La Genoteca Como Herramienta de La Biotecnología

La genoteca como herramientade la biotecnologa
Instituto Nacional de Investigaciones

Agrcolas
Centro Nacional de investigaciones
agropecuarias
La genoteca
como herramienta
de la ingeniera
gentica
Ana Teresa Guilln
Investigador INIA-CENIAP
Unilab. Sanidad Animal
INIA. Centro Nacional de Investigaciones Agropecuarias, Maracay. Venezuela
SERIE B - N 19
La genoteca como herramienta de la biotecnologa
Instituto Nacional de Investigaciones Agrcolas - INIA, 2009

Edif. Gerencia General del INIA
Av. Universidad, va El Limn, Maracay, Aragua. Venezuela.
Telfonos: (58) 243 2833155 - 2833311 - 2834321 - 2833544
Apartado postal 2103
http://www.inia.gob.ve
Coordinacin editorial: Alfredo Romero
Asistencia editorial: Jenny Gmez
Diagramacin: Sonia Pia
Impresin y encuadernacin: Taller de Artes Grficas del INIA.
Hecho el Depsito de Ley
Depsito Legal: lf22320096004290
ISBN. 978-980-318-233-5
Prohibida la reproduccin total o parcial de esta obra,

la recopilacin en sistema informtico, transmisin
en cualquier medio o forma, fotocopia u otros mtodos
sin el permiso previo del INIA.
Impreso en Venezuela - Printed in Venezuela
Contenido
I.
II.
III.
IV.
Introduccin
Elaboracin de genoteca
a. Obtencin de ADNg y ARNm
b. Sntesis de ADNc
c. Vectores
d. Seleccin de bacterias que contienen el ADN
recombinante, cuando se usan plsmidos
como vector
e. Seleccin de fagos recombinantes
f. Mtodos para evaluar las genotecas
g. Ejemplos de genotecas
h. Importancia de la elaboracin de una genoteca
Bibliografa
Presentacin
I Introduccin
Las tcnicas de anlisis del genoma desarrolladas a partir de
los aos setenta han revolucionado los conocimientos a nivel
molecular de muchos procesos biolgicos normales y patolgicos. Actualmente, es posible localizar, identificar, amplificar y secuenciar los genes que codifican las protenas esenciales, y los
elementos reguladores de su expresin. Tambin es factible expresar genes en sistemas apropiados, para analizar su funcin o
producir grandes cantidades de las protenas que codifican.
Los avances de la gentica molecular han revolucionado la vida
moderna porque han puesto a disposicin de investigadores bsicos y aplicados, cantidades ilimitadas de cidos nucleicos con
informacin para la construccin de molculas de importancia
clnica o industrial. Sea cual fuere la ndole del cido nucleico en
estudio, este debe ser aislado y caracterizado. Para esto, debe
ser generada una fuente permanente del material de manera
que se disponga de cantidades suficientes para los estudios.
La caracterizacin molecular de un gen requiere tanto su identificacin y aislamiento a partir del resto del genoma, como su
ampliacin para poder obtener cantidades suficientes para su
anlisis. Aunque es posible amplificar in vitro fragmentos de
ADN mediante PCR, la identificacin y amplificacin de genes
de inters se realiza muy a menudo recurriendo a tcnicas que
permiten multiplicar in vivo un gen determinado, tras la introduccin de una nica copia del mismo en una clula hospedadora,
generalmente bacteriana. El nmero de copias del gen aumenta
a medida que se multiplica el organismo hospedador. El proce
so, en su conjunto, se denomina clonacin molecular y se resume en los pasos siguientes:

Se comienza con el aislamiento del ADN genmico (ADNg)
de varias clulas, que al ser digerido con enzimas de restriccin, genera una enorme cantidad de segmentos cortos de ADN, llamados fragmentos de restriccin. Tambin
el ARN mensajero (ARNm) se puede usar como material
de partida. Como las molculas de ARN son excepcionalmente lbiles, difciles para amplificar en su forma original
y no pueden por si mismas ser ligadas a un vector para
clonacin, son convertidas en ADN por sntesis de ADN
complementario (ADNc), mediante la enzima transcriptasa reversa.
Estos fragmentos son incorporados a otras secuencias de
ADN (vectores plsmidos o bacterifagos), de modo que
cada vector recibe uno de los fragmentos. Las molculas
resultantes de esta unin se denomina ADN recombinante.
Los vectores con sus fragmentos de restriccin se introducen en la clula hospedadora (bacterias principalmente, levaduras u otras clulas eucariotas), las cuales son
sembradas en medios de cultivo para su multiplicacin.
La multiplicacin de cada bacteria genera una colonia separada de las dems, de modo que en los cultivos se forman miles de colonias. Como consecuencia, cada colonia
est formada por un clon de bacterias que descienden de
un ancestro comn, conteniendo cada clon un fragmento
de restriccin o molcula de ADN recombinante diferente.
En trminos generales, la coleccin de estos clones, suficientes
en nmero para que contenga cada gen presente en la clula de
origen que se estudia, se denomina genoteca. Las diferentes
etapas para su elaboracin sern consideradas a continuacin.

II Elaboracin de genoteca
La genoteca puede ser de ADN genmico (ADNg) o ADN complementario (ADNc). La primera es una coleccin de fragmentos de ADN genmicos clonados en un vector, que en conjunto
representan la totalidad del ADN o genoma de un organismo.
A partir de este tipo de genoteca se podr seleccionar el clon
que posea un ADN recombinante especfico y cultivarlo posteriormente para amplificarlo (De Robertis y col., 1998; Peafiel y
Garca, 2001; Izquierdo, 2001).
La genoteca de ADNc es el conjunto de clones obtenidos a partir
de los ARN mensajeros (ARNm), por lo que comprendern una
seleccin del total de genes de la clula, ya que slo aquellos genes que estn siendo expresados son transcritos al ARNm. Una
vez que la informacin est disponible en la forma de genoteca
de ADNc, los segmentos procesados individualmente podrn ser
aislados y examinados con relativa facilidad (Stratagene, 2000;
Izquierdo, 2001).
a) Obtencin del ADN y ARNm
Los insertos pueden ser esencialmente de dos tipos: fragmentos
de ADNg y ADNc obtenido a partir del ARNm.
El ADN total de la clula, que con frecuencia es requerido como
una fuente de material para obtener genes a ser clonados, puede
ser procedente de cultivo de bacterias, clulas de origen vegetal
y animal o procedente de otro tipo de organismo a estudiar.
Las tcnicas de ruptura de las clulas pueden dividirse en mtodos fsicos, con los cuales las clulas se rompen por fuerzas
mecnicas y mtodos qumicos, donde la lisis celular es llevada
a cabo por exposicin a agentes qumicos que afectan la integridad de las barreras celulares. La lisis qumica involucra generalmente un agente que ataca la pared celular, en el caso que la

haya, y otro que destruye la membrana celular. Para la bacteria

Escherichia coli y organismos relacionados, el ablandamiento de
la pared celular se lleva a cabo por lisozimas, etilendiaminotetraactico (EDTA), o una combinacin de ambos. Las lisozimas
digieren compuestos polmeros que son los que le dan rigidez a
la pared celular. El EDTA remueve los iones magnesio que son
esenciales para preservar la estructura de las envolturas celulares y tambin inhibe enzimas celulares que podran degradar el
ADN. El debilitamiento de la pared celular con lisozimas o EDTA
es suficiente para causar la ruptura de la clula, pero usualmente un detergente como el 3-sodio-1-duodecil -2-sulfato (SDS)
ayuda en el proceso de lisis al remover las molculas de lpidos
y, por lo tanto, causar la ruptura de las membranas celulares.
Una vez lisada la clula, se remueven los detritus insolubles.
Componentes como paredes celulares digeridas parcialmente
pueden ser removidas por centrifugacin, quedando el extracto
celular como un limpio sobrenadante. Para eliminar protenas
remanentes se puede usar fenol o una mezcla de fenol cloroformo en proporcin 1:1. Estos solventes orgnicos precipitan las
protenas y dejan los cidos nucleicos (ADN y ARN) en solucin
acuosa. Para eliminar el exceso de ARN de la solucin acuosa
se usa la enzima ribonucleasa. Para concentrar el ADN de la
muestra, el mtodo ms usado es la precipitacin con etanol, en
presencia de sal (cationes monovalentes de Na+) y a una temperatura de 20C o menos. El precipitado puede ser recolectado
por centrifugacin y luego redisuelto en un volumen adecuado
de agua. Aunque los pasos bsicos de purificacin del ADN son
los mismos, cualquiera que sea el organismo, algunas modificaciones son consideradas de acuerdo a las caractersticas de las
clulas que se usen (Brown, 1990).
Para su clonacin, los fragmentos de ADN deben tener dimensiones determinadas y limitadas. El tamao del ADNg, sea procariota o eucariota, es muy superior al mximo posible para un
inserto. Por ello, la clonacin de genes a partir de ADNg requiere
el aislamiento previo del ADN y su ruptura en fragmentos de ta
mao adecuado, mediante el uso de endonucleasas de restriccin.

Para el aislamiento de ARN se puede usar una solucin monofsica de fenol e isotiocianato de guanidina (Trizol Reagent), basado en el mejoramiento del mtodo de Chomczynski y Sacchi
de 1987 (GIBCOTM BRL. 1999). Durante la homogeneizacin y
lisis de la muestra, el Trizol mantiene la integridad del ARN. La
adicin de cloroformo seguido de centrifugacin, separa la solucin en una fase acuosa y una fase orgnica. El ARN permanece
exclusivamente en la fase acuosa y es recuperado por precipitacin con alcohol isoproplico. El ARN aislado con Trizol est libre
de protenas y contaminacin con ADN. A partir del ARN total se
asla el ARNm poli (A) utilizando una resina oligo (dT) (Brown,
1990; GIBCOTM BRL,1999; Stratagene, 2000; Lewin, 2001).
Para la realizacin de genotecas de ADNc, se debe realizar la
sntesis de los ADNc a partir de los ARNm obtenidos.
b) Sntesis del ADNc
La sntesis de los ADNc se logra utilizando un cebador oligo (dT),
de 12-18 nucletidos de largo, el cual se une a la colas poli (A)
del extremo 3 de las molculas de ARNm de clulas eucariotas
y la accin de la enzima transcriptasa reversa, la cual sintetiza
una cadena complementaria de ADN por cadena de ARNm existente (Figura 1).
En kit comerciales como el elaborado por Stratagene, el primer
oligo (dt) posee un sitio de reconocimiento para la enzima de
restriccin Xho I.
Si la doble cadena de ADNc contiene uno o ms sitios de reconocimiento para la enzima de restriccin que se use, sta pudiera
ser clivada y subsecuentemente clonada en dos o ms fragmentos, haciendo difcil el aislamiento y anlisis de ADNc completos.

