Entomopatogenos

2012 Volumen 4, No.
8
Revista Cientfica de la Universidad Autnoma de Coahuila
CONTROL DE INSECTOS-PLAGA EN LA AGRICULTURA UTILIZANDO

HONGOS ENTOMOPATOGENOS: RETOS Y PERSPECTIVAS
Marily Gonzlez-Castillo, Cristbal No Aguilar y Ral Rodrguez-Herrera*
1
Departamento de Investigacin en Alimentos. Universidad Autnoma de Coahuila. Blvd. V. Carranza
esquina Ing. Jos Crdenas V. s/n. Col. Repblica Ote. Saltillo 25280, Coahuila* rrh961@hotmail.com
RESUMEN
El manejo de insectos plaga generalmente se ha realizado por medio de agentes pesticidas que entre otras cosas
son txicos y contaminan el ambiente. Por este motivo en el presente documento se aborda la importancia de
implementar nuevas estrategias de control de plagas a travs del uso de microorganismos entomopatgenos,
resaltando el empleo de hongos como grupo mayoritario y ms comnmente empleado para este fin.
Introduccin
En la actualidad la produccin de alimentos enfrenta el reto de mantener un alto nivel de calidad, considerando
aspectos de inocuidad alimentaria y sistemas de produccin con retribucin ms justa para los productores (Garca
y Gonzlez, 2010). En Mxico son frecuentes e importantes los daos que causan plagas tan conocidas como el
gusano cogollero del maz, la mosca de la fruta, el picudo del algodonero y del manzano, las araas rojas, las
mosquitas blancas, las chicharritas o los pulgones que atacan a las plantas cultivadas (Alatorre y col., 2000). Para
controlar este tipo de insectos se ha tenido que recurrir al uso de plaguicidas qumicos sintticos tales como los
clorados, organofosforados y piretroides, los cuales fueron exitosos en el control de plagas en sus inicios,
minimizando las prdidas de las cosechas. Sin embargo, como consecuencia de su uso inadecuado e
indiscriminado, pronto aparecieron problemas de resistencia de los insectos hacia estos productos, as como un
rpido crecimiento de las poblaciones de plagas secundarias y alteraciones ecolgicas, causando efectos
indeseables en el medio ambiente y en la salud del ser humano. Esto ha ocasionado la prohibicin o restriccin de
muchos insecticidas como el dieldrn, mirex, BHC, paratin etlico, toxafeno y DDT (Morales y col., 2009). Con el fin
de minimizar estas consecuencias desfavorables, se ha propuesto disminuir el uso de los plaguicidas
convencionales y desarrollar nuevas estrategias para un Manejo Integrado de Plagas (MIP), principalmente por
medio del control biolgico siendo este un mtodo de control de plagas ms racional y respetuoso con el medio
ambiente y acordes con la filosofa de desarrollo sustentable (Badii y col, 2006).
El MIP es una alternativa para disminuir la dependencia en el uso de insecticidas qumicos sintticos. Se basa en las
prcticas culturales con orientacin al control de plagas, la capacidad que tienen las plantas para tolerar o resistir
sus daos y la accin de los factores naturales de mortalidad de las mismas, como lo son los parasitoides,
depredadores y patgenos de insectos-plagas. Estas tres ltimas son la alternativa de control ms usada para
sustituir el uso inadecuado de los insecticidas (Alatorre y col., 2000).
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2012 Volumen 4, No. 8

INSECTOS
NSECTOS PLAGA QUE ATACAN LOS CULTIVOS EN MXICO
Existen ms de 100 especies de insectos atacando los cultivos en Mxico, a continuacin se describirn solo tres de
los ms importantes.
