Manual de Laboratorio de Inmunologia Basica y Clinica

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Manual de Laboratorio de Inmunologa

Bsica y Clnica
Aurora Martnez Romero
Jos Luis Ortega Snchez
Libro electrnico Manual de Laboratorio de Inmunologa Bsica y Clnica.

2011
A esta obra le ha sido
emitida los Derechos de
Autor por la Secretara de
Educacin
Pblica
del
Instituto
Nacional
del
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N de Registro 03-2009111713215700-14
Se publica en Abril de 2011 como un suplemento de

REDVET Revista electrnica de Veterinaria
(http://www.veterinaria.org/revistas/redvet) con n
ISSN 1695-7504 por la editorial Veterinaria
Organizacin
S.L.
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Inscrita en el BORME de Espaa con el nmero 2001/0175466 en el
Grupo Servicios, sector Veterinarios. Copyright veterinaria.org 19962011.
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veterinaria.org http://www.veterinaria.org info@veterinaria.org
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Autores
Dra. en C. Aurora Martnez
Romero. Divisin de Estudios
de Postgrado e Investigacin de
la
Facultad
de
Ciencias
Qumicas. Universidad Jurez
del Estado de Durango. Gmez
Palacio,
Durango.
Mxico.
quimicaaurora@hotmail.com
C. Dr. en C., M.S.P. Jos Luis

Ortega Snchez. Unidad Regional
Universitaria
de
Zonas
ridas.
Universidad
Autnoma
Chapingo.
Bermejillo,
Durango.
Mxico.
jlortega@chapingo.uruza.edu.mx
Manual de Laboratorio de Inmunologa Bsica y Clnica 2011 est protegido por los Derechos de Autor por la
Secretara de Educacin Pblica del Instituto Nacional del Derecho de Autor con el N de Registro 03-2009111713215700-14. Se publica en Abril de 2011 como un suplemento de REDVET Revista electrnica de Veterinaria
(http://www.veterinaria.org/revistas/redvet) con n ISSN 1695-7504 por la editorial Veterinaria Organizacin S.L.
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Veterinarios. Copyright veterinaria.org 1996-2011.
INDICE
Presentacin.................................................................................................................................................. 7
Introduccin ................................................................................................................................................. 8
Manejo, transporte y almacenamiento de materiales en el laboratorio de Inmunologa ........ 9
Prcticas generales de seguridad y bioseguridad en el laboratorio..................... 100
Reglamentos ........................................................................................................ 100
Normas de Seguridad especficas de las prcticas ................................................ 10
Manejo de residuos peligrosos biolgico infecciosos (RPBI).................................. 13
Los residuos peligrosos biolgico infecciosos (RPBI) ........................................................................13
Cuadro de Competencias........................................................................................... 14
Mapa del sistema de prcticas de Inmunologa. Estructura y programa del sistema de
rcticas....................................................................................................................... 14
Contenido de cada prctica en particular ............................................................... 1616
PRACTICA NO. 1...................................................................................................................................... 17
ANIMALES DE EXPERIMENTACIN........................................................................ 17
Posicin de las inyecciones: a) intravenosa b) intraperitoneal ................................... 19
PRACTICA NO. 2...................................................................................................................................... 25
DILUCIONES ............................................................................................................. 25
PRCTICA NO. 3.................................................................................................................................... 300
MTODO DE OUCHTERLONY ................................................................................. 30
REACCIONES DE INMUNODIFUSIN ..................................................................... 30
PRCTICA NO. 4...................................................................................................................................... 34
DETERMINACIN DE INMUNOGLOBULINAS SRICAS ........................................ 34
1 PRUEBA DE PRECIPITACIN DEL SULFITO DE SODIO .............................. 34
2 PRUEBA DE TURBIDEZ DEL SULFATO DE ZINC ........................................... 36
3 PRUEBA DEL GLUTARALDEHDO.................................................................. 39
PRACTICA NO. 5...................................................................................................................................... 40
BRUCELOSIS: Aspectos generales y Serodiagnstico ............................................. 40
PRUEBA RAPIDA DE AGLUTINACIN EN PLACA.................................................. 45
(ROSA DE BENGALA (Card Test))............................................................................ 45
PRACTICA NO. 6...................................................................................................................................... 48

FUNDAMENTO .......................................................................................................... 48
PRACTICA NO. 7...................................................................................................................................... 53
PRIMERA PARTE ...................................................................................................... 53
AGLUTINACION ESTNDAR EN TUBO ................................................................... 53
SEGUNDA PARTE..................................................................................................... 57
AGLUTINACIN EN TUBO EN PRESENCIA DE ...................................................... 57
2-MERCAPTOETANOL ............................................................................................. 57
PRACTICA NO. 8...................................................................................................................................... 61
PRIMERA PARTE ...................................................................................................... 61
AGLUTINACIN ESTANDAR EN MICROPLACA ..................................................... 61
AGLUTINACIN EN PRESENCIA DE 2- Me EN MICROPLACA .............................. 61
SEGUNDA PARTE..................................................................................................... 64
PRACTICA NO. 9...................................................................................................................................... 67
ANTGENOS DE SUPERFICIE DE GRUPOS SANGUNEOS .................................. 67
SISTEMA ABO ........................................................................................................... 67
METODOLOGA ........................................................................................................ 68
PRACTICA NO. 10.................................................................................................................................... 71
REACCIONES FEBRILES ......................................................................................... 71
PRCTICA NO. 11.................................................................................................................................... 75
ANTIESTREPTOLISINAS .......................................................................................... 75
PRACTICA NO. 12.................................................................................................................................... 81
DIAGNOSTICO PRECOZ DEL EMBARAZO ............................................................. 81
PRACTICA NO. 13.................................................................................................................................... 85
DIAGNOSTICO SEROLGICO DE SFILIS .............................................................. 85
PRACTICA NO. 14.................................................................................................................................... 89
DETERMINACION DEL FACTOR REUMATOIDE..................................................... 89
PRACTICA NO. 15.................................................................................................................................... 97

PROCEDIMIENTO PARA LA OBTENCIN DE CLULAS MONONUCLEARES A PARTIR
DE SANGRE TOTAL POR EL MTODO FICOLL-HYPAQUE................................... 97
Viabilidad Celular.................................................................................................... 97
CONGELACIN Y DESCONGELACIN DE CLULAS MONONUCLEARES...... 98
PRACTICA NO. 16.................................................................................................................................. 101
PRUEBAS CRUZADAS ........................................................................................... 101
PRACTICA NO. 17.................................................................................................................................. 104
PRUEBA DE COOMBS............................................................................................ 104
PRUEBA DE COOMBS DIRECTA ........................................................................... 104
PRUEBA DE COOMBS INDIRECTA ....................................................................... 106
PRACTICA No. 18................................................................................................................................... 108
PODER BACTERICIDA DEL SUERO NORMAL ..................................................... 108
Glosario de trminos ................................................................................................ 111
Presentacin
Este manual de prcticas de Inmunologa se propone iniciar al estudiante en el
estudio de la inmunologa. Su contenido es terico y esquematizado, redactado
de tal manera que facilite su comprensin. Su planeacin intenta seguir el
trayecto que realiza una sustancia extraa a travs del organismo, con los
diversos mecanismos de defensa que opone a su penetracin y en algunos casos
limitar su replicacin a travs de la respuesta inmune. Se plantea la realizacin
de 17 prcticas correspondientes a la aplicacin de la inmunologa clnica,
implementadas de tal manera que el estudiante las pueda realizar sin la
necesidad de material ni equipo sofisticado, nicamente con el material necesario
para realizar las pruebas convencionales, de rutina en cualquier laboratorio de
anlisis clnicos, con fines didcticos se proporcionan a los estudiantes muestras
de fluidos corporales positivas, trabajando siempre con tica profesional, en el
manejo de este tipo de muestras.
La base para la realizacin del presente Manual fue la visualizacin de la
importancia que tiene que el estudiante de inmunologa, tenga una formacin
slida sobre su conocimiento prctico y que ingrese al mbito laboral con las
habilidades para resolver problemas en el rea de la inmunologa, adems los
estudiantes adquieren el conocimiento sobre la importancia de desarrollar su
trabajo con tica y responsabilidad, con el compromiso de otorgar a los
individuos que requieran de su servicio, la confianza de saber que cuentan con un
laboratorio comprometido con la calidad y de esta manera puedan ser partcipes
del mejoramiento de la calidad de vida de los pacientes.
Esta obra enfrenta la aplicacin de otorgar un servicio de calidad, proporcionando
diagnsticos oportunos y confiables, es de fundamental importancia para quienes
trabajamos sobre los problemas que aquejan la salud, tengamos conciencia de
ser profesionales de calidad. Este Manual de prcticas de Laboratorio de la
Ctedra de Inmunologa, representa una revisin exhaustiva destinada a la
enseanza de la inmunologa. La elaboracin de este proyecto inicia con la
construccin de las tcnicas de laboratorio implementadas en el trabajo diario de
un laboratorio clnico.
Como criterios de seleccin de las prcticas, se consider la necesidad sobre el
conocimiento de las mismas frente al desempeo en el campo laboral. Adems,
las prcticas desarrolladas en su metodologa se manejan el uso de material
accesible en nuestro laboratorio, implementado de tal manera que se puedan
aplicar en un laboratorio clnico, sin necesidad de equipo sofisticado, en donde el
principio en su aplicacin es el conocimiento del fundamento de cada uno de los
exmenes de diagnstico realizados.
La problemtica que se presenta es la necesidad de que los estudiantes procesen

muestras positivas, para esto se les adiestra a trabajar con responsabilidad,
puesto que al procesarlas estn bajo el factor de riesgo inminente de infectarse.
Es necesario trabajar con este tipo de fluidos corporales para que conozcan la
interpretacin real de los resultados que sern de suma importancia en la
orientacin al mdico tratante sobre el estado de salud de los pacientes, el
plasmar un diagnstico presuntivo certero en la hoja de reporte dar credibilidad
a nuestro desempeo como profesionales de la salud. Todo el personal
involucrado en el sector salud tiene que manejar todo el material biolgico
teniendo en mente que es potencialmente infectante. Al egresar de la carrera
tenga una slida formacin con base en sus estudios de inmunologa, para aplicar
sus conocimientos en el mundo del desempeo laboral, resolviendo problemas en
el rea de serologa o inmunologa, otorgando a los pacientes que requieran de
su servicio, otorgar un elevado nivel de competitividad en cuanto al trabajo de
calidad en su desempeo, colaborando con el equipo del personal de salud
pblica en el uso racional y oportuno de las sustancias, solamente para otorgar el
mejor servicio a los usuarios. Desarrollando con tica y responsabilidad
profesional su trabajo con el propsito de mejorar la calidad de vida del paciente.
Incluso, este manual genera el inters del alumno a incursionar en el rea de la
investigacin bsica y aplicada relacionada a las reas de la salud.
Para comprender la terminologa utilizada en inmunologa, se anexa un glosario
de trminos. Adems se recomienda al estudiante que busque la relacin entre
sus actividades diarias y conocimientos adquiridos anteriormente, para que lo
logre en ellos un aprendizaje significativo y en vez de memorizar que analicen la
terminologa utilizada en inmunologa buscando su significado etimolgico, de
esta manera lo que se estudie durante el curso jams se olvide.
Introduccin
Por definicin, la Inmunologa tiene como objetivo el estudio de los fenmenos
relacionados con la inmunidad, por inmunidad se entiende el conjunto de
mecanismos de defensa que protegen contra los microagresores que se
encuentran en el medio ambiente. Inmunologa, palabra de origen latino,
etimolgicamente significa, privilegio, exencin. Actualmente, la Inmunologa ya
no puede limitarse al estudio de los medios de lucha contra los agentes
infecciosos: su dominio, mucho ms amplio, reagrupa las diversas reacciones que
utiliza el organismo para mantener su integridad.
La Inmunologa es el estudio del mecanismo y de las consecuencias de las
modificaciones especficas producidas en un organismo por introduccin de una
sustancia llamada antgeno; se llama reaccin inmunitaria a la reactividad nueva
y especfica que el organismo adquiere despus de la introduccin de este
antgeno, tanto si se trata de un agente infeccioso como de una molcula de peso
molecular elevado o de una clula.
Es importante generar la conciencia de trabajar con calidad, para que el mdico
siempre tenga confianza en el qumico para apoyarse en l, con la certeza que se
le apoyar para poder otorgar al paciente un diagnstico definitivo. En cada
prctica se realiz un anlisis en la metodologa de trabajo e interpretacin de los
resultados obtenidos.
Se deben promover y coordinar esfuerzos de los diferentes constituyentes del
sector salud para preservar la salud, combatir las enfermedades, prolongar la
vida y estimular el desarrollo fsico, mental y social de sus habitantes. Otorgar un
servicio de calidad a la comunidad, nuestro trabajo nos respaldar y ser
nuestra carta de presentacin. Los objetivos del presente manual de prcticas
son exponer de manara clara las prcticas elementales implementadas en la
medicina cotidiana en un laboratorio de diagnstico del rea de serologa de un
laboratorio de anlisis clnicos, desarrollar habilidades y aptitudes necesarias para
el manejo adecuado de muestras biolgicas, realizar tcnicas y mtodos
inmunolgicos que apoyarn en el diagnostico certero y oportuno de
padecimientos inmunes.
Manejo, transporte y almacenamiento de materiales en el laboratorio de

Inmunologa
Se implementa un programa de eco-eficiencia, que se logra a travs de la
generacin de productos y servicios que satisfacen las necesidades humanas y
generan calidad de vida, al mismo tiempo que se reducen en forma progresiva
los impactos ambientales y el uso de recursos no renovables, reduccin de la
energa y de las emisiones txicas, aumento de la cultura del reciclaje y
durabilidad del producto/servicio, entre otros.
Se llevan a cabo estrategias de gestin ambiental, por lo que, se cuenta con
servicio de recoleccin, transporte y disposicin final de residuos biolgicoinfecciosos procedentes de las actividades relacionadas con la prevencin y
cuidado de la salud implementada en la Facultad de Ciencias Qumicas.
En las reas de laboratorio hay rtulos de informacin y los contenedores
necesarios para eliminar los residuos biolgico-infecciosos:
1. Patolgicos (Clave CRETIB (B) RPNE 1-2/03)
2. Punzocortantes (Clave CRETIB (B) RPNE 1-2/05)
3. Miscelneos (Clave CRETIB (B) RPNE 1-2/06)
Las actividades implementadas para monitorear el desempeo en el cuidado y
mantenimiento del medio ambiente son:
Capacitar al personal en el manejo adecuado de residuos biolgico-
infecciosos.
-
Inspeccionar el sitio donde se generan los residuos y los programas

de recoleccin, tipos de equipo, material y procedimientos adecuados.
Mantener los suministros de material necesario para la seleccin,
clasificacin y empaque de residuos (contenedores plsticos, bolsas, cajas de
cartn, etc.).
Monitorear que se respete la programacin
de las fechas de
recoleccin de residuos, en funcin de sus volmenes de generacin de los
mismos y realizar los ajustes y seguimientos necesarios.
Vigilar que el transporte de los residuos biolgico-infecciosos
generados sea el adecuado y bajo las normas de confinamiento para ste objeto.
Garantizar que el destino final de los residuos biolgicos generados
sea el adecuado segn las disposiciones de la Secretara de Medio Ambiente,
Recursos Naturales y Pesca (SEMARNAP).
Prcticas generales de seguridad y bioseguridad en el laboratorio.

Reglamentos
El presente manual est sustentado bajo normas oficiales mexicanas y reglamentos de los
Laboratorios de la Facultad de Ciencias Qumicas de la UJED, as como,
Normas de Seguridad especficas de las prcticas

a) Cuadro de Deteccin de Riesgos Particulares.
Tipo de peligro
Como evitarlo
Cortaduras
Utiliza guantes de asbesto y/o

acerados en caso de manejar equipo
cortante, as como solicitar al
laboratorista y/o a tu docente las
recomendaciones en el manejo del
mismo.
Descarga elctrica
Utiliza como tapete de piso un

material
aislante
(madera)
al
encender o conectar electricidad; no
tomes cables expuestos o daados
visiblemente.
Cerciorarte de la ventilacin en el
rea de trabajo (extractores) y evita
llevar a cabo la prctica en caso de
sentirte dbil y/o mareado.
Desmayo
Incendio
Lesin de los ojos
Quemaduras
Como proceder en caso de

un accidente
Si el sangrado es intenso,
aplica
presin
o
una
compresa
directamente
sobre la herida y consiga
atencin mdica. Si la
cortadura es pequea deja
que sangre un poco y lvala
con agua y jabn.
Procura que la persona
respire
aire
fresco.
acomdala de modo que su
cabeza quede debajo del
cuerpo
Procura que la persona
respire
aire
fresco.
Acomdala de modo que su
cabeza quede debajo del
cuerpo.
Cierra todas las tomas de
gas, desconecta todos los
circuitos elctricos. Usa una
manta contra el fuego o un
extinguidor para apagarlos.
Lava de inmediato el ojo con
agua corriente. No permitas
que la vctima se frote el ojo.
Apaga el equipo en caso de

sobrecalentamiento y as mismo,
desconctalo en forma inmediata. No
uses material no equipo visiblemente
daado.
Utiliza lentes protectores y toma una
distancia de medio metro o ms de
ser posible en la actividad a
desarrollar.
Utiliza guantes, camisa de manga Lava con agua fra hasta que
larga y tu bata de trabajo, tomando el la sensacin de ardor se
material y el equipo calientes con calme.
pinzas, contenedores, etc.
10
b) Cuadro de Disposicin de desechos.

Tipo de desechos
Como clasificarlos
Tipo de contenedor
Orgnicos e inorgnicos
Orgnica: cscaras de frutas, El indicado para cada caso

sobras de comida, cabello y
uas, pasto y hojas, y esto
es lo que usas para hacer la
composta.
Inorgnica: latas de aluminio
y acero, pero deben de estar
limpias. Al acabarse su
contenido, se lavan como
trastes normales y se dejan
secar.
Papel,
cartn,
envases
de
vidrio,
de
plstico.
c) Normas oficiales mexicanas.

NOM-025-STPS-1999:5.1, 5.2, 5.3: NOM-001-STPS-1999:5.5. Condiciones
de iluminacin en los centros de trabajo http://info4.juridicas.unam.mx/
NOM-017.STPS-2001:NOM-114-STPS-1994:NOM-022-STPS-1999
Sistema para la identificacin y comunicacin de riesgos para proporcionar
seguridad a los trabajadores de los centros de trabajo, como una solucin a los
problemas de riesgos de trabajo por esas sustancias.
Se considera que existe una responsabilidad general para proporcionar seguridad
a los trabajadores en los centros de trabajo. La comunicacin sobre riesgos es
una parte importante de esta responsabilidad, ya que las empresas pueden llegar
a utilizar sustancias qumicas y los trabajadores deben estar capacitados para
reconocer el riesgo potencial de los diversos productos qumicos, en los
procedimientos de operacin y saber usar el equipo de proteccin personal.
Este sistema ha sido diseado para llenar la necesidad de una comunicacin
efectiva y proporcionar informacin del uso seguro de sustancias qumicas por los
trabajadores, a travs de la capacitacin de los elementos que componen el
sistema.
La parte central de este sistema es la identificacin de los riesgos inherentes de
una sustancia:
11
NOM-002-STPS-1993 Relativa a las condiciones de seguridad para la

prevencin y proteccin contra incendios en los centros de trabajo.
http://www.dif.gob.mx/edif/sad/SGC_CHN/EXTERNOS/NOM-002-STPS1993.pdf
NOM-005-STPS-1993 Relativa a las condiciones de seguridad en los centros
de trabajo para el almacenamiento transporte y manejo de sustancias
inflamables y combustibles.
http://wwweconomia.gob.mx/work/normas/noms/kpronoman/p005stps.pdf
NOM-008-STPS-1993 Relativa a las condiciones de seguridad e higiene
para la produccin, almacenamiento y manejo de explosivos en los centros
de trabajo.
NOM-009-STPS-1993 Relativa a las condiciones de seguridad e higiene
para la produccin, almacenamiento y manejo de sustancias corrosivas,
irritantes y txicas en los centros de trabajo.
NOM-010-STPS-1993 Relativa a las condiciones de seguridad e higiene en
los centros de trabajo donde se produzcan, almacenen y manejen
sustancias qumicas capaces de generar contaminacin en el ambiente
laboral.
http://www.fabregat.com/catalogo/NOMs/NOM-010-STPS-1993.doc
NOM-028-STPS-1993 Seguridad-cdigo de colores para la identificacin de
fluidos conducidos por tuberas.
http://www.celorio.com/vapor/norma.htm
NOM-026-STPS-1993 Seguridad colores y su aplicacin.
http://www.dif.gob.mx/edif/sad/SGC_CHN/EXTERNOS/NOM-026-STPS1993.pdf
CONVENIO 170 (OIT) Convenio sobre la seguridad en la utilizacin de los
productos qumicos en el trabajo.
NOM-008-SCFI-1993 Sistema General de Unidades de Medida.
http://www.ine.gob.mx/ueajei/publicaciones/nom-008a.html
NOM-022-STPS-1999 Relativa a las condiciones de seguridad en los centros
de trabajo en donde la electricidad esttica representa un riesgo.
Electricidad esttica en los centros de trabajo. Condiciones de seguridad e
higiene.
http://www.steps.gob.mx/DGSST/normatividad/noms/Nom-022.pdf
NOM-114-STPS-1994 Sistema para la identificacin y comunicacin de
riesgos por sustancias qumicas en los centros de trabajo.
http://www.facmed.unam.mx/deptos/salud/strabajo/pdf/nom-114.pdf
12
Manejo de residuos peligrosos biolgico infecciosos (RPBI)

