Documentos de Académico
Documentos de Profesional
Documentos de Cultura
Manual Practicas Micalimentos PDF
Manual Practicas Micalimentos PDF
MICROBIOLOGA
DE ALIMENTOS
(Guin de Prcticas)
Objetivo
Se pretende conseguir que los alumnos conozcan:
.- las buenas prcticas de trabajo en el laboratorio de Microbiologa
.- aprender las tcnicas de preparacin de diferentes medios de cultivo
- familiarizarse con las tcnicas empleadas en Microbiologa para el cultivo y la
manipulacin de microorganismos en condiciones de esterilidad
.- familiarizarse con el manejo del microscopio ptico para la visualizacin de
microorganismos as como las tinciones ms habituales en el laboratorio de
Microbiologa
.- aprender otras tcnicas como las de transformacin bacteriana, infeccin de
bacterias con bacterifagos, as como aprender a realizar un antibiograma
.- determinar el grado de contaminacin microbiolgica de los alimentos. Ejemplo:
contenido de grmenes por gramo de alimento a 30 C
.- verificacin de las buenas prcticas de fabricacin (BFP). Ejemplo: recuento de
indicadores en alimentos procesados (coliformes, enterobacterias, grmenes totales,
etc.)
.- determinacin de microorganismos testigos de falta de higiene.
.- comprobacin de la salubridad de un alimento mediante la determinacin de la
ausencia o presencia de grmenes patgenos o toxinas que provocaran riesgos al
consumidor (Salmonella spp., Listeria monocytogenes, toxina estafiloccica, etc).
.- descripcin de tcnicas sencillas para estudiar el papel de los microorganismos en
la produccin de alimentos.
Metodologa
Lecciones prcticas en el laboratorio de Microbiologa (en grupos
reducidos). Cada grupo realizar las prcticas a lo largo de cuatro semanas (3 das
/semana; 2horas/da). La realizacin de las prcticas es obligatoria para aprobar la
asignatura.
Prctica 6: Antibiograma.
El objetivo de esta prctica es estudiar qu son los antibiticos y cmo se
realiza la valoracin de la actividad antimicrobiana de un compuesto qumico
(antibitico) mediante la tcnica de Kirby-Bauer.
Prctica 7: Efecto de las altas temperaturas sobre el crecimiento microbiano
El objetivo de esta prctica consiste en estudiar el efecto y la resistencia de
un cultivo bacteriano a altas temperaturas.
Prctica 8: Transformacin bacteriana por resistencia a ampicilina.
En esta prctica se hablar de los fenmenos de transformacin,
conjugacin y transduccin y se realizar un ensayo de transformacin bacteriana por
adquisicin de plsmidos resistentes al antibitico ampicilina.
Preparacin de la muestra:
Tomar la muestra en condiciones aspticas. Para ello se pueden emplear
cubiertos y botes previamente esterilizados. Si transcurre un tiempo entre la
toma de muestra y el anlisis, se mantendr la muestra en refrigeracin.
Homogeneizacin del alimento. Emplearemos un homogeneizador comercial
de paletas para que la distribucin de los microorganismos en el medio sea
homognea. Se pesan 10g del alimento en una bolsa de plstico estril
(especial para el homogeneizador) y se aaden 90 ml de caldo de peptona
estril. El triturado de la muestra se realiza al menos durante 2 minutos,
aunque el tiempo depende de la consistencia del alimento.
13-A
13-B
DETERMINACIN
DE
INDICADORES
DE
FALTA
DE
HIGIENE
Recuento de coliformes totales en placa
Investigacin de Escherichia coli Presencia/Ausencia
Recuento de Staphylococcus coagulasa positivos
13-C INVESTIGACIN DE PATGENOS
Presencia de Salmonella
Presencia de Listeria monocytogenes
14-A
14-B
15-A
15-B
ANLISIS DE SUPERFICIES
15-C
ANLISIS DE MANIPULADORES
PREPARACIN DE YOGUR
16-B
PREPARACIN DE CERVEZA
CALENDARIO DE PRCTICAS
1a SEMANA
1er DIA- prctica 1
Qu es un medio de cultivo en microbiologa?. Preparacin de medios de
cultivo generales, de enriquecimiento, selectivos y diferenciales
slido en placa
slido en tubo (slant)
lquido (caldo)
Esterilizacin: Diferentes tcnicas, aparatos y formas de trabajo para lograr la
esterilizacin del material y para desechar el material una vez contaminado.
