UNIVERSIDAD DE TALCA

FACULTAD DE CS. DE LA SALUD

DPTO. BIOQUMICA CLNICA E INMUNOHEMATOLOGA

BIOQUIMICA CLINICA I
CTEDRA- TALLER
CONTROL DE ERRORES
EN ESPECTROFOTOMETRA

PROF. T.M. MSc. ELBA LEIVA MADARIAGA

%T

Relacin entre el porcentaje

de transmitancia (%T) y la
concentracin

Concentracin

LEYES DE LA
ESPECTROFOTOMERIA
Io

It

Lambert-Bourguer-Bunsen-Roscoe-Beer
( Lambert-Beer)

b
Io = Intensidad de la luz incidente
It = Intensidad de la luz transmitida
b = espesor del medio
= coef. de absorcin molar (cte. para cada solucin a una solucin de 1
molar)
c= concentracin de la solucin
It = Io*10-bc
Transmitancia = It/Io
Absorbancia = -logT
Entonces:
Abs = -log (10-bc)
Abs = *b*c

Errores en Espectrofotometra
Escala de absorbancia y porcentaje de
transmitancia
Ab
2.0 1.0 .80.70 .60 .50 .40 . 30

%
T 0 10
100

20

30

40

50

.20

60

.10

70

80

90

ERROR EN LA ABSORBANCIA EN FUNCIN DEL

PORCENTAJE DE TRANSMITANCIA.

%T

4
10
25
35
50
70
90

Absorbancia

1
1
1
1
1
1
1

1.398
1.000
0.602
0.456
0.301
0.155
0.046

Variacin en
absorbancia

0.22
0.041
0.035
0.025
0.017
0.012
0.0097

Porcentaje de error
en la medida de
absorbancia
15.8
8.60
5.79
5.44
5.78
8.03
21.2

Rayo de luz monocromtica

que muestra el ancho de
banda espectral

Intensidad

Longitud de onda

INTERFERENCIAS ESPECTRALES

Absorbanci
a

60

40

Oxihemoglobina

20

0
400

500

600

700

Longitud de onda (nm)

Espectro parcial de la oxihemoglobina
(HbO2)

Curva estndar para medir protenas totales

por reaccin de Biuret: A540 v/s concentracin.
Lneas continua, A540 para un estandar de protenas de
50 g/L; lnea punteada, A540 para el mismo estndar que
adems contiene hemoglobina.

Absorbancia (540
nm)

1.2
1.0
0.8

Hemoglobina
estndar 50 g/L

0.6

0.4
0.2

25

50

75

Protenas totales (g/L)

100

CORRECIN DE LA
INTERFERNCIA ESPECTRAL
Blancos de
muestras
Mediciones
cintica

PROPIEDADES FOTOMTRICAS
EXACTITUD DE LA LONGITUD DE ONDA
EXACTITUD FOTOMTRICA
LINEALIDAD FOTOMTRICA
PRECISIN FOTOMTRICA
PRESENCIA DE LUZ PARSITA
ESTABILIDAD FOTOMTRICA: DERIVA Y
RUIDO

CONTROL DE EXACTITUD DE LA LONGITUD

DE ONDA
Es necesario calibrar la longitud de onda como mnimo
una vez al mes:
METODOS PRIMARIOS

a.- Uso de filtro de Didimio: se puede usar en espectrofotometros

que tengan un ancho de banda espectral de 20 nm, este tiene la
mxima absorbancia a 585 nm.
b.- Uso de filtro de Oxido de Olmio: se puede usar en espectrofotometros
que tengan un ancho de banda espectral de 2-8 nm, y se obtiene la mxima
absorbancia a 360 nm.
METODOS SECUNDARIOS
Utilizacin de Punto Isosbstico

EXACTITUD FOTOMETRICA
Solucin de 50 mg/l Dicromato de Potasio en cido
sulfrico 0.01 N Absorbancia a 350 nm debe ser 0.535
Tolerancia de la medicin 2 %
Dicromato de Potasio:
Calidad mxima normalizado del National Bureau of
Standar, secado overnight a 110C y enfriado a
temperatura ambiente en un desecador. Otras soluciones
usadas son :
SOLUCIN DE SULFATO DE COBRE:
SOLUCIN DE SULFATO DE AMONIO Y COBALTO
SOLUCIN DE CROMATO DE POTASIO

