Tcnicas de tincin.

Fundamentos
El tamao de la mayora de las clulas bacterianas es tal que resultan difciles de ver con el microscopio ptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la clula y el medio que la rodea, y el medio ms simple de aumentar el contraste es la utilizacin de colorantes. Estos pueden emplearse para distinguir entre tipos diferentes de clulas o para revelar la presencia de determinados constituyentes celulares, tales como flagelos, esporas, cpsulas, paredes celulares, centros de actividad respiratoria, etc. Las clulas generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de teirlas, proceso llamado fi acin. !ara bacterias, la fi acin por el calor es lo ms corriente, aunque tambin puede fi arse con sustancias qumicas como formalde"ido, cidos y alco"oles. #espus de la fi acin, si se aade el colorante, no se producen ulteriores cambios estruturales en el protoplasma. La fi acin se realiza "abitualmente en clulas que "an sido fi adas sobre un portaob etos, tratando despus ste con el agente fi ador, y siguiendo inmediatamente el proceso de tincin. La fi acin produce "abitualmente el encogimiento de las clulas$ la tincin, por el contrario, "ace que las clulas aparezcan mayores que lo que son realmente, de manera que las medidas de las clulas que "an sido fi adas o teidas no pueden realizarse con muc"a precisin. La mayora de los colorantes son compuestos orgnicos que tienen alguna afinidad especfica por los materiales celulares. %uc"os colorantes utilizados con frecuencia son molculas cargadas positivamente &cationes' y se combinan con intensidad con los constituyentes celulares cargados negativamente, tales como los cidos nucleicos y los polisacridos cidos. E emplos de colorantes catinicos son el azul de metileno, el cristal violeta y la safranina. (tros colorantes son molculas cargadas negativameute &aniones' y se combinan con los constituyentes celulares cargados positivamente, tales como muc"as protenas. Esos colorantes incluyen la eosina, la fucsina cida y el ro o )ongo. (tro grupo de colorantes son sustancias liposolubles$ los colorantes de este grupo se combinan con los materiales lipdicos de la clula, usndose a menudo para revelar la localizacin de las gotculas o depstos de grasa. *n e emplo de colorante liposoluble es el negro +udn. ,lgunos colorantes teirn me or slo despus de que la clula "aya sido tratada con otra sustancia qumica, que no es un colorante por s mismo. Esta sustancia se denomina mordiente$ un mordiente "abitual es el cido tn-co. El mordiente se combina con un constituyente celular y lo altera de tal modo que a"ora s podr atacar el colorante. +i se desea simplemente incrementar el contraste de las clulas para la microscopa, son suficientes los procedimientos simples de tincin. El azul de metileno es un buen colorante simple que act.a sobre todas las clulas bacterianas rpidamente y que no produce un color tan intenso que oscurezca los detalles celulares. Es especialmente .til para detectar la presencia de bacterias en muestras naturales, puesto que la mayor parte del material no celular no se tie.

La tincin negativa es el reverso del procedimiento de tincin usual/ las clulas se de an sin teir, pero se colorea en cambio el medio que las rodea. Lo que se ve, por tanto, es el perfil de las clulas. La sustancia utilizada para la tincin negativa es un material opaco que no tiene afinidad por los constituyentes celulares y que simplemente rodea las clulas, tal como la tinta c"ina &que es una suspensin de particulas de carbono coloidal' o la nigrosina &un colorante negro insoluble en agua'. La tincin negativa es un modo satisfactorio de aumentar el contraste de las clulas en la microscopia ptica, pero su m0ima utilidad est en revelar la presencia de cpsulas alrededor de las clulas bacterianas. Los mtodos de tincin son de gran utilidad, pero deben usarse siempre con precaucin, ya que pueden conducir a errores. Las molculas de colorante forman en ocasiones precipitados o agregados que parecen estructuras celulares autnticas, pero que son formaciones completamente artificiales inducidas por el mismo colorante. 1ales estructuras se denominan artefactos, y deben tomarse muc"as precauciones para tener la seguridad de que no nos estamos equivocando al creer que un artefacto es una estructura realmente e0istente.

