Factors associated with pregnancy-associated glycoprotein (PAG)

levels in plasma and milk of Holstein cows during early pregnancy

and their effect on the accuracy of pregnancy diagnosis
“A. Ricci ,*† P. D. Carvalho ,* M. C. Amundson ,* R. H. Fourdraine ,‡ L. Vincenti ,† and P.
M. Fricke *”

Factores Asociados con la glicoproteínas asociadas a la preñez

en niveles de plasma y leche de vacas Holstein con preñez
temprana y su efecto en la precisión del diagnostico.
 Proteínas asociadas a la gestación
Glicoproteínas asociadas a la células binucleadas los 20 días de gestación
preñez (PAG).

 Transferencia de sustancias.
 La secreción de Lactógeno Placentario.
 Las proteínas especificas de preñez B
(PSPB).
 PAG.

 indicadores muy útiles de gestación y de bienestar fetal.

En 1982 . describieron una proteína En 1991 utilizo un proceso en

específica de la gestación, PSP-B en vacunos para purificar , una
vacunos la cual actualmente cuenta con un glicoproteína asociada a la gestación
aprueba Elisa especifica. (Pregnancy Associated Glycoprotein),
PAG.
 Introducción
La no identificación temprana de la preñez Por lo tanto es necesario buscar nuevas
después de la inseminación artificial disminuye tecnologías para identificación temprana de la
la eficiencia reproductiva y aumenta el intervalo preñez
entre servicios por IA.

Con la detección química de sustancias especificas La prueba de preñez idexx PAG leche y plasma
en la circulación fetal se notan como un posible se ha comercializado (laboratorios idexx
indicador indirecto de preñez temprana westbrook).

Las PAG aumentan las concentraciones medias

PAG en sangre materna se utiliza en grandes
entre los 15 y 30 días de gestación pero se
producciones comerciales de leche (silva et al
describe que es mas útil en los días 26 a 30 (zoli
2007, 2009.)
y col.,1992; humblot, 2001).
 Objetivos
Determinar la exactitud de los resultados
Evaluar factores asociados con los
de preñez en base a los niveles de PAG
niveles de PAG en sangre y leche
en plasma y leche en comparación con
durante el inicio de la gestación en vacas
ultrasonografía rectal.
Holstein
 Materiales y métodos
El diagnostico de preñez se realizo 32 días Se sincronizaron 141 vacas HO, 41 primíparas
post IATF en todas las vacas con ecógrafo y 100 multíparas de 53 +3 dim para iatf.
Ibex de transductor línea de 7.5 Hz usando un protocolo de doble Ovsynch.

La gestación se evaluó semanalmente con

ecografía tras-rectal semanalmente de 32 a
102 días post iatf

los animales fueron alojados en la universidad Wisconsin-madison en el centro de investigación en

ganado lechero en establos libres con zonas de alimentación, con una dieta TMR ad libitum formulada de
acuerdo con los requerimientos de la NRC de vacas en alta producción.
 DOBLE OVSYNCH OVSYNCH

PGF2a 25mg PGF2a 25mg

7 DIAS 3d 7 DIAS 7 DIAS 56 d 16 H

GnRH GnRH GnRH GnRH

IATF
1mg 1mg 1mg 1mg
 Las muestras de sangre y leche se recogieron semanalmente desde 25- 102 d post IATF, las vacas diagnosticadas
como preñadas por ultrasonografía luego del día 32 entraron en el estudio

Las muestras de leche se toman 35 ml en el ordeño de la

Las muestra de sangre se extraen mediante punción
mañana en tubos de polipropileno de 40 ml con 50 ul de 2br-
venosa de la arteria coccígea media en tubos de 10
2np-1,3 diol (sol 18 %) como conservante se colocaron en
ml
hielo y se trasportaron a Agsourse laboratorios.

