INFORME CINETICA ENZIMATICA

La cintica enzimtica estudia la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas . Estos estudios proporcionan informacin directa acerca del mecanismo de la reaccin cataltica y de la especifidad del enzima. La velocidad de una reaccin catalizada por un enzima puede medirse con relativa facilidad, ya que en muchos casos no es necesario purificar o aislar el enzima . La medida se realiza siempre en las condiciones ptimas de pH, temperatura, presencia de cofactores, etc, y se utilizan concentraciones saturantes de sustrato. En estas condiciones, la velocidad de reaccin observada es la velocidad mxima (V max). La velocidad puede determinarse bien midiendo la aparicin de los productos o la desaparicin de los reactivos.

Al seguir la velocidad de aparicin de producto (o de desaparicin del sustrato) en funcin del tiempo se obtiene la llamada curva de avance de la reaccin , o simplemente, la cintica de la reaccin. A medida que la reaccin transcurre, la velocidad de acumulacin del producto va disminuyendo porque se va consumiendo el sustrato de la reaccin (Figura de la derecha). Para evitar esta complicacin se procede a medir la velocidad inicial de la reaccin (v0). La velocidad inicial de la reaccin es igual a la pendiente de la curva de avance a tiempo cero (Figura de la derecha). De esta forma, la medida de v0 se realiza antes de que se consuma el 10% del total del sustrato, de forma que pueda considerarse la [S] como esencialmente constante a lo largo del experimento. Adems, en estas condiciones no es necesario considerar la reaccin inversa , ya que la cantidad de producto formada es tan pequea que la reaccin inversa apenas ocurre. De esta forma se simplifican enormemente las ecuaciones de velocidad.

Para estudiar la cintica enzimtica se mide el efecto de la concentracin inicial de sustrato sobre la velocidad inicial de la reaccin , manteniendo la cantidad de enzima constante. Si representamos v0 frente a [S]0 obtenemos una grfica como la de la Figura de la derecha. Cuando [S]0 es pequea, la velocidad inicial es directamente proporcional a la concentracin de sustrato, y por tanto, la reaccin es de primer orden. A altas [S]0, el enzima se encuentra saturada por el sustrato, y la velocidad ya no depende de [S] 0. En este punto, la reaccin es de orden cero y la velocidad es mxima (Vmax).
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Experimento 2. Estudio de la influencia del pH No hay imgenes ni resultados

Los enzimas poseen grupos qumicos ionizables (carboxilos -COOH; amino NH2; tiol -SH; imidazol, etc.) en las

cadenas laterales de sus aminocidos. Segn el pH del medio, estos grupos pueden tener carga elctrica positiva, negativa o neutra. Como la conformacin de las protenas depende, en parte, de sus cargas elctricas, habr un pH en el cual la conformacin ser la ms adecuada para la actividad cataltica (Figura de la derecha). Este es el llamado pH ptimo. La mayora de los enzimas son muy sensibles a los cambios de pH. Desviaciones de pocas dcimas por encima o por debajo del pH ptimo pueden afectar drsticamente su actividad. As, la pepsina gstrica tiene un pH ptimo de 2, la ureasa lo tiene a pH 7 y la arginasa lo tiene a pH 10 (Figura de la izquierda). Como ligeros cambios del pH pueden provocar la desnaturalizacin de la protena, los seres vivos han desarrollado sistemas ms o menos complejos para mantener estable el pH intracelular: Los amortiguadores fisiolgicos.

im

3. E

l i l

(S)

Resultados

CONCENTRACIN DEL SUSTRATO tie de reccin Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 t2 10 min t3 15 min t3 15 min

Tubo 4

t3 15 min

El sustrato forma con la enzima el complejo Enzima sustrato (ES), en donde el sustrato reacciona mucho mas fcil y rpidamente que en ausencia de la enzima, por una disminucin de la energa de activacin. A parte del complejo enzima sustrato resultan los productor de la reaccin, y la enzima queda en su condicin original lista para aceptar otra molecula de sustrato:

De acuerdo con la ley de accin de masas, la velocidad de la reaccin 3 sera proporcional ala concentracin (ES), la cual a su vez depe nde de [] y de [S]. Como E vuelve a quedar disponible al final de la reaccin, podemos concluir que la velocidad de la reaccin es directamente proporcional al [s]. Sin embargo, esta relacin es validad cuando [s] es baja, y deja de serlo cuano aumenta. Con los valores muy altos de [S] la velocidad no cambia aunque [S] se siga aumentando, o sea que se ha alcanzado una velocidad mxima . A baja [S], velodicada es directamente proporcional a [S] A mu alta [S], velocidad es independiente de (S), ya no aumenta a pesar que aumente [S] y por tanto v = V max. Existe un valor de [S] en el que v= V max/2, y ese valor recibe el nombre de Km, Constante de Michaelis.

