Tema 6.

Purificacin de protenas

Bioqumica

TEMA 6. PURIFICACIN DE PROTENAS

1. Introduccin
2. Mtodos de rotura celular y extraccin de protenas
3. Mtodos cromatogrficos
4. Mtodos electroforticos

1. Introduccin
La mayor parte de las investigaciones bioqumicas requieren la purificacin, al
menos parcial, de las sustancias objeto de estudio. Esto requiere generalmente
un gran esfuerzo ya que una clula contiene miles de sustancias diferentes, la
molcula que buscamos puede ser extremamente inestable o encontrarse a
concentraciones muy bajas. En este tema se presenta una visin general de las
tcnicas ms usuales empleadas para la purificacin de protenas, aunque
muchas de ellas son aplicables a la separacin de la mayora de las molculas
biolgicas.
El conocimiento del proteoma, conjunto de protenas de un organismo, ha
pasado a ser el reto de la comunidad cientfica y de las empresas
biotecnolgicas, una vez que ya se ha completado la secuenciacin del
genoma de varios organismos incluyendo el genoma humano. El conocimiento
de las secuencias de DNA que integran nuestros genes no tiene un gran valor,
si no se identifica cual es la funcin de dichos genes, en su caso, para que
protenas codifican.
El programa proteoma busca la caracterizacin de todas las protenas de la
clula humana, identificando su secuencia de aminocidos. Cuando se obtenga
toda la secuencia de aminocidos del proteoma humano se podr relacionar
mediante potentes programas informticos la secuencia de aminocidos de una
protena con el gen que la codifica. Los mtodos de secuenciacin tradicionales
(basados en la degradacin de Edman) son demasiado lentos para abordar
esta ingente tarea, la secuenciacin de los pptidos debe hacerse por
espectometra de masas. Naturalmente las tcnicas de purificacin y
aislamiento de protenas son esenciales para abordar toda esta tarea.
2. Mtodos de rotura celular y extraccin de protenas
El primer paso en el aislamiento de una protena es la rotura celular, para
posteriormente poder extraer la protena con un tampn adecuado. El mtodo
de rotura a elegir depende de las caractersticas mecnicas del tejido o clulas
de donde se va a aislar la protena, as como de su localizacin. Entre los
distintos mtodos ellos estn:

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z Lisis celular. Vlido para clulas sin pared celular como las clulas de
tejidos animales, pero no es suficiente para clulas vegetales o bacterias.
Consiste en suspender las clulas en una solucin hipotnica (ms diluida que
el interior celular). Debido a la diferencia osmtica el agua difunde al interior de
la clula, causando su hinchamiento y rotura.
z Destruccin mcanica. Entre estos mtodos se encuentran la
homogenizacin (hacer pasar las clulas entre un tubo y un pistn de vidrio
que ajustan casi totalmente); moler en un mortero con arena o almina;
molino con perlas de vidrio, la prensa de French (que hace pasar las clulas
a gran velocidad a travs de un pequeo orificio), la sonicacin (someter las
clulas a vibraciones de ultrasonido).

Sonicacin
Presin

z Congelacin-descongelacin. La rotura se produce al someter las clulas a

un cambio brusco de temperatura, congelando primero a -196 C (con
nitrgeno lquido) y pasndolas rpidamente a temperatura ambiente (25 C).

Tras la rotura o bien, si se requiere, durante el proceso de rotura, se utilizan

tampones de extraccin para solubilizar las protenas. Pueden utilizarse como
tales disoluciones acuosas de tampones especficos para protenas solubles o
bien que contengan adems detergentes si se pretende purificar protenas
asociadas a membranas, si bien en este caso hay que cuidar que la enzima no
se desnaturalice.
Una vez que la protena se ha extrado de su entorno natural est expuesta a
muchos agentes que pueden daarla. Los cambios bruscos de pH, cidos y
bases fuertes, temperaturas extremas y la accin de las proteasas (enzimas
que hidrolizan los enlaces peptdicos) son los principales factores que pueden
desnaturalizar las protenas. Para evitar o minimizar estos factores la
manipulacin de las protenas durante el proceso de purificacin suele llevarse
a cabo en disoluciones tamponadas, a bajas temperaturas (4C) y se procura
que el proceso sea lo ms corto posible, adems en ocasiones es necesario

