empleados son
adecuados para la deteccin de todos los serotipos de Salmonella. Con este objetivo se
pueden emplear slo antisueros preparados por un suministrador competente reconocido (por
ejemplo, por un organismo de vigilancia gubernamental).
6.
EQUIPOS Y MATERIAL DE VIDRIO PARA LABORATORIO
NOTA Si el material desechable tiene especificaciones adecuadas, es una alternativa aceptable frente al material
de vidrio reutilizable.
Equipo usual de laboratorio microbiolgico (vase la NTC 4092) y, en particular, lo siguiente.

6.1
EQUIPO PARA ESTERILIZACIN EN SECO (HORNO) O ESTERILIZACIN EN

HMEDO (AUTOCLAVE)
Vase la NTC 4092 (ISO 7218).

6.2
INCUBADORA
Con capacidad de funcionar a 41,5 oC 1 oC y capaz de operar entre 37 C 1 C.

6.3
MEDIDOR DE pH
Con precisin de calibracin de 0,1 unidades de pH a 25 C.

6.4
FRASCOS PARA CULTIVO
NOTA
Pueden usarse frascos para cultivo con tapa rosca metlica o plstica no txica.
6.5
TUBOS PARA CULTIVO
De 15 mm de dimetro y de 160 mm de longitud.

6.6
PIPETAS GRADUADAS O PIPETAS AUTOMTICAS
De capacidades nominales de 10 ml y de 1 ml, graduadas respectivamente en divisiones de 0,5 ml

y 0,1 ml respectivamente.
5

6.7
CAJAS DE PETRI
De tamao pequeo (de 90 mm a 100 mm de dimetro) o de tamao grande (de 140 mm de

dimetro).
NOTA
se pueden utilizar cajas de vidrio o de material desechable.
6.8
BAO DE AGUA
En caso de incubar en bao de agua, mantenerlo a una temperatura entre 41,5 C 1,0 C a
37 C 1 C.
NOTA Se recomienda emplear un bao que contenga un agente antibacteriano debido a la baja dosis infectiva de
Salmonella.
7.
MUESTREO
Es importante que el laboratorio reciba una muestra representativa y adecuada para su

correspondiente anlisis y que no haya sufrido daos o cambios durante el transporte o el
almacenamiento.
El muestreo no hace parte del mtodo especificado en esta norma. Debe verse la norma
especfica para el producto que interese. Si no hay norma especfica, se recomienda que las
partes interesadas lleguen a un acuerdo sobre este aspecto.
8.
PREPARACIN DE LA MUESTRA PARA ENSAYO
La muestra para ensayo se prepara de acuerdo con la norma especfica del producto que
interese. Si no hay norma especfica, se recomienda que las partes interesadas lleguen a un
acuerdo sobre este aspecto.
9.
PROCEDIMIENTO
(Vase el diagrama del Anexo A (Normativo)).

9.1
MUESTRA PARA ENSAYO Y SUSPENSIONES INICIALES
9.1.1 Vase la NTC 4491-1 (ISO 6887-1) y la norma especfica que trate del producto en
particular. Vase la norma ISO 8261 para leches y productos lcteos.
Para la preparacin de la suspensin inicial, se usa como diluyente el medio de
preenriquecimiento especificado en el numeral 5.2.1 y el numeral 4.2 (agua peptonada
tamponada).
En general se prepara la suspensin inicial adicionando una muestra para ensayo de 25 g a 225 ml
de medio de preenriquecimiento (vase el numeral 5.2.1), el cual est en proporcin de la muestra
para ensayo al medio de preenriquecimiento especificado en este mtodo.
Si la muestra para ensayo prescrita es diferente de 25 g, se usa la cantidad necesaria al medio
de preenriquecimiento para producir aproximadamente una dilucin 1/10 (masa a volumen).
NOTA Para reducir la carga de trabajo cuando ms de 25 g de la muestra para ensayo de un lote especfico de alimentos
ha sido analizado y cuando hay evidencia disponible de que su mezcla (juntando las porciones de muestras para ensayo) no
afecta el resultado del producto en particular, las muestras para ensayo pueden ser compuestas. Por ejemplo, si 10 porciones
de ensayo de 25 g se van a analizar, se combinan las 10 unidades para formar una muestra para ensayo compuesta de 250 g y
se adicionan 2,25 L de caldo de preenriquecimiento. Alternativamente, se pueden combinar porciones de caldos de
preenriquecimiento de 0.1 ml ( en 10 ml de medio RVS) y 1 ml ( en 10 ml de medio tetrationate Mueller Kauffmann) de los
caldos de preenriquecimiento provenientes de 10 porciones de muestras para ensayo separadas (vase el numeral 9.3.1)
para enriquecerlas en 100 ml de los medios de enriquecimiento selectivos.
9.1.2
Preparaciones especficas de la suspensin inicial para ciertos productos

alimenticios
NOTA
Para preparaciones especficas de la suspensin inicial para ciertos productos alimenticios aplicables a la
determinacin de Salmonella o cualquier microorganismo se describen en las NTC 4491-1, NTC 4491-2, NTC 4491-3 y
NTC 4491-4 e ISO 8261. Si algn producto no est referenciado en estas normas o no existe una norma especfica
de producto, se recomienda que las partes interesadas lleguen a un acuerdo sobre este aspecto.
9.1.2.1 Cacao y productos que contienen cacao (por ejemplo ms del 20 %)

Se aaden, al agua peptonada tamponada (vase el numeral 5.2.1), preferiblemente 50 g/l de
casena (evitar el empleo de casena cida), o 100 g/l de leche desnatada en polvo estril y se
aaden despus de unas 2 h de incubacin, 0,018 g/l de verde brillante si es probable que el
producto alimenticio est muy contaminado con flora Gram positiva.
9.1.2.2 Productos alimenticios cidos y acidificantes
Se ha de asegurar que el pH no baja de 4,5 durante el preenriquecimiento.
NOTA El pH de los productos alimenticios cidos y acidificantes es ms estable si se emplea agua peptonada
tamponada a doble concentracin.
9.2
PREENRIQUECIMIENTO NO SELECTIVO
Se incuba la suspensin inicial a 37 C 1 oC durante 18 h 2 h.

9.3
ENRIQUECIMIENTO SELECTIVO
9.3.1 Se transfieren 0,1 ml del medio de cultivo obtenido en el numeral 9.2, a un tubo que
contenga 10 ml del medio RVS (vase el numeral 5.2.2); se transfieren 1 ml del medio de
cultivo obtenido en el numeral 9.2 a un recipiente que contenga 10 ml del medio tetrationate
Mueller Kauffmann (vase el numeral 5.2.3).
NOTA En el caso de utilizar el medio de cultivo selenito como medio de enriquecimiento, se transfieren 1.0 ml del
cultivo obtenido en el numeral 9.2, a un tubo que contenga 10 ml de caldo selenito (vase numeral 5.2.2). Se incuba
a 35 1 C durante 24 h 2 h.
9.3.2 Se incuban los dos medios inoculados (vase el numeral 9.3.1) durante 24 h 3 h como
sigue:
Se incuba el caldo RVS sembrado (vase el numeral 9.3.1) a 41,5 C 1 C y el caldo
tetrationate Mueller Kauffmann sembrado a 37 C 1 C. Hay que tener cuidado de que no se
supere la mxima temperatura de incubacin permitida (42,5 C).
9.4
SIEMBRA EN MEDIO SELECTIVO
9.4.1 Tras incubar durante 24 h 3 h, utilizando el cultivo obtenido en el caldo RVS (9.3.2), se
siembra mediante un asa la superficie de una placa de Petri que contenga el primer medio en
placa selectivo (agar XLD), de tal forma que se obtengan colonias aisladas.
7
Se procede de la misma manera con el segundo medio selectivo (vase el numeral 5.2.4.2)
empleando un asa estril y cajas de Petri.
9.4.2 Tras incubar durante 24 h 3 h, utilizando el cultivo obtenido en caldo tetrationate
Mueller Kauffmann (vase el numeral 9.3.2), se repite el procedimiento descrito en el numeral
9.4.1 con los dos medios selectivos en placa.
9.4.3 Se invierten las placas (vanse los numerales 9.4.1 y 9.4.2) dndoles la vuelta y se
colocan en la incubadora a 35 C 2 oC para el primer medio. Para el segundo medio en placa
(vase el numeral 5.2.4.2), deben seguirse las instrucciones del fabricante.
9.4.4 Despus del perodo de incubacin durante 24 h 3 h, se examinan las cajas (vase el
numeral 9.4.3) para la presencia de colonias tpicas de Salmonella y de colonias atpicas que
pueden ser Salmonella (vase la Nota 7). Se marca su posicin en la parte inferior de la placa.
Las colonias tpicas de Salmonella que crecen en el agar XLD tienen un centro negro y una
zona ligeramente transparente de color rojizo debido al cambio del indicador.
NOTA
Las variantes de Salmonella H2S negativas (por ejemplo S. paratyphi A) que crece en agar XLD son rosas
con un centro rosa ms oscuro. Las Salmonella lactosa positivas que crecen en agar XLD son amarillas con o sin
ennegrecimiento. Cualquier colonia sospechosa debe estar sujeta a confirmacin (vase el numeral 9.5); el
reconocimiento de las colonias de Salmonella es en gran parte obra de la experiencia, y su apariencia puede variar
algo. No slo de especie a especie, sino tambin de lote a lote de medio. Con relacin a esto, la aglutinacin, en
esta etapa, de colonias con antisuero de Salmonella polivalente puede facilitar el reconocimiento de las colonias
sospechosas.
El segundo medio slido selectivo se incuba a la temperatura adecuada y se realiza la lectura

