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Pruebas Bioquimicas de Identificacion 243338506
Pruebas Bioquimicas de Identificacion 243338506
catalasa
Prueba de la catalasa
Fundamento: Detecta la presencia de la enzima catalasa. Procedimiento: En portaobjetos colocar sobre una colonia unas gotas de H202 3 %. H202 H20 + 02 Liberacin de burbujas rpida y sostenida indica la produccin de oxgeno molecular = prueba (+) Consideraciones: No Agar sangre (peroxidasa en los eritrocitos).
coagulasa
Prueba de la coagulasa
Fundamento: Detecta un factor de agregacin clumping factor en la superficie de la bacteriana. Procedimiento: se coloca una colonia sospechosa de pertenecer a una especie de Staphylococcus y se emulsifica en una gota de plasma de conejo. Interpretacin: arracimamiento bacteriano en 1 minuto = prueba (+). Si el resultado es negativo ensayar la produccin de coagulasa en tubo. Consideraciones: Utilizar plasma con EDTA y no citratado, ya que organismos capaces de metabolizar el citrato (Enterococcus spp.) pueden dar resultados falsos (+). Las pruebas (-) luego de 4 hs de incubacin a 35C, dejar a temperatura ambiente y leer luego de 18-24 hs a fin de evitar la fibrinlisis que producen algunas cepas al ser incubadas en forma prolongada a 35C.
Prueba de PYR
DNAsa
Prueba de la DNAsa
Fundamento: El S. aureus produce una DNAasa termoestable que hidroliza DNA. La produccin de DNAsa puede determinarse incorporando cido desoxirribonucleico (DNA) en agar nutritivo . Procedimiento: Se inocula el microorganismo en manchas densas sobre agar DNA y despus de 18 a 24 hs de incubacin. Revelar con HCl al 1%, que precipita el DNA nativo del medio.
Interpretacin: colonias rodeadas por una zona clara donde el ADN ha sido despolimerizado e hidrolizado = prueba (+)
Manitol salado
Consideraciones: La alta concentracin de sal inhibe otros microorganismos excepto enterococos (por lo tanto usar la placa para identificacin, no para aislamiento).
Bilis Esculina
Prueba de la bilis-esculina:
Fundamento: Se basa en la capacidad de ciertas bacterias (estreptococos del grupo D) para hidrolizar la esculina en presencia de 1-4% de sales biliares. Procedimiento: Se inocula el microorganismo en la superficie de un pico de flauta. Incubar 24 hs. Interpretacin: La beta glucosidasa escinde la esculina en glucosa y esculetina. Esta ultima es soluble en el medio y forma un complejo de color negro con Fe 3+ .La hidrlisis de esculina se observa como un oscurecimiento del medio (color negro) en 24 hs de incubacin a 35C, raramente se requieren 48 hs de incubacin hasta que la hidrlisis sea aparente. Consideraciones: Es importante que el medio contenga 40% de bilis, ya que algunos productos contienen menos cantidad lo que lleva a confundir algunos estreptococos viridans con enterococos
Prueba de CAMP
Fundamento: Los estreptococos grupo B secretan el factor CAMP que interacta con la -hemolisina secretada por una cepa hemoltica de S. aureus (ATCC 25923) lo que causa un acrecentamiento o sinergismo de la hemlisis. Procedimiento: En placa de agar sangre sembrar una estra de la cepa de S. aureus y perpendicularmente a sta (lo ms cerca posible, sin llegar a tocarla) sembrar la cepa de estreptococo en estudio. Tiempo y T de incubacin: Incubar 24 hs a 35C en aerobiosis (en CO2 aumentan los falsos positivos). Interpretacin: El sinergismo se observa como un rea de Hemlisis en forma de punta de flecha en la zona de desarrollo ms cercana a ambas estras.
Prueba de CAMP
Hidrlisis de hipurato
Prueba de la Bacitracina:
Fundamento: Se basa en que ciertas bacterias son sensibles a la bacitracina. Procedimiento: Se inocula el microorganismo en AS segn tcnica de Kirby-Bauer utilizando discos de Bacitracina (0.04 U). Interpretacin: Sensible: Cualquier zona de inhibicin del desarrollo. Consideraciones: Kirby Bauer (Difusin en disco) Inoculo sin incubacin previa Tiempo de lectura: 18 a 24 hs. T de incubacin: 33 a 35 en CO2 Recordar que el uso de discos de Bacitracina en forma directa en las placas primarias de cultivo puede dar como resultado un 40% a 50% de falsos negativos.
Prueba de la Bacitracina
Prueba de la optoquina
Oxidasa
NEG
POS
Consideraciones Esta prueba no puede realizarse con colonias que provengan de medios de cultivo que contenga hidratos de carbono ni indicadores, por lo que si se la va a realizar se debe incubar los microorganismos en un placa de AS o bien un TSA (tripteina-soya-agar)
Prueba OF
SIM
SIM
SH2+ Ind+ Mot+ SH2+ IndMotSH2- Ind+ Mot+
SH2- IndMot-
Prueba de VP y RM
ONPG
ONPG (O-NITROFENIL-GALACTOPIRANSIDO)
Fundamento: Lo microorganismos lactosa (+) tienen -galactosidasa y permeasa, dos enzimas necesarias para la formacin de cidos a partir de la lactosa La permeasa es necesaria para que la molcula de lactosa ingrese en la clula bacteriana. Hay algunos microorganismo que son falsos lactosa (-) por carecer de permeasa, pero s tienen -galactosidasa, en realidad son lactosas (+). Esta prueba se hace con los microorganismo que dan lactosa (-) Procedimiento: Hacer un inculo con SF estril, agregar un disco de papel comercial, se agita y antes de los 2 minutos se debe leer. Interpretacin: Un color amarillo intenso nos indica que el microorganismo es productor de -galactosidasa= prueba (+). Consideraciones Se hace un inculo del microorganismo en solucin fisiolgica estril, se agrega un disco de papel. Se lleva a incubar a 37C durante 24hs.
Citrato
CITRATO
Fundamento: Sirve para poner de manifiesto aquellos microorganismos que utilizan el citrato como nica fuente de carbono, el indicador es azul de bromo timol. Procedimiento: El color original del medio es verde, y se encuentra fraccionado en pico de flauta, la siembra se hace por estra, se incuba 24-72hs a 35C. Interpretacin: Si el microorganismo utiliza citrato, se produce alcalinizacin del medio de cultivo pasando ste a color azul intenso, lo cual indica prueba positiva para el citrato.
Ureasa
Positivo Negativo
UREA:
Fundamento: Sirve para poner de manifiesto aquellos microorganismo que poseen la enzima ureasa. Procedimiento: El medio fraccionado en pico de flauta contiene urea y rojo de fenol como indicador, el color original del medio es amarillo (o sea cido) La siembra se realiza con ansa de punta tanto en profundidad como en la superficie. Se deja incubar 24 hs a 35 C. Interpretacin: Si el microorganismo es productor de ureasa, desdobla la urea produciendo amonaco, consecuentemente produce alcalinidad que se manifiesta porque el medio toma un color fucsia.
Fenilalanina
(-) (+)
FENIL-ALANINA-DESAMINASA:
Fundamento: Sirve para poner de manifiesto aquellos microorganismo que poseen la enzima FENILALANINA-DESAMINASA. El medio se prepara con un pico de flauta largo, pues la lectura se hace sobre la superficie del medio de cultivo.
Procedimiento: Se siembra sobre la superficie del medio solamente, se incuba 24 hs a 35 C, se revela con cloruro frrico. Interpretacin: El color original es amarillo, si el microorganismo es productor de la enzima, al agregar sobre el medio cloruro frrico, sta se pone de manifiesto, dando a la superficie un color verde intenso.
Lisina Decarboxilasa
AMINOCIDOS: DESCARBOXILASAS:
Fundamento: Las descarboxilasas son enzimas sustratoespecficas (presentes o no en los microorganismos) capaces de reaccionar con la porcin carboxilo (COOH) de AA formando aminas de reaccin alcalina. Esta reaccin, conocida como descarboxilacin, forma C02 como producto secundario. Cada descarboxilasa es especfica para un aminocido. Lisina, arginina y ornitina son los aminocidos evaluados de rutina en la identificacin de enterobacterias. El medio Moeller es la base (semi-slida) que se emplea con ms frecuencia. El aminocido se agrega a la base. El color original es lila. Procedimiento: Se inoculan por puncin 2 tubos y se sellan con aceite mineral. Uno de los tubos contiene el AA y el otro no. Interpretacin: Si el aminocido es descarboxilado, se forman aminas alcalinas y el medio pasa a violeta ms intenso. Si no es descarboxilado pero fermenta la glucosa, vira al amarillo por la formacin de cidos
LIA SH2 -
LIA + SH2 -
LIA + SH2 -
LIA: Agar de ensayo para la demostracin simultnea de lisina decarboxilasa (LD) y de la formacin de hidrogeno sulfurado (H2S) para la identificacin de enterobacterias. La lisina puede ser descarboxilada por microorganismos LD positivas que la transforman en la amina cadaverina. Esto produce un viraje al violeta del indicador de pH prpura de bromocresol,puesto que la descarboxilacin slo tiene lugar en medio cido (pH inferior a 6.0). Es necesario que se produzca previamente la acidificacin del medio decultivo, por fermentacin de la glucosa. Este medio de cultivo solo puede utilizarse para la diferenciacin de bacterias que fermentan glucosa. Los microorganismos LD negativos, pero fermentadores de la glucosa, producen un viraje al amarillo de la totalidad del medio de cultivo. La incubacin prolongada puede ocasionar alcalinizacin en la zona de la superficie del medio de cultivo y en consecuencia, se produce un viraje al violeta. La formacin de H2S produce una coloracin negra debido al sulfuro de hierro producido.