MANUAL PRCTICO DE MICROBIOLOGA - Tomo I: Microbiologa Ambiental I

Manacorda A. M., Cuadros D. P y lvarez A. S.

Ao 2007

CAPITULO 6
MEDIOS DE CULTIVO
6.1. OBJETIVOS:

Conocer la clasificacin, preparacin, esterilizacin y distribucin de los medios

de cultivo.

Adquirir conciencia de la importancia que tiene la correcta preparacin del

medio de cultivo en la prctica microbiolgica.

Adquirir prctica en el preparado de algunos medios de cultivo a partir de sus

componentes individuales.

Reconocer la necesidad de evitar la contaminacin tanto de los medios de

cultivo como de los dems elementos utilizados en el laboratorio de
microbiologa.

6.2. INTRODUCCIN
Las bacterias se encuentran en el ambiente junto con otros microorganismos, razn
por la cual es difcil aislarlas. A menudo nuestro inters es caracterizar una especie
bacteriana, para lo cual debemos estar preparados para aislar, cultivar e identificar a la
misma. Si bien el aislamiento es un paso crucial en este camino, comenzaremos
examinando los medios de cultivo, ya que en estos ltimos se basan muchos de los
principios del aislamiento.
Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros
componentes que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los
microorganismos. Es decir, es un soporte que proporciona sustancias nutritivas que
permitan el desarrollo y reproduccin de microorganismos. La diversidad metablica
de los microorganismos es enorme, por ello, la variedad de medios de cultivo tambin
lo es, no existiendo un medio de cultivo universal adecuado para todos ellos.
El conocimiento de las necesidades nutritivas y fsicas de los microorganismos es
fundamental para seleccionar un medio de cultivo adecuado.
Los requisitos que debe reunir el cultivo de un microorganismo tienden a reproducir el
ambiente natural en el que se desarrollan.
Las caractersticas de los microorganismos a tener en cuenta al momento de
preparar un medio de cultivo adecuado para su desarrollo en el laboratorio son:

Tipo trfico: se refiere a los requerimientos de carbono y energa, segn los

cuales se los clasifica en auttrofos, hetertrofos, quimiotrofos (litotrofos u
organotrofos) y fottrofos.

Tipo respiratorio: aerobios, anaerobios, anaerobios facultativos y microaerfilos.

Temperatura ptima de crecimiento: segn el rango de temperatura al cual el

microorganismo presenta su mayor crecimiento, se los clasifica en sicrfilos,
mesfilos y termfilos.

Rango de pH: en general el rango ptimo de pH para la mayora de las bacterias

oscila entre 6,6 y 7,2.

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6.3. CLASIFICACIN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO SEGN SU ORIGEN

Los medios de cultivos pueden clasificarse en:

Naturales: Son aquellos que existen como tales en la naturaleza, por ejemplo,
agua, suero, papa, huevos, leche, sangre, tierra, etc.

Artificiales: Estn compuestos de substancias que son manipuladas por el

hombre en el laboratorio. A los medios artificiales a su vez se los puede dividir en
sintticos y complejos. Un medio del cual se conoce exactamente su composicin
qumica se denomina sinttico o qumicamente definido; puede ser una simple
solucin de sales con una fuente de carbono o puede contener muchos
compuestos orgnicos. Un medio no sinttico o complejo es aquel del que se
desconoce su composicin qumica exacta; se trata bsicamente de extractos de
tejidos vegetales, animales o microbianos, cuya concentracin no se conoce con
exactitud y que proveen todos los nutrientes necesarios, como por ejemplo el caldo
nutritivo.

