Introducción a la Determinación de Impurezas y

Estudios de Degradación Forzadas.

Dr. Esteban A. Ugliarolo

Impurezas - Definición
Real Academia Española: “Materia que, en una sustancia, deteriora
alguna o algunas de sus cualidades”.

ICH “cualquier componente de un producto medicinal que no corresponde

a la entidad química definida como la sustancia activa o un excipiente en
el producto”.

EP define Impureza como “cualquier componente de una sustancia para

uso farmacéutico que no es la entidad química definida como la
sustancia”.

WHO, por su parte, define una impureza como “químicos indeseables

presentes en el API o PT obtenidos durante el proceso normal de
manufactura”. Además aclara que “no son introducidos maliciosa o
accidentalmente”, “no poseen valor terapéutico y son potencialmente
peligrosos”. Entonces deben ser controlados.
Terminología

Intermediarios: compuestos producidos durante la síntesis del compuesto de

interés.

Subproductos (by-products): compuestos colaterales formados en los pasos de

síntesis.

Productos relacionados: compuestos químicamente similares al API que pueden,

incluso, presentar actividad biológica.

Productos de degradación: compuestos producidos debido a la degradación por

factores externos (luz, humedad, temperatura).
 Origen de las Impurezas
Impurezas del Material de Impurezas relacionadas
Material de Partida Partida a la síntesis
Reactivos Residuos del MP
Sub-productos Solventes Residuos de intermediarios
Catalizadores Impurezas en el MP
Intermediario Reactivos
de Reacción Solventes
Reactivos
Catalizadores
Sub-productos Solventes
Catalizadores Reacciones secundarias
Productos de degradación
Degradación Final API

Proceso de
Interacciones Manufactura
Excipientes-API
Impurezas relacionadas
Solventes,
Temperatura a la formulación
Interacciones Producto Interacciones Excipiente-API
Empaque-API Terminado Interacciones con empaque primario

Estabilidad Producto Terminado

 Tipos de Impurezas
• Impurezas Orgánicas
▫ Relacionadas a la síntesis: formadas durante la síntesis y/o almacenamiento. Pueden ser
identificadas o no, volátiles o no volátiles.
•Materiales de Partida

•Intermediarios

•Sub-productos
•Productos de Degradación

•Reactivos, ligandos y catalizadores

Oxibutinina
Tipos de Impurezas
•Intermediarios

•Sub-productos Ac2O
+
•Productos de Degradación

•Reactivos, ligandos y catalizadores

Paracetamol

NH2NH2 NH2CHO
+

Allopurinol

Hidroclorotiazina Disulfonamida
 Tipos de Impurezas
• Impurezas Orgánicas
▫ Relacionadas a la Formulación:

•Impurezas relacionadas con la forma farmacéutica

•Impurezas relacionadas al método: esterilización de ampollas de diclofenac

123°C -NaOH

•Impurezas relacionadas al ambiente: temperatura (vitaminas), luz (vitaminas), humedad (aspirina)

•Impurezas por envejecimiento : hidrólisis, oxidación, fotólisis, decarboxilación.

•Impurezas por interacción con el material de empaque: peróxidos, metales, electrófilos,

extractables (NO2, SiO2, CaO, MgO)
 Tipos de Impurezas
• Impurezas Inorgánicas

▫ Derivan del proceso de manufactura y de los excipientes. Generalmente son conocidas y

de identidad conocida.
 Reactivos, ligandos, catalizadores.
 Metales pesados o residuos metálicos

Clase I: metales con graves efectos sobre la salud. Se conoce o sospecha que son cancerígenos en
el hombre, o tienen una alta toxicidad.
Ej: Pt, Pd, Cr, Os, V, Mo, Ru, Rh, Ir, Ni

Clase II: metales con bajo potencial tóxico para la salud.

Ej: Cu, Mn.

Clase III: metales con mínimos efectos sobre la salud.

Ej: Fe, Zn.

 Sales inorgánicas
 Tipos de Impurezas

• Solventes Residuales
▫ Líquidos orgánicos o inorgánicos utilizados como vehículos en la preparación de
suspensiones o soluciones durante la síntesis. Toxicidad conocida, por lo cual puede
hacerse una selección adecuada.

Clase I: solventes que deben evitarse. Efecto carcinogénico en humanos confirmado o altamente
probable y peligrosos para el ambiente.
Ej. Benceno, CCl4, 1,2-dicloroetano.

Clase II: solventes con uso limitado. Solventes no carcinogénicos, teratogénicos ni genotóxico que
puede causar severa pero reversible toxicidad sobre el SNC, pulmones, riñones, etc.
Ej. Acetonitrilo, CHCl3, CH2Cl2, MeOH, Piridina

Clase III: solventes con bajo potencial tóxico. Toxicidad a largo plazo o efecto carcinogénico no
reportados.
Ej. Acetona, 1-butanol, 2-butanol, AcH

Clase IV: solventes para las cuales no se encontraron adecuados datos toxicológicos.
Ej. Ác. Trifluoracético, Éter de Petróleo, Isooctano.
Impurezas Potenciales
Impureza que teóricamente puede formarse durante la manufactura o el
almacenamiento.

• Impureza Específica: impureza individualmente determinada con un criterio de

aceptación específico. Puede ser identificada o no idenfiticada.

• Otras Impurezas: impurezas potenciales con una estructura definida pero que no sabe
si normalmente se encuentran por encima del umbral de identificación. Son impurezas
no especificadas y, por lo tanto, se aplica un criterio de aceptación general.

