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Manual de prcticas y talleres en Biologa General - Universidad del Valle Departamento de Biologa F. Castro, C. Rosero, F.

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PRACTICA 1 INSTRUMENTACIN PARA LA INVESTIGACIN EN BIOLOGA

1. EL MICROSCOPIO COMPUESTO INTRODUCCIN El Microscopio es un instrumento ptico que permite observar, medir y cuantificar objetos y organismos muy pequeos. El microscopio tiene dos propiedades importantes: El aumento y la resolucin. El poder resolutivo es la capacidad que tiene un microscopio (o el ojo humano, etc.) de percibir por separado dos puntos pequeos, adyacentes y cercanos, es decir, la capacidad para percibir detalles. El poder resolutivo aumenta a medida que disminuye la distancia que separa dichos puntos. Es decir, si dos puntos distan 1cm uno del otro y yo los veo como un solo punto borroso tendr menor poder resolutivo que alguien que los distingue por separado o que distingue perfectamente puntos que distan de 0,5cm entre si. Cuanto mayor sea el poder resolutivo, mayor ser la definicin de un objeto. Los microscopios de gran poder resolutivo son especialmente buenos para ver pequeas estructuras. El poder de aumento se define como la relacin entre el dimetro aparente de la imagen y el dimetro o longitud del objeto. Esto quiere decir que si el microscopio aumenta 100 dimetros un objeto, la imagen que estamos viendo es 100 veces mayor que el tamao real del objeto. Para calcular el aumento de un microscopio, basta multiplicar el aumento del ocular por el aumento del objetivo. Por ejemplo, si estamos utilizando un ocular de 10X y un objetivo de 45X, el aumento a que estamos viendo la preparacin ser: 1OX x 45X = 450X, lo cual quiere decir que la imagen del objeto est ampliada 450 veces. Existen diferentes tipos de Microscopios los cuales varan en su poder de resolucin y aumento Los rangos aproximados de magnificacin se encuentran entre 4X y 40X (Microscopio Estereoscpico), 20X-25X (Microscopio Simple o Lupa), 40X-1500X (Microscopio Compuesto), 10.000X-16.000X (Microscopio Electrnico), donde X es el nmero de veces que se aumenta el tamao real del objeto. Adems de estos existen algunos Microscopios especiales como los Microscopios de Contraste de Fase y los Microscopios Invertidos. Una comparacin entre la forma como actan los Microscopios ptico, Electrnico de Transmisin y Microscopio Electrnico de Barrido.

OBJETIVO El propsito del siguiente ejercicio es la adquisicin de experiencia sobre el uso y cuidado del Microscopio. As, podremos aprender; Primero: cmo disponer el Equipo para las observaciones; Segundo: los nombres de las diferentes partes del Microscopio y sus funciones; Tercero: la tcnica de observar objetos y de preparar materiales para la

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observacin, as como el ajuste y enfoque correctos; Finalmente, estudiaremos las formas de medir los tamaos de los objetos microscpicos. Al finalizar el Laboratorio Usted deber haber adquirido destreza en el cuidado y uso del Microscopio. MATERIALES Cada estudiante debe traer: Lminas porta objetos Laminillas cubre objetos Bayetilla y papel toalla absorbente

Suministrado por el laboratorio: Microscopio Papel milimetrado Papel peridico Papel de revista Aceite de inmersin

PROCEDIMIENTO 1. Disposicin del Microscopio: Al recoger El Microscopio tmelo con ambas manos, de tal forma que una lo sostenga por el Brazo, y la otra por debajo de la Base. Deposite o descargue el instrumento suavemente y orintelo de manera que el Brazo quede mirando hacia Usted. Encindalo y apguelo con la menor intensidad lumnica; no mover ni golpear cuando este encendido. 2. Partes del Microscopio: Utilizando la figura 1. distinga los nombres de las distintas partes del Microscopio localizndolas en su propio aparato: Oculares, Objetivos, Revolver, Porta-Objetos, Diafragma-Iris, Condensador, Fuente de Iluminacin, Base, Brazo, Platina, Carro Mecnico, Tornillo Macro y Micromtrico. Coloque el Objetivo de Menor Aumento (el ms pequeo), haciendo rotar nicamente desde el revolver. Gradue la intensidad de luz reflejada y sea observable en el Condensador. Observe a travs del Microscopio y ajuste el Diafragma, de manera que el Campo Visual se encuentre iluminado en forma homognea. Si el Ocular o el Objetivo se encuentran empolvados o empaados, lmpieles cuidadosamente con una porcin de Papel Lente. NO USE en ningn caso, otro tipo de material para tal efecto. Si la visin no se aclara consulte al Instructor. 3. Preparacin de Materiales: Los materiales para Observacin Microscpica se colocan en una Lmina de Vidrio que generalmente es de 1" x 3 " y tiene el nombre de Porta-