6.3.1. Clasificacin de los Medios ARTIFICIALES COMPLEJOS segn su

Finalidad
I. Comunes
Medios Artificiales
Complejos

II. Especiales

II.a. Enriquecidos
II.b. Selectivos
II.c. Diferenciales

I. Medios comunes: Permiten el desarrollo de una gran variedad de microorganismos,

como el caldo carne y agar carne.
II. Medios especiales: se los clasifica segn su finalidad.
II.a Medios enriquecidos o mejorados: se obtienen a partir de un medio comn, con
el agregado de elementos nutritivos elegidos segn las necesidades. tales como
sangre, albmina, yema de huevo etc. Se utilizan para el cultivo de microorganismos
exigentes en cuanto a sus requerimientos nutricionales. Se citan como ejemplos el
agar sangre y el agar chocolate.
II.b Medios selectivos: Estos medios han sido modificados de alguna manera para
que, en una flora mixta, permitan el desarrollo de determinadas especies y al mismo
tiempo inhiban la proliferacin de la flora acompaante. Para esto ltimo se busca
establecer condiciones desfavorables de pH, nutrientes y de temperatura, o por el
agregado de inhibidores.
El agar Saburaud es un ejemplo de medio selectivo, en el que el pH de 5,6 favorece el
desarrollo de hongos al mismo tiempo frena el desarrollo de la mayora de las
bacterias.
Ejemplos de sustancias inhibidoras son algunos colorantes (cristal violeta, verde
brillante), los antibiticos, el alcohol fenil etlico y la azida de sodio.
II.b.1 Medios selectivos para enriquecimiento: Son medios en los que los
microorganismos crecen en libre competencia, vindose favorecidos aquellos para los
cuales las condiciones de desarrollo son las ms apropiadas, no llegndose a inhibir
totalmente el crecimiento del resto de microorganismos. Se logra as la multiplicacin
de los microorganismos que se desea identificar, hasta un nmero suficiente tal que
sea posible su aislamiento en medios selectivos apropiados.

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II.b.2 Medios selectivos para aislamiento: son medios selectivos slidos, se utilizan
para sembrar directamente con la muestra incgnita o a partir del medio selectivo para
enriquecimiento.
II.c Medios diferenciales: permiten el desarrollo de muchas de las especies que
coexisten en una mezcla que se desea aislar. Aunque dos o ms tipos de
microorganismos pueden crecer en este medio, algn elemento presente en l permite
diferenciarlos, por ejemplo un indicador. Estas diferencias se basan en alguna
propiedad bioqumica que unos poseen y otros no. Un ejemplo de este tipo es el agar
con eosina azul de metileno que diferencia Escherichia coli de Enterobacter
aerogenes, sobre la base de la diferencia de color de sus respectivas colonias.
Cuando se cultivan ambas especies sobre agar nutritivo, forman colonias de color
blanco grisceo. Sin embargo en agar con azul de metileno las colonias de E. coli son
oscuras y con brillo metlico, en cambio las colonias de E. aerogenes son rosadas con
un centro azul y rara vez presentan brillo.
En su mayor parte los medios diferenciales son asimismo selectivos, por el agregado
de agentes que inhiben el crecimiento. Estos medio selectivo-diferenciales resultan
muy tiles para el aislamiento de un microorganismo separndolo de la flora
acompaante. Se ponen en evidencia las colonias de los microorganismos que se
desea aislar y a su vez se diferencian de aquellas que pudieran haber desarrollado
provenientes de la flora acompaante.
6.4. CARACTERSTICAS GENERALES DE UN BUEN MEDIO DE CULTIVO
Un buen medio de cultivo es aquel que le provee a los microorganismos los
nutrientes indispensables en la concentracin adecuada, cantidad necesaria de
sales y agua, que tenga la consistencia y el pH adecuados, que sea estril y que no
contenga sustancias inhibidoras.

Como ya se ha sealado, la provisin de elementos nutritivos en concentracin

adecuada, depende del conocimiento que se tenga de las condiciones del desarrollo
en el hbitat natural.
La cantidad de sales y agua que se agregue a un medio de cultivo, se relaciona
directamente con el pH, la fluidez y la presin osmtica que se le quiera brindar a los
microorganismos.
En funcin de la consistencia se puede clasificar a los medio el lquidos y slidos. En
el laboratorio, los medios de cultivo pueden presentarse en forma lquida, en cuyo
caso se los denomina caldos, o en forma slida si se le agrega agar al caldo.
En cuanto a la esterilizacin, este procedimiento garantiza la destruccin de todos los
microorganismos no deseados que se encuentran presentes durante la preparacin
del medio de cultivo. Si los componentes del medio son estables al calor se los lleva al
autoclave (121 C, 15 minutos). Si se requiere sangre u otros componentes inestables,
como antibiticos y compuestos fcilmente oxidables al calor, se los esteriliza por
separado por otros procedimientos y se lo agrega al medio que ha sido esterilizado
cuando se haya enfriado a 50 C.
En cuanto a los inhibidores, cabe aclarar que un compuesto puede actuar como
inhibidor para algunos microorganismos y no para otros.

