Práctica 5.

Investigación de
Salmonella sp. en alimentos

9QV1 Eq. 5

• Pulido Tovar Carlos Manuel

• Raya Pahuamba Yehoshuah Rafael
• Tlacuilo Cano Juan Daniel
 Salmonella spp: El género Salmonella, ● Característ ● Resultad
mide de 2 a 3 x 0.4 a 0.6 μ de tamaño y pertenece ica o
a la familia Enterobacteriaceae. Con excepción de
los serotipos gallinarum y pullorum los demás ● Morfología ● Bacilo
serotipos son móviles por medio de flagelos
peritricos. Es una bacteria patógena para el ● Gram ● Negativo
hombre y algunos animales. ● Lactosa ● Negativo
INTRODUCCIÓN

● Glucosa ● Positivo
● Producción de ● Positivo
gas
● Catalasa ● Negativo
● Oxidasa ● Negativo
● Descarboxilació ● Positiva
n de la Lisina
● Descarboxilació ● Positiva
n de la Ornitina
● Movilidad ● Positivo
● Crecimiento ● Aerobio o
anaerobio
facultativo
Para que su crecimiento sea óptimo, Salmonella necesita de un pH entre 6.6 - 8.2,
las temperaturas más bajas a las que se ha señalado su existencia de crecimiento
son de 5.3 a 6.2 °C, son incapaces de tolerar elevadas concentraciones de sal.
Salmonella es destruida a las temperaturas de pasteurización de la leche
 Objetivos de NOM-210-SSA1-2014.
la Norma
Este método es Productos y servicios. Métodos
• Esta Norma aplicable:
Oficial Mexicana de prueba microbiológicos.
establece un método general Determinación de
✔ Paraparala la determinación
detección de
de Salmonella microorganismos indicadores.
sppSalmonella en alimentos.
en productos para consumo
•humano, así como de áreas de Determinación de
•producción
Esta Norma Oficial Mexicana
y manejo es
de alimentos microorganismos patógenos.
de observancia
especialmente en obligatoria
productos en el
donde
lasTerritorio Nacional ambientales
condiciones para las
personas
permiten físicas y morales
la contaminación de estos
querequieran
productos aplicar
por microorganismos estede
la método en alimentos nacionales
familia Enterobacteriaceae.
y de importación.
 01 02
Conocer la importancia Conocer el fundamento de los
de Salmonella en la salud medios de cultivo que se
pública utilizan para el aislamiento de
Salmonella a partir de
OBJETIVOS alimentos.

DE LA PRÁCTICA
03 04
Aplicar la metodología para
Interpretar la presencia de
el aislamiento de
Salmonella en alimentos.
Salmonella a partir de
alimentos.
FUNDAMENTO DE
MEDIOS DE
CULTIVO
 Agua Peptonada
Amortiguada
● Componentes ● Cantidad (g/L)

● Peptona de ● 10.0
caseína Interpretación
● Cloruro de sodio ● 5

● Fosfato de Sodio ● 3.5 Medio no selectivo recomendado

Dibásico
para el pre-enriquecimiento en el
● Fosfato de Potasio ● 1.5
Monobásico análisis de muestras de alimentos
● pH ● 7.0 ± 0.2 con sospechas de contaminación por
Salmonella
 Caldo Rappaport
Vassiliadis (RVS)
● Componentes ● Cantidad (g/L)

● Triptona ● 4.54

Interpretación ● Cloruro de sodio ● 7.2

● Fosfato de Sodio ● 1.45

Medio de enriquecimiento selectivo Monobásico
utilizado después de un enriquecimiento ● Cloruro de ● 13.4
preliminar. magnesio anhidro
El pH, el verde malaquita y la alta ● Oxalato de Verde ● 0.036
concentración de cloruro de de Malaquita