El gusano cogollero del maz, Spodoptera frugiperda (Lepidptera: Noctuidae),

), es una de las principales plagas
que atacan a los cultivos del maz, puede ocasionar una reduccin en la produccin que va desde un 20 % hasta la
prdida total del cultivo desde las primeras etapas de desarrollo de la planta e incluso cuanto ste se encuentra en
pocas de floracin (Del Rincn y col.,., 2006). Este insecto hace raspaduras sobre las partes tiernas de las hojas,
que posteriormente aparecen como pequeas reas traslcidas; una vez que la larva alcanza cierto desarrollo,
empieza a comer follaje preferentemente en el cogollo y al des
desplegarse,
plegarse, las hojas muestran una hilera regular de
perforaciones a travs de la lmina o bien reas alargadas comidas (figura 1) (Soto, 2008).
Figura 1.- Dao causado por Sodoptera frugiperda en cultivos de maz (Soto, 2008).
La mosca blanca, Bemisia tabaci o Trialeurodes vaporariorum es un insecto plaga, perteneciente al orden
Homoptera. Los cultivos que se ven ms afectados por este insecto son: las plantas del tomate, chile, pepino, frijol y
tabaco. Los daos que ocasionan comienzan cuando la mosca se instala en el envs de la hoja hospedante y tanto
en estado adulto como larvario, comienzan a nutrirse de ella y deterioran el crecimiento de la misma. Debido a su
facilidad para desplazarse de una planta a otra, e introducir su aparato bucal, llega a ttransmitir
ransmitir enfermedades vrales
e incluso por su excremento, que forma una lmina pegajosa y produce el desarrollo de hongos (Alas Marroqun,
2000; Gonzlez, 2009).
El picudo del manzano, Amphidees latifrons,

latifrons es un escarabajo de hbitos nocturnos, altamente destructivo. Las
hembras ovipositan los huevecillos dentro de las yemas de los rboles, al eclosionar emergen larvas muy voraces
que consumen todo el tejido celular, posteriormente hacen un agujero y caen al suelo enterrndose y comiendo
races del mismo rbol hasta completar todo su ciclo larvario. Despus el insecto pasa al estado pupal, naciendo los
adultos en la primavera, los cuales suben de regreso al rbol para comer las hojas haciendo mordeduras en forma
de U hasta el otoo, en los meses de noviembre a febrero en la ausencia de hojas, atacan las yemas vegetativas y
florales causando anillamientos y la muerte de la rama del rbol (Dvila, 2007).
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CONTROL BIOLGICO
El estudio y aplicacin del control biolgico en Mxico tiene una larga historia. Diferentes autores han tratado de
documentar en diversas pocas el desarrollo de las actividades del control biolgico como disciplina cientfica y
estrategia fundamental en el manejo integrado de plagas (Rodrguez y Arredondo, 2007). Los insecticidas biolgicos
se usan en Mxico desde hace 56 aos, pero su aplicacin se incremento significativamente desde 1990 (Morales y
col., 2009). El Control Biolgico es parte muy importante del MIP, ya que adems de cuidar y reforzar la accin de
los agentes que normalmente estn presentes en el ecosistema (Alatorre y col., 2000) se desarrolla la manipulacin
deliberada de parasitoides, depredadores y patgenos de las especies plaga dentro del agrosistema, diseada o
proyectada para reducir la poblacin plaga a un nivel que no produzca daos econmicamente importantes (Badii y
col, 2006). A partir del uso de insectos entomfagos para el control de insectos plaga, el control biolgico se ha
extendido al uso de una amplia gama de organismos para el control de insectos. Entre los organismos ms
utilizados como agentes de control se incluyen virus, bacterias y sus toxinas, hongos y otros microorganismos
patgenos. Estos organismos generalmente tienen como efecto la muerte directa de la especie de insecto que
atacan o actan como antagonistas inhibiendo el desarrollo de otros microorganismos mediante sustancias que
excretan (Rodrguez y Arredondo, 2007).
MICROORGANISMOS UTILIZADOS EN EL CONTROL BIOLGICO DE INSECTOS PLAGA
Hasta el momento solo se conocen 3 especies de bacterias con posibilidad de ejercer control sobre insectos:
Bacillus thuringiensis, Bacillus sphericus, y Bacillus popilliae. Sin embargo, estas especies presentan algunas
subespecies y muchas razas que durante su proceso de esporulacin producen cristales protecos con efecto
insecticida y/o algunas toxinas con el mismo efecto. Estas bacterias han sido encontradas colonizando insectos de
los rdenes Dptera, Ortptera, Hymenptera y Coleptera. Destaca el empleo de Bacillus thuringiensis para el
control de larvas de lepidpteros que atacan a plantas agrcolas y forestales.