Preparacin de un frotis
+obre un portaob etos de vidrio, limpio y seco, se coloca una gota del material que se va a teir &si es lquido' o se "ace rodar el "isopo con que se tom la muestra. *na vez que el "isopo "a tocado la superficie del portaob etos, que no est estril, ya no puede ser empleado para inocular los medios de cultivo. !uede usarse una agu a estril para transferir una pequea cantidad de un cultivo bacteriano a la superficie del portaob etos. Este material es suspendido en una gota de agua o solucin salina previamente colocada sobre el portaob etos. )uando se trata de colonias muy pequeas que pueden perderse en una gota de lquido se emplea una varilla delgada de madera estril con la cual se toca la colonia obtenindose as una fraccin apreciable del desarrollo. El material se frota directamente sobre el portaob etos, donde puede visualizarse con facilidad. El material colocado en el portaob etos se de a secar al aire o bien se pasa varias veces por la zona azul de la llama de un mec"ero de 2unsen "asta que el vidrio est tan caliente que moleste al tacto pero no queme.

Examen de muestras al microscopio

+eg.n la manipulacin que efectuemos sobre la muestra a observar y seg.n los colorantes que empleemos durante el proceso, podemos "ablar de diferentes modalidades de tincin.

Examen microscpico directo de las muestras clnicas

3o se utiliza ning.n tipo de colorante.

Sin Tincin

Es el monta e directo ".medo o e0amen en fresco/ las muestras se e0tienden directamente sobre la superficie de un portaob etos para su observacin. El material que es demasiado espeso para permitir la diferenciacin de sus

elementos puede diluirse con igual volumen de solucin salina fisiolgica estril. +e deposita suavemente un cubreob etos sobre la superficie del material. Este tipo de preparacin se emplea para detectar trofozotos mviles de parsitos intestinales como Giardia, Entamoeba, "uevos y quistes de otros parsitos, larvas y gusanos adultos, Trichomonas, "ifas de "ongos, etc En la imagen/ Candida sp en un e0amen en fresco.

Examen microscpico de las muestras clnicas levemente modificadas Tincin Simple

+e utiliza un solo colorante, por lo que todas las estructuras celulares se tien con la misma tonalidad &1inta c"ina, ,zul %etileno de Loeffler, ,zul de lactofenol'. El 4idr0ido de potasio al 567 &solucin de 8(4' permite ver elementos de "ongos ya que el 8(4 digiere parcialmente los componentes proteicos, por e emplo de la clula "usped, pero no act.a sobre los polisacridos de las paredes celulares de los "ongos. La tinta c"ina o 3igrosina permite observar clulas levaduriformes capsuladas & Cryptococcus', sobre todo en L)9. Los polisacridos capsulares rec"azan la tinta c"ina y la cpsula aparece como un "alo claro alrededor de los microorganismos. ,zul de metileno de Loeffler puede agregarse a las preparaciones en fresco de "eces para observar la presencia de leucocitos. En la imagen/ Cryptococcus neoformans en una tincin con tinta c"ina.

Examen microscpico de las muestras clnicas muy modificadas Diferencial

Tincin

+e utilizan varios colorantes combinados. Las estructuras celulares se diferencian en funcin de los diferentes colorantes que fi an de acuerdo con su propia constitucin qumica. Los e emplos clsicos sera la tincin de :9,% o la de ;ie"l<3eelsen En la imagen/ 2:3 y levaduras en una tincin :9,%
microfotografa/ #aniel =al