Magnesio dan el carácter selectivo para ● pH ● 5.1 ± 0.2

Salmonella
Caldo Muller-Kauffmann con
Verde Brillante y
Novobiacina (MKTTN)
● Componentes ● Cantidad (g/L)
● Digerido ● 8.6
enzimático de
caseína Interpretación
● Extracto de carne ● 4.3
● Verde Brillante ● 0.0096 Medio de enriquecimiento selectivo para la
● Novobiocina ● 0.004 detección de Salmonella spp.
● Bilis de buey ● 4.78 Las sales biliares, verde brillante y
● Tiosulfato de sodio ● 30.5 novobiocina inhiben otros organismos
● Carbonato de ● 38.7 distintos de Salmonella. Además el
calcio tiosulfato de sodio suprime los coliformes
● Cloruro de sodio ● 2.6
● pH ● 7.0 ± 0.2
 Agar de xilosa-lisina-
NOTA: desoxicolato (XLD)
En ausencia de
● Componentes ● Cantidad (g/L)
colonias típicas,
seleccionar 2 o más ● Xilosa ● 3.5
colonias atípicas ● L-Lisina ● 5.0
● Extracto de levadura ● 3.0
● Desoxicolato de ● 2.5
Interpretación sodio
● Lactosa ● 7.5
• Colonias típicas ● Sacarosa ● 7.5
Rosas con o sin centro negro, pueden ● Citrato férrico de ● 0.8
producir colonias con un centro negro muy amonio
grande o completamente negras. ● Tiosulfato de sodio ● 6.8
● Cloruro de sodio ● 5.0
• Colonias atípicas ● Rojo de fenol ● 0.08
Amarillas con o sin centro negro ● Agar ● 13.5
● pH ● 7.4 ± 0.2
 Agar
Entérico Hektoen (EH) NOTA:
En ausencia de
● Componentes ● Cantidad (g/L) colonias típicas,
● Digerido péptico de ● 12.0 seleccionar 2 o más
tejido animal colonias atípicas
● Extracto de levadura ● 3.0
● Sales biliares ● 9.0 Interpretación
● Lactosa ● 12.0
● Sacarosa ● 12.0 • Colonias típicas
● Salicina ● 2.0 Azul-verdes o azules, con o sin centro
● Tiosulfato de sodio ● 5.0 negro (muy grande o completamente
● Cloruro de sodio ● 5.0 negras*)
● Fucsina ácida ● 0.1
● Agar ● 14.0 • Colonias atípicas
● pH ● 7.6 ± 0.2 Rosa salmón con o sin centro negro
 Agar
NOTA: sulfito de bismuto
En ausencia de
colonias típicas, (ASB)
seleccionar 2 o más
● Componentes ● Cantidad (g/L)
colonias atípicas
● Peptona ● 20.0
bacteriológica

Interpretación ● Dextrosa ● 5.0

● Extracto de carne ● 5.0
• Colonias típicas
● Verde Brillante ● 0.025
Cafés, grises o negras; pueden presentar
● Sulfato ferrosa ● 0.3
brillo metálico y el medio circundante
generalmente café-negro. ● Fosfato dipotásico ● 4.0
● Sulfito de bismuto ● 8.0
• Colonias atípicas ● Agar ● 20
Verdes con un halo oscuro muy pequeño ● pH ● 7.5 ± 0.2
 Agar
Verde Brillante NOTA:
En ausencia de
(VB) colonias típicas,
seleccionar 2 o más
● Componentes ● Cantidad (g/L)
colonias atípicas
● Extracto de ● 3.0
levadura
● Proteosa Peptona ● 10.0 Interpretación
● Lactosa ● 10.0
• Colonias típicas
● Sacarosa ● 10.0
Rojas o rosadas rodeadas por medio
● Cloruro de sodio ● 5.0 enrojecido; las fermentadoras de lactosa
● Rojo fenol ● 0.08 dan colonias amarillas
● Verde brillante ● 12.5
● Agar ● 20 • Colonias atípicas
● pH ● 6.9 ± 0.2 No se mencionan
 Agar
NOTA:
Se evidencia la Cromogénico para
actividad de la Salmonella
esterasa

● Componentes ● Cantidad (g/L)

● Citrato de sodio ● 8.5
Interpretación
● Peptona de ● 5.0
caseína
• ● Extracto de ● 5.0
• Colonias típicas carne
Las colonias magenta son el resultado de ● Mezcla de ● 5.81
la hidrólisis del magenta-caprilato por las cromógenos
especies de Salmonella
● Agar ● 12.80
● pH ● 7.5 ± 0.2
Metodología
de trabajo
 1. Pre- 2. Enriquecimiento
enriquecimiento selectivo