Las familias de virus ms comunes en el control de plagas son: Baculoviridae, virus de la poliedrosis nuclear que
ataca Lepidpteros e himenpteros; Reoviridae, virus de la poliedrosis citoplasmtica que ataca Lepidpteros y
Dpteros; y Poxviridae virus entomopox que ataca Lepidpteros y Colepteros. De los virus entomopatgenos, los
baculovirus son los ms utilizados con fines de control biolgico, debido a que tienen un rango de hospedantes
limitado a algunas especies de Lepidpteros, Hymenpteros, Dpteros, Colepteros y Tricpteros. Se han
encontrado hasta 450 especies de virus patgenos de insectos y caros (Badii y col, 2006).
Particularmente, los hongos han sido una de las mejores alternativas para el control de plagas en los ltimos aos.
Ms de 750 especies de hongos se han documentado infectando insectos (National Academy of Sciences 1979).
Entre los hongos ms utilizados como insecticidas biolgicos se incluye a Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin y
Metarhizium anisopliae (Metchnikoff) Sorokin (Monzn, 2001; Rodrguez y Arredondo, 2007). Aproximadamente el
80% de las enfermedades que se producen en los insectos tienen como agente causal un hongo (Badii y col, 2006).
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Los hongos entomopatgenos poseen caractersticas muy especiales que les permiten sobrevivir en forma
parastica sobre los insectos y en forma saprofita sobre material vegetal en descomposicin. El crecimiento saprofito
puede dar como resultado la produccin de conidiforos, conidias y desarrollo miceliar, lo cual permite que el hongo
pueda ser cultivado en el laboratorio utilizando tcnicas de produccin en masa de bajo costo (Alean Carreo,
2003). Prcticamente, todos los insectos son susceptibles a algunas de las enfermedades causadas por estos
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hongos (Cuadro 1).

Se conocen aproximadamente 100 gneros y 700 especies de hongos entomopatgenos. Entre los gneros ms
importantes se encuentran: Metarhizium, Beauveria, Aschersonia, Entomophthora, Zoophthora, Erynia, Eryniopsis,
Akanthomyces, Fusarium, Hirsutella, Hymenostilbe, Paecelomyces y Verticillium (Monzn, 2001).
Cuadro 1. Plagas de importancia econmica controladas mediante hongos entomopatgenos (Monzn, 2001).
Cultivo
Plaga
Hongo entomopatgeno
Caf
Broca
B. bassiana
Minador
M. anisopliae
Repollo
Plutella
B. bassiana
Pltano, algodn
Picudos
B. bassiana
Arroz
Chinches
B. bassiana
Ajonjol
M. anisopliae
Caa de azcar, pastos
Salivazo
M. anisopliae
Papa
Gallina ciega
M. anisopliae
Granos bsicos
B. bassiana
HONGOS ENTOMOPATGENOS MS UTILIZADOS PARA EL CONTROL DE INSECTOS-PLAGA
Beauveria bassiana.
Este hongo ataca a ms de 200 especies de insectos de diferentes rdenes, incluyendo plagas de gran importancia
agrcola, entre las que estn la broca del caf, la palomilla del repollo y el picudo del pltano (Monzn, 2001). El
gnero Beauveria est compuesto por varias especies: B. bassiana, B. brongniartii B. tenella, B. amorpha y B.
velata, sin embargo las ms frecuentemente estudiadas son B. bassiana y B. brongniartii (Alean Carreo, 2003).
