79

Lesin y Supervivencia de las Clulas ? Pancreticas El Islote Pancretico en el Desarrollo y Tratamiento de la Diabetes
AUTORES
Anna Novials Sard*
Slvia Casas Fontdevila**
*Endocrinloga. Investigadora bsica. Fundaci Sard Farriol
**Investigadora bsica. Fundaci Sard Farriol
CAPTULO 5
Amilina y Toxicidad
Beta Pancretica

80
El Islote Pancretico en el Desarrollo y Tratamiento de la Diabetes
1. Amiloide pancretico
Amiloidosis engloba un grupo de entidades clnicas caracterizadas por el depsito
extracelular de protenas de estructura fibrilar en rganos y tejidos. Algunas formas
de amiloidosis fueron consideradas como un fenmeno inespecfico asociado al
proceso de envejecimiento. No obstante, el aumento de la longevidad y la mejor
definicin clnica de las enfermedades crnicas han demostrado que el depsito de
amiloide puede ser especfico para determinadas enfermedades, como son las pla-
cas de amiloide en el tejido nervioso de la enfermedad de Alzehimer o el amiloide
pancretico en la diabetes mellitus tipo 2 (DM2). El trmino amiloide fue introdu-
cido por Virchow en 1853, basndose en las propiedades tintoriales de los depsi-
tos amorfos en las secciones histolgicas: los rganos infiltrados adquiran colora-
cin negruzca al ser tratados con yodo, de forma anloga al almidn (del griego
amylos, almidn).
A pesar que cada tipo de amiloidosis se caracteriza por la agregacin y deposicin
de una protena fibrilar especfica, los depsitos de sustancia amiloide comparten
caractersticas histoqumicas y una morfologa estructural parecida. En primer lugar,
durante el proceso de formacin, aparecen oligomeros solubles del componente pro-
teico, los cuales pasan a adoptar una estructura secundaria en conformacin beta, lo
que significa que las cadenas polipeptdicas estn dispuestas en lminas plegadas,
unidas transversalmente mediante enlaces de hidogeno intercatenarios. La presencia
de una estructura cuaternaria se muestra con un aspecto tpico al microscopio elec-
trnico, en la que la sustancia amiloide est constituida por agregados fibrilares rgi-
dos, lineares no ramificados, de 7-10 nm de dimetro y de longitud variable. Todos
los depsitos de amiloide, independientemente de la protena especfica formadora
de fibras, contienen protenas comunes, como la glucoprotena denominada SAP
(serum amyloid P component), los componentes del complemento C1q y C3, la apo-
protena E y los proteoglicanos del tipo heparn sulfato.
La presencia de depsitos de sustancia amiloide en los islotes pancreticos es una
caracterstica fisiopatolgica en la diabetes mellitus tipo 2, que se ha descrito en
mas del 90% de las necropsias de los pacientes afectos de dicha enfermedad. Estos
depsitos fueros originalmente descritos por Opie en 1900, pero debido a su eleva-
da insolubilidad que dificultaba el anlisis de los compuestos qumicos, se pens
errneamente que consistan en depsitos de insulina. Fue en 1986 cuando
Westermark et al. (1) aislaron el principal componente proteico a partir de un insu-

linoma pancretico, siendo purificado y secuenciado parcialmente. En 1987,
Cooper et al. (2) identificaron un pptido idntico en extractos de tejido pancreti-
co rico en amiloide procedente de pacientes diabticos. Se trataba de una protena
de 37 aminocidos, sintetizada y secretada por las clulas beta pancreticas, llama-
da amilina o IAPP (islet amyloid polypeptide).
2. Amilina: sntesis, secrecin y funciones
biolgicas
La amilina presenta homologa estructural del 43 y 46%, respectivamente, con los
neuropptidos CALCA y CALCB (calcitotnin gene-related polypeptides), sinteti-
zados por las clulas C de la glndula tiroides. Los tres pptidos tienen longitud
idntica, residuos de cistena en la posicin 2 y 7, y presentan dos modificaciones
postraduccionales homlogas (amidacin del residuo carboxiterminal y un puente
disulfuro intramolecular). Ms del 80% de la secuencia de la amilina presenta un
alto grado de conservacin entre diferentes especies de mamferos, lo que sugiere
puede tener una significativa funcin biolgica.