3. Aislamiento en
4. Identificación medios de cultivo
bioquímica

5. Identificación
serológica
Procesamiento de
muestras
● Tipo de muestra
● Productos ácidos y
acidificantes
Moluscos con concha
● Moluscos, desconchados
y descongelados
● Yema de huevo en polvo, clara de huevo
en polvo, huevo en polvo, leche fluida,
leche descremada, leche con 2% de
grasa, entera y suero de leche. Mezclas
preparadas en polvo (Harinas para pastel,
galletas, donas, bísquets y pan) Fórmulas
infantiles y alimentos para administración
por cánula u oral, que contengan huevo
● Especificaciones
● No debe tener pH <4.5, ajustar con NaOH 1N
● 10-12 moluscos bivalvos (20-30 si son pequeños)
● Limpieza de la concha, desechar las dañadas
● Remoción del contenido (200 g)
● Agua peptonada amortiguada 1:2
● Licuar 2 min
● 200 g muestra
● Agua peptonada amortiguada 1:2
● Licuar 2 min
● Si las muestras no están en polvo, agregar 225mL de agua
peptonada amortiguada.
● Si el producto es un polvo, agregar aproximadamente
15mL de agua peptonada y agitar hasta obtener una
suspensión homogénea. Agregar tres porciones más de
10mL, 10mL y 190mL para un total de 225mL
● Tipo de muestra
● Huevo en cascarón
Huevo entero líquido
● Huevo cocido o hervido
(gallina, pato u otros)
● Leche descremada en polvo y
Caseína
● Productos que contienen huevo (pastas,
rollos de huevo, macarrones, espagueti),
● Especificaciones
● Desinfección con Alcohol 70%
● 50 muestras por gallinero (Muestra: 20
huevos)
● 25 mL o gr + 225 mL CTS con sulfato ferroso
● 15 porciones de 25 mL
● 3375 mL de CTS con sulfato ferroso
● Pulverizar clara y yema 25 g
● 225 mL de CTS
● 50 g producto
● 1 L de agua peptonada amortiguada
● 2 mL de Verde Brillante 1%
● De preferencia no descongelar o en su lugar descongelar a
flujo continuo 45 °C 15 min
● Tipo de muestra ● Especificaciones
● Levadura seca (activa e ● 25 g de muestra en 225 mL CTS
inactiva)
Mezclas para repostería o ● 25 g de muestra en 225 mL caldo nutritivo
cremas pasteleras
● Pimienta negra, pimienta blanca, semillas
de apio en hojuelas, chile en polvo, ● 25 g de muestra en 225 mL de CTS
cominos, páprika, hojuelas de perejil,
romero, semilla de ajonjolí, tomillo y
●
yerbas en hojuelas
● Cebolla en hojuelas, cebolla en polvo, 25 g de muestra en 225 mL de CTS con K 2SO3
ajo en hojuelas

● Pimienta de Jamaica, canela, ● Diluirlas más allá de su nivel tóxico

clavo y orégano • Jamaica, canela y oregano: 1:100 muestra/CTS
• Clavo: 1:1000 muestra/CTS
• Hojas secas: > 1:10 muestra/CT
● Dulce, cubierta de dulce 25 g muestra en 225 mL de leche descremada
(incluyendo chocolate) 0.45 mL de Verde Brillante 1%
● Tipo de muestra
● Coco
Colorantes y substancias
coloridas para alimentos
● Colorante (lacas) o colorantes
con pH abajo de 6.0
Gelatina
● Carnes, substitutos de carne,
productos cárnicos, sustancias de
origen animal, glándulas y otros
alimentos (pescado, carne y hueso)
● Ancas de rana
● Especificaciones
● 25 g de muestra en 225 mL caldo lactosado
● 2.25 mL de Terguitol/Aniónico o 2 gotas Triton
X-100
● De preferencia no descongelar o en su lugar descongelar a
flujo continuo 45 °C 15 min
● 25 g muestra en 225 mL agua peptonada amortiguada
● Licuar 2 min
● 25 g de muestra en 225 mL CTT sin Verde Brillante
2.25 mL de Verde Brillante 0.1%
25 g de muestra en 225 mL agua peptonada amortiguada
5 mL de solución acuosa de papaína al 5%
25 g de muestra en 225 mL agua peptonada amortiguada
● Licuar 2 min
● 15 pares en agua peptonada amortiguada 1:9
● Tipo de muestra ● Especificaciones

● Conejo en cana ● Colocar el conejo en agua peptonada amortiguada 1:9

(muestra/caldo)
● Bolsa plástica estéril
Jugo de naranja (pasteurizado y sin 25 g de muestra en 225 mL agua peptonada amortiguada
pasteurizar), jugo de manzana ● Incubación
(pasteurizado y sin pasteurizar)
● Orejas de puerco ● Una pieza (2-3 si son pequeñas) en agua
peptonada amortiguada 1:9 (muestra/caldo)

