Espermiograma.

Segn los criterio de OMS 2012

Prof. MSc. Luis Sarabia Villar. e mail: lsarabia@med.uchile.cl:
Si es un paciente o profesional solicite su hora o curso al mismo correo.
Programa de Anatoma y Biologa del Desarrollo.
Facultad de Medicina. Universidad de Chile.
Documento en preparacin.
Introduccin
El presente texto busca simplificar y ayudar a la comunidad hispano parlante a
implementar las recomendaciones realizadas por la Organizacin Mundial de la Salud
(OMS) en su reciente manual WHO laboratory manual for the Examination and processing
of human semen (fifth edition). En este caso indicaremos las recomendaciones de la OMS y
comentaremos estas indicaciones con la experiencia del autor.
En la dcada del 50 aparecen las importantes contribuciones de Mac Leod donde
comparaba los resultados obtenidos del anlisis seminal de personas frtiles con los
obtenidos de pacientes con problemas para concebir un hijo. Se comprob una fuerte
correlacin entre la movilidad y fertilidad potencial y que la probabilidad de la concepcin
dependa del porcentaje de clulas activas y de la calidad de la movilidad, Mac Leod (1951)
encontr que por encima de 20 millones por mililitro (mL.) no haba aumento de la
fertilidad potencial. De sus trabajos surgen las condiciones mnimas que debe reunir un
esperma para ser considerado con capacidad fecundante. Sin embargo, en base a estos
valores lmites, debe tenerse en cuenta que si algn resultado es inferior al valor mnimo
correspondiente, debe compensarse con un aumento correlativo de otro y que siempre se
habla en trmino de probabilidad para que un apareja conciba un hijo, sin embargo, en vista
de la nueva evidencia, estos valores han cambiado a lo largo del tiempo, lo que se aprecia al
comparar los manuales de la OMS en sus versiones, primera edicin (1982), segunda
edicin (1987), tercera edicin (1992), cuarta edicin (1999) y por ltimo la quinta edicin
WHO laboratory manual for the Examination and proccessing of human semen (2010), al
cual simplemente nos referiremos como el manual OMS 2010.

Figura 1 a: Sistema Reproductor masculino (SRM)

Figura 1 b: Epiddimo extrado despus de una

orquiectoma,suspendidos
con la finalidaden
delas
recuperar
El semen normal es una mezcla de espermatozoides
secreciones
espermatozoides.
(Foto
L.
Sarabia)
que provienen del testculo y epiddimo (fotografa), las que se combinan al momento de la
1

eyaculacin con las secreciones de la prstata, vesculas seminales y glndulas

bulbouretrales. Por lo tanto, el anlisis del semen provee informacin sobre la produccin
de espermatozoides en los tbulos seminferos y condicin fisiolgica de estos tejidos.

Recoleccin de la muestra y entrega.

Las indicaciones se deben entregar al paciente en forma escrita y oral, de una forma
clara, en lo referente a la recoleccin y transporte del semen. El manejo de la muestra debe
ser muy cuidadoso en el laboratorio, ya que toda muestra biolgica puede ser
potencialmente peligrosa por la presencia de virus y bacterias patgenas.
La muestra debe ser recolectada por masturbacin. El eyaculado se recoge en un
frasco limpio, estril, de boca ancha (fig. 4), cerca del laboratorio para as, limitar el
tiempo de exposicin del semen a las fluctuaciones de la temperatura y mantener el
control entre coleccin de la muestra y su anlisis. Debe mantener la temperatura
entre los 20 y 37 C a temperaturas inferiores a 5 C los espermatozoides
experimentan el Schock trmico que se caracteriza por la disminucin de la
movilidad de manera irreversible. Sin embargo, excepcionalmente una muestra
puede ser colectada en casa despus de una demostrada inhabilidad del paciente de
producir una muestra por masturbacin cerca del laboratorio.
b) La movilidad espermtica declina con el tiempo y las variaciones de temperatura.
En estos casos hay que ser muy claros y dar las instrucciones por escrito y
oralmente al paciente.
a)

Instrucciones para el paciente (Se entregan por escrito)

1.- La muestra debe estar completa. (Esto es esencial para un correcto anlisis),
oralmente se le puede explicar al paciente que la primera porcin de l lquido seminal
contiene la mayor cantidad de espermatozoides.
2.-Deber rotular el frasco con el nombre del paciente y hora de emisin del
eyaculado.
3.-Deber entregar la muestra al laboratorio mximo dentro de una hora de emitida.
4.-Durante el transporte al laboratorio, la muestra debe ser mantenida entre 20 C y
37 C.
El laboratorio por su parte indicar la hora de recepcin y anlisis de la muestra
junto a la especificacin que la muestra fue obtenida fuera del laboratorio.
b) Cuando la muestra no se puede recolectar por masturbacin se debe utilizar un condn
especial para recoleccin de semen. Ningn otro tipo de condn es recomendable. El coitus
interruptus no es un medio adecuado para recolectar la muestra.
c) El paciente debe tener un mnimo de 2 das de abstinencia sexual, pero no ms all de los
7 das de abstinencia (ojala con una abstinencia constante en cada muestra del mismo
paciente). Se debe procurar que el tiempo de abstinencia sea registrado en das para
estandarizar los protocolos de trabajo. La abstinencia debe ser valorada de acuerdo a la
frecuencia de las relaciones sexuales en la pareja. Con un menor perodo de abstinencia a la
media sexual, se puede producir una disminucin en la densidad espermtica o del volumen
seminal. Con una abstinencia mayor a los 7 das, se puede ver incrementado el nmero de
espermatozoides inmviles y morfolgicamente alterados.
Episodios febriles, intervenciones quirrgicas o tratamientos farmacolgicos recientes
deberan aplazar el espermiograma hasta despus de 70 das despus (ciclo
espermatognico).
2

d) Dos muestras como mnimo son necesarias para la evaluacin inicial, si los resultados
entre ambas muestras son marcadamente diferentes, muestras adicionales deben ser
evaluadas.
e) El intervalo entre cada toma de muestra no debe ser menor a 7 das ni mayor a 3
semanas.
f) La recoleccin de la muestra debe ser completa. Es importante sealar que la primera
porcin del eyaculado emitido es la que contiene la mayor concentracin de
espermatozoides (75 % aproximadamente), y por esta razn es importante que no se pierda,
de lo contrario se pide una nueva muestra para realizar el anlisis con el mismo rango de
abstinencia antes sealada, las ltimas porciones eyaculadas se caracterizan porque
predominan los espermatozoides inmviles y de mala morfologa, en donde la segunda
fraccin es predominantemente de origen prosttico y la tercera (ltima) fraccin es
predominantemente de origen de las glndulas seminales.
g) El frasco de recoleccin debe ser adecuadamente rotulado con los datos del paciente, con
la fecha y la hora de recoleccin de la muestra y en presencia del paciente para evitar
posteriores errores de rotulacin.
Recoleccin de la muestra para reproduccin asistida o microbiologa.
La finalidad es disminuir al mximo la posibilidad de contaminacin principalmente de
bacterias comensales que estn en la piel y que podran contaminar la muestra. Por lo tanto,
todo el material a utilizar debe ser estril.
En estos casos el paciente debera
1.-Orinar
2.-Lavar sus manos y el pene con jabn.
3.-Secar sus manos y pene con toallas desechables.
4.-Eyacular dentro del frasco.
Recoleccin de la muestra mediante condn.
Una muestra puede ser colectada en condn durante una relacin sexual solo bajo
circunstancias excepcionales, tal como demostrada incapacidad de producir una muestra
por masturbacin. Condiciones a tomar en cuenta.
1.- Solo condones no txicos diseados especialmente para no daar a los espermatozoides
se podrn entregar al paciente por el laboratorio.
2.- Se deber entregar al paciente las instrucciones precisas para usar el condn, cerrarlo y
transportarlo hasta el laboratorio.
3.- Durante el transporte hasta el laboratorio, la muestra deber mantenerse entre 20 C y 37
C.
4.- El examen deber consignar que la obtencin de la muestra fue por condn y fuera del
laboratorio (fig 2).
Nota: No se debern usar condones de ltex
comunes ya contiene agentes que interfieren con la
movilidad espermtica.
El coito interruptus no es indicado para la
recoleccin de semen ya que la primera porcin del
eyaculado, contiene la mayor concentracin
espermtica, y esta puede perderse, Adems, se
puede producir la contaminacin de la muestra y
3
Figura 2: Condn para espermiograma.

una baja del pH debido a la acides de los fluidos vaginales que podran adems afectar a la
movilidad espermtica.
Nota: Hay que tomar en cuenta que si el hombre no puede obtener una muestra seminal por
masturbacin, se recomienda la obtencin con condn apropiado y entregado por el
laboratorio o en ltimo caso por el test post coital que entregara la informacin de sus
espermatozoides, teniendo en consideracin el efecto de los fluidos vaginales sobre los
espermatozoides