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Objeto y/o Lmina y se cubren con Laminillas y/o Cubre-Objetos. Tanto ste como el Porta-Objetos deben estar pticamente limpios, la limpieza del Porta-Objetos debe hacerse con agua y sostenindolo por los bordes y luego se frota suavemente con una Toalla de Papel Absorbente para secarlo. Los Cubre-Objetos son muy frgiles y por tanto deben manejarse con mucho cuidado, su limpieza debe hacerse en forma similar a la descrita antes teniendo as mismo el cuidado de no tocar la superficie con los dedos. Corte un cuadro de Papel Peridico que tenga unos 7 mm, que contenga la letra e. Colquelo luego en el centro del Porta-Objetos con el lado derecho de la letra e haca arriba. Ponga una gota de agua sobre el papel. Despus de esperar unos segundos hasta que el agua haya empapado el papel, coloque la Laminilla o Cubre-Objetos sobre la preparacin; evitando que queden burbujas de aire que pueden dificultar la observacin. 4. Como enfocar El Microscopio: Coloque la preparacin sobre la Platina en forma tal que el cuadro de papel quede justamente encima de la abertura y luego fije la Lmina mediante las Pinzas que hay en la Platina. Enfoque la letra e con la ayuda del movimiento de los Tornillos Macro, y Micromtricos. Es importante tener en cuenta que siempre que se haga una observacin al Microscopio debe usarse en primer lugar el Objetivo de Menor Aumento. Describa la posicin de la letra e (como es la imagen o su orientacin) Mueva ahora la Lmina sobre la Platina de derecha a izquierda, mueva la Platina hacia delante o hacia atrs en qu direccin se mueve la imagen?. Suba ahora el Tubo usando el Tornillo Macromtrico y rote el Revolver para cambiar a un Objetivo de Mayor Aumento (40X), enfoque nuevamente en forma lenta evitando quebrar la Lmina Porta-Objetos, conteste: Ha cambiado la posicin de la imagen con respecto a la observada con el Objetivo de Menor Aumento?, Es el Campo de Observacin mayor o menor?, Es la Iluminacin ms o menos brillante que con el Objetivo de Menor Aumento?, Describa y compare lo observado en el Campo de Menor y Mayor Aumento. Retire la preparacin cuidadosamente de la Platina y consrvela para observaciones posteriores. 5. Medidas Microscpicas: La Unidad de Longitud ms frecuentemente usada en Microscopia es la micra o micrn que equivale a 1/1000 mm o 1/1000.000 m. En los Laboratorios de Investigacin se utiliza un instrumento, el Micrmetro o Retculo Micromtrico, sin embargo, es posible estimar el tamao de los Objetos Microscpicos conociendo el dimetro del Campo correspondiente a cada Objetivo. Ejercicios: 1- Coloque un pedazo de papel milimetrado sobre la Platina de tal manera que al enfocar El Microscopio pueda observarlo, mida entonces el dimetro del campo correspondiente al objetivo de menor aumento en milmetros y su conversin en micras. Tambin con los otros aumentos disponibles.

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2- Con el dato anterior es posible determinar el dimetro del Campo correspondiente a cualquiera de los Objetivos pticos; se divide el dimetro encontrado por la razn entre las magnificaciones del Objetivo de trabajo y del Objetivo de menor aumento. Por ejemplo, s el aumento del Objetivo de Mayor Aumento es de 100X y el otro es de 3.2 X, la razn mencionada ser 100/3.2 =31.25 Si el campo correspondiente al objetivo de menor aumento tiene un dimetro de 1.500 m, el dimetro del campo para el de mayor aumento es, de 1.500/31.25 = 48 m. Calcule ahora el dimetro del campo correspondiente a todos los objetivos de su Microscopio, complete la informacin de la tabla en la pagina 18. 3- Cul es la dimensin de la letra

e observada anteriormente en milmetros y en micras?

