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TRANSFORMACIÓN DE Escherichia coli Y OBTENCIÓN DE ADN PLASMÍDICO

Transformación de E.coli:


En el presente trabajo se ha seguido el protocolo descrito por Hanahan (1983) para la


transformación de células competentes de E. coli obtenidas por métodos químicos.

1. Se descongelan las células en un baño con hielo.

2. Se mezclan suavemente 100 μl de solución de células con 1-10 μl de solución de ADN y se


incuban en hielo durante 20 min.

3. Se somete a la mezcla de reacción a un choque térmico, incubando a 42 oC durante 45 s.


Posteriormente se incuba la mezcla en hielo durante 2 min.

4. Se añaden 600-900 μl de medio LB a la mezcla de transformación y se incuba a 37 oC y en


agitación durante 45-60 min.

5. Se siembra en un medio sólido selectivo para clones transformados, habitualmente medio LB


suplementado con algún antibiótico.

Electroporación de E. coli:
 El protocolo de electroporación que se ha utilizado es el


siguiente:

1. Se descongelan en hielo las células electrocompetentes DH10B y se mezclan con el ADN,


utilizando 30 μl de suspensión de células y 1-5 μl de ADN.

2. Se transfiere la mezcla de células y ADN a una cubeta de electroporación de 0,2 cm previamente


enfriada en hielo. La mezcla debe estar en contacto con las dos láminas metálicas de la cubeta y
sin formar burbujas.

3. Se seca bien el exterior de la cubeta y se coloca en el soporte, previamente enfriado a –20oC,


del aparato de electroporación.

4. Se ajustan las condiciones (25 μF, 2.500 V y 200 Ω) y se realiza la electroporación. La duración
del pulso debe ser de 4-5 milisegundos para obtener una buena eficiencia de transformación. Se
coloca la cubeta en hielo hasta que se recojan las células.
5. Se añade 1 ml de medio LB en la cubeta de transformación, se mezcla con una micropipeta, se
recoge el medio y se incuba en un tubo eppendorf a 37 oC y 250 r.p.m. durante 1 h.

6. Se siembra en un medio sólido adecuado para la selección de clones transformantes.

Minipreparaciones de ADN plasmídico (minipreps):

Se ha seguido el protocolo descrito por Holmes y Quigley (1981):

1. Se realizan cultivos a pequeña escala en tubos eppendorf con 1 ml de medio TB, complementado
con el antibiótico apropiado, inoculando dichos cultivos con colonias aisladas de E. coli. Los
cultivos se incuban durante 8-12 h a 37 oC y con agitación (250 r.p.m.).

2. Se recogen las células por centrifugación durante 10 minutos a 10.000 r.p.m. y temperatura
ambiente. Después de descartar el sobrenadante, se resuspende el precipitado en 300-350 μl de
STET mediante agitación fuerte.

3. Se añaden 10 μl de una solución de lisozima alcalina en agua (10 mg/ml) y se incuba 45 s con
agitación fuerte.

4. Una vez lisadas las células, se incuban las reacciones en agua hirviendo durante 45 s. Este
proceso provocará la coagulación de los restos celulares, ADN cromosómico y proteínas; que serán
concentrados por centrifugación durante 15 minutos a 14.000 r.p.m.. El precipitado formado por
estos componentes celulares se retira del fondo de los tubos con un palillo estéril libre de nucleasas.

5. El sobrenadante obtenido se mezcla con 40 μl de acetato sódico 3 M pH 5,2 y 400 μl de 2-


propanol, precipitando con este procedimiento el ADN plasmídico. Dicho ADN se recoge por
centrifugación durante 10 minutos a 14.000 r.p.m., y una vez descartado el sobrenadante, se lava
con etanol al 70 % en agua.

6. El precipitado se seca al aire y se resuspende en 30-40 μl de TE, almacenándose a 4 oC o a


temperatura ambiente.

STET: Sacarosa 8 %, Tritón X-100 0,5 %; Tris-HCl 10 mM, EDTA 50 mM, pH 8.


Obtención de ADN plasmídico a gran escala mediante lisis alcalina:

Se ha seguido el protocolo descrito por Maniatis et al. (1982):


1. Se inoculan 100 ml de medio TB, complementado con el antibiótico apropiado, con una colonia
aislada de E. coli y se incuba el cultivo durante 8-12 horas a 37 oC y agitación a 250 r.p.m.

2. Una vez crecido el cultivo, se recogen las células en un tubo GSA por centrifugación durante 5
minutos a 5.000 r.p.m., utilizando una super centrífuga Sorvall (DuPont Instruments). El
precipitado obtenido se resuspende en 2 ml de solución GTE, y se transfiere a un tubo SS34.

3. La solución de células se mezcla con 2 ml de lisozima alcalina (10 mg/ml en GTE) y se incuba
5 minutos a temperatura ambiente.

4. Se añaden 8 ml de solución alcalina/SDS, se mezcla suavemente por agitación y se incuba


durante 10 minutos en hielo. Este proceso facilitará la desnaturalización selectiva del ADN
cromosómico.

5. Se añaden 6 ml de una solución de acetato potásico pH 4,8 y se agita vigorosamente hasta


conseguir una mezcla homogénea, incubando posteriormente en hielo durante 10 min. Esto
provocará la precipitación de las proteínas en la solución.

6. A continuación, se eliminan los restos precipitados centrifugando durante 15 minutos a 15.000


r.p.m. y 4 oC en una súper centrífuga Sorvall. El sobrenadante se recupera y se filtra a través de
un filtro de nilón a un tubo SS34 limpio para eliminar restos celulares que pudieran quedar en la
solución.

7. Se añaden 0,7 volúmenes de 2-propanol y 0,1 vol. de acetato sódico 3 M pH 5,2 para precipitar
los ácidos nucleicos. Esta mezcla se mantiene a temperatura ambiente durante 10-15 min.

8. Se centrifuga durante 10 minutos a 8.000 r.p.m. en una centrífuga Sorvall para recoger los ácidos
nucleicos, lavando posteriormente el precipitado con etanol al 70 % en agua. Se seca el tubo al
aire para eliminar restos de etanol y se resuspende el precipitado en 1 ml de TE.

9. Se trata la solución obtenida con ARNasa (concentración final 10 μg/ml) durante 60-90 minutos
a 37 oC para eliminar el ARN. Se eliminan las proteínas por fenolización y se precipita el ADN
en tubos eppendorf con 2,5 vol. de etanol absoluto frío y 0,1 vol. de acetato sódico 3 M pH 5,2.

10. Después de recuperar el ADN por centrifugación durante 30 minutos a 14.000 r.p.m. y 4 oC,
se lava con etanol al 70 % y se resuspende en 75-150 μl de TE.

GTE: Glucosa 50 mM, Tris-HCl 25 mM, EDTA 10 mM, pH 8. Solución alcalina/SDS: NaOH
0,2 M; SDS 1 %. Acetato potásico pH 4,8: Acetato potásico 3 M, ácido acético glacial 2 M.