ESPECTROFOTOMETROS UV/VIS

Espectrofotómetros

* Los espectrofotómetros son aquellos instrumentos

en los que se mide fundamentalmente la distribución
espectral de energía radiante en las regiones
espectrales: UV, VIS e IR.

* Estos instrumentos utilizan un sistema óptico de

selección de longitud de onda (monocromador).

 Estos instrumentos pueden seleccionar longitud de

onda en forma continua y en algunos casos con
precisión de décimas de nm. Por lo tanto, es posible
obtener en forma continua el espectro de absorción
de una molécula.
  Un solo haz
 Doble haz
 Multicanal
 Doble dispersión

CLASIFICACIÓN
COMPONENTES BÁSICOS
 ESPECTROFOTÓMETRO DE UN
SOLO HAZ

 Tipo de espectrofotómetro más simple, se basa en la

absorción de la luz al pasar un solo haz por la
muestra a una longitud de onda especifica

 Este instrumento produce luz monocromática y la

detecta después de atravesar la muestra.
 COMPONENTES ÓPTICOS

 Utilizan lámparas intercambiables de wolframio, H2 ó D2

 Tubos fotomultiplicadores y redes de dispersión

 Unos utilizan dispositivos de salida digitales, otros diferentes

medidores

 Los diseños ópticos de los instrumentos difieren por el

fabricante
Conventional Spectrophotometer

Schematic of a conventional single-beam spectrophotometer

F undam entals of m odern U V -visible spectroscopy

F igure : 2 3
 CARACTERISTICAS
 Equipo sencillo y económico
 Trabajanen la región Vis y otros en la región
UV/Vis (190/320 – 800/1100)nm.
 Producen anchos de banda de 2 - 8 nm.

DESVENTAJAS
 Presencia de ruido de “parpadeo” de las fuentes
y detectores
 Cambios de intensidad de la fuente y sensibilidad
del detector con la longitud de onda de trabajo
 ESPECTROFOTÓMETROS DE
DOBLE HAZ
 En este tipo de instrumento la radiación se
divide en dos (Po similares) una pasa por la
muestra y el otro al blanco.

 El doble haz realiza correcciones por:

 La intensidad de la fuente de luz
 Sensitividad (respuesta) del detector
 Transmisión del monocromador (estos factores cambian
con λ)
ESPECTROFOTÓMETRO DE DOBLE HAZ
 VENTAJAS

 Resultados más confiables (A diferencial de la muestra y blanco)

 Operan automáticamente, eliminan ajustes manuales (ahorrando
tiempo)

COMPONENTES OPTICOS
 Espejos giratorios: dividen el haz, ambos se juntan por un espejo
reticular que refleja uno y transmite el otro.
 Detector: recibe pulsos alternativos del haz de referencia y de la
muestra
 Sistema de señales: compara la respuesta de los dos haz y
efectúa la corrección.
 Dispositivos que igualan la intensidad de los dos haz.
 INSTRUMENTOS MULTICANAL

 Tienen pocos componentes ópticos (mayor

rendimiento de la radiación)
 Obtención rápida de barrido y espectros (1s)
 Se acoplan a diferentes ordenadores personales.
 Determinación simultánea de multicomponentes
 Obtención de espectros con barrido electrónico y
reproducibilidad de λ (200 – 800 nm, UV/VIS/IR)
ESPECTROFOTÓMETRO MULTICANAL
COMPONENTES Y FUNCIONAMIENTO
 Lámparas intercambiables de deuterio y tungsteno

 El haz de luz después de atravesar la muestra se enfoca en la

rendija de entrada y pasa a una red de reflexión holográfica

 El detector es una serie de diodos de silicio que consta de 316

elementos.
 INSTRUMENTOS DE DOBLE DISPERSIÓN

 Estosinstrumentos mejoran la resolución espectral y

reducen la radiación parásita
 Tienen dos monocromadores en serie (red o prisma)
 Trabajan en el rango de 185 a 3125 nm.
 Producen resoluciones de 0.07 nm
 Luz parásita = 0.0008 % de Po.
λ > 800 nm, utilizan detector de fotoconductividad de
sulfuro de plomo con lámpara de wolframio.
 COMPONENTES Y FUNCIONAMIENTO

 Laradiación atraviesa la rendija de entrada 1, se

dispersa en la red 1. Luego se dirige a la rendija
de entrada 2 y se dispersa en la red 2.