Luego de tomadas las muestras se trasportaron a IDEXX laboratorios para el análisis

de PAG en plasma y leche utilizando kit Elisa comercial

El resultado de la prueba Color proporcional al la

cantidad de PAG se midió utilizando
espectrofotómetro SN= ODm – ODn (450nm). Los
resultados se comparan baja la especificidad de
PAG Elisa comercial
La vacas se ordeñan dos veces al día con intervalos de 12 h y la
producción diaria de leche se almacena y se registran en el
software DairyComp 305 y se calcula la producción promedio
semanal de leche el mismo día de la toma de muestra.
 Análisis estadístico
Se encontró dos vacas con valores atípicos de PAG en leche y plasma las cuales
fueron excluidas del análisis final, pero fueron tenidas en cuenta en los resultados
de análisis de preñez PAG leche

Se utilizo el programas SAS para los diseños Para PAG plasma se Para PAG leche debido a la falta de
estadísticos y para analizar el acuerdo entre incluyeron un total de 141 algunas pruebas se analizaron 135
resultados se utilizo el índice Kappa. muestras de sangre muestras de leche

Los resultados de la ultrasonografía trasn-rectal se consideran como la prueba de

referencia para que las pruebas de PAG plasma y leche fueran comparados mediante el
calculo de “sensibilidad especificidad valor predictivo positivo valor predictivo negativo
y precisión”
 Resultados y discusión
Sincronización y resultados de preñez

De las 141 vacas candidatas a doble Ovsynch para

IATF 3% (4/141) no se pudieron sincronizar
debido a la falta de regresión luteal o falta de
ovulación luego de la ultima inyección de GnRH
estas 4 vacas fueron retiradas de los análisis

En general el 42% de la vacas Sincronizadas ( 57/137) fueron diagnosticadas con preñez 32 d

post IATF, 2 vacas fueron diagnosticadas con gemelos que fueron retiradas del estudio (55/57) la
perdida embrionaria entre los días 32 y 102 fue del 13 % (7/55) con un resultado general de
87% de vacas diagnosticadas que mantuvieron una preñez normal (48/55).
 Perfiles PAG de plasma y leche