2 DIA- prcticas 1, 2 y 3
-Siembra de los medios preparados el da anterior:
siembra de un cultivo en una placa de LB mediante agotamiento por estras.
siembra de tres cultivos mediante agotamiento por estras en una placa de
LB y otra de agar McConkey.
siembra de un caldo de LB.
siembra de dos cultivos en slant de TSI.
siembra de microorganismos ambientales a partir de objetos y superficies
para demostrar la ubicuidad de los microorganismos
siembra de levaduras en agar sabouraud: incubacin a temperatura ambiente.
Cultivo de bacterias en anaerobiosis: Utilizacin de la jarra de anaerobiosis
3er DIA- prctica 4. Resultados prcticas 1, 2 y 3.
Tincin de Gram: Cmo se realiza y cul es el objetivo de la misma
Ver los resultados del agotamiento por estras y del crecimiento en medio
lquido y slant. Diferencias entre medio de cultivo general, selectivo y
diferencial.
Comprobar la ubicuidad de los microorganismos
Ver el resultado del crecimiento en anaerobiosis.
10
2a SEMANA
11
3a SEMANA
1er DIA- prctica 13-A-1, 13-A-2, 13-B-1, 13-B-2, 13-B-3, 16-B
Aprender a preparar, homogeneizar y diluir convenientemente la muestra a analizar para
el anlisis de alimentos frescos-cocinados. Comenzaremos por la investigacin de
microorganismos indicadores (mesfilos, enterobacterias) y la determinacin de
indicadores de falta de higiene (coliformes totales, Escherichia coli y Staphylococcus
coagulasa positivos).
Comprobar la transformacin de una suspensin de harina de malta que la levadura
Saccharomyces cerevisiae lleva a cabo mediante una fermentacin alcohlica para
dar lugar a cerveza.
12
13
14
15
16
9. Agentes selectivos. Sustancias como el cristal violeta, las sales biliares etc.
que a determinadas concentraciones en el medio actan como
agentes selectivos frente a determinados microorganismos.
Tipos de medios de cultivo.
Por su CONSISTENCIA:
a) Slidos. Son aquellos que contienen un agente solidificante entre sus
componentes, normalmente agar. Se preparan en placas de Petri o en tubos en slant
(tubos con la superficie del medio inclinada).
b) Lquidos. Se denominan caldos y se preparan en tubos o erlenmeyers.
Por su COMPOSICIN:
a) Medios generales. Permiten el desarrollo de una gran variedad de
microorganismos.
b) Medios de enriquecimiento. Favorecen el crecimiento de un determinado
grupo de microorganismos, sin llegar a inhibir totalmente el crecimiento del resto.
c) Medios selectivos. Permiten el crecimiento de un tipo de microorganismos
determinado, inhibiendo el desarrollo de los dems.
d) Medios diferenciales. Son aquellos en los que se pone de relieve alguna
propiedad que un determinado tipo de microorganismos posee.
Siembra de microorganismos
En trminos microbiolgicos se entiende por SIEMBRA el proceso
mediante el cual se lleva una porcin de una poblacin de microorganismos (inculo)
de un cultivo bacteriano a un medio nutritivo para su crecimiento.
PARA UNA CORRECTA REALIZACIN DE LA SIEMBRA SON
NECESARIAS CIERTAS CONDICIONES:
1) Que se lleve a cabo con instrumentos estriles sobre medios de cultivo estriles.
Para estudiar una bacteria determinada, es necesario destruir todos aquellos
microorganismos que pudieran encontrarse en el medio y en los instrumentos de
trabajo. Esto se consigue con la ESTERILIZACION, proceso que consiste en
conseguir que todos los microorganismos presentes mueran desde el punto de vista
microbiolgico.