● Melones De preferencia no descongelar o en su lugar descongelar a

flujo continuo 45 °C 15 min
● 25 g muestra en 225 mL agua peptonada amortiguada
● Licuar 2 min
● Melones enteros ● Analizarlos como estén
● Agregar agua peptonada amortiguada que permita que
flote
● Mangos De preferencia no descongelar o en su lugar descongelar a
flujo continuo 45 °C 15 min
● 25 g muestra en 225 mL agua peptonada amortiguada
● Licuar 2 min
● Tipo de muestra
Mangos enteros
Tomates (rojos o jitomates)
Tomates enteros
● Ambientales
Semillas de alfalfa y frijoles
● Agua para consumo humano
● Especificaciones
Analizarlos como estén
Agregar agua peptonada amortiguada que permita que flote
● 25 g muestra en 225 mL agua peptonada amortiguada
● Licuar 2 min
Analizarlos como estén
Agregar agua peptonada amortiguada que permita que flote
Utilizar hisopos o esponjas estériles
Bolsa estéril con caldo Dey-Engley o sol. de fosfatos
225 mL de agua peptonada amortiguada
25 g muestra en 225 mL agua peptonada amortiguada
Cubrir el matraz con papel aluminio
● Utilizar métodos de concentración
• Filtración por membrana
Filtrar 1 L o más
Retirar la membrana y colocar en 50 mL de agua
peptonada amortiguada
Identificación bioquímica
 Agar inclinado TSI

● Componentes ● Cantidad (g/L)

Extracto de carne ● 3.0
● Extracto de levadura ● 3.0 NOTA: Sembrar por picadura en
● Peptona ● 15.0 - 20.0 el fondo y por estría en la
● NaCl ● 5.0 superficie inclinada.
● Lactosa ● 10.0
Incubar los tubos de TSI a 36 °C
● Sacarosa ● 10.0
± 1 °C por 24h ± 3h.
● Glucosa ● 1.0
● Citrato de fierro (III) ● 0.2 - 0.3
● Tiosulfato de sodio ● 0.3
Rojo de fenol 0.024
● Agar ● 12.0 - 15.0
 Interpretación
• TSI: Superficie inclinada
- Amarillo, lactosa y/o sacarosa positivos.
- Rojo o sin cambio de color, lactosa
y/o sacarosa negativa.
•
• TSI: Fondo del medio
- Amarillo, glucosa positiva.
- Rojo o sin cambio de color, glucosa
negativa.
- Negro, formación de sulfuro de
hidrógeno.
- Burbujas o grietas en el medio, formación
de gas debido a la utilización de la
glucosa.
Agar inclinado TSI
• Las colonias típicas de Salmonella
spp, producen alcalinidad (color
rojo) en la parte inclinada del
medio y ácido (color amarillo) en el
fondo; con producción de gas y
cerca del 90% de los casos
producen H2S (ennegrecimiento
del agar).

•
 Agar inclinado LIA
● Componentes ● Cantidad (g/L)
Peptona de gelatina ● 5.0
● Extracto de levadura ● 3.0
● Glucosa ● 1.0
•
Interpretación
● L-lisina ● 10.0
• En LIA, Salmonella spp. produce ● Citrato férrico- ● 0.5
reacción alcalina (color púrpura). amónico
• ● Tiosulfato de sodio ● 0.04
• La mayoría de los cultivos de anhidro
Salmonella spp. producen H2S en
● Púrpura de ● 0.02
LIA. bromocresol
● Agar ● 13.0 - 15.0
● pH 6.7 ± 0.2
NOTA: Sembrar por picadura en el fondo y por
estría en la superficie inclinada.

Incubar los tubos de TSI a 36 °C ± 1 °C por 24h

± 3h.
 Prueba de ureasa
(convencional)
● Componentes ● Cantidad (g/L)
Peptona ● 1.0
● Glucosa ● 1.0 Interpretación
● NaCl ● 5.0
● Fosfato ● 2.0
• Para Salmonella spp no se
dihidrogenado de produce cambio en la coloración
potasio
(amarillo anaranjado).
● Rojo de fenol ● 0.012
● Urea ● 400
● Agar ● 15.0

NOTA: Incubar 24h ± 2h a 36 °C ± 1 °C.