La colonia de Beauveria en PDA a los 14 das es algodonosa a polvorienta, blanca y a medida que va pasando el
tiempo se vuelve amarillenta y cremosa. El revs es de color rojizo al centro y amarillento alrededor (figura 2). Se
caracteriza por presentar conidiforos sencillos, aproximadamente de 1-2 de dimetro (Caedo y Ames, 2004),

estn irregularmente agrupados o en grupos verticilados, en algunas especies hinchados en la base y

adelgazndose hacia la porcin que sostiene la conidia, la cual se presenta en forma de zig-zag, despus de que
varias conidias se producen; las conidias son hialinas, redondeadas a ovoides y unicelulares (Alean Carreo, 2003),
midiendo aproximadamente de 2 a 3 X 2 a 2.5 (Caedo y Ames, 2004).
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Figura 2.- Morfologa macroscpica (A: Echeverra, 2006) y microscpica (B: Luque, 2011.) de Beauveria bassiana.
Metarhizium anisopliae
Este hongo entomopatgeno ataca naturalmente ms de 300 especies de insectos de diversos rdenes. Algunas
plagas que son afectadas por este hongo son la salivita de la caa de azcar (Aeneolamia varia), y chinches plagas
de diversos cultivos. Los insectos muertos por este hongo son cubiertos completamente por micelio, el cual
inicialmente es de color blanco pero se torna verde cuando el hongo esporula (Monzn, 2001).
Presenta una colonia pegada al medio, completamente redonda, de colores olivceo, amarillento, verdoso, marrn
oscuro, dependiendo del aislamiento, con un revs incoloro a marrn, a veces verdoso citrino (figura 3). Los
conidiforos nacen del micelio y son irregularmente ramificados con dos a tres ramas en cada septo, miden de 4 a
14 de longitud x 1.5 a 2.5 de dimetro. Las filides son cilndricas en forma de clava, adelgazados en el pice,
miden de 6 a 13 de longitud y de 2 a 4 de dimetro. Las conidias son unicelulares, cilndricas y truncadas,
formadas en cadenas muy largas, hialinas a verde olivceo, miden de 3.5 a 9 de longitud x 1.5 a 3.5 de dimetro
(Caedo y Ames, 2004).
Figura 3.- Morfologa macroscpica y microscpica de Metarhizium anisopliae (Pik-Kheng y col., 2009).

Nomuraea rileyi
Este hongo ataca ms de 32 especies de insectos de los rdenes Coleoptera, Lepidoptera y Orthoptera. Con mayor
frecuencia se encuentra atacando lepidopteros, por ejemplo Spodoptera en maz. El cuerpo de los insectos muertos
por este hongo presentan un micelio blanco, que puede tornarse verde con la esporulacin (Monzn, 2001).Posee
conidiforos muy complejos que se ramifican a intervalos regulares que se levantan erectos y muy densamente
agrupados para dar lugar a conidios verdes muy plido que con el tiempo cambian a tonalidades hasta verde
malaquita (figura 4). Las hifas son lisas y hialinas. Los conidiforos son cortos y anchos, las filides son redondas,
cilndricas a globosas con una base muy ancha (Elsegui, 2006).
Figura 4.- Morfologa macroscpica (A: Aguirre N. 2006) y microscpica (B: Edelstein y Trumper, 2005) de
Nomuraea rileyi.
Paecilomyces fumosoroseus
Se han reportado como mnimo cinco especies de Paecilomyces infectando ocho insectos diferentes. Las
infecciones causadas por P. fumosoroseus se reconocen por el color rosado plido mientras que en P. lilacinus son
de color violeta claro. La especie ms importante del gnero es Paecilomyces fumosoroseus (Alean Carreo, 2003).
Sus colonias son inicialmente de color blanco en medio PDA, luego adquieren el tinte rosado caracterstico. El revs
de la colonia es al comienzo ligeramente amarillento, pero a medida que pasa el tiempo se vuelve de color
anaranjado intenso (Caedo y Ames, 2004).
