espectrofotometría

¿Qué es espectrofotometría?

Método de ánalisis físico-químico, que permite

determinar la concentración de un analito, en
función a la cantidad de energía radiante
absorbida o emitida.

Energía
electromagnética
VENTAJAS:

Rápido
Naturaleza dual
Sencillo
Exacto
Versátil
Onda Partícula
RADIACIÓN ELECTROMAGNÉTICA

Propiedades de partícula (fotón)

C
E  hv E  h
 h  CttePlanck (6,62 1027 erg  seg )
1 v  Frecuencia
E  hC  E


Propiedades ondulatorias (onda)

 Onda: perturbación periódica que se transmite a través de un
medio o del vacío.

A(x,0) 1/n
A(0,t)
A0

A0 = Amplitud
x
= longitud de onda (L)
t
1/n=t= periodo (T)
n= frecuencia (T-1)
s-1 = Herz; Hz

C = velocidad de 
propagación C   n
(depende del medio) t
 ESPECTRO ELECTROMAGNÉTICO

Cambio de
Tipo de cambio configuración Cambio de distribución Cambio de Cambio de
nuclear de los electrones Configuración Orientación Cambio de espín
Cuántico

or

Longitud
de Onda 100 pm 10 nm 1000 nm 100 um 1 cm 100 cm 10 m

Frecuencia, 3 x 1018 3 x 1016 3 x 1014 3 x 1012 3 x 1010 3 x 108 3 x 106

Hz

Energía 109 107 105 103 10 10-1 10-3

j/mol

Tipo de Rayos g Rayos X Ultravioleta Infrarrojo Microondas Ondas de radio

Espectroscopia y Visible

5
Espectro Electromagnético
Espectro Visible
ESPECTRO ELECTROMAGNÉTICO

mayor Espectro Visible menor

frecuencia frecuencia

longitud de onda (nm)

400 - 435 Amarillo - verdoso
435 - 480 Amarillo
480 - 490 Naranja
490 – 500 Rojo
500 – 560 Púrpura
560 – 580 Violeta
580 – 595 Azul
595 - 650 Azul - verde
595 – 750 Verde - azul
Absorción total: se ve negro
Reflexión total: se ve blanco
 Interacción de la luz
con la materia

Haz incidente Absorción Haz emergente

(Io) (I)

Absorbancia: A = log Io / I
 ABSORCIÓN Y EMISIÓN

Edo. Excitado
(E2)

Edo. Basal
(E1)

•Transición de 1 electrón a nivel •Calor.

de mayor energía. •Cambios químicos disociación.
•Cambio en el modo de vibración •Emisión de Rad. de ondas más
de la molécula. largas (fluorescencia o
•Cambio en el modo de Rotación fosforescencia).
de la molécula.

E  h.v  E1  E2
 Ley de lambert - beer
Capa infinitesimalmente delgada de una muestra de grosor “ds”,
que es atravesada por un haz de radiación monocromática.

I0

ds dI
b   K .dn
I I
 Ley de lambert - beer
I N
dI
  K  dN
dI
  K  dN
I I0
I 0

I c
 Ln  K  N N  6,0 10  S  b 
23

I0 1000

I0 K c(mol / L)
log   6 10 ( part / mol)  S (cm )  b(cm) 
23 2

I 2,303 1000(cm 3 / L)

I0
log  A    b  c
I
 Ley de lambert - beer

A = ε . b. c

ε = Absortividad molar (L . cm-1. mol-1)

b = Espesor (cm)
c = Concentración (mol . L-1)

A = a . b. c

a = Absortividad (cm-1. conc.-1)

b = Espesor (cm)
c = Concentración (unidades diferentes a mol . L-1)
 RELACIÓN ENTRE
ABSORBANCIA Y TRANSMITANCIA
La transmitancia (T) se define como:

T= I T (%) = I x 100
Io Io

Si la absorbancia (A):

A = log Io A = log 1
; entonces:
I T

A = log 100 A = log 100 – log %T

%T
A = 2 – log %T
 REPRESENTACIÓN
LEY DE LAMBERT-BEER

A = ε . b. c
 LIMITACIONES
LEY DE LAMBERT-BEER

• Esta ley solo se cumple a concentraciones bajas

del analito, por lo general por debajo de 0,01 M.

• Se cumple cuando se emplea radiación

monocromática.