 Caldo L-lisina
NOTA: Inocular el caldo con descarboxilasa
pequeña cantidad de cultivo. Cerrar
la tapa fuertemente e incubar a 36
°C ± 1 °C por 24h ± 3h.
● Componentes ● Cantidad (g/L)
● Monoclorhidrato ● 5.0
de L-lisina

Interpretación ● Extracto de ● 3.0

levadura
•
• Las especies de Salmonella spp. ● Glucosa ● 1.0
dan reacción alcalina por
● Púrpura de ● 0.015 - 0.02
descarboxilación de la lisina (color bromocresol
púrpura del medio).
● Peptona ● 5.0
 Detección de β -galactosidasa Interpretación
• Color amarillo es indicativo de reacción
● Componentes ● Cantidad (mL) positiva, la cual se hace evidente en
Solución amortiguadora ● 5 aproximadamente 20 min.
● Solución ONPG ● 15
•
• Salmonella spp. da una prueba negativa.

NOTA: Colocar la colonia seleccionada

en un tubo conteniendo 0.25mL de
solución salina, agitar para obtener una
suspensión homogénea.

Adicionar 0.25mL del agente de

detección de la b-galactosidasa y
mezclar. Colocar el tubo en el baño de
agua a 36 °C ± 1 °C y dejar por 24h ±
3h.
 Interpretación Prueba de Indol (Caldo
•
• La formación de un anillo de color rojo
triptona al 1%.)
indica una reacción positiva. Un anillo de
● Componentes ● Cantidad (g/L)
color amarillo indica una reacción
negativa. Triptona o tripticasa ● 10
• Salmonella spp. da una ● pH 6,9 ± 0,2
prueba negativa.
NOTA: Inocular un tubo conteniendo
5mL del caldo triptona con una
suspensión homogénea de la colonia
sospechosa.

Incubar a 36 °C ± 1 °C por 24h ± 3h

después de la incubación adicionar de
0.2mL a 0.3 mL de reactivo de Kovac,
sin agitar y resbalando por las
paredes.
 Prueba de VP Interpretación
• Resultado positivo: desarrollo de un color
Componentes Cantidad (g/L)
rojo en pocos minutos después de una
● Peptona ● 7.0 completa agitación del tubo.
● Glucosa ● 5.0 •
• Resultado negativo: ausencia de color rojo.
● Fosfato ● 5.0
dipotásico • Salmonella spp. da una prueba negativa.
NOTA: Re-suspender una asada de la
colonia seleccionada en un tubo estéril
conteniendo 3mL del medio VP. Incubar
36 °C ± 1 °C por 24h ± 3h.

Después de la incubación adicionar dos

gotas de solución de creatina, tres gotas
de solución alfa-naftol y al final dos
gotas de solución de KOH, agitar
después de cada reactivo.
Interpretación de las pruebas bioquímicas
 Identificación
serológica

Antígeno (O), somático termoestable.

Antígeno (Vi), de envoltura termolábil.
Antígeno (H), flagelar termolábil.
Eliminación de las cepas autoaglutinables
Detección de los antígenos Poly A-I & Vi.
 Interpretación de los resultados
Salmonella spp en 25g: Salmonella spp en 25g: Salmonella spp en 25g:
PRESENCIA AUSENCIA AUSENCIA

Los cultivos determinados Descartar los cultivos con Placas con agar XLD, ASB y el
como presuntivos con las resultados atípicos a partir de tercer medio selectivo sin
pruebas bioquímicas y las pruebas bioquímicas desarrollo y/o colonias atípicas
confirmados por la serología miniaturizadas clasificadas
como no Salmonella spp

Presencia o ausencia en la porción Presencia o ausencia por piezas

de ensayo analizada
En caso de que la cantidad sea menor a 25g Para los casos en los que se analiza una
se debe reportar en la porción de ensayo (g o pieza de producto reportar como presencia o
mL) de producto utilizado ausencia por piezas analizadas
 Bibliografía
• NORMA Oficial Mexicana NOM-210-SSA1-2014, Productos y servicios. Métodos de
prueba microbiológicos. Determinación de microorganismos indicadores. Determinación de
microorganismos patógenos. Diposnible en:
http://www.economia-noms.gob.mx/normas/noms/2010/210ssa12015.pdf

• NORMA Oficial Mexicana NOM-114-SSA1-1994, Bienes y servicios. Método para la

determinación de salmonella en alimentos. Disponible en:
http://www.ordenjuridico.gob.mx/Documentos/Federal/wo69538.pdf

• Antisueros Salmonella Difco. Disponible en:

http://winklerltda.cl/quimicav2/wp-content/uploads/2017/04/salmonella.pdf

• OPS/OMS | Peligros biológicos - PAHO/WHO (Salmonella).

Disponible en:
https://www3.paho.org/hq/index.php?option=com_content&view=article&id=10838:2015
-peligros-biologicos&Itemid=41432&lang=es