Paecilomyces fumosoroseus (figura 5) presenta hifas hialinas a amarillosas, septadas, de paredes delgadas. La
mayora presenta ramificaciones verticiladas o irregularmente ramificadas, llevan en su parte terminal en cada rama
grupos de filides, las cuales pueden ser tambin solitarias, stas constan de una porcin basal cilndrica o
hinchada, adelgazndose abruptamente a menudo para formar un cuello muy notorio, miden de 5 a 7 de largo x
2.5 a 3 de dimetro, que se reduce a 0.5 en el extremo superior. Los conidiforos alcanzan hasta 100 de largo x
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1.5 a 3 de dimetro. Las conidias son hialinas, unicelulares y de forma ovoide, miden de 3 a 5 x 1 a 2 y se
observan agrupadas en cadenas largas (Carreo, 2003; Caedo y Ames, 2004).
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Figura 5.-Morfologa macroscpica (A) y microscpica (B) de Paecilomyces fumosoroseus (Carreo, 2003).
Verticillium lecanii.
Este hongo se encuentra frecuentemente atacando fidos y escamas en zonas tropicales y subtropicales. Adems
ha sido encontrado sobre insectos del orden Coleoptera, Diptera, Hymenoptera y sobre caros. Los insectos
infectados por este hongo tienen una apariencia blanquecina (Monzn, 2001). El hongo en medio PDA presenta un
color blanco amarillento compacto y revs amarillo intenso (figura 6). Los conidiforos de las especies de
Verticillium son poco diferenciados de las hifas vegetativas, las clulas conidigenas (filides) estn en forma de
verticilios de dos a seis, en parejas o solitarias sobre hifas o apicalmente sobre cortas ramificaciones, miden de 11 a
30 de largo x l.5 a 2 de dimetro, son ligeramente anchos en la base y van adelgazando hacia la punta. Las
conidias de Verticillium lecanii son pequeas, hialinas cilndricas o elipsoidales y redondeadas en sus extremos
midiendo de 2 a 4 x 1 a 1.5. Son uniformes en cuanto a forma y tamao dependiendo del aislamiento. Estas
conidias nacen en forma de gotas filamentosas o en cadenas (Carreo, 2003; Caedo y Ames, 2004).
Figura 6.- Morfologa macroscpica (A) y microscpica (B) de Verticillium lecanii (Carreo, 2003).

MECANISMO DE INFECCIN DE HONGOS ENTOMOPATGENOS
En forma general los hongos presentan las siguientes fases de desarrollo sobre los hospederos: germinacin,
formacin de apresorios y estructuras de penetracin, colonizacin y reproduccin del patgeno. El inoculo o unidad
infectiva est constituida por las
as estructuras de reproduccin sexual y asexual, es decir las esporas y conidias
(Monzn, 2001). El inicio de la infeccin se realiza por germinacin de las esporas del hongo sobre el tegumento del
insecto plaga. La dispersin de las esporas se realiza por contaminacin ambiental a travs del viento, suelo, la
lluvia e incluso insectos enfermos al entrar en contacto con otros sanos ((Giraldo, 2009).
Las caractersticas fsicas y qumicas de las superficies de la cutcula del insecto y la espora son las responsables
de esta unin, algunas glicoprotenas pueden servir como un receptor especfico para las esporas (Tanada y Kaya
1993). Luego se produce un tubo germinativo y un apresorio, con ste se fija en la cutcula y con el tubo germinativo
o haustorio (hifa) se da la penetracin al cuerpo del insecto (figura 7). Aqu participa un mecanismo fsico y uno
qumico, el primero consiste en la presin ejerci
ejercida
da por la estructura de penetracin, la cual rompe las reas
esclerosadas y membranosas de la cutcula. El mecanismo qumico consiste en la accin enzimtica, principalmente
por proteasas, lipasas y quitinasas, las cuales causan descomposicin del tejido eenn la zona de penetracin, lo que
facilita el proceso (Monzn, 2001).
). Despus de sta fase se inicia el proceso de colonizacin, en el cual la hifa sufre
un engrosamiento y se ramifica en la cavidad general del cuerpo. A partir de ese momento se forman pequeas
pequ
colonias del hongo y otros cuerpos hifales (blastosporas), sin embargo no ocurre gran crecimiento hifal antes de la
muerte del insecto (Giraldo, 2009).