F igu ra 1. g lico p ro teín a asociad a a l e m b ara zo P la sm a p erfil (P A G ) p ara va cas H o lsteinF ig(nu ra= p4e8)rfilq u2 e. Lme cahntien
e g liceo pe rl oem
te ínbaraz
a a sooc ia d a a l e m b a r a zo ( P A G ) p a ra la s v a c a s e m b a ra z a d a s H o lste in ( n = 4 8 ) q u e
2 5-1 0 2 d de sp u és d e la IA , y los resultad o s de l e m b ara z o -d iag n ó stic o resu ltan te s dm ed ealaEn tie n e n e l e m b a ra z o 2 5 -1 0 2 d d e sp u é s d e la I A , y lo s r e su lta d o s d e l e m b a ra zo -d ia g n ó stic o r e su lta n te s d e la p r u e b a
prue b a d e E L IS A P A G p lasm a.
Los niveles de PAG en plasma y leche aumentan después de 25 días post
(P an e l su p erior) lo s re su ltad os d e plasm a d e E L IS A se ca lcu la ro n a p artir d e la de (OnDsida
L I S A P A G le c h e . ( P a n e l su p e rio r) lo s r e su lta d o s d e la le c h e d e E L I S A se c alc u la r o n a p a r tir d e la d e n sid a d ó p tic a
) d e dla ómp utica
e stra(O[ cDo rr
) edgeidlaa pmo ru su e stra
En un estudio similar dondeSesedetermina
analizo lael perfil semanal
presencia PSPB ydesePAG plasma
obtuvo que ya los
leche
15semanal
días post IA no fue detectado
[c orreg ida p or sustrac c ió n d e la D O d e lo n g itu d d e o n d a de referenc ia de la m u estra (SD O) md eenl cos o n la
tr oDl nOe gdael
tivcoo(Nn tro
) al 4neg5 0 an tiv
str a c c ió n d e la D O d e lo n g itu d d e o n d a d e r e fe r e n c ia d e la m u e str a (S ) m e n o s la
o o n a m b o s v a lo r e s c o r re g id a p o r su stra c c ió n d e la lo n g itu d d e o n d a O D d e
IATF y un pico de temprano a los 32 días post IATF, por otra parte se
m (c
r efe re n cia d e l c o n tr o l n e g a tiv o )], q u e r e su ltó e n u n v a lo r d e S N . L a m e d ia (± S E M ) lo s n iv e le s d e P A G le c h e se v ie r o n
únicamente
pero que en contrario a los 40 días post aIAvacas que mantienen
los niveles ya habíanpreñez
aumentade considerablemente
25 a 102 d de y que después de los
(N ) a 4 5 0 n m (c o n a m b o s v a lores c orreg id a p or sustracc ió n d e la lo n g itu d de aofen dctaa dOa sDp odreserefere m a n a nd cia
e sp udé el s d ec olan Itro
A (Pl A G <0,01). (Panel inferior) Cuando el valor de SN fue <0,100 (línea de
vieron disminuidos 32 post IATF con un comportamiento similar hasta las
n eg ativ o)], q ue re su ltó en u n v alor d e S N . L a m e dia (± S E M ) n iv ele s d e P A G d e p lapuntos sm a se en v iero n afecsuperior),
el panel ta d as p o r la sem vaca a nafue clasificado “no embarazada” (barras negras); cuando el valor de SN fue>
70 días post IA se manteníagestación (48)
constantes, envacas diagnosticadas
otro estudio donde secomo cargadas
trabajo con Kit32 d pos
Elisa comercial para PAG se
d esp u é s d e la IA (P A G < 0 ,0 1 ). (P a n e l in fe rio r) C u a n d o el v a lo r d e S N fu e < 0 0.100 ,3 0 0 (alín e a d e(línea
<0,250 p u n todiscontinua
s e n e l p an ene el
l panel superior), la vaca se clasificó como “vuelva a verificar” (barras
53 y 60 días post IATF y luego se observo un aumento gradual a partir de
su p e rio r), la v a ca fu e c la sificad o “ n o e m b araza d a ” (b a rras n e g ra s); c u a n d o e l AI.
rayadas); y cuando el valor SN era ≥0.250, la vaca fue clasificado (barras abiertas) “embarazadas”. TAI = timed
v a lo r d e S N fu e > 0 .3 0 0 a < 1 ,0 0 0 ,
reporto similar de la SN de IATF
plasmatras Ultrasonografía continuaron el experimento.
y leche.
la v ac a fu e c la sific a d o “ v u e lv a a v e rific a r” (b a rra s ray ad a s); y c u a n d o el v a lo r S N era ≥ 0 .3 0 0 (lín ea d isc o n tin u a
los 73 días post IATF Hasta los 102 días fig. (1 y 2).
en e l p an el su p e rio r), la v ac a fu e cla sific a d o (b a rra s a b ie rtas) “ e m b araz a d as” . T A I = tim e d A I.
 Figura 4. Asociació n entre los perfiles de proteínas de la leche A asociada al embarazo gl
Holstein embarazadas, y los resultados del embarazo -diagnó stico resultantes de la PAG l
F i g u r a 3 . A s o c i a c i ón e n t r e p e r fil e s e n p l a s m a a s o c i a d a a l e m b a r a z o G l y - c o p r o t ePAG in (P A G ) y d e(panel
Leche p a r i d a dsuperior)
p a r a v a c a s para primíparas (n = 19) y multíparas (n = 29) vacas que ma
H o l s t e i n e m b a r a z a d a s , y l o s r e s u l t a d o s d e l e m b a r a z o - d i a g n ós t i c o r e s u lt a n t e s d ede
l p lla
asm a P A G E L ISA p ru eba po r
IA. los resultados de la leche de ELISA se calcularon a partir de la densidad ó ptica (O
p a r i d a d . ( P a n e l s u p e r io r ) l o s n i v e l e s d e p l a s m a d e P A G p a r a p r i m íp a r a s ( n =
sustracció n de la longitud de onda OD de referencia de la muestra (S) menos la DO del tr
19) y multíparas (n = 29) vacas que mantenían el embarazo 25-102 d después de la IA. resultados Plasm a PAG de ELISA se
Con respecto a la relación entre primíparas y multíparas los nivel de PAG y
ambos valores corregidos por sustracció n de la longitud de onda OD de referencia del co
calcularon a partir de la densidad óptica (OD) de la muestra [corregida por sustracción valor dedela SN.
DO deLa longitud
mediade (±onda
SEM) de los niveles de PAG leche se vieron afectadas por semana d
referencia de la muestra (S) menos la DO del control negativo (N) a 450 nm (con am bos valores corregidos por ción
= 0,05). (Panel medio) OUT- embarazo viene basa en los niveles de PAG leche de vacas p
subtrac- de la OD de longitud de onda de referencia del control negativo)], que resultó en un valoren de SN. La media (± SEM ) PAG leche de vacas multíparas. Cuando el valor de SN
los resultados obtenidos son mas precisos en vacas primíparas que en
los niveles de PAG de plasma se vieron afectadas por semana después de la IA (P <0,01)
resultados (el panel medio) Embarazo basan en los niveles de plasma de PAG vacas
Embarazo

