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CAMPO I
GRUPO 2502
EQUIPO 1:
GUZMÁN TORRES MIGUEL ANGEL
RODRÍGUEZ HERNÁNDEZ SANDRA PATRICIA
ROJAS NAVA CLAUDIA
SÁNCHEZ FLAVIO GERMAN
OBJETIVOS GENERALES
- Conocer el manejo del equipo de Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución
- Conocer los fundamentos de la cromatografía de Líquidos de Alta Resolución en fase reversa
OBJETIVOS PARTICULARES
- Determinar las condiciones óptimas para llevar a cabo una cuantificación en Cromatografía de
Líquidos de Alta Resolución en fase reversa
a) Determinación de velocidad de flujo óptimo.
b) Determinación del % de agua en la fase móvil
- Llevar a cabo una cuantificación de paracetamol en una muestra farmacéutica por medio de la
Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución en Fase reversa
METODOLOGÍA
Selección de la
fase movil
0.9 1.2
ml/min ml/min
Las lecturas tomadas para dos diferentes velocidades, así como para diferentes % de agua para el caso de la
velocidad de flujo de 1.2 ml/min, son las siguientes
A= Paracetamol
B= Ácido Acetil salicílico
Para poder elegir cual es la velocidad de flujo más adecuada, se calculó la resolución de ambas velocidades: 0.9 y
1.2 ml /min
R = (t2 – t1) . t1 y t2 = Tiempos de retención de los picos 1 y 2
½ (w2 – w3) w1 y w2= anchuras de picos para 1 y 2
A= Paracetamol
B= Ácido Acetil salicílico
MUESTRA PROBLEMA
Aexterno = F Cinterno
Ainterno Cexterno
50 ml
50 ml
25ml
.
25ml
CALCULO DE RESOLUCIÓN
Para calcular la resolución en todos los siguientes casos se utilizó la siguiente fórmula:
R = (t2 – t1) . t1 y t2 = Tiempos de retención de los picos 1 y 2
½ (w2 – w3) w1 y w2= anchuras de picos para 1 y 2
Porcentajes de Agua:
85 % de H2O
75% de H2O
Velocidades de Flujo
A 1.2 ml/min
A 0.9 ml/min
En base a estos cálculos de resolución se confirma que la velocidad de flujo para la lectura de la muestra problema sería
0.9 ml/min con un 75% de H2O
Para poder determinar las condiciones óptimas, los estándares B2, con diferentes proporciones de agua (75 y 85 %
de H2O) se sometieron a diferentes velocidades. Mediante el análisis visual de los cromatogramas se apreció que existía
mayor separación de los picos para la proporción de agua de 75%; así mismo tomando esta proporción de agua se determinó
por el mismo análisis visual que la velocidad óptima par la cuantificación de paracetamol, es 0.9 ml/min; los picos
estuvieron más separados en este caso que en la velocidad de flujo de 1.2 ml/min.
Posteriormente en el tratamiento de los resultados se calculó la resolución para el estándar B2, primeramente para
las dos proporciones de agua (75 y 85%) de las cuales la proporción de agua de 75% tuvo la mejor resolución. De las dos
velocidades de flujo, la correspondiente a 0.9 ml/min obtuvo la mejor resolución, por lo cual se confirmaron las condiciones
óptimas: 0.9 ml/min con un 75% de H2O.
La resolución es un término para decribir el grado de separación entre dos picos. Este está afectado por la
selectividad (α ), la eficiencia (N) y la capacidad de la columna (k’). La ecuación de resolución describe la relación entre
esos factores e indica como pueden ser manipulados en orden para mejorar la resolución entre dos picos; la ecuación es la
siguiente:
R = 1α - 1 (N1/2) k ‘ .
4 α 1 + k’
Los parámetros que se ven afectados cuando se varia la proporción de la fase movil son el tiempo de retención, y
por lo tanto el factor de retención ( K ′ ), esto se debe a que se esta cambiando la polaridad de la fase movil; y observando
resultados tenemos que, con la fase movil B tenemos mejores tiempos de retención que con la fase movil A, esto es debido
a que en la fase movil B tenemos una mezcla de acetonitrilo/solución acuosa de 25/75 ml respectivamente y en la fase movil
A tenemos una mezcla de acetonitrilo/solución acuosa de 35/65 ml, y con esto se puede notar que la fase movil B es mas
polar que la fase movil A, de lo cual podemos decir que el paracetamol se va a comportar mejor en fases moviles polares.
