Universidad de Castilla-La Mancha

Facultad de Ciencias Ambientales y Bioqumica

GRADO DE BIOQUMICA
DEPARTAMENTO DE QUMICA INORGNICA, ORGNICA Y BIOQUMICA

PRCTICAS DE INMUNOLOGA
CURSO 2013/2014

NORMAS DE SEGURIDAD BIOLOGICA

NORMAS
- Est prohibido comer, beber o fumar en los laboratorios de prcticas.
- Est prohibido el uso de dispositivos electrnicos tales como telfonos, PDAs, ordenadores
personales, etc. en los laboratorios de prcticas.
- Est prohibido pipetear con la boca.
- Es obligatorio el uso de bata.
- Es obligatorio el uso de guantes de ltex.
- Es obligatorio lavarse las manos antes de empezar el experimento con el
biolgico (evita contaminaciones) y cuando se sale del laboratorio.

material

- Es altamente recomendable que los alumnos que usan lentillas para corregir la vista, las
reemplacen por gafas durante el desarrollo de las prcticas.
- Todo el material biolgico (clulas y virus, y en especial estos ltimos) debe inactivarse
con leja antes de tirarlo.
- Los cultivos celulares no infectados por virus debern manipularse en las mismas
condiciones de seguridad que aquellos infectados.
- Se debe trabajar siempre con material estril (puntas, botellas,...).
- La mesa se descontaminar antes y despus del trabajo experimental. El material
biolgico derramado debe ser inactivado inmediatamente con hipoclorito.
- A falta de cabinas de seguridad biolgica para todos, se deber trabajar siempre cerca de
la llama.
- El incumplimiento de alguna de estas medias de seguridad supone la salida inmediata del
alumno del aula de prcticas. La violacin sistemtica de las medidas de seguridad
supondr la incapacidad del alumno para terminar sus prcticas de laboratorio y una
calificacin de suspenso en su cuaderno de prcticas, con el consiguiente perjuicio para su
formacin acadmica.
PROCESAMIENTO DEL MATERIAL Y LIMPIEZA
- El material de vidrio debe lavarse con agua/jabn, finalizando con agua destilada para
eliminar las sales.
- Todo material que haya estado en contacto con clulas o virus se debe retirar aadindole
leja, y ponindolo en la zona de material sucio.
- Luz ultravioleta al final del da.
- TODOS LOS DAS, al terminar la prctica, se debe limpiar la mesa con leja y etanol. As
se conseguir tener un ambiente ms propicio para empezar la prctica al da siguiente.
- Lavarse las manos con jabn a menudo. Y, por supuesto, al final de cada da de prcticas.
ANTES DE EMPEZAR
Qu se necesita para entrar en el laboratorio?:
1. Una bata blanca: para proteger la ropa de la contaminacin por sustancias qumicas o
biolgicas.
2. Un guin de prcticas: para seguir adecuadamente las explicaciones del profesor y realizar
las consultas sobre dudas que puedan surgir en el desarrollo de la prctica.