Los pasos bsicos en el anlisis del semen son los siguientes:

1.- A los 0-5 minutos despus de emitida la muestra, se registran los datos del paciente y se
coloca en una incubadora a 37 C. hasta que licu.
2.- A los 20-25 minutos, se evala la licuefaccin, la apariencia visual y se toma nota del
olor si este esta alterado.
3.- A los 30-60 minutos, se evala la viscosidad, la movilidad espermtica, la
agregacin/aglutinacin espermtica, otros tipos celulares y el debris. Se realizan los test
para anticuerpos, se evala la vitalidad espermtica. Se hacen las diluciones para
determinar la concentracin espermtica, se separan 100 L de semen para evaluar clulas
inflamatorias, se tien las lminas para evaluar la morfologa espermtica, se recupera y
centrifuga el semen para el anlisis bioqumico posterior si corresponde.
4.- Mas tarde, se hace el recuento de espermatozoides en una cmara Neubauer. Si hay un
nmero > a 1 x 106 clulas redondas/mL en el semen, se hace una evaluacin de clulas
inflamatorias, se tien los frotis para evaluacin de la morfologa espermtica y de clulas
redondas.
5.- En el mismo da o despus si la muestra es congelada, se realiza el anlisis bioqumico
de las secreciones de la prstata (zinc), vescula seminal (fructuosa) y epiddimo (glucosidasa).

MANIPULACIN INICIAL DE LA MUESTRA.

Las muestras de semen pueden tener agentes infecciosos peligrosos (VIH, hepatitis, herpes,
gonorrea, sfilis, etc.). La utilizacin de vestimenta adecuada, guantes, as como evitar
cualquier contacto directo con la muestra por parte del personal debe ser de estricto
cumplimiento.
EXAMEN MACROSCOPICO
El anlisis debe ser hecho mediante inspeccin simple inmediatamente despus de la
liquefaccin, preferiblemente antes de los 30 minutos, pero no ms all de una hora, para
4

prevenir la deshidratacin o cambios en la temperatura que afectan la calidad del lquido

seminal. (Espinoza-Navarro, O. and Sarabia, L. 2011)
Rango de Valores Normales Segn O.M.S, 2010 WHO laboratory manual for the
Examination and proccessing of human semen Entre parntesis se indica el rango de
valores limites inferiores.
LICUEFACCIN: (Tiempo normal entre 5-60 minutos a 37 C).
Inmediatamente despus de la eyaculacin la muestra es tpicamente una masa gelatinosa y
coagulada. Dentro de unos pocos minutos, a temperatura ambiente, la muestra de semen
comienza a licuarse, Hacia los 15 minutos la muestra debera estar licuada. Hay que tener
presente que la presencia de moco puede interferir en el anlisis y rara vez la muestra no
licua antes de una hora, si esto no ocurriese dentro de la hora se debe registrar como
licuefaccin incompleta a la hora.
Una vez licuada la muestra, se debe mezclar suavemente el semen con un movimiento
rotatorio para reducir el error en la determinacin de la concentracin espermtica.
El semen normal puede contener cuerpos gelatinosos de origen prostticos normales que no
se licuan pero que no parecen tener importancia clinica. Sin embargo, los hilos de moco
pueden interferir con la movilidad y recuento espermtico.
Licuefaccin retardada: Ocasionalmente algunas muestras no licuan a la hora y en estos
casos, un tratamiento adicional debe ser realizada, mezclando mecnicamente o por
digestin enzimtica, en estos casos, sin embargo en base a nuestra experiencia no hemos
conocido un laboratorio en
Latinoamrica que utilice la
digestin enzimtica y en la
ltima encuesta del Programa
para la estandarizacin del
anlisis seminal que involucro a
30 expertos latinoamericanos
realizadas en Santiago de Chile
el 2010, todos indicaron usar en
sus
laboratorios
solo
la
licuefaccin
obtenida
con
jeringa y aguja (licuefaccin
mecnica), haciendo pasar la
muestra a travs de una guja
18G o 19G de 6 a 10 veces
Figura 2: Lquido seminal con viscosidad aumentada.
(Sarabia et al., 2010). Sin embargo,
sabemos que al libera a los espermatozoides del
impedimento mecnico que influye sobre la movilidad de los espermatozoides, la
movilidad espermtica si es que aumenta no representar necesariamente lo que ocurre in
vivo.
CONSISTENCIA: La viscosidad, est en relacin a cmo fluye la muestra desde una
pipeta. La muestra debe caer en forma de pequeas gotas. Si se forma un hilo al caer la
muestra desde la pipeta, se dice que hay una viscosidad anormal (filancia). Cuando el hilo
que se forma es > de 2 cm., se dice que hay una viscosidad elevada. La viscosidad elevada
se reconoce rpidamente ya que al intentar pipetear la muestra, esta se adhiere fuertemente
5

a la punta de pipeta. Los mtodos para bajar la viscosidad son los mismos que para lograr
la licuefaccin de la muestra.
APARIENCIA, COLOR, OLOR: Deben ser evaluados a temperatura ambiente, dentro de
la primera hora despus de emitida la muestra. Una muestra normal tiene una apariencia
homognea, un color blanco opalescente a gris amarillento y un olor caracterstico. (Se
informa como normal). Un aspecto translucido se relaciona con una baja concentracin
espermtica y con ausencia de clulas de la espermatognesis, leucocitos hemates o
grmenes y un aspecto heterogneo se observa cuando queda material sin licuar. Un Color
Amarillo intenso en los casos que hay leucocitos (piospermia), herrumbre indica presencia
de sangre hemolizada (vesiculitis o prostatitis), rojo indica presencia de sangre
(hemospermia por traumatismo o neoplasia de las vas seminales). Casi siempre se debe a
una afeccin banal denominada hemosperma crnica y un color verdoso se correlaciona
con infeccin de pseudomonas algunas vitaminas y frmacos pueden alterar el color del
lquido seminal. Olor: Un olor fecal indica la presencia de E. coli.
VOLUMEN: ( 1.5 mL): El volumen del eyaculado es principalmente aportado por las
vesculas seminales y glndula prosttica, con un pequeo aporte de las glndulas
bulbouretrales y el epiddimo. El volumen del
lquido seminal es esencial para obtener el
nmero total de espermatozoides y clulas no
espermticas en el eyaculado. OMS recomienda
el clculo por simple pesada del frasco sin
muestra y luego con muestra tomando en cuenta
que la densidad del lquido seminal es
aproximadamente de 1 g/mL (Auger et al., 1995)
y pesando cada frasco por separado ya que estos
por fabricacin pueden tener diferentes pesos.
Cuando el volumen es muy pequeo se informa
sin medirlo, como menor de 0.5 mL. Es
frecuente el hallazgo de volmenes aumentados
sobre 6 mL sin embargo solo se informa el
volumen sin hacer un comentario adicional.
Alternativamente OMS recomienda que se puede
medir directamente el volumen de la muestra si
esta la coloca directamente en un frasco
graduado tipo probeta de 0.1 mL de precisin,
con boca ancha, pero en lo personal no hemos
visto laboratorios latinoamericanos que utilicenFigura 3: Lquido seminal con apariencia normal.
este medio. No se recomienda la medicin de la muestra pasndola desde el frasco original
a una jeringa, probeta o tubo graduado ya que se sabe que se pierde entre 0,3 y 0,9 mL de
liquido seminal (Cooper et al., 2007).
En nuestro laboratorio hemos encontrado pacientes con volmenes entre 9 y 13 mL. y dos
casos de pacientes con 18 y 19 mL de eyaculado que podran deberse a procesos
inflamatorios de alguna glndula accesoria. Al contrario, bajos niveles de lquido seminal
son caractersticos en obstrucciones del conducto eyaculador, ausencia bilateral del
conducto deferente o pobre desarrollo de las vesculas seminales. (Weiske et al., 2000),
eyaculacin retrograda o ausencia funcional de los conductos eyaculadores. Este ltimo
sndrome fue descrito en 1972 y lo presentan hasta el 15 % de los pacientes azoospermicos,
6