4- Monte ahora un pedazo de un grabado de una revista. Cuntos puntos puede ver en el Campo del Objetivo de Menor Aumento?, Qu distancia hay en promedio entre cada dos puntos? Este ejercicio proporciona un ejemplo del Poder de Resolucin. As, a simple vista solo podemos ver las diferentes densidades del grabado, mientras que con El Microscopio nos es posible distinguir puntos, es decir distinguimos o resolvemos los puntos.

Tabla de ejercicio, Completar en la siguiente tabla los datos correspondientes:


OCULAR OBJETIVO AUMENTO DIAMETRO mm DIAMETRO m RELACION

3.2X

10X

40X

100X

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BIBLIOGRAFA

BINNGNG, G. & H. ROHRER. 1985. Microscopio de efecto de tunel. Investigacin y Ciencia, Octubre de 1985. pg 30 HAWELLS, M.R. & J. Kirz, 1991. Microscopia de Rayos X. Investigacin y Ciencia. Abril 1991. pg 52. LICHTMANN. J. W. 1994. Microscopia cofocal. Investigacin y Ciencia, Octubre 1994, pg 20. MADER, SILVIA 2004. Biologa (Capitulo 1 paginas 1 a 4) McGraw Hill WICKRAMASINGHE, H. K. 1989. Microscopio de sonda de barrido. Investigacin y Ciencia, Diciembre 1989. pg 28.

UN VISTAZO A LA RED http//www.funsci.com/fun3_it/sfera/sfera.htm http//www.chem.uniroma1.it/~chemus/pagine_sito/strumenti/strum_VET_SIN/16_strument i/Microscopio.htm http//www.terra.es/personal/manmig/pages/microsco.htm http//www.newnet.it/capecchi/microscopi.htm http//www.salonhogar.com/ciencias/Microscopio/micro1.htm http//www.macprof.macity.it/test/microscope.html http//www.csic.es/hispano/patrimo/micro1/microevo.htm http//www.usuarios.iponet.es/jan3d/Microscopio http//www.ncsa.uiuc.edu/Edu/Fracta1_Home.html http//www2.comune.bologna.it/bologna/malpighi/mostra/micro3.htm http//cuhwww.upr.clu.edu/biologa/micro/portada.htm http//usuarios.iponet.es/jan3d/2000/ordenador/MICROSCOPIO/Microscopio.html http//micro.fa.uam.es/Laboratorio/Microscopio.html http//www.ips.it/scuola/concorso_99/acqua_1/microsc.html http://www.csic.es/hispano/patrimo/micro1/microele.htm http://www.shimadzu.com.br/analitica/esp/Productos/Microscopio/SS550.htm http://edafologia.ugr.es/OptMine/intro/microsc.htm http://www.aldeaeducativa.com/aldea/tareas2.asp?which=40 http://www.drpez.com/drmicro.htm http://www.crosswinds.net/~librostecnicos/comofunciona/comofunciona23.html http://www.monografias.com/trabajos/microscopio/microscopio.shtml

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Figura 1. Microscopio Compuesto

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ANEXO 1 El Microscopio
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Cmo funciona? Partes del Microscopio ptico


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Aunque como es lgico, la forma y partes de un Microscopio pueden variar y varan de un modelo a otro, existen unas partes comunes que aparecen representadas a manera de esquema en el dibujo adjunto y cuya definicin pasamos a comentar:

1. Lente Ocular: Conjunto de lentes especializadas en aumentar la Imagen previamente formada por el objetivo. Puede desmontarse a intercambiarse por otros con diferentes aumentos o funcionalidades; agujas para sealar, retculos para recuento. 2. Cilindro o Tubo porta-ocular: Tubo por cuyo interior avanza la luz desde el Objetivo. En los modelos ms antiguos se mova, mediante una Cremallera, para conseguir el enfoque de la muestra, cosa que hoy suele realizarse con la Platina. Hoy da suele estar sustituido por varias piezas entre las que se incluyen Prismas para conseguir el uso en una postura ms cmoda. 3. Revolver: Mecanismo Giratorio en el que se pueden situar varios Objetivos de manera que se consigan diferentes aumentos. 4. Lente Objetivo: Conjunto de Lentes responsables de aumentar y resolver (distinguir las diferentes partes) el objeto a observar. 5. Muestra: Objeto a observar que se coloca sobre una Lmina de Cristal (Porta-Objetos) y bajo otra an ms fina (Cubre-Objetos) la muestra ha de ser tan fina que la luz la atraviese (transparente) por ello se hace imprescindible el uso de colorantes: Tcnicas de Tincin. 6. Platina: Soporte de la muestra. Puede moverse mediante Tornillos de Enfoque Grueso (Macromtrico) o Fino (Micromtrico). 7. Condensador Conjunto de lentes que focalizan la luz sobre la muestra.

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8. Diafragma: Sistema para controlar la cantidad de luz que llega al objeto. De esta manera se puede controlar la definicin que, en muchas ocasiones se consigue reduciendo intensidad de la luz.

Figura 2 Microscopio compuesto con aditamentos para monitor de televisin. Para usos didcticos y alto detalle en investigacin.

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Lecturas complementarias

INTRODUCCIN A LA ESPECTROFOTOMETRA
La Espectroscopa en general se fundamenta en la radiacin electromagntica emitida o absorbida por las sustancias, representa una de las herramientas ms poderosas en el anlisis qumico por su sensibilidad, sus tcnicas son rpidas y fciles, permitiendo agilidad y eficiencia en el trabajo de rutina en los laboratorios. La espectroscopia moderna parte de los trabajos desarrollados en 1859 por Robert Wilhelm Eberhard Bunsen (1811-1899) y Gustav Robert Kirchhoff (1824-1887), profesores de qumica y de fsica en la Universidad alemana de Heidelberg, La radiacin electromagntica es una forma de energa que se puede describir en funcin de sus propiedades ondulatorias. Las ondas electromagnticas se desplazan a velocidades muy grandes y no exigen la presencia de ningn medio de soporte para su propagacin, es decir, la onda resulta ser un medio de transmisin de energa a distancia. Esta transferencia de energa se llama radiacin electromagntica porque las ondas se pueden producir por electricidad y por magnetismo. El espectro de la radiacin electromagntica cubre un inmenso campo de longitudes de onda. Se aplican las reglas de Woodward-Hoffman las cuales sirven de referencia para identificar, y predecir la longitud de onda de mxima absorcin (pico) en muchos compuestos que permiten su posterior identificacin. La regin UV en el anlisis qumico es importante para la determinacin cuantitativa de muchos compuestos orgnicos. La regin visible (V), proporciona medios para la determinacin cuantitativa de cantidades muy pequeas o trazas de la mayor parte de los compuestos inorgnicos. Cuando a travs de un lquido se hace pasar un haz de luz blanca, parte de la radiacin es absorbida por la muestra, la luz transmitida puede colorearse si algn componente presente en la muestra puede absorber a distintos niveles longitudes de ondas diferentes de la luz. As, la absorcin selectiva de la radiacin electromagntica al atravesar una solucin, da lugar a que el rayo emergente difiera del incidente. Para poder evaluar la luz dispersada por un espectroscopio se coloca a la salida del mismo un detector que es capaz de medir la cantidad de fotones que componen la luz que nos llega del objeto estelar en cada longitud de onda. Estos detectores pueden ser desde pelculas fotogrficas hasta fotmetros o cmaras. Cuando a un espectroscopio se le coloca uno de estos detectores en su salida se le suele denominar espectrgrafo. Los instrumentos usados para el anlisis espectroscpico en general, tienen como partes fundamentales: a) Fuentes de la radiacin (foco estable de energa radiante)

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b) Monocromador (prisma o redes de difraccin) c) Recipientes transparentes para contener la muestra y el disolvente. d) Detector de la radiacin que mide la seal de salida del instrumento Entre otras de las aplicaciones de la espectroscopa uv/v se encuentran: 1. Se pueden identificar especies no absorbentes hacindolas reaccionar selectivamente con sustancias qumicas dando productos que absorben fuertemente en las regiones UV/V. 2.. Combinando ciertos aspectos de la Cintica Qumica permite predecir el tiempo de vida media y el tiempo al 90% de los sustancias qumicas.