La amilina es sintetizada en la clula beta a partir de un precursor proteico de 89 ami-
nocidos, la preproamilina. En el retculo endoplasmtico se realiza la escisin prote-
oltica de la secuencia de 22 aminocidos del pptido seal, liberndose la proamili-
na de 67 aminocidos. Las modificacioes postraduccionales para formar la amilina
madura incluyen perdida de los propptidos aminoterminal (11 aminocidos) y car-
boxiterminal (19 aminocidos) por enzimas proteasas convertasas (NEC2 y NEC1/3)
responsables tambin del procesamiento de la proinsulina. En el extremo carboxiter-
minal, la seal dibsica est procedida de una glicina, lo que permite la amidacin de
la tirosina en la posicin 37 de la amilina madura. Modificaciones adicionales inclu-
yen la formacin de un puente disulfuro entre los residuos 2 y 7 de cistena.
La amilina se localiza juntamente con la insulina en los grnulos secretores de las
clulas beta pancreticas. Existen evidencias en humanos de que se secreta juntamen-
te con la insulina en condiciones basales y en respuesta tanto a la glucosa como a dife-
rentes estmulos secretagogos. Experimentos in vitro con islotes humanos aislados
han demostrado que la regulacin del gen de amilina depende de las concentraciones
de glucosa y de las seales derivadas de su metabolismo de una forma similar al gen
81
Amilina y Toxicidad Beta Pancretica

de la insulina (3,4). En la mayora de condiciones, los cambios de secrecin de la ami-
lina se producen de forma paralela a los cambios en la secrecin de insulina, consti-
tuyendo aproximadamente una relacin equimolar entre 1/20 y 1/50. Entre sus accio-
nes biolgicas para algunas de las cuales se han descrito receptores especficos, des-
taca la inhibicin de la secrecin de glucagon, el estmulo sobre el eje renina-angio-
tensina, el retraso del vaciamiento gstrico, y la inhibicin sobre los centros hipotal-
micos reguladores del apetito. Algunas de estas acciones se estn estudiando como
tratamiento coadyuvante de la insulina para ciertos casos de diabetes.
3 Factores determinantes para la formacin
del depsito de amiloide en la DM2
A pesar de que ms del 80% de la secuencia de la amilina presenta un alto grado
de conservacin entre diferentes especies de mamferos, nicamente humanos, pri-
mates y gatos expresan una forma de amilina capaz de formar depsitos de sustancia
amiloide. Los residuos 20-29, localizados en el centro de la secuencia de aminoci-
dos de la amilina, presentan un mayor grado de variabilidad entre especies, y son cr-
ticos para la formacin de la estructura secundaria beta. En esta regin, tres residuos
de prolina estn presentes en la amilina de rata y ratn. Puesto que la prolina inhibe
el cambio a conformacin beta, la presencia de tres residuos de prolina en sta regin
crtica de la amilina prevendra de la formacin de lminas beta plegadas necesarias
para la creacin de fibras amiloides y explicara la ausencia de amiloidosis pancre-
tica en roedores. sta hiptesis ha sido demostrada en experimentos donde se substi-
tuyen aminocidos en la regin 20-29 de la amilina humana, vindose modificadas
las propiedades amiloidognicas del pptido. En este sentido, se iniciaron estudios
genticos poblacionales en busca de mutaciones en el gen de la amilina que pudieran
dar origen a cambios crticos en la secuencia del pptido, y que pudieran explicar la
presencia de depsitos de amiloide en individuos diabticos. La mutacin S20G fue
descrita en poblacin japonesa en el 4% de pacientes con diabetes mellitus tipo 2.
Estudios in vitro confirmaron que, la substitucin de serina en la posicin 20 por gli-
cina de la molcula de amilina mutada, otorga mayor potencial amiloidognico. No
obstante, esta mutacin no ha sido detectada en otras poblaciones estudiadas de ori-
gen caucsico.
La presencia de depsitos de amiloide es excepcional en individuos sanos no diabti-
82
El Islote Pancretico en el Desarrollo y Tratamiento de la Diabetes

cos. Por tanto, la secuencia crtica amiloidognica de la amilina es necesaria, pero no
suficiente, para la formacin de tales depsitos en los islotes pancreticos de pacien-
tes con DM2. En consecuencia, otros factores estaran involucrados en el proceso de
amiloidognesis para explicar la frecuente asociacin entre amiloide y DM2.