• Impureza potencialmente genotóxica: compuesto que en su estructura presenta

“structural alert”.
▫ Genotóxico:
 Mutagénico
 Clastogénico (ruptura cromosómica)
▫ Mutagénico
▫ Carcinogénico (estudios a largo plazo)
▫ Teratogénico
Impurezas Potenciales
Impurezas Potenciales – Monografía USP

Impurezas identificadas

Impurezas no identificadas
 Impurezas Potenciales – Monografía EP

Impurezas identificadas

Impurezas no identificadas

Las monografías son desarrolladas considerando las

rutas de síntesis históricas del API. Un cambio en el
proceso de manufactura puede llevar a impurezas
distintas.
 Impurezas Potenciales
• Es esencial tener un conocimiento detallado de la síntesis del API y de cómo éste se degrada.

NH2NH2 NH2CHO
+

Allopurinol

NH2NH2 NH2CHO
+

• Generalmente, las especificaciones de impurezas en PT se enfocan en los productos de

degradación del API. Por lo cual, la mayor atención se centra sobre el control de impurezas
en el mismo.

• Las impurezas pueden ser determinadas mediante estudios de degradación forzada.

Productos de degradación significativos deben ser identificados y tratados como impurezas
potenciales.
Impurezas Potenciales

• Conocimiento en química resultar útil  grupos funcionales susceptibles a reacciones

típicas.

• Por ejemplo, el enlace C-O puede sufrir reacciones de oxidación, reducción, sustitución,
eliminación o adición con facilidad.
O

O
OR
OH

O Dimerisation

HO

• Adiciones a dobles enlaces pueden ocurrir espontáneamente. Incluso si la reacción es la

buscada no son 100% específicas.

X X
[X]
+
+

X X
98% 1.5% 0.5%
 Métodos Analíticos
• La identificación y la cuantificación de impurezas es un punto crucial para establecer la
calidad y seguridad del API o PT.

• Los métodos analíticos para impurezas deberían ser “stability indicating”.

• Los métodos pueden desarrollarse para determinar la cantidad de droga remanente, la

aparición de productos de degradación (o cantidad de droga perdida), o ambos.

• Métodos usados:
▫ TLC
▫ HPLC
▫ GC
▫ Electroforesis capilar
▫ Electrocromatografía capilar
▫ MS
▫ RMN

• Deben ser capaz de detectar la impureza, demostrar especificidad y un adecuado LOD/LOQ.

• Importante conocer el método utilizado por el proveedor.

 Métodos de Cuantificación por HPLC

• Si bien existen diferentes tipos de detectores utilizados para el análisis cuantitativo

por HPLC, la base de la cuantificación se mantiene constante.

La RESPUESTA depende de la CANTIDAD de analito en la muestra.

• Requerimientos generales previos a la cuantificación:

- Definir qué se quiere determinar.
- Alcanzar la mejor separación para cada componente.
- Disponibilidad de estándares de pureza conocida.
- Preparación de la muestra y calidad de separación reproducibles.
 Métodos de Cuantificación por HPLC – Factor de Respuesta
FR: relación entre la señal producida por el analito y la cantidad del mismo para producir dicha
señal.

FRR: parámetro analítico utilizado para corregir la diferencia en la respuesta del detector para las
impurezas y el analito.
El FRR puede estar codificado o puede ser obtenido
durante la validación del método por relación de
pendientes:
Piridoxina

Impureza A Impureza B

Criterio de
Nombre TRR FRR
Aceptación

Impureza A
6-methyl-1,3-
1,7 1 0,10%
dihydrofuro[3,4-c]pyridin-
7-ol, En caso de asumir linealidad, se puede utilizar
Impureza B
el siguiente cálculo:
0,15%
5-(hydroxymethyl)-2,4- 1,9 1,5
dimethylpyridin-3-ol
 Límites de Impurezas

• El primer paso en el establecimiento de las especificaciones de impureza es considerar las

impurezas que podrían estar presentes, en base a toda la información disponible.

• Las monografías son desarrolladas considerando las rutas de síntesis históricas del API. Un
cambio en el proceso de manufactura puede llevar a impurezas distintas.

• Los límites deben ser calificados como seguros y ser un reflejo fiel de los datos de estabilidad.

• Considerar los límites indicados por ICH.

▫ Impurezas por debajo del límite definido por la ICH no necesitan ser detalladas
individualmente en la especificación.

▫ Impurezas por encima del umbral de ICH necesitan ser identificadas y determinar un
límite individual en la especificación.
Estudios de Estabilidad
0.2% = 0.1 mg
0.5% = 250 µg

Realizar la identificación estructural del compuesto de degradación 0.2% = 3.8 mg

Proceso de adquirir y evaluar los datos que establecen la seguridad

biológica de un producto de degradación individual o de un perfil de
degradación a los niveles especificados.
 Límites de Impurezas (2)
• Si el límite de una impureza orgánica es mayor al establecido por ICH, entonces es
necesaria una calificación de la especificación:

▫ A través de ensayos toxicológicos.

▫ Comparando con los límites establecidos en Farmacopeas (Ph.Eur., USP, etc) para una
impuerza específica. Incluso puede ser una monografía de otra sustancia.

▫ Comparando los niveles encontrados en un innovador o un PT precalificado.