Los residuos peligrosos biolgico infecciosos (RPBI), son los que contienen
bacterias, hongos, virus, parsitos, microorganismos capaces de causar
infecciones, efectos nocivos para la salud y el medio ambiente.
NOM-087-ECOL-1995 Establece los requisitos para la separacin, envasado,
almacenamiento, recoleccin, transporte, tratamiento y disposicin final de los
RPBI que se generan en establecimientos que prestan atencin mdica (Diario
Oficial de la Federacin 07/11/1995). Dicha Norma es de observancia obligatoria
para los establecimientos que presten atencin mdica, tales como: hospitales,
clnicas, laboratorios clnicos, laboratorios de produccin de agentes biolgicos,
de enseanza e investigacin, tanto humanos como veterinarios en pequeas
especies y centros antirrbicos, cuando estos generen ms de 25 kg/ mes o 1
kg/da de RPBI.
http://bvs.insp.mx/artculos/2/11/06032001.pdf
Los RPBI se clasifican en:
1. Residuos de sangre y sus derivados: plasma, suero, etc.
2. Cultivos y cepas almacenadas de agentes infecciosos: vacunas, placas
de cultivo, etc.
3. Residuos patolgicos: residuos de tejidos, rganos, partes y fluidos
corporales, etc.
4. Residuos no anatmicos derivados de la atencin a pacientes y de los
laboratorios: torundas, guantes, cubrebocas, tubos, etc.
5. Residuos de objetos punzocortantes usados o sin usar: navajas,
jeringas, pipetas Pasteur, porta y cubreobjetos, etc.
El siguiente cuadro muestra el color y tipo de envase requerido para cada uno de
los tipos de RPBI:
Tipo de residuos
Sangre
Cultivos y cepas de
agentes infecciosos
Residuos
no
anatmicos
Patolgicos
Patolgicos
Objetos
punzocortantes
usados y sin usar
Estado fsico
Slidos
Lquidos
Envasado
Bolsas de plstico
Recipientes
hermticos
Color
Rojo
Rojo
Slidos
Lquidos
Bolsas de plstico
Recipientes
hermticos
Recipientes rgidos
Amarillo
Amarillo
Slidos
Rojo
13
Cuadro de Competencias
Ubicar dentro del siguiente cuadro las competencias profesionales donde se ubica
la ctedra de inmunologa, identificando los diferentes mbitos del desempeo
profesional y laboral, el contenido requerido, as como tambin, las habilidades y
actitudes que sern adquiridas durante el desarrollo de las prcticas de
inmunologa.
Competencia a
adquirir
Objetivo
Intencin o
finalidad
Contexto o
restricciones
Aplicar
Aplicar en el
laboratorio clnico
las prcticas
realizadas en el
laboratorio de
Inmunologa
Para realizar
exmenes de
diagnstico
certeros y
confiables
Utilizacin de los
laboratorios,
material y equipo
correspondiente,
en cada prctica
Rangos
(s) o
situacione
s
En los
procesos
acadmic
os,
relativos a
la
inmunolog
a bsica
Mapa del sistema de prcticas de Inmunologa. Estructura y

programa del sistema de prcticas.
El presente manual forma parte esencial de la ctedra de Inmunologa, la
cual se imparte en la Facultad de Ciencias Qumicas dentro del plan de
estudios del octavo semestre de la carrera de Qumico Farmacutico Bilogo.
Se desarrolla de manera secuencial, acorde al programa temtico de la parte
terica de inmunologa, y es parte del sistema formativo bsico de los
estudiantes de la carrera de Q.F.B.
LABORATORIO
Duracin: 6 sesiones (2
horas en cada una) que corresponden
al 33.34% del curso.
14
Competencia o unidad de
competencia
Encuadre
Semana
Prcticas
Tipo
Pre-requisitos
1.
Laboratorio
(2 horas)
Lectura de reglamento
de Laboratorio
1. Unidad
Generalidades sobre
inmunidad y medios de
defensa
2. Unidad
Clulas involucradas en el
fenmeno de fagocitosis
3. Unidad
Inmunidad celular y humoral
2.
Introduccin a la parte
prctica de la ctedra de
Inmunologa
Prctica No. 1
Animales de
experimentacin
Laboratorio
(2 horas)
Elaboracin de
cuestionario previo con
diagrama de flujo
Elaboracin de
diagrama de flujo
Elaboracin de
diagrama de flujo
Elaboracin de
diagrama de flujo
Elaboracin de
diagrama de flujo
3.
Prctica No. 2
Diluciones
Laboratorio
(2 horas)
4.
Prctica No. 3
Mtodo de Ouchterlony
Laboratorio
(2 horas)
4. Unidad
Complemento
5.
Laboratorio
(2 horas)
5. Unidad
Anormalidades del sistema
inmune e inmunidad frente a
diferentes microorganismos
6. Unidad
Autoinmunidad
6.
Prctica No. 4
Determinacin de
Inmunoglobulinas sricas
Prctica No. 5
Brucelosis: Aspectos
generales y serodiagnstico
Laboratorio
(2 horas)
7.
Prctica No. 6
Prueba de Rivanol
Laboratorio
(2 horas)
7. Unidad
Reacciones de
hipersensibilidad
8.
Laboratorio
(2 horas)
8. Unidad
Complejo Principal de
histocompatibilidad (MHC)
9. Unidad
Reacciones inmunolgicas
9.
Prctica No. 7
Primera parte. Aglutinacin
estndar en tubo
Segunda parte. Aglutinacin
en tubo en presencia de 2Mercaptoetanol (2-Me)
Primera parte. Aglutinacin
estndar en microplaca
Segunda parte. Aglutinacin
en microplaca en presencia
de 2-Mercaptoetanol (2-Me)
Prctica No. 8
Antgenos de superficie de
grupos sanguneos
Prctica No. 9
Reacciones febriles
10. Unidad
Inmunidad y terapia gnica:
beneficios y riesgos
11. Unidad
Biotica en Inmunologa
11.
Prctica No. 10
Antiestreptolisinas
Laboratorio
(2 horas)
12.
Laboratorio
(2 horas)
12. Unidad
13.
13. Unidad
14.
Prctica No. 11
Diagnstico precoz del
embarazo
Prctica No. 12
Diagnstico serolgico de
sfilis
Prctica No. 13
Determinacin del factor
reumatoide
10.
Laboratorio
(2 horas)
Laboratorio
(2 horas)
Laboratorio
(2 horas)
Laboratorio
(2 horas)
Elaboracin de
diagrama de flujo
Elaboracin de
diagrama de flujo
Elaboracin de
diagrama de flujo
Elaboracin de
diagrama de flujo
Elaboracin de
diagrama de flujo
Elaboracin de
diagrama de flujo
Elaboracin de
diagrama de flujo
Elaboracin de
diagrama de flujo
15
14. Unidad
15.
15. Unidad
16.
17.
Prctica No. 14
Procedimiento para la
obtencin de clulas
mononucleares a partir de
sangre total por el mtodo
de Ficoll-Hypaque
Prctica No. 15
Pruebas cruzadas
Laboratorio
(2 horas)
Elaboracin de
diagrama de flujo
Laboratorio
(2 horas)
Prctica No. 16
Prueba de Coombs directa
Laboratorio
(2 horas)
Poder bactericida del suero

normal
Laboratorio
(2 horas)
Elaboracin de
diagrama de flujo
Elaboracin de
diagrama de flujo
Elaboracin de
diagrama de flujo
Contenido de cada prctica en particular

Se recomienda que la cantidad de alumnos por equipo para poder trabajar
ptimamente en el laboratorio en la ctedra de Inmunologa, sea de 4 a 5 alumnos por
mesa de trabajo, para un mejor desempeo personal y participativo de cada
integrante.
En el desarrollo de las prcticas se pretende que se conceptualicen y apliquen los
trminos de respuesta inmune celular y humoral, fagocitosis, aglutinacin,
precipitacin, inmunoglobulinas, diluciones, reacciones febriles, etc., asocindolos con
la solucin de problemas enfocados a resolver problemas relacionados con la salud.
Se pretende que con el presente manual el estudiante adquiera las habilidades y
conocimientos necesarios para el buen desempeo en un laboratorio clnico y que
con el conocimiento del fundamento de cada procedimiento den un razonamiento
lgico al diagnstico presuntivo otorgado al mdico solicitante del estudio con un
espritu crtico y resolutivo frente a los problemas que se puedan enfrentar en el
ejercicio de su profesin.
16
PRACTICA NO. 1
ANIMALES DE EXPERIMENTACIN
Introduccin
La biotica tiene como objetivo conectar la reflexin tica con la investigacin
cientfica con la finalidad de construir una ciencia con conciencia al servicio
integral del hombre, la experimentacin clnica, constituye un valor en s misma
que debe ser buscado lcitamente por los cientficos y que no se contrapone con
la instancia tica en cuanto al objetivo comn de ambas que es la bsqueda de la
verdad para el hombre y para su salud. La Ley Federal de sanidad animal,
publicada el 18 de Junio de 1993 (vigente) trata la prevencin y control de las
enfermedades de los animales, la cual fija las bases para el diagnstico,
prevencin, control y erradicacin de enfermedades y plagas de los animales
terrestres, establece atribuciones de la Secretara en cuestiones de medidas
zoosanitarias. Normas oficiales para productos, subproductos animales,
productos qumicos, farmacuticos, biolgicos y alimenticios para uso en
animales o consumo por stos, as como envases y rtulos. Normas que deben
reunir los siguientes establecimientos: ferias, frigorficos, fbricas de productos o
subproductos animales para consumo humano, los que fabriquen o expendan
alimentos procesados para consumo animal y productos qumicos y
farmacolgicos para uso en animales, hospitales y clnicas vegetarianas. Desde
el punto de vista biotico, la experimentacin clnica es objetada en base al uso
de los pacientes y el investigador y puede aplicarse en varias etapas de la
investigacin: la seleccin de pacientes y su reclutamiento. La Ley Federal de
Sanidad Animal contempla los laboratorios de prueba o diagnstico en cuanto al
trato humanitario, cuidado zoosanitario y tcnicas de sacrificio.
La eleccin de especies animales se basa en diversas consideraciones. Se debe
tomar en cuenta si la especie en cuestin es susceptible a la enfermedad contra
la cual estamos elaborando el producto. Es importante, adems considerar el
costo de los animales as como el de su mantenimiento, el tamao y docilidad de
los mismos, etc. Un factor importante en bioterios (unidades en donde se cran
estos animales) y en laboratorios, es el manejo adecuado, tanto para evitar
heridas por mordeduras y araazos, etc., como para evitar el excesivo
sufrimiento de los mismos.
El manejo de estos animales vara de especie a especie. En las figuras 1-7 se
muestra el manejo adecuado de las especies ms comunes en el laboratorio. Las
especies que ms se utilizan en el laboratorio son el cobayo, ratn albino, rata
albina y el Hamster, ofrecen mayor dificultad la rata y el ratn porque al sentirse
17
capturados muerden. El cobayo y Hamster son sumamente dciles, la manera

ms fcil de tomar una rata es con una mano y de la cola y con la otra sujetar la
piel del cuello, as queda inmovilizada.
El ratn se toma boca arriba, tomando la cola con los dedos medio e ndice
(como se toma un cigarro), y rodearlo con el resto de la mano. Para inyecciones
o inoculaciones deber tomarse de la piel del dorso con el pulgar y el ndice,
sostenindolo de la cola con el meique y el anular apoyados en la palma de la
mano. El Hamster nicamente se utiliza la sujecin por la piel del dorso, ya que.
Tienen la cola muy pequea. Los cobayos no ofrecen dificultad, basta con
rodearlos por el dorso con una mano y ejerciendo poca presin porque fcilmente
se asfixian.
El uso de los animales de granja en investigacin cientfica debe estar sujeto a
las mismas consideraciones ticas que el uso de otros animales para el mismo
propsito, sin importar los objetivos cientficos del investigador ni las fuentes de
financiamiento. Los sistemas de alojamiento para los animales de granja
empleados en investigacin biomdica pueden o no ser diferentes de los usados
en investigacin agrcola. Los animales utilizados tanto en investigacin
biomdica como agrcola pueden alojarse en jaulas, pesebres, o pastizales.
Algunos estudios agrcolas necesitan condiciones uniformes para minimizar la
variabilidad medio ambiental y algunos estudios biomdicos se llevan a cabo en
circunstancias de granja. Las guas para la utilizacin de los animales en estudios
de campo preparadas por las sociedades profesionales son tiles siempre que se
adhieran a los principios humanitarios.
OBJETIVO
Aprender el manejo adecuado de los animales ms comunes de laboratorio.
METODOLOGA
1) Despus de observar el manejo de cada animal de laboratorio, tomars
cada uno de ellos y practicars su manejo, con mucho cuidado, evitando
molestar a los animales y evitar salir lesionado (Figuras 1-7).
2) Se llevar a cabo toma de muestra (venopunciones) a cada animal.
18
TECNICAS DE VENOPUNCIN (SANGRADO) E INOCULACIN

1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Venopuncin o Inoculacin intravenosa en conejos. El conejo se

inmoviliza como se muestra en la figura 2, se limpia la oreja en el
margen exterior con una torunda y agua caliente, para favorecer la
dilatacin de la arteria central; posteriormente, con una torunda se
desinfecta la zona, con la ayuda de una jeringa tipo tuberculina con
aguja delgada, se procede a tomar una muestra sangunea o
inoculacin, segn sea el caso.
Inoculacin intravenosa en ratas macho y cobayos. Anestesie al
animal en cmara de ter. Despus colquelo en posicin ventral,
localice la vena dorsal del pene y administre con una aguja delgada
la sustancia deseada.
Inoculacin intravenosa en ratn. Introduzca al ratn en un tubo
de paredes lisas y con un orificio de salida en la tapa donde se
extrae la cola. Limpie la cola con una torunda y agua caliente, para
que la vena caudal se dilate e inocule con una jeringa de tipo
tuberculina usando una aguja del 25. No debe forzarse la jeringa
en ningn momento. Para la venopuncin se procede de la misma
manera e incluso se puede cortar un pedazo de la cola.
Inoculacin o venopuncin intraperitoneal en ratn. Sujete al
animal con la mano, como se muestra en la figura 6, con la parte
ventral hacia arriba, incline la cabeza hacia abajo, con la idea de
que las viseras se desplacen hacia abajo, limpie la regin
peritoneal con una torunda y agua caliente; posteriormente, con
una torunda desinfecte la zona, con la ayuda de una jeringa tipo
tuberculina con aguja delgada, se procede a tomar una muestra
sangunea o inoculacin, al introducir la aguja debe percibir que
perfora los dos planos (piel y pared abdominal).
Inoculacin subcutnea en rata o ratn. Con la ayuda de unas
pinzas, se inmoviliza al animal por atrs de las orejas, fije las
pinzas del lado opuesto y jale la cola. Con los dedos pulgar e ndice
forme un pliegue de la piel e introduzca la guja por este pliegue.
Inoculacin con sonda gstrica. Se usa para administrar lquidos en
estmago y para eso se una aguja roma, del tipo de las que se
utilizan para anestesia raqudea en humanos. Sujete al animal con
la parte ceflica hacia arriba con el dedo ndice y medio realice
extensin del cuello e introduzca lentamente la sonda sin lastimar
al animal. No es necesario anestesiar.
Sangrado en aves. Se inmoviliza el animal como muestra la figura
1. Se sube una de las alas y abajo se localiza la vena alar, es la
vena ms irrigada y se utiliza para realizar un sangrado
exitosamente. Se limpia la zona con una rotunda y agua caliente,
19
8.
9.
10.
11.
as se estimula la dilatacin, posteriormente se desinfecta con

alcohol y se procede a tomar la muestra.
Para realizar puncin cardiaca. Anestesiar al animal, limpiar la zona
izquierda del trax , localizar el corazn y extraer lentamente la
sangre usando una jeringa con aguja del nmero 20 x 32
Sangrado de yugular. En chivos y en carneros es relativamente
fcil de realizar. Derribe al animal e inmovilcelo, crtele el pelo en
un lado del cuello y localice la yugular, limpie con benzal el rea y
ligue en la base del cuello lo que hace que se vea mejor la vena.
Corte de vena axilar. Este sangrado se puede realizar en ratn,
rata, cobayo. Se anestesia el animal, colquelo en posicin ventral
y con un bistur realice una incisin en el rea axilar, corte plexo
axilar y colecte la sangre con una pipeta Pasteur.
Plexo venoso oftlmico. Es una tcnica para obtener pequeas
cantidades de sangre en ratones y ratas. Anestesie al animal,
introduzca una pipeta Pasteur en la parte interna del ojo girndola,
despus se retira un poco para que la sangre suba por capilaridad.
INVESTIGACIN PREVIA AL EXPERIMENTO

1. Por que es importante en Inmunologa conocer el manejo de animales
de experimentacin?
2. Qu es la biotica?
3. Investiga la Ley Federal de Sanidad Animal
CUESTIONARIO PARA ANEXAR AL REPORTE
1) Que animales encontraste ms fcil de manejar, y porqu?
2) Que animales encontraste ms difcil de manejar, y porqu?
3) Realiza una lista de los animales manejados de acuerdo a su docilidad.
4) Cul es tu opinin acerca de la biotica y de la Ley Federal de Sanidad
animal? Explica
5) Para que se realiza la inmunizacin de los animales y cuales son las
prcticas de inmunizacin usando modelos en animales?
6) Cules son las especies que se usan con ms frecuencia?
20
21
22
23
Posicin de las
intraperitoneal
inyecciones:
a)
intravenosa
b)
DIAGRAMA DE
FLUJO
1.- Observar la
manipulacin
adecuada del animal
en cuestin.
Metodologa
2.- Evitar molestar

a los animales,
practicar su manejo
con mucho cuidado.
24
PRACTICA NO. 2
DILUCIONES
En el laboratorio de Inmunologa constantemente estars realizando diluciones.
Esto obedece a que, para determinar la cantidad de anticuerpos que tiene un
animal, o la cantidad de antgeno que contiene una vacuna, etc., es necesario
diluir stos hasta el punto donde ya no es posible detectar actividad. A este
proceso se le denomina titulacin, y la ltima dilucin que todava muestra
actividad se le denomina ttulo. Aunque existen muchas maneras de efectuar
diluciones, dos de ellas son las ms utilizadas. Diluciones dobles Para iniciar una
serie de diluciones dobles se mezcla una parte del lquido que se va a diluir en
una parte del diluyente (por ejemplo, una parte de suero en una parte de
solucin salina fisiolgica). A esta primera dilucin se le denomina 1:2, porque
hay en este caso, una parte de suero en dos partes de lquido. Una vez mezclado
esto se pasa una parte de la mezcla a una nueva parte de diluyente, la dilucin
ahora es de 1:4 (Figura 1). Este tipo de diluciones son las ms utilizadas en
Inmunologa, puesto que nos dan divisiones pequeas entre un tubo y el
siguiente, permitiendo as determinar con bastante exactitud el ttulo de la
muestra.
Diluciones Logartmicas: Estas diluciones se hacen de la misma manera que las

dobles, pero en este caso, la muestra se mezcla cada vez con nueve partes
(Figura 2). De esta manera se obtienen diluciones de 1:10, 1:100, 1:1000, etc.
Este tipo de diluciones no se usan mucho en Inmunologa pero en ocasiones se
recurre a ellas cuando se sospecha que el ttulo ser muy elevado, como por
ejemplo, se titulan sueros de individuos sospechosos de Leptospirosis.
El objetivo de esta prctica es aprender las tcnicas de diluciones.
25
METODOLOGA
1) En una serie de 10 tubos, pon 0.25 mide agua en cada uno.
2) Deposita 0.25 ml de colorante en el primer tubo y mezcla muy bien.
3) Con una pipeta limpia, toma 0.25 ml del primer tubo y colcalos en el segundo
tubo, mezclando bien.
4) Con una pipeta limpia, pasa 0.25 ml del segundo al tercer tubo, mezclando
bien.
5) Repite el proceso en todos los tubos.
6) Observa y anota tus resultados.
7) En una serie de 10 tubos, coloca 2.25 ml de agua en cada uno.
8) Mezcla 0.25 ml de colorante en el primer tubo.
9) Cambia de pipeta y transfiere 0.25 ml de la mezcla de colorante del primer
tubo al segundo tubo.
10) Repite el proceso en todos los tubos.
11) Observa y anota tus resultados.
Realizar una dilucin DOBLE (1:2) de cido clorhdrico (HCl) en agua, en un
volumen de 25 ml
26
Soluto
Diluyente
TOTAL
PROPORCION
1 parte de HCl
1 parte de agua
2 partes en total
VOLUMEN
12.5 ml
12.5 ml
25.0 ml
Realizar una dilucin QUINTUPLE (1:5) de cido clorhdrico (HCl) en agua, en

un volumen de 25 ml
PROPORCION
VOLUMEN
Soluto
1 parte de HCl
5 ml
Diluyente
4 partes de agua
20 ml
TOTAL
5 partes en total
25.0 ml
Realizar una dilucin 1:250 de cido clorhdrico (HCl) en agua, en un volumen de
25 ml
PROPORCION
VOLUMEN
Soluto
1 parte de HCl
0.1 ml
Diluyente
249 partes de agua
24.9 ml
TOTAL
5 partes en total
25.0 ml
De lo anterior se deduce que para obtener el volumen correspondiente a una
parte de la dilucin (parte correspondiente al soluto), bastar dividir el volumen
deseado entre el total de partes de la dilucin:
SOLUTO =
VOLUMEN TOTAL / TOTAL DE Partes de la dilucin
Posteriormente se multiplicar el valor de una parte por el nmero de partes

que ocupa el diluyente, para determinar el volumen del mismo:
DILUYENTE = Valor de una parte No. De partes del diluyente
1) Investigue que es dilucin.
2) Que finalidad tiene el conocer el ttulo en una aglutinacin?
3) Que diferencia habr entre una dilucin doble y una logartmica?
1) Hasta que dilucin llegaste en la primera serie de tubos?
2) Hasta que dilucin llegaste en la segunda serie de tubos?
27
3) Porque cambiaste la pipeta en cada uno?
DIAGRAMA DE
FLUJO
Realizar una dilucion
DOBLE (1:2) de HCl
en agua.
En un volumen de
25 mL.
HCl
H2O

QUINTUPLE (1:5) de
HCl en agua, en un
volumen de 25 mL.
1
H2O
20 mL
HCl
5 mL

(1:250) de HCl en
agua, en un volumen
de 25 mL.
H2O
HCl
24.9 mL
0.1 mL
28
En una serie de 10 tubos,

coloca 0.25 de agua.
Con una pipeta limpia,

toma 0.25 mL del
primer tubo y colocalos
en el segundo tubo.
En el tubo 1, deposita
0.25 mL de oolorante.
Mezclar muy bien.
1 2 3 4 5
1
H2O
6 7 8 9 10

toma 0.25 mL del tubo
2, pasa al tercer tubo.
Mezclar muy bien.

Repite el poceso con
todos los tubos. observa y
anota tus resultados.

toma 0.25 mL del
primer tubo y colocalos
en el segundo tubo.
En una
de 10de
tubos,
Enserie
una serie
10 tubos,
coloca
0.25 0.25
de agua.
coloca
de agua.
En el tubo 1, deposita
0.25 mL de oolorante.
Mezclar muy bien.
1 2 3 4 5
H2O
2

toma 0.25 mL del tubo
2, pasa al tercer tubo.
6 7 8 9 10
Mezclar muy bien.

Repite el poceso con
todos los tubos. observa y
anota tus resultados.
29
PRCTICA NO. 3
MTODO DE OUCHTERLONY
REACCIONES DE INMUNODIFUSIN
Cuando una solucin de antgeno soluble, es mezclado con un antisuero
correspondiente, el antgeno se combina muy rpido con el anticuerpo y si las
condiciones son las adecuadas los reactantes forman un precipitado. La velocidad
de la reaccin de precipitacin est influenciada por factores fsicos, qumicos e
inmunolgicos. Ouchterlony en 1947, introdujo el mtodo de inmunodifusin
doble, es una tcnica de doble difusin en agar, se fundamenta en que cuando el
antgeno y el anticuerpo, se difunden en un medio semislido (agar) forman un
inmunoprecipitado, estable que se visualiza fcilmente. Antgeno y anticuerpo
difunden simultneamente a partir de pozos cercanos, de modo que a su
alrededor se forme un gradiente de concentraciones que, al alcanzarse y llegar al
punto de equivalencia, formen bandas visibles de precipitacin.
METODOLOGA
1.
Se disuelve la Solucin salina amortiguada y el agar con ayuda de calor, ya

disuelto totalmente, el volumen perdido se debe restituir con agua destilada.
Para evitar la contaminacin microbiana se agrega 1 ml de solucin de
timerosal 1:1000 en agua destilada.
2.
Se disponen de portaobjetos o capas petri. Barnice los portaobjetos con

agarosa al 1% y squelos al horno. Funda agarosa al 1% y en caliente se
colocan 5 ml de la agarosa al portaobjeto, sin derramar. Deje que gelifique.
Si usa caja petri se llenan hasta una altura de 1 a 2 mm con la solucin de
agar an caliente.
3.
Se deja solidificar el agar a temperatura ambiente y si no se van a utilizar el

mismo da, las cajas petri pueden guardarse en cmara hmeda a 4C. Al
agar de la caja petri se le hacen varias perforaciones: una central y dos o
ms alrededor de sta. En el pozo central se coloca el antgeno que se desea
investigar, y en los pozos perifricos se colocan los diversos antisueros.
Tanto los antgenos como los antisueros se difunden por el agar,
separndose por su peso molecular, de tal manera que los que tienen menor
peso se difunden ms rpidamente. Cuando el antgeno y su anticuerpo
especfico se encuentran, se unen y precipitan. Este precipitado se ve como
una estrecha banda blanca en el agar.
4.
Perfore los portaobjetos con un sacabocados, distribuya los agujeros

alrededor de un pozo central (3 mm de dimetro aproximadamente), en
30
donde se colocar el anticuerpo, el antgeno se coloca en pequeos pozos

laterales. Se debe mantener una distancia de aproximadamente 0.5 cm
entre pozo y pozo.
5.
Incube en una cmara hmeda, a temperatura ambiente por 24 h. Observe

las bandas de precipitacin, los portaobjetos tambin se dejan reposar en
una cmara hmeda y se deja proseguir la difusin a temperatura ambiente
durante 24 h.
INTERPRETACIN
Se busca la presencia de bandas opalescentes entre ambos pozos. El nmero
de bandas indica la cantidad de sistemas antgeno-anticuerpo presentes en las
preparaciones. Si se trata de comparar dos antgenos, habr identidad total
entre ambos si se establece la continuidad en el punto donde se alcanzan las
bandas correspondientes a uno y otro; no hay identidad si ambas bandas slo
se cruzan y cada una continua en lnea recta; identidad parcial si hay un
fenmeno mixto. Si al cabo del perodo de incubacin no aparecen las bandas
de precipitacin o stas an no son muy claras, puede proseguirse la
incubacin durante el tiempo que sea necesario. Debe siempre vigilarse que el
agar no se deshidrate. Las bandas pueden teirse con algn colorante de
protenas (amido negro, eosina, fucsina, etc.) para ser mejor observadas.
VENTAJAS DE LA PRUEBA DE OUCHTERLONY
a.
Se puede ver de cuantos antgenos est compuesto un producto

