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Determinacin de la Digestibilidad in vitro del Almidn

I. Introduccin

El almidn es uno de los componentes principales de la dieta humana y hasta hace


algunos aos era considerado como un carbohidrato disponible que era
completamente digerido y absorbido en el intestino delgado de los humanos. El
componente principal de reserva que se encuentra en la papa es el almidn y su
obtencin resulta no ser muy compleja, seala Estrada (1956). De acuerdo con la
velocidad y extensin de la digestin del almidn, almidn se clasifica en almidn de
digestin rpida (RDS), almidn de digestin lenta (SDS), y almidn resistente (RS)
(Englyst et al., 1992). RDS es la fraccin de almidn que han sido digeridos y
absorbidos en el tracto gastrointestinal, lo que provoca un aumento repentino en el
nivel de glucosa en la sangre despus de la ingestin rpidamente, mientras SDS
es la fraccin de almidn que se digiere lentamente pero completamente y sostiene
la liberacin de glucosa en el tiempo. RS ha sido definida como la porcin de
almidn que no puede ser digerida en el gastrointestino superior, pero puede ser
fermentado por microorganismos en el intestino grueso, que produce cidos grasos
de cadena corta que es beneficioso para la salud del colon (Zhang et al., 2009).
Esta resistencia a la hidrlisis puede ser explicada por varios factores como grado y
tipo de cristalinidad del grano de almidn, contenido de amilosa, morfologa del
grnulo, la presencia de complejos almidn-lipdico y almidn-protena, etc.
Jenkins et al. (2002) menciona que el efecto de la glucemia postprandial de los
alimentos est relacionado con la velocidad de la digestin de hidratos de carbono y
se caracteriza de forma fiable por el ndice glucmico (GI), un modelo que permite la
comparacin de una variedad de alimentos ricos en almidn. La respuesta
glucmica se ha relacionado con la tasa de digestin y absorcin de alimentos que
contienen carbohidratos con ayuda de mtodos in vitro, que estn imitando in vivo
procesos de digestin (Singh et al., 2010).
La respuesta glucmica depende de factores endgenos de la matriz del alimento
(susceptibilidad almidn, protenas y lpidos), la susceptibilidad de almidn se
determina por su estructura nativa, la encapsulacin fsica, la cristalinidad, el grado
de gelatinizacin y retrogradacin de los grnulos de almidn, as como por la
proporcin de grnulos daados (Fardet et al., 2006).
El estudio de la hidrlisis enzimtica del almidn in vitro de esta prctica permite
obtener una informacin relativa de la biodisponibilidad del almidn in vivo. Es por
ello que en la presente prctica se realiz la determinacin de la tasa de hidrlisis
de almidn de pur de papa deshidratado, para ello se hidroliz con -amilasa
hasta reducirlo a azcares ms simples y reportarlos como equivalentes de maltosa
mediante cuantificacin por un mtodo espectrofotomtrico con DNS.

II. OBJETIVOS
Conocer el mtodo estndar para la hidrlisis del almidn con la -amilasa y su
aplicacin en productos alimenticios con el fin de conocer su grado de digestibilidad
in vitro.
Determinar el grado de digestibilidad del almidn del pur de papa deshidratado,
sometidas a coccin por diferentes tiempos.

III. Revisin de Literatura

Los procesos enzimticos muestran plenamente su potencial en el campo de los


carbohidratos, porque tienen el control regio-y-estereoespecfico, lo cual los hace
superiores frente a las mismas reacciones catalizadas por tratamientos qumicos.

3.1. Almidn:

El almidn es un polmero de glucosa unido por enlaces glucocdicos. Este enlace


es estable a pH alto pero hidrolizado a pH bajo. Al final de la cadena polimrica se
encuentra un grupo aldehdo conocido como el grupo reductor (Van der Maaerel et
al., 2009).