▫ Comparando con el límite previamente aprobado en un PT precalificado.

• Estos conceptos son aplicables a API´s sintéticos, pero podrían ser usados para API´s
semisintéticos.
 22

Estudios de Degradación Forzada (EDF)

• Los estudios de degradación forzada, descomposición forzada o pruebas de stress

consisten en la exposición de un API o un producto farmacéutico a diferentes
condiciones de stress con el fin de obtener productos de degradación.

• Es una herramienta útil para predecir la estabilidad de una droga, un parámetro

crítico que tiene impacto en la pureza, la potencia y la seguridad del producto
farmacéutico.

• Actualmente, existen numerosas guías con recomendaciones para la realización de

los EDF. Sin embargo, ninguna da instrucciones claras, completas y detalladas o
definiciones relacionadas con aspectos individuales (condiciones exactas o
tiempos de exposición).
 23

Estudios de Degradación Forzada (EDF) – Aspectos Regulatorios

• ICH
▫ ICH Q1A – Stability Testing of New Drug Substances and Products
▫ ICH Q1B – Photostability Testing of New Drug Substances and Products
▫ ICH Q2B – Validation of Analytical Procedures: Methodology
▫ ICH Q3A – Impurities in New Drug Substances
▫ ICH Q3B – Impurities in New Products
▫ M4Q(R1) – The common Technical Document (CTD): Quality
• EMA
• FDA “estudios de degradación forzada son estudios realizados para degradar la muestra
deliberadamente”
• Requerimientos de Farmacopeas: USP, JP (como parte de la validación)
• WHO
• ANVISA fue pionera en publicar la resolución Resolution RDC 53/2015 donde se incluyen
diferentes aspectos y tópicos de degradaciones forzadas que las compañías farmacéuticas
deben cumplir.
 24

Estudios de Estabilidad vs Estudios de Degradación Forzada

• Los estudios de estabilidad incluyen estudios a largo plazo (12 meses) y

estudios de estabilidad acelerada (6 meses) mientras que los estudios de
degradación forzada permiten generar degradados en tiempo mucho más
acotados.

• Además, las muestras de los estudios de degradación forzada pueden ser

utilizadas para el desarrollo de métodos indicativos de estabilidad.
 25

Estudios de Degradación Forzada (EDF) – Propósito

• Elucidar estructura de productos de degradación

• Desarrollar y validar métodos analíticos stability-indicating

• Identificar impurezas relacionadas con el API o excipientes

• Generar formulaciones más estables

• Distinguir en las formulaciones entre productos de degradación relacionados con el API de

aquellos que no lo son (por ej. Excipientes)

• Resolver problemas relacionados con la estabilidad (balance de masa)

• Generar un perfil de degradación que mimetice lo que podría ser observado en un estudio de
estabilidad formal bajo las condiciones de la ICH

• Facilitar mejoras en el proceso de manufactura y formulaciones en paralelo con los estudios

acelerados.

• Elegir las condiciones de almacenamiento adecuadas y el empaque adecuado

Estudios de Degradación Forzada (EDF) – Cronología

• Estudios de Stress
Inicio Generales

• API- Optimización del Proceso

Desarrollo • Producto - Compatibilidad de
excipientes y desarrollo de
temprano formulación

Estructura de
Degradados • API y Producto -
Desarrollo Generación de
perfil y uso en
Final desarrollo
analítico
Estructura de
Degradados Principales y
mecanismo de
degradación
 27

Estudios de Degradación Forzada (EDF) - Buenas Prácticas

• Recopilación de datos:

▫ Reunir toda la información pertinente sobre la sustancia activa para identificar

las posibles vías de degradación

▫ Conocer de la solubilidad del compuesto, en particular la solubilidad acuosa,

▫ Si la solubilidad en agua es demasiado baja, entonces un co-solvente orgánico

relativamente inerte tal como acetonitrilo, puede ser utilizado para lograr la
solución deseada
 28

Estudios de Degradación Forzada (EDF) - Buenas Prácticas

• Mapeo de las impurezas:

▫ Diseñar un mapa de posibles impurezas del API y del producto (química –

software)

▫ La predicción debe estar asociada con una evaluación del riesgo documentado
para cada una de las impurezas.

▫ Para los productos terminados, los picos no relacionados a la sustancia como

placebo, deben distinguirse y separarse de compuestos relacionados al principio
activo. Este proceso puede llevarse a cabo a través de un análisis comparativo de
muestras estresadas ​de materia prima sola, de la materia prima más excipientes,
y de excipientes solos
 30

Estudios de Degradación Forzada (EDF) - Buenas Prácticas

• Elementos de estudio de degradación Forzada :
▫ Materia Prima
Estado sólido,
▫ Producto Terminado
solución o
▫ Excipientes suspensión
▫ RLD – Producto de referencia (si está disponible)

• Condiciones de Degradación
▫ Hidrólisis (diferentes valores de pH)
▫ Oxidación
▫ Térmica (diferentes temperaturas y diversos valores de humedad)
▫ Fotolítica (según la directriz ICH)
 31