despus del tiempo recomendado por el fabricante para comprobar la presencia de colonias
que, por sus caractersticas, se consideran Salmonella presuntivas.
9.5
CONFIRMACIN
9.5.1
Generalidades
Para las pruebas de confirmacin pueden utilizarse los sistemas de identificacin que estn
disponibles en el comercio para el anlisis bioqumico de Salmonella si demuestran ser fiables.
El empleo de los kits de identificacin se refiere a la confirmacin bioqumica de las colonias.
Es conveniente que estos kits se empleen siguiendo las instrucciones del fabricante.
NOTA El reconocimiento de las colonias de Salmonella es en gran parte una cuestin de experiencia y, su aspecto
puede variar algo, no solo de serovariedad a serovariedad, sino tambin de lote a lote del medio de cultivo selectivo
utilizado.
9.5.2
Seleccin de colonias para su confirmacin
Para confirmacin se toma al menos una colonia considerada como tpica o sospechosa de
cada placa de cada medio selectivo (vase el numeral 9.4), y luego otras cuatro colonias si la
primera es negativa.
Se recomienda que se identifiquen al menos 5 (cinco) colonias en el caso de estudios
epidemiolgicos. Si en una placa hubiera menos de 5 (cinco) colonias tpicas o sospechosas,
se toman para confirmacin todas las colonias tpicas o sospechosas.
Se reaslan las colonias seleccionadas en la superficie de placas de agar nutritivo previamente
secado de manera que permita el desarrollo de las colonias bien aisladas. Se incuban las
placas sembradas a 37 C 1 C durante 24 h 3 h.
8
Una vez realizado el subcultivo en medio nutritivo, se emplean cultivos puros para la
confirmacin bioqumica y serolgica, se somete a pruebas bioqumicas como son los medios
TSI, LIA, Urea, VP, indol, motilidad.
9.5.3
Confirmacin bioqumica
9.5.3.1 Generalidades
Se siembran mediante una asa bacteriolgica los medios especificados en los numerales 9.5.3.2 a
9.5.3.7 con cada uno de los cultivos obtenidos de las colonias seleccionadas en el numeral 9.5.2.
9.5.3.2 Agar TSI (numeral 5.2.6)
Se siembra en estra la superficie inclinada del agar y la parte profunda por puncin. Se incuba
a 37 C 1 C durante 24 h 3 h.
Se interpretan los cambios del medio de la siguiente manera:
a)
b)
Profundidad
-
Amarillo
glucosa positivo (utilizacin de la glucosa)
Rojo o sin cambio
glucosa negativo (no utilizacin de la glucosa)
Negro
formacin de sulfuro de hidrgeno
Burbujas o fisuras
formacin de gas a partir de la glucosa
Parte inclinada
-
Amarillo
sacarosa)
lactosa y/o sacarosa positivo (utilizacin de la lactosa y/o
Rojo o sin cambio

y/o sacarosa)
lactosa y/o sacarosa negativo(no utilizacin de la lactosa
Los cultivos tpicos de Salmonella muestran la parte inclinada alcalina (roja) y la parte profunda
cida(amarilla) con formacin de gas (burbujas) y (en aproximadamente el 90 % de los casos)
formacin de sulfuro de hidrgeno (ennegrecimiento del agar) (vase el numeral 9.5.3.7).
Cuando se asla una Salmonella lactosa positivo (vase numeral 4.4), la parte inclinada del TSI
es amarilla. Por esto la confirmacin preliminar de los cultivos de Salmonella no debe estar
basada slo en los resultados de las pruebas del TSI (vase el numeral 9.5.3)
9.5.3.3 Caldo urea (vase el numeral 5.2.7).
Se siembra con un asa bacteriolgica el inculo. Se incuba a 37 C 1 C durante 24 h 3 h y
se examina de vez en cuando.
Si la reaccin es positiva, la descomposicin de la urea libera amonio, que cambia el color del rojo
de fenol a rosa y luego a cereza oscuro. La reaccin es a menudo visible al cabo de 2 h a 4 h.
9.5.3.4 Medio para la descarboxilacin de la L-lisina (vase el numeral 5.2.8)

Se siembra justo por debajo de las superficie del medio lquido. Se incuba a 37 C 1 C
durante 24 h 3 h.
La turbidez y un color morado despus de la incubacin indican una reaccin positiva. Un color
amarillo indica una reaccin negativa.
9.5.3.5 Medio para reaccin de Voges-Proskauer (VP) (vase el numeral 5.2.9)
Se suspende el contenido de un asa de la colonia sospechosa en un tubo estril que contenga
3 ml de medio VP. Se incuba a 37 C 1 C durante 24 h 3 h.
Despus de la incubacin, se aaden dos gotas de la disolucin de creatina, tres gotas de la
disolucin etanlica del n-naftol y luego dos gotas de la disolucin de hidrxido potsico; se
agita despus de la adicin de cada reactivo.
La formacin de un color rosa a rojo brillante en 15 min indica una reaccin positiva.
9.5.3.6 Medio para la reaccin del indol (vase el numeral 5.2.10)
Se siembra con la colonia sospechosa un tubo que contenga 5 ml de medio SIM (movilidad).
Se incuba a 37 C 1 C durante 24 h 3 h.
Despus de la incubacin se aade 1 ml del reactivo de Kovacs.
La formacin de un anillo rojo indica una reaccin positiva. Un anillo amarillo-marrn indica una
reaccin negativa.
9.5.3.7 Interpretacin de las pruebas bioqumicas
Salmonella muestra generalmente las reacciones indicadas en la Tabla 1.
10
Tabla 1. Interpretacin de las pruebas bioqumicas
Prueba
(9.5.3.2 a 9.5.3.7)
S.typhi
Reacb
%
cin
cido de glucosa en
+
TSI
Gas de glucosa en
d
TSI
cido de lactosa en
TSI
cido de sacarosa en
TSI
Produccin de sulfuro
+
de hidrgeno en TSI
Hidrlisis de urea
Descarboxilacin de
+
la lisina
Reaccin de VP
Produccin de Indol
a
De la referencia [5]
Cepa de Salmonella
S. paratyphi A
S. paratyphi B S. paratyphi C
ReacReacReacb
%
%b
%b
cin
cin
cin
Otras cepas
Reac%b
cin
100
100
100
100
92
100
97
10
92
98
95
0
0
0
0
0
14
Estos porcentajes indican que no todos los aislamientos de serotipos de Salmonella dan las reacciones
marcadas como + +o -. Estos porcentajes pueden variar dentro de un mismo serotip y entre un serotipo y
otro de los causantes de toxi-infecciones alimentarias de diferentes procedencias.
Los porcentajes no son conocidos segn la literatura disponible.
Salmonella Typhi no produce gas.
Las Salmonella enterica subespecie arizonae dan una reaccin de lactosa positiva o negativa pero son
siempre -galactosidasa positivo. Para el estudio de estas cepas puede ser til realizar pruebas
complementarias.
9.5.4
Confirmacin serolgica y serotipo
9.5.4.1 Generalidades
La deteccin de la presencia de los antgenos de Salmonella O, Vi, y H se realiza a partir de las
colonias puras (vase el numeral 9.5.2) mediante aglutinacin en portaobjetos con los sueros
adecuados y, despus de que las cepas autoaglutinantes hayan sido eliminadas. Se utilizan los
antisueros segn las instrucciones del fabricante si difieren de las descritas a continuacin.
9.5.4.2 Eliminacin de las cepas autoaglutinables
Se sita una gota de la disolucin salina (vase el numeral 5.2.12) en un portaobjetos de vidrio
perfectamente limpio. Se dispersa parte de la colonia a probar en la gota, con un asa de
manera que se obtenga una suspensin homognea y turbia.
NOTA Tambin es posible dispersar parte de la colonia a analizar en una gota de agua, y luego mezclar esta
disolucin con una gota de la disolucin salina (vase el numeral 5.2.12).
Se hace oscilar el portaobjetos de 30 s a 60 s. Se observa el resultado sobre un fondo oscuro,

