48.

Transformacin de Escherichia coli con un

plsmido recombinante

Aurora Galvn Cejudo, Manuel Tejada, Antonio Camargo, Jos
Javier Higuera, Emilio Fernndez Reyes

Departamento de Bioqumica y Biologa Molecular, Campus Universitario de Rabanales,
Edificio Severo Ochoa, 14071-Crdoba


RESUMEN

Se trabaja el principio de adquisicin de informacin gentica en
bacterias mediante la introduccin de DNA plasmdico por
transformacin. Se trabaja la seleccin de clones celulares con las
caractersticas esperadas de la expresin o ausencia de expresin de los
genes marcadores presentes en un plsmido recombinante y se estima la
eficiencia de la transformacin. Asimismo, se preparan soluciones y
medios de cultivos de bacterias y se utilizan en condiciones aspticas.

Palabras clave: clulas competentes, choque trmico, eficiencia de
transformacin, -galactosidasa.

Abreviaturas empleadas. ATP: trifosfato de adenosina; DNA: cido
desoxirribonucleico; mRNA: cido ribonucleico mensajero; IPTG, isopropil--D-
tiogalactopiransido; X-gal: 5-bromo-4-cloro-3-indolil--D-galactopiransido.


1. INTRODUCCIN Y OBJETIVOS

La transformacin es un proceso por el cual las clulas captan DNA libre
presente en el medio. Es un fenmeno que ocurre de forma natural en muchas
bacterias, pero la eficacia del proceso vara enormemente de unas especies a
otras. Para que la transformacin tenga lugar, la bacteria tiene que encontrarse
en el llamado estado de competencia, que ocurre en determinadas condiciones
fisiolgicas; en este estado, la bacteria presenta alteraciones en su pared y
membrana celulares, que permiten la entrada de cidos nucleicos en la clula.

En el laboratorio se ha conseguido poner a punto tcnicas que inducen el
estado de competencia en bacterias que no lo presentan de forma natural,
como es el caso de E. coli. Estas tcnicas se basan en diversos tratamientos
qumicos o fsicos que producen microporos en la clula, lo que permite la
introduccin del DNA exgeno (transformacin) de modo bastante eficiente.
Uno de los mtodos fsicos es la electroporacin, consistente en inducir la
competencia mediante la aplicacin de un pulso elctrico muy breve e intenso.
Dicha competencia se puede inducir con tratamientos qumicos utilizando
compuestos como el cloruro clcico. Hay que tener en cuenta sin embargo que
tras estos tratamientos no todas las clulas del cultivo se hacen competentes.

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La transformacin en el laboratorio es una tcnica rutinaria de enorme
utilidad, que nos permite introducir prcticamente cualquier plsmido en su
forma circular o superenrollada en casi cualquier tipo de bacteria. El mtodo
que se describe a continuacin es, por su simplicidad, uno de los ms
utilizados para transformar E. coli. Para detectar la transformacin, el DNA
introducido llevar un marcador seleccionable en el medio adecuado.




El objetivo de esta prctica es introducir el plsmido recombinante obtenido
en una reaccin de ligacin en la estirpe de Escherichia coli DH5. Esta estirpe
est modificada genticamente de manera que es posible inducir en laboratorio
la competencia de las clulas as como mantener el plsmido de forma estable
en su interior.

Se usarn clulas competentes obtenidas por tratamiento qumico con
cloruro de calcio.


2. LISTADO DEL MATERIAL NECESARIO

Tubos Eppendorf, micropipetas, puntas estriles, agua estril, microcentrfuga,
bao termostatizado.


3. PROTOCOLO A REALIZAR

3.1. Obtencin de clulas competentes

1. Estriar las clulas de Escherichia coli DH5 en una caja Petri con medio
PSI-a e incubar toda la noche a 37C.
2. Inocular 5 ml de medio PSI-b con una colonia aislada (utilizar un matraz
de 125 ml) e incubar a 37C hasta alcanzar una densidad ptica de 0,3 a
550 nm.
3. Inocular, con el cultivo anterior, 100 ml de medio PSI-b en un matraz de
1 litro precalentado a 37C. Incubar a 37C hasta alcanzar una densidad
ptica de 0,48 a 550 nm.
4. Enfriar el matraz del paso anterior durante 5 minutos en hielo y
posteriormente recoger las clulas por centrifugacin a 6000 rpm, 5
minutos a 4C.
5. Resuspender el pella (pellet) en 40 ml de TFB-1 fro. Mantener 5
2
minutos en hielo.
6. Recoger las clulas por centrifugacin a 6000 rpm 5 minutos a 4C.
7. Resuspender las clulas en 4 ml de TFB-2. Mantener en hielo durante
15 minutos.
8. Alicuotar las clulas y congelar a 80C o en nitrgeno lquido.