(embutido, bacteria, etc.).
b.
Se pueden comparar antgenos y antisueros entre s. En efecto, cuando

en dos pozos adyacentes existe un mismo anticuerpo contra el antgeno
central, la lnea de precipitacin se une. A esta lnea se le denomina
identidad total. Cuando los anticuerpos son diferentes y reaccionan contra
antgenos del pozo central, las lneas de precipitacin se cruzan y se les
denomina no identidad. Existe tambin la posibilidad de que se
encuentren dos o ms antgenos diferentes que tengan el mismo peso
molecular y que uno de ellos tenga anticuerpos especficos en dos pozos
adyacentes y el otro solo en uno. En este caso, la lnea estar al mismo
tiempo, unida y cruzada, denominndose a este fenmeno identidad
parcial.
31

1. A que se le llama precipitacin?
2. Investigue el sistema de difusin de Oudin (1947)
3. Investigue las aportaciones de Grabar y Williams (1953)
4. Investigue el mtodo de Manzini
5. Investigue el mtodo de Ouchterlony
A.
Realiza un esquema de las perforaciones que realizaste sealando los

diferentes antisueros y el antgeno que utilizaste
B.
Efecta un esquema de las lneas obtenidas en la precipitacin en gel.
C.
Enumera las fuerzas fisicoqumicas que son responsables de la unin

antgeno-anticuerpo
D.
Consideras que esta prueba puede utilizarse para la identificacin de los

grupos sanguneos en manchas de sangre en Medicina Legal, y porque?
32
DIAGRAMA DE FLUJO
Se disulve la solucin
salina amortiguadora y
el agar con ayuda del calor.
Solucin
salina
Ya que este disuleto

totalmente, el volimen
perdido se restituye con
agua destilada.
H2O
Destilada
Fundir agarosa al 1% y en
caliente se colocan de 1 a 2
mm en la caja petri con una
solucin de agar caliente.
Barnizar las cajas petri

con agarosa al 1% y
secarlos al horno.
En el pozo central se coloca

el antigeno que se desea
investigar, y en los pozos
perifericos se colocan se
colocan los diversos
antisueros.
Antisuero
Agre
time ga 1 mL
r
des ti os al 1:1 de s oluc
0
la
i
c onta da, p/e 0 0 en a n
v it
gua
mina
c i n ar
mic r
obia
na.
H2O
Destilada
Se seja solidificar el agar a

temperatura ambiente, al
agra de la caja de petri se le
hacen varias perforaciones.
Incube en una camara

humeda, a temperatura
ambiente por 24 horas,
observe las bandas de
precipitacin.
Antigeno
33
PRCTICA NO. 4
DETERMINACIN DE INMUNOGLOBULINAS SRICAS
1 PRUEBA DE PRECIPITACIN DEL SULFITO DE SODIO
OBJETIVO
El alumno determinar la presencia de inmunoglobulinas (Igs) sricas llevando a
cabo la prueba de precipitacin de sulfito de sodio.
FUNDAMENTO
Esta prueba se basa en la precipitacin de Igs del suero
por sales de sulfito de sodio. Esta prueba es til cuando se
determina la presencia de Igs en recin nacidos hasta tres
semanas de edad. Su interpretacin es de tipo objetivo y
tiene un porcentaje de confiabilidad de aproximadamente
93%. Es indispensable que la muestra sea de suero y no
plasma, ya que este contiene protenas que se
precipitaran con las Igs, dando falsos resultados. La
hemlisis parcial de la muestra parece no afectar los
resultados de esta prueba. Esta prueba permite
diagnosticar la Falla en la Transferencia de Igs (FTI).
METODOLOGA
Se preparan tres soluciones de sulfito de sodio al 14, 16 y
18% en agua destilada. Se colocan 1.9 ml de cada solucin en tres tubos de
ensaye (con capacidad de 3 a 5 ml) y se aade 0.1 ml de suero a cada uno de los
tubos, mezclando perfectamente bien el contenido.
INTERPRETACIN
En caso de haber titulacin de Igs, se observar turbidez en forma inmediata y
la formacin de un precipitado al cabo de 30 - 60 min. Los resultados se
interpretan de la siguiente manera:
Precipitacin en los tubos con 14, 16 y 18%: 15 mg Ig/ml de suero.
Precipitacin en los tubos con 16 y 18%: 5 - 15 mg Ig/ml de suero.
Precipitacin en los tubos con 18% o ninguna precipitacin: 5 mg Ig/ml de
suero.
34
DIAGRAMA DE FLUJO
1
Se preparan tres disoluciones

de sulfito de sodio al 14, 16 y
18 % en agua destilada.
ZnSO4
7H2O
Prueba de precipitacin
del sulfito de sodio
Sulfito de
sodio
14 %
Sulfito de
sodio
16 %
Sulfito de
sodio
18 %
2
Colocar 1.9 de cada solucion y
colocar 0.1 ml de suero en
cada tubo.
Sulfito de
sodio
14 %
Mexclar
perfectamente
el contenido.
35
2 PRUEBA DE TURBIDEZ DEL SULFATO DE ZINC

OBJETIVO
El alumno determinar la presencia de Igs sricas llevando a cabo la prueba de
turbidez de sulfato de zinc.
FUNDAMENTO
Esta prueba se basa en la precipitacin de Igs del suero al entrar en contacto
sales de sulfato de zinc. Esta prueba es til cuando se determina la presencia de
Igs en recin nacidos hasta tres semanas de edad. Su interpretacin es de tipo
objetivo, el grado de turbidez desarrollado por la reaccin tiene una correlacin
de 0.96 con el contenido de IgG o IgM del suero.
Sin embargo, esta prueba puede verse afectada por la temperatura ambiental, el
periodo de incubacin, la presencia de bixido de carbono en el reactivo y el
grado de hemlisis de la muestra.
Es indispensable que la muestra sea de suero y no plasma, ya que esta ltima
causa lecturas ms altas en los resultados. Esta prueba permite diagnosticar la
FTI.
METODOLOGA
1. Se colocan 20.8 mg de Sulfato de zinc heptahidratado (ZnSO4 7 H2O) dentro
de un frasco color mbar de 100 ml de capacidad, se aade agua destilada a
temperatura ambiente (previamente hervida) hasta llegar a la marca de 100
ml. Inmediatamente se cierra el frasco con su tapn y se agita hasta lograr
una disolucin total de la sal. Se fija el tapn a la botella con cinta adhesiva
para lograr un buen sellado.
La solucin del reactivo debe sustituirse aproximadamente cada dos meses,
ya esta absorbe gradualmente bixido de carbono, lo que altera los resultados
de la prueba. Tambin la exposicin excesiva a la luz afecta la solucin, la
solucin debe guardarse en refrigeracin a una temperatura de 4 a 7C
2. Se toman 0.1 ml de suero y se colocan en un tubo de ensayo al que se
agregan 6 ml de la solucin de ZnSO4 7H2O.
3. Se agita suavemente la muestra y se deja incubar por una hora a 20C.
36
4. Se calibra el espectrofotmetro a 0, utilizando un tubo control con el reactivo

de ZnSO4 7 H4O. A continuacin, se mezcla bien el contenido del tubo prueba
y se lee en el espectrofotmetro.
5. Se lee el grado de absorbancia (turbidez) a una longitud de onda de 660 nm.
6. El resultado se multiplica por 10 y se expresa como el nmero de unidades de
turbidez del ZnSO4 7 H4O. El nmero de U. TSZ corresponde a los miligramos
de Igs totales por mililitro de suero. El nmero de U. TSZ se ha relacionado
con las posibilidades de supervivencia del neonato. Menos de 10 U. TSZ
(menos de 10 mg/ml): estos niveles son insuficientes para una proteccin
adecuada (septicemia, diarrea por E. coli, etc. De 10 a 20 U. TSZ (de 10 a 20
mg/mI): accin de organismos patgenos sobre la mucosa intestinal
ocasionando diarreas, principalmente. Ms de 20 U. TSZ (ms de 20 mg/ml):
lactacin exitosa. A medida que aumentan los niveles de anticuerpos (Abs), la
mortalidad por causas infecciosas, se reduce hasta eliminarse por completo
cuando sobrepasan las 40 U. TSZ.
DIAGRAMA DE FLUJO
1
Colocar 20.8 mg de ( ZnSO4

7H2O), dentro de un frasco
color ambar.
ZnSO4
7H2O
Aadir agua destilada

(previamente hervida) 100 mL.
Inmediatamente se cierra el
frasco con su tapon, agitacndo
hasta llegar a la dilusion total.
ZnSO4
7H2O
20.8
37
2
Una vez separado el suero,
tomar 0.1 mL y colocarlo en un
tubo de ensayo.
Agregar 6 ml de la solucion de (
ZnSO4 7H2O), agiitar suavemente
la muestra.. Incubar durante una
hora a 20 C
AGITAR SUAVEMENTE
ZnSO4
7H2O
Leer al espectofotometro a 660

nm. el resultado se multiplica
por 10.
ZnSO4
7H2O
38
3 PRUEBA DEL GLUTARALDEHDO

Se colocan 50l de una solucin de glutaraldehdo
al 10% en un tubo de ensaye, agregar 0.5 ml de
suero y mezclar perfectamente. El tiempo
requerido para que ocurra la coagulacin es
inversamente proporcional a la concentracin de
Igs en suero. Las muestras sricas con alta
concentracin de Igs coagulan la muestra entre 5
y 15 min.
INVESTIGACIN
EXPERIMENTO
PREVIA
AL
1. Investigue la estructura de una Ig

2. Describa las caractersticas de cada una de las
Igs
3. Porque es importante determinar la presencia de las Igs?
39
PRACTICA NO. 5
BRUCELOSIS: Aspectos generales y Serodiagnstico
Aspectos generales:
Se entiende por Brucelosis al conjunto de enfermedades provocadas por los
microorganismos del gnero Brucella tanto en el hombre como en los animales.
Investigaciones en historia de la medicina consideran que la brucelosis es una
enfermedad conocida desde Hipcrates (400 a. C.); sin embargo, las primeras
descripciones en las que se presenta con claridad son las de Cleghorn en 1751.
Marston en 1863, realiz estudios clnicos cuidadosos y autopsias de fiebres de
Malta remitentes y en 1863 present una descripcin detallada de la enfermedad
tal como ocurra en Malta, la que fue confirmada por otros investigadores, no
solo en esas Islas sino en otras zonas, considerndose desde entonces como
padecimiento endmico caracterstico de los pases del mediterrneo. Por otro
lado, el agente causal de la Brucelosis fue descrito por Bruce en 1886, en el bazo
de soldados muertos por esa enfermedad.
El mayor impacto de esta enfermedad en el humano se debe al alto costo del
tratamiento, la prdida de horas de trabajo, los costos de hospitalizacin y
diagnstico.
Es una enfermedad principalmente de animales y el hombre se infecta de manera
accidental al estar en contacto con productos, subproductos o secreciones de
animales infectados ya sea porque trabaja en ranchos ganaderos, empacadoras
de carnes, queseras, rastros, frigorficos o por consumir leche o sus derivados
sin pasteurizar.
El gnero Brucella incluye tres especies importantes: B. melitensis, que infecta
primordialmente cabras, pero puede infectar bovinos y cerdos; es el agente ms
patgeno responsable de la mayora de los casos humanos; B. abortus,
responsable de la brucelosis bovina y de patogenicidad moderada para el
hombre; B. suis, cuyo reservorio primario son los cerdos; B. neotomae que se
asla de la rata de bosque; B. canis de los perros.
Actualmente, se ha aislado B. maris que se encuentra en los animales marinos.
Dos nuevas especies han sido propuestas para ser adicionadas a este gnero, B.
cetaceae y B. pinnipediae aisladas de mamferos marinos, cetceos y pinipedios,
respectivamente. Tambin la B. cetaceae se ha aislado de focas.
40
1. Resistencia y sobrevivencia
Comparada con otras bacterias patgenas no esporuladas, Brucella tiene la
capacidad de sobrevivir y persistir en el medio ambiente bajo ciertas condiciones
de humedad y temperatura (Cuadro 1). A baja temperatura, Brucella puede
sobrevivir en la tierra ms de 10 semanas y en el estircol lquido ms de 2 1/2
aos. En canales congeladas puede sobrevivir por muchos aos. La Brucella es
bastante sensible al calor ya que muere a temperatura de pasteurizacin o a una
exposicin de 60 C por 30 min o a 70 C durante 10 min. Es bastante sensible a
las radiaciones ionizantes y muere rpidamente al ser expuesta a los rayos
ultravioleta o rayos Gama de tal manera que bastan 4 5 h de exposicin a la
luz solar para que muera la bacteria. En leche a 15 C puede sobrevivir durante
38 das y en queso a 4.4 C hasta 180 das. En placenta y tejidos fetales
expulsados por los animales durante la primavera y el invierno puede sobrevivir
hasta por 135 das.
2. Desinfectantes empleados en el control de Brucelosis
Las explotaciones pecuarias afectadas de brucelosis se deben desinfectar
peridicamente de acuerdo a los resultados obtenidos en los muestreos
serolgicos, es muy importante la desinfeccin de los materiales posteriormente
a los partos as como de otras reas donde ocurren los nacimientos. Todas las
especies de Brucella mueren al exponerse a los desinfectantes comunes tales
como componentes fenlicos al 3%, solucin de sosa custica al 2%, creolina al
5% as como formol al 2%. El material de laboratorio empleado debe enjuagarse
y desinfectarse en una solucin de fenol al 5% durante la ejecucin de pruebas
(Cuadro 2).
Serodiagnstico
Debido a que el aislamiento de Brucella a partir de personas o animales
infectados es difcil y prolongado se utilizan y se confa en las pruebas serolgicas
para el diagnstico rutinario de Brucelosis. Las pruebas de aglutinacin para el
diagnstico son las ms utilizadas en Mxico.
Prueba rpida en placa con antgeno Rosa de Bengala
Es una prueba rpida de aglutinacin en la que se emplea una suspensin de
clulas de B. abortus (99S) teidas con colorante Rosa de Bengala y disueltas en
cido lctico a pH 3.6. Esta prueba ha sustituido a la prueba de Huddleson, por
ser ms sensible y especfica.
41
Se considera como prueba positiva cuando ocurre cualquier tipo de aglutinacin y

negativa cuando no hay aglutinacin al cabo de 4 min.
Prueba de fijacin de complemento
La finalidad de la reaccin de fijacin de complementos (FC) es descubrir si en el
suero existen anticuerpos especficos contra un antgeno al comprobar que el
complemento desaparece (fijacin) cuando se mezcla con el suero (anticuerpo).
Al formarse un complejo antgeno anticuerpo ste fija el complemento presente
en el medio, una vez fijado, este complemento est incapacitado para la lisis de
glbulos rojos sensibilizados aadidos en una segunda fase.
Esta prueba ha demostrado ser exacta y sensible. Es una prueba excelente, slo
que para su realizacin requiere de personal capacitado, as como material y
equipo adecuados.
Prueba de Coombs (prueba de la antiglobulina)
Es una tcnica muy laboriosa y se basa en la demostracin de anticuerpos no
aglutinantes que en general pertenece a las clases lgG e IgA. Cuando este
mtodo se compara con la prueba de aglutinacin en tubo los ttulos obtenidos
por Coombs son superiores, sobre todo en pacientes con brucelosis crnica en
donde pueden llegar a ser 200 veces mayor al ttulo. La prueba tiene una
limitante ya que como mnimo se requieren 48 h para obtener resultados, de tal
manera que algunos investigadores lo han sustituido por el mtodo de
inmunofluorescencia indirecta que determina este tipo de anticuerpos.
Esta prueba detecta anticuerpos especficos que se han unido al antgeno pero
que son incapaces de aglutinar. La prueba emplea una antigammaglobulina que
se une a los anticuerpos que previamente se unieron a las clulas de Brucella, lo
que da por resultado una aglutinacin visible. Para el caso de la prueba de
Coombs aplicada a sueros se utiliza la antiglobulina bovina (Alton).
Prueba de ELISA
Los trabajos publicados indican que el mtodo de Ensayo inmunoabsorbente
ligado a enzimas (ELISA, por sus siglas en ingls), es una prueba muy sensible y
especfica y capaz de distinguir entre Brucelosis aguda y crnica.
El antgeno ms utilizado consiste en una suspensin de bacterias lisas o de
extractos enriquecidos en lipopolisacridos (LPS) as como algunos antgenos de
protenas exteriores de la membrana (OMP). Con este mtodo se identifican
42
inmunoglobulinas totales (lgG, lgM, e IgA principalmente) presentes en el suero o

en liquido cefalorraqudeo. La prueba utiliza como reactivo anticuerpos
antiinmunoglobulinas acoplados a una enzima (peroxidasa, fosfatasa alcalina,
betaglucoronidasa, etc.) estos anticuerpos reaccionan con las inmunoglobulinas y
su antgeno. La muestra problema se hace reaccionar con su antgeno que se
halla fijo en una superficie y si posee anticuerpos que se unen al antgeno hay
reaccin la cual se pone en evidencia con el reactivo enzimtico y su substrato.
La prueba se lleva a cabo en placas de microtitulacin de poliestireno. Despus
de varios perodos de incubacin la lectura se realiza en un lector de ELISA en el
cual se determina absorbancia a 492 nm.
Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR)
Este mtodo conocido como PCR, por sus siglas en ingls, permite la rpida
amplificacin del material gentico para su posterior anlisis. El DNA de la
Brucella sp es extrado mediante la tcnica de fenolcloroformo modificada;
posteriormente el DNA purificado se amplifica con la PCR.
La PCR permite ampliar el material gentico de la Brucella sp para su posterior
anlisis. La tcnica est basada en el hecho de que las enzimas que realizan la
sntesis del DNA requieren de la presencia de un iniciador o primer para copiar
la cadena que les sirve de molde y en que la capacidad del DNA de formar
hbridos es dependiente. El DNA obtenido se conserva a temperatura menor de
20C hasta su procesamiento. La prueba ha sido de gran impacto, ya que goza
de una gran sensibilidad y especificidad, puede determinar gnero, especie y
hasta variedad en un corto tiempo.
Cuadro 1: Tiempo de sobrevivencia de B. abortus bajo diversas condiciones ambientales
(Gillespie y Timoney, 1981).
Medio
Exudado uterino
Placenta, rganos
fetales
Leche
Mantequilla
Queso
Pasto
Temperatura o
Condiciones
estacin
ambientales
Febrero
Sobre la tierra
Invierno y primavera Bajo las hojas en
el bosque
15C
Muestras de leche
de
vacas
infectadas
4.4 C
12-21 C Feb.
15 -27 C Mayo
152 mm de lluvia
Exposicin al sol
Tiempo de
sobrevivencia (d)
10
135
38
142
180
6
<1
43
Cultivos en placa
abierta
Agua
Cadver de cobayo
infectado
Carne y carne salada

Abono en seco
Abono colocado
2.2-21 C Nov.
Octubre y Nov.
<40 C.
37 C, 25 C, 8C.
Enero (Wisconsin)
Junio y Agosto
(Wisconsin)
Enero (Wisconsin)
0 -20C
70C
Exposicin al sol
5
2 -3
Sobre la tierra
Sobre la tierra
800
57
44
1
Bajo la tierra
Muestra del fondo
Muestra
de
la
parte superior
12C
29
65
< 4h
2
250
Cuadro 2: Productos recomendados para la desinfeccin en caso de brucelosis (Trejo, S. J.,

1988).
Desinfectante
Cloruro de calcio
Solucin
de
sosa
caustica
Cal recin apagada
Emulsin de creolina
Solucin de formol
Concentracin
de solucin en
%
2-2.5
2
Temperatura de
la solucin
Exposicin
(h)
20
70-80
1
3
10-20
5
2
Ambiente
70-80
70-80
3
3
3
44
PRUEBA RAPIDA DE AGLUTINACIN EN PLACA

(ROSA DE BENGALA (Card Test))
INTRODUCCION
Se emplea para el diagnstico de brucelosis, es una prueba de aglutinacin en
donde se emplea el antgeno rosa de Bengala, cuando esta reaccin es positiva el
diagnstico se debe de complementar desarrollando las pruebas de aglutinacin
en tubo y/o microplaca y la prueba de aglutinacin con 2-mercaptoetanol (2-Me)
en tubo y/o microplaca. Anteriormente, se realizaba la prueba de Huddleson y
fue muy utilizada en todo el mundo para diagnstico de brucelosis, pero segn
observaciones de la Universidad de Minnesota, este mtodo si se utiliza solo debe
usarse como prueba de seleccin porque se han encontrado a menudo reacciones
falsamente positivas.
OBJETIVO
Desarrollar la prueba de tarjeta rosa de bengala como prueba tamiz para
diagnstico de brucelosis.
FUNDAMENTO
Esta prueba se basa en la bsqueda de Abs que se ponen de manifiesto para
hacerse reaccionar con los antgenos complementarios que existen en la
superficie bacteriana.
METODOLOGA
1) Centrifugar la sangre y separar el suero del paquete celular (1500 rpm).
2) Antes de utilizar cualquier antgeno se debe llevar a cabo una prueba del
antgeno a utilizar con un suero control positivo y un suero control negativo. Se
depositan 0.08 ml de suero positivo en un valo de la placa serolgica y 0.08 ml
de suero negativo en otro valo, se agrega una gota de antgeno en cada uno, se
mezcla con aplicador y se somete a rotacin mecnica o elctrica durante cuatro
min.
3) Con una pipeta serolgica (Bang) se extrae suero (a temperatura ambiente)
problema. Manteniendo la pipeta en ngulo de 45 se deposita en una placa de
vidrio serolgica, en el primer valo se depositan 0.08 ml, en el segundo 0.04 ml,
en el tercero 0.02 ml, 0.01 y 0.005 ml.
45
4) El frasco que contiene el antgeno se homogeniza por agitacin (a temperatura

ambiente) y se deposita una gota (0.03 ml) del antgeno sobre cada una de las
cantidades de suero problema.
5) Con un removedor o aplicador de madera se mezclan el antgeno y el suero
(comenzando con la dilucin ms baja a la ms alta), extendindose cada una de
las mezclas en crculos.
6) Agitar la placa manualmente o por rotacin mecnica, durante cuatro min.
7) Observar la placa sobre un fondo bien iluminado.
8) Anotar y registrar el grado de aglutinacin en los primeros cuatro min.
9) Reportar el ttulo del suero como recproco de la ltima dilucin donde se
observe aglutinacin.
1) Que es aglutinacin?
2) Describa el concepto de antgeno y anticuerpo.
3) Investigue que es Brucilla
4) Cules son las diferentes especies de Brucella?
5) Describa su morfologa
6) Explique que es una reaccin cruzada.
7) Cual es el principal antgeno de superficie de Brucella?
8) Con que bacterias Brucella presenta reaccin cruzada?
9) Cual es la Brucella que presenta mayor patogenicidad y porque evade la
fagocitosis?
10) Porque el antgeno de Huddleson ya no se utiliza para diagnstico de
Brucelosis?
46