Figura 1. Sntesis de ADNc (Adaptado del Zap-cDNA Sntesis Kit.

Instruction Manual. Stratagene, 2000)
Para evitar esto, la primera cadena de ADNc debe ser metilada.

De esta forma, los sitios de restriccin dentro de la molcula de
ADNc quedaran protegidos del clivaje.
Una vez que la primera cadena de ADNc ha sido sintetizada, el
ARNm, miembro de la molcula hbrida, es parcialmente degradado por el tratamiento con ribonucleasas H. Los fragmentos
remanentes de ARN sirven como cebadores para la ADN polimerasa I de E. coli, la cual sintetiza una segunda cadena de
10
ADN, utilizando como molde a la primera, generando molculas

de ADNc con extremos romos. Esta segunda cadena es idntica
al ARNm original.
Luego que se ha producido la sntesis de la segunda cadena
de ADN, se incorporan adaptadores EcoRI. La doble cadena de
ADNc se incuba con los adaptadores, en presencia de la enzima
bacterifago T4 ADN ligasa, enzima que cataliza la unin de los
adaptadores a los extremos romos de las molculas de ADNc.
En el proceso de unin de los adaptadores a los extremos romos
de las molculas de ADNc, es importante que la reaccin de ligacin se haga en el menor volumen. La concentracin molar de
los adaptadores debe ser de al menos 100 veces ms que la de
los terminales de ADNc, para minimizar la unin de los extremos
romos de las molculas de ADNc entre ellos mismos.
Luego, la enzima Xho I acta en su sitio de reconocimiento, produciendo extremos cohesivos. De esta forma, los fragmentos de
ADN de doble cadena resultantes pueden ser ligados al vector
en el sentido Eco RI Xho I y efectuarse la clonacin.
Los extremos de las molculas que portan los adaptadores son
fosforilados con la enzima bacteriofago T4 polinucletido kinasa
para ser ligados al vector desfosforilado apropiado, el cual debe
haber sido previamente clivado con enzimas de restriccin que
generen extremos cohesivos compatibles con los de los adaptadores.
Finalmente, antes de que el ADNc sea insertado en el vector, los
adaptadores que no se unieron y los productos de bajo peso molecular, creados por la accin de la enzima de restriccin sobre los
adaptadores, deben ser removidos en columnas de cromatografa.
Los clones de ADNc obtenidos son representativos del ARNm presente en la preparacin original (Sambrook y col., 1989; Brown,
1990; Stratagene, 2000; Lewin, 2001, Izquierdo, 2001).
11
c) Vectores
Para que un fragmento de ADN (ADN forneo o inserto) quede
permanentemente presente en la clula hospedadora y su descendencia, es necesario que vaya unido a otras secuencias de
ADN que confieran al conjunto la capacidad de autorreplicacin,
y que permitan, adems, diferenciar fcilmente las clulas que
se han transformado captando el ADN, de las que no lo han hecho. Por ello, es necesario unir in vitro los fragmentos de ADN
que se quieren clonar a una molcula de ADN denominada vector, con capacidad de ser introducida, replicada y seleccionada
en las clulas hospedadora (Peafiel y Garca, 2001). Entonces,
el vector es el vehculo que transporta un gen dentro de la clula
receptora y es responsable de su replicacin.
Para que una molcula de ADN acte como un vehculo para la
clonacin de genes debe poseer algunas caractersticas:
- Ser capaz de replicarse dentro de la clula receptora, de tal
manera que numerosas copias de la molcula de ADN recombinante se puedan reproducir y pasar a las clulas hijas.
- Un vehculo para clonacin necesita ser pequeo, menor de
10 Kb en tamao, que permita la incorporacin del inserto y su
entrada en la clula. Molculas ms grandes tienden a romperse durante la purificacin y son ms difciles de manipular.
- Poseer marcadores para la seleccin de las bacterias que
los capten.
- Poseer una o varias secuencias de restriccin en donde las
endonucleasas de restriccin acten generando extremos
para ligar los insertos.
Las dos clases de molculas de ADN que satisfacen estos criterios son: plsmidos y bacterifagos (Brown, 1990 ; Peafiel y
Garca, 2001).
12
Los plsmidos
Son pequeas molculas circulares de ADN de doble cadena
que se replican en las bacterias con independencia del cromosoma bacteriano. Sin embargo, cuentan con enzimas y protenas
codificadas por el hospedador para su replicacin y transcripcin
(Figura 2).
Plsmido
Divisin celular
Cromosoma bacteriano
Figura 2. Replicacin de plsmidos no integrativos (Fuente: Brown,

1990).
Estos vectores casi siempre transportan uno o ms genes y

con frecuencia estos genes son responsables por caractersticas muy tiles expresadas por la bacteria receptora. Ejemplos
de stas son: la habilidad de sobrevivir en concentraciones de
antibiticos normalmente txicas tales como cloranfenicol y ampicilina, frecuentemente debida a la presencia en la bacteria de
un plsmido que transporta genes de resistencia a antibiticos
(Figura 3).
13
Figura 3. Uso de resistencia a anticuerpos como marcadores de seleccin para el plsmido RP4. (Fuente: Brown, 1990).
Produccin de antibiticos, degradacin de compuestos orgnicos complejos, restriccin y modificacin de enzimas. Algunos plsmidos son capaces de replicarse por insertarse en el
cromosoma de las bacterias formando los llamados episomas
(Figura 4), los cuales pueden ser mantenidos establemente en
esta forma a travs de numerosas divisiones celulares para que
en algn estado volver a existir como elementos independientes
14
(Sambrook y col.,1989; Brown, 1990; Lewin, 2001; Peafiel y

Garca, 2001). Por su seguridad y fcil manejo, han sido una importante herramienta de trabajo en la clonacin molecular.
Figura 4. Episoma (Fuente: Brown, 1990)
Como se mencion anteriormente, es importante el tamao del

vehculo de clonacin, siendo ideal el menor a 10 kb. El rango de
los plsmidos va desde aproximadamente 1.0 kb para los ms
pequeos y sobre los 250 kb para los ms grandes (Cuadro 1),
de manera que solo unos pocos son tiles para clonacin. Sin
embargo, los plsmidos ms grandes pueden ser usados para
clonacin, bajo ciertas condiciones de adaptacin.
En cuanto al nmero de copias de un plsmido individual dentro de
una clula bacteriana, este puede variar desde uno (especialmente
en las molculas grandes) hasta 3.000. En forma general, un vehculo de clonacin til necesita estar presente en la clula en copias
mltiples de manera que se pueda obtener grandes cantidades de
ADN recombinante (Brown, 1990; Izquierdo, 2001).
15
Cuadro 1. Tamao de diferentes plsmidos
Plsmido
Tamao (kb)
PBR322
4,36
PUC18 y 19
2,69
PUC118 y 119
3,2
PSP64 y PSP 65
PGEM-3 y 4C
2,87
PGEM-3Z
2,74
PGEM-3Zf (-)
3,2
ColE1
6,36
RP4
54
95
TOL
117
PTiAch5
213
Fuente: Sambrook y col.,1989; Brown, 1990.
Los primeros plsmidos usados como vectores de clonacin fueron pSC101 (Cohen y col. 1973), ColE1 (Hershfield y col. 1974)
y PCR1 (Covey y col. 1976). Su versatilidad era limitada, se replicaban poco o portaban marcadores de seleccin inservibles.
Ninguno de ellos contena ms de dos sitios de restriccin que
pudieran ser usados para clonacin. El primer plsmido que combinaba estas caractersticas deseables era el pBR313 (Bolvar y
col., 1977a,b), con dos marcadores de seleccin tet r y amp r y un
nmero til de sitios de restriccin. Sin embargo, era muy largo
y ms de la mitad de su ADN no jugaba un rol como vector. La
primera fase de desarrollo de plsmidos como vectores termin
con la construccin de pBR322 (Bolvar y col., 1977 b), un plsmido de 4.36 kb del cual la mayora de las secuencias innecesarias fueron eliminadas. Este plsmido se convirti en el vehculo
de clonacin ms ampliamente usado y mucho de los plsmidos
16
vectores que se usan hoy, son descendientes directos de ste