3.2. Transformacin de clulas competentes

1. Descongelar las clulas en hielo. Inmediatamente despus, aadir 1/10
de -mercaptoetanol 1,8% v/v. Para ello aadir 15 l de -mercapto
etanol 1,8% a 150 l de clulas.
2. Mantener 10 minutos en hielo. Enfriar las muestras que contienen las
ligaciones del inserto de DNA y el vector en hielo durante este tiempo.
3. Aadir 50 l de clulas a cada ligacin. Mantener en hielo durante 30
minutos.
4. Someter las clulas a un choque trmico de 3 minutos a 37C en un
bao termostatizado.
5. Enfriar en hielo durante 2 minutos.
6. Aadir 500 l de medio de cultivo LB. Incubar 1 hora a 37C en
agitacin.
7. Transferir todo el volumen a placas LB/ampicilina/IPTG/X-Gal.
8. Incubar toda la noche a 37C.


4. RESULTADOS ESPERADOS

En una placa A se siembra la bacteria utilizada sin transformar y en otra B la
bacteria que se transform con la mezcla de ligacin y en otra C con una
cantidad de DNA de vector conocida (unos 1-5 ng).

Al da siguiente se debe observar en las placas dos parmetros. Uno es el
nmero de colonias obtenidas en cada placa, y otro es el tipo (color) de dichas
colonias. El nmero de colonias dividido por la cantidad de DNA utilizado nos
indicar la eficiencia de la transformacin, que depender del grado de
competencia de las clulas utilizadas, del mtodo de transformacin elegido y
del tamao del plsmido utilizado, siendo dicha eficiencia inversamente
proporcional al tamao del mismo. Esta eficiencia es en algunos casos superior
a 10
9
colonias /g DNA, pero puede ser tan pequea como cero o unas pocas
colonias en el caso ms desfavorable.

En la placa A no se observarn colonias ya que la estirpe hospedadora
utilizada es sensible a ampicilina.

En la placa B aparecern dos tipos de colonias blancas y azules,
seleccionadas por resistencia a ampicilina, ya que ambos tipos de bacterias
portan el plsmido. Las colonias azules corresponden a las clulas
transformadas con el vector que lleva el gen de la -galactosidasa funcional y
produce por induccin con IPTG dicha enzima capaz de hidrolizar al X-Gal y
generar color azul. Las colonias blancas corresponden a las clulas
transformadas con el vector que lleva un gen de la -galactosidasa no funcional
por insercin de un fragmento de DNA dentro del mismo.

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Finalmente, la placa C slo contendr colonias azules pues portan el vector
intacto con una -galactosidasa funcional.

Se contar el nmero de colonias en B y C, y se determinar la eficiencia de
la transformacin y de la ligacin.


5. DISCUSIN Y COMENTARIOS

El mtodo de transformacin mediante choque trmico de clulas
competentes con cationes divalentes es muy rutinario dada la facilidad de
realizacin del mismo y la no necesidad de utilizar aparatos sofisticados, a
diferencia de la electroporacin o la biobalstica. No obstante la eficiencia del
mismo puede resultar baja, segn el caso.


6. BIBLIOGRAFA COMENTADA

Inohue H, Nojima H, Okayama H (1990): High efficiency transformation of
Escherichia coli with plasmids. Gene 96:23-28. Artculo clsico optimizando
el mtodo.
Old RW, Primrose SB (1989) Principles of gene manipulation. Blackwell Sci.
Pub. Oxford. pp 11-13. Resumen completo del procedimiento.
Sambrook J , Fritsch EF, Maniatis T (1989) Molecular cloning. Cold Spring
Harbor Laboratory Press. pp. 1.74-1.84. Excelente recetario con variaciones
tiles.


ANEXO 1: MEDIOS, SOLUCIONES Y MATERIAL BIOLGICO EMPLEADO

Soluciones

-Medio PSI-a:
Extracto de levadura 5g/l
Triptona 20 g/l
MgSO
4
5g/l
Ajustar el pH a 7,6 con KOH. Aadir 14 g/l de agar.
Esterilizar en autoclave. Almacenar a temperatura ambiente.

-Medio PSI-b:
Medio PSI-a sin agar.

-TFB-1:
Acetato potsico 30 mM
KCl 100 mM
CaCl
2
10 mM
MnCl
2
50 mM
Glicerol 15% v/v
Ajustar el pH a 5,8 con cido actico 0,2 M. Esterilizar por filtracin. Almacenar
en fro.

-TFB-2:
4
MOPS 10 mM
CaCl
2
75 mM
KCl 10 mM
Glicerol 15% v/v
Ajustar el pH a 6,5 con KOH. Esterilizar por filtracin. Almacenar en fro.

-Medio de cultivo LB:
Extracto de levadura 5g/l
Triptona 10 g/l
NaCl 5g/l
Esterilizar en autoclave. Almacenar en fro.

-Placas LB/ampicilina/IPTG/X-Gal:
Medio de cultivo LB
Agar 1,6%
Ampicilina 100 g/ml
IPTG 500 M
X-Gal 40 g/ml

Material biolgico

En esta prctica se utiliza la estirpe de Escherichia coli DH5 y el plsmido
pBKSII, pero tambin podran utilizarse otras estirpes hospedadoras (K12, B,
W, XL1-Blue, HB101, J M109 y C600) y otros plsmidos que incluyan el sitio de
clonacin mltiple dentro de la secuencia del gen de -galactosidasa.

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