En condiciones fisiolgicas, la amilina no forma fibras de amiloide, sugiriendo que
deben existir mecanismos en la clula beta pancretica que mantengan la estructura
nativa de la amilina. El nivel de pH y la concentracin de calcio estn altamente con-
trolados en el granulo de secrecin para permitir el correcto trfico y maduracin de
la insulina y amilina. Alteraciones en ambos parmetros se han relacionado con ano-
malas en el proceso de formacin de amiloide. Parece que un ambiente normal den-
tro del grnulo de secrecin mantiene la amilina en forma soluble no fibrilar.
Asimismo, estudios in vitro sugieren que una proporcin molar normal entre amilina
e insulina, proinsulina o pptido C protegera de la formacin de fibras de amiloide,
puesto que insulina y amilina pueden formar complejos estables que impiden el cam-
bio a conformacin beta. Alteraciones en cualquiera de estos componentes del grnu-
lo de secrecin, que bien se puede dar en una situacin de disfuncin de la clula beta
pancretica, podran contribuir a la formacin de fibras de amiloide.
La DM2 est asociada a niveles elevados de glucosa y cidos grasos libres, condi-
ciones que pueden contribuir a la formacin de depsitos de amiloide. La hiperglu-
cemia crnica en combinacin con el estrs oxidativo da lugar a la formacin de
AGEs (advanced glycation end products). Existen evidencias de glicosilacin de
amilina por AGEs en la diabetes, as como que la amilina glicosilada tiene mas
potencial amilogognico que el pptido no modificado. Situaciones en que la dis-
funcin de la clula beta provoca una secrecin elevada de proinsulina, es decir que
se incrementa el ratio proinsulina respecto a insulina, es un hecho observado en la
diabetes, y en individuos con riesgo de padecer la enfermedad. Dado que proamili-
na es procesada por las mismas proteasas que la insulina, se postula que la disfun-
cin de la clula beta provocara una alteracin en el procesamiento de la amilina,
que conducira a su precipitacin y acumulo en el espacio pericapilar.
Se ha propuesto que la sobre-expresin de amilina podra conducir tambin a la
acumulacin y agregacin del pptido. Ensayos in vitro utilizando amilina sintti-
ca muestran que es posible generar fibras de amilina espontneamente, y que ste
proceso depende mayoritariamente de la concentracin inicial de pptido (figura 1).
La expresin de amilina en modelos celulares mediante promotores potentes, como
83
Amilina y Toxicidad Beta Pancretica

84
promotores vricos, han reproducido la formacin de depsitos de amiloide. Existen
tambin diversos modelos de animales transgnicos para la amilina humana dnde
se han detectado depsitos de amiloide. En humanos, en una situacin de actividad
excesiva de la clula beta, es posible observar la formacin de depsitos de amiloi-
de, siendo el ejemplo ms demostrativo el amiloide asociado a insulinomas.
Tambin se ha documentado abundante amiloide insular en pacientes con hiperpla-
El Islote Pancretico en el Desarrollo y Tratamiento de la Diabetes
A: Obtencin de fibras de amilina humana
mediante ensayos in vitro utilizando pptido
sinttico, tincin negativa de stas y anlisis
morfolgico mediante microscopio electrni-
co de transmisin. B: Morfologa ultraestruc-
tural de clulas beta pancreticas cultivadas
con concentraciones amiloidognicas de
amilina humana. Derecha: La formacin de
fibras de amilina (indicadas con flechas)
induce importantes alteraciones en la mem-
brana plasmtica (indicadas con asteriscos),
tales como plegamientos e invaginaciones.
Izquierda: Cultivo control. Casas et al: (8)
FIGURA 1
Morfologa de los depsitos de amiloide pancreticos
A
B
85
Amilina y Toxicidad Beta Pancretica
sia de islotes pancreticos. Por otro lado, existe el caso de los pacientes no diabti-
cos con insuficiencia renal terminal, en los que junto a elevadas concentraciones de
amilina se ha descrito una mayor prevalencia de amiloide pancretico en relacin
con sujetos no diabticos y sin insuficiencia renal.