EXACTITUD FOTOMTRICA
1.- DISOLUCIN DE SULFATO DE COBRE:
20,0 g
CuSO4 x 5 H2O + 10 ml de H2SO4 concentrado aforado a
1000 ml, dan una disolucin con las siguientes longitudes
de onda.
400 nm
0,002
600 nm
0,068
650 nm
0,224
700 nm
0,527
2. DISOLUCIN DE SULFATO DE AMONIO Y COBALTO:
14,481 g de CoSO4 NH4 SO4 x 6 H2O + 10 ml de H2SO4
concentrado aforados a 1000 ml con agua de pureza
analtica, dan una disolucin con las siguientes
absorbancias en las longitudes de ondas especficas.
400 nm
0,012
450 nm
0,077
500 nm
0,163
550 nm
0,077

EXACTITUD FOTOMTRICA
(UV)

3.- DISOLUCIN DE CROMATO DE POTASIO: 40 mg

de KCrO4 en 1000 ml de KOH 0,05 N (3,3 g/L), dan
una disolucin con las siguientes absorbancias en
las longitudes de onda especficas.
340 nm
375 nm
400 nm
450 nm

0,316
0,991
0,396
0,033

LINEALIDAD FOTOMTRICA
SOLUCIONES DE DISTINTA
CONCENTRACIN CUYAS ABSORBANCIAS
ABARQUEN EL RANGO DE TRABAJO A CADA
LONGITUD DE ONDA

UV . DICROMATO DE POTASIO EN MEDIO

CIDO
405 nm: p-NITROFENOL EN MEDIO
ALCALINO
510 nm: NITRATO DE COBALTO EN MEDIO
CIDO

PRESENCIA DE LUZ PARSITA

340nm: SOLUCIN DE NITRITO DE

SODIO
LECTURA DE ABSORBANCIA O % DE T

LMITE DE ACEPTABILIDAD :% DE T < 1

%

PRECISIN FOTOMTRICA
ESTUDIO A 650 nm CON SULFATO DE COBRE EN
MEDIO CIDO.
1O MEDIDAS DE LA ABS. DE ALCUOTAS DE LA
MISMA SOLUCIN.
CLCULO DE LA PRECISIN DE LAS LECTURAS DE
ABSORBANCIA
LMITE DE ACEPTABILIDAD: CV< 1 %

SERIE DISTRIBUCIN NORMAL

88,2
95,5
99,7
3DE

2DE 1DE

1DE

2DE

Curva de Gauss

3DE

ANLISIS DE LOS
n
DATOS
x=
x
i

n
DE =

(xi -x)2
estndar

Desviacin
n -1

S2 =

( xi - x)2

Varianza
n-1

CV = DE - 100
Coeficiente de
Variacin
x

Frecuencia

Distribuciones de
Frecuencia

Valores

Frecuencia

Distribucin de frecuencia de los resultados de una muestra

por dos mtodos diferentes, 1 y 2. Ambos mtodos son de
igual precisin (
) pero con promedios diferente una de
otra (x1 = x2).
1 2
x1 = x2

x1

x2

ESTABILIDAD FOTOMTRICA

340nm:

SOLUCIN DE DICROMATO DE
POTASIO EN MEDIO CIDO

- ESTUDIO DE LA DERIVA Y RUIDO FOTOMTRICOS

- CLCULO DE LA PENDIENTE Y DE LA DISPERSIN
DE LA RECTA ABS/TIEMPO

LIMITE DE ACEPTABILIDAD: ( DERIVA +RUIDO < 1 % )

Absorbancia

Absorbancia

Deriva y Ruido

Tiempo
bajo deriva y alto ruido

Absorbancia

Absorbancia

Tiempo
bajo ruido y baja deriva

Tiempo
alta deriva y bajo ruido

Tiempo
alta deriva y alto ruido

Error constante y proporcional

(Westgard J, de Vos D, Hunt M, et al: Am J Med Technol 1978;44:290)

30
Error constante
Sin error
Error proporcional

20

10

10

20

30

Medido por mtodos comparativos

A continuacin se presenta una serie de datos al medir diferentes

concentraciones de una sustancia determinada por un mtodo de referencia
( IDEAL, tericamente sin errores) en el eje X y por otra metodologa en el
eje Y.
De acuerdo a los siguientes datos y observando el grfico Ud. debe encontrar
para cada uno de ellos la ecuacin de la recta que los identifica, e interpretar su
resultado.

Tecnica de referencia
X / Y
0 / 0
10 / 8

Error
X / Y
0 / 3
10 / 11

Error..
X /Y
0 /0
20 / 12