preferiblemente con la ayuda de una lupa.
Si las bacterias se agrupan en unidades ms o menos distintas, se considera la cepa como
autoaglutinable y no debe someterse a las siguientes pruebas, porque la deteccin de
antgenos no es posible.
11
9.5.4.3 Comprobacin de los antgenos O

Empleando una colonia pura no aglutinable, se procede segn el numeral 9.5.4.2, empleando
una gota de suero anti O, en lugar de la disolucin salina.
Si se produce aglutinacin, la reaccin se considera positiva.
Se usa el suero poli y monovalente uno despus del otro.
9.5.4.4 Comprobacin de los antgenos Vi
Empleando una colonia pura no aglutinable, se procede segn el numeral 9.5.4.2, empleando
una gota de suero anti Vi, en lugar de la disolucin salina.
9.5.4.5 Comprobacin de los antgenos H
Se inocula el agar nutritivo semislido con una colonia pura no autoaglutinable. Se incuba el
medio a 37 C 1 C durante 24 h 3 h.
Se usa ese cultivo para el examen de los antgenos H, procediendo segn el numeral 9.5.4.2,
empleando una gota de suero anti H, en lugar de la disolucin salina.
9.5.5
Interpretacin de las reacciones bioqumicas y serolgicas
La Tabla 2 da las interpretaciones de las pruebas de confirmacin (vanse los numerales 9.5.3
y 9.5.4) realizadas en las colonias seleccionadas (vase el numeral 9.5.2).
Tabla 2. Interpretacin de las pruebas de confirmacin
Reacciones bioqumicas
Auto aglutinacin
Tpicas
No
Tpicas
No
Tpicas
Si
Reacciones no tpicas
Reacciones no tpicas
9.5.6
Reacciones serolgicas
Antgeno O, Vi y H positivo
Interpretacin
Cepa considerada como
Salmonella
Puede ser Salmonella
No / si
Todas las reacciones negativas

No analizado (vase el numeral
9.5.4.2)
Antgeno O, Vi y H positivo
No / si
Todas las reacciones negativas
No se considera que sea

Salmonella
Confirmacin definitiva
Las cepas que se consideran que son Salmonella o pueden ser Salmonella (vase la Tabla 2),
deben enviarse a un centro de referencia de Salmonella reconocido para el tipificado definitivo.
Este envo debe acompaarse de toda a informacin posible referente a la cepa(s) y si se trata
de un brote o de un alimento aislado.
12

10.
EXPRESIN DE RESULTADOS
De acuerdo con los resultados de la interpretacin, se indica la presencia o ausencia de

Salmonella en una porcin de x g de producto (vase la NTC 4092).
Vase el Anexo C para los datos de precisin obtenidos del anlisis interlaboratorios.
11.
INFORME DE ENSAYO
El informe de ensayo debe especificar:

-
toda la informacin necesaria para la completa identificacin de la muestra;
el mtodo de muestreo utilizado, si se conoce;
el mtodo de ensayo utilizado, con referencia a esta parte de la norma;
todos los detalles operativos no especificados en esta parte de la norma, o considerado

como opcional, cualquier incidente detallado que pueda haber influenciado los
resultados del ensayo;
el resultado obtenido.
El informe del anlisis debe tambin hacer constar si se obtuvo un resultado positivo
exclusivamente con un medio en placa (vase el numeral 5.2.4) no especificado en la presente
norma.
12.
ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD
Se debe verificar la capacidad del laboratorio de detectar la Salmonella con los mtodos y los
medios descritos en esta norma e introducir una muestra de referencia en los recipientes de
control del medio de preenriquecimiento (vase el numeral 5.2.1). Se prosigue con los
recipientes de control como para los ensayos de cultivo.
13

ANEXO A
(Normativo)
DIAGRAMA DE PROCEDIMIENTO
Muestra 25 g
PRE-ENRIQUECIMIENTO NO SELECTIVO
225 ml de agua peptonada o caldo lactosado
Incubacin a 35C 2C - 18 h 2 h
Rapport Vassiliadis
Incubar 41,5C 0,5C
24 h 3 h
Caldo de Muller-Kauffman
tetratronato novobiocina
(MKTTn) 37C 1C
24 h 3 h
ENRIQUECIMIENTO
SELECTIVO
SIEMBRA EN MEDIOS
SELECTIVOS
Rambach
Hektoen
McConkey
XLD
Bismuto
sulfito
SalmonellaShiguella
Verde
Brillante
Incubacin a
35C 2C
24 h 3 h
Colonias caractersticas
PRUEBAS BIOQUMICAS
Reaccin de
Voges-Proskauer
TSI
Lisina
SEROLOGIA
Antisuero Polivalente
Antisuero monovalente
14
Urea
Produccin
de Indol

ANEXO B
(Normativo)
COMPOSICIN Y PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS

B.1
MEDIO DE PREENRIQUECIMIENTO NO SELECTIVO
B.1.1 Solucin buferizada

B.1.1.1 Composicin
Fosfato dibsico de sodio anhidro
cido ctrico saturado
Agua
9.23 g
-1 000 ml
B.1.1.2 Preparacin
Disolver 9,23 g de fosfato dibsico de sodio anhidro en 800 ml de agua, ajustar la solucin con
cido ctrico saturado a un pH de 4 + 0,1 aforar con agua a 1000 ml y mezclar. Esterilizar a 121 C
durante 20 min.
B.1.2 Agua peptonada
B.1.2.1 Composicin
Peptona
Cloruro de sodio
Hidrofosfato disodico .dodecahidratado(Na2HPO412H2O)
Fosfato dihidrgeno potasico (KH2 PO4)
Agua
10,0 g
5,0 g
9,0 g
1,5 g
1 000 ml
B.1.2.2 Preparacin
Disolver los componentes en agua, mezclar bien y calentar si es necesario. Ajustar el pH de tal
modo que despus del tratamiento en autoclave, sea de 7,0. Esterilizar a 121 C durante 20 min.
B.1.2 Caldo lactosado
B.1.2.1 Composicin
Peptona de gelatina
Extracto de carne
Lactosa
5,0 g
3,0 g
5,0 g
B.1.2.2 Preparacin
Disolver 13 gr por litro mezclar bien y distribuir en frascos de 250 ml. Ajustar el pH de tal modo
que despus del tratamiento en autoclave, sea de 6,9 . Esterilizar a 121 C durante 15 min.
B.2
RAPPAPORT-VASSILIADIS VERDE MALAQUITA
B.2.1 Solucin A
15
B.2.1.1 Composicin
Triptona
Cloruro de sodio
Fosfato dipotsico (KH2 PO4)
Agua
5,0 g
8,0 g
1,6 g
1 000 ml
B.2.1.2 Preparacin
Debe ser preparada diariamente. Disolver los componentes en agua a 70 C.
B.2.2 Solucin B
B.2.2.1 Composicin
Oxalato verde malaquita
Agua
0,4 g
100 ml
B.2.2.2 Preparacin
Disolver el oxalato verde malaquita en agua y mantenerlo en frasco oscuro y a una temperatura
fresca.
B.2.3 Medio completo
B.2.3.1 Composicin
Solucin A
Solucin B
1000 ml
10 ml
B.2.3.2 Preparacin
Mezclar 1 000 ml de solucin A con 10 ml de solucin B ajustar el pH de tal modo que despus
del tratamiento en autoclave, sea de 5,2. Distribuir en tubos en cantidades de 10 ml y esterilizar
en autoclave a 115 C por 15 min. Mantener el medio en refrigeracin.
B.3
CALDO MULLER-KAUFFMANN TETRATIONATE NOVOBIOCINA (MKTTn)
B.3.1 Medio base