Figura 7.-Estructura
Estructura y composicin de la cutcula de insectos y forma de penetracin de hongos entomopatgenos
entomopatgenos
(Montesinos, 2008).
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Otra forma mediante la cual el hongo puede causar la muerte del insecto, es mediante la produccin de toxinas. Los
hongos entomopatgenos tienen la capacidad de sintetizar toxinas que son utilizadas en el ciclo de la relacin
patgeno- hospedante. Entre estas toxinas destacan las dextruxinas (demetildextruxina y protodextruxina) ya que su
modo de accin tambin inhibe la sntesis de ADN, ARN y protenas en las clulas de los insectos (Pucheta y col.,
2006); adems son sustancias de baja toxicidad, pero de mucha actividad txica sobre insectos, caros y
nematodos (Monzn, 2001; Giraldo, 2009).
La muerte del insecto se produce con mayor rapidez cuando es afectado por un hongo que produce cantidades
considerables de toxinas, ya que se adiciona la toxemia a la destruccin de los tejidos y a las deficiencias
nutricionales. Los individuos enfermos no se alimentan, presentan debilidad, desorientacin y cambian de color,
presentando manchas oscuras sobre el tegumento, que corresponden con las esporas germinadas del hongo (Alean
Carreo, 2003; Caedo y Ames, 2004; Giraldo J. 2009). Con la muerte del insecto termina el desarrollo parastico
del hongo y empieza la fase saproftica: el hongo crece en el hemocele formando masas miceliares que salen al
exterior fundamentalmente por las regiones intersegmentales, esporulando sobre el cadver y produciendo inculo
para infectar a otros insectos y por las aberturas naturales: espirculos, boca y ano (Caedo y Ames, 2004).
Normalmente, los hongos entomopatgenos son de accin lenta. Pero estos productos dependen generalmente de
las condiciones ambientales de temperatura y de elevada humedad relativa para que su desarrollo y accin
patgena sea la adecuada. Generalmente tardan una semana como mnimo en eliminar a la vctima o al menos en
que esta deje de alimentarse. Son adecuados para su aplicacin por introduccin, manipulacin ambiental o
aumento inoculativo (Giraldo, 2009).
RETOS DEL USO DE MICROORGANISMOS PARA EL CONTROL BIOLGICO
El desarrollo de productos basados en microorganismos para su uso como bioinsecticidas implica numerosas
pruebas de laboratorio y de campo, para confirmar su presencia natural del microorganismos en el medio ambiente,
su virulencia, factores medioambientales y su correcta identificacin (Arredondo, 2007). Dentro de los agentes
entomopatgenos se incluyen principalmente hongos, bacterias y virus, por su disponibilidad en el mercado, adems
de nematodos y protozoos en menor proporcin (Dufour, 2001). Estos microorganismos por lo general, se
caracterizan por su escasa toxicidad sobre otros organismos del ambiente, su aptitud para ser tratados de forma
industrial, es decir, que se cultivan, formulan, empaquetan, almacenan y se comercializan como un insecticida
convencional. Estos insecticidas biolgicos penetran en el insecto plaga por ingestin y por contacto en el caso de
los hongos (Badii y col, 2006; Giraldo, 2009). Los hongos entomopatgenos tienen un gran potencial para ser
empleados como biocontroladores (Caedo y Ames, 2004). Por ejemplo, los gneros Beauveria sp, Metarhizium
sp y Paecilomyces sp tienen un amplio uso y aceptacin por su especificidad y efectividad como insecticidas
biolgicos (Caedo y Ames, 2004; Morales y col., 2009; Garca y Gonzlez, 2010). Se suelen comercializar en
preparados a base de esporas (Giraldo, 2009).