3. Material para escribir: papel y bolgrafo. Es muy posible que en algn momento tengan que
hacerse clculos. Adems, se debe tomar notas segn se vaya realizando la prctica para
presentar el cuadernillo de resultados.
CMO ACTUAR ANTE EL MANEJO DE SUSTANCIAS BIO-PELIGROSAS?
1. Cada da, al comenzar a trabajar se debe poner un papel de filtro limpio en la bancada. Del
mismo modo, cada da al terminar de trabajar se debe tirar el papel de filtro utilizado y dejar la
bancada limpia (si es necesario se pasar papel tissue hmedo para limpiarla).
2. Nunca se bebern ni inhalarn sustancias bio-peligrosas, ni siquiera al pipetear.
3. Al manejar muestras biolgicas (potencialmente peligrosas, como sangre o clulas) o
productos qumicos (colorantes, decolorantes) se debe utilizar guantes para protegerse las
manos.
4. El entorno de trabajo debe ser limpio (bancada con papel limpio y cabina de flujo limpia:
pasando un papel tissue con agua y/o alcohol).
5. Siempre que sea necesario se debe trabajar en ambiente de seguridad (dentro de la cabina
de flujo laminar o en la campana de extraccin).
CMO MANEJAR LOS DESECHOS?
1. Los desechos normales: papeles sucios, plsticos inocuos, etc... se tiran al contenedor de
basura normal.
2. Los desechos peligrosos: tubos y puntas de pipeta que se han utilizado para la sangre y
las clulas se tiran al contenedor de residuos biopeligrosos con el fin de evitar la exposicin
de los compaeros. Las puntas de pipeta usadas NO deben quitarse con los dedos.
CMO EVITAR CONTAMINACIONES?
1. Cada vez que se utilice una pipeta para pipetear cualquier sustancia (medio de cultivo,
sangre, suero, etc...) se desechar en el contenedor para residuos peligrosos. JAMS se
utilizar una pipeta o punta de pipeta 2 veces.
2. No se debe tocar con las manos nunca los bordes de los tubos.
CMO IDENTIFICAR LOS TUBOS Y MUESTRAS?
1. Cada individuo es diferente y las muestras que proceden de l tambin lo son. Se debe
identificar todo aquello en lo que se introduzca muestras de un individuo (tubos, geles, etc...)
de un modo inconfundible.
2. Si a un mismo individuo se le somete a 2 tipos de ensayo diferentes, tambin se tienen que
distinguir los tubos correspondientes.
3. Para la identificacin de muestras se deben utilizar siempre marcadores PERMANENTES y
no bolgrafos normales.
EN CASO DE ACCIDENTE
Las salpicaduras o derrames en la piel intacta deben lavarse inmediatamente con jabn y
agua abundantes.
Informar inmediatamente al encargado de la prctica de forma concisa y clara de incidente
ocurrido.
MANEJO DE LOS EQUIPOS Y APARATOS COMUNES
1. Los equipos que se estn manejando son caros.
2. Se debe tratar el equipamiento de laboratorio con la mxima delicadeza posible.
3. Al acabar de utilizar un equipo se debe recordar que vendr otro grupo detrs, por lo que
se debe ser solidario y dejarlo recogido y limpio, listo para su uso.
4. Ante una duda en la utilizacin de un equipo, SIEMPRE preguntar primero antes de
utilizarlo.
CUADERNILLO DE RESULTADOS
1. Al terminar las prcticas se debe que entregar (en un plazo de 15 das) un cuadernillo de
resultados
2. En dicho cuadernillo tiene que constar:
- Una mnima introduccin de la tcnica.
- Las aplicaciones diagnsticas de la determinacin.
- Un resumen del protocolo que se ha seguido.
3

- Los resultados obtenidos sin omitir los errores experimentales, de clculo o incidencias
ocurridas en el curos de la experimentacin.
- Discusin. Se deben discutir los resultados obtenidos en cada prctica (en trminos tales
como el resultado se considera normal, o el resultado se considera anormal por....).
Tambin si realmente se ha aprendido algo nuevo, y si haber realizado la prctica ayuda a
reforzar los conocimientos tericos de la asignatura.
- Conclusin. Se debe dar una conclusin fundamentada en los resultados experimentales de
cada prctica.
- Respuestas a las preguntas planteadas. Se debe incluir un apartado con las respuestas a
las preguntas planteadas al final de la prctica. Estas respuestas valorarn el nivel de
comprensin de la prctica por el alumno.

CONTENIDO
Prctica 1: Determinacin del grupo sanguneo y Rh.
Objetivo: comprender el concepto de antgenos de superficie y su utilidad en el diagnstico
clnico.
Tcnica: prueba de aglutinacin.
Prctica 2: Tincin de clulas sanguneas
Objetivo: identificar las diferentes poblaciones de clulas del sistema inmune.
Tcnicas: tincin y microscopa. .
Prctica 3: Deteccin y cuantificacin de antgenos en soporte slido
Objetivo: Comprender las reacciones antgeno-anticuerpo y mtodos de cuantificacin de
antgenos.
Tcnica: Enzimo Inmuno Ensayo (ELISA)
Prctica 4: Seminario mtodos diagnsticos en Inmunologa
Anexo I: Glosario de trminos

ORGANIZACIN DE LAS PRCTICAS

El guin debe ser completado por cada alumno.

Plan de trabajo experimental.

Martes, Prcticas 1 y 2.
Mircoles, Prctica 3.
Jueves Seminario.

Material necesario por grupo Prctica ELISA.