Grafica 1

Con e siguiente ilustracion se entiende mejor, la grfica anterior. Donde la enzima tiene 4 puntos activos, y alcanza su velocidad mxima cuando est saturada, es decir nmero activos = a moles de sustrato.

Imagen 1

Revisando la grfica 2, la velocidad mxima 7 minutos 30 segundos se alcanza con aproximadamente 0,43 ml de soluto. Cuando se supera esta concentracin, la velocidad sigue siendo la misma, porque se saturan los sitios activos de las enzimas, y se debe esperar a que se produzca el producto y queden libres los sitios activos para generar mas productos. Bibliografa

Informacin obtenida de Bioqumica Escrito por Antonio Pea - Las enzimas, aceleradores de reaccin qumicas pg. 193.

Experimento 1. Estudio de la influencia de c(e)

Resultados No hay resultados de este experimento, solo hay las imgenes y para hacer la grafica es necesario tener los resutados en tiempo y concentracin de la enzima. Si los conseguimos maana, hacemos la grfica. Colocar Las Imgenes Aqu

ANALISIS DE RESULTADOS (TEORICO) la velocidad de la reaccin es directamente proporcional a la concentracin de la enzima a cualquier concentracin de sustrato. Por ejemplo, si la concentracin de enzima es disminuida a la mitad, la velocidad inicial de la reaccin (v0 es reducida tambin a la mitad de la original. La velocidad de transformacin de los sustratos de una reaccin en los correspondientes productos, mediante una enzima y bajo condiciones de estado estacionario, es dependiente tanto de las concentraciones de la enzima como de los sustratos si esta es baja. Normalmente, esa dependencia puede ser expresada matemticamente por la ecuacin de Micaelis-Menten: v= Vmax [S] / (Km + [S] ) Esta ecuacin predice que la velocidad de formacin de producto es saturab le con respecto al sustrato, es decir existe una concentracin de sustrato a partir del cual la v no aumenta de forma significativa. La Vmax se denomina velocidad mxima, y depende de la concentracin de enzima segn una relacin lineal: Vmax = k2 [E] La expresin de Micelis Menten puede ser transformada algebraicamente en otras formas, que son ms tiles para la expresin de los datos experimentales. Una de esas formas consiste en tomar los recprocos (inversa) de ambos miembros de la ecuacin.

ESPACIO PARA GRAFICA

Cuando se aumenta gradualmente la concentracin de la enzima se aumenta tambin la cantidad de sitios activos que pueden recibir un sustrato y convertirlo en producto; cuando se crea el producto el sitio activo queda libre para recibir otro sustrato. por ende al aumentar la concentracin de enzima disminuye la saturacin de sustrato y se produce mas producto en menor de cantidad de tiempo.. Aumenta la velocidad de reaccin.

GRUPO 4: INFLUENCIA DE LA TEMPERATURA (a 0 C Y 40 C) PRUEBA DE 0C y 40 C Resultados: La siguiente tabla muestra las variaciones en los colores de la muestra al agregar el lugol. Nota: para los tiempos to y t1, la cantidad de lugol agregado a la muestra sobrepaso los valores recomendados en la gua de laboratorio, es por ello que para estos dos tiempos los resultados no son verdicos. Los siguientes resultados si expresan el comportamiento normal del almidn en presencia de la enzima alfa- amilasa y su respectiva coloracin con lugol. Tiempo (lapsos de 5 minutos) t0 t1 t2 t3 t4 Temperatura a 0C El color dominante es el marrn caracterstico del lugol El color dominante es el marrn caracterstico del lugol Presencia de color azul Presencia de color azul Presencia de color azul

t5 t6 t7 t8 t9 t10 t11

Presencia de color azul Presencia de color azul El color azul empieza disminuir en su concentracin en la muestra La intensidad del color azul es menor, se denota la presencia de lugol. El color azul sigue presente pero la cantidad de lugol es mayor. Las imgenes muestran que no se realizo el experimento para estos tiempos. Las imgenes muestran que no se realizo el experimento para estos tiempos.