17
La esterilizacin
Se utilizan dos tipos principales de esterilizacin:
Por MTODOS FSICOS (calor, filtracin, radiaciones).
Por MTODOS QUMICOS (empleo de soluciones qumicas).
Los medios de cultivo se esterilizan en el AUTOCLAVE, el cual hace uso
del calor hmedo. El autoclave es un aparato que permite elevar la presin y la
temperatura con lo que se consigue un aumento en la temperatura de ebullicin del
agua. Normalmente, se lleva la presin a 1 atmsfera (por encima de la ambiental) lo
que corresponde a una temperatura interior de 126C, mantenindolo en estas
condiciones durante 20 minutos.
Todo el material de vidrio (pipetas, tubos, varillas.etc..) se esteriliza con
calor seco, siendo el "horno Pasteur" el aparato ms empleado (se somete a
temperaturas de 140-180 C durante 2h-3h).
En el caso de objetos metlicos, como el asa de siembra, que se esterilizan
en el momento de su utilizacin, se mantienen en la llama hasta que se pongan al
rojo, teniendo la precaucin de enfriarlos antes de su uso.
2) Que el inculo no se contamine, modifique o destruya:
Normalmente se emplea el calor directo, flameando las bocas de los tubos de
ensayo, matraces, pipeta, etc. antes y despus de su utilizacin, a pesar de estar
esterilizados previamente.
3) Que las condiciones ambientales durante el proceso sean lo ms prximas a la
esterilidad para evitar contaminaciones durante el manejo del instrumental y de los
medios de cultivo.
Esto se resuelve con el uso de cabinas estriles (con flujo de aire y luz
ultravioleta). Cuando no se dispone de ellas, se utiliza un mechero Bunsen que,
debido a que fuerza la circulacin del aire en sentido vertical y hacia arriba, es capaz
de crear un ambiente semiestril en la zona inmediata alrededor y debajo de la llama,
de forma que los riesgos de contaminacin disminuyen considerablemente.
18
Material de la Prctica:
Mechero bunsen o similar
Asa de siembra
Tubos con cultivos bacterianos crecidos: Escherichia coli, Salmonella enteritidis,
Staphylococcus aureus.
Material a preparar por el alumno:
1 Tubo con medio lquido estril (caldo comn): Luria Bertani (LB)
2 Tubos con medio slido estril (agar inclinado): TSI
Placas: 4 placas LB agar; 1 placa agar McConkey; 1 placa agar Sabouraud.
Mtodos:
1) PREPARACIN DE MEDIOS
Preparacin de un medio slido en placa.
1. Pesar la cantidad de medio (si el preparado contiene agar debemos aadirlo a una
concentracin de 15 g/l.) y rehidratarlo con agua destilada en una botella.
2. Autoclavar la botella sin cerrar totalmente el tapn de rosca.
3. Sacar del autoclave, enroscar del todo el tapn e introducir la botella en un bao a
40C al menos durante 30 minutos.
4. Distribuir el medio en las placas de Petri que estn estriles dentro de una campana
de flujo laminar o en las proximidades del mechero, flameando bien la boca de la
botella para evitar las contaminaciones.
5. Dejar que el medio solidifique.
Preparacin de medio slido en tubo (slant).
1. Pesar el medio que contenga agar y rehidratar con agua destilada en un matraz.
2. Fundir el medio en un horno microondas o en una placa caliente. El medio debe
hervir hasta que se vuelva transparente.
3. Distribuir rpidamente el medio en los tubos antes de que comience a solidificar.
Para ello se emplear una pipeta y los tubos no se llenarn ms de un tercio de su
volumen.
4. Autoclavar.
5. Sacar del autoclave e inclinar los tubos sobre la poyata para obtener tubos con
medio en slant.
Preparacin de medio lquido en tubo (caldo).
1. Pesar y rehidratar el medio.
19
2. Distribuirlo con una pipeta en los tubos ( sin llenarlos ms de 1/3 de su volumen).
3. Autoclavar.
4. Sacar del autoclave y dejar enfriar.
Todos los medios se guardan en nevera a 4C.