los signos que sugieren este sndrome adems del volumen disminuido (< 1 mL) son:
azoospermia, pH disminuido (< 7.0) fructosa disminuida (Marcador de funcionalidad de
las vesculas seminales), fosfatasa cida o cido ctrico aumentados (marcadores de
funcionalidad prosttica). Otros trastornos que pueden dar origen a un volumen disminuido
son el sndrome de Klinefelter y el hipogonadismo hipogonadotrofico, por la baja
estimulacin de las glndulas sexuales.
pH: 7.2 El pH del semen refleja el balance entre diferentes valores de pH de diferentes
secreciones de las glndulas accesorias, principalmente alcalino de las vesculas seminales y
acida de la prstata. El pH puede ser ms alcalino y no necesariamente significa
anormalidad. A medida que transcurre el tiempo la muestra se va alcalinizando por prdida
de anhdrido carbnico. Se mide en tanto licua la muestra preferiblemente dentro de los
primeros 30 minutos post eyaculacin y en algunos casos se puede medir a lo ms una hora
post eyaculacin. La exactitud y calidad del papel se puede verificar con sustancias de pH
conocido. Para muestras viscosas, el pH puede ser medido usando un phmetro diseado
para medir soluciones viscosas. (Haugen and Grotmol, 1998). Si el pH es menor de 7.0 con
un bajo volumen y bajo recuento espermtico, puede deberse a una obstruccin del
conducto eyaculador o ausencia bilateral del conducto deferente (Daudin et al., 2000).
El pH del semen vara normalmente en un rango muy estrecho (7,2 - 8,0), pocos son los
trastornos capaces de alterarlo. Es importante asegurarse que el laboratorio est usando el
papel de pH adecuado pues de otra manera las lecturas pueden ser falsas; el mejor es el
papel con rango 6,4 - 8,0, que es el que ms se ajusta al pH del semen, pero en su defecto
puede usarse el de rango 6,1 - 10,0. Nosotros hemos visto estudios de otros laboratorios
donde se ha informado valores de hasta 11,0 lo que desde el punto de vista biolgico es
totalmente imposible.
Se ha sugerido que un pH elevado (> 8,0) puede considerarse un signo de infeccin seminal
si se asocia a otros sntomas y signos de sospecha, mientras que un pH disminuido (< 7,2) se
observa cuando existe un dficit de la funcin de las vesculas seminales, en especial en
pacientes con el sndrome de ausencia funcional de los conductos eyaculadores.

Figura 4: Medicin de pH con tiras Merck.

PREPARACIN DE LA MUESTRA PARA EL ANLISIS DEL SEMEN

7

EXAMEN DENTRO DE LA HORA.

La muestra debe ser colocada inmediatamente a una temperatura de 37 C hasta la
licuefaccin. Un volumen de 10 l. de semen es adecuado para ser colocado en una lmina
portaobjeto y cubierto con una lmina cubreobjeto de 22 mm x 22 mm de esta manera el
cubreobjeto queda perfectamente adherido al porta y se forma una profundidad de lquido
de 20 m suficientes para asegurar el movimiento rotacional de los espermatozoides
durante su avance ya que una profundidad menor interfiere con el avance espermtico y una
profundidad mayor nos obligara a obtener diferentes planos focales para observar
adecuadamente a todos los espermatozoides del campo. Otras alternativas incluyen cubre
objetos de 18 mm x 18 mm en este caso se agregan 6.5 l de lquido seminal para asegurar
una profundidad de 20 um. Se determina una aproximacin sobre la concentracin de
espermatozoides, la calidad de movimiento, la presencia de clulas redondas, aglutinacin y
el debris (que corresponde generalmente a desechos de fragmento celulares). Esto nos dar
una idea de cmo proceder con respecto a las diluciones para los anlisis, que incluye
recuento en cmara, viabilidad espermtica, con qu volumen hacer el frotis etc. Si la
temperatura ambiente es inferior a 22 C debe colocarse previamente los portaobjetos y
cubreobjeto a 37 C durante 15 minutos. (OMS 2010; Sarabia et al., 2011)
Si la muestra no esta bien mezclada nos resultarn valores totalmente diferentes entre
nuestros duplicados de movilidad, vitalidad, concentracin y morfologa espermtica. Para
lograr una buena homogeneizacin de la muestra se mezcla la muestra en el mismo
recipiente original con movimientos rotacionales suaves y con pipetas desechables, nunca se
debe utilizar vortex a altas velocidades debido al dao que genera el movimiento brusco
sobre los espermatozoides.
Si en el primer anlisis no se observan espermatozoides ni clulas de la espermatognesis,
se procede a centrifugar el semen y con el sedimento se hacen preparados para teir e
identificar la presencia de espermatozoides o clulas de la espermatognesis. Idealmente se
centrfuga a 3.000 g durante 15 minutos y si an as no se encuentran estas clulas se
informa de la siguiente manera:
En el sedimento de la muestra centrifugada a 3000g durante 15 minutos, no se
observaron espermatozoides o clulas de la espermatognesis.
AGREGACIN.
La adherencia entre espermatozoides inmviles o espermatozoides mviles con hilos de
mucus, clulas no espermticas o debris se considera agregacin no especfica y debe ser
registrada como tal.
AGLUTINACION ESPERMATICA. La aglutinacin se refiere especficamente a
espermatozoides mviles y pegados entre ellos, esta aglutinacin puede ser de tipo A:
(cabeza-cabeza), B: (cola-cola), C: (solo la punta de la cola), D: Se aglutina las cabezas con
las cabezas y a la vez las colas con las colas) y E: Se produce una maraa de aglutinacin.
Al mismo tiempo se registra el grado de aglutinacin como Grado 1: Menos del 10 % de los
espermatozoides esta aglutinado, Grado 2: entre el 10 y 50 % de los espermatozoides esta
aglutinado, Grado 3: Ms del 50 % de los espermatozoides esta aglutinado pero algunos
permanecen libres, Grado 4: Todos
los espermatozoides estn aglutinados e
interconectados. Espermatozoides mviles y pegados a clulas, debris o a espermatozoides
inmviles (agregacin) no deben ser informados como aglutinacin. La presencia de
aglutinacin no es suficiente para deducir infertilidad por causa inmunolgica, pero es
sugestiva de la presencia de anticuerpos anti espermticos que debern investigarse.
8

Figura 5: Grados y tipos de aglutinacin espermtica. Pgina 20 WHO laboratory manual for the Examination and
processing of human semen.

OTROS ELEMENTOS EN EL LQUIDO SEMINAL

CELULAS REDONDAS: ( 5x 106 clulas/mL)
CELULAS GERMINALES INMADURAS: 1-3% con respecto a 100 espermatozoides.
LEUCOCITOS: 1 x 106 leucocitos/mL
El eyaculado adems de poseer espermatozoides, posee otros elementos y clulas que
pueden tener importancia clinica. Esto incluye clulas epiteliales del tracto genitourinario,
leucocitos y clulas inmaduras de la espermatogenesis. Estas clulas llamadas en general
clulas redondas. Pueden ser identificadas en el frotis de la muestra y tambin con ayuda
de la determinacin de la enzima peroxidasa presente en los neutrfilos o indirectamente
cuantificadas, determinando la tasa entre espermatozoides y las clulas redondas que
encontremos en el frotis correlacionando esta tasa con la concentracin espermtica.
Detallaremos ms adelante.
ANLISIS DE LA MOVILIDAD: (> 32 %). La movilidad debe ser determinada tan
pronto como sea posible despus de licuada la muestra y preferiblemente dentro de los
9