1) Qu es serologa?
2) Que resultado obtuviste en la prueba Rosa de BENGALA?
3) Por qu solo se reporta esta tcnica como positivo o negativo?
4) Qu es el antgeno Rosa de Bengala?
4) Anota 5 enfermedades que diagnosticaras por aglutinacin?
47
PRACTICA NO. 6
INTRODUCCIN
La brucelosis es una zoonosis que tiene una distribucin mundial. La Brucelosis
es una enfermedad infectocontagiosa y zoontica de origen bacteriano que afecta
al ser humano y a diferentes especies animales domsticas, sobre todo al ganado
bovino, ovino y caprino. La enfermedad en los animales ocasiona grandes
prdidas econmicas debido a disminucin en la produccin de leche, abortos e
infertilidad en machos y hembras. Generalmente, la brucelosis bovina se
caracteriza por provocar aborto en el ltimo tercio de la gestacin.
El gnero Brucella est formado por bacterias parsitas intracelulares
facultativas, que producen el aborto epizotico en muchas especies domsticas
de animales y una enfermedad febril septicmica o infecciones focalizadas en el
hombre. Tiene una importante repercusin econmica en la produccin pecuaria,
debido a que provoca abortos, metritis, infertilidad y el nacimiento de animales
dbiles, constituyendo un serio problema para la salud pblica.
La especie de Brucella que afecta al ganado bovino son B. abortus, al ganado
caprino, B. melitensis, en borregos es B. ovis la que causa la infeccin, para
perros B. canis, en cerdos B. suis y para roedores B. neotomae. B. abortus
primeramente infecta a ganado bovino y puede ser transmitida a perros,
caballos, borregos y al hombre. La prueba solamente detecta Abs del grupo lgG
que estn presentes en el suero de animales infectados, esta prueba nos
diferencia los animales vacunados de los animales infectados con Brucella.
Al respecto, es importante mencionar que esta diferenciacin solo ocurre cuando
el animal fue vacunado con la cepa atenuada 19 de B. abortus, al contrario que si
fue vacunado con la cepa RB51 de B. abortus, la prueba diagnstica de rivanol no
diferenciar estos anticuerpos por no tener especificidad contra esta cepa y solo
detectar animales infectados al igual que la prueba de tarjeta. Por lo tanto, es
importante seguir investigando nuevas tcnicas diagnsticas que sean capaces
de detectar con gran confiabilidad cualquier tipo de reaccin ya que existen una
serie de factores que influyen en el control de la brucelosis.
OBJETIVO
Diagnosticar la brucelosis bovina y/o caprina en animales infectados con Brucella,
con la tcnica diagnstica Rivanol.
48
FUNDAMENTO
El diagnstico de brucelosis en los laboratorios se fundamenta en pruebas
convencionales que identifican anticuerpos circulantes en sangre. La prueba se
basa en la precipitacin de la albmina y las macroglobulinas por la accin del
lactato-2-etoxi-6-9-diamino acridina (Rivanol) poniendo de manifiesto la IgG.
METODOLOGA
a) El suero problema, el antgeno y la solucin de rivanol deben estar a
temperatura ambiente por lo menos una hora antes de realizar la prueba.
b) Antes de procesar la prueba diagnstica rivanol, se debe de realizar la prueba
de tarjeta, como prueba tamiz capaz de identificar una mnima cantidad de
sueros falsos negativos, ya que si esta prueba no manifiesta aglutinacin
(negativa) no es necesario realizar las pruebas confirmatorias como rivanol o
fijacin de complemento.
c) En un tubo pequeo (13 x 100 mm), depositar 0.4 ml del suero problema.
Agregar 0.4 ml de solucin rivanol y mezclar bien agitando el tubo y dejar a
temperatura ambiente no menos de 10 min y no ms de una h.
d) Centrifugar las mezclas a 1000 x g durante 5 a 10 min.
e) Con pipeta serolgica, aspirar el lquido sobrenadante y hacer una prueba de
aglutinacin similar al mtodo de tarjeta. En una placa de vidrio clara y limpia,
depositar cantidades de 0.08, 0.04, 0.02, 0.01 ml.
f) Agregar una gota (0.03 ml) de antgeno rivanol a cada cantidad de lquido
sobrenadante, mezclar con un aplicador de madera, removedor mltiple metlico
agitador mecnico, comenzando con la cantidad ms pequea (0.01 ml). Cada
dilucin debe ser extendida de forma que cubra la superficie indicada para la
prueba estndar de aglutinacin en placa (18, 21, 24 y 27 mm,
respectivamente).
g) Si se usa removedor mltiple metlico, enjuagarlo y secano bien antes de
pasar la siguiente muestra.
h) Inclinar la placa imprimindole movimiento circular hacindola girar 4 veces.
49
i) Transcurridos 6 min, girar 4 veces la placa. A los 12 min rotar nuevamente la

placa y efectuar la lectura con luz indirecta sobre fondo negro.
INTERPRETACION
Para facilitar las lecturas y la comparacin con los resultados en otras pruebas se
acepta denominar a las diluciones obtenidas como de 1:25, 1:50, 1:100 y 1:200,
respectivamente. El resultado se expresa en funcin de la dilucin ms alta en la
que observa aglutinacin. Cualquiera que sea el ttulo de reaccin, se interpreta
como infectado (ttulo 1:25), ya que la prueba solamente detecta anticuerpos
del grupo lgG en la misma forma que en la prueba de 2-Me en animales
vacunados.
El rivanol puede causar cierta precipitacin de lgG, por lo cual el ttulo final puede
ser inferior al obtenido con la prueba de 2-Me.
Nota: 1:25 sospechoso en animales vacunados (Alton).
1) En que casos es til la prueba de rivanol?
2) Que diagnosticamos en una prueba de rivanol?
3) Cuales son los anticuerpos aglutinantes?
4) Que anticuerpos se detectan en esta prueba?
5) Como se da la respuesta inmunolgica a la infeccin por Brucella?
6) Que Brucella es la ms resistente al mecanismo de muerte intracelular?
7) Porque se debe suspender la administracin de un antibitico 48 h antes de
tomar una muestra de sangre?
1) Que inconvenientes encontr al realizar la prueba de rivanol?
2) Porque no se utiliza esta prueba para diagnstico de Brucelosis en el
hombre?
3) Que diferencia hay entre el fenmeno de prozona y postzona? Explique.
50
DIAGRAMA DE FLUJO
El suero problema, el
antigeno y la solucion
de rivanol, deben estar
a
temperatura
ambiente.
Antigeno
Suero
problema
Rivanol
1%
Depositar 0.4 ml
de
suero
problema.
Mezclar
bien
agitando el tubo.
dejar a temperatura
ambiente 10 minutos.
Depositar 0.4
ml de solucion
rivanol al 1%.
Rivanol
1%
En placa de vidrio,
depositar 0.08, 0.04,
0.02, 0.01 ml.
Rivanol
1%
Con pipeta serologica

Bang, aspirar el liquido
sobrenadante y hacer
una
prueba
de
aglutinacion.
Centrifugar a
2000 rpm de
5-10 minutos.
51
Agregar
0.03
de
antigeno rivanol a
cada cantidad de
liquido sobrenadante.
Rivanol
1%
Mezclar con aplicador de

madera, trancurridos 6
minutos girar 4 veces la
placa en forma indicada al
punto anterior.
A los 12 minutos
rotar nuevamente la placa y
efectuar la lectura con luz
indirecta sobre fondo negro.
0.01 ml
0.02 ml
0.04 ml
0.08 ml
52
PRACTICA NO. 7
PRIMERA PARTE
AGLUTINACION ESTNDAR EN TUBO
INTRODUCCIN
Las pruebas serolgicas se efectan para determinar la presencia de anticuerpos
especficos anti-Brucella en el suero del paciente, para observar el incremento del
ttulo en la brucelosis aguda y para evaluar la eficacia del tratamiento. Dichas
pruebas serolgicas incluyen aglutinacin con rosa de bengala, aglutinacin
estndar y aglutinacin en presencia de 2-Me.
La interpretacin de los resultados es diferente en los casos de brucelosis aguda
y crnica. En las etapas tempranas de la infeccin la aglutinacin estndar es
positiva mientras que la de 2-Me permanece negativa. Con la evolucin de la
enfermedad, se observa aumento en el ttulo de la prueba de 2-Me, llegando a
alcanzar ttulos tan elevados como los de aglutinacin estndar.
Un ttulo de 1:20 - 1:40 en la prueba de aglutinacin estndar por s solo puede
ser sospechoso, pero no es definitivo, mientras que igual ttulo en la prueba 2-Me
indica una infeccin activa y requiere tratamiento; los resultados de la prueba de
2- Me indican en forma til en lo que se refiere a la respuesta del paciente al
tratamiento antimicrobiano.
El antgeno usado en las pruebas de aglutinacin para detectar Abs en contra de
B. melilensis, B. abortus y B. suis se prepara con suspensiones lisas de B.
abortus cepa 99 S (o con B. abortus 1119-3).
Si se desea investigar anticuerpos contra B. canis se emplea un antgeno
preparado con esta bacteria, no puede usarse el mismo antgeno de cepas lisas
puesto que B. canis es rugosa natural. Lo mismo sucede si se desea investigar
Abs contra B. ovis. Los antgenos producidos se someten a procedimientos de
control de calidad, se ajustan a lo establecido en los manuales de los centros
internacionales de referencia para la Brucelosis y se comparan con los antgenos
de referencia.
OBJETIVO
Efectuar la tcnica cuantitativa y confirmatoria, aglutinacin estndar en tubo
para diagnostico de brucelosis aguda humana.
53
FUNDAMENTO
Esta prueba se basa en la bsqueda de Abs que se ponen de manifiesto al
hacerse reaccionar con los antgenos complementarios que existen en la
superficie bacteriana. Esta prueba detecta las Igs especficas totales (IgM, IgG,
IgA) presentes en el suero.
METODOLOGA
A) Antes de procesar esta prueba debe realizar al suero problema la prueba de
rosa de Bengala [0.03 ml de suero problema y 0.03 ml de antgeno (una
gota)], con esta dilucin eliminar el fenmeno de prozona y postzona,
interpretar el resultado y si es positivo se procesa la prueba de aglutinacin
en tubo con solucin salina fenolada (SSF). Se efecta haciendo primero una
dilucin 1:10 del suero problema con SSF y a partir de esta, diluciones
seriadas con factor de dilucin 1:2 en SSF. Se aade despus un volumen
igual de antgeno diluido.
B) El antgeno se diluye 1: 10 en SSF para la prueba estndar.
C) PREPARACION DE LA SSF.
El antgeno normalizado deber diluirse con una solucin salina (SS) con 0.5%
de fenol, la cual se preparar de la siguiente manera:
a)
b)
Cloruro de sodio (NaCl) 25.5 g

Agua destilada. 3000 ml
Esta SS ya preparada queda a una concentracin del 0.85%, la cual deber

esterilizarse en autoclave a 121C durante 10 min (de preferencia preparar
volmenes adecuados para almacenarlos).
c) Fenol 15g
De esta manera queda lista la SSF que se emplear para diluir tanto el antgeno
como el suero.
1)
Etiquetar una serie de 10 tubos limpios (13 x 100 mm).
2)
Colocar 0.9 ml de SSF al 0.5% en el primer tubo.
3)
Aadir 0.1 ml del suero problema al primer tubo y mezclar perfectamente.
54
4)
En el resto de los tubos colocar 0.5 ml de SSF.
5)
Tomar 0.5 ml del primer tubo y pasar al segundo.
6)
Mezclar bien y pasar 0.5 ml al tercero y as sucesivamente hasta el ltimo.
7)
Desechar los 0.5 ml del ltimo tubo.
8) Agregar a cada tubo 0.5 ml de antgeno previamente diluido en SSF.

9)
Incubar a 37C durante 24 h (48 h).
10) Las diluciones finales son: 1:20, 1:40, 1:80, 1: 160, 1:320, etc.
11) Examinar sin agitar los tubos empleando una fuente luminosa colocada
detrs de los tubos.
12) Deber procesar al mismo tiempo y siguiendo cada uno de los pasos un
suero negativo y otro suero positivo (testigo).
INTERPRETACIN
Medir el grado de aglutinacin por la mayor o menor clarificacin que se haya
producido en los tubos en comparacin con su testigo y la formacin de una
malla de aglutinacin en el fondo del tubo.
++++ Aglutinacin - sedimentacin completas con clarificacin total del lquido
sobrenadante.
+++ Aglutinacin casi completa, clarificacin del 75%
++ Aglutinacin pronunciada y transparencia del 50%
+ Sedimentacin parcial y clarificacin del 25%
- Clarificacin nula.
El ttulo corresponde al ltimo tubo donde hubo clarificacin del 75 al 100%, y se
considera positivo cuando el ttulo es mayor o igual a 1:80, es importante sealar
que cuando hay exceso de Abs se presenta fenmeno de zona, por lo que se
recomienda emplear siempre una serie de cuando menos 10 tubos.
55
DIAGRAMA DE FLUJO
Realizar al suero
problema la prueba de
rosa de bengala,
0.03ml
suero
problema, 0.03 ml de
antigeno.
Interprete el resultado
si es positivo, procese
la
prueba
de
aglutinacion en tubo
con solucion salina
fenodala.
H2O
destilada
Rosa de
Bengala
PRIMER
Colocar 0.9 ml de
solucion salina
fenolada en el
primer tubo.
1 2 3 4 5 6 7 8 9
2
Solucin
salina
fenolada
0.5%
Realizar una dilucin

1:10 del suero problema con
solucin salina fenolada y a
partir de esta, diluciones
seriadas con factor de dilucin
1:2 en solucin salina fenolada,
se aade despus un volumen
igual de antgeno diluido.
NaCl
Depositar 0.1 ml
de
suero
problema.
10
En el resto de los
tubos colocar 0.5
ml de solucin
salina fenolada.
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Para preparar la solucion

salina
fenolada
se
agrega 25.5 g de NaCl y
3000 ml de agua
destilada, se diluye el
antigeno normalizado.
Solucin
salina
fenolada
0.5%
10
Solucin
salina
fenolada
0.5%
1 2 3 4 5 6 7 8 9
10
56
Pasar 0.5 ml del

primer tubo al
segundo.
Mezclar bien y pasar

0.5 ml al tercero y
asi sucesivamente
hasta elultimo.
Desechar los 0.5

ml del ultimo
tubo.
1 2 3 4 5 6 7 8 9
10
1 2 3 4 5 6 7 8 9
10
Agregar a cada tubo

0.5 ml del antgeno previamente
diluido en solucin salina
fenolada. Incubar a 37C
durante 24 horas. Examinar sin
agitar los tubos empleando una
fuente luminosa.
SEGUNDA PARTE
AGLUTINACIN EN TUBO EN PRESENCIA DE
2-MERCAPTOETANOL
INTRODUCCIN
El 2-Me es un agente reductor (reduce los puentes de disulfuro de la IgM) que
disocia la macroglobulina IgM, que es un pentmero, con lo que se inactiva su
actividad de Ab, por lo que si observamos la presencia de Abs aglutinantes se
deber a las Igs IgG e IgA. La IgG es resistente a este tratamiento cuando se
usan las diluciones correctas del reductor.
Esta prueba se considera de utilidad para controlar la eficacia de la
quimioterapia, ya que al alcanzar valores negativos de IgG se considera que el
tratamiento fue el adecuado, y se estar evitando originarle al paciente una
brucelosis crnica por proporcionarle tratamientos inadecuados e inespecficos.
En infecciones crnicas, los niveles de IgG son mucho ms altos que los de IgM.
FUNDAMENTO
Se emplea para poner de manifiesto Abs de la clase IgG principalmente, ya que
los de la clase IgM se inactivan por el tratamiento con 2-Me.
57
METODOLOGIA
A) Esta prueba de debe de procesar al mismo tiempo que la aglutinacin en tubo
con SSF o aglutinacin estndar.
B) Preparacin de la SS con 2-Me
a) Pesar 0.85 g de NaCl y disolver en 100 ml de agua destilada.
b) Aadir 0.71 ml de 2 - Me. Agitar y colocar en un recipiente limpio.
C) Hacer dilucin 1:10 del suero problema en SS con 2 - Me.
D) Diluir el antgeno 1:10 con SS (no fenolada).
Se efecta haciendo primero una dilucin 1:10 del suero problema con SS con 2Me y a partir de esta, diluciones seriadas con factor de dilucin 1:2 en SS con 2 Me. Se aade despus un volumen igual de antgeno diluido.
1) Etiquetar una serie de 10 tubos limpios (13 x 100 mm).
2) Colocar 0.9 ml de solucin salina 2-Me al 0.71 en el primer tubo.
3) Aadir 0.1 ml del suero problema al primer tubo y mezclar perfectamente.
4) En el resto de los tubos colocar 0.5 ml de SS con 2-Me.
5) Tomar 0.5 ml del primer tubo y pasar al segundo.
6) Mezclar bien y pasar 0.5 ml al tercero y as sucesivamente hasta el ltimo.
7) Desechar los 0.5 ml del ltimo tubo.
8) Agregar a cada tubo 0.5 ml de antgeno previamente diluido en SS.
9) Incubar a 37C durante 24 h (48 h) y realizar la lectura.
10) Las diluciones finales son: 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, 1:320, etc.
11) Examinar sin agitar los tubos empleando una fuente luminosa colocada
detrs de los tubos.
58
suero negativo y otro positivo (testigo).
INTERPRETACION
Cualquier ttulo de aglutinacin por este mtodo se considera positivo y se debe a
la presencia de Igs de la clase IgG.
DIAGRAMA DE FLUJO
Para preparar la solucion

salina-mercaptoetanol,
pesar
0.85g de NaCl y disolver en 100
ml de agua destilada, aadir
0.71 ml de 2-Mercaptoetanol y
colocar en un recipiente limpio.
H2O
destilada
1
Hacer dilucin 1:10 del
suero problema en solucin
salina con 2-mercaptoetanol.
Diluir el antgeno 1:10 con
solucin salina (no fenolada)
NaCl
Depositar 0.1 ml
de
suero
problema.
Colocar 0.9 ml de
solucion salina
2-ME en el primer
tubo.
3
2
1 2 3 4 5 6 7 8 9
10
Solucin
salina
2-ME
59
Colocar 0.5 ml de
solucion salina
2-ME en el resto
de los tubos.
4
Solucin
salina
2-ME
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Pasar 0.5 ml del

primer tubo al
segundo.
10
Solucin
salina
2-ME
Mezclar bien y pasar

0.5 ml al tercero y
asi sucesivamente
hasta el ultimo.
1 2 3 4 5 6 7 8 9
10
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Desechar los 0.5

ml del ultimo
tubo.
10
Agregar 0.5 ml de
antigeno
previamente diluido
en solucion salina.
Antigeno
1 2 3 4 5 6 7 8 9
10
Incubar a 37C durante 24

horas (48 horas) y realizar la
lectura, las diluciones finales
son: 1:20,1:40, 1:80, 1:160,
1:320, examinar sin agitar los
tubos empleando una fuente
luminosa colocada detrs de
ellos.
60
PRACTICA NO. 8
PRIMERA PARTE
AGLUTINACIN ESTANDAR EN MICROPLACA
Esta tcnica es la adaptacin como micromtodo de la aglutinacin estndar en
tubo, que detecta al igual que esta, inmunoglobulinas especficas totales (IgG,
IgM, IgA) del suero.
METODOLOGIA
1) Se utiliza una placa de 96 pozos con fondo en U.
2) Colocar 180 L de SSF al 0.5% en el primer pozo.
3) Aadir 20 L del suero problema al primer pozo y mezclar perfectamente.
4) En el resto de los pozos colocar 100 L de SSF.
5) Tomar 100 L del primer pozo y pasarlo al segundo.
6) Mezclar bien y pasar 100 L al tercero y as sucesivamente hasta el ltimo.
7) Desechar los 100 L del ltimo pozo.
8) Agregar a cada pozo 100 L de antgeno previamente diluido en SSF.
11) Examinar sin agitar la placa empleando una fuente luminosa colocada detrs
de la microplaca.
suero positivo y otro suero negativo (testigo).
INTERPRETACION
Medir el grado de aglutinacin por la mayor o menor clarificacin que se haya
producido en los pozos en comparacin con su testigo y la formacin de una
malla de aglutinacin en el fondo del pozo.
61
++++ Aglutinacin - sedimentacin completas con clarificacin total del lquido

sobrenadante.
+++ Aglutinacin casi completa, clarificacin del 75%
++ Aglutinacin pronunciada y transparencia del 50%
+ Sedimentacin parcial y clarificacin del 25%
- Clarificacin nula.
La reaccin positiva se observa como un conglomerado de clulas en el fondo del
pozo formando una malla de aglutinacin (la cual al inclinar ligeramente la placa
permanece adherida al fondo del pozo).
El ttulo corresponde al ltimo pozo donde hubo clarificacin del 75 al 100%, y se
considera positivo cuando el ttulo es mayor o igual a 1:80, en el ltimo pozo se
forma una malla bien definida, es importante sealar que cuando hay exceso de
anticuerpos se presenta fenmeno de zona, por lo que se recomienda emplear
siempre una serie de cuando menos 10 pozos.
62
DIAGRAMA DE FLUJO
PRIMERA PARTE
Aglutinacin Estndar en
microplaca
Colocar
180
microlitros
de
solucion
salina
fenolada al 0.5% en
el primer pozo.
Colocar 100 microlitros

de solucion salina
fenolada al 0.5% en el
resto de los pozos.
Depositar
20
microlitros de
suero problema.
Solucin
salina
fenolada
0.5%
Solucin
salina
fenolada
0.5%
Tomar
100
microlitros
del
primer pozo y
pasarlo al segundo.
Mezcalr bien y
pasar
100
microlitros al
tercer pozo.
Agregar a cada pozo

100 microlitros de
antigeno previamente
diluido en solucion
salina fenolada.
Desechar los
100 microlitros
del ultimo pozo.
Antigeno
Incubar a 37C durante 24 horas

(48 horas) y realizar la lectura, las
8
diluciones finales son: 1:20, 1:40,
1:80, 1:160, 1:320, examinar sin
agitar la placa empleando una
y Clnica
2011 est
protegido
fuenteBsica
luminosa
colocada
detrs
de por los Derechos de Autor por la 63
Secretara de Educacin Pblica del Instituto Nacional del Derecho de Autor con el N de Registro 03-2009ellos.
Deber
procesar
mismo Revista electrnica de Veterinaria
111713215700-14. Se publica en Abril
de 2011
como un
suplementoelde REDVET
con
n
ISSN
1695-7504
por
(http://www.veterinaria.org/revistas/redvet)
tiempo y siguiendo cada uno ladeeditorial
los Veterinaria Organizacin S.L.
http://www.veterinaria.org, Inscrita en
el
BORME
de
Espaa
con
el
nmero
2001/0175466
en el Grupo Servicios, sector
pasos un suero negativo (testigo).
AGLUTINACIN EN PRESENCIA DE 2- Me EN MICROPLACA

SEGUNDA PARTE
Esta tcnica es la adaptacin como micromtodo de la aglutinacin en tubo en
presencia de 2- Me, que detecta al igual que esta, inmunoglobulinas de la clase
IgG principalmente ya que los de la clase IgM se inactivan con el 2-Me.
METODOLOGIA
1) Se utiliza una placa de 96 pozos con fondo en U.
2) Colocar 180 L de SS con 2-Me al 0.71% en el primer pozo.
3) Aadir 20 L del suero problema al primer pozo y mezclar perfectamente.
4) En el resto de los pozos colocar 100 L de SS con 2-Me.
5) Tomar 100 L del primer pozo y pasarlo al segundo.
6) Mezclar bien y pasar 100 L al tercero y as sucesivamente hasta el ltimo.
7) Desechar los 100 L del ltimo pozo.
8) Agregar a cada pozo 100 L de antgeno previamente diluido en solucin
salina.
11) Examinar sin agitar la placa empleando una fuente luminosa colocada detrs
de la microplaca.
suero positivo y otro suero negativo (control).
INTERPRETACION
Cualquier ttulo de aglutinacin por este mtodo se considera positivo y se debe a
la presencia de inmunoglobulinas de la clase IgG, es importante recordar que
64
cuando hay exceso de anticuerpos se

presenta fenmeno de zona, por lo que se
recomienda emplear siempre una serie de cuando menos 10 pozos.
1) Qu es Brucelosis?
2) Porqu se debe utilizar por lo menos una serie de 10 tubos o pozos?
3) Que anticuerpos detectamos en la prueba de aglutinacin estndar?
4) Porqu B. melitensis evade la fagocitosis?
5) Cmo se da la respuesta inmunolgica a la infeccin por Brucella?
6) Cules son los componentes antignicos de Brucella?
7) Cul es el tratamiento especfico para una brucelosis?
8) Qu anticuerpos detectamos en la prueba de aglutinacin con 2-Me?
9) Para qu fines diagnsticos se utiliza la prueba de aglutinacin con 2-Me?
10) Qu actividad presenta el 2-Me frente a IgM?
1) Cmo realizara en su laboratorio de anlisis bioqumico clnicos un
diagnstico de Brucelosis?
2) Recomendara al paciente volver a su laboratorio a otra valoracin al
terminar el tratamiento indicado por el mdico?
65
DIAGRAMA DE FLUJO
SEGUNDA PARTE
Aglutinacin en presencia de 2-Me en microplaca.
Colocar
180
microlitros
de
solucion salina 2-ME
al 0.71% en el primer
pozo.
Colocar 100 microlitros

de solucion salina 2-ME
al 0.71% en el resto de
los pozos.
Depositar
20
microlitros de suero
problema al primer
pozo,
mezclar
perfectamente.
Solucin
salina
2-ME al
0.71 %
Solucin
salina
2-ME al
0.71 %
Tomar
100
microlitros
del
primer pozo y
pasarlo al segundo.
Mezcalr bien y
pasar
100
microlitros al
tercer pozo.
Agregar a cada pozo

100 microlitros de
antigeno previamente
diluido en solucion
salina.
Desechar los
100 microlitros
del ultimo pozo.
Antigeno
Incubar a 37C durante 24 horas