(Balbs y col.,1986).
La tendencia de los prximos aos fue perfeccionar los vectores
para reducir su tamao al mnimo y expandir su capacidad de
aceptar fragmentos de ADN forneos, generados por clivaje con
un amplio rango de enzimas de restriccin. Los plsmidos pequeos son preferidos por varias razones: primero, la eficiencia de
transformacin es inversamente relacionada al tamao del plsmido. Es un factor limitante cuando el plsmido excede 15 kb de
tamao. Los plsmidos ms pequeos permiten insertar segmentos grandes de ADN forneo. Segundo, los plsmidos ms grandes son ms difciles de caracterizar por mapas de restriccin.
Tercero, debido a que los plsmidos ms grandes se replican en
menor nmero de copias, el rendimiento del ADN forneo disminuye y la intensidad de la seal obtenida es reducida, cuando las
colonias son seleccionadas por hibridizacin. As en los aos 70 y
comienzos de los 80, vectores derivados de pBR322 fueron construidos con la ausencia de secuencias auxiliares, involucradas en
el control de nmero de copias y movilizacin. Los ms conocidos
de stos son: pAT153 (Twigg y Sherratt, 1980), pBR327 (Sobern
y col., 1980) y pXf3 (Hanahan, 1983). Al mismo tiempo, el nmero
de sitios tiles de clivaje de las enzimas de restriccin dentro del
plsmido fue expandido y su distribucin fue racionalizada. Casi
todos los vectores contienen ahora una serie de sitios de clonacin, que consisten en secuencias reconocidas por las enzimas
de restriccin comnmente usadas en experimentos de clonacin
(sitios de policlonaje). En la mayora de los casos, estos sitios de
restriccin son nicos y no se encuentran en otro sitio del plsmido. Estas secuencias suministran una variedad de blancos que
pueden ser usados, solos o en combinacin, para clonar fragmentos de ADN generados por clivaje con una o con un gran nmero
de enzimas de restriccin. Los fragmentos insertados en un sitio
de restriccin pueden frecuentemente ser recuperados por la accin de una enzima de restriccin que cliva en un sitio prximo
(Sambrook y col., 1989).
17
Aunque el tamao de los insertos que se pueden clonar en la

mayora de los plsmidos es de aproximadamente 5 kb (Brown,
1990), actualmente existen diversos plsmidos disponibles, que
permiten la clonacin de insertos de hasta 15 Kb, los cuales contienen fuertes promotores que generan grandes cantidades de
ARNm complementario a las secuencias clonadas de ADN forneo. Se trata entonces de vectores de expresin, los cuales
son diseados para expresar protenas forneas que no estn
relacionadas a ninguna secuencia procariota. En otros casos,
ellos generan protenas codificadas, parte por el vector y parte
por el segmento clonado del ADN forneo.
Recientemente, la construccin de plsmidos ha involucrado la
incorporacin de secuencias auxiliares que han permitido, entre
otras cosas: reconocimiento visual de clones recombinantes por
pruebas histoqumicas, seleccin directa de clones recombinantes y expresin de una gran cantidad de protenas forneas.
Los fragmentos ms fciles para clonar tienen terminales sobresalientes o cohesivos no complementarios entre si, generados
por digestin con dos enzimas de restriccin diferentes. Debido
a la presencia de sitios de policlonacin, es posible encontrar un
vector que contenga sitios de restriccin que son compatibles
con el terminal del fragmento de ADN forneo. El fragmento de
ADN forneo es entonces insertado en el vector, por un proceso
conocido como clonacin direccional. Como ejemplo, el vector
pUC19 puede ser digerido con BamHI y HindIII, y despus de
la digestin, el fragmento largo del vector puede ser separado
del resto del sitio de mltiple clonacin por electroforesis en gel
o cromatografa de exclusin molecular. Este vector entonces
puede ser ligado a un segmento de ADN forneo que tiene terminales cohesivos compatibles con los generados por BamHI y
HindIII en el vector. El recombinante circular resultante es entonces usado para transformar bacterias E. coli, confirindole resistencia a ampicilina (Figura 5). Debido a la falta de complementariedad entre los terminales sobresalientes de BamHI y HindIII,
18
el vector no puede circularizarse eficientemente. Entonces, las

clulas bacterianas resistentes a la ampicilina contienen plsmidos que poseen segmentos de ADN forneo que forman puentes entre los sitios BamHI y HindIII. Diferentes combinaciones
de enzimas pueden ser usadas dependiendo del segmento de
ADN forneo.
Figura 5. Clonacin direccional en el plsmido (Fuente: Sambrook

y col., 1989).
19
La remocin del grupo 5-fosfato con fosfatasa alcalina es frecuentemente usada para suprimir la propia ligacin y circulizacin del plsmido. Durante la ligacin in vitro, el bacterifago T4
ADN ligasa cataliza la formacin de un puente fosfodiester entre
nucletidos adyacentes solo si un nucletido contiene grupo 5fosfato y el otro contiene el grupo 3-hidroxil. Entonces, la recircularizacin del ADN del plsmido es minimizada, removiendo el
5-fosfato de ambas terminaciones del DNA lineal con fosfatasa
alcalina. El fragmento de ADN forneo con el grupo 5 fosfato
terminal puede ser ligado eficientemente al ADN desfosforilado
del plsmido.
Los fragmentos de ADN con extremos romos se ligan menos eficientemente que los que poseen extremos cohesivos, por lo que
se requerira una alta concentracin tanto de bacteriofago T4
ADN ligasa, como de ADN forneo y de plsmido en la reaccin
de ligacin (Sambrook y col., 1989).
Una vez unidos el ADN del plsmido y el ADN forneo, en un
plsmido recombinante (Figura 6), ste se usa para transformar
las bacterias. Los plsmidos recombinantes y no recombinantes
son introducidos en las bacterias mediante distintas tcnicas de
transformacin. Para esto, las bacterias son tratadas con mezclas de cationes divalentes para hacerlas temporalmente permeables a pequeas molculas de ADN, siendo slo una pequea fraccin de las bacterias las que capta el ADN plasmdico, las
cuales se multiplican y forman colonias (Sambrook y col.,1989;
Lodish y col., 1995; Peafiel y Garca, 2001).
20
Figura 6. Procedimiento general de clonacin de un fragmento de

ADN en un plsmido (Fuente: Lodish y col., 1995).
21
Los bacterifagos o fagos

Hasta 1983, casi todas las clonaciones de ADNc se realizaban
usando plsmidos como vectores y las genotecas eran usualmente mantenidas como una coleccin por encima de 105 colonias
bacterianas transformadas. Algunas veces esas colonias eran
recolectadas, amplificadas en cultivo lquido y almacenadas a
70C. y en otras, eran mantenidas en la superficie de filtros de
nitrocelulosa (Hanahan and Meselson, 1983). En ambos casos,
los resultados eran insatisfactorios. Las genotecas eran difciles
de preservar sin la prdida de viabilidad y la evaluacin por hibridizacin con mltiples sondas radiactivas, requera la replicacin
de las colonias de un filtro de nitrocelulosa a otro. Este laborioso
trabajo se deba realizar en corto tiempo, antes que las colonias
del filtro se mancharan y fuese difcil su reconocimiento. Con la
obtencin ms eficiente de ADNc y la disponibilidad de adaptadores, entre otros avances, se consider posible aprovechar la alta
eficiencia y reproducibilidad del empaquetamiento in vitro del ADN
del bacteriofago , en la partcula viral. Las genotecas resultantes
pueden ser amplificadas y almacenadas indefinidamente sin prdida de viabilidad y pueden ser evaluadas fcilmente con cidos
nucleicos y antibiticos (Sambrook y col., 1989).
Los bacterifagos son virus que infectan especficamente a bacterias. Son estructuras simples que consisten en molculas de
ADN (ocasionalmente molculas de ARN) que transportan algunos genes, incluyendo muchos que participan en la replicacin,
rodeadas por una cubierta protectiva o cpside, construida por
molculas de protena.
El patrn general de infeccin de un fago es el siguiente:
1. La partcula del fago se adhiere a la pared celular de la bacteria e inyecta su ADN dentro de la bacteria.
2. La molcula de ADN del fago se replica, usualmente por enzimas especficas codificadas por genes del fago.
22
3. Otros genes del fago dirigen la sntesis de los componentes

del cpside y una nueva partcula es ensamblada y liberada
de la bacteria (Brown, 1990; Lewin, 2001).
Hay dos tipos de infeccin por parte de los fagos, ciclo ltico e
infeccin lisognica. El ciclo ltico (Figura 7), es de corta duracin (menos de 20 minutos) y en l, el ADN circular viral se replica muchas veces, un gran nmero de productos de genes del
bacterifago son sintetizados, las partculas de la progenie del
bacterifago son ensambladas y la liberacin de las partculas
infecciosas del nuevo fago est asociada a la lisis de la bacteria (Sambrook y col., 1989; Brown, 1990; Lewin, 2001). Por lo
tanto, el tratamiento de un csped bacteriano, creciendo sobre
una placa de agar, con partculas infecciosas producir placas
lticas formadas por la lisis de las bacterias infectadas (Peafiel
y Garca, 2001).
En contraste al ciclo ltico, la infeccin lisognica (Figura 8) est
caracterizada por integracin de la molcula de ADN del fago
en el genoma de la bacteria receptora, formando el denominado
profago, mantenindose as posiblemente por muchas divisiones
celulares y es heredado en forma latente e inerte, de la misma
forma que los genes bacterianos. Posteriormente, el profago es
liberado del genoma portador y se revierte al ciclo ltico, lisando
la clula (Brown, 1990; Campbell, 2001; Lewin, 2001).
Aunque hay una gran variedad de bacterifagos, solo el y M13
tienen un papel real como vectores de clonacin. Ambos fagos
son del tipo lisognico, con la diferencia que el ADN del M13 no
se integra al genoma de la bacteria y son liberados de la clula
sin producir lisis (Brown, 1990 ; Campbell, 2001).
23
Figura 7. Ciclo ltico del bacterifago. (Fuente: Lewin, 2001).
24
Figura 8. Ciclo lisognico y ciclo ltico del bacterifago (Fuente:

Lewin, 2001).
25
El bacterifago ha ocupado un rol central en la clonacin molecular. Un gran nmero de vectores verstiles y sofisticados se
encuentran disponibles y su desarrollo fue posible por el vasto
y detallado anlisis de la gentica y fisiologa de este bacterifago. Es un ejemplo tpico de fago con cabeza y cola (Figura 9).
Su ADN est contenido en la estructura de la cabeza poliedral y
la cola le sirve para unir el fago a la superficie bacterial e inyectar el ADN dentro de la clula. El genoma es una molcula de
ADN lineal de doble cadena de aproximadamente 49 kb, con extremos de 12 nucletidos que forman cadenas simples complementarias denominadas terminales cohesivos cos. Dentro de la
bacteria, estos extremos se asocian por apareamiento de bases,
permitiendo que la molcula se haga circular al unir sus extremos, por la accin de la enzima ADN ligasa del hospedador, para
generar una molcula de ADN circular que sirve de molde para
la replicacin durante la fase temprana de infeccin (Sambrook y
col.,1989; Brown, 1990; Campbell, 2001, Izquierdo, 2001).
Figura 9. Bacteriofago (Fuente: Lodish y col, 1995).
26
No hay un solo bacterifago adecuado para la clonacin de todos los fragmentos de ADN. Es necesario elegir cuidadosamente
entre los vectores disponibles. Hay tres consideraciones que influyen en la escogencia: las enzimas de restriccin a usar, tamao
del fragmento de ADN forneo a ser insertado y si el vector ser o
no usado para expresar secuencias de ADN clonadas.
El desarrollo de vectores conteniendo mltiples sitios de clonacin y la disponibilidad de una variedad de enzimas de restriccin que cliven el ADN para producir terminales cohesivos, ha
simplificado altamente los mecanismos de clonacin en vectores
bacterifago .
El tamao del inserto es un factor importante a ser considerado
para escoger el vector. Solamente cerca de 60% del genoma
viral es necesario para el crecimiento ltico del bacterifago y
el resto del genoma puede ser remplazado por el ADN forneo.
Sin embargo, la viabilidad disminuye dramticamente cuando el
tamao del genoma es mayor que 105% o menor que 78%. Por
esto es importante realizar una combinacin tal que el vector y
el ADN forneo alcancen el tamao en los lmites aceptables
(Sambrook y col., 1989). El tamao de diferentes fagos se presenta en el Cuadro 2.
Con el uso de vectores derivados del fago se pueden clonar
fragmentos de ADN de hasta 25 Kb. Con gt10, fragmentos de
6 kb y con EMBL, fragmentos de 23 kb (Sambrook y col., 1989;
Brown, 1990; Peafiel y Garca, 2001).
Zap es el primero de una nueva generacin de vectores que
han sido diseados para suministrar un mayor rango de sitios
potenciales para clonacin y expresin de ADNc y un mtodo
simplificado para la recuperacin y subsecuente manipulacin
del ADNc. Debido a su versatilidad, seguramente este vector
reemplazar gt10 y gt11 como vectores de eleccin para la
construccin de genotecas de ADNc (Sambrook y col., 1989).
27
Cuadro 2. Tamao de diferentes bacterifagos
Bacterifago
Tamao (kb)
Tamao del inserto (kb)
gt10
43
0 -6
gt11
44
0 - 7,2
ORF8
44
0-9
gt18 Agt19
44
0 - 7,7
gt20 Agt21
44
0 - 8,2
gt22 Agt23
44
0 - 8,2
Zap
40
0 -10
EMBL
28,7
23
(Fuente: Sambrook y col., 1989)
El fago M13 es un ejemplo de fago filamentoso y su estructura

es completamente diferente a la del fago . La molcula de ADN
es circular, de cadena simple y de 6,4 kb. Una vez dentro de la
clula, la molcula de cadena simple acta como molde para la
sntesis de una cadena complementaria y formar una molcula
de ADN de cadena doble. Con este fago se pueden clonar fragmentos menores de 3 kb (Brown, 1990.; Izquierdo, 2001).
Otros vectores
Los csmidos: son plsmidos a los que se les ha insertado la
regin cos del fago lambda. Son particularmente tiles para
clonar insertos de gran tamao, debido a que son muy pequeos
(8 kb o menos). La regin cos le confiere la facilidad para ser empaquetado in vitro por el sistema del fago, siempre que existan
de 37 a 52 kb entre cos y cos, lo que implica una seleccin efectiva para insertos de entre 40-45 kb. Una vez que el fago haya
inyectado el ADN en la bacteria, ste se comportar como un
plsmido y podr ser seleccionado por resistencia a ampicilina.
28
Se utilizan en la elaboracin de genotecas de genomas grandes,

pero una vez aislado el clon deseado, conviene caracterizarlo
y subclonarlo en un plsmido convencional y de fcil manejo.
(Brown, 1990; Peafiel y Garca, 2001; Izquierdo, 2001).
Cromosomas de bacterias (CAB): constituyen unos interesantes vectores con dos caractersticas fundamentales: 1) permiten
insertos de entre 100 y 300 kb y 2) los insertos permanecen estables sin reordenar o eliminar material interno, debido a la presencia de uno o dos por bacteria. stos se usan para elaborar
genotecas de genomas de gran tamao. Pueden ser construidos
a partir de los factores de fertilidad F, los cuales son episomas
que pueden mantenerse en el citoplasma como plsmidos o integrarse en el cromosoma de la bacteria. En este ltimo caso,
puede escindirse, duplicar una de las bandas y movilizarla en
forma de hebra sencilla a otra bacteria por conjugacin, llevndose parte del cromosoma bacteriano. Ya en clula receptora,
el ADN pasa a hebra doble, habiendo dejado una copia de todo
el cromosoma en la bacteria donante y creando un diploide parcial en la clula receptora. stos tambin pueden ser escindidos
del cromosoma bacteriano y en su proceso de escisin puede
tomar alguno de los genes bacterianos vecinos al lugar de la
integracin. Estos vectores son introducidos en la bacteria por
electroporacin. La seleccin de los transformantes se realiza
por resistencia a cloranfenicol, y la presencia de insertos se confirma por hibridizacin.
Tambin pueden se construidos a partir del fago P1, los cuales se
integran al cromosoma de la bacteria (lisogenia), al escindirse de
nuevo, transportan genes prximos al lugar de integracin; estos
genes son transmitidos de una bacteria a otra por el proceso de
transduccin. Los CAB derivados de P1, mantiene estable insertos de hasta 100 kb. ste confiere resistencia a kanamicina.
29
Vectores de levaduras
Las levaduras son organismos eucariotas unicelulares. Son la
alternativa natural en la produccin a escala industrial de protenas con inters farmacolgico para terapia humana. stas son
capaces de llevar a cabo procesos posteriores a la traduccin
(fosforilan, acetilan y glicosilan protenas) que no realizan las
bacterias y que pueden ser importantes para la expresin de un
gen eucaritico en un sistema heterlogo. Adems, son fciles
de cultivar y econmicas de mantener. Por todo esto, las levaduras podran actuar como hospedador alternativo para la expresin de protenas humanas con inters biotecnolgico.
Entre los vectores de levaduras que tienen un papel importante
en la expresin de protenas se encuentran:
Vectores de integracin cromosmica: son molculas hbridas que contienen un plsmido procaritico y secuencias de
levaduras. La presencia del plsmido facilita el crecimiento y
preparacin de grandes cantidades del vector en E. coli. Las
secuencias de levadura permiten una integracin en su propio
genoma, introduciendo un gen de inters en la levadura. El
pFA6-kanMx3 es un ejemplo de este tipo de vector.
Vectores de replicacin autnoma: se pueden replicar en forma libre sin necesidad de integracin en el genoma del hospedador. Transforman levaduras con una eficiencia alta, pues
no requieren una recombinacin en el cromosoma para perpetuarse. Tienen las secuencias de replicacin autnoma (SRA).
Los vectores SRA/CEN son vectores SRA a los que se les ha
aadido secuencias centromricas para aumentar su estabilidad. stos a la vez se dividen en:
a) Cromosomas artificiales (CAL): son vectores SRA/CEN
a los que se les han aadido telmeros cromosmicos
(SRA/CEN/TEN). Son los vectores que permiten clonar
los fragmentos ms grandes de ADN (de 100 a 2.000 kb).
30
Bsicamente estos vectores incluyen un plsmido procaritico para su propagacin y preparacin en E. coli. Se
emplean preferentemente para elaborar libreras de genomas muy grandes, como el humano, o para mantener
un gen completo con muchos intrones en un solo clon. Un
ejemplo de este tipo de vectores es el pCAL2.
b) Vectores basados en el plsmido 2 m: la levadura Saccharomyces cerevisiae posee un plsmido endgeno
de 2 m de longitud, que no confiere a la clula ninguna caracterstica especial. Se le denomina simplemente
crculo de 2 m. El nmero de copias es de 50 a 100
unidades por clula y es estable. Los vectores basados
en el crculo de 2 m tienen como finalidad la expresin
del inserto, tanto a niveles de explotacin farmacutica
de la protena recombinante, como de sistema modelo en
investigacin bsica o aplicada.
c) Vectores de expresin de origen mixto: uno de los vectores de expresin ms sofisticados es el ZAP pEL URA3
(plsmido de expresin de levadura URA3). Este vector
es un fago que lleva otro vector procaritico bluescript
M13(-), como inserto. El conjunto se denomina ZAP y
tiene la gran ventaja de que en presencia de un virus
auxiliar, F1 o M13, el bluescript puede escindirse in vivo
de lambda y crecer como plsmido. Dentro del bluescript,
se han insertado las secuencias de levaduras que le convierten en un excelente vector de expresin. Este vector
de 6,4 kb queda incorporado en el ZAP, una vez que
tenga el inserto del gen eucaritico (clones de ADNc en la
mayora de los casos). Una vez en la bacteria, se puede
escindir con ayuda de un fago auxiliar y reproducirse,
circularizado, como plsmido.
Todos estos vectores ofrecen la posibilidad de amplificar el vector en procariotas antes de ser introducidos en la levadura. El
sistema de levaduras se utiliza fundamentalmente con la finali31
dad de expresar el gen clonado en un sistema eucaritico, con

excepcin de los YAC, donde la posibilidad de grandes insertos
supera el inters tradicional (Izquierdo, 2001).
d) Seleccin de bacterias que contienen el ADN recombinante, cuando se usan plsmidos como vector.
En la mayora de los casos, las clulas hospedadoras son bacterias seleccionadas por presentar las mejores propiedades de
captacin, seleccin y multiplicacin de ADN recombinante. Entre
los hospedadores eucariotas, como se mencion anteriormente,
las levaduras ocupan un lugar importante por ser organismos unicelulares, y fciles de manejar y multiplicar a gran escala en el
laboratorio. Tambin se realizan clonaciones en clulas vegetales,
pero las clulas animales son las de mayor inters en ciencias
biomdicas. No obstante, la introduccin de ADN en clulas eucariotas es ms delicada y su cultivo es ms complejo. Adems, la
replicacin del vector con independencia de los cromosomas de
la clula hospedadora es problemtica, por lo que suele ser necesario utilizar vectores que permitan la integracin estable del ADN
forneo en los cromosomas del hospedador. A pesar de ello, la
introduccin y expresin de genes en clulas eucariotas es cada
vez ms frecuente (Peafiel y Garca, 2001).
Antes de seleccionar el gen de inters, la coleccin de fragmentos unidos al vector correspondiente debe introducirse en clulas hospedadoras adecuadas, como lo son las bacterias. El
organismo hospedador amplifica los fragmentos recombinantes,
facilitando su identificacin. Como la transformacin del hospedador, por introduccin de molculas recombinantes, se realiza
en condiciones de gran exceso de clulas hospedadoras y de
eficiencia limitada, se necesitan mecanismos sencillos para poder distinguir las bacterias que han captado ADN de las que no
lo han hecho (Figura 10). La seleccin de las bacterias transformadas es sencilla cuando las molculas recombinantes les
confieren una nueva caracterstica fcilmente identificable.
32
Figura 10. Clonacin de un gen deseado utilizando plsmidos como