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aadir el tampn de extraccin agentes protectores de grupos funcionales

especficos de la protena o bien inhibidores de proteasas.
El resultado de todos estos tratamientos es un lisado u homogenado que
contiene una mezcla de enzimas, membranas y clulas rotas. Esta preparacin
se somete a centrifugacin (10.000 15.000 rpm) para eliminar los restos
celulares y separar, el sobrenadante, que contiene las protenas solubles, del
precipitado que adems de restos celulares tambin contienen protenas
asociadas a membranas y que para solubilizarlas requiere un tratamiento
adicional con detergentes. En cualquier caso, la fase soluble (con o sin
detergente) constituye el extracto crudo donde se encuentra la protena de
inters objeto de la purificacin. A la hora de centrifugar hay que tener en
cuenta que la centrfuga sea refrigerada, balancear los tubos y asegurarse
siempre que los rotores estn fijos.
Para purificar una protena es imprescindible tener un mtodo para detectar
cuantitativamente su presencia. Es deseable que este mtodo sea especfico y
fcil de llevar a cabo. En este sentido es mucho ms cmodo trabajar con
enzimas, pues se detectaran mediante su ensayo de actividad, en caso de
purificar protenas no enzimticas, se requieren mtodos de seleccin ms
especficos.
3. Mtodos cromatogrficos para separacin de protenas
Las separaciones cromatogrficas se basan en las diferencias de carga,
tamao o afinidad de las diferentes protenas. Uno de los mtodos ms
habitualmente utilizados para la separacin de protenas es la cromatografa en
columna, aunque tambin existe la cromatografa en papel y en placa.
La columna est rellena con un material slido con las caractersticas qumicas
adecuadas (fase estacionaria), y una solucin tamponada se hace pasar a
travs de la columna (fase mvil). El extracto crudo se aplica en la parte
superior de la columna y va poco a poco entrando en la columna con la fase
mvil. Cada protena migrar a distinta velocidad segn su grado de afinidad
por la fase estacionaria.
Generalmente estas cromatografas se realizan de una forma semiautomtica,
la fase mvil se hace pasar a la columna a travs de una bomba peristltica y
un colector de fracciones va recogiendo el eluyente que sale de columna. Este
colector hace que el tubo vaya cambiando cada cierto nmero de gotas o de
volumen. Despus hay que localizar en que tubo o tubos est la protena que
se pretende purificar.
Existen distintos tipos de cromatografas en tres ellos:

La filtracin o exclusin molecular

El cromatografa de intercambio inico
La cromatografa hidrofbica
La cromatografa de afinidad

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Filtracin

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z Filtracin en gel o cromatografa de

exclusin molecular. La fase estacionaria esta
constituida por partculas de polmeros de
diferente porosidad. La separacin se basa en el
tamao de las partculas. Las protenas ms
grandes que no pueden penetrar en los poros de
las partculas de la matriz de filtracin son
eluidas con ms rapidez que las protenas ms
pequeas que penetran por los poros de las
partculas y siguen un camino ms tortuoso y
ms largo. El tamao de los poros internos
depende de la naturaleza del polmero en
cuestin, y permite la entrada a protenas por
debajo de un determinado peso molecular.

z Cromatografa de intercambio inico. En ella, la columna est rellena con

un soporte al que van unidos grupos cargados positivamente (intercambio
aninico) o negativamente (intercambio catinico). Estos grupos cargados
normalmente estn neutralizados por iones del tampn. Estos iones son
reversiblemente reemplazados por las protenas con ms tendencia a unirse al
soporte. Las protenas cargadas pueden por lo tanto unirse a intercambiadores
catinicos o aninicos dependiendo de su carga neta. Las protenas ms
cargadas
se
unirn
ms
fuertemente
al
intercambiador y por lo tanto sern ms difciles de
eluir. La afinidad con la que una protena se une a un
intercambiador inico depende de la fuerza inica del
medio, debido a la competencia entre los grupos
cargados de la protena y los iones de la fase mvil.
Una vez pegadas las protenas, para eluirlas
(retirarlas) de la columna, se suele ir subiendo la
fuerza inica de la fase mvil (aumentando la
concentracin de sal, NaCl), de esta forma se eluyen
primero las protenas mas dbilmente retenidas y
cuando la fuerza inica sea mayor saldrn las
protenas ms cargadas y por lo tanto ms retenidas.
z Cromatografa hidrofbica. Se trata de un
mtodo similar al anterior con la nica diferencia de
que la fase estacionaria es apolar (hidrofbica), es decir, la protena se pega al
soporte por los resto de aminocidos apolares, cuanto ms residuos de este

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tipo tenga en su superficie, ms apolar ser, ms se retendr en la columna y

se eluir ms tarde. En este caso a elusin se realiza aumentando la
apolaridad de fase mvil.
z Cromatografa de afinidad. Muchas protenas tienen la capacidad de unirse
especficamente a ciertas molculas, mediante uniones fuertes, pero no
covalentes. En esta tcnica la molcula que se une especficamente a la
protena se conoce con el nombre de ligando y se une covalentemente a una
matriz inerte. Cuando el extracto con la mezcla de protenas se aplica a la
columna, la protena buscada se unir al ligando inmovilizado mientras que las
dems saldrn de la columna con el tampn. En este caso tambin se utiliza el
incremento de fuerza inica para eluir las protenas.