 Al
salir de la rendija de salida 2, el haz se divide
en dos (espejo obturador) uno atraviesa la
muestra y otro la solución de referencia

 Se dirige hacia el detector para registrarse en la

región de trabajo.
ESPECTRO ELECTROMAGNÉTICO
 PROPIEDADES DE UN PRISMA

Cuando la luz
incide en un
objeto, la luz
puede ser:

 Reflejada
 Absorbida,
 Transmitida
 Difractada.
 TRANSMITANCIA (T)

Representa el porcentaje de luz que pasa a través de la muestra. Es

la relación entre la intensidad de radiación transmitida por la muestra
y la intensidad de radiación que incide sobre la muestra, medidos
ambos en la misma posición del espectro y con la misma rendija.

T = 100 (I / Io)
 ABSORBANCIA (A)

Representando la cantidad de luz que es absorbida por la muestra.

Es el logaritmo en base diez del reciproco de la transmitancia, en el
que el disolvente puro es el material de referencia.

A = - log10( T/ 100) = log10 (Io / I)

LEYES DE LA ESPECTROFOTOMETRIA
 Figura 1. Como no hay ninguna película en el paso
de haz de luz que absorba radiación, entonces el
detector da una lectura de T=100% y A =0

 Figura2. Una única película esta en el paso del

haz de luz, y su transmitancia es del 70%,
entonces:

 I/Io = 0.70 T = 70% A = - log10(0.70) = 0.155

LEYES DE LA ESPECTROFOTOMETRIA
 Figura 3. La segunda película transmite el 70% de la luz
que recibe, o 49% (0.70 x 70%) de la luz original:
 I/Io = 0.49 T = 49% A = - log10(0.49) = 0.310

 Figura 4. La tercera película transmite el 70% de la luz

que recibe, o 34.3 % (0.70 x 49%) de la luz original:
 I/Io = 0.343 T = 34.3% A = - log10(0.343) = 0.465

LEYES DE LA ESPECTROFOTOMETRIA
 LEY DE LAMBERT

 Sepuede concluir que la absorbancia es

proporcional al número de películas de
material coloreado teniendo en cuenta
que cada una de las películas tiene un
espesor constante en cada una de ellas.
 LEY DE BEER

En el ejemplo anterior, la adición de una gota de colorante rojo a una

de las cubetas reduce la transmitancia a 70% ( A = 0.155).

La adición de una gota a la segunda cubeta reduce la transmitancia a

49% (A = 0.310) duplicando la absorbancia como lo indica la ley de
Lambert, ya que la longitud que el haz atraviesa por el material
colorido es ahora el doble de la longitud inicial.
 LEY DE BEER

Sin embargo, si agregamos la segunda gota en la primera

cubeta se obtiene exactamente el mismo resultado que
cuando fue agregada a la segunda cubeta.

En este caso, la longitud sigue siendo la misma inicial y

final, pero la concentración de material colorante ha sido
duplicada, duplicando también la absorbancia. A ese efecto
se le conoce como la Ley de Beer:
 LEY LAMBER-BEER
A=a*b*C

 a= longitud de trayecto
 b=concentración
 C=coeficiente de absorción molar, que depende de la
longitud de onda de la luz, del material absorbente y del
medio o solvente.

Esta ley es de propiedad aditiva en el caso que haya distinto

materiales absorbentes:
A = a1b1C1 + a2b2C2 + . . .
LEY LAMBER-BEER
Certificado Holmio
CM1

ID 0,1 nm velocidad lento. ABE 1,8 nm

Diapositiva 32

CM1 CARLOS MOGOLLON; 13/01/2020

 EXACTITUD DE LA LONGITUD DE ONDA/
Lectura m edia λ Exp
MRC λ T (nm ) Error (nm ) Incertidum bre (nm )
(nm )

λ λ
241,74 242,00 0,26 0,59
279,44 280,00 0,56 0,59
287,98 288,00 0,02 0,59
334,10 334,00 -0,10 0,59
361,00 361,00 0,00 0,59
418,61 418,00 -0,61 0,59
446,10 446,00 -0,10 0,59
453,63 453,00 -0,63 0,59
460,05 460,00 -0,05 0,59
536,66 536,00 -0,66 0,59
637,98 637,00 -0,98 0,59

RESULTADOS DE LA CALIBRACION
Informe Barrido Análisis
Hora Informe: Mié 05 Jun 12:06:32 PM 2019
Método:
Baño: C:\Documents and Settings\gvalenci\Escritorio\Laboratorio1 - EA2019\CM YCIA.DSW
Versión Software: 3.00(339)
Operador:

Nombre Muestra:muestra1
Hora Colección 05/06/2019 12:06:37 p.m.

