tecnologa de laboratorio

Ana Lzaro, directora ingeniera.

Tecnologas Crticas para la Industria (TCI)

El fermentador o biorreactor es la figura principal de la tecnologa de

bioprocesos; un pequeo ecosistema totalmente controlado. La
disparidad de requerimientos multiplica las opciones disponibles a nivel de diseo y funcionamiento. En el siguiente artculo se examinan
los puntos clave a tener en cuenta a la hora de su eleccin y/o diseo.

Tecnologa de los bioprocesos

Diseo de biorreactores y fermentadores

os procesos biotecnolgicos son

cada vez ms importantes en el desarrollo de nuevos enfoques para
el tratamiento de enfermedades. Por ese
motivo, la tecnologa de los bioprocesos
es un rea en creciente desarrollo. A continuacin, vamos a comentar los principa-

Figura 1. Esquema de un fermentador. A.G.P.

2 NOVIEMBRE/DICIEMBRE13

les factores que intervienen en el diseo

y operacin de biorreactores y fermentadores:
1. Requerimientos de los bioprocesos
2. Caractersticas e impacto del diseo
del proceso
3. Geometra de un reactor y seleccin

del agitador
4. Seleccin y diseo de los accesorios
5. CIP/SIP
6. Optimizacin de costes de produccin
Requerimientos de los bioprocesos
Los bioprocesos tienen como objetivo el
crecimiento de clulas vivas. Para ello, es
precisa la utilizacin de un entorno donde
las condiciones de crecimiento puedan ser
controladas en todo momento. Los biorreactores son los recipientes o sistemas
que ofrecen un ambiente biolgicamente
activo y controlado.
Para que el bioproceso tenga xito, el diseo del biorreactor debe tener en cuenta
tres aspectos principales: caractersticas de
la clula, modo de operacin y condiciones
de esterilidad.
Caractersticas de la clula
Las caractersticas de la clula influyen en
el diseo del bioreactor de acuerdo con
los siguientes factores:
Metabolismo celular. En funcin del
tipo de metabolismo celular, el medio
de cultivo ser rico en oxgeno, si se
trata de un metabolismo aerobio, o
carente de oxgeno, si se trata de un
metabolismo anaerobio. Por lo tanto,
este factor determinar aspectos como
la aireacin o el control de pH en el
interior del biorreactor.
Tipo de clula. El tipo de clula (procariota como las bacterias o eucariota),
la sensibilidad de la pared celular y sus
caractersticas frente a la transferencia
de fluidos influirn directamente en el
tipo de agitacin o el control de temperatura en el interior del biorreactor.
Farmespaa INDUSTRIAL

Figura 2. Mezcla homognea (izq.) vs Mezcla no homognea (dcha.)

Modo de operacin
Los bioprocesos o fermentaciones pueden
ser clasificados en funcin de su operatividad en 4 grandes grupos:
Operacin discontinua (batch). Se trata de un sistema cerrado, en el que
en el inicio de la operacin se aade
la solucin esterilizada de nutrientes
y se inocula con el microorganismo,
permitiendo que se lleve a cabo la incubacin en condiciones ptimas de
fermentacin. En los procesos a escala
industrial, se interrumpe la fermentacin al final de la fase logartmica (metabolitos primarios) o antes de que comience la fase de muerte (metabolitos
secundarios). Se trata de un mtodo
robusto, bien conocido y que precisa
de instalaciones simples. Sin embargo,
la utilizacin de los medios materiales
y humanos no es ptima.
Operacin alimentada (fed-batch). Es
bsicamente similar a la fermentacin
discontinua, pero en este caso, algunos sustratos se aaden escalonadamente a lo largo del proceso. Tambin
es un mtodo robusto, bien conocido,
que precisa de instalaciones simples, y
adems, ofrece una mejora en la produccin. Sin embargo, la utilizacin de
los medios materiales y humanos sigue
sin ser ptima.
Operacin continua. En la fermentacin continua se establece un sistema
abierto. La solucin nutritiva estril se
aade continuamente al biorreactor y
una cantidad equivalente de cultivo
con los microorganismos, se saca simultneamente del sistema. Se trata
de un proceso continuo que permite
una buena utilizacin de los recursos
materiales y humanos. Sin embargo,
requiere una atencin mucho mayor
que los modos de operacin anteriores para lograr el mantenimiento de la
estabilidad, por ejemplo en la compoFarmespaa INDUSTRIAL