vector (Fuente: Brown. 1990).
33
Seleccin por inactivacin de un marcador

La mayora de los vectores de clonacin son diseados de manera tal que la insercin de un fragmento de ADN dentro del
plsmido destruye la integridad de uno de los genes presentes
en la molcula. En este caso, al insertarse en un gen que codifica un marcador de seleccin, ste se inactiva y de esa forma
se seleccionan las clulas transformadas que albergan el vector
ligado al ADN recombinante de aquellas clulas transformadas
que contienen plsmidos normales (sin ADN recombinante).
Los marcadores comnmente usados son genes que confieren
resistencia a antibiticos como ampicilina, tetraciclina, cloranfenicol y kanamicina. Prcticamente todos los plsmidos contienen uno o ms genes de resistencia a antibiticos (Sambrook y
col., 1989).
Por ejempo, el plsmido pBR322, el cual confiere a la clula receptora resistencia a la ampicilina y a la tetraciclina (ampR tetR),
tiene varios sitios de restriccin que pueden ser usados para
abrir el vector antes de la insercin del nuevo fragmento de ADN.
BamHI es uno de ellos y corta al plsmido en un punto dentro
del conjunto de genes que codifican para resistencia a la tetraciclina. La molcula recombinante de pBR322, una vez que incorpora un fragmento de ADN extra en el sitio BamHI, pierde la
resistencia a la tetraciclina, ya que los genes necesarios para
ello son interrumpidos por el ADN insertado (Figura 11).
Las clulas que contengan este plsmido recombinante sern
todava resistentes a la ampicilina pero sensibles a la tetraciclina; por lo tanto, las colonias de bacterias que crecen en una
placa con ampicilina y no crecen en la placa con tetraciclina sern clulas que tienen el recombinante (ampR tets) (Figura 12)
(Sambrook y col., 1989; Brown, 1990).
34
Figura 11. a) Vector de clonacin pBR322. Molcula normal. (b) Molcula recombinante conteniendo un fragmento de ADN en
el sitio BamHI (Fuente: Brown. 1990).
35
Figura 12. Seleccin por inactivacin por insercin de un ADN forneo en un gen de resistencia a antibitico de un plsmido
(Fuente: Sambrook y col., 1989).
36
Seleccin por inactivacin del gen Lac Z

Para abordar el prximo ejemplo es importante explicar el opern Lac presente en la bacteria E. coli, analizado por primera vez
por los cientficos Francois Jacob y Jaques Monod, en 1960, y
por el cual ganaron el premio Nobel en 1965 junto al investigador
Andre Lwoff.
Este opern posee tres genes: Z, Y y A. El Lac Y codifica la enzima lactosa permeasa, responsable de la entrada de la lactosa a
la clula. El gen Lac Z codifica la -galactosidasa, la cual hidroliza a la lactosa en glucosa y galactosa. El gen Lac A codifica la
tiogalactsido transacetilasa de funcin fisiolgica no bien conocida (Figura 13).
Figura 13. Opern Lac (Fuente: Lodish y col., 1995).
La sntesis de -galactosidasa y lactosa permeasa es inhibida

cuando el medio en el que crecen las bacterias tiene glucosa
como nica fuente de carbn y energa, e incrementada cuando
estas clulas crecen en medio con lactosa. Algunas molculas
similares en estructura a la lactosa pueden inducir la expresin
de los genes del opern Lac; aun cuando ellas no pueden ser hidrolizadas por la -galactosidasa, estas molculas son llamadas
inductores. Una de ellas es el Isopropil--D-tiogalactsido, abreviado IPTG. Es particularmente til en los estudios genticos del
opern Lac debido a que l puede entrar a la clula y como
no es metabolizado, su concentracin permanece constante a
travs del ensayo. Cuando las bacterias E. coli son colocadas
37
en placas con IPTG y 5-bromo-4-cloro-3-indolil--D-galactsido (X-gal), compuesto incoloro que tambin es hidrolizado por
-galactosidasa produciendo un compuesto insoluble de color
azul, todas las colonias que crecen son azules. Cuando son colocadas en placas con X-gal sin IPTG, las colonias resultantes
sern blancas, en este caso no hay suficiente -galactosidasa
en la clula para hidrolizar el X-gal y producir la coloracin azul.
A la izquierda del gen Lac Z hay una regin llamada gen Lac I,
el cual codifica para una protena que normalmente reprime la
expresin del opern Lac en la ausencia de lactosa, de ah que
los investigadores la denominaron represor Lac y propusieron
que su unin al sitio del genoma de E. coli donde se inicia la
transcripcin del opern Lac, lo bloqueaba. Ms adelante, propusieron la hiptesis que cuando la lactosa est presente en la
clula, sta se une a la protena represor Lac, disminuyendo su
afinidad por el sitio de unin del represor en el ADN. Como resultado, el represor falla y la transcripcin del opern Lac se inicia,
conduciendo a la sntesis de galactosidasa, lactosa permeasa
y tiogalactsido transacetilasa (Lodish y col., 1995).
Un ejemplo de esta seleccin es el plsmido pUC8, el cual contiene el gen para la resistencia a la ampicilina y un segmento de
ADN derivado del opern Lac de E. coli, llamado gen Lac Z, que
codifica para la porcin amino terminal de la enzima -galactosidasa, cuya sntesis tambin es inducida por IPTG. Vectores
de este tipo son usados con cepas de E. coli que tienen el gen
Lac Z modificado (Lac-), faltndoles el segmento conocido como
Lac Z. Estas bacterias pueden sintetizar slo la porcin carboxi- terminal de la enzima -galactosidasa, por lo que la clula
hospedadora y el plsmido se asocian para formar la protena
enzimaticamente activa. Las clulas que transportan el plsmido
normal pUC8 sern ampicilina resistentes y capaces de sintetizar ambos fragmentos de la enzima, formando colonias azules
cuando el medio contiene X-gal (Figura 14).
38
Figura 14. Seleccin por inactivacin por insercin de un ADN forneo en el gen Lac Z del plsmido pUC8. a) Molcula normal. b) Produccin de la molcula completa de la enzima
- galactosidasa (Fuente: Brown, 1990).
La clonacin con pCU8, que incluye la inactivacin por insercin

en el gen Lac Z de un fragmento de ADN forneo, produce colonias ampicilina resistentes pero incapaces de sintetizar la enzima, ya que la insercin del ADN forneo en el sitio de policlonaje
del plsmido, inactiva el fragmento amino terminal de la enzima
- galactosidasa (Figura 15).
Para la seleccin, en el agar con X-gal ms el inductor de la enzima como es el IPTG en conjunto con ampicilina, las colonias no39
recombinantes sern azul oscuro, mientras las que tienen el gen

Lac Z recombinante son incapaces de sintetizar la enzima y por
lo tanto sern blancas (Sambrook y col., 1989; Brown, 1990).
Figura 15. a) pUC8 recombinante con inserto de AND en el sitio bamHI.

b) Seleccin de las recombinantes en agar conteniendo
x-gal ms IPTG (Fuente: Brown. 1990).
e) Seleccin de fagos recombinantes

El estado final de un ciclo de infeccin de un fago es la lisis celular. Si las clulas infectadas son esparcidas sobre un medio
40
slido de agar, inmediatamente despus de haberse incubado

con los fagos, la lisis celular puede ser visualizada como placas
o espacios abiertos sin bacterias. Cada placa es una zona clara
producida por la lisis de los fagos sobre las bacterias, los cuales
infectan nuevas clulas vecinas provocando su lisis. El resultado
final de un experimento de clonacin de genes usando fagos
como vectores es una placa de agar cubierta de placas de fagos.
Cada placa es el resultado de una clula infectada y por lo tanto
contiene partculas de fagos idnticas. Ellas pueden contener
vectores recombinantes y no recombinantes. Entre las diferentes formas para lograr la seleccin de los fagos recombinantes
(Figura 16), se encuentran las siguientes:
Inactivacin por insercin del gen Lac Z transportado por
el fago: la insercin de un nuevo ADN dentro del gen Lac
Z inactiva la sntesis de -galactosidasa, y al igual como
sucede con el plsmido pUC8, los fagos recombinantes
son distinguidos cuando se usan hospedadores Lac- en
presencia de un sustrato cromgeno X-gal, por su habilidad de formar placas claras y las de los fagos no recombinantes sern azules.
Seleccin usando el fenotipo SPI: el fago normalmente
no puede infectar clulas de E. coli que posean un profago conocido como P2. A estos fagos se les llama Spi+
(sensibles a la inhibicin del profago P2). Algunos fagos
son escogidos de tal manera que la insercin de un
nuevo ADN causa un cambio de Spi+ a Spi-, (carecen de
dos genes involucrados en la recombinacin, genes red
y gam) por lo que el recombinante puede infectar clulas
que transportan el profago P2. Tales clulas son usadas
como receptoras para experimentos de clonacin con estos vectores, solamente las recombinantes Spi - producirn placas (Sambrook y col.,1989; Brown, 1990).
Seleccin sobre la base del tamao del genoma : el sistema de ensamblaje , que ensambla partculas de fagos
41
maduras, puede insertar slamente molculas de ADN

entre 37 y 52 Kb dentro de la cabeza del fago. Cualquier
molcula inferior o menor a 37 Kb no podr ser ensamblada. Muchos vectores han sido construidos cortando
segmentos largos de la molcula de ADN para ser menores de 37 Kb de largo. As, el fago ser ensamblado
solamente despus que el ADN extra se haya insertado,
dndole al genoma un tamao por encima de los 37 Kb.
Por lo tanto los fagos recombinantes sern los capaces
de replicarse y lisar las clulas (Brown, 1990).
Figura 16. Estrategias para seleccionar fagos recombinantes (Fuente: Brown, 1990).
42
f) Mtodos para evaluar las genotecas