Enzima

LIGANDO
Sustrato

Todos estos sistemas pueden automatizarse, en base a sistemas

cromatogrficos tales como el FPLC, en el que se hace uso de bombas de alta
presin (100-400 bares) y columnas con materiales que soportan altas
presiones. Este sistema reduce notablemente los tiempos de purificacin y
utilizan fases estacionarias con mayor poder de retencin, lo que se incrementa
los porcentajes y rendimiento de las purificaciones.

FPLC: Cromatografa lquida

de separacin rpida de
protenas

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4. Mtodos electroforticos
Para comprobar si la protena de inters se ha separado del resto, es decir si la
protena est pura, se requieren las tcnicas electroforticas. La electroforesis
de protenas se lleva a cabo generalmente en geles de poliacrilamida. Se trata
de geles porosos, cuya porosidad se puede regular en funcin de la
concentracin de acrilamida.
Durante la electroforesis la fuerza que provoca la migracin de las protenas es
un campo elctrico, y el gel acta como filtro molecular, ralentizando la
migracin de las protenas en funcin de su relacin carga/masa. A diferencia
de lo que ocurra en la cromatografa de filtracin, en las electroforesis las
protenas mayores son retardadas y se mueven ms lentamente a travs del
gel, ay que las va frenando el tamao del poro y las protenas ms pequeas
avanzan ms rpidamente.
En la figura vemos un tpico aparato de electroforesis. El gel se encuentra
entre dos placas (normalmente de vidrio). La colocacin de un peine de
electroforesis en la parte superior antes de que la acrilamida gelifique permite
la formacin de unos pocillos, donde se colocarn posteriormente y una vez
retirado el peine, las muestras, que se desplazarn por calles paralelas al
aplicar el campo elctrico.

( -)

(+)

Las muestras de protena se disuelven en una pequea cantidad de una

solucin tampn, que contiene glicerol, que hace que la muestra se site en el
fondo del pocillo y un colorante azul (azul de bromofenol) de pequeo peso
molecular que nos indica migracin del frente. El tampn de electroforesis
cierra el circuito entre el ctodo (+) y el nodo (-). El sistema se conecta a una
fuente de alimentacin y las protenas migran hacia el polo positivo, situado en
la base del gel.
Despus el gel se saca del recipiente que lo contiene y se incuba en presencia
del colorante adecuado (azul de Coomassie), que tie por completo el gel. A
continuacin se destie con una disolucin de etanol/actico y el gel queda
transparente y las bandas de protenas quedan teidas de color azul.

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Teir con
Coomassie

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Desteir con
Actico 10%
Metanol 25 %

Existen dos tipos principales de electroforesis, en condiciones Nativas las

protenas se separan en funcin de su carga/masa; y en condiciones
desnaturalizantes la electroforesis se realiza en presencia de un detergente,
el SDS (dodecil sulfato sdico). El SDS es un detergente aninico, que se une
a todas las protenas en la misma proporcin formando una especie de micela
cargada negativamente. La gran carga negativa del SDS enmascara la carga
intrnseca de las protenas, con lo que stas se separan solo en funcin de su
masa e independientemente de su carga. El nico inconveniente de esta
tcnica es que el SDS desnaturaliza las protenas y las protenas multimricas
se separan en sus subunidades. Las electroforesis en SDS adems de permitir
calcular el peso molecular de las cadenas polipeptdicas, nos indican las
distintas subunidades que posee la protena.
Generalmente la protena inters se analizan incluyendo calles con marcadores
moleculares, que son protenas de peso molecular conocido que nos permiten
determinar el peso molecular de la cadena polipeptdica, como se muestra en
la siguiente figura.

Protena
desconocida

Migracin de la
banda

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En la calle 1 se encuentran los patrones de peso molecular conocido, en la

calle 2 se encuentra la protena sujeta a estudio, de tal manera que se puede
hacer una relacin lineal entre el Log del peso molecular de las protenas y la
distancia que recorren en el gel (Rf=distancia de la banda/distancia del frente).
La siguiente figura nuestra la diferencia entre las electroforesis nativa (NATIVAPAGE) y la electroforesis desnaturalizante (SDS-PAGE). Como se aprecia en
la figura una banda en la Nativa, puede dividirse en varias en SDS, si la
protena tiene varias subunidades de distinto peso molecular, o bien en una
banda de menor peso molecular, si las subunidades poseen el mismo peso
molecular. De la figura se deduce que, la protena est pura (pues solo aparece
un banda) y que adems posee 2 subunidades de 15000 g/mol (o lo que es lo
mismo 15 kDa ) cada una.

NATIVA-PAGE

SDS-PAGE

150 kDa
90
40
30 kDa

23

15 kDa

12