sicin del sustrato, y de la esterilidad

del sistema.
Biorreactores de enzimas o clulas
inmovilizadas. Se trata de un sistema
de produccin continuo. Consiste en
pasar el medio fresco a travs de un
biorreactor en el que hemos inmovilizado clulas (o enzimas). Con este
sistema se eliminan los problemas de
desequilibrio e inestabilidad de los
sistemas abiertos y continuos. Sin embargo, tiene el inconveniente de que
no todos los organismos vivos pueden
inmovilizarse.
Condiciones de esterilidad
El diseo del biorreactor deber garantizar
las condiciones de esterilidad, evitando la
aparicin de contaminacin, ya sea qumica o microbiolgica. Para ello, la seleccin
de materiales debe garantizar la inocuidad
total, deben ser inertes qumicamente y
deben ser resistentes a las soluciones de
lavado y los procesos de desinfeccin.
El diseo de los equipos deber garantizar la esterilidad del proceso y la seleccin
de los accesorios, deber permitir la operacin en condiciones aspticas.
Caractersticas e impacto del diseo del
proceso
El diseo del proceso debe permitir que
tanto el rendimiento del equipo como la
capacidad de produccin sean los ptimos. Para lograr ambos objetivos, el diseo del sistema deber garantizar en todo
el volumen del equipo los siguientes aspectos:
Distribucin uniforme de clulas
Temperatura constante y homognea
Mnimo gradiente de concentracin de
nutrientes
Ausencia de sedimentacin y de floculacin
Difusin de gases nutrientes fcil y
controlada
Para conseguir estos objetivos, que per-

mitirn optimizar los rendimientos productivos, debern estudiarse los siguientes aspectos del proceso:
Mtodo de mezcla y agitacin
Mtodo de control de temperatura
Mtodo de control de pH
Mtodo de control de [O2] o mtodo
de aireacin
Mtodo de eliminacin de espumas
Mtodo de mezcla y agitacin
La agitacin es la operacin que crea o
que acelera el contacto entre dos o varias
fases. Una fermentacin microbiana puede
ser considerada como un sistema de tres
fases:
Fase lquida: sales disueltas, sustratos
y metabolitos
Fase slida: clulas individuales, agregados celulares, sustratos insolubles o
productos del metabolismo que precipitan.
Fase gaseosa: proporciona un reservorio para el suministro de oxgeno, para
la eliminacin del CO2 o para el ajuste
de pH.
La agitacin permite la dispersin del gas
en la solucin de nutrientes, la homogeneizacin de la temperatura, del pH y de la
concentracin de nutrientes en el fermentador. Gracias a la agitacin se consigue la
suspensin de los microorganismos y de
los nutrientes slidos, as como de la dispersin de los lquidos inmiscibles.
Los tipos de agitacin pueden ser: columna de burbujas, agitacin rotativa o recirculacin.
Mtodo de control de temperatura
El control de la temperatura en el interior
de los fermentadores es un factor fsico que
afecta al rendimiento del proceso. Una temperatura inferior a la ptima provoca el retardo en el crecimiento y la reduccin de la
produccin celular. Asimismo, una temperatura superior a la ptima produce choque
trmico, induccin a una respuesta de esNOVIEMBRE/DICIEMBRE13

tecnologa de laboratorio
Para el burbujeo del gas desde la parte
inferior del recipiente se utilizar un sparger
o tubo taladrado, de fcil limpieza.
El control de la correcta aireacin se
llevar a cabo mediante la medida de oxgeno in-situ. La transferencia de masa gaslquido podr mejorarse con el control de
la presin en el interior del recipiente, as
como con el control de la temperatura. El
incremento de temperatura disminuye la
transferencia de masa gas-lquido.
Figura 3: Tipos de Sparger.

trs celular, produccin de proteasas celulares y reduccin de los productos proteicos.