Estudios realizados por nuestro grupo de investigacin en poblacin diabtica han
detectado en la regin promotora del gen de la amilina la presencia de una muta-
cin, consistente en la substitucin guanina por alanina, en la posicin -132 bp del
punto de inicio de transcripcin (5)(figura 2). Dicha mutacin presenta una fre-
cuencia significativamente superior en poblacin diabtica en relacin con la
poblacin control (10.1% vs. 0.9%). Asimismo, los niveles de amilina en los indi-
viduos portadores eran significativamente superiores a los de los individuos diab-
ticos no portadores. Estudios in vitro han demostrado que dicha mutacin causa un
incremento de la actividad transcripcional del gen (6), capaz de producir una sobre-
expresion de la amilina, sugiriendo que podra desempear un papel potencial en la
formacin de depsitos de amiloide.
Figura 2. Anlisis de la mutacin
132 G/A de la regin del promo-
tor del gen de amilina. A:
Deteccin de distintos patrones
de migracin del ADN genmico
de pacientes con DM2, mediante
tcnica de SSCP. Carriles 1 y 6,
patrn normal. Carriles 2,3 y 4
patrn heterozigoto. Carril 5,
patrn homocigoto. B:
Secuenciacin de ADN de las
muestras anteriores donde se
detecta el punto mutado de cam-
bio de base guanina por adenina.
En las muestras heterozigotas se
detectan dos picos superpuestos
que representan los dos alelos
distintos de ADN. Novials et al (5)
FIGURA 2
Anlisis de la mutacin 132 G/A de la regin
del promotor del gen de amilina.
NO PORTADOR
1 2 3 4 5 6
HOMOZIGOTO HETEROZIGOTO

No existe todava un claro consenso en relacin al lugar donde se inicia la for-
macin de amiloide. Las necropsias de pncreas diabticos humanos, de gato,
o de primates no humanos indican la formacin de los depsitos siempre extra-
celulares a la clula beta pancretica y cerca de los capilares. Slo en modelos
de sobreexpresin de amilina, tales como animales transgnicos, lneas celula-
res expresando amilina humana mediante promotores gnicos potentes, o en
insulinomas humanos, se ha detectado depsitos de amiloide dentro de la clu-
la beta pancretica.
4. Citotoxicidad de la amilina
Actualmente se considera que la asociacin entre formacin de amiloide y cito-
toxicidad es comn para la mayora de amiloidosis, y se produce por induccin
de apoptosis. La formacin de depsitos de amiloide en los islotes pancreticos
se caracteriza in vivo por presentar una reduccin del 40 al 50% de masa celu-
lar beta pancretica en pacientes con diabetes mellitus tipo 2. Estudios con ani-
males transgnicos o lneas celulares expresando amilina humana han demos-
trado su capacidad citotxica. Asimismo, varios estudios in vitro muestran que
la citotoxicidad por amilina humana es concentracin-dependiente para varios
tipos celulares, incluidas las clulas beta pancreticas. Sin embargo, existen aun
varios puntos crticos que estn por clarificar. Por ejemplo, cabe preguntarse
cual es el estado de agregacin y conformacin de la amilina citotxica? as
cmo cual es el mecanismo detallado de induccin de apoptosis?
Los primeros estudios dirigidos a investigar los mecanismos de citotoxicidad
por amilina en islotes pancreticos humanos fueron realizados por Lorenzo et
al. (7), y demostraron una correlacin directa entre muerte celular por apopto-
sis y presencia de fibras insolubles de amilina humana en contacto con los islo-
tes. Se demostr tambin que los agregados solubles de amilina humana no eran
txicos, ni tampoco amilina de rata que no es capaz de formar fibras insolubles.
La citotoxicidad de amilina humana fue confirmada en varias lneas celulares
neuronales y pancreticas, tratadas con elevadas dosis del pptido en forma
insoluble, aportando evidencias adicionales de la apoptosis como el proceso
responsable de muerte celular. Por otra parte, estudios in vitro identificaron
alteraciones en la expresin de varios genes relacionados con vas especficas
86
El Islote Pancretico en el Desarrollo y Tratamiento de la Diabetes

de induccin apopttica. Se ha asociado citotoxicidad de la amilina humana con
formacin de ROS (reactive oxygen species). De hecho, han sido descritos mar-
cadores de estrs oxidativo en clulas tratadas con amilina humana. Otra carac-
terstica de la citotoxicidad de la amilina humana es la induccin de alteracio-
nes en los niveles intracelulares de calcio, documentada en estudios in vitro en
varios modelos celulares. Resultados preliminares obtenidos por nuestro grupo
de investigacin muestran que alteraciones en la homeostasis intracelular del
calcio son crticas para la viabilidad de la clula beta pancretica. Tales altera-
ciones conllevan a la aparicin de estrs de retculo endoplasmtico, que a su
vez influirn sobre la cascada de sealizacin de apoptosis (8).