Estudios de Degradación Forzada (EDF) - Buenas Prácticas

• Condiciones de Degradación
 32

Tipo de estrés Etapa de desarrollo Etapa de validación

Reactivos Duración Reactivos

pocos minutos para 0.05 N – 0.5 N HCl

0.05 N – 0.5 N HCl
Hidrólisis ácida compuestos lábiles y alrededor + neutralizar (NaOH)
+ neutralizar (NaOH)
de 1 - 5 días para estables

pocos minutos para

0.05 N – 0.5 N NaOH compuestos lábiles a 0.05 N – 0.5 N NaOH
Hidrólisis básica
+ neutralizar (HCl) alrededor de 1 - 5 días para + neutralizar (HCl)
estables
1) luz blanca fluorescente (≥
1,2 mln lux × hora)
2) UV(≥ 200 watt × h/m2)
Fotóisis 3) Cámara con luz solar (250-
700 watt × h/m2);
exposición: desde varios
minutos hasta horas
Oxidación – pocos minutos para 0,3% - 3% H2O2 a TA o menos +
0,3% - 3% H2O2 a TA o menos +
Peróxido de compuestos lábiles y alrededor Quench (H2O/MeOH,
Hidrógeno Neutralizar de 1 - 5 días para estables H2O/MeCN)
 33

Tipo de stress Etapa de desarrollo Etapa de validación

Reactivo Duracion Reactivo

0,1 a 1,0 mg / ml de solución Por lo general: 1 - 3 días 0,1 a 1,0 mg / ml de solución de

de ensayo + 5 - 20 mol% de ensayo + 5 – 20 de AIBN en
Oxidación-AIBN AIBN en MeCN (≥ 50%) / MeCN (≥ 50%) / MeOH (10%) /
(Soluble en agua) MeOH (10%) / agua (0 - 25%); agua (0 - 25%); Temperatura. ≤
Temperatura. ≤ 40 º C 40 º C

0,1 a 1,0 mg / ml de solución Por lo general: 1 - 3 días 0,1 a 1,0 mg / ml de solución de

de ensayo + 5 - 20% mol% de ensayo + 5 – 20 mol% de ACVA
Oxidación-ACVA ACVA en agua (≥ 50%) / MeOH en agua (≥ 50%) / MeOH (10%) /
(Orgánica (10%) / MeCN (≤ 40%); MeCN (≤ 40%); Temperatura. ≤
soluble) Temperatura. ≤ 40 º C 40 º C

AIBN: 2,2’-Azobis(isobutironitrilo)
ACVA: 4,4’-Azobis(ácido 4-cianopentanoico)
 34

Lista de reactivos estresantes alternativos

Tipo de Stress Etapa de desarrollo Etapa de Validación*

Reactivo Duración Reactivo

Temperatura - 60 – 80ºC, varias horas para inestable, hasta 14

(Solidos) días para estable

Temperature + - 60 – 80ºC / 75% RH, varias horas para inestable,

Humedad hasta 14 días para estable
(API / formas (Tener en cuenta el punto de fusión!)
dosificación
sólidas)

Temperatura - 40 – 80ºC, varias horas para inestable, hasta 14

(Suspensiones / días para estable;
Soluciones) Autoclavar (121°C pocos minutos) puede
tenerse en cuenta para soluciones
 35

Lista de reactivos estresantes alternativos

Condiciones de stress Reactivos Alternativos Ventajas

Hidrólisis ácida Ácido sulfúrico

Diferentes concentraciones
(“clásico” – HCl) Ácido Trifluoracético

Hidrólisis básica
Hidróxido de Litio/Potasio Aunque parecen similares, tienen diferente reactividad
(“clásico” – NaOH)

Oxidación Peróxido de Hidrógeno Aminas 1° o 2° , pirrol, piridina para N-óxidos,

(“clásico” – H2O2) AIBN, NMP hidroxilaminas

Oxidación Peróxido de Hidrógeno

(“clásico” – H2O2) Sulfuro a sulfóxidos a sulfona
AIBN, NMP

Oxidación
KMnO4 Alcoholes 1° o 2° a ácidos carboxílicos, alquenos a dioles
(“clásico” – H2O2)
 36

Lista de reactivos estresantes alternativos

Condiciones de stress Reactivos alternativos Ventajas

NMP (N-methyl Pyrrolidone): NMP–agua

(10:90) calentada a 25°, 40°C, 60°C – 80°C
Oxidación
en presencia y ausencia de oxigeno 1, 3, 5 Bencilico, alilico a alcohol bencílico
(“clasica” – H2O2)
dias
AIBN, MnO2

Oxidación
(“clasica” – H2O2) Iodo (I2) Azúcares, indoles

Oxidación
(“clasica” – H2O2) Clorocromato de Piridinio
Alcoholes primarios y secundarios a cetonas
(PCC)

Oxidación
(“clasica” – H2O2) NaClO (lavandina) Alcoholes secundarios a cetonas
 37

Lista de reactivos estresantes alternativos

Condiciones de stress Reactivos alternativos

Catalizadores metálicos: 0.1 – 1 mg/mL contenidode agua 1 – 5 mM Fe3+, Ni2+,

Oxidación
(“clasica” – H2O2) Cu2. Saturada de oxígeno burbujear en matraces ámbar aforados.
(1día, 2 días), Temp 30 – 40C

Oxidación Saturado con oxígeno: 0.1 – 1 mg/mL saturado con oxigeno burbujeado en
(“clasica” – H2O2) matraces ámbar aforados.

Oxidación Oxígeno presurizado: 0.1 – 1 mg/ml con oxigeno presurizado en viales de

(“clasica” – H2O2) headspace cerradps (80 – 300 psi) protegido de la luz, 1día, 2 días
 38

Estudios de Degradación Forzada (EDF) - Buenas Prácticas

• Límite de Degradación
▫ Una degradación entre el 5-20% ha sido aceptada como un valor razonable para la
validación de métodos cromatográficos. Un valor de 10% es considerado un valor
óptimo.