2) REALIZACIN DE LA SIEMBRA
1.- Marcar el material con el nombre de la pareja y grupo.
2.- Realizar la siembra, como sigue:
a) Siembra en medio lquido:
Se introduce el asa de siembra en el tubo con cultivo crecido y se toma un inculo
que se lleva al tubo estril con medio lquido (agitndola en el seno del medio),
tomando las precauciones mencionadas anteriormente.
b) Siembra en placa:
Dividida la placa en tres partes, sembrar en cada tercio el inculo tomado de los
cultivos crecidos. Se introduce el asa de siembra en el tubo con cultivo crecido y se
toma una gota de inculo que se extiende sobre el agar de la placa deslizando el asa
suavemente por su superficie en zig-zag.
c) Siembra en agar inclinado:
Se introduce el asa de siembra en el tubo con cultivo crecido y se toma un inculo
que se extiende sobre el agar inclinado deslizando el asa suavemente por su
superficie en zig-zag. En el caso del medio TSI, la siembra se deber realizar tanto en
superficie (aerobiosis) como en la profundidad del agar (anaerobiosis).
3) INCUBACIN de los medios sembrados a 37 C hasta que haya habido
crecimiento bacteriano.
4) OBSERVACIN DE LOS RESULTADOS:
En primer lugar, observar a simple vista diversas caractersticas como el
color y el borde de las colonias crecidas en el agar as como el olor y la turbidez del
medio ya que en algunos casos suelen ser tpicos de un determinado tipo de
microorganismo y pueden servir de ayuda a la hora de su identificacin.
El siguiente paso sera la observacin al microscopio, que ser objeto de otra
prctica.
20
22
23
2) Tinciones:
A) La TINCIN SIMPLE es la tincin en que se utiliza un solo colorante.
Como colorantes utilizaremos el azul de metileno o la safranina, ambos de
naturaleza bsica. La tcnica es la siguiente:
1. Hacer el frotis, secarlo y fijarlo.
2. Cubrir con colorante la preparacin y dejarlo actuar durante un minuto.
3. Lavar suavemente con agua destilada para eliminar el exceso de colorante.
4. Secar al aire y observar al microscopio con el objetivo de inmersin (100x)
empleando el aceite apropiado.
Esta tcnica permite observar la morfologa y tamao de las bacterias, as como los
tipos de agrupaciones que forman.
B) La TINCIN DE GRAM es la tincin diferencial ms utilizada en
Bacteriologa pues permite separar las bacterias en dos grandes grupos, las Grampositivas y las Gram-negativas. La tincin de Gram requiere cuatro soluciones:
1. Primer colorante. Es un colorante bsico que en contacto con las clulas
cargadas negativamente, reacciona con ellas colorendolas. El ms
utilizado es el cristal violeta.
2. Solucin mordiente. Fija las tinciones y aumenta la afinidad entre el
colorante y las clulas. Los mordientes empleados suelen ser sales
metlicas, cidos o bases, como, por ejemplo, una solucin diluida de
yodo.
3. Agente decolorante. Es un disolvente orgnico, por ejemplo, alcoholacetona (1:1).
4. Colorante de contraste. Es un colorante bsico de distinto color que el
primer colorante, como, por ejemplo, la safranina. Los dos grupos
bacterianos a los que anteriormente nos referamos difieren en el color con
el que finalmente aparecen. Las bacterias Gram positivas se teirn de azul
por el cristal violeta y no perdern esta coloracin durante los pasos
sucesivos. Las bacterias Gram negativas perdern la coloracin inicial del
cristal violeta en los siguientes pasos y se teirn de rosa debido a la
safranina. La diferencia est determinada por la composicin de su
envoltura celular. Las bacterias gram positivas poseen una malla de
peptidoglicano en su parte ms externa, mientras que las bacterias gram
negativas, recubriendo una fina capa de peptidoglicano, presentan una
membrana externa que envuelve toda la clula.
24
25
26
Prctica 6: ANTIBIOGRAMA
Introduccin
En nuestros das han sido puestos a nuestra disposicin para la lucha
contra las enfermedades bacterianas gran cantidad de agentes antibacterianos.