La fermentacin debe llevarse a cabo en
un estrecho margen de temperatura y a ser
posible constante.
En un proceso de fermentacin, la produccin de calor deriva de la agitacin y de
la actividad metablica. Este calentamiento
puede provocar evaporaciones. Para evitarlo, se emplean camisas de refrigeracin con
agua.
Mtodo de control de pH
Durante el crecimiento en un fermentador, los metabolitos celulares son liberados
al medio lo que puede originar un cambio
de pH del medio de cultivo. Sin embargo, la
mayor parte de los microorganismos crecen
ptimamente a pH comprendidos entre 5,5
y 8,5. Concretamente, las bacterias crecen

a pH neutro y los hongos a pH cido.

Para mantener constante el pH y que
su variacin no perjudique el crecimiento,
debe realizarse la medida de pH in-situ y
el ajuste con reactivos cidos o bsicos, en
caso de que sea necesario.
Mtodo de control de concentracin de
oxgeno o mtodo de aireacin
Otro factor que afecta al rendimiento de
las fermentaciones industriales, esta vez,
qumico, es la concentracin de oxgeno.
En el caso de los microorganismos aerobios, debe asegurarse una perfecta transferencia gas-lquido del oxgeno que se burbujea desde la parte inferior del biorreactor.
En el caso de los microorganismos anaerobios, deber controlarse la ausencia de
este gas, ya sea mediante el burbujeo de
CO2 o de N2.

Mtodo de eliminacin de espumas

Se hace necesaria la eliminacin de espumas durante el proceso de fermentacin
porque alteran la transferencia de masa
entre la fase lquida y la gaseosa de la
parte superior del recipiente. El mtodo
para el control de espumas se basa, por un
lado, en la adicin controlada de antiespumantes y, por otro lado, en la deteccin de
estas espumas mediante sensores especficos y su eliminacin mediante vaco.
Geometra de un reactor y seleccin del
agitador
Geometra del reactor
Sabiendo que la altura HL es la altura de
lquido dentro del recipiente y que DT es
el dimetro total, la relacin geomtrica
(HL / DT) habitual en un biorreactor es la
siguiente:
Cultivo celular: desde 1 1,5 hasta 1
Microbiolgico: desde 2 2, 5 hasta 1

Figura 4. Fermentador, exterior e interior.

4 NOVIEMBRE/DICIEMBRE13

Farmespaa INDUSTRIAL

Figura 5. Turbina Rushton (izquierda) y hlice marina (derecha).

El recipiente destinado al crecimiento celular debe disponer de un diseo que sea

completamente drenable. Por ese motivo,
la configuracin es cilndrica vertical, con
fondos tori-esfricos. Normalmente se trata
de fondos tipo Klpper.
Materiales y acabados
Los materiales empleados en su construccin deben ser no reactivos y resistentes a
la esterilizacin y los reactivos de limpieza.
Los ms habituales son aceros inoxidables
de alta calidad. Para las partes en contacto
con producto, se emplea desde AISI-316L
hasta Hastelloy. Para el resto de partes,
como patas, camisa de refrigeracin o cobertura final del aislamiento, se suele utilizar acero inoxidable AISI 304.
Deben presentar un acabado, tanto interior como exterior, que evite la acumulacin de partculas. Por tanto, es habitual
que estos equipos dispongan de acabados
exteriores matizados o pulidos mecnicos
(GR-180 a GR-320), incluidos los cordones
de soldadura.
Interiormente, el acabado superficial habitual consta de un pulido mecnico con
rugosidad media Ra menor de 0,5 micras.
Este pulido mecnico se ve sustituido a menudo por un electropulido que mejora la rugosidad mxima (Rmax), disminuyendo las
distancias mximas entre valles y crestas.
Cuanto mejor sea el acabado superficial
del recipiente, ms fcil ser mantener las
condiciones de esterilidad.
Seleccin del agitador
Para la seleccin del tamao del agitador
deben tenerse en cuenta varios factores. Por
un lado, la relacin geomtrica entre el tamao del agitador y el del biorreactor y, por
otro lado, la relacin entre el tamao de la
pala del agitador y la eficiencia de la mezcla.
Farmespaa INDUSTRIAL

Si estudiamos la geometra del impulsor,

siendo Di el dimetro de pala del impulsor,
la relacin (Di / DT) habitual en un biorreactor es la siguiente:
Cultivo celular: de 0,5 a 0,6
Microbiolgico: de 0,3 a 0,4
Asimismo, en la seleccin del tamao de
pala tambin debe tenerse en cuenta que

agitadores con el mismo dimetro de pala

tienen la misma eficiencia, es decir, mismo
tiempo de mezcla para conseguir un grado
concreto de homogeneidad con el mismo
volumen. Por tanto, a mayor dimetro de
pala, menor tiempo de mezcla para el mismo volumen.
Los impulsores de los agitadores pueden

Figura 6. Patrn de flujo sin deflectores (izq.) y patrn de flujo con deflectores (dcha.).

