Natalie Rodríguez Cortés

Profundización en Genética Molecular Bacteriana

2024-I
 Puede verse afectada por disbiosis es una bacteria anaerobia
intestinal y/o invasión de patógenos

INTRODUCCIÓN
facultativa, gramnegativa e
intestinales. Esto puede afectar intracelular que provoca una
gravemente a las células madres inflamación severa de la mucosa
intestinales intestinal, dando lugar a
gastroenteritis, incluida la EII

La Mucosa
intestinal la
principal barrera
intestinal

Salmonella
enterica serovar
typhimurium (S.
typhimurium) es
una

El sistema de secreción tipo

3 codificado por la isla de
patogenicidad 1

Haddad, M.J.; Sztupecki, W.; Delayre-Orthez, C.; Rhazi, L.; Barbezier, N.; Depeint, F.; Anton, P.M.
Complexification of In Vitro Models of Intestinal Barriers, A True Challenge for a More Accurate Alternative
Approach. Int. J. Mol. Sci. 2023, 24, 3595. https://doi.org/10.3390/ijms24043595

ESTOS SISTEMA GENERARÁN EN EL permite la replicación intracelular dentro

HUESPED UNA RESPUESTA de los macrófagos y es necesario para
INFLAMATORIA, POR ENDE UNA una virulencia total en modelos de
DISBIOSIS, PARA FAVORECER LA infección murinos y bovinos
COLONIZACIÓN
PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN

¿Puede L. acidophilus mantener la homeostasis intestinal, prevenir la

inflamación intestinal y la hiperplasia criptal inducidas por la
infección de S. typhimurium mediante la modulación de la
proliferación y diferenciación del epitelio intestinal?
OBJETIVO DE INVESTIGACIÓN

El objetivo central de la investigación es entender cómo L.

acidophilus afecta la proliferación y diferenciación del epitelio
intestinal, utilizando tanto organoides intestinales como modelos en
ratones para explorar la interacción entre este probiótico y la mucosa
intestinal.
MODELO
Los ratones fueron divididos
en cuatro grupos: uno
El modelo experimental
recibió un placebo (grupo
planteado en el estudio
de control), otro fue
consistió en la
infectado con S.
administración de diferentes
typhimurium, un tercero fue
tratamientos a ratones para
tratado con L. acidophilus, y
evaluar la protección de
un cuarto grupo fue
Lactobacillus acidophilus
pretratado con L.
contra la infección por
acidophilus y luego
Salmonella typhimurium.
infectado con S.
typhimurium.
Se registró la supervivencia
de los ratones, se
recolectaron muestras de
heces para análisis de
unidades formadoras de
colonias (UFC) y se
sacrificaron los ratones para
el análisis de muestras de
tejido. Este modelo
experimental permitió
evaluar el efecto protector
de Lactobacillus acidophilus
contra la infección por
Salmonella typhimurium en
un entorno controlado y
reproducible.
METODOLOGÍA
• Inmunohistoquímica: Las muestras de tejido fueron procesadas, desparafinadas, rehidratadas y teñidas con
anticuerpos específicos. Se realizó la recuperación de antígenos, y se utilizaron anticuerpos secundarios
1 conjugados con tintes fluorescentes para la visualización.

• Western Blot: Las proteínas fueron extraídas, separadas mediante SDS-PAGE, transferidas a membranas de
PVDF, y analizadas con anticuerpos primarios y secundarios. Las concentraciones de proteínas se detectaron
2 mediante un ensayo de cuantificación de proteínas BCA.

• Citometría de flujo: Los organoides intestinales fueron digeridos, y se utilizó la citometría de flujo para analizar
las diferencias entre grupos, con niveles de significancia indicados por valores de *P.
• RT-PCR : Se extrajeron muestras de ADN, y se empleó la PCR en tiempo real para cuantificar cepas de
3 Lactobacillus en los intestinos de los ratones.

• Detección de apoptosis: La apoptosis en las células se probó utilizando un kit de detección de apoptosis
celular.
• Análisis morfológico: Se estudió la morfología de los tejidos intestinales para evaluar el impacto de los
4 tratamientos en el mantenimiento intestinal.
RESULTAD
OS
RESULTADO FIG 1. Lactobacillus proporcionó protección contra la infección por S.
typhimurium en ratones

Este experimento demostró que Lactobacillus acidophilus tuvo un efecto protector

significativo contra la infección por Salmonella typhimurium en ratones, lo que sugiere su
potencial uso terapéutico en el tratamiento de enfermedades intestinales.
RESULTADO FIG. 2 La hiperplasia de las células secretoras aliviada por
Lactobacillus responde a S. typhimurium infección in vivo

Estos hallazgos sugieren que Lactobacillus puede modular la respuesta del sistema
inmunitario y la proliferación de células intestinales en presencia de la infección por S.
typhimurium, lo que podría tener implicaciones en el tratamiento de enfermedades
intestinales.
RESULTADO FIG. 3
El efecto regulador de L. acidophilus sobre la vía Wnt/β-
catenina y la proliferación de la vía intestinal en ratones

Los resultados indican que L.