 Menos de 5%:
• Si la degradación en todas las condiciones es menos de 5%, se debe evaluar un
aumento en la concentración del reactivo, la exposición y / o la temperatura.
• Si aún así no se logra el 5% se debe proporcionar una justificación científica
sobre la estabilidad de la molécula sobre la condición evaluada.

 Mayor que 20%:

• Se recomienda el uso de condiciones más suaves. Una muestra sobre-estresada
puede generar productos de degradación secundarios que podrían no ser
formados durante los estudios de vida útil.
 39

Estudios de Degradación Forzada (EDF) - Buenas Prácticas

• Concentración de la droga

▫ La concentración de la droga no se especifica en las guías regulatorias.

▫ Se recomienda iniciar con una concentración de 1 mg/ml para conseguir productos de

degradación en el rango de detección.

▫ Para las sustancias solubles en soluciones acuosas, la degradación es más sencilla.

▫ Para los fármacos que no son solubles en agua, se realizan pruebas con la materia prima presente
en forma de suspensión, pero es probable que la degradación sea lenta y pueden ser necesarias
condiciones de reacción más severas las cuales pueden producir reacciones secundarias que no
estén en correspondencia con lo encontrado durante los estudios de estabilidad.

▫ La adición de co-solventes compatibles está permitida siempre que el co-solvente no tome parte
o altere el curso de la reacción.

▫ También es necesario tener en cuenta la miscibilidad entre el solvente orgánico o co-solvente con
la fase móvil para asegurar la forma adecuada del pico para la cuantificación
 40

Recomendaciones generales para estudios de Degradación Forzada

1. Se debe intentar utilizar el mismo método analítico para la valoración y el análisis de

impurezas por degradación forzada. Si no es posible utilizar el mismo método,
analice la misma solución de degradación forzada usada en el método para
determinar impurezas en el principio activo/producto terminado, en el método
utilizado para valoración del principio activo/producto terminado.

2. Realizar una búsqueda bibliográfica y evaluar los datos de estabilidad del proveedor
de la materia prima. Comprender la naturaleza del API.

3. Si se disponible del producto innovador- examinar el material de empaque del mismo

(incluyendo las cantidades, tipos de desecantes y antioxidantes).

4. Se recomienda realizar pruebas preliminares de degradación forzada, mediante la

variación de condiciones de humedad / temperatura y fotolítica, en diferentes
formulaciones propuestas - antes del inicio de los estudios de estabilidad formales.
 41

Recomendaciones generales para estudios de Degradación Forzada

5. Se recomienda preparar soluciones madre comunes de materia prima/ producto

terminado para el estudio completo (cuando sea posible).

6. Para los estudios de validación formal: En primer lugar realizar las degradaciones por
stress a temperatura ambiente, a continuación, si es necesario combinar con
degradaciones a temperaturas mas elevadas (40 – 80 ° C).

7. Es importante frenar la reacción de degradación luego del tiempo estipulado.

8. Degradar el API, placebo y producto terminado en igualdad de condiciones de estrés

en paralelo.

9. Reproducir las mismas condiciones de stress en las soluciones sin el API/ producto
terminado/placebo por el mismo tiempo/ temperatura para identificar los picos
procedentes de reactivos / diluyente.
 42

Recomendaciones generales para estudios de Degradación Forzada

10. Utilizar métodos de gradiente cuando sea posible y mantener alta la proporción de
fase orgánica durante 15 minutos adicionales (elución de los dímeros, especies muy
hidrofóbicas). El tiempo de corrida total debe ser de al menos 2 veces el tiempo de
retención del último principio activo.

11. Usar detector PDA.

12. Utilizar métodos compatibles de espectrometría de masas cuando sea posible.

13. Proteger las soluciones de la luz, ya que algunas de las soluciones de base / ácido /
peróxido podrían ser autocatalizadas por la luz.
 43

Recomendaciones generales para estudios de Degradación Forzada

14. Usar rack termostatizado para evitar degradaciones secundarias durante la secuencia
de HPLC.

15. Evitar la degradación secundaria. Nota: en casos especiales, los productos de

degradación de orden secundario y terciario podrían ser relevantes si se observan
durante los estudios acelerados / estabilidad a largo plazo / durante la fabricación y
aquí los estudios de degradación forzada, deben llevarse a cabo. Con el fin de dilucidar
si un producto de degradación secundario está presente durante la degradación
forzada, se debe considerar la inclusión de puntos de tiempo intermedios durante
estudios de degradación forzada.

16. Utilizar solventes de alta pureza, grado HPLC o gradiente para la preparación de la
muestra, especialmente durante la degradación forzada.
 Línea de Base
• No debe contener Picos Fantasmas.

• Origen:
▫ Carry over: elución de analitos retenidos en inyecciones previas
 Residuos en el inyector
 Adsorción no específica en la columna
 Acumulación en la superficie del sistema

– Solventes no puros
• Solventes no puros Inyección N° 1

• Lixiviados de los viales

• Lixiviados de los reservorios

Inyección N° 10
Línea de Base
• No debe contener Picos Fantasmas.