1 gradilla de epp.
1 gradilla ELISA
1 caja puntas azules/amarilla
1 juego de pipetas
1 papel de filtro
1 vaso precipitado para el washing buffer
Muestras
4 alcuotas (30l) CAL0, CAL1, CAL2, CAL3, CAL4 y CAL5
8 alcuotas de suero (30l) C:control; A:ayuno; AR: retroalimentadas
8 alcuotas (450l) de stop solution
Ejemplo muestras (x tira)
C,C

A,A AR,AR

BLANK,BLANK (2 GRUPOS)

CAL0,CALO CAL1,CAL1 CAL2,CAL2

CAL3,CAL3

CAL0,CAL0 CAL3, CAL3 CAL4,CAL4 CAL5,CAL5

CAL0,CAL0 CAL2,CAL2 CAL4,CAL4 CAL5,CAL5

Prctica 1. Determinacin de grupo sanguneo y Rh.

A. Introduccin:

Los antgenos presentes en las clulas sanguneas constituyen los grupos sanguneos, que se agrupan en
sistemas, cuya caracterstica fundamental es su transmisin hereditaria independiente.
Todos los antgenos se definen serolgicamente por un mismo principio: reaccin con su anticuerpo
especfico.
En general cuando se habla de grupo sanguneo se hace referencia al grupo eritrocitario, porque fue el
primero en conocerse y es el ms importante en la transfusin sangunea.

Siempre que uno de estos antgenos A1, A2, B, O se halla presente en la membrana eritrocitaria en el
suero existe el anticuerpo recproco.

Los anticuerpos del sistema ABO son, por regla general, naturales, de clase IgM y aglutinantes*. Por
estimulacin con sustancias parecidas qumicamente a los antgenos, por transfusiones o por embarazos, los
anticuerpos del sistema ABO pueden ser tambin inmunes (requieren estimulacin o sensibilizacin previa), del
tipo IgG y son especialmente peligrosos en la enfermedad hemoltica del recin nacido.

Tabla 1. Sistema ABO. Antgenos y anticuerpos.

Antgenos

Anticuerpos
regulares

A1

Anti-B

A2

Anti-B

Anti-A

Anti-A,B

A1B

A2B

Sistema Rhesus, Rh:

Es el sistema de mayor importancia transfusional despus del ABO.
Se divide a los individuos en Rh (D) positivos o Rh (D) negativos. El 85% de la poblacin blanca es Rh
positiva (expresan el antgeno D en los hemates) y el 15% restante es Rh negativa (no expresa el antgeno D).
El sistema Rh es mucho ms complejo, tiene un elevado polimorfismo, se han descrito alrededor de 48
antgenos diferentes.
Los anticuerpos del sistema Rh, sobre todo los anti-D, tienen una gran importancia transfusional. En
general son inmunes y de clase IgG, su produccin se estimula por transfusin o embarazo.
Los anticuerpos del sistema Rh pueden causar reacciones trasnfusionales y enfermedad hemoltica del
recin nacido.
Hasta la aparicin de la inmunoglobulina especfica que permite prevenir la formacin de estos
anticuerpos.

Tabla 2. Distribucin de grupos sanguneos en Espaa (Cruz Roja).

Hemoterapia:
La mayora de las donaciones de sangre se fraccionan en sus componentes: hemates, concentrado de
plaquetas, plasma y crioprecipitado (rico en fibringeno y factor von Willebrand). Dicho fraccionamiento
permite administrar al paciente slo el componente que requiere en la concentracin adecuada y aplicar a cada
componente las condiciones ptimas de conservacin, que difieren para cada uno de ellos.

Transfusin de hemates:
Su objetivo principal es mejorar la capacidad de transporte de oxgeno de la sangre, prevenir o corregir
la hipoxemia. La indicacin ha de ser clnica y analtica, y no slo de sta ltima, ya que la tolerancia a la anemia
depende de mltiples factores, como la rapidez de instauracin, edad del paciente o la coexistencia de otras
enfermedades.

Transfusin de plaquetas:
Puede tener una finalidad teraputica o profilctica. Con fines teraputicos est indicada siempre que
exista una hemorragia debida a trombopenia.
Con intencin profilctica est indicada sobre todo en cirugas, con el fin de mantener durante un
perodo determinado un incremento de la cifra de plaquetas para que prevenga una hemorragia espontnea.