primeros 30 minutos de emitida, pero en ningn caso despus de una hora de la

eyaculacin, para evitar el deterioro por efecto del cambio de pH, deshidratacin o cambios
de la temperatura.
Se pueden trabajar con un volumen de 10 L para cubre objetos de 22 x 22 mm.
Se debe evitar que haya demasiado volumen entre las lminas para que el desplazamiento
de los espermatozoides sea homogneo y en lo posible en una monocapa segn lo
recomendado al inicio en examen dentro de la hora. La temperatura de evaluacin puede ser
de 37 C pero al elegir esta temperatura se deber pre temperar los portas y cubre objetos y
trabajar en microscopio acondicionado con platina termo regulada, pero se puede trabajar a
temperatura ambiente, entre 20 y 24 C. Es importante estandarizar las condiciones de
temperatura para el trabajo, mezclar bien la muestra, se deben contar no menos de 200
espermatozoides y por duplicado en otra alcuota de la muestra y solo incluir en este
parmetro a espermatozoides intactos (que presentan cabeza y cola).
Los tipos de movilidad a evaluar son los siguientes:
Movilidad Progresiva (MP): Los espermatozoides se mueven activamente, ya sea de
manera lineal o en un gran crculo, independiente de la velocidad.
Movilidad No Progresiva: (MNP) Incluye todos los patrones de movilidad pero con
ausencia de progresin como el avance en pequeos crculos.
Inmviles (IM): Sin movimiento.
En los manuales anteriores de OMS se indicaba una separacin entre espermatozoides
rpidos tipo A > 25 um/s y los progresivos lentos o tipo B con una velocidad inferior a esta,
sin embargo, es muy difcil eliminar el grado de subjetividad y diferenciar las velocidades.
En muy pocas oportunidades hemos observado hipercinesis, que se caracteriza por
movimientos sumamente enrgicos y desordenados de los espermatozoides. Valores
inferiores al 32 % pueden deberse a perdida de fracciones seminales, cambios bruscos de
temperatura, pH sobre o bajo 7.2-8.0, leucocitosis que puede producir un aumento de la
concentracin de especies reactivas del oxigeno, anticuerpos antiespermaticos, recipientes
contaminados aunque esto ltimo cada vez es ms improbable ya que se recomienda que el
frasco estril sea entregado por el laboratorio y que sea en base a polipropileno neutro.
Movilidad entre 0 y 5 % probablemente se deban al sndrome de cilias inmviles lo que se
correlaciona con sntomas respiratorios en el paciente al ser los cilios esenciales para la
depuracin del lumen respiratorio.
Recomendaciones para la determinacin correcta de movilidad:
-Observar ordenadamente diferentes campos evitando evaluar el mismo campo dos veces y
evitar buscar un campo en base al numero de espermatozoides mviles, la eleccin del
primer campo y de los sucesivos debe ser al azar).
-Comenzar instantneamente una vez determinado el campo a evaluar, no esperar que el
espermatozoide comienza a moverse para comenzar.
-Determinar la movilidad espermtica dentro de un rea definida, esto es ms fcilmente
realizable cuando se utiliza un retculo instalable en el ocular.
-Revisar y contar rpidamente para evitar la sobre estimacin del nmero o
espermatozoides mviles y el conteo de espermatozoides que recin entran al campo de la
grilla.
-Inicialmente se recomienda que se evalen primero los espermatozoides progresivos
rpidos (PR), luego los No progresivos o motilidad in situ (NP) y finalmente los inmviles
(IM), sin embargo, con experiencia el observador podr evaluar los tres parmetros
simultneamente.
-Contar los espermatozoides y registrar el nmero con ayuda de un multicontador.
10

-Evaluar a lo menos 200 espermatozoides en total en al menos cinco campos en cada

replica, con el objetivo de lograr el menor error de muestra.
-Calcular el porcentaje promedio de las tres categoras de movilidad (PR, NP, IM)
VITALIDAD ESPERMTICA: Se considera normal un valor 58% de
espermatozoides vivos para las tcnicas descritas a continuacin.
Esta prueba debe ser utilizada si el porcentaje de
espermatozoides inmviles excede el 60 % aunque la
mayora de los laboratorios la realizan de rutina
debido a su facilidad y rapidez en entregar el resultado.
ANLISIS DE LA VITALIDAD: La vitalidad
espermtica se evala dentro de los primeros 30
minutos inmediatamente despus de licuada la
Figura 6: Espermatozoides muertos
muestra, pero en algunos casos se puede evaluar hasta
teidos de rojo y los vivos no se tien.
dentro de una hora cuando la muestra no a licuado
completamente, nunca despus de la hora para evitar
encontrar un elevado numero de espermatozoides muertos por efectos de deshidratacin o
cambios de pH o temperatura que puedan afectar a la muestra. i) Tcnica eosina pura: La
proporcin de espermatozoides vivos puede ser determinada utilizando tcnicas de tincin
las que se basan en el principio de que las clulas muertas con una membrana plasmtica
daada toman ciertos colorantes. Para esta evaluacin se utiliza una solucin de eosina (C.I.
45380) al 0.5% en Buffer fosfato Salino (PBS pH 7.1) o NaCl 0,9 %. Se mezcla una alcuota
de eosina (5 L.) con una muestra de semen (5 L), se cubre con un cubreobjeto de 22 x 22
mm., se deja reposar 30 segundos y se evala inmediatamente al microscopio. Se deben
contar 200 espermatozoides diferenciando los espermatozoides vivos (no teidos) de los
espermatozoides muertos (teidos). ii) Una segunda forma de realizar el examen de
vitalidad corresponde a la tcnica con la tincin de Eosina-Nigrosina (E-N) cuya ventaja
con respecto al test de Eosina es que nos permite almacenar las muestras para re-evaluacin
y propsitos de control de calidad o re chequeos por otros investigadores en casos de
evaluacin cientfica, con esta tincin los
espermatozoides muertos se tien de Rojo o rosado
oscuro y los vivos se tien de rosado claro o no se
tien.
Para esta tcnica se agrega 10 g de negrosina a la
eosina 0,5 % en PBS o NaCl 0,9 % se hierve, luego se
enfra y filtra y guarda en frasco de vidrio oscuro.
El procedimiento consiste en remover 50 L de
semen y mezclar con igual cantidad de E-N, esperar
30 segundos mezclar y realizar un frotis (todo se
realiza en duplicado real) se deja secar al aire y se
cubre de manera permanente con medio de montaje
para examinar a x 1000
Figura 7: Espermatozoides teidos con Eosina-Nigrosoina observados a x1000 con microscopia
de luz. Pgina 28 WHO laboratory manual for the Examination and processing of human
semen.

iii) Por ltimo, una tercera manera de realizar el test de vitalidad consiste en el conocido
test Hipoosmtico en donde espermatozoides con membranas intactas se hinchan y su
forma flagelar cambia dentro de 30 minutos de exposicin al medio hiposmotico.
11

Figura 8: Representacin esquemtica de los cambios morfolgicos en espermatozoides humanos

sujetos a estrs hiposmotico. Pgina 32 WHO laboratory manual for the Examination and
processing of human semen.

Brevemente, se disuelve 0.735 g de citrato de sodio dihidrato y 1.351 g de D-fructosa en 100

mL de agua, se congelan alicuotas de 1 mL a -20 C. Para realizar el test, se descongela 1
mL de medio hipo osmtico y se estabiliza por 5 minutos a 37 C luego se agregan 100 L.
de semen bien mezclado y se incuba 5 minutos para fines teraputicos como la inyeccin
intracitoplasmtica ovocitaria conocida comnmente como ICSI o 37 minutos para fines
diagnsticos. Posteriormente se transfieren 10 L. de la mezcla a un portaobjeto y se cubre
para la observacin de 200 espermatozoides por duplicado con un aumento de 40 x se
calcula el promedio y se informa segn corresponde (ver tabla 4).
La disminucin de la movilidad espermtica con un porcentaje normal de espermatozoides
vivos, sugiere la presencia de anomalas en la ultraestructura del flagelo del espermatozoide
como el sndrome de cilios inmviles cuya causa es a nivel gentico y su diagnstico
definitivo se realiza mediante microscopia electrnica, de diagnosticarse esta patologa es
de muy mal pronostico quedando como nica opcin la inyeccin intracitoplasmtica del
ovocito con un espermatozoide de la pareja.
RECUENTO DE ESPERMATOZOIDES
Limite inferior normal 15 x 106 espermatozoides/mL. o 39 x 106 espermatozoides por
eyaculado o ms (OMS, 2010).
Principio: El nmero total de espermatozoides por eyaculado y la concentracin
espermtica se encuentran directamente relacionadas con el tiempo en que tarda la pareja
en conseguir la preez (Slama et al., 2002) y con la tasa de preez (Zinaman et al., 2000) y
como predictor de la concepcin (Larsen et al., 2000). El nmero total de espermatozoides
por eyaculado se correlaciona en condiciones normales con el volumen testicular con
tiempos de abstinencia normales.

12

La primera observacin nos orientar

para determinar la dilucin de trabajo
(ver Observacin dentro de la hora)
teniendo en cuenta que siempre las
muestra debe estar perfectamente y
recin homogeneizada para comenzar
las diluciones.

Figura 9: Frasco con solucin de formalina para recuento.

La concentracin espermtica solo

incluye
a
espermatozoides
completos con cabeza y cola y si
existen
anormalmente
muchos
cabezas o colas sueltas, estas se
cuantificarn por separado o se puede
cuantificar en el frotis y consignar
como una observacin, aunque estos
casos no son frecuentes.
Se
cuantifica
utilizando
un
hemocitmetro de Neubauer, (ltima recomendacin de OMS 2010) o en cmara Makler
que no requiere dilucin.
Procedimiento: Las diluciones para la cmara de Neubauer pueden ser 1:5, 1:10, 1:20, 1:50
(lo importante para evitar errores es tomar al menos 50 L. de muestra para las diferentes
diluciones, fig 9b). El diluyente es preparado adicionando a 1 Litro de agua destilada, 50 g
de bicarbonato de sodio, 10 mL 35% (v/v) de formalina y 0.25 g de azul tripn o 5 mL de
una solucin saturada de violeta de genciana. (Se almacena a 4 C. Si se forman cristales se
filtra con papel de 0.45 m antes de usar).
Se deben transferir entre 10 a 15 L. de la dilucin hacia la cmara de recuento de
Neubauer, pero lo ms importante es que la cmara quede completamente llena pero no en
exceso para evitar que la lmina que la cubre se mueva por accin de la dilucin
transferida. La muestra se debe dejar sedimentar (2 a 3 minuto), y debe ser conservada en
una cmara hmeda y evaluadas dentro de 10 a 15 minutos para prevenir la evaporacin,
hasta el momento de realizar el recuento. El recuento debe ser de cabezas de
espermatozoides y no de colas para evitar el doble recuento.
Tabla de dilucin:

13

Figura 9 b: Esta tabla recomienda los volmenes de muestra y fijador necesarios para la dilucin dependiendo
la concentracin nativa de espermatozoides y la cantidad de grillas a evaluar que por lo general sern tres
grillas y en duplicado real. (Pg. 39, OMS 2010).
Pgina 39 WHO laboratory manual fort he Examination and processing of human semen.