B.3.1.1 Composicin medio base
Extracto de carne
Digerido enzimtico de casena
Cloruro de sodio (NaCl)
Carbonato de calcio (CaCO3)
Tiosulfato de sodio pentahidratado
Bilis de buey para uso bacteriolgico
Verde brillante
Agua
4,3 g
8,6 g
2,6 g
38,7 g
47,8 g
4,78 g
9,6 g
1000 ml
B.3.1.2 Preparacin
Se disuelven los componentes bsicos deshidratados o el medio completo deshidratado en el
agua mediante ebullicin durante 5 min..
16
Se ajusta el pH, si fuera necesario, de manera que sea de 8,2 0,2 a 25 C.

Se mezcla el medio completamente. El medio base puede ser almacenado durante 4 semanas
a 3 C 0,2 C.
B.3.2 Disolucin de yodo-yoduro
B.3.2.1 Composicin
Yodo
Yoduro potsico (KI)
Agua
20,0 g
25,0 g
100 ml
B.3.2.2 Preparacin
Se disuelve completamente el yoduro potsico en 10 ml de agua, luego se aade el yodo y se
diluye hasta 100 ml con agua estril. No calentar.
Se almacena la disolucin preparada en la oscuridad a temperatura ambiente en un recipiente
hermticamente cerrado.
B.3.3 Disolucin de novobiocina
B.3.3.1 Composicin
Sal sdica de novobiocina
Agua
0,04 g
5 ml
B.3.3.2 Preparacin
Se disuelve la sal sdica de novobiocina en el agua y se esteriliza por filtracin.
Se puede almacenar hasta 4 semanas a 3 C 0,2 C.
B.4
AGAR XLD (XILOSA, LISINA DESOXICOLATO)
B.4.1 Composicin
Extracto de levadura en polvo
Cloruro sdico
Xilosa
Lactosa
Sacarosa
Hidrocloruro de L-lisina
Tiosulfato sdico
Citrato amnico de hierro
Rojo de fenol
Desoxicolato sdico
Agar
Agua
17
3g
5g
3,75 g
7,5 g
7,5 g
5g
6,8 g
0,8 g
0,08g
1,0 g
de 9 g a 18 g
1000 ml
B.4.2 Preparacin
Disolver los componentes bsicos deshidratados o el medio base en el agua mediante
calentamiento, con agitacin frecuente, hasta que el medio comience a hervir. Evitar el
sobrecalentamiento. Se ajusta pH de manera que despus de la esterilizacin sea de 7,4 0,2
a 25 C.
B.5
FENOL ROJO/ AGAR VERDE BRILLANTE(EDEL Y KAMPELMACHER)
B.5.1 Base
B.5.1.1 Composicin
Extracto de carne
Peptona
Extracto de levadura
Disodio hidrogeno fosfato Na2HPO4
Sodio dihidrogeno fosfato NaH2PO4
Agar
Agua
1)
Depende de la fuerza del gel
5,0 g
10,0 g
3,0 g
1,0 g
0,6 g
12 g a 18 g 1)
900 ml
B.5.1.2 Preparacin
Disolver los componentes y calentar si es necesario, ajustar el pH a 7,0, transferir a tubos y
esterilizar en autoclave a 121 C por 15 min.
B.5.2 Caldo carbohidrato rojo de fenol
B.5.2.1 Composicin
Lactosa
Sucrosa
Rojo de fenol
Agua hasta completar volumen
10,0 g
10,0 g
0,09 g
100 ml
B.5.2.2 Preparacin
Disolver los componentes en 50 ml de agua, luego llevar a 100 ml, calentar en un bao de
agua a 70 C por 20 min. Enfriar a 55 C 1 C y usar inmediatamente.
B.5.3 Solucin de verde brillante
B.5.3.1 Composicin
Verde brillante
Agua
0,5
100 ml
B.5.3.2 Preparacin
Aadir el verde brillante al agua, almacenar la solucin en un sitio oscuro.
18

B.5.4.1 Composicin
Base
Caldo carbohidrato rojo de fenol
Solucin de verde brillante
900 ml
100 ml
1 ml
B.5.4.2 Preparacin
Aadir en condiciones aspticas la solucin de verde brillante a el caldo carbohidrato rojo de
fenol, enfriar a 55 C 1 C y aadir esto a la base.
B.6
AGAR NUTRITIVO
B.6.1 Composicin
Extracto de carne
Peptona
Agar
Agua
1)
3,0 g
5,0 g
12 g a 18 g 1)
1000 ml
B.6.2 Preparacin
modo que despus del tratamiento en autoclave, sea de 7,0. Esterilizar a 121 C durante 20 min.
B.7
TRES AZCARES / AGAR HIERRO (AGAR TSI)
B.7.1 Composicin
Extracto de carne
Peptona
Cloruro de sodio
Lactosa
Sacarosa
Glucosa
Citrato frrico(III)
Triosulfato de sodio
Rojo fenol
Agar
Agua
1)
3,0 g
3,0 g
20,0 g
5,0 g
10,0 g
10,0 g
1,0 g
0,3 g
0,3 g
0,024 g
12 g a 18 g 1)
1 000 ml
B.7.2 Preparacin
modo que despus del tratamiento en autoclave, sea de 7,4. Distribuir en tubos en cantidades
de 10 ml y esterilizar a 121 C durante 10 min.
19

B.8
CALDO UREA (CHRISTENSEN)
B.8.1 Base
B.8.1.1 Composicin
Peptona
Glucosa
Cloruro de sodio
Fosfato dihidrgeno potasico (KH2 PO4)
Rojo fenol
Agua
1,0 g
1,0 g
5,0 g
2,0 g
0,012 g
1 000 ml
B.8.1.2 Preparacin
Disolver los componentes en agua, mezclar bien y calentar si es necesario. Ajustar el pH de tal modo
que despus del tratamiento en autoclave, sea de 6,8. Esterilizar a 121 C durante 20 min.
B.8.2 Solucin de urea
B.8.2.1 Composicin
Urea
Agua
400 g
1 000 ml
B.8.2.2 Preparacin
Disolver la urea en agua, esterilizar por filtracin y chequear.
B.8.3.1 Composicin
Base
Solucin de urea
950 ml
50 ml
B.8.3.2 Preparacin
Aadir en condiciones aspticas la solucin de urea sobre la base, enfriar a 45 C 1 C.
Distribuir en tubos en cantidades de 10 ml.
B.9
L-LISINA DESCARBOXILADA
B.9.1 Composicin
L-lisina monohidroxiclorada
Glucosa
Prpura de bromocresol
Agua
5,0 g
3,0 g
1,0 g
0,015 g
1 000 ml
B.9.2 Preparacin
modo que despus del tratamiento en autoclave, sea de 6,8. Distribuir en tubos en cantidades
de 5 ml. Esterilizar a 121 C durante 10 min.
20