Plasma:
El plasma se congela inmediatamente despus de la extraccin. Su indicacin principal es la de reponer
los factores de la coagulacin en pacientes con deficiencias adquiridas o congnitas. La compatibilidad es con
respecto a los anticuerpos presentes en el plasma. As un paciente del grupo A ser trasfundido con plasma

B. Determinacin del grupo sanguneo ABO.

El grupo sanguneo ABO puede determinarse por dos procedimientos: el grupo hemtico y el grupo
srico.
Los resultados obtenidos por ambos procedimientos deben coincidir y cualquier discrepancia debe ser
investigada a fondo y resuelta antes de efectuar una transfusin.
Grupo hemtico:
Para determinar el grupo hemtico de un paciente, se enfrentan sus hemates con antisueros
especficos: anti-A (de donantes del grupo B); anti-B (de donantes del grupo A), anti A-B (donantes grupo O).
Observamos si hay o no aglutinacin (VER ANEXO I). Se puede hacer en porta o en tubo.

Segn el modelo especfico de reacciones podremos identificar los antgenos ABO de los hemates del
paciente.

*****Un receptor puede ser transfundido con sangre de un donante que no sea del grupo ABO
idntico, siempre que sea compatible desde el punto de vista de este sistema. Por ejemplo, los individuos cuyo
fenotipo sea AB se denominan receptores universales, ya que en su plasma no contienen anti-A ni anti-B y
pueden por tanto, recibir sangre de cualquier grupo del sistema ABO.
Los individuos del grupo O son llamados donantes universales porque sus hemates al carecer de
antgenos A y B pueden ser transfundidos a cualquier receptor independientemente de su grupo sanguneo
ABO.
Es preferible transfundir sangre isogrupo siempre que sea posible.

Grupo ABO receptor

Donante ABO compatible

A, O

B, O

AB

A, B, AB, O

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Determinacin del Rh:

Para la determinacin de Rh se enfrentan los hemates problema con el suero anti-D. Los hemates que
presentan resultado positivo con dicho antisuero son los Rh positivos. En la determinacin de Rh no puede
realizarse el grupo srico pues no necesariamente un individuo Rh negativo tiene anticuerpos antiD en el suero,
los tendr post transfusin de sangre positiva o en caso de mujer sensibilizada por embarazo.

C. PRINCIPIO DEL MTODO

El reactivo provocar una aglutinacin directa de los hemates que lleven el correspondiente antgeno
ABO.
La no aglutinacin indica en general la ausencia de antgenos ABO.
Muestras: sangre.

Material: lancetas, guantes, puntas de pipeta, bandeja grupo, bata de laboratorio, kit antisuero.

I. Mtodo en Porta-bandeja (el compaero/a)

1. Depositar en un porta identificado: 1 volumen del reactivo Anti-ABO y 1 volumen de la suspensin de
hemates
2. Utilizando un stik aplicador limpio, mezclar el reactivo y las clulas en una rea de unos 20 x 40 mm.
3. Inclinar lentamente el portaobjetos de atrs a delante durante 30 segundos, ocasionalmente con un periodo
adicional de mezcla de 2 minutos, manteniendo el porta a temperatura ambiente.
4. Leer macroscpicamente tras 2 minutos y no confundir las fibras de fibrina con la aglutinacin.
5. Cualquier reaccin dbil debe ser repetida con la tcnica en tubo.

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II. INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOS

1. Positivo: La aglutinacin constituye un resultado positivo, indica la presencia apropiada de antgeno ABO en
los hemates.
2. Negativo: La ausencia de aglutinacin de hemates constituye un resultado negativo, indica la ausencia del
antgeno apropiado ABO en los hemates.
3. Discrepancias: Si no existe correlacin entre los resultados obtenidos con el grupo directo y el grupo inverso,
es preciso realizar ms pruebas.

ANEXO I. Aglutinacin.

Sensibilizacin: proceso mediante el cual el Anticuerpo se une al Antgeno en la superficie del hemate.

Aglutinacin: cuando el Ac. fijado se una a los hemates adyacentes formando grumos. Los hemates
debern estar suficientemente prximos.

La sensibilizacin por IgG no produce aglutinacin debido a que la molcula es demasiado pequea para
cubrir la distancia entre hemate y hemate.

La molcula de IgM puede causar la aglutinacin con facilidad.

Prctica 2. Tincin de clulas sanguneas.

Objetivo: Realizacin de frotis sanguneo y posterior tincin. Identificacin de las distintas clulas de
sangre perifrica y descripcin de las principales caractersticas. Resolucin de cuestiones y dudas.

Frotis sanguneo: es la extensin de sangre realizada sobre un portaobjeto y a partir de la cual se

observarn, al microscopio, las caractersticas de las clulas sanguneas.

Usos: Es un anlisis rutinario que acompaa a todo hemograma.