> rous
0.100
y la paridad
superior),
prima ipa-.
base
la vaca (P =
a los
0,009).
fue
los resultados
<0,250,
niveles
los
clasificado
la vaca se (panel
de
“no embarazadas” (barras negras); cuando el valor de SN
clasificó como “vuelva a verificar” (barras rayadas); y cuando

multíparas tanto en plasma como en leche fig. (3 y 4 )

inferior) de embarazo en base a los niveles de PAG plasma de vacas multíparas. Cuando el valor de SN fue <0,300 (línea de
discontinua en el panel superior), la vaca fue clasificado (barras abiertas) “embarazadas”
puntos en el panel superior), la vaca fue clasificado “no embarazadas” (barras negras); cuando el valor de SN fue> 0.300 a
<1. 000, la vaca se clasifi- sified “vuelva a verificar” (barras rayadas); y cuando el valor SN era ≥0.300 (línea discontinua en
el panel superior), la vaca fue clasificado (barras abiertas) “embarazadas”. TAI = timed AI.
 Se realizo una correlación para comparar los
valores SN para leche y plasma en las mismas
vacas fig. (5)

Correlación positiva moderada entre PAG en

plasma y leche

F ig u ra 5 . R e la c ión e n tr e lo s n iv ele s re la tiv o s d e g lic o p r o te ín a s c ia d o s c o n el e m b a r a zo a so - (P A G ) e n p la s m a y la le ch e

d e v a c a s H o lste in d e 2 5 a 10 2 d e n la g e st a c i ón (P A G <0,01; R2 = 0,64). El plasma y la leche PAG resultados de
ELISA se calcularon a partir de la densidad óptica (OD) de la muestra [corrigieron por sustracción de la DO de
 Exactitud de pruebas PAG Elisa en plasma y
leche, en diagnostico de preñez
Se determina el perfil semanal de PAG plasma y leche semanal únicamente a vacas que mantienen preñez
de 25 a 102 d de gestación (48) vacas diagnosticadas como cargadas 32 d pos IATF tras Ultrasonografía
continuaron el experimento

Para PAG plasma el 100% de la vacas Para PAG leche el 98% de la vacas diagnosticadas
diagnosticadas como preñadas por ultrasonografía como preñadas por ultrasonografía coincidieron con los
coincidieron con los datos obtenidos datos obtenidos

En un estudio de diagnostico de preñez con PAG Elisa con la estrategia de re sincronizar rápidamente las vacas
posteriormente habían sido sometidas a un protocolo OVSYNCH y diagnosticadas para preñez por test PAG Elisa
aquellas que fueron determinadas como no preñadas fueron sometidas a un protocolo RESYNCH. Los autores
concluyeron que la detección temprana de no preñez con PAG Elisa y la re sincronización rápida aumento la tasa de
preñez en el rebaño lechero además de una ventaja económica al disminuir los intervalos generacionales
 Análisis de preñez 32 d post IATF
Para evaluar los resultados de preñez de PAG Elisa se construyeron tablas 2x2 para calcular la sensibilidad
especificidad valor predictivo positivo y valor predictivo negativo y precisión de los resultados los cuales fueron
comparados con ultrasonografía

El beneficio de un diagnostico temprano de gestación se basa en identificar vacas vacías con el fin de re
sincronizar e ingresar en un programa de IA mas rápido por otra parte la especificidad de la prueba se ve afectada
por resultados de vacas vuelva a verificar. Estas vacas deben ser diagnosticadas por Ultrasonografía o por
verificación de incidencia del celo

La desventaja de la PAG Elisa en leche y plasma radica en los días 46 y 74 donde los niveles de PAG se
encuentran en sus niveles mas bajos y por consiguiente aparecen mas resultados de vacas preñadas con resultado
de vuelva a verificar, vacas que se diagnostiquen mal pueden ocasionar un perdida embrionaria si se utiliza
inmediatamente un programa de re sincronización basado en PGF2a lo que puede resultar en una perdida
económica
 Perdida de la preñez
En vacas lecheras la detección de la preñez debe ser lo mas rápido posible.