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Los hongos entomopatgenos presentan grados variables de especificidad, pueden ser especficos a nivel de familia
o especies muy relacionadas. En el caso de las cepas, pueden ser especficas a nivel de especie, sin afectar a los
enemigos naturales (Alean Carreo, 2003; Caedo y Ames, 2004). Si el entomopatgeno encuentra las condiciones
adecuadas para introducirse y colonizar un ecosistema, se reproduce y renueva en forma continua, es decir, se
vuelve persistente, haciendo innecesarias nuevas aplicaciones. Se pueden aplicar mezclas de hongos
entomopatgenos con dosis subletales de insecticidas para lograr efectos sinrgicos superiores a los logrados con
aplicaciones de cada producto por separado. Cuando el hongo no llega a causar la muerte directamente, se
presentan efectos secundarios que alteran el desarrollo normal del ciclo de vida del insecto plaga (Caedo y Ames,
2004).
PERSPECTIVAS DEL USO DE HONGOS ENTOMOPATOGENOS PARA EL CONTROL DE INSECTOS-PLAGA
El aislamiento consiste en la obtencin del hongo a partir de la fuente de inoculo, la cual puede ser insectos, plantas,
suelos o medios artificiales como PDA o de preservacin en seco como la slica gel. A partir del aislamiento del
hongo se procede a la inoculacin de un medio de cultivo, para la obtencin de un cultivo puro. Por tal razn se
debe tener la seguridad de que el hongo aislado corresponde al de inters, adems ste debe estar libre de
contaminantes. El aislamiento de hongos entomopatgenos puede hacerse de dos maneras: por dilucin seriada y
de forma directa.
El aislamiento por dilucin seriada consiste en colocar un insecto infectado por hongos y esporulado en un
recipiente que contiene 10 ml de agua destilada estril con 0,1% de Tween 80. Como resultado se obtiene una
suspensin concentrada del inoculo. A partir de esta solucin, se preparan diluciones en serie (10-1, 10-2, 10-3, 10- 4,
10-5, 10-6). Para realizar la siembra y obtener los cultivos del hongo se deben usar las ltimas diluciones (10-4, 10- 5,
10-6). El aislamiento directo consiste en la obtencin del hongo a partir del cuerpo del insecto, pasndolo luego a un
medio nutritivo. Debido a que las muestras que se toman del insecto pueden estar sucias y contaminar el
aislamiento se recomienda hacer una desinfeccin externa del insecto con hipoclorito de sodio (3-5 %),
enjuagndose con agua destilada estril. Este tipo de aislamiento puede ser de dos formas: raspando partculas del
hongo en un insecto desinfectado, utilizando un asa bacteriolgica y pasndola en un medio nutritivo o bien con una
pinza seca y estril se toma el insecto esporulado desinfectado y se agita con movimiento verticales y horizontales,
sobre la superficie del medio de cultivo (Monzn, 2001).
El aislamiento de hongos de suelos cultivados generalmente se realiza haciendo un muestreo del rea de cultivo
seleccionada, se toma alrededor de 0,5 Kg de suelo de los primeros 10-20 cm de profundidad y con una distancia de
5 m entre cada una de ellas. Las submuestras se mezclan y se toma una muestra final de 0.5 Kg. El suelo se debe
colocar en bolsas de plstico, mantenindose a la sombra durante el traslado al laboratorio. En las muestras de
suelo se colocan insectos trampa preferentemente aquellos que son altamente susceptibles a especies de hongos y
nematodos entomopatgenos. Las larvas del insecto trampa se recuperan del suelo y se desinfectan
superficialmente en hipoclorito de sodio al 1 %, se enjuagan en agua destilada estril; se remueve el exceso de y se
colocan en cajas de Petri con una capa doble de papel filtro, con el fin de producir una humedad relativa elevada y
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para favorecer el desarrollo de los hongos y se incuban. Los hongos que se desarrollan sobre la superficie de las
larvas se aslan y se procede a su identificacin (Gaitn, 2003; Quesada y col., 2007).