Examen de muestras al microscopio: la tincin GRAM

La tincin de :ram es uno de los mtodos de tincin ms importantes en el laboratorio bacteriolgico y con el que el estudiante debe estar perfectamente familiarizado. +u utilidad prctica es indiscutible y en el traba o microscpico de rutina del Laboratorio de %icrobiologa las referencias a la morfologa celular bacteriana & cocos, bacilos, positi os, ne!ati os , etc' se basan ustamente en la tincin de :9,% #escripta en forma breve, la secuencia de la tincin es la siguiente/ el >rotis fi ado con calor se tie 5 min con =ioleta )ristal, se lava con agua, se cubre con solucin ?odada durante 5 min y se lava de nuevo con agua, decolorar con mezcla alco"ol etlico@acetona. Escurrir y cubrir con +afranina &color de contraste' durante A6 seg. Lavar y secar. Esta tincin se denominada as por el bacterilogo dans )"ristian :ram, quien la desarroll en 5BCC. +obre la base de su reaccin a la tincin de :ram, las bacterias pueden dividirse en dos grupos, grampositivas y gramnegativas &en este caso, los trminos positivo y negativo no tiene nada que ver con carga elctrico, sino simplemente designan dos grupos morfologicos distintos de bacterias'. Las bacterias gram<positivas y gram<negativas tien de forma distinta debido a las diferencias constituti as en la estructura de sus paredes celulares . La pared de la clula bacteriana sirve para dar su tamao y forma al organismo as como para prevenir la lisis osmtica. El material de la pared celular bacteriana que confiere rigidez es el peptidoglicano. La pared de la clula gram<positiva es gruesa y consiste en varias capas interconectandas de peptidoglicano as como algo de cido teicoico. :eneralmente, B67<D67 de la pared de la clula gram<positiva es peptidoglicano. La pared de la clula gram<negativa, por otro lado, contiene una capa muc"o ms delgada, .nicamente de peptidoglicano y est rodeada por una membrana e0terior compuesta de fosfolpidos, lipopolisacridos, y lipoprotenas. +lo 567 < A67 de la pared de la clula gram<negativa es peptidoglicano. #ebido a su importancia en ta0onoma bacteriana y a que indica diferencias fundamentales de la pared celular de las distintas bacterias, describiremos aqu con alg.n detalle la tincin de :ram y las interpretaciones que actualmente se "acen sobre el porqu de su funcionamiento. Las clulas fi adas al calor sobre un portaob etos se tien, primero con una solucin de cristal violeta &otros colorantes bsicos no son tan efectivos' y son lavadas despus para quitar el e0ceso de colorante. En este estado, todas las clulas, tanto las grampositivas como las gramnegativas, estn teidas de azul. El portaob etos se cubre entonces con una solucin de yodo<yoduro potsico. El ingrediente activo es aqu el EA$ el 8E simplemente "ace soluble el EA en agua. El EA entra en las clulas y forma un comple o insoluble en agua con el cristal violeta. #e nuevo tanto las clulas grampositivas como las gramnegativas se encuentran en la misma situacin.

+e lleva a cabo despus la decoloracin, usando una mezcla de alco"ol<acetona, sustancias en las que es soluble el comple o E A<cristal violeta. ,lgunos organismos &grampositivos' no se decoloran, mientras que otros &gramnegativos' lo "acen. La diferencia esencial entre esos dos tipos de clulas est por tanto en su resistencia a la decoloracin$ esta resistencia se debe probablemente al "ec"o de que en el caso de bacterias gram<negativas, la mezcla de alco"ol@acetona es un solvente lipdico y disuelve la membrana e0terior de la pared de la clula &y tambin puede daar la membrana citoplsmica a la que se une peptidoglicano'. La delgada capa de peptidoglicano es incapaz de retener el de comple o cristal violeta<yodo y la clula se decolora. Las clulas grampositivas, a causa de sus paredes celulares ms espesas &tienen ms peptidoglicano y menos lpido', no son permeables al disolvente ya que ste des"idrata la pared celular y cierra los poros, disminuyendo as el espacio entre las molculas y provocando que el de comple o cristal violeta<yodo quede atrapado dentro de la pared celular. #espus de la decoloracin las clulas grampositivas son todava azules, pero las gramnegativas son incoloras. !ara poner de manifiesto las clulas gramnegativas se utiliza una coloracin de contraste. 4abitualmente es un colorante de color ro o, como la safranina o la fucsina bsica. #espus de la coloracin de contraste las clulas gramnegativas son ro as, mientras que las grampositivas permanecen azules. #eben destacarse algunos aspectos cruciales de la tincin de :ram/ 5' El tratamiento con cristal violeta debe preceder al tratamiento con yodo. El yodo por s solo tiene poca afinidad con las clulas. A' La decoloracin debe realizarse con poca agua para evitar que pierdan la tincin las clulas grampositivas. EE proceso de decoloracin debe ser corto y es esencial un clculo preciso del tiempo para obtener resultados satisfactorios. F' )ultivos ms vie o de AC "oras pueden perder su "abilidad de retener el comple o cristal violeta < yodo. El carcter de grampositivo no es siempre un fenmeno del todo o nada. ,lgunos organismos son ms grampositivos que otros y algunos son gram<variables, es decir, unas veces grampositivos y otras gramnegativos.