B.10
REACTIVOS PARA LA REACCIN DE VOGES PROSKAUER (VP)
B.10.1 Medio VP
B.10.1.1 Composicin
Peptona
Glucosa
Hidrgeno fosfato dipotsico
Agua
7g
5g
5g
1 000 ml
B.10.1.2 Preparacin
Se disuelven los componentes en el agua, calentando si fuera necesario. Se ajusta el pH, de
manera que despus de la esterilizacin sea de 6,9 0,2 a 25 C si es necesario. Se reparte el
medio en tubos en cantidades de 3 ml. Esterilizar a 121 C durante 20 min.
B.10.2 Disolucin de creatina (N-amidinosarcosina)
B.10.2.1 Composicin
Monohidrato de creatina
Agua
0,5 g
100 ml
B.10.2.2 Preparacin
Se disuelve el monohidrato de creatina en agua.
B.10.3 1-Naftol, disolucin etanlica
B.10.3.1 Composicin
1-naftol
Etanol, 96 % (fraccin volumen)
6g
100 ml
B.10.3.2 Preparacin
Se disuelve el 1-naftol en el etanol.
B.10.4 Disolucin de hidrxido de potasio
B.10.4.1 Composicin
Hidrxido de potasio
Agua
40 g
100 ml
B.10.4.2 Preparacin
Se disuelve el hidrxido de potasio en el agua.
21

B.11
REACTIVOS PARA LA REACCIN DEL INDOL
B.11.1 Medio triptona/triptfano

B.11.1.1 Composicin
Triptona
DL-Triptfano
Agua
10 g
5g
1g
1 000 ml
B.11.1.2 Preparacin
Se disuelven los componentes en agua hirviendo. Se ajusta el pH, si fuera necesario, de
manera que despus de la esterilizacin sea de 7,5 0,2 a 25 C. Se reparte el medio, en
cantidades de 5 ml, en los tubos. Esterilizar a 121 C durante 20 min.
B.11.2 Reactivo de kovacs
B.11.2.1Composicin
4 dimetil amino benzaldehido
Acido clorhdrico p = 1,18 g/ml a 1,19 g/ml
2 metil - 2 butanol
5g
25 ml
75 ml
B.11.2.2 Preparacin
Se mezclan los componentes.
B.12
AGAR NUTRITIVO SEMISLIDO
B.12.1 Composicin
Extracto de carne
Peptona
Agar
Agua
1)
3,0 g
5,0 g
De 4 g a 9 g 1
1 000 ml
B.12.2 Preparacin
Se disuelven los componentes en el agua, calentando si fuera necesario. Se ajusta el pH, si
fuera necesario de manera que despus de la esterilizacin sea de 7,0 0,2 a 25 C. Se
reparte el medio en matraces de capacidad adecuada. Esterilizar a 121 C durante 20 min.
B.12.3 Preparacin de las placas de agar
Se vierten unos 5 ml del medio recin preparado en tubos. No hay que dejar que el medio se seque.
B.13
DISOLUCIN SALINA FISIOLGICA
B.13.1 Composicin
Agua
8,5 g
1 000 ml
22
B.13.2 Preparacin
Se disuelve el cloruro de sodio en agua. Se ajusta el pH, si fuera necesario, de manera que
despus de la esterilizacin sea de 7,0 0,2 a 25 C. Se reparten cantidades de la disolucin
en matraces o tubos de manera que contengan de 90 ml a 100 ml despus de la esterilizacin.
Esterilizar a 121 C durante 20 min.
B.14
SELENITO CISTINA
B.4.1 Base
B.14.1.1 Composicin
Triptona
Lactosa
Hidrofosfato disodico
dodecahidratado(Na2HPO412H2O)
Sodio selenito hidrogenado
Agua
5,0 g
4,0 g
10,0 g
4,0 g
1 000 ml
B.14.1.2 Preparacin
Disolver primero los tres componentes tribsicos en agua, llevar a ebullicin por 5 min.
Despus de enfriar aadir sodio selenito hidrogenado y ajustar el pH a 7,0
B.14.2 Solucin de L-Cistina
B.14.2.1 Composicin
L-Cistina
Solucin de hidrxido de sodio 1 mol/l
Agua estril hasta completar volumen
0,1 g
15 ml
100 ml
B.14.2.2 Preparacin
Colocar los componentes en un erlenmeyer estril, llevar a 100 ml con agua estril y no
autoclavar.
B.4.3.1 Composicin
Base
Solucin de L-Cistina
1000 ml
10 ml
B.14.3.2 Preparacin
Enfriar la base y aadir la solucin de L-Cistina, aspticamente, ajustar el pH a 7,0. Distribuir
en tubos aspticamente. Preparar la solucin diariamente.
23

ANEXO C
(Normativo)
COMPARACIN ENTRE EL MTODO DE LA ISO 6579:2002 Y LA AOAC VERSIN 2005

AOAC 995.20
ALIMENTOS ALTAMENTE
CONTAMINADOS
10 ml de caldo RVS como 10
ml
de
caldo
RVS
como
preenriquecimiento.
preenriquecimiento.
0.1 ml de muestra
0.1 ml de muestra
Se incuba a 41,5 C 1 durante 24 h Se incuba a 42 C 0,2 durante 24 h 2 h.
3 h.
10 ml de caldo Tetrationato como 10 ml de caldo Tetrationato como
preenriquecimiento.
preenriquecimiento.
1.0 ml de la muestra
1.0 ml de muestra
Se incuba a 37 1 C durante 24 h 3 Se incuba a 43 0,2 durante 24 h 2 h.
h.
ISO 6579:2002
24
AOAC 967.26
ALIMENTOS PROCESADOS
10 ml de caldo selenito cistina como

preenriquecimiento.
1 ml de muestra
Se incuba a 35 1 C durante 24 h 2 h.
10 ml de caldo Tetrationato como
preenriquecimiento.
1.0 ml de muestra
Se incuba a 35 1 C durante 24 h 2 h.

ANEXO D
(Informativo)
RESULTADOS DE LA PRUEBA INTERLABORATORIOS

En el ao 2000 AFSSA Ploufragan en Europa, y Biocontrol Systems en Estados Unidos,
organizaron un anlisis colaborativo internacional en el marco del proyecto europeo
SMT CT 96 2098 [6]. Once laboratorios de nueve pases europeos y 10 laboratorios de
Estados Unidos participaron en este estudio que tuvo lugar sobre cuajada de queso fresco,
huevo deshidratado en polvo, carne cruda de pollo y un material de referencia. Cada una de las
muestras de alimentos se analiz a dos niveles diferentes de contaminacin, junto con un
control negativo.
Las Tablas C.1 a C.4 dan las los valores del rendimiento por tipo de muestra segn este
anlisis colaborativo. Los resultados obtenidos por algunos laboratorios han sido excluidos de
los clculos exclusivamente por razones tcnicas identificadas claramente (desviaciones del
protocolo).
Tabla C.1. Resultados de los anlisis de los datos obtenidos con muestras de cuajada de queso fresco
Cuajada de queso
fresco
(blanco)
Cuajada de queso
fresco
(nivel de contaminacin bajo)
Cuajada de
queso
fresco
(nivel de contaminacin alto)
23
23
23
Nmero de laboratorios excluidos
Nmero de laboratorios retenidos despus de

exclusin
21
21
21
Nmero de muestras aceptadas
105
105
105
Fiabilidad (especificidad), %
100
Fiabilidad (sensibilidad), %
74,3
83,8
100
100
83,8
60,5
95,2
71,7
Nmero de laboratorios que enviaron los

resultados
Nmero de muestras por laboratorio
Conformidad, %
Concordancia, %
25
Tabla C.2. Resultados de los anlisis de los datos obtenidos con

muestras de huevo deshidratado en polvo
Huevo deshidratado
en polvo
(blanco)
Huevo deshidratado
en polvo
(nivel de
contaminacin bajo)
Huevo deshidratado
en polvo
(nivel de
contaminacin alto)
26
26
26
Nmero de laboratorios que enviaron

los resultados
Nmero de laboratorios retenidos
despus de exclusin
21
21
21
105
105
104
100
98,1
99
100
100
96,2
96,2
98,1
98,1
Conformidad, %
Concordancia, %
Tabla C.3. Resultados de los anlisis de los datos obtenidos con muestras de carne cruda de pollo
Carne cruda de pollo
(blanco)
Nmero de laboratorios que enviaron

los resultados
Carne cruda de pollo Carne cruda de pollo

(nivel de
(nivel de
contaminacin bajo)
contaminacin alto)
25
25
25

Nmero de laboratorios retenidos
despus de exclusin
20
20
20
100
99
100
100
98
100
100
100
96,9
96
100
100
Conformidad, %
Concordancia, %
Tabla C.4. Resultados de los anlisis de los datos obtenidos con materiales de referencia
Material de referencia
(cpsulas conteniendo unas 5 ufc de S. Typhimurium)
Nmero de laboratorios que enviaron los resultados
26
Nmero de laboratorios retenidos despus de exclusin
25
125
94,4
Conformidad, %
Concordancia, %
88,8
89,1
26