• ε depende del índice de refracción(η). Por lo

tanto si hay cambios considerables de η en una
solución se observaran desviaciones.
 DESVIACIONES
LEY DE LAMBERT-BEER
 DESVIACIONES
LEY DE LAMBERT-BEER
a) REALES

b) INSTRUMENTALES Radiación policromática

Radiación parásita
Errores de lectura

c) QUÍMICAS Influencia del equilibrio

(dimerizaciones, ácido-base, complejos)
Influencia del disolvente
Influencia de la temperatura
Impurezas de los reactivos
Interacción entre especies
absorbentes
d)PERSONALES
DESVIACIONES REALES

La Ley de Lambert-Beer es válida para

bajas concentraciones de analito:

Pérdida de la independencia en el
comportamiento de cada partícula de
analito (< distancia entre moléculas)

La absortividad (a) y la absortividad

molar (ε) se ven afectadas por cambios
en el índice de refracción
 DESVIACIONES
INSTRUMENTALES
• Uso de radiación no monocromática:

Afecta el valor de absortividad molar

Se debe aislar una banda de longitudes de

onda cercana a la longitud de onda donde A
sea máx. y ε varíe muy poco
 DESVIACIONES
INSTRUMENTALES
• Presencia de radiación parásita:

Dispersión y reflexión de los componentes

ópticos

Tiene una λ diferente

• Errores de lectura:

Los errores indeterminados en la lectura de

la absorbancia o transmitancia siempre están
presentes
 DESVIACIONES QUÍMICAS
• Influencia del equilibrio:
Cuando la sustancia problema forma parte de
un sistema en equilibrio con otras especies,
el desplazamiento del equilibrio implica una
modificación en la concentración, y, en
consecuencia, en la absorbancia

• Influencia del disolvente:

Desplazamientos espectrales, ensanchamiento
de bandas, entre otros fenómenos

• Influencia de la temperatura
• Interacción entre especies absorbentes
ERROR FOTOMÉTRICO
 espectrofotómetro

Cubeta

Monocromador
Detector

Rejilla de salida

Prisma
Fuente de dispersión
Rejilla
de entrada
 espectrofotómetro

a) FUENTE DE RADIACIÓN:
 Suministrar un haz de radiación con la suficiente
potencia

 Proporcionar energía de intensidad

constante

 Estable, continua y de vida

media larga

 Fuentes de radiación más comunes:

de filamento de wolframio,
de descarga de hidrógeno,
de filamento de Nerst.
 espectrofotómetro

b) REGULADOR DE INTENSIDAD:
 La intensidad de la radiación incidente se regula
mediante el uso de diafragmas o rendijas

c) SELECTOR DE λ:
 Dispersan la radiación en sus
longitudes de onda y la aisla
en bandas muy estrechas

 Existen tres tipos: de filtro,

monocromador de prisma y
monocromador de rejilla
 espectrofotómetro
d) CELDA ó CUBETA:
 Material transparente a la
radiación
 Pueden ser cilíndricas o
rectangulares, generalmente
su espesor es de 1 cm.

e) DETECTOR:
 Convierte la energía radiante en energía
eléctrica, que luego debe ser medida

 Los más utilizados para la región visible y UV son:

células fotoválticas y fotoeléctricas (fototubo)
 Radiación Fuente de Selector de Celda Detector
energía λ de
radiación
Ultra Lámpara de Prisma de Cuarzo, Fototubo
Violeta descarga de cuarzo, Sílice
(160-350nm) Hidrógeno o Red de fundido
Deuterio difracción

Visible Lámpara de Red de Vidrio, Fototubo,

(380-780nm) filamento de difracción, Plástico Célula
Wolframio o Filtros fotovoltaica
Tungsteno

IR Lámpara Prismas NaCl, KBr, Termolpila

(780-105nm) globar o NaCl, KBr, CaF2, LiF Balómetro
filamento de LiF, CaF
2
Nernst
 PASOS PARA UN ANÁLISIS
ESPECTROFOTOMÉTRICO

1.- Preparación de soluciones patrón

 A partir de solución madre que contiene el analito

2.- Construir espectro de absorción

 Se mide la absorbancia de una solución patrón
de concentración intermedia a diferentes λ

 Se grafica la absorbancia A
en función de la λ  optimo


ESPECTRO DE ABSORCIÓN

 óptima

(nm)
 PASOS PARA UN ANÁLISIS
ESPECTROFOTOMÉTRICO

3.- Construir curva estándar

 Se mide la absorbancia para la serie de soluciones

patrón, a la λ óptima

 Se grafica Absorbancia vs. Concentración

C
CURVA ESTÁNDAR
 CURVA ESTÁNDAR

 Permite comprobar la Ley de Lambert-Beer

 La recta debe pasar por el origen

 Permite determinar la concentración de

una solución problema

 No se puede extrapolar
 PASOS PARA UN ANÁLISIS
ESPECTROFOTOMÉTRICO

4.- Analizar solución problema

 Se mide la absorbancia de la solución problema a

la λ óptima

 Se determina la concentración por interpolación

A
C?

C
 IMPORTANCIA DEL ANÁLISIS
ESPECTROFOTOMÉTRICO
EN AGRONOMÍA
 Fertilizantes:
-Fósforo soluble en agua
-Fósforo insoluble en agua y en citrato de amonio
-Fósforo total
 Insecticidas
-Residuos de paratión
 En frutos y vegetales
-Pectina
-Carotenoides y carotenos
-Almidón
-Taninos
-Clorofila
-Acido ascórbico
-Glucosa, fructosa y sacarosa
-Otros.