• Origen:

▫ Carry over: elución de analitos retenidos en inyecciones previas

 Residuos en el inyector
 Adsorción no específica en la columna
 Acumulación en la superficie del sistema

– Solventes no puros
• Solventes no puros
• Lixiviados de los viales
• Lixiviados de los reservorios
Sv. Grado Gradiente: si los solventes no son los suficientemente
puros, las impurezas son adsorbidas en la fase estacionaria al
comienzo de la corrida y luego eluyen cuando se desarrolla el
gradiente.

– Preparación de la muestra

– Contaminación de la columna
Línea de Base
• No debe contener Picos Fantasmas.

• Origen:

▫ Carry over: elución de analitos retenidos en inyecciones previas

 Residuos en el inyector
 Adsorción no específica en la columna
 Acumulación en la superficie del sistema

– Solventes no puros
• Solventes no puros
• Lixiviados de los viales
• Lixiviados de los reservorios Inyección N° 1

– Preparación de la muestra

– Contaminación de la columna
Inyección N° 10
 47

Recomendaciones generales para estudios de Degradación Forzada

17. Evitar el uso de ciertos co-solventes. Por ejemplo, metanol como co-solvente es
reactivo frente a muchos grupos funcionales. Puede contener trazas de formaldehído
y esto podría reaccionar con aminas. Por ejemplo, acetonitrilo, también puede ser
problemático, ya que los grados más bajos pueden contener acetamida y peróxidos.

18. Calor y H2O2 no deben mezclarse durante la degradación oxidativa, la solución de H 2O2
aumenta la escisión homolítica del enlace HO-OH para formar 2HO●, y porque este
último es indeseable, es aconsejable llevar a cabo el estrés con H 2O2 a temperatura
ambiente o menos. La presencia de co-solventes (por ejemplo, metanol) ayudan a
evitar los HO● a ROO● no deseados.
 48

Recomendaciones generales para estudios de Degradación Forzada

19. H2O2 y acetonitrilo no se mezclan debido a la formación de ácido peroxicarboximidico.

El estrés de H2O2 en soluciones básicas de acetonitrilo también puede inducir la
formación de ácido peroxicarboximidico. La reacción puede ser catalizada por la base,
y soluciones buffer o APIs básicos pueden aumentar la formación de ácido
peroxicarboximidico. El ácido peroxicarboximidico activa la reactividad de
hidroxilación y formación de los radicales libres.

Ácido
peroxicarboximidico
Acetonitrilo

Nü

Amida Producto Oxidado

 49

Recomendaciones generales para estudios de Degradación Forzada

20. Una vez que un nuevo producto de degradación es identificado  intentar sintetizarlo
(con la pureza y concentración deseadas) o aislarla para posteriormente caracterizarla.

21. Las robustez/estabilidad del método HPLC/UPLC debe ser demostrada por el balance
de masa durante los estudios de degradación forzada.

22. Cuando un compuesto es tan estable que no puede ser degradado (es decir, <5%), se
deben adjuntar y justificar apropiadamente los datos completos sobre los intentos
realizados. Por lo menos un tipo de combinación de condiciones de estrés debe ser
intentado, para lograr alcanzar >= 5% de degradación.

23. La sensibilidad y la respuesta del método deben ser adecuados para el análisis previsto.

24. Para el efecto placebo, un placebo debe ser analizado cuando se realiza el ensayo de
degradación forzada valoración/impurezas con el fin de evitar resultados sesgados. Para
comprobar que los productos de degradación puede atribuirse exclusivamente a los
propios excipientes.
 50

Recomendaciones generales para estudios de Degradación Forzada

25. En la mayoría de los casos, el API proporciona importantes productos de degradación

más que el producto terminado por lo tanto, para obtener el máximo conocimiento
sobre los procesos de degradación de un medicamento, se estudia a fondo la
degradación del API y debe ser la primera prioridad.

26. Analizar correctamente las variables de degradación para observar la posible

interacción entre ellas, es decir, si se estudia el efecto del pH, es necesario mantener
inalteradas el resto de las otras variables (temperatura, luz, tiempo, etc).

27. Una vez que cada estudio de degradación preliminar ha concluido, se recomienda
repetir los experimentos para proporcionar veracidad de los resultados (esto se puede
hacer durante la validación formal)
 51

Recomendaciones generales para estudios de Degradación Forzada

28. Si se logra un porcentaje menor que aproximadamente 5%, se debe justificar en base
a los experimentos realizados (por ejemplo, mostrando que sólo bajo condiciones
poco realistas se consigue el % de degradación requerido).

29. Es muy importante no degradar por demás el producto terminado con el fin de evitar
la degradación secundaria provocada por condiciones agresivas, especialmente si la
degradación secundaria puede que no sea genuina. Esto es importante para llevar a
cabo el estudio de degradación forzada que realmente imiten las condiciones de
almacenamiento a largo plazo.
 52

Arbol de decisión degradación forzada

Consultar a un Químico orgánico Si no es posible consultar a un químico

(análisis estructural) analítico experimentado

Llevar a cabo los experimentos

Nivel inadecuado de degradación Nivel adecuado de degradación

Cambiar parámetros (T°, tiempo, Realizar el Balance de Masa

concentración, etc)

Nivel inadecuado de degradación Nivel adecuado de

degradación Evaluar posible productos de degradación

Cambiar reactivo/s
Elegir métodos apropiados para
caracterizar los productos de degradación

Asentar la relevancia de los productos de

degradación en condiciones reales
 Estudio de compatibilidad de excipientes

1. Realizar búsqueda de literatura preliminar de incompatibilidad conocida antes de iniciar el

estudio. Buscar en la bibliografía científica y de las patentes para descartar posibles
reacciones entre el fármaco y los excipientes.
2. Preparar al menos tres conjuntos de muestras, a temperaturas elevadas (40-60 °C) y
Humedad (condiciones aceleradas):
1. Activo solo
2. Excipiente
3. Activo con excipiente relación de 1: 1 o en la relación que es compatible con la
formulación (teniendo un excipiente a la vez).
3. Si es posible, realizar comprimidos con el activo y un excipiente a la vez para asegurarse el
contacto físico del fármaco con el mismo.