La incidencia de perdida de preñez en el presente
estudio fue de 13% (7/55) que esta de acuerdo con la
perdida de preñez informados en estudio a base de
ultrasonografía en los días 27 a 31 y 38 hasta 50 de 14
estudios analizados.
Para este estudio 7 vacas a sufrieron perdida de preñez
durante el experimento, los resultados de estas vacas
PAG en plasma y leche se compararon con los resultados
de ultrasonografía fig. (6) y Tabla (4)
En algunas vacas se observa un comportamiento similar para
PAG en leche en donde uno de los puntos dio preñez positiva
mientras se había confirmado perdida de preñez.

En PAG Elisa leche donde 3 de 7 vacas presentaron recheck r

cuando ya se sabia que había perdida de preñez

En PAG plasma 5 de las 7 vacas que perdieron la preñez

presentaron resultados de vuelva a comprobar

Los niveles de PAG plasma y leche lo que retrasa la detección

de perdida de preñez en un intervalo entre 7 y 14 d en
comparación con ultrasonografía
 En vacas que presentaron preñez vs aquella que presentaron
perdida de preñez los valores fueron 2.46 +0.8 vs 2.12 +0.26 en
plasma y 1.06 +0.08 vs 0.76 +0.14 en leche

En este estudio se evaluó la rapidez en que disminuyo PAG en

animales con perdida de preñez en los 39 d gestación la las PAG
tiene una vida media en circulación materna, aproximadamente
entre 5 y 7 días post perdida de preñez los niveles de PAG
volvieron a sus niveles basales cuando la regresión lútea se esta
produciendo

La inexactitud de PAG Elisa se basa en la condición fisiológica

de las hembra, las cuales mantiene niveles residuales de PAG
durante aproximadamente 60 días post parto, por esto PAG
Elisa comercial esta especificado para animales con un numero
>60 post parto

F ig u r a 6 . P e rf ile s d e g lic o p r o te ín a a s o c ia d a a l e m b a r a z o ( P A G ) p a r a v a c a s in d iv id u a le s H o ls te in ( n = 7 ) d ia g n o s tic a d o

e m b a r a z a d a u tiliz a n d o tr a n s r e c ta l u ltr a s o n o g r a f ía 3 2 d d e s p u é s d e la I A y p o s te r io r m e n te s o m e tid o s a la p é r d id a d e l
e m b a r a z o . ( P a n e l s u p e r io r ) p e rf ile s d e P A G d e p la s m a in d iv id u a l. ( P a n e l in f e rio r ) P A G p e r f ile s in d iv id u a le s d e le c h e .
E l p la s m a y la le c h e P A G r e s u lta d o s d e E L I S A s e c a lc u la r o n a p a r tir d e la d e n sid a d ó p tic a ( O D ) d e la m u e s tr a
 Efecto de la producción de leche sobre los
niveles de Pag plasma y leche
Los niveles de PAG en plasma y leche fueron correlacionados
negativamente con la producción de leche tanto en primíparas
como en multíparas

Lopez gatius et al 2007 informo una correlación negativa entre

la producción de leche y los nivel de PAG plasma y leche una
posible explicación para este fenómeno se basa en que a medida
que la producción de leche aumenta el crecimiento embrionario
disminuye

En Vacas con gran produccion de leche las concentraciones de

progesterona después de la IATF son bajas por efecto del
incremento del metabolismo hepático de la progesterona
(Sangsritavonget al., 2002),
Figura
7. Relación entre la producción de leche y nive- relativas de glicoproteína asociada al embarazo (PAG) en el plasma de vacas
Holstein. pesos leche diarias desde el 7 d anteriores las veces a la semana de recogida de muestras del plasma se utilizaron
Correlación negativa baja en niveles de PAG leche y plasma
para calcular la producción de leche promedio semanal. resultados Plasma PAG de ELISA se calcularon a partir de la densidad
vs la producción de leche.
óptica (OD) de la muestra [corrigieron por sustracción de la longitud de onda OD de referencia de la muestra (S) menos la DO
 Conclusiones

Se concluye que el mejor tiempo para la

Por efectos de la perdida embrionaria para un
realización de un primer muestreo de Pag Elisa
diagnostico con PAG se recomienda realizar
plasma y leche para un primer diagnostico de
un re chequeo hacia los 74 días post IA cuando
preñez puede ser realizado con óptimos resultados
los niveles de pag leche y plasma se
cerca a los 32 días post IA debido a que en estos
encuentran estables
días se produce un pico temprano de PAG.
Thank you…
Arigato
Merci
Danke