En las siguientes imgenes se muestran los resultados del experimento. Imagen 4.1.1 resultados prueba a Temperatura de 0C.

ANALISIS DE RESULTADOS Fundamento terico del experimento

En general, los aumentos de temperatura aceleran las reacciones qumicas: por cada 10C de incremento, la velocidad de reaccin se duplica. La s reacciones catalizadas por enzimas siguen esta ley general. Sin embargo, al ser protenas, a partir de cierta te mperatura, se empiezan a desnaturalizar por el calor. La temperatura a la cual la actividad cataltica es mxima se llama temperatura ptima (Figura de la derec a). Por encima de esta temperatura, el aumento de velocidad de la reaccin debido a la temperatura es contrarrestado por la prdida de actividad cataltica debida a

la desnaturalizacin trmica, y la actividad enzimtica decrece rpidamente hasta anularse.

Para el caso especifico de nuestro experimento, la temperatura se mantiene constante, pero el factor determinante de la reaccin radica en el tiempo que permanece a la misma temperatura. Entre mayor tiempo permanece la muestra ( alfa amilasa y a1-4 del almidn) a la misma temperatura la reaccin empieza a acabar con el sustrato y es por ello que para los ltimos tiempos (t7, t8 y t9) la presencia del precipitado azul es menor y al contrario la cantidad de lugol aumenta considerablemente. Esto se debe a que el lugol genera un complejo ioduro de almidn, de una coloracin azul violeta intenso que permite identificar la presencia de polisacridos en la muestra. Es as que cuando se acaba el sustrato, en este caso el alfa 1-4 del almidn se deja se observar el precipitado color azul-violeta intenso.

PRUEBA DE 40C Resultados Tiempo (lapsos de 5 minutos) t0 t1 t2 t3 t4 t5 t6 t7 t8 Temperatura a 40 C Se excedi en la cantidad de lugol a aplicar Presencia de precipitado color azul Presencia de precipitado color azul Presencia de precipitado color azul Presencia de precipitado color azul Presencia de precipitado color azul Presencia de precipitado color azul, presencia de coloracin marrn (lugol). Presencia de precipitado color azul, desaparece la presencia de lugol en la muestra. Presencia de precipitado color azul, aparece de

t9

t10

t11

nuevo los residuos de lugol. Las imgenes muestran que no se realizo el experimento para estos tiempos. No hay ninguna coloracin Las imgenes muestran que no se realizo el experimento para estos tiempos. No hay ninguna coloracin Las imgenes muestran que no se realizo el experimento para estos tiempos. No hay ninguna coloracin.

Nota: En la prueba a 40 C se presenta continuidad en los resultados de la tonalidad del precipitado (color azul), pero la presencia del lugol no es continua, ya que aparentemente aparece en t6 pero en t7 desaparece por completo, para luego reaparecer en t8. Para esta prueba se debe ignorar la muestra del tiempo t0, que tambin contiene exceso de lugol. Imagen 4.1.2 resultados para prueba a temperatura de 40 C

Analisis de resultados: Para no repetir las mismas conclusiones anteriores, solo cabe agregar que la velocidad de la reaccin para una temperatura mayor (40 C) es mayor que a temperauras menores, es por ello que la presencia intermitente de lugol puede deberse a la temperatura a la cual se mantenia la muestra, pero este fenmeno puede estar relacionado con la poca agitacin del tubo de ensayo, por lo cual en algunos momentos la muestra podria tener mayor concentracin de almidon y en otras mucho menor. Experimento 4: Influencia De La Tmepratura (50 C y temperatura Ambiente) Resultados: Colocar aqu los resultados Pues no estan completos estos de aca.

Analisis de resultados Temperatura del ambiente y 50 C Partiendo de los mismo principios fsicos y qumicos expuestos con anterioridad, se pueden explicar los fenomenos ocurridos con estas temperaturas. Para los cambios ocurridos en la muestra con la temperatura ambiente, se puede decir que la temperatura no influye notablemente en los cambios ocurridos a nivel de la raccin, para este caso la velocidad de la reaccin depende netamente de la enzima. Para los resultados ontenidos con la temperatura a 50 C, se puede concluir que hay una mayor velocidad de la reaccin en comparacin con los resultados de la temperatura ambiente, esto se comprueba con la pequea cantidad de presipitado azul-violeta retenido en la placa de porcelana para los tiempos t4 y t5. A una mayor temperatura mayor velocidad de la reaccin.