Clculos y resultados.
Tipos de cmara de conteo recomendados por OMS 2010.
El hemocitmetro de Neubauer: Cada hemocitmetro posee dos cmaras de conteo por
separado, con un rea de 3 mm x 3 mm. (9 cuadrantes de 1 mm2 conteniendo 100 nL de
volumen cada uno) y ambas cmaras se cubren con un cubre cmara n 4 que es de 0.44
milimetros de grosor, este cubre cmara queda levantado 100 m por medio de pilares de
vidrio pertenecientes a la misma cmara de Neubauer (fig. 10). El cuadrante 5 de la figura
11 tiene 25 cuadrculas menores que se denomina en conjunto retculo de Thomas, cada una
de estas 25 cuadriculas menores a su vez tiene 16 cuadrculas ms pequeas (fig. 11
derecha).
Metodologa para el recuento: Si un espermatozoide se ubica sobre la lnea que divide
dos cuadrculas adyacentes, debe ser contado solamente si est en la lnea inferior o hacia la
lnea del lado izquierdo de la cuadrcula a ser evaluada, si las retculas tienen lneas triples
la misma regla se conserva pero para la lnea central (fig 11).
Con la finalidad de simplificar los clculos de los resultados, explicaremos una metodologa
que difiere de la metodologa recomendada por OMS, sin embargo, entrega el mismo grado
de confiabilidad. A fin de determinar la concentracin de los espermatozoides en la muestra
original de semen en millones/mL, el nmero promedio de espermatozoides (2 recuentos) es
multiplicado por el factor de conversin apropiado. Para mayor claridad de lo expuesto
tenemos el siguiente ejemplo:
Si la dilucin es 1/5 (200 uL de semen y 800 uL de solucin de solucin), y se han
contado las 25 cuadrculas (retculo de Tomas completo), entonces se multiplica el nmero
de espermatozoides en las 25 cuadrculas, por 5 (dilucin) y por 10.000 (x 50.000). Segundo
ejemplo, si la dilucin es 1/5, y se han contado solo 5 cuadrculas, entonces se multiplica el
nmero de espermatozoides registrados en las 5 cuadrculas por 5 (representa los 25
cuadrantes), por 5 (dilucin) y por 10.000 (10.000 corresponde al factor de conversin
propio de la cmara por sus dimensiones obtenidos al dividir el equivalente a 1 mL
(1.000.000 nL) por el volumen promedio contado en un cuadrante de los 9 enumerados en la
figura 11, de esta manera tenemos 1.000.000 nL/100 nL = 10.000). Hay que tener presente
que el mnimo recomendado de espermatozoides a contar son 200 por lo que si la muestra
no tiene suficientes espermatozoides para llegar a 200 en el retculo de Tomas se deber
14

continuar con los cuadrantes vecinos numerados en la figura 11 de tal manera de obtener un
error de muestra calculado en solo un 5 % (tabla 5). Y una diferencia aceptable de 39
espermatozoides como mximo entre ambos recuentos (tabla 6). Si la diferencia fuese
mayor se repite el procedimiento desde la mezcla del liquido seminal en adelante. (Replicas
nuevas y duplicados reales).

Figura 10: Cmara de Neubauer Izquierda: Vista desde arriba, Derecha vista de perfil mostrando la separacin entre
la cmara y el cubrecamara.

Figura 11 Ampliaciones sucesivas de la cmara de Neubauer, el recuadro 5 (retculo de Tomas) se ve

amplificado en el esquema central (1 mm 2) que a su vez indica un circulo que se amplifica nuevamente a la
derecha para realizar el recuento (0,2 mm 2). Pgina 34 WHO laboratory manual for the Examination and
processing of human semen.

1 mm.
0.2 mm.

0.05 mm = 50 um.
15

Figura 12: Fotografas equivalentes a los esquemas central y derecha de la figura 11.

Figura 13: Los crculos blancos indican espermatozoides que se cuentan en el campo indicado y los crculos
negros indican espermatozoides que no se cuentan: Esta tcnica evita contar al espermatozoide 2 veces. Pgina
34 WHO laboratory manual for the Examination and processing of human semen.

En los casos en que no se alcancen a contar los 200 espermatozoides en el retculo de

Tomas (cuadricula 5, figura 11) se continuara el recuento en las otras cuadriculas de la
cmara de Neubauer, desde la 1 a la 9 y el resultado se divide por el nmero de cuadriculas
contadas, as por ejemplo si fue necesario contar las cuadriculas 1, 2, 3, 4, 5 y 6 para
alcanzar los 200 espermatozoides el resultado final se divide en 6 ya que el rea abarcada
fue seis veces ms que el retculo de tomas completo.
Recuento en cmara Makler
La cmara Makler no es recomendada por OMS en el ltimo manual del 2010, sin embargo,
presenta la ventaja de trabajar con muestra sin diluir lo que evita este factor de error y
adems se puede determinar los distintos grados de movilidad a la vez, lo que ahorra tiempo
al personal del laboratorio.
Para determinar la concentracin, se cuenta las 100 cuadrculas y se multiplica el resultado
por 100.000, para expresar la concentracin espermtica en millones/mL.

Figura 14: Cmara de Makler Izquierda: Vista desde arriba, Derecha vista de perfil mostrando la separacin entre la
cmara y el cubrecamara.
16

Figura 15: Izquierda: Vista a bajo aumento de la grilla casi completa de la cmara de Makler: posee 100
cuadrantes en total. Derecha: Esquema de la grilla en cmara de Makler.

Hay que tener en cuenta que la centrifugacin en muestras con criptozoospermia

(concentracin espermtica menor de 1 x 106/mL), disminuir la movilidad espermtica en
los pocos espermatozoides que se pudieran encontrar y en algunos caso la movilidad se
puede perder en su totalidad.
Si el numero de espermatozoides es < 4 por campo con aumento de x400 esto representara
aproximadamente a 1 x 106/mL de espermatozoides y para la mayora de los propsitos
clnicos se informara una concentracin espermtica < 2 x 106/mL ya sea se encuentren o no
espermatozoides mviles.
Al finalizar el trabajo de recuento se dejara la cmara en solucin desinfectante
preferiblemente durante toda la noche para eliminar posibles agentes infecciosos del semen.
La siguiente tabla explica que al contar un total de 400 espermatozoides tendremos
un error de muestra de solo un 5 %.

17

Pgina 37 WHO laboratory manual for the Examination and processing of human semen.
Tanto el recuento, morfologa, motilidad y vitalidad espermtica consideran contar en duplicado al menos 200
espermatozoides para tener un error de muestra menor o igual al 5 %