El almidn est constituido por dos tipos de polmeros: la amilosa y la amilopectina


(Fig. 1). La amilosa es un polmero lineal de aproximadamente 6000 unidades de
glucosa con enlace ,1-4 glucosdico. La amilopectina posee cadenas lineales
cortas ,1-4 de 10-60 unidades de glucosa y de cadenas laterales ,1-6 con 15-45
unidades de glucosa. El nmero promedio de puntos de ramificacin es del 5%. La
molcula completa de amilopectina contiene aproximadamente 2 000 000 unidades
de glucosa, por lo que es considerada una de las molculas ms grandes de la
naturaleza (Burlen, 1998).
Fig.1: Estructura del almidn. Fuente: Pea et al, 2009.

3.2. Enzimas de conversin de almidn

Bsicamente existen cuatro grupos de enzimas en el proceso de conversin del


almidn: (a) endoamilasas, (b) exoamilasas; (c) enzimas desramificadoras y (d)
transferasas (Van der Maaerel et al., 2002).

Las endoamilasas son capaces de hidrolizar enlaces ,1-4 glucosdicos en la parte


interior de la cadena de la amilosa o de la amilopectina. La alfa-amilasa es la
endoamilasa ms conocida. Los productos finales de hidrlisis por la alfa-amilasa,
son oligosacridos con longitud variable en configuracin , y dextrinas con lmite-
que constituyen oligosacridos ramificados, segn Padel et al (2009).

En el segundo grupo, la exoamilasas, rompen enlaces ,1-4 glucosdicos (-


amilasa), o hidrolizan enlaces ,1-4 y ,1-6 glucosdicos (glucoamilasa y -
glucosidasa). Las exoamilasas actan en los residuos externos de glucosa de la
amilosa o amilopectina, por tanto el producto es glucosa o maltosa (Van der
Maaerel et al., 2002).

Las enzimas amilolticas unen los residuos glucsidos del sustrato en una serie de
subsitios consecutivos que se extienden en toda la hendidura del sitio activo donde
se lleva a cabo la reaccin. Las enzimas desramificadoras hidrolizan exclusivamente
enlaces ,1-6 glucsido (isoamilasa y pullanasa tipo I). Los principales productos
son la maltosa y la maltotriosa. Las transferasas hidrolizan un enlace ,1-4
glucsido de la molcula donador y la transfiere al aceptor con la formacin de un
nuevo enlace glucsido (Van der Maaerel et al., 2002).
3.3 Alfa-amilasa

La alfa-amilasa pertenece a la familia 13 glicosil hidrolasas (GH 13), de acuerdo


con la clasificacin de Pea et al. (2009) . En esta familia se comparte un grupo de
caractersticas comunes tales como, una estructura (/)8 barril, la hidrlisis o
formacin de enlaces -glucsido y un nmero de aminocidos definido en el sitio
activo. El mecanismo cataltico establecido para la familia -amilasa incluye dos
tipos de reacciones SN2; los aminocidos que intervienen en la catlisis son Glu 230
que acta como donador de protn seguido de un ataque nucleoflico por el Asp
206.
La alfa-amilasa se compone de una cadena polipeptdica plegada en tres dominios:
A, B y C. El A es el dominio cataltico (/)8 barril, y los dominios B y C se
encuentran aproximadamente a los lados opuestos de este TIM-barril como se
muestra en la Fig 2. (Tripathy, 2008).

Fig 2: Representacin esquemtica de la estructura en 3D de la alfa-amilasa;


obtenida de banco datos de las protenas (PDB).