Proporciona valiosa informacin en casos como las leucemias, deficiencias de hierro, trastornos
genticos de la forma de los eritrocitos, posibles deficiencias de vitamina B12, etc.

A. Tcnica para la realizacin de un frotis:

1. Con la lanceta estril realizar una puncin en un pulgar

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2. Depositar una gota de sangre al principio y en la parte central de un portaobjetos muy limpio (libre
de pelusas y grasa).
3. Con otro portaobjetos (tomarlo lateralmente entre las yemas de los dedos) deslizarlo sobre toda la
superficie del porta de manera que se pueda obtener una fina pelcula de sangre. El inicio del frotis se denomina
cabeza y la parte final del frotis se denomina cola.
4. Esperar a que se seque la extensin, dejarla sobre el papel de filtro de la poyata, con la zona donde
est la muestra mirando hacia arriba.

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B. Procedimiento de Tincin:
1.Introduccin:

Con el fin de estudiar satisfactoriamente los frotis sanguneos, es necesario colorearlos.

En la mayora de los laboratorios los colorantes ms empleados para la tincin hematolgica se basan
en el de Romanowsky constituido fundamentalmente con la mezcla de eosina (cido) y azul de metileno
(bsico).
Tanto la eosina como el azul de metileno son muy sensibles a las variaciones de pH de las diferentes
estructuras celulares, de forma que las que tienen carcter bsico fijan la eosina mientras que las que poseen
propiedades cidas fijan principalmente el azul de metileno.
Esto explica que las estructuras basfilas se tian de color azul mientras que los componentes acidfilos
adquieren un color rosado. La diferente afinidad de ciertas granulaciones citoplasmticas por dichos colorantes
permite clasificar a los leucocitos polimorfonucleares en 3 grupos:

Granulocitos eosinfilos, en los que la granulacin especfica contiene sustancias de carcter bsico que
fijan los colorantes cidos y se tien de color rojo-naranja.

Granulocitos basfilos, en los que la granulacin especfica posee sustancias de carcter cido que fijan
los colorantes bsicos y se tien de color azul oscuro.

Granulocitos neutrfilos, en los que la granulacin especfica posee compuestos de carcter neutro por
lo que fijan ambos colorantes simultneamente, de ah que se tien de color pardo.

Dentro del grupo de colorante tipo Romanowsky los ms utilizados son el de Wright, Giemsa y MayGrnwald-Giemsa, entre otras. En la prctica vamos a realizar esta ltima.

2.Tincin de Pappenheim o tincin panptica de May-Grnwald-Giemsa.

Es el resultado de combinar la tincin de Giemsa con la de May-Grnwald, con el fin ltimo de combinar
las ventajas de dichos colorantes.

Fundamento:
Se basa teir con solucin de May Grunwald formada por eosinato de azul de metileno en alcohol metlico, la
que
fija
el
extendido
y
tiene
afinidad
por
los
citoplasmas.
Luego se agrega el colorante Giemsa diludo (en el momento de realizarse la coloracin). Esta constituido por
Azures que son derivados por oxidacin del azul de metileno. Tiene afinidad por los ncleos y ciertas
granulaciones.
En
esta
coloracin
se
trabaja
a
pH
neutro
o
ligeramente
alcalino
Si se trabaja a pH cido, habr mayor cantidad de sustancias cargadas positivamente y se absorber mayor
cantidad
de
eosina.
Las
extensiones
adquieren
una
tonalidad
rojiza.
Si el pH es muy bsico, habr mayor fijacin de azul de metileno y se exagerarn los colores azules.

Materiales:
Lancetas, portas, cubres, pinzas, guantes, papel de filtro.

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Aceite de inmersin, frasco lavador agua destilada.

Microscopio *40 ,*100.
Colorante de Giemsa.
Colorante de May-Grnwald
Metanol

Tcnica:
Realizar frotis y dejar secar unos 2-3 minutos.
Transferir a una dilucin de May-Grnwald diluida en agua destilada o con PBS (1:1) preparada
extemporneamente y dejar en reposo durante 5 minutos.
Lavar en vaso con agua, sumergir el frotis en la solucin de Giemsa preparada, diluda entre 1/10-1/20,
extemporneamente durante 15 minutos.
Lavar el frotis con agua.
Secar el frotis al aire y una vez seco est listo para su observacin al microscopio.
Interpretacin de resultados:

Esta preparacin proporciona una amplia gama de colores. Los hemates se tien de una tonalidad
color prpura con una zona central ms clara.