Los antibiticos son sustancias qumicas producidas por
microorganismos o derivados semisintticos de stas, mientras que los
quimioterpicos son productos de sntesis qumica, pero ambos tienen la propiedad
de estar dotados de actividad antibacteriana.
Todas las bacterias no tienen la misma sensibilidad a los distintos
antibacterianos. La evaluacin de esta sensibilidad nos va a ayudar en la seleccin del
compuesto ms adecuado para el tratamiento de una infeccin bacteriana. Las
pruebas ms utilizadas para evaluar la sensibilidad de una bacteria a un agente
antibacteriano estn basadas en el enfrentamiento in vitro de la bacteria con distintas
concentraciones del agente.
Concentracin mnima inhibitoria (CMI) se define como la menor
concentracin de antimicrobiano capaz de inhibir el desarrollo de una
cepa bacteriana dada.
Concentracin mnima bactericida (CMB) se define como la
menor concentracin de antimicrobiano capaz de destruir una cepa
bacteriana dada.
Fundamento
El antibiograma por el mtodo de difusin en agar es una prueba en la
que se enfrenta la bacteria inoculada sobre la superficie de un medio de agar con una
solucin antibitica absorbida en discos de papel de filtro. Este mtodo est
estandarizado y los halos de inhibicin han sido obtenidos correlacionndolos con las
CMI y aparecen en unas tablas.
Hay varios factores que afectan al halo de inhibicin: la carga del
antibitico en los discos, la difusin del antibitico en el medio de cultivo, el tamao
del inculo bacteriano, la composicin y grosor del medio de cultivo, la velocidad del
crecimiento bacteriano y el tiempo de incubacin.
Los discos de antibiticos son adquiridos comercialmente. Deben
contener la cantidad establecida de antibitico y ser conservados a 4C protegidos de
la humedad.
El inculo bacteriano debe tener una turbidez similar al 0,5 de la escala
8
de McFarland, aproximadamente 10 UFC/ml y ser preparado en solucin salina
estril o caldo de cultivo.
27
Objetivos
Determinar la sensibilidad bacteriana a distintos antibiticos utilizando
metodologa sencilla y asequible a cualquier laboratorio de Microbiologa.
una
Material necesario
- Cultivo puro de Staphylococcus aureus y Escherichia coli.
- Placas de LB agar.
- Discos comerciales de antibiticos.
- Hisopos estriles
- Pinzas de laboratorio.
Realizacin
1. Preparacin del inculo. Partiendo de un cultivo puro tomar con el asa de siembra
X colonias de la bacteria e introducirlas en el caldo de cultivo. La turbidez del
inculo debe equivaler al estndar 0,5 de McFarland.
2. Inocular la superficie de una placa de agar con el hisopo pasndolo uniformemente
por toda la superficie en tres direcciones. Por ltimo, pasar el hisopo por el reborde
de la placa de agar. Dejar secar 5 minutos. Colocar los discos de antibiticos sobre la
superficie del agar utilizando unas pinzas estriles y apretndolos suavemente sobre
la superficie del agar. Los discos no deben estar a menos de 15 mm de los bordes de
la placa y lo bastante separados entre ellos para que no se superpongan sus zonas de
inhibicin. Dejar las placas 15 minutos a temperatura ambiente para que comiencen a
difundir los antibiticos.
3. Incubar la placa en posicin invertida a 37C durante 18-24 horas.
4. Medir los dimetros de los halos de inhibicin con una regla.
Ensayo cualitativo: un mismo cultivo se enfrenta a distintas soluciones antibiticas.
Ensayo cuantitativo: un mismo cultivo se enfrenta a un slo antibitico, preparado a
distintas concentraciones.
28
Tomado de http://personales.ya.com/erfac/practi/antibio4.jpg
29
30
3.-La TRANSDUCCION: cuando un virus que infecta una bacteria de forma que el
ADN viral est integrado en el de la bacteria (ciclo lisognico) se escinde del
cromosoma bacteriano (pasa a ciclo ltico) puede llevarse consigo parte del
genoma bacteriano e integrarlo en el cromosoma de una nueva bacteria a la que
infecte.