(48 horas) y realizar la lectura, las
diluciones finales son: 1:20, 1:40,
1:80, 1:160, 1:320, examinar sin
Bsica
est protegido
agitar
lay Clnica
placa 2011
empleando
una por los Derechos de Autor por la 66
Secretara de Educacin Pblica del Instituto Nacional del Derecho de Autor con 8el N de Registro 03-2009fuente
luminosa
colocada
detrs
de
111713215700-14. Se publica en Abril de 2011 como un suplemento de REDVET Revista electrnica de Veterinaria
ellos.conDeber
procesarporella mismo
n ISSN 1695-7504
editorial Veterinaria Organizacin S.L.
(http://www.veterinaria.org/revistas/redvet)
http://www.veterinaria.org, Inscrita en el
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el nmero
en el Grupo Servicios, sector
tiempo
uno2001/0175466
de los
pasos un suero negativo (testigo).
PRACTICA NO. 9
ANTGENOS DE SUPERFICIE DE GRUPOS SANGUNEOS
SISTEMA ABO
INTRODUCCIN
Los antgenos son protenas, polisacridos voluminosos o grandes complejos de
lipoprotena, que se encuentran principalmente pero no exclusivamente en la
superficie de las membranas celulares y estn colocadas de tal manera que las
cadenas glucosdicas polares se encuentran en el ambiente externo de las
clulas. Las estructuras exactas de estos glcidos unidos a lpidos y protenas de
membrana estn determinadas genticamente.
Los componentes antignicos de la membrana del eritrocito se han estudiado en
detalle debido a su importancia en el tratamiento con transfusiones. Se han
distinguido mas de 100 antgenos del eritrocito constituyendo por lo menos 15
sistemas de grupos sanguneos genticamente distintos; sin embargo, no todos
desencadenan reacciones de transfusin tan severas como los antgenos que
conforman el denominado sistema ABO y el sistema Rh.
Los antgenos A, B y O son oligosacridos estructuralmente relacionados que
pueden estar unidos a lpidos o a protenas. El antgeno O (tambin llamado
antgeno H) es una cadena de fucosa, galactosa, N-acetilglucosamina y glucosa
unido a un lpido ceramida (o un hidroxilo de la cadena lateral de una protena) a
la glucosa. El antgeno A difiere del O solamente en que contiene un resto de Nacetilgalctosamina unido al resto ms externo de la galactosa, en cuanto al B que
tambin es parecido al O se diferencia por poseer un resto ms de galactosa
unido a la galactosa exterior.
Todas las personas tienen la enzima que produce el antgeno O, las personas con
el grupo sanguneo A tienen, adems, la enzima que adiciona Nacetilgalactosamina de ms, mientras que los de tipo B tienen la enzima que
adiciona la galactosa extra; los que tienen el tipo AB sintetizan ambos antgenos,
el A y el B, mientras que los que son del tipo O solo producen el antgeno O.
Los Abs contra los antgenos ABO son isohemaglutininas, pues los antgenos son
de origen humano (iso, de la misma especie) y se descubren ordinariamente por
una reaccin de aglutinacin con clulas de un tipo ABO conocido; en otras
palabras, el suero que contiene anticuerpos contra los antgenos A y B hace que
se aglutinen los eritrocitos en cuya superficie existen dichos antgenos. Hay
67
cuatro fenotipos ABO bsicos, tipo O (eritrocitos sin antgenos A ni B), tipo A
(eritrocitos con antgeno A), tipo B (eritrocitos con antgenos B) y tipo AB
(eritrocitos con antgeno A y B).
Los antgenos Rh de los grupos sanguneos recibieron su nombre por haberse
identificado inicialmente en los eritrocitos del mono Rhesus (Macaca mulata). Los
hemates Rh+ poseen un antgeno denominado Rho en una nomenclatura y D en
otra. El antgeno D es el que determina que un individuo sea Rh+ Rh-, las
personas con genotipo DD o Dd son de tipo Rh+, los individuos con genotipo dd
pertenecen al tipo Rh-. El antisuero antiD es sinnimo de antisuero antiRh.
Para determinar los grupos sanguneos en la prctica se hacen pruebas con los
antgenos ABO y Rh, provocando reacciones de antgeno-anticuerpo, mediante
pruebas de aglutinacin. El mecanismo de una reaccin de aglutinacin se
produce por medio de anticuerpos multivalentes que se combinan con partculas
de antgeno, formando complejos antgeno-anticuerpo. La reaccin de
aglutinacin se da cuando en una mezcla de las partculas de antgeno con los
antisueros especficos provoca una agrupacin de dichas partculas de antgeno
con los antisueros especficos provoca una agrupacin de dichas partculas
antignicas. Por lo general la aglutinacin es perceptible a simple vista, pero en
ocasiones se requiere de observaciones al microscopio de la preparacin
estudiada.
METODOLOGA
1. Acomodar al paciente de manera que este cmodo, e inspirarle confianza.
2. Explicarle al paciente lo que se le va a practicar.
3. Colocar el torniquete aproximadamente a la mitad entre el codo y el hombro.
4. Inspeccionar el rea que planeamos usar (vena ceflica, vena baslica, vena
cubital mediana, vena mediana).
5. Retirar el torniquete, ya que no puede durar mucho tiempo.
6. Ya localizada la vena, nuevamente colocamos el torniquete.
7. Se hace la asepsia con una torunda alcoholada al 7O%, procurando limpiar de
arriba hacia abajo y dejar que se seque.
68
8. Fijar la vena en posicin sujetando el antebrazo del enfermo con la mano y

comprimiendo y empujando los tejidos blandos con el pulgar justo por debajo del
punto donde se va a intentar la puncin.
9. Se empuja la aguja al interior de la vena con una puncin directa nica de piel
y vena.
10. Hay que desatar el torniquete para que la sangre fluya libremente.
11. Se retira la jeringa y la aguja.
12. Se le aplica una presin suave (tres min) en el punto de la puncin con una
torunda sin friccionar, ya que la friccin provoca hematomas, tambin, se le pide
al paciente mantener extendido el brazo, para prevenir la formacin de un
hematoma.
13. La sangre se coloca en sus respectivos tubos y en ese momento se etiqueta
con el nmero de registro o las iniciales del nombre del paciente, los exmenes
solicitados por el mdico y la firma de quien hizo la extraccin.
14. Si utiliza una lanceta estril, se desinfecta el dedo medio y se pincha la
yema del dedo, se colocan tres gotas en sobre una placa de vidrio, se aade una
gota de antisuero A, Rh y B, con diferente aplicador se mezcla cada antisuero con
la gota de sangre. Se observa la reaccin de aglutinacin por debajo de la placa a
contra luz y de ser necesario en el microscopio.
15. Al terminar, se sumerge la placa de vidrio en una solucin de cloro comercial
al 50%.
1. Describe la importancia que tiene conocer la tcnica de extraccin de
sangre venosa y porque es necesario que un Qumico conozca esta tcnica.
2. Describe los grupos sanguneos.
69
DIAGRAMA DE FLUJO
SISTEMA
ABO
Se colocan 3 gotas de
sangre sobre una
placa de vidrio.
Aadir 1 gota de
antisuero A, Rh, B.
Observar la reaccion
de aglutinacin.
Laura Perales Mota
Laura Perales Mota
70
PRACTICA NO. 10
REACCIONES FEBRILES
METODO: Inmunolgico; Prueba rpida de aglutinacin o placa
INTRODUCCIN
Esta prueba consiste en detectar en la sangre la presencia de anticuerpos o
clulas de memoria, las que indican que el organismo ha estado en contacto
previamente con diferentes tipos de bacterias, o bien que el organismo ha
padecido ciertas enfermedades. Las reacciones febriles son particularmente tiles
para apoyar el diagnstico de padecimientos como la fiebre tifoidea, brucelosis,
paratifoideas y de Rickettsiosis.
FUNDAMENTO
La fiebre tifoidea, la fiebre malta y la tifoidea (salmonelosis, brucelosis y
Rickettsiosis respectivamente) se confirman demostrando la presencia de los
anticuerpos homlogos en el suero del paciente. Las diferentes salmonelosis se
detectan usando antgenos especficos de la bacteria correspondiente
seleccionados segn la clase de salmonelosis que son ms comunes en la regin
y esta prueba se conoce como reaccin de Widal. La Brucelosis se comprueba con
la reaccin de Rosa de Bengala usando antgenos de B. abortus. Las Rickettsiosis
se detectan usando antgeno procedentes de algunas cepas de Proteus OX que
comparten un antgeno comn con las Rickettsias (como el Proteus OX-1 9), en
la Reaccin de Weil Flix.
MUESTRA: Suero, Separarlo de 5 ml sangre sin anticoagulante previo reposo de
30 min. Para separarlo, centrifugar a 3,000 x g X 5 min.
Antgenos:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Tfico O
Tfico H
Paratfico A
Paratfico B
Brucella
Proteus OX 19
71
METODOLOGA: PRUEBA CUALITATIVA

1. Revisar la caducidad de los antgenos, los cuales deben estar a temperatura
ambiente. Marcar con el nmero del paciente una serie de 6 anillos de la
placa de aglutinacin y sobre estos anotar los nmeros de los antgenos (1 al
6).
2. Trasladar a la placa de vidrio 0.08 ml. de suero x c/u de los 6 anillos.
3. Agregar una gota de cada antgeno previamente mezclado al anillo
correspondiente.
4. Mezclar con un palillo (1/valo).
5. Balancear la placa durante dos min.
6. Interpretar la prueba antes de tres min, con la ayuda del aglutinoscopio.
Anotar el nmero de los antgenos que den la reaccin positiva (aglutinacin
franca).
7. Practicar la prueba con los antgenos que dieron la reaccin negativa (falta de
aglutinacin) usando 0.01 ml de suero.
Anotar los nmeros de los antgenos que den reaccin positiva (aglutinacin
franca).
8. Practicar la prueba cuantitativa usando los antgenos que aglutinaron con el
suero.
PRUEBA CUANTITATIVA
I.-Cuando los antgenos aglutinan con 0.08 ml de suero.
a) Trasladar con pipeta de vidrio 0.04, 0.02, 0.01 y 0.005 ml de suero por valo.
b) Mezclar el antgeno y agregar una gota a cada cantidad de suero.
c) Mezclar con un palillo comenzando con el valo que tenga 0.005 ml de suero y
terminando con el que tenga 0.04 ml de suero.
d) Balancear la placa x dos min.
72
e) Interpretar la prueba antes de 3 min con ayuda del aglutinoscopio para

determinar la cantidad ms pequea de suero que da la aglutinacin franca.
II.-Cuando los antgenos aglutinan con 0.01 0.005 mI:
a) Preparar una dilucin progresiva doble de suero (1:2,1:4., 1:8, 1:16) en
albmina bovina al 33% de la siguiente manera:
- Trasladar 0.1 ml de albmina a c/u de los 3 tubos de ensayo y etiquetados.
- Agregar 0.1 ml de suero del paciente al primer tubo y mezclar para obtener la
dilucin 1:2
- Trasladar 0.1 ml de la dilucin 1:2 al segundo tubo y mezclar para obtener la
dilucin 1:4
- Trasladar 0.1 ml de la dilucin 1:4 al tercer tubo y mezclar para obtener la
dilucin 1:8, etc.
b) Trasladar 0.01 de cada dilucin a la plaza de vidrio.
c)
Agregar una gota del antgeno correspondiente (mezclado).
Mezclar con palillo. Balancear x dos min.

INTERPRETACIN
Detectar la dilucin mayor que de la reaccin positiva (aglutinacin franca).
Reportar el nmero del antgeno y el ttulo determinado:
VOLUMEN DE SUERO (ml)
TITULO
0.08------------------------------------------------------------------------1:20
0.04------------------------------------------------------------------------1:40
0.02------------------------------------------------------------------------1:80
0.01------------------------------------------------------------------------1:160
0.005 (0.01 de dilucin 1:2) ----------------------------------------1:320
0.01 de dilucin 1:4---------------------------------------------------1:640
0.01 de dilucin 1:8---------------------------------------------------1:1280
0.01 de dilucin 1:16-------------------------------------------------1:2560
NOTAS.- 1.-En das calurosos, las reacciones pueden ser falsamente positivas
2.-Ttulos menores de 1:80 se pueden considerar normales. Tomar en cuenta
diagnstico clnico.
73

1) Qu significa reacciones febriles?
2) Para qu resulta til la demostracin de anticuerpos en el suero contra las
especies de Salmonella?
3) Porqu en la actual serologa de suero de Salmonella deben utilizarse
antgenos representativos de diversos grupos de Salmonella?
4) Cul es el (cuales son los) antgeno (s) de superficie de Salmonella?
5) Cmo resultan los ttulos de aglutininas O en el transcurso de la enfermedad?
6) Cmo resultan los ttulos de aglutininas H en el transcurso de la enfermedad?
7) Porqu el ttulo de aglutinina O constituye el indicador mas fiable en una
infeccin reciente de Salmonella?
8) Qu puede enmascarar la respuesta de la aglutinina en el suero?
9) Cules son las especies que reconoce el esquema taxonmico de Salmonella
y cual es la que contiene ms de 1500 serotipos?
1) Qu parmetros debemos considerar al considerar un resultado serolgico?
2) En qu consiste la preparacin de antgeno H y la del antgeno O?
3) Qu enfermedades se diagnostican en la prueba serolgica con cepas de
Proteus y en que consiste su preparacin?
4) Cmo diagnosticara en su laboratorio una infeccin por Salmonella?
5) Cul es el tratamiento de eleccin contra Salmonelosis?
6) Cules son los factores importantes en la profilaxis de la transmisin de la
fiebre tifoidea de hombre a hombre?
7) Considera usted poder erradicar la enfermedad humana causada por
Salmonella que infectan los animales y al hombre?
74
8) Investigue que es el fenmeno de prozona, postzona y zona de equivalencia.

9) Por qu es ms conveniente empezar a trabajar con la dilucin 1:40?
10) Qu es ttulo?
11) Qu ttulos considera indicativos de presencia de enfermedad en las
reacciones febriles (positivos) y porque?
PRCTICA NO. 11
ANTIESTREPTOLISINAS
INTRODUCCIN
El anticuerpo estreptolisina O se encuentra presente en casi todas las personas
en ttulos bajos, debido a que las infecciones estreptoccicas son comunes. Sin
embargo, un ttulo alto o creciente de antiestreptolisina O, indica una infeccin
reciente producida por estreptococo -hemoltico de grupo A, como amigdalitis,
escarlatina, sepsis puerperal, erisipela, etc.
Tiene adems especial inters en los procesos que aparecen como segunda
enfermedad: fiebre reumtica y glomerulonefritis aguda. Por lo tanto a pesar de
no ser una prueba especfica para fiebre reumtica, apoya su diagnstico cuando
lo sugieren la historia y los signos clnicos.
FUNDAMENTO
La estreptolisina O, producida por el estreptococo -hemoltico de grupo A, tiene
la propiedad de producir hemlisis cuando se pone en contacto con glbulos
rojos. Al colocar distintas diluciones de un suero que contenga antiestreptolisina
O en presencia de dosis constantes de estreptolisina O, se produce una reaccin
antgeno - anticuerpo que neutraliza la capacidad hemoltica de la misma. Este
fenmeno se evidencia por una inhibicin de la hemlisis al agregar suspensin
de glbulos rojos del 3 al 5%. El ttulo de antiestreptolisina ser la recproca de la
mxima dilucin del suero del paciente capaz de neutralizar totalmente la
estreptolisina.
75
REACTIVOS
Estreptolisina O: estreptolisina liofilizada titulada.
Buffer concentrado: solucin de buffer fosfatos conteniendo fosfatos 0.36 mol/l y
cloruro de sodio 1.2 moI/l, para pH final 6.5
Agua destilada
Eritrocitos frescos humanos de grupo O
Solucin fisiolgica
PREPARACIN
Buffer: diluir el contenido del frasco con el volumen de agua destilada indicado
en el rtulo. A baja temperatura el buffer concentrado puede cristalizar. En tal
caso colocar en bao de agua a 37C unos minutos mezclando por inversin
hasta dilucin completa.
Estreptolisina O: disolver cada vial con el volumen de buffer indicado en el rtulo,
mezclando por inversin hasta disolucin completa.
Suspensin de eritrocitos: lavar los mismos tres veces con solucin fisiolgica.
Luego del ltimo lavado centrifugar a 2000 x g durante 15 min. En el
sobrenadante no debe aparecer hemlisis; caso contrario desechar. Con los
eritrocitos lavados, una vez descartado el sobrenadante, preparar una suspensin
del 3 al 5% con buffer pH 6.5
ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO
Reactivos provistos: son estables en refrigerador (2 - 10C) hasta la fecha de
vencimiento indicado en la caja.
Estreptolisina O: Una vez preparada es estable 2 horas a temperatura ambiente,
5 das en refrigerador (2 - 10C) o 2 meses congelada (-20C) y fraccionada.
Buffer: estable 1 ao en refrigerador (2 - 10C).
Suspensin de eritrocitos: los eritrocitos pueden usarse hasta 48 horas despus
de preparada la suspensin si previamente se lavan una vez con buffer y no se
observa hemlisis.
76
MUESTRA
Suero
a) Recoleccin: debe obtenerse suero libre de hemlisis.
b) Aditivos: no se requieren.
c) Sustancias interferentes conocidas: muestras con hemlisis visible pueden
conducir a una interpretacin errnea de los resultados, por lo que deben
descartarse.
d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: la antiestreptolisina en suero
es estable congelada por lo que puede mantenerse en estas condiciones hasta
efectuar el ensayo.
PROCEDIMIENTO
Preparar diluciones de la siguiente forma:
1:10 (0.2 ml de suero + 1.8 ml de Buffer)
1:100 (0.5 ml de dilucin 1:10 + 4.5 mI de Buffer)
1:500 (1 ml de dilucin 1:100 + 4 mI de Buffer)
Luego proceder de la siguiente forma:
Dilucin de suero 1 en 10
1 en 100
Tubo No.
1 2
3
4
5
Suero diluido (ml)
0.2
1 0.8 0.6
0.4
Buffer (ml)
0.8
0.2 0.4
0.6
Estreptolisina O
(ml)
0.5 0.5 0.5 0.5
0.5
6
0.3
0.7
7
1
0.5
0.5
1 en 500
controles
8
9 10 11 12 13
0.8 0.6 0.4 0.2
0.2 0.4 0.6 0.8 1.5
1
0.5 0.5 0.5 0.5
0.5
Mezclar y mantener a bao Mara a 37C 15 min (o incubadora)

Eritrocitos 3 - 5%
(ml)
0.5 0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5 0.5
0.5
0.5
0.5 0.5
Mezclar agitando ligeramente y mantener en bao Mara a 37C durante 15 min,

agitar nuevamente y continuar en bao Mara durante 30 min ms. Centrifugar 3
min a1500 x g y leer.
Unidades Tood/ml
50
100 125
166
250
333 500 625 833 1250 2500
(-)
(+)
77
MATERIAL
- Tubos de ensayo.
- Material volumtrico apropiado.
- Centrfuga.
- Bao de agua a 37C
CONDICIONES DE REACCIN
- Temperatura de reaccin: 37C
- Tiempo de incubacin: 60 min.
- Volumen final de reaccin: 2 ml
INTERPRETACIN DE RESULTADOS
El ttulo de la muestra se expresa mediante la inversa de la mayor dilucin en la
cual se observa ausencia total de hemlisis.
El tubo 12 (control eritrocitario) no deber presentar hemlisis mientras que el
tubo 13 (control estreptolisina O) deber mostrar hemlisis completa.
MTODO DE CONTROL DE CALIDAD
Para controlar el procedimiento y los reactivos es conveniente procesar
simultneamente un suero con cantidad conocida de antiestreptolisina O.
VALORES DE REFERENCIA
Normalmente, pueden existir en suero hasta 200 unidades de antiestreptolisina
O. Ttulos superiores son indicativos de un proceso infeccioso por estreptococo hemoltico de grupo A.
LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO
En caso de conservar la estreptolisina O reconstituida congelada, se recomienda
fraccionaria de modo de evitar los congelamientos y descongelamientos
sucesivos que ocasionan su deterioro.
78

1. Qu es la Estreptolisina O?
2. Cul es el ttulo de antiestreptolisina O (ASO) en adultos, que se considera
como lmite superior normal?
3. Cmo es el ttulo de ASO en un recin nacido, y porque?
4. Cmo se obtiene el antgeno necesario para el mtodo de medicin del ttulo
ASO?
5. Qu enfermedad presentan los pacientes con incidencia mayor de ttulos
elevados ASO?
6. Cules son los anticuerpos utilizados ms a menudo en situaciones clnicas?
DIAGRAMA DE FLUJO
0.2 ml
suero
1:10
1.8 ml
Buffer
0.5 ml
dilucin
1:10
1:100
4.5 ml
Buffer
1 ml
dilucin
1:100
1:500
4 ml
Buffer
79
Dilucin en
suero
Tubo no.
1:10
Suero diluido
(ml)
Buffer (ml)
Estreptolisisna
O (ml)
0.2
0.8
0.5
1:100
1:500
0.8
0.6
0.4
0.3
0.5
0.2
0.5
0.4
0.5
0.6
0.5
0.7
0.5
Controles
10
11
0.8
0.6
0.4
0.2
0.5
0.2
0.5
0.4
0.5
0.6
0.5
0.8
0.5
12
1.5
13
1
0.5
Mezclar y mantener en bao mara a 37 C 15 min (o incubar)

Tubo
no.
10
11
12
13
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
=
Eritro
3-5%
(ml)
Mezclar agitando en el bao

mara a 37 C durante 15
min., agitar nuevamente y
permanecer 30 min
Centrifugar 3 min a 1500 rpm

y leer
Incubadora
80
PRACTICA NO. 12
DIAGNOSTICO PRECOZ DEL EMBARAZO
INTRODUCCIN
La gonadotropina o gonadotrofina es una hormona secretada por la glndula
pituitaria. En la mujer, estimula el crecimiento del folculo ovrico que contiene el
vulo. La concentracin de la hormona estimulante del folculo (HFE o FSH) es
mxima en la primera parte del ciclo, durante las primeras etapas de desarrollo
del folculo. En el varn, la FSH es esencial para la espermatognesis (formacin
de espermatozoides).
Una de las funciones principales de la gonadotropina corinica humana (HCG, por
sus siglas en ingls, Human Chorionic Gonadotropin),
qumicamente una
glucoprotena, es administrar los factores nutricionales y estimular cantidades
necesarias de otras hormonas. Es una hormona que se sintetiza en el cerebro,
manifestando diferentes funciones en la mujer y en el hombre. Es producida por
clulas trofoblsticas (del sinciciotrofoblasto) de la placenta de la mujer durante
el embarazo; aumenta su concentracin en la sangre y en la orina de la mujer
poco tiempo despus de la implantacin, y su presencia sirve para realizar
pruebas de diagnstico de embarazo.
La HCG es la base histrica y actual del diagnstico de embarazos, su
diferenciacin de los falsos embarazos que pueden constituirse en tumores, as
como del diagnstico del cncer de prstata.
La HCG estimula la maduracin del vulo y en los varones la produccin de
testosterona dentro de los testculos. Una de las funciones ms importantes es la
de prevenir la involucin normal del cuerpo lteo al final del ciclo sexual
femenino. El cuerpo lteo, adems de secretar esta hormona, secreta
progesterona y estrgenos. Todos los tratamientos con HCG en hombres y en
mujeres deben ser supervisados por el mdico especialista, para evitar posibles
interacciones. Existen dos formas de valorar la presencia de HCG en el
laboratorio: en sangre y en orina.
Los aos de funcin reproductiva de la mujer se caracterizan por cambios
rtmicos en las tasas de secrecin de las hormonas femeninas y por cambios
correspondientes en los rganos sexuales. Las funciones sexuales y reproductivas
en la mujer pueden dividirse en dos fases principales: la primera es la
preparacin del cuerpo para la concepcin, la segunda es el periodo de gestacin
o embarazo.
81
Durante el periodo de gestacin en la mujer se producen grandes cantidades de

estas hormonas: HCG, estrgenos, progesterona y somatotropina corinica, ya
que sus niveles son esenciales para la supervisin del embarazo.
Una funcin principal de la HCG consiste en administrar los factores nutricionales
y estimular cantidades necesarias de otras hormonas para mantener en ptimas
condiciones el endometrio y la cavidad uterina, lo que, en caso de no haber
concepcin o cantidad insuficiente de esta hormona, se perdera en forma de
lquido menstrual.
La HCG tiene otras aplicaciones diagnsticas, aparte del monitoreo del periodo de
gestacin y sus consecuencias despus de ste. Tambin se utiliza como un
marcador tumoral en diferentes padecimientos neoplsicos en la mujer y en el
hombre.
Existen diferentes mtodos cuantitativos de laboratorio para determinar la
presencia y niveles de sta hormona, ya que con los aos se han actualizado y
purificado para el estudio, valoracin y diferenciacin de diversos diagnsticos.
Definitivamente el patrn de estudio de esta hormona es de gran importancia, ya
que nos proporciona aspectos clnicos importantes durante las diferentes etapas
de la naturaleza del hombre y de la mujer.
FUNDAMENTO
La gonadotropina corinica humana (HCG), es una hormona que aparece en la
orina de mujeres embarazadas o en ciertos procesos neoplsicos. La
determinacin de HCG se puede realizar inmunolgicamente mediante una
prueba de inhibicin de la aglutinacin pasiva. La HCG es una glucoproteina
producida por las clulas trofoblsticas despus de la concepcin. Despus de
cinco semanas de gestacin aumenta la HCG en la orina y alcanza su mximo a
las 10 semanas. En la medida de que la produccin de estrgenos y progesterona
por la placenta aumenta, durante el segundo trimestre del embarazo, los niveles
de HCG descienden.
OBJETIVO
Identificar la gonadotropina corinica humana en orina.
82
MATERIAL
- Orina problema
- Suero anti HCG
- Suspensin de partculas de ltex o eritrocitos recubiertos con GCFI
- Aplicadores de madera
- Pipetas graduadas de 1ml
- Centrfuga
METODO
1. Realice todo el proceso a temperatura ambiente
2. Filtre la orina o centrifugar y usar el sobrenadante
3. Coloque una gota de orina sobre la placa de vidrio
4. Adicione una gota del suero anti-HCG y mezcle
5. Adicione 2 gotas de suspensin de partculas recubiertas con HGC y mezcle
6. Mezcle suavemente la placa por 2 min y lea
7. Una inhibicin de aglutinacin indica una prueba positiva.
83
DIAGRAMA DE FLUJO
1.- Realice todo el proceso a

temperatura ambiente
3.- Coloque una gota de

orina sobre la placa de
vidrio
2.- Filtre o centrifugue la orina

y utilice el sobrenadante
4.- Adicione una gota de

suero anti-HGC y mezcle
6.- Mezcle la placa por dos min

(suavemente) e interprete
.
5.- Adicione 2 gotas de suspensin de
partculas con HGC
84