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6.5. CONSTITUYENTES HABITUALES DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Los elementos citados a continuacin, son los ms frecuentemente usados en la
preparacin de los medios de cultivo, aunque pueden no ser los nicos e incluso
alguno de ellos puede estar ausente de la preparacin.

Agua destilada o desionizada. Libre de inhibidores del crecimiento.

Agar. El agar se utiliza como agente gelificante para dar solidez a los medios de
cultivo. El componente dominante en el agar es un polisacrido, al que acompaan
algunas impurezas y que se obtiene de ciertas algas marinas. Existe en rama o en
polvo, se solubiliza en agua a ebullicin (funde hacia los 98C) y al enfriarse forma
un gel inodoro e inspido (se gelifica alrededor de los 42C), dependiendo de su
grado de pureza, por lo que tiene la ventaja de ser slido a la temperatura de
incubacin. Con la excepcin de algunos microorganismos marinos, el agar no es
empleado como nutriente. Para preparar un medio slido se le agrega agar al 1218 %. Si se desea visualizar movilidad se usa agar blando se le agrega agar al 3
%.

Extractos. Para su preparacin, ciertos rganos o tejidos animales o vegetales

(por ejemplo carne, hgado, semillas, etc.) son extrados con agua y calor, y
posteriormente concentrado hasta la forma final de pasta o polvo. Estos
preparados deshidratados son frecuentemente empleados en la confeccin de
medios de cultivo. Ejemplos: extracto de carne, de levadura, de malta, etc. En el
caso del extracto de carne en polvo o pasta, provee sustancias nitrogenadas,
minerales y vitaminas, mientras que el extracto de levaduras provee vitaminas del
grupo B, nitgeno y carbono.

Peptonas. Son mezclas complejas de compuestos orgnicos nitrogenados y sales

minerales que carecen de identidad qumica definida; se obtienen por digestin
enzimtica o qumica de protenas animales o vegetales (soja, carne, gelatina,
casena, etc.). Las peptonas son muy ricas en pptidos y aminocidos, pero
pueden ser deficientes en determinadas vitaminas y sales. Proveen proteosas,
peptonas, polipptidos y aminocidos.

Fluidos Corporales. Sangre completa, sangre desfibrinada, plasma o suero

sanguneo son frecuentemente aadidos a los medios empleados para el cultivo
de algunos patgenos. La sangre no puede ser esterilizada y debe, por tanto, ser
obtenida en condiciones aspticas directamente de un animal sano. Los fluidos
corporales no solamente contribuyen con factores de crecimiento, sino tambin
con sustancias que neutralizan inhibidores del crecimiento de algunas bacterias.

Sistemas amortiguadores. Algunos componentes son incorporados al medio de

cultivo para mantener el pH dentro del rango ptimo del crecimiento bacteriano.
Los microorganismos ms comunes son neutrfilos (el pH ptimo para su
crecimiento est prximo a la neutralidad), y sales como fosfatos bisdicos o
bipotsicos, o sustancias como las peptonas, previenen una desviacin del pH.

Indicadores de pH. Indicadores cido- base se aaden a menudo a los medios de

cultivo con objeto de detectar variaciones del pH.

Agentes reductores. Cistena, tioglicolato y otros son agentes reductores que se

aaden a los medios de cultivo para crear condiciones que permitan el desarrollo
de los grmenes microaerfilos o anaerobios.