Tabla Picos
Peak Style Picos
Umbral Picos 0.0100
Rango 650.00nm a220.00nm

Long. Onda (nm) Abs

________________________________
637.95 0.158
536.60 0.307
484.60 0.113
473.25 0.110
460.00 0.808
453.60 0.783
446.05 1.670
418.60 0.195
385.90 0.078
361.05 0.559
347.90 0.085
333.95 0.111
287.85 0.257
279.45 0.290
241.65 0.636
 EXACTITUD DE LA ESCALA DE ABSORBANCIA EN LA REGIÓN UV/
Longitud de Lectura Media Incertidumbre Ecuación de regresión
MRC (A) Error (A)
onda (nm) (A) (A) lineal R2

0,2381 0,2457 0,0076 0,0038

0,4890 0,4850 -0,0040 0,0045
235 nm 0,7373 0,7320 -0,0053 0,0049 1,01602 x + ( -0,0080 ) 0,9999
0,9767 0,9710 -0,0057 0,0058
1,2467 1,2353 -0,0114 0,0069

IGUAL PARA 257 nm, 313nm, y 350 nm.

RESULTADOS DE LA CALIBRACION
 EXACTITUD DE LA ESCALA DE ABSORBANCIA EN LA REGIÓN VISIBLE/

Longitud de Lectura Media Incertidum bre Ecuación de regresión

MRC (A) Error (A)
onda (nm ) (A) (A) lineal R2

0,5650 0,5633 -0,0017 0,0028

440 nm 0,7472 0,7420 -0,0052 0,0028 0,99931 x + ( 0,0035 ) 0,9999
1,0419 1,0400 -0,0019 0,0028

IGUAL PARA 465 nm, 546,1nm, 590 nm y 635 nm

RESULTADOS DE LA CALIBRACION
 MRC CÓDIGO N° CERTIFICADO FECHA DE CALIBRACIÓN TRAZABILIDAD

ÓXIDO DE HOLMIO 027 62181 2017-03-02 STARNA SCIENTIFIC LTD

DICROMATO DE POTASIO 030 62178 2017-03-02 STARNA SCIENTIFIC LTD
FILTROS DE DENSIDAD NEUTRA 028 62183 2017-03-02 STARNA SCIENTIFIC LTD

TRAZABILIDAD
 CONCENTRACIONES (mg/L)
235 nm
20,0 40,0 60,0 80,0 100,0
P ro m e dio 0,2457 0,4850 0,7320 0,9710 1,2353
R e f e re nc ia 0,2381 0,4890 0,7373 0,9767 1,2467
E rro r 0,0076 -0,0040 -0,0053 -0,0057 -0,0114
U re pe t ib 0,0003 0,0000 0,0000 0,0000 0,0003
U P a t ró n 0,0019 0,0023 0,0025 0,0029 0,0034
U R e s o luc ió n
0,0003
de l e quipo
U co mb i nad a 0,0019 0,0023 0,0025 0,0029 0,0034
G ra do s V e f 2,12E+03 2,23E+55 1,95E+54 9,99E+02 2,24E+04
F acto r K 2,0000 2,0000 2,0000 2,0025 2,0000
U e xpa ndida 0,0038 0,0045 0,0049 0,0058 0,0069

FUENTES DE INCERTIDUMBRE
LECTOR DE ELISA
 ELISA son las siglas por las que se conoce al ensayo por
inmunoabsorción ligado a enzimas (en inglés enzyme-linked
immunosorbent assay).

 Se trata de una técnica de laboratorio que fue diseñada por

científicos suecos y holandeses en 1971, que permite detectar
pequeñas partículas llamadas antígenos, que habitualmente
son fragmentos de proteínas.

 La identificación es específica, es decir, consigue que

pequeños segmentos de proteínas destaquen y no puedan ser
confundidas con otras.