En las necropsias de pncreas diabticos humanos y de animales transgnicos
se observan alteraciones morfolgicas en la membrana plasmtica de las clu-
las beta pancreticas en contacto con los depsitos de amiloide extracelulares.
Lorenzo et al. (7) demostraron que para detectar citotoxicidad por amilina
humana era necesario el contacto de las fibras insolubles con los islotes. Para
el estudio de las interacciones de la amilina humana con la membrana celular
plasmtica se han utilizado, en la mayora de los trabajos, membranas fosfoli-
pdicas artificiales. Mirzavecov et al. (9) demostraron que concentraciones cito-
txicas de amilina humana causaban un incremento de la conductancia a travs
de la membrana celular, sugiriendo como posible mecanismo de accin, la for-
macin de canales permeables a iones. Se obtuvieron resultados similares con
concentraciones citotxicas del pptido amiloide de Alzehimer pero no con
amilina de rata. Estos hallazgos corroboran la especificidad de la molcula
humana para desarrollar fibras txicas. Por otro lado, el grupo de Janson et al.
(10) evidenciaron diferencias en la capacidad de elevar la conductancia de
membrana al tratar in vitro con concentraciones de amilina humana recin
disuelta versus administracin de fibras de amilina maduras. A partir de estos
trabajos surgi la hiptesis de que durante la formacin de fibras de amilina,
aparecen oligomeros solubles de amilina, especies transitorias con conforma-
cin diferente al monmero original, y que serian desde el punto de vista cito-
txico, ms agresivas que las fibras de amilina maduras. sta capacidad seria
compartida por otros pptidos amiloides, tales cmo Ab, pero se propone cmo
mecanismo el incremento de la permeabilidad de membrana, independiente a la
formacin de canales inicos o a la disrupcin de la integridad de la membra-
na plasmtica. En la actualidad, ste es un campo interesante de investigacin
en pleno desarrollo.
87
Amilina y Toxicidad Beta Pancretica

88
El Islote Pancretico en el Desarrollo y Tratamiento de la Diabetes
5. Depsito de amiloide y DM2: un componente
precoz o tardio?
Cul seria la relacin entre amiloide pancretico y la patogenia de la DM2?,
Podemos establecer realmente si el fenmeno de amiloidognesis es una compli-
cacin de la diabetes o se trata de un efecto casual? Desafortunadamente, la rela-
cin entre amiloide, diabetes, resistencia a la insulina y disfuncin de la clula beta,
es muy difcil de establecer in vivo, y no existen marcadores clnicos que puedan
cuantificar el proceso, debido en parte a que las biopsias pancreticas son tica-
mente inaceptables. Estudios longitudinales en monos muestran la aparicin de
depsitos de amiloide antes del desarrollo de la diabetes. En cambio, en pacientes
diabticos de larga evolucin, en el anlisis de las autopsias de pncreas el grado
de amiloidosis puede ser muy variable, desde tan solo un 1% de los islotes con
pequeos cmulos perivesculares, hasta un 90% de afectacin con grandes cmu-
los que desplazan y destruyen las clulas insulares. De estos hallazgos podemos
deducir que el papel del amiloide en el inicio y progresin de la diabetes en el hom-
bre es extremadamente complejo y se requiere ms amplios estudios para determi-
nar su importancia etiopatognica.
La creacin de animales transgnicos proporcion la oportunidad de estudiar el
efecto de un factor determinado en una enfermedad multifactorial como es la dia-
betes. Los ratones transgnicos heterocigotos iniciales que sobreexpresaban la ami-
lina humana no fueron capaces de formar depsitos de amiloide, pero si en ciertos
casos en ratones homocigotos. Estos hallazgos indican que la citotoxicidad de la
clula beta inducida por el transgn depende de los valores de expresin del gen.