Los linfocitos se tien de violeta. El citoplasma de los monocitos aparece de un color ligeramente
azulado.

Las granulaciones de los eosinfilos son rojo-anaranjado. Las granulaciones de los basfilos son violeta
oscuro a negro, mientras que los grnulos neutrfilos rojo-prpura bastante claros.

Las plaquetas prpura.

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En la figura 1 y 2 se representan los distintos tipos de clulas sanguneas que vamos a observar.

Figura 1.

Figura 2.

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Cuestiones planteadas:

1. Caso: Paciente crtico-accidente de trfico que llega a urgencias y es trasladado

rpidamente a quirfano. Llaman al laboratorio de banco de sangre solicitando
transfusin de hemates de mxima urgencia. Razona por qu a este paciente se le
trasfunden hemates no isogrupo.
2. En qu consiste incompatibilidad sangunea materno-fetal?

3. Paciente embarazada grupo AB negativo y su pareja A positivo. En relacin al posible

grupo del recin nacido deduce si es necesaria alguna medida preventiva a adoptar
por parte de la madre y por qu.

4. Cmo se observa el citoplasma de un monocito, linfocito y granulocito? Color de las

plaquetas. Proporcin de clulas sanguneas en sangre perifrica.

5. Por qu utilizamos un tampn a 7.2?

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Prctica 3. Deteccin y cuantificacin de antgenos en soporte slido: Tcnica: Enzimo

Inmuno Ensayo (ELISA).
Conceptos: La tcnica inmunolgica denominada ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent
Assay) es un poderoso test, basado en el uso de anticuerpos, que se emplea para detectar
agentes patgenos que provocan enfermedades como el SIDA y el SARS, o para buscar
trazas de patgenos en el agua, en alimentos, o en el aire, cuando aparezcan estos agentes
de forma natural o como consecuencia de contaminacin intencionada de estos medios. La
tcnica ELISA tambin se utiliza para identificar organismos genticamente modificados
(GMOs), o para rastrear la presencia de alrgenos alimentarios, marcadores moleculares de
embarazos, o de drogadiccin, etc.
Mediante el uso de anticuerpos especficos podemos reconocer posibles antgenos
procedentes de organismos patgenos con una altsima especificidad. Como balas mgicas,
los anticuerpos localizan y se pegan a las molculas diana. Al pegarse a estas molculas
forneas, los anticuerpos los convierten en reconocibles para las clulas del sistema inmune.
Los anticuerpos constituyen una herramienta muy til y por ello se usan en biotecnologa y en
diagnstico de enfermedades y su tratamiento.
Para la siguiente prctica, vamos a utilizar un Kit comercial especialmente diseado
para la rpida deteccin de insulina. En nuestro caso, vamos a cuantificar los niveles de
insulina en plasma de rata. La tcnica del ELISA admite diferentes variantes: identificar un
antgeno dado o identificar la presencia de anticuerpos especficos contra un antgeno dado.
Utilizar diferentes reactivos de deteccin del ensayo, como fosfatasa alcalina o peroxidasa.
Por tratarse de un Kit ya preparado, simplemente se proceder a seguir detalladamente las
instrucciones dadas por la casa suministradora.
Introduccin:
Las siglas ELISA significan: Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ensayo inmunosorbente ligado a enzimas ms simplemente: enzimo-inmuno-ensayo: EIA).
Este ensayo se utiliza para multitud de determinaciones diagnsticas, para la
cuantificacin de un antgeno (o un anticuerpo) en diferentes fluidos fisiolgicos o cultivos de
laboratorio. Permite identificar protenas gracias a la especificidad de la unin AntgenoAnticuerpo. Los inmuno-complejos empleados en esta tcnica estn unidos a una superficie
plstica, lo que permite el lavado y la adicin secuencial de diferentes reactivos. Este tipo de
ensayo es rpido, sencillo y fcilmente adaptable a analizadores automticos en el
laboratorio. Dada su elevada sensibilidad, los reactivos deben estar altamente purificados y
casi siempre se utilizan anticuerpos monoclonales en el proceso.
Hay mltiples variantes del mtodo que se utilizarn dependiendo de lo que queremos
cuantificar. El mtodo indirecto se suele utilizar cuando vamos a cuantificar anticuerpos
especficos en un suero. Cuando lo que se va a cuantificar es una protena srica (no
anticuerpo) el mtodo de eleccin es el ELISA en sndwich.
El mtodo indirecto se resume en:

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1) En placas de 96 pocillos de un plstico especial, al que se pueden pegar protenas

se pega un antgeno determinado, frente al que queremos medir la presencia o ausencia
de anticuerpos en un determinado paciente.
2) Se aade el suero del paciente en estudio: si hay anticuerpos dirigidos frente al
antgeno en cuestin, quedarn unidos a l. Si no los hay, no se producir el complejo
antgeno-anticuerpo. Se lava para retirar las protenas no adheridas al antgeno.
3) Se aade un anticuerpo secundario, monoclonal o policlonal (normalmente de ratn
o conejo) que lleva una enzima conjugada a l. Es un anticuerpo anti-Inmuno-globulinas
humanas. Si hubo anticuerpos en el suero del paciente, este anticuerpo 2 se quedar unido
a ellos . Si no haba anticuerpos en el suero del paciente, no se va quedar unido este
segundo anticuerpo. En el caso de que se haya adherido a un anticuerpo no especfico del
antgeno, el complejo se eliminar al lavar. Se lava para retirar las protenas no adheridas al
antgeno.
4) Se aade una sustancia qumica que sea sustrato de la enzima conjugada al
anticuerpo 2. El enzima actuar sobre dicho sustrato en una reaccin qumica que generar
una sustancia coloreada. As, si hay color en el pocillo, la reaccin es positiva; si no lo
hay, la reaccin es negativa. Adems, se puede cuantificar la cantidad de color, que ser
proporcional a la cantidad de anticuerpo especfico que tena el paciente frente al antgeno
que hayamos pegado al plstico. Es pues, una tcnica cuantitativa.
En la prctica diaria, esta tcnica se utiliza como ensayo de primera lnea para detectar
la presencia de anticuerpos anti-HIV. Tambin se utiliza para detectar la produccin de
citocinas, detectar infecciones por virus o bacterias, as como la presencia de diferentes
auto-anticuerpos en pacientes con enfermedades auto-inmunes.
Dicho antgeno es fijado
los pocillos de la microplaca.

Los
pocillos
son
incubados
con muestras de suero del
paciente, con lo que
se
permite
la
unin
de
los
anticuerpos presentes
en
el
suero con los antgenos de la
placa.
Se lava, arrastrndose
as el resto de los anticuerpos que
no reaccionaban frente
al antgeno y manteniendo solamente fijados
en la placa los complejos antgeno-anticuerpo formados.
La unin de los anticuerpos es detectada con un segundo anticuerpo anti-Ig
humana que est marcado enzimticamente.
Despus de otro lavado, los pocillos son incubados con un sustrato para el enzima
Por ltimo la reaccin enzimtica (aparicin del producto) es detectada mediante el
espectofotmetro.

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Principio del ensayo: ELISA en sandwich

La tcnica que utilizaremos para determinar la cantidad de protenas especficas ser
el test de ELISA (Enzyme-Lynked Inmunospecific Assay), tambin denominado
inmunoenzimoensayo (EIA). Se trata de un ensayo serolgico que permite identificar
inmunocomplejos por medio de enzimas unidas al antgeno o anticuerpo, estando uno de
ellos adsorbido a un soporte slido (placa de poliestireno). La reaccin antgeno-anticuerpo se
detecta mediante la utilizacin de una enzima conjugada qumicamente al antgeno o
anticuerpo. La enzima convierte un sustrato incoloro (tras aadirlo) en un producto coloreado,
cuyo color es proporcional a la cantidad de inmunocomplejos formados.
El ELISA se basa en dos puntos claves:
La especificidad de la unin antgeno-anticuerpo
La capacidad de unir covalentemente enzimas al anticuerpo sin afectar la
capacidad de unin de ste al antgeno, ni inhibir la actividad del enzima.
Las enzimas ms utilizadas para la deteccin son la peroxidasa y la fosfatasa alcalina,
que producen productos coloreados que pueden ser cuantificados usando un
espectofotmetro. Para aumentar la sensibidad del anlisis se pueden utilizar enzimas que
den productos con quimioluminiscencia o aplicar el conjugado biotina/avidina.
Estos anlisis tienen la ventaja de ser muy sensibles, rpidos, sencillos y fcilmente
adaptables a modalidades automticas pero requieren una alta purificacin del antgeno,
anticuerpo o ambos, para poder realizarlos.