NOVIEMBRE/DICIEMBRE13

tecnologa de laboratorio
mediante un PLC, que deber ser cualificable segn CFR21, y que de acuerdo con
las guas GAMP, recoger en tiempo real
las medidas de los distintos instrumentos
ubicados en lnea y gestionar el funcionamiento.

Reactor.

ser principalmente de dos tipos:

Flujo radial, como la turbina Rushton
Flujo axial, como las hlices marinas
De los dos tipos empleados, los ms habituales son los de tipo axial por las siguientes razones:
Posibilidad de montaje tanto en fondo
superior como inferior
Bajo poder de cizalladura de las paredes celulares
Fcil drenabilidad
Para que los patrones de flujo en el interior de los biorreactores o fermentadores
permitan la homogeneidad del contenido,
se hace necesaria en algunos casos la instalacin de bafles o deflectores en la pared interna del recipiente. Estos deflectores crean
las turbulencias necesarias para la correcta
mezcla. Sin embargo, es muy importante
que estos dispositivos puedan limpiarse
correctamente para que no provoquen un
problema de contaminacin.
Ubicacin del agitador
La ubicacin del agitador en un fermentador puede ser tanto en el fondo superior
como en el fondo inferior. La instalacin
del agitador mecnico centrado en el fondo superior presenta ventajas a la hora del
funcionamiento del cierre mecnico, que
no exige ser lubricado, y tambin ventajas
en su limpieza. Sin embargo, como ya hemos visto, puede hacer necesaria la instalacin de deflectores para mejorar el flujo.
La ubicacin del agitador mecnico descentrado en el fondo inferior permite que el
6 NOVIEMBRE/DICIEMBRE13

tanque pueda prescindir de los deflectores.

Sin embargo, complica su funcionamiento,
pues precisa lubricacin del cierre con un
lquido que, adems, entrar en contacto
directo con el producto y tambin limitaciones de limpieza.
Una alternativa a los agitadores mecnicos descentrados en fondo inferior, son los
agitadores magnticos descentrados en
fondo inferior. Por su concepcin, no presentan las desventajas de los mecnicos,
sin embargo, tienen limitaciones en cuanto
a las caractersticas del producto a mezclar,
sobre todo en relacin con la densidad, viscosidad mxima, volumen y presencia de
slidos en suspensin.
Seleccin y diseo de los accesorios
La seleccin del resto de elementos que
forman parte de un biorreactor o fermentador debern respetar las mismas premisas de durabilidad y fcil limpieza que
hemos visto hasta ahora.
Tanto las vlvulas en contacto directo con
el producto, como las tomamuestras, los
instrumentos y los accesorios, debern respetar la seleccin de materiales y acabados
establecida en el caso del recipiente y del
agitador.
Las vlvulas en contacto directo con el
producto empleadas sern fundamentalmente de diafragma, resistente a los ciclos
de esterilizacin. Asimismo, las tomamuestras debern permitir su total esterilizacin
previa a la propia toma de muestra.
El control del proceso se llevar a cabo