La identificacin de las clulas transformadas por un ADN recombinante concreto, que ha incorporado un inserto especfico
entre los muchos posibles, requiere la posesin de un mtodo
de deteccin del gen o producto del gen, de forma que se puede
aislar el clon recombinante, entre las diferentes colonias de bacterias o fagos (Peafiel y Garca, 2001). Entre los mtodos que
existen para evaluar las genotecas estn: hibridizacin con sondas de cido nucleico radiomarcadas y deteccin inmunolgica
de antgenos especficos.
En 1975, Grunstein y Hogness describieron un mtodo para la
lisis in situ de colonias bacterianas en filtro de nitrocelulosa y
unin no covalente del ADN liberado a el filtro. Entonces, el ADN
puede ser hibridizado por sondas apropiadas de cido nucleico
radiomarcado. 2 x 104 colonias por filtro de 138 mm o 104 colonias por filtro de 82 mm pueden ser evaluadas usando esta tcnica (Sambrook y col., 1989).
Para detectar cul de las colonias recombinantes que crece en
la placa de agar posee un inserto determinado (Figura 17), se
presiona suavemente un filtro de nitrocelulosa sobre la placa de
agar, de modo que algunas clulas de cada colonia se peguen al
filtro, formando una rplica de la placa. La rplica se trata con lcali para romper las clulas y desnaturalizar el ADN, que queda
unido al filtro, y se incuba despus con la sonda radiactiva (casi
siempre marcada con 32p). Por autorradiografia, se obtiene una
imagen que permite detectar la posicin en la placa de agar de
la colonia o colonias de inters (Luque y Herrez, 2001; Peafiel
y Garca, 2001; Izquierdo, 2001).
Otro mtodo es el anlisis de ADN plasmdico sometido a digestin con enzimas de restriccin. Para esto, un nmero de
colonias bacterianas transformadas son tomadas y colocadas a
crecer en cultivo a pequea escala. El ADN de los plsmidos es
aislado de cada cultivo y analizado por digestin con enzimas de
43
restriccin y electroforesis en gel. Este procedimiento, aunque

laborioso, es el mtodo de eleccin cuando hay una alta probabilidad de encontrar el recombinante deseado dentro de un
pequeo nmero de colonias transformadas escogidas al azar
(Sambrook y col., 1989).
Figura 17. Seleccin de la colonia de bacterias con el recombinante

deseado por medio del mtodo de hibridizacin (Fuente:
Luque y Herrez, 2001)
En el caso de los bacteriofagos, es similar. Despus que una

coleccin de fagos ha sido preparada, es necesario identificar y
aislar el recombinante deseado de la poblacin. El mtodo comnmente usado involucra una evaluacin de las placas de los
bacteriofagos por hibridizacin con sondas de ADN marcadas
con 32p (Benton y Davis, 1977) (Figura 18). Los bacterifagos
son sembrados en una densidad adecuada y para imprimir una
copia del patrn de las placas, se coloca un filtro de nitrocelulosa
sobre la superficie del top agar. Las partculas del bacterifago y
el ADN son transferidas al filtro por capilaridad y as se obtiene
un patrn exacto de las placas. Luego de una desnaturalizacin
con lcali, el ADN se une irreversiblemente al filtro y puede ser
44
hibridizado con la sonda marcada con 32p. El exceso de la sonda

se elimina por lavados y los filtros son expuestos a una pelcula o
placa autoradiogrfica. Las placas hibridizadas son identificadas
por alineacin de la pelcula con la placa de agar original y recolectadas para su anlisis. Este mtodo es valioso para identificar
un pequeo nmero de bacteriofagos recombinantes que porten secuencias de inters en genotecas genmicas o de ADNc
(Sim y col., 1979). En placas de Petri de 90 mm se pueden evaluar un mximo de 15.000 placas y en una placa de Petri de 150
mm se puede evaluar 50.000 placas. (Sambrook y col., 1989).
Figura 18. Identificacin de un clon especfico de fagos recombinantes por el mtodo de hibridizacin (Fuente: Lodish y col.,
1995).
45
Se han desarrollado bacterifagos no slo para permitir la propagacin de secuencias forneas, sino tambin para permitir su
expresin en la clula bacteriana. El vector de este tipo ms comnmente usado, es gt11 (Huynh y col., 1985). ste porta una
porcin del gen de la -galactosidasa de E. coli, incluyendo los
elementos que son esenciales para su expresin. Las genotecas
de ADNc construidas con gt11 y gt18-23 pueden ser evaluadas inmunologicamente por la expresin de antgenos especficos en E. coli (Figura 19). Esto ha permitido el aislamiento de
muchos genes que codifican para protenas, utilizando anticuerpos especficos. El ORF8 es otro vector de expresin usado
con xito.
Las genotecas con plsmidos son ms difciles de almacenar,
replicar y evaluar que aquellas construidas con bacterifagos
. Por esta razn, la evaluacin inmunolgica de genotecas de
ADNc es usualmente llevada a cabo en genotecas construidas
en bacterifago de expresin como gt11 y sus derivados,
ORF8 y Zap.
Cuando hay la disponibilidad de los dos mtodos, la hibridizacin con sondas de cido nucleico radiomarcado es el preferido,
debido a que se puede usar bajo diferentes grados de astringencia. Las sondas de cidos nucleicos detectan todos los clones
que contienen secuencias de ADNc, mientras los anticuerpos
slo reaccionan con un subconjunto de estos clones (en algunos casos uno de seis) en los cuales el ADNc ha sido insertado
en el vector, en el correcto marco de lectura y orientacin. Las
genotecas de ADNc que son evaluadas con anticuerpos necesitan ser ms grandes (por un factor por lo menos de seis) que
aquellas que son evaluadas por sondas de cidos nucleicos. La
evaluacin por hibridizacin con cido nucleico no requiere que
el ADNc clonado est completo y no requiere que el producto
sintetizado en la clula hospedadora sea funcional y mantenga
sus propiedades antignicas (Sanbrook y col., 1989).
46
Figura 19. Evaluacin inmunolgica de una genoteca, debido a la expresin de protenas, utilizando anticuerpos radiomarcados (Fuente: Lodish y col.,1995).
47
Actualmente tambin se usan otros sistemas de marcaje incorporados a la sonda o al anticuerpo. Entre estos marcajes se encuentran: el sistema biotina-avidina, en el cual la protena avidina
lleva acoplado un marcador fluorescente y la deteccin se hace
por fluorescencia. Otro es el uso de enzimas que actan sobre
sustratos que dan un producto coloreado o quimioluminiscente,
el cual se detecta por autoradiografa. Un ejemplo de este ltimo
es el uso de la enzima peroxidasa que degrada el luminol con la
emisin de quimioluminiscencia (Brown, 1990; Luque y Herrez,
2001).
g) Ejemplos de genotecas.
Se han elaborado genotecas tanto de ADNc como genmicas
de variados agentes patgenos (Cuadro 3), lo que ha permitido
un conocimiento de las bases moleculares de muchas enfermedades.
48
Cuadro 3. Algunos agentes patgenos para los cuales se han elaborado genotecas
Tipo de
Referencia
genoteca
Anaplasma marginale
ANDg
Aboytes y Buening, 1990
Babesia bigemina
ANDc
Valencia, 2002
Gill
y col., 1987; Ruef y col., 2000
Babesia bovis
ADNc
Allred y Al-Khedery, 2004
Babesia bovis
ANDg
Petchpoo y col.,1992
Babesia divergens
ADNc
DelbecQ y col., 2002
Babesia equi
ADNc
Schelp y col., 1995
Fukumoto y col., 2001
Babesia gibsoni
ADNc
Fukumoto y col., 2003
Homer y col., 2000
Babesia microti
ADNg
Homer y col., 2003; Lodes y col.,
2000
Brugia pahangi
ADNc
Hunter y col., 1999
Cryptosporidium parvum
ADNc
Petry y col., 1998
Dictyocaulus viviparus
ANDc
Britton y col., 1995
Echinococcus granulosus
ADNc
Margutti y col., 1999
Ouarzane
y col., 1998; Refega y
Eimeria tenella
ADNc
col.,2003
Leishmania major
ANDc
Piedrafita y col.,1999; Stober, 2004
Necator americanus
ANDc
Zhan y col., 2000
Neospora caninum
ANDc
Hemphill y col., 1997
Plasmodium berghei
ANDc
Shibui y col., 2001
Plasmodium falciparum
ANDc
Watanabe y col., 2001
Plasmodium vivax
ANDc
Qui y Tong, 1994
Psoroptes ovis
ANDc
Lee y col., 1999
Sarcoptes scabiei
ANDc
Harumal y col., 2003
Schistosoma mansoni
ANDc
Zouain y col., 1998
Taenia saginata
ANDc
Ferrer y col., 2003
Taenia solium
ANDc
Jimnez y col., 2000
Toxoplasma gondii
ANDc
Striepen y col., 2002
Trichomona vaginalis
ANDc
Arroyo y col., 1995
Wuchereria bancrofti
ANDg
Raghavan y col., 1991
Agente patgeno
49
h) Importancia de la elaboracin de una genoteca