3.4 Digestin, absorcin y metabolismo


La ingestin del almidn crudo no tiene valor nutritivo y causa diarrea. La digestin
se inicia en la boca, donde la amilasa salivar empieza a digerirlo, luego se activa la
amilasa pancretica y luego los subproductos y el resto de los disacridos son
atacados por enzimas de las clulas intestinales (maltasa, lactasa y sacarosa),
quedando transformados en monosacridos, pasando a la sangre (Patio, 2006).
Despus de comer, se eleva el nivel de glucosa sangunea y este hecho induce al
aumento de la secrecin pancretica de la insulina. Esta hormona hace que la
glucosa sea transportada al hgado, msculo y tejido adiposo. La glucosa tiende a
almacenarse en el hgado y en el msculo en forma de glucgeno, siendo este
glucgeno la fuente productora en situaciones de ayuno, pero no sirve ms que para
las primeras diez o quince horas (Patio, 2006).
La mayora de los procesos de digestin se completan en el duodeno con la
participacin de secreciones pancreticas y biliares, mientras que el yeyuno e leon
intervienen fundamentalmente en la absorcin de nutrientes. Por su parte, en el
intestino grueso se absorben bsicamente agua y electrolitos. Circula un residuo
semislido por absorcin de 500 a 1000 ml. de agua, perdindose por heces de 100
a 200 ml (Vsquez et al. 2005).
Por ltimo, las bacterias presentes en el organismo reducen los alimentos que se
resisten a la digestin, de forma que todo aquello que tenga valor nutricional sea
recuperado; entonces las heces estn compuestas por agua, clulas de
descamacin, bacterias autctonas y grasas (Vsquez et al. 2005). Previo a la etapa
de absorcin, los carbohidratos son hidrolizados. La absorcin es de tres tipos:
transporte activo, difusin mediada por transportadores y difusin simple, siendo
casi el 95% de la glucosa absorbida de forma activa. Adems, el metabolismo de los
carbohidratos se altera rpidamente, de no suministrarse una cantidad adecuada de
los mismos, el organismo utiliza las protenas como fuente energtica, con la idea
de convertirla en metabolitos intermediarios y glucosa (Patio, 2006).

Figura . Digestin y absorcin de carbohidratos (Vsquez et al. 2005).

3.5 . Digestin del almidn en el intestino delgado


El almidn debe ser completamente despolimerizado a glucosa para que pueda ser
absorbido en el intestino delgado. La despolimerizacin es llevada a cabo por
diferentes enzimas que rompen enlaces glucosidicos (1-4) y (1-6). Las enzimas
que actan en especies monogstricas son las -amilasas que rompen enlaces
(1-4), liberando maltosa y dextrinas. En la digestin de almidones la saliva que
contiene enzimas que no actan sobre el enlace (1-6) por que tiene poca afinidad
por los enlaces terminales (Low y Longland, 1990).
Segn Fandila (2010), el almidn es hidrolizado y absorbido en el intestino delgado,
estn en funcin de su hidrlisis y absorcin en el intestino delgado. Proponiendo
una clasificacin del almidn en: almidn de digestin rpida (ADR), almidn de
digestin lenta (ADL) y almidn resistente (AR).
ADR es aquella fraccin en que la cantidad de glucosa es liberada despus de los
20 minutos de hidrlisis.
ADL es la fraccin de almidn que no es hidrolizado despus de entre 20 y 120
minutos despus de la hidrlisis.
AR es la cantidad de almidn que no es hidrolizado despus de los 120 minutos de
hidrolisis

3.5.1. Tamao de partcula.


El tamao de partcula afecta la digestin del almidn debido a que las partculas
ms pequeas (con mayor superficie especfica) facilitan la accin de las amilasas
y se digieren ms rpidamente (que las partculas con mayor volumen). De esta
forma un mayor grado de molido o masticacin pueden facilitar la digestin de los
almidones. Liljeberg et al. (1992) estudiaron la digestibilidad in vivo del almidn de
cereales molidos o enteros a partir del ndice glicmico, comprobaron que los
granos enteros disminuyen el ritmo de digestin del almidn y por lo tanto reducen
la digestibilidad de la dieta. En consecuencia, tambin reducen o retrasan la
glicemia e insulinemia postprandial.

3.5.2. Matriz proteica


Los grnulos de almidn estn acompaados por otras materias vegetales que
pueden inhibir el acceso de las amilasas al grnulo. En algunos casos los grnulos
de almidn pueden estar encapsulados en una matriz proteica y en otros casos con
lpidos los cuales dificultan el accionar de la enzima restringiendo su actividad
hidroltica (Martnez, 2006).