Sin embargo al incrementar aún más la polaridad de la muestra, se nota un descenso en la resolución del cromatograma a
una proporción 15/85 acetonitrilo/agua, por lo cual se concluye que el paracetamol se comporta en fases móviles
medianamente polares.
Cambiando el flujo de la fase movil, los parámetros que cambiamos también es el tiempo de retención, los
diferentes flujos modifican el tiempo de separación del analito, esto conlleva a encontrar una relación inversa entre el flujo y
el tiempo de retención para la muestra. También cambia el ancho de pico de las bandas, esto se debe a que los solutos que se
tardan menos tiempo en salir tienen anchos de pico reducido, y por lo tanto los que tardan mas tiempo en salir los anchos de
pico son mas grandes, esto se debe a la relación:
N
W = tr
4
comparando los resultados tenemos que el flujo optimo para nuestra muestra fue la de 0.9 ml/min ya que la resolución de
los sistemas era mejor, que con el flujo de 1.2 ml/min.
El cambio de columna no se realizó en la practica, pero en caso de que si se hubiese cambiado alguno de los
factores que se pudieran ver afectados serian la resolución de los sistemas, el grado de separación, el numero de platos
teóricos, la altura. Esto puede variar debido a que en un cambio de columna se puede variar el tamaño de partícula de la cual
esta constituida la columna y por lo tanto se cambia la fase estacionaria, el tamaño de la columna también puede variar.
Las ventajas de utilizar una cromatografía en fase reversa es que podemos separar compuestos no polares o de
mediana polaridad, ya que en esta se utiliza una fase estacionaria no polar y una fase movil polar, teniendo así una buena
separación de estas muestras, ya que si intentáramos separar este tipo de compuestos en una cromatografía de fase normal
no habría separación de tales compuestos, ya que estos compuestos se irían con la fase movil sin interaccionar con la fase
estacionaria, debido a que en la fase normal se utiliza una fase estacionaria polar y una fase movil no polar.
Esta técnica es la que probablemente proporciona la retención y selectividad óptimas cuando los compuestos no
tienen grupos para enlaces de Hidrógeno o tienen un carácter predominantemente alifático o aromático. El método es muy
apropiado para separar solutos con base en el tamaño y estructura de los grupos alquilo. En química clinica se usa
frecuentemente por medio de esta técnica, el análisis cuantitativo de drogas de abuso.
En cuanto a la cuantificación de paracetamol en la muestra, esta fue de 315 mg por tableta (peso de tableta= )
que en porcentaje es de 63.03 %. Este porcentaje es bajo ya que teóricamente cada tableta debe contener 500 mg de
paracetamol; sin embargo debemos considerar que el error puede deberse al errores sistemáticos que puede proceder de la
precisión del método de cuantificación; recordemos que la metodología usada a pesar de ser rápida (en comparación con el
método de curva de calibración) puede adolecer de cierta imprecisión. También el error puede deberse al manejo de las
soluciones y del equipo por parte del operador. Debemos considerar ambos factores, ya que el porcentaje fue bajo en
comparación con el intervalo permitido (95 – 105 % de la sustancia en la muestra).
CONCLUSIONES
Se realizo la separación e identificación de paracetamol en una muestra comercial por cromatografía de líquidos de alta
resolución seleccionando las condiciones instrumentales optimas.
Se prepararon las fases movil Acetonitrilo/disolución acuosa de las cuales se obtuvo una mejor resolución con la fase movil
B. El flujo optimo en el cual se presento la mayor eficacia y resolución fue la de 0.9 ml/min.
A pesar de que el método de relación de áreas es relativamente rápido en comparación con el método de Curva de
Calibración, puede tener menos precisión; sin embargo en casos clínicos donde solo se requiere saber la presencia de una
sustancia, por ejemplo el Antidoping, puede ser de gran utilidad. En la práctica se obtuvo un porcetaje relativamente bajo,
posiblemente debido tanto al manejo de los alumnos como a la relativa falta de precisión del método (Relación de áreas)
para calcular la concentración y posteriormente la cantidad de paracetamol en la muestra.
BIBLIOGRAFÍA
WILLARD, Hobart., Métodos de Análisis Instrumental. Editorial Iberoamericana. 1991. México D.F. p.p. 616-618.