ANEXO E
(Informativo)
CUADRO COMPARATIVO RESPECTO DE LAS MODIFICACIONES REALIZADAS A LA

NTC 4574 (Primera actualizacin) Y SU DOCUMENTO DE REFERENCIA LA ISO 6579
Documento de referencia
ISO 6579:2002
1.
OBJETO
1. OBJETO
Esta norma describe los mtodos
Esta norma internacional describe un
horizontales para la deteccin de
mtodo horizontal para la deteccin de
Salmonella spp.
Salmonella, incluyendo Salmonella
Sujeta a las limitaciones indicadas al
typhi y Salmonella paratyphi.
comienzo de esta norma, se aplica a
Sujeta a las limitaciones discutidas en
productos para consumo humano y
la introduccin esta norma internacional
para alimentacin animal.
es aplicable a:
los productos para consumo
La temperatura de incubacin (35 C humano animal;
2 C) se acordar entre las partes
las muestras ambientales en el
involucradas y se debe especificar en rea de la produccin y
el reporte del ensayo.
manipulacin de alimentos.
2.
REFERENCIAS
2.
REFERENCIAS
NORMATIVAS
NORMATIVAS
NTC 5395, Agua para uso en anlisis
de laboratorio. Especificacin y
mtodos de anlisis.
4
PRINCIPIO
4. PRINCIPIO
4.1
GENERALIDADES
4.1 GENERALIDADES
Para la deteccin de Salmonella spp. se La deteccin de Salmonella necesita
necesitan cuatro etapas sucesivas cuatro etapas sucesivas (vase
(vase tambin el Anexo A).
tambin el anexo A).
NTC 4574 (primera actualizacin)
NOTA
Salmonella spp. puede
estar
presente
en
bajas
concentraciones
y
est
frecuentemente acompaada por otros
microorganismos. Por tanto, es
necesario un preenriquecimiento no
selectivo y posteriormente realizar un
enriquecimiento selectivo.
NOTA La determinacin de
Salmonella puede realizarse tambin
por los siguientes mtodos: siembra en
membranas hidrofbicas, PCR,
inmunofluorescencia (VIDAS) o
cualquier otro mtodo bsqueda.
4.2 PREENRIQUECIMIENTO EN
MEDIO LQUIDO NO SELECTIVO
Se inocula en solucin buferada, agua
peptonada
tamponada
o
caldo
lactosado con la muestra para ensayo,
y se incuba a 37 C 1 C por 18 h
+/2 h.
Para ciertos productos alimenticios es
necesario
emplear
otros
procedimientos
de
preenriquecimiento. Vase el numeral
9.1.2.
NOTA Las Salmonella pueden estar

presentes en nmeros pequeos y, a
menudo estn acompaadas de
nmeros considerablemente mayores
de otras Enterobacteriaceae o de
otras
familias.
Adems,
el
preenriquecimiento es necesario para
permitir la deteccin de nmeros
bajos de Salmonella o de Salmonella
lesionadas.
4.2
PRE-ENRIQUECIMIENTO
EN MEDIO LQUIDO NO
SELECTIVO
Sustentacin
Se modifica el objeto debido a que se
considera que al nombrar Salmonella
spp, no es necesario mencionar que
aplica para Salmonella typhi y
Salmonella paratyphi, tambin.
Adicionalmente es importante aclarar
que la temperatura de incubacin se
acordar entre las partes dependiendo
del tipo de muestras que se estn
procesando.
Se incluy la referencia normativa

respecto a los requisitos que debe
cumplir el agua para uso en anlisis de
laboratorio.
Se modifica la redaccin de la nota,
porque se tiende a interpretaciones
respecto
a
microorganismos
lesionados. Adicionalmente se incluye
una nota respecto al uso de mtodos
alternos que son utilizados para la
deteccin de ste microorganismo que
estn
referenciados
en
otros
estndares internacionales tales como
la AOAC.
Se divide el numeral en dos partes,

generalidades y preenriquecimiento en medio
lquido no selectivo. En generalidades se
aclara que etapas son contempladas para la
Se agua peptonada tamponada con la deteccin de Salmonella y dos notas
muestra para ensayo, y se incuba a 37 respecto a muestras con concentraciones
bajas y recomendaciones para uso de
C 1 C por 18 h +/2 h.
Para ciertos productos alimenticios es tcnicas alternativas a la tcnica propuesta en
el documento.
necesario emplear otros
procedimientos de preSe
adiciona
como
medio
de
enriquecimiento. Vase el numeral
preenriquecimiento la solucin buferada y el
9.1.2.
caldo lactosado, como medios alternativos
Para grandes cantidades, es
que tienen la misma funcin que el agua
conveniente calentar el agua
peptonada tamponada a 37 C 1 C peptonada tamponada.
El prrafo respecto al calentamiento antes de
antes de ser sembrada con la porcin
sembrar la porcin para anlisis se retira
para anlisis.
porque este procedimiento se da en la
preparacin de la muestra dependiendo del
producto.
27

4.3
ENRIQUECIMIENTO
EN
MEDIO LQUIDO SELECTIVO
Se inocula 0,1 ml del medio de
preenriquecimiento (vase numeral
4.2) en 10 ml del medio Rappaport
Vassiliadis/medio verde malaquita
(medio RVS) (o medio selenito
segn AOAC 967.25 p. 109) y 1,0
ml del medio de preenriquecimiento
(vase el numeral 4.2) en el medio
Tetrationate Mueller Kauffmann
(medio MKTTn).
El caldo RVS se incuba a 41,5 C
1,0 C durante 24 h 3 h y el
caldo MKTTn se incuba a 37 C 1
C durante 24 h 3 h.
4.4
SIEMBRA
EN
MEDIO
SELECTIVO
A partir de los caldos de
enriquecimiento lquido obtenidos
en el numeral 4.3, se inoculan
como mnimo dos medios selectivos
slidos:
-Xilosa Lisina Desoxicolato (XLD)
Y cualquier otro medio selectivo
complementario al XLD y que sea
especialmente adecuado para el
aislamiento de cepas de Salmonella
lactosa positivas y Salmonella typhi
y paratyphi; el medio se deja a la
eleccin del laboratorio:
EJEMPLO
agar Rambach
Agar Hektoen
agar McConkey
agar Salmonella
Shigella(SS)
ISO 6579:2002
Sustentacin
4.3 ENRIQUECIMIENTO EN MEDIO Se adiciona el medio de cultivo

LQUIDO SELECTIVO
selenito recomendado por el mtodo
de la AOAC y que es ampliamente
Se siembra el medio Rappaport- utilizado
en
los
laboratorios
Vassiliadis (caldo RVS) y el caldo colombianos. Adicionalmente se
Muller-Kauffmann tetrationato (caldo aclara a que temperaturas y durante
MKTTn) con el cultivo obtenido en el cuanto tiempo debe realizarse la
numeral 4.2.
incubacin.
4.4
SIEMBRA EN PLACA E
IDENTIFICACIN
Se siembran dos medios slidos
selectivos a partir de los cultivos
obtenidos en el numeral 4.3.
agar xilosa lisina desoxicolato
(agar XLD);
cualquier otro medio selectivo
complementario al XLD y que
sea especialmente adecuado
para el aislamiento de cepas de
Salmonella lactosa positivas y,
Salmonella typhi y Salmonella
paratyphi; el medio se deja a la
eleccin del laboratorio.
Se modifica el numeral para incluir

como medio principal el XLD y una
lista de los posibles medios de cultivo
que pueden ser utilizados como
alternativa no como una nota como
est en el documento de referencia.
El agar XLD se incuba a 37 C 1