Una vez que el ADN ha sido clonado, se pueden multiplicar los
clones individuales en cualquier momento y obtener un fragmento de ADN recombinante en cantidad suficiente, a partir de lo
cual se abren diversas posibilidades, tanto en el mbito de la
investigacin pura (estudio de la estructura y la funcin de un
gen) y aplicada (obtencin de plantas o animales transgnicos),
como en la esfera mdica (diagnstico y tratamiento de enfermedades).
Hay muy pocas reas de la investigacin biolgica que no han
sido afectadas por la clonacin de genes. En la industria, por
ejemplo, la clonacin de genes ha permitido alcanzar enormes
avances en biotecnologa. Por muchos aos han sido utilizados
bacterias y hongos como fbricas vivientes las cuales producen
componentes muy tiles como los antibiticos, por ejemplo la
penicilina, la cual es sintetizada por un hongo Penicilium y la estreptomicina, producida por una bacteria Streptomyces griseus.
La clonacin ha revolucionado la biotecnologa de una forma notable, proporcionando una va en la cual, protenas de mamferos
puedan ser producidas dentro de clulas bacterianas. Los genes
que controlan la sntesis de importantes principios activos farmacuticos, tales como drogas, hormonas, pueden ser tomadas de
los organismos donde estn presentes naturalmente, pero que
su obtencin a partir de los organismos naturales puede ser costosa y difcil, y al colocarlos en una bacteria, el producto puede
ser recuperado fcilmente y en mayores cantidades. Un ejemplo
es la insulina recombinante (Peafiel y Garca, 2001).
De ah la importancia de las genotecas, como herramienta para
la obtencin de conocimiento ms preciso de las bases moleculares de muchas enfermedades y de nuevas posibilidades teraputicas.
50
III Bibliografia consultada

Aboytes-Torres, R. y Buening, G.M. 1990. Development of a
recombinant Anaplasma marginale DNA probe. Vet. Microbiol.
24(3-4):391-408.
Allred, D. R. y Al-Khedery, B. 2004. Antigenic variation and cytoadhesion
in Babesia bovis and Plasmodium falciporum, diferent logics
achieve the some goal. Mol Biochem parasitol. 134 (1):27-35.
Arroyo, R.; Engbring, J.; Nguyen, J.; Musatovova, O.; Lopez, O.;
Lauriano, C. y Alderete, J.F. 1995. Characterization of cDNAs
encoding adhesin proteins involved in trichomonas vaginalis
cytoadherence. Arch. Med. Res. 26(4):361-9.
Balbs, P.; Sobern, X.; Merino, E.; Zurita, M.; Lomeli, H.; valle, F.;
Flores, N. y Bolvar, F. 1986. Plasmid vector pbr322 and its
special- purpose derivatives. Gene 50:3.
Benton, W.D. y Davis, R.W. 1977. Screening gt recombinant clones
by hybridization to single plaques in situ. Science 196:180.
Bolvar, F.; Rodrguez, M.C.; Betlach, M.C. y Boyer, H. W. 1977a.
Construction and characterization of new cloning vehicles. I.
Ampicillin-resistant derivatives of the plasmid pMB9. Gene. 2: 75
Bolvar, F.; Rodrguez, M.C.; Greene, P.J.; Betlach, M.C.; Heyneker,
H.L.; Boyer, H. W.; Crosa, J.H. y Falkow, S. 1977b. Construction
and characterization of new cloning vehicles. II. A multipurpose
cloning system. Gene 2:95
Britton, C.; Moore, J.; Gilleard, J.S. y Kennedy, M.W. 1995. Extensive
diversity in repeat unit sequences of the cDNA encoding
the polyprotein antigen/allergen from the bovine lungworm
Dictyocaulus viviparus. Mol. Biochem. Parasitol. 72(1-2):77-88.
Brown, T. A. 1990. Gene Cloning. Segunda edicin. Chapman and
May. 286 p
Cohen, S.N.; Chang, A.C.Y.; Boyer, H.W. y Helling, R.B. 1973.
Construction of biologically functional bacterial plasmids in vitro.
Proc. Natl. Acad. Sci. 70: 3240
51
Campbell, A. M. (2001). Bacteriophages. En: Fields Virology. Knipe,

D.M. and Howley, P.M. Editors in chief and associate editors. Vol
1. 659 - 682
Covey, C.; Richardson, D. y Carbon, J. 1976. A method for the deletion
of restriction sites in bacterial plasmid deoxyribonucleic acid. Mol.
Gen. Genet. 145: 155
De Robertis, E.M.F.; Hib, J. y Ponzio R. 1998. Mtodos de estudio
en biologa celular. En; Biologa Celular y Molecular de Eduardo
D.P. De Robertis. Editorial El Ateneo.45 80
Delbecq, S.; Precigout, E.; Vallet, A.; Carcy, B.; Schetters, T.P.M. y
Gorenflot,A. 2002. Babesia divergens: cloning and biochemical
characterization of Bd37. Parasitology. 125: 305-312.
Ferrer, E.; Moyano, E.; Benitez, L.; Gonzalez, L.M.; Bryce, D.; FosterCuevas, M.; Davila, I.; Cortez, M.M.; Harrison, L.J.; Parkhouse,
R.M. y Garate, T. 2003. Cloning and characterization of Taenia
saginata paramyosin cDNA. Parasitol. Res. 91(1):60-7.
Fukumoto, S.; Xuan, X.; Nishikawa, Y.; Inoue, N.; Igarashi, I.; Nagasawa,
H.; Fujisaki, K.. y Mikami, T. 2001. Identification and expression of
a 50-kilodalton surface antigen of Babesia gibsoni and evaluation
of its diagnostic potential in an enzyme-linked immunosorbent
assay. J. Clin. Microbiol. 39(7):2603-9.
Fukumoto, S.; Xuan, X.; Inoue, N.; Igarashi, I.; Sugimoto, C.; Fujisaki,
K.; Nagasawa, H.; Mikami, T. y Suzuki, H. 2003. Molecular
characterization of a gene encoding a 29-kDa cytoplasmic protein
of Babesia gibsoni and evaluation of its diagnostic potentiality.
Mol. Biochem. Parasitol. 131(2):129-36
GIBCOTM BRL. 1999. TRIzolR Reagent. Total RNA isolation Reagent.
Instruction Manual.
Gill, A.; Timms, P. y Kemp, D.J. 1987. cDNA clone encoding a high
molecular weight antigen of Babesia bovis. Mol. Biochem.
Parasitol. 22(2-3):195-202. Grunstein, M. y Hogness, D. S. 1975.
Colony hybridization: A method for the isolation of cloned DNAs
that contain a specific gen. Proc. Natl. Acad. Sci. 72: 396.
Hanahan, D. 1983. Studies on transformation of Escherichia coli with
plasmids. J. Mol. Biol. 166: 557.
52
Hanahan, D. y Meselson, M. 1983. plasmid screening at high colony

density. Gene 10:63.
Harumal, P.; Morgan, M.; Walton, S.F.; Holt, D.C.; Rode, J.; Arlian, L.G.;
Currie, B.J. y Kemp, D.J. 2003. Identification of a homologue of a
house dust mite allergen in a cDNA library from Sarcoptes scabiei
var hominis and evaluation of its vaccine potential in a rabbit/S.
scabiei var. canis model. Am. J. Trop. Med. Hyg. 68(1):54-60.
Hemphill, A.; Felleisen, R.; Connolly, B.; Gottstein, B.; Hentrich, B.
y Muller, N. 1997. Characterization of a cDNA-clone encoding
Nc-p43, a major Neospora caninum tachyzoite surface protein.
Parasitology. 1997 Dec;115 (Pt 6):581-90
Hershfield, V.; Boyer, H.W.; Yanofsky, C.; Lovett, M.A. y Helinski, D.R.
1974. Plasmid ColE1 as a molecular vehicle for cloning and
amplification of DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. 71: 3455
Homer, M.J.; Lodes, M.J.; Reynolds, L.D.; Zhang, Y.; Douglass, J.F.;
McNeill, P.D.; Houghton, R.L. y Persing, D.H. 2003. Identification
and characterization of putative secreted antigens from Babesia
microti. J. Clin. Microbiol. 41(2):723-9.
Homer, M.J.; Bruinsma, E.S.; Lodes, M.J.; Moro, M.H.; Telford S 3rd;
Krause, P.J.; Reynolds, L.D.; Mohamath, R.; Benson, D.R.;
Houghton, R.L.; Reed, S.G. y Persing, D.H. 2000. A polymorphic
multigene family encoding an immunodominant protein from
Babesia microti. J. Clin. Microbiol. 38(1):362-8.
Hunter, S.J.; Martin, S.A.; Thompson, F.J.; Tetley, L. y Devaney, E.
1999. The isolation of differentially expressed cDNA clones
from the filarial nematode Brugia pahangi. Parasitology. 119 (Pt
2):189-98.
Huynh, T.V.; Young, R.A. y Davis, R.W. 1985. Constructing and screening
cDNA libraries in gt10 and gt11. In DNA cloning: A practical
approach (ed. D.M. Glover), vol. 1, p. 49. IRL Press, Oxford.
Izquierdo, M. 2001. Ingeniera Gentica y Transferencia Gnica.
Editorial Pirmide. 341 p
Jimnez, L.; Vibanco-Perez, N.; Navarro, L. y Landa, A. 2000. Cloning,
expression and characterisation of a recombinant triosephosphate
isomerase from Taenia solium. Int. J. Parasitol. 30(9):1007-12
53
Lee, A.J.; Isaac, R.E. y Coates, D. 1999. The construction of a cDNA