31
32
B.-Transformacin
1. Dividir la placa de Petri en dos mitades con el marcador de vidrio.
2. Extender con la punta de la pipeta 50 l de las clulas competentes en una
mitad de la placa.
3. Aadir el resto de las clulas sobre el ADN del segundo tubo.
4. Mantener 20 minutos en hielo.
5. Colocar el ADN con las clulas a 42 durante 1 minuto.
6. Poner la mezcla en hielo durante 5 minutos.
7. Incubar las clulas a 37C durante 15 minutos.
8. Extender las clulas transformadas en la segunda mitad de la placa.
9. Incubar 20 horas a 37C
Observacin y discusin de resultados.
Se observar que algunas de las clulas tratadas han adquirido resistencia
a ampicilina como se puede comprobar por la aparicin de colonias en la placa en
que se sembraron.
33
Prctica
9:
AISLAMIENTO
CARACTERISTICAS
DE
UN
34
en la clula) y una vez unido inyecta su ADN de cadena doble en la clula bacteriana.
En el interior de la bacteria este ADN puede o bien integrarse en el cromosoma
bacteriano y sus genes quedan reprimidos, o bien se expresar sus genes y sintetizar
nuevos fagos. En el primer caso se habla de ciclo lisognico y en el segundo de ciclo
ltico.
Objetivo
La presencia de virus pasara desapercibida a no ser por el hecho de que son agentes
infecciosos y que se hacen evidentes a travs de los sntomas de las enfermedades
que producen. El objetivo de la prctica consiste en visualizar la presencia de
bacterifagos a travs de las consecuencias de su ciclo infeccioso.
Material
Dos placas de medio phage base precalentadas a 37C.
Dos tubos de vidrio con 300 l de bacterias Staphylococcus aureus 8325-4
competentes diluidas en phage broth.
10 ml de phage top agar a 55 C.
Eppendorf con 200 l del fago 85 diluido en phage broth.
Pipeta automtica
Pipeta de 5 ml estril
Pipeteador automtico
Metodologa
Tomar un tubo con 300 l de clulas competentes y aadirles 200 l de una dilucin
del fago. Mezclar por agitacin. A partir de aqu, hacer lo mismo con el tubo con 300
l de clulas competentes al que no le hemos aadido el fago.
Incubar 30 min a temperatura ambiente.
Aadir 5 ml de phage top agar a 55 C. IMMEDIATAMENTE mezclar y aadir
sobre la placa de phage base precalentada a 37C.
Dejar solidificar y meter en la estufa a 37C.
35
36
Material necesario.
1. Cultivos puros en agar Sabouraud de:
Candida pseudotropicalis
Saccharomyces cerevisiae
Realizacin
1. Observar el aspecto de las colonias de las dos especies de levaduras.
2. Inocular las placas de agar Sabouraud. A partir de los cultivos puros se
inoculan las dos levaduras en una misma placa de Sabouraud. Para ello se
toma una pequea parte de una colonia aislada y se realizan estras en una
porcin de la placa. Se incuban las placas durante tres das a temperatura
ambiente.
3. Colocar una gota de agua en un portaobjetos limpio y con el asa de siembra
previamente flameada transferir una pequea cantidad del cultivo en medio
slido a la gota. Remover hasta formar una suspensin homognea. Colocar
un cubreobjetos
4. Observacin microscpica de los cultivos. Se emplear el objetivo X10.
37
38
39
Las cpsulas son estructuras inertes no vivas, carentes de papel activo (metablico)
pero que confieren a las bacterias importantes propiedades:
La estructura es a base de una matriz muy hidratada, con una ordenacin regular
radial, o a veces en lminas concntricas. El material capsular se compone de
40
Material
-
Tinta china
Portaobjetos y cubreobjetos
Microscopio ptico
Mtodo
La observacin a microscopa ptica en fresco es difcil, ya que su ndice de
refraccin es similar al del medio. Se recurre a tincin negativa por medio de
nigrosina o tinta china.