C y se examina despus de 24 h
3 h. El segundo agar selectivo se
incuba segn las recomendaciones
del fabricante.
NOTA Para informacin, el agar

verde brillante, agar sulfito de
El agar XLD se incuba a 37 C 1 bismuto, etc., podran ser utilizados
C y se examina despus de 24 h como el segundo medio en placa.
3 h. El segundo agar selectivo se
incuba a 37 C 1 C, y se examina
despus de 24 h 3 h o segn las
indicaciones del fabricante del
medio de cultivo, si es necesario,
despus de 48 h para verificar la
presencia de colonias las cuales, a
partir de sus caractersticas, se
consideran presuntivas de ser
Salmonella spp.
4.5 CONFIRMACIN
4.5 CONFIRMACIN DE
En Colombia se entiende que
IDENTIDAD
confirmacin se refiere a la
identificacin del microorganismo e
identidad se refiere cuando se esta
hablando de una persona; por lo
tanto se elimina.
28

5.1
GENERALIDADES
Sustentacin
ISO 6579:2002
5.1
GENERALIDADES
Para
la
prctica
actual
de Para
la
prctica
actual
laboratorio vase la NTC 4092 (ISO laboratorio vase la ISO 7218.
7218).
Se adiciona la nota respecto al uso

de mtodos rpidos y reactivos listos
de para uso, debido a que en el
mercado estn disponibles con
tcnicas validadas.
NOTA 1 Se
pueden
emplear
reactivos listos para usar, preparados
comercialmente.
5.2.1 Medio
de
pre5.2.1
Medio de preenriquecimiento no selectivo:
enriquecimiento no selectivo:
agua peptonada tamponada.
Solucin buffer, agua peptonada
tamponada o caldo lactosado
La eleccin del segundo medio se
deja a criterio del laboratorio de
anlisis. Es conveniente seguir de
manera precisa las instrucciones del
fabricante en lo referente a su
preparacin.
agar Rambach
agar Hektoen
agar McConkey
agar Salmonella Shigella (SS)
agar verde brillante.
Vase numeral B.5.
Se adiciona como medio de preenriquecimiento la solucin buferada

y el caldo lactosado, como medios
alternativos que tienen la misma
funcin que el agua peptonada
tamponada.
Se adiciona el listado para
seleccionar el segundo medio.
La eleccin del segundo medio se

deja a criterio del laboratorio de
anlisis. Es conveniente seguir de
manera precisa las instrucciones del
fabricante en lo referente a su
preparacin.
5.2.9 Reactivo para la deteccin

de la -galactosidasa (o discos de
papel listos para su uso y
empleados segn las instrucciones
del fabricante). Vase el numeral B.
9.
5.2.11 Agar nutritivo semislido

Este numeral se elimina de la

norma, debido a que actualmente
en los laboratorios no se cuenta con
los reactivos para realizar esta
prueba. Se considera que las otras
bioqumicas mencionadas en el
documento, sirven para identificar
una Salmonella, sin necesidad de
realizar la deteccin por medio de
la - galactosidasa.
Se adiciona movilidad para aclarar
el uso del mismo.
5.2.11 Agar nutritivo semislido

(movilidad)
6.7
CAJAS DE PETRI
De tamao pequeo (de 90 mm a
100 mm de dimetro) o de tamao
grande (de 140 mm de dimetro).
6.7
CAJAS DE PETRI
Se incluye la nota para aclarar que
De tamao pequeo (de 90 mm a pueden utilizarse tanto cajas de
100 mm de dimetro) o de tamao vidrio, como desechables.
grande (de 140 mm de dimetro).
NOTA se pueden utilizar cajas de

vidrio o de material desechable.
6.8
BAO DE AGUA
En caso de incubar en bao de
agua, mantenerlo a una temperatura
entre 41,5 C 1,0 C a 37 C 1
C.
NOTA se pueden utilizar cajas de

vidrio o de material desechable.
6.4
BAO DE AGUA
En caso de incubar en bao de
agua, mantenerlo a una temperatura
entre 41,5 C 1,0 C a 37 C 1
C.
NOTA Se recomienda emplear un

bao que contenga un agente
antibacteriano debido a la baja dosis
infectiva de Salmonella.
29
En la norma se decide dejar como

alternativa
para
incubar
las
muestras tanto la incubadora, como
un bao de agua, introduciendo las
dos temperaturas de incubacin en
este caso, pero el laboratorio tiene
la libertad de decidir, mientras que
cuente con una tcnica validada y
unificar el equipo en un solo
numeral.
ISO 6579:2002
Sustentacin
9.1
MUESTRA PARA
ENSAYO Y SUSPENSIONES
INICIALES
... NOTA 5Para reducir la carga de
trabajo cuando ms de 25 g de la
muestra para ensayo de un lote
especfico de alimentos ha sido
analizado y cuando hay evidencia
disponible de que su mezcla (juntando
las porciones de muestras para
ensayo) no afecta el resultado del
producto en particular, las muestras
para ensayo pueden ser compuestas.
Por ejemplo, si 10 porciones de ensayo
de 25 g se van a analizar, se
combinan las 10 unidades para formar
una muestra para ensayo compuesta
de 250 g y se adicionan 2,25 l de caldo
de pre-enriquecimiento.
Alternativamente, se pueden combinar
porciones de caldos de preenriquecimiento de 0.1 ml ( en 10 ml de
medio RVS) y 1 ml ( en 10 ml de medio
tetrationate Mueller Kauffmann) de los
caldos de pre-enriquecimiento
provenientes de 10 porciones de
muestras para ensayo separadas
(vase el numeral 9.3.1) para
enriquecerlas en 100 ml de los medios
de enriquecimiento selectivos.
9.1.2
Preparaciones
especficas de la suspensin
inicial para ciertos productos
alimenticios
9.1
Muestra para ensayo y Se decide dejar el prrafo como nota
suspensiones iniciales
y no como requisito en dado caso
Con el fin de reducir la carga de que esta situacin se presente.
trabajo cuando haya de analizarse
ms de una porcin para anlisis de
25 g de un determinado lote de
alimento y, cuando exista evidencia
de que su mezcla (juntando las
porciones para anlisis) no afecta al
resultado de ese alimento en
particular, las porciones de anlisis
pueden ser mezcladas. Por ejemplo,
si deben analizarse 10 porciones de
anlisis de 25 g, se combinan las 10
unidades para constituir una porcin
para anlisis compuesta de 250 g y
se aaden 2,25 l de caldo de preenriquecimiento. Una alternativa
sera reunir las porciones de 0,1 ml
(en 10 ml de caldo RVS) y 1 ml (en
10 ml de caldo MKTTn) de los
caldos
de
pre-enriquecimiento
provenientes de 10 porciones para
anlisis
separadas
(vase
el
numeral 9.3.1) para enriquecerlas
en 100 ml de los medios de
enriquecimiento selectivos.
NOTA 6 Para
preparaciones
especficas de la suspensin inicial
para ciertos productos alimenticios
aplicables a la determinacin de
Salmonella
o
cualquier
microorganismo se describen en las
NTC 4491-1, NTC 4491-2, NTC
4491-3 y NTC 4491-4 e ISO 8261.
Si
algn
producto
no
est
referenciado en estas normas o no
existe una norma especfica de
producto, se recomienda que las
partes interesadas lleguen a un
acuerdo sobre este aspecto.
NOTA Las
siguientes
preparaciones
especficas
se
refieren slo al caso de Salmonella.
Las
preparaciones
especficas
aplicables a la determinacin de
cualquier
microorganismo
se
describen
en
las
normas
internacionales ISO 6887-2, ISO
6887-3, ISO 6887-4 e ISO 8261.
9.1.2
Preparaciones
especficas de la suspensin
inicial para ciertos productos
alimenticios
30
Se
cambian
las
referencias
normativas por las NTC colombianas
que han sido adoptadas en el comit
tcnico. Adicionalmente se aclara
que si algn producto que se vaya a
analizar no est contemplado dentro
de estas normas, se debe consultar
la norma de producto y si no la hay,
se debe establecer un acuerdo entre
las partes interesadas para su
anlisis.