1. Que es la gonadotropina corinica humana?
2. Cmo es la estructura de la HCG?
3. Cmo es la relacin existente entre la HCG, pregnanediol y estriol en la
orina?
4. Cual es e! perodo en el cual el nivel de HCG es ptimo para obtener
resultados con esta prueba?
5. La persistencia de HCG en niveles altos es sugerente de
PRACTICA NO. 13
DIAGNOSTICO SEROLGICO DE SFILIS
INTRODUCCIN
La sfilis es una enfermedad infecciosa aguda o crnica cuyo agente causal es
Treponema pallidum (T. pallidum ) perteneciente, junto con otros treponemas,
Borrelias y Leptospiras, a la familia Treponemataceae.
La enfermedad est clasificada como venrea y de declaracin obligatoria, siendo
su mecanismo de transmisin el contacto directo con una lesin productiva. Tras
un perodo de incubacin de 12 a 90 das (media de 21 das), aparece en el lugar
de la inoculacin una lesin primaria, rica en treponemas (el chancro), que
desaparece espontneamente a las pocas semanas. Durante este primer estado,
conocido como sfilis primaria, T. pallidum se multiplica en los linfticos
regionales distribuyndose por la sangre a todos los rganos del individuo
(infeccin sistmica).
Generalmente las pruebas serolgicas se hacen positivas en este perodo pasadas
3-4 semanas de la infeccin. En el paciente no tratado, el segundo estado
comienza con la aparicin de una de las manifestaciones sistmicas de la
enfermedad: una erupcin en piel, palmas y plantas, la roseola sifiltica,
acompaada de sntomas generales y frecuentemente, de otros signos
localizados (condilomas genitales). Las lesiones abiertas de este perodo son muy
contagiosas. Tras la primera desaparicin espontnea de la misma y durante el
primer y segundo ao, pueden aparecen brotes similares cada vez de menor
85
intensidad (fases de latencia precoz) hasta que desaparecen totalmente todos los
signos y sntomas (fase de latencia tarda). El tercer estado de la enfermedad,
que solo se presenta en unos pocos pacientes, se caracteriza por la formacin de
lesiones granulomatosas destructivas (gummas) que, curiosamente, tienen
escasa carga treponmica. En este perodo pueden aparecer sntomas y signos
de focalizacin de la enfermedad: neurosfilis, sfilis cardiovascular, etc.
La identificacin del T. pallidum mediante el examen directo del exudado de la
lesin (campo oscuro y/o fluorescencia directa) es una prueba definitiva para
asegurar el diagnstico, aunque un resultado negativo del mismo no descarta la
posibilidad de la enfermedad, ya que la presencia de treponemas puede ser
escasa dependiendo de los das de evolucin y de tratamientos previos.
Debido a las dificultades que puede presentar la realizacin del diagnstico
directo, la experiencia indica que el diagnstico indirecto (serolgico) se ha
convertido en el procedimiento de uso ms frecuente. Actualmente existen
diferentes tcnicas para el diagnstico serolgico de sfilis: las no treponmicas
(reagnicas) no determinan anticuerpos especficos frente a T. pallidum y se
basan en antgenos compuestos de soluciones alcohlicas con cantidades
determinadas de cardiolipina, colesterol y lecitina.
Miden anticuerpos frente a estas sustancias que son producidas por los tejidos
daados por el T. pallidum. Estas pruebas son: VDRL (Venereal Research
Disease Laboratory), RPR (Rapid Plasma Reagin), TRUST (Toluidine Red
Unheated Serum Test), USR (Unheated Serum Reagin) y ELISA
(Enzimoinmunoensayo). Son de bajo costo, fciles de efectuar, se utilizan como
pruebas de inicio en la deteccin de sfilis y para evaluar la respuesta al
tratamiento. La desventaja que presentan es que, debido a su inespecificidad,
pueden arrojar falsos resultados positivos.
Las pruebas treponmicas, en cambio, detectan especficamente los anticuerpos
de T. pallidum y su utilidad en el laboratorio est orientada a confirmar los
resultados arrojados por las pruebas no treponmicas. Las pruebas treponmicas
ms conocidas son: FTA-Abs (Inmunofluorescencia indirecta con absorcin del
suero), FTA-Abs 200DS (Inmunofluorescencia indirecta con absorcin y doble
tincin), TPHA (Microhemaglutinacin), Captia syphilis M (ELISA de captura
anti cadena pesada), ELISA IgG, y WESTERN BLOT, las cuales tienen muy bajo
ndice de falsos resultados, tanto positivos como negativos. Deben realizarse con
una absorcin previa del suero para eliminar la reaccin cruzada con otras
treponemas. Sin embargo, carecen de utilidad para monitorear los tratamientos,
ya que suelen permanecer positivas en el 85/90% de los pacientes tratados y
curados.
86
FUNDAMENTO
La prueba del VDRL es un procedimiento de floculacin no treponmico usado
para detectar anticuerpos en sueros de pacientes con sfilis designados como
reaginas. Si el resultado no esta de acuerdo con la observacin clnica, se debe
hacer una prueba de inmunofluorescencia.
MATERIAL
Equipo de diagnostico para pruebas no treponmicas
Suero problema, Suero testigo
Placas de aglutinacin
Bao mara
Microscopio y aplicadores de madera
METODO
1. Inactive el suero a 56C durante 30 min (para VDRL)
2. Adicione en las placas una gota de los siguientes sueros: suero problema,
suero testigo positivo, suero testigo negativo.
3. Coloque una gota de emulsin del antgeno, en cada uno de los pozos de la
placa.
4. Mezcle por tres min y lea de inmediato en un microscopio con objetivo 10X. La
presencia de floculacin se interpreta como una prueba positiva.
87
DIAGRAMA DE FLUJO
2.- Adicione a las placas una gota

de los siguientes sueros: suero
problema, suero testigo positivo y
suero testigo negativo
1.- Inactive el suero para la VDRL
3.- Coloque una gota

de emulsin del
antgeno en cada uno
de los pozos de las
placas
4.- Mezcle por tres min y lea de

inmediato a en un microscopio a un
objetivo de 100x. La presencia de
floculacin se interpretar como
positiva
88

1. Qu es la Sfilis y cmo se puede prevenir?
2. Cmo se diagnostica en un laboratorio clnico?
3. Qu significa la prueba del antgeno no treponmico?
4. Qu significa VDRL?
5. Qu significa la prueba del antgeno treponmico?
6. Explique como se presenta una sfilis congnita.
PRACTICA NO. 14
DETERMINACION DEL FACTOR REUMATOIDE
INTRODUCCIN
La artritis reumatoide (AR) es una enfermedad autoinmune sistmica que afecta
el 1% de la poblacin adulta a nivel mundial , se caracteriza por inflamacin
crnica de la membrana sinovial que finalmente conduce a prdida de la funcin,
dolor crnico y fatiga, hasta incapacidad en las personas que la padecen. Su
causa es desconocida, aunque mltiples factores estn involucrados en la
patogenia de la enfermedad.
Caractersticas inmunitarias principales
Los factores reumatoides IgM, IgA e IgG monomrica y pentamrica, existen
en suero y lquido sinovial
Clnicamente, hay vasculitis y sinovitis.
Consideraciones generales
La AR es una enfermedad inflamatoria crnica, recidivante y sistmica, que
afecta principalmente las articulaciones. Afecta de 1 a 3% de la poblacin de
EUA, con una relacin de mujeres a varones 3:1. Los sntomas constitucionales
incluyen malestar general, fiebre y prdida de peso. La enfermedad tiene un
inicio caracterstico en las articulaciones pequeas de manos y pies, y progresa
de manera centrpeta y simtrica. Los ancianos pueden presentarse con afeccin
89
de las articulaciones grandes proximales. Son frecuentes las deformidades. Las

manifestaciones extraarticulares son vasculitis, atrofia de piel y msculo, ndulos
subcutneos, linfadenopata, esplenomegalia y leucopenia.
Patogenia inmunitaria
Se desconoce la causa de la AR. Cerca de 70% de los individuos con AR tienen un
haplotipo HLA -DR4. Este haplotipo posee algunas variantes diferentes. Ciertos
alelos HLA DR determinan la susceptibilidad a la enfermedad, as como su
intensidad. Es posible que stos y quizs otros determinantes genticos
proporcionen susceptibilidad a un factor ambiental no identificado, como un
virus, que inicia el proceso de la enfermedad. Aunque nunca se han identificado
partculas virales, en teora un estmulo antignico origina la aparicin de una IgG
anormal, lo cual ocasiona la produccin de factor reumatoide y el desarrollo
eventual de la enfermedad.
Cualquiera que sea el estmulo primario, los linfocitos sinoviales producen IgG,
IgM monomrica e IgM pentamrica antiinmunoglobulina (es decir, factores
reumatoides). La presencia de agregados de IgG o complejos de IgG factorreumatoide, pueden activar el sistema del complemento e inducir diversos
fenmenos inflamatorios, como liberacin de histamina, produccin de factores
quimiotcticos para neutrfilos PMN y clulas MN y dao a la membrana con
citlisis. Existe un marcado flujo de leucocitos hacia el espacio sinovial.
Las prostaglandinas y los leucotrienos, producidos por clulas inflamatorias, se
consideran que desempean una funcin principal en la mediacin de los
procesos inflamatorios. Adems, los lisosomas activados y las enzimas liberadas
al espacio sinovial por leucocitos, amplifican ms an la respuesta inflamatoria de
la membrana sinovial.
El infiltrado mononuclear que se observa de manera caracterstica dentro del sino
vio, incluye colecciones perivasculares de clulas CD4 y conjuntos intersticiales
de clulas CD8, linfocitos B, linfoblastos, clulas plasmticas y macrfagos. La
interaccin inmunitaria de estas clulas origina liberacin de linfocinas, las cuales
ocasionan acumulacin de macrfagos dentro del sinovio. Las diversas clulas
inflamatorias de la articulacin producen protenas y colagenasas que lesionan el
cartlago y las estructuras de soporte celular.
Los factores reumatoides pueden tener una funcin importante en la causa de la
enfermedad extraarticular. Los sujetos con vasculitis reumatoide tienen ttulos
aumentados de factores reumatoides de IgG, IgM e IgA. Los complejos antgenoanticuerpo aplicados a animales de experimentacin en presencia de factor
reumatoide IgM, originan vasculitis necrosante. En teora, los complejos
90
inmunitarios inician la inflamacin vascular por la activacin del complemento. La

afeccin pulmonar se relaciona con el depsito de complejos 11S y 15S, que
contienen agregados de IgG en las paredes de vasos pulmonares y alvolos.
El factor reumatoide IgM 19S tambin se ha detectado en arteriolas y paredes
alveolares adyacentes a los ndulos cavitarios. Los factores reumatoides no
inician el proceso inflamatorio que ocasiona la enfermedad reumatoide, pero
quiz perpeten y amplifiquen este proceso.
Diagnstico inmunitario
El dato serolgico ms importante es el ttulo aumentado de factor reumatoide,
presente en ms de 75% de los individuos. Los factores reumatoides son
inmunoglobulinas con especificidad para el fragmento Fc de la IgG. La mayor
parte de las tcnicas de laboratorio detecta factor reumatoide de IgM
pentamrica, pero las propiedades del factor reumatoide tambin se aprecian en
IgG e IgA.
El factor reumatoide de IgM pentamrica puede combinarse con molculas IgG
para formar un complejo soluble circulante de alto peso molecular de
inmunoglobulinas en el suero.
En la AR, la electroforesis de protenas sricas puede mostrar incremento de alfa2 -globulina, hipergammaglobulinemia policlonal e hipoalbuminemia. A menudo,
se aprecian en la vasculitis reumatoide los crioprecipitados compuestos de
inmunoglobulinas. Los valores sricos del complemento en general son normales,
pero pueden estar reducidos cuando hay vasculitis activa. Muchos sujetos tienen
anticuerpos antinucleares.
Se dispone de varias pruebas para detectar factor reumatoide en el laboratorio.
En la actualidad, el mtodo ms utilizado para deteccin de factor reumatoide es
la prueba de fijacin en ltex. La gamma-globulina agregada (fraccin II de
Cohn) se absorbe en las
Partculas de ltex, que entonces se aglutinan en presencia del factor
reumatoide; sin embargo, no es especfica, aunque si muy sensible, lo que
origina gran incidencia de resultados falsos positivos. La prueba de eritrocitos
sensibilizados de abeja (prueba de Rose- Waaler) depende de la fijacin de
anticuerpo especfico, y es ms especfica que el anlisis de fijacin de ltex. Los
eritrocitos de carnero se recubren con anticuerpo de conejo contra eritrocitos de
carnero. Los eritrocitos de carnero sensibilizados se aglutinan en presencia de
factor reumatoide. Otras tcnicas capaces de detectar el factor reumatoide de
91
todas las clases, incluyen

nefelometra con lser.
RIA,
inmunofluorescencia
indirecta,
ELISA
Sin embargo, resultados negativos de una prueba de factor reumatoide realizada

con los procedimientos usuales de laboratorio no excluyen el diagnstico de AR.
Cerca de 20% de los individuos con AR por otra parte clsica son seronegativos.
Algunos de estos pueden tener IgG, IgA o factores reumatoides monomricos.
Por el contrario, los factores reumatoides no son nicos para la AR. El factor
reumatoide tambin se encuentra en sujetos con lupus eritematoso sistmico
(30%), en un gran porcentaje de sujetos con sndrome de Sjogren (90%), y con
menor frecuencia, en individuos con esclerodermia o polimiositis. Las pruebas
positivas de aglutinacin con la prueba de ltex, tambin se presentan en
personas con cierto nmero de afecciones inflamatorias crnicas como hepatitis
crnica activa, kala-azar, sarcoidosis, neoplasia y sfilis. La prueba de los
eritrocitos de carnero sensibilizados, en general es negativa en esos trastornos.
En algunas enfermedades infecciosas crnicas, como lepra y tuberculosis, pueden
ser positivas la prueba de ltex y la prueba del eritrocito de carnero sensibilizado.
En la endocarditis bacteriana subaguda, ambas pruebas pueden ser positivas
durante la enfermedad activa y es posible que se vuelvan negativas al mejorar el
paciente. En los reclutas militares se ha notado la aparicin transitoria de factor
reumatoide despus de vacunaciones. Los estudios epidemiolgicos han
mostrado que un nmero pequeo de gente normal tiene factores reumatoides.
Gran proporcin de los ancianos tiene prueba positiva de ltex, aunque en
general es negativa la prueba de eritrocitos de carnero sensibilizados.
ARTRITIS JUVENIL
Sus caractersticas inmunitarias principales son la existencia de factores
reumatoides evidentes o escondidos y la presencia de anticuerpos
antinucleares.
La artritis juvenil consiste en un grupo de trastornos que se presentan en
individuos menores de 16 aos de edad. La incidencia de esta enfermedad tiene
un punto mximo en los varones a la edad de dos aos y de nuevo a los nueve
aos, mientras que en las nias alcanza su punto mayor entre 1 y 3 aos de
edad. Esta enfermedad se puede presentar como una enfermedad sistmica
(enfermedad de StiII), poliartritis o pauciartritis seronegativa, o bien poliartritis
seropositiva idntica a la artritis reumatoide del adulto. El pronstico de las nias
con enfermedad pauciarticular es excelente, mientras que los varones con esta
enfermedad pueden desarrollar finalmente espondilitis anquilosante.
92
En cuanto a su patogenia inmunitaria. Se desconocen los mecanismos bsicos

inmunopatgenos de la artritis juvenil; sin embargo, se presentan defectos
humorales y celulares. Est presente hipergammaglobulinemia difusa que incluye
IgG, IgA e IgM. Se han detectado factores reumatoides de todas las clases de
inmunoglobulinas. Cerca de 10% de los nios con artritis juvenil tiene una
prueba positiva de fijacin de ltex para factor reumatoide IgM. El suero de
algunas personas con pruebas negativas de fijacin de ltex puede contener
factores reumatoides IgM.
Se han ofrecido dos teoras principales es un intento de explicar la presencia de
estos factores reumatoides escondidos en la artritis juvenil. Primero, el factor
reumatoide IgM puede fijarse con avidez a la IgG nativa en el suero del enfermo
y, por tanto, no tiene la propiedad de fijar la IgG que recubre las partculas de
ltex. Segundo, puede haber una IgG anormal que de preferencia se fija a la IgM
y, por tanto, bloqueo la prueba de fijacin de ltex. Los factores reumatoides de
IgM pentamrica que reaccionan en fro (4C), llamados crioglobulinas se
vinculan con la enfermedad grave.
Estn aumentados los componentes sricos de la va clsica y alterna del
complemento, aunque este aumento es menor en nios con factores reumatoides
o enfermedad grave. El aumento del complemento srico puede reflejar una
sobre compensacin secundaria en respuesta al incremento en el consumo o
quiz un aumento general en la sntesis de protenas. Los estudios de
metabolismo del complemento, en realidad muestran hipercatabolismo. La
depresin del complemento en el lquido sinovial tal vez sea secundaria a la
activacin del complemento, debida a complejos inmunitarios, similar a la que se
aprecia en la artritis reumatoide.
Los estudios sugieren que los pacientes con artritis juvenil poseen ciertos tipos
tisulares de HLA con frecuencias mayores a las esperadas. De esta manera, las
personas con la enfermedad pauciarticular de inicio temprano, tienden a ser
positivos para los antgenos HLA -DR5 o HLA-DR8, mientras que aquellos con la
enfermedad pauciarticular de inicio tardo, tienden a ser HLA -B27 positivas. Los
individuos con enfermedad poliarticular positiva a factor reumatoide, tienden a
ser HDL-D4 positivos, y aquellos con enfermedad sistmica tienden a resultar
HLA-DR5 positivos.
Finalmente, el diagnstico inmunitario de la artritis juvenil, al momento, se basa
en estudios clnicos. Aunque ciertas anormalidades de las inmunoglobulinas,
complemento e inmunidad celular son compatibles con el diagnstico de artritis
juvenil, ninguna prueba inmunitaria especfica es diagnstica.
93
FUNDAMENTO
Las partculas de poliestireno cargadas con gamma-globulina humana son
aglutinadas por las muestras que contienen factores reumticos.
OBJETIVO
Procesar el estudio de laboratorio para identificar la presencia o ausencia de
factores reumatoides en pacientes, as como establecer sus caractersticas y
significado inmunitario.
MATERIALES Y REACTIVOS
3 Pipetas serolgicas de 1/100 ml
1 Placa plstica de prueba de factor reumatoide
3 Muestras sricas presuntamente positivas a factores reumatoides
Aplicadores de madera o de plstico
PROCEDIMIENTO
1. Llevar las muestras de los pacientes y/os reactivos a temperatura ambiente.
2. Colocar en uno de los campos de la placa de prueba, 40 l de muestra srica
del paciente sin diluir; en otro campo, una gota (aproximadamente 40 I) de
suero control positivo y, finalmente, en un tercer campo, colocar una gota de
igual magnitud que las anteriores de suero control negativo.
3. Colocar una gota (aproximadamente 40 l) del reactivo comercial Rapi Tek-RF
previa agitacin, en cada una de las muestras; despus, utilizando los
aplicadores de madera o de plstico, mezclar estas soluciones. Al terminar,
imprmale a la placa un movimiento de rotacin con el fin de homogeneizar los
componentes.
4. Al cabo de 2 min observe si se presenta una aglutinacin (prueba positiva).
INTERPRETACIN
Una clara aglutinacin indica la presencia de factores reumatoides. Las muestras
que no reaccionan a la prueba no contienen factores reumatoides o estos se
encuentran en una concentracin menor a las 20 UI/ml.
94

1. Describe que es la protena C reactiva
2. En que individuos encontramos esta protena?
3. Cmo se determina la presencia de esta protena?
4. En que casos aumentan los niveles de protena C reactiva?
5. Cul es su utilidad ms comn?
95
DIAGRAMA DE FLUJO
Llevar las muestras de

los pacientes y/o los
reactivos a
temperatura ambiente
Colocar en uno de los

campos de la placa de
prueba, 40 l de
muestra srica del
paciente sin diluir, en
otro campo, una gota
del suero control
positivo, y en otro
campo, colocar una gota
de control negativo
Colocar
una gota
del
reactivo
Rapi TekRF en cada
muestra
Al cabo de dos minutos

observe si se presenta
aglutinacin (prueba
positiva)
Mezclar las soluciones

con un agitador.
Enseguida imprimir
movimiento para
homogenizar
componentes
96
PRACTICA NO. 15
PROCEDIMIENTO PARA LA OBTENCIN DE CLULAS MONONUCLEARES A
PARTIR DE SANGRE TOTAL POR EL MTODO FICOLL-HYPAQUE
OBJETIVO
Aprender la metodologa para obtener clulas mononucleares (MN) a partir de
sangre venosa.
METODOLOGA
La sangre perifrica se colecta en tubos Vacutainer con EDTA y se procesa en un
lapso no mayor de cuatro horas a temperatura ambiente. Posteriormente, la
sangre total se centrifug a 1500 x g durante 15 min, se recolect el plasma y se
colect en un tubo cnico de 15 ml la capa de clulas MN o suspensin celular
(SC) presente entre el plasma y el paquete globular, posteriormente la SC se
resuspende en RPMI suplementado con suero fetal bovino (SFB) al 10% y 27 mM
de bicarbonato de sodio llevndolo a 6 ml, despus se pasa a otro tubo cnico
con 3 ml de Ficoll-histopaque de una manera lenta por las paredes del tubo, se
centrifuga a 1,500 x g durante 15 min (eliminar freno de la centrfuga), se
obtienen 4 capas, Ficoll, MN, Ficoll y PMN con eritrocitos, respectivamente.
Posteriormente, se recupera el anillo rico en clulas MN mediante aspiracin con
una pipeta Pasteur y se lava dos veces PBS estril llevndolo hasta 10 ml para
lavar del Ficoll que haya quedado, manteniendo en hielo y centrifugar a 1500 x g
durante 5 min. Se elimina el PBS por decantacin y el botn celular se
resuspende con 1 ml (2 ml si es una SC grande) de medio de cultivo RPMI-1640
completo (Sigma Chemical Co., St Louis, MO, USA) suplementado con SFB al
10%, inactivado por calor, se mezcl dentro del medio para no formar burbujas
con la misma micropipeta.
97
Viabilidad Celular
Los botones celulares se resuspenden en RPMI completo con SFB, 100 U/ml de
penicilina/100 g/ml de estreptomicina, 2 mM de L-glutamina, 15 mM de hepes
(2.38 g/l), aminocidos esenciales y 50 M de 2-Me. La viabilidad de las clulas
se determina utilizando la prueba de exclusin del colorante azul de tripano. Se
realiza en un hematocitmetro (cmara de Neubauer) de la siguiente manera: se
preparan 100 l de suspensin (1:10): en un tubo eppendorf se agregan 90 l de
PBS + 10 l de SC, se mezcla y en otro tubo eppendorf se toman de esta
suspensin 10 l + 80 l de PBS + 10 l de azul de tripano, se mezcla e
inmediatamente se toman 10 l y se agregan a un hematocitmetro para
determinar la viabilidad celular.
Se realiza una dilucin con 100 l de SC: en un tubo eppendorf de adicionan 90
l de PBS ms 10 l de SC (1:10), de esta suspensin se toman 10 l y se pasan
a otro tubo eppendorf con 80 l de PBS ms 10 l de azul de tripano (1:100) e
inmediatamente despus se mezcla y se toman 10 l para adicionarlos a un
hematocitmetro para contar las clulas MN en un microscopio con el objetivo
seco dbil (10X), una vez contadas, la densidad celular se ajust a una
concentracin de 1 x 106 clulas/ ml:
Nmero de clulas / 4 x 104 x factor de dilucin = cantidad de clulas/ ml
Se incuban a 37C en una atmsfera hmeda con 5% de CO2, por ser una
transformacin blastoide con antgenos especficos (5 a 6 das). Despus de
haber incubado la SC, a cada pozo de la placa se le aaden 20 l de bromuro de
difeniltetrazolio (MTT) (5 mg/ml de RPMI 1640)/pozo y se incuban durante 60
min ms; posteriormente, a las placas se les descarta el sobrenadante. Luego se
adicionan 300 l de Dimetil sulfxido (DMSO)/pozo, para hacer liposolubles las
clulas y se efecta la lectura de la placa en un lector de ELISA a una densidad
ptica (DO) de 570 nm.
98
DIAGRAMA DE FLUJO
OBTENCION DE CELULAS MONONUCLEARES POR EL METODO FICOLLLHYPAQUE
Sangre en tubo procesada
Centrifugar
15 min.
Recolectar plasma
Resuspender en RPMI
Pasar a un tubo Ficoll-histopaque y centrifugar
Recuperar el anillo de clulas mononucleares con una pipeta Pasteur
Centrifugar 5 min, suspender en medio de cultivo con cultivo RPMI-1640
Numero de clulas /factor de

dilucin = cantidad de clulas/ml
99
CONGELACIN Y DESCONGELACIN DE CLULAS MONONUCLEARES