expression library for the sheep scab mite Psoroptes ovis. Vet.
Parasitol. 83(3-4):241-52.
Lewin, B. 2001. Genes VII. Marbn. 990p
Lodes, M.J.; Houghton, R.L.; Bruinsma, E.S.; Mohamath, R.; Reynolds,
L.D.; Benson, D.R.; Krause, P.J.; Reed, S.G. y Persing, D.H.
2000. Serological expression cloning of novel inmunoreactive
antigens of Babesia microti. Infect.Immun. 68(5): 2783-90.
Lodish, H.; Baltimore, D.; Berk, A.; Zipursky, S.L.; Matsudaria, P. y
Darnell, J. 1995. Molecular Cell Biology. Third edition. Scientific
American Books. 1344 p
Luque, L. y Herrez, A. 2001. Texto ilustrado de Biologa Molecular
e Ingenieria Gentica. Conceptos, tcnicas y aplicaciones en
ciencias de la salud. Ediciones Harcourt. 469p.
Margutti, P.; Ortona, E.; Vaccari, S.; Barca, S.; Rigano, R.; Teggi, A.;
Muhschlegel, F.; Frosch, M. y Siracusano, A. 1999. Cloning and
expression of a cDNA encoding an elongation factor 1beta/delta
protein from Echinococcus granulosus with immunogenic activity.
Parasite Immunol. 21(9):485-92.
Ouarzane, M.; Labbe, M y Pery, P. 1998. Eimeria tenella: cloning and
characterization of cDNA encoding a S3a ribosomal protein.
Gene, 225(1-2): 125-30.
Peafiel, R. y Garca-Borrn, J.C. 2001. Anlisis Molecular del
Genoma, Tcnicas y Aplicaciones. En: Bioqumica y Biologa
Molecular para Ciencias de la Salud. Ed: Lozano, J.A.; Galindo,
J.D.; Garca-Borrn, J.C.; Martnez-Liarte, J.H.; Peafiel, R. y
Solano, F. 2da Edicin. McGraw-Hill Interamericana. 226 p
Petchpoo, W.; Tan-ariya, P.; Boonsaeng, V.; Brockelman, C.R.; Wilairat,
P. y Panyim, S. 1992. A specific DNA probe which identifies
Babesia bovis in whole blood. Vet. Parasitol. 42(3-4):189-98.
Petry, F.; Shirley, M.W.; Miles, M.A. y McDonald, V. 1998. Characterisation
of a Cryptosporidium parvum-specific cDNA clone and detection
of parasite DNA in mucosal scrapings of infected mice. Mol.
Biochem. Parasitol. 95(1):21-31.
54
Piedrafita, D.; Xu, D.; Hunter, D.; Harrison, R.A. y Liew, F.Y. 1999.
Protective immune responses induced by vaccination with an
expression genomic library of Leishmania major. J. Immunol.
163(3):1467-72.
Qui, C. y Tong, X. 1994. Construction of a cDNA library of the erythrocytic
stage of Plasmodium vivax. Zhongguo Ji Sheng Chong Xue Yu Ji
Sheng Chong Bing Za Zhi. 12(2):104-6.
Raghavan, N.; McReynolds, L.A.; Maina, C.V.; Feinstone, S.M.;
Jayaraman, K.; Ottesen, E. A. y Nutman, T.B. 1991. A recombinant
clone of Wuchereria bancrofti with DNA specificity for human
lymphatic filarial parasites.Mol. Biochem. Parasitol. 47(1):63-71.
Refega, S.; Girard-Misguich, F.; Bourdieu, C.; Pery, P. y Labbe, M.
2003. Gene discovery in Eimeria tenella by immunoscreening
cDNA expression libraries of sporozoites and schizonts with
chicken intestinal antibodies. Vet. Parasitol. 113(1):19-33.
Ruef, B.J.; Dowling S.C.; Conley, P.G.; Perryman, L.E.; Brown, W.C.
y Jasmer, D.P. 2000. A unique Babesia bovis spherical body
protein is conserved among geographic Isolates and localizes
to the infected erythrocyte membrane. Mol. Biochem. Parasitol.
105(1):1-12.
Sambrook, J.; Fritsch, E.F. y Maniatis, T. 1989. Molecular Cloning.
A Laboratory Manual. Second edition. Cold Spring Harbor
Laboratory Press
Schelp, C.; Bose, R.; Micha, A. y Hentrich, B. 1995. Cloning and
expression of two genes from Babesia equi merozoites
and evaluation of their diagnostic potential. Appl. Parasitol.
36(1):1-10.
Shibui, A.; Ohmori, Y.; Suzuki, Y.; Sasaki, M.; Nogami, S.; Sugano, S.
y Watanabe, J. 2001. Effects of DNA vaccine in murine malaria
using a full-length cDNA library. Mol. Pathol. Pharmacol. 109(34):147-57.
Sim, G. K.; Kafatos, F.C.; Jones, C.W.; Koehler, M.D.; Efstratiadis, A.
y Maniatis, T. 1979. Use of cDNA library for studies on evolution
55
and developmental expression of the chorion multigene families.

Cell 18. 1303.
Sobern, X.; Covarrubias, L. y Bolvar, F. 1980. Construction and
characterization of new cloning vehicles. IV. Deletion derivatives
of pBR322 and pBR325. Gene 9: 287.
Stober C.B. 2004. From genomes to vaccines for leishmaniasis.
Methods Mol. Biol. 270:423-38.
Stratagene. 2000. Zap-cDNA Synthesis kit. Instruction Manual.
Striepen, B.; White, M.W.; Li, C.; Guerini, M.N.; Malik, S.B.;
Logsdon, J.M. Jr ; Liu, C. y Abrahamsen, M.S. 2002. Genetic
complementation in apicomplexan parasites. Proc. Natl. Acad.
Sci. U S A. 99(9):6304-9.
Twigg, A.J. y Sherratt, D. 1980. trans-complementable copy-number
mutants of plasmid ColE1. Nature 283:216
Valencia, M. 2002. Caracterizacin Bioqumica y molecular de
proteasas de Babesia bigemina y Babesia divergens. Tesis
Doctoral, Universidad Simn Bolvar.
Watanabe, J.; Sasaki, M.; Suzuki, Y. y Sugano, S. 2001. FULL-malaria:
a database for a full-length enriched cDNA library from human
malaria parasite, Plasmodium falciparum. Nucleic. Acids. Res.
29(1):70-1.
Zhan, B.; Hawdon, J.; Shan, Q.; Ren, H.; Qiang, H.; Xiao, S.H.; Li, T.H.;
Feng, Z. y Hotez, P. 2000. Construction and analysis of cDNA
library of Necator americanus third stage larvae. Zhongguo Ji
Sheng Chong Xue Yu Ji Sheng Chong Bing Za Zhi. 18(1):26-8.
Zouain, C.S.; Azevedo, V.A.; Franco. G.R.; Pena, S.D. y Goes, A.M.
1998.Identification of genes encoding Schistosoma mansoni
antigens using an antigenic sequence tag strategy. J. Parasitol.
84(6):1307-10.
56

La Genoteca Como Herramienta de La Biotecnología

Cargado por

Información del documento

Título original

Derechos de autor

Formatos disponibles

Compartir este documento

Compartir o incrustar documentos

Opciones para compartir

¿Le pareció útil este documento?

¿Este contenido es inapropiado?

Copyright:

Formatos disponibles

La Genoteca Como Herramienta de La Biotecnología

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

La genoteca como herramientade la biotecnologa

Instituto Nacional de Investigaciones

INIA. Centro Nacional de Investigaciones Agropecuarias, Maracay. Venezuela

La genoteca como herramienta de la biotecnologa

Instituto Nacional de Investigaciones Agrcolas - INIA, 2009

Prohibida la reproduccin total o parcial de esta obra,

La genoteca como herramientade la biotecnologa

La genoteca como herramienta de la biotecnologa

La genoteca como herramientade la biotecnologa

La genoteca como herramienta de la biotecnologa

so, en su conjunto, se denomina clonacin molecular y se resume en los pasos siguientes:

La genoteca como herramientade la biotecnologa

La genoteca como herramienta de la biotecnologa

haya, y otro que destruye la membrana celular. Para la bacteria

La genoteca como herramientade la biotecnologa

mao adecuado, mediante el uso de endonucleasas de restriccin.

La genoteca como herramienta de la biotecnologa

Figura 1. Sntesis de ADNc (Adaptado del Zap-cDNA Sntesis Kit.

Para evitar esto, la primera cadena de ADNc debe ser metilada.

La genoteca como herramientade la biotecnologa

ADN, utilizando como molde a la primera, generando molculas

La genoteca como herramienta de la biotecnologa

La genoteca como herramientade la biotecnologa

Figura 2. Replicacin de plsmidos no integrativos (Fuente: Brown,

Estos vectores casi siempre transportan uno o ms genes y

La genoteca como herramienta de la biotecnologa

La genoteca como herramientade la biotecnologa

(Sambrook y col.,1989; Brown, 1990; Lewin, 2001; Peafiel y

Figura 4. Episoma (Fuente: Brown, 1990)

Como se mencion anteriormente, es importante el tamao del

La genoteca como herramienta de la biotecnologa

Cuadro 1. Tamao de diferentes plsmidos

La genoteca como herramientade la biotecnologa

vectores que se usan hoy, son descendientes directos de ste

La genoteca como herramienta de la biotecnologa

Aunque el tamao de los insertos que se pueden clonar en la

La genoteca como herramientade la biotecnologa

el vector no puede circularizarse eficientemente. Entonces, las

Figura 5. Clonacin direccional en el plsmido (Fuente: Sambrook

La genoteca como herramienta de la biotecnologa

La genoteca como herramientade la biotecnologa

Figura 6. Procedimiento general de clonacin de un fragmento de

La genoteca como herramienta de la biotecnologa

Los bacterifagos o fagos

La genoteca como herramientade la biotecnologa

3. Otros genes del fago dirigen la sntesis de los componentes

La genoteca como herramienta de la biotecnologa

Figura 7. Ciclo ltico del bacterifago. (Fuente: Lewin, 2001).

La genoteca como herramientade la biotecnologa

Figura 8. Ciclo lisognico y ciclo ltico del bacterifago (Fuente:

La genoteca como herramienta de la biotecnologa

Figura 9. Bacteriofago (Fuente: Lodish y col, 1995).

La genoteca como herramientade la biotecnologa

La genoteca como herramienta de la biotecnologa

Cuadro 2. Tamao de diferentes bacterifagos

Tamao del inserto (kb)

(Fuente: Sambrook y col., 1989)

El fago M13 es un ejemplo de fago filamentoso y su estructura

La genoteca como herramientade la biotecnologa

Se utilizan en la elaboracin de genotecas de genomas grandes,

La genoteca como herramienta de la biotecnologa

La genoteca como herramientade la biotecnologa

La genoteca como herramienta de la biotecnologa