3.6. Digestibilidad en productos trmicamente tratados.


Segn (Garca, 2007) el anlisis de la hidrlisis enzimtica in vitro del almidn de
productos horneados: se realiz por el mtodo de Holm, el cual permiti determinar
la tasa de digestin del almidn trabaj con -amilasa pancretica porcina,
reducindose este en azcares sealados como equivalentes de maltosa,
determinados por espectrofotometra.
Afirman que produce una parcial o completa destruccin de la estructura cristalina
de los grnulos de almidn en el horneado lo que facilita el accionar de las enzimas.
Adems al evaluar se observa la velocidad de hidrlisis de la enzima - amilasa en
las harinas horneadas aumenta a medida que la temperatura de horneado de la
harina se incrementa en un mismo tiempo.
Recomiendan tambin el uso de las harinas horneadas por conveccin, previamente
gelatinizadas en ese experimento para incrementar la disponibilidad enzimtica del
almidn.

3.7. Importancia de la digestibilidad del almidn.

Los carbohidratos tienen una gran relevancia nutricional, por la importancia de la


fibra en la salud y porque la digestibilidad del almidn es diferente en una amplia
gama, de alimentos (Englyst et al., 1992; FAO/OMS, 1996). El almidn adems de
ser el principal componente de las plantas, es el carbohidrato dominante de la dieta
humana (Skrabanja et al., 1999). No todo el almidn se digiere, y existe una fraccin
resistente a la hidrolisis por las enzimas digestivas humanas; su trnsito contina
por el intestino delgado llegando hasta el intestino grueso, donde es sustrato para
las enzimas de la microflora normal del colon. Esta fraccin de denomina almidn
resistente (AR) y se define como la suma del almidn y productos de la degradacin
del almidn que no pueden ser absorbidos en el intestino delgado de individuos
sanos (Asp, 1992). El AR se ha clasificado en: 1) AR1 es el almidn fsicamente
inaccesible, y atrapado en una matriz celular, lo que impide su completo
hinchamiento y dispersin; 2) AR2 son grnulos de almidn nativo, no sometido a
ningn proceso, 3) AR3 es el almidn retrogradado, formado en alimentos cocinados
y almacenados, donde el fenmeno de la retrogradacin se ha iniciado; 4) AR4 son
los almidones modificados por mtodos qumicos o fsicos (Wursh et al., 1986;
Tovar et al., 1992; Bello-Prez et al., 2006).
El contenido de AR en los alimentos, as como la velocidad y el nivel de digestin
del almidn, tienen un efecto positivo en la salud. Influyen en la reduccin de la
respuesta glucmica e insulinemica al alimento, tienen un efecto
hipocolesterolemico, adems de un efecto protector contra el cncer colon-rectal
(Cassidy et al., 1994; Asp et al., 1996).
Varios factores tiene efecto en la velocidad y nivel de digestin del almidn: el tipo
de procesamiento del alimento, el tiempo de almacenamiento y su origen botnico.
Por ejemplo, algunas leguminosas contienen cantidades significativas de AR
comparadas con otras fuentes, adems despus de consumir leguminosas la
velocidad de digestin del almidn y la liberacin de glucosa al torrente sanguneo
es lenta, lo cual causa bajas respuestas glucemicas e insulinemicas posprendiales
en comparacin con las de los cereales o tuberculos (Jenkins et al., 1982; Tovar et
al., 1992).
Aquellas fuentes botnicas que tengan almidon de baja digestibilidad sirven como
fuente importante de fibra diettica, definida como la parte comestible de las plantas
o los carbohidratos resistentes a la digestin y absorcin en el intestino delgado del
hombre, con completa o parcial fermentacin en el intestino grueso (AACC, 2000).
Existen ejemplos como las leguminosas que su grado de integridad de sus fibras,
representan una barrera fsica para la gelatinizacin completa de almidn, que
aunado a ciertos factores antinutricionales como loa inhibidores de la amilasa,
impiden su hidrolisis enzimtica (Wursh et al., 1986; Tovar et al., 1992).
Los procesos o pre tratamientos que se puedan dar a una muestra (coccin,
molienda y calentamiento a altas temperaturas) acarrea el deterioro extenso de la
estructura tisular y de las paredes celulares, liberando al almidon de cualquier
impedimento fsico para su digestin por las enzimas amiloliticas (Bjorck et al.,
1994).