Cuando sea necesario se lleva a cabo la congelacin de linfocitos la cual consiste
en que una vez obtenidos los linfocitos de sangre perifrica se suspenden en 0.1
ml de RPMI 1640 a una concentracin de 6 X 107 clulas/ml y se colocan en un
criotubo, inmediatamente se adiciona 90% (90l) de SFB y 10% (10l) de DMSO
y luego se congelan a -70C. Para descongelar las clulas, se mantienen a
temperatura ambiente durante 10 min y luego se centrifugan a 800 x g durante
10 min a 10C; despus se descarta el sobrenadante y el paquete celular se
suspende en RPMI 1640, ajustando las clulas a la concentracin deseada. Se
efecta la lectura de la placa en un lector de ELISA a una DO de 570 nm.
Obtenidos los linfocitos se suspenden en RPMI
Se adiciona suero fetal bovino
Descongelar a temperatura ambiente 10 min
Centrifugar 10 min
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PRACTICA NO. 16
PRUEBAS CRUZADAS
INTRODUCCIN
La transfusin es uno de los modelos trascendentales que obligan a la aplicacin
rigurosa del control de calidad. Actualmente, hay una gran variedad de pruebas
pretransfusionales que se han desarrollado para mejorar la seguridad y eficacia
de una transfusin; si se efectan de manera adecuada, establecen la
compatibilidad ABO entre el donador y el receptor y detectan la mayora de los
anticuerpos clnicamente significativos.
FUNDAMENTO:
Este se logra a travs de la deteccin de anticuerpos salinos y de anticuerpos
incompletos.
OBJETIVO:
Establecer la aceptacin o rechazo de una transfusin.
METODO
1. Preparar una suspensin al 5% de hemates en solucin isotnica, tanto del
donador como del receptor.
2. Usando tubos de ensayo pequeos:
PRUEBA MAYOR
Una gota de suero del receptor
Una gota de suspensin de eritrocitos
eritrocitos del
del donador
PRUEBA MENOR
Una gota de suero del donador
Una gota de suspensin de
receptor
AUTOTESTIGO
Una gota de eritrocitos del receptor ms dos gotas de suero del receptor
- Agitar cada tubo y centrifugar inmediatamente a 1000 x g durante 1 min.
- Remover suavemente
aglutinacin.
los
eritrocitos
sedimentados
observar
si
hay
- Si el resultado es dudoso, incubar a 37C durante 20 min.

- Centrifugar a 1000 x g durante 1 min y remover los eritrocitos sedimentados.
Observar si existe hemaglutinacin macroscpica.
- Si la reaccin continua siendo negativa, dbil positiva o dudosa se lavan los
eritrocitos 4 veces con solucin isotnica a 0.9%.
- Despus del ltimo lavado se elimina el sobrenadante (solucin isotnica) y se
resuspenden los eritrocitos en las ultimas 1 2 gotas de solucin isotnica.
- Agregar una gota de suero de Coombs a cada tubo.
- Mezclar. Centrifugar a 1000 x g durante un min.
- Remover suavemente los eritrocitos sedimentados y observar si existe la
aglutinacin macroscpica. Tambin se puede observar al microscopio sin
cubreobjetos.
- Interpretacin: en caso de compatibilidad, las reacciones o pruebas cruzadas no
presentan ni hemlisis ni aglutinacin.
NO aglutinacin en la prueba mayor y en la prueba menor, esto significa 100%
de
COMPATIBILIDAD SANGUNEA.
Aglutinacin en la prueba mayor: 75% de incompatibilidad
Aglutinacin en la prueba menor: 25% de incompatibilidad
PRUEBAS CRUZADAS EN MEDIO PROTEINICO
PRUEBA MAYOR
Dos gotas de suero del receptor
del
del donador al 2%
PRUEBA MENOR
Dos gotas de suero del donador
receptor al 2%
- Agregar dos gotas de albmina bovina al 22%

- Incubar 15 min a 37C

- Mezclar y centrifugar durante un min a 3000 x g.
- Remover suavemente los eritrocitos sedimentados y observar si existe
aglutinacin macroscpica.
1. Para que se realizan en un Banco de Sangre las pruebas cruzadas?
DIAGRAMA DE FLUJO
Suspensin de eritrocitos en solucin isotnica
Prueba mayor
Prueba menor
Agitar y centrifugar cada tubo
Remover eritrocitos y ver aglutinacin
Si es dudoso el resultado, incubar. Centrifugar nuevamente resultado dudoso, lavar

eritrocitos. Resuspender en solucin isotnica y agregar suero de Coombs 1 gota
Mezclar y centrifugar 1 min
Remover eritrocitos sedimentados, observar.
EN CASO DE COMPATIBILIDAD, NO PRESENTA HEMOLISIS NI
AGLUTINACION
PRACTICA NO. 17
PRUEBA DE COOMBS
El Fundamento de la Prueba de Coombs es que permite demostrar la presencia
de anticuerpos incompletos mediante el uso de un segundo anticuerpo, que es
una antiglobulina. La Prueba de Coombs directa se utiliza como mtodo
diagnstico de enfermedades como las anemias hemolticas, la enfermedad
hemoltica del recin nacido y en las reacciones transfusionales. La Prueba de
Coombs indirecta se usa para realizar tipificacin de grupos sanguneos, pruebas
sanguneas cruzadas y como mtodo de rastreo para evitar reacciones
transfusionales.
PRUEBA DE COOMBS DIRECTA
FUNDAMENTO
Se emplea la antiglobulina para detectar los anticuerpos incompletos
antieritrocitarios, que ya se encuentran unidos in vivo a los eritrocitos. Es un
procedimiento valioso en el diagnstico de la anemia hemoltica del recin nacido
y en la anemia hemoltica auto inmune.
METODO EN TUBO
- Colocar una pequea cantidad de sangre completa en un tubo de ensayo.
- Lavar con solucin isotnica 4 veces, centrifugando en cada ocasin y eliminar
el sobrenadante salino.
- Preparar una suspensin de eritrocitos al 2%
- Depositar una gota de la suspensin de eritrocitos en un tubo pequeo y aadir
una gota de suero de Coombs.
- Mezclar y centrifugar a 1000 x g durante 1 min.
INTERPRETACIN
Aglutinacin: significa prueba directa positiva.
MTODO EN PORTAOBJETOS:
- Preparar una suspensin de hemates al 50%, lavando previamente los
eritrocitos en 4 ocasiones.
- Colocar una gota de la suspensin de hemates en un portaobjetos.
- Agregar a un lado 1 gota de suero de Coombs.
- Mezclar con un agitador.
- Rotar el portaobjetos
- Observar si hay aglutinacin dentro de los siguientes dos min.
DIAGRAMA DE FLUJO
Colocar una
pequea
cantidad de
sangre completa
en un tubo de
ensayo.
PREPARAR SUSPENSION
DE ERITROCITOS AL 2 %.
Lavar con solucion salina 4
veces, centrifugar en cada
ocasion y eliminar el
sobrenadado.
Solucion
salina
Depositar una cantidad

apropiada de sangre y
solucion salina, centrifugar
durannte 5 minutos.
Decantar el sobrenadante e
incorporar
nuevamente
durante 5 minutos, realizar
1 vez mas.
Solucion
salina
Depositar una gota de

suspension de eritrocitos
en un tubo pequeo y
aadir una gota de suero
de Coombs.
Mezcalr y centrifugar a
1000
rpm
durante
1
minuto.
Remover
suavemente los eritrocitos
sedimentados y observar
si
existe
aglutinacion
macroscopica.
PRUEBA DE COOMBS INDIRECTA

FUNDAMENTO
Se emplea la antiglobulina para detectar la presencia de anticuerpos incompletos
antieritrocitarios no unidos in vivo a los eritrocitos. Para detectar ciertos grupos
sanguneos como el Duffy, kell y kidd. Se realiza en dos fases, en la primera se
enfrentan los anticuerpos frente a hemates de antigeinicidad conocida para
provocar su unin y posteriormente se aade al antiglobulina hemaglutinante.
METODO EN TUBO
- Preparar una suspensin de eritrocitos al 5%
- Depositar una gota de la suspensin de eritrocitos a cada tubo pequeo
- Mezclar y centrifugar a 1000 rpm durante un min.
- Remover suavemente los eritrocitos sedimentados
- Lavar con solucin isotnica 4 veces, centrifugando en cada ocasin y eliminar
el sobrenadante salino dejando 1 o 2 gotas para resuspender.
- Aadir una gota de suero de Coombs. Mezclar y centrifugar.
INTERPRETACIN
Aglutinacin: significa la presencia de anticuerpos incompletos.
MTODO EN PLACA:
- Preparar una suspensin de hemates grupo sanguneo O factor Rh positivo
- Agregar dos gotas de suspensin de eritrocitos al 50%, en un tubo.
- Agregar cinco gotas de suero problema. Mezclar e incubar a 37C durante 60
min.
- Lavar los eritrocitos en cuatro ocasiones con solucin isotnica y resuspender

hasta obtener una suspensin de aproximadamente el 50%.
- Depositar una gota de la suspensin de eritrocitos lavados y sensibilizados en
un portaobjetos.
- Depositar separadamente una gota de suero de Coombs.
- Mezclar con un aplicador de madera y rotar el portaobjetos.
- Observar si hay aglutinacin dentro de los dos min siguientes.
- Agregar a un lado 1 gota de suero de Coombs.
- Mezclar con un agitador.
- Rotar el portaobjetos
- Observar si hay aglutinacin dentro de los siguientes dos min.
DIAGRAMA DE FLUJO
PREPARAR SUSPENSION
DE ERITROCITOS AL 5 %.
Depositar una cantidad
apropiada de sangre y
durannte 5 minutos.
Solucion
salina
Decantar el sobrenadante e
incorporar
nuevamente
durante 5 minutos, realizar
1 vez mas.
Depositar una gota de la

suspension de eritrocitos
a cada tubo pequeo.
mezclar y centrifugar a
1000 rpm durante 1
minuto.
Lavar con solucion salina 4

veces, centrifugar en cada
ocasion y eliminar el
sobrenadado. dejando 1
gota para resuspender.
Solucion
salina
PRACTICA No. 18
PODER BACTERICIDA DEL SUERO NORMAL
El suero normal contiene una serie de sustancias, que son capaces de destruir a
las bacterias. Estas sustancias estn presentes en mayor o menor grado en todos
los sueros, y por lo tanto no son el resultado de una inmunizacin previa. Por
esta razn estn clasificadas dentro de las defensas inespecficas del organismo
La cantidad de las diversas sustancias presentes en el suero vara de especie a
especie, y entre individuos. Su eficacia depende tambin del agente infeccioso
que se trate.
Sustancia
Accin
Lisozima
Destruye pared celular de Gram +
Fagocitina
Acta sobre Gram - y algunos Gram +
Lisina
Acta sobre Gram +
Complemento
Tiene varias acciones.

Leuquina
Presente en los leucocitos
Espermita
Presentes en los espermatozoides
Hematina
Presentes en glbulos rojos, puede
Polipptidos bsicos
actuar como sustancia nutritiva

de algunas bacterias
Mesohematina
Funcin similar a la hematina
Plaquina
Presente en las plaquetas
Factor de Tillet
Inhibe a Streptococcus pyogenes.
Interfern
Protege a las clulas contra la infeccin viral.
Mucoproteinas
Inhibe las bacterias y virus en combinacin con

iones Mg 2-4-
Properdina
Inhibe la neuraminidasa producida por los virus.
Peroxidasa
Destruye el perxido de hidrgeno que es el

producto final de la respiracin de algunas
bacterias.
Perxido de Hidrgeno
Mata a bacterias catalasa negativas.
Entre las sustancias ms importantes se encuentran:

Lisozima. Esta es una poderosa sustancia bactericida que acta destruyendo la
pared celular de un gran nmero de bacterias, sobre todo las Gram (+), se
encuentra presente en forma abundante en las lgrimas (formando el mecanismo
ms importante de defensa del ojo), y en el suero. Se encuentra tambin en
saliva y secreciones mucosas, aunque en menor concentracin.
Interfern. Esta es una sustancia viricida de gran poder, que se forma dentro de
las clulas despus de que stas han sido infectadas. Acta inespecficamente
contra todos los virus, y se puede utilizar como proteccin pasiva en individuos
de la misma especie. Su papel como posible agente inmunizante a nivel de
poblacin est bajo estudio.
Fagocitina, Leuquina: Estas sustancias juegan un papel importante en la
actividad bactericida de las clulas fagocitarias, aunque su mecanismo de accin
no se conoce con exactitud.
OBJETIVO
Evaluar la sobrevivencia de una bacteria patgena en suero hiperinmune, suero
normal y solucin salina fisiolgica.
METODOLOGA
1) Coloca 0.25 ml de solucin salina (SS) estril en el tubo A
2) Coloca 0.25 ml de suero 1 en el tubo B
3) Coloca 0.25 ml de suero 2 en el tubo C
4) Coloca 0.25 ml (o una asada) de cultivo de Salmonella en todos los tubos.
5) Incuba los tres tubos a 37C durante 30 min.
6) Diluye el contenido de los tubos 1:20 con SS
7) Inocula 0.1 m de esta dilucin en una caja de agar nutritivo.
8) Incuba tus cajas a 37C durante 24 h.
9) Lee tus resultados y compara con tus compaeros.
Nota: El procedimiento debe realizarse usando tcnica estril.

1) Qu es un suero hipermmune?
2) Qu es el complemento?
3) Investiga que es la catalasa y el perxido de hidrgeno
4) Qu es lisozima?
5) Qu es Salmonella?
1) Cuntas colonias crecieron en cada caja?
2) En base a esa informacin, cual suero era hiperinmune y cual el normal?
3) Porque?
4) Cul es la accin del complemento en el suero normal y en el hipermmune?
5) Cul es la relacin entre catalasa y perxido de hidrgeno desde el punto de
vista patgeno?
6) Realiza una lista de cinco bacterias en orden decreciente de su sensibilidad a
la lisozima.
Glosario de trminos
Es importante, que para la mejor comprensin y conocimiento de la ctedra
de inmunologa, conocer el significado de la terminologa utilizada durante
el estudio de la inmunologa.
Adyuvante
Cualquier sustancia que intensifica de manera inespecfica la respuesta
inmunitaria frente a un antgeno o aumenta los efectos farmacolgicos de
un medicamento.
Anergia
Tolerancia inmunolgica especfica potencialmente reversible en la cual el
linfocito pierde la capacidad de respuesta funcional.
Anticuerpo (Ab)
Protena que posee las propiedades moleculares de una inmunoglobulina,
sintetizada principalmente por las clulas plasmticas como resultado del
estmulo de un antgeno (agente infeccioso o una sustancia extraa). Un
anticuerpo es producido por clulas plasmticas derivadas de linfocitos B.
Esta protena tiene afinidad especfica para el antgeno que estimul la
formacin fijndose a l por su fragmento Fab en forma no covalente.
Todos los anticuerpos IgG, IgM, IgA secretoria, IgA srica, IgE e IgD
pertenecen a las inmunoglobulinas, sin embargo no todas las
inmunoglobulinas funcionan como anticuerpos.
Molculas proteicas
producidas por el organismo como respuesta a un estmulo por un
inmungeno. Ante los inmungenos que los originan, los anticuerpos tienen
la propiedad esencial de reaccionar especficamente.
Anticuerpo fluorescente
Un anticuerpo conjugado con un colorante fluorescente como el FITC.
Anticuerpo monoclonal
Anticuerpo homogneo derivado de una nica clona celular B. Todos estos
anticuerpos tienen idnticos sitios de fijacin antignica e isotipo.
Antgeno (Ag)
Trmino que se acu en el s. XIX para designar cualquier sustancia que
introducida en el organismo era capaz de inducir una respuesta
inmunolgica. 1) en la actualidad el trmino se utiliza ms ampliamente
para referirse a cualquier sustancia o clula (e.g. bacterias, virus, glbulos
rojos, clulas de trasplantes o algunos componentes de estos como:
protenas, lipopolisacridos) que es reconocida como extraa por el sistema
inmune. 2) tambin se utiliza para designar a uno de los reactivos de las
pruebas serolgicas, e.g. antgeno Rosa de Bengala, antgeno Tfico. Segn
la definicin clsica, es una sustancia capaz de provocar en el organismo la
formacin de anticuerpos que puedan unirse especficamente con ella, o de
clulas que tengan una afinidad especfica ante ella. De hecho, esta
definicin corresponde ms bien al trmino de inmungeno.
Antgeno CD - Conjunto de diferenciacin celular
Designacin de la aglomeracin de diferenciacin para molculas de la
superficie celular leucoctica que son identificadas por un grupo dado de
anticuerpos monoclonales. Los linfocitos T se localizan predominantemente
en los folculos y entre ellos, en la paracorteza. La
mayora (70%
aproximadamente) de estas clulas T son linfocitos T colaboradores CD4+,
entremezclados con escasas clulas CD8+. Las clulas CD4+ y CD8+ son
protenas de superficie molculas de adhesin; integrinas. CD44 Isoforma
CD45 principal (solo en seres humanos). La Isoforma de la molcula CD45
es identificada por anticuerpos especficos del segmento codificado por el
exn A, por lo que recibe el nombre de CD45RA (restringida por A).
Antgeno de Histocompatibilidad.
Isoantgenos codificados por los genes del sistema mayor de
Histocompatibilidad (HLA y H-2) que se localizan en la membrana celular
de la mayora de las clulas nucleadas. Son las responsables de la
interaccin y cooperacin celular (Ag de la clase II), as como del rechazo
de injertos (Ag de la clase I).
Apoptosis
Muerte celular programada que se caracteriza por la digestin
endonuclesica del ADN. Proceso de muerte celular caracterizado por la
escisin del ADN,
condensacin y fragmentacin
del ncleo y la
vesiculacin de la membrana plasmtica que provoca la fagocitosis de la
clula sin inducir una respuesta inflamatoria. Este tipo de muerte celular es
importante en el desarrollo de los linfocitos, en la regulacin de las

respuestas linfocticas a los antgenos extraos y en el mantenimiento de la
tolerancia a los autoantgenos.
Bacilo Calmette-Gurin (BCG)
Mycobacterium tuberculosis o bovis atenuado que se emplea como vacuna
especfica contra la TB y tambin como un adyuvante.
CD 4+
Glucoprotena de la superficie celular, usualmente en las clulas T
cooperadoras, que reconoce las molculas de la clase II del MHC en las
APC.
CD 8+
Glucoprotena de la superficie celular, usualmente en las clulas T
citotxicas, que reconoce las molculas de la clase I del MHC en las dianas
celulares.
Clulas citocidas naturales (NK)
Subpoblacin de linfocitos derivados de la mdula sea, diferentes de las
clulas T o B, que actan en las respuestas inmunitarias innatas para
destruir
a las clulas infectadas por microorganismos mediante
mecanismos lticos
directos y secretando
IFN-. Las clulas NK no
expresan receptores para el antgeno de distribucin clonal como los
receptores Ig o los TCR, y su activacin esta regulada por una combinacin
de receptores estimuladores e inhibidores; estos ltimos reconocen
molculas del MHC propio. Secretan citoquinas e IFN-
Clulas Dendrticas
Clulas accesorias inmunitarias derivadas de la mdula sea presentes en
los tejidos epiteliales y linfoides que se caracterizan desde el punto de vista
morfolgico por delgadas proyecciones membranosas. Actan como APC
para los linfocitos T no estimulados, y son importantes para el inicio de las
respuestas inmunitarias adaptativas a los antgenos proteicos.
Clula Dendrtica Folicular