Incrementos en la incidencia de aparicin de amiloide se consigui al tratar los ani-
males transgnicos con hormonas de crecimiento y dexametasona para inducir
resistencia a insulina, o al cruzarlos con animales modelos genticos de obesidad
(mutantes para los genes Agrp o leptina). En los animales trangnicos para amili-
na humana y ob/ob, el grado de amiloidosis se correlacion significativamente con
la severidad de diabetes. Mediante el estudio de los diferentes animales transgni-
cos se propuso que los depsitos de amiloide eran tanto causa como consecuencia
de la DM2. As, los depsitos de amiloide podran ser una consecuencia de la
sobreproduccin de amilina que acompaa a la sobreproduccin de insulina, y a
continuacin, contribuiran a la degeneracin y prdida de masa celular beta del
islote.
6. Conclusiones
El papel de la amilina sigue siendo enigmtico, a pesar que hace ya ms de un siglo
que se conoce su implicacin en la diabetes. La complejidad de este pequeo pp-
tido pancretico lo ha hecho muy atractivo para un gran nmero de cientficos que
siguen investigando a nivel molecular el proceso de amiloidognesis, as como la
forma de revertir la formacn de fibras de amilina. La sntesis de nuevos frmacos
que inhiban la formacin de fibras de amiloide podr representar una nueva opcin
teraputica para la DM 2.
89
Amilina y Toxicidad Beta Pancretica

90
El Islote Pancretico en el Desarrollo y Tratamiento de la Diabetes
1. Westermark P, Wernstedt C, Wilander E,
Hyden DW, OBrien TD, Johnson KH. Amyloid
fibrils in human insulinoma and islets of
Langerhans of the diabetic cat are derived from
a neuropeptide-like protein also present in nor-
mal islet cells. Proc Natl Acad Sci USA 84:3881-
3885, 1987.
2. Cooper GJ, Willis AC, Clark A, Turner RC,
Sim RB, Reid KB. Purification and characteriza-
tion of a peptide from amyloid-rich pancreases
of type 2 diabetic patients. Proc Natl Acad Sci
USA 84:8628-8632, 1987.
3. Novials A, Sarri Y, Casamitjana R, Rivera R,
Gomis R. Regulationa of islet amyloid polypepti-
de in human pancreatic islets. Diabetes 42:
1514-1519, 1993
4. Gasa R, Gomis R, Casamitjana R, Rivera F,
Novials A: Glucose regulation of islet amyloid
polypeptide gene expression in rat pancreatic
islets. Am J Physiol 272: E543-E549, 1997
5. Novials A, Rojas I, Casamitjana R, Usac EF,
Gomis R. A novel mutation in islet amyloid poly-
peptide (IAPP) gene promoter is associated with
Type II diabetes mellitus. Diabetologia 44:1064-
1065, 2001.
6. Novials A, Mato E, Lucas M, Franco C, Rivas
M, Santiesteban P, Gomis R: Mutation at posi-
tion 132 in the islet amyloid polypeptide (IAPP)
gene promoter enhances basal transcriptional
activity through a new CRE-like binding site.
Diabetologia 47:1167-1174, 2004.
7. Lorenzo A, Razzaboni B, Weir GC, Yankner
BA. Pancreatic islet cell toxicity of amylin asso-
ciated with type-2 diabetes mellitus. Nature
368:756-760, 1994.
8. Casas S, Gomis R, Gribble FM, Altirriba J,
Knuutila S, Novials A. Impairment of the ubiqui-
tin-proteasome pathway is a downstream ER
stress response induced by extracellular human
islet amyloid polypeptide and contributes to
pancreatic -cell apoptosis. Diabetes 56: 2284-
2294, 2007
9. Mirzabekov T, Lin MC, Yuan WL, Marshall PJ,
Carman M, Tomaselli K, Lieberburg I, Kagan BL.
Channel formation in planar lipid bilayers by a
neurotoxic fragment of the beta-amyloid pepti-
de. Biochem Biophys Res Commun 202:1142-
1148, 1994.
10. Janson J, Ashley RH, Harrison D, McIntyre
S, Butler PC. The mechanism of islet amyloid
polypeptide toxicity is membrane disruption by
intermediate-sized toxic amyloid particles.
Diabetes 48:491-498, 1999.
7. Bibliografa seleccionada