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08 Espectrofotometría
08 Espectrofotometría
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p
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a
s
t
o
Carotenoides
Clorofila b
Clorofila a
Espectros de absorcin de
tres pigmentos fotosintticos
cloroplastdicos.
Observar que un compuesto
puede tener ms de un pico
de absorcin (
max
).
Longitud de onda (nm)
Efecto del pH en la absorcin de HNTS.
Espectros 1 y 2 en medio cido (mximo de
absorcin a 370 nm); espectros 3 y 4 en
medio bsico (mximo a 410 nm).
Desplazamiento del mximo de absorcin y
descenso de absorbancia cuando el HNTS se
incuba con H
2
O
2
a distintos tiempos (0, 5, 10 y
15 minutos).
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Para obtener una curva de calibrado de un compuesto se preparan soluciones
de diferentes concentraciones del mismo, determinndose para cada una de
ellas el valor de absorbancia a
max
. Estos valores de absorbancia se
representan en el eje de abscisas (eje de x) y los de concentracin en el eje de
ordenadas (eje de y). Se observar que, a bajas concentraciones, el aumento de
concentracin se corresponde con un incremento lineal en la absorbancia (zona
de cumplimiento de la ley de Lambert-Beer). A concentraciones altas la
linealidad se pierde y se observa que la lnea se aplana, por lo que las medidas
son poco fiables.
La representacin de Lambert-Beer, A =cl, nos permitir calcular el valor
del coeficiente de extincin molar, que corresponde a la pendiente de la recta.
1.6. Objetivos
Espectos de absorcin
Se van a realizar espectros de absorcin de distintas sustancias para
determinar su
max
y comprobar que un cambio en la estructura de la molcula,
por ejemplo su reduccin, supone una modificacin en su espectro.
Ley de Lambert-Beer
Se aplicar la ley de Lambert-Beer y tras hacer una recta de calibrado para
dos sustancias, se calcular grficamente el valor de los correspondientes
coeficientes de extincin molar.
Determinaciones colorimtricas especficas de compuestos
Se aplicarn reacciones especficas para la determinacin colorimtrica de
sustancias.
2. LISTADO DEL MATERIAL NECESARIO
2.1. Material de uso general
Espectrofotmetro.
Agitador de tubos de ensayo.
Balanza.
pHmetro.
Tijeras
2.2. Material para cada grupo
Gradillas con tubos de ensayo.
J uego de pipetas (0.5, 1.0, 2.0, 5.0, 10.0 y 25.0 ml).
Prepipetas (dos juegos).
Probetas (100 y 250 ml).
Vasos de precipitado (100 y 500 ml).
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Frasco lavador con agua destilada.
Recipientes para muestras biolgicas de 50 ml.
Papel de filtro.
Papel de parafilm.
Rotulador para vidrio.
Pipetas Pasteur de plstico (cuatro).
Guantes de latex.
Cubetas de plstico para medir en el espectrofotmetro.
2.3. Reactivos
Espectos de absorcin
Solucin de p-nitrofenol 0,20 mM en agua destilada.
Solucin de NaOH 0,50 N.
Solucin de p-nitrofenol de concentracin desconocida.
Solucin de flavn mononucletido (FMN) 0,25 M en agua destilada.
Ditionito sdico.
Determinacin colorimtrica de glucosa y nitrito mediante reacciones
especficas
Glucosa
Glucosa oxidasa
Peroxidasa
Fenol
4 amino-antipirina
Tampn fosfato
Nitrito potsico
Sulfanilamida
Dicloruro de N-naftol-1-etilendiamino
cido clorhdrico
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