OLIGOZOOSPERMIA: Se define como el recuento de espermatozoides inferior a 15 x

106 /mL esta puede ser, ligera (entre 10 - <15 x 10 6 /mL), oligozoospermia moderada (entre
5 y < 10 x 106 /mL) y oligozoospermia severa cuando la concentracin espermtica es
inferior a 5 x 106 /mL). Algunas causas son; Obstruccin epididimaria, eyaculacin
retrograda, diabetes mellitus, factores congnitos, estrs y periodos febriles intensos, e
hipogonadismo hipogonadotrofico entre otros.
CRIPTOZOOSPERMIA: Se define como una concentracin de espermatozoides inferior
a 1 x 106 /mL.
AZOOSPERMIA: Se define como la ausencia de espermatozoides en el lquido seminal y
puede indicar un dao severo del epitelio germinal con aplasia germinal o sndrome de
Sertoli solo (azoospermia secretora) y la detencin de la maduracin espermtica (arresto
de la espermtogenesis). La zoospermia tambin puede deberse a una obstruccin de las
vas seminales (azoospermia obstructiva). En estos casos se deber centrifugar toda la
muestra a 3000 g durante 15 minutos y revisar en 2 portaobjetos todo el pellet para
informar, revisado preferiblemente con aumento de x 20 para abarcar toda el rea del
cubreobjeto de 22 x 22 mm. Si se encuentra al menos 1 espermatozoide se informa como
criptozoospermia, de lo contrario solo se sugiere la azoospermia ya que existe la posibilidad
que en el resto de la muestra si se encuentren espermatozoides ya que e ha demostrado que
no todos los espermatozoides bajan al pellet a ese tiempo y velocidad. (Corea et al., 2005)
Debemos tener presente que casi en todos los casos, esta centrifugacin afectar
negativamente la movilidad de los escasos espermatozoides que pudiera tener la muestra.
Conclusin: A pesar que estos protocolos se sigan con exactitud, tenemos que considerar
varios factores relacionados con posibles errores, entre ellos tenemos solo como algunos
18

ejemplo ms frecuentes, el uso de pipetas de aire en vez de pipetas de presin positiva,

errores en la mezcla y dilucin de las muestras, pipetas descalibradas, cmaras y contadores
defectuosos entre otros factores por lo que siempre se recomendara el uso de control de
calidad tanto interno como externo para asegurar la confiabilidad de nuestros resultados.
RECUENTO
DE
OTRAS
ESPERMATOZOIDES:

CELULAS

DIFERENTES

LOS

El semen eyaculado contiene otras clulas adems de los espermatozoides, entre ellas se
incluyen clulas epiteliales de la uretra, leucocitos, clulas germinales.
La concentracin de estas clulas se puede estimar de la siguiente manera. Se cuentan las
clulas en los cuadrados que estn ubicados en las esquinas del retculo de Thomas
(Cuadrantes 1, 3, 7 y 9). Cada cuadrado tiene un volumen de 0.1mL3 pero representan un
valor de 1 mL. El conteo que resulta en los 4 cuadrados se divide entre 4 y se multiplica por
el factor de dilucin para obtener el nmero de clulas por mL de muestra. Lo mnimo que
hay que contar son 200 clulas redondas, si este valor no se alcanza se cuentan el resto de
los cuadrantes y el resultado se divide por el nmero de cuadrantes contados OMS adems
recomienda que este anlisis se haga por duplicado real en la cmara contra lateral.

Otra manera de estimar el nmero de clulas redondas especificando el detalle de estas es

directamente en el mismo frotis utilizado para determinar la morfologa espermtica, lo
cual obviamente requerir un anlisis de un experto en citologa para poder discriminar
entre clulas de origen sanguneo y de origen espermtico, de esta manera si N es el nmero
de un tipo celular dado por 100 espermatozoides y S es la concentracin de
espermatozoides en millones/mL, entonces la concentracin C de un tipo celular dado en
millones/mL. puede ser calculada con la siguiente frmula:
C=(NxS)/200
As, si el nmero de clulas germinales inmaduras o leucocitos contados es 5 por 200
espermatozoides y el recuento de espermatozoides es 120 x 106/mL la concentracin de
dichas clulas es 5 x 120x106 /200 = 3 millones /mL.
Con el mismo ejemplo pero ahora determinado el nmero de neutrfilos, si encontramos 2
neutrfilos por cada 200 espermatozoides tendremos que:
C= 2 x 120x106 /200

= 1,2 millones/mL

Figura 16: De izquierda a derecha, 1.- Neutrfilos, 2.- epitlio descamativo, 3.-epitlio descamativo plano, 4.Espermtidas.

Determinacin qumica de Leucocitos.

19

Los leucocitos pueden daar la movilidad y el DNA espermtico a travs de un ataque

oxidativo, sin embargo, este dao depender de varios factores entre ellos, el lugar de
infiltracin leucocitaria, naturaleza de los leucocitos encontrados (Macrfagos, Neutrfilos
y excepcionalmente Linfocitos) y el estado de activacin leucocitaria. Aunque la
leucocitoespermia no nos asegura el diagnstico de infeccin, si se considera un signo de
sospecha si se asocia a otros signos seminales y clnicos que confirman dicho diagnstico.
Algunos sntomas clnicos podran ser: dolor al eyacular, antecedentes de infecciones de
transmisin sexual o genitourinarias, exmenes anormales de alguna glndula del sistema
reproductor y alteraciones fsico qumicas del plasma seminal lo que confirma el
diagnstico es el examen bacteriolgico positivo. Hay que tomar en cuenta que un segundo
grupo de anlisis de espermiograma solo podr realizarse solo despus de transcurridos al
menos 90 das despus de la ltima dosis de antibiticos ya que estos afecta a la
concentracin espermtica.
Dentro de la poblacin de leucocitos, predominan los Neutrfilos. Sin embargo, estas
clulas podran ser confundidas por un evaluador inexperto con espermticas
multinucleadas. Algunas caractersticas morfolgicas que los diferencia a ambos, por
ejemplo, son: los puentes de cromatina que solo estn presentes en el Neutrofilo, los
linfocitos tiene un ncleo en promedio de 9 m a diferencia de un macrfago que posee un
tamao nuclear promedio de 15 m
En nuestro laboratorio determinamos leucocitos peroxidasa positivos en base a una
solucin de agua oxigenada 100 L a 10-30% mezclada con 900 L de una solucin de
ortotoluidina 0.15% (relacin agua oxigenada: Toluidina de 1:10). De esta mezcla, se toman
900 L a los que se agregan 100 L de muestra de semen (relacin 1:10). La solucin final
se incuba por 30 minutos a temperatura ambiente. Los leucocitos peroxidasa positivos dan
una coloracin marrn, y se registran como positivos para la reaccin. Este recuento es til
para diferenciar los leucocitos peroxidasa positiva (Neutrfilos) de otros tipos de clulas
redondas y se cuentan en cmara de Neubauer o Makler, sin embargo, esta tcnica no
detecta a Macrfagos o Neutrfilos que ya hayan exocitado sus grnulos. Un mtodo similar
pero ms complejo se detalla en el Manual OMS 2010 aunque varias otras tcnicas para
identificar la poblacin leucocitaria en semen, como son en base a inmunocitoqumica,
tambin pueden ser utilizadas aunque estas son mas costosas y demandan un tiempo de
procesamiento y anlisis mayor por lo que tendr que evaluarse el real aporte que puede
entregar esta tcnica al diagnstico en cada caso en particular.
La agencia internacional de investigacin del cncer (IARC, 1982) ha declarado que la
ortho-toluidina presenta riesgo carcinognico para humanos.

20

Figura 17: Clulas Peroxidas positivas: Se marcan de caf claro hasta marrn intenso.

Determinacin de clulas inmaduras:

Las clulas germinales o clulas inmaduras incluyen espermtidas y espermatocitos pero
rara vez incluyen a espermatogonias debido a que estas estn unidas mediante
hemidesmosomas a la lamina basal lo que previene su liberacin al lumen y la que se libera
tras una mitosis generalmente alcanza a transformarse en un elemento celular ms
diferenciado, estas clulas generalmente son detectadas en los preparados (frotis) pero son
difcilmente diferenciadas de clulas inflamatorias cuando estas clulas se encuentran en
degeneracin.

El siguiente grafico y tabla muestras cual es la diferencia aceptable entre dos

recuentos ya sea en cmara o frotis y aplica para las clulas redondas en funcin de
los espermatozoides.

21

Pgina 255 WHO laboratory manual for the Examination and processing of human semen.

Pgina 255 WHO laboratory manual for the Examination and processing of human semen