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Figura 3. Espectrofotmetro

En 1860, Bunsen y Kirchhoff publicaron un importante trabajo sobre la espectroscopia, del Tratado de Anlisis Qumica Cualitativa en la que se esquema del nuevo instrumento, procedente del artculo publicado por estos autores en 1860 as como un ejemplo de su modo de empleo.

Figura 4. Espectrmetro

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Esquema del funcionamiento del espectroscopio: El grabado que representa un modelo de espectroscopio semejante al de la exposicin, que procede de la Facultad de Ciencias de la Universidad de Valencia. Su funcionamiento puede ser fcilmente comprendido a travs del esquema que se encuentra reproducido a continuacin. El tubo "B" contiene la lente de observacin y el tubo "A" est destinado al paso de la luz que se pretende analizar. El tubo "C" contiene una imagen fotogrfica de una escala, hecha sobre una lmina de vidrio, de manera que la posicin de cada raya espectral puede determinarse sobre esta escala. La imagen procedente del tubo "A" se refracta sobre el prisma "P" mientras que la imagen de la escala se refleja sobre una las caras del prisma, de modo que se pueden observar ambas imgenes a travs del ocular situado en "B". (Figura 4.) El objetivo de un espectroscopio es la dispersin de la luz en sus diferentes longitudes de onda para que pueda ser analizada. No es de extraar, por tanto, que la pieza fundamental de un espectroscopio sea su elemento dispersor. Existen dos principios pticos fundamentales que permiten dispersar la luz, la refraccin diferencial y la interferencia. El primero da lugar a los espectroscopios de prisma y el segundo a los basados en redes de difraccin. Existen tambin elementos dispersores hbridos, que suelen ser la combinacin de un elemento de cada. Independientemente del diseo del espectroscopio y de su elemento dispersor, su caracterstica fundamental es la resolucin espectral (R). Este parmetro indica la capacidad del espectroscopio para separar dos lneas muy prximas: TIPOS: Espectrofotmetros de Absorcin Atmica Espectrofotmetro de Fluorescencia Espectrofotmetro uv-visible Espectroscopa con prisma: Espectroscopa con red de difraccin - Prisma (o red) objetivo: Es el ms sencillo de todos los montajes es el prisma objetivo. Consiste en colocar un prisma delgado pero lo suficientemente grande como para cubrir el objetivo del telescopio. El prisma es entonces colocado delante del objetivo de modo que resulta innecesaria ninguna ptica adicional ya que los rayos de luz inciden ya paralelos sobre el prisma. Esto tiene la gran ventaja de que se puede obtener un gran nmero de espectros al mismo tiempo. Espectrgrafos de rendija: Es el tipo de espectrgrafo ms extendido en los observatorios profesionales. Este montaje se coloca a la salida del Telescopio Clsico.

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Figura 5. Montaje clsico con prisma

Figura 6. Montaje clsico con red de difraccin

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Figura 7. Cmo construimos el espectroscopio sencillo?

Otros instrumentos para el estudio en la microscopia del mundo biolgico.

MICROTOMOS Del griego (micro = pequeo, tomo= cortar). Permite cortes en serie de igual y cualquier espesor, facilitando reconstruir de este modo la estructura interna de alguna estructura. Consiste en un tubo con una pinza que sostiene el cilindro de mdula y una platina que sobre la cual se hace resbalar la navaja. Un tornillo hace ascender muy lentamente el objeto con navajas bien afiladas. Se pueden hacer cortes de 0,005 y 0,01 mm. Para fijar los objetos embebidos en parafina se utilizan bloques de madera o de metal. La cuchilla se encuentra con un ngulo de 5 8o al objeto. Entre ms dura o fra este la parafina ms delgado se podr hacer el corte. El grosor regular de los cortes se halla cerca de 7-10 micras. Cuanto ms delgadas son las clulas tanto ms delgadas hay que cortarlas (hasta 5 micras). Para clulas adultas 10 micras es suficiente, a partir del tejido incluido en parafina. Se encuentran diferentes tiopos: microtomo convencional, de rotacin o Minot - europeo), deslizamiento (americano), en tejido congelado (criostato) o en tejido incluido en plstico para estudio ultraestructural (ultramicrotomo).