Agentes selectivos. La adicin de determindas sustancias al medio de cultivo

puede convertirlo en selectivo (ver ms adelante, clasificacin de los medios de
cultivo). Por ejemplo, cristal violeta, sales biliares, azida sdica, telurito potsico,

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antibiticos, etc., a la concentracin adecuada, actan como agentes selectivos

frente a determinados microorganismos.
6.6. PREPARACIN
En la actualidad, la mayora de los medios de cultivo se encuentran comercializados,
normalmente bajo la forma de liofilizados que es preciso rehidratar. En general, la
preparacin de un medio de cultivo se reduce simplemente a pesar la cantidad
deseada del mismo y disolverla en agua destilada, siguiendo las instrucciones del
fabricante y luego esterilizarlo.
En caso que el medio de cultivo debamos hacerlo nosotros, la preparacin de un
medio de cultivo comienza por hacer un estudio de la frmula que constituye una
receta que deber respetarse estrictamente.
Primero se agrega agua destilada o desionizada a un recipiente, luego se van
incorporando todos los ingredientes de la lista en el orden en el que se encuentran.
Generalmente figura en primer trmino el compuesto que acta como tampn, como
puede ser el PO4H2K, que adems provee fsforo y potasio.
Es conveniente aadir todos los ingredientes en el orden indicado y disolverlos de a
uno antes de agregar el siguiente.
Al finalizar la preparacin y una vez que sta se enfre, se debe verificar que el pH sea
el adecuado. En caso de ser necesario se ajusta con CO3Na2 (1N) o ClH (1N).
6.6.1. Preparacin de medios de cultivo
Materiales:
- Erlenmeyer
- pipetas de 10 ml
- tubos de ensayo con sus tapones
- gradillas
- tiras de pH
- drogas correspondientes a cada frmula
- balanza
- autoclave
A. Caldo nutritivo (Caldo carne)
Es el medio complejo ms comn para el cultivo de microorganismos.
Frmula:
Peptona............................................. 5 g
Extracto de carne.......... 3 g
Agua c.s.p................. 1000 ml
pH.................................. 7,2
Preparacin:
1) Colocar un volumen medido de agua destilada en un recipiente.

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2) Disolver los ingredientes de a uno y por orden.

3) Llevar a ebullicin agitando peridicamente con una varilla de vidrio.
4) Completar el volumen hasta 1000 ml.
5) Dejar enfriar y medir pH. Si hace falta corregir con HONa 1M.
6) Colocar 10 ml del caldo en tubos de ensayo y volmenes apropiados en frascos.
7) Tapar, colocar capuchn de papel y esterilizar en autoclave 15 minutos a 1 atm.
B. Agar nutritivo
Frmula:
Agar........................... 20 g
Caldo nutritivo........ 1000 ml
Preparacin:
1) Colocar 1000 ml de caldo en un recipiente.
2) Agregar el agar calentando a bao mara agitando hasta disolucin total.
3) Ajustar pH hasta 7,2.
4) Llevar 10 ml a tubos de ensayo.
5) Esterilizar.
Cuando se prepara agar nutritivo no es necesario usar caldo estril, la esterilizacin se
lleva a cabo una vez que se ha envasado el caldo agarizado.
Se prepararn tubos con agar inclinado o en pico de flauta (slant), para ello se
colocan 5 ml del agar en los tubos de ensayo, se tapan y esterilizan. Una vez afuera
del autoclave, cuando estn an lquidos, se apoyan sobre la mesada con un cierto
ngulo hasta que solidifiquen.
Se prepararn tambin tubos con agar para puncin. En este caso, una vez que los
tubos fueron retirados del autoclave se dejan solidificar en posicin vertical.
Por ltimo se prepararn cajas de Petri con agar nutritivo. Para ello se puede utilizar
medio de cultivo recin esterilizado y todava lquido, o bien medio solidificado y
fundido a ebullicin en Bao Mara. Se deja enfriar el agar hasta 45 C, luego se lo
vuelca aspticamente en caja de Petri estril, teniendo la precaucin de flamear
previamente la boca del tubo o recipiente a la llama del mechero. Se deja solidificar en
posicin horizontal.
6.7. BIBLIOGRAFA
-

Madigan, M. T.; Martinko G. M. ; Parker J. Brock, Biologa de los Microorganismos.

Ed. Pretice Hall. 8 edicin. 2004.

Laboratorios Britania. http://www.britanialab.com.ar