Morfolo!"a ultramicroscpica estructuras internas

Pared celular

de

las

bacterias:

#eba o de las sustancias e0tracelulares, como son las cpsulas y cubiertas mucilaginosas, y en la periferia de una delicada membrana que est en inmediato contacto con el citoplasma, se encuentra la pared celular, que es una estructura rgida que da forma a la clula. Las paredes celulares pueden destruirse o romperse en condiciones especiales. )onstituyentes importantes de la pared celular son los aminocidos, aminoaz.cares, az.cares y grasas. Estas sustancias &protenas, 4idratos de carbono, grasas' estn enlazadas formando el polmero comple o que forma la pared celular. Entre los constituyentes de la pared celular de las bacterias Gram#positi as y Gram# ne!ati as e0isten importantes diferencias. !or e emplo, las paredes de las bacterias gram< positivas contienen menos aminocidos que las gram<negativas$ el contenido graso es muc"o ms elevado en las gram<negativas que en las gram<positivas. Este "ec"o se "a propuesto como e0plicacin del mecanismo de la reaccin al gram &ver las dos im$!enes %untas&. 'acteria Gram Positi a 'acteria Gram (e!ati a

1iene una capa delgada de peptidoglicano &mureina' unida a una membrana e0terior por lipoprotenas. La membrana e0terior 1iene una capa gruesa de peptidoglicano &mureina' y dos clases de cidos teicoicos. Gcido Lipoteicoico que est en la superficie, empotrado en la capa de peptidoglicano y unido a la membrana citoplsmica. ? cido teicoico de la pared que est en la superficie y se une slo a la capa de peptidoglicano. El cido 1eicoico es el responsable del determinante antignico del organismo. est "ec"a de protena, fosfolpido y

lipopolisacrido. En el lipopolisacrido, la porcin de lpido est embebida en el fosfolpido y el antgeno (

polisacrido est en la superficie. El lpido se llama Lpido , y es t0ico, pero el lipopolisacrido entero se llama Endoto0ina. La pared de la clula tiene poros llamado !orines para el transporte de substancias de peso

molecular ba o. Entre la membrana citoplsmica y la pared celular "ay un espacio periplsmico de con enzimas y

"idrolticas,

enzimas

inactivadoras

antibiticos

protenas de transporte.

1ambin e0isten diferencias en la composicin de la pared entre las clulas de las diversas especies.

Membrana Citoplsmica (citoplasmtica o protoplasmtica)

Enmediatamente deba o de la pared celular, e0iste una membrana fina, o envoltura, que se denomina membrana citoplsmica o protoplsmica y est formada por una bicapa de fosfolpido integral y protenas perifricas empotradas. La membrana citoplsmica tiene una significacin funcional de suma importancia. +e trata de una membrana semipermeable, selectiva, que controla el paso de los elementos nutritivos dentro de la clula y la salida de los productos de desec"o. 1iene enzimas respiratorias y durante la divisin celular el cromosoma se une a la membrana de la clula en el sitio llamado %esosoma.

Citoplasma
El material celular contenido dentro de la membrana citoplsmica puede dividirse en tres partes, regin citoplsmica, de apariencia granular, la cual es rica en 93,, regin nuclear o cromatnica, que es rica en #3,, y la parte lquida que mantiene disueltos los elementos nutritivos. El 93,, combinado con protenas, forma partculas o corp.sculos macromoleculares, de unos A66 , de dimetro, que forman una masa densa y compacta en todo el citoplasma. Estas partculas de 93,<protena se denominan ribosomas, y son el equivalente en las bacterias de los microsomas, o partculas que se encuentran en las clulas animales y vegetales.