acidophilus afecta la
expresión de β-catenina,
PCNA, TLR2, TLR4,
MyD88, Wnt3 y Lgr5 en la
mucosa intestinal de ratones.
Los datos sugieren que L.
acidophilus modula la vía
Wnt/β-catenina, afecta la
proliferación intestinal y
rescata la pérdida de células
madre Lgr5+ después de la
infección por Salmonella para
respaldar la regeneración de
la barrera de la mucosa
intestinal.
 Lactobacillus mejoró la alteración de los organoides intestinales
RESULTADO FIG.4
infectados con Salmonella typhimurium

El pretratamiento de organoides
intestinales con L. acidophilus ATCC 4356
antes de la infección con SL1344, como se
muestra en la Fig. 4 del documento, es
significativo porque demuestra que L.
acidophilus tiene un efecto protector sobre
la alteración de los organoides intestinales
causada por la infección de Salmonella
(SL1344). La morfología y el crecimiento
de los organoides se conservaron cuando se
pretrataron con L. acidophilus, lo que
indica su potencial para aliviar el daño
causado por la infección de Salmonella.
Además, la concentración de TNF-α, una
citoquina proinflamatoria, se redujo en el
sobrenadante celular, resaltando aún más el
papel protector de L. acidophilus en
mitigar los efectos de la infección por
Salmonella en los organoides intestinales.
 El efecto de Lactobacillus sobre la expresión de péptidos

RESUTADO FIG. 5
antimicrobianos in vitro

•Tinción inmunohistológica para células

caliciformes con el marcador UEA-1 en
organoides, donde Lactobacillus aumentó el
número de células positivas para
fluorescencia. un aumento en la expresión.
•Tinción inmunohistológica para células de
Paneth con lisozima como marcador en
organoides, mostrando un aumento en el
número de células positivas para
fluorescencia.
•Análisis de RT-qPCR de péptidos
antimicrobianos (Reg3g y Defa1), que
demostró un aumento en la expresión.
RESUTADO FIG. 5
expresiones de ARNm de TLR2, TLR4 y MyD88 analizado por RT-
qPCR en organoides intestinales

•Expresiones de ARN mensajero de TLR2,

TLR4 y MyD88 analizadas por RT-qPCR en
organoides intestinales, indicando un
aumento moderado de la expresión de
MyD88 durante la infección por Salmonella.
•Análisis de RT-qPCR de Wnt3 y Lgr5 con
inhibidor de TLR2 (CU-CUPT2) e inhibidor
de TLR4 (atractilenólido I), mostrando la
modulación de la expresión de Wnt3 y Lgr5.
RESULTADO FIG.6
Lactobacillus protegió la alteración de los organoides
intestinales contra el daño del TNF-α

morfología de los organoides después del tratamiento con TNF-α

El estudio demostró que Lactobacillus (L. acidophilus ATCC 4356) tenía efectos protectores en la alteración de los
organoides intestinales contra el daño causado por TNF-α. Los resultados mostraron que el pretratamiento con
Lactobacillus alivió significativamente la alteración de los organoides causada por TNF-α
 RESULTADO FIG.6
La apoptosis de organoides fue detectado y analizado después
del tratamiento con TNF-α

Además, se mantuvo la morfología y el crecimiento de los organoides intestinales, y se redujo la apoptosis de los organoides después del
tratamiento con TNF-α + Lactobacilo. Pero Dll4 mostró exactamente el efecto opuesto. Lactobacillus tiene efectos positivos al mitigar el daño
causado por TNF-α, el tratamiento con DAPT refuerza esos efectos beneficiosos, mientras que Dll4 muestra un efecto negativo, empeorando el
daño a los organoides y aumentando la apoptosis celular.
RESULTADO FIG.6Elmediante
Muc2, Defa1 y la expresión del ARNm de Reg3g se probó
RT-qPCR. Estos genes y las proteínas que codifican
son esenciales para mantener la homeostasis, la integridad de la
mucosa y la defensa contra patógenos.

Además, la expresión de ARN mensajero de Muc2, Defa1 y Reg3g se mantuvo en niveles

elevados después del daño por TNF-α cuando los organoides fueron pretratados con
Lactobacillus. Estos hallazgos sugieren que Lactobacillus tiene un efecto protector en los
organoides intestinales contra el daño inducido por TNF-α.
CONCLUSIÓN
El estudio reveló que la activación del sistema RcsCDB reduce la expresión del operón fimbrial std en Salmonella enterica, el
cual codifica fimbrias esenciales para la adherencia en el intestino grueso. Se identificó un sitio de unión de RcsB mediante
análisis bioinformático y se confirmó su unión in vitro a la región promotora de std mediante ensayos de movilidad
electroforética. La inclusión de RcsB como regulador de la transcripción de std destaca un ejemplo de modulación de síntesis
de fimbrias por un sistema de señalización. La relevancia fisiológica de la represión de std por RcsCDB podría estar vinculada
al control ambiental del cambio en std, ajustando la expresión génica de Salmonella a diversos entornos del huésped. Estas
conclusiones aportan claridad sobre los mecanismos reguladores de las fimbrias std en Salmonella enterica y sus posibles
implicaciones en la adaptación bacteriana y la virulencia.
GRACIAS !!!