1. Colocar una gota del medio con la bacteria en un portaobjetos, aadir una
gota de tinta china y mezclar bien.
2. Colocar suavemente un cubreobjetos sobre la suspensin de clulas con tinta
china. Evitar que se formen burbujas.
3. Colocar los portaobjetos con los cubreobjetos entre dos papeles absorbentes.
Presionar con los dedos sobre el portaobjetos. El exceso de suspensin ser
absorbido por los papeles.
4. Tirar el papel en un contenedor para material contaminado y lavarse las
manos con jabn.
5. Observar al microscopio, se debe de ver la clula teida de negro y la cpsula
en blanco. Trabajar con el diafragma del condensador cerrado para aumentar
el contraste de las clulas.
41
13-A:
42
En esta prctica se asla en medio selectivo OGA que lleva incorporado el antibitico
oxitetraciclina, el cual inhibe de forma eficaz el crecimiento bacteriano.
Material
Muestra
Balanza de precisin
Pipetas automticas de 1 y 0,1 ml
Placas de Petri con medio OGA
Mtodo
1. Aadir con pipetas estriles, a partir de tres de las diluciones decimales (10 -2,
10 -3, 10 -4), 0,1 ml/placa a placas con medio OGA.
2. Incubar durante 5 das a 25 C. Recuento de placas en las que el nmero de
colonias est comprendido entre 30 y 300. Clculo de ufc/gramo.
44
Material
Muestra
Balanza de precisin
Pipetas automticas de 1 y 0,1 ml
Tubos con caldo EC con campana
Tubos con caldo de triptona
Reactivo de Kovacs
Mtodo
1. Siembra de 10 ml de muestra (dilucin 10-1) en 10 ml de caldo EC de doble
concentracin con campana, precalentados a 44C.
2. Incubar los tubos 24-48 horas a 44C.
3. Considerar positivos los tubos que presenten al menos un 10% de gas en la
campana.
4. Confirmar los tubos positivos de EC mediante pase de 0,1 ml a tubos con
caldo de triptona, para realizar la prueba del indol. Incubar los tubos a 44C
durante 24-48 horas.
5. Aadir reactivo de Kovacs para revelar la presencia de indol.
45
13-C:
INVESTIGACIN DE PATGENOS
Su presencia en los alimentos indica que estos pueden ser causa de toxiinfecciones al
ser ingeridos por el hombre.
47
Material
Muestra
Balanza de precisin
Pipetas automticas de 1 y 0,1 ml
Agua de peptona tamponada (BPW)
Placas de Petri con medio XLD
Placas de Petri con medio BGA
Tubos con caldo Mueller Kauffmann tetrationato
Tubos con caldo Rappaport-Vassiliadis Soja
Mtodo
1. Preenriquecimiento: Pesar 25 g del alimento en una bolsa de plstico estril
y aadir 225 ml de agua de peptona tamponada (BPW). Homogeneizar con el
stomacher. Incubar la bolsa 16-18 horas a 37 C.
2. Enriquecimiento en medios lquidos selectivos: Aadir con pipeta estril,
1ml de la muestra preenriquecida a 10 ml de caldo Mueller Kauffmann
tetrationato e incubar a 37 C durante 24 horas. Por separado, aadir 0,1 ml
de la muestra preenriquecida a un tubo con 10 ml de Rappaport-Vassiliadis
Soja en incubarlo a 42 C durante 24 horas.
3. Aislamiento
en
medios
slidos
selectivos:
agitar
los
caldos
de
49
50
14-B RECUENTO
DE
FORMAS
ESPORULADAS
ANAEROBIAS
Material
Muestra
Balanza de precisin
Pipetas automticas de 1
Placas de Petri estriles vacas
PCA fundido para recuento en placa
Medio Schaedler fundido para recuento en placa
Jarra de anaerobiosis
51
AEROBIAS
Mtodo
1. Calentar el tubo de muestra (dilucin 10 -1) a 80 C en el bao durante 10
minutos. Este tratamiento trmico destruye las formas vegetativas pero lo
resisten las esporas.
2. Hacer una dilucin decimal en caldo de peptona del tubo previamente
sometido a calor.