Estructuras Citoplasmticas
(ucleoide )cuerpo cromat"nico& Las clulas bacterianas no contienen el n.cleo caracterstico de las clulas de las plantas y animales superiores. +in embargo, contienen en el citoplasma HcuerposH que se consideran como una estructura nuclear, el ,#3 de la clula bacteriana se encuentra confinado en este espacio, es .nico y circular, doble "lice sin protenas. )omo no se trata de un n.cleo discreto, se "a sugerido que se d a estas estructuras las denominaciones de cuerpo cromatnico, nucleoides, equivalentes nucleares, y aun cromosomas bacterianos. +e demuestra con el mtodo de tincin de >eulgen, especfico para el #3,, y por microscopia electrnica, porque la sustancia nuclear es menos densa que el citoplasma cincundante. Ribosomas 1ienen estrec"a relacin con la sntesis de protenas &F6+ y I6+ para formar un comple o J6+'. Pl$smidos Lazos e0tracromosmicos de ,#3, alg.n cdigo para la resistencia a drogas, to0inas y otros factores. Endosporas

,lgunas bacterias pueden transformarse en pequeos ovoides o esferas, que son formas celulares muy resistentes, denominadas esporas, o endosporas, porque se producen intracelularmente. 1odos los organismos de los gneros Bacillus y Clostridium se caracterizan, en parte, por su propiedad de producir esporas. 1ambin tienen esta propiedad otros gneros de bacterias verdaderas, pero slo en casos aislados. Las bacterias capaces de esporular pueden crecer y reproducirse en forma de clulas vegetativas durante muc"as generaciones. +in embargo, en cierto perodo del desarrollo del cultivo en medio nutritivo apropiado, se produce, dentro del citoplasma, la sntesis de nuevo protoplasma destinado a transformarse en espora.

Tincin GRAM: Morfolo!"a 'acteriana

?a "emos visto que la tincin de GRAM aporta dos ideas bsicas para la deficinin Hta0onmicaH de las bacterias/ el color que adquieren tras la tincin y la forma que presentan las clulas bacterianas. En lo relativo a la coloracin, ya "emos e0plicado anteriormente que "ablamos de

microorganismos Gram#positi os cuando aparecen teidos de color azul<violeta y de Gram ne!ati os cuando se visualizan de color ro o<rosado. Formas b$sicas en que se puede visualizar la morfologa bacteriana en una tincin :9,%/

Cocos
%icrococos, aparecen aislados y dispersos tras la divisin celular. #iplococos, aparecen por pares. Estreptococoss, tienden a unirse formando cadenas. Estafilococos, aparecen en grupos irregulares, a veces de gran tamao

forma esfrica/ se llama )oco

#ivisin a lo largo del mismo plano, formando cadenas cortas A cocos untos/ #iplococos C < A6 en cadenas/ Estreptococos #ivisin a lo largo de A planos diferentes/ 1tradas

#ivisin a lo largo de F planos

regularmente/ +arcinas

irregularmente/ Estafilococos

Bacilos
grandes variaciones morfolgicas/ fusiformes, estreptobacilos, cocobacilos

>orma de vara/ se llaman 2acilos

#os bacilos untos/ #iplobacilos

)adenas de bacilos/ Estreptobacilos

Empalizadas, 2acilos lado con lado o en figuras en K, = o ?

Espirales &1reponemas, 2orrelias ...'

>orma espiral rgida se llama/ Espirilo

+i la espiral es fle0ible y ondulada se llama/ Espiroqueta

*tilizamos el trmino !leomorfismo para referirnos a la adopcin de diferentes formas en una misma especie.

Tincin GRAM: 'acterias Gram#Positi as

Cocos Gram-positivos
9acimos/ forma tpica de Staphylococcus sp, como S. aureus

)adenas/ forma tpica de Streptococcus sp, como S. pneumoniae, Streptococcus grupo 2

1etradas/ forma tpica de Micrococcus sp

Bacilos Gram-positivos
:ruesos/ forma tpica de Clostridium sp, como C. perfringens, C. septicum

>inos/ forma tpica de Listeria sp

9amificados/ forma tpica de Actinomycetes y Nocardia, como A. israelii

grficos obtenidos de/ *ttp:++,,,.up*s.upenn.edu+bu!dru!+antibiotic-manual+!ram.*tm

Tincin GRAM: 'acterias Gram#(e!ati as

Cocos Gram-negativos

#iplococos/ forma usual de Neiseria sp, como N. meningitidis 1ambin Mora ella sp y Acinetobacter sp aparecen con morfologa de diplococos. Acinetobacter puede ser pleomrfico, y a veces aparece como coco :ram<positivo.