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Es un instrumento insustituible en las investigaciones sobre tejidos humanos (Patologa) y de otras especies, as como en el estudio de vegetales. Los tejidos son sometidos a un tratamiento previo que consiste en la fijacin o estabilizacin, deshidratacin y aclaramiento, para luego ser includos en parafina o plstico y, de este modo, poder ser cortados con el Micrtomo, en partes tan finas (por ejemplo, de 5 micrones de espesor) como para que, previa coloracin, o no, puedan ser observadas en el microscopio.

Figura 8- Micrtomo de rotacin

Figura 9. Micrtomo de deslizamiento

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Fijacin FORMALDEHIDO: En solucin min. 37% y exento de cido. Se utiliza para minimizar los procesos que ocurren despus de la muerte del tejido y fijar las estructuras en su estado original. La fijacin de los extendidos celulares se debe hacer inmediatamente despus de tomada la muestra, cuando an est hmeda. Inclusin Para la visualizacin microscpica la muestra debe ser extremadamente delgada (aprox. 1-5mm). El tejido o biopsia se debe impregnar en una substancia que sea ms dura que el tejido mismo. Debe ser fcil de cortar con el micrtomo y no debe influir en las caractersticas de coloracin. Los medios clsicos utilizados son parafinas y celulosa para microscopia y resinas artificiales para microscopia electrnica. Las parafinas son mezclas de hidrocarburos saturados, cuyo punto de fusin incrementa con el aumento de la longitud de la cadena. Para procesos Histolgicos se emplean cadenas de 20 a 35 tomos con puntos de fusin de 38 - 58C. Parafina enriquecida con polmeros de alta pureza, con o sin Dimetilsulfxido (DMSO). El DMSO incorporado a la parafina permite una infiltracin rpida de la muestra y garantiza una total penetracin del tejido y los polmeros aseguran un incremento en la plasticidad de la muestra, despus de la inhibicin. El alto grado de pureza elimina la necesidad de filtrar repetidas veces y adicionalmente la forma y el color de la muestra no es alterado.

Deshidratacin y Desparafinizacin En los laboratorios de Histologa se usa comnmente un solvente como el xileno, que puede producir daos en el medio ambiente y la salud por los vapores que emana. NEO-CLEAR es un substituto del xileno, se puede utilizar en lugar de ste en todas las etapas del Histoprocesamiento sin alterar los tiempos, calidad ni cualidad de la coloracin. Es completamente inodoro, no varan los tiempos de procedimiento y no aumenta el consumo de otros solventes Coloraciones para Microscopa: Permiten la observacin de diferentes estructuras celulares lo cual ha sido de gran importancia para el diagnstico. Teniendo en cuenta las caractersticas de las diferentes coloraciones se logra resaltar estructuras que antes eran difciles de distinguir. Hay coloraciones bsicas, cidas, as como naturales y sintticas. Con coloraciones bsicas por ejemplo azul de metileno, azur, se resaltan las estructuras cidas de ncleo celular, como la cromatina; e igual, las coloraciones cidas como la eosina tien las protenas bsicas, como las enzimas lisosomales en los grnulos. La imagen microscpica, su intensidad y grado de color, dependen finalmente de la calidad de la coloracin, de la solucin de trabajo (pH, concentracin, estabilidad, etc.) y del

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procedimiento tcnico. Entre los colorantes se encuentran: fuscina acida, carmin, rojo congo ,eosina azulada, fast green , rojo neutro, sefrina o sudan, negro orange g, azl de metileno, verde malaquita.

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MAPA CONCEPTUAL: PRACTICA 1. INSTRUMENTACIN PARA LA INVESTIGACION EN BIOLOGA E INTRODUCCIN A LA ESPECTOFOTOMETRA

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DIAGRAMA DE FLUJO: PRACTICA 1. . INSTRUMENTACIN PARA LA INVESTIGACION EN BIOLOGA E INTRODUCCIN A LA ESPECTOFOTOMETRA

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ESQUEMAS: PRACTICA 1. . INSTRUMENTACIN PARA LA INVESTIGACION EN BIOLOGA 1. Dimetro del campo visual: papel milimetrado

2. Poder de Aumento: La dimensin de la letra e

3. Poder de resolucin: tramado de revista

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