Tradicionalmente, la identificacin de hongos se basa en mtodos fenotpicos como son: la morfologa de las
esporas (conidios) e hifas, o bioqumicos, como el perfil de protenas extracelulares, los cuales son influenciados
grandemente por la interpretacin y dependen de un alto grado de especializacin del analista y del ambiente. Las
caractersticas morfolgicas que se utilizan para la identificacin de hongos son el tipo de crecimiento, forma y
tamao de la espora y tipo de estructuras reproductivas, lo cual muchas de las veces resulta insuficiente para la
identificacin certera a nivel de especie (Carrillo, 2003). La caracterizacin molecular, consiste especficamente en
diferenciar individuos de inters segn sus variaciones o polimorfismos en el ADN. Estos polimorfismos pueden
darse debido a dos tipos de cambios principalmente: cambios en las bases nitrogenadas por adicin, transicin,
traslocacin o delecin, y reorganizaciones en la secuencia del ADN (Luna y col., 2001). Con el desarrollo de
tcnicas ms especficas basadas en las diferencias en la informacin o configuracin gentica, ha sido posible
aminorar estos errores, y brindar informacin ms exacta y reproducible (Echeverra, 2006). El principal argumento a
favor del uso de caracteres moleculares es que son universales. Existen genes presentes en todos los genomas
celulares como los ribosomales, que pueden proveer de informacin para reconstrucciones filogenticas, donde los
caracteres morfolgicos son inaplicables (Ochoa, 2008).
Las regiones que codifican para el RNA ribosmico (rDNA) (Iturralde, 2005) se pueden encontrar en mitocondrias,
cloroplasto y ncleo, y contiene la informacin para el RNA que conforma los ribosomas, por lo que es informacin
que se transcribe pero no se traduce (Rentara 2007). La principal razn para el estudio de rDNA es que es un gen
multicopia que contiene regiones que no codifican para protenas, y que estas copias estn repetidas en tndem,
facilitando as su amplificacin (Calle, 2005). En el DNA ribosmico existen fragmentos con distinto grado de
conservacin de una longitud cercana a 6Kb, lo que permite realizar estudios evolutivos a nivel de gneros y familias
y suelen usarse para el diseo de iniciadores universales. La regin del rDNA en eucariotes incluye el gen 18S
(tambin denominado small sub unit, SSU), el espaciador intergnico ITS1, el gen 5.8S, el espaciador ITS2 y el gen
28S (tambin denominado large sub unit, LSU). Las regiones 18S, 5.8S, 28S estn relativamente conservadas entre
los hongos, facilitando una base molecular para buscar relaciones filogenticas a diferentes niveles. El tamao
pequeo del gen 5.8S limita su utilidad en comparaciones filogenticas (Ochoa, 2008).
La amplificacin por PCR y la posterior secuenciacin del gen 18S rDNA para la caracterizacin de hongos presenta
una serie de ventajas como son: est presente en todos los organismos y tiene la misma funcin en todos ellos;
debido a restricciones estructurales, diferentes regiones de la molcula presentan distinto grado de variabilidad en
secuencia, lo que permite realizar comparaciones con diferente nivel de resolucin; su transmisin es principalmente
vertical ya que se considera que no est sujeto a transferencia gnica horizontal entre microorganismos; la longitud
de su secuencia tiene un tamao adecuado como para proporcionar suficiente informacin, con un coste asumible, y
el anlisis de la secuencia permite realizar reconstrucciones filogenticas de los microorganismos (Nogales, 2005).
52

Por otra parte, los hongos presentan sensibilidad a la variacin de las condiciones climticas como temperaturas
extremas, desecacin y luz ultravioleta (Alean Carreo, 2003; Caedo y Ames, 2004). Estas limitantes pueden ser
contrarrestadas mediante el uso de aditivos (protectores solares, aceites y anti-desecantes). Por lo tanto, requieren
de condiciones de almacenamiento ms exigentes que las molculas inorgnicas, para evitar que pierdan su
patogenicidad. En general, los insecticidas biolgicos no matan instantneamente pero alcanzan buenos niveles de
control entre una y tres semanas despus de la aplicacin, dependiendo de la plaga y del ambiente. Aunado a esto,
el insecto deja de ser plaga al ser parasitado por el hongo, ya que deja de alimentarse mucho antes de morir,
disminuyendo el dao al cultivo (Caedo y Ames, 2004).
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