ANTICUERPOS ANTIESPERMTICOS.
Se ha sabido desde hace mucho tiempo que los animales de experimentacin podra ser
infrtiles mediante la inmunizacin con el esperma. Los espermatozoides estn
22

normalmente aislados del resto del cuerpo en los tbulos seminferos. Si hay ruptura de los
tbulo y los espermatozoides quedan expuestos al sistema inmune, estas clulas sern
reconocidas como extraas y provocaran una respuesta de anticuerpos. Los anticuerpos
anti-espermticos se encuentran en un 8-10% de los hombres. En los hombres con
antecedentes de infeccin, traumatismo o ciruga, los anticuerpos se pueden encontrar hasta
un 60% de los casos, tambin aumenta la posibilidad de presentar anticuerpos
antiespermticos en pacientes con torsin o cncer testicular, varicocele y sometidos a
biopsia testicular, tambin los pacientes sometidos a la reversin de la vasectoma en un 70
% de los casos presentan anticuerpos antiespermticos.
A menudo, sin embargo, no hay causa conocida para su presencia. Cuando el anticuerpo se
une a los espermatozoides, que pueden alterar la capacidad de los espermatozoides de nadar
(si esta unido a la cola) o fertilizar un vulo (si esta unido a la cabeza). Cuando hay un gran
porcentaje de espermatozoides con anticuerpos unidos a ellos, hay una buena probabilidad
de fracaso de la fertilizacin, incluso con la FIV el ICSI es la eleccin en casos graves de
anticuerpos antiespermticos.
Para determinar la presencia de anticuerpos antiespermticos, especialmente cuando se
detecta aglutinacin espermtica (anticuerpos unidos entre si y con motilidad) ya sea
cabeza-cabeza, cola-cola o una mezcla de ambas, en estos casos la presencia de anticuerpos
podra ser la causa, aunque los anticuerpos pueden estar presentes sobre los
espermatozoides sin generar aglutinacin y la aglutinacin tambin puede ser causada por
una causa diferente a la presencia de anticuerpos. La mera presencia de anticuerpos es
insuficiente para el diagnstico de autoinmunidad espermtica. Es necesario demostrar que
los anticuerpos interfieren severamente con la funcin espermtica; esto es usualmente
hecho por el test de penetracin de espermatozoides en moco. Los anticuerpos pueden
interferir con la unin del espermatozoide a la zona y con la reaccin acrosmica.
Los anticuerpos antiespermticos en semen pertenecen casi exclusivamente a dos clases de
inmunoglobulinas: IgA y IgG. Los anticuerpos de clase IgM , debido a su gran tamao, son
raramente encontrados en semen. Los anticuerpos del tipo IgA pueden tener gran
importancia clnica e incluso ms que los anticuerpos IgG (Kremer and Jager, 1980).
Ambas clases pueden ser detectadas sobre los espermatozoides o en fluidos biolgicos.
Test Directo: test para detectar anticuerpos sobre los espermatozoides. Describiremos
dos test, el primero llamado MAR Test (mixed antiglobulina reaction). (Bronson et al.,
1984). Y los inmunobead (IB) o inmunoperlas. (Bronson et al., 1982). El MAR test es
realizado en una muestra de semen fresco mientras que el IB es realizado en
espermatozoides lavados. Los resultados de ambos test no siempre concuerdan pero los
resultados de IB estn siempre correlacionados con los resultados de los test de
inmovilizacin de anticuerpos detectados en suero. Los protocolos experimentales para IB y
MAR test varan, pero para ambos las preparaciones son examinadas bajo el microscopio.
Las inmunoperlas se adhieren a los anticuerpos que estn unidos sobre la superficie de
espermatozoides motiles e inmtiles; Se informa el porcentaje de espermatozoides motiles
con perlas.
PROCEDIMIENTO PARA MAR test.
MAR test es rpido y sensible (Rajah et al., 1992), este reactivo con anticuerpos anti IgG o
IgA se unen a los anticuerpos del tipo IgG o IgA que estn sobre los espermatozoides. El
reactivo que contiene el anticuerpo se mezcla con semen nativo y se observa la presencia de
espermatozoides motiles con perlas unidas a este. En nuestra experiencia, esta tcnica es la
23

prueba inmunolgica ms utilizada para detectar anticuerpos antiespermticos, por lo que

nos referiremos a ella con ms detalles.
Tcnica: Mezclar muy bien la muestra de semen y toma 3.5 L de semen para cada
determinacin (para IgG e IgA), tambin se debe incluir muestras de semen positivas y
negativas como control provenientes de individuos controles". Alternativamente controles
positivos pueden ser producidos por incubacin de espermatozoides con suero que contiene
tales anticuerpos antiespermticos. Lego se agrega 3.5 L de IgG cubierta por perlas de
latex (beads) a cada muestra y mezclar con una punta de micropipeta, luego se agregan 3.5
Lde antisuero contra la IgG a cada mezcla de semen bead y volver a mezclar,
posteriormente se cubre con un cubre objetos de 22 x 22 mm para proporcionar una
profundidad entre portaobjeto y cubre de 20m, se deja reposar por 3 minutos a temperatura
ambiente en cmara hmeda para prevenir el secado y posteriormente se examina de
preferencia en microscopio con contraste de fases a los 3 y 10 minutos. Repetir el
procedimiento para IgA.
Expresin de los resultados: Se determina el porcentaje en 200 espermatozoides motiles
que presenta la unin de 2 o ms partculas de ltex unidas, ignorando a los
espermatozoides que tiene unidas las partculas en la punta de la cola (se realiza en
duplicado). Se consigna el tipo de anticuerpo unido y la zona del espermatozoide afectado
(cabeza, pieza media, pieza principal).
Notas: Si el 100 % de los espermatozoides motiles presenta perlas unidas a los 3 minutos, se
toma como resultado final de lo contrario se lee nuevamente a los 10 minutos, pero si a los
10 minutos los espermatozoides estn inmviles se toma como resultado el determinado a
los 3 minutos.
Valor de referencia: Positivo hasta 50 % de los espermatozoides motiles, ya que la tasa de
penetracin espermtica en moco cervical es severamente daada cuando 50 % o ms de los
espermatozoides presentas MAR es positivo.
Esquema.

PROCEDIMIENTO PARA Inmunobead (IB).

Este procedimiento consume ms tiempo que el MAR test pero entrega informacin acerca
de anticuerpos sobre los espermatozoides que podran haber sido enmascarados por
componentes del plasma seminal. En este test (IB) el reactivo esta formado por perlas de
ltex cubierta con anticuerpos anti IgA o IgG que se mezclan directamente con
espermatozoides lavados y la unin de las perlas a los espermatozoides indica la presencia
de IgG o IgA en la superficie del espermatozoide. Procedimiento descrito en el 5 manual de
OMS pg 111 y 112.
Valor de referencia: Positivo hasta 50 % de los espermatozoides motiles.
24

Test Indirecto: Test para detectar anticuerpos antiespermticos en fluidos libres de

espermatozoides. Como el plasma seminal, sangre, suero y moco cervical solubilizado. En
estos test, los fluidos inactivados por calor son incubados con espermatozoides lavados y
libres de anticuerpos de un donante. Cualquier anticuerpo antiespermticos del paciente se
unir a los espermatozoides lavados del donante, el cual es tratado luego con un test directo
como el indicado anteriormente. Para permitir resultados seguros, es importante permitir un
tiempo suficiente de interaccin ya que puede tardar hasta 10 minutos para que la mezcla y
aglutinacin sea visible. Sin embargo, hay que tener en cuenta que la motilidad declina con
el tiempo, y el test depende de espermatozoides motiles. Procedimiento descrito en el 5
manual de OMS pg 113 y 114.
Valor de referencia: Positivo hasta 50 % de los espermatozoides motiles.
Estos test estn disponibles comercialmente y ambos dependen de la presencia de
espermatozoides motiles. Si hay insuficientes espermatozoides motiles se pueden utilizar los
test indirectos sobre plasma seminal, sangre o suero pueden ser usados. Tambin hay que
considerar que anticuerpos citotxicos pueden matar a todos los espermatozoides o inhibir
por completo la motilidad.

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AQU
EL
DOCUMENTO
DE
ENTRENAMIENTO
DE
MORFOLOGA ESPERMTICA DE 23 PGINAS. Por el momento bsquela
tambin por Internet o escriba a LSARABIA@MED.UCHILE.CL y con gusto se la
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ANLISIS ESPERMTICO ASISTIDO POR COMPUTADORA

Computer-assisted semen analysis (CASA).
Los actuales avances en la tecnologa nos han permitido contar eficientemente
espermatozoides marcando el DNA y algoritmo que detectan la cola del espermatozoide, de
esta manera se descarta el detritus o clulas redondas propias del lquido seminal. El uso de
sistemas computacionales para la determinacin de la motilidad espermtica depende de la
concentracin espermtica, del debris de la muestra ya que este ltimo puede ser
confundido con espermatozoides motiles, tasa de imgenes obtenidas por segundo, aunque
la mayora de las compaias fabricantes recomiendas una adquisicin de imgenes que
varia entre 50 y 60 Hz (Morris et al., 1996). y actualmente esa tasa de adquisicin es mayor
25

y se recomienda especialmente para muestras con espermatozoides de baja linearidad y/o

hiperactivados e incluso para los espermatozoides ms rpidos conocidos como son los
espermatozoides del pez Zebra, se requieren tasas de adquisicin de 290 Hz para describir
la motilidad espermtica con confiabilidad (Wilson_Leedy et al., 2007). Sin embargo, el
sistema entrega resultados bastante reproducibles. OMS recomienda que al menos 200
espermatozoides sean analizados y en l posible sean 400, as tambin el sistema debe estar
unido a un software que permita el anlisis estadstico de los resultados, en general tambin
es necesario estandarizar las condiciones de grabacin de los videos que determinaran la
motilidad de los espermatozoides como son la temperatura a 37 C ya que la motilidad es
sensible a la temperatura y de preferencia realizar la determinacin en muestra si diluir.
Tambin se ha determinado que la motilidad de la muestra se puede realizar sin dificultad
con muestras que tienen una concentracin espermtica de entre 2 x 106 y 50 x 106 por mL
(Garret et al., 2003).
En muestras que superan los 50 x 106 por mL las colisiones pueden ocurrir con una
alta frecuencia y es probable que eso induzca a errores, tales muestras deben ser diluidas
con plasma seminal del mismo paciente obtenido de una alicuota centrifugada a 16.000 g
por 6 minutos, tambin deben disponerse de cmaras dobles que del sistema generalmente
hace las recomendaciones para una adecuada grabacin en cuento a intensidad de luz,
contraste y aumento. Un dato importante a considerar es que en Estados Unidos solo un 2 %
de los laboratorios que realizan mediciones de motilidad espermtica para fines clnicos
utilizan un sistema CASA (Amann 2004).