CIP & SIP

Cleaning In Place
La limpieza de un fermentador (CIP) tras su
uso se lleva a cabo mediante una bola o
cabezal de limpieza. El dimensionamiento
de este dispositivo debe garantizar que
su alcance llegue al 100% de la superficie
interior del depsito. Para ello, el caudal
y la presin del agua de alimentacin deben ser verificados y adecuados al tipo de
cabezal seleccionado (fijo, rotativo, etc).
En grandes fermentadores con deflectores, puede ser necesaria la instalacin de
ms de un cabezal, para asegurar el rociado total.
Para alimentar el cabezal de limpieza
se utiliza un sistema de bombeo en recirculacin, que puede incluir la adicin de
agentes de limpieza especficos. La receta
de la limpieza depende en cada caso del
bioproceso realizado y la geometra del recipiente.
Sterilisation In Place
La esterilizacin en un fermentador es necesaria en varias fases del bioproceso. En
concreto se utiliza para:
Asegurar que slo nuestro producto est
presente en el medio de produccin
Proteger el producto durante el proceso
Proteger el producto despus del proceso
Proteger al paciente
El tipo de esterilizacin ms frecuente
se lleva a cabo mediante vapor puro. Para
verificar que la esterilizacin ha sido efectiva, debern controlarse la temperatura y el
tiempo, como parmetros fsicos, as como
factores biolgicos como el bioburden presenta antes de la esterilizacin (N0) o el
tiempo en minutos requerido a una temperatura T para lograr un 90% de reduccin
de la poblacin de microorganismos, tambin conocido como DT, siendo T normalmente 121,1C.
Para conseguir los objetivos de la esterilizacin en sus diferentes aplicaciones, ser
imprescindible que el sistema permita esterilizaciones independientes de los distintos
elementos que componen el sistema:
Recipiente
Cierre mecnico del agitador
Filtros de venteo
Farmespaa INDUSTRIAL

 Filtros de aireacin
Sistemas de dosificacin
Optimizacin de costes de produccin
El diseo final del equipo debe ser verstil
para la aplicacin en diversas modalidades
de procesos, de tal forma que, las operaciones a llevar a cabo durante el funcionamiento, recoleccin, limpieza y mantenimiento sean las mnimas. De esta manera,
se conseguir minimizar el tiempo para
cada etapa del ciclo.
El equipo debe estar diseado para que
el consumo de energa sea lo ms bajo
posible, disminuyendo as los gastos de
produccin. Los materiales seleccionados
debern ser los adecuados para que los
resultados sean satisfactorios, pero sin caer
en aspectos superfluos que puedan incluso
complicar las tareas de limpieza y desinfeccin.

Bibliografa
-- J. A. Asenjo & J.C. Merchuk (1995)
Bioreactor System Design. Marcel Dekker,
Inc., NY
-- P.M. Doran (1995) Bioprocess Engineering
Principles. Academic Press, London
-- V.A. Vinci & S.R. Parekh (2003) Handbook
of Industrial Cell Culture - Mammalian,
Microbial, and Plant Cells, Humana Press,
Totowa, NJ.
-- S.S. Block(2001) Disinfection Sterilization,
and Preservation 5th Ed. Lippincott,
Williams, & Wilkins, Philadelphia, PA
-- A.Amanullah, B.C.Buckland, & A.W. Nienow
(2003) Mixing in the Fermentation and Cell
Culture Industries, Ch. 18 in Handbook of
Industrial Mixing: Science and Practice, S.M.
Kresta, V. Atiemo-Obeng, & E.L. Paul (eds),
John Wiley & Sons, Inc., NY
-- K.N. Baker et al. (2002) Rapid monitoring
of recombinant protein products: a
comparison of current technologies. Trends
in Biotechnology 20:149-156.
-- M.Charles & J. Wilson (1999) Fermeter
Design, pp.1157-1189 in Encyclopedia
of Bioprocess Technology: Fermentation,
Biocatalysis, and Bioseparation,
M.C.Flickinger * S.W. Drew eds, John Wiley
& Sons, Inc. NY.
-- S.-O.Enfors et al. (2001) Physiological
responses to mixing in large scale
bioreactors. J Biotechnol 85:175-185.
-- R.J. Pugh (1996) Foaming, foam films,
antifoaming and defoaming. Adv Colloid
Interface Science 64:67-142.
-- R.S.Senger & M.N. Karim (2003) Biotechnol.
Prog. 19:1199-1209.
-- C.E.Joosten & M.L.Shuler (2003) Biotechnol.
Prog. 19: 739-749.
-- F.Bylund etl a. (2000) Biotechnol Bioeng.
69:119-128.
-- T. Schweder et al. (1999) Biotechnol Bioeng.
65:151-159.
-- J. Zanghi et al. (1999) Biotechnol Bioeng.
64:108 119.
-- R. Kimura & W.M. Miller (1996) Biotechnol
Bioeng. 52:152-160.
-- P.E.Cruz et al (1998) Biotechnol Bioeng. 60:
408 418.
-- N.H. Simpson (1998) Biotechnol. Bioeng.
59:89-98.

Farmespaa INDUSTRIAL

NOVIEMBRE/DICIEMBRE13