3. Aadir con pipetas estriles, a partir de las diluciones 10 -1 y 10 -2 1 ml/placa a
placas de Petri vacas estriles.
4. Verter en cada placa unos 20 ml de medio PCA fundido y atemperado a 4550 C (para recuento de esporos aerobios) o de medio Schaedler fundido y
atemperado a 45-50 C (para recuento de esporos anaerobios. En este caso
aadir doble capa).
5. Incubar durante 24 h a 37 C. Las placas de anaerobios se incuban en una
jarra de anaerobiosis. Recuento de placas en las que el nmero de colonias
est comprendido entre 30 y 300. Comparacin con el recuento de aerobios
mesfilos. Tincin de Gram y esporas.
52
53
hay que emplear. A no ser que los alimentos hayan sido esterilizados, todos los
productos llevarn microorganismos. En la manipulacin, el envasado y el
almacenaje de los alimentos, estos microorganismos deben mantenerse en todo
momento en niveles que aseguren la calidad microbiolgica del alimento. El objetivo
de los anlisis microbiolgicos de superficies es comprobar el estado higinico del
lugar de trabajo, de modo que evitemos contaminaciones cruzadas durante el
procesado de los alimentos. Existen distintos mtodos para el examen microbiolgico
de las superficies: mtodo del hisopo, de la placa de contacto, de la jeringa de agar,
de la lengeta (o pelcula pegajosa), etc. En esta prctica se describen el mtodo del
hisopo (para el estudio de superficies no planas) y el de placa de contacto Rodac
(para el estudio de superficies planas).
54
55
2. Lavarse las manos con un desinfectante y volver a pasar los dedos por la
mitad restante de la placa.
3. Tomar con un hisopo estril muestra del interior de la nariz y sembrar el
hisopo sobre la placa de Agar Manitol Sal.
4. Incubar durante 24 horas a 37 C.
5. Observar el crecimento de las colonias caractersticas en cada medio de
cultivo: colonias violetas con halo del mismo color en el caso de
Enterobacteriaceae en placas de VRBG y amarillas en el de Staphylococcus
aureus en placas de agar manitol sal (Staphylococcus epidermidis y
Staphylococcus saprophyticus dan lugar a colonias blancas).
56
57
Fermentacin lctica
58
Fermentacin alcohlica
59
PRUEBAS BIOQUMICAS
Prueba del indol: esta prueba se emplea para detectar la presencia de la enzima
triptofanasa en las bacterias y nos permite distinguir E. coli (indol+) de los otros
coliformes (indol-). Esta enzima degrada el aminocido triptfano a indol, que es
el compuesto que se detecta en este ensayo.
Procedimiento: inocular un caldo de triptona + NaCl al 0,5 % (este digerido de
protenas animales es especialmente rico en triptfano) con una colonia. Incubar a
37 C durante 24 horas. Aadir el reactivo de Kovacs: si se produce un anillo de
color rojo en la superficie del caldo, la prueba ser considerada positiva.
El reactivo de Kovacs contiene p-dimetilaminobenzaldehido, que puede
reaccionar tanto con el indol como con el triptfano, produciendo compuestos de
coloracin
rojiza.
Para
evitar
la
interferencia
del
triptfano,
el
p-
60
API (no la cpula) con una pipeta Pasteur. El smbolo significa que el pocillo ha
de llenarse hasta arriba. El signo _ significa que hay que poner vaselina en la
cpula del pocillo. Incubar a 37 C durante 24 horas.
Lectura del API: hay que apuntar en una plantilla en qu pocillos la prueba
correspondiente ha sido positiva o negativa (esto se sabe porque ha habido un
cambio de color, la aparicin de un precipitado, etc.). La prueba de indol y la de
fenilalanina
(Kovacs y
cloruro
frrico
respectivamente). Una vez reveladas las pruebas hay que sumar los nmeros que
hay debajo de los pocillos positivos en la plantilla. Como stos se encuentran
agrupados de tres en tres, finalmente obtenemos una serie de nmeros o cdigo
que nos permitir identificar la bacteria.
61