)ocobacilos/ forma usual de Acinetobacter sp, que puede ser :ram<positivo o :ram<negativo, y, a menudo, :ram<variable.

Bacilos Gram-negativos

2acilos finos/ forma usual de enterobacteriaceae, como E. Coli

)ocobacilos/ forma usual de !aemophilus sp, como !. influen"ae

)urvados/ forma usual de #ibrio sp, como #. cholerae, y Campylobacter sp, como C. $e$uni

>orma

de

agu a

fina/

forma

usual

de

%usobacterium sp

grficos obytenidos de/ *ttp:++,,,.up*s.upenn.edu+bu!dru!+antibiotic-manual+!ram.*tm

.tras tinciones de uso *abitual

RODAMINA-AURAMINA
Los cidos miclicos de las paredes celulares de las micobacterias poseen afinidad para los fluorocromos auramina y rodamina. Estos colorantes se fi an a las bacterias, que aparecen de color amarillo o naran a brillante contra un fondo verdoso. El permanganato de potasio, empleado como contraste, evita la fluorescencia inespecfica. 1odos los microorganismos cido< alco"ol resistentes, incluyendo los esporozoarios parsitos, se tien con estos colorantes. *n aspecto importante de la coloracin rodamina<auramiria es que luego los frotis pueden ser reteidos con la coloracin de ;ie"l<3eelsen o 8inyoun directamente sobre la tincin con el fluorocromo, si se elimina antes el aceite de inmersin. #e esta forma, los resultados positivos pueden ser confirmados con las coloraciones tradicionales, que adems permiten la diferenciacin morfolgica.

NARAN A DE ACRIDINA

El fluorocromo naran a de acridina se une al cido nucleico ya sea en su forma nativa o desnaturalizada. En algunas preparaciones de naran a de acridina, el color de la fluorescencia puede variar, dependiendo del p4 y de la concentracin. El naran a de acridina "a sido empleado como colorante vital, que da una fluorescencia verde si el microorganismo est vivo y ro a si est muerto. #e todos modos, como el colorante se intercala en el cido nucleico, el germen viable se inactivar poco tiempo despus de la tincin. El uso de naran a de acridina para detectar la presencia de bacterias en los "emocultivos "a sido ampliamente aceptado. #e "ec"o, una gran cantidad de estudios "an demostrado que la tincin de "emocultivos con naran a de acridina es tan sensible como el subcultivo ciego para la deteccin inicial de "emocultivos positivos.

!IE"#-NEE#$EN (%AAR)
Las paredes celulares de ciertos parsitos y bacterias contienen cidos grasos &cidos miclicos' de cadena larga &I6 a D6 tomos de carbono' que les confieren la propiedad de resistir la decoloracn con alco"ol<cido, despus de la tincin con colorantes bsicos. !or esto se denominan cido<alco"ol resistentes. Las micobacterias como M. tuberculosis y M. marinum y los parsitos coccdeos como Cryptosporidium se caracterizan por sus propiedades de cido< alco"ol resistencia. La coloracin clsica de ;ie"l<3eelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras. +e "a desarrollado una coloracin de cido<alco"ol resistencia modificada que diferencia las especies de Nocardia &bacterias ramificadas filamentosas cuyas paredes celulares contienen cidos<grasos de unos I6 tomos de carbono', de los actinomiceos &muy seme antes pero no cido<alco"ol resistentes'. Nocardia spp son decoloradas por la mezcla cido<alco"ol estndar pero no por un tratamiento ms suave con cido sulf.rico 6,I a 57. Estos microorganismos se denominan cido<alco"ol resistentes parciales o dbiles. El frotis se tie durante unos I min con )arbolfucsina aplicando calor suave. Lavar con agua. #ecolorar con alco"ol etlico DI7 con un F7 de )l4 concentrado. Lavar y teir durante F6<L6 seg con ,zul de %etileno &color de contraste'. Lavar y secar

%#ANCO DE CA#CO&#'OR
Las paredes celulares de los "ongos fi an el colorante blanco de calcofl.or aumentando considerablemente su visibilidad en los te idos y otras muestras. +eg.n fue descrito por 4ageage y 4arrington, este colorante se emplea en lugar de 8(4 al 567 para el e0amen inicial de los materiales clnicos. 1ambin se emplea para aumentar la visualizacin de los elementos morfolgicos de los cultivos puros de los "ongos. En algunos laboratoros "a suplantado al azul de lactofenol en muc"as aplicaciones. Los organismos fluorescen con luz blanco<azulada o verde manzana, seg.n la fuente luminosa que se utilice.