9.3.1
Se transfieren 0,1 ml del
medio de cultivo obtenido en el
numeral 9.2, a un tubo que
contenga 10 ml del medio RVS
(vase el numeral 5.2.2); se
transfieren 1 ml del medio de cultivo
obtenido en el numeral 9.2 a un
recipiente que contenga 10 ml del
medio
tetrationate
Mueller
Kauffmann (vase el numeral 5.2.3).
ISO 6579:2002
9.3.1
Se transfieren 0,1 ml del
medio de cultivo obtenido en el
numeral 9.2, a un tubo que
contenga 10 ml del medio RVS
(vase el numeral 5.2.2); se
transfieren 1 ml del medio de cultivo
obtenido en el numeral 9.2 a un
recipiente que contenga 10 ml del
medio
tetrationate
Mueller
Kauffmann (vase el numeral 5.2.3).
Sustentacin
Se incluye una nota para aclarar que

se debe hacer con la muestra en
caso de usar el caldo de cultivo
selenito.
NOTA En el caso de utilizar el medio

de cultivo selenito como medio de
enriquecimiento, se transfieren 1.0 ml
del cultivo obtenido en el numeral
9.2, a un tubo que contenga 10 ml de
caldo selenito (vase numeral 5.2.2).
Se incuba a 35 1 C durante 24 h
2 h.
9.5.3.5 Deteccin de la - Vase explicacin de su eliminacin
galactosidasa (5.2..9). Se suspende en el numeral 5.2.9.
el contenido de un asa de la colonia
sospechosa en un tubo que
contenga 0,25 ml de la disolucin
salina (5.3.13). Se aade una gota
de tolueno y se agita el tubo. Se
coloca el tubo en un bao de agua
(6.6) regulado a 37C y se deja
durante algunos minutos (5 min
aproximadamente). Se aaden 5 ml
del reactivo para la deteccin de la galactosidasa y se mezcla. Se vuelve
a colocar el tubo en el bao de agua
regulado a 37 C y se deja durante
24 h 3 h, examinando el tubo de
vez en cuando.
ANEXO C
Se introduce un anexo informativo
realizando una comparacin entre la
(normativo)
tcnica analtica propuesta en el
documento de referencia y el mtodo
COMPARACIN
ENTRE
EL
propuesto en la AOAC para la
MTODO DE LA ISO 6579:2002 Y LA
deteccin de Salmonella.
AOAC VERSIN 2005
31

BIBLIOGRAFIA
[1]
Manual Tcnico Divisin de Insumos pecuarios. Laboratorio Nacional de Insumos

pecuarios 1996
[2]
Instituto Nacional de Salud, Anlisis Microbiolgico de Alimentos. Manual de

procedimientos. Red Nacional de Laboratorios, Septiembre de 1990
[3]
Manual operativo de anlisis microbiolgicos para alimentos. Gilma Janeth Luna, Fondo
Editorial. Fundacin Universidad de Bogot Jorge Tadeo Lozano.
[4]
AOAC INTERNATIONAL Official Methods of Analysis 18th Ed 2005, AOAC

INTERNATIONAL, Gaithersburg, MD, USA, Method 967.25 Salmonella in Foods. p 109111. Chapter 17.
[5]
AOAC INTERNATIONAL Official Methods of Analysis 18th Ed 2005, AOAC

INTERNATIONAL, Gaithersburg, MD, USA, Method 967.26 Salmonella in Foods. p 111112. Chapter 17.
32
DOCUMENTO DE REFERENCIA
INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION. Microbiology. General
Guidance on Methods for the Detection of Salmonella. Geneve, 2002 (ISO6579:2002).
33

NTC 4574

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NORMA TCNICA

MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS Y ALIMENTOS

MICROBIOLOGY OF FOOD AND ANIMAL FEEDING

esta norma es una adopcin

El Instituto Colombiano de Normas Tcnicas y Certificacin, ICONTEC, es el organismo

ENZIPAN DE COLOMBIA LTDA

LABORATORIO MICROBIOLGICO SIS

NORMA TCNICA COLOMBIANA

NTC 4574 (Primera actualizacin)

REFERENCIAS NORMATIVAS ...................................................................................1

PREENRIQUECIMIENTO EN MEDIO LQUIDO NO SELECTIVO ..............................2

ENRIQUECIMIENTO EN MEDIO LQUIDO SELECTIVO ..............................................

SIEMBRA EN MEDIO SELECTIVO .............................................................................2

MEDIOS DE CULTIVO, REACTIVOS Y ANTISUEROS ..............................................3

MEDIOS DE CULTIVOS Y REACTIVOS .....................................................................3

EQUIPOS Y MATERIAL DE VIDRIO PARA LABORATORIO ...................................5

EQUIPO PARA ESTERILIZACIN EN SECO (HORNO) O ESTERILIZACIN

FRASCOS PARA CULTIVO ........................................................................................5

TUBOS PARA CULTIVO..............................................................................................5

NORMA TCNICA COLOMBIANA

NTC 4574 (Primera actualizacin)

PIPETAS GRADUADAS ..............................................................................................5

CAJAS DE PETRI ........................................................................................................6

PREPARACIN DE LA MUESTRA PARA ENSAYO .................................................6

MUESTRA PARA ENSAYO Y SUSPENSIONES INICIALES .....................................6

SIEMBRA EN MEDIO SELECTIVO .............................................................................7

EXPRESIN DE RESULTADOS ...............................................................................13

INFORME DE ENSAYO .............................................................................................13

ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD .......................................................................13

NORMA TCNICA COLOMBIANA

NTC 4574 (Primera actualizacin)

NORMA TCNICA COLOMBIANA

NTC 4574 (Primera actualizacin)

MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS Y DE ALIMENTOS PARA ANIMALES.

Los siguientes documentos normativos referenciados son indispensables para la aplicacin de

NORMA TCNICA COLOMBIANA

NTC 4574 (Primera actualizacin)

Para los propsitos de esta norma se aplican las siguientes definiciones.

PREENRIQUECIMIENTO EN MEDIO LQUIDO NO SELECTIVO

ENRIQUECIMIENTO EN MEDIO LQUIDO SELECTIVO

SIEMBRA EN MEDIO SELECTIVO

Xilosa Lisina Desoxicolato (XLD),

NORMA TCNICA COLOMBIANA

NTC 4574 (Primera actualizacin)

agar bismuto sulfito

agar Salmonella -Shigella(SS)

agar verde brillante

agares cromognicos selectivos o diferenciales para Salmonella

El agar XLD se incuba a 37 C 1 C y se examina despus de 24 h 3 h. El segundo agar

Se subcultivan las colonias de Salmonella spp. presuntivas aisladas como se describe en el

MEDIOS DE CULTIVO, REACTIVOS Y ANTISUEROS

Para la prctica actual de laboratorio vase la NTC 4092 (ISO 7218).

Se pueden emplear reactivos listos para usar, preparados comercialmente.

MEDIOS DE CULTIVOS Y REACTIVOS

Medio de preenriquecimiento no selectivo: Solucin buffer, agua peptonada

Vase el numeral B.1.

Primer medio de enriquecimiento selectivo: Rappaport. Vassiliadis/medio verde

Vase el numeral B.2.

Segundo medio de enriquecimiento selectivo Tetrationate Mueller Kauffmann

Vase el numeral B.3.

NORMA TCNICA COLOMBIANA

NTC 4574 (Primera actualizacin)

Medios slidos selectivos en placa para aislamiento