Aplicaciones
La determinacin de la presencia en suero de anticuerpos frente a determinados
antgenos nos es muy til en el diagnstico de enfermedades infecciosas (como el SIDA o la
hepatitis B) o enfermedades autoinmunes (como el lupus eritematoso o la artritis
reumatoide).

20

Tambin se usa para determinar si un sujeto ha estado o no expuesto a un

microorganismo o sustancia, y prever as la posible respuesta a transplantes, donaciones
de sangre, embarazo (incompatibilidad Rh materno-fetal), alergia o infecciones.
Vdeo demostrativo:
http://www.bio-rad.com/LifeScience/jobs/2004/04-0522/04-0522_ELISA.html

Objetivos didcticos:

Aprender sobre las interacciones antgeno-anticuerpos.

Entender cmo detectar y cuantificar protenas en el laboratorio.

Aprender cmo se diagnostican agentes patgenos con esta tcnica.

Entender cmo se producen en el laboratorio los anticuerpos para uso diagnstico.

Estudiar la unin enzima-sustrato.

Mtodo:
1. Seguir el protocolo del kit
2. Grupo A
Subgrupos 1,2,3,4,5,6,7,8 y 9.
2. Grupo B
Subgrupo 1,2,3,4,5,6,7,8 y 9.
2. Grupo C
Subgrupo 1,2,3,4,5,6,7 y 8.
Muestras
Subgrupo 1: muestras en duplicado (control, refeeding, ayuno, y ?)
Subgrupo 2: muestras en duplicado (control, refeeding, ayuno, y ?)
Subgrupo 3: muestras en duplicado (control, refeeding, ayuno, y ?)
Subgrupo 4: muestras en duplicado (control, refeeding, ayuno, y ?)
Subgrupo 5: muestras en duplicado (Calibrador 0, 1, 2, 3)
Subgrupo 6: muestras en duplicado (Calibrador 0, 1, 2, 3)
Subgrupo 7: muestras en duplicado (Calibrador 0, 1, 2, 3)
Subgrupo 8: muestras en duplicado (Calibrador 2, 3, 4, 5)
Subgrupo 9: muestras en duplicado (Calibrador 2, 3, 4, 5)

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RESULTADOS PRCTICA 3.
Calcula las concentraciones de insulina en el plasma analizado a partir de la curva
patrn generada en el experimento.

CUESTIONES
1.

Cmo tendramos que haber procedido para detectar anticuerpos en vez de

antgenos?

2.

Si trabajaras en un hospital Se te ocurre algn test extra antes de decirle, por

ejemplo, a un paciente que tiene una infeccin viral?

3.

Consideras que la tcnica es cualitativa o cuantitativa?

4.

Explica la finalidad de cada uno de los controles utilizados. Por qu hacer el

experimento por duplicado?

5.

Determina y representa la curva patrn. Determina la pendiente de la curva,

interseccin con el eje y el coeficiente de correlacin de Pearson.

6.

A partir de la curva patrn, estable la concentracin de insulina en las muestras

de plasma.

7.

En funcin de los resultados obtenidos de las muestras biolgicas, cmo

afectan los niveles de glucosa y estado de alimentacin a los niveles de
insulina en plasma?

8.

Segn los valores obtenidos en las muestras de control, ayuno y re-alimentacin,

En qu categora incluiras a las muestras problema?

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ANEXO I (glosario de trminos)

Sensibilizacin: proceso mediante el cual el Anticuerpo se une al Antgeno en la
superficie del hemate.
Aglutinacin: cuando el Ac. fijado se una a los hemates adyacentes formando
grumos. Los hemates debern estar suficientemente prximos.
La sensibilizacin por IgG no produce aglutinacin debido a que la molcula es
demasiado pequea para cubrir la distancia entre hemate y hemate.
La molcula de IgM puede causar la aglutinacin con facilidad.
Frotis sanguneo: es la extensin de sangre realizada sobre un portaobjeto y a partir
de la cual se observarn, al microscopio, las caractersticas de las clulas sanguneas.
Usos: Es un anlisis rutinario que acompaa a todo hemograma.
Proporciona valiosa informacin en casos como las leucemias, deficiencias de hierro,
trastornos genticos de la forma de los eritrocitos, posibles deficiencias de vitamina B12, etc.
El coeficiente de correlacin de Pearson es un ndice que mide la relacin lineal
entre dos variables aleatorias cuantitativas. A diferencia de la covarianza, la correlacin de
Pearson es independiente de la escala de medida de las variables.

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