Clulas dendrticas negativas para la clase II del MHC y positivas para
receptores de Fc que poseen inmunocomplejos en su superficie y
probablemente participen en la generacin de clulas secretoras de
anticuerpos y en el mantenimiento de la memoria celular B en los centros
germinativos.
Clula Dendrtica Interdigitante
Clulas dendrticas APC positivas para la clase II del MHC y negativas para
receptores de Fc que se encuentran en las reas celulares T de los ganglios
linfticos y el bazo.
Clulas de Langerhans
Son de las principales poblaciones celulares presentes en la epidermis,
stas son las clulas dendrticas inmaduras. Su funcin principal es atrapar
y transportar antgenos proteicos a los ganglios linfticos de drenaje.
Durante su migracin a los ganglios linfticos, las clulas de Langerhans
maduran a clulas dendrticas a los ganglios linfticos, capaces de
presentar eficazmente los antgenos a las clulas no estimuladas
(vrgenes), positivas para la clase II del MHC y para receptores de Fc que
se encuentran en la piel.
Clulas M
Son clulas de membrana especializadas. Clulas epiteliales especializadas
utilizadas sobre las placas de Peyer del intestino que desempean un papel
en la llegada de los antgenos a las placas de Peyer.
Clula NK (destructora o citocida natural)
Linfocito granular grande que no reordena ni expresa genes de
inmunoglobulinas ni de receptores celulares T pero que es capaz de
reconocer o destruir ciertas clulas tumorales o infectadas por virus de una
manera independiente de los anticuerpos y el MHC.
Clula presentadora de antgenos (APC)
Clula que expone en su superficie fragmentos peptdicos de antgenos
proteicos, asociados a molculas del MHC, y activa las clulas T especficas
de los antgenos. Adems de presentar complejos pptido-molcula del
MHC, las APC tambin deben expresar molculas coestimuladoras para

activar ptimamente a los linfocitos T.
Clula presentadora de antgeno profesional (APC profesional)
APC para los linfocitos T colaboradores, como las clulas dendrticas, los
fagotitos mononucleares y los linfocitos B, que es capaz de expresar
molculas de clase II del MHC y coestimuladores. Las APC profesionales
ms importantes para el inicio de las respuestas de clulas T primarias son
las clulas dendrticas.
Clulas plasmticas
Linfocitos B; clulas que sintetizan y secretan anticuerpos especficos de
una especificidad e isotipo. Los anticuerpos son sintetizados y secretados
por las clulas plasmticas. Las clulas plasmticas maduras son de corta
vida y liberan muchos miles de anticuerpos idnticos por segundo. Cada
anticuerpo es capaz de reaccionar especficamente con el antgeno que
inici la respuesta inmune. El origen de los anticuerpos son las clulas
plasmticas diferenciadas. Estas clulas se encuentran ms frecuentemente
en la pulpa blanca del bazo, mdula de ganglios perifricos y otros tejidos
linfticos secundarios. Las clulas plasmticas estn caracterizadas por su
retculo endoplsmico rugoso iniciador de la sntesis proteica activa, su
cromatina nuclear marginada y por la presencia de un citoplasma
fuertemente basfilo. Los grnulos plasmticos son ricos en anticuerpos
proteicos. Durante el curso de la respuesta inmune, las clulas plasmticas
producen anticuerpos.
Clulas presentadoras de antgenos (APC)
Denominacin habitual para clulas que presentan pptido antignico
procesado y molcula de la clase II del MHC al receptor T en los linfocitos T
CD4+. Son ejemplos macrfagos, clulas dendrticas y clulas B. La mayor
parte de los tipos celulares es capz de presentar pptidos antignicos con
la clase I del MHC a las clulas T CD8+, como ocurre con las clulas
infectadas por virus.
Clulas
presentadoras
profesionales)
de
antgenos
profesionales
(APC
Son APC profesionales los linfocitos T colaboradores, como las clulas

dendrticas, los fagotitos mononucleares y los linfocitos B, que es capaz de
expresar molculas de clase II del MHC y coestimuladores. Las APC
profesionales ms importantes para el inicio de las respuestas de clulas T

primarias son las clulas dendrticas.
Clulas T colaboradoras
Subpoblacin funcional de los linfocitos T
cuyas funciones efectoras
principales consisten
en activar a los macrfagos en las respuestas
inmunitarias celulares y promover la produccin de anticuerpos por las
clulas B en las respuestas inmunitarias humorales. Estas funciones
efectoras estn mediadas por citoquinas secretadas y por la unin del
ligando de CD40 expresado en las clulas T al CD40 de los macrfagos o
las clulas B. La mayora de las clulas T colaboradoras expresa CD4.
Clulas Th1 (Clulas T colaboradoras)
Subpoblacin funcional de clulas T colaboradoras que secreta un conjunto
especfico de citoquinas, como IFN- , y cuya funcin principal consiste en
estimular la defensa mediada por los fagotitos contra las infecciones,
especialmente las debidas a los microorganismos intracelulares.
Clulas Th2 (Clulas T colaboradoras)
Subpoblacin funcional de clulas T colaboradoras que secreta un conjunto
especfico de citoquinas, como IL-4 e IL-5, y cuyas funciones principales
consisten en estimular las reacciones inmunitarias medidas por IgE y por
eosinfilos/mastocitos y regular negativamente las respuestas de Th1.
Cininas
Una familia de polipptidos liberados durante las respuestas inflamatorias y
que aumentan la permeabilidad vascular y la contraccin del msculo liso.
Citometra de Flujo
Mtodo para el anlisis del fenotipo de las poblaciones celulares que
requiere un instrumento especializado (citmetro de flujo) que detecta la
fluorescencia en clulas individuales en una suspensin y, por lo tanto,
determina el nmero de clulas que expresan la molcula a la que se une
la sonda fluorescente. Las suspensiones de clulas se incuban con
anticuerpos marcados fluorescentemente o con otras sondas, y la cantidad
de sonda unida por cada clula de la poblacin se mide haciendo pasar las
clulas a travs de un fluormetro con un haz incidente generado por lser.
Citoquinas (citocinas)
Protenas de bajo peso molecular que estimulan o inhiben la diferenciacin,
proliferacin o funcin de las clulas inmunitarias. Protenas producidas por
muchos tipos de clulas distintos que median las reacciones inflamatorias e
inmunitarias. La citoquinas son uno de los principales mediadores de la
comunicacin entre las clulas del sistema inmunitario.
Citotoxicidad mediada por clulas dependiente de anticuerpos
Proceso por el cual las clulas citocidas naturales (NK) son dirigidas a las
clulas recubiertas de anticuerpos. En la membrana de las clulas NK se
expresa un receptor especfico de la regin constante de las IgG,
denominado FcRIII (CD16), que media la unin a la Ig.
Coestimulador
Molcula de la superficie de una clula presentadora de antgenos (APC) o
secretada por esta que proporciona un estmulo (una segunda seal)
necesaria para la activacin de las clulas T no estimuladas (vrgenes),
adems del antgeno. Los coestimuladores mejor definidos son las
molculas B7 presentes en las APC profesionales que se unen a la molcula
CD28 presente en las clulas T.
Complejo Principal de Histocompatibilidad (MHC)
Es un locus gentico de gran tamao localizado en el cromosoma 6 del ser
humano y en el 17 del ratn, consta de genes muy polimrficos que
codifican las molculas de unin al pptido que son reconocidas por los
linfocitos T. El locus CMH tambin contiene genes que codifican citoquinas,
molculas que participan en el procesamiento antignico y protenas del
complemento.
Complemento (C)
Complejo proteico, presente en todo suero normal. Es inespecfico, es
decir, existe en ausencia de toda inmunizacin. Se fija a la mayora de
complejos antgeno-anticuerpo. Completa, en cierta manera, la accin de
los anticuerpos y es necesario en la hemlisis inmunolgica y en la
bacterilisis. C es una serie de protenas plasmticas que, al activarse,
operan como una cascada para efectuar la lisis de membranas celulares;
pueden activarse por reaccin entre antgeno en una membrana celular
(va clsica) o por polisacridos bacterianos, como endotoxinas (va

alternativa).
Determinante antignico
Una aglomeracin de eptopos.
ELISA Anlisis de inmunoabsorcin ligado a enzimas
Mtodo para cuantificar un antgeno inmovilizado en una superficie slida
utilizando un anticuerpo especfico con una enzima unida covalentemente.
La cantidad de anticuerpo que se une al antgeno es proporcional a la
cantidad de antgeno presente, y se establece mediante la determinacin
espectrofotomtrica de la conversin de un sustrato transparente en un
producto coloreado por la enzima unida.
Eptopo
La parte de un antgeno que es reconocida
(determinante antignico)
por un receptor antignico
Factor de Necrosis Tumoral (TNF)

Citocina producida fundamentalmente por fagotitos mononucleares
activados que acta estimulando el reclutamiento de los neutrfilos y los
monocitos a los sitios de infeccin y activando estas clulas para erradicar
a los microorganismos. El TNF estimula a las clulas del endotelio vascular
para que expresen nuevas molculas de adhesin, induce la secrecin de
quimioquinas por los macrfagos y las clulas endoteliales y promueve la
apoptosis de las clulas Diana.
Factor de Necrosis Tumoral-alfa y beta (TNF- y TNF-)
Dos citocinas emparentadas que originalmente fueron designadas as por
sus efectos citotxicos sobre ciertas clulas tumorales pero que tambin
poseen funciones inmunorreguladoras.
Fagocitosis
Fenmeno que consiste en el englobamiento y destruccin por los fagocitos
de partculas slidas organizadas o inertes. Proceso por el que ciertas
clulas del sistema inmunitario, incluidos los macrfagos y los neutrfilos,
engloban partculas de gran tamao (> 0.5 m de dimetro), como
microorganismos intactos. La clula rodea la partcula con extensiones de

una membrana plasmtica mediante un proceso dependiente de energa y
del citoesqueleto; este proceso tiene como resultado loa formacin de una
vescula intracelular denominada fagosoma, que contiene la partcula
ingerida.
Fagocitosis inducida
Fagocitosis auxiliada por la accin de las opsoninas del suero sanguneo.
Fitohemaglutinina (PHA)
Lectina vegetal que acta como mitgeno para las clulas T.
Fragmento Fab
Obtenido por accin de la papana. Esta formado por las dos mitades C
terminales de las dos cadenas ligeras.
Fragmento Fc
Fragmento, llamado cristalizable, de la molcula de Ig. Fragmento que no
fija antgenos, obtenido de una molcula de Ig tras la digestin con
papana. Consiste en la fraccin C-terminal de ambas cadenas pesadas que
se une a los receptores de Fc y al C1q.
Hipersensibilidad
Respuesta inmunolgica inadecuada o exagerada que causa dao en un
individuo inmunizado.
Hipersensibilidad inmediata
Sensibilidad anormal a un antgeno que se traduce por una reaccin
patolgica (liberacin de aminas vasoactivas) en los minutos que siguen a
la unin de este antgeno con el anticuerpo especfico correspondiente.
Hipersensibilidad retardada
Reaccin inmunitaria, mediante clulas nucleadas de un mismo individuo,
responsables de la reaccin inmunitaria de rechazo de injertos.
Corresponden a una especificidad del individuo.
IgG
(immunoglobulin G) inmunoglobulina G (-gamma). PM de 150,000, 80%
del total de inmunoglobulina en plasma; protege los lquidos corporales
internos contra bacterias y sus toxinas; puede cruzar la placenta y conferir
defensas en las primeras semanas de vida.
Inflamacin
La respuesta de los tejidos ante los traumatismos que se caracteriza por un
aumento del flujo sanguneo y el influjo de leucocitos en el sitio afectado y
cuyas consecuencias son la tumefaccin (tumor), el enrojecimiento (rubor),
el aumento de la temperatura (calor) y el dolor.
Inmune
Protegido natural o artificialmente contra una enfermedad determinada.
Inmunidad
Conjunto de manifestaciones que un organismo vivo es capaz de
desarrollar en su esfuerzo para adquirir un estado refractario frente a las
infecciones.
Inmunidad Activa (Inmunidad Actual)
La debida a una reaccin del organismo contra el agente nocivo, despus
de curado de una enfermedad infecciosa o de inoculado con la bacteria
causante o sus productos.
Inmunidad Adquirida (Inmunidad Artificial)
Inmunidad mediada por linfocitos y caracterizada por especificidad
antignica y memoria. Es la que se obtiene naturalmente despus de una
enfermedad infecciosa o artificialmente por inoculacin o vacunacin.
Inmunidad Antibacteriana o antitxica
Inmunidad contra la accin de las bacterias o las toxinas respectivamente.
Inmunidad Celular
Es la inmunidad mediada por clulas, alude a las respuestas inmunitarias
mediadas por clulas T. Inmunidad en la que los factores activos son las
clulas fagocitarias.
Inmunidad de Comunidad
La que por medidas higinicas u otras se confiere a un grupo de individuos
contra una enfermedad a la que particularmente cada individuo sigue
siendo susceptible.
Inmunidad Congnita (Inmunidad Natural, inherente o innata)
Inmunidad que poseen ciertos individuos o especies de animales contra
una enfermedad determinada, como la que tienen muchas especies
respecto a la sfilis.
Inmunidad Especfica
Inmunidad contra una enfermedad o antgeno particular.
Inmunidad Familiar
Inmunidad que existe como caracterstica de algunas familias.
Inmunidad Humoral
Aquella cuyos factores activos son los anticuerpos en los humores
orgnicos. Derivada de linfocitos B y sntesis de anticuerpos especficos
solubles por las clulas plasmticas; esto estimula la fagocitosis de clulas
extraas o la combinacin con molculas extraas y su precipitacin.
Inmunidad innata
Inmunidad que no es intrnsecamente afectada por el contacto previo con
el antgeno, o sea todos los aspectos de la inmunidad no mediada de
manera directa por los linfocitos.
Inmunidad Opsnica
La debida a la presencia de opsoninas que estimulan la fagocitosis.
Inmunizacin
Proteccin contra una enfermedad por medio de una vacuna, generalmente
con una forma dbil del agente que causa la enfermedad.
Inmunoglobulina (Ig)
Fraccin de las protenas plasmticas ligada a la funcin anticuerpo;
sinnimo de globulinas . Son globulinas sricas con propiedades de
anticuerpo. Sin embargo, no todas las molculas de inmunoglobulinas
tienen una actividad de anticuerpo. Actualmente se conocen cinco
variedades denominadas IgG, IgA, IgM, IgD e IgE.
Inmunomoduladores
Medicamentos que se espera fortalezcan el sistema inmunolgico y ayuden
al cuerpo a combatir las infecciones oportunistas u otras enfermedades. No
son necesariamente usados para estimular el sistema inmunolgico ya que
puede ser perjudicial. Incluyen dos sub-grupos: las citocinas y los
inmunomoduladores de amplia actividad. Los inmunomoduladores de
amplia actividad son hormonas mensajeras qumicas del cuerpo que
regulan el sistema inmunolgico, como las endorfinas que controlan el
calor.
Interferones (IFN)
El IFN- deriva de diversos leucocitos, el IFN- lo hace de fibroblastos y el
IFN- proviene de los linfocitos T. Los tres tipos inducen un estado
antivirsico en las clulas y el IFN- acta como una citocina en la
regulacin de las respuestas inmunitarias.
Interfern-gamma (IFN-)
Citosina producida por los linfocitos T y las clulas citocidas naturales (NK)
cuya principal funcin consiste en activar a los macrfagos en las
respuestas inmunitarias, tanto innatas como adaptativas. El IFN- tambin
se denomina interfern inmunitario o de tipo II.
Interleucina (IL)
Designacin de algunas citocinas secretadas por los leucocitos.
Interleucina 1
Linfocina secretada por los macrfagos o clulas accesorias que tiene como
accin biolgica el activar los linfocitos T y linfocitos B contra los antgenos.
Interleucina 2
Linfocina sintetizada por los linfocitos T cooperadores activados cuya
funcin es la de causar la proliferacin y activacin de otros linfocitos T en
forma no especfica. Este factor es esencial para mantener en cultivo por
tiempo prolongado a los linfocitos T.
ITAM (Motivos de activacin de inmunorreceptores basados en
tirosina)
Son secuencias concenso para la familia src de las tirosina cinasas. Estos
motivos se encuentran en los dominios citoplasmticos de varias molculas
de sealizacin, incluidas las unidades de transduccin de seales de los
receptores antignicos linfocticos y de los receptores de Fc.
Knockout
El uso de recombinacin gentica homloga en clulas precursoras
embrionarias para reemplazar un gen funcional por una copia defectuosa
de ese gen. Los animales generados mediante esta tcnica pueden criarse
hacia la homocigosis, lo que permite la aparicin de un fenotipo nulo para
ese producto gnico.
Lectina
Una familia de protenas, en su mayora de origen vegetal, que se unen a
los carbohidratos especficosen glucoprotenas y glucolpidos. Algunas
lecitinas tambin son mitgenos (PHA, conA).
Linfocitos B
Linfocitos timoindependientes o burso -o bone marrow- dependientes,
precursores de los plasmocitos que producen los anticuerpos.
Linfocitos T
Linfocitos timoderivados o timodependientes, implicados en las reacciones
inmunitarias de tipo celular.
Linfocito T citotxico
Clulas T (por lo general CD8+) que destruyen dianas celulares tras el
reconocimiento de molculas del MHC-pptidos extraos en la membrana
celular de la diana.
Linfocitos T cooperador (auxiliar) TH
Linfocitos T que colaboran en la sntesis de anticuerpos frente a antgenos
timodependientes.
Linfocitos T supresores
Linfocitos T que ejercen una accin supresiva ante respuestas inmunitarias
humorales.
Linfokinas
Mediadores solubles producidos tanto por linfocitos T sensibilizados a un
antgeno, durante la reaccin inmunitaria celular, como por los linfocitos T
no sensibilizados, bajo influencia de mitgenos no especficos.
Lipopolisacrido (LPS)
Endotoxina derivada de las paredes celulares de las
Gramnegativas que tienen acciones inflamatorias y mitgenas.
bacterias
Macrfago (M)
Clula fagoctica grande, derivada del monocito de la sangre, que tambin
funciona como clula presentadora de antgenos y puede mediar la
citotoxicidad mediada por clulas dependiente de anticuerpos (ADCC).
Mycobacterium
Gnero de bacterias aerobias, muchas especies de las cuales pueden
sobrevivir en el interior de los fagocitos y provocar enfermedad. La
principal defensa del husped frente a las micobacterias como
Mycobacterium tuberculosis es la inmunidad celular.
NADPH
Forma reducida del fosfato de dinucleotido de nicotinamida adenina.
Opsoninas
Sustancia termolbil del suero sanguneo normal, que hace a los microbios
o clulas sanguneas ms aptos para ser fagocitados por los leucocitos.
Sustancias capaces de aumentar la fagocitosis. Son bsicamente
anticuerpos y fracciones del complemento.
Opsonina especfica o inmune
Opsonina que se desarrolla en el suero sanguneo como resultado de una
infeccin, activa nicamente contra el organismo infectante.
Opsonizacin
Proceso en que un antgeno se combina con el anticuerpo opsonina para
hacerlo ms susceptible a la accin de englobamiento de los fagocitos.
Organo linfoide central
Organo bajo cuya influencia las clulas se hacen inmunolgicamente
competentes, es decir, capaces de reaccionar con el antgeno. Lo son la
mdula sea, el timo y la bolsa de Fabricio (est nicamente en las aves).
rgano linfoide perifrico
rgano en el que se realiza el contacto entre el antgeno y las clulas
inmunolgicamente competentes. Comprende los ganglios linfticos, el
bazo y las formaciones linfoides de las mucosas digestivas y respiratorias.
Oxido Ntrico (NO)
Molcula efectora biolgica con una amplia gama de actividades que en los
macrfagos acta como un potente agente microbicida para destruir a los
microorganismos ingeridos.
Protena fijadora de manosa
Un miembro de la familia de las colectinas (lectinas calciodependientes)
que es una protena de fase aguda. Funciona como un estimulante de la
activacin de la va clsica del C y como una opsonina para la fagocitosis a
travs de su unin a la manosa, un residuo de carbohidrato que suele
hallarse en una forma expuesta solo en la superficie de los
microorganismos.
Quimioquinas
Una familia de citocinas de
estructuralmente que inducen con
las clulas fagocticas y linfocitos.
rpidamente la adhesin leucictica
bajo peso molecular, relacionadas

selectividad quimiotaxis y activacin de
Tambin son capaces de desencadenar
mediada por integrinas.
Reaccin inmunitaria
Reactividad nueva y especfica del organismo adquirida como consecuencia
de la introduccin de un inmungeno. Se distingue la reaccin inmunitaria
humoral caracterizada por la produccin de anticuerpos y la reaccin
inmunitaria celular, con produccin de clulas mononucleadas que
reaccionan especficamente con el antgeno.
Receptor de clula T (TCR)
El receptor antignico heterodimrico del linfocito T existe en dos formas
alternativas consistentes en cadenas y y en cadenas y . El TCR
reconoce fragmentos peptdicos presentados por molculas del MHC en la
superficie de las clulas. La funcin de los TCR no est tan bien definida
pero se sabe que puede reconocer protenas nativas en la superficie celular.
Receptores de Fc (FcRs)
Receptores de la superficie celular que fijan la porcin Fc de clases
particulares de Igs.
Reclutamiento
Movimiento regulado por los linfocitos.
Respuesta inmune primaria
Es la respuesta inmunitaria relativamente dbil que se produce en el primer
encuentro de los linfocitos vrgenes con un antgeno dado.
Respuesta inmune secundaria
Es la respuesta inmunitaria con mejoras cualitativas y cuantitativas que
ocurre en el segundo encuentro de los linfocitos programados con un
antgeno dado.
Separador celular activado por fluorescencia (FACS)

Adaptacin del citmetro de flujo que se utiliza para purificar las clulas de
una poblacin mixta en funcin de que sonda y que cantidad de la misma
se une a las clulas. Las clulas se tien con una sonda marcada
fluorescentemente, como un anticuerpo especfico del antgeno de
superficie de una poblacin celular. Las clulas se hacen pasar entonces de
una en una a travs de un fluormetro con un haz incidente generado por
lser y son deflectadas diferencialmente por campos electromagnticos
cuya potencia y direccin varan de acuerdo con la intensidad medida de la
seal de fluorescencia.
Sintetasa de xido ntrico inducible (iNOS)
Es una enzima citoslica que no existe en los macrfagos en reposo, pero
puede inducirse en respuesta al LPS en combinacin con IFN-. La iNOS
cataliza la conversin de arginina en citrulina, y se libera xido ntrico que
se difunde libremente.
Telergeno
Antgeno utilizado para inducir tolerancia, a menudo depende de las
circunstancias de la administracin que de cualquier propiedad inherente a
la molcula.
Timo
Sitio de maduracin de los linfocitos T. rgano linfoide llamado central en
el que tiene lugar la diferenciacin en los linfocitos T, responsables de la
respuesta inmunitaria de tipo celular. Es un rgano glandular endcrino
transitorio, propio de la infancia, del que solo quedan vestigios adiposos a
los 10 o 12 aos de edad, situado en la parte inferior del cuello y superior
del mediastino anterior, formado por dos lbulos alargados, compuestos
cada uno de ellos por una serie de lobulillos dispuestos alrededor de un eje
o cordn central conjuntivo. Cada lobulillo se halla dividido por un tabique
de tejido conjuntivo en folculos formados de una sustancia cortical y otra
medular con linfocitos, leucocitos y corpsculos de Hassall (cuerpos
pequeos en el Timo, estriados concntricamente; restos del tejido epitelial
que se encuentran en los primeros perodos de desarrollo de la glndula).
Timocito
Clula T en desarrollo en el timo.
Vacuna
Preparacin microbiana que, introducida en el organismo, provoca en ste
la inmunizacin activa contra una enfermedad determinada. Provoca una
reaccin en el organismo y es principalmente preventiva.
Vas de Activacin del Complemento
La activacin de los factores proteicos del complemento se hace
secuencialmente segn dos vas: en la va clsica, el activador est
constituido por complejos antgeno-anticuerpo; en la va alterna, los
activadores corresponden a las endotoxinas bacterianas, el zymosan, el
veneno de cobra y agregados de determinadas inmunoglobulinas (IgA,
IgE).
REDVET: 2010, Vol. 12 N 4

Este libro electrnico Manual de Laboratorio de Inmunologa Bsica y Clnica est disponible en
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REDVET Revista Electrnica de Veterinaria est editada por Veterinaria Organizacin.
Se autoriza la difusin y reenvo siempre que enlace con Veterinaria.org http://www.veterinaria.org y con REDVEThttp://www.veterinaria.org/revistas/redvet

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Se publica en Abril de 2011 como un suplemento de

Prohibida la reproduccin total o parcial, sin la autorizacin escrita de los autores y de

C. Dr. en C., M.S.P. Jos Luis

PRACTICA NO. 6...................................................................................................................................... 48

PRACTICA NO. 15.................................................................................................................................... 97

La problemtica que se presenta es la necesidad de que los estudiantes procesen

Manejo, transporte y almacenamiento de materiales en el laboratorio de

Inspeccionar el sitio donde se generan los residuos y los programas

Prcticas generales de seguridad y bioseguridad en el laboratorio.

Normas de Seguridad especficas de las prcticas

Utiliza guantes de asbesto y/o

Utiliza como tapete de piso un

Lesin de los ojos

Como proceder en caso de

Apaga el equipo en caso de

b) Cuadro de Disposicin de desechos.

Orgnica: cscaras de frutas, El indicado para cada caso

c) Normas oficiales mexicanas.

NOM-002-STPS-1993 Relativa a las condiciones de seguridad para la

Manejo de residuos peligrosos biolgico infecciosos (RPBI)

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Poder bactericida del suero

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capturados muerden. El cobayo y Hamster son sumamente dciles, la manera

TECNICAS DE VENOPUNCIN (SANGRADO) E INOCULACIN

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Diluciones Logartmicas: Estas diluciones se hacen de la misma manera que las

Realizar una dilucin QUINTUPLE (1:5) de cido clorhdrico (HCl) en agua, en

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Posteriormente se multiplicar el valor de una parte por el nmero de partes

3) Porque cambiaste la pipeta en cada uno?

Realizar una dilucion

Realizar una dilucion

En una serie de 10 tubos,

Con una pipeta limpia,

Mezclar muy bien.

Con una pipeta limpia,

Mezclar muy bien.

Con una pipeta limpia,

Mezclar muy bien.

Con una pipeta limpia,

Mezclar muy bien.

Se disuelve la Solucin salina amortiguada y el agar con ayuda de calor, ya

Se disponen de portaobjetos o capas petri. Barnice los portaobjetos con

Se deja solidificar el agar a temperatura ambiente y si no se van a utilizar el

Perfore los portaobjetos con un sacabocados, distribuya los agujeros

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Efecta un esquema de las lneas obtenidas en la precipitacin en gel.

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En el pozo central se coloca