Tabla 1: Resumen de Lmites de Referencia Inferiores (LRI), con un percentil de 5 e

intervalo de confianza de un 95 %.

26

Pgina 224 WHO laboratory manual for the Examination and processing of human semen.

Tabla 2: Forma para registrar el anlisis del espermiograma y moco cervical, segn
el manual de la OMS 2010.

27

Pgina 252 WHO laboratory manual for the Examination and processing of human semen.

Tabla 3: Nomenclatura para algunas variables seminales WHO 2010 y Sarabia et al,
2010
TERMINO
Normozoospermia:
Oligozoospermia:

DEFINICIN
Eyaculado normal definido por los valores
de referencia.
Concentracin espermtica menor a los
28

Astenozoospermia:
Teratozoospermia
Oligoastenoterato zoospermia:
Azoospermia:
Aspermia
Cryptozoospermia:
Hemospermia:

valores de referencia. (< 15 millones de

espermatozoides por mL)
Movilidad menor al valor de referencia. (<
32 % de espermatozoides progresivos)
Morfologa menor al valor de referencia. (<
4 % de espermatozoides de morfologa
normal)
Significa alteraciones en tres variables.
(Tambin se usar la combinacin de 2
prefijos).
Ausencia de espermatozoides en el
Eyaculado.
Ausencia de eyaculado.
Espermatozoides ausentes en el preparado
examinado al fresco pero presentes en el
pellet.
Hematospermia;
Presencia de eritrocitos en el eyaculado.

Leucospermia:

Leucocitospermia, Piospermia;
Presencia de leucocitos en el eyaculado por
sobre el valor de referencia.

Necrozoospermia:

Porcentaje de espermatozoides vivos menor

al valor de referencia.
(< 58 % espermatozoides vivos).

El sufijo espermia se refiere al eyaculado y zoospermia al espermatozoide. Por lo

tanto, los siguientes trminos NO deben ser usados: astenospermia, astenoteratospermia,
criptospermia, oligoastenospermia, oligoteratospermia, oligospermia, teratospermia.

Las siguientes tablas nos resuelven el problema que tenan los laboratorios al obtener
diferentes valores en las variables determinadas en duplicados reales.
Tabla 4: Diferencias aceptables entre dos porcentajes promedios provenientes de la
misma muestra, al evaluar 200 clulas en cada placa, total 400 clulas.
Ejemplo 1:
29

Si la vitalidad en la placa 1 nos da un valor del 60 % y en la placa 2 un valor de 68 %

tenemos que:
Promedio, 64 % para lo cual la mxima diferencia aceptable observada en esta tabla
corresponde a 10, entonces como 68-60 es 8 la vitalidad espermtica que informaremos es
de 68 % de lo contrario si la diferencia fuese mayor a la diferencia aceptable, se tendr que
analizar un nuevo set de preparados.

Pgina 25 WHO laboratory manual for the Examination and processing of human semen.

Tabla 5: Error de muestreo en porcentaje (%) de acuerdo al nmero total de clulas

contadas.
Ejemplo 2: El valor mnimo a evaluar para todas las variables, ser de 200 clulas y por
duplicado, lo que nos entrega un valor total de 400 clulas analizadas y con esto
aseguramos un error de muestra del 5 %.

30

Pgina 37 WHO laboratory manual for the Examination and processing of human semen.
Tabla 6: Diferencia aceptable entre dos recuentos que entregan una suma
Ejemplo 3: Si el recuento de clulas redondas en la placa 1 nos entrega un valor del 100 y
en la placa 2 un valor de 120 tenemos que:
La suma es 220 para lo cual la mxima diferencia aceptable observada en esta tabla
corresponde a 29, entonces como 120-100 es 20, Se acepta la suma de 220 y se proceden a
hace los clculos para determinar la concentracin de las clulas, determinadas segn
dilucin.

Pgina 42 WHO laboratory manual for the Examination and processing of human semen.

Tabla 7: Diferencia aceptable entre dos bajos recuentos que entregan una suma
Ejemplo 4: Idntico al ejemplo 3 y se incluye el calculo para bajas concentraciones.

31

Pgina 50 WHO laboratory manual for the Examination and processing of human semen.

Normograma: De especial utilidad para extrapolar la fuerza centrifuga a las revoluciones

por minutos (rpm) y viceversa.
En este ejemplo una fuerza de rotacin centrifuga (RCF) de 550 g para una centrifuga con
un radio de rotor de 8 cm. Corresponder a 2500 rpm.
32

Pgina 231 WHO laboratory manual for the Examination and processing of human semen.

INFORME DE ESPERMOGRAMA
NUMERO DE BOLETA: __________
FECHA: _____________
NOMBRE DEL PACIENTE: _______________________________________________ EDAD: ______
NOMBRE DE LA PAREJA: ________________________________________________
MEDICO QUE REFIERE AL PACIENTE: ____________________________________

33

RECOLECCION DE MUESTRA
Recipiente suministrado por el laboratorio: _____ SI _____ NO Das de Abstinencia _______
____________________
Muestra colectada en: ____ Laboratorio ____ Casa
Dificultades en la obtencin de muestra: __________________Medicamentos y antecedentes:
___________________________________________
Hora de entrega al laboratorio: _______
Hora de Inicio del anlisis: __________

PARAMETROS A EVALUAR
EXAMEN MACROSCOPICO

RESULTADOS

Licuefaccin Total
Volumen
Viscosidad
Color
pH

Hora de Recoleccin:

VALORES DE REFERENCIA SEGN OMS 2010

5 - 60 minutos a 37 C
1.5 mL
Normal: < 2 cm; Aumentada: > 2 cms
Blanco Opalescente o Gris amarillento
7.2

EXAMEN MICROSCOPICO
Aglutinacin espermtica:

Recuento Total de espermatozoides

Concentracin Espermtica
Vitalidad
Movilidad total (MP + MNP)
Movilidad Progresiva / MP
Movilidad No progresiva / MNP
Inmviles
Morfologa
Normal
Anormal
Defecto de cabeza
Defecto de cuello y pieza media
Defecto de pieza principal
Exceso de citoplasma residual

Negativo
Grado 1: < 10%; Grado 2: 10 50 %; Grado 3: > 50%; Grado 4:
100%
Tipo A: cabeza/cabeza; Tipo B: pieza media/pieza media; Tipo C:
cola/cola; Tipo D: cabeza/cabeza y cola/cola; Tipo E: Maraa de
aglutinacin.
39 x 106 / Volumen Total
15 x 106 espermatozoides / mL
58 % espermatozoides vivos
40 %
32 %

4%

PRUEBAS DIVERSAS
Clulas Redondas
Clulas peroxidasa positivo
Test de MAR
Test Inmunobead
Zinc
Fructosa
Glucosidasa Neutra

No debe superar el 5 % relativo al recuento espematico.

1 x 106 leucocitos / mL
< 50 % de espermatozoides mviles con partculas adheridas
< 50 % de espermatozoides mviles con gotas adheridas
2.4 mol / volumen total de semen
13 mol / volumen total de semen
13 mol / volumen total de semen

OTROS
NOTAS: Un solo anlisis de lquido seminal o un parmetro fuera de los rangos de referencia segn el Manual de la OMS 2010, puede ser un evento
aleatorio y no indican subfertilidad, para esto est indicado un segundo anlisis seminal tres o ms semanas ms tarde. As mismo los valores por
fuera de los rangos de referencia pueden reflejar desrdenes mdicos, urolgicos y/o subfertilidad, que pueden ayudar al diagnstico mdico. No se
recomienda hacer un diagnstico de subfertilidad o de disfunciones reproductivas en base a un anlisis seminal, estos resultados deben ser
interpretados en conjunto con una historia clnica completa.

____________________________________________
FIRMA

Bibliografa.

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