La velocidad de amilolisis in vitro es un elemento til para la prediccin de la


respuesta glucmica postprandial que inducen los alimentos y de all que su
evaluacin sea importante dentro de la caracterizacin de las propiedades
nutricionales de los alimentos amilceos (Bjorck et al., 1994).

En cuanto a los granulos de almidon, se ha reportado que los de forma esfrica


presentan mayor resistencia a la digestin que los de forma polidrica (Freitas y
Tavares, 2005).

3.8. Pur de papa

The History Channel Latin America (2013) nos menciona que para obtener el polvo
del pur de papas instantneo hace falta hervir las papas a 70C y posteriormente
enfriarlo a 20C. De esta manera se rompe la estructura de la papa, para luego
poder mezclarla fcilmente con los aditivos necesarios. Luego se calienta a 150C y,
por ltimo, la masa resultante se la hace polvo para finalmente ser envasada. Por lo
que podemos decir que nuestro pur ha sido pre-cocido.
Muoz (1990) citado por Tarazona (1995) nos menciona que el cocimiento produce
la gelatinizacin del almidn hacindose ms susceptible al ataque enzimtico
durante el metabolismo ya mencionamos que para la elaboracin del pur se ha
pre-cocido lo que ha facilitado su digestin con las enzimas.
Tarazona (1995) nos menciona que la mayor o menor porcentaje de digestibilidad
puede estar asociado al grado de gelatinizacin de los almidones durante el proceso
de coccin, es deseable que este sea superior a 90% para que haya una eficiente
digestin y asimilacin. Nos menciona que la digestibilidad del pur de papa es de
95.08%.
Segn Araya (2000), el pur de papas posee una rpida absorcin. Tambin nos
menciona que el pur de papa es digerido rpidamente y su efecto glicmico es
similar al de una carga equivalente de glucosa.

IV. Materiales y Mtodos

4.1. Muestra Alimenticia: Pur de papa instantnea (Knorr), con un contenido de


carbohidratos de 23 mg en 31 g de muestra.

4.2. Materiales:
- Material de vidrio: erlenmeyer, pipetas, tubos de ensayo.
- Micropipeta de 20 - 200 l
- Micropipeta de 100 - 1000 l

4.3. Reactivos:
- -amilasa SIGMA TIPO IA 1200 U/mg (27mg/ml). Diluir 56 l de enzima con
10 ml de tampn fosfato (preparar durante los 30 minutos previos al comienzo de la
hidrlisis).
- Tampn fosfato. Disolver en aprox. 700 ml de a 3.03g de KH2PO4, 3.96 g de
Na2HPO4.2H2O y 0.4 g de NaCl. Llevar a pH 6.9 y aforar a 1000 ml.
- Sal de Rochelle. Preparar una solucin al 40 % (p/v) de tartrato de sodio y potasio
en agua destilada.
- Maltosa anhidra (solucin estndar de 2 mg/ml).

3.4. Equipos:
- Balanza analtica
- Bao Mara con agitacin
- Cocina
- Espectrofotmetro
- Vortex

3.5. Procedimiento:

La muestra ya se encontraba precocinada, por ello no necesit una


precoccin

V. Resultados y Discusin

Tabla 1. Absorbancias de las muestras de 0 a 60 minutos el blanco medidos a


550nm.

Muestra Absorbancia

BM 0.015

0 min 0.005 0.012

5 min 0.003 0.003

15 min 0.011 0.012

30 min 0.012 0.012


60 min 0.117 0.119

Curva de maltosa
Y = 0.7245X 0.0768
Y: ABS
X: mg maltosa/ml

Tabla 2. Data calculada mediante el uso de la ecuacin determinada con la


curva estndar de maltosa y frmula para la determinacin del porcentaje de
hidrlisis.

Muestra Concentracin (mg Concentracin (mg % Hidrlisis


maltosa/ml) muestra/ml)

BM 0.1267 - -

0 min 0.1129 22.4667 -0.058

5 min 0.1101 22.4667 4.217

15 min 0.1219 22.4667 4.267

30 min 0.1226 22.4667 4.269

60 min 0.2689 22.4667 4.888


Figura 1. Porcentaje de hidrlisis versus tiempo (min)
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VII. Anexos