TINCIN DE ESPORAS (WIRTZ-CONKLIN)

Algunos gneros bacterianos, entre los que destacan Clostridium y Bacillus, producen en su interior formas de resistencia denominadas endosporas. Se producen cuando las condiciones ambientales son desfavorables (agotamiento de los nutrientes, temperaturas extremas, radiaciones, compuestos txicos, etc.) formndose una espora por cada forma vegetativa. Al finali ar el proceso de esporognesis, la clula vegetativa se lisa y libera la espora al exterior. !uando el ambiente es favorable, la espora germina generando una nueva forma vegetativa. "a capacidad de germinar perdura durante a#os. Algunas de las bacterias productoras de endosporas son patgenas para el $ombre, por lo que su estudio y observacin son de enorme inters.

OBJETIVOS
'. *.

FUNDAMENTO "as endosporas poseen unas cubiertas exclusivas que las $acen resistentes a los factores ambientales adversos. Adems, estas $acen cubiertas que las

'. +bservar las endosporas y su disposicin en las formas vegetativas. *. !omparar las distintas morfolog%as y disposiciones que adoptan las endosporas en las especies empleadas.

MATERIAL NECESARIO ( ,ortaob-etos con frotis bacterianos previamente preparados. ( !olorantes& a) Solucin de verde malaquita (./) b) Solucin de safranina (0,./) ( ,in as de madera ( 1ec$ero 2unsen o de alco$ol ( 1icroscopio y aceite de inmersin

esporas apare can en el microscopio ptico como estructuras refringentes y de dif%cil tincin. "a tincin espec%fica de esporas requiere dos colorantes& '.( )erde malaquita& capa de te#ir las esporas en caliente. *.( Safranina& colorante de contraste que ti#e las formas vegetativas. "as endosporas, tras la primera tincin, no perdern el colorante en el lavado con agua, y s% lo $arn las formas vegetativas, que quedarn te#idas con el segundo colorante.

REALIZACIN Se emplearn cultivos en fase estacionaria para dar lugar a que las bacterias produ can las esporas. 3sta tincin es delicada en su reali acin y para poder obtener unos resultados satisfactorios $ay que seguir cuidadosamente las instrucciones.
&'

&' bacterianos

,reparar

los

frotis
('

indicados. (' 4e#ir la con pin as muestra mec$ero $umee que ms evapora5 muestra "avar exceso con "avar la verde malaquita. !on unas de madera colocar encima de la llama del de forma que el colorante durante . min. Nota& muestra colorante es no se seque.
)'

evitar A#adir se la

$ierva. si

ste que )'

importante

con abundante agua el de colorante.

*'

*' +'

4e#ir

safranina ' min.

+' ,' -'

con abundante agua el exceso de colorante. ,' Secar la preparacin.

Tincin d

!"#$%!

-' +bservar la preparacin al microscopio. Anotar la disposicin y la morfolog%a

de las tres especies del gnero Bacillus.

INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOS "a posicin y la morfolog%a de la endospora en el interior de la bacteria constituyen un carcter taxonmico 6til para diferenciar especies dentro de un mismo gnero.
Las tres bacterias empleadas en esta prctica difieren en la disposicin y morfologa de las endosporas. B. sphaericus posee una endospora esfrica con localizacin terminal y deformante de la clula

vegetativa, por lo que suele ser denominada "en palillo de tambor". B. thuringiensis tiene localizada la endospora elipsoidal en el centro de la clula vegetativa, lo que provoca un abombamiento caracterstico denominado "en huso". B. subtilis forma una espora cilndrica subterminal no deformante.

L#c%.i/%ci0 1 2#$3#.#4 d .%! !"#$%! n B%cillus