4. El método HPLC (MS compatible) con una resolución de separación suficiente entre los
activos, excipientes e impurezas. Utilizar el mismo método de HPLC para todos los estudios.
Este método debe ser el mismo que el utilizado para la degradación forzada, así como para el
programa de

53
Estudio de compatibilidad de excipientes

54
 56

Balance de masas

• La investigación del balance de masas en muestras degradadas puede revelar la

naturaleza stability-indicating de un método.

• Consiste en sumar el valor de ensayo de Valoración y los niveles de productos de

degradación para evaluar si dicha suma se acerca a 100% del valor inicial (antes de la
degradación en cada condición específica).

• Diferentes escenarios se presentan en la forma de determinar el balance de masa en el

método de ensayo, o el método de impureza si el método de valoración y el método de
impurezas no son los mismos
 57

• Caso 1:
Método de impurezas
La concentración de API excede la escala lineal/fuera de escala
se debe reducir el volumen de inyección para determinar la cantidad de activo
(valoración)
Esta cantidad (contenido) se puede agregar a la cantidad total de impurezas
determinadas en el método (usado oficial, mayor volumen de inyección)
 58

• Caso 2:
Método de valoración
Todas las impurezas eluyen en la primera parte del gradiente y/o eluyen como un pico
combinado debido a la elución al final del gradiente - Es correcto, si las impurezas no
se separan entre si y se eluyen como un solo pico.

Solo la suma de los picos de impurezas (% de impurezas totales es necesaria para el

cálculo del balance de masa) + cantidad de valoración (pico API)

Sin embargo, si los picos de placebo co-eluyen con picos de impureza, entonces el área
debida a los picos de placebo necesita ser sustraída para alcanzar una estimación
correcta del porcentaje total de impurezas.
 59

• Caso 3:
Todas las impurezas no eluyeron en la corrida, y eluyen durante la etapa de lavado
En este caso, se registra el cromatograma durante la etapa de lavado y se determina la
cantidad total de impurezas.

• Caso 4:
Si el volumen de inyección en el método de valoración es demasiado bajo, y no se
detectan las impurezas  aumentar el volumen de inyección y determinar la suma de
las impurezas.

(Nota: las impurezas no deben resolverse una de la otra, pero las medidas apropiadas
deben ser tomadas para restar el área de cualquier pico coeluyente de placebo, si se
coeluyen con picos de impurezas)

Las impurezas totales se suman a la cantidad determinada en la valoración con el

método de ensayo que tiene un volumen de inyección menor
 60

• Caso 5:

La misma solución de la degradación forzada se puede analizar corriendo dos

métodos diferentes: el método de valoración y el método de impureza

Sumar el % de valoración del método y las impurezas totales obtenidas en el

método de impureza y determinar el balance de masas
 61

Análisis de los resultados del Balance de Masa

• Si se observa una pérdida sustancial de masa  considerar factores de respuesta o la

formación de productos de degradación altamente retenidos o productos de
degradación volátiles.

• Posibles razones:
1. Relativas al proceso de manufactura
2. Incompatibilidad del producto-embalaje (adherencia parcial, principalmente para
líquidos)
3. Sistema de cierre del envase, Ejemplo: evaporación de impurezas, API
4. Método analítico

• Para la determinación del balance de masa, la misma muestra debe ser utilizado tanto
para la determinación de impurezas y valoración.

• En el caso de muestras estresadas es importante determinar la pureza de pico porque

indica el estado del balance de masas descartando posibles co-eluciones.
 62

Pureza de Pico

▫ En todas las muestras estresadas, la pureza de pico tiene que ser evaluada para
verificar que hay limitada interferencia de los picos en el tiempo(s) de retención
del pico (s) principal.
▫ Si la pureza de pico no cumple con los criterios de aceptación definidos, se
requiere trabajo adicional sobre el método para resolver todos los picos de
interés
 • Determinar si un pico es espectralmente homogeneo, es decir, si es puro. Sin coelución.
• Necesario utilizar métodos con DAD  Definir cuando se crea el Processing Method!!!

• Análisis con Empower:

▫ Comparación de valores de Purity Angle y Purity Threshold
– Spectrum Index
– Utilizando la Ventana de Resultados

Purity Angle < Purity Threshold

 • Determinar si un pico es espectralmente homogeneo, es decir, si es puro. Sin coelución.
• Necesario utilizar métodos con DAD  Definir cuando se crea el Processing Method!!!

• Análisis con Empower:

▫ Comparación de valores de Purity Angle y Purity Threshold
– Spectrum Index
– Utilizando la Ventana de Resultados

Purity Angle < Purity Threshold

Ligeras diferencias en los espectros

indican que el pico no es puro

La línea del Purity Angle (verde) debe estar por

debajo de la línea del Threshold Angle (azul)
para un pico puro
 • Determinar si un pico es espectralmente homogeneo, es decir, si es puro. Sin coelución.
• Necesario utilizar métodos con DAD  Definir cuando se crea el Processing Method!!!

• Análisis con Empower:

▫ Comparación de valores de Purity Angle y Purity Threshold
– Spectrum Index
– Utilizando la Ventana de Resultados

Purity Angle < Purity Threshold

Ligeras diferencias en los espectros

indican que el pico no es puro

La línea del Purity Angle (verde) debe estar por

debajo de la línea del Threshold Angle (azul)
para un pico puro
 66

Balance de masas - Criterio de aceptación

Límites de Rango medio de Variabilidad Criterio de aceptación

especificación especificación analítica
99.0 – 101.0% 1 2 3 (97.0 – 103.0%)
98.0 – 102.0% 2 2 4 (96.0 – 104.0%)
95.0 – 105.0% 5 2 7 (93.0 – 107.0%)*
90.0 – 110.0% 10 2 7 (93.0 – 107.0%)*

*Criterio de aceptación máximo para balance de masas

 67

Causas potenciales de un mal balance de masas

Desafíos del
Causas raíz Causas raíz Causas raíz Causas raíz Causas raíz Causas raíz
método analítico
Elución temprana - No elución: No elución: No Detectado: No detectado: El No detectado: picos
en el frente de Muy hidrofóbico y Polimerización, No es optima detector no es lo de elución tardíos.
solvente o antes del retenido en la incompatibles con la longitud de onda / suficientemente Eluye entre las
volumen muerto columna (RP HPLC). columna, pegado a No hay respuesta en sensible inyecciones o los
Método que no Muy hidrofílico y la cabeza de la UV picos demasiado
detecta todas las retenido en la columna o grandes (bajo
impurezas columna (NP y precipitado número de platos)
HILIC) para ser detectados

El método no es lo
Impurezas / Impurezas/
suficientemente
Degradación / picos Degradación /
selectivo (mala
Co-elución de placebo son co- Picos de placebo - - -
elección columna, la
eluidos con picos Son co-eluídos con
fuerza eluyente,pH,
parientes otros picos
etc.)
 68

Desafíos del
método Causa raíz Causa raíz Causa raíz Causa raíz
analítico

RRF incorrecta
La detección de las impurezas no se
(factor de
encuentra en el máximo de absorbancia
respuesta relativa)
UV del pico principal.
El pH de la fase
Diferencia en RRF - elección Si la impureza no tiene mismo máximo
móvil y la
Factor de equivocada de la longitud de del API, un estándar de calibración
concentración de Desconocido RRF
respuesta onda o Diferencia de modelo de separado de la impureza podría ser
disolvente
Detector utilizado y determinada en el máxima
orgánico pueden
longitud de onda de la impureza, pero el
tener un efecto
API también necesita algo de respuesta
sobre la absorción
a esta longitud de onda.
UV

Las impurezas
podrían tener baja
Algunas veces la solubilidad en
solubilidad del API disolvente particular
y las impurezas y puede precipitar
Solubilidad son muy diferentes en el vial, - -
 especialmente si la
recuperación temperatura de
incompleta inyector
automático. es
demasiada baja
 69

Desafíos del
Causas raíz Causas raíz Causas raíz
método analítico

La impureza no es estable y durante

corridas cromatográficas largas puede La impureza puede cambiar a otra y se
Estabilidad -
ser degradados (temperatura, la luz, la observa la degradación secundaria.
reacción con el disolvente, etc)

unión a excipientes /
Preparación de Extracción insuficiente / insolubilidad de
Insuficiente extraction del API material de vidrio / filtros / carga
muestra impurezas
estática / segregación
La recuperación
incompleta debido Viales HPLC (vidrio, plastico, goma) Instrumento (componentes metálicos) -
a la adsorción

Línea de base ruidosa /elevada o

Mala integración Picos interferentes (excipientes / diluyentes) -
decreciente línea de base.

Posibles fuentes de contaminación:

Fase móvil, muestra solvente,
Contaminación Electrodos de pH, manejo de las soluciones -
columna, los picos del sistema, filtros
de muestra, sistema de HPLC

Método no sensible (relación S /N deseada La falta de precisión debido a la falta

Método Fuera del rango lineal
de solución LOQ no alcanzado) de homogeneidad de la muestra
 Bibliografía
• Kashyap R. Wadekar, Mitali Bhalme, S. Srinivasa Rao, K. Vigneshwar Reddy, L. Sampath Kumar
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Human Services - Food and Drug Administration - Center for Drug Evaluation and Research
(CDER) - Center for Biologics Evaluation and Research (CBER), 2008, ICH Revision 2 .
• Guidance for Industry: ANDAs: Impurities in Drug Products U.S. Department of Health and
Human Services Food and Drug Administration Center for Drug Evaluation and Research
(CDER), 2010 OGD .
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• ICH Harmonised Tripartite Guideline. Q3C(R4) - Impurities: Guideline for Residual Solvents,
February 2009 .
• ICH Harmonised Tripartite Guideline. Q3A(R2) – Impurities in New Drug Substances, October
2006.
• ICH Harmonised Tripartite Guideline. Q3B(R2) – Impurities in New Drug Products, June 2006.
• European Pharmacopoeia 8.